TW202346017A - 用於低溫和環境控制樣品處理的方法和設備 - Google Patents

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Abstract

本發明揭露一種操作低溫樣品以進行後續檢查的方法，其包括將低溫樣品安裝在樣品支架的工作表面上，並將樣品支架放置在具有一層低溫液體於其內的泵送低溫恆溫器腔室內。 低溫恆溫器腔室通風並保持在低濕度下，以便在低溫液體上方產生低溫蒸汽層，使樣品支架的工作表面處在低溫蒸汽層和低濕度和惰性環境中。 然後將低溫樣品操作到包含在工作表面不同部分的樣品載體上，同時將低溫樣品保持在低溫蒸汽層內。

Description

用於低溫和環境控制樣品處理的方法和設備
本發明大體上係關於離子束製備樣品的操作，尤其是在低溫下操作樣品的詳細方法和系統，必要時使用低溫電子顯微鏡進行檢查，或經由廣泛範圍的方法進行光譜或分析檢查。
使用電子顯微鏡等工具從較大的塊狀試樣中操作小樣品進行檢查係非常複雜，並導致發展出幾種複雜的程序。 不幸的是，迄今為止，還沒有一種有效的原位(in situ)(在創造樣品的儀器內進行操作和檢查)或非原位(ex situ)(在創造樣品的儀器之外進行操作和檢查)   方法得以在低溫和環境受控條件下充分操作樣品，其中這種溫度控制條件為必需的。 例如在使用玻璃態生物樣品或其它光束敏感材料(例如聚合物、有機物、鋰基、鈉基等)的情況下，可能需要這種低溫條件。這些材料必須保持低溫或保持在低溫下，或者在聚焦離子束(focus ion beam；FIB)銑削和操作過程中必須保持在受控環境中，以便隨後進行低溫電子顯微鏡(cryogenic electron microscopy；低溫EM)(或環境EM)或其他表徵技術和分析。
在小於-140°C的溫度下進行的低溫樣品製備對於保留生物組織的玻化相以防止冰晶形成是必要的，冰晶會掩蓋電子顯微鏡成像對比度並損壞細胞。 操作低溫製備聚焦離子束(cryogenically prepared focused ion beam；cryo-FIB)樣品用以進行後續低溫電子顯微鏡檢查(低溫EM)的先前方法是在粒子光學儀器真空腔室(即FIB)內的真空下使用低溫試樣臺支架和單獨的低溫冷卻探頭進行的，稱為低溫原位取出(cryogenic in situlift out；低溫INLO)。 這些低溫INLO的先前方法包括：(i)將低溫探頭尖端附接到樣品上，然後使用不同的沉積方法將其牢固到載體網格上，及/或(ii)對樣品振動低溫探頭尖端以產生物質的局部相變，導致尖端附接在樣品上並將其牢固到載體網格上，及/或 (iii) 低溫夾持器型探頭抓取樣品並將其牢固在載體網格上。 在某些情況下，可能需要低溫FIB銑削法來銑削樣品以在連接探頭後將其從溝槽壁上移除，及/或在將樣品(藉由沉積或相變)附接到樣品網格載體後，將低溫探針尖端銑削以將其從樣品中取出，以便可以進一步對樣品進行低溫FIB銑削和變薄來進行低溫EM。
低溫FIB INLO需要使用之探頭尖端(通常是金屬)係配置為獨立於低溫試樣支架之低溫恆溫器的一部分，以便使尖端可以保持在低溫下，以在樣品從塊狀試樣中提取(即“取出”) 之提取期間將樣品保持在玻璃相，在安裝在 FIB 中的低溫臺上的同時也保持在低溫下。
低溫FIB INLO需要許多複雜的步驟，通常需要30至60分鐘才能完成。由於樣品和探頭尖端是獨立冷卻的，因此在這些步驟中很難將低溫樣品和低溫探頭尖端保持在完全相同的低溫下，這通常會導致兩者在接觸時發生熱漂移。 這種熱漂移經常導致無法形成牢固的附接，導致沉積點處的破損和失效，尤其是因為在沉積/附接過程中必須保持這種溫度穩定性達數分鐘。 由於低溫INLO方法需要在FIB真空腔室 內側以許多複雜的步驟對 FIB製備的樣品進行低溫操作，這會導致樣品損壞/損失的風險，導致通常每天只有1個可用樣品的低成功率，最終顯著增加每個樣品的成本。
低溫FIB INLO方法的替代方案之低溫超薄切片術係使用刀具將低溫薄樣品切片用以進行低溫EM。刀具會造成機械性損壞，並且該方法對特定部位的切片而言並不理想。 採用於低溫超薄切片術的探頭主要僅用於將大型樣品切片(~0.5毫米或更大)引導到碳塗層的網格載體表面，因此與FIB製備的樣品(~20微米長度)相比，由完全不同的幾何形狀和尺寸組成。 此外，這些探頭不能用於從限制在FIB銑削溝渠內的含塊狀低溫樣品中特定的“拔出(pluck)”、“拾取(pick)”或“取出(lift out)”在特定位置處的樣品，然後隨後將變薄的樣品轉移/操作到載體網格的特定位置區域。因此，低溫超薄切片術的應用和方法不可適用於FIB製備的薄層或其他小樣品的低溫操作。
非原位取出 ( Ex situlift-out；EXLO) 是一種眾所周知的 環境( ambient)(室內溫度和條件)探測技術，其通常用於在執行特定位置的聚焦離子束 (FIB) 銑削流程後操作樣品以進行後續透射電子顯微鏡 (EM) 或其他分析表徵。除EM外，FIB製備的取出還藉由數種技術進行了分析，包括但不限於：掃描式電子顯微鏡術、共聚焦顯微鏡術、歐傑顯微鏡術、掃描式探頭顯微鏡術、二次離子質譜法、拉曼光譜法、同步加速器、X射線分析和其他類似的光譜技術。
使用EXLO，樣品在帶電粒子真空環境中進行FIB銑削，然後將樣品在FIB 外側的環境溫度條件下，在電動試樣臺上以光學顯微鏡和顯微操縱器系統引導操作成具薄膜塗層(例如，碳、孔狀碳、馮瓦(formvar)等)， 或開槽之EM網格。EXLO方法對FIB樣品的優點是：(i)它是針對特定地點的，(ii)它具有高成功率，(  i ii)它快速簡便，因此更具成本效益，以及(iv)如有必要，樣品可以進一步進行FIB增薄。目前，EXLO的主要缺點是該技術僅限於在室溫(例如，環境)條件下的空氣中進行操作。FIB樣品的EXLO操作可以主要使用凡得瓦力將探頭尖端黏著在樣品上或經由真空輔助操作或經由夾持器型探頭進行。
雖然INLO技術能夠在低溫環境中操作樣品，但它們有幾個缺點和複雜性，導致通量緩慢和樣品破壞的機會增加。雖然EXLO技術比現有的INLO技術具有幾個優點，但該技術僅限於在室溫(例如環境)條件下的空氣中操作，因此尚未適當地適用在低溫下操作樣品。
因此，期望提供一種更有效的方法來操作小型低溫樣品，以避免先前技術的缺點。
一種操作低溫樣品用於後續檢查的方法包括首先將低溫樣品安裝在樣品支架的工作表面上的步驟。然後將樣品支架放置在具有一層低溫液體於其內的低溫恆溫器腔室內，在低溫液體上方具有低溫蒸汽層，使得樣品支架的工作表面位於低溫蒸汽層內。然後將低溫樣品操作到含在工作表面不同部分的樣品載體上，同時將低溫樣品保持在低溫蒸汽層內。
用於操作低溫樣品的設備包括低溫恆溫器腔室，該低溫恆溫器腔室具有一層低溫液體和在低溫液體上方的低溫蒸汽層。 低溫樣品支架位於低溫恆溫器腔室內，並組構為將低溫樣品保持在僅位於低溫蒸汽層內的工作表面上。該設備還可包括維持在真空下的過渡腔室並在其中具有一層低溫液體，以及定位於過渡腔室的低溫液體內的低溫夾套。低溫夾套被組構為使其底部和側壁與低溫液體的頂表面接觸，但高於低溫液體的頂表面，以便形成一個內部隔間，該內部隔間被組構以接收低溫樣品支架於其內，使得低溫樣品支架不與低溫液體接觸。
本發明充分發揮應用於低溫和環境製備之FIB樣品的快速、簡單和可重製的EXLO方法。 這是新穎的，因為EXLO以往只在環境條件下進行。本發明係應用在製備此類樣品的儀器外側操作FIB銑削或其他小樣品(例如纖維、顆粒或鐳射切割樣品)。本發明可利用多數不同的探頭設計，包括但不限於拉到細針尖的玻璃或金屬探頭、金屬化玻璃探頭、開口幾何形狀與將要操作的樣品幾何形狀匹配的空心玻璃或金屬探頭、夾持器或端效器探頭、使用一些其他附接機構(如黏膠)的探頭。該方法和設備係設計以在所有轉移和操作步驟期間保持樣品為玻璃態，並以非常省時的方式進行。此外，低溫FIB製備的樣品可以完全無FIB銑削，或者微小的材料片可以留在樣品的任一側。該操作在低溫蒸汽相下的工作表面上進行，使得FIB樣品、樣品載體和探頭如下所述都處於相同的低溫。
以下吾人描述一種在低溫和環境受控條件下對樣品進行EXLO操作的新穎方法。這些低溫EXLO方法可用於操作玻璃態生物及/或冷凍樣品，以及用於任何環境或光束敏感材料(例如聚合物、有機物、鋰基、鈉基等)，這些材料必須在FIB銑削期間保持冷卻或保持在低溫下或在受控環境中以用於隨後的低溫EM(或環境EM)， 或其他表徵技術和分析之操作。玻璃態樣品可藉由非常快速地冷卻樣品(例如傾沒冷凍(plunge-freezing))或藉由高壓冷凍來進行初始低溫製備。
雖然本發明針對的是低溫條件下樣品的新穎EXLO操作，但首先重要的是要瞭解目前如何在環境條件下使用EXLO。
在將樣品在環境條件下至網格的EXLO操作可以藉由不同的探測方法進行。一種習知方法係利用如圖1所示藉由碰觸玻璃(或金屬塗層玻璃)探針104之外表面於包含在FIB銑削溝槽壁102內在塊狀試樣100的試樣表面101下方之樣品103而產生的凡得瓦吸引力。如圖2中整個直徑為3毫米的網格的一小部分201所示，附接至探頭104上的樣品103可被轉移或操作到諸如碳、多孔碳或由金屬網格條203支撐的馮瓦塗層202的樣品載體上。凡得瓦黏著力比作用在小樣品上的靜電力或重力大幾個數量級(Giannuzzi 等人，2015年)。 使用EXLO，將錐形空心或實心玻璃探頭尖端加熱並拉到細點(例如，~1微米)，並且探頭的外曲面用於拾取或取出FIB製備的樣品(圖1)，然後操作到碳塗層EM網格載體、多孔碳塗層EM網格載體或類似的表面(圖2)。在執行取出後，可旋轉探頭以優化樣品的位置，以便操作到所選的樣品載體上，或者可將第二探頭與第一探頭結合使用以有助於樣品操作程序。
本發明的所有人先前的發明專利(例如，敘述在美國發明專利\第8,740,209號和第8,789,826號和第10,801,926號中揭露EXLO方法，稱為“EXpressLO方法”)描述了從不對稱聚焦離子束(FIB)製備之樣品操作至開槽樣品網格載體的EXLO樣品載體和方法(圖3和圖4)。這些EXpressLO方法的優點是：(i)不需要碳或薄膜支撐來支撐樣品，這允許在不受碳薄膜干擾的情況下進行進階顯微鏡法，(ii)樣品可在操作至開槽載體後進行後處理，(iii)用於額外FIB銑削的背側操作消除所欲區域的FIB垂簾偽影(curtaining artifacts)， (iv)斜面優化了EXLO的幾何形狀並增加了凡得瓦吸引力。
圖3所示的EXpressLO取出方法使用錐形玻璃探頭104尖端，如上所述，拉到細點(例如，~1微米) 利用探頭的外表面以拾取或取出FIB製備的不對稱底切樣品103，隨後操作至EXpressLO的開放半網格之開槽樣品載體網格302。 EXpressLO載體網格302經由由網格的上邊緣303和下邊緣304定義的凹槽的表面301支撐樣品，該上邊緣303和下邊緣304可相隔5微米或更高的高度。在操作之前，可旋轉探頭，或者可用第二探頭或網格的上邊緣303輕推或旋轉樣品，以優化樣品103在探頭104頂部的取向，然後再操作探頭穿過槽使得樣品103停留在網格表面301上。可分析樣品的表面，或者可以透過將電子束穿過跨越開槽的樣品藉由EM分析其內部結構。
使用聚焦離子束 (FIB) 儀器，樣品的方向性藉由銑削不對稱底切來表示。 該樣品103的不對稱性可用用於取出和顯微操作程序的光學顯微鏡容易地可視化，以將樣品定位在任何所需的方向上。 在操作過程中，可旋轉探頭及/或使用保持靜止的第二個探頭或經由第二顯微操縱器或使用EXpressLO網格的突出表面輕推樣品以將樣品定向到其所需位置，然後再透過EXpressLO網格槽操作探頭，使樣品可受操作以停留在 EXpressLO 網格表面上。圖4示出了斜面橢圓表面401相對於探頭軸線402為了凡得瓦取出而被優化的示例。對樣品網格載體的操作是在有或沒有探頭旋轉的情況下進行的。
在環境條件下操作樣品的其它方法係使用真空抽吸作為保持力(圖5)，或使用各種夾持器或端效器，或者藉由將探頭浸入黏膠中以將樣品黏著到探頭上來轉移到也含有黏膠的網格上。在一示例中，可以透過斜面空心玻璃管501施加真空，以從樣品頂部接近而取出無FIB銑削樣品(Wang 美國發明專利7,041,985 B1)，或者如果樣品仍然附接在塊狀FIB銑削溝槽壁上，則從其表面取出FIB銑削樣品(Arjavac 美國發明專利8,455,821 B2，Arjavac 美國發明專利8,890,064 B2)。 對於這些先前技術中的任一真空方法，最終利用真空力或吸力透過中空玻璃探頭協助取出和操作程序來將樣品502操作到碳塗層202的EM網格載體201中，如圖5所示。根據所使用特定的真空探測方法，FIB樣品應完全無FIB銑削，否則FIB樣品每個外側的少量材料會保留並在操作過程中脫落。上述先前技術中描述的所有這些探測方法都描述在環境條件下的操作。
現在回至特定用於需要低溫及/或高度受控環境條件之樣品的EXLO操作方法和設備，圖  6A示出低溫夾套600的透視圖，該夾套係用於在下述程序中的一部分期間保留、絕緣並保護樣品，例如樣品103(圖1)。 低溫夾套600較佳形成有鍍金銅材料的夾套本體602。經成形具有下燕尾榫604端，並具有矩形上部分，用於藉由使用鑷子或鉗子將低溫夾套移入和移出低溫液體 。槽606穿過夾套本體602的頂面608形成，以作為進入夾套本體內部隔室610的入口。樣品支架，也稱為低溫支架612，被示出為保留在低溫夾套600的內部隔室610內，其部件將在下文進一步描述。低溫支架612的朝上的一側包括附接點，例如卡口型接收器或如此處所示的螺紋孔613，以便桿件或其它轉移裝置(參見圖8)可用於將低溫支架612移入/移出FIB 800(圖8)穿過FIB氣閘814到低溫夾套內部隔室610。
圖  6B示出沿圖6A中的截面線6B-6B擷取的低溫夾套600的側面正視圖，其中低溫夾套600係部分浸入保留在低溫恆溫器腔室616內的一層低溫流體614  內。 低溫恆溫器腔室616較佳形成有基座618和側壁620，其係形成以將低溫流體614保留在內部。形成在底座618內的槽609係成形以接收低溫夾套燕尾榫604，並防止低溫夾套600在低溫支架612移入槽609外時傾斜。低溫流體614被設置在低溫恆溫器腔室616中，其層622的厚度足以接觸低溫夾套600的側面和底部。 然而，低溫夾套側壁624具有足夠的高度以防止低溫液體切斷層626延伸越過側壁624的上部高度而溢出到內部隔室610中。內部隔室610和保留的低溫支架612因此保持不與低溫流體614接觸，但由於其靠近低溫流體614和低溫夾套的燕尾榫604和側壁624的外表面與其接觸，因此仍然保持冷卻。
低溫支架612包括防霜蓋628，其經由螺釘或銷632樞轉地附接至主體630上。圖6B示出了低溫支架之防霜蓋628處於關閉位置，使得它完全覆蓋工作表面634(圖7A)，而低溫支架612則保持在低溫夾套600內。  防霜蓋628保護工作表面634免受污染並限制冰晶生長於安裝在其上的樣品上。 低溫夾套600位於低溫恆溫器腔室616的內側，使得低溫液體614(例如，液態氮[LN2]、液態氦、液態乙烷、液態氬或其它類似的低溫液體)包圍並冷卻夾套，其隨後冷卻低溫支架612。
圖7A示出了座置在護城河支架700頂部的低溫支架612的透視圖。 護城河支架700在操作中位於低溫流體704的層702內(此處以陰影線勾勒出輪廓)。如將透過下文可理解，低溫流體704可與圖6A和圖6B中的低溫夾套600一起使用的流體相同，以便低溫夾套600和護城河支架700得以坐落在與低溫恆溫器616內的同一低溫流體池中，並藉此被冷卻。 此外，低溫層702可與所示的層622相同(圖6B)。 然而，由於在例如當樣品的低溫支架612移動到低溫夾套600並隨後移動到護城河支架700的同時以及如下將進一步陳述之當樣品從安裝表面移動到工作表面上的網格載體的同時等操作過程中低溫流體614的沸騰，層702的頂面705與層622相比可以降低高度。
護城河支架700的側壁706在所有側面向上延伸，較佳但不一定須在低溫層702上方，以便圍繞上表面形成周邊脊部708。 低溫支架612因此被設置在該上表面上並被該周邊脊部708包圍，使得低溫支架612保持在定位並防止滑落到低溫流體704中。 低溫支架612所在的護城河支架700的上表面較佳升高到足以使工作表面634位於低溫蒸汽層710內，該低溫蒸汽層702由低溫流體704隨時間緩慢汽化形成在低溫流體704的層702上方。由此產生的低溫蒸汽層710通常為由來自實質上為惰性的低溫流體704沸騰的低溫氣體加上在腔室內附加惰性環境的組合。
溫度感測器(未示出)可以懸浮在低溫流體層702上方，其高度實質上等於工作表面634的高度，以便精確地測量在低溫蒸汽層710內操作樣品的工作溫度。 雖然液態氮(liquid nitrogen；LN2)的溫度通常約為-196°C或更低，但較佳之操作玻璃態樣品的溫度在-195°C和-160°C之間。高於低溫流體的頂表面705的高度通常與溫度有關。 例如，對於LN2，工作表面越接近頂表面705，工作溫度就越接近低溫流體的 -196 oC溫度，例如，如果高於低溫流體頂表面705達17cm，則約為-161 oC；如果高於12cm，則為-167 oC，如果高於7cm，則為-168 oC等。 但是由於顯微鏡通常用作EXLO系統的一部分，以便於在樣品低溫支架612的工作表面634內操作顯微樣品從架座712到載體714，因此操作係限於從低溫流體頂表面705到與顯微鏡焦距相匹配的非常小的高度範圍內，通常在工作表面634上方18至35mm之間。
低溫支架612的工作表面634較佳包括一對在其上操作樣品且間隔開的安裝表面。樣品(例如在塊狀樣品(基材)100內形成的樣品103(圖1)或冷凍酵母細胞網格的玻璃態樣品)被安裝在樣品架座712內，並使用本文描述的各種方法經由探頭716操作(即移動)到網格或其它樣品載體714。樣品可以使用可釋放的夾子或其它手段(未示出)將樣品固定在樣品架座712的位置內。
樣品網格載體714被保留在凹陷區域內或經由具有狹縫側部715的夾子(未示出)以允許將鑷子/鉗子***並夾住網格載體714並安裝樣品以操作至儀器進行檢查。
圖7B是沿圖7A的剖面線7B-7B的組合(assembly)的側面正視圖。液體製冷劑(例如LN2)層702包含在低溫恆溫器腔室616內。在液體製冷劑(例如LN2)層702的頂表面705上方的是低溫蒸汽710的層720，其保持在低濕度(例如，＜10%相對濕度)和實質上惰性的環境(例如，氮氣)。 低溫恆溫器腔室616充滿液體製冷劑(層702)以冷藏含有試樣低溫支架612的試樣支架護城河支架 700，使得液體製冷劑頂表面705處於工作表面634以下的高度。 工作表面634可以客製化以適用於低溫FIB銑削的不同塊狀試樣和一個或多個樣品網格載體的預定義位置。顯示成在打開位置的防霜蓋628是用於在低溫轉移步驟期間覆蓋低溫支架612上的工作表面634(參見圖7A)，以便具有所需尖端形狀的探頭716可用於低溫EXLO操作。應注意，這種幾何形狀(即其中工作表面634所在位置和探頭操作在低溫液體表面705上方的氣相720環境中執行)允許在座架712的FIB樣品、網格載體714和探頭716都在相同的低溫下操作。
圖8和圖9分別顯示在低溫環境中透過操作從形成處(formation)移動樣品的過程的示意圖和流程圖。 在步驟901中，安裝樣品低溫支架612在低溫冷卻臺804上的聚焦離子束(FIB)腔室802內，並且旋轉打開防霜蓋628以將塊狀試樣806暴露給FIB銑削儀器808，其還可以包含掃描式電子顯微鏡柱809。當這些試樣是玻璃態的或具有其他性質使得它們必須保持在低溫環境中時，將塊狀試樣806在FIB中以低溫裝設並保持在較佳低於-140°C的低溫環境中。FIB銑削儀器808將光束810聚焦到塊狀試樣806上，並銑削成適合隨後由例如電子顯微鏡的儀器進行檢查的薄樣品812。 一旦樣品812被銑削，防霜蓋628就關閉，從而覆蓋試樣及樣品低溫支架612的工作表面634並盡量減少冰污染的形成。應理解圖8僅是示意圖，其已經相對於低溫支架612的大小增加所繪示的塊狀試樣806和樣品812的尺寸，以便它們在此圖像中是可視的。實際上，塊狀試樣和樣品比樣品低溫支架612小許多倍，並且在圖8的真實尺寸表示中將會幾乎是不可見的。在步驟902中，在對樣品812進行低溫銑削之後，樣品低溫支架612和銑削後的樣品812在防霜蓋628封閉下通過氣閘814轉移到真空腔室816。  樣品低溫支架612定位在使其垂直地停留在低溫夾套600的內部隔室610(圖6B)內。 如上所述，低溫夾套位於低溫流體614浴中，其本身被保留在低溫恆溫器腔室616內，其中低溫流體的液位(低溫液體切斷層626)不會延伸超過低溫恆溫器腔室616側壁620的高度。 腔室816和組合經由泵818抽真空，並穿過氣閘820移動到受控的惰性環境中。
在步驟903中，整個低溫恆溫器腔室616透過氣閘820轉移到手套箱腔室822中。 然後經由閥門824控制手套箱腔室822的環境條件，以保持腔室822內相對濕度＜10%且為惰性氣體環境。 一旦進入手套箱腔室822，腔室816進行洩氣，低溫恆溫器腔室616從腔室816中移出。隨著時間的推移，低溫流體614的頂層沸騰，使得液位從略低於低溫夾套600側壁高度的低溫液體切斷層626液位降低到護城河支撐700頂表面705下方的液位。 還可以根據需要在手套箱腔室822內添加額外的LN2，以將低溫流體液位(頂表面705)加到所需的深度。組合的排氣進一步創造了集結剛好在流體頂表面705上方的低溫蒸汽層710(如圖7A和7B所示)的條件。夾持器(例如鑷子826)用於從低溫夾套600內抓住封閉的試樣低溫支架612並將試樣低溫支架612移動到護城河支架700的支撐表面上。整個低溫恆溫器腔室616位於EXLO工作站上，以便使用者可以藉由穿過手套箱腔室822側壁形成的密封手套孔開口828手動操作FIB樣品、低溫恆溫器和低溫恆溫器的其他特性。
在步驟904中，防霜蓋628被揭開，從而暴露樣品812，以便在低溫蒸汽層環境中進行操作。 如上所述的EXLO方法接著用於從塊狀試樣806中取出樣品812並操作到所選的樣品載體，例如網格載體714(圖7A)或圖3中所示的開槽網格。可以關閉防霜蓋628，並且移動低溫恆溫器腔室618到手套箱腔室822之外，然後可以將帶有樣品812的網格載體714轉移到檢測工具(未示出)，以使用例如電子顯微鏡、拉曼光譜術、歐傑光譜分析、X射線螢光光譜術、二次離子質譜術或其他適當的表徵或分析技術等各種方法分析低溫樣品。 手套箱腔室822內的所有步驟，包括將低溫恆溫器從氣閘820轉移到手套箱腔室822中、手套箱腔室822進行洩氣、打開樣品支架之防霜蓋628，以及操作樣品從樣品表面位置(架座712)到網格載體714位置，都可以通過密封的手套孔開口828手動完成。
以這種方式，所描述的方法和相關設備能夠在低溫和環境控制的環境中(例如，手套箱腔室822)中執行樣品操作，該環境位於製備樣品的儀器之外，例如FIB腔室802。所述方法和設備還允許將低溫支架從製備樣品的儀器轉移到低溫恆溫器內的低溫夾套中，以保持其低溫而無需將低溫支架直接浸入製冷劑中。因此所描述的所得方法和設備允許樣品在所有轉移和操作過程中保持在玻璃態狀態。已經證實這可以將樣品操作所需的總時間減少至不到10分鐘。
較佳的是對樣品進行操作的環境，例如手套箱腔室(聚氯乙烯(polyvinyl chloride；PVC/珀斯佩有機玻璃(plexi)/等)，實質上保持惰性，並且相對低的濕度百分比(即手套箱內的環境水蒸汽)較佳＜10%。這種降低的濕度減少了樣品上冰晶形成/污染的機會，因此保持經FIB銑削的樣品表面“清潔”，以便使用檢測工具進行精確檢測。泵和除溼系統以及氣體供應器(閥門824)可用於控制濕度和惰性條件。
可以理解，所描述的操作方法可以用一個或多個探頭進行，其中任何一個可為主要使用凡得瓦力以固體表面探頭取出樣品、以空心探頭使用真空或吸力輔助、使用帶有夾具或端效器的探頭、或者使用帶有膠水輔助的探頭，如先前技術中所討論者。此外，一個或多個樣品載體可用於操作一個或多個低溫FIB製備樣品之製程。 低溫恆溫器中也可以配置多個工作表面，使工作表面位於低溫蒸汽內—例如，一個工作表面可以包括帶有低溫FIB樣品的塊狀試樣，第二個表面可用於樣品網格載體。一些低溫電子顯微鏡( electron microscope ； EM)使用傳統的網格，這些網格被夾在更大的支撐結構中，因此它們可以由自動網格裝載器處理。 對於此類自動裝載器，可以將網格預先夾入這些支撐結構中，用於低溫EXLO製程。或者，工作表面也可以由樣品網格載體或預安裝在EM支架中的預夾住的樣品網格載體組成，從而減少額外的低溫轉移步驟。此外，可以使用一種或多種探頭類型來優化樣品操作。整個或部分的EXLO系統可以包含在提供環境控制的外殼中。EXLO系統可以通過氣閘、手套埠或直接有線或無線/藍牙控制該系統的電腦化功能進行近接。
圖9示出了低溫EXLO製程步驟的基本工作流程圖。 在步驟901中，低溫支架612(圖7A)具有可以經由重力或使用鑷子或其他工具打開或關閉的防霜蓋，係用以將塊狀樣品安裝到其工作表面上，該工作表面將被FIB銑削以製備用於後續低溫EM的薄樣品。 該支架工作表面也可以客製化為包含將用於夾持、固定或支撐樣品載體網格的獨特區域。該支架使用習知方法低溫轉移到FIB中。在低溫FIB臺上定位之前，真空負載鎖定中的中間步驟可以包括在蓋子打開下的金屬濺射塗敷。保護性FIB沉積和FIB銑削係使用傳統的低溫FIB銑削方法與傳統的EXLO FIB研磨方案相結合而執行。在FIB 銑削之後，步驟902關閉防霜蓋並將低溫支架真空轉移到位於含有製冷劑(例如液態氮，LN2)的低溫恆溫器內的低溫夾套中。 低溫夾套在轉移過程中將低溫支架保持在低溫下，而無需將支架浸入製冷劑中(例如LN2)。在支架被轉移到低溫恆溫器後，它被抽真空，且該組合穿過氣閘轉移到受控的低濕度(＜10%相對濕度)和實質上惰性的環境(例如，氮氣)。  在步驟903中，對該組合進行排氣，並將支架從低溫夾套低溫轉移到低溫恆溫器內的護城河支架上，使得支架工作表面得以定位在製冷劑(例如LN2)表面上方的低溫蒸汽中，並且整個低溫恆溫器得以定位在包含在濕度受控和惰性環境中的EXLO工作站上。揭開防霜蓋，將冷樣品網格載體或冷預夾式樣品網格載體定位在支架工作表面的定義區域。或者，可以將具有合適樣品網格載體的低溫EM支架桿定位在低溫製冷劑蒸汽內的低溫恆溫器中。然後在步驟904中，使用上述和圖10中描述的任意數目的探測技術來執行EXLO，以將一個或多個FIB樣品操作到所選的樣品網格載體。
圖10示出了工作流程圖，指出可與低溫EXLO (步驟904)一起應用的探測方法的替代選擇。據瞭解，多個探頭和多個探頭類型可用於低溫EXLO 操作製程步驟。在步驟1001中，可以使用主要利用凡得瓦力的錐形或斜面探頭來操作低溫FIB製備的樣品並將其低溫轉移到所選的網格載體上。在替換性步驟1002期間，使用真空或吸力輔助來操作低溫FIB製備的樣品的空心探頭可用於進行低溫轉移到所選的網格載體。在替換性步驟1003期間，可以使用夾持器或帶有端效器的探頭來操作低溫FIB製備的樣品並將其低溫轉移到所選的網格載體。在交替步驟1004期間，可以使用帶有膠水的探頭來操作低溫FIB製備的樣品並將其低溫轉移到所選的網格載體。
圖11示出將樣品操作到所選網格載體的步驟。在步驟1110中，關閉防霜蓋並將包含支架的低溫恆溫器從環境腔室中取出。  打開防霜蓋，並將一個或多個網格載體低溫儲存或轉移到低溫EM中。在步驟1120期間，如果將樣品網格載體預先安裝在低溫EM支架中，則支架可以直接低溫轉移到低溫EM中，或者可以將樣品網格載體以低溫儲存。 在步驟1130中，如果將厚低溫FIB樣品操作到開槽網格載體上，則可以將開槽網格載體低溫轉移回低溫FIB中，以便在低溫轉移到低溫儲存室或低溫EM之前進行額外的FIB薄化作業。
圖12A是用EXLO工作站在低溫EXLO操作後立即獲得的光學顯微鏡圖像，並示出玻璃態酵母樣品1215***作到由銅網格框架1217支撐的碳薄滲透膜1216上。
圖12B是玻璃態酵母樣品1215、碳薄滲透膜1216和銅網格框架1217的明場能量濾波低溫EM圖像。
在較佳實施例中描述和說明本發明的原理之後，應當顯而易知本發明可以在配置和細節上進行修改而不偏離這些原理。可以使用其他材料和製程，樣品可以由光束敏感材料形成，這些樣品在形成、操作和檢測過程中需要保持低溫，但不一定需低於-140°C的溫度下。因此，吾人請求的權利範圍包括在以下申請專利範圍的精神和範疇內所有可能出現的修改和變化。
100:塊狀試樣 101:試樣表面 102:溝槽壁 103:樣品 104:探針 201:網格的一小部分 202:塗層 203:網格條 301:網格表面 302:載體網格 303:上邊緣 304:下邊緣 401:斜面橢圓表面 402:探頭軸線 501:斜面空心玻璃管 502:樣品 600:低溫夾套 602:夾套本體 604:燕尾榫 606、609:槽 608:頂面 610:內部隔室 612:低溫支架 613:螺紋孔 614:低溫流體 616:低溫恆溫器腔室 618:基座 620:側壁 622:層 624:(低溫夾套)側壁 626:低溫液體切斷層 628:防霜蓋 630:主體 632:螺釘或銷 634:工作表面 700:護城河支架 702:層 704:低溫流體 706:側壁 705:頂表面 708:周邊脊部 710:低溫蒸汽(層) 712:架座 714:載體 715:狹縫側部 716:探頭 720:氣相 800:聚焦離子束(FIB) 802:聚焦離子束(FIB)腔室 804:低溫冷卻臺 806:試樣 808:FIB銑削儀器 809:掃描式電子顯微鏡柱 810:光束 812:樣品 814:氣閘 816:腔室 818:泵 820:氣閘 822:手套箱腔室 824:閥門 901~904、1001~1004、1110~1130:步驟
本發明的上述和其它目的、特徵和優點將從參考圖式進行的本發明的較佳實施例的以下詳細描述中變得更加明顯，其中：
圖1是示出使用先前技術中已知的實心錐形玻璃探頭尖端之非原位取出(EXLO)的透視圖。
圖2是示範已知於先前技術中對碳塗層網格的小區域的EXLO操作的俯視圖。
圖3是示出已知於先前技術中將不對稱FIB製備的樣品操作成背側取向於開槽網格表面上的側面正視圖。
圖4是使用已知於先前技術中具有橢圓形探頭平坦表面之斜面實心探頭尖端的樣品及取出幾何形狀的透視圖。
圖5是已知於先前技術使用真空/吸力透過空心玻璃探頭尖端將FIB製備樣品操作於碳塗層EM網格載體的一小部分的俯視圖。
圖6A和圖6B分別是保持在低溫夾套內並形成本發明之較佳特徵的樣品支架的透視圖和側視截面圖。
圖7A和圖7B分別是根據本發明的教示內容保持在護城河支撐結構(moat support structure)上的試樣支架的透視圖和側視截面圖。
圖8是示意性截面側視圖，顯示根據本發明的教示內容，試樣支架從樣品的形成到操作樣品到載體通過各種階段的動態。
圖9是根據本發明的教示內容實現的低溫EXLO步驟的流程圖表。
圖10是列出可與圖9的低溫EXLO步驟一起使用的替代探測方法步驟的流程圖表。
圖11列出了根據本發明的教示內容在操作至所選擇的載體網格後可能的工作流程。
圖12A是樣品網格載體上的低溫樣品的光學顯微鏡圖像。
圖12B是樣品網格載體上之低溫試樣的低溫EM圖像。
901~904:步驟

Claims (22)

  1. 一種操作低溫樣品以進行後續檢查之方法，其包括以下步驟： 將低溫樣品安裝在樣品支架的工作表面上； 將所述樣品支架放置在具有一層低溫液體於其內的低溫恆溫器腔室內，所述低溫液體上方具有低溫蒸汽層，使得所述樣品支架的工作表面在所述低溫蒸汽層內；以及 將所述低溫樣品操作到包含在所述工作表面的不同部分上的樣品載體，同時將所述低溫樣品保持在所述低溫蒸汽層內。
  2. 如請求項1所述的方法，其中，非原位(ex situ)操作所述低溫樣品的步驟包括以下的至少一者：主要使用凡得瓦力將所述低溫樣品黏著在固體表面探頭尖端、使用真空或吸力輔助將所述低溫樣品黏著到空心表面探頭尖端、使用夾持器或端效器將所述低溫樣品黏著在探頭尖端、以及使用膠水輔助將所述低溫樣品黏著在探頭尖端。
  3. 如請求項1所述的方法，其中，所述低溫蒸汽層實質上係為惰性。
  4. 如請求項3所述的方法，其中，所述低溫液體為液態氮(LN2)、液態氦、液態乙烷或液態氬。
  5. 如請求項1所述的方法，進一步包括以下步驟：將發生所述操作步驟的環境保持在相對濕度＜10%。
  6. 如請求項1所述的方法，進一步包括以下步驟： 在所述低溫液體內放置護城河支撐結構；以及 將所述樣品支架安裝在所述護城河支撐結構上，使得所述樣品支架的工作表面升高到所述低溫蒸汽層中。
  7. 如請求項6所述的方法，其中，所述護城河支撐結構包括昇高至所述低溫液體之頂表面上方的頂表面，所述將所述樣品支架安裝在所述護城河支撐結構上的步驟包括將所述樣品支架支撐在所述護城河支撐結構的頂表面上。
  8. 如請求項1所述的方法，其中，所述將所述低溫樣品操作到所述工作表面的不同部分的步驟包括將所述低溫樣品移動到樣品網格載體。
  9. 如請求項8所述的方法，其中，所述樣品網格載體定位在所述工作表面的不同部分上。
  10. 如請求項9所述的方法，其中，在所述操作步驟之後，進一步包括以下步驟： 使用電子顯微鏡、拉曼光譜術、歐傑光譜分析、X射線螢光光譜術、二次離子質譜術或其它適當的表徵或分析技術來分析所述低溫樣品。
  11. 如請求項1所述的方法，進一步包括以下步驟： 在所述樣品支架上安裝塊狀試樣； 將具有所述低溫樣品的所述樣品支架從儀器移入低溫夾套中；以及 將所述樣品支架和低溫夾套保持在真空下。
  12. 如請求項11所述的方法，進一步包括以下步驟： 在所述使用所述儀器製備所述低溫樣品的步驟之後，以及在所述將所述樣品支架移入所述低溫夾套中的步驟之前，以防霜蓋覆蓋所述樣品支架的工作表面。
  13. 如請求項12所述的方法，進一步包括以下步驟： 對所述低溫恆溫器腔室進行洩氣，使所述低溫恆溫器腔室在主要為惰性之環境中保持在相對低的濕度；以及 將所述樣品支架從所述低溫夾套轉移到所述低溫恆溫器腔室內的護城河支撐結構上。
  14. 如請求項13的方法，進一步包括以下步驟： 在低於-140°C的溫度下在一儀器中從所述塊狀試樣中製備所述低溫樣品。
  15. 如請求項13所述的方法，其中所述低溫樣品為生物樣品，所述方法還包括以下步驟： 在整個所述轉移和操作步驟中將所述低溫樣品維持在玻璃態狀態。
  16. 一種用於操作低溫樣品的設備，其包括： 低溫恆溫器腔室，其具有一層低溫液體以及在所述低溫液體上方的低溫蒸汽層；以及 低溫樣品支架，其定位於所述低溫恆溫器腔室內，且配置為將所述低溫樣品保持在僅位於由低相對濕度 (＜ 10%)組成且在實質上為惰性之條件下的所述低溫蒸汽層內的工作表面上。
  17. 如請求項16所述的設備，進一步包括安裝在所述低溫樣品支架的所述工作表面上的樣品網格載體，所述樣品網格載體被配置為接收所述低溫樣品，以便使用選自以下組成之群組的方法進行後續分析：電子顯微鏡、拉曼光譜術、歐傑光譜分析、X射線螢光光譜術、二次離子質譜術或其它適當的表徵或其他分析技術。
  18. 如請求項16所述的設備，進一步包括定位在所述低溫液體內的護城河支撐結構，其中，所述樣品支架定位在所述護城河支撐結構上，使得所述樣品支架的所述工作表面不與所述低溫液體接觸，並且所述樣品支架的所述工作表面被昇高到所述低溫蒸汽層中。
  19. 如請求項18所述的設備，其中，所述護城河支撐結構包括高於所述低溫液體的下表面的頂表面，使得所述樣品支架定位在所述護城河支撐結構的頂表面上。
  20. 如請求項16所述的設備，進一步包括： 低溫夾套，其定位在所述低溫恆溫器腔室的低溫液體內，所述低溫夾套的底部和側壁與所述低溫液體接觸，但高於所述低溫液體的頂表面，以形成內部隔間，所述內部隔間配置為接收所述低溫樣品支架於其内，使得所述低溫樣品支架不與所述低溫液體接觸。
  21. 如請求項16所述的設備，其中所述低溫樣品支架包括防霜蓋，所述防霜蓋被配置為在暴露所述工作表面的打開位置和覆蓋所述工作表面的關閉位置之間移動。
  22. 如請求項16所述的設備，其中所述低溫液體取自以下組成的群組中的一者：液態氮(LN2)、液態氦、液態乙烷和液態氬。
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