TW202400635A - 針對sars-cov-2變異體之免疫原性組合物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本發明揭示編碼嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus 2；SARS-CoV-2)棘抗原之核酸分子、SARS-CoV-2棘抗原、免疫原性組合物，及疫苗，以及其在個體中誘導免疫反應及保護免於SARS-CoV-2感染或治療SARS-CoV-2感染之用途。

Description

針對SARS-COV-2變異體之免疫原性組合物及其使用方法

本發明係關於用於嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)之疫苗及投與疫苗之方法。

冠狀病毒疾病-19 (COVID-19)仍為全球大流行病。迄今，SARS-CoV-2已感染超過5億人且超過6百萬人已死於該疾病[World Health Organization. WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. 2022；可獲自：https_covid19_who_int]。令人擔憂的是，含有影響病毒及流行病特徵之新穎突變的嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)變異體正驅使世界上許多地區之COVID-19發病率及死亡率上升。

若干種變異體已變成關注焦點。B.1.1.7 (英國；阿爾法(Alpha))、B.1.351 (南非；貝塔(Beta))、P.1 (巴西；伽馬(Gamma))；B.1.617.2 (Delta)；及B.1.1.529 (Omicron)變異體在一些地區迅速成為主導。重要的是，與此等VOC相關之一些突變增強對感染或接種疫苗後所誘導之中和抗體的抗性。[Collier, D.A.等人, Sensitivity of SARS-CoV-2 B.1.1.7 to mRNA vaccine-elicited antibodies. Nature, 2021；Garcia-Beltran, W.F.等人, Multiple SARS-CoV-2 variants escape neutralization by vaccine-induced humoral immunity. Cell, 2021；Wang, P.等人, Increased resistance of SARS-CoV-2 variant P.1 to Antibody Neutralization. Cell Host Microbe, 2021；Wang, Z.等人, mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants. Nature, 2021. 592(7855):第616至622頁；Wibmer, C.K.等人, SARS-CoV-2 501Y.V2 escapes neutralization by South African COVID-19 donor plasma. Nat Med, 2021. 27(4):第622至625頁；Liu, J.等人, BNT162b2-elicited neutralization of B.1.617 and other SARS-CoV-2 variants. Nature, 2021.]。

需要解決目前及新出現之SARS-CoV-2變異體之攻擊的新疫苗候選物。

本文提供編碼SARS-CoV-2棘抗原之核酸分子。根據一些實施例，經編碼之SARS-CoV-2棘抗原為共同抗原。在一些實施例中，核酸分子包含：SEQ ID NO: 2之核苷酸55至3828之核酸序列；SEQ ID NO: 2之核酸序列；或SEQ ID NO: 3之核酸序列。本文亦提供編碼SARS-CoV-2棘抗原之核酸分子，其中SARS-CoV-2棘抗原包含：SEQ ID NO: 1之殘基19至1276中所闡述之胺基酸序列或SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。

在一些實施例中，將編碼SARS-CoV-2抗原之核酸分子併入病毒粒子中。

進一步提供包含編碼SARS-CoV-2抗原之核酸分子的載體。在一些實施例中，載體為表現載體。核酸分子可以可操作地連接至選自啟動子及聚腺苷酸化信號之調節元件。表現載體可為質體或病毒載體。例示性載體為pGX9541。

揭示包含有效量之載體或病毒粒子的免疫原性組合物。免疫原性組合物可包含醫藥學上可接受之賦形劑，諸如(但不限於)緩衝液。緩衝液可視情況為鹽水-檸檬酸鈉緩衝液。在一些實施例中，免疫原性組合物包含佐劑。例示性免疫原性組合物為INO-4803藥品(或INO-4803疫苗)。

本文亦提供SARS-CoV-2棘抗原。根據一些實施例，SARS-CoV-2棘抗原為共同抗原。在一些實施例中，SARS-CoV-2棘抗原包含：SEQ ID NO: 1之殘基19至1276中所闡述之胺基酸序列或SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。

本文進一步提供用於預防或治療嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)感染之疫苗。根據本發明所預防或治療之SARS-CoV-2感染包括原始武漢病毒株(WT)以及變異體病毒株，該等變異體病毒株包括(但不限於)所關注變異體，諸如B.1.1.7 (英國；阿爾法)變異體、B.1.351 (南非；貝塔)變異體、P.1 (巴西；伽馬)變異體、B.1.617.2 (Delta)變異體及B.1.1.529 (Omicron)變異體。疫苗包含有效量之前述核酸分子、載體或抗原中之任一者或組合。根據一些實施例，疫苗進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑及/或佐劑。醫藥學上可接受之賦形劑可為緩衝液，視情況為鹽水-檸檬酸鈉緩衝液。根據一些實施例，疫苗進一步包含佐劑。

進一步提供誘導有需要之個體中之針對嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)之免疫反應的方法。在一些實施例中，誘導免疫反應之方法包含向個體投與有效量之前述核酸分子、載體、免疫原性組合物、抗原或疫苗中之任一者或組合。本文亦提供保護有需要之個體免於SARS-CoV-2感染之方法，該方法包含向個體投與有效量之前述核酸分子、載體、免疫原性組合物、抗原或疫苗中之任一者或組合。進一步提供治療有需要之個體中之SARS-CoV-2感染的方法，該方法包含向個體投與有效量之前述核酸分子、載體、免疫原性組合物、抗原或疫苗中之任一者或組合。根據本發明預防或治療之SARS-CoV-2感染包括原始武漢病毒株(WT)以及變異體病毒株，該等變異體病毒株包括(但不限於)所關注變異體，諸如B.1.1.7 (英國；阿爾法)變異體、B.1.351 (南非；貝塔)變異體、P.1 (巴西；伽馬)變異體、B.1.617.2 (Delta)變異體及B.1.1.529 ( Omicron)變異體。本文亦提供用於治療或保護有需要之個體免於與SARS-CoV-2感染相關之疾病或病症的方法，該方法包含向個體投與有效量之前述核酸分子、載體、免疫原性組合物、抗原或疫苗中之任一者或組合。在一些實施例中，與SARS-CoV-2感染相關之疾病或病症為2019年冠狀病毒疾病(COVID-19)、成人多系統發炎症候群(MIS-A)或兒童多系統發炎症候群(MIS-C)。在此等方法中之任一者中，投與可包括電穿孔及注射中之至少一者。根據一些實施例，投與包含例如藉由皮內、肌內或皮下注射進行之非經腸投與，隨後視情況進行電穿孔。在所揭示之方法之一些實施例中，向個體投與約0.5 mg至約2.0 mg核酸分子之初始劑量，初始劑量視情況為0.5 mg、1.0 mg或2.0 mg核酸分子。該等方法可進一步涉及在初始劑量之後約四週向個體投與約0.5 mg至約2.0 mg核酸分子之後續劑量，視情況其中後續劑量為0.5 mg、1.0 mg或2.0 mg核酸分子。在其他實施例中，該等方法涉及在初始劑量之後至少十二週向個體投與約0.5 mg至約2.0 mg核酸分子之一或多個其他後續劑量，視情況其中其他後續劑量為0.5 mg、1.0 mg或2.0 mg核酸分子。根據一些實施例，核酸分子包含：SEQ ID NO: 2之核苷酸55至3828之核酸序列；SEQ ID NO: 2之核酸序列；SEQ ID NO: 3之核酸序列；或編碼SARS-CoV-2棘抗原之核酸分子，其中SARS-CoV-2棘抗原包含SEQ ID NO: 1之殘基19至1276中所闡述之胺基酸序列或SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。舉例而言，可根據前述方法中之任一者投與pGX9541、INO-4803藥品或其生物類似藥。

本文亦提供所揭示之核酸分子、載體、免疫原性組合物、抗原或疫苗中之任一者或組合之用途，其用於誘導有需要之個體中之針對嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)之免疫反應的方法中。進一步提供所揭示之核酸分子、載體、免疫原性組合物、抗原或疫苗中之任一者或組合的用途，其用於保護個體免於嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)感染之方法中。本文亦提供所揭示之核酸分子、載體、免疫原性組合物、抗原或疫苗中之任一者或組合之用途，其用於治療有需要之個體的SARS-CoV-2感染之方法中。根據本發明預防或治療之SARS-CoV-2感染包括原始武漢病毒株(WT)以及變異體病毒株，該等變異體病毒株包括(但不限於)所關注變異體，諸如B.1.1.7 (英國；阿爾法)變異體、B.1.351 (南非；貝塔)變異體、P.1 (巴西；伽馬)變異體、B.1.617.2 (Delta)變異體及B.1.1.529 (Omicron)變異體。本文亦提供所揭示之核酸分子、載體、免疫原性組合物、抗原或疫苗中之任一者或組合之用途，其用於治療或保護有需要之個體免於與SARS-CoV2感染相關之疾病或病症的方法中。在一些實施例中，與SARS-CoV-2感染相關之疾病或病症為2019年冠狀病毒疾病(COVID-19)、成人多系統發炎症候群(MIS-A)或兒童多系統發炎症候群(MIS-C)。根據此等用途中之任一者，可藉由電穿孔及注射中之至少一者向個體投與核酸分子、載體、免疫原性組合物、抗原或疫苗。在一些實施例中，向個體非經腸投與核酸分子、載體、免疫原性組合物、抗原或疫苗，隨後進行電穿孔。在所揭示之用途之一些實施例中，向個體投與約0.5 mg至約2.0 mg核酸分子之初始劑量，初始劑量視情況為0.5 mg、1.0 mg或2.0 mg核酸分子。該等用途可進一步涉及在初始劑量之後約四週向個體投與約0.5 mg至約2.0 mg核酸分子之後續劑量，視情況其中後續劑量為0.5 mg、1.0 mg或2.0 mg核酸分子。在其他實施例中，該等用途涉及在初始劑量之後至少十二週向個體投與約0.5 mg至約2.0 mg核酸分子之一或多個其他後續劑量，視情況其中其他後續劑量為0.5 mg、1.0 mg或2.0 mg核酸分子。根據一些實施例，根據前述用途中之任一者投與之核酸分子包含：SEQ ID NO: 2之核苷酸55至3828之核酸序列；SEQ ID NO: 2之核酸序列；SEQ ID NO: 3之核酸序列；或編碼SARS-CoV-2棘抗原之核酸分子，其中SARS-CoV-2棘抗原包含SEQ ID NO: 1之殘基19至1276中所闡述之胺基酸序列或SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。舉例而言，可根據前述用途中之任一者投與pGX9541、INO-4803藥品或其生物類似藥。

本文進一步提供所揭示之核酸分子、載體、免疫原性組合物、抗原或疫苗中之任一者或組合的用途，其用於製備藥物。在一些實施例中，藥物係用於治療或保護免於嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)感染。根據本發明預防或治療之SARS-CoV-2感染包括原始武漢病毒株(WT)以及變異體病毒株，該等變異體病毒株包括(但不限於)所關注變異體，諸如B.1.1.7 (英國；阿爾法)變異體、B.1.351 (南非；貝塔)變異體、P.1 (巴西；伽馬)變異體、B.1.617.2 (Delta)變異體及B.1.1.529 (Omicron)變異體。在一些實施例中，藥物係用於治療或保護免於與SARS-CoV-2感染相關之疾病或病症。在一些實施例中，藥物係用於治療或保護免於2019年冠狀病毒疾病(COVID-19)、成人多系統發炎症候群(MIS-A)或兒童多系統發炎症候群(MIS-C)。根據一些實施例，根據前述用途中之任一者投與之核酸分子包含：SEQ ID NO: 2之核苷酸55至3828之核酸序列；SEQ ID NO: 2之核酸序列；SEQ ID NO: 3之核酸序列；或編碼SARS-CoV-2棘抗原之核酸分子，其中SARS-CoV-2棘抗原包含SEQ ID NO: 1之殘基19至1276中所闡述之胺基酸序列或SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。舉例而言，可根據前述用途中之任一者投與pGX9541、INO-4803藥品或其生物類似藥。

相關申請案之交互參照

本申請案主張2022年4月20日申請之美國臨時申請案第63/332,982號之權利，該申請案之全部內容以引用之方式併入本文中。 序列表

電子序列表(104409000849_Sequence Listing.xml；大小：44,632位元組；及創建日期：2023年4月3日)之內容以全文引用之方式併入本文中。

結合附圖，參照以下實施方式可更容易地理解所揭示之組合物及方法，該等附圖形成本發明之一部分。應理解，所揭示之組合物及方法不限於本文中所描述及/或展示之特定組合物及方法，且本文中所使用之術語係出於僅藉由實例描述特定實施例之目的，並不意欲限制所主張之方法。

除非以其他方式特定說明，否則任何關於可能機制或作用模式或改良原因之描述僅意謂為說明性的，且所揭示之組合物及方法不受限於任何此類建議機制或作用模式或改良原因之正確性或不正確性。

當表示數值範圍時，另一實施例包括自一個特定值及/或至另一特定值。此外，提及範圍中所陳述之值包括此範圍內的每一個值。所有範圍均為包括性及可組合的。當藉由在前面使用「約」，以近似值表示值時，應理解特定值形成另一實施例。除非上下文另外明確指示，否則提及特定數值至少包括該特定值。

應瞭解，本文中為清楚起見而在單獨實施例之情形下描述的所揭示之組合物及方法之某些特徵亦可以單個實施例之組合形式提供。相反地，為簡潔起見而在單個實施例之情形下描述的所揭示之組合物及方法之各種特徵亦可單獨或以任何子組合形式提供。

在整個本說明書及申請專利範圍中使用與本說明書之態樣相關的各種術語。除非另外指示，否則此類術語將提供其在此項技術中之普通含義。其他特別定義之術語應以符合本文中所提供之定義的方式進行解釋。

如本文中所使用，單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」包括複數形式。 某些術語

如本文中所使用，在用於提及數值範圍、截止值或特定值時，術語「約」用於指示所述值可與所列值相差至多10%。因此，術語「約」用於涵蓋規定值之± 10%或更小之差異、± 5%或更小之差異、± 1%或更小之差異、± 0.5%或更小之差異或± 0.1%或更小之差異。

如本文中所使用，術語「至少一個」意味「一或多個」。

術語「包含」意欲包括由術語「基本上由……組成」及「由……組成」所涵蓋之實例；類似地，術語「基本上由……組成」意欲包括由術語「由……組成」所涵蓋之實例。無論是否明確闡述，本發明亦涵蓋「包含」本文中所呈現之實施例或要素、「由其組成」及「基本上由其組成」之其他實施例。

如本文中所使用之「佐劑」意謂添加至本文中所描述之免疫原性組合物或疫苗中以增強抗原之免疫原性的任何分子。

如本文中所使用之「抗體」意謂IgG、IgM、IgA、IgD或IgE類之抗體或片段，其片段或衍生物，包括Fab、F(ab') 2、Fd及單鏈抗體、雙功能抗體、雙特異性抗體、雙官能性抗體及其衍生物。抗體可為自哺乳動物之血清樣品分離之抗體、多株抗體、親和力純化抗體或其混合物，其對所需抗原決定基或自其衍生之序列展現充分之結合特異性。

術語(經批准之參考產品/生物藥物，亦即參考對照藥物(reference listed drug)之)「生物類似藥」係指與參考產品高度類似之生物產品，儘管臨床上非活性組分存在微小差異，但在安全性、純度及效力方面，生物類似藥與參考產品之間沒有臨床上有意義之差異，其係基於衍生自以下之資料：(a)儘管臨床上非活性組分存在微小差異，但仍顯示生物產品與參考產品高度類似之分析性研究；(b)動物研究(包括毒性評估)；及/或(c)臨床研究或(包括免疫原性及藥物動力學或藥效學之評估)的研究，該等研究足以顯示在一或多種適當使用條件下之安全性、純度及效力，其中參考產品經許可並意欲使用且其中正為生物類似藥尋求許可。生物類似藥可為可互換產品，其可在藥學中取代參考產品而無需開處方之健康照護專業人員介入。為符合「互換性」之額外標準，預期生物類似藥將產生與任何給定患者中之參考產品相同的臨床結果，且若向個體投與生物類似藥超過一次，則在使用生物類似藥與參考產品之間進行交替或切換的安全性或減弱功效方面之風險並不大於在無此類交替或切換之情況下使用參考產品之風險。在參考產品之機制為已知的情況下，生物類似藥在所提議之使用條件下利用相同之作用機制。針對生物類似藥所提議之標籤中所規定、推薦或提出的一或多種使用條件先前已批准用於參考產品。生物類似藥之投藥途徑、劑型及/或強度與參考產品之投藥途徑、劑型及/或強度相同，且生物類似藥經製造、加工、封裝或保存於符合經設計以確保生物類似藥持續為安全、純且有效之標準的設施中。在與參考產物相比時，生物類似藥可包括胺基酸序列中之微小修飾，諸如預期不改變生物類似藥效能之N端或C端截短。

如本文中所使用之「編碼序列」或「編碼核酸」意味包含編碼蛋白質之核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。編碼序列可進一步包括與調節元件可操作地連接之起始及終止信號，該等調節元件包括能夠引導在投與核酸之個體或哺乳動物之細胞中表現的啟動子及聚腺苷酸化信號。編碼序列可進一步包括編碼信號肽之序列，例如IgE前導序列。

如本文中所使用之「互補序列」或「互補」意謂在核酸分子之核苷酸或核苷酸類似物之間的華特生-克里克(Watson-Crick) (例如A-T/U及C-G)或胡斯坦(Hoogsteen)鹼基配對。

如本文中所使用之「共同」或「共同序列」可意謂基於對特定抗原之多種亞型之比對分析而構築的合成核酸序列或對應之多肽序列。序列可用於誘導針對特定抗原之多種亞型、血清型或病毒株之廣泛免疫性。可操控合成抗原(諸如融合蛋白)以產生共同序列(或共同抗原)。

如本文中可互換地使用之「電穿孔」、「電滲透」或「電動力增強」(「EP」)意謂使用跨膜電場脈衝以誘導生物膜中之微觀路徑(孔)；其存在允許諸如質體、寡核苷酸、siRNA、藥物、離子及水之生物分子自細胞膜之一側穿過至另一側。

如本文中所使用之「片段」意謂編碼能夠在哺乳動物中引發免疫反應之多肽的核酸序列或其部分。片段可為選自各種核苷酸序列中之至少一者的DNA片段，該等核苷酸序列編碼下文所闡述之蛋白質片段。

關於多肽序列之「片段」或「免疫原性片段」意謂能夠在與參考全長SARS-CoV-2抗原交叉反應之哺乳動物中引發免疫反應之多肽。共同蛋白之片段可包含至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%之共同蛋白。在一些實施例中，共同蛋白之片段可包含至少20個胺基酸或更多、至少30個胺基酸或更多、至少40個胺基酸或更多、至少50個胺基酸或更多、至少60個胺基酸或更多、至少70個胺基酸或更多、至少80個胺基酸或更多、至少90個胺基酸或更多、至少100個胺基酸或更多、至少110個胺基酸或更多、至少120個胺基酸或更多、至少130個胺基酸或更多、至少140個胺基酸或更多、至少150個胺基酸或更多、至少160個胺基酸或更多、至少170個胺基酸或更多、至少180個胺基酸或更多、至少190個胺基酸或更多、至少200個胺基酸或更多、至少210個胺基酸或更多、至少220個胺基酸或更多、至少230個胺基酸或更多或至少240個胺基酸或更多之共同蛋白。

如本文中所使用，術語「基因構築體」係指包含編碼蛋白質之核苷酸序列的DNA或RNA分子。編碼序列包括可操作地連接至調節元件之起始及終止信號，該等調節元件包括能夠引導在投與核酸分子之個體之細胞中表現的啟動子及聚腺苷酸化信號。如本文中所使用，術語「可表現形式」係指基因構築體，其含有可操作地連接至編碼蛋白質之編碼序列的必需調節元件，從而在存在於個體之細胞中時，將表現編碼序列。

在兩個或更多個核酸或多肽序列之情形下，如本文中所使用之「一致」或「一致性」意謂序列具有指定百分比之殘基，該等殘基在指定區域上相同。可藉由以下計算百分比：最佳比對兩個序列，比較指定區域上之兩個序列，確定兩個序列中一致之殘基出現的位置之數目，得到匹配位置之數目，將匹配位置之數目除以指定區域中之位置的總數目，且將結果乘以100，得到序列一致性之百分比。在兩個序列具有不同長度或比對產生一或多個交錯末端且指定之比較區域僅包括單個序列之情況下，單個序列之殘基包括於計算之分母中，但不包括於分子中。在比較DNA及RNA時，胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)可視為等效的。一致性可人工地或藉由使用諸如BLAST或BLAST 2.0之電腦序列演算法來進行。

如本文中所使用之「免疫反應」意謂回應於抗原之引入而進行之宿主免疫系統(例如哺乳動物之免疫系統)之活化。免疫反應可呈細胞或體液反應之形式或兩者。

INO-4800藥品含有於1X SSC緩衝液(150 mM氯化鈉及15 mM檸檬酸鈉)中之10 mg/mL DNA質體pGX9501 (或INO-4800)。

INO-4802藥品含有於1X SSC緩衝液(150 mM氯化鈉及15 mM檸檬酸鈉)中之10 mg/mL DNA質體pGX9527 (或INO-4802)。

INO-4803藥品含有於1X SSC緩衝液(150 mM氯化鈉及15 mM檸檬酸鈉)中之10 mg/mL DNA質體pGX9541 (或INO-4803)。

如本文中所使用之「核酸」或「寡核苷酸」或「聚核苷酸」或「核酸分子」意謂至少兩個共價地連接在一起之核苷酸。單股之描繪亦定義互補股之序列。因此，核酸亦涵蓋所描繪之單股的互補股。核酸之許多變異體可用於與給定核酸相同之目的。因此，核酸亦涵蓋實質上一致之核酸及其互補序列。單股提供可在嚴格雜交條件下與目標序列雜交之探針。因此，核酸亦涵蓋在嚴格雜交條件下雜交之探針。核酸可為單股或雙股的，或者可含有雙股及單股序列兩者之部分。核酸可為基因體及cDNA兩者之DNA、RNA或雜交體，其中核酸可含有去氧核糖核苷酸與核糖核苷酸之組合及鹼基之組合，該等鹼基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶及異鳥嘌呤。核酸可藉由化學合成方法或藉由重組方法獲得。

如本文中所使用之「可操作地連接」意謂基因之表現處於與其空間連接之啟動子的控制下。啟動子可位於在其控制下之基因之5' (上游)或3' (下游)。啟動子與基因之間的距離可與該啟動子與其在衍生啟動子之基因中控制的基因之間的距離大致相同。如此項技術中已知，此距離之變化可在不損失啟動子功能之情況下調節。

如本文中所使用之「肽」、「蛋白質」或「多肽」可意謂經連接之胺基酸序列，且可為天然、合成的或天然與合成之修飾或組合。

如本文中所使用之「啟動子」意謂能夠賦予、活化或增強細胞中之核酸表現的合成或天然衍生之分子。啟動子可包含一或多個特定轉錄調節序列以進一步增強表現及/或改變其空間表現及/或時間表現。啟動子亦可包含遠端強化子或抑制子元件，該等元件可位於距轉錄之起始部位多達數千個鹼基對處。啟動子可衍生自包括病毒、細菌、真菌、植物、昆蟲及動物之來源。啟動子可相對於發生表現之細胞、組織或器官，或相對於發生表現之發育階段，或回應於諸如生理應激、病原體、金屬離子或誘導劑之外部刺激，組成性或差異性地調節基因組件之表現。啟動子之代表性實例包括噬菌體T7啟動子、噬菌體T3啟動子、SP6啟動子、乳糖(lac)操縱子-啟動子、tac啟動子、SV40晚期啟動子、SV40早期啟動子、RSV-LTR啟動子及CMV IE啟動子。

「信號肽」及「前導序列」在本文中可互換地使用且係指可在本文中所闡述之SARS-CoV-2蛋白質的胺基端處連接之胺基酸序列。信號肽/前導序列通常引導蛋白質之定位。本文中所使用之信號肽/前導序列較佳促進蛋白質自產生其之細胞中分泌。在自細胞分泌後，信號肽/前導序列通常自蛋白質(通常稱為成熟蛋白)之其餘部***解。信號肽/前導序列在蛋白質之N端處連接。

如本文中所使用之「個體」可意謂想要或需要用本文中所描述之免疫原性組合物或疫苗進行免疫接種之哺乳動物。哺乳動物可為人類、黑猩猩、天竺鼠、狗、貓、馬、母牛、小鼠、倉鼠、兔或大鼠。因此，方法適用於人類及非人類動物，但較佳地，最佳用於人類。「個體」及「患者」在本文中可互換地使用。

如本文中所使用之「實質上一致」可意謂第一及第二胺基酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多個胺基酸之區域上為至少60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。實質上一致亦可意謂第一核酸序列及第二核酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多個核苷酸之區域上為至少60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。

如本文中所使用之「治療(treatment)」或「治療(treating)」可意謂經由預防、遏制、抑制或完全消除疾病之方式保護動物免於疾病。預防疾病涉及在疾病發作之前向動物投與本發明之免疫原性組合物或疫苗。遏制疾病涉及在誘導疾病之後，但在其臨床顯現之前，向動物投與本發明之免疫原性組合物或疫苗。抑制疾病涉及在疾病之臨床顯現之後向動物投與本發明之免疫原性組合物或疫苗。

本文中關於核酸所使用之「變異體」意謂(i)所提及之核苷酸序列的一部分或片段；(ii)所提及之核苷酸序列或其部分的互補序列；(iii)與所提及之核酸或其互補序列實質上一致的核酸；或(iv)在嚴格條件下與所提及之核酸、其互補序列或與其實質上一致之序列雜交的核酸。變異體可為在全長之全基因序列或其片段上實質上一致的核酸序列。核酸序列在基因序列或其片段之全長上可為80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。

本文中關於肽或多肽所使用之「變異體」係指胺基酸序列因胺基酸之***、缺失或保守性取代而不同，但保留至少一種生物活性之肽或多肽。「生物活性」之代表性實例包括被特異性抗體結合或促進免疫反應之能力。變異體亦可意謂胺基酸序列與保留至少一種生物活性之參考蛋白之胺基酸序列實質上一致的蛋白。胺基酸之保守性取代(亦即，胺基酸經具有類似特性(例如帶電區域之親水性、程度及分佈)之不同胺基酸置換)在此項技術中公認為通常涉及微小變化。如此項技術中所理解，此等微小變化可部分地藉由考慮胺基酸之親水指數而鑑別。Kyte等人, J. Mol. Biol.157:105-132 (1982)。胺基酸之親水指數係基於其疏水性及電荷之考慮。此項技術中已知具有類似親水指數之胺基酸可經取代且仍保留蛋白質功能。在一個態樣中，具有±2之親水指數之胺基酸經取代。胺基酸之親水性亦可以用於揭示將產生保留生物功能之蛋白質的取代。在肽之情形下考慮胺基酸之親水性允許計算該肽之最大局部平均親水性，此為一種已經報導與抗原性及免疫原性密切相關之適用量度。如此項技術中所理解，具有類似親水性值之胺基酸的取代可產生保留生物活性(例如免疫原性)之肽。可使用彼此具有±2內之親水性值的胺基酸進行取代。胺基酸之疏水性指數及親水性值兩者均受該胺基酸之特定側鏈影響。與該觀測結果一致，與生物功能相容之胺基酸取代應理解為視胺基酸且尤其該等胺基酸之側鏈的如由疏水性、親水性、電荷、尺寸及其他特性所展現之相對相似度而定。變異體可為在胺基酸序列或其片段之全長上實質上一致的胺基酸序列。胺基酸序列在胺基酸序列或其片段之全長上可為80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。

如本文中所使用之「載體」意味含有複製起點之核酸序列。載體可為病毒載體、噬菌體、細菌人工染色體或酵母人工染色體。載體可為DNA或RNA載體。載體可為自我複製之染色體外載體，且較佳為DNA質體。

對於本文中數值範圍之敍述而言，明確地涵蓋具有相同精確度之其間的各間插數值。舉例而言，對於6至9之範圍，除6與9以外，涵蓋數值7及8，且對於6.0至7.0之範圍，明確涵蓋數值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9及7.0。 核酸分子、抗原及免疫原性組合物

本文提供免疫原性組合物(諸如疫苗)，其包含編碼SARS-CoV-2棘抗原、其片段、其變異體或其組合之核酸分子。本文亦提供免疫原性組合物(諸如疫苗)，其包含SARS-CoV-2棘抗原、其片段、其變異體或其組合。免疫原性組合物可用於保護免於任何數目之SARS-CoV-2病毒株及治療任何數目之SARS-CoV-2病毒株，由此治療、預防及/或保護免於基於SARS-CoV-2之病變。免疫原性組合物可顯著誘導投與免疫原性組合物之個體之免疫反應，由此保護免於SARS-CoV-2感染及/或治療SARS-CoV-2感染。

免疫原性組合物可為DNA疫苗、肽疫苗或DNA及肽組合疫苗。DNA疫苗可包括編碼SARS-CoV-2棘抗原之核酸分子。核酸分子可為DNA、RNA、cDNA、其變異體、其片段或其組合。核酸分子亦可包括額外序列，其編碼藉由肽鍵連接至編碼SARS-CoV-2棘抗原之核酸分子的連接子、前導序列或標籤序列。肽疫苗可包括SARS-CoV-2抗原肽、SARS-CoV-2抗原蛋白、其變異體、其片段或其組合。DNA及肽組合疫苗可包括上文所描述之核酸分子，其編碼SARS-CoV-2棘抗原及SARS-CoV-2棘抗原肽或蛋白質，其中SARS-CoV-2棘抗原肽或蛋白質及經編碼之SARS-CoV-2棘抗原具有相同或不同之胺基酸序列。

所揭示之免疫原性組合物可引發體液及細胞免疫反應兩者，該等體液及細胞免疫反應靶向投與免疫原性組合物之個體中之SARS-CoV-2棘抗原。所揭示之免疫原性組合物可引發與SARS-CoV-2棘抗原具有反應性之中和抗體及免疫球蛋白G (IgG)抗體。免疫原性組合物亦可引發CD8+及CD4+ T細胞反應，其對SARS-CoV-2棘抗原具有反應性且產生干擾素-γ (IFN-γ)、介白素-2 (IL-2)、TNFα、介白素-4 (IL-4)、循環T濾泡輔助(Tfh)細胞或其任何組合。

免疫原性組合物可誘導投與免疫原性組合物之個體中之體液免疫反應。所誘導之體液免疫反應可對SARS-CoV-2棘抗原具有特異性。所誘導之體液免疫反應可與SARS-CoV-2棘抗原具有反應性。可在投與疫苗之個體中誘導約1.5倍至約16倍、約2倍至約12倍或約3倍至約10倍之體液免疫反應。可在投與疫苗之個體中誘導至少約1.5倍、至少約2.0倍、至少約2.5倍、至少約3.0倍、至少約3.5倍、至少約4.0倍、至少約4.5倍、至少約5.0倍、至少約5.5倍、至少約6.0倍、至少約6.5倍、至少約7.0倍、至少約7.5倍、至少約8.0倍、至少約8.5倍、至少約9.0倍、至少約9.5倍、至少約10.0倍、至少約10.5倍、至少約11.0倍、至少約11.5倍、至少約12.0倍、至少約12.5倍、至少約13.0倍、至少約13.5倍、至少約14.0倍、至少約14.5倍、至少約15.0倍、至少約15.5倍或至少約16.0倍之體液免疫反應。

由免疫原性組合物誘導之體液免疫反應可包括與未投與免疫原性組合物之個體相比，與投與免疫原性組合物之個體相關的中和抗體之水平增加。中和抗體可對SARS-CoV-2棘抗原具有特異性。中和抗體可與SARS-CoV-2棘抗原具有反應性。中和抗體可針對投與免疫原性組合物之個體中之SARS-CoV-2感染及其相關病變提供保護及/或治療。

由免疫原性組合物誘導之體液免疫反應可包括與未投與免疫原性組合物之個體相比及/或與投與pGX9501 (INO-4800)之個體相比，與投與免疫原性組合物之個體相關之IgG抗體的水平增加。此等IgG抗體可對SARS-CoV-2棘抗原具有特異性。此等IgG抗體可與SARS-CoV-2棘抗原具有反應性。與未投與免疫原性組合物之個體相比及/或與投與pGX9501 (INO-4800)之個體相比，與投與免疫原性組合物之個體相關之IgG抗體的水平可增加約1.5倍至約16倍、約2倍至約12倍或約3倍至約10倍。與未投與免疫原性組合物之個體相比及/或與投與pGX9501 (INO-4800)之個體相比，與投與免疫原性組合物之個體相關之IgG抗體的水平可增加至少約1.5倍、至少約2.0倍、至少約2.5倍、至少約3.0倍、至少約3.5倍、至少約4.0倍、至少約4.5倍、至少約5.0倍、至少約5.5倍、至少約6.0倍、至少約6.5倍、至少約7.0倍、至少約7.5倍、至少約8.0倍、至少約8.5倍、至少約9.0倍、至少約9.5倍、至少約10.0倍、至少約10.5倍、至少約11.0倍、至少約11.5倍、至少約12.0倍、至少約12.5倍、至少約13.0倍、至少約13.5倍、至少約14.0倍、至少約14.5倍、至少約15.0倍、至少約15.5倍或至少約16.0倍。

免疫原性組合物可誘導投與免疫原性組合物之個體中之細胞免疫反應。所誘導之細胞免疫反應可對SARS-CoV-2棘抗原具有特異性。所誘導之細胞免疫反應可對SARS-CoV-2棘抗原具有反應性。所誘導之細胞免疫反應可包括引發CD8+ T細胞反應。所引發之CD8+ T細胞反應可與SARS-CoV-2棘抗原具有反應性。所引發之CD8+ T細胞反應可為多功能的。所誘導之細胞免疫反應可包括引發CD8+ T細胞反應，其中CD8+ T細胞產生干擾素-γ (IFN-γ)、介白素-2及/或上調CD107a。

與未投與免疫原性組合物之個體相比及/或與投與pGX9501 (INO-4800)之個體相比，所誘導之細胞免疫反應可包括與投與免疫原性組合物之個體相關之CD8+ T細胞反應增加。與未投與免疫原性組合物之個體相比及/或與投與pGX9501 (INO-4800)之個體相比，與投與免疫原性組合物之個體相關之CD8+ T細胞反應可增加約2倍至約30倍、約3倍至約25倍或約4倍至約20倍。與未投與免疫原性組合物之個體相比及/或與投與pGX9501 (INO-4800)之個體相比，與投與免疫原性組合物之個體相關之CD8+ T細胞反應可增加至少約1.5倍、至少約2.0倍、至少約3.0倍、至少約4.0倍、至少約5.0倍、至少約6.0倍、至少約6.5倍、至少約7.0倍、至少約7.5倍、至少約8.0倍、至少約8.5倍、至少約9.0倍、至少約9.5倍、至少約10.0倍、至少約10.5倍、至少約11.0倍、至少約11.5倍、至少約12.0倍、至少約12.5倍、至少約13.0倍、至少約13.5倍、至少約14.0倍、至少約14.5倍、至少約15.0倍、至少約16.0倍、至少約17.0倍、至少約18.0倍、至少約19.0倍、至少約20.0倍、至少約21.0倍、至少約22.0倍、至少約23.0倍、至少約24.0倍、至少約25.0倍、至少約26.0倍、至少約27.0倍、至少約28.0倍、至少約29.0倍或至少約30.0倍。

由免疫原性組合物誘導之細胞免疫反應可包括引發CD4+ T細胞反應。所引發之CD4+ T細胞反應可與SARS-CoV-2抗原具有反應性。所引發之CD4+ T細胞反應可為多功能的。所誘導之細胞免疫反應可包括引發CD4+ T細胞反應，其中CD4+ T細胞產生IFN-γ、介白素-2 (IL-2)、介白素-4 (IL-4)、腫瘤壞死因子α (TNFα)或其任何組合。

由免疫原性組合物所誘導之細胞免疫反應可包括循環Tfh (CXCR5+ PD-1+)細胞之增加。

本發明之免疫原性組合物可具有有效免疫原性組合物所需之特徵，諸如為安全的，因此免疫原性組合物本身不會引起疾病或死亡；能夠防護因暴露於諸如病毒或細菌之活病原體而產生之疾病；誘導中和抗體以防止細胞產生；誘導針對胞內病原體之保護性T細胞；且使其容易投與、幾乎無副作用、具有生物穩定性及每劑量低成本。

當向不同組織(諸如肌肉或皮膚)投與時，免疫原性組合物可進一步誘導免疫反應。如本文中所描述，在例如藉由皮下、皮內或肌內注射進行非經腸投與，隨後視情況進行電穿孔時，免疫原性組合物可進一步誘導免疫反應。 a.  SARS-CoV-2抗原及編碼該SARS-CoV-2抗原之核酸分子

如上文所描述，本文提供包含編碼SARS-CoV-2棘抗原、其片段、其變異體或其組合之核酸分子的免疫原性組合物。本文亦提供免疫原性組合物，其包含SARS-CoV-2棘抗原、其片段、其變異體或其組合。

SARS-CoV-2棘抗原能夠在哺乳動物中引發針對一或多種SARS-CoV-2病毒株之免疫反應。根據一些實施例，SARS-CoV-2病毒株或變異體為SARS-CoV-2 Omicron變異體(B.1.1.529)。SARS-CoV-2棘抗原可包含使其作為免疫原尤其有效之抗原決定基，針對該免疫原可誘導抗SARS-CoV-2免疫反應。

SARS-CoV-2抗原可為來源於一或多種SARS-CoV-2病毒株的共同抗原。在一些實施例中，SARS-CoV-2抗原為SARS-CoV-2共同棘抗原。SARS-CoV-2共同棘抗原可來源於來自一或多種SARS-CoV-2病毒株的棘抗原之序列，且因此，SARS-CoV-2共同棘抗原為獨特的。根據一些實施例，本發明之免疫原性組合物由於SARS-CoV-2共同棘抗原之獨特序列而廣泛適用於SARS-CoV-2之多種病毒株。此等獨特序列使得疫苗能夠防護SARS-CoV-2之多種病毒株，包括SARS-CoV-2之基因多樣化變異體。

編碼SARS-CoV-2抗原之核酸分子可經修飾以改良表現。修飾可包括密碼子最佳化、RNA最佳化、添加科紮克序列(kozak sequence)以用於增加轉譯起始，及/或添加免疫球蛋白前導序列以增加SARS-CoV-2棘抗原之免疫原性。SARS-CoV-2棘抗原可包含信號肽，諸如免疫球蛋白信號肽，例如(但不限於)免疫球蛋白E (IgE)或免疫球蛋白G (IgG)信號肽。在一些實施例中，SARS-CoV-2棘抗原可包含血球凝集素(HA)標籤。SARS-CoV-2棘抗原可經設計以引發比對應經密碼子最佳化之棘抗原更強且更廣泛的細胞及/或體液免疫反應。

在一些實施例中，SARS-CoV-2棘抗原包含在SEQ ID NO: 1之殘基19至1276之整個長度上具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，SARS-CoV-2棘抗原包含SEQ ID NO: 1之殘基19至1276中所闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，SARS-CoV-2棘抗原包含在SEQ ID NO: 1之整個長度上具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，SARS-CoV-2棘抗原包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。

在一些實施例中，編碼SARS-CoV-2棘抗原之核酸分子包含與SEQ ID NO: 2之核苷酸55至3828、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3中所闡述之序列具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之核苷酸序列。

在一些實施例中，SARS-CoV-2棘抗原可操作地連接至IgE前導序列。在一些此類實施例中，SARS-CoV-2棘抗原包含SEQ ID NO: 1中所闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，具有IgE前導序列之SARS-CoV-2棘抗原係由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 3中所闡述之核苷酸序列編碼。

提供SEQ ID NO:1之免疫原性片段。免疫原性片段可包含至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之SEQ ID NO:1。在一些實施例中，免疫原性片段包括前導序列，諸如免疫球蛋白前導序列，諸如IgE前導序列。在一些實施例中，免疫原性片段不含前導序列。

可提供胺基酸序列與SEQ ID NO: 1之免疫原性片段同源的蛋白質之免疫原性片段。此類免疫原性片段可包含與SEQ ID NO: 1 95%同源之至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之蛋白質。一些實施例係關於與本文中之共同蛋白序列的免疫原性片段具有96%同源性之免疫原性片段。一些實施例係關於與本文中之共同蛋白序列的免疫原性片段具有97%同源性之免疫原性片段。一些實施例係關於與本文中之共同蛋白序列的免疫原性片段具有98%同源性之免疫原性片段。一些實施例係關於與本文中之共同蛋白序列的免疫原性片段具有99%同源性之免疫原性片段。在一些實施例中，免疫原性片段包括前導序列，諸如免疫球蛋白前導序列，諸如IgE前導序列。在一些實施例中，免疫原性片段不含前導序列。

一些實施例係關於SEQ ID NO:1之免疫原性片段。免疫原性片段可為至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之SEQ ID NO:1。免疫原性片段可與SEQ ID NO:1之片段至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同源。在一些實施例中，免疫原性片段包括編碼前導序列，諸如免疫球蛋白前導序列，諸如IgE前導序列之序列。在一些實施例中，片段不含編碼前導序列之編碼序列。 b. 載體

免疫原性組合物可包含一或多種載體，其包括編碼SARS-CoV-2棘抗原之核酸分子。一或多種載體可能夠表現棘抗原。載體可具有含有複製起點之核酸序列。載體可為質體、噬菌體、細菌人工染色體或酵母人工染色體。載體可為自我複製之染色體外載體或整合至宿主基因體中之載體。

一或多種載體可為表現構築體，其通常為用於將特異性基因引入靶細胞中之質體。一旦表現載體處於細胞內部，則藉由細胞轉錄及/或轉譯機構核糖體複合物產生由基因編碼之蛋白質。質體通常經工程改造以含有調節序列，該等調節序列充當強化子區及啟動子區且引起攜帶於表現載體上之基因的高效轉錄。本發明之載體表現大量穩定之信使RNA，且因此表現蛋白質。

載體可具有表現信號，諸如強啟動子、強終止密碼子、啟動子與選殖基因之間之距離的調節，以及轉錄終止序列及攜帶型轉譯起始序列(portable translation initiation sequence；PTIS)之***。 (1) 表現載體

載體可為環狀質體或線性核酸。環狀質體及線性核酸能夠引導特定核苷酸序列在適合之個體細胞中之表現。載體可具有可操作地連接至編碼抗原之核苷酸序列的啟動子，該核苷酸序列可可操作地連接至終止信號。載體亦可含有核苷酸序列之恰當轉譯所需的序列。包含所關注之核苷酸序列的載體可為嵌合載體，此意謂其組分中之至少一者相對於其其他組分中之至少一者為異源的。核苷酸序列在表現卡匣中之表現可處於組成型啟動子或可誘導型啟動子之控制下，該啟動子僅在宿主細胞暴露於一些特定外部刺激時引發轉錄。在多細胞生物體之情況下，啟動子亦可對特定組織或器官或發育階段具有特異性。 (2) 環狀及線性載體

載體可為環狀質體，其可藉由整合至細胞基因體中來轉型靶細胞或在染色體外存在(例如具有複製起點之自主複製質體)。

載體可為pVAX、pcDNA3.0、pGX0001或provax，或任何其他能夠表現編碼該抗原之DNA且使細胞能夠將該序列轉譯成免疫系統識別之抗原的表現載體。

本文亦提供能夠經由電穿孔有效遞送至個體且表現一或多種所需抗原之線性核酸免疫原性組合物或線性表現卡匣(「LEC」)。LEC可為無任何磷酸主鏈之任何線性DNA。該DNA可編碼一或多種抗原。LEC可含有啟動子、內含子、終止密碼子及/或聚腺苷酸化信號。該抗原之表現可由啟動子控制。LEC可不含任何抗生素抗性基因及/或磷酸主鏈。LEC可不含與所需抗原基因表現無關之其他核酸序列。

LEC可衍生自能夠線性化之任何質體。質體可能夠表現抗原。質體可為pNP (波多黎各/34 (Puerto Rico/34))或pM2 (新喀里多尼亞/99 (New Caledonia/99))。質體可為WLV009、pVAX、pGX0001、pcDNA3.0或provax，或任何其他能夠表現編碼該抗原之DNA且使細胞能夠將該序列轉譯成免疫系統識別之抗原的表現載體。

LEC可為perM2。LEC可為perNP。perNP及perMR可分別衍生自pNP (波多黎各/34)及pM2 (新喀里多尼亞/99)。 (3) 啟動子、內含子、終止密碼子及聚腺苷酸化信號

載體可具有啟動子。啟動子可為任何能夠驅動基因表現且調節經分離之核酸表現的啟動子。此類啟動子為經由DNA依賴性RNA聚合酶轉錄所需之同側作用(cis-acting)序列元件，該DNA依賴性RNA聚合酶轉錄本文中所描述之抗原序列。用於引導異源核酸表現之啟動子的選擇視特定應用而定。啟動子可位於載體中距轉錄起始的距離與其在自然環境中距轉錄起始的距離大致相同。然而，此距離之變化可在不損失啟動子功能下調節。

啟動子可能可操作地連接至編碼該抗原之核酸序列及轉錄本之有效聚腺苷酸化、核糖體結合部位及轉譯終止所需之信號。啟動子可為CMV啟動子、SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠類***腫瘤病毒啟動子、勞斯氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)啟動子、多角體蛋白(polyhedrin)啟動子，或顯示對真核細胞中之表現有效之另一啟動子。

載體可包括強化子及具有功能性剪接供體及受體部位之內含子。載體可含有結構基因下游之轉錄終止區以提供有效終止。終止區可獲自與啟動子序列相同之基因或可獲自不同基因。 c. 免疫原性組合物之賦形劑及其他組分

免疫原性組合物可進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑。醫藥學上可接受之賦形劑可為功能性分子，諸如媒劑、載劑、緩衝液或稀釋劑。如本文中所使用，「緩衝液」係指藉由酸-鹼結合物組分之作用來抵抗pH變化的緩衝溶液。緩衝液通常具有約4.0至約8.0，例如約5.0至約7.0之pH。在一些實施例中，緩衝液為鹽水-檸檬酸鈉(SSC)緩衝液。在免疫原性組合物包含編碼上文所描述之SARS-CoV-2棘抗原之核酸分子的一些實施例中，免疫原性組合物包含於緩衝液，例如(但不限於) SSC緩衝液中之10 mg/ml載體。在一些實施例中，免疫原性組合物包含於緩衝液中之10 mg/mL DNA質體pGX9541。在一些實施例中，免疫原性組合物儲存於約2℃至約8℃下。在一些實施例中，免疫原性組合物儲存於室溫下。免疫原性組合物可在室溫下儲存至少一年。在一些實施例中，免疫原性組合物在室溫下穩定至少一年，其中將穩定性定義為至少約80%之超捲曲質體百分比。在一些實施例中，在室溫下儲存至少一年後，超捲曲質體百分比為至少約85%。

醫藥學上可接受之賦形劑可為轉染促進劑，其可包括界面活性劑，諸如免疫刺激複合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐劑(Freunds incomplete adjuvant)、包括單磷醯基脂質A之LPS類似物、胞壁醯基肽、醌類似物、囊泡(諸如角鯊烯及角鯊烯)、玻尿酸、脂質、脂質體、鈣離子、病毒蛋白、多價陰離子、多價陽離子或奈米粒子，或其他已知的轉染促進劑。

轉染促進劑可為多價陰離子、多價陽離子，包括聚-L-麩胺酸(LGS)或脂質。轉染促進劑為聚-L-麩胺酸，且聚-L-麩胺酸可以低於6 mg/ml之濃度存在於免疫原性組合物中。轉染促進劑亦可包括界面活性劑，諸如免疫刺激複合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐劑、包括單磷醯基脂質A之LPS類似物、胞壁醯基肽、醌類似物及囊泡(諸如角鯊烯及角鯊烯)，且玻尿酸亦可用於與基因構築體一起投與。DNA質體免疫原性組合物亦可包括轉染促進劑，諸如脂質、脂質體(包括卵磷脂脂質體或此項技術中已知的其他脂質體，如DNA-脂質體混合物(參見例如WO9324640))、鈣離子、病毒蛋白、多價陰離子、多價陰離子或奈米粒子，或其他已知的轉染促進劑。轉染促進劑為多價陰離子、多價陽離子，包括聚-L-麩胺酸(LGS)或脂質。免疫原性組合物中之轉染劑的濃度低於4 mg/ml、低於2 mg/ml、低於1 mg/ml、低於0.750 mg/ml、低於0.500 mg/ml、低於0.250 mg/ml、低於0.100 mg/ml、低於0.050 mg/ml或低於0.010 mg/ml。

醫藥學上可接受之賦形劑可為佐劑。佐劑可為其他基因，其在替代性質體中表現或與以上質體組合以蛋白質形式遞送於免疫原性組合物中。佐劑可選自由以下組成之群：α-干擾素(IFN-α)、β-干擾素(IFN-β)、γ-干擾素、血小板衍生生長因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、皮膚T細胞吸引趨化介素(CTACK)、表現上皮胸腺之趨化介素(TECK)、黏膜相關之上皮趨化介素(MEC)、介白素(IL)-12、IL-15、MHC、CD80、CD86，包括信號序列缺失之IL-15且視情況包括來自IgE之信號肽。佐劑可為IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板衍生生長因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其組合。

可用作佐劑之其他基因包括編碼以下之基因：MCP-1、MIP-1a、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-選滯蛋白、P-選滯蛋白、E-選滯蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18之突變形式、CD40、CD40L、血管生長因子、纖維母細胞生長因子、IL-7、IL-22、神經生長因子、血管內皮生長因子、Fas、TNF受體、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、凋亡蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、失活NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干擾素反應基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40 LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段。

可根據所使用之投藥模式調配免疫原性組合物。根據一些實施例，免疫原性組合物係調配於緩衝液(視情況為鹽水-檸檬酸鈉緩衝液)中。舉例而言，免疫原性組合物可以每毫升緩衝液(視情況為檸檬酸鈉鹽緩衝液) 10 mg核酸分子之濃度調配。可注射免疫原性醫藥組合物可為無菌、無熱原及無粒子的。可使用等張調配物或溶液。等張性添加劑可包括氯化鈉、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇及乳糖。免疫原性組合物可包含血管收縮劑。等張溶液可包括磷酸鹽緩衝鹽水。免疫原性組合物可進一步包含包括明膠及白蛋白之穩定劑。穩定劑可允許調配物在室溫或環境溫度下穩定延長之時段，包括LGS或多價陽離子或多價陰離子。 接種疫苗之方法

本文亦提供藉由向有需要之個體投與免疫原性組合物來治療、保護免於及/或預防個體之疾病的方法。向個體投與免疫原性組合物可誘導或引發個體中之免疫反應。所誘導之免疫反應可用於治療、預防及/或保護免於疾病，例如與SARS-CoV-2感染相關之病變。在投與免疫原性組合物之個體中誘導之免疫反應可提供針對一或多種SARS-CoV-2病毒株，例如SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529)變異體之抗性。

所誘導之免疫反應可包括所誘導之體液免疫反應及/或所誘導之細胞免疫反應。相對於個體之基線、未投與免疫原性組合物之個體或已投與INO-4800 (pGX9501)之個體，可誘導約1.5倍至約16倍、約2倍至約12倍或約3倍至約10倍之體液免疫反應。所誘導之體液免疫反應可包括對抗原具有反應性之IgG抗體及/或中和抗體。所誘導之細胞免疫反應可包括CD8+ T細胞反應，其被誘導約2倍至約30倍、約3倍至約25倍或約4倍至約20倍。所誘導之細胞免疫反應可包括CD4+ T細胞反應，其被誘導約2倍至約30倍、約3倍至約25倍或約4倍至約20倍。所誘導之細胞免疫反應可包括Tfh細胞增加約2倍至約30倍、約3倍至約25倍或約4倍至約20倍。

疫苗劑量可在1 μg至10 mg活性組分/kg體重/次之間，且可為20 μg至10 mg組分/kg體重/次。可每21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40天或更多天，或每3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20週或更多週投與疫苗。用於有效治療之疫苗劑量之數目可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多。 a. 投藥

免疫原性組合物可根據熟習醫藥技術者所熟知之標準技術調配。可考慮諸如特定個體之年齡、性別、體重及病況以及投藥途徑之此類因素，以劑量形式且藉由熟悉醫療技術者所熟知之技術來投與此類組合物。疫苗可例如以一次、兩次、三次、四次或更多次注射之形式投與。在一些實施例中，向個體投與約0.5 mg至約2.0 mg核酸分子之初始劑量。初始劑量可以一次、兩次、三次或更多次注射之形式投與。在初始劑量後，可在先前劑量之後約一週、兩週、三週、四週、五週、六週、七種、八週、十週、十二週或更多週立即投與約0.5 mg至約2.0 mg核酸分子之一次、兩次、三次、四次或更多次後續劑量。各後續劑量可以一次、兩次、三次或更多次注射之形式投與。在一些實施例中，在額外藥劑之前、同時或之後向個體投與免疫原性組合物。在一些實施例中，在投與用於治療SARS-CoV-2感染或治療或預防與SARS-CoV-2感染相關之疾病或病症的藥劑後，以輔助劑形式投與免疫原性組合物。用於治療SARS-CoV-2感染或治療或預防與SARS-CoV-2感染相關之疾病或病症的藥劑可為例如(但不限於) SARS-CoV-2野生型匹配疫苗、pGX9501、INO-4800藥品或其生物類似藥、pGX9527或INO-4802藥品或其生物類似藥。在一個實施例中，與SARS-CoV-2感染相關之疾病或病症包括(但不限於)2019年冠狀病毒疾病(COVID-19)。在一些實施例中，與SARS-CoV-2感染相關之疾病或病症為成人多系統發炎症候群(MIS-A)或兒童多系統發炎症候群(MIS-C)。

個體可為哺乳動物，諸如人類、馬、非人類靈長類動物、母牛、豬、綿羊、貓、狗、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠或倉鼠。

可預防性或治療性地投與疫苗。在預防性投與中，疫苗可以足以誘導免疫反應之量投與。在治療性應用中，向有需要之個體投與足以引發治療作用之量的疫苗。將足以實現此目標之量定義為「治療有效劑量」。對此用途有效之量將視例如所投與之疫苗方案的特定組合物、投藥方式、疾病之階段及嚴重程度、患者之整體健康狀況及處方醫師之判斷而定。

可藉由Donnelly等人(Ann. Rev. Immunol. 15:617-648 (1997))；Felgner等人(U.S. Pat. No. 5,580,859,發佈於1996年12月3日)；Felgner (U.S. Pat. No. 5,703,055,發佈於1997年12月30日)；及Carson等人(U.S. Pat. No. 5,679,647,發佈於1997年10月21日) (所有文獻之內容均以全文引用之方式併入本文中)中所描述之此項技術中熟知的方法投與疫苗。疫苗之DNA可與粒子或珠粒複合，該等粒子或珠粒可例如使用疫苗槍向個體投與。熟習此項技術者應知曉，醫藥學上可接受之載劑(包括生理學上可接受之化合物)的選擇視例如表現載體之投藥途徑而定。

疫苗可經由各種途徑遞送。典型之遞送途徑包括非經腸投與，例如皮內、肌內或皮下遞送。其他途徑包括經口投與、鼻內及***內途徑。特定言之，對於疫苗之DNA，可將疫苗遞送至個體之組織的間質空間(Felgner等人, U.S. Pat. Nos. 5,580,859 and 5,703,055，其內容均以全文引用之方式併入本文中)。疫苗可投與至肌肉，或可經由皮內或皮下注射或經皮，諸如藉由離子電滲法進行投與。亦可使用疫苗之表皮投與。表皮投與可涉及以機械或化學方式刺激表皮之最外層以刺激針對刺激物之免疫反應(Carson等人, U.S. Pat. No. 5,679,647，其內容以全文引用之方式併入本文中)。經本文中所描述，在非經腸投與後可視情況進行電穿孔。

疫苗亦可經調配以用於經由鼻道之投與。適合於經鼻投與之調配物(其中載劑為固體)可包括粗粉末，其具有例如約10至約500微米範圍內之粒徑，該粗粉末係以鼻吸方式投與，亦即經由鼻道自保持於靠近鼻子之粉末容器中快速吸入。調配物可為鼻用噴霧、鼻滴劑或藉由噴霧器進行氣溶膠投與。調配物可包括疫苗之水性或油性溶液。

疫苗可為液體製劑，諸如懸浮液、糖漿或酏劑。疫苗亦可為用於非經腸、皮下、皮內、肌內或靜脈內投與(例如可注射投與)之製劑，諸如無菌懸浮液或乳液。

疫苗可併入脂質體、微球或其他聚合物基質中(Felgner等人, U.S. Pat. No. 5,703,055；Gregoriadis, Liposome Technology,第I至III卷(第2版1993)，其內容以全文引用之方式併入本文中)。脂質體可由磷脂或其他脂質組成，且可為生理學上可接受及可代謝之無毒載劑，該等載劑可相對簡單地製備及投與。

可經由電穿孔，諸如藉由美國專利第7,664,545號(其內容以引用之方式併入本文中)中所描述之方法投與疫苗。可藉由美國專利第6,302,874號；第5,676,646號；第6,241,701號；第6,233,482號；第6,216,034號；第6,208,893號；第6,192,270號；第6,181,964號；第6,150,148號；第6,120,493號；第6,096,020號；第6,068,650號及第5,702,359號(其內容以全文引用之方式併入本文中)中所描述之方法及/或設備進行電穿孔。可經由最小侵入式裝置進行電穿孔。

最小侵入式電穿孔裝置(「MID」)可為用於將上文所描述之疫苗及相關流體注射至身體組織中之設備。裝置可包含中空針、DNA卡匣及流體遞送構件，其中裝置經調適以在使用中啟動流體遞送構件，以便在將針***至身體組織期間同時(例如自動)將DNA注射至該身體組織中。此具有以下優點：在***針的同時逐漸注射DNA及相關流體之能力會使得身體組織中之流體分佈更均勻。由於所注射之DNA分佈於較大區域內，在注射期間經歷之疼痛可能會減少。

MID可在不使用針之情況下將疫苗注射至組織中。MID可以強力之細流或噴流形式注射疫苗，從而使得疫苗刺穿組織表面並進入皮下組織及/或肌肉中。細流或噴流背後的力可藉由壓縮氣體(諸如二氧化碳)在幾分之一秒內穿過微孔之膨脹來提供。最小侵入式電穿孔裝置之實例及其使用方法描述於出版之美國專利申請案第20080234655號；美國專利第6,520,950號；第7,171,264號；第6,208,893號；第6,009,347號；第6,120,493號；第7,245,963號；第7,328,064號及第6,763,264號中，其各者之內容以引用之方式併入本文中。

MID可包含注射器，其產生無痛刺穿組織之高速液體噴流。此類無針注射器為可商購的。可在本文中利用之無針注射器的實例包括美國專利第3,805,783號；第4,447,223號；第5,505,697號；及第4,342,310號(其各者之內容以引用之方式併入本文中)中所描述之無針注射器。

可使用無針注射器將呈適用於直接或間接電傳送之形式的所需疫苗引入(例如注射)所治療之組織中，通常藉由使組織表面與注射器接觸以便啟動藥劑之噴流之遞送，使用足夠的力以使得疫苗滲透至組織中。舉例而言，若所治療之組織為黏膜、皮膚或肌肉，則以足夠的力朝向黏膜或皮膚表面投射藥劑，以使得藥劑分別穿透角質層且進入真皮層，或進入皮下組織及肌肉。

無針注射器非常適合於將疫苗遞送至所有類型之組織，尤其遞送至皮膚及黏膜。在一些實施例中，無針注射器可用於將含有疫苗之液體推進至表面並推進至個體之皮膚或黏膜中。可使用本發明之方法治療之各種類型組織的代表性實例包括胰臟、喉頭、鼻咽、下咽、口咽、唇、咽喉、肺、心臟、腎臟、肌肉、***、大腸、***、胸腺、睪丸、皮膚、黏膜組織、卵巢、血管或其任何組合。

MID可具有對組織進行電穿孔之針電極。藉由在多電極陣列(例如以矩形或正方形圖案設定)中之多對電極之間施加脈衝，提供與在一對電極之間施加脈衝相比改良之結果。舉例而言，名稱為「Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes」之美國專利第5,702,359號揭示針陣列，其中複數對針可在治療性治療期間產生脈衝。在該申請案中，其以引用之方式併入本文中如同完全闡述一般，針係以圓形陣列形式安置，但具有實現相對之針電極對之間之脈衝的連接器及開關設備。可使用一對用於向細胞遞送重組表現載體之針電極。此類裝置及系統描述於美國專利第6,763,264號中，其內容以引用之方式併入本文中。或者，可使用單個針裝置，其藉由與正常注射針類似的單個針實現DNA之注射及電穿孔，且施加與當前使用之裝置所遞送的脈衝相比電壓更低之脈衝，因此降低患者經歷之觸電感。

MID可包含一或多個電極陣列。陣列可包含兩個或更多個具有相同直徑或不同直徑之針。針可均勻或不均勻地間隔開。針可在0.005吋與0.03吋之間、在0.01吋與0.025吋之間；或在0.015吋與0.020吋之間。針之直徑可為0.0175吋。針可間隔0.5 mm、1.0 mm、1.5 mm、2.0 mm、2.5 mm、3.0 mm、3.5 mm、4.0 mm或更遠。

MID可由脈衝發生器及兩個或更多個針疫苗注射器組成，該等注射器在單個步驟中遞送疫苗及電穿孔脈衝。脈衝發生器可經由快閃記憶卡操作之個人電腦實現脈衝及注射參數之可撓性程式化，以及全面記錄及儲存電穿孔及患者資料。脈衝發生器可在短時段期間遞送各種伏特之脈衝。舉例而言，脈衝發生器可遞送三個100 ms持續時間之15伏特脈衝。此類MID之實例為Inovio Biomedical Corporation之Elgen 1000系統，其描述於美國專利第7,328,064號中，其內容以引用之方式併入本文中。

MID可為CELLECTRA® (Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell Pa.)裝置及系統，其為模組化電極系統，該系統有助於將大分子(諸如DNA)引入身體或植物中之所選擇組織的細胞中。模組化電極系統可包含複數個針電極；皮下注射針；電連接器，其提供自可程式化恆定電流脈衝控制器至複數個針電極之導電連接；及電源。操作員可握緊安裝於支撐結構上之複數個針電極且將其牢固地***身體或植物中之所選擇組織中。接著，經由皮下注射針將大分子遞送至所選擇組織中。啟動可程式化恆定電流脈衝控制器且向複數個針電極施加恆定電流電脈衝。所施加之恆定電流電脈衝有助於將大分子引入複數個電極之間的細胞中。藉助於恆定電流脈衝，藉由限制組織中之能量耗散來最小化由細胞過熱引起之細胞死亡。Cellectra®裝置及系統描述於美國專利第7,245,963號中，其內容以引用之方式併入本文中。CELLECTRA®裝置可為CELLECTRA 2000®裝置或CELLECTRA® 3PSP裝置。CELLECTRA® 2000裝置經製造商組態以支援皮內(intradermal；ID)或肌內(intramuscular；IM)投與。CELLECTRA™ 2000包括CELLECTRA™脈衝發生器、適合之供液器、拋棄式無菌陣列及拋棄式護套(僅ID)。在臨電穿孔治療之前，分別經由針及注射器注射在電極所界定之區域中遞送DNA質體。

MID可為Elgen 1000系統(Inovio Pharmaceuticals)。Elgen 1000系統可包含提供中空針之裝置；及流體遞送構件，其中設備經調適以在使用中啟動流體遞送構件，以便在將針***至身體組織期間同時(例如自動)將流體(本文中所描述之疫苗)注射至該身體組織中。優點為在***針的同時逐漸注射流體之能力會使得身體組織中之流體分佈更均勻。亦咸信由於所注射之流體之體積分佈於較大區域內，在注射期間經歷之疼痛會減少。

此外，流體之自動注射有助於自動監測及記錄流體之實際注射劑量。可視需要藉由控制單元儲存此資料以用於文件製作目的。

應瞭解，注射速率可為線性或非線性的，且可在針已***穿過所治療之個體之皮膚後且在針進一步***身體組織中時進行注射。

可藉由本發明之設備注射流體的適合之組織包括腫瘤組織、皮膚或肝臟組織，但亦可為肌肉組織。

設備進一步包含用於導引針***身體組織中之針***構件。藉由針***速率控制流體之注射速率。此具有可控制針***及流體注射兩者之優點，從而使得***速率可視需要與注射速率匹配。其亦使得設備更易於由使用者操作。視需要，可提供用於將針自動***身體組織中之構件。

使用者可選擇何時開始注射流體。然而理想的是，在針尖已達到目標組織時開始注射且設備可包括用於感測針何時已***足以開始注射流體之深度的構件。此意謂在針已達到所需深度(其通常將為開始出現肌肉組織之深度)時，可促使流體自動開始注射。可例如採集開始出現肌肉組織之深度作為預設針***深度(諸如4 mm之值)，此將認為足以使針穿過表層。

感測構件可包含超音波探針。感測構件可包含用於感測阻抗或阻力變化之構件。在此情況下，構件可能並非由此記錄身體組織中之針的深度，而實情為經調適以感測隨著針自不同類型之身體組織移動進入肌肉時的阻抗或阻力變化。此等替代方案中之任一者提供操作感測構件開始注射之相對精確性及簡單性。可視需要進一步記錄針之***深度且可用於控制流體注射，從而根據所記錄之針***深度確定所注射之流體體積。

設備可進一步包含：用於負載針之基座；及用於將基座收納於其中之外殼，其中基座可相對於外殼移動，從而實現當基座相對於外殼位於第一背向位置時，針縮回外殼內且當基座位於外殼內之第二正向位置時，針伸展出外殼。此對於使用者而言為有利的，因為外殼可在患者之皮膚上排列，且接著可藉由相對於基座移動外殼來將針***患者之皮膚中。

如上文所陳述，需要實現受控流體注射速率，從而使得流體在針***皮膚中時在針之長度內均勻分佈。流體遞送構件可包含經調適以受控速率注射流體之活塞驅動構件。活塞驅動構件可例如由伺服馬達啟動。然而，可藉由基座相對於外殼在軸向方向上移動來啟動活塞驅動構件。應瞭解，可提供用於流體遞送之替代性構件。因此，舉例而言，可提供可經擠壓以用於以受控或非受控速率遞送流體之封閉容器來替代注射器及活塞系統。

上文所描述之設備可用於任何類型之注射。然而，設想其尤其適用於電穿孔領域，且因此其可進一步包含用於向針施加電壓之構件。此使得針不僅可用於注射，且亦在電穿孔期間用作電極。此為尤其有利的，因為其意謂將電場與注射流體施加至相同區域。電穿孔傳統上存在極難以精確對準電極與預先注射之流體的問題，且因此使用者傾向於在較大區域內注射比所需體積更大的體積之流體且在較高區域內施加電場以嘗試確保注射物質與電場之間的重疊。使用本發明，可降低所注射之流體體積及所施加之電場大小，同時實現電場與流體之間的良好配合。 在組合中之用途

在一些實施例中，本發明提供一種在有需要之個體中治療、保護免於及/或預防SARS-CoV-2感染，或治療、保護免於及/或預防與SARS-CoV-2感染相關之疾病或病症的方法，其係藉由投與編碼如本文中所揭示之SARS-CoV-2棘抗原或其片段或變異體之核酸分子，以及用於治療、保護免於及/或預防SARS-CoV-2感染或治療或預防與SARS-CoV-2感染相關之疾病或病症的一或多種額外藥劑之組合來實現。根據一些實施例，SARS-CoV-2為SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529)變異體。在一些實施例中，與SARS-CoV-2感染相關之疾病或病症為2019年冠狀病毒疾病(COVID-19)、成人多系統發炎症候群(MIS-A)或兒童多系統發炎症候群(MIS-C)。

可使用任何適合之方法投與編碼SARS-CoV-2棘抗原之核酸分子及額外藥劑，從而使得編碼SARS-CoV-2棘抗原之核酸分子與額外藥劑之組合均存在於個體中。在一個實施例中，方法可包含：投與包含用於預防或治療SARS-CoV-2感染或治療或預防與SARS-CoV-2感染相關之疾病或病症之藥劑的第一組合物，及在投與包含用於治療或預防SARS-CoV-2感染或治療或預防與SARS-CoV-2感染相關之疾病或病症之藥劑的第一組合物後少於1天、少於2天、少於3天、少於4天、少於5天、少於6天、少於7天、少於8天、少於9天或少於10天，投與包含編碼如本文中所揭示之SARS-CoV-2棘抗原之核酸分子的第二組合物。在一個實施例中，方法可包含：投與包含編碼如本文中所揭示之SARS-CoV-2棘抗原之核酸分子的第一組合物，及在投與編碼SARS-CoV-2棘抗原之核酸分子後少於1天、少於2天、少於3天、少於4天、少於5天、少於6天、少於7天、少於8天、少於9天或少於10天，投與包含用於治療或預防SARS-CoV-2感染或治療或預防與SARS-CoV-2感染相關之疾病或病症之藥劑的第二組合物。在一個實施例中，方法可包含：同時投與包含用於治療或預防SARS-CoV-2感染或治療或預防與SARS-CoV-2感染相關之疾病或病症之藥劑的第一組合物及包含編碼如本文所揭示之SARS-CoV-2棘抗原之核酸分子的第二組合物。在一個實施例中，方法可包含：投與包含用於治療或預防SARS-CoV-2感染或治療或預防與SARS-CoV-2感染相關之疾病或病症之藥劑及編碼如本文所揭示之SARS-CoV-2棘抗原之核酸分子的單一組合物。根據所揭示之方法，編碼SARS-CoV-2棘抗原之核酸分子包含SEQ ID NO: 2之核苷酸55至3828之核酸序列、SEQ ID NO: 2之核酸序列、SEQ ID NO: 3之核酸序列、pGX9541、INO-4803或其生物類似藥。

在一些實施例中，用於治療或預防SARS-CoV-2感染或治療或預防與SARS-CoV-2感染相關之疾病或病症的藥劑為治療劑。在一個實施例中，治療劑為抗病毒劑。在一個實施例中，治療劑為抗生素劑。

可與編碼本發明之SARS-CoV-2抗原之核酸分子組合使用之抗生素的非限制性實例包括胺基醣苷類(例如正大黴素(gentamicin)、阿米卡星(amikacin)、妥布黴素(tobramycin))、喹啉酮(例如環丙沙星(ciprofloxacin)、左氧丙沙星(levofloxacin))、頭孢菌素(例如頭孢他啶(ceftazidime)、頭孢吡肟(cefepime)、頭孢哌酮(cefoperazone)、頭孢匹羅(cefpirome)、頭孢吡普(ceftobiprole))、抗假單胞菌青黴素：羧基青黴素(carboxypenicillin) (例如卡本西林(carbenicillin)及替卡西林(ticarcillin))及脲基青黴素(ureidopenicillin) (例如美洛西林(mezlocillin)、阿洛西林(azlocillin)及哌拉西林(piperacillin))、碳青黴烯類(carbapenem) (例如美羅培南(meropenem)、亞胺培南(imipenem)、多尼培南(doripenem))、多黏菌素類(polymyxins) (例如多黏菌素B及克利斯汀(colistin))及單環β-內醯胺類(monobactam) (例如安曲南(aztreonam))。 以輔助劑形式投與

在一個實施例中，在投與用於治療或預防SARS-CoV-2感染或治療或預防與SARS-CoV-2感染相關之疾病或病症的初始藥劑或疫苗之前或之後以輔助劑疫苗形式投與免疫原性組合物，該與SARS-CoV-2感染相關之疾病或病症包括(但不限於) COVID-19、成人多系統發炎症候群(MIS-A)或兒童多系統發炎症候群(MIS-C)。根據所揭示之方法，用於治療或預防SARS-CoV-2感染或治療或預防與SARS-CoV-2感染相關之疾病或病症的初始藥劑可為例如(但不限於) SARS-CoV-2野生型匹配疫苗、pGX9501、INO-4800藥品或其生物類似藥、pGX9527或INO-4802藥品或其生物類似藥。在一些實施例中，輔助劑疫苗包含SEQ ID NO: 2之核苷酸55至3828之核酸序列、SEQ ID NO: 2之核酸序列、SEQ ID NO: 3之核酸序列、pGX9541、INO-4803或其生物類似藥。

在一些實施例中，在投與用於治療或預防SARS-CoV-2感染或治療或預防與SARS-CoV-2感染相關之疾病或病症的初始藥劑或疫苗之後，投與輔助劑疫苗至少一次、至少兩次、至少3次、至少4次或至少5次，該與SARS-CoV-2感染相關之疾病或病症包括(但不限於) COVID-19、成人多系統發炎症候群(MIS-A)或兒童多系統發炎症候群(MIS-C)。在一個實施例中，在投與用於治療或預防SARS-CoV-2感染或治療或預防與SARS-CoV-2感染相關之疾病或病症的初始藥劑或疫苗至少8小時、至少12小時、至少16小時、至少20小時、至少24小時、至少36小時、至少48小時、至少60小時、至少72小時、至少4天、至少5天、至少6天、至少1週、至少2週、至少3週、至少4週、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少1年或超過1年後，投與輔助劑疫苗，該與SARS-CoV-2感染相關之疾病或病症包括(但不限於) COVID-19、成人多系統發炎症候群(MIS-A)或兒童多系統發炎症候群(MIS-C)。 在分析法中之用途

在一些實施例中，本發明之核酸分子或經編碼之抗原可用於活體內或活體外分析法中。在一些實施例中，核酸分子或經編碼之抗原可用於用以偵測抗SARS-CoV-2棘抗體之存在的分析法中。核酸分子或經編碼之抗原可併入其中之例示性分析法包括(但不限於)西方墨點法(Western blot)、點狀墨點法(dot blot)、表面電漿子共振法、流式細胞分析技術法、各種免疫分析法(例如免疫組織化學分析法、免疫細胞化學分析法、ELISA、捕獲ELISA、酶聯免疫斑點(ELISpot)分析法、夾心分析法、酶免疫分析法、放射免疫分析法、螢光免疫分析法及其類似分析法)，所有分析法均為熟習此項技術者已知的。參見例如Harlow等人, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York；Harlow等人, 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY。

在一個實施例中，本發明之SARS-CoV-2棘抗原或其片段可用於與流式細胞分析技術組合之用於胞內細胞介素染色的分析法中，以評估T細胞免疫反應。此分析法能夠同時評估與回應T細胞有關之多種表現型、分化及功能參數，最值得注意的是，多種效應細胞介素之表現。此等屬性使得該技術尤其適合於評估由本發明之疫苗所誘導之T細胞免疫反應。

在一個實施例中，本發明之SARS-CoV-2棘抗原或其片段可用於ELIspot分析法中。ELISpot分析法為高靈敏度免疫分析法，其量測單個細胞水平下分泌細胞介素之細胞的出現率。在此分析法中，在存在或不存在刺激物之情況下在塗佈有特定捕捉抗體之表面上培養細胞。在一個實施例中，本發明之SARS-CoV-2棘抗原或其片段可在ELISpot分析法中用作刺激物。 診斷方法

在一些實施例中，本發明係關於將個體診斷為患有SARS-CoV-2感染或具有SARS-CoV-2抗體之方法。在一些實施例中，方法包括使來自個體之樣品與本發明之SARS-CoV-2棘抗原或包含用於表現SARS-CoV-2棘抗原之核酸分子的細胞接觸，且偵測抗SARS-CoV-2棘抗體與本發明之SARS-CoV-2棘抗原的結合。在此類實施例中，個體之樣品中所存在之抗SARS-CoV-2棘抗體與本發明之抗原或其片段的結合將指示個體目前感染SARS-CoV-2或先前感染SARS-CoV-2。 套組及製品

本文提供一種套組，其可用於使用上文所描述之疫苗接種方法治療個體。套組可包含本文中所描述之免疫原性組合物。

套組亦可包含關於進行上文所描述之疫苗接種方法及/或如何使用套組的說明書。套組中所包括之說明書可貼附至包裝材料或可作為藥品說明書包括在內。雖然說明書通常為書面或印刷材料，但其不限於此。本發明涵蓋能夠儲存說明書且將其傳達至終端使用者之任何媒體。此類媒體包括(但不限於)電子儲存媒體(例如磁碟、磁帶、磁匣)、光學媒體(例如CD ROM)及其類似媒體。如本文中所使用，術語「說明書」可包括提供說明書之網際網路站點的位址。

本文進一步提供含有本文中所描述之免疫原性組合物的製品。在一些實施例中，製品為容器，諸如小瓶，視情況為單次用小瓶。在一個實施例中，製品為配備有塞子之單次用玻璃小瓶，其含有所投與之本文中所描述之免疫原性組合物。在一些實施例中，小瓶包含可由注射器刺穿之塞子及密封件。在一些實施例中，製品為注射器。

本文亦提供包含本發明之免疫原性組合物的製品。在一些實施例中，製品為容納免疫原性組合物之容器。容器可為例如(但不限於)注射器或小瓶。小瓶可具有可由注射器刺穿之塞子。免疫原性組合物可以多次劑量形式或以單位劑型封裝於適當滅菌容器(諸如安瓿、瓶子或小瓶)中。容器較佳在用疫苗製劑填充之後進行密閉性密封。較佳地，疫苗封裝於貼有標籤之容器中，該標籤鑑別疫苗，且附有由政府機構(諸如美國食品藥物管理局(the United States Food and Drug Administration))所規定之形式的公告，其反映疫苗根據適當法律、劑量資訊及其類似者之批准。標籤較佳含有關於疫苗之資訊，其適用於向患者投與疫苗之健康照護專業人員。包裝亦較佳含有與疫苗投與相關之印刷資訊材料、說明書、適應症及任何需要且必需之警告。 實例

本文中所描述之實例及實施例係僅出於說明之目的，且熟習此項技術者提出之各種修改或變化將包括於本申請案之精神及範圍以及隨附申請專利範圍之範疇內。 實例 1 ： INO-4803 、 SARS-CoV-2 Omicron 棘匹配之合成 DNA 疫苗的設計

合成DNA疫苗候選物INO-4803 (pGX9541；SEQ ID NO: 3)經設計以提供針對SARS-CoV-2 Omicron所關注變異體(VOC)之免疫覆蓋度，該所關注變異體經鑑別在2021年流行於南非(Ren, S.Y.等人, Omicron variant (B.1.1.529) of SARS-CoV-2: Mutation, infectivity, transmission, and vaccine resistance. World J Clin Cases, 2022. 10(1):第1至11頁)。研究揭示SARS-CoV-2 Omicron VOC逃避由COVID-19疫苗之第一代所引發之中和抗體反應，該等疫苗已經設計以表現上代棘抗原(Liu, L.等人, Striking antibody evasion manifested by the Omicron variant of SARS-CoV-2. Nature, 2022. 602(7898):第676至681頁。Dejnirattisai, W.等人, Reduced neutralisation of SARS-CoV-2 omicron B.1.1.529 variant by post-immunisation serum. Lancet, 2021)。

INO-4803為一種DNA質體(pGX9541；SEQ ID NO: 3)之調配物。pGX9541為表現合成共同(SynCon®) SARS-CoV-2棘蛋白(SARS-CoV-2 Omicron棘OPT)之DNA質體，其經設計以反映在SARS-CoV-2譜系B.1.1.529 (Omicron) (一種在世界範圍內新出現之變異體，其由人類CMV啟動子(hCMV啟動子)驅動，且具有牛生長激素3'末端聚腺苷酸化信號(bGH聚A (bGH polyA)))中觀測到的胺基酸變化。pGX0001主鏈包括康黴素(kanamycin)抗性基因(KanR)及質體複製起點(pUC ori)以用於生產目的。此等元件在真核細胞中不具有功能性。pGX9541之示意圖呈現於圖1中。

pGX9541係衍生自人類巨細胞病毒立即早期啟動子(hCMV啟動子)與bGH聚A之間的SynCon® SARS-CoV-2 Omicron棘OPT編碼序列至pGX0001 (經修飾之pVAX1表現載體)之選殖。原始pVAX1表現載體獲自Thermo Fisher Scientific。

經修飾之表現載體pVAX1 (pGX0001)的圖及描述展示於圖2中。將修飾引入至pVAX1中以產生pGX0001且基於可購自Thermo Fisher Scientific之pVAX1的報告序列來鑑別。此等修飾為：

C＞G	241	在hCMV啟動子中
C＞T	1158	牛生長激素聚腺苷酸化信號(bGH聚A)下游之主鏈
A＞ -	2092	康黴素抗性基因(KanR)下游之主鏈
C＞T	2493	在pUC複製起點(pUC ori)
G＞C	2969	在核糖核酸酶H (RNASeH)部位上游之pUC Ori之最末端

鹼基對2、3及4在hCMV啟動子上游之主鏈中自ACT變為CTG。

如圖3中所示，pGX9541係藉由在BamHI及XhoI部位處將SynCon® SARS-CoV-2 Omicron棘OPT編碼序列選殖至pGX0001中來製備。產生SynCon® SARS-CoV-2 Omicron棘OPT編碼序列之DNA序列以反映在Omicron SARS CoV2變異體中觀測到的胺基酸變化，且接著使用用於人類中之表現的Inovio專屬基因最佳化演算法(Gene Optimization ALgorithm；GOAL)來最佳化。

使用全球流感資料共享計劃(Global Initiative on Sharing All Influenza Data；GISAID)收集提交之SARS-CoV-2基因體序列資料。自GISAID收集在設計時可用之指定至譜系B.1.1.529的所有序列條目(176個序列條目) (Shu等人, 2017, EuroSurveillance, 22(13) doi:10.2807/1560-7917.ES.2017.22.13.30494 PMCID: PMC5388101；Rambaut等人, 2020, Nat Microbiol. 2020年11月;5(11):1403-1407. doi: 10.1038/s41564-020-0770-5. 2020年7月15日電子版. PMID: 32669681)。分析中所使用之條目的寄存編號可提供如下： EPI_ISL_6590782、EPI_ISL_6640916、EPI_ISL_6640917、EPI_ISL_6640919、EPI_ISL_6647956、EPI_ISL_6647957、EPI_ISL_6647958、EPI_ISL_6647959、EPI_ISL_6647960、EPI_ISL_6647961、EPI_ISL_6647962、EPI_ISL_6670244、EPI_ISL_6698790、EPI_ISL_6698792、EPI_ISL_6699728、EPI_ISL_6699729、EPI_ISL_6699730、EPI_ISL_6699731、EPI_ISL_6699732、EPI_ISL_6699733、EPI_ISL_6699734、EPI_ISL_6699735、EPI_ISL_6699736、EPI_ISL_6699737、EPI_ISL_6699738、EPI_ISL_6699739、EPI_ISL_6699740、EPI_ISL_6699741、EPI_ISL_6699742、EPI_ISL_6699743、EPI_ISL_6699744、EPI_ISL_6699745、EPI_ISL_6699746、EPI_ISL_6699747、EPI_ISL_6699748、EPI_ISL_6699749、EPI_ISL_6699750、EPI_ISL_6699751、EPI_ISL_6699752、EPI_ISL_6699753、EPI_ISL_6699754、EPI_ISL_6699755、EPI_ISL_6699756、EPI_ISL_6699757、EPI_ISL_6699758、EPI_ISL_6699759、EPI_ISL_6699760、EPI_ISL_6699761、EPI_ISL_6699762、EPI_ISL_6699763、EPI_ISL_6699764、EPI_ISL_6699765、EPI_ISL_6699766、EPI_ISL_6699767、EPI_ISL_6699768、EPI_ISL_6699769、EPI_ISL_6699770、EPI_ISL_6699771、EPI_ISL_6704864、EPI_ISL_6704867、EPI_ISL_6704870、EPI_ISL_6704871、EPI_ISL_6704872、EPI_ISL_6704873、EPI_ISL_6704874、EPI_ISL_6704875、EPI_ISL_6752026、EPI_ISL_6752027、EPI_ISL_6774081、EPI_ISL_6774082、EPI_ISL_6774083、EPI_ISL_6774084、EPI_ISL_6774085、EPI_ISL_6774086、EPI_ISL_6774087、EPI_ISL_6774088、EPI_ISL_6774089、EPI_ISL_6774090、EPI_ISL_6774091、EPI_ISL_6774092、EPI_ISL_6774093、EPI_ISL_6777160、EPI_ISL_6782043、EPI_ISL_6782055、EPI_ISL_6782056、EPI_ISL_6782071、EPI_ISL_6782079、EPI_ISL_6782080、EPI_ISL_6782084、EPI_ISL_6782090、EPI_ISL_6782092、EPI_ISL_6794907、EPI_ISL_6795188、EPI_ISL_6795189、EPI_ISL_6795190、EPI_ISL_6795191、EPI_ISL_6795192、EPI_ISL_6795193、EPI_ISL_6795195、EPI_ISL_6795199、EPI_ISL_6795202、EPI_ISL_6795212、EPI_ISL_6795406、EPI_ISL_6795833、EPI_ISL_6795835、EPI_ISL_6795836、EPI_ISL_6795837、EPI_ISL_6795838、EPI_ISL_6795839、EPI_ISL_6795840、EPI_ISL_6795841、EPI_ISL_6795842、EPI_ISL_6795844、EPI_ISL_6795845、EPI_ISL_6795846、EPI_ISL_6795847、EPI_ISL_6795848、EPI_ISL_6795849、EPI_ISL_6795850、EPI_ISL_6810482、EPI_ISL_6810483、EPI_ISL_6810484、EPI_ISL_6810485、EPI_ISL_6810487、EPI_ISL_6814922、EPI_ISL_6814923、EPI_ISL_6818284、EPI_ISL_6821008、EPI_ISL_6825389、EPI_ISL_6825390、EPI_ISL_6825391、EPI_ISL_6825392、EPI_ISL_6825393、EPI_ISL_6825394、EPI_ISL_6825395、EPI_ISL_6825396、EPI_ISL_6825397、EPI_ISL_6825398、EPI_ISL_6825546、EPI_ISL_6825551、EPI_ISL_6826713、EPI_ISL_6826714、EPI_ISL_6829575、EPI_ISL_6829577、EPI_ISL_6832108、EPI_ISL_6832737、EPI_ISL_6833884、EPI_ISL_6834467、EPI_ISL_6841607、EPI_ISL_6841608、EPI_ISL_6841609、EPI_ISL_6841610、EPI_ISL_6841611、EPI_ISL_6841612、EPI_ISL_6841613、EPI_ISL_6841614、EPI_ISL_6841615、EPI_ISL_6841616、EPI_ISL_6841617、EPI_ISL_6841619、EPI_ISL_6841980、EPI_ISL_6841981、EPI_ISL_6842154、EPI_ISL_6842155、EPI_ISL_6842156、EPI_ISL_6842157、EPI_ISL_6842158、EPI_ISL_6842159、EPI_ISL_6842160、EPI_ISL_6842161、EPI_ISL_6842162、EPI_ISL_6842163、EPI_ISL_6842164、EPI_ISL_6842165、EPI_ISL_6842166、EPI_ISL_6842167 分析在來自此等條目之SARS-CoV-2棘序列中觀測到的突變資料。接著彙總結果以確定在指定至譜系B.1.1.529之此等SARS-CoV-2棘蛋白序列中一致觀測到的一組共同共同突變。接著將此等胺基酸變化置放於由pGX9501 (INO-4800中所使用之質體)之SynCon® SARS-CoV-2棘所編碼之棘肽序列中，由此產生SARS-CoV-2譜系B.1.1.529 (Omicron)特異性棘蛋白序列。

另外，向SynCon® SARS-CoV-2 Omicron棘OPT中添加命名為「2P」之串聯脯胺酸突變(K986P/V987P)。此外，與INO-4800中所使用之序列一致的IgE前導序列亦置換內源性SARS-CoV-2棘信號肽序列。

接著，將具有上文所提及之變化的肽序列用作GOAL演算法中之輸入物，以產生SynCon® SARS-CoV-2 Omicron棘OPT之人類表現最佳化DNA序列，pGX9541之編碼序列(SEQ ID NO: 2)。

除了用於將構築體次選殖至pGX0001載體中之限制部位(5' BamHI及3' XhoI)以外，構築體合成中包括在緊臨起始密碼子之5'處添加科紮克序列(GCCACC)。合成經最佳化之DNA序列，用BamHI及XhoI消化，且在巨細胞病毒立即早期啟動子之控制下選殖至表現載體pGX0001中。

SynCon® SARS-CoV-2 Omicron棘OPT之胺基酸序列及核苷酸序列分別為SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2。 實例 2 ： 小鼠及倉鼠模型中之 INO-4803 、 SARS-CoV-2 Omicron 棘匹配之合成 DNA 疫苗的免疫原性A. BALB/c小鼠中之INO-4803、SARS-CoV-2 Omicron棘匹配之合成DNA疫苗的免疫原性

在雌性BALB/c小鼠中藉由肌內(IM)注射進行投與，隨後進行電穿孔(EP)之後，評估編碼SARS-CoV-2 Omicron BA.1棘變異體抗原之DNA疫苗候選物pGX9541質體之免疫原性。研究設計概述於圖4中。在第0天，小鼠接受藉由肌內注射遞送之單次劑量之DNA質體，隨後用CELLECTRA® 3P進行電穿孔。在第19天，處死小鼠，且對所收集之樣品進行IFNɣ ELISpot、抗體結合及假病毒中和分析法。 材料及方法：

結合抗體ELISA：用1 µg/ml之SARS-CoV-2棘蛋白(Acro Biosystems目錄號SPN-C52H9)、1 µg/ml之SARS-CoV-2 Omicron變異體棘蛋白(Acro Biosystems目錄號SPN-C52Hz)、1 µg/ml之SARS-CoV-2 Delta變異體棘蛋白(Acro Biosystems目錄號SPN-C52He)塗佈96孔之高結合Corning Costar半區盤(目錄號3690)。另外，亦用1 µg/ml之SARS-CoV-2棘RBD蛋白(Sino Biological目錄號40592-V08B)及1 µg/ml之SARS-CoV-2 Omicron變異體棘RBD蛋白(Sino Biological目錄號40592-V08H121)塗佈盤。所有蛋白質均含有His標籤。在4℃下在1×DPBS (Thermo Scientific)中塗佈所有盤隔夜。次日，用1×PBS + 0.05% Tween-20洗滌盤，且在室溫(RT)下用於PBS + Tween-20中之3% BSA阻斷2小時。接著，如前所述洗滌盤且添加連續稀釋之血清樣品，且在RT下培育盤2小時。洗滌盤且在室溫下用1:10,000稀釋度之抗小鼠IgG HRP二級抗體(Sigma目錄號A4416)培育1小時。洗滌盤且向盤中添加100 µl/孔之SureBlue TMB受質(KPL 5120-0077)。在培育10分鐘之後，添加TMB停止溶液(KPL 5150-0021)後反應停止，且在Biotek Synergy盤讀取器上在450 nm波長處讀出盤。

小鼠IFNγ ELISpot分析法：小鼠IFN-γELISpot套組係購自MabTech (MabTech #3321-4APW-10)以評估抗原特異性反應。根據製造商之方案在PBS中洗滌預塗佈之96孔盤，且在室溫下用R10培養基阻斷至少一小時。將經分離之脾細胞再懸浮於R10培養基中且以2×10 ⁵個細胞/孔一式三份地接種。跨越WT、Delta或Omicron SARS-2-CoV S蛋白(Genscript)之全長棘蛋白序列的重疊15-聚體肽(由9個殘基重疊)係用作回憶抗原。將此等肽再懸浮於DMSO (Sigma)中且以每個肽約5 µg/ml之濃度合併至5個肽池中以用於細胞刺激。為了製備巨池(Megapool)，將各肽池以相同莫耳當量混合在一起，使得最終濃度為1 µg/ml。以5 µg/ml使用刀豆球蛋白A (Concavalin A) (Sigma)作為陽性對照且使用具有DMSO之完全培養基作為陰性對照。在37℃ 5% CO ₂下培育盤最少18小時。為了開發，首先在PBS中洗滌盤，接著在室溫下用經生物素標記之抗小鼠IFN-γ偵測抗體(R4-6A2-生物素)培育2小時。在洗滌之後，接著在室溫下用鏈黴抗生物素蛋白-ALP (MabTech #3321-4APW-10)培育盤1小時。洗滌盤，且根據製造商之說明書(MabTech)使用經過濾之受質溶液(BCIP/NBT-plus)偵測斑點。盤一經乾燥，則使用自動化ELISpot讀取器(Cellular Technology)對斑點進行計數。將平均斑點形成單位(SFU)調節至1×10 ⁶個脾細胞，且抗原特異性反應報導為大於DMSO對照組之每1×10 ⁶個脾細胞的IFN-γ SFU數目。 SARS-CoV-2假病毒中和分析法：

假病毒產生：使用經脂染胺3000 (ThermoFisher)轉染之HEK293T細胞，分別使用與pNL4-3.Luc.R-E-質體(NIH AIDS試劑)以1:8之比率共轉染之IgE-SARS-CoV-2 S質體變異體(Genscript)產生編碼武漢(WT)、B.1.617.2 (Delta)、B.1.1.529 (Omicron)棘蛋白之SARS-CoV-2假病毒儲備物。轉染後72小時，收集上清液，進行滅菌過濾(Millipore Sigma)並等分以用於在-80℃下儲存。

假病毒中和：以7,000個細胞/孔穩定表現ACE2之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(ACE2-CHO)係用作靶細胞。感染72小時之後，滴定SARS-CoV-2假病毒以得到大於30倍之細胞僅對照相對發光單位(RLU)。熱不活化動物血清且以1:32之稀釋度開始連續稀釋兩倍。在室溫下將血清與SARS-CoV-2假病毒一起培育90分鐘。培育之後，將血清-假病毒混合物添加至ACE2-CHO中且使其在標準培育箱(37℃，5% CO ₂)中培育72小時。72小時後，使用Britelite plus報導基因(PerkinElmer™)裂解細胞，且使用自動化光度計量測RLU。使用GraphPad Prism 8計算中和效價(ID ₅₀)，且將其定義為在減去細胞對照孔中之背景RLU後，與病毒對照孔中之RLU相比，RLU減少50%之倒數血清稀釋度。 結果：

在用SARS-CoV-2肽刺激脾細胞之後，在單次免疫接種後的第19天藉由IFNγ ELISpot量測T細胞反應。用含有跨越WT或 Omicron變異體棘蛋白之肽巨池的細胞培養基刺激脾細胞(圖5A)。在用10 µg之SARS-CoV-2質體pGX9501及pGX9541進行單次免疫接種後，在小鼠中偵測到抗原特異性T細胞反應，但在空載體對照中未偵測到。用pGX9501或pGX9541進行免疫接種使得針對WT及Omicron棘肽之平均斑點計數相對於經pGX0001給藥之小鼠增加。所有測試質體均引發針對WT及Omicron棘肽之SARS-CoV-2棘特異性T細胞反應。

藉由在免疫接種後的第19天所收集之血清樣品中進行結合IgG ELISA來量測針對全長WT及Omicron SARS-CoV-2棘蛋白之體液反應(圖5B)。所有經測試之變異體的抗體結合效價在給藥pGX0001之所有小鼠中均不存在。用pGX9501 (INO-4800)免疫接種之小鼠展現與對照小鼠相比升高之終點結合效價，其中在6/6及5/6之動物中觀測到針對全長WT及Omicron棘蛋白之血清轉化。接受pGX9541之小鼠中的抗體結合效價展現針對Omicron抗原之100%血清轉化及針對WT抗原之4/6動物血清轉化。

在免疫接種後的19天，評估包括WT及Omicron變異體之SARS-CoV-2棘變異體的假病毒中和(圖5C)。基於血清稀釋度計算ID ₅₀值，該血清稀釋度賦予50%針對所測試之各假病毒變異體之抑制作用。用pGX0001免疫接種不產生針對任一假病毒之中和活性。用pGX9501免疫接種使得6隻小鼠中之2隻產生針對WT假病毒之中和且使得6隻小鼠中之1隻產生針對Omicron之中和。用pGX9541免疫接種使得6隻小鼠中之5隻產生Omicron假病毒之中和(圖5C)。在用pGX9541免疫接種之小鼠中未觀測到針對WT假病毒之交叉中和活性。 B ： C57BL/6 小鼠中之 INO-4803 、 SARS-CoV-2 Omicron 棘匹配之合成 DNA 疫苗的免疫原性材料及方法：

結合抗體ELISA：用1 µg/ml之SARS-CoV-2棘蛋白(Acro Biosystems目錄號SPN-C52H9)、1 µg/ml之SARS-CoV-2 Omicron變異體棘蛋白(Acro Biosystems目錄號SPN-C52Hz)、1 µg/ml之SARS-CoV-2 Delta變異體棘蛋白(Acro Biosystems目錄號SPN-C52He)塗佈96孔之高結合Corning Costar半區盤(目錄號3690)。另外，亦用1 µg/ml之SARS-CoV-2棘RBD蛋白(Sino Biological目錄號40592-V08B)及1 µg/ml之SARS-CoV-2 Omicron變異體棘RBD蛋白(Sino Biological目錄號40592-V08H121)塗佈盤。所有蛋白質均含有His標籤。在4℃下在1×DPBS (Thermo Scientific)中塗佈所有盤隔夜。次日，用1×PBS + 0.05% Tween-20洗滌盤，且在室溫(RT)下用於PBS + Tween-20中之3% BSA阻斷2小時。接著，如前所述洗滌盤且添加連續稀釋之血清樣品，且在RT下培育盤2小時。洗滌盤且在室溫下用1:10,000稀釋度之抗小鼠IgG HRP二級抗體(Sigma目錄號A4416)培育1小時。洗滌盤且向盤中添加100 µl/孔之SureBlue TMB受質(KPL 5120-0077)。在培育10分鐘之後，添加TMB停止溶液(KPL 5150-0021)後反應停止，且在Biotek Synergy盤讀取器上在450 nm波長處讀出盤。

小鼠IFNγ ELISpot分析法：小鼠IFN-γ ELISpot套組係購自MabTech (MabTech #3321-4APW-10)以評估抗原特異性反應。根據製造商之方案預塗佈之96孔盤在PBS中洗，且在室溫用R10培養基阻斷至少一小時。將經分離之脾細胞再懸浮於R10培養基中且以2×10 ⁵個細胞/孔一式三份地接種。跨WT、Delta或Omicron SARS-2-CoV S蛋白(Genscript)之全長棘蛋白序列的重疊15-聚體肽(由9個殘基重疊)係用作回憶抗原(recall antigens)。將此等肽再懸浮於DMSO (Sigma)中且以每個肽約5 µg/ml之濃度匯集至5個肽池中用於細胞刺激。為了製備巨池，將各肽池以相同莫耳當量混合在一起，使得最終濃度為1 µg/ml。以5 µg/ml刀豆球蛋白A (Concavalin A) (Sigma)作為陽性對照且使用具有DMSO之完全培養基作為陰性對照。在37℃ 5% CO ₂下培育盤最少18小時。為了開發，盤先在PBS中洗，接著在室溫用經生物素標記之抗小鼠IFN-γ偵測抗體(R4-6A2-生物素)培育2小時。在洗之後，接著在室溫用鏈黴抗生物素蛋白-ALP (MabTech #3321-4APW-10)培育盤1小時。洗盤，且根據製造商之說明書(MabTech)使用經過濾之受質溶液(BCIP/NBT-plus)偵測斑點。盤一經乾燥，則使用自動化ELISpot讀取器(Cellular Technology)計數斑點。將平均斑點形成單位(SFU)調節至1×10 ⁶個脾細胞，且抗原特異性反應報導為每1×10 ⁶個脾細胞的IFN-γ SFU數目大於DMSO對照組。 SARS-CoV-2假病毒中和分析法：

假病毒產生：使用經脂染胺3000 (ThermoFisher)轉染之HEK293T細胞，分別使用IgE-SARS-CoV-2 S質體變異體(Genscript)與pNL4-3.Luc.R-E-質體(NIH AIDS試劑)以1:8之比率共轉染產生編碼武漢(WT)、B.1.617.2 (Delta)、B.1.1.529 (Omicron)棘蛋白之SARS-CoV-2假病毒儲備物。轉染後72小時，收集上清液，進行滅菌過濾(Millipore Sigma)，並等分在-80℃儲存。

假病毒中和：使用穩定表現ACE2之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(ACE2-CHO)作為靶細胞，以7,000個細胞/孔。感染72小時之後，滴定SARS-CoV-2假病毒以產生大於30倍之細胞僅對照相對發光單位(RLU)。熱不活化動物血清且以1:32之稀釋度開始連續稀釋兩倍。在室溫將血清與SARS-CoV-2假病毒一起培育90分鐘。在培育之後，將血清-假病毒混合物添加至ACE2-CHO中且在標準培育箱(37℃，5% CO ₂)中培育72小時。72小時後，使用Britelite plus報導基因(PerkinElmer™)溶解細胞，且使用自動化光度計量測RLU。使用GraphPad Prism 8計算中和效價(ID ₅₀)，且將其定義為在減去細胞對照孔中之背景RLU後，與病毒對照孔中之RLU相比，RLU減少50%之血清稀釋度倒數。 結果：

在雌性C57BL/6小鼠中藉由肌內(IM)注射進行投與，隨後進行電穿孔(EP)之後，評估編碼SARS-CoV-2 Omicron BA.1棘變異體抗原之DNA疫苗候選物pGX9541質體之免疫原性。研究設計概述於圖6中。在第0天，小鼠接受藉由肌內注射遞送之單次劑量之DNA質體，隨後用CELLECTRA 3P進行電穿孔。在第19天，處死小鼠，且對所收集之樣品進行IFNɣ ELISpot、抗體結合及假病毒中和分析法。

在用SARS-CoV-2肽刺激脾細胞之後，在免疫接種後的第19天藉由IFNγ ELISpot量測T細胞反應。用含有跨越WT、Delta或Omicron變異體棘蛋白之肽巨池的細胞培養基刺激脾細胞(圖7A)。在用10 µg之pGX9501及pGX9541進行單次免疫接種後，在小鼠中偵測到抗原特異性T細胞反應，但在接受空載體對照之小鼠中未偵測到。用pGX9501或pGX9541進行免疫接種使得針對WT、Delta及 Omicron肽之平均斑點計數與經pGX0001給藥之小鼠相比增加。所有測試質體均引發針對WT、Delta及Omicron棘肽之穩固SARS-CoV-2棘特異性T細胞反應。

藉由在免疫接種後的第19天所收集之血清樣品中進行結合IgG ELISA來量測針對全長WT、Delta及Omicron SARS-CoV-2棘蛋白之體液反應(圖7B)。所有經測試之變異體的抗體結合效價在給藥pGX0001之所有小鼠中均不存在。用pGX9501免疫接種之小鼠展現與接受pGX0001之小鼠相比升高之抗體結合效價，其中在5/6之動物中觀測到針對所有變異體之血清轉化。用pGX9541免疫接種之小鼠在所有經測試之變異體中展示廣泛抗體反應，其中所有動物展現針對WT、Delta及Omicron之抗體反應。

與WT相比，Omicron在單獨RBD中獲得15個胺基酸取代。由於RBD為棘內負責結合至ACE2細胞受體之區域，吾人進一步研究用pGX9501及pGX9541治療之小組對WT及 Omicron RBD蛋白的抗體結合反應。在所有經測試之變異體中，在用pGX0001治療之小組中未觀測到結合。相比之下，吾人在用pGX9501治療之小組中偵測到與WT RBD之穩固結合及對Omicron RBD之效價升高(3/6血清轉化)。在用pGX9541免疫接種之小組中，5/6及6/6之動物分別展示針對WT及Omicron RBD蛋白之血清轉化(圖7B)。

如圖4C中所示，在單次免疫接種後19天，評估包括WT、Delta及Omicron變異體之SARS-CoV-2棘變異體的假病毒中和。基於血清稀釋度計算ID50值，該血清稀釋度對所測試之各假病毒變異體賦予50%之抑制作用。用pGX0001免疫接種不產生針對所測試之變異體中之任一者的中和活性。用pGX9501免疫接種引起6隻小鼠中之4隻的WT變異體之中和增加，但針對Delta (1/6之小鼠)之中和活性降低，且對Omicron無活性(圖7C)。用pGX9541免疫接種引起針對Omicron之中和反應增加，其中血清轉化為100%。在接受pGX9541之小鼠中未觀測到針對WT或Delta假病毒之交叉中和反應。 C ： 敍利亞黃金倉鼠中之 INO-4803 、 SARS-CoV-2 Omicron 棘匹配之合成 DNA 疫苗的免疫原性

在敍利亞黃金倉鼠中藉由皮內(ID)注射進行投與，隨後進行電穿孔(EP)之後，評估編碼SARS-CoV-2 Omicron BA.1棘變異體抗原之DNA疫苗候選物pGX9541質體之免疫原性。研究設計概述於圖8中。在第0天及第21天，動物接受藉由皮內注射遞送之DNA質體，隨後用CELLECTRA® 3P進行電穿孔。在第35天，處死小鼠，且對所收集之樣品進行IFNɣ ELISpot及假病毒中和分析法。 材料及方法： SARS-CoV-2假病毒中和分析法

假病毒產生：使用經脂染胺3000 (ThermoFisher)轉染之HEK293T細胞，分別使用與pNL4-3.Luc.R-E-質體(NIH AIDS試劑)以1:8之比率共轉染之IgE-SARS-CoV-2 S質體變異體(Genscript)產生編碼武漢(WT)、B.1.617.2 (Delta)、B.1.1.529 (Omicron)棘蛋白之SARS-CoV-2假病毒儲備物。轉染後72小時，收集上清液，進行滅菌過濾(Millipore Sigma)並等分以用於在-80℃下儲存。

假病毒中和：以7,000個細胞/孔穩定表現ACE2之CHO細胞(ACE2-CHO)係用作靶細胞。轉染72小時之後，滴定SARS-CoV-2假病毒以得到大於30倍之細胞僅對照相對發光單位(RLU)。熱不活化動物血清且以1:32之稀釋度開始連續稀釋兩倍。在室溫下將血清與SARS-CoV-2假病毒一起培育90分鐘。培育之後，將血清-假病毒混合物添加至ACE2-CHO中且使其在標準培育箱(37℃，5% CO ₂)中培育72小時。72小時後，使用Britelite plus報導基因(PerkinElmer™)裂解細胞，且使用自動化光度計量測RLU。使用GraphPad Prism 8計算中和效價(ID ₅₀)，且將其定義為在減去細胞對照孔中之背景RLU後，與病毒對照孔中之RLU相比，RLU減少50%之倒數血清稀釋度。

倉鼠IFN-γ ELISpot：倉鼠IFN-γ ELISpot套組係購自MabTech (MabTech # 3102-2H)以評估抗原特異性反應。用35%乙醇活化PVDF 96孔盤(Millipore目錄號MSIPS4W10)，且遵循製造商之方案用倉鼠IFNɣ抗體塗佈。在4度下培育盤24小時。隨後，用PBS洗滌盤5次且在室溫下用R10培養基阻斷至少一小時。將經分離之脾細胞再懸浮於R10培養基中且以2×10 ⁵個細胞/孔一式三份地接種。跨越WT或 Omicron SARS-2-CoV S蛋白(Genscript)之全長棘蛋白序列的重疊15-聚體肽(由9個殘基重疊)係用作回憶抗原。將此等肽再懸浮於DMSO (Sigma)中且以每個肽約5 µg/ml之濃度合併至5個肽池中以用於細胞刺激。為了製備巨池，將各肽池以相同莫耳當量混合在一起，使得最終濃度為1 µg/ml。以5 µg/ml使用刀豆球蛋白A (Sigma)作為陽性對照且使用具有DMSO之完全培養基作為陰性對照。在37℃ 5% CO ₂下培育盤最少18小時。為了開發，首先在PBS中洗滌盤，接著在室溫下用經生物素標記之抗倉鼠IFN-γ偵測抗體培育2小時。洗滌之後，接著在室溫下用鏈黴抗生物素蛋白-ALP培育盤1小時。洗滌盤，且根據製造商之說明書(MabTech)使用經過濾之受質溶液(BCIP/NBT-plus)偵測斑點。盤一經乾燥，則使用自動化ELISpot讀取器(Cellular Technology)對斑點進行計數。將平均斑點形成單位(SFU)調節至1×10 ⁶個脾細胞，且抗原特異性反應報導為大於DMSO對照組之每1×10 ⁶個脾細胞的IFN-γ SFU數目。 結果：

在用SARS-CoV-2肽刺激脾細胞之後，在第二次免疫接種後的第35天藉由IFNγ ELISpot量測T細胞反應。用含有跨越WT或Omicron變異體棘蛋白之肽巨池的細胞培養基刺激脾細胞(圖9A)。在用100 µg之SARS-CoV-2質體pGX9501及pGX9541進行兩次免疫接種之後，在倉鼠中偵測到抗原特異性T細胞反應，但在未經治療之小組中未偵測到。所有測試質體均引發針對WT及Omicron棘肽之SARS-CoV-2棘特異性T細胞反應。

分別在第一次或第二次免疫後的21及35天，評估包括WT及Omicron變異體之SARS-CoV-2棘變異體的假病毒中和(圖9B)。基於血清稀釋度計算ID ₅₀值，該血清稀釋度對所測試之各假病毒變異體賦予50%之抑制作用。用pGX9501免疫接種使得第21天及第35天兩者之WT中和增加，其中在兩次免疫接種之後ID ₅₀效價增加。pGX9501針對Omicron假病毒產生極少中和活性至無中和活性。用pGX9541免疫接種使得單次免疫接種之後的6隻倉鼠中之5隻產生Omicron假病毒之中和。在兩次免疫接種之後，所有經pGX9541免疫接種之倉鼠展示對Omicron假病毒之中和活性。另外，在兩次免疫接種之後，pGX9541治療誘導針對WT假病毒之交叉中和抗體。在對照組中未觀測到中和活性。 結論

據展示，用pGX9541進行之治療藉由引發針對 Omicron棘之體液反應及T細胞反應而在小鼠(BALB/c、C57BL/6)及倉鼠(敍利亞金倉鼠)模型中具有免疫原性。另外，pGX9541展現針對所測試之所有棘蛋白(包括WT、Delta及Omicron)的交叉反應性抗體及T細胞反應。

在小鼠以及倉鼠中進行單次免疫接種之後，用pGX9541治療引發針對Omicron假病毒之中和抗體。在用pGX9541免疫接種之小鼠中，針對WT及Delta之中和抗體較少或不存在。相比之下，用pGX9501免疫接種之小鼠展示針對WT假病毒之中和反應增加，但無針對Omicron之中和。相比之下，用pGX9541免疫接種之倉鼠展示在兩次免疫接種之後針對WT之中和抗體增加。用pGX9541治療之所有倉鼠在單次免疫接種之後引發針對Omicron之中和抗體且在兩次免疫接種之後反應增加。

針對接受Omicron質體疫苗之所有小組以及接受pGX9501之小組中所測試的所有棘肽來偵測如藉由IFNɣ之水平所量測的細胞反應。此發現證實SARS-CoV-2棘質體DNA疫苗在多種變異體中保留細胞反應之能力。

總而言之，用pGX9541治療可在單次免疫接種之後誘導針對Omicron棘之體液反應及T細胞反應兩者。另外，在兩次免疫接種之後，pGX9541誘導針對上代WT SARS-CoV-2之交叉T細胞免疫以及針對WT之交叉中和抗體。 序列 SEQ ID NO: 1 - SARS CoV2 Omicron 棘 OPT 之胺基酸序列 ( 由 pGX9541 之抗原***序列編碼之 SARS-CoV-2 共同棘抗原胺基酸序列 ) (IgE 前導序列帶下劃線 ) ： SEQ ID NO: 2 - 編碼 SARS CoV2 Omicron 棘 OPT 之核酸序列 (pGX9541 之 SARS-CoV-2 共同棘抗原***序列 ) (IgE 前導序列帶下劃線 ) ： SEQ ID NO: 3 - pGX9541 之單股 DNA 序列 ( 抗原***序列帶下劃線 ) ： SEQ ID NO: 4    pGX9501 之 SARS-CoV-2 共同棘抗原胺基酸***序列 (IgE 前導序列帶下劃線 ) ： SEQ ID NO: 5    pGX9501 之 DNA ***序列 (IgE 前導序列帶下劃線 ) ： SEQ ID NO: 6    pGX9501 之單股 DNA 序列： SEQ ID NO: 7    pGX9527 之 SARS-CoV-2 共同棘抗原胺基酸***序列 (IgE 前導序列帶下劃線 ) ： SEQ ID NO: 8 編碼 pGX9527 之 SARS-CoV-2 共同棘抗原胺基酸***序列的核酸序列 (IgE 前導序列帶下劃線 ) ： SEQ ID NO: 9    pGX9527 之單股 DNA 序列

圖1提供DNA質體pGX9541之圖解表示。

圖2提供經修飾之pVAX1主鏈(pGX0001)之圖解表示。

圖3繪示質體pGX9541之構築。

圖4繪示評估雌性BALB/c小鼠中之INO-4803 (pGX9541質體)之免疫原性的研究設計。在第0天，小鼠接受藉由肌內注射遞送之單次劑量之DNA質體，隨後用CELLECTRA® 3P進行電穿孔。在第19天，處死小鼠，且對所收集之樣品進行IFNɣ ELISpot、抗體結合及假病毒中和分析法。

圖5A至圖5C展示在BALB/c小鼠中單次投與INO-4803之後所量測之體液及細胞免疫反應。在第19天，自免疫接種之小鼠收集脾細胞及血清以評估對SARS-CoV-2棘變異體之細胞及體液反應。圖5A展示如藉由IFNγ ELISpot分析法所量測之個別小鼠之SARS-CoV-2棘特異性T細胞反應。在經WT或 Omicron棘肽刺激之脾細胞中，藉由IFN-γ ELISpot量測T細胞反應。條柱表示平均值±標準差(SD)。圖5B展示在初次免疫接種後的19天，來自小鼠之血清樣品中之IgG的全長棘蛋白抗原結合。所展示之資料表示投與pGX0001、pGX9501 (INO-4800)或pGX9541之6隻小鼠之各組的幾何平均效價值(GMT+/- 95%信賴區間[CI])。圖5C展示小鼠血清中之WT及Omicron SARS-CoV-2假病毒中和ID ₅₀效價。各資料點表示各動物(n=6隻/組)之技術重複值的平均值且呈現幾何平均值±95% CI。虛線表示分析法之偵測極限(LOD)。

圖6繪示評估C57BL/6小鼠中之INO-4803 (pGX9541)之免疫原性的研究設計。在第0天，小鼠接受藉由肌內注射遞送之單次劑量之DNA質體，隨後用CELLECTRA® 3P進行電穿孔。在第19天，處死小鼠，且對所收集之樣品進行IFNɣ ELISpot、抗體結合及假病毒中和分析法。

圖7A至圖7C展示在C57BL/6小鼠中單次投與INO-4803之後所量測之體液及細胞免疫反應。在第19天，自免疫接種之小鼠收集脾細胞及血清以評估對SARS-CoV-2棘質體之細胞及體液反應。圖7A展示如藉由IFNγ ELISpot分析法所量測之個別小鼠之SARS-CoV-2棘特異性T細胞反應。在經WT、Omicron或Delta棘肽刺激之脾細胞中，藉由IFN-γ ELISpot量測T細胞反應。條柱表示平均值±SD。圖7B展示在初次免疫接種後的19天，來自小鼠之血清樣品中之IgG的全長棘或受體結合域(RBD)抗原結合。所展示之資料表示投與pGX0001、pGX9501及pGX9541之6隻小鼠之各組的幾何平均效價值(GMT+/- 95% CI)。圖7C展示小鼠血清中之WT、Omicron及Delta SARS-CoV-2假病毒中和ID ₅₀效價。各資料點表示各動物(n=6隻/組)之技術重複值的平均值且呈現幾何平均值±95% CI。虛線表示分析法之偵測極限(LOD)。

圖8提供評估敍利亞黃金倉鼠中之INO-4803 (pGX9541)之免疫原性的研究設計。在第0天及第21天，動物接受藉由皮內注射遞送之DNA質體，隨後用CELLECTRA® 3P進行電穿孔。在第35天，處死小鼠，且對所收集之樣品進行IFNɣ ELISpot及假病毒中和分析法。

圖9A及圖9B展示在用INO-4803免疫接種之敍利亞黃金倉鼠中所量測之體液及細胞免疫反應。圖9A展示如藉由IFNγ ELISpot分析法所量測之個別倉鼠之SARS-CoV-2棘特異性T細胞反應。在經WT或Omicron棘肽刺激之脾細胞中，藉由IFN-γ ELISpot量測T細胞反應。條柱表示平均值±SD。圖9B展示在一次(第21天)或兩次(第35天)免疫接種之後所收集之倉鼠血清中的WT及Omicron SARS-CoV-2假病毒中和ID ₅₀效價。各資料點表示各動物(n=6隻/組)之技術重複值的平均值且呈現幾何平均值±95% CI。虛線表示分析法之偵測極限(LOD)。

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Claims (20)

1. 一種編碼嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus 2；SARS-CoV-2)棘抗原之核酸分子，其中： 該核酸分子編碼SEQ ID NO: 1之胺基酸19至1276 該核酸分子編碼SEQ ID NO: 1之胺基酸序列； 該核酸分子包含SEQ ID NO: 2之核苷酸55至3828之核酸序列； 該核酸分子包含SEQ ID NO: 2之核酸序列；或 該核酸分子包含SEQ ID NO: 3之核酸序列。
2. 一種表現載體，其包含如請求項1之核酸分子。
3. 一種免疫原性組合物，其包含有效量之如請求項2之表現載體及醫藥學上可接受之賦形劑。
4. 如請求項3之免疫原性組合物，其中該醫藥學上可接受之賦形劑包含緩衝液，視情況鹽水-檸檬酸鈉緩衝液。
5. 如請求項4之免疫原性組合物，其中該組合物包含每毫升鹽水-檸檬酸鈉緩衝液10 mg該載體。
6. 如請求項3至5中任一項之免疫原性組合物，其進一步包含佐劑。
7. 一種如請求項3至6中任一項之免疫原性組合物之用途，其係用於製造用以誘導有需要之個體中針對嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)之免疫反應的藥劑。
8. 一種如請求項3至6中任一項之免疫原性組合物之用途，其係用於製造用以保護個體免於感染嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)之藥物。
9. 一種如請求項3至6中任一項之免疫原性組合物之用途，其係用於製造用以治療有需要之個體對抗嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)感染之藥物。
10. 如請求項7至9中任一項之用途，其中該藥物進一步包含或與至少一種另外藥劑組合投與用於治療SARS-CoV-2感染，或治療或預防與SARS-CoV-2感染相關之疾病或病症，視情況其中該至少一種另外藥劑包含SARS-CoV-2野生型匹配疫苗、pGX9501、INO-4800藥品或其生物類似藥(biosimilar)、pGX9527，或INO-4802藥品或其生物類似藥。
11. 如請求項7至9中任一項之用途，其中該免疫原性組合物經調配用於藉由電穿孔及注射中之至少一者投與。
12. 如請求項11之用途，其中該免疫原性組合物經調配用於非經腸投與，隨後進行電穿孔。
13. 如請求項7至9中任一項之用途，其中向該個體投與初始劑量約0.5 mg至約2.0 mg該載體，視情況其中該初始劑量為0.5 mg、1.0 mg或2.0 mg該載體。
14. 如請求項13之用途，其中在該初始劑量之後約四週向該個體投與後續劑量約0.5 mg至約2.0 mg該載體，視情況其中該後續劑量為0.5 mg、1.0 mg或2.0 mg該載體。
15. 如請求項14之用途，其中在該初始劑量之後至少十二週向該個體投與其他後續劑量約0.5 mg至約2.0 mg該載體，視情況其中該其他後續劑量為0.5 mg、1.0 mg或2.0 mg該載體。
16. 如請求項7至9中任一項之用途，其中該免疫原性組合物包含pGX9541、INO-4803藥品或其生物類似藥。
17. 一種如請求項2之載體之用途，其用於製備用以治療或保護免於嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)感染之藥物。
18. 如請求項7至9及17中任一項之用途，其中該SARS-CoV-2為SARS-CoV-2 Omicron變異體(B.1.1.529)。
19. 如請求項7至9中任一項之用途，其中該免疫原性組合物係藉由皮內投與或調配用於皮內投與，隨後進行電穿孔。
20. 一種嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)棘抗原，其包含SEQ ID NO: 1之胺基酸19至1276，或SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。