TW202342094A - 高度活化之脂質奈米粒子 - Google Patents

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安德魯 Ｎ 康福思
強納森 周
達妮亞 茲凡奇
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Abstract

本發明係關於包含溶血磷脂醯膽鹼(LPC)化合物及至少一種另外的脂質及/或界面活性劑的脂質奈米粒子，及其在高度活化哺乳動物樹突細胞(諸如人類樹突細胞)中之用途。本發明亦關於包含有包含LPC及至少一種另外的脂質及/或界面活性劑的脂質奈米粒子之組合物，其中該等組合物包含病原體識別受體促效劑、抗原及哺乳動物樹突細胞中之一或多種，以及產生及使用該等組合物之方法。

Description

高度活化之脂質奈米粒子
本發明係關於包含溶血磷脂醯膽鹼(LPC)化合物及至少一種另外的脂質的脂質奈米粒子，及其在高度活化哺乳動物樹突細胞，諸如人類樹突細胞中之用途。本發明亦關於包含脂質奈米粒子之組合物，該等脂質奈米粒子包含LPC及至少一種另外的脂質，其中該等組合物包含病原體識別受體促效劑、抗原及哺乳動物細胞中之一或多種，以及產生及使用該等組合物之方法。
脂質奈米粒子(LNP)已成為重要的疫苗遞送工具，尤其係在mRNA疫苗之情形下。雖然基於LNP之mRNA疫苗以及蛋白質次單元疫苗可有效誘導抗原特異性抗體反應，但其通常表現出有限的抗原特異性T細胞反應。
樹突細胞(DC)為T細胞提供多種信號，此等信號對於建立適當的T細胞反應很重要。信號的類型及大小取決於DC的活化狀態(Zhivaki及Kagan, Nature Reviews Immunology, 22:322-339, 2022)。初生DC係具有攝取抗原能力的靜息細胞。活性DC不僅具有攝取抗原的能力，而且具有增強的在主要組織相容性複合體分子上呈現抗原肽片段的能力。此外，活性DC增加了用於刺激T細胞的共刺激分子的表現。高度活性DC與其活性DC對應物分享活性，但亦獲得了高度遷移至淋巴結及分泌IL-1β的能力。與高度活性DC一樣，焦亡DC分泌較高含量的IL-1β。然而，焦亡DC係死細胞，會迅速失去其T細胞刺激能力。當DC使用含有病原體相關分子模式(PAMP)的分子、脂多醣(LPS)及含有損傷相關分子模式(DAMP)的分子(諸如PGPC (1-棕櫚醯基-2-戊二醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼))成熟時，其分泌IL-1β而沒有焦亡，將此等細胞描述為高度活性(Zanoni等人, Science, 352(6290):1232-1236, 2016)。
因此，具有高度活化樹突細胞能力的LNP調配物需要包含在疫苗中。特別地，此項技術中需要具有誘導IL-1β分泌及增強長壽命T細胞反應產生的能力的LNP。
本發明係關於包含溶血磷脂醯膽鹼(LPC)化合物及至少一種另外的脂質的脂質奈米粒子，及其在高度活化哺乳動物樹突細胞中之用途。本發明亦關於包含脂質奈米粒子之組合物，該等脂質奈米粒子包含LPC及至少一種另外的脂質，其中該等組合物進一步包含病原體識別受體促效劑、抗原及哺乳動物樹突細胞中之一或多種，以及產生及使用該等組合物之方法。
具體而言，本發明提供了一種組合物，其包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、至少一種另外的脂質及TLR7/8促效劑，其中該醯基鏈係C13-C22醯基鏈或C13-C24醯基鏈，並且該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分。在一些實施例中，該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群。在一些實施例中，該醯基鏈係C18-C22醯基鏈、C21-C24醯基鏈或C22醯基鏈。在一些實施例中，該組合物進一步包含抗原及/或樹突細胞。
在一些態樣，本發明提供了一種組合物，其包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、至少一種另外的脂質及抗原，其中該醯基鏈係C21-C24醯基鏈，並且該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分。在一些實施例中，該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群。在一些實施例中，該組合物進一步包含樹突細胞及/或TLR7/8促效劑。
在一些態樣，本發明提供了一種組合物，其包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、至少一種另外的脂質及樹突細胞，其中該醯基鏈係C21-C24醯基鏈，並且該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分。在一些實施例中，該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群。在一些實施例中，該組合物進一步包含TLR7/8促效劑及/或抗原。
在前述態樣之一些實施例中，該抗原存在於自個體獲得之生物樣品中。在一些實施例中，該生物樣品包含活檢組織。在一些實施例中，該生物樣品包含細胞。在其他實施例中，該生物樣品不包含細胞。在一些實施例中，該生物樣品包含來自膿腫的膿。在一些實施例中，該抗原包含蛋白質抗原。在一些實施例中，該抗原包含腫瘤抗原。在一些實施例中，該腫瘤抗原包含合成或重組新抗原。在一些實施例中，該腫瘤抗原包含腫瘤細胞溶胞產物。在一些實施例中，該抗原包含微生物抗原並且該微生物抗原包含病毒抗原、細菌抗原、原生動物抗原及真菌抗原中之一或多種。在一些實施例中，該微生物抗原包含經純化或重組表面蛋白。在一些實施例中，該微生物抗原包含不活化完整病毒。
在一些實施例中，該組合物不包含LPS或MPLA。在一些實施例中，該組合物不包含oxPAPC或oxPAPC之物種。在一些實施例中，該組合物不包含HOdiA-PC、KOdiA-PC、HOOA-PC、KOOA-PC及/或PGPC。在一些實施例中，該組合物不包含經分離mRNA。在一些實施例中，該組合物不包含界面活性劑(例如，泊洛沙姆(poloxamer))。在一些實施例中，該組合物不包含泊洛沙姆407 (KP407)、泊洛沙姆188 (KP188)及/或Pluronic P123(P123)。
在一些實施例中，該組合物進一步包含佐劑，其中該佐劑包含鋁鹽佐劑、水包角鯊烯乳液、皂苷或其組合。
在一些實施例中，本發明提供了一種醫藥調配物，其包含如前述態樣中任一項之組合物及醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，該調配物確實包含界面活性劑(例如，泊洛沙姆)。在一些實施例中，該調配物包含泊洛沙姆407 (KP407)、泊洛沙姆188 (KP188)及/或Pluronic P123 (P123)。在其他實施例中，該調配物不包含界面活性劑。
在其他態樣，本發明提供了一種用於產生經高度活化樹突細胞之方法，該方法包含使該等樹突細胞與有效量之包含具有單個C13-C22醯基鏈或C13-C24醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、至少一種另外的脂質及TLR7/8促效劑之組合物接觸，用於產生經高度活化樹突細胞，其中該等經高度活化樹突細胞分泌IL-1β而不經歷細胞焦亡，且該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分。在一些實施例中，該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群。在一些實施例中，使該等樹突細胞與如前述實施例中任一項之組合物或醫藥調配物離體接觸。在其他實施例中，使該等樹突細胞與包含如前述實施例中任一項之組合物之醫藥調配物在活體內接觸。在一些態樣，本發明提供了一種醫藥調配物，其包含藉由前述實施例產生的複數個經高度活化樹突細胞及醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，該複數個樹突細胞包含至少10 3、10 4、10 5、10 6、10 7或10 8個高度活化之DC。
在其他態樣，本發明提供了一種組合物，其包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、至少一種另外的脂質及病原體識別受體(PRR)促效劑，其中該醯基鏈係C13-C22醯基鏈或C13-C24醯基鏈，並且該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分。在一些實施例中，該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群。在一些實施例中，該PRR促效劑係類鐸受體(TLR)、類NOD受體(NLR)、類RIG-I受體(RLR)或C型凝集素受體(CLR)的促效劑。在一些實施例中，該PRR促效劑係細胞溶質DNA感測器(CDS)或IFN基因刺激因子(STING)的促效劑。在一些實施例中，該PRR促效劑包含TLR7/8促效劑。在一些實施例中，該組合物進一步包含抗原及/或樹突細胞。
在前述態樣之一些實施例中，該醯基鏈係C21-C24醯基鏈。在一些實施例中，該醯基鏈係C22醯基鏈。在一些實施例中，該醯基鏈係完全飽和的。在一些實施例中，該LPC包含1-二十二烷醯基-2-羥基- sn-甘油-3-磷膽鹼[LPC(22:0)]。
在前述態樣之一些實施例中，該TLR7/8促效劑係分子量為900道爾頓或更小的小分子。在一些實施例中，該TLR7/8促效劑包含咪唑并喹啉化合物。在一些實施例中，該TLR7/8促效劑包含雷西莫特(resiquimod) (R848)。在一些實施例中，該LPC包含LPC(22:0)，並且該TLR7/8促效劑包含雷西莫特(R848)。
本發明進一步提供了用於高度活化人類樹突細胞之組合物，其包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)化合物、至少一種另外的脂質及病原體識別受體(PRR)促效劑，其中該醯基鏈係C22醯基鏈，該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分，並且該組合物與包含比較化合物代替LPC的比較組合物相比有效達成更高水平的樹突細胞高度活化。在一些實施例中，該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群。在一些實施例中，該高度活化在活體外或離體發生。在其他實施例中，該高度活化在活體內發生。在一些實施例中，該更高水平的樹突細胞高度活化包含與當與包含比較化合物及該PRR促效劑的比較組合物接觸時相比，當與包含該LPC及該PRR促效劑的該組合物接觸時，在活體外誘導該等哺乳動物(例如人類)樹突細胞以高至少2、3或4倍的含量分泌IL-1β，其中該PRR促效劑係LPS。在一些實施例中，該LPC的濃度及該比較化合物的濃度係相同的濃度，視情況在約10 μM至約80 μM的範圍內，並且該LPS在該組合物及該比較組合物中均以1 μg/ml的濃度存在。在一些實施例中，該較高水平的樹突細胞高度活化包含與包含該比較化合物及該PRR促效劑的該比較組合物相比，對於包含該LPC及該PRR促效劑之該組合物，哺乳動物(例如人類)樹突細胞分泌IL-1β的脂質活性指數的活性單位高至少4、5或6倍。在一些實施例中，該比較化合物係PGPC。
相關申請案之交互參照
本申請案主張2022年10月18日申請之美國臨時專利申請案第63/417,282號、2022年4月11日申請之國際申請案第PCT/US2020/071664號及2022年2月7日申請之美國臨時專利申請案第63/307,569號之優先權及權益，該等申請案各自以全文引用的方式併入本文中。
本發明係關於包含溶血磷脂醯膽鹼(LPC)化合物及至少一種另外的脂質的脂質奈米粒子(LNP)，及其在高度活化哺乳動物樹突細胞中之用途。本發明亦關於包含有包含LPC及至少一種另外的脂質的LNP之組合物，其中該等組合物進一步包含病原體識別受體促效劑、抗原及哺乳動物樹突細胞中之一或多種，以及產生及使用該等組合物之方法。在一些實施例中，該等樹突細胞係人類樹突細胞。在其他實施例中，該等樹突細胞係非人類樹突細胞。在一些實施例中，該等非人類樹突細胞並非嚙齒動物樹突細胞。在一些實施例中，該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群。
在本發明之一些實施例中，相對於具有單脂質層的粒子(微胞)，組合物的LNP以具有脂質雙層的粒子(脂質體)形式富集。具體而言，在一些實施例中，LNP包含脂質體，並且幾乎沒有微胞。
在本發明之其他實施例中，相對於具有脂質雙層的粒子(脂質體)，組合物的LNP以具有單脂質層的粒子(微胞)形式富集。具體而言，在一些實施例中，LNP包含微胞，並且幾乎沒有脂質體。 通用技術及定義
除非另外指示，否則本發明之實踐將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習知技術，其完全處於此項技術之範圍內。
除非另外指明，否則如本文及隨附申請專利範圍所使用之單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個參考物。舉例而言，「一」賦形劑包括一或多種賦形劑。
如本文所使用之片語「包含」為開放式的，表明此類實施例可以包括其他元素。相比之下，片語「由……組成」為封閉式的，表明此類實施例不包括其他元素(痕量雜質除外)。片語「基本上由……組成」為部分封閉式的，表明此類實施例可進一步包含不會實質上改變此類實施例之基本特徵的元素。
如本文所使用之術語「約」係指一值，包括該值的90%至110% (例如，約900道爾頓的分子量，係指810道爾頓至990道爾頓的分子量)。
物質之「有效量」或「足夠量」為足以實現有利或所需結果，包括臨床結果之量，且因而「有效量」視其所應用之上下文而定。舉例而言，在投與免疫原性組合物的情況下，有效量含有足夠的抗原，以及溶血磷脂醯膽鹼(LPC)化合物及PRR促效劑中之一或兩種，以刺激針對抗原的免疫反應(例如，抗原反應性抗體及/或細胞免疫反應)。
術語「個體」及「受試者」係指哺乳動物。「哺乳動物」包括(但不限於)人類、非人類靈長類動物(例如猴)、農場動物、運動型動物、嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)及寵物(例如狗及貓)。在一些實施例中，受試者係人類患者，諸如患有癌症及/或感染性疾病的人類患者。
如本文關於免疫原性組合物所使用之術語「劑量」係指受試者在任一時間服用(向受試者投與或藉由受試者接受)之免疫原性組合物之量測部分。
如本文所用，術語「經分離」及「經純化」係指自至少一種組分中移出的材料，該組分在該材料的生產過程中本來與之相關聯(例如，自其原始環境中移出)。作為一實例，當用於提及LPC時，經分離LPC係至少為90%、95%、96%、97%、98%或99%純的，以藉由薄層層析法或氣相層析法所測定。作為進一步的實例，當用於提及重組蛋白質時，經分離蛋白質係指已經自產生該蛋白質的宿主細胞的培養基中移出的蛋白質。此外，當用於提及合成的化合物時，經分離化合物或經純化化合物已經自合成其的反應混合物中移出。
術語「醫藥調配物」及「醫藥組合物」係指呈准許活性成分之生物活性有效之形式，且不含對將投與調配物或組合物之個體不可接受地產生毒性之額外組分的製劑。此類調配物或組合物意欲係無菌的。
如本文所用，「賦形劑」包括醫藥學上可接受之賦形劑、載劑、媒劑或穩定劑，其在所使用之劑量及濃度下對暴露於其之細胞或哺乳動物無毒性。通常生理學上可接受之賦形劑為水性pH緩衝溶液。
術語「抗原」係指被抗體或T細胞抗原受體特異性識別及結合的物質。抗原可以包括肽、多肽、蛋白質、醣蛋白、多醣、複合碳水化合物、糖、神經節苷脂、脂質及磷脂；其部分及其組合。當存在於本發明之組合物中時，抗原可以係合成的或由自然界分離的。適用於在本發明之方法中投與的抗原包括能夠引發抗原特異性B細胞或T細胞反應的任何分子。半抗原包括在「抗原」的範圍內。「半抗原」係一種低分子量化合物，其本身不具有免疫原性，但在與通常較大的免疫原性分子(攜載物(carrier))結合時會產生免疫原性。
「多肽抗原」可以包括經純化天然肽、合成肽、重組肽、粗肽提取物或處於部分純化或未純化活性狀態的肽(例如作為減毒或不活化病毒、微生物或細胞之一部分的肽)或此類肽的片段。多肽抗原的長度較佳為至少八個胺基酸殘基。
術語「促效劑」在最廣義上使用，且包括經由受體活化信號傳導的任何分子。在一些實施例中，促效劑與受體結合。舉例而言，TLR8促效劑與TLR8受體結合並活化TLR8信號傳導路徑。
「烷基」係指一價飽和脂族烴基。Cx烷基係指具有x數目個碳原子的烷基。Cx-Cy烷基或Cx-y烷基係指具有在x數目個與y數目個之間的碳原子的烷基，包括端值。
「伸烷基」係指二價飽和脂族烴基。
「烯基」係指具有至少一個雙鍵(＞C=C＜)的一價烴基。Cx烯基係指具有x數目個碳原子的烯基。Cx-Cy烯基或Cx-y烯基係指具有在x數目個與y數目個之間的碳原子的烯基，包括端值。
反應或參數之「刺激」包括當相比於除了所關注參數其他方面相同的條件或替代地相比於另一條件時引發及/或增強該反應或參數(例如在TLR促效劑存在下相比於缺乏TLR促效劑，TLR-信號傳導提高)。舉例而言，免疫反應之「刺激」意謂反應提高。視所量測的參數而定，提高可能係2倍至2,000倍，或者5倍至500倍或更多倍，或者2、5、10、50或100倍至500、1,000、2,000、5,000或10,000倍。
相反，反應或參數的「抑制」包括當相比於除了所關注參數其他方面相同的條件或替代地相比於另一條件時減少及/或抑制該反應或參數(例如，投與包含LPC化合物及一或多種病原體識別受體促效劑、抗原及人類樹突細胞的組合物之後相比於投與安慰劑組合物或不進行治療，異常細胞增殖減少)。舉例而言，免疫反應之「抑制」意謂反應減少。視所量測的參數而定，減少可能係2倍至2,000倍，或者5倍至500倍或更多倍，或者2、5、10、50或100倍至500、1,000、2,000、5,000或10,000倍。
相對術語「較高」及「較低」分別係指當相比於除了所關注參數其他方面相同的條件或替代地相比於另一條件時，反應或參數的可量測的增加或減少。舉例而言，「較高的DC高度活化水平」係指由治療條件(包含本發明的LPC化合物)導致的DC高度活化水平至少比由對照條件(例如，沒有LPC、PGPC、oxPAPC等)導致的DC高度活化水平高2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。同樣，「較低的DC高度活化水平」係指由治療條件(包含本發明的LPC化合物)導致的DC高度活化水平至少比由對照條件(例如，沒有LPC、PGPC、oxPAPC等)導致的DC高度活化水平低2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些實施例中，對照條件包含比較化合物代替治療條件的LPC。
如本文所用，術語「免疫」係指增加哺乳動物受試者對抗原的反應並因此提高其抵抗或克服感染及/或抵抗疾病的能力的過程。
如本文所使用之術語「疫苗接種」係指將疫苗引入至哺乳動物受試者體內。
「佐劑」係指一種物質，當其添加至包含抗原之組合物中時，在暴露後加強或增強哺乳動物接受者對該抗原的免疫反應。
術語「治療(treating)」或「治療(treatment)」疾病係指執行方案，該方案可以包括向個體(人類或其他)投與一或多種治療劑，以努力在個體中獲得有益或期望的結果，包括臨床結果。有益或期望的臨床結果包括但不限於減輕或改善疾病的一或多種體徵或症狀、減少疾病程度、穩定(即不惡化)疾病狀態、防止疾病傳播、延遲或減緩疾病進展，改善或緩解疾病狀態，以及緩解(無論是部分還是全部)。「治療」亦可意謂存活期相比於未接受治療之個體之預期存活期延長。另外，「治療」可藉由投與一個劑量之一或多種治療劑進行，或可在投與一系列劑量之一或多種治療劑之後進行。「治療(treating)」或「治療(treatment)」不需要完全緩解體徵或症狀，亦不需要治癒，且特別包括對個體僅具有緩解作用的方案。「緩解」疾病或病症意謂與預期的未治療結果相比，疾病或病症的程度及/或不良臨床表現減輕及/或疾病或病症進展的時間進程減慢。 I. 溶血磷脂醯膽鹼化合物
「溶血磷脂醯膽鹼」(LPC)或「溶血磷脂醯膽鹼分子」係指在甘油的羥基上帶有一個磷膽鹼基團並且在甘油的另外兩個羥基之一上帶有一個醯基的甘油分子。其餘的羥基未經取代。
在一些實施例中，具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)具有以下形式： 或 。
在一些實施例中，具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)具有以下形式： 或 。
烷基或烯基鏈與羰基碳一起形成比烷基或烯基鏈長一個碳原子的醯基鏈。舉例而言，(C23烷基)-C(＝O)-基團形成C24醯基鏈。因此，當基團「(烷基或伸烷基)」為C12-C23烷基(諸如C12-C19烷基或C20-C23烷基)時，(C12-C23烷基-C(＝O)-基團形成C13-C24醯基鏈(諸如C13-C20醯基鏈或C21-C24醯基鏈)。當基團「(烷基或伸烷基)」為C12-C23烯基(諸如C12-C19烯基或C20-C23烯基)，(C12-C23烯基-C(＝O)-基團形成C13-C24醯基鏈(諸如C13-C20醯基鏈或C21-C24醯基鏈)。醯基鏈可稱為飽和醯基或不飽和醯基，以區分含烷基及含烯基的醯基。標準的δ符號或ω符號可以用於指示不飽和醯基鏈中一或多個雙鍵的位置。
本發明的溶血磷脂醯膽鹼(LPC)化合物具有單個醯基鏈，其中該醯基鏈係C13-C22醯基鏈或C13-C24醯基鏈。在一些實施例中，該醯基鏈係C18-C22醯基鏈或C21-C24醯基鏈。在一些較佳的實施例中，該醯基鏈係C22醯基鏈。包含在本發明的LNP中的例示性LPC化合物的名稱及結構以及其化學摘要服務社(Chemical Abstract Service，CAS)登記號列為國際申請案第PCT/US2022/071664號之表I的化合物#30-#43，視情況#30-#42，該申請案以引用的方式併入本文中。已知幾種用於合成溶血磷脂的方法(參見例如，D'Arrigo等人, 「Synthesis of lysophospholipids」, Molecules, 15(3):1354-77, 2010；及Yang等人, 「Lysophosphatidylcholine synthesis by lipase-catalyzed ethanolysis」, J Oleo Sci., 64(4):443-7, 2015，以及其中引用的參考文獻)。此外，許多溶血磷脂係市售的。 II. 病原體識別受體促效劑
本發明之組合物及方法可以進一步包含病原體識別受體(PRR)促效劑。在一些實施例中，PRR促效劑包括類鐸受體(TLR)、類NOD受體(NLR)、類RIG-I受體(RLR)或C型凝集素受體(CLR)的促效劑。在其他實施例中，PRR促效劑包含細胞溶質DNA感測器(CDS)或IFN基因刺激因子(STING)。在一些實施例中，PRR促效劑包含TLR7/8促效劑。 A. TLR7/8 促效劑
如本文所用，術語「TLR7/8促效劑」係指TLR7及/或TLR8的促效劑。在一個態樣，TLR7/8促效劑係TLR7促效劑。在另一態樣，TLR7/8促效劑係TLR8促效劑。在另一態樣，TLR7/8促效劑係TLR7及TLR8兩者的促效劑。本發明的TLR7/8促效劑適用於在LPC存在下高度活化人類樹突細胞。
在一些態樣，TLR7/8促效劑係小分子。在一些實施例中，該TLR7/8促效劑係分子量為900道爾頓或更小的小分子或其鹽。亦即，小分子TLR7/8促效劑並非如重組蛋白或合成寡核苷酸般的大分子，大分子受美國FDA生物製品評估及研究中心(U.S. FDA's Center for Biologics Evaluation and Research)的監管。相反，小分子TLR7/8促效劑受FDA藥物評估及研究中心(FDA's Center for Drug Evaluation and Research)的監管。在一些實施例中，小分子具有約90至約900道爾頓的分子量。在一些實施例中，該TLR7/8促效劑包含咪唑并喹啉化合物。在一些較佳的實施例中，該TLR7/8促效劑包含雷西莫特(R848)。 B. 其他 PRR 促效劑
在一些態樣，病原體識別受體(PRR)促效劑包含類鐸受體(TLR)促效劑，其限制條件係TLR促效劑不包含TLR7/8促效劑。在一些實施例中，TLR促效劑包含TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR9及TLR13中之一或多種的促效劑。在一些實施例中，PRR促效劑係TLR2/6促效劑，諸如Pam2CSK4。在其他實施例中，TLR促效劑係TLR4促效劑，諸如單磷醯基脂質A (MPLA)。然而，在較佳的實施例中，TLR促效劑並非TLR2、TLR4及/或TLR9的促效劑。舉例而言，在較佳的實施例中，TLR9促效劑並非TLR4配位體，諸如LPS (內毒素)。
在其他態樣，PRR促效劑包含類NOD受體(NLR)促效劑。在其他態樣，PRR促效劑包含類RIG-I受體(RLR)促效劑。在另外的態樣，PRR促效劑包含C型凝集素受體(CLR)促效劑。在更進一步的態樣，PRR促效劑包含CDS促效劑或STING促效劑。 III. 抗原
本發明之組合物及方法可以進一步包含抗原。在一些實施例中，該抗原包含蛋白質抗原。術語「多肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用，指包含長度至少為8個胺基酸的肽鏈的蛋白質抗原。在一些實施例中，蛋白質抗原的長度為8至1800個胺基酸、9至1000個胺基酸或10至100個胺基酸。在一些實施例中，抗原包含合成蛋白或重組蛋白。在其他實施例中，抗原包含自生物樣品中純化的蛋白質。多肽可以進行轉譯後修飾，諸如藉由磷酸化、羥基化、磺化、棕櫚醯化及/或醣基化。
在一些實施例中，抗原係包含至少一種全長蛋白質或其片段的胺基酸序列的腫瘤抗原。在一些實施例中，腫瘤抗原包含來自致癌蛋白的胺基酸序列或其片段。在一些實施例中，哺乳動物抗原係新抗原或由包含相對於來自哺乳動物受試者的正常細胞中存在的基因的突變的基因編碼。新抗原被認為在使T細胞能夠區分癌細胞及非癌細胞方面特別有用(參見例如，Schumacher及Schreiber, Science, 348:69-74, 2015)。在其他實施例中，腫瘤抗原包含病毒抗原，諸如致癌病毒的抗原。
在一些實施例中，腫瘤抗原係包含兩種或更多種多肽的融合蛋白，其中各種多肽包含來自不同腫瘤抗原的胺基酸序列或來自相同腫瘤抗原的非連續胺基酸序列。在此等實施例之一些中，融合蛋白包含第一多肽及第二多肽，其中各多肽包含來自相同腫瘤抗原的非連續胺基酸序列。
在一些實施例中，抗原係微生物抗原。在一些實施例中，微生物抗原包含病毒抗原、細菌抗原、原生動物抗原、真菌抗原或其組合。在一些實施例中，微生物抗原包含微生物的表面蛋白或其他抗原次單元。在其他實施例中，微生物抗原包含不活化或減毒微生物。舉例而言，微生物抗原可以包含不活化病毒，諸如以化學方式或以基因方式不活化的病毒。或者，微生物抗原可以包含病毒樣粒子。
在一些實施例中，抗原可存在於獲自個體，諸如人類患者的生物樣品中。舉例而言，抗原可以包含癌細胞。在另一態樣，抗原可以包含微生物感染的細胞，諸如病毒感染的細胞。 IV. 樹突細胞
本發明之組合物及方法可進一步包含樹突細胞(DC)，樹突細胞係被認為橋接哺乳動物的先天性及適應性免疫系統的抗原呈現細胞。在較佳的實施例中，DC係子集1習知DC (cDC1，以前稱為髓樣DC1)，與漿細胞樣DC (pDC)相反。
在一些實施例中，DC係表現較高含量的CD40及IL-12p70的高度活性DC。如本文所用，術語「高度活性樹突細胞」係指DC能夠分泌IL-1β同時維持細胞存活率(例如，不經歷細胞焦亡)的細胞狀態。以此方式，經高度活化的樹突細胞能夠刺激穩健的T細胞免疫(圖1)，此顯然結合了活化及焦亡的樹突細胞的益處(Zhivaki等人, Cell Reports, 33 (7), 2020, 108381)。 V. 另外的脂質
本發明之一些組合物及方法包含至少一種另外的脂質，其中該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分。在一些實施例中，至少一種另外的脂質包含可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質或其混合物。在一些實施例中，LNP包含第一磷脂(具有單個C13-C24醯基鏈的溶血磷脂醯膽鹼[LPC:C13-C24])、可電離脂質、第二磷脂、聚乙二醇化脂質及結構脂質。適用於本發明之組合物及方法的另外的脂質的結構如下所示(複製自Hou等人, Nature Review Materials, 6:1078-1094, 2021的圖2)。
在一些實施例中，該至少一種另外的脂質包含另外的磷脂及結構脂質中之一或兩者，視情況其中該另外的磷脂包含1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)，且該結構脂質包含膽固醇。在一些實施例中，該至少一種另外的脂質包含或進一步包含聚乙二醇化脂質，視情況其中該聚乙二醇化脂質包含聚乙二醇[PEG] 2000二肉豆蔻醯甘油[DMG]。在一些實施例中，至少一種另外的脂質包含或進一步包含可電離脂質，視情況其中該可電離脂質包含4-(二甲基胺基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基酯，亦稱為4-(二甲基胺基)-丁酸, (10Z,13Z)-1-(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯-1-基-10,13-十九碳二烯-1-基酯(DLin-MC3-DMA)或其類似物或衍生物。 VI. 醫藥調配物
本發明之一些組合物係包含醫藥學上可接受之賦形劑及脂質奈米粒子(LNP)之醫藥調配物，該脂質奈米粒子包含LPC化合物及至少一種另外的脂質。在一些實施例中，該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群。在一些實施例中，醫藥調配物進一步包含PRR促效劑、樹突細胞、抗原、佐劑或其任何組合。本發明之醫藥調配物可以呈溶液或懸浮液的形式。或者，醫藥調配物可以係脫水固體(例如冷凍乾燥或噴霧乾燥的固體)。本發明之醫藥調配物較佳係無菌的，並且較佳基本上不含內毒素。術語「醫藥調配物」在本文中可與術語「醫藥產品」及「藥劑」互換使用。在一些實施例中，醫藥調配物包含基於調配物預期目的之特定比例的各種組分。在一些實施例中，醫藥調配物包含LPC化合物及非離子界面活性劑。在一些實施例中，該非離子界面活性劑包含環氧乙烷-環氧丙烷共聚物，諸如泊洛沙姆-407 (CAS登記號977057-91-2)。本發明之一些組合物係包含界面活性劑及LPC化合物、PRR促效劑、樹突細胞、抗原、佐劑或其任何組合之醫藥調配物。 A. 賦形劑
本發明的醫藥學上可接受之賦形劑包括例如溶劑、緩衝劑、張力調節劑、增積劑及防腐劑(參見例如，Pramanick等人, Pharma Times, 45:65-77, 2013)。在一些實施例中，醫藥調配物可以包含用作溶劑、緩衝劑、張力調節劑及增積劑中之一或多種的賦形劑(例如，含氯化鈉之鹽水可用作水性媒劑及張力調節劑)。本發明的醫藥學上可接受之賦形劑亦包括清潔劑、潤濕劑、乳化劑、發泡劑及分散劑，以及界面活性劑。
本文揭示之許多脂質微溶於水。界面活性劑可以用於使脂質溶解在水性調配物中。多種界面活性劑可供使用，該等界面活性劑可分為陰離子界面活性劑、非離子界面活性劑、陽離子界面活性劑及兩性離子界面活性劑。
非離子界面活性劑之一些實例包括泊洛沙姆，其係環氧乙烷及環氧丙烷的三嵌段共聚物，通式為：HO-[CH 2CH 2-O-] a-[CH 2CH(CH 3)-O-] b-[CH 2-CH 2-O-] a-H。一些泊洛沙姆以商品名Pluronic®出售(PLURONIC係BASF SE, Ludwigshafen, Germany之註冊商標)。泊洛沙姆之實例係泊洛沙姆407 (KP407；a=101，b=56)；泊洛沙姆188 (KP188；a=80，b=27)；Pluronic® P84 (P-84；a=19，b=39)；及Pluronic® P123 (P-123；a=20，b=70) (上述a及b值可能略有不同)。
其他非離子界面活性劑包括Cremophor®系列(CREMAPHOR係BASF SE, Ludwigshafen, Germany之註冊商標)。Cremophor®界面活性劑包括Cremophor® EL (KEL)，一種由蓖麻油與環氧乙烷以大約1:35的莫耳比反應生成的聚氧乙烯化甘油三酯的混合物；以及Cremophor® RH40(亦稱為Kolliphor® RH40；KOLLIPHOR係BASF SE之註冊商標)，藉由將40莫耳環氧乙烷與1莫耳氫化蓖麻油反應獲得。
在一些實施例中，醫藥調配物包含水性媒劑作為溶劑。合適的媒劑包括例如無菌水、鹽水溶液、磷酸鹽緩衝鹽水及林格氏溶液(Ringer's solution)。在一些實施例中，組合物為等張的。
醫藥調配物可以包含緩衝劑。緩衝劑控制pH值，以抑制活性劑在加工、儲存及視情況復原期間的降解。適合的緩衝劑包括例如包含乙酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽或硫酸鹽之鹽。其他適合的緩衝劑包括例如胺基酸，諸如精胺酸、甘胺酸、組胺酸及離胺酸。緩衝劑可進一步包含鹽酸或氫氧化鈉。在一些實施例中，緩衝劑將組合物的pH維持在6至9的範圍內。在一些實施例中，pH大於(下限) 6、7或8。在一些實施例中，pH小於(上限) 9、8或7。亦即，pH在約6至9的範圍內，其中下限小於上限。
醫藥組合物可以包含張力調節劑。適合的張力調節劑包括例如右旋糖、丙三醇、氯化鈉、甘油及甘露糖醇。
醫藥調配物可以包含增積劑。當醫藥組合物在投與前凍乾時，增積劑尤其適用。在一些實施例中，增積劑為有助於在冷凍或噴霧乾燥期間及/或在儲存期間穩定及防止活性劑降解的保護劑。適合的增積劑為糖(單醣、二醣及多醣)，諸如蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、葡萄糖及棉子糖。
醫藥調配物可以包含防腐劑。適合的防腐劑包括例如抗氧化劑及抗微生物劑。然而，在較佳的實施例中，醫藥調配物在無菌條件下製備並且在一次性容器中，且因此不需要包含防腐劑。
本發明之醫藥組合物及其他組合物通常不含界面活性劑(例如，泊洛沙姆)。具體而言，在一些實施例中，醫藥組合物及其他組合物不含泊洛沙姆407 (KP407)、泊洛沙姆188(KP188)及/或Pluronic P123(P123)。
本發明之醫藥調配物適合非經腸投與。亦即，本發明之醫藥調配物不旨在用於腸內投與(例如，不藉由經口、胃內或經直腸投與)。 B. 佐劑
本發明的醫藥學上可接受之佐劑包括例如鋁鹽佐劑、水包角鯊烯乳液、皂苷或其組合。在一些實施例中，佐劑係選自由非晶羥基磷酸鋁硫酸鹽、氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁鉀及其組合組成之群的鋁鹽佐劑。在其他實施例中，佐劑係水包角鯊烯乳液，諸如MF59或AS03。在其他實施例中，佐劑係皂苷，諸如Quil A或QS-21，如在AS01或AS02中。 VII. 產生方法
在一些態樣，本發明係關於用於製備經高度活化樹突細胞之方法，以及用於製備免疫原性組合物之方法。該等免疫原性組合物適用於在活體外、離體或在活體內高度活化樹突細胞。
在一個態樣，本發明提供了一種用於產生經高度活化樹突細胞(DC)之方法，該方法包含使該等樹突細胞與有效量之包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、至少一種另外的脂質及PRR促效劑的組合物接觸，用於產生經高度活化樹突細胞，其中該等經高度活化樹突細胞分泌IL-1β而不經歷細胞焦亡，並且該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分。在一些實施例中，該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群。在一些實施例中，DC係經分離的，而在其他實施例中，DC存在於自哺乳動物受試者(諸如人類患者)獲得的生物樣品中。在一些實施例中，DC係單核球衍生的DC，較佳cDC1。
在具體的實施例中，本發明提供了一種用於產生免疫原性組合物之方法，該方法包含： a)視情況自製備自腫瘤之細胞懸浮液中耗乏白血球以獲得富集腫瘤細胞之懸浮液； b)自該富集腫瘤細胞之懸浮液中溶解細胞以獲得腫瘤細胞溶胞產物；以及 c)使該腫瘤細胞溶胞產物與具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、至少一種另外的脂質及PRR促效劑接觸，以獲得該免疫原性組合物，其中該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分。在一些實施例中，該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群。在一些實施例中，藉由使富集腫瘤細胞之懸浮液與對白血球具有特異性之抗體接觸，自富集腫瘤細胞之細胞懸浮液中耗乏該等白血球。在一些實施例中，藉由使富集腫瘤細胞之懸浮液與抗CD45抗體接觸來耗乏白血球。在一些實施例中，細胞藉由基於物理破壞的細胞溶解方法溶解，諸如但不限於機械溶解、液體均質化、音波處理、凍融或手動研磨。在一些較佳的實施例中，細胞藉由一或多次凍融循環溶解。
在上述方法之一些實施例中，LPC的醯基鏈係C13-C22醯基鏈或C13-C24醯基鏈。在一些實施例中，LPC的醯基鏈係C18-C22醯基鏈或C18-C24醯基鏈。在一些較佳的實施例中，醯基鏈係完全飽和的。在一些較佳的實施例中，LPC的醯基鏈係C22醯基鏈。在一些較佳的實施例中，LPC係1-二十二烷醯基-2-羥基- sn-甘油-3-磷膽鹼[LPC(22:0)]。在一些實施例中，PRR促效劑係TLR7/8促效劑。在一些較佳的實施例中，該TLR7/8促效劑係咪唑并喹啉化合物，該咪唑并喹啉化合物在特別較佳的實施例中係雷西莫特(R848)。 VIII. 使用方法
在一些態樣，本發明係關於使用本文所描述之任何一種組合物或調配物之方法。在一些實施例中，組合物或調配物包含LPC化合物及至少一種另外的脂質，其中該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分。在一些實施例中，該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群。在一些實施例中，組合物或調配物進一步包含PRR促效劑、樹突細胞、抗原、佐劑或其任何組合。使用方法適用於涉及刺激免疫反應的複數種用途。在一些實施例中，使用方法包含治療癌症之方法。在一些實施例中，使用方法包含抑制異常細胞增殖之方法。在一些實施例中，使用方法包含治療感染性疾病之方法。該等方法包含將有效量之本文所描述之調配物或組合物投與有需要之個體以達成特定結果。該個體係哺乳動物受試者，諸如人類患者。在其他實施例中，該個體係非人類患者。在一些實施例中，該個體係犬患者。亦即，在一些實施例中，使用方法涉及臨床使用，而在其他實施例中，使用方法涉及臨床前及/或獸醫使用。對於臨床前使用，哺乳動物受試者可以係非人類靈長類動物(例如猴子或猿)或嚙齒動物(例如小鼠或大鼠)。對於獸醫使用，哺乳動物受試者可以係農場動物(例如牛)、運動動物(例如馬)或寵物(例如伴侶動物，諸如狗或貓)。 A. 免疫反應的刺激
簡而言之，本發明提供了在個體中刺激免疫反應之方法，其包含以足以在個體中刺激免疫反應的量向個體投與本文描述之組合物或調配物。「刺激」免疫反應(可與「引發」及免疫反應互換使用)意謂增加免疫反應，此可能源於引發從頭免疫反應(例如，作為初始疫苗接種方案的結果)或增強現有免疫反應(例如，作為增強免疫疫苗接種方案的結果)。在一些實施例中，刺激免疫反應包含由以下組成之群中的一或多種：刺激細胞介素產生；刺激B淋巴球增殖；刺激干擾素路徑相關基因表現；刺激化學引誘劑相關基因表現；以及刺激樹突細胞DC成熟。量測免疫反應刺激之方法係此項技術中已知的。
舉例而言，本發明提供在個體中誘導抗原特異性免疫反應之方法，該方法藉由以足以在個體中誘導抗原特異性免疫反應的量向個體投與本文描述之組合物或調配物來進行。在較佳的實施例中，組合物或調配物包含抗原。在一些實施例中，將組合物或調配物投與個體的包含抗原的組織。免疫反應可以包含抗原特異性抗體反應及抗原特異性細胞毒性T淋巴球(CTL)反應中之一或兩種。「誘導」抗原特異性抗體反應意謂將抗原特異性抗體的力價增加至高於臨限值水平，諸如投藥前基線力價或血清保護水平。「誘導」抗原特異性CTL反應意謂在周邊血液中發現的抗原特異性CTL的頻率增加至高於投藥前基線頻率。
免疫反應的分析(定性及定量)可以藉由此項技術中已知的任何方法進行，包括但不限於量測抗原特異性抗體的產生(包括量測特定抗體亞類)；特定淋巴球群的活化，諸如B細胞及輔助性T細胞；細胞介素，諸如IFN-α、IFN-γ、IL-6、IL-12的產生及/或組織胺的釋放。量測抗原特異性抗體反應之方法包括酶聯免疫吸附分析法(ELISA)。特定淋巴球群的活化可以藉由增殖分析法及螢光活化細胞分選(FACS)來量測。細胞介素的產生亦可以藉由ELISA來量測。在一些實施例中，刺激免疫反應之方法包含刺激單核球衍生之樹突細胞或周邊血液單核細胞分泌白血球介素-1β (IL-1β)、分泌干擾素-γ (IFN-γ)及/或分泌腫瘤壞死因子-α (TNF-α)。在一些較佳的實施例中，與本發明之組合物接觸的至少50%、55%、60%、65%、70%或75%的細胞在接觸後40-56小時(或約48小時)保持存活。
在一些實施例中，該等方法適用於刺激抗腫瘤免疫反應。在其他實施例中，該等方法適用於刺激抗微生物免疫反應。在一些實施例中，抗微生物反應係抗細菌免疫反應。在一些實施例中，抗微生物反應係抗真菌免疫反應。在一些實施例中，抗微生物反應係抗病毒免疫反應。在一些實施例中，抗微生物反應係抗原生動物免疫反應。 B. 治療或預防疾病
本發明進一步提供治療或預防個體疾病之方法，其包含以足以治療或預防個體疾病的量向個體投與本文描述之組合物或調配物。在一些實施例中，疾病係癌症。在一些實施例中，疾病係異常細胞增殖。在其他實施例中，疾病係感染性疾病。
在一個態樣，該等方法可以包含向有需要之受試者投與包含LPC化合物及至少一種另外的脂質之組合物，其中該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分。在另一態樣，該等方法涉及過繼細胞療法，並且包含向有需要之受試者投與包含樹突細胞(諸如經高度活化樹突細胞)、LPC化合物及另外的脂質之組合物，其中該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分。在一些實施例中，組合物進一步包含PRR促效劑、抗原、佐劑或其任何組合。
在一些實施例中，該等方法涉及治療個體的癌症或以其他方式治療患有癌症之哺乳動物受試者。在一些實施例中，該等方法包含：a)製備免疫原性組合物，該免疫原性組合物包含腫瘤細胞溶胞產物、具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、至少一種另外的脂質及類鐸受體7/8 (TLR7/8)促效劑，其中該腫瘤細胞溶胞產物係或已經由自患有癌症之受試者獲得之腫瘤樣品製備，該醯基鏈係C13-C22醯基鏈或C13-C24醯基鏈，並且該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分；及b)向該受試者投與有效量之該免疫原性組合物。在一些實施例中，該癌症係血液癌症，諸如淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。在其他實施例中，該癌症係非血液癌症，諸如肉瘤、癌或黑色素瘤。在一些實施例中，該癌症係惡性的。
在一些實施例中，該等方法涉及抑制個體的異常細胞增殖。「異常細胞增殖」係指良性腫瘤或惡性腫瘤的增殖。惡性腫瘤可以係轉移性腫瘤。
在一些實施例中，該等方法涉及治療或預防個體的感染性疾病。在一些實施例中，感染性疾病係由病毒感染引起的。在其他實施例中，感染性疾病係由細菌感染引起的。在進一步的實施例中，感染性疾病係由真菌感染引起的。在更進一步的實施例中，感染性疾病係由原蟲感染引起的。特別重要的係由感染人類以及其他動物(諸如哺乳動物或鳥類)的人畜共通病原體引起的感染性疾病。在一些實施例中，人畜共通病原體經由中間物種(載體)傳播給人類。 列舉的實施例1.一種組合物，其包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、至少一種另外的脂質及TLR7/8促效劑，其中 該醯基鏈係C13-C22醯基鏈或C13-C24醯基鏈， 該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群，且 該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分。 2.如實施例1之組合物，其中該醯基鏈係C18-C22醯基鏈或C21-C24醯基鏈。 3.如實施例1或實施例2之組合物，其進一步包含抗原。 4.如實施例1至3中任一項之組合物，其進一步包含樹突細胞。 5.一種組合物，其包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、至少一種另外的脂質及抗原，其中 該醯基鏈係C21-C24醯基鏈， 該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群，且 該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分。 6.如實施例5之組合物，其進一步包含樹突細胞。 7.如實施例5或實施例6之組合物，其進一步包含TLR7/8促效劑。 8.一種組合物，其包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、至少一種另外的脂質及樹突細胞，其中 該醯基鏈係C21-C24醯基鏈， 該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群，且 該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分。 9.如實施例8之組合物，其進一步包含TLR7/8促效劑。 10.如實施例8或實施例9之組合物，其進一步包含抗原。 11.如實施例1至10中任一項之組合物，其中該醯基鏈係C22醯基鏈。 12.如實施例1至11中任一項之組合物，其中該醯基鏈係完全飽和的。 13.如實施例1至12中任一項之組合物，其中該LPC包含1-二十二烷醯基-2-羥基- sn-甘油-3-磷膽鹼[LPC(22:0)]。 14.如實施例1至13中任一項之組合物，其中該TLR7/8促效劑係分子量為900道爾頓或更小的小分子。 15.如實施例14之組合物，其中該TLR7/8促效劑包含咪唑并喹啉化合物。 16.如實施例15之組合物，其中該TLR7/8促效劑包含雷西莫特(R848)。 17.如實施例14或實施例15之組合物，其中該TLR7/8促效劑不抑制NLR家族含比林(pyrin)域3 (NLRP3)。 18.如實施例13之組合物，其中該LPC包含LPC(22:0)，並且該TLR7/8促效劑包含雷西莫特(R848)。 19.如實施例1至18中任一項之組合物，其中該抗原存在於自個體獲得之生物樣品中。 20.如實施例19之組合物，其中該生物樣品包含活檢組織。 21.如實施例19之組合物，其中該生物樣品包含細胞。 22.如實施例19之組合物，其中該生物樣品不包含細胞。 23.如實施例19之組合物，其中該生物樣品包含來自膿腫的膿。 24.如實施例1至23中任一項之組合物，其中該抗原包含蛋白質抗原。 25.如實施例24之組合物，其中該抗原包含腫瘤抗原。 26.如實施例25之組合物，其中該腫瘤抗原包含合成或重組新抗原。 27.如實施例26之組合物，其中該腫瘤抗原包含腫瘤細胞溶胞產物。 28.如實施例24之組合物，其中該抗原包含微生物抗原並且該微生物抗原包含病毒抗原、細菌抗原、原生動物抗原及真菌抗原中之一或多種。 29.如實施例28之組合物，其中該微生物抗原包含經純化或重組表面蛋白。 30.如實施例28之組合物，其中該微生物抗原包含不活化完整病毒。 31.如實施例1至30中任一項之組合物，其中該組合物包含脂質體。 32.如實施例1至31中任一項之組合物，其中該組合物不包含脂多醣(LPS)或單磷醯基脂質A (MPLA)。 33.如實施例1至32中任一項之組合物，其中該組合物不包含經氧化1-棕櫚醯基-2-花生四烯醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(oxPAPC)或oxPAPC之物種。 34.如實施例33之組合物，其中該組合物不包含2-[[(2R)-2-[(E)-7-羧基-5-羥基庚-6-烯醯基]氧基-3-十六醯基氧基丙氧基]-羥基磷醯基]氧基乙基-三甲基銨(HOdiA-PC)、2-(三甲基銨基)乙基磷酸[(2R)-2-[(E)-7-羧基-5-側氧基庚-6-烯醯基]氧基-3-十六醯基氧基丙基]酯(KOdiA-PC)、l-棕櫚醯基-2-(5-羥基-8-側氧基-辛烯醯基)-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(HOOA-PC)、2-[[(2R)-2-[(E)-5,8-二側氧基辛-6-烯醯基]氧基-3-十六醯基氧基丙氧基]-羥基磷醯基]氧基乙基-三甲基銨(KOOA-PC)、2-(三甲基銨基)乙基磷酸[(2R)-3-十六醯基氧基-2-(5-側氧基戊醯基氧基)丙基]酯(POVPC)、2-(三甲基銨基)乙基磷酸[(2R)-2-(4-羧基丁醯基氧基)-3-十六醯基氧基丙基]酯(PGPC)、2-(三甲基銨基)乙基磷酸[(2R)-3-十六醯基氧基-2-[4-[3-[(E)-[2-[(Z)-辛-2-烯基]-5-側氧基環戊-3-烯-l-亞基]甲基]環氧乙烷-2-基]丁醯基氧基]丙基]酯(PECPC)、2-(三甲基銨基)乙基磷酸[(2R)-3-十六醯基氧基-2-[4-[3-[(E)-[3-羥基-2-[(Z)-辛-2-烯基]-5-側氧基環戊亞基]甲基]環氧乙烷-2-基]丁醯基氧基]丙基]酯(PEIPC)及/或1-棕櫚醯基-2-壬二醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(PAzePC)。 35.如實施例1至34中任一項之組合物，其進一步包含佐劑，其中該佐劑包含鋁鹽佐劑、水包角鯊烯乳液、皂苷或其組合。 36.一種醫藥調配物，其包含如實施例1至35中任一項之組合物及醫藥學上可接受之賦形劑。 37.一種用於產生經高度活化樹突細胞之方法，該方法包含使該等樹突細胞與有效量之包含具有單個C13-C22醯基鏈或C13-C24醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、至少一種另外的脂質及TLR7/8促效劑之組合物接觸，用於產生經高度活化樹突細胞，其中 該等經高度活化樹突細胞分泌IL-1β而不經歷細胞焦亡， 該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群，且 該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分。 38.如實施例37之方法，其中使該等樹突細胞與如實施例1至35中任一項之組合物或如實施例36之調配物離體接觸。 39.如實施例37之方法，其中使該等樹突細胞與如實施例36之調配物在活體內接觸。 40.一種醫藥調配物，其包含至少10 3、10 4、10 5或10 6個藉由如實施例38之方法產生的經高度活化樹突細胞及醫藥學上可接受之賦形劑。 41.一種刺激針對抗原的免疫反應之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之如實施例36之調配物以刺激針對該抗原的該免疫反應。 42.一種治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之如實施例36之調配物以治療癌症。 43.一種抑制異常細胞增殖之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之如實施例36之調配物以抑制異常細胞增殖。 44.一種治療感染性疾病之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之如實施例36之調配物以治療該感染性疾病。 45.一種如實施例36之調配物用於在有需要之個體中誘導針對抗原的免疫反應之用途。 46.一種如實施例36之調配物用於在有需要之個體中誘導抗腫瘤免疫反應之用途，其中該個體係或曾經係負載腫瘤的。 47.一種如實施例36之調配物用於在有需要之個體中誘導抗微生物免疫反應之用途，其中該個體經該微生物感染或尚未暴露於該微生物。 48.如實施例19至47中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該個體係哺乳動物受試者。 49.如實施例19至47中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該個體係人類受試者。 50.一種製備免疫原性組合物之方法，該方法包含： a)自腫瘤中獲得富集腫瘤細胞之懸浮液； b)自該富集腫瘤細胞之懸浮液中溶解細胞以獲得腫瘤細胞溶胞產物；以及 c)使該腫瘤細胞溶胞產物與包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、至少一種另外的脂質及類鐸受體7/8 (TLR7/8)促效劑之組合物接觸，以獲得該免疫原性組合物，其中 該醯基鏈係C13-C22醯基鏈或C13-C24醯基鏈， 該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群，且 該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分。 51.如實施例50之方法，其中步驟a)包含自該富集腫瘤細胞之懸浮液中耗乏白血球，視情況其中使用抗CD45抗體藉由去除性選汰耗乏該等白血球。 52.如實施例50或實施例51之方法，其中在步驟b)中藉由一或多次凍融循環溶解該等細胞。 53.如實施例50至52中任一項之方法，其中該醯基鏈係完全飽和的C18-C22醯基鏈或完全飽和的C18-C24醯基鏈。 54.如實施例53之方法，其中該LPC包含1-二十二烷醯基-2-羥基- sn-甘油-3-磷膽鹼[LPC(22:0)]。 55.如實施例50至54中任一項之方法，其中該TLR7/8促效劑係分子量為900道爾頓或更小的小分子。 56.如實施例55之方法，其中該TLR7/8促效劑包含咪唑并喹啉化合物。 57.如實施例56之方法，其中該TLR7/8促效劑包含雷西莫特(R848)。 58.如實施例55或實施例56之方法，其中該TLR7/8促效劑不抑制NLR家族含比林域3 (NLRP3)。 59.如實施例54之方法，其中該LPC包含LPC(22:0)，並且該TLR7/8促效劑包含雷西莫特(R848)。 60.如實施例50至59中任一項之方法，其進一步包含在步驟a)之前自患有癌症之哺乳動物受試者的腫瘤中獲得樣品並自該樣品製備細胞之該懸浮液。 61.一種免疫原性組合物，其藉由如實施例50至60中任一項之方法製備。 62.一種引發抗癌免疫反應之方法，該方法包含： 向患有癌症之哺乳動物受試者投與有效量之如實施例61之免疫原性組合物。 63.如實施例62之方法，其中該抗癌免疫反應包含細胞免疫反應。 64.如實施例63之方法，其中該抗癌免疫反應包含癌抗原誘導的IL-1β分泌及/或CD8+ T淋巴球的活化。 65.如實施例62至64中任一項之方法，其中該癌症係非血液癌症。 66.如實施例65之方法，其中該非血液癌症係癌、肉瘤或黑色素瘤。 67.如實施例62至64中任一項之方法，其中該癌症係淋巴瘤。 68.一種治療癌症之方法，該方法包含： a)製備免疫原性組合物，該免疫原性組合物包含腫瘤細胞溶胞產物、具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、至少一種另外的脂質及類鐸受體7/8 (TLR7/8)促效劑，其中 該腫瘤細胞溶胞產物係或已經由自患有癌症之哺乳動物受試者獲得之腫瘤樣品製備， 該醯基鏈係C13-C22醯基鏈或C13-C24醯基鏈， 該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群，且 該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分；以及 b)向該受試者投與有效量之該免疫原性組合物。 69.如實施例62至68中任一項之方法，其中該醯基鏈係完全飽和的C18-C22醯基鏈或完全飽和的C18-C24醯基鏈。 70.如實施例68之方法，其中該LPC包含1-二十二烷醯基-2-羥基- sn-甘油-3-磷膽鹼[LPC(22:0)]。 71.如實施例62至70中任一項之方法，其中該TLR7/8促效劑係分子量為900道爾頓或更小的小分子。 72.如實施例71之方法，其中該TLR7/8促效劑包含咪唑并喹啉化合物。 73.如實施例72之方法，其中該TLR7/8促效劑包含雷西莫特(R848)。 74.如實施例70之方法，其中該LPC包含22:0 LPC，並且該TLR7/8促效劑包含雷西莫特(R848)。 75.如技術方案68至74中任一項之方法，其進一步包含向該受試者投與有效量之額外的治療劑。 76.如實施例75之方法，其中該額外的治療劑包括由免疫檢查點抑制劑、抗癌劑及放射療法組成之群中之一或多種。 77.一種組合物，其包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、至少一種另外的脂質及病原體識別受體(PRR)促效劑，其中 該醯基鏈係C13-C22醯基鏈或C13-C24醯基鏈， 該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群，且 該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分。 78.如實施例77之組合物，其中該PRR促效劑係類鐸受體(TLR)、類NOD受體(NLR)、類RIG-I受體(RLR)或C型凝集素受體(CLR)的促效劑。 79.如實施例77之組合物，其中該PRR促效劑係細胞溶質DNA感測器(CDS)或IFN基因刺激因子(STING)的促效劑。 80.如實施例77之組合物，其中該PRR促效劑包含R848、TL8-506、LPS、Pam2CSK4及ODN2336中之一或多種。 81.如實施例77至80中任一項之組合物，其進一步包含抗原。 82.如實施例77至81中任一項之組合物，其進一步包含樹突細胞。 83.一種醫藥調配物，其包含如實施例77至82中任一項之組合物及醫藥學上可接受之賦形劑。 84.一種醫藥調配物，其包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、至少一種另外的脂質及醫藥學上可接受之賦形劑，其中 該醯基鏈係C21-C24醯基鏈， 該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群，且 該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分。 85.如實施例83或實施例84之醫藥調配物，其中該醯基鏈係完全飽和的C22醯基鏈。 86.如實施例85之醫藥調配物，其中該LPC包含1-二十二烷醯基-2-羥基- sn-甘油-3-磷膽鹼[LPC(22:0)]。 87.一種用於高度活化人類樹突細胞之組合物，其包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、至少一種另外的脂質及病原體識別受體(PRR)促效劑，其中 該醯基鏈係C22醯基鏈， 該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群， 該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分，並且 該組合物與包含PGPC代替該LPC的比較組合物相比有效達成更高水平的樹突細胞高度活化。 88.如實施例87之組合物，其中該更高水平的樹突細胞高度活化包含與當與包含該PGPC及該PRR促效劑的該比較組合物接觸時相比，當與包含該LPC及該PRR促效劑的該組合物接觸時，在活體外誘導該等人類樹突細胞以高至少2、3或4倍的含量分泌IL-1β，其中該PRR促效劑係LPS。 89.如實施例88之組合物，其中該LPC的濃度及該PGPC的濃度係在約10 μM至約80 μM範圍內的相同濃度，並且該LPS在該組合物及該比較化合物中均以1 μg/ml的濃度存在。 90.如實施例88之組合物，其中該較高水平的樹突細胞高度活化包含與包含該PGPC及該PRR促效劑的該比較組合物相比，對於包含該LPC及該PRR促效劑之該組合物，該等人類樹突細胞分泌IL-1β的脂質活性指數的活性單位高至少4、5或6倍。 91.如實施例19至47中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該個體係犬受試者。 92.如實施例60至90中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該哺乳動物受試者係人類患者。 93.如實施例60至90中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該哺乳動物受試者係非人類患者。 94.如實施例60至90中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該哺乳動物受試者係犬患者。 95.如實施例1至90或92中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該等樹突細胞係人類樹突細胞。 96.如實施例1至91或94中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該等樹突細胞係犬樹突細胞。 97.如實施例95或實施例96之組合物、調配物、方法或用途，其中該等樹突細胞存在於包含周邊血液單核細胞(PBMC)之組合物中。 98.如實施例37至49或實施例91中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該等經高度活化樹突細胞分泌IFNγ及TNFα中之一或兩種。 99.如實施例1至98中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該至少一種另外的脂質包含另外的磷脂及結構脂質中之一或兩者，視情況其中該另外的磷脂包含1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)，且該結構脂質包含膽固醇。 100.如實施例99之組合物、調配物、方法或用途，其中該至少一種另外的脂質包含聚乙二醇化脂質，視情況其中該聚乙二醇化脂質包含聚乙二醇[PEG] 2000二肉豆蔻醯甘油[DMG]。 101.如實施例99或實施例100之組合物、調配物、方法或用途，其中該至少一種另外的脂質包含可電離脂質，視情況其中該可電離脂質包含4-(二甲基胺基)-丁酸, (10Z,13Z)-1-(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯-1-基-10,13-十九碳二烯-1-基酯(DLin-MC3-DMA)或其類似物或衍生物。 102.一種包含脂質奈米粒子(LNP)之組合物，其中該LNP包含第一磷脂及至少一種選自由可電離脂質、第二磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群的脂質，其中該第一磷脂包含具有單醯基鏈的溶血磷脂醯膽鹼(LPC)，並且該醯基鏈係C13-C24醯基鏈。 103.一種包含脂質奈米粒子(LNP)之組合物，其中該LNP包含第一磷脂、可電離脂質、第二磷脂、聚乙二醇化脂質及結構脂質，其中該第一磷脂包含具有單醯基鏈的溶血磷脂醯膽鹼(LPC)，並且該醯基鏈係C13-C24醯基鏈。 104.如實施例1至103中任一項之組合物，其中該可電離脂質包含： i) 8-[(2-羥基乙基)[6-側氧基-6-(十一烷氧基)己基]胺基]-辛酸, 1-辛基壬基酯(SM-102)或其類似物或衍生物；及/或6-((2-己基癸醯基)氧基)-N-(6-((2-己基癸醯基)氧基)己基)-N-(4-羥基丁基)己-1-胺鎓(ALC-0315)或其類似物或衍生物；或 ii) 4-(二甲基胺基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基酯(DLin-MC3-DMA)或其類似物或衍生物。 105.如實施例1至104中任一項之組合物，其中該聚乙二醇化脂質選自由以下組成之群：PEG修飾的磷脂醯乙醇胺、PEG修飾的磷脂酸、PEG修飾的神經醯胺、PEG修飾的二烷基胺、PEG修飾的二醯基甘油、PEG修飾的二烷基甘油及其組合。 106.如實施例1至104中任一項之組合物，其中該聚乙二醇化脂質包含聚乙二醇[PEG] 2000二肉豆蔻醯甘油[DMG]。 107.如實施例1至106中任一項之組合物，其中該結構脂質選自由以下組成之群：膽固醇、糞固醇、植固醇、麥角固醇、菜油固醇、豆固醇、蕓苔固醇、番茄鹼、熊果酸、α-生育酚及其組合。 108.如實施例1至106中任一項之組合物，其中該結構脂質包含膽固醇。 109.如實施例1至108中任一項之組合物，其中該另外的磷脂或該第二磷脂包含選自由以下組成之群的親水性頭部部分：磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯甘油、磷脂醯絲胺酸、磷脂酸、2-溶血磷脂醯膽鹼及鞘磷脂。 110.如實施例1至108之組合物，其中該另外的磷脂或該第二磷脂包含一或多個選自由以下組成之群的脂肪酸尾部部分：月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞麻油酸、α-次亞麻油酸、芥子酸、花生酸、花生四烯酸、植烷酸、二十碳五烯酸、二十二酸、二十二碳五烯酸及二十二碳六烯酸。 111.如實施例1至108中任一項之組合物，該另外的磷脂或該第二磷脂係選自由以下組成之群： 1,2-二亞麻油醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DLPC)、 1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-磷膽鹼(DMPC)、 1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DOPC)、 1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DPPC)、 1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)、 1,2-雙十一烷醯基-sn-甘油-磷膽鹼(DUPC)、 1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(POPC)、 1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷膽鹼、 1-油醯基-2-膽固醇基半琥珀醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼、 1,2-二次亞麻油醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼、 1,2-二花生四烯醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼、 1,2-雙二十二碳六烯醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼、 1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、 1,2-二植醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、 1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、 1,2-二亞麻油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、 1,2-二次亞麻油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、 1,2-二花生四烯醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、 1,2-雙二十二碳六烯醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、 1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)鈉鹽(DOPG)、 鞘磷脂、及 其組合。 112.如實施例1至108中任一項之組合物，其中該另外的磷脂或該第二磷脂包含1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)。 113.如實施例1至112中任一項之組合物，其中該至少一種另外的脂質包含：i)陽離子脂質，並且包含或進一步包含ii)中性或陰離子脂質。 114.如實施例113之組合物，其中該陽離子脂質包含以下中之一或兩者： i) 1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基銨丙烷(DOTMA)或其類似物或衍生物；及 ii) 1,2-二油醯基-3-三甲基銨丙烷(DOTAP)或其類似物或衍生物。 115.如實施例113或實施例114之組合物，其中該中性或陰離子脂質包含： i) 1,2-二-(9Z-十八烯醯基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)或其類似物或衍生物；及/或 ii)膽固醇或其類似物或衍生物；及/或 iii) 1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DOPC)或其類似物或衍生物。 116.如實施例102至116中任一項之組合物，其中該LPC的該醯基鏈係C21-C24醯基鏈。 117.如實施例102至116中任一項之組合物，其中該LPC的該醯基鏈係C22醯基鏈。 118.如實施例102至117中任一項之組合物，其中該組合物進一步包含TLR7/8促效劑。 119.如實施例118之組合物，其中該TLR7/8促效劑包含咪唑并喹啉化合物。 120.如實施例119之組合物，其中該TLR7/8促效劑包含雷西莫特(R848)。 121.如實施例119之組合物，其中該LPC包含LPC(22:0)，並且該TLR7/8促效劑包含雷西莫特(R848) 122.如實施例102至121中任一項之組合物，其中該組合物進一步包含抗原。 123.如實施例122之組合物，其中該抗原係腫瘤抗原或新抗原。 124.如實施例122之組合物，其中該抗原係微生物抗原，視情況其中該微生物抗原係病毒抗原、細菌抗原、原生動物抗原或真菌抗原。 125.如實施例1至122中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該組合物不包含經分離mRNA。 126.如實施例1至125中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該LNP的有效直徑小於約500奈米，視情況約5至約500奈米，視情況約10至約400奈米，視情況約20至約300奈米，或視情況約25至約250奈米。 127.如實施例126之組合物、調配物、方法或用途，其中該LNP具有小於約250奈米的有效直徑。 128.如實施例127之組合物、調配物、方法或用途，其中該LNP具有小於約125奈米的有效直徑。 129.如實施例128之組合物、調配物、方法或用途，其中該LNP具有約10至約110奈米的有效直徑 130.如實施例1至129中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該組合物不包含界面活性劑。 進一步列舉的實施例1.一種組合物，其包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、界面活性劑及TLR7/8促效劑，其中該醯基鏈係C13-C24醯基鏈。 2.如進一步的實施例1之組合物，其中該醯基鏈係C18-C22醯基鏈或C21-C24醯基鏈。 3.如進一步的實施例1或進一步的實施例2之組合物，其進一步包含抗原。 4.如進一步的實施例1至3中任一項之組合物，其進一步包含樹突細胞。 5.一種組合物，其包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、界面活性劑及抗原，其中該醯基鏈係C21-C24醯基鏈。 6.如進一步的實施例5之組合物，其進一步包含樹突細胞。 7如進一步的實施例5或進一步的實施例6之組合物，其進一步包含TLR7/8促效劑。 8.一種組合物，其包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、界面活性劑及樹突細胞，其中該醯基鏈係C21-C24醯基鏈。 9.如進一步的實施例8之組合物，其進一步包含TLR7/8促效劑。 10.如進一步的實施例8或進一步的實施例9之組合物，其進一步包含抗原。 11.如進一步的實施例1至10中任一項之組合物，其中該醯基鏈係C22醯基鏈。 12.如進一步的實施例1至11中任一項之組合物，其中該醯基鏈係完全飽和的。 13.如進一步的實施例1至12中任一項之組合物，其中該LPC包含1-二十二烷醯基-2-羥基-sn-甘油-3-磷膽鹼[LPC(22:0)]。 14.如進一步的實施例1至13中任一項之組合物，其中該TLR7/8促效劑係分子量為900道爾頓或更小的小分子。 15.如進一步的實施例14之組合物，其中該TLR7/8促效劑包含咪唑并喹啉化合物。 16.如進一步的實施例15之組合物，其中該TLR7/8促效劑包含雷西莫特(R848)。 17.如進一步的實施例14或進一步的實施例15之組合物，其中該TLR7/8促效劑不抑制NLR家族含比林域3 (NLRP3)。 18.如進一步的實施例13之組合物，其中該LPC包含LPC(22:0)，並且該TLR7/8促效劑包含雷西莫特(R848)。 19.如進一步的實施例1至18中任一項之組合物，其中該抗原存在於自個體獲得之生物樣品中。 20.如進一步的實施例19之組合物，其中該生物樣品包含活檢組織。 21.如進一步的實施例19之組合物，其中該生物樣品包含細胞。 22.如進一步的實施例19之組合物，其中該生物樣品不包含細胞。 23.如進一步的實施例19之組合物，其中該生物樣品包含來自膿腫的膿。 24.如進一步的實施例1至23中任一項之組合物，其中該抗原包含蛋白質抗原。 25.如進一步的實施例24之組合物，其中該抗原包含腫瘤抗原。 26.如進一步的實施例25之組合物，其中該腫瘤抗原包含合成或重組新抗原。 27.如進一步的實施例26之組合物，其中該腫瘤抗原包含腫瘤細胞溶胞產物。 28.如進一步的實施例24之組合物，其中該抗原包含微生物抗原並且該微生物抗原包含病毒抗原、細菌抗原、原生動物抗原及真菌抗原中之一或多種。 29.如進一步的實施例28之組合物，其中該微生物抗原包含經純化或重組表面蛋白。 30.如進一步的實施例28之組合物，其中該微生物抗原包含不活化完整病毒。 31.如進一步的實施例1至30中任一項之組合物，其中該組合物不包含脂質體。 32.如進一步的實施例1至31中任一項之組合物，其中該組合物不包含LPS或MPLA。 33.如進一步的實施例1至32中任一項之組合物，其中該組合物不包含oxPAPC或oxPAPC之物種。 34.如進一步的實施例33之組合物，其中該組合物不包含HOdiA-PC、KOdiA-PC、HOOA-PC、KOOA-PC及/或PGPC。 35.如進一步的實施例1至34中任一項之組合物，其進一步包含佐劑，其中該佐劑包含鋁鹽佐劑、水包角鯊烯乳液、皂苷或其組合。 36.一種醫藥調配物，其包含如進一步的實施例1至35中任一項之組合物及醫藥學上可接受之賦形劑。 37.一種用於產生經高度活化樹突細胞之方法，該方法包含使該等樹突細胞與包含界面活性劑及有效量之具有單個C13-C24醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)及TLR7/8促效劑之組合物接觸，用於產生經高度活化樹突細胞，其中該等經高度活化樹突細胞分泌IL-1β而不經歷細胞焦亡。 38.如進一步的實施例37之方法，其中使該等樹突細胞與如進一步的實施例1至35中任一項之組合物或如進一步的實施例36之調配物離體接觸。 39.如進一步的實施例37之方法，其中使該等樹突細胞與如進一步的實施例36之調配物在活體內接觸。 40.一種醫藥調配物，其包含至少10 3、10 4、10 5或10 6個藉由如進一步的實施例38之方法產生的經高度活化樹突細胞及醫藥學上可接受之賦形劑。 41.一種刺激針對抗原的免疫反應之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之如進一步的實施例36之調配物以刺激針對該抗原的該免疫反應。 42.一種治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之如進一步的實施例36之調配物以治療癌症。 43.一種抑制異常細胞增殖之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之如進一步的實施例36之調配物以抑制異常細胞增殖。 44.一種治療感染性疾病之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之如進一步的實施例36之調配物以治療該感染性疾病。 45.一種如進一步的實施例36之調配物用於在有需要之個體中誘導針對抗原的免疫反應之用途。 46.一種如進一步的實施例36之調配物用於在有需要之個體中誘導抗腫瘤免疫反應之用途，其中該個體係或曾經係負載腫瘤的。 47.一種如進一步的實施例36之調配物用於在有需要之個體中誘導抗微生物免疫反應之用途，其中該個體經該微生物感染或尚未暴露於該微生物。 48.如進一步的實施例19至47中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該個體係哺乳動物受試者。 49.如進一步的實施例19至47中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該個體係人類受試者。 50.一種製備免疫原性組合物之方法，該方法包含： a)視情況自製備自腫瘤之細胞懸浮液中耗乏白血球以獲得富集腫瘤細胞之懸浮液； b)自該富集腫瘤細胞之懸浮液中溶解細胞以獲得腫瘤細胞溶胞產物；以及 c)使該腫瘤細胞溶胞產物與包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、界面活性劑及類鐸受體7/8 (TLR7/8)促效劑之組合物接觸以獲得該免疫原性組合物，其中該醯基鏈係C13-C24醯基鏈。 51.如進一步的實施例50之方法，其中在步驟a)中使用抗CD45抗體藉由去除性選汰來耗乏該等白血球。 52.如進一步的實施例50或進一步的實施例51之方法，其中在步驟b)中藉由一或多次凍融循環溶解該等細胞。 53.如進一步的實施例50至52中任一項之方法，其中該醯基鏈係完全飽和的C18-C22醯基鏈或完全飽和的C18-C24醯基鏈。 54.如進一步的實施例53之方法，其中該LPC包含1-二十二烷醯基-2-羥基-sn-甘油-3-磷膽鹼[LPC(22:0)]。 55.如進一步的實施例50至54中任一項之方法，其中該TLR7/8促效劑係分子量為900道爾頓或更小的小分子。 56.如進一步的實施例55之方法，其中該TLR7/8促效劑包含咪唑并喹啉化合物。 57.如進一步的實施例56之方法，其中該TLR7/8促效劑包含雷西莫特(R848)。 58.如進一步的實施例55或進一步的實施例56之方法，其中該TLR7/8促效劑不抑制NLR家族含比林域3 (NLRP3)。 59.如進一步的實施例54之方法，其中該LPC包含LPC(22:0)，並且該TLR7/8促效劑包含雷西莫特(R848)。 60.如進一步的實施例50至59中任一項之方法，其進一步包含在步驟a)之前自患有癌症之哺乳動物受試者的腫瘤中獲得樣品並自該樣品製備細胞之該懸浮液。 61.一種免疫原性組合物，其藉由如進一步的實施例50至60中任一項之方法製備。 62.一種引發抗癌免疫反應之方法，該方法包含： 向患有癌症之哺乳動物受試者投與有效量之如進一步的實施例61之免疫原性組合物。 63.如進一步的實施例62之方法，其中該抗癌免疫反應包含細胞免疫反應。 64.如進一步的實施例63之方法，其中該抗癌免疫反應包含癌抗原誘導的IL-1β分泌及/或CD8+ T淋巴球的活化。 65.如進一步的實施例62至64中任一項之方法，其中該癌症係非血液癌症。 66.如進一步的實施例65之方法，其中該非血液癌症係癌、肉瘤或黑色素瘤。 67.如進一步的實施例62至64中任一項之方法，其中該癌症係淋巴瘤。 68.一種治療癌症之方法，該方法包含： a)製備免疫原性組合物，該免疫原性組合物包含腫瘤細胞溶胞產物、具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、界面活性劑及類鐸受體7/8 (TLR7/8)促效劑，其中該腫瘤細胞溶胞產物係或已經由自患有癌症之哺乳動物受試者獲得之腫瘤樣品製備，並且該醯基鏈係C13-C24醯基鏈；以及 b)向該受試者投與有效量之該免疫原性組合物。 69.如進一步的實施例62至68中任一項之方法，其中該醯基鏈係完全飽和的C18-C22醯基鏈或完全飽和的C18-C24醯基鏈。 70.如進一步的實施例68之方法，其中該LPC包含1-二十二烷醯基-2-羥基-sn-甘油-3-磷膽鹼[LPC(22:0)]。 71.如進一步的實施例62至70中任一項之方法，其中該TLR7/8促效劑係分子量為900道爾頓或更小的小分子。 72.如進一步的實施例71之方法，其中該TLR7/8促效劑包含咪唑并喹啉化合物。 73.如進一步的實施例72之方法，其中該TLR7/8促效劑包含雷西莫特(R848)。 74.如進一步的實施例70之方法，其中該LPC包含22:0 LPC，並且該TLR7/8促效劑包含雷西莫特(R848)。 75.如技術方案68至74中任一項之方法，其進一步包含向該受試者投與有效量之額外的治療劑。 76.如進一步的實施例75之方法，其中該額外的治療劑包括由免疫檢查點抑制劑、抗癌劑及放射療法組成之群中之一或多種。 77.一種組合物，其包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、界面活性劑及病原體識別受體(PRR)促效劑，其中該醯基鏈係C13-C24醯基鏈。 78.如進一步的實施例77之組合物，其中該PRR促效劑係類鐸受體(TLR)、類NOD受體(NLR)、類RIG-I受體(RLR)或C型凝集素受體(CLR)的促效劑。 79.如進一步的實施例77之組合物，其中該PRR促效劑係細胞溶質DNA感測器(CDS)或IFN基因刺激因子(STING)的促效劑。 80.如進一步的實施例77之組合物，其中該PRR促效劑包含R848、TL8-506、LPS、Pam2CSK4及ODN2336中之一或多種。 81.如進一步的實施例77至80中任一項之組合物，其進一步包含抗原。 82.如進一步的實施例77至81中任一項之組合物，其進一步包含樹突細胞。 83.一種醫藥調配物，其包含如進一步的實施例77至82中任一項之組合物及醫藥學上可接受之賦形劑。 84.一種醫藥調配物，其包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、界面活性劑及醫藥學上可接受之賦形劑，其中該醯基鏈係C21-C24醯基鏈。 85.如進一步的實施例83或進一步的實施例84之醫藥調配物，其中該醯基鏈係完全飽和的C22醯基鏈。 86.如進一步的實施例85之醫藥調配物，其中該LPC包含1-二十二烷醯基-2-羥基-sn-甘油-3-磷膽鹼[LPC(22:0)]。 87.一種用於高度活化人類樹突細胞之組合物，其包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、界面活性劑及病原體識別受體(PRR)促效劑，其中該醯基鏈係C22醯基鏈，並且其中該組合物與包含PGPC代替該LPC的比較組合物相比有效達成更高水平的樹突細胞高度活化。 88.如進一步的實施例87之組合物，其中該更高水平的樹突細胞高度活化包含與當與包含該PGPC及該PRR促效劑的該比較組合物接觸時相比，當與包含該LPC及該PRR促效劑的該組合物接觸時，在活體外誘導該等人類樹突細胞以高至少2、3或4倍的含量分泌IL-1β，其中該PRR促效劑係LPS。 89.如進一步的實施例88之組合物，其中該LPC的濃度及該PGPC的濃度係在約10 μM至約80 μM範圍內的相同濃度，並且該LPS在該組合物及該比較化合物中均以1 μg/ml的濃度存在。 90.如進一步的實施例88之組合物，其中該較高水平的樹突細胞高度活化包含與包含該PGPC及該PRR促效劑的該比較組合物相比，對於包含該LPC及該PRR促效劑之該組合物，該等人類樹突細胞分泌IL-1β的脂質活性指數的活性單位高至少4、5或6倍。 91.如進一步的實施例19至47中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該個體係犬受試者。 92.如進一步的實施例60至90中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該哺乳動物受試者係人類患者。 93.如進一步的實施例60至90中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該哺乳動物受試者係非人類患者。 94.如進一步的實施例60至90中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該哺乳動物受試者係犬患者。 95.如進一步的實施例1至90或92中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該等樹突細胞係人類樹突細胞。 96.如進一步的實施例1至91或94中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該等樹突細胞係犬樹突細胞。 97.如進一步的實施例95或進一步的實施例96之組合物、方法或用途，其中該等樹突細胞存在於包含周邊血液單核細胞(PBMC)之組合物中。 98.如進一步的實施例37至49或進一步的實施例91中任一項之組合物、方法或用途，其中該等經高度活化樹突細胞分泌IFN-γ及TNF-α中之一或兩種。 99.如進一步的實施例1至98中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其包含界面活性劑。其中該界面活性劑包含非離子界面活性劑。 100.如進一步的實施例99之組合物、調配物、方法或用途，其中該非離子界面活性劑包含環氧乙烷-環氧丙烷共聚物。 101.如進一步的實施例99之組合物、調配物、方法或用途，其中該非離子界面活性劑包含泊洛沙姆407、泊洛沙姆188及P123中之一或多種。 102.如進一步的實施例99之組合物、調配物、方法或用途，其中該非離子界面活性劑包含泊洛沙姆407。 103.如進一步的實施例99至102中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中i)將該LPC溶解在醇中，以形成LPC醇溶液；ii)將該LPC醇溶液與該非離子界面活性劑混合，以形成混合物；iii)自該混合物中蒸發該醇，以形成包含該LPC及該非離子界面活性劑的粒子。 104.如進一步的實施例99至103中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該非離子界面活性劑以約2.5%至25% (w/w)、視情況約5%至20% (w/w)、視情況約15% (w/w)的量存在。 105.如進一步的實施例99至104中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該LPC及該非離子界面活性劑以直徑小於約2.0 μm、小於約1.5 μm、小於約1.0 μm、小於約0.5 μm或小於約0.1 μm的粒子存在，視情況其中該等粒子包含微胞。 實例
縮寫：CDS (細胞溶質DNA感測器)；CLR (C型凝集素受體)；DAMP (損傷相關分子模式)；DC (樹突細胞)；dLN (引流淋巴結)；DLS (動態光散射)；DMG-PEG-2000 (聚乙二醇[PEG] 2000二肉豆蔻醯甘油[DMG]；DSPC (1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼)；ELSD (蒸發光散射偵測器)；FLT3L (Fms相關酪胺酸激酶3配位體)；HOdiA-PC (1-棕櫚醯基-2-(5-羥基-8-側氧基-6-辛烯二醯基)-sn-甘油-3-磷脂醯膽鹼)；HOOA-PC (1-棕櫚醯基-2-(5-羥基-8-側氧基辛-6-烯醯基)-sn-甘油-3-磷膽鹼)；IFNγ (干擾素-γ)；IL-1b/IL1-β/IL-1β (白血球介素-1β)；KOdiA-PC (1-(棕櫚醯基)-2-(5-酮基-6-辛烯-二醯基)磷脂醯膽鹼)；KOOA-PC (1-棕櫚醯基-(5-酮基-8-側氧基-6-辛烯醯基)-sn-甘油-3-磷膽鹼)；LNP (脂質奈米粒子)；LPC/Lyso PC (溶血磷脂醯膽鹼)；Lyso PC(22:0) (1-二十二烷醯基-2-羥基-sn-甘油-3-磷膽鹼)；LPS (脂多醣)；MC3 (4-(二甲基胺基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基酯，亦稱為DLin-MC3-DMA)；moDC (單核球衍生之樹突細胞)；MPLA (單磷醯基脂質A)；NLR (類NOD受體)；oxPAPC (經氧化1-棕櫚醯基-2-花生四烯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)；PAMP (病原體相關分子模式)；PBMC (周邊血液單核細胞)；PGPC (1-棕櫚醯基-2-戊二醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼)；POVPC (1-棕櫚醯基-2-(5'-側氧基-戊醯基)-sn-甘油-3-磷膽鹼)；PRR (病原體識別受體)；RLR (類RIG-I受體)；R848 (雷西莫特)；SC (皮下)；STING (IFN基因刺激因子)；TNFα (腫瘤壞死因子-α)；及TLR (類鐸受體)。
儘管出於清晰及理解的目的藉由說明及實例的方式對本發明進行了一些詳細描述，但是對於熟習此項技術者來說顯而易見的是，可以實施某些改變及修改。因此，以下實例不應被解釋為限制本發明的範疇，本發明的範疇由所附申請專利範圍限定。 實例 1 ：具有單醯基鏈的溶血磷脂醯膽鹼 (LPC) 及 TLR7/8 促效劑的組合高度活化哺乳動物周邊血液單核細胞
此實例描述了用脂質DAMP與小分子PAMP組合高度活化犬及人類周邊血液單核細胞(PBMC)。 材料及方法
自全血中分離PBMC。使用Ficoll-Paque PLUS (Cytivia)進行密度梯度離心自全血中分離PBMC。用PBS 1:1稀釋全血，在Ficoll-Paque PLUS上分層，並在室溫下以1000×g離心30分鐘。收集PBMC，在PBS中洗滌兩次，並與Ack溶解緩衝液(Lonza)一起培育以去除任何剩餘的紅血球。
細胞培養及刺激. 分離後立即將PBMC接種在含有10% FBS、50單位/mL青黴素、50 mg/mL鏈黴素、2 mM L-麩醯胺酸、1 mM丙酮酸鈉及50 mM β-巰基乙醇的RPMI培養基(R10培養基)中。將細胞以每孔1×10 5(犬細胞)或1×10 6(人類細胞)接種至96孔平底組織培養板中。根據製造商的建議對凍乾的Vaccigrade R848 (Invivogen)進行復原及稀釋，並將其以1 µg/mL的最終濃度添加至細胞中。緊接著，將22:0 LYSO PC添加至細胞中，最終濃度為82.5 µM。根據製造商的建議，在R10培養基中稀釋額外的先天性促效劑，並按如下方式添加至細胞中：人類GM-CSF (Peprotech)以10 ng/mL的最終濃度添加；2'3' cGAMP (Invivogen)以15 µg/mL的最終濃度添加；LPS，血清型O55:B5 (Enzo Life Sciences)以1 µg/mL的最終濃度添加；氫氧化鋁(Invivogen)以30 µg/mL的最終濃度添加。細胞在37℃、5% CO 2下培育兩天。接著將細胞培養物用於終點分析。
終點分析. 將PBMC與PAMP及DAMP一起培養兩天後，收集上清液及細胞樣品用於分析。藉由以400×g離心5分鐘沈澱培養物中的細胞。收集孔中一半的培養基體積用於藉由酶聯免疫吸附分析法(ELISA)或Lumit TM生物冷光分析法進行細胞介素定量，而剩餘的培養基及細胞用於藉由評估代謝活性來定量細胞存活率。
細胞介素分泌的定量. 使用以下套組之一評估人類PBMC的IL-1β分泌：ELISA MAX Deluxe Set人類IL-1β套組(Biolegend)、Invitrogen人類IL-1β套組或Lumit TM人類IL-1β免疫分析法(Promega)。使用ELISA MAX Deluxe Set人類IFNγ (Biolegend)評估人類PBMC的IFNγ分泌，且使用人類TNFα未塗佈ELISA套組(Invitrogen)評估人類PBMC的TNFα分泌。ELISA係根據製造商的說明進行的，並進行了以下修改：i)用於培育的總樣品+緩衝液體積自100 µL減少至50 µL；ii)最高標準品以500 pg/mL製備，兩倍稀釋至7.8 pg/mL；以及iii)在4℃下在定軌振盪器上隔夜完成樣品培育。Lumit TM分析係根據製造商的說明進行的。犬PBMC的IL-1β分泌使用犬IL-1β/IL-1F2 DuoSet ELISA (R&D)根據製造商的說明進行評估，並進行以下修改：i)用於培育的總樣品+緩衝液體積自100 µL減少至50 µL；ii)在定軌振盪器上在4℃下隔夜完成樣品培育。對於所有ELISA，使用Spectramax M5e盤讀取器(Molecular Devices)在450 nm處量測吸光度，且進行570 nm校正。對於Lumit TM分析法，使用Spectramax M5e盤讀取器(Molecular Devices)在所有波長上量測發光，積分時間為500 ms。為了確定上清液中的細胞介素濃度，經由GraphPad Prism 9 (GraphPad Software)上的4PL分析使用標準曲線對樣品濃度進行插值。接著針對對上清液進行的任何稀釋調整樣品的內插結果。
細胞存活率的定量. 使用CellTiter-Glo發光細胞存活率分析法(Promega)，藉由定量ATP的存在作為代謝活性細胞的指標來評估細胞存活率。按照製造商的說明評估代謝活性。CellTiter-Glo試劑與細胞集結粒及新鮮培養基混合，接著轉移至白色不透明的96孔盤中。使用500 ms的積分時間在Spectramax M5e盤讀取器(Molecular Devices)上在所有波長上量測發光。相對於用R848處理的PBMC的對照條件計算存活率百分比。
統計分析. 對於各種情況，將來自各供體的細胞一式三份接種以進行測試。對於細胞介素定量，一式三份的值用於插值，且數據繪製為總濃度(pg/mL)或每個供體相對於單獨R848對照條件的變化倍數。對於存活率定量，對各供體一式三份求平均，並將平均值用作一個供體量測值。對多個供體進行了測試，且柱狀圖上的各數據點代表供體的值。為了對測試條件的差異進行測試，將測試結果與單獨R848的對照條件進行比較。使用混合效應單因子變異數分析計算P值，並使用Dunnett檢定對多重比較進行校正。 結果 - 用 22:0 LYSO PC 及 R848 處理可高度活化犬 PBMC
之前發現22:0 LYSO PC (DAMP)及TLR7/8促效劑R848 (PAMP)的組合在人類moDC中具有強力的高度刺激活性。為了評估此種高度刺激活性是否轉化為其他臨床相關物種，評估了22:0 LYSO PC+R848高度活化自犬全血中分離之PBMC的能力。對於各數據集，由於缺乏可以用於誘導真正的犬moDC的犬特異性試劑，因此使用來自多個供體的PBMC代替moDC。簡而言之，使用密度梯度離心法自全血中分離出PBMC，接著與感興趣的高度活化刺激物一起培養兩天。
培養兩天後，藉由定量細胞培養上清液中的IL-1β及量測細胞存活率來評估高度活化。當用22:0 LYSO PC及R848一起處理時，犬PBMC分泌的IL-1β含量與所有其他測試的刺激物相比相當或更高，每毫升濃度以及每個供體相對於單獨R848的變化倍數均如此( 圖 1A- 圖 1B)。與先前的研究一致，表明占PBMC的5-10%的單核球可以對R848的活化起反應而釋放IL-1β，與未經處理的細胞相比，使用單獨R848的犬PBMC分泌的IL-1β含量升高。正如預期般，LPS+明礬的焦亡組合引發了高含量的IL-1β。值得注意的是，雖然與單獨R848相比，PGPC+R848引發了相似含量的IL-1β，但與未經處理的細胞相比，GM-CSF及2'3'cGAMP均未誘導犬PBMC顯著分泌IL-1β。
雖然在細胞培養上清液中犬PBMC高度活化後一天可以偵測到IL-1β，但在高度活化後兩天評估細胞存活率，以確保IL-1β分泌後的持久存活率。22:0 LYSO+R848沒有顯著降低相對細胞存活率( 圖 1C)。有趣的是，PGPC與R848組合證明對犬PBMC有一定毒性，但未觀察到其對人類moDC或人類PBMC有毒。然而，解釋自測試混合細胞群中獲得的觀察結果係具有挑戰性的，因為無法自混合物獲得的結果中確定感興趣的特定細胞群(在此情形中為單核球)的存活率。此等數據共同表明，22:0 LYSO+R848可引發犬PBMC分泌較高含量的IL-1β，此表明高度活化。 結果 - 用 22:0 LYSO PC 及 R848 處理可高度活化人類 PBMC
亦用自人類供體獲得的全血中分離的PBMC進行了高度活化實驗。簡而言之，藉由密度梯度離心法自多個人類供體的全血中分離出PBMC，並與感興趣的高度活化刺激物一起培養兩天。
人類PBMC，如人類moDC及犬PBMC，分泌的IL-1β的含量與所有其他測試的刺激物相比相當或更高( 圖 2A- 圖 2B)。與犬PBMC類似，由於單核球的活化，人類PBMC對單獨R848起反應而分泌IL-1β，並且此分泌藉由添加22:0 LYSO PC而提高。正如預期般，LPS+明礬的焦亡組合引發了較高含量的IL-1β。與犬PBMC中的觀察結果一致，PGPC+R848並未誘導與單獨R848相比顯著更高含量的IL-1β。GM-CSF誘導的人類PBMC分泌的IL-1β含量並沒有顯著高於未經處理細胞產生的背景含量。
人類PBMC的存活率亦在高度活化後兩天進行評估，以確保人類PBMC在IL-1β分泌後具有持久的存活率。在用任何刺激物處理後沒有觀察到人類PBMC存活率的顯著降低( 圖 2C)。然而，解釋自測試混合細胞群中獲得的觀察結果係具有挑戰性的，因為無法自混合物獲得的結果中確定感興趣的特定細胞群(在此情形中為單核球)的存活率。此等數據共同表明，人類及犬PBMC均被22:0 LYSO PC+R848高度活化。有趣的是，與PGPC+R848相比，22:0 LYSO PC+R848對犬PBMC的高度活化程度更高。
因為活化的人類PBMC可以分泌除IL-1β之外的其他細胞介素，所以在高度活化後兩天量測細胞培養上清液中促炎細胞介素IFNγ及TNFα的分泌。與所有其他測試的刺激物相比，22:0 LYSO PC+R848的組合誘導了每個供體在IFNγ分泌及TNFα分泌方面相對於單獨的R848的最高變化倍數( 圖 3A- 圖 3B)。值得注意的是，儘管LPS+明礬誘導人類PBMC分泌較高含量的IL-1β ( 圖 3B)，但此種刺激物的組合並未誘導IFNγ或TNFα分泌的倍數增加。此外，與單獨R848相比，GM-CSF及2'3'cGAMP均未引起IFNγ分泌的顯著倍數變化。此等數據表明，22:0 LYSO PC+R848的組合在誘導人類PBMC分泌促炎細胞介素IFNγ及TNFα方面係優異的。 實例 2 ：製備包含溶血磷脂醯膽鹼 (LPC) 的脂質奈米粒子
此實例描述了在微流體製程中製備負載有高度活化之脂質(例如22:0 LYSO PC)的脂質奈米粒子(LNP)。 材料及方法
使用NanoAssemblr® Ignite™微流體儀器(Precision Nanosystems, Vancouver, BC, Canada)合成LNP。最初，使用含有GenVoy-ILM™可電離脂質混合物(Precision Nanosystems, Vancouver, BC, Canada)的套組來生產LNP。不含mRNA的套組用於構建空的LNP媒劑，並藉由以相對於總LNP含量10%的莫耳比添加22:0 Lyso PC來生成負載高度活化劑的LNP。亦使用個別的組分(沒有套組)生產LNP，以確定是否可以有意改變負載至LNP中的22:0 Lyso PC。藉由將以下組分與或不與1-二十二烷醯基-2-羥基-sn-甘油-3-磷膽鹼組合來製備LNP (CAS登記號125146-65-8，本文稱為「22:0 Lyso PC」) (Avanti)： (10Z,13Z)-1-(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯-1-基-10,13-十九碳二烯-1-基酯 (CAS登記號1224606-06-7，本文稱為「DLin-MC3-DMA」或「MC3」) (Cayman Chemical)； 1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼 (CAS登記號816-94-4，本文稱為「DSPC」) (Avanti)； 膽固醇(Sigman)；及 1,2-二肉豆蔻醯基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000 (CAS登記號160743-62-4，本文稱為「DMG-PEG2000」) (Avanti)。 首先將脂質溶解在乙醇中，接著按照 表 2-1中所示的莫耳濃度百分比進行組合。含脂質之乙醇與PBS (pH 7.4)以1:3的體積比混合。NanoAssemblr® Ignite™微流體儀器經程式化成流速為12 mL/min，起始廢液為0.35 mL，以及最終廢液為0.05 mL。LNP在PBS (pH 7.4)中洗滌以去除殘留的乙醇，接著使用Amicon 10K MWCO離心過濾器藉由以2000×g旋轉30分鐘進行濃縮。 表 2-1. LNP 調配物 ^
脂質 GenVoy 媒劑 LNP LPC GenVoy LNP LNP 媒劑 1 LPC LNP 1 LNP 媒劑 2 LPC LNP 2 LPC LNP 3
GenVoy-ILM 100.0% 90.0% -- -- -- -- --
MC3 -- -- 45.0% 41.0% -- -- --
DSPC -- -- 15.0% 10.0% 50.0% 25.0% 10.0%
膽固醇 -- -- 38.5% 37.5% 48.5% 48.5% 48.5%
DMG-PEG2000 -- -- 1.5% 1.5% 1.5% 1.5% 1.5%
22:0 Lyso PC -- 10.0% -- 10.0% -- 25.0% 40.0%
^不同LNP調配物之組分的莫耳濃度百分比。LNP 2及LNP 3調配物具有相同的媒劑(LNP媒劑2)。
使用HPLC評估進入LNP中的22:0 Lyso PC負載量。含LNP之PBS在-80℃下冷凍，接著凍乾並儲存在-20℃下直至其可以被定量。LNP在乙醇中復原，接著與水混合以溶解PBS。在乙醇中製作22:0 Lyso PC的七點標準曲線，加入水及PBS以匹配樣品製備。在HPLC上運作之前，標準品及樣品經由0.45 µm過濾器過濾。使用配備1260 Infinity II蒸發光散射偵測器(ELSD)的Agilent 1260 Infinity II HPLC進行HPLC定量。使用管柱溫度為30℃的Luna 5 µm NH2 100Å, 150X4.6mm LC管柱(Phenomenex, Torrance, CA)偵測樣品。使用了兩種溶離液：A，100%水；及B，100%乙腈。使用由5%/95% A/B構成的初始移動相裝載管柱，2.5分鐘後梯度達到24%/76% A/B。自2.5分鐘至6分鐘使用更淺的梯度，在該時段期間A/B緩慢達到25%/75%。在下一次樣品運作之前，使用3分鐘的等候時間(post time)將梯度恢復至起始條件。流速設置為1 mL/min，且樣品及標準品的注入體積為5 µL。ELSD使用的蒸發器溫度為80℃，霧化器溫度為30℃，以及氮氣流速為0.9標準公升/分鐘。Agilent CDS 2.6軟體用於HPLC儀器控制、數據採集及處理。
在NanoBrook Omni粒徑及ζ電位分析儀(Brookhaven Instruments Corp., Holtsville, NY)上使用動態光散射(DLS)評估LNP的大小。對各樣品進行四次量測，各次量測120秒，其中對各樣品進行的第一次量測自下游分析中排除，因為樣品平衡需要時間。尺寸圖上的數據點代表兩種LNP製備物的單個重複量測值。 結果
探索將22:0 Lyso PC摻入LNPs以測試22:0 Lyso PC對LNP的物理特徵及生物活性的影響。負載含量及負載的LNP數目被考量為影響遞送至細胞的22:0 Lyso PC有效負載的關鍵變量。
GenVoy-ILM™可電離脂質混合物(Precision Nanosystems, Vancouver, BC, Canada)用於生產LNP，其中添加10% 22:0 Lyso PC (基於莫耳比)或不添加22:0 Lyso PC (空媒劑LNP)。藉由將以下組分與或不與22:0 Lyso PC組合來產生另外的LNP：MC3、DPSC、膽固醇及DMG-PEG2000。所有LNP均係使用NanoAssemblr® Ignite™微流體儀器(Precision Nanosystems, Vancouver, BC, Canada)生產的。隨後使用旋轉過濾純化LNP，以去除乙醇及未摻入的材料。
使用動態光散射(DLS)確定LNP調配物的大小以確定其平均有效直徑。製備各種調配物之兩個LNP批次，且每批進行了三次尺寸量測。LNP的直徑在50至200 nm範圍內，具體取決於調配物及22:0 Lyso PC的添加( 圖 4)。在任何測試的調配物中，添加22:0 Lyso PC似乎都不會顯著影響LNP的有效直徑。
測試的四種LNP調配物以不同的22:0 LPC莫耳比輸入開始。為了確定調節輸入比率是否影響LNP中22:0 Lyso PC的負載含量，使用HPLC評估了LNP中存在的22:0 Lyso PC的數量。將LNP製備物凍乾，接著溶解在乙醇及水的混合物中進行定量。將樣品與使用相同溶解條件製備的22:0 Lyso PC的標準曲線進行比較。22:0 Lyso PC在其以起始輸入包括在內的製備物中被成功偵測到，而在其相應的空媒劑對照中未偵測到( 圖 5A- 圖 5C)。假設22:0 Lyso PC摻入LNP的效率為100%，則計算脂質摻入的理論值。經由HPLC量測的22:0 Lyso PC的實際量在理論值的75%以內( 圖 5D)。隨著22:0 Lyso PC輸入的增加，負載至LNP中的量測的22:0 Lyso PC亦增加。此表明可以根據特定應用所需的22:0 Lyso PC的量調整LNP中的22:0 Lyso PC負載量。 實例 3 ：用 TLR7/8 促效劑與包含溶血磷脂醯膽鹼 (LPC) 的脂質奈米粒子組合高度活化人類樹突細胞
此實例描述了用TLR7/8促效劑與負載有高度活化之脂質(例如，22:0 LYSO PC)的LNP組合高度活化人類單核球衍生的樹突細胞(moDC)。 材料及方法
根據製造商的說明，使用StraightFrom Leukopak CD14微珠套組由購自Miltenyi Inc. (San Jose, CA)的Leukopaks中分離人類單核球。接著將單核球等分並冷凍在含有10%二甲亞碸的胎牛血清中。對於單核球衍生的樹突細胞(moDC)培養物的研究，將單核球解凍並在含有10% FBS、50單位/mL青黴素、50 mg/mL鏈黴素、2 mM L-麩醯胺酸、1 mM丙酮酸鈉、50 mM β-巰基乙醇、10 mM HEPES及Gibco MEM非必需胺基酸之RPMI培養基(R10培養基)培養。為了將單核球分化為moDC，將重組人類GM-CSF (50 ng/mL)及IL-4 (25 ng/mL)添加至R10培養基中。用GM-CSF及IL-4培養細胞6天，並在第3天用含有GM-CSF及IL-4的R10培養基進行額外細胞餵養。
分化後六天，收集並計數moDC。將細胞以1×10 5個細胞/孔接種至96孔平底盤中。使用或不使用1 µg/mL R848(最終)以及使用或不使用高度活化之脂質(或媒劑對照)處理細胞。使用兩種分析法量測LNP誘導的高度活性。CellTiter-Glo分析法(Promega)偵測ATP作為細胞存活率的量度。IL-1β Lumit分析法(Promega)量測存在於moDC細胞培養上清液中的IL-1β細胞介素。一式三份地測試實驗條件，並且繪製來自一位供體的平均結果。數據代表在兩次實驗中測試的六個人類供體樣品的結果。 結果
高度活性moDC在產生IL-1β的同時保持細胞存活率，IL-1β係長壽命記憶T細胞生成及重新活化的重要細胞介素。測試了如實例2中所述製備的LNP高度活化人類moDC的能力。相比之下，22:0 Lyso PC亦僅簡單地重新懸浮在PBS介質中，此使其成為一種大的、不溶的、薄片狀的材料。當使用ATP定量分析法量測細胞存活率時，大多數實驗條件對細胞存活率的影響可以忽略不計( 圖 6A)。最顯著的例外係moDC使用由GenVoy-ILM製成的LNP進行處理的情況，其平均存活率低於75% (相對於僅R848的處理)。GenVoy-ILM LNP誘導IL-1β產生，無論調配物中是否包括22:0 Lyso PC( 圖 6B)。鑒於細胞存活率降低，推測GenVoy-ILM LNP已導致細胞死亡，因此IL-1β釋放可能並非moDC高度活化之結果。
當細胞被投配直接重新懸浮於PBS的22:0 Lyso PC時，會產生IL-1β，但會降低細胞存活率( 圖 6A)。此外，PBS中22:0 Lyso PC的較大的薄片狀形式導致moDC的劑量不一致，因此使用源自供體的moDC時的複製係可變的。相比之下，LNP調配物具有更一致的IL-1β反應。22:0 Lyso PC LNP誘導IL-1β分泌高於其相應空LNP媒劑對照的背景量測值( 圖 6B)。有趣的是，儘管在不同的調配物中投配了82.5 µM的22:0 Lyso PC，但在用較少的LNP處理的細胞中產生了遞增量的IL-1β，每個LNP負載了更多的22:0 Lyso PC。含有10% 22:0 Lyso PC (GenVoy及LNP1)的調配物與其媒劑對照相比沒有增加免疫原性。相比之下，含有25%或40% 22:0 Lyso PC的調配物與其媒劑對照相比確實誘導了更高含量的IL-1β分泌，其中含有40% 22:0 Lyso PC的LNP誘導了最高含量的IL-1β分泌。此等數據表明，每個LNP的22:0 Lyso PC的給定有效負載係促成moDC高度活化之重要因素。分佈在更多LNP上的等量22:0 Lyso PC在高度活化方面效率較低。
總之，數據表明22:0 Lyso PC可以摻入LNP。此種新的調配方法經考慮係具有臨床意義，因為其允許微調摻入粒子中的22:0 Lyso PC的量，此會對高度活化之效率產生重大影響。儘管高度活化，PBS中的22:0 Lyso PC無法提供相同水平的可調性。此外，在PBS中製備22:0 Lyso PC的另一個問題係會形成非常大的可見粒子，此等粒子在溶液中分佈不均勻。分佈不均勻的大粒子經考慮對精確劑量提出挑戰。此外，非常大的粒子可能會限制22:0 Lyso PC在體內的生物分佈，因為肉眼可見的粒子比細胞大得多。大粒子在活體內遞送時可能會被免疫系統隔離，此可能會限制22:0 Lyso PC到達樹突細胞以高度活化之能力。 實例 4 ：用 TLR7/8 促效劑與包含溶血磷脂醯膽鹼 (LPC) 的脂質奈米粒子組合高度活化鼠類樹突細胞
此實例描述了用TLR7/8促效劑與負載有高度活化之脂質(例如，22:0 Lyso PC)的脂質奈米粒子(LNPs)組合高度活化小鼠骨髓來源的樹突細胞(BMDC)。 材料及方法
LNP 合成 .藉由將以下組分與或不與1-二十二烷醯基-2-羥基-sn-甘油-3-磷膽鹼組合來製備LNP (CAS登記號125146-65-8，本文稱為「22:0 Lyso PC」) (Avanti)： 1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼 (CAS登記號816-94-4，本文稱為「DSPC」) (Avanti)； 膽固醇(Sigman)；及 1,2-二肉豆蔻醯基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000 (CAS登記號160743-62-4，本文稱為「DMG-PEG2000」) (Avanti)。 LNP在沒有22:0 Lyso PC的情況下製備，或負載20%或40%莫耳比的22:0 Lyso PC以確定是否可以有意改變22:0 Lyso PC負載量。使用NanoAssemblr Ignite儀器(Precision Nanosystems)合成脂質奈米粒子(LNP)。脂質首先溶解在乙醇中，接著按照 表 4-1所示的莫耳濃度百分比使總脂質濃度達到12.5 mM。含脂質之乙醇與檸檬酸鈉緩衝液(pH 4)以1:3的體積比以12 mL/min的流速混合。LNP在10體積的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) (pH 7.4)中洗滌以去除殘留的乙醇，接著使用Amicon 10K MWCO離心過濾器濃縮。
LNP 表徵 .使用HPLC評估進入LNP中的22:0 Lyso PC負載量。含LNP之PBS在-20℃下冷凍直至定量。藉由將1份乙醇添加至含LNP之PBS來溶解LNP。22:0 Lyso PC的七點標準曲線係在經添加以匹配樣品製備的1:1乙醇:PBS中製備。在HPLC上運作之前，標準品及樣品經由0.45 µm過濾器過濾。使用配備1260 Infinity II蒸發光散射偵測器的Agilent 1260 Infinity II HPLC進行HPLC定量。使用管柱溫度為30℃的Luna 5 µm NH2 100Å, 150X4.6mm LC管柱(Phenomenex)偵測樣品。使用了兩種溶離液：A，100%水；及B，100%乙腈。使用由5%/95% A/B構成的初始移動相裝載管柱，2.5分鐘後梯度達到24%/76% A/B。自2.5分鐘至6分鐘使用更淺的梯度，在該時段期間A/B緩慢達到25%/75%。在下一次樣品運作之前，使用3分鐘的等候時間將梯度恢復至起始條件。流速設置為1 mL/min，且樣品及標準品的注入體積為2.5 µL。蒸發光散射偵測器(ELSD)使用的蒸發器溫度為50℃，霧化器溫度為30℃，以及氮氣流速為0.9標準公升/分鐘。Agilent CDS 2.6軟體用於HPLC儀器控制、數據採集及處理。
在NanoBrook Omni (Brookhaven)組織上使用動態光散射(DLS)評估LNP的大小。在DLS上運作之前，LNP在PBS中按1:10稀釋。各樣品記錄三個90秒的量測值。使用配備了旋轉速度設置為1500 rpm的Hydro SV小體積分散單元的Mastersizer 3000 (Malvern)評估PBS中的22:0 Lyso PC的大小。各樣品記錄五個5秒的讀數。
鼠類骨髓來源的 FLT3L-DC 生成 .自小鼠中取出腿股骨及脛骨，用剪刀剪開，並沖洗至無菌管中。骨髓懸浮液用ACK溶解緩衝液處理1分鐘，接著通過40 µm細胞過濾器。對細胞進行計數並將其重新懸浮於由含有10% FBS、青黴素及鏈黴素以及L-麩醯胺酸及丙酮酸鈉補充劑的完全IMDM組成的培養基(I10)中。接著將細胞以每孔8×10 6個骨髓細胞接種在P12盤中。將重組小鼠FLT3L (Miltenyi)以200 ng/mL添加至培養物中。經分化細胞用於第8天的後續分析法。使用BD Symphony A3藉由流式細胞分析技術監測分化效率，CD11c +MHC-II +細胞通常高於活細胞的80%。對於各實驗，使用5至15隻小鼠來生成骨髓來源的樹突細胞(BMDC)。
鼠類骨髓來源的 FLT3L-DC 高度活化 .在分化後第8天收穫BMDC，用PBS洗滌並以2×10 5個細胞/mL的濃度重新接種在含有FLT3L的完全IMDM培養基(I10)中。在存在或不存在1 µg/mL R848的情況下培養細胞，接著使用或不使用含22:0 Lyso PC的PBS或82 µM的22:0 Lyso PC LNP進行處理。刺激後四十八小時，收集上清液用於細胞介素量測。使用CellTiter-Glo分析法(Promega)量測存活率，該分析法量測細胞的ATP含量。將五十微升CellTiter-Glo試劑添加至50 µL細胞中。使用500 ms的積分時間在SpectraMax M5e盤讀取器上對發光進行定量。相對於用R848處理細胞的對照條件設置存活率數據。使用夾心ELISA(Invitrogen)量測IL-1β及IL-6細胞介素分泌。
細胞存活率的定量 .使用CellTiter-Glo發光細胞存活率分析法(Promega)，藉由定量ATP的存在作為代謝活性細胞的指標來評估細胞存活率。按照製造商的說明評估代謝活性。CellTiter-Glo試劑與細胞集結粒及剩餘的上清液混合，並轉移至白色不透明的96孔盤中。使用500 ms的積分時間在Spectramax M5e盤讀取器(Molecular Devices)上在所有波長上量測發光。相對於R848處理的DC計算存活率百分比。
IL-1β 及 IL-6 分泌的定量 .使用ELISA小鼠IL-1β及IL-6套組(Invitrogen)評估IL-1β及IL-6分泌。ELISA係根據製造商的說明進行的。使用Spectramax M5e盤讀取器(Molecular Devices)在450 nm處量測吸光度，校正570 nm。為了測定上清液中的IL-1β及IL-6濃度，樣品IL-1β或IL-6濃度經由GraphPad Prism 9 (GraphPad Software)上的4PL分析使用標準曲線進行內插。接著針對對上清液進行的任何稀釋調整樣品的內插結果。
用於遷移分析的 FLT3L-DC 的高度活化 .在分化後第8天收穫小鼠骨髓來源的樹突細胞(BMDC)，用PBS洗滌並以10×10 6個細胞/mL的濃度重新接種在含有FLT3L的I10中。對於高度活化，以1 µg/mL的最終濃度添加500 µl R848，並以82 µM的最終濃度添加500 µL脂質(在PBS中製備的22:0 Lyso PC或22:0 Lyso PC LNP)。細胞在試管旋轉器上在37℃下培育24小時。刺激後二十四小時，用PBS洗滌細胞並用CFSE (1:1000)在37℃下避光染色30分鐘。接著對DC進行計數，並以每隻小鼠100 µL皮下(SC)注射1×10 6個細胞。注射後24小時，自注射側切下皮膚引流淋巴結(dLN)。製備單細胞懸浮液，且細胞在PBS中用Live/Dead Fixable染料(ThermoFisher)在4℃下染色20分鐘。接著再次洗滌細胞並在MACS緩衝液(含1% FCS及2 mM EDTA的PBS)中在4℃下染色20分鐘，該緩衝液含有以下螢光偶聯抗體：抗CD11c及抗I-A/I-E (MHC-II)。為了測定活細胞中CD11c +MHC-II +的絕對數目，按照製造商的方案使用了countBright計數珠(ThermoFisher)。在BD FACS Symphony (Becton-Dickenson)上獲取數據。使用FlowJo軟體(Tree Star)分析數據。各實驗組使用四隻小鼠。 結果
22:0 Lyso PC 可以負載至 LNP 中 .22:0 Lyso PC被有效地整合到包含DSPC、膽固醇及DMG-PEG2000的LNP中。使用上述LNP合成製程，合成期間添加的22:0 Lyso PC的87.4%自LNP中回收並藉由HPLC偵測，如 表 4-1所示。 表 4-1. LNP 組分的莫耳濃度百分比
脂質 空 LNP 22:0 Lyso PC LNP 封裝效率 (%)
DSPC 50.0% 10.0%   
膽固醇 48.5% 48.5%   
DMG-PEG2000 1.5% 1.5%   
22:0 Lyso PC 0.0% 40.0% 87.4 ± 0.1
LNP 製備物中的 22:0 Lyso PC 更均勻 .在PBS中製備22:0 Lyso PC的一個問題係22:0 Lyso PC不溶，且因此會導致大粒子在溶液中分佈不均勻。粒子的直徑約為130 µm( 圖 7A)，具有較大的多分散指數，表明粒徑範圍較廣。此粒徑太大而無法被細胞(例如吞噬細胞)吸收，因為其大約係細胞大小的10倍。因此，此等大粒子可能無法在活體內到達樹突細胞(或其他所關注的細胞)。相反，當22:0 Lyso PC摻入LNP時，LNP的大小約為50 nm，最大的粒子(未過濾)的直徑小於1 µm( 圖 7B)。此外，此等粒子的多分散指數(PDI)更小，表明懸浮液更均勻。在此尺寸下，LNP可以很容易地被細胞吸收。因此，預計22:0 Lyso PC在活體內具有更高的生物可用度。LNP懸浮液中22:0 Lyso PC分佈的均勻性有望轉化為更可重複及更準確的劑量水平。
22:0 Lyso PC LNP 在活體外誘導鼠類 DC 分泌 IL-1β.FLT3L-DC用單獨培養基、空LNP或於PBS中或負載至LNP中的82 µM 22:0 Lyso PC進行刺激。或者，用1 µg/ml的R848與空LNP、22:0 Lyso PC LNP或含22:0 Lyso PC之PBS組合處理FLT3L-DC。刺激後48小時，收集細胞上清液用於ELISA，並藉由cell Titer Glow分析法量測細胞存活率，該分析法量測細胞釋放的ATP含量。當用R848與高度活化之脂質調配物(含22:0 Lyso PC之PBS或LNP)組合或與空LNP組合處理細胞時，與單獨的R848相比，FLT3L DC係存活的，以藉由細胞存活率百分比所顯示( 圖 8A)。此外，R848與空LNP或22:0 Lyso PC組合刺激誘導了高含量的促炎細胞介素IL-6，無論22:0 Lyso PC係調配在PBS還是LNP中( 圖 8B)。此外，雖然R848及含22:0 Lyso PC之PBS不誘導活細胞分泌IL-1β，但用R848與含22:0 Lyso PC之LNP組合處理DC確實誘導活細胞分泌IL-1β( 圖 8C)，表明含22:0 Lyso PC之LNP誘導DC高度活化，並且優於含22:0 Lyso之PBS。
22:0 Lyso PC LNP 在活體內誘導 DC 高度遷移 .高度活化之另一個標誌係高度活化脂質誘導DC自皮膚高度遷移至引流淋巴結(dLN)的能力。為了評估含22:0 Lyso PC之LNP是否可以誘導DC遷移，將FLT3L-DC在試管旋轉器上與空LNP、含22:0 Lyso PC之LNP、或R848與空LNP、含22:0 Lyso PC之LNP或含22:0 Lyso PC之PBS組合培育隔夜。第二天，洗滌細胞並用CFSE染色。每隻小鼠的右背部皮下注射1×10 6個細胞。注射後24小時，收穫dLN並製備單細胞懸浮液。來自未注射的小鼠的dLN用作陰性對照。細胞用Live/Dead染色來識別活細胞、CD11c及MHC-II。藉由流式細胞分析技術量測CFSE +、CD11c +MHC-II +DC的百分比。正如預期般，用R848與空LNP組合或單獨的22:0 Lyso PC LNP處理的DC沒有誘導任何DC自皮膚遷移至dLN ( 圖 8D)。類似地，用R848與空LNP組合或R848與含22:0 Lyso PC之PBS組合處理的DC不會誘導DC遷移至dLN。有趣的是，用R848與含22:0 Lyso PC之LNP組合處理的DC增強了DC向dLN的遷移( 圖 8D)。
此等數據表明，與水性緩衝液(諸如PBS)中的22:0 Lyso PC相比，含有22:0 Lyso PC的LNP係一種更優異的高度活化之脂質調配物。與不含22:0 Lyso PC的LNP及在PBS中調配的22:0 Lyso PC相比，用在LNP中遞送的22:0 Lyso PC處理的DC顯示出IL-1β分泌增加及向引流淋巴結遷移的增加。因此，在LNP中遞送22:0 Lyso PC經考慮在活體內與抗原一起遞送時，同與含22:0 Lyso PC之PBS一起(或與不含22:0 Lyso PC的LNP一起)遞送的抗原相比，產生更強力的新生T細胞(且特別是記憶T細胞)。 實例 5 ：將 22:0 LYSO PC 調配成微胞
此實例描述了22:0 Lyso PC的含界面活性劑調配物的製備及測試。 材料及方法
用泊洛沙姆調配22:0 Lyso PC。以下界面活性劑以1%、2%或5.5%的濃度溶解在水中：泊洛沙姆407 (KP407)、泊洛沙姆188(KP188)、Cremophor EL (KEL)、Cremophor RH40 (KRH)、Pluronic P84 (P-84)及Pluronic P123 (P-123)。將22:0 Lyso PC重新懸浮於界面活性劑溶液中並在4℃下攪拌一小時。接著將溶液置於室溫以形成微胞。使用10×濃縮的PBS，將鹽添加至溶液中以穩定分子相互作用並提供生理相關的容積滲透濃度。脂質溶液不過濾，或經由0.45 µm的孔徑過濾，以去除不溶性脂質薄片。脂質進一步稀釋並與1 µg/mL R848一起添加至人類moDC細胞培養物中。目標脂質濃度係基於脂質在過濾前完全生物可用的情況。然而，不溶性脂質的過濾減少了脂質的生物可用度供應。因此，IL-1β作為高度活性的量度可以用作22:0 Lyso PC摻入微胞並因此摻入溶液的指標。高度活化一天後，收集細胞培養物上清液以量測細胞介素分泌，並使用細胞經由Cell Titer-Glo量測存活率。
溶劑蒸發方法利用甲醇或乙醇在與KP407混合之前完全溶解22:0 Lyso PC。將溶解的脂質溶液與5.5% KP407在室溫攪拌下混合90分鐘，以蒸發醇溶劑並誘導泊洛沙姆及脂質形成粒子。將鹽添加至溶液中以穩定分子相互作用並使溶液達到生理相關的容積滲透濃度。接著，溶液不過濾，或經由0.45 µm的孔徑過濾，以去除不溶性脂質薄片或粒子聚集體。接著用1 µg/mL R848將脂質添加至人類moDC培養物中。高度活化一天後，收集細胞培養物上清液以量測細胞介素分泌，並使用細胞量測細胞存活率。
粒徑藉由動態光散射(DLS)進行定量。對使用在KP407中再懸浮或溶劑蒸發粒子合成製成的微胞進行0.45 µm過濾後，評估溶液中粒子的粒徑。 結果 -22:0 LYSO PC 摻入微胞中
22:0 Lyso PC係一種脂質，幾乎不溶於水溶液。吾人最初將22:0 Lyso PC添加至細胞培養物中之方法係簡單地將脂質重新懸浮於培養基中。然而，脂質材料在溶液中清晰可見，呈薄片狀。為了投與一致的劑量，將脂質溶解係理想的。此在動物研究中係最重要的，且亦作為供人類使用的開發療法。鑒於高度活化分子係一種脂質，吾人假設22:0 Lyso PC可以摻入微胞中。
為了測試吾人的假設，吾人篩選了一組有助於22:0 Lyso PC微胞化的界面活性劑。將凍乾的脂質與含有1%或2%界面活性劑的水溶液混合。在混合過程中將溶液冷藏，以使界面活性劑單體化並與脂質相互作用。接著將溶液溫熱至室溫以允許微胞化。使用10×濃縮的PBS，將鹽添加至溶液中以幫助穩定分子相互作用並使溶液達到生理相關的容積滲透濃度。接著，22:0 Lyso PC微胞不過濾，或經由0.45 µm過濾器以去除不溶性脂質。接著將此等脂質儲備液進一步稀釋並添加至人類moDC培養物中以高度活化細胞。一些界面活性劑，諸如K EL、K RH及P-84會導致細胞存活率損失，使用起來並不理想( 圖 9)。相比之下，KP407、KP188及P-123並未損害細胞存活率。接著吾人定量了IL-1β在細胞存活率得以維持的此等不同的刺激條件下的分泌。當脂質不過濾時，觀察到高IL-1β分泌，類似於吾人的將22:0 Lyso PC重新懸浮在PBS中並添加至細胞中的標準方法( 圖 10)。脂質的過濾顯著降低了moDC分泌的IL-1β，表明不溶性脂質亦有助於高度活化( 圖 10)。當22:0 Lyso PC與KP407或P-123一起調配並過濾時，與經過濾的含22:0 Lyso PC之PBS相比，IL-1β分泌得到改善。此等數據表明，溶解為微胞的22:0 Lyso PC保持了其誘導DC高度活化之能力，並且改善的溶解度增加了DC高度活化。此項初步研究表明，藉由使用泊洛沙姆及普朗尼克將脂質摻入微胞中，可以實現22:0 Lyso PC的一致溶液。
選擇KP407作為泊洛沙姆進行進一步研究及最佳化。由於22:0 Lyso PC大部分不溶於水溶液，吾人假設完全溶解的脂質更容易與KP407締合。22:0 Lyso PC可溶於乙醇或甲醇，而此等醇均可與水混溶。為了使22:0 Lyso PC摻入粒子中最佳化，首先將脂質溶解在甲醇或乙醇中。溶解的脂質溶液在攪拌下與5.5% KP407混合，並在室溫下以150 rpm攪拌90分鐘以蒸發醇溶劑並誘導泊洛沙姆及脂質形成粒子。加入水使KP407濃度在蒸發後恢復至5.5%。使用10×濃縮的PBS，添加鹽以穩定粒子形成並達到生理相關的容積滲透濃度，使PBS中KP407的最終濃度達到5%。經由0.45 µm的孔徑過濾後，脂質溶液被稀釋並用於在82.5 µm的理論目標濃度下高度活化細胞。未摻入KP407微胞中的22:0 Lyso PC誘導了最少量的IL-1β，因為大部分材料被過濾掉了( 圖 11A)。然而，混合KP407增加了IL-1β分泌( 圖 11A)。藉由使用甲醇或乙醇首先溶解脂質，IL-1β分泌進一步增加，表明使用此種溶劑蒸發策略，更多的脂質被摻入粒子中。大多數細胞在各種條件下都保持活力，但溶劑蒸發方法確實將細胞存活率降低了大約25% ( 圖 11B)。有趣的是，使用媒劑溶劑蒸發法處理的樣品的存活率並沒有經歷太多的存活率下降，此表明增加22:0 Lyso PC的生物可用度可能允許使用較低劑量的22:0 Lyso PC。
為了表徵粒徑，採用了動態光散射。對含22:0 Lyso PC之PBS及含22:0 Lyso PC之5% KP407進行的讀取導致品質較差的大小數據，由於粒徑不一致，樣品讀數具有很大的變異性。相比之下，使用溶劑蒸發產生的粒子直徑始終約為1500 nm( 圖 12)，而缺乏22:0 Lyso PC的微胞製備物則缺乏此種大小的粒子。因此，22:0 Lyso PC及KP407之間的相互作用允許形成直徑約1500 nm的穩定粒子。此等粒子並非固體，且考慮到粒子的量測尺寸，其可能會變形，從而使其可通過較小的過濾器孔隙。 實例 6 ：鼠類樹突細胞在活體外及活體內的高度活化
本實例描述了在活體外鼠類細胞及活體內鼠類腫瘤模型中測試含有KP407的22:0 Lyso PC及/或R848調配物。 材料及方法
鼠類FLT3L分化的骨髓衍生之DC (BMDC)生成. 自小鼠中取出腿股骨及脛骨，用剪刀剪開並沖洗至無菌管中。骨髓懸浮液用ACK處理1分鐘，接著通過40 µm細胞過濾器。對細胞進行計數並將其重新懸浮於由含有10% FBS、青黴素及鏈黴素以及L-麩醯胺酸及丙酮酸鈉補充劑的完全IMDM組成的培養基(I10)中。接著將細胞以每孔5×10 6個骨髓細胞接種在P12盤中。將重組小鼠FLT3L (Miltenyi)以200 ng/mL添加至培養物中。經分化細胞用於第9天的後續分析法。使用BD Symphony A3藉由流式細胞分析技術監測分化效率，且CD11c+MHC-II+細胞通常高於活細胞的80%。對於各實驗，使用五隻小鼠來收集BM並生成DC。
鼠類FLT3L分化的BMDC (FLT3L-BMDC)高度活化. BMDC用PBS洗滌，並以1.5×10 5個細胞/孔的濃度重新接種在含有FLT3L的I10中。將刺激物以指定濃度添加至培養物中，最終體積為200 µL/孔。刺激後二十四小時，離心後收集細胞培養上清液，且儲存在-20℃下，以量測細胞介素分泌。IL-1b、IL-6、IL-12p40及TNF-α ELISA使用eBioscience Ready-SET-Go! (現為ThermoFisher) ELISA套組根據製造商的方案進行。使用Promega的Cell Titer-Glo套組量測細胞存活率。
流式細胞分析技術。FcR阻斷後，將經處理的FLT3L-BMDC洗滌並在PBS中用Live Dead Fixable染料(ThermoFisher)在4℃下染色20分鐘。接著再次洗滌細胞並在MACS緩衝液(具有1% FCS及2 mM EDTA的PBS)中在4℃下染色20分鐘，該緩衝液含有購自BioLegend的下列螢光偶聯抗體：抗CD11c、抗I-A/I-E、抗H-2Kb，抗SIRPa、抗CD24、抗CD40、抗CD45R、抗CXCL16及抗CCR7。在BD FACS Symphony (Becton-Dickenson)上獲取數據。使用FlowJo軟體(Tree Star)分析數據。實驗條件一式三份測試，且條件在兩次或三次獨立實驗中測試。
皮膚dLN中的DC浸潤. 為了評估DC在皮膚引流淋巴結(dLN)中的浸潤，給小鼠皮下注射R848與以10%或15%或20%重新懸浮於KP407中的22:0 Lyso PC組合。注射後24小時，解剖皮膚引流淋巴結(dLN)。製備單細胞懸浮液，且細胞在PBS中用Live Dead Fixable染料(ThermoFisher)在4℃下染色20分鐘。接著再次洗滌細胞並在MACS緩衝液(具有1% FCS及2 mM EDTA的PBS)中在4℃下染色20分鐘，該緩衝液含有以下螢光偶聯抗體：抗CD11c及抗I-A/I-E (MHC-II)。為了測定活細胞中CD11c+ MHC-II高的絕對數目，按照製造商的方案使用了countBright計數珠(ThermoFisher)。在BD FACS Symphony (Becton-Dickenson)上獲取數據。使用FlowJo軟體(Tree Star)分析數據。每個實驗組使用五隻小鼠。
抗原攝取及呈現分析法。為了檢查BMDC的抗原攝取及內吞能力，使用了pHrodo™紅色葡聚醣10,000 MW (ThermoFisher)。簡而言之，將先前單獨用培養基培養或單獨用R848或與22:0 Lyso PC組合處理24小時的FLT3L衍生的BMDC與pHrodo™紅色葡聚醣(40 µg/ml)在37℃下，或在4℃下(作為抗原表面結合的對照)培育45分鐘。接著清洗BMDC並用Live/Dead Fixable Violet染料(ThermoFisher)染色，以區分活細胞及死細胞。接著用BD固定溶液固定細胞並重新懸浮於MACS緩衝液中。藉由流式細胞分析技術量測活細胞的紅色(APC)螢光。在37℃下培育的BMDC的螢光值報導為pHrodo™紅色葡聚醣相關細胞的平均螢光強度(MFI)，其相對於在4℃下培育的pHrodo™紅色葡聚醣相關細胞的MFI標準化。為了量測OVA肽在MHC-I上呈現的效率，FLT3L-BMDC如上所述進行處理，並與Endofit-OVA蛋白(0.5 mg/ml)在37℃下培育1小時。接著用MACS緩衝液洗滌細胞，並在4℃下用APC偶聯的抗小鼠H-2Kb抗體(BioLegend)及與結合至OVA肽「SIINFEKL」(BioLegend)的H-2Kb結合的PE偶聯抗體染色20至30分鐘。未經OVA處理的DC作為陰性對照，且同型對照用作染色對照。藉由流式細胞分析技術計算與MHC-I上的OVA肽相關的細胞百分比。在Symphony A3流式細胞儀(Becton-Dickenson)上獲取數據並使用FlowJo軟體(Becton-Dickenson)進行分析。一式三份地測試實驗條件。
離體全腫瘤溶胞產物製備. 自未免疫的負載腫瘤小鼠的腫瘤外植體製備同基因全腫瘤溶胞產物(WTL)。簡而言之，使用溫和的MACS解離器(Miltenyi Biotec)機械分解來自負載大小為10-12 mm之腫瘤的未免疫小鼠的腫瘤，並按照製造商的方案使用腫瘤解離套組(Miltenyi Biotec)進行酶消化。消化後，腫瘤細胞懸浮液用PBS洗滌，並通過70 µm及30 µm過濾器。使用抗CD45 TIL微珠(Miltenyi Biotec)耗乏單細胞懸浮液中的CD45+細胞。接著對腫瘤細胞進行計數並以1×10 7個細胞/ml重新懸浮，接著藉由3-4個凍融循環溶解。藉由使材料反覆通過18G、接著係21G、最後係25G針頭，進一步破壞溶解的細胞。溶胞產物再次通過70 µm及30 µm細胞過濾器過濾，以等分試樣於儲存在-80℃下直至使用。WTL以相當於每隻小鼠5.75×10 5個腫瘤細胞的濃度用於免疫療法。
免疫治療性免疫及腫瘤攻擊. 對於免疫治療方法背景下的免疫接種，C57BL/6J的左側腹注射了5×10 4個B16F10細胞。當腫瘤可觸及時，小鼠不經免疫，或經單獨WTL免疫，經WTL與R848組合免疫，經WTL與R848及在PBS或KP407中製備的22:0 LPC組合免疫。小鼠每隔7天接受兩次增強免疫注射。
定量及統計分析. 在活體內研究中，n係指來自一次或兩次獨立實驗的每個條件下的動物數目。藉由使用未配對的雙尾學生t檢定(Student's t test)或單因子變異數分析與Tukey後檢定來計算統計差異。使用配對t檢定分析相依樣品。具有超過兩組的實驗的統計顯著性用二因子變異數分析與Tukey多重比較檢定校正進行了檢定。所有實驗均使用Prism 7 (GraphPad Software)進行分析。圖形數據顯示為平均值，誤差條表示SD或SEM。P值＜0.05(*)、＜0.01(**)或＜0.001(***)；%0.0001(****)表示組間存在顯著差異。 結果
小鼠係一種重要的實驗模型，特別係用於測試癌症療法。為了評估22:0 Lyso PC在鼠類負載腫瘤模型中的治療效果，吾人首先試圖確定22:0 LPC是否高度活化鼠類樹突細胞。使用鼠類FLT3L重組蛋白自小鼠骨髓中分化樹突細胞。為了高度活化鼠類DC，使用兩種方法製備了22:0 Lyso PC。將22:0 Lyso PC重新懸浮在PBS中以添加至細胞上，或者將脂質重新懸浮在5% Kolliphor P407 (KP407)中。當與R848 (1 µg/mL)組合使用時，不同濃度的22:0 Lyso PC重新懸浮於PBS中，無法誘導IL-1β分泌。相比之下，在KP407中調配的22:0 Lyso PC以劑量依賴性方式誘導IL-1β分泌，表明小鼠細胞可以被22:0 Lyso PC高度活化( 圖 13A)。正如預期般，未經處理的DC或使用單獨R848或不帶R848的22:0 Lyso PC處理的DC未能誘導IL-1β分泌。在測試的脂質濃度中，在KP407中調配的41 μM 22:0 Lyso PC在支持IL-1β分泌同時保持細胞存活率方面表現優異( 圖 13B)。此等數據表明，將22:0 Lyso PC摻入微胞中可使脂質對鼠類樹突細胞具有生物可用度。高度活性DC獲得釋放IL-1β的能力，同時保持存活率，但其亦應該與使用單獨PAMP處理的活性DC具有相似的特性。為了測試用R848及22:0 Lyso PC處理的高度活性DC是否保留了其經典DC功能(促炎細胞介素分泌、抗原攝取、抗原呈現、共刺激分子表現及趨化介素受體)，DC如上所述用培養基或單獨R848處理，或DC用R848與41 µM 22:0 Lyso PC組合處理24小時。正如預期般，與用單獨培養基處理的初生DC相比，R848刺激誘導了較高水平的促炎細胞介素分泌，諸如TNF-α分泌或IL-6。類似地，用R848與重新懸浮於PBS或KP407中的22:0 LPC組合處理的高度活性DC誘導了較高TNF-α及IL-6分泌，在用R848及含22:0 Lyso PCKP407刺激DC之後TNF-α分泌略有增加( 圖 14A- 圖 14B)。值得注意的是，在存在或不存在22:0 LPC的情況下，藉由R848刺激誘導Th1反應的關鍵驅動因子IL-12p40細胞介素( 圖 14C)。總體而言，此等數據強調22:0 Lyso PC不會干擾DC中NF-kB介導的反應。因此，高度活性DC與使用單獨PAMP R848處理的活性DC具有相似的特性，但將IL-1β添加至其細胞介素分泌儲庫中。
FLT3L-DC分為兩個主要子集：cDC1及cDC2。在此等子集中，cDC1具有獨特的抗原交叉呈現能力，可以致敏(prime)初生CD8+ T細胞，亦可以致敏CD4+T細胞。相反，cDC2活化Th2及Th17免疫。為了確定22:0 Lyso PC在cDC1及cDC2子集中的行為，吾人藉由流式細胞分析技術分析了來自FLT3L分化的DC的cDC1及cDC2。為了鑑別cDC1及cDC2，FLT3L DC用CD11c、SIRPa、CD24、MHC-II及CD45R染色。cDC1定義為CD11c+MHC-II+CD45R-CD24+SIRPa-，而cDC2定義為CD11c+MHC-II+CD45R-CD24低SIRPa+。吾人分析了諸如CD40之共刺激分子的表現，此對於DC與T細胞的相互作用至關重要。正如預期般，刺激後24小時，與初生cDC1及cDC2細胞相比，R848誘導了CD40表現的上調。有趣的是，吾人發現在用R848與重新懸浮於5% KP407中的41 μM 22:0 LPC組合處理的高度活性cDC1及cDC2中，CD40表現得到強烈增強( 圖 15)。
DC遷移係活化適應性免疫反應的關鍵步驟。CCR7係DC遷移至淋巴結所需的趨化介素受體。當在KP407調配物中使用22:0 Lyso PC使細胞高度活化時，與單獨的R848相比，cDC1細胞顯著增加了其CCR7表現( 圖 16A)。對於CXCL16觀察到類似的趨勢，CXCL16係T細胞的化學引誘劑，在腫瘤微環境中抗腫瘤T細胞與DC的相互作用中起著關鍵作用( 圖 16B)。此外，與單獨的R848刺激相比，高度活化增強了cDC1及cDC2子集上的MHC I類表現( 圖 17)。
DC上的MHC I類(MHC-I)表現對於抗原交叉呈現至CD8+ T細胞很重要。因此，吾人分析了DC在MHC-I上攝取及交叉呈現抗原的能力，此係刺激抗原特異性T細胞所必需的DC功能。為了首先測試DC內吞能力，FLT3L-DC如上所述被刺激24小時，接著與紅色pHrodo葡聚醣一起培育。當葡聚醣被內吞時，可以藉由流式細胞分析技術偵測到紅色螢光。未接受葡聚醣的DC作為陰性對照。吾人發現，當DC在存在或不存在22:0 Lyso PC的情況下用R848處理時，DC攝取抗原的方式相似，表明22:0 Lyso PC不會損害DC的抗原攝取能力( 圖 18A)。為測試抗原處理及抗原交叉呈現，將DC如上所述刺激24小時，接著在4℃或37℃下用卵白蛋白全蛋白處理45分鐘。接著，吾人藉由使用對與「SIINFEKL」結合的H-2Kb具有特異性的抗體量測了MHC-I分子上卵白蛋白肽的表現。吾人發現用R848處理的DC大大增強了其處理及交叉呈現OVA抗原的能力。值得注意的是，22:0 Lyso PC不干擾此等功能，因為高度活性DC仍然能夠處理抗原並在MHC-I分子上交叉呈現OVA肽( 圖 18B)。總體而言，此等數據表明高度活性DC能夠有效誘導適應性T細胞免疫反應。
吾人設想22:0 Lyso PC與R848組合可以利用內源性DC產生抗腫瘤免疫反應。正如在活體外觀察到的，使用KP407對22:0 Lyso PC進行微胞化係高度活化DC所必需的。為了最佳化小鼠活體內疫苗接種所需的KP407量，在皮下注射中使用了不同的百分比。用R848與以10%、15%或20%重新懸浮於KP407中的22:0 Lyso PC組合對小鼠進行皮下免疫。當使用15% KP407時，吾人觀察到dLN中定義為CD11c+MHC高的DC的最高流入，表明15%的KP407係誘導DC運輸至淋巴結的最佳濃度( 圖 19)。
22:0 Lyso PC隨後作為治療性腫瘤疫苗進行了測試。小鼠左側腹皮下接種B16-F10，一種小鼠黑色素瘤腫瘤細胞株。作為疫苗抗原的來源，B16-F10細胞衍生的全腫瘤溶胞產物(WTL)在3-4次冷凍/解凍循環後用於自腫瘤細胞中釋放抗原。為治療負載腫瘤小鼠，腫瘤注射後7天，小鼠右側腹用80 µg WTL與100 µg/小鼠的R848及65 µg含22:0 Lyso PC之KP407 (15%)組合免疫。接著小鼠每7天接受2次增強免疫。未免疫的小鼠在接種腫瘤後3週內死於腫瘤生長。當小鼠接種腫瘤溶胞產物與R848組合或腫瘤溶胞產物與R848及含22:0 Lyso PC之PBS組合時，未觀察到顯著益處。相比之下，用WTL及R848與用15% KP407調配的22:0 Lyso PC組合接種的小鼠存活時間更長( 圖 20)並且具有延遲的腫瘤生長動力學( 圖 21)。此項初步研究表明，22:0 Lyso PC對小鼠DC具有高度活化作用，並且可以啟動針對腫瘤攻擊的保護性免疫反應。
圖 1A- 圖 1B顯示了用指定刺激物活化後兩天犬周邊血液單核細胞(PBMC)的IL-1β分泌，分別顯示為總濃度( 圖 1A)及每個供體相對於單獨R848的變化倍數( 圖 1B)。結果表明，22:0 LYSO PC在與R848組合時能夠刺激犬PBMC分泌IL-1β，其分泌的含量與DAMP (諸如PGPC)或LPS及明礬相當或更高。 圖 1C顯示了用指定刺激物活化後兩天犬PBMC的相對存活率。結果表明，犬PBMC在用22:0 LYSO PC處理後仍保持存活。
圖 2A- 圖 2B顯示了用指定刺激物活化後兩天人類PBMC分泌的IL-1β，顯示為總濃度( 圖 2A)及每個供體相對於單獨R848的變化倍數( 圖 2B)。結果表明，22:0 LYSO PC在與R848組合時能夠刺激人類PBMC分泌IL-1β，其分泌的含量與DAMP (諸如PGPC)或LPS及明礬相當或更高。 圖 2C顯示了用指定刺激物活化後兩天人類PBMC的相對存活率。結果表明，人類PBMC在用22:0 LYSO PC處理後仍保持存活。
圖 3A- 圖 3B顯示了用指定刺激物活化後兩天人類PBMC分泌的IFNγ ( 圖 3A)及TNFα ( 圖 3B)，顯示為每個供體相對於單獨R848的變化倍數。結果表明，22:0 LYSO PC在與R848組合時能夠刺激人類PBMC分泌其他免疫刺激性細胞介素，其分泌的含量與DAMP (諸如PGPC)或LPS及明礬相當或更高。
圖 4顯示在脂質奈米粒子(LNP)中包含不同濃度的22:0 Lyso PC不會影響所得LNP的大小。在此圖中，LNP 2及LNP 3的媒劑對照相同。
圖 5A顯示了GenVoy LNP中包含22:0 Lyso PC的定量。 圖 5B顯示了含有可電離脂質的LNP中包含22:0 Lyso PC的定量。 圖 5C顯示了在缺乏可電離脂質的LNP中包含22:0 Lyso PC的定量。 圖 5D顯示增加22:0 Lyso PC輸入引起LNP中22:0 Lyso PC的負載增加。
圖 6A顯示了在存在或不存在LNP以及存在或不存在含有病原體相關分子模式的分子(PAMP)的情況下培養的單核球衍生的樹突細胞(moDC)的存活率。 圖 6B顯示了在存在或不存在LNP以及存在或不存在PAMP的情況下培養的moDC分泌的IL-1β。在 圖 6A- 圖 6B的分析中使用的PAMP係雷西莫特(R848)，其係TLR7/8促效劑。當存在時，22:0 Lyso PC以82.5 µM的濃度包括在內。
圖 7A顯示PBS中的22:0 Lyso PC直徑大，粒徑範圍大。 圖 7B顯示負載至LNP中的22:0 Lyso PC導致粒徑小得多，均勻性增加。
圖 8A- 圖 8D顯示22:0 Lyso PC LNP誘導鼠類骨髓來源的樹突細胞(BMDC)的高度活化。 圖 8A顯示了用各種調配物處理後48小時BMDC的存活率，以使用Cell Titer Glow分析法所量測。提供的數據係相對於R848處理的細胞。 圖 8B顯示用各種調配物處理後48小時BMDC的IL-6分泌，而 圖 8C顯示IL-1β分泌，以藉由ELISA所量測。顯示了平均值及SD，且其代表一項實驗的三次重複。 圖 8D顯示了作為CFSE+的引流淋巴結中CD11c+ MHC-II+ DC的絕對數目，以藉由流式細胞分析技術所量測。在CFSE染色及注射之前，BMDC用各種調配物處理24小時。使用非配對t檢定。顯示了平均值及SD，且其代表一項實驗中的四隻小鼠。
圖 9顯示在PBS或各種經過濾或未經過濾的脂質調配物存在下培養的人類moDC的存活率。
圖 10顯示在PBS或各種經過濾或未經過濾的脂質調配物存在下培養的人類moDC的IL-1β分泌。
圖 11A- 圖 11B顯示了在PBS或各種經過濾的調配物存在下培養的人類moDC的IL-1β分泌( 圖 11A)及存活率( 圖 11B)。
圖 12顯示了藉由動態光散射測定的含有22:0 LYSO PC的粒子大小的表徵。
圖 13A- 圖 13B顯示在指定條件下培養的鼠類FLT3L分化的DC的IL-1β分泌( 圖 13A)及存活率( 圖 13B)。
圖 14A- 圖 14C顯示在指定條件下培養的鼠類FLT3L分化的DC的TNF-α ( 圖 14A)、IL-6 ( 圖 14B)及IL-12p40 ( 圖 26C)。
圖 15顯示在指定條件下培養的鼠類FLT3L分化的cDC1及cDC2細胞的共刺激分子(CD40)表現。顯示了至少兩次重複的平均值及SD，且數據代表至少兩次獨立實驗。P值＜0.05 (*)、＜0.01 (**)或＜0.001 (***)、%0.0001 (****)表示組間存在顯著差異。使用二因子變異數分析檢定。
圖 16A- 圖 16B顯示了在指定條件下培養的鼠類FLT3L分化的cDC1及cDC2細胞的CCR7 ( 圖 16A)及CXCL16 ( 圖 16B)表現。
圖 17顯示在指定條件下培養的鼠類FLT3L分化的cDC1及cDC2細胞的MHC I類表現。顯示了至少兩次重複的平均值及SD，且數據代表至少兩次獨立實驗。P值＜0.05 (*)、＜0.01 (**)或＜0.001 (***)、%0.0001 (****)表示組間存在顯著差異。使用二因子變異數分析檢定。
圖 18A- 圖 18B顯示在指定條件下培養的鼠類FLT3L分化的DC的抗原攝取( 圖 18A)及抗原呈現( 圖 30B)。藉由量測紅色pHrodo葡聚醣的內吞來評估抗原攝取。藉由量測與MHC I類H-2Kb結合的卵白蛋白肽來評估抗原呈現。
圖 19顯示在皮下注射包含R848、22:0 LYSO PC及界面活性劑KP407的指定調配物後小鼠皮膚的引流淋巴結(dLN)的DC浸潤。
圖 20顯示了用PBS或治療性癌症疫苗(例如，全腫瘤溶胞產物調配物)處理的負載腫瘤小鼠的存活率。
圖 21顯示了用PBS或治療性癌症疫苗(例如，全腫瘤溶胞產物調配物)處理的小鼠的腫瘤生長動力學。

Claims (130)

  1. 一種組合物，其包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、至少一種另外的脂質及TLR7/8促效劑，其中 該醯基鏈係C13-C22醯基鏈或C13-C24醯基鏈， 該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群，且 該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分。
  2. 如請求項1之組合物，其中該醯基鏈係C18-C22醯基鏈或C21-C24醯基鏈。
  3. 如請求項1或請求項2之組合物，其進一步包含抗原。
  4. 如請求項1至3中任一項之組合物，其進一步包含樹突細胞。
  5. 一種組合物，其包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、至少一種另外的脂質及抗原，其中 該醯基鏈係C21-C24醯基鏈， 該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群，且 該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分。
  6. 如請求項5之組合物，其進一步包含樹突細胞。
  7. 如請求項5或請求項6之組合物，其進一步包含TLR7/8促效劑。
  8. 一種組合物，其包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、至少一種另外的脂質及樹突細胞，其中 該醯基鏈係C21-C24醯基鏈， 該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群，且 該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分。
  9. 如請求項8之組合物，其進一步包含TLR7/8促效劑。
  10. 如請求項8或請求項9之組合物，其進一步包含抗原。
  11. 如請求項1至10中任一項之組合物，其中該醯基鏈係C22醯基鏈。
  12. 如請求項1至11中任一項之組合物，其中該醯基鏈係完全飽和的。
  13. 如請求項1至12中任一項之組合物，其中該LPC包含1-二十二烷醯基-2-羥基- sn-甘油-3-磷膽鹼[LPC(22:0)]。
  14. 如請求項1至13中任一項之組合物，其中該TLR7/8促效劑係分子量為900道爾頓或更小的小分子。
  15. 如請求項14之組合物，其中該TLR7/8促效劑包含咪唑并喹啉化合物。
  16. 如請求項15之組合物，其中該TLR7/8促效劑包含雷西莫特(resiquimod) (R848)。
  17. 如請求項14或請求項15之組合物，其中該TLR7/8促效劑不抑制NLR家族含比林(pyrin)域3 (NLRP3)。
  18. 如請求項13之組合物，其中該LPC包含LPC(22:0)，並且該TLR7/8促效劑包含雷西莫特(R848)。
  19. 如請求項1至18中任一項之組合物，其中該抗原存在於自個體獲得之生物樣品中。
  20. 如請求項19之組合物，其中該生物樣品包含活檢組織。
  21. 如請求項19之組合物，其中該生物樣品包含細胞。
  22. 如請求項19之組合物，其中該生物樣品不包含細胞。
  23. 如請求項19之組合物，其中該生物樣品包含來自膿腫的膿。
  24. 如請求項1至23中任一項之組合物，其中該抗原包含蛋白質抗原。
  25. 如請求項24之組合物，其中該抗原包含腫瘤抗原。
  26. 如請求項25之組合物，其中該腫瘤抗原包含合成或重組新抗原。
  27. 如請求項26之組合物，其中該腫瘤抗原包含腫瘤細胞溶胞產物。
  28. 如請求項24之組合物，其中該抗原包含微生物抗原並且該微生物抗原包含病毒抗原、細菌抗原、原生動物抗原及真菌抗原中之一或多種。
  29. 如請求項28之組合物，其中該微生物抗原包含經純化或重組表面蛋白。
  30. 如請求項28之組合物，其中該微生物抗原包含不活化完整病毒。
  31. 如請求項1至30中任一項之組合物，其中該組合物包含脂質體。
  32. 如請求項1至31中任一項之組合物，其中該組合物不包含脂多醣(LPS)或單磷醯基脂質A (MPLA)。
  33. 如請求項1至32中任一項之組合物，其中該組合物不包含經氧化1-棕櫚醯基-2-花生四烯醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(oxPAPC)或oxPAPC之物種。
  34. 如請求項33之組合物，其中該組合物不包含2-[[(2R)-2-[(E)-7-羧基-5-羥基庚-6-烯醯基]氧基-3-十六醯基氧基丙氧基]-羥基磷醯基]氧基乙基-三甲基銨(HOdiA-PC)、2-(三甲基銨基)乙基磷酸[(2R)-2-[(E)-7-羧基-5-側氧基庚-6-烯醯基]氧基-3-十六醯基氧基丙基]酯(KOdiA-PC)、l-棕櫚醯基-2-(5-羥基-8-側氧基-辛烯醯基)-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(HOOA-PC)、2-[[(2R)-2-[(E)-5,8-二側氧基辛-6-烯醯基]氧基-3-十六醯基氧基丙氧基]-羥基磷醯基]氧基乙基-三甲基銨(KOOA-PC)、2-(三甲基銨基)乙基磷酸[(2R)-3-十六醯基氧基-2-(5-側氧基戊醯基氧基)丙基]酯(POVPC)、2-(三甲基銨基)乙基磷酸[(2R)-2-(4-羧基丁醯基氧基)-3-十六醯基氧基丙基]酯(PGPC)、2-(三甲基銨基)乙基磷酸[(2R)-3-十六醯基氧基-2-[4-[3-[(E)-[2-[(Z)-辛-2-烯基]-5-側氧基環戊-3-烯-l-亞基]甲基]環氧乙烷-2-基]丁醯基氧基]丙基]酯(PECPC)、2-(三甲基銨基)乙基磷酸[(2R)-3-十六醯基氧基-2-[4-[3-[(E)-[3-羥基-2-[(Z)-辛-2-烯基]-5-側氧基環戊亞基]甲基]環氧乙烷-2-基]丁醯基氧基]丙基]酯(PEIPC)及/或1-棕櫚醯基-2-壬二醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(PAzePC)。
  35. 如請求項1至34中任一項之組合物，其進一步包含佐劑，其中該佐劑包含鋁鹽佐劑、水包角鯊烯乳液、皂苷或其組合。
  36. 一種醫藥調配物，其包含如請求項1至35中任一項之組合物及醫藥學上可接受之賦形劑。
  37. 一種用於產生經高度活化樹突細胞之方法，該方法包含使該等樹突細胞與有效量之包含具有單個C13-C22醯基鏈或C13-C24醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、至少一種另外的脂質及TLR7/8促效劑之組合物接觸，用於產生經高度活化樹突細胞，其中 該等經高度活化樹突細胞分泌IL-1β而不經歷細胞焦亡， 該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群，且 該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分。
  38. 如請求項37之方法，其中使該等樹突細胞與如請求項1至35中任一項之組合物或如請求項36之調配物離體接觸。
  39. 如請求項37之方法，其中使該等樹突細胞與如請求項36之調配物在活體內接觸。
  40. 一種醫藥調配物，其包含至少10 3、10 4、10 5或10 6個藉由如請求項38之方法產生的經高度活化樹突細胞及醫藥學上可接受之賦形劑。
  41. 一種刺激針對抗原的免疫反應之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之如請求項36之調配物以刺激針對該抗原的該免疫反應。
  42. 一種治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之如請求項36之調配物以治療癌症。
  43. 一種抑制異常細胞增殖之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之如請求項36之調配物以抑制異常細胞增殖。
  44. 一種治療感染性疾病之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之如請求項36之調配物以治療該感染性疾病。
  45. 一種如請求項36之調配物用於在有需要之個體中誘導針對抗原的免疫反應之用途。
  46. 一種如請求項36之調配物用於在有需要之個體中誘導抗腫瘤免疫反應之用途，其中該個體係或曾經係負載腫瘤的。
  47. 一種如請求項36之調配物用於在有需要之個體中誘導抗微生物免疫反應之用途，其中該個體經該微生物感染或尚未暴露於該微生物。
  48. 如請求項19至47中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該個體係哺乳動物受試者。
  49. 如請求項19至47中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該個體係人類受試者。
  50. 一種製備免疫原性組合物之方法，該方法包含： a)自腫瘤中獲得富集腫瘤細胞之懸浮液； b)自該富集腫瘤細胞之懸浮液中溶解細胞以獲得腫瘤細胞溶胞產物；以及 c)使該腫瘤細胞溶胞產物與包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、至少一種另外的脂質及類鐸受體7/8 (TLR7/8)促效劑之組合物接觸，以獲得該免疫原性組合物，其中 該醯基鏈係C13-C22醯基鏈或C13-C24醯基鏈， 該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群，且 該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分。
  51. 如請求項50之方法，其中步驟a)包含自該富集腫瘤細胞之懸浮液中耗乏白血球，視情況其中使用抗CD45抗體藉由去除性選汰耗乏該等白血球。
  52. 如請求項50或請求項51之方法，其中在步驟b)中藉由一或多次凍融循環溶解該等細胞。
  53. 如請求項50至52中任一項之方法，其中該醯基鏈係完全飽和的C18-C22醯基鏈或完全飽和的C18-C24醯基鏈。
  54. 如請求項53之方法，其中該LPC包含1-二十二烷醯基-2-羥基- sn-甘油-3-磷膽鹼[LPC(22:0)]。
  55. 如請求項50至54中任一項之方法，其中該TLR7/8促效劑係分子量為900道爾頓或更小的小分子。
  56. 如請求項55之方法，其中該TLR7/8促效劑包含咪唑并喹啉化合物。
  57. 如請求項56之方法，其中該TLR7/8促效劑包含雷西莫特(R848)。
  58. 如請求項55或56之方法，其中該TLR7/8促效劑不抑制NLR家族含比林域3 (NLRP3)。
  59. 如請求項54之方法，其中該LPC包含LPC(22:0)，並且該TLR7/8促效劑包含雷西莫特(R848)。
  60. 如請求項50至59中任一項之方法，其進一步包含在步驟a)之前自患有癌症之哺乳動物受試者的腫瘤中獲得樣品並自該樣品製備細胞之該懸浮液。
  61. 一種免疫原性組合物，其藉由如請求項50至60中任一項之方法製備。
  62. 一種引發抗癌免疫反應之方法，該方法包含： 向患有癌症之哺乳動物受試者投與有效量之如請求項61之免疫原性組合物。
  63. 如請求項62之方法，其中該抗癌免疫反應包含細胞免疫反應。
  64. 如請求項63之方法，其中該抗癌免疫反應包含癌抗原誘導的IL-1β分泌及/或CD8+ T淋巴球的活化。
  65. 如請求項62至64中任一項之方法，其中該癌症係非血液癌症。
  66. 如請求項65之方法，其中該非血液癌症係癌、肉瘤或黑色素瘤。
  67. 如請求項62至64中任一項之方法，其中該癌症係淋巴瘤。
  68. 一種治療癌症之方法，該方法包含： a)製備免疫原性組合物，該免疫原性組合物包含腫瘤細胞溶胞產物、具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、至少一種另外的脂質及類鐸受體7/8 (TLR7/8)促效劑，其中 該腫瘤細胞溶胞產物係或已經由自患有癌症之哺乳動物受試者獲得之腫瘤樣品製備， 該醯基鏈係C13-C22醯基鏈或C13-C24醯基鏈， 該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群，且 該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分；以及 b)向該受試者投與有效量之該免疫原性組合物。
  69. 如請求項62至68中任一項之方法，其中該醯基鏈係完全飽和的C18-C22醯基鏈或完全飽和的C18-C24醯基鏈。
  70. 如請求項68之方法，其中該LPC包含1-二十二烷醯基-2-羥基- sn-甘油-3-磷膽鹼[LPC(22:0)]。
  71. 如請求項62至70中任一項之方法，其中該TLR7/8促效劑係分子量為900道爾頓或更小的小分子。
  72. 如請求項71之方法，其中該TLR7/8促效劑包含咪唑并喹啉化合物。
  73. 如請求項72之方法，其中該TLR7/8促效劑包含雷西莫特(R848)。
  74. 如請求項70之方法，其中該LPC包含22:0 LPC，並且該TLR7/8促效劑包含雷西莫特(R848)。
  75. 如請求項68至74中任一項之方法，其進一步包含向該受試者投與有效量之額外的治療劑。
  76. 如請求項75之方法，其中該額外的治療劑包括由免疫檢查點抑制劑、抗癌劑及放射療法組成之群中之一或多種。
  77. 一種組合物，其包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、至少一種另外的脂質及病原體識別受體(PRR)促效劑，其中 該醯基鏈係C13-C22醯基鏈或C13-C24醯基鏈， 該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群，且 該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分。
  78. 如請求項77之組合物，其中該PRR促效劑係類鐸受體(TLR)、類NOD受體(NLR)、類RIG-I受體(RLR)或C型凝集素受體(CLR)的促效劑。
  79. 如請求項77之組合物，其中該PRR促效劑係細胞溶質DNA感測器(CDS)或IFN基因刺激因子(STING)的促效劑。
  80. 如請求項77之組合物，其中該PRR促效劑包含R848、TL8-506、LPS、Pam2CSK4及ODN2336中之一或多種。
  81. 如請求項77至80中任一項之組合物，其進一步包含抗原。
  82. 如請求項77至81中任一項之組合物，其進一步包含樹突細胞。
  83. 一種醫藥調配物，其包含如請求項77至82中任一項之組合物及醫藥學上可接受之賦形劑。
  84. 一種醫藥調配物，其包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、至少一種另外的脂質及醫藥學上可接受之賦形劑，其中 該醯基鏈係C21-C24醯基鏈， 該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群，且 該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分。
  85. 如請求項83或請求項84之醫藥調配物，其中該醯基鏈係完全飽和的C22醯基鏈。
  86. 如請求項85之醫藥調配物，其中該LPC包含1-二十二烷醯基-2-羥基- sn-甘油-3-磷膽鹼[LPC(22:0)]。
  87. 一種用於高度活化人類樹突細胞之組合物，其包含具有單醯基鏈的經分離溶血磷脂醯膽鹼(LPC)、至少一種另外的脂質及病原體識別受體(PRR)促效劑，其中 該醯基鏈係C22醯基鏈， 該至少一種另外的脂質選自由可電離脂質、陽離子脂質、另外的磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群， 該LPC及該至少一種另外的脂質係脂質奈米粒子(LNP)之一部分，並且 該組合物比包含PGPC代替該LPC的比較組合物有效達成更高水平的樹突細胞高度活化。
  88. 如請求項87之組合物，其中該更高水平的樹突細胞高度活化包含與當與包含該PGPC及該PRR促效劑的該比較組合物接觸時相比，當與包含該LPC及該PRR促效劑的該組合物接觸時，在活體外誘導該等人類樹突細胞以高至少2、3或4倍的含量分泌IL-1β，其中該PRR促效劑係LPS。
  89. 如請求項88之組合物，其中該LPC的濃度及該PGPC的濃度係在約10 μM至約80 μM範圍內的相同濃度，並且該LPS在該組合物及該比較化合物中均以1 μg/ml的濃度存在。
  90. 如請求項88之組合物，其中該較高水平的樹突細胞高度活化包含與包含該PGPC及該PRR促效劑的該比較組合物相比，對於包含該LPC及該PRR促效劑之該組合物，該等人類樹突細胞分泌IL-1β的脂質活性指數的活性單位高至少4、5或6倍。
  91. 如請求項19至47中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該個體係犬受試者。
  92. 如請求項60至90中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該哺乳動物受試者係人類患者。
  93. 如請求項60至90中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該哺乳動物受試者係非人類患者。
  94. 如請求項60至90中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該哺乳動物受試者係犬患者。
  95. 如請求項1至90或92中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該等樹突細胞係人類樹突細胞。
  96. 如請求項1至91或94中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該等樹突細胞係犬樹突細胞。
  97. 如請求項95或請求項96之組合物、調配物、方法或用途，其中該等樹突細胞存在於包含周邊血液單核細胞(PBMC)之組合物中。
  98. 如請求項37至49或請求項91中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該等經高度活化樹突細胞分泌IFNγ及TNFα中之一或兩種。
  99. 如請求項1至98中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該至少一種另外的脂質包含另外的磷脂及結構脂質中之一或兩者，視情況其中該另外的磷脂包含1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)，且該結構脂質包含膽固醇。
  100. 如請求項99之組合物、調配物、方法或用途，其中該至少一種另外的脂質包含聚乙二醇化脂質，視情況其中該聚乙二醇化脂質包含聚乙二醇[PEG] 2000二肉豆蔻醯甘油[DMG]。
  101. 如請求項99或請求項100之組合物、調配物、方法或用途，其中該至少一種另外的脂質包含可電離脂質，視情況其中該可電離脂質包含4-(二甲基胺基)-丁酸, (10Z,13Z)-1-(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯-1-基-10,13-十九碳二烯-1-基酯(DLin-MC3-DMA)或其類似物或衍生物。
  102. 一種包含脂質奈米粒子(LNP)之組合物，其中該LNP包含第一磷脂及至少一種選自由可電離脂質、第二磷脂、聚乙二醇化脂質、結構脂質及其混合物組成之群的脂質，其中該第一磷脂包含具有單醯基鏈的溶血磷脂醯膽鹼(LPC)，並且該醯基鏈係C13-C24醯基鏈。
  103. 一種包含脂質奈米粒子(LNP)之組合物，其中該LNP包含第一磷脂、可電離脂質、第二磷脂、聚乙二醇化脂質及結構脂質，其中該第一磷脂包含具有單醯基鏈的溶血磷脂醯膽鹼(LPC)，並且該醯基鏈係C13-C24醯基鏈。
  104. 如請求項1至103中任一項之組合物，其中該可電離脂質包含： i) 8-[(2-羥基乙基)[6-側氧基-6-(十一烷氧基)己基]胺基]-辛酸, 1-辛基壬基酯(SM-102)或其類似物或衍生物；及/或6-((2-己基癸醯基)氧基)-N-(6-((2-己基癸醯基)氧基)己基)-N-(4-羥基丁基)己-1-胺鎓(ALC-0315)或其類似物或衍生物；或 ii) 4-(二甲基胺基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基酯(DLin-MC3-DMA)或其類似物或衍生物。
  105. 如請求項1至104中任一項之組合物，其中該聚乙二醇化脂質選自由以下組成之群：PEG修飾的磷脂醯乙醇胺、PEG修飾的磷脂酸、PEG修飾的神經醯胺、PEG修飾的二烷基胺、PEG修飾的二醯基甘油、PEG修飾的二烷基甘油及其組合。
  106. 如請求項1至104中任一項之組合物，其中該聚乙二醇化脂質包含聚乙二醇[PEG] 2000二肉豆蔻醯甘油[DMG]。
  107. 如請求項1至106中任一項之組合物，其中該結構脂質選自由以下組成之群：膽固醇、糞固醇、植固醇、麥角固醇、菜油固醇、豆固醇、蕓苔固醇、番茄鹼、熊果酸、α-生育酚及其組合。
  108. 如請求項1至106中任一項之組合物，其中該結構脂質包含膽固醇。
  109. 如請求項1至108中任一項之組合物，其中該另外的磷脂或該第二磷脂包含選自由以下組成之群的親水性頭部部分：磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯甘油、磷脂醯絲胺酸、磷脂酸、2-溶血磷脂醯膽鹼及鞘磷脂。
  110. 如請求項1至108中任一項之組合物，其中該另外的磷脂或該第二磷脂包含一或多個選自由以下組成之群的脂肪酸尾部部分：月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞麻油酸、α-次亞麻油酸、芥子酸、花生酸、花生四烯酸、植烷酸、二十碳五烯酸、二十二酸、二十二碳五烯酸及二十二碳六烯酸。
  111. 如請求項1至108中任一項之組合物，其中該另外的磷脂或該第二磷脂係選自由以下組成之群： 1,2-二亞麻油醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DLPC)、 1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-磷膽鹼(DMPC)、 1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DOPC)、 1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DPPC)、 1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)、 1,2-雙十一烷醯基-sn-甘油-磷膽鹼(DUPC)、 1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(POPC)、 1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷膽鹼、 1-油醯基-2-膽固醇基半琥珀醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼、 1,2-二次亞麻油醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼、 1,2-二花生四烯醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼、 1,2-雙二十二碳六烯醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼、 1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、 1,2-二植醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、 1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、 1,2-二亞麻油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、 1,2-二次亞麻油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、 1,2-二花生四烯醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、 1,2-雙二十二碳六烯醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、 1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)鈉鹽(DOPG)、 鞘磷脂、及 其組合。
  112. 如請求項1至108中任一項之組合物，其中該另外的磷脂或該第二磷脂包含1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)。
  113. 如請求項1至112中任一項之組合物，其中該至少一種另外的脂質包含：i)陽離子脂質，並且包含或進一步包含ii)中性或陰離子脂質。
  114. 如請求項113之組合物，其中該陽離子脂質包含以下中之一或兩者： i) 1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基銨丙烷(DOTMA)或其類似物或衍生物；及 ii) 1,2-二油醯基-3-三甲基銨丙烷(DOTAP)或其類似物或衍生物。
  115. 如請求項113或請求項114之組合物，其中該中性或陰離子脂質包含： i) 1,2-二-(9Z-十八烯醯基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)或其類似物或衍生物；及/或 ii)膽固醇或其類似物或衍生物；及/或 iii) 1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DOPC)或其類似物或衍生物。
  116. 如請求項102至116中任一項之組合物，其中該LPC的該醯基鏈係C21-C24醯基鏈。
  117. 如請求項102至116中任一項之組合物，其中該LPC的該醯基鏈係C22醯基鏈。
  118. 如請求項102至117中任一項之組合物，其中該組合物進一步包含TLR7/8促效劑。
  119. 如請求項118之組合物，其中該TLR7/8促效劑包含咪唑并喹啉化合物。
  120. 如請求項119之組合物，其中該TLR7/8促效劑包含雷西莫特(R848)。
  121. 如請求項119之組合物，其中該LPC包含LPC(22:0)，並且該TLR7/8促效劑包含雷西莫特(R848)。
  122. 如請求項102至121中任一項之組合物，其中該組合物進一步包含抗原。
  123. 如請求項122之組合物，其中該抗原係腫瘤抗原或新抗原。
  124. 如請求項122之組合物，其中該抗原係微生物抗原，視情況其中該微生物抗原係病毒抗原、細菌抗原、原生動物抗原或真菌抗原。
  125. 如請求項1至122中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該組合物不包含經分離mRNA。
  126. 如請求項1至125中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該LNP的有效直徑小於約500奈米，視情況約5至約500奈米，視情況約10至約400奈米，視情況約20至約300奈米，或視情況約25至約250奈米。
  127. 如請求項126之組合物、調配物、方法或用途，其中該LNP具有小於約250奈米的有效直徑。
  128. 如請求項127之組合物、調配物、方法或用途，其中該LNP具有小於約125奈米的有效直徑。
  129. 如請求項128之組合物、調配物、方法或用途，其中該LNP具有約10至約110奈米的有效直徑。
  130. 如請求項1至129中任一項之組合物、調配物、方法或用途，其中該組合物不包含界面活性劑。
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