TW202400648A - 抗ｃｃｒ８抗體及其用途 - Google Patents
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Abstract
本揭露關於抗CCR8抗體及用途。
Description
本揭露屬於生物技術領域，更具體地，本揭露關於抗CCR8抗體及其應用。
這裡的陳述僅是提供與本揭露有關的背景信息，而不必然地構成現有技術。
CCR8(chemokine C-C motif receptor 8)是一個七次跨膜的GPCR蛋白，暴露在胞外的部分有N端和3個環(loop)，它的主要配體是CCL1。其中N端和環2對CCL1的結合有重要作用。
CCL1-CCR8軸在腫瘤的發生發展中起著重要的作用。腫瘤微環境中的腫瘤幹細胞，腫瘤相關的成纖維細胞(CAF,cancer-associated fibroblasts)以及腫瘤相關巨噬細胞(TAM,tumor-associated macrophages)會分泌CCL1，驅使外周血中CCR8陽性的Treg浸潤到腫瘤組織內部，抑制Teff細胞的活性，同時CCL1和腫瘤細胞分泌的TGFβ共同作用，使CD4陽性的Tconv轉換成Treg。部分腫瘤細胞表面也會表達CCR8，在CCL1的作用下，促使腫瘤細胞抗凋亡(如T細胞淋巴瘤)，促進腫瘤細胞增殖(如膀胱癌)，以及促進腫瘤細胞轉移(促使黑色素瘤轉移入淋巴結)。同時腫瘤組織內部的血管內皮細胞也會表達CCR8，在
CCL1的誘導下會促進新生血管的生成。除此之外，在臨床上多種瘤種中都發現CCR8表達越低，病人的生存情況越好，這是因為CCR8表達低的病人，意味著腫瘤微環境中Treg浸潤較少，而Teff的比例和活性相對更高。
新的研究發現CCR8抗體能夠藉由ADCC作用特異性殺傷CCR8高表達的腫瘤浸潤性Treg細胞，消除具有免疫抑制活性的Treg細胞，達到抑制腫瘤生長的作用。另外CCL1和CCR8結合，除了誘導Treg向腫瘤微環境中富集外，也會藉由上調Treg中CCR8表達、FOXP3、IL-10等其它免疫抑制因子來加強腫瘤免疫抑制能力。
有相關的CCR8抗體的專利已公開，比如WO2018181425、WO2015048801和CN110835371。目前有多家公司針對CCR8開發了抗體並進入了臨床試驗階段，但是這些CCR8抗體主要是結合在CCR8的N端，無猴CCR8交叉活性或與猴CCR8的交叉結合活性很弱。
本揭露提供一種抗CCR8抗體，其包含：
SEQ ID NO：10所示的重鏈可變區中所包含的HCDR1’HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO：11所示的輕鏈可變區中所包含的LCDR1’LCDR2和LCDR3。
在一些實施方案中，該HCDR1-3和LCDR1-3按照Kabat、IMTG、Chothia、contact或AbM編號規則獲得。
在另一個方面，本揭露提供一種抗CCR8抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，
(a)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：14、15和16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：17、18和19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
(b)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：20、21和22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：23、24和25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
(c)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：20、21和22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：34、35和36所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
(d)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：33、21和22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：34、35和36所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方案中，如前所述的抗CCR8抗體為鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
在一些實施方案中，如前所述抗CCR8抗體藉由ADCC發揮抗腫瘤作用。
具體地，該抗CCR8抗體進一步包含源自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重鏈恆定區或其同種型，視需要地，該抗CCR8抗體是去岩藻糖基化的抗體。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體為人源化抗體。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體包含人抗體的框架區(FR)。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體包含人IGHV2-26*01或IGHV4-30-4*01的FR1、FR2、FR3，和IGHJ6*01的FR4作為重鏈框架區模板；和人IGKV6-21*01、IGKV1-39*01或IGKV3-20*02的FR1、FR2、FR3，和IGKJ4*01的FR4作為輕鏈框架區模板；或者
該框架區包含人IGHV3-72*01、IGHV3-66*01、IGHV3-23*01或IGHV7-4-1*01的FR1、FR2、FR3，和IGHJ6*01的FR4區作為重鏈框架區模板；和人IGKV2-28*01、IGKV3-11*01或IGKV1-39*01的FR1、FR2、FR3，和IGKJ4*01的FR4作為輕鏈框架區模板。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體，其中該抗體的框架區包含胺基酸取代，在一些實施方案中，該胺基酸取代是回復突變。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體，其中，
(a)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：14、15和16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，且該重鏈可變區的FR包含選自1E、27F、28S、30T、71K、73K、78V、44G和49G中的一個或多個胺基酸取代；和
該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：17、18和19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該輕鏈可變區的FR包含選自43S、45K、46P、47W、58V、60A、71Y和49Y中的一個或多個胺基酸取代；或
(b)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：20、21和22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，且該重鏈可變區的FR包含選自27F、48V、69I、71R、75E、29F和93V中的一個或多個胺基酸取代；和
該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：23、24和25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該輕鏈可變區的FR包含視需要自4V、36L、43S、45Q、60S和100A中的一個或多個胺基酸取代；或
(c)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：20、21和22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，且該重鏈可變區的FR包含視需要自27F、48V、69I、71R、75E、29F和93V中的一個或多個胺基酸取代；和
該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：34、35和36所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該輕鏈可變區的FR包含視需要自4V、36L、43S、45Q、60S和100A中的一個或多個胺基酸取代；或
(d)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：33、21和22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，且該重鏈可變區的FR包含視需要自27F、48V、69I、71R、75E、29F和93V中的一個或多個胺基酸取代；和
該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：34、35和36所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該輕鏈可變區的FR包含視需要自4V、36L、43S、45Q、60S和100A中的一個或多個胺基酸取代；
上述的胺基酸取代位點依據Kabat編號規則。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體，其包含人抗體的框架區(FR)；
該抗CCR8抗體包含SEQ ID NO：27、26或28、或與SEQ ID NO：27、26或28具有至少80%(例如至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的重鏈可變區序列，和SEQ ID NO：31、29、30或32、或與SEQ ID NO：31、29、30或32、具有至少80%(例如至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的輕鏈可變區序列；或
該抗體包含SEQ ID NO：37、38、39或40、或與SEQ ID NO：37、38、39或40具有至少80%(例如至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的重鏈可變區序列，和SEQ ID NO：43、41或42、或與SEQ ID NO：43、41或42具有至少80%(例如至少80%、83%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的輕鏈可變區序列。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體，其包含人抗體的框架區(FR)；
該抗CCR8抗體包含與SEQ ID NO：26、27或28具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的重鏈可變區序列，和與SEQ ID NO：29、30、31或32具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的輕鏈可變區序列；或
該抗體包含與SEQ ID NO：37、38、39或40具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的重鏈可變區序列，和與SEQ ID NO：41、42或43具有至少90%(例如至少90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的輕鏈可變區序列。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體，其包含如SEQ ID NO：26、27或28所示的重鏈可變區序列，和如SEQ ID NO：29、30、31或32所示的輕鏈可變區序列。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體，其包含如SEQ ID NO：37、38、39或40所示的重鏈可變區序列，和如SEQ ID NO：43、41或42所示的輕鏈可變區序列。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體包含：
i)如SEQ ID NO：27所示的重鏈可變區，和如SEQ ID NO：31所示的輕鏈可變區；或
ii)如SEQ ID NO：37所示的重鏈可變區，和如SEQ ID NO：43所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體是全長抗體或其抗體片段；較佳地，其中該抗體片段為Fab、Fab’、F(ab')2、Fd、Fv、scFv、dsFv或dAb。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體為Fab。在一些實施方案中，該Fab包含：SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列和SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列；或SEQ ID NO：52所示的胺基酸序列和SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區；具體地，該重鏈恆定區源自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恆定區，該輕鏈恆定區源自人κ和λ鏈恆定區。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區，該重鏈恆定區為源自人IgG1的恆定區，其包含選自可以增強ADCC的突變S298A/E333A/K334A和S239D/I332E中的一個或多個胺基酸取代，其中該胺基酸取代位點按照EU編號。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區，該重鏈恆定區包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列，和/或該輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：45的胺基酸序列。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體包含重鏈和輕鏈，其中，
該重鏈包含與SEQ ID NO：46具有至少85%(例如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈包含與SEQ ID NO：47具有至少85%(例如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列；或
該重鏈包含與SEQ ID NO：48具有至少85%(例如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈包含與SEQ ID NO：49具有至少85%(例如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體包含重鏈和輕鏈，其中，
該重鏈包含SEQ ID NO：46的胺基酸序列，和該輕鏈包含SEQ ID NO：47的胺基酸序列；或
該重鏈包含SEQ ID NO：48的胺基酸序列，和該輕鏈包含SEQ ID NO：49的胺基酸序列。
在另一個方面，本揭露還提供一種如前所述的抗CCR8抗體，其具有一種或更多種以下特性：
A.該抗CCR8抗體與猴CCR8有交叉結合活性；較佳地，與細胞表面的猴CCR8蛋白的結合EC50值小於1nM；更佳地，與細胞表面的猴CCR8蛋白的結合EC50值小於0.5nM；
B.該抗CCR8抗體與如SEQ ID NO：65所示的人CCR8的環2結合；和
C.該抗CCR8抗體與如SEQ ID NO：66所示的人CCR8的環3結合。
在另一個方面，本揭露還提供一種醫藥組成物，其包含如前任一項所述的抗CCR8抗體以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
在另一個方面，本揭露還提供一種免疫偶聯物，其包含：如前任一項所述的抗CCR8抗體和效應分子，其中，該效應分子偶聯至該抗CCR8抗體；較佳地，該效應分子選自抗腫瘤劑、免疫調節劑、生物反應修飾劑、凝集素、細胞毒性藥物、發色團、螢光團、化學發光化合物、酶、金屬離子，以及其任何組合。
在另一個方面，本揭露還提供一種核酸分子，其編碼如前任一項所述的抗CCR8抗體。
在另一個方面，本揭露還提供一種宿主細胞，其含有如前所述的核酸分子；較佳地，該宿主細胞為微生物、植物或非人動物細胞宿主細胞；更佳地，該宿主細胞為剔除了Glul和Fut8基因的宿主細胞。
在一些實施方案中，本揭露還提供一種宿主細胞，該宿主細胞可選自原核細胞和真核細胞，較佳為真核細胞，更佳哺乳動物細胞，較佳不包括人類的哺乳動物細胞；其中該哺乳動物細胞包括但不限於CHO、293、NSO以及在哺乳動物細胞中進行基因編輯可改變抗體或其抗原結合片段的糖基化修飾，進而改變抗體或其抗原結合片段的ADCC功能的細胞，例如，剔除Fut8或GnT-III等基因進行糖基化修飾。
在一些實施方案中，本揭露還提供一種製備前述抗CCR8抗體的方法，該方法包括培養前述的宿主細胞，然後純化回收抗體的步驟。
在另一個方面，本揭露還提供如前任一項所述的抗CCR8抗體、或如前所述的醫藥組成物、或如前所述的免疫偶聯物，在製備用於治
療CCR8相關的疾病或病症的藥物中的用途，具體地，該CCR8相關的疾病或病症為CCR8高表達的疾病或病症，更具體地，該CCR8相關的疾病或病症選自CCR8表達升高的癌症或腫瘤，炎症性疾病和病毒感染。
在另一個方面，本揭露還提供如前任一項所述的抗CCR8抗體、或如前所述的醫藥組成物、或如前所述的免疫偶聯物，在製備用於治療癌症或腫瘤、炎症性疾病和病毒感染的藥物中的用途；較佳地，該癌症或腫瘤選自***癌、膀胱癌、卵巢癌、肺癌(包括非小細胞肺癌和小細胞肺癌)、肝癌、胃癌、結腸癌、腎癌、皮膚纖維肉瘤、骨肉瘤、子宮頸癌、食道癌、直腸癌、頭頸部鱗狀細胞癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤、淋巴瘤和黑色素瘤。
在另一個方面，本揭露還提供一種治療癌症或腫瘤、炎症性疾病和病毒感染的方法，該方法包括向有需要的患者施用如前任一項所述的抗CCR8抗體或如前所述的醫藥組成物、或如前所述的免疫偶聯物；較佳地，該癌症或腫瘤選自***癌、膀胱癌、卵巢癌、肺癌(包括非小細胞肺癌和小細胞肺癌)、肝癌、胃癌、結腸癌、腎癌、皮膚纖維肉瘤、骨肉瘤、子宮頸癌、食道癌、直腸癌、頭頸部鱗狀細胞癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤、淋巴瘤和黑色素瘤。
在另一個方面，本揭露還提供如前任一項所述的抗CCR8抗體、或如前所述的醫藥組成物、或如前所述的免疫偶聯物用作藥物。在一些實施方案中，用作治療癌症或腫瘤，炎症性疾病和病毒感染的藥物。較佳地，該癌症或腫瘤選自***癌、膀胱癌、卵巢癌、肺癌(包括非小細胞肺癌和小細胞肺癌)、肝癌、胃癌、結腸癌、腎癌、皮膚纖維肉瘤、骨肉
瘤、子宮頸癌、食道癌、直腸癌、頭頸部鱗狀細胞癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤、淋巴瘤和黑色素瘤。
術語
為了更容易理解本揭露，以下對某些技術和科學術語進行了描述。除非在本文中另有明確定義，本文使用的全部技術和科學術語具有與所屬技術領域具有通常知識者通常所理解的相同含義。
說明書和申請專利範圍中所用的單數形式“一個”、“一種”和“該”包括複數指代，除非上下文清楚表明並非如此。
除非上下文另外清楚要求，否則在專利說明書和申請專利範圍中，應將詞語“包含”、“具有”、“包括”等理解為“包括但不僅限於”的意義，而不是排他性或窮舉性意義。
術語“和/或”，意指包含“和”與“或”兩種含義。例如短語“A、B和/或C”旨在涵蓋以下方面中的每一個：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(單獨)；B(單獨)；和C(單獨)。
本揭露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
術語“CCR8”指的是全長CCR8蛋白質，人CCR8具有SEQID NO：1的胺基酸序列。來自非人物種(例如，小鼠、猴、兔、狗、豬等等)的CCR8分子的胺基酸序列可得自公共資源。
術語“胺基酸”是指天然存在的和合成的胺基酸，以及以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是由遺傳密碼編碼的那些胺基酸，以及後來修飾的那些胺基酸，例如羥脯胺酸、γ-羧基谷胺酸和O-磷酸絲胺酸。胺基酸類似物是指與天然存在的胺基酸具有相同基本化學結構(即與氫、羧基、胺基和R基團結合的α碳)的化合物，例如高絲胺酸、正亮胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。此類類似物具有修飾的R基團(例如，正亮胺酸)或修飾的肽骨架，但保留與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物是指具有與胺基酸的一般化學結構不同的結構，但是以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用的化學化合物。
術語“胺基酸突變”包括胺基酸取代(也稱胺基酸替換)、缺失、***和修飾。可以進行取代、缺失、***和修飾的任意組合來實現最終構建體，只要最終構建體擁有期望的特性，例如降低或對Fc受體的結合。胺基酸序列缺失和***包括在多肽鏈的胺基端和/或羧基端的缺失和***。具體的胺基酸突變可以是胺基酸取代。在一個實施方式中，胺基酸突變是非保守性的胺基酸取代，即將一個胺基酸用具有不同結構和/或化學特性的另一種胺基酸替換。胺基酸取代包括由非天然存在的胺基酸或由20種天然胺基酸的衍生物(例如4-羥脯胺酸、3-甲基組胺酸、鳥胺酸、高絲胺酸、5-羥賴胺酸)替換。可以使用本領域中公知的遺傳或化學方法生成胺基酸突變。遺傳方法可以包括定點誘變、PCR，基因合成等。預計基因工程以外的改變胺基酸側鏈基團的方法，如化學修飾也可能是可用的。本文中可使用各種名稱來指示同一胺基酸突變。本文中，可採用位置+胺基酸殘基的方式表示特定位點的胺基酸殘基，例如366W，表示在366位點上的
胺基酸殘基為W。T366W則表示第366位點上的胺基酸殘基由原來的T突變為了W。
術語“抗體”以最廣義使用，並且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體，多株抗體；單特異性抗體，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)；全長抗體和抗體片段(或抗原結合片段，或抗原結合部分)，只要它們展現出期望的抗原結合活性。“天然抗體”指天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體是約150,000道爾頓的異四聚糖蛋白，由二硫鍵結合的兩條相同輕鏈和兩條相同重鏈構成。從N至C端，每條重鏈具有一個可變區(VH)，又稱作可變重域、重鏈可變區，接著是重鏈恆定區，天然IgG重鏈恆定區通常含三個恆定域(CH1、CH2和CH3)。類似地，從N至C端，每條輕鏈具有一個可變區(VL)，又稱作可變輕域，或輕鏈可變域，接著是一個恆定輕域(輕鏈恆定區、CL)。術語“全長抗體”、“完整抗體”和“全抗體”在本文可互換使用，指具有與天然抗體結構基本類似的結構或具有如本文所限定的Fc區的重鏈的抗體。天然完整抗體輕鏈包括輕鏈可變區VL及恆定區CL，VL處於輕鏈的胺基末端，輕鏈恆定區包括κ鏈及λ鏈；重鏈包括可變區VH及恆定區(CH1、CH2及CH3)，VH處於重鏈的胺基末端，恆定區處於羧基末端，其中CH3最接近多肽的羧基末端，重鏈可屬任何同種型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4亞型)、IgA(包括IgA1及IgA2亞型)、IgM及IgE。
術語抗體“可變區”或“可變域”指抗體重鏈或輕鏈中涉及抗體結合抗原的域。本文中，抗體重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)各包含四個保守的框架區(FR)和三個互補決定區(CDR)。其中，術語“互補決定區”或“CDR”指可變結構域內主要促成與抗原結合的區域；“框架”或“FR”是指除CDR殘基之外的可變結構域殘基。VH包含3個CDR區：
HCDR1、HCDR2和HCDR3；VL包含3個CDR區：LCDR1、LCDR2和LCDR3。每個VH和VL由從胺基末端(也稱N末端)排到羧基末端(也稱C末端)按以下順序排列的三個CDR和四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
可以藉由各種公知方案來確定CDR的胺基酸序列邊界，例如：“Kabat”編號規則(參見Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)、“Chothia”編號規則、“ABM”編號規則、“contact”編號規則(參見Martin,ACR.Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains[J].2001)和ImMunoGenTics(IMGT)編號規則(Lefranc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)；Front Immunol.2018 Oct 16；9：2278)等；各種編號系統之間的對應關係是所屬技術領域具有通常知識者熟知的，示例性的，如下表1中所示。
除非另有說明，本揭露實施例中的可變區和CDR均適用“Kabat”編號規則。
術語“抗體片段”指不同於完整抗體的分子，其包含完整抗體的部分，該部分與完整抗體所結合的抗原相結合。抗體片段的實例包括但不限於Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab')2、單域抗體、單鏈Fab(scFab)、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體(例如scFv)；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。
術語“Fc區”或“片段可結晶區”用於定義抗體重鏈的C末端區域，包括天然Fc區和改造的Fc區。在一些實施方式中，Fc區包含了相同或不同的兩個亞基。在一些實施方式中，人IgG重鏈的Fc區定義為從Cys226位置處的胺基酸殘基或從Pro230延伸至其羧基末端。用於本文所述抗體的合適Fc區包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4的Fc區。在一些實施方式中，Fc區的邊界還可以變化，例如缺失Fc區的C末端賴胺酸(根據EU編號系統的殘基447)或缺失Fc區的C末端甘胺酸和賴胺酸(根據EU編號系統的殘基446和447)。除非另有說明，Fc區的編號規則為EU編號系統，又稱作EU索引。
術語“嵌合”抗體指抗體中的重和/或輕鏈的一部分自特定的來源或物種衍生，而重和/或輕鏈的剩餘部分自另外的不同來源或物種衍生的抗體。
術語“人源化”抗體是保留非人抗體的反應性同時在人中具有較低免疫原性的抗體。例如，可以藉由保留非人CDR區並用其人對應物(即，恆定區以及可變區的框架區部分)替換抗體的其餘部分來實現。
術語“人抗體”、“人源抗體”、“全人抗體”、“完全人抗體”可以互換使用，意指可變區及恆定區是人序列的抗體。該術語涵蓋源自人基因
但具有，例如，降低可能的免疫原性、增加親和力、消除可能會引起不期望的折疊的半胱胺酸或糖基化位點等序列已發生改變的抗體。該術語涵蓋這些在非人細胞(其可能會賦予不具人細胞特徵的糖基化)中重組產生的抗體。該術語亦涵蓋已在含有一些或所有人免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因座的轉基因小鼠中飼養的抗體。人抗體的含義明確排除包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。
術語“親和力”是指分子(例如，抗體)的單個結合部位與其結合配體(例如，抗原)之間非共價相互作用的總體的強度。除非另外指明，如本文所用，結合“親和力”是指內部結合親和力，其反映出結合對(例如，抗體與抗原)的成員之間1：1相互作用。分子X對其配體Y的親和力通常可以由解離常數(KD)表示。親和力可以藉由本領域已知的常規方法(包括本文所述的那些方法)測量。
如本文所使用的，術語“kassoc”或“ka”指特定抗體-抗原相互作用的締合速率，術語“kdis”或“kd”指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。術語“KD”指解離常數，其獲得自kd與ka的比率(即kd/ka)並且表示為莫耳濃度(M)。可以使用本領域公知的方法測定抗體的KD值。例如，使用生物傳感系統例如系統測量表面電漿共振(例如Biacore)，或藉由溶液平衡滴定法(SET)測量溶液中的親和力。
術語“表面電漿共振”指的是藉由檢測生物傳感器基質內的蛋白質濃度的變化而分析實時相互作用的光學現象，例如，使用BIAcoreTM系統(Biacore LifeSciences division of GE Healthcare，Piscataway，NJ)。
術語“效應子功能”指那些可歸於抗體Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列突變的Fc區)且隨抗體同種型而變化的生物學活性。抗體效應子功能的例子包括但不限於：C1q結合和補體依賴性細胞毒性、Fc受體
結合、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、吞噬作用、細胞表面受體(例如B細胞受體)下調；和B細胞活化。
術語“單株抗體”指基本上均質的抗體的群，即在該群中包含的抗體分子的胺基酸序列是相同的，除了可能少量存在的天然突變以外。相比之下，多株抗體製劑通常包含在其可變結構域具有不同胺基酸序列的多種不同抗體，其通常特異性針對不同表位。“單株”表示從基本上均質的抗體群體獲得的抗體的特徵，並且不應解釋為要求藉由任何特定方法來生產抗體。在一些實施方式中，本揭露提供的抗體是單株抗體。
術語“抗原”是指能夠由諸如抗原結合蛋白(包括例如抗體)的選擇性結合劑結合，且另外能夠用於動物中以產生能夠結合該抗原的抗體的分子或分子部分。抗原可具有一個或多個能夠與不同的抗原結合蛋白(例如抗體)相互作用的表位。
術語“表位”指能夠與抗體或其抗原結合片段特異性結合的抗原上的區域(area或region)。表位可以由連續胺基酸串(線性表位)形成或包含非連續胺基酸(構象表位)，例如因抗原的折疊(即藉由蛋白質性質的抗原的三級折疊)而變成空間接近。構象表位和線性表位的差別在於：在變性溶劑的存在下，抗體對構象表位的結合喪失。表位包含處於獨特空間構象的至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，或8-10個胺基酸。篩選結合特定表位的抗體(即那些結合相同表位的)可以使用本領域例行方法來進行，例如但不限於丙胺酸掃描、肽印跡、肽切割分析、表位切除、表位提取、抗原的化學修飾(見Prot.Sci.9(2000)487-496)、和交叉阻斷。
術語“能夠特異性結合”、“特異性結合”或“結合”是指相比其他抗原或表位，抗體能夠以更高的親和力結合至某個抗原或該抗原的表位。
通常地，抗體以約1×10-7M或更小(例如約1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M或更小)的平衡解離常數(KD)結合抗原或抗原內的表位。在一些實施方式中，抗體與抗原結合的KD為該抗體結合至非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)的KD的10%或更低(例如1%)。可使用已知的方法來測量KD，例如藉由BIACORE®表面電漿共振測定法所測量的。然而，特異性結合至抗原或抗原內的表位的抗體可能對其它相關的抗原具有交叉反應性，例如，對來自其它物種(同源)(諸如人或猴，例如食蟹獼猴(Macaca fascicularis)(cynomolgus，cyno)、黑猩猩(Pan troglodytes)(chimpanzee，chimp))或狨猴(Callithrix jacchus)(commonmarmoset，marmoset)的相應抗原具有交叉反應性。
術語“抗CCR8抗體”和“結合CCR8的抗體”是指能夠以足夠的親和力結合CCR8的抗體。
術語“抗原結合分子”以最廣義使用，涵蓋各種特異性結合抗原的分子，包括但不限於抗體、其他具有抗原結合活性的多肽以及兩者融合而成的抗體融合蛋白。示例性的，本文中的抗原結合分子是雙特異性抗原結合分子(例如：雙特異性抗體)，其可包含兩條相同的第一鏈和兩條相同的第二鏈；或互不相同的第一鏈、第二鏈、第三鏈和第四鏈。示例性的，該鏈是多肽鏈。示例性的，該第一多肽鏈或第三多肽鏈可以是抗體的重鏈或包含Fc區的多肽，該第二多肽鏈或第四多肽鏈可以是抗體的輕鏈或經改造的抗體輕鏈。術語“雙特異性抗原結合分子”指能夠對兩個不同抗原或同一抗原的至少兩個不同抗原表位特異性結合的抗原結合分子。
術語“連接子”、“Linker”或“接頭”指連接兩個多肽片段的連接單元，通常具有一定的柔性，接頭的使用不會使蛋白質結構域原有的功能喪失。在本文中，同一結構中出現的連接子可以是相同或不同的。連接
子可以是肽連接子，其包含一個或多個胺基酸，典型的約1-30個、2-24個或3-15個胺基酸。應用於本文的連接子可以是相同或不同的。
術語“抗體依賴性細胞的細胞毒性”、“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”或“ADCC”是誘導細胞死亡的機制，該機制依賴於抗體包被靶細胞與具有裂解活性的效應細胞(諸如自然殺傷細胞(NK)、單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞)經由效應細胞上表達的Fcγ受體(FcγR)發生的相互作用。例如，NK細胞表達FcγRIIIa，而單核細胞表達FcγRI、FcγRII和FcγRIIIa。本文提供的抗體的ADCC活性可使用體外測定，使用表達抗原的細胞作為靶細胞和NK細胞作為效應細胞進行評定。根據從裂解的細胞中釋放的標記物(例如放射性受質、螢光染料或天然胞內蛋白)來檢測細胞裂解。
術語“抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)”是指藉由吞噬細胞(諸如巨噬細胞或樹突狀細胞)的內化作用消除抗體包被的靶細胞的機制。
術語“補體依賴性細胞毒性”或“CDC”是指誘導細胞死亡的機制，其中靶結合抗體的Fc效應域結合並激活補體成分C1q，C1q繼而激活補體級聯，從而導致靶細胞死亡。補體的激活也可導致補體成分沉積在靶細胞表面上，這些補體成分藉由結合白細胞上的補體受體(例如，CR3)來促進CDC。
術語“核酸”在本文中可與術語“多核苷酸”互換使用，並且是指呈單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術語涵蓋含有已知核苷酸類似物或修飾的骨架殘基或連接的核酸，該核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有與參考核酸相似的結合特性，並且以類似於參考核苷酸的方式代謝。此類類似物的實例包括但不限於硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷
酸、肽-核酸(PNA)。“分離的”核酸指已經與其天然環境的組分分開的核酸分子。分離的核酸包括在下述細胞中含有的核酸分子，該細胞通常含有該核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置的染色體位置處。編碼多肽或融合蛋白的分離的核酸指編碼多肽或融合蛋白的一個或更多個核酸分子，包括在單一載體或分開的載體中的這樣的一個或更多個核酸分子，和存在於宿主細胞中一個或更多個位置的這樣的一個或更多個核酸分子。除非另有說明，否則特定的核酸序列還隱含地涵蓋其保守修飾的變體(例如，簡併密碼子取代)和互補序列以及明確指明的序列。具體地，如下詳述，簡併密碼子取代可以藉由產生如下序列而獲得，在這些序列中，一個或多個所選的(或全部)密碼子的第三位被混合鹼基和/或脫氧肌苷殘基取代。
術語“多肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用，指胺基酸殘基的聚合物。該術語適用於胺基酸聚合物，其中一個或多個胺基酸殘基是相應天然存在的胺基酸的人工化學模擬物，以及適用於天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。除非另外說明，否則特定的多肽序列還隱含地涵蓋其保守修飾的變體。
術語序列“同一性”指，當對兩條序列進行最佳比對時，必要時引入間隙，以獲取最大序列同一性百分比，且不將任何保守性取代視為序列同一性的一部分，兩條序列的胺基酸/核酸在等價位置相同的程度(百分比)。為測定序列同一性百分比，比對可以藉由本領域技術已知的技術來實現，例如使用公開可得到的計算機軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟體。所屬技術領域具有通常知識者可確定適用於測量比對的參數，包括在所比較的序列全長上達成最大比對所需的任何算法。
術語“載體”意指能夠轉運與其連接的另一多核苷酸的多核苷酸分子。一種類型的載體是“質粒”，其是指環狀雙鏈DNA環，其中可以連接附加的DNA區段。另一種類型的載體是病毒載體，例如腺相關病毒載體(AAV或AAV2)，其中另外的DNA區段可以連接到病毒基因組中。某些載體能夠在引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)可以在引入宿主細胞中後整合到宿主細胞的基因組中，從而與宿主基因組一起複製。術語“表達載體”或“表達構建體”是指可對宿主細胞進行轉化，且含有指導和/或控制(連同宿主細胞一起)與其可操作地連接的一個或多個異源編碼區的表達的核酸序列的載體。表達構建體可以包括但不限於影響或控制轉錄、轉譯且在存在內含子時影響與其可操作地連接的編碼區的RNA剪接的序列。
術語“宿主細胞”、“宿主細胞系”和“宿主細胞培養物”可互換使用，並且指已經導入外源核酸的細胞，包括此類細胞的後代。宿主細胞包括“轉化體”和“經轉化的細胞”，其包括原代的經轉化的細胞及自其衍生的後代，而不考慮傳代的次數。後代在核酸內容物上可以與親本細胞不完全相同，而是可以含有突變。本文中包括具有與在初始轉化細胞中篩選或選擇的相同功能或生物學活性的突變體後代。宿主細胞包括原核和真核宿主細胞，其中真核宿主細胞包括但不限於哺乳動物細胞、昆蟲細胞系植物細胞和真菌細胞。哺乳動物宿主細胞包括人、小鼠、大鼠、犬、猴、豬、山羊、牛、馬和倉鼠細胞，包括但不限於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NSO、SP2細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細胞(例如，Hep G2)、A549細胞、3T3細胞和HEK-293細胞。真菌細胞包括酵母和絲狀真菌細胞，包括例如巴氏畢赤酵母
(Pichiapastoris)、芬蘭畢赤酵母(Pichia finlandica)、海藻畢赤酵母(Pichia trehalophila)、科克拉馬畢赤酵母(Pichia koclamae)、膜狀畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)、小畢赤酵母(Pichia minuta)(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、仙人掌畢赤酵母(Pichiaopuntiae)、耐熱畢赤酵母(Pichia thermotolerans)、柳畢赤酵母(Pichia salictaria)、Pichia guercuum、皮傑普畢赤酵母(Pichia pijperi)、具柄畢赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)、畢赤酵母屬、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、釀酒酵母屬、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、克魯維酵母屬、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、構巢麯黴(Aspergillus nidulans)、黑麯黴(Aspergillus niger)、米麯黴(Aspergillus oryzae)、裡氏木黴(Trichoderma reesei)、勒克氏菌(Chrysosporium lucknowense)、鐮刀菌屬(Fusarium sp.)、禾穀鐮刀菌(Fusarium gramineum)、菜鐮刀菌(Fusarium venenatum)、小立碗蘚(Physcomitrella patens)和粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)。畢赤酵母屬、任何釀酒酵母屬、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、任何克魯維酵母屬、白色念珠菌(Candida albicans)、任何麯黴屬、裡氏木黴(Trichoderma reesei)、勒克黴菌(Chrysosporium lucknowense)、任何鐮刀菌屬、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)。
如在本申請中所使用的，表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可以互換使用，並且所有這樣的名稱均包括子代。因而，詞語“轉化體”和“轉化的細胞”包括原代受試者細胞和來源於其的培養物，而與傳代的次數無關。還應理解的是，由於有意或無意的突變，使得並非所有子代均具
有完全相同的DNA內容物。包括與原始轉化細胞具有相同功能或生物活性的突變子代。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。
術語“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述的抗CCR8抗體融合蛋白與其他化學組分的混合物，該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。
術語“藥學上可接受的載體”指藥學配製劑中與活性成分不同的，且對受試者無毒的成分。藥學可接受載劑包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
術語“受試者”或“個體”包括人類和非人類動物。非人動物包括所有脊椎動物(例如哺乳動物和非哺乳動物)例如非人靈長類(例如，食蟹猴)、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物和爬行動物。除非指出時，否則該術語“患者”或“受試者”在本文中可互換地使用。如本文所使用的，術語“食蟹猴(cyno)”或“食蟹猴(cynomolgus)”是指食蟹猴(Macaca fascicularis)。在某些實施方案中，個體或受試者是人。
“施用”或“給予”，當其應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。
術語“樣本”是指從受試者分離的類似流體、細胞、或組織的採集物，以及存在於受試者體內的流體、細胞或組織。示例性樣本為生物流體，諸如血液、血清和漿膜液、血漿、淋巴液、尿液、唾液、囊液、淚液、***物、痰、分泌組織和器官的黏膜分泌物、***分泌物、腹水、胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它體腔的流體、由支氣管灌洗液收集的流體、
滑液、與受試者或生物來源接觸的液體溶液，例如細胞和器官培養基(包括細胞或器官條件培養基)、灌洗液等，組織活檢樣本、細針穿刺、手術切除的組織、器官培養物或細胞培養物。
“治療(treatment或treat)”和“處理”(及其語法變型)指試圖改變所治療個體的天然過程的臨床干預，並且可以為了預防或者在臨床病理學的過程期間實施。治療的期望效果包括但不限於預防疾病的發生或再發生，減輕症狀，減輕/減少疾病的任何直接或間接病理後果，預防轉移，降低疾病進展速率，改善或減輕疾病狀態，和消退或改善的預後。在一些實施方案中，使用本揭露的抗體來延遲疾病的形成或減緩疾病的進展。
“有效量”一般是足以降低症狀的嚴重程度及/或頻率、消除這些症狀及/或潛在病因、預防症狀及/或其潛在病因出現及/或改良或改善由疾病狀態引起或與其相關的損傷(例如肺病)的量。在一些實施例中，有效量是治療有效量或預防有效量。“治療有效量”是足以治療疾病狀態或症狀、尤其與該疾病狀態相關的狀態或症狀，或者以其他方式預防、阻礙、延遲或逆轉該疾病狀態或以任何方式與該疾病相關的任何其他不理想症狀的進展的量。“預防有效量”是當給予受試者時將具有預定預防效應，例如預防或延遲該疾病狀態的發作(或復發)，或者降低該疾病狀態或相關症狀的發作(或復發)可能性的量。完全治療或預防效未必在給予一個劑量之後便發生，可能在給予一系列劑量之後發生。因而，治療或預防有效量可以一次或多次給予的方式給予。“治療有效量”和“預防有效量”可取決於多種因素變化：諸如個體的疾病狀態、年齡、性別和體重，以及治療劑或治療劑組合在個體中引發期望的應答的能力。有效治療劑或治療劑組合的示例性指標包括例如患者改善的健康狀況。
示例性的抗CCR8抗體
一方面，本揭露提供一種抗CCR8抗體，其包含：
SEQ ID NO：10所示的重鏈可變區中所包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，和SEQ ID NO：11所示的輕鏈可變區中所包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3。
在另一個方面，本揭露提供一種抗CCR8抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：14、15和16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：17、18和19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方案中，如前所述的抗CCR8抗體，其為鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體，較佳為人源化抗體。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體，其為人源化抗體。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體，其包含人抗體的框架區(FR)。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體，其中，
該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：14、15和16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，且該重鏈可變區的FR包含視需要自1E、27F、28S、30T、71K、73K、78V、44G和49G中的一個或多個胺基酸突變；和
該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：17、18和19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該輕鏈可變區的FR包含視需要自43S、45K、46P、47W、58V、60A、71Y和49Y中的一個或多個回復突變；
上述的回復突變位點或胺基酸突變位點依據Kabat編號規則。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體，其包含人抗體的框架區(FR)；
較佳地，該抗體包含與SEQ ID NO：26、27或28具有至少80%(例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的重鏈可變區序列，和包含與SEQ ID NO：29、30、31或32具有至少80%(例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的輕鏈可變區序列。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體包含：
該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體，其中該抗CCR8抗體是抗體片段；較佳地，其中該抗體片段為Fab、Fab’、F(ab')2、Fd、Fv、scFv、dsFv或dAb。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體，其包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體，其包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區，該重鏈恆定區為人IgG1恆定區，其包含選自可以增強ADCC的突變S298A/E333A/K334A和S239D/I332E中的一個或多個胺基酸取代，其中該胺基酸取代位點按照EU編號。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體，其包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區，該重鏈恆定區包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列，和/或該輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：45的胺基酸序列。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體，其包含重鏈和輕鏈，其中，
該重鏈包含與SEQ ID NO：46具有至少85%(例如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈包含與SEQ ID NO：47具有至少85%(例如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，如上任一項所述的抗CCR8抗體，其包含如SEQ ID NO：46所示的重鏈，和如SEQ ID NO：47所示的輕鏈胺基酸序列。
在另一個方面，本揭露還提供一種如前所述的抗CCR8抗體，其具有一種或更多種以下特性：
A.該抗CCR8抗體與猴CCR8有交叉結合活性；較佳地，與細胞表面的猴CCR8蛋白的結合EC50值小於1nM；更佳地，與細胞表面的猴CCR8蛋白的結合EC50值小於0.5nM；
B.該抗CCR8抗體與如SEQ ID NO：65所示的人CCR8的環2結合；和
C.該抗CCR8抗體與如SEQ ID NO：66所示的人CCR8的環3結合。
抗體結構
在某些實施方案中，本文中提供的抗體是全長抗體。
在某些實施方案中，本文中提供的抗體是抗體片段。
在一個實施方案中，抗體片段是Fab、Fab'、Fab'-SH或F(ab')2片段，特別是Fab片段。“Fab”，其是由VL、VH、CL和CH1結構域組成
的單價片段。“Fab片段”可以是抗體經木瓜蛋白酶裂解產生的。“Fab'”含有VL、CL以及VH和CH1，還含有CH1和CH2結構域之間的區域，以使得在兩個Fab'片段的兩條重鏈之間可以形成鏈間二硫鍵，以形成F(ab')2分子。“Fab'-SH”是其中恆定區的半胱胺酸殘基具有游離巰基的Fab'片段。“F(ab')2”包含在鉸鏈區藉由二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段。
在另一個實施方案中，抗體片段是雙抗體，三抗體或四抗體。雙抗體是具有兩個抗原結合位點的抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(VH-VL)中包含相連的VH和VL。藉由使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個結構域之間不能配對，迫使這些結構域與另一條鏈的互補結構域配對，從而產生兩個抗原結合位點，兩個抗原可以是相同或不同的。
在另一個實施方案中，抗體片段是單鏈Fab片段。“單鏈Fab片段”或“scFab”是由VH，CH1，VL，CL和接頭組成的多肽，其中該抗體域和該接頭在N端至C端方向具有以下順序之一：a)VH-CH1-接頭-VL-CL，b)VL-CL-接頭-VH-CH1，c)VH-CL-接頭-VL-CH1或d)VL-CH1-接頭-VH-CL。在一個實施方式中，該接頭是具有至少30個胺基酸的多肽。在另一個實施方式中，該接頭是具有32至50個胺基酸之間的多肽。該單鏈Fab片段經由CL和CH1之間的天然二硫鍵而被穩定化。另外，藉由***半胱胺酸殘基(例如在重鏈可變區中的位置44和輕鏈可變區中的位置100，根據Kabat編號)產生鏈間二硫鍵，這些單鏈Fab分子可以進一步被穩定化。
在另一個實施方案中，抗體片段是由抗體的單臂的VH和VL結構域組成的Fv片段。
在另一個實施方案中，抗體片段是單鏈可變片段(scFv)。“scFv”是包含至少一個含有輕鏈可變區的抗體片段和至少一個含有重鏈可變區的抗體片段的融合蛋白，其中輕鏈可變區和重鏈可變區藉由短的柔性肽接頭連續連接，能夠表達為單鏈多肽，並且其中scFv保持其所源自的完整抗體的特異性。除非特別指出，否則在本文中scFv可以以任何一種順序具有VL和VH可變區，例如相對於多肽的N端和C端，scFv可以包含VL-接頭-VH或可以包含VH-接頭-VL。
在另一個實施方案中，抗體片段是dsFv，dsFv是藉由將其中每個VH和VL中的一個胺基酸殘基被半胱胺酸殘基取代的多肽經由半胱胺酸殘基之間的二硫鍵相連而獲得的。可以按照已知方法(Protein Engineering.7：697(1994))基於抗體的三維結構預測來選擇被半胱胺酸殘基取代的胺基酸殘基。
在另一個實施方案中，抗體片段是單域抗體(dAb)。單域抗體是包含抗體的整個或部分重鏈可變域或整個或部分輕鏈可變域的抗體片段。
在某些實施方案中，本文中提供的抗體是嵌合抗體。在一個例子中，嵌合抗體包含非人可變區(例如自小鼠、大鼠、倉鼠、家兔、或非人靈長類，諸如猴衍生的可變區)和人恆定區。在又一個例子中，嵌合抗體是“類轉換的”抗體，其中類或亞類已經自親本抗體的類或亞類改變。
在某些實施方案中，抗體是人源化抗體。通常，將非人抗體藉由人源化以降低對人的免疫原性，同時保留親本非人抗體的特異性和親和力。一般地，人源化抗體包含一個或多個可變區，其中CDR或其部分衍
生自非人抗體，而FR或其部分衍生自人抗體。視需要地，人源化抗體還會包含人恆定區的一部分。在一些實施方案中，可將人源化抗體中的一些FR殘基用來自非人抗體(例如提供CDR序列的抗體)的相應殘基替代。
人源化抗體及其生成方法綜述於如Almagro and Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008)，並且進一步記載於如Riechmann等，Nature 332：323-329(1988)；Queen等，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Kashmiri等，Methods 36：25-34(2005)(描述了特異性決定區(SDR)嫁接)；Padlan,Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述了“再表面”(resurfuacing))；Dall’Acqua等，Methods 36：43-60(2005)(描述了“FR改組”)；和Osbourn等，Methods 36：61-68(2005)和Klimka等，Br.J.Cancer 83：252-260(2000)(描述了FR改組的“引導選擇”方法)。
可以用於人源化的人框架區包括但不限於：使用“最佳擬合(best-fit)”方法選擇的框架區(見例如Sims等，J.Immunol.151：2296(1993))；衍生自輕鏈可變區或重鏈可變區的特定亞組的人抗體的共有序列的框架區(見例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；和Presta等，J.Immunol.,151：2623(1993))；人成熟的(體細胞突變的)框架區或人種系框架區(見例如Almagro and Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；和藉由篩選FR文庫獲得的框架區(見例如Baca等，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)和Rosok等，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
在某些實施方案中，本文中提供的抗體是多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體是對至少兩種不同位點(即不同抗原上的
不同表位或相同抗原上的不同表位)具有結合特異性的單株抗體。在某些實施方案中，多特異性抗體具有三種或更多種結合特異性。在某些實施方案中，結合特異性之一針對CCR8，而其它特異性針對任何其它抗原。在某些實施方案中，雙特異性抗體可以結合CCR8的兩種(或更多種)不同表位。也可以使用多特異性(例如雙特異性)抗體來將細胞毒性藥劑或細胞定位於表達CCR8的細胞。多特異性抗體可以以全長抗體或抗體片段製備。
用於生成多特異性抗體的技術包括但不限於具有不同特異性的兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈的重組共表達(見Milstein and Cuello,Nature 305：537(1983))，和“杵臼”工程化(見例如美國專利No.5,731,168和Atwell等，J.Mol.Biol.270：26(1997))。也可以藉由用於生成抗體Fc-異二聚體分子的工程化靜電操縱效應(見例如WO 2009/089004)；交聯兩種或更多種抗體或片段(見例如美國專利No.4,676,980和Brennan等，Science,229：81(1985))；使用亮胺酸拉鍊來生成雙特異性抗體(見例如Kostelny etal.,J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992)和WO 2011/034605)；使用共同輕鏈技術來規避輕鏈錯配問題(見例如WO 98/50431)；使用用於生成雙特異性抗體片段的“雙抗體”技術(見例如Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；和使用單鏈Fv(sFv)二聚體(參見，例如Gruber等，J.Immunol.,152：5368(1994))；和例如Tutt等J.Immunol.147：60(1991)中所描述的，製備三特異性抗體來生成多特異性抗體。
抗CCR8抗體的變體
在某些實施方案中，涵蓋本文中提供的抗CCR8抗體或其融合蛋白的胺基酸序列變體。例如，可以期望改善抗體的結合親和力和/或其
它生物學特性。可以藉由將合適的修飾引入編碼抗體的核苷酸序列中，或者藉由肽合成來製備抗體的胺基酸序列變體。此類修飾包括例如對抗CCR8抗體或其融合蛋白的胺基酸序列內的殘基的刪除、和/或***、和/或取代。可以進行刪除、***、和取代的任何組合以得到最終的構建體，只要最終的構建體擁有期望的特徵，例如抗原結合特性。
取代、***、和刪除變體
在某些實施方案中，提供了具有一處或多處胺基酸取代的抗體變體。取代誘變感興趣的位點包括CDR和FR。保守取代在表3中在“較佳的取代”的標題下顯示。更實質的變化在表2中在“示例性取代”的標題下提供，並且如下文參照胺基酸側鏈類別進一步描述的。可以將胺基酸取代引入感興趣的抗體中，並且對產物篩選期望的活性，例如保留/改善的抗原結合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。
依照常見的側鏈特性，胺基酸可以如下分組：
(1)疏水性的：正亮胺酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性，親水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性的：Asp，Glu；
(4)鹼性的：His，Lys，Arg；
(5)影響鏈取向的殘基：Gly，Pro；
(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。
非保守取代會需要用這些類別之一的成員替換另一個類別的成員。
一類取代變體涉及取代親本抗體(例如人源化或人抗體)的一個或多個CDR殘基。一般地，經選擇用於進一步研究的所得變體相對於親本抗體會具有某些生物學特性(例如升高的親和力，降低的免疫原性)的改變(例如改善)，和/或會基本上保留親本抗體的某些生物學特性。一
種例示性的取代變體是親和力成熟的抗體，可以例如使用基於噬菌體展示的親和力成熟技術(如本文所述的那些技術)，便利地產生該抗體。簡言之，將一個或多個CDR殘基突變，並將變體抗體在噬菌體上展示，並對其篩選特定的生物學活性(例如結合親和力)。可以對CDR做出改變(例如取代)，例如以改善抗體親和力。可以對CDR“熱點”，即在體細胞成熟過程期間以高頻率經歷突變的密碼子所編碼的殘基，和/或接觸抗原的殘基做出此類改變，同時對所得的變體VH或VL測試結合親和力。在親和力成熟的一些實施方案中，藉由多種方法(例如易錯PCR、鏈改組、或寡核苷酸指導的誘變)的任一種，將多樣性引入所選擇用於成熟的可變基因中。然後，創建次級文庫。然後，篩選文庫以鑑定具有期望的親和力的任何抗體變體。另一種引入多樣性的方法涉及CDR定向的方法，其中將幾個CDR殘基(例如一次4-6個殘基)隨機化。可以例如使用丙胺酸掃描誘變或建模來特異性鑑定涉及抗原結合的CDR殘基。特別地，經常靶向HCDR3和LCDR3。
在某些實施方案中，取代、***或缺失可以在一個或多個CDR內發生，只要此類變化不實質性降低抗體結合抗原的能力。例如，可以對CDR做出保守變化(例如保守取代，如本文中提供的)，其不實質性降低結合親和力。此類變化可以例如在CDR中的抗原接觸殘基外部。在上文提供的變體VH和VL序列的某些實施方案中，每個CDR是未改變的，或者含有不超過1、2或3處胺基酸取代。
一種可用於鑑定抗體中可以作為誘變靶位的殘基或區域的方法稱作“丙胺酸掃描誘變”。在這種方法中，鑑定一個殘基或靶殘基組(例
如帶電荷的殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，並且用中性或帶負電荷的胺基酸(例如，Ala或聚丙胺酸)替換以確定該抗體與抗原的相互作用是否受影響。可以在對初始取代顯示功能敏感性的胺基酸位置引入進一步的取代。此外，可藉由研究抗原-抗體複合物的晶體結構來鑑定抗體與抗原間的接觸點。這些接觸殘基及鄰近殘基可以作為取代候選物被打靶或消除。可以篩選變體以確定它們是否含有期望的特性。
胺基酸序列***包括長度範圍為1個殘基至含有100或更多個殘基的多肽的胺基和/或羧基端融合，和單個或多個胺基酸殘基的序列內***。末端***的例子包括具有N端甲硫胺醯基殘基的抗體。抗體分子的其它***變體包括抗體的N或C端與酶或延長抗體的血清半衰期的多肽的融合物。
Fc區的修飾
在一個方面，本揭露的抗CCR8抗體或抗CCR8抗體融合蛋白的Fc區包含一個或多個胺基酸取代，該一個或多個胺基酸取代增加其與Fc受體的結合，例如其與Fcγ受體的結合。天然IgG Fc區，具體地是IgG1 Fc區或IgG4 Fc區，可能導致本揭露的融合蛋白靶向表達Fc受體的細胞，而不是表達抗原的細胞。在一些實施方案中，本揭露改造的Fc區表現出增加的對Fc受體的結合親和力和/或增加的效應子功能。
重組方法
抗CCR8抗體或抗CCR8抗體融合蛋白可以使用重組方法來產生。對於這些方法，提供編碼多肽或融合蛋白的一個或更多個分離的核酸。
在一個實施方案中，本揭露提供了編碼如前所述的抗CCR8抗體或抗CCR8抗體融合蛋白的分離的核酸。此類核酸可以給自獨立的編碼前述的任一多肽鏈。在另一方面中，本揭露提供了包含此類核酸的一種或多種載體(例如表達載體)。在另一方面中，本揭露提供了包含此類核酸的宿主細胞。在一個實施方案中，提供製備多肽或融合蛋白的方法，其中該方法包括，在適合表達的條件下，培養包含編碼該多肽或融合蛋白的核酸的宿主細胞，如上文所提供的，和視需要地從宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗CCR8抗體或抗CCR8抗體融合蛋白。
為了重組產生抗CCR8抗體或抗CCR8抗體融合蛋白，將編碼蛋白的核酸分離並***一個或更多個載體中，用於在宿主細胞中進一步選殖和/或表達。此類核酸可以使用常規程序容易地分離和測序，或者藉由重組方法產生或藉由化學合成獲得。
用於選殖或表達編碼抗CCR8抗體或抗CCR8抗體融合蛋白的載體的適當宿主細胞包括本文描述的原核或真核細胞。例如，可在細菌中產生，特別是當不需要糖基化和Fc效應子功能時。在表達後，可以在可溶級分中從細菌細胞糊狀物分離，並且可進一步純化。
除了原核生物以外，真核微生物諸如絲狀真菌或酵母也是用於編碼融合蛋白的載體的合適的選殖或表達宿主，包括真菌和酵母菌株。適於表達融合蛋白的合適的宿主細胞也可源自多細胞生物體(無脊椎動物和脊椎動物)；無脊椎動物細胞的例子包括植物和昆蟲細胞。已經鑑定了許多杆狀病毒株，其可與昆蟲細胞聯合使用，特別是用於草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞的轉染；還可利用植物細胞培養物作為宿主，例如US5959177、US 6040498、US6420548、US 7125978和US6417429；也可將脊椎動物細胞用作宿主，例如適應於在懸浮液中生長
的哺乳動物細胞系。適宜的哺乳動物宿主細胞系的其它例子是經SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7)；人胚腎系(293或293T細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)細胞(TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；水牛鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL3A)；人肺細胞(W138)；人肝細胞(Hep G2)；小鼠***腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞；MRC 5細胞；和FS4細胞。其它適宜的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR-CHO細胞；以及骨髓瘤細胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。關於適合產生抗體的某些哺乳動物宿主細胞系的綜述參見例如Yazaki，P.和Wu，A.M.，Methods in Molecular Biology，Vol.248，Lo，B.K.C.(編)，Humana Press，Totowa，NJ(2004)，第255-268頁。
測定
本文提供的抗CCR8抗體或抗CCR8抗體融合蛋白可以藉由本領域已知的多種測定法對其物理/化學特徵和/或生物學活性進行鑑定、篩選或表徵。在一個方面中，例如藉由已知方法如ELISA、蛋白印跡法等，測試本揭露的抗CCR8抗體或抗CCR8抗體融合蛋白活性。
治療方法與施用途徑
本揭露的抗CCR8抗體(和任何另外的治療劑)可藉由任何合適的手段施用，包括腸胃外、肺內和鼻內，並且如果需要局部治療，則病灶內施用。腸胃外輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下施用。給藥可以藉由任何適當的途徑，例如，藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射，這部分取決於施用是短期的還是長期的。本文考慮多種給藥時間方案，包括但不限於，單次或在多個時間點多次施用，推注施用和脈衝輸注。
本揭露的抗CCR8抗體將以符合良好醫療實踐的方式配製、給藥和施用。在此背景下考慮的因素包括所治療的具體病症、所治療的具體哺乳動物、個體患者的臨床狀況、病症的起因、試劑的遞送部位、施用方法、施用時間安排以及醫學從業者已知的其他因素。多肽或融合蛋白可以與或不與目前用於預防或治療該病症的一種或更多種試劑一起配製。此類其它試劑的有效量取決於醫藥組成物中存在的量、病症或治療的類型以及其它因素。這些通常以與本文所述相同的劑量和施用路徑使用，或以本文所述劑量的約1%至99%使用，或以其它劑量使用，並藉由經驗/臨床確定為合適的任何途徑使用。
為了預防或治療疾病，本揭露的抗CCR8抗體(當單獨使用或與一種或更多種其他另外的治療劑組合使用時)的適當的劑量將取決於待治療的疾病的類型，治療分子的類型，疾病的嚴重性和病程，是為預防還是治療目的施用，之前的治療，患者的臨床病史和對治療分子的響應，和主治醫師的判斷。治療分子恰當地以一次或經過一系列治療施用於患者。
製品
在本揭露的另一方面中，提供一種製品，該製品包含可用於治療、預防和/或診斷上述病症的材料。該製品包含容器和在容器上或與容器聯合的標簽或包裝插頁(package insert)。合適的容器包括，例如，瓶子、管形瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以自各種材料諸如玻璃或塑料形成。容器裝有單獨或與另一種組成物組合有效治療，預防和/或診斷疾患的組成物，並且可具有無菌的存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射針可刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或管形瓶)。組成物中的至少一種活性試劑是本揭露的抗CCR8抗體或抗CCR8抗體融合蛋白。標簽或包裝插頁指示使用該組成物是來治療選擇的病況。此外，製品可以包含：(a)其中裝有
組成物的第一容器，其中所述組成物包含本揭露的抗CCR8抗體或抗CCR8抗體融合蛋白；和(b)其中裝有組成物的第二容器，其中該組成物包含另外的細胞毒性劑或其他方面的治療劑。本揭露的該實施方案中的製品可進一步包含包裝插頁，該包裝插頁指示該組成物可以用於治療特定病況。備選地，或另外地，製品可進一步包含第二(或第三)容器，該第二(或第三)容器包含藥學上可接受的緩衝液。從商業和用戶立場，它可進一步包括所需的其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。
實施例與測試例
以下結合實施例和測試例進一步描述本揭露，但這些實施例和測試例並非限制著本揭露的範圍。本揭露實施例和測試例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例1、CCR8融合蛋白和穩轉細胞的製備
1.1 相關蛋白序列
不帶標簽的人CCR8基因、人CCR4基因、猴CCR8基因轉染到CHOK1和/或HEK293細胞中，形成在細胞表面表達不同種屬CCR8或人CCR4蛋白的CHOK1或HEK293細胞株，用於後續抗體的篩選和鑑定。把Gqi5基因和人CCR8基因轉染到CHOK1細胞上，形成的CHOK1-hCCR8-Gq細胞用於鈣流抑制實驗檢測。把人CCR8基因和Luc-GFP基因轉染到HEK293細胞上，形成的HEK293-hCCR8/Luc-GFP細胞用於PBMC ADCC殺傷實驗檢測。同時人或猴CCR8蛋白N端序列和Fc標簽
分別株到哺乳動物細胞表達載體中，在293E細胞中表達純化後，獲得Fc融合蛋白用於後續各實施例的實驗中。相關蛋白胺基酸序列如下：
CHOK1/HEK293細胞表面表達人CCR8蛋白序列如下：
CHOK1細胞表面表達猴CCR8蛋白序列如下：
CHOK1細胞表面表達人CCR4蛋白序列如下：
CHOK1-hCCR8細胞表面表達Gqi5蛋白序列如下：
HEK293-hCCR8細胞表面表達Luc-GFP的基因序列如下：
人CCR8 N端-人Fc(下文簡稱hCCR8-hFc)蛋白序列如下：
人CCR8 N端-小鼠Fc(下文簡稱hCCR8-mFc)蛋白序列如下：
註釋：信號肽+
+
+
猴CCR8 N端-人Fc(下文簡稱cynoCCR8-hFc)蛋白序列如下：
註釋：信號肽+
+
+
猴CCR8 N端-小鼠Fc(下文簡稱cynoCCR8-mFc)蛋白序列如下：
註釋：信號肽+
+
+
。
以上單下劃線為信號肽，雙下劃線為胞外區N端，波浪線為連接肽，點劃線為相應的Fc片段。
1.2 相關蛋白的純化
含Fc的蛋白、嵌合抗體及融合瘤抗體的純化。
將細胞表達上清樣品高速離心去除雜質，含Fc的重組蛋白、嵌合抗體表達上清用Protein A管柱進行純化，融合瘤表達上清用Protein G管柱進行純化。上清液以一定流速上管柱。用PBS沖洗管柱，至A280讀數降至基線。用pH 3.0的100mM乙酸沖提目的蛋白，用pH 8.0的1M Tris-HCl中和。沖提樣品濃縮換成PBS後分裝備用。
實施例2、小鼠抗人CCR8單株抗體的製備
使用人CCR8過表達的HEK293及CHOK1細胞系及人或猴CCR8 N端和人Fc融合蛋白免疫SJL小鼠。免疫5次後取血測定血清中抗體的效價，選擇血清中抗體滴度高並且滴度趨於平臺的小鼠進行脾細胞融合，將融合好的融合瘤細胞鋪在96孔細胞培養板中，置於37℃，5%CO2培養箱中進行培養。取細胞培養上清液藉由Mirrorball進行檢測。將篩選出的陽性株進行擴增凍存保種和二到三次亞選殖直至獲得單細胞株。選擇出的融合瘤株用無血清細胞培養法進一步製備和純化抗體。得到的融合瘤抗體用FACS檢測抗體與人和猴CCR8過表達細胞系的結合情況(方法見本揭露測試例1和測試例2)，挑選出結合活性和阻斷活性好的融合瘤細胞株。
選擇單株融合瘤細胞株mAbCP11和mAb28株單株抗體的序列。過程如下：收集對數生長期融合瘤細胞，用Trizol(Invitrogen,Cat# 15596-018)提取RNA，反轉錄為cDNA。用cDNA為模板進行PCR擴增後送測序公司測序，得到的DNA序列對應的抗體的可變區胺基酸序列如下：
mAbCP11重鏈可變區的胺基酸序列：
mAb CP11輕鏈可變區的胺基酸序列：
mAb28重鏈可變區的胺基酸序列：
mAb28輕鏈可變區的胺基酸序列：
將上述mAbCP11和mAb28候選分子可變區序列分別藉由PCR擴增VH/VK序列，再與表達載體pTT5(帶信號肽及hIgG1/hkappa恆定區基因(CH1-Fc/CL)片段)進行同源重組。示範性地，人重鏈IgG1恆定區序列如SEQ ID NO：44所示，人輕鏈κ恆定區序列如SEQ ID NO：45所示，構建重組嵌合抗體全長表達質粒VH-CH1-Fc-pTT5/VL-CL-pTT5，進而獲得其嵌合抗體ChCP11和Ch28。
實施例3、抗人CCR8單株抗體的人源化設計
鼠源單株抗體人源化根據本領域許多文獻公示的方法進行。簡言之，在所獲得的鼠源抗體VH/VL CDR典型結構的基礎上，從人源種
系數據庫中搜索輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)的同源序列，將鼠源抗體的CDR區移植到人源模板上，並對VL和VH的部分胺基酸進行取代，將鼠源抗體的恆定區替換為人恆定區，得到最終的人源化分子。
1.抗體mAbCP11的人源化
鼠源抗體mAbCP11的人源化抗體選擇IGHV2-26*01或IGHV4-30-4*01的FR1、FR2、FR3，和IGHJ6*01的FR4作為重鏈框架區模板；選擇IGKV6-21*01或IGKV1-39*01或IGKV3-20*02的FR1、FR2、FR3和IGKJ4*01的FR4作為輕鏈框架區模板。視需要地，對人源化抗體的重鏈可變區的FR區上第1、27、28、30、44、49、71、73和/或78位(根據Kabat編號系統編號)的胺基酸殘基進行取代；和/或對人源化抗體的輕鏈可變區的FR區上第43、45、46、47、49、58、60和/或71位的胺基酸殘基進行取代。
採用表4的回復突變設計得到不同的人源化重鏈可變區和輕鏈可變區，按表5進行可變區組合得到不同的抗體分子：
人源化及突變後的可變區具體序列如下：
>hCP11VH1(SEQ ID NO：26)：
>hCP11VH2(SEQ ID NO：27)：
>hCP11VH3(SEQ ID NO：28)：
>hCP11VL1(SEQ ID NO：29)：
>hCP11VL2(SEQ ID NO：30)：
>hCP11VL3(SEQ ID NO：31)：
>hCP11VL4(SEQ ID NO：32)：
2.抗體mAb28人源化
鼠源抗體mAb28人源化抗體的重鏈模版選擇人IGHV3-72*01或IGHV3-66*01或IGHV3-23*01或IGHV7-4-1*01的FR1、FR2、FR3，和IGHJ6*01的FR4區；輕鏈的模版選擇人的IGKV2-28*01或
IGKV3-11*01或IGKV1-39*01的FR1、FR2、FR3，和IGKJ4*01的FR4區。視需要地，對人源化抗體的重鏈可變區上第27、29、31、48、69、71、75和/或93位(根據Kabat編號系統編號)的胺基酸殘基進行取代；和/或對人源化抗體的輕鏈可變區上第4、27c、29、36、43、45、51、60、93和/或100位的胺基酸殘基進行取代。
其中，以上突變包括對h28抗體輕鏈可變區的CDR進行選自L27c A、G29R、M51K和E93Q的突變。對h28重鏈可變區的HCDR1進行P31I的突變，得到如下的CDR組合：
採用表6的突變設計得到不同的人源化重鏈可變區和輕鏈可變區，按表8進行可變區組合得到不同的抗體分子。
人源化及突變後的具體序列如下：
>h28VH1(SEQ ID NO：37)
>h28VH2(SEQ ID NO：38)
>h28VH3(SEQ ID NO：39)
>h28VH4(SEQ ID NO：40)
>h28VL1(SEQ ID NO：41)
>h28VL2(SEQ ID NO：42)
>h28VL3(SEQ ID NO：43)
實施例4、人源化抗體的製備
4.1 人源化抗體的序列
分別構建抗體輕鏈和重鏈的表達載體，將人源化的抗體輕/重鏈分別交叉配對組合，轉染293E細胞後收集培養上清純化即得到人源化的全長抗體。人源化抗體重鏈恆定區可選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4恆定區，示例性的，使用人重鏈IgG1恆定區，人源化抗體輕鏈恆定區可選自選自人源κ和λ鏈恆定區，示例性的抗體的恆定區序列如下：
人IgG1重鏈恆定區的胺基酸序列
人輕鏈κ恆定區的胺基酸序列：
示例性的，將前述mAbCP11或mAb28的人源化抗體重鏈可變區與人重鏈IgG1恆定區(序列如SEQ ID NO：44所示)融合形成抗體全長重鏈，將人源化抗體輕鏈可變區與人輕鏈κ恆定區(序列如SEQ ID NO：45所示)融合形成抗體全長輕鏈，得到mAbCP11和mAb28人源化抗體，用於後續實驗的測試，最終選出活性最好的人源化抗體，其完整序列如下：
抗體hCP11-7：
hCP11-7重鏈序列：
hCP11-7輕鏈序列：
抗體h28-3：
h28-3重鏈序列：
h28-3輕鏈序列：
示例性的，本揭露中的人源化抗體經體外酶切，降解得到Fab片段。人源化抗體Fab片段序列如下：
hCP11-7Fab序列
hCP11-7-Fab重鏈：
hCP11-7-Fab輕鏈：
h28-3-Fab序列
h28-3-Fab重鏈：
h28-3-Fab輕鏈：
示例性的，本揭露中使用鼠mIgG2a恆定區與人源化可變區融合，得到mIgG2a形式的抗體，用於在小鼠體內進行抑瘤活性評價。mIgG2a形式的抗體序列如下：
hCP11-7-mIgG2a重鏈序列：
hCP11-7-mIgG2a輕鏈序列：
h28-3-mIgG2a重鏈序列：
h28-3-mIgG2a輕鏈序列：
4.2、對照抗體的序列和製備
專利WO2021194942A1的人源化抗體4A19作為本揭露的對照分子，其輕重鏈胺基酸序列如下：
4A19重鏈序列：
4A19輕鏈序列：
專利WO2020138489中的抗體10A11作為本揭露的對照分子，其輕重鏈胺基酸序列如下：
10A11重鏈序列：
10A11輕鏈序列：
實施例5、CCR8單株抗體體外去岩藻糖抗體的製備
CCR8抗體藉由細胞ADCC發揮作用，因此去岩藻糖形式的抗體比正常IgG1形式抗體殺傷作用更強。
將IgG1形式的抗體藉由體外去岩藻糖製備ADCC增強型抗體，具體製備過程如下：
去糖基化：調整IgG1形式抗體濃度約為10mg/mL，調節其pH為7.0-7.4，向抗體溶液中添加終濃度為50μg/mL的糖苷內切酶Endo S與終濃度為1.5mg/mL的Alfc酶溶液，37℃水浴孵育24小時。利用SDS-PAGE對抗體去糖基化效果進行判斷，然後使用Protein A磁珠進行抗體純化，並藉由超濾管(cutoff：50kDa)換液至PBS中。
糖基化轉移：向去糖基化抗體溶液中添加終濃度為抗體濃度50倍當量的噁唑啉受質CT-oxa(抗體終濃度5mg/mL，噁唑啉終濃度為1.67mM)，加入終濃度為0.1mg/mL的EndoS2 D184M，30℃水浴孵育1小時。藉由質譜分析鑑定所製備的抗體是否是去岩藻糖形式，所獲得的抗體為去岩藻糖形式抗體。
以下測試例中，去岩藻糖基化的人源化抗體以“(Defuc)”後綴表示，例如：hCP11-7的去岩藻糖形式抗體為hCP11-7-Defuc；h28-3的去岩藻糖形式抗體為h28-3-Defuc。
測試例
體外活性生物學評價
測試例1、檢測抗體與細胞表面表達的CCR8的結合能力
為了檢測抗體與細胞表面CCR8蛋白的結合情況，用在細胞表面表達CCR8的細胞藉由FACS檢測抗體的結合活性。
將編碼人CCR8、人CCR4或猴CCR8全長基因選殖到哺乳動物細胞表達載體上，分別用pCDH-人CCR8或pCDH-人CCR4或pCDH-cyno CCR8，和pVSV-G與pCMV-dR8.91三種質粒共同轉染HEK293T細胞(ATCC® CRL-11268)包裝病毒。轉染48小時後，收集病毒感染CHO-K1(ATCC，CCL-61)細胞。藉由加壓篩選兩週後，進行細胞亞選植。經過FACS檢測，分別獲得高表達人CCR8、人CCR4、猴CCR8的細胞株人CCR8-CHO-K1、人CCR4-CHO-K1、cynoCCR8-CHO-K1。
收集細胞，400g，4℃離心5分鐘；加入含有終濃度10% FBS的預冷的PBS，400g，4℃離心5分鐘，重複兩次；將細胞分配至96孔板，105個細胞/孔；每孔加入100μL梯度稀釋的抗體溶液，4℃孵育60分鐘，300g離心去上清；每孔加入含有終濃度10% FBS的預冷的PBS 200μL重新懸浮細胞，300g，4℃離心5分鐘，去上清液，重複兩次；加入100μL 1：1000稀釋的二抗Alexa FluorA488羊抗人IgG(H+L)(Lifetechologies，Cat# A11013)，4℃避光孵育45分鐘，離心去上清液；
每孔加入含有終濃度10% FBS的預冷的PBS 200μL重新懸浮，400g，4℃離心5分鐘，重複兩次；每孔加入100μL預冷的PBS重新懸浮細胞；用流式細胞儀檢測(BD，FACS CantoII)；得到螢光信號值，信號越高表示抗體與細胞表面的蛋白結合活性越強。將檢測結果用PRISM分析軟體做結合曲線圖，擬合得到抗體與細胞表面蛋白結合活性的EC50值。人源化抗體的結合活性如下表9所示：
測試例2、Biacore測定抗體與CCR8 N端融合蛋白的親和力
用Biacore(GE，T200)儀器測定待測人源化抗體對人CCR8 N端融合蛋白的親和力。用CM5生物傳感芯片(Cat.# BR-1005-30,
Cytiva)親和捕獲hCCR8-mFc融合蛋白(實施例1)，然後於芯片表面流經一定濃度的人CCR8抗體分子，持續進樣180秒，之後解離300秒。用Biacore T200儀器實時檢測反應信號獲得結合和解離曲線。在每個試驗循環解離完成後，用Glycine1.5(Cat.# BR-1003-54,Cytiva)將生物傳感芯片洗淨再生。實驗得到的數據採用1：1或者穩態模型(Steady State Model)進行擬合，得出親和力數值。人源化抗體與CCR8 N-小鼠Fc融合蛋白的親和力測試結果如表10。
測試例3、測定抗體對配體CCL1刺激的鈣流的抑制作用
在測試例1中獲得的人CCR8-CHO-K1細胞系上進一步轉染Gqi5基因。將編碼Gqi5全長基因選殖到哺乳動物細胞表達載體上，用pVSV-G、pCMV-dR8.91和pCDH-Gqi5三種質粒共同轉染HEK293T細胞(ATCC® CRL-11268)來包裝病毒，轉染48小時後，收集病毒感染人CCR8-CHO-K1細胞，藉由加壓篩選兩週後，進行細胞亞選植，經過FACS檢測獲得同時表達人CCR8和Gqi5蛋白的細胞系人CCR8-Gq-CHO-K1。
人CCR8-Gq-CHO-K1細胞表面的CCR8被配體CCL1激活後，會引起細胞內鈣離子水平的上調，在CCR8過表達的CHOK1細胞系上進一步過表達Gqi5蛋白可以提高鈣流檢測的靈敏度。因此我們用CCR8
和Gqi5過表達的CHOK1細胞系檢測抗體對配體CCL1刺激的鈣流的抑制作用，檢測試劑為Fluo-4 DirectTM Calcium Assay kits(Invitrogen,Cat#F10473)，按照試劑盒說明書配置使用。實驗前一天將細胞按照20000個/孔的密度種到96孔板中，37℃培養箱過夜培養。第二天將培養板中的上清去除後，新鮮配置1×Fluo-4 DirectTM calcium reagent loading solution(Invitrogen,Cat#F10473)100μL/孔，37℃，孵育30分鐘。孵育結束後，將96孔板移至室溫環境平衡10~30分鐘後，將配製好的梯度稀釋抗體加入96孔板中，25μL/孔，室溫孵育30分鐘。陰性對照孔加入Fluo-4 DirectTM calcium assay緩衝液(Invitrogen,Cat#F10473)。結束孵育後，用flexstation 3酶標儀進行檢測，由機器自動加入40nM CCL1(Biolegend，Cat#582708)25μL/孔，並立刻在EX494/EM516nm處讀值。計算得到各抗體對CCL1刺激引起的細胞內鈣流抑制作用，如下表11所示。
結論：本揭露抗體對CCL1刺激引起的細胞內鈣流有較強的抑制作用。
測試例4、測定抗體對配體CCL1引起的趨化阻斷的作用
用CCR8過表達的BaF3重組細胞系檢測抗體對配體CCL1引起的趨化阻斷作用。
將編碼人CCR8全長基因選殖到哺乳動物細胞表達載體上，用pVSV-G、pCMV-dR8.91和pCDH-人CCR8三種質粒共同轉染HEK293T細胞(ATCC® CRL-11268)來包裝病毒，轉染48小時後，收集病毒感染Ba/F3胞(南京科佰，CBP60474)，藉由加壓篩選兩週後，進行細胞亞選植，經過FACS檢測獲得高表達人CCR8蛋白的重組細胞系人CCR8-Ba/F3。
CCL1(R&D,Cat#272-I-050/CF)和抗體均用RPMI1640完全培養基配置(GE SH30809.01)，人CCR8-Ba/F3細胞用RPMI1640+10% FBS+10ng/mL mIL3(Peprotech，Cat#213-13)+4μg/mL嘌呤黴素(puromycin)培養。實驗當天用完全培養基重新懸浮細胞，計數後將細胞密度調整為8×106/mL。將細胞和配置好的抗體1：1混合，37℃培養液孵育30分鐘。然後打開Chemotaxis System(Neuron Probe Cat#106-8)的上蓋，並揭開過濾膜，將20ng/mL CCL1蛋白加入下室中，每孔30μL；輕輕蓋上過濾膜，在膜上加細胞抗體混合液，50μL/孔；蓋上上蓋，置於培養箱(37℃，5% CO2)中，孵育2小時。然後用乾淨紙巾吸去過濾膜上液體，打開過濾膜，向下室每孔加入30μL Cell Titer-Glo溶液(Promega Cat#G7573)，室溫避光孵育5分鐘。將液體轉移至已加入40μL Cell Titer-Glo溶液的96孔白底板中，用酶標儀(PerkinElmer，Vector3)採用化學發光法讀板。實驗數據用Graphpad處理，計算出抗體對BaF3細胞趨化阻斷實驗的IC50，見表12。
結論：本揭露的抗體具有較強的配體阻斷作用。
測試例5、測定抗體誘導的PBMC對表達CCR8的細胞的殺傷作用
用過表達hCCR8和Luc-GFP的HEK293重組細胞檢測抗體誘導的殺傷作用。將編碼人CCR8和Luc-GFP全長基因選植到哺乳動物細胞表達載體上，用pVSV-G、pCMV-dR8.91和pCDH-人CCR8及pCDH-Luc-GFP四種質粒共同轉染HEK293T細胞(ATCC® CRL-11268)包裝病毒。轉染48小時後，收集病毒感染HEK293(ATCC，CRL-1573)細胞。藉由加壓篩選兩週後，進行細胞亞選殖。經過FACS檢測獲得CCR8不同表達量的重組細胞，其中HEK293-hCCR8/Luc-GFP株1為人CCR8高表達細胞株；HEK293-hCCR8/Luc-GFP株11為人CCR8低表達細胞株，株11的CCR8表達量跟PBMC中Treg細胞上CCR8的表達量相當。
HEK293-hCCR8/Luc-GFP株1(CCR8高表達)和株11(CCR8低表達)細胞分別以5000個/孔鋪到白色透明底的96孔板中。新鮮的PBMC細胞離心後用RPMI1640完全培養基將密度調整為0.6×106/mL，然後將50μL的細胞懸液加入到孔板中，使得每孔中有30000個效應細胞(E：T ratio=6：1)。無效應細胞的對照孔加入50μL的RPMI1640完全培養基。取配製好的抗體10μL加入到96孔板中，使得細胞中的抗體首濃度為10nM，無抗體對照孔加入10μL的RPMI1640完全培養基。陰性
對照為只有培養基和靶細胞，以及有靶細胞和效應細胞但不含抗體的對照。將孔板放置在37℃細胞培養箱中孵育24個小時。然後用ONE-Glo試劑(Promega，E6120)定量存活的靶細胞數。將孔板取出後加入50μL每孔配製好的ONE-Glo試劑並在室溫孵育10分鐘，在孔板底部貼上白色貼紙，然後用Wallac Victor 3酶標儀測定luminescence螢光信號值。以抗體濃度為橫坐標，測定的luminescence信號值為縱坐標，用GraphPad Prism9軟體繪製量效曲線並計算各抗體的EC50值。結果見表13和表14。
表13表明，本揭露的兩個抗體誘導的PBMC對CCR8高表達的細胞株株1有較強的ADCC殺傷能力。而對於ADCC增強型的去岩藻糖的本揭露的抗體，誘導的PBMC對高表達細胞株株1的ADCC殺傷能力均加強了。
表14表明，所有抗體或其增強型的去岩藻糖形式均對CCR8低表達的clone11細胞沒有表現出明顯的ADCC殺傷作用，Emax都比較低，難以擬合計算出EC50。
綜上，本揭露的抗體可誘導PBMC對CCR8高表達的細胞(株1)的顯著的殺傷作用，而對於CCR8低表達的細胞(株11)沒有明顯的殺傷作用。顯示出了抗體對不同CCR8表達量的細胞具有明顯的差異化殺傷能力。
測試例6、測定抗體對正常PBMC中CCR8低表達的Treg的殺傷作用
螢光放大配體BATDA(雙(乙醯氧基甲基)2,2'：6',2"-三聯吡啶-6,6"-二羧酸)和靶細胞(HEK293-hCCR8/Luc-GFP株1或Treg細胞)共同孵育。BATDA能迅速進入靶細胞，並在水解作用下形成親水的TDA(2,2'：6',2”-三吡啶-6,6”-二羧酸)留在細胞內。當本揭露的抗體在PBMC中對靶細胞發生ADCC作用時，靶細胞裂解釋放TDA。釋放出的TDA和含有鑭系元素銪的溶液(DELIFA Eu試劑)相結合形成強螢光。螢光信號越強表明抗體的ADCC作用越強。
本實驗用DELFIA EUTDA試劑盒(DELFIA® EuTDA Cytotoxicity Reagents，PerkinElmer，貨號AD0116)檢測待測抗體對不同靶細胞(HEK293-hCCR8/Luc-GFP株1或Treg細胞)的ADCC殺傷作
用。Victor3上讀取time-resolved fluorometer。按照試劑盒說明書計算得到裂解%。
待測抗體包括h28-3-Defuc和hCP11-7-Defuc，用RPMI1640完全培養基(GE SH30809.01)配置成終濃度為10000pM、250pM和6.25pM。C25-hIgG1-Defuc為陰性對照。
檢測結果如下：
而表16表明，對於CCR8高表達的HEK293-hCCR8/Luc-GFP株1，本發明的兩個去岩藻糖形式的抗體均表現出來顯著的殺傷作用，裂解%明顯高於無關抗體C25。該實驗進一步證明了本發明的抗體能夠差異化的藉由ADCC作用殺傷CCR8高表達的細胞(HEK293-hCCR8-Luc-GFP株1)，而對於正常PBMC中CCR8低表達的Treg細胞沒有顯著的殺傷作用。
測試例7、測定抗體與CCR8結合的位點
為了測定CCR8的抗體與CCR8的結合位點，我們藉由突變CCR8 N端的胺基酸及構建CCR8和CCR4的嵌合抗原，構建了一系列重組細胞系，並在N端添加一個V5標簽便於檢測。抗體抗V5標簽(sinobiology，貨號：100378-MM04)為陽性對照。
用CCR4的N端來替換CCR8的N端，得到嵌合蛋白質粒P2746。用CCR4的環2替換CCR8的環2，得到嵌合蛋白質粒P2748。用CCR4的環3替換CCR8的環3得到嵌合蛋白質粒P2749。將編碼人CCR8和人CCR4的嵌合蛋白基因選殖到哺乳動物細胞表達載體pCDH上，用pVSV-G、pCMV-dR8.91和嵌合蛋白質粒三種質粒共同轉染HEK293T細胞(ATCC® CRL-11268)來包裝病毒，轉染48小時後，收集病毒感染CHO-K1(ATCC，CCL-61)細胞，藉由加壓篩選兩週後，進行細胞亞選殖，經過FACS檢測獲得高表達嵌合抗原的重組細胞系。
嵌合蛋白質粒胺基酸序列如下：
>P2746-CCR4 N：
>P2748-CCR4環2：
>P2749-CCR4環3：
註釋：下劃波浪線為V5 tag，單下劃線為N端，雙下劃線為環1，環2，環3胞外區。
CCR8的環2序列：
YQVASEDGVLQCYSFYNQQTLKWKIFTNFKM SEQ ID NO：65
CCR8的環3序列：
HSMHILDGCSISQQLTY SEQ ID NO：66
同測試例1方法一樣，用FACS檢測抗體與這些重組細胞系的結合能力。結果如下表17所示：
結論：所有的抗體跟CHOK1野生型細胞系均不結合，平均螢光強度均低於300，而抗V5標簽抗體跟所有表達CCR8片段的細胞系均有結合，平均螢光強度均大於600，說明我們構建的這些重組細胞系可以用來檢測。
如果我們用CCR4的N端來替換CCR8的N端的話(P2746)，所有待測抗體均沒有結合，說明待測抗體跟CCR8的結合需要CCR8的N端。
同時如果用CCR4的環2、環3分別來替換CCR8的環2(P2748)、環3(P2749)的話，兩個陽性抗體均能與P2748和P2749細胞系結合，說明兩個陽性抗體跟CCR8的結合不需要環2和環3的參與，主要結合在CCR8的N端。
當CCR8的環2被替換成CCR4的環2後(P2748)，hCP11-7完全沒有結合，同時當CCR8的環3替換成CCR4的環3(P2749)後，hCP11-7的結合也明顯降低，說明hCP11-7跟CCR8的結合需要CCR8的環2和環3的參與，因此HCP11-7主要結合在CCR8的N端及環2、環3組成的空間構象上。
同時人和猴CCR8的環2及環3在胺基酸序列上高度保守，而人和猴CCR8的N端胺基酸序列相似度並不高，hCP11-7結合在CCR8 N端、環2、環3的空間構象上，因此具有很好的猴CCR8交叉活性，而兩個陽性抗體主要結合在CCR8的N端，因此與猴CCR8的結合活性很弱或沒有。
測試例8、測定抗體對B-hCCR8小鼠MC38細胞荷瘤模型的藥效評價
本實驗採用C57BL/6N品系的人CCR8轉基因小鼠(B-hCCR8雌性小鼠，購自百奧賽圖實驗動物有限責任公司)接種MC38小鼠結腸癌細胞，待腫瘤長至均值約118mm3後隨機分組，給予抗體治療。藉由對比不同抗體治療後腫瘤體積的大小，評價藥物對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響。因為CCR8抗體主要是藉由ADCC作用來清除腫瘤TIL中CCR8高表達的Treg來發揮作用，本實驗採用的抗體均為mIgG2a形式的抗體。
於B-hCCR8小鼠右肋部皮下接種MC38細胞，接種量為5×105/100μL/隻；待瘤體積均值約為~118mm3時，根據瘤體積大小，挑選出56隻小鼠，隨機分為7組，每組8隻。於分組當天(D0)開始腹腔給藥(i.p.)，給藥頻次為一週兩次(BIW)。每週測量腫瘤體積和小鼠體重兩次。在整個治療過程中，各組體重與空白組相比較均未見異常。
腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×長度×寬度2
相對腫瘤增殖率T/C%=(T-T0)/(C-C0)×100%
抑瘤率TGI%=1-T/C%
其中C0、T0分別為實驗開始時的空白對照組及實驗組的腫瘤體積。C、T分別為實驗結束時的空白對照及實驗組腫瘤體積。
抑瘤結果見表18。
雖然為了清楚的理解，已經借助於附圖和實例詳細描述了上述發明，但是描述和實例不應當解釋為限制本揭露的範圍。本文中引用的所有專利和科學文獻的揭露內容藉由引用完整地清楚結合。
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Claims (14)
- 一種抗CCR8抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，(a)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：14、15和16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：17、18和19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或(b)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：20、21和22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：23、24和25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或(c)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：20、21和22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：34、35和36所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或(d)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：33、21和22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：34、35和36所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
- 如請求項1所述的抗CCR8抗體，其為鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體，較佳為人源化抗體。
- 如請求項1所述的抗CCR8抗體，其包含人抗體的框架區；較佳地，該框架區包含人IGHV2-26*01或IGHV4-30-4*01的FR1、FR2、FR3，和IGHJ6*01I的FR4作為重鏈框架區模板；和人IGKV6-21*01、IGKV1-39*01或IGKV3-20*02的FR1、FR2、FR3，和IGKJ4*01的FR4作為輕鏈框架區模板；或者該框架區包含人IGHV3-72*01、IGHV3-66*01、IGHV3-23*01或IGHV7-4-1*01的FR1、FR2、FR3，和IGHJ6*01的FR4區作為重鏈框架 區模板；和人IGKV2-28*01、IGKV3-11*01或IGKV1-39*01的FR1、FR2、FR3，和IGKJ4*01的FR4作為輕鏈框架區模板；更佳地，該抗CCR8抗體包含SEQ ID NO：27、26或28、或與SEQ ID NO：27、26或28具有至少80%序列同一性的重鏈可變區序列，和SEQ ID NO：31、29、30或32、或與SEQ ID NO：31、29、30或32具有至少80%序列同一性的輕鏈可變區序列；或該抗CCR8抗體包含SEQ ID NO：37、38、39或40、或與SEQ ID NO：37、38、39或40具有至少80%序列同一性的重鏈可變區序列，和SEQ ID NO：43、41或42、或與SEQ ID NO：43、41或42具有至少80%序列同一性的輕鏈可變區序列；較佳地，該抗CCR8抗體包含：i)如SEQ ID NO：27所示的重鏈可變區，和如SEQ ID NO：31所示的輕鏈可變區；或ii)如SEQ ID NO：37所示的重鏈可變區，和如SEQ ID NO：43所示的輕鏈可變區。
- 如請求項1至3中任一項所述的抗CCR8抗體，其中該抗CCR8抗體是全長抗體或其抗體片段；較佳地，所述的抗體片段為Fab、Fab’、F(ab')2、Fd、Fv、scFv、dsFv或dAb。
- 如請求項1至4中任一項所述的抗CCR8抗體，其中該抗CCR8抗體包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區；較佳地，該重鏈恆定區源自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恆定區，該輕鏈恆定區源自人κ和λ鏈恆定區；更佳地，該重鏈恆定區包含SEQ ID NO：44的胺基酸序列，和/或該輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：45的胺基酸序列。
- 如請求項1至5中任一項所述的抗CCR8抗體，其包含重鏈和輕鏈，其中，該重鏈包含與SEQ ID NO：46具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈包含與SEQ ID NO：47具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；或該重鏈包含與SEQ ID NO：48具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，和該輕鏈包含與SEQ ID NO：49具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；較佳地，該重鏈包含SEQ ID NO：46的胺基酸序列，和該輕鏈包含SEQ ID NO：47的胺基酸序列；或該重鏈包含SEQ ID NO：48的胺基酸序列，和該輕鏈包含SEQ ID NO：49的胺基酸序列。
- 如請求項1至6中任一項所述的抗CCR8抗體，其具有一種或更多種以下特性：A.該抗CCR8抗體與猴CCR8有交叉結合活性；較佳地，與細胞表面的猴CCR8蛋白的結合EC50值小於1nM；更佳地，與細胞表面的猴CCR8蛋白的結合EC50值小於0.5nM；B.該抗CCR8抗體與如SEQ ID NO：65所示的人CCR8的環2結合；和C.該抗CCR8抗體與如SEQ ID NO：66所示的人CCR8的環3結合。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至7中任一項所述的抗CCR8抗體以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
- 一種免疫偶聯物，其包含：如請求項1至7中任一項所述的抗CCR8抗體和效應分子，其中，該效應分子偶聯至該抗CCR8抗體；較佳地，該效應分子選自抗腫瘤劑、免疫調節劑、生物反應修飾劑、凝集素、細胞毒性藥物、發色團、螢光團、化學發光化合物、酶、金屬離子，以及其任何組合。
- 一種核酸分子，其編碼如請求項1至7中任一項所述的抗CCR8抗體。
- 一種宿主細胞，其含有如請求項10所述的核酸分子。
- 一種如請求項1至7中任一項所述的抗CCR8抗體、或如請求項8所述的醫藥組成物、或如請求項9所述的免疫偶聯物在製備用於治療CCR8相關的疾病或病症的藥物中的用途。
- 一種如請求項1至7中任一項所述的抗CCR8抗體、或如請求項8所述的醫藥組成物、或如請求項9所述的免疫偶聯物在製備用於治療癌症或腫瘤，炎症性疾病和病毒感染的藥物中的用途；較佳地，該癌症或腫瘤選自***癌、膀胱癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、腎癌、皮膚纖維肉瘤、骨肉瘤、子宮頸癌、食道癌、直腸癌、頭頸部鱗狀細胞癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤、淋巴瘤和黑色素瘤。
- 一種治療CCR8相關的疾病或病症的方法，該方法包括向有需要的患者施用如請求項1至7中任一項所述的抗CCR8抗體、如請求項8所述的醫藥組成物、或如請求項9所述的免疫偶聯物；其中該CCR8相關的疾病或病症選自癌症或腫瘤、炎症性疾病和病毒感染；較佳地，該癌症或腫瘤選自***癌、膀胱癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、 腎癌、皮膚纖維肉瘤、骨肉瘤、子宮頸癌、食道癌、直腸癌、頭頸部鱗狀細胞癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤、淋巴瘤和黑色素瘤。
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2023
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- 2023-04-28 WO PCT/CN2023/091525 patent/WO2023208182A1/zh unknown
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| WO2023208182A1 (zh) | 2023-11-02 |
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