TW202341167A - 一種幹細胞質量評價方法 - Google Patents

一種幹細胞質量評價方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202341167A
TW202341167A TW112101383A TW112101383A TW202341167A TW 202341167 A TW202341167 A TW 202341167A TW 112101383 A TW112101383 A TW 112101383A TW 112101383 A TW112101383 A TW 112101383A TW 202341167 A TW202341167 A TW 202341167A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
stem cells
cell
stem
quality
stem cell
Prior art date
Application number
TW112101383A
Other languages
English (en)
Inventor
裕建 康
張金來
馬飛
Original Assignee
大陸商天士力幹細胞產業平台有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 大陸商天士力幹細胞產業平台有限公司 filed Critical 大陸商天士力幹細胞產業平台有限公司
Publication of TW202341167A publication Critical patent/TW202341167A/zh

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G16B25/10—Gene or protein expression profiling; Expression-ratio estimation or normalisation
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/30—Detection of binding sites or motifs
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G16B40/20—Supervised data analysis
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G16B40/30—Unsupervised data analysis
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B5/00—ICT specially adapted for modelling or simulations in systems biology, e.g. gene-regulatory networks, protein interaction networks or metabolic networks

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Software Systems (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Evolutionary Computation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Bioethics (AREA)
  • Artificial Intelligence (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明提供了一種幹細胞質量評價方法，包括：獲取幹細胞質量相關的特徵基因的表現量；根據特徵基因的表現量和特徵基因的權重係數，計算幹細胞質量評分；根據幹細胞質量評分評價幹細胞質量。本發明為預測幹細胞在微環境的影響下發生異質性改變、由此帶來的品質風險，利用監督性機器學習模型學習帶有品質屬性標籤的單細胞基因表現資料集，確定幹細胞質量相關的特徵基因及特徵基因的權重係數；根據待檢測幹細胞樣本中特徵基因的表現量、及特徵基因的權重係數，實現了準確、快速、定量判定幹細胞質量的效果。

Description

一種幹細胞質量評價方法
本發明屬於幹細胞技術領域，關於一種幹細胞質量評價方法，特別係關於涉及一種根據特徵基因的表現量和特徵基因的權重係數評價幹細胞質量的方法。
幹細胞療法有望通過介導組織再生、替代及修復因衰老或病變引起的組織器官損傷等方式，從根本上改變現有醫學面對的免疫性、退行性、創傷性和腫瘤性等難治性疾病的臨床困局，是未來醫學發展的方向。
通過適度擴增培養獲得充足的幹細胞，是支撐幹細胞研究與應用的必要前提。但是，幹細胞在增殖過程中受到所處微環境的影響，基因表現發生改變，使得相同來源增殖獲得的幹細胞具有異質性，這種異質性嚴重阻礙了幹細胞的科學研究與臨床應用轉化，也是導致幹細胞回輸存在潛在安全性風險的重要原因。因此，鑒定和預防幹細胞增殖過程中的異質性，是幹細胞療法臨床發展的關鍵先決條件。
單細胞RNA測序技術（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）為探索細胞間的異質性提供了可能，能夠基於基因表現圖譜初步分析細胞亞群的異質性，但是無法明確細胞異質性與細胞質量間的關係，更無法定量判定幹細胞的品質。
CN113061638A提供了一種幹細胞評估體系，對幹細胞進行無菌檢測、安全性檢測、細胞活性檢測以及細胞形態檢測。
然而，現有技術缺乏針對幹細胞質量進行評價的健全統一的規範和標準，不能準確揭示微環境對幹細胞的影響，無法解決幹細胞療法中因幹細胞異質性所引發的安全性問題。幹細胞行業仍然面臨著質控體系不健全、機理研究不透徹、臨床應用不規範的巨大挑戰。
針對現有技術的不足和實際需求，本發明提供了一種幹細胞質量評價方法，所述幹細胞質量評價方法基於單細胞轉錄組學技術和功能性細胞亞群聚類方法，在單細胞水準確定了關鍵的幹細胞質量分類標準，構建了帶有品質屬性分類標籤的幹細胞的單細胞基因表現資料集，利用監督性機器學習模型構建了幹細胞質量預測模型、確定了幹細胞質量相關的特徵基因和特徵基因的權重係數，實現了定量判定因幹細胞異質性變化而引發的品質風險的效果。
本發明第一個方面提供了一種幹細胞質量評價方法，其包括：
獲取幹細胞質量相關的特徵基因的表現量；根據特徵基因的表現量和特徵基因的權重係數，計算幹細胞質量評分；以及根據幹細胞質量評分評價幹細胞質量。
應用於臨床的幹細胞是一類具有相同細胞生物學屬性的幹細胞，其細胞命運受到微環境的影響會發生異質性變化，本發明為確定幹細胞的分化方向、評價幹細胞的品質，利用生物資訊學手段確定幹細胞質量相關的特徵基因及特徵基因的權重係數，通過檢測幹細胞樣本對特徵基因的表現量、基於特徵基因的表現量和權重係數，評價幹細胞質量。
本發明中，幹細胞質量相關的特徵基因及特徵基因的權重係數是利用監督性機器學習模型學習帶有品質屬性標籤的單細胞基因表現資料集確定的，特徵基因能夠準確表徵不同幹細胞在品質方面的異質性；根據待檢測幹細胞樣本對特徵基因的表現量、及特徵基因的權重係數，便可以計算到幹細胞質量評分，實現定量評價幹細胞質量的效果。
較佳地，所述幹細胞質量相關的特徵基因是在單細胞水準確定的幹細胞質量相關的特徵基因。
具體來說，所述特徵基因和特徵基因的權重係數的確定方法包括：
以幹細胞的單細胞基因表現資料和特定品質屬性形成資料集，分為訓練集和測試集；
利用訓練集訓練監督性機器學習模型，通過交叉驗證和測試集測試，調整監督性機器學習模型參數，確定幹細胞質量預測模型、幹細胞質量相關的特徵基因和特徵基因的權重係數。
本發明中，採用帶有已知品質屬性標籤的幹細胞的單細胞基因表現資料作為資料集，按比例隨機分為訓練集和測試集，訓練監督性機器學習模型：利用訓練集資料確定監督性機器學習模型的特徵數量，利用測試集資料調整參數、優化監督性機器學習模型，獲得在預測準確率、精准率、召回率和F1得分等指標中表現良好的模型，作為幹細胞質量預測模型，確定與幹細胞質量相關的特徵基因及其權重。
所述幹細胞的單細胞基因表現資料的獲取方法包括：
對幹細胞進行單細胞RNA測序，獲取幹細胞的單細胞基因表現資料。
所述特定品質屬性的獲取方法包括：
根據幹細胞的培養微環境確定特定品質屬性；
根據幹細胞的單細胞基因表觀遺傳資料確定特定品質屬性；或
根據幹細胞的單細胞基因表現資料確定特定品質屬性；
所述根據幹細胞的單細胞基因表現資料確定特定品質屬性包括：
對幹細胞的單細胞基因表現資料進行通路富集分析，計算通路在每個幹細胞中的富集分數，獲得幹細胞的單細胞通路富集分數矩陣；
對幹細胞的單細胞通路富集分數矩陣進行生物資訊分析，獲得幹細胞的單細胞亞群聚類結果，作為幹細胞的特定品質屬性。
較佳地，所述對幹細胞的單細胞通路富集分數矩陣進行生物資訊分析，包括：
對幹細胞的單細胞通路富集分數矩陣進行降維和聚類處理。
本發明中，通過整合傳統的細胞亞群聚類、差異基因分析和通路富集分析，依通路富集分析結果建立了幹細胞的單細胞通路富集分數矩陣，該單細胞通路富集分數矩陣的每一行代表一個通路在不同幹細胞中的表現情況、每一列代表不同幹細胞對所有代謝通路的表現情況、每個格子的資料代表特定的通路在特定的幹細胞中的表現情況；該基於通路的功能性單細胞亞群聚類方法實現了快速發現幹細胞功能差異的效果。
較佳地，獲取特徵基因的表現量的方法包括本領域常規的基因定量方法，例如可以是單細胞測序、高通量測序、微陣列晶片、qPCR等，較佳採用單細胞測序獲取特徵基因的表現量。
較佳地，所述幹細胞質量評分的計算公式為：
其中， Gi為第 i個特徵基因的表現量， Wi為第 i個特徵基因的權重係數， n為特徵基因的數量。
本發明中，檢測待測幹細胞樣本對特徵基因的表現量、並計算加權和，帶入上述計算公式得到幹細胞質量評分，分值越高表示幹細胞的品質風險越高。
較佳地，所述根據幹細胞質量評分評價幹細胞質量的方法包括：
幹細胞質量評分≥幹細胞質量風險閾值，幹細胞為品質風險幹細胞；
幹細胞質量評分＜幹細胞質量風險閾值，幹細胞為非品質風險幹細胞。
較佳地，所述幹細胞質量風險閾值的確定方法包括：
利用受試者工作特徵曲線和曲線下面積分析資料集的幹細胞質量評分，受試者工作特徵曲線最高點的數值為幹細胞質量風險閾值；
其中，所述資料集包含帶有已知特定品質屬性標籤的幹細胞的單細胞基因表現資料。
較佳地，所述監督性機器學習模型包括感知機模型、K近鄰演算法、樸素貝葉斯模型、決策樹模型、邏輯回歸、支援向量機、隨機森林、提升方法模型、EM演算法或條件隨機場中的任意一種。
較佳地，所述幹細胞質量相關的特徵基因含有至少三種選自下列基因組的基因：TAGLN、EFEMP1、TPM1、CLU、PTX3、IER3、IGFBP7、MFAP5、IL6、LUM、SERPINE2、CRIM1和RHOB。最較佳地，所述幹細胞質量相關的特徵基因包括TAGLN、EFEMP1、TPM1、CLU、PTX3、IER3、IGFBP7、MFAP5、IL6、LUM、SERPINE2、CRIM1和RHOB。
較佳地，所述幹細胞包括成體幹細胞、胚幹細胞、誘導性多能幹細胞或成熟體細胞轉化獲得的幹細胞及其衍生細胞中的任意一種或至少兩種的組合。
較佳地，所述幹細胞包括間充質幹細胞、間充質基質細胞、多能基質細胞、多能間充質基質細胞或藥物信號傳導細胞中的任意一種或至少兩種的組合。
較佳地，所述幹細胞包括脂肪源幹細胞、臍帶幹細胞、胎盤源幹細胞、骨髓源幹細胞、牙髓源幹細胞、宮血源幹細胞、羊膜上皮幹細胞、支氣管基底層細胞中的任意一種或至少兩種的組合。
作為較佳技術方案，本發明提供了一種幹細胞質量評價方法，包括：
一、幹細胞的亞群聚類
對幹細胞的單細胞RNA測序數據進行預處理，獲得幹細胞的單細胞基因表現資料；
對幹細胞的單細胞基因表現資料進行通路富集分析，計算通路在每個幹細胞中的富集分數，獲得幹細胞的單細胞通路富集分數矩陣；
對幹細胞的單細胞通路富集分數矩陣進行標準化、降維、聚類和視覺化處理，獲得幹細胞的單細胞亞群聚類結果，作為幹細胞的特定品質屬性。
二、幹細胞的亞群識別
將獲取的帶有特定品質屬性標籤的幹細胞的單細胞基因表現資料形成資料集，分為訓練集和測試集；
利用訓練集訓練監督性機器學習模型，通過交叉驗證和測試集測試，調整監督性機器學習模型參數，確定幹細胞質量預測模型、幹細胞質量相關的特徵基因和特徵基因的權重係數。
三、幹細胞的品質評分
獲取幹細胞樣本中特徵基因的表現量；
根據特徵基因的表現量和特徵基因的權重係數，計算幹細胞質量評分；
所述幹細胞質量評分的計算公式為：
其中，Gi為第i個特徵基因的表現量，Wi為第i個特徵基因的權重係數，n為特徵基因的數量。
四、幹細胞的品質評價
根據幹細胞質量評分評價幹細胞質量：
幹細胞質量評分≥幹細胞質量風險閾值，幹細胞為品質風險幹細胞；
幹細胞質量評分＜幹細胞質量風險閾值，幹細胞為非品質風險幹細胞；
所述幹細胞質量風險閾值的確定方法包括：
利用受試者工作特徵曲線和曲線下面積分析資料集的幹細胞質量評分，受試者工作特徵曲線最高點的數值為幹細胞質量風險閾值；
其中，所述資料集包含帶有已知特定品質屬性標籤的幹細胞的單細胞基因表現資料。
本發明第二個方面提供了一種幹細胞質量預測模型的建立方法，包括：
獲取幹細胞的單細胞基因表現資料和特定品質屬性，形成資料集，分為訓練集和測試集；
利用訓練集訓練監督性機器學習模型，通過交叉驗證和測試集測試，調整監督性機器學習模型參數，確定幹細胞質量預測模型。
較佳地，所述獲取幹細胞的單細胞基因表現資料和特定品質屬性的方法包括：
對幹細胞進行單細胞RNA測序，獲取幹細胞的單細胞基因表現資料；
對幹細胞的單細胞基因表現資料進行通路富集分析，計算通路在每個幹細胞中的富集分數，獲得幹細胞的單細胞通路富集分數矩陣；
對幹細胞的單細胞通路富集分數矩陣進行生物資訊分析，獲得幹細胞的單細胞亞群聚類結果，作為幹細胞的特定品質屬性。
較佳地，所述對幹細胞的單細胞通路富集分數矩陣進行生物資訊分析，包括：
對幹細胞的單細胞通路富集分數矩陣進行降維和聚類處理。
較佳地，所述建立方法還包括：
根據幹細胞質量預測模型確定幹細胞質量相關的特徵基因和特徵基因的權重係數。
本發明第三個方面提供了一種幹細胞的單細胞功能分類方法，包括：
對幹細胞的單細胞基因表現資料進行通路富集分析，計算通路在每個幹細胞中的富集分數，獲得幹細胞的單細胞通路富集分數矩陣；
對幹細胞的單細胞通路富集分數矩陣進行生物資訊分析，獲得幹細胞的單細胞亞群聚類結果。
較佳地，所述對幹細胞的單細胞通路富集分數矩陣進行生物資訊分析，包括：
對幹細胞的單細胞通路富集分數矩陣進行降維和聚類處理。
較佳地，所述方法還包括：
分析幹細胞的單細胞亞群的差異表現基因，選擇一個或多個通路相關的差異表現基因所在的單細胞亞群，利用差異表現基因進行降維和聚類處理，獲得幹細胞的單細胞功能分類結果。
較佳地，所述功能通路可以是促栓塞相關通路，包括纖維蛋白凝塊形成內在通路、纖維蛋白凝塊形成外在通路和纖維蛋白凝塊-凝血級聯反應形成通路。
本發明第四個方面提供了一種特徵基因的組合，其含有至少三種選自下列基因組的基因：TAGLN、EFEMP1、TPM1、CLU、PTX3、IER3、IGFBP7、MFAP5、IL6、LUM、SERPINE2、CRIM1和RHOB或由其組成。
本發明第五個方面提供了含有至少三種選自下列基因組的基因：TAGLN、EFEMP1、TPM1、CLU、PTX3、IER3、IGFBP7、MFAP5、IL6、LUM、SERPINE2、CRIM1和RHOB用於幹細胞質量評價的用途。
本發明第六個方面提供了一種伺服器，所述伺服器包括處理器和存儲所述處理器可執行指令的記憶體；其中所述處理器用於執行本發明第一個方面所述的幹細胞質量評價方法、本發明第二個方面所述的幹細胞質量預測模型的建立方法或本發明第三個方面所述的幹細胞的單細胞功能分類方法。
本發明第七個方面提供了一種電腦可讀存儲介質，所述電腦可讀存儲介質儲存有電腦程式，所述電腦程式執行本發明第一個方面所述的幹細胞質量評價方法、本發明第二個方面所述的幹細胞質量預測模型的建立方法或本發明第三個方面所述的幹細胞的單細胞功能分類方法。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
（1）本發明的幹細胞質量評價方法基於單細胞RNA測序技術和功能性細胞亞群聚類方法，在單細胞水準建立了幹細胞質量標準圖譜，以此幹細胞質量標準圖譜作為資料集，基於監督性機器學習模型建立了幹細胞質量預測模型；
（2）本發明利用幹細胞質量預測模型確定了幹細胞質量相關的特徵基因和特徵基因的權重係數，通過計算幹細胞質量相關的特徵基因的加權和，實現了準確、定量評判幹細胞質量的效果，是一種規範、健全、統一的幹細胞質量評價方法；
（3）本發明的幹細胞質量評價方法實現了準確、定量評價幹細胞在微環境的影響下發生的異質性變化的效果；
（4）本發明的幹細胞質量評價方法可以用於篩選高品質的幹細胞。
為進一步闡述本發明所採取的技術手段及其效果，以下結合實施例和附圖對本發明作進一步地說明。可以理解的是，此處所描述的具體實施方式僅僅用於解釋本發明，而非對本發明的限定。對本發明的方法和系統所作的各種修改或變型對本發明所屬領域中具有通常知識者而言是顯而易見的且不會脫離本發明的範圍和實質。雖然已經結合特定較佳實施方式對本發明作了描述，但是應當理解如發明申請專利範圍的那樣本發明不應當被過度地限制於這些特定實施方式中，此外在本發明範圍內可以對所述實施方式作出各種修改和增加。當然，為了實施本發明而對所述實施方式作出的對分子生物學及相關領域之通常知識者所做出的各種修改都落在發明申請專利範圍的保護範圍之內。
實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件，或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可通過正規管道商購獲得的常規產品。
定義
如上下文所述，“幹細胞”是指相對未分化的、具有分化潛能的細胞，其活躍地***和迴圈，對成熟的、分化的和功能細胞系產生適當的刺激。對所述幹細胞所定義的性質包括：(a)自身不是最終分化的；(b)可在動物一生中無限***；(c)具有一致的細胞標記表徵結果，是一種幹細胞，不是多種幹細胞和/或體細胞的混合；(d)在其***時，每個子細胞可選擇繼續維持為幹細胞或進入不可逆導致最終分化的過程。
如上下文所述，“間充質基質細胞”或“間充質幹細胞”是可分化至多種細胞類型的多能幹細胞。間充質基質細胞或間充質幹細胞已顯示出體外或體內分化成的細胞類型包括成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞和脂肪細胞。間充質是胚胎結締組織，其得自中胚層並分化成造血組織和結締組織，其中間充質幹細胞不分化成造血細胞。
如上下文所述，“幹細胞質量”是指上述任一種與幹細胞安全性相關的因素，幹細胞在微環境的影響下發生異質性改變、由於此異質性變化帶來的可能風險。臨床級幹細胞包含一種幹細胞，不是多種幹細胞和/或幹細胞與體細胞的混合，需經過嚴格的協力廠商品質檢測和實驗室檢測，包括細胞活力、生物學功能、致瘤性、致栓塞性、免疫原性、微生物、支原體、內毒素等檢測，與幹細胞的安全性、有效性、一致性密切相關。品質合格的幹細胞，在移植前還需進行放行檢測，進一步對微生物、支原體和內毒素進行符合檢驗，以免在移植過程中或移植後出現急性或亞急性嚴重不良反應，如發熱、過敏、細菌性血症等。
如上下文所述，“幹細胞質量相關的特徵基因”是指決定幹細胞質量類別的基因，這些基因一旦表現升高，幹細胞的品質風險將升高或降低。
如上下文所述，“表現量”是指基因的表現水準。
如上下文所述，“幹細胞質量評分”是指根據特徵基因的表現量和幹細胞質量預測模型確定的每個特徵基因的權重係數，根據以下計算公式計算得到的分數；
其中， Gi為第 i個特徵基因的表現量， Wi為第 i個特徵基因的權重係數， n為特徵基因的數量。
如上下文所述，“基因表現量”指細胞中具體基因的表現量，採用分子生物學領域常規的方法測量。例如，包括固定在DNA晶片板表面的探測核酸之間的以螢光強度形式測定的雜交水準值(測量資料)，基於數值獲得的基因表現量估計值，等等。
如上下文所述，“特定品質屬性”是指採用亞群聚類方法確定的單個幹細胞的亞群聚類結果，即“品質風險幹細胞”或“非品質風險幹細胞”。
如上下文所述，“通路富集分數矩陣”的行代表一個通路在不同幹細胞中的表現情況、列代表不同幹細胞對所有代謝通路的表現情況、每個格子的資料代表特定的通路在特定的幹細胞中的表現情況；資料分析方法（包括監督和未監督的資料分析以及生物資訊學方法）在Brazma和ViIo J，2000，FEBS Lett 480（1）:17-24中披露。
如上下文所述，“通路”可以是與幹細胞功能相關的任何通路，例如發育信號通路如Notch、WNT、Hedgehog、Hippo、NANOG通路，致癌信號通路如NF-κB、MAPK、PI3K、EGFR等等。本發明所屬領域中具有通常知識者知曉與幹細胞功能相關的細胞通路的設計。本發明的通路可以是與幹細胞致瘤性、免疫原性相關的任何通路。較佳的通路包括纖維蛋白凝塊形成內在通路、纖維蛋白凝塊形成外在通路和纖維蛋白凝塊-凝血級聯反應形成通路。
在下述實施例中描述了與幹細胞質量密切相關的幹細胞致栓塞風險的實例，本發明所屬領域中具有通常知識者理解，基於本發明的公開，使用基本相同的方法和手段，對於幹細胞致瘤性、免疫原性都可以作出相同的鑒別。例如，與致瘤性相關的幹細胞質量相關的特徵基因可以是： c-myc；與免疫原性相關的特徵基因可以是： dnam-1、 mcp-1。
幹細胞的致栓塞風險是最典型的幹細胞應用風險，是影響幹細胞製劑品質的最重要的因素之一，近20年來已報導多例臨床病例在接受幹細胞治療後發生栓塞併發症（Woodard, J. P. et al. Pulmonary cytolytic thrombi: a newly recognized complication of stem cell transplantation. Bone Marrow Transpl 25, 293-300 (2000).；Tatsumi, K. et al. Tissue factor triggers procoagulation in transplanted mesenchymal stem cells leading to thromboembolism. Biochem Biophys Res Commun 431, 203-209 (2013).），這說明本發明所屬領域中具有通常知識者理解對該風險的評價可以用來評價幹細胞製劑的品質。
實施例1 脂肪間充質基質細胞的獲取和培養
一、脂肪間充質基質細胞的獲取
①   脂肪組織的採集
在無菌環境下，收集供者1（愛滋病病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、人類嗜T細胞病毒、EB病毒、巨細胞病毒和梅毒螺旋體均檢測陰性）的脂肪組織；
取50~150 mL脂肪組織到預加入100 mL組織保存液（購自天津市灝洋生物製品科技有限責任公司）的封閉容器中，2~8℃恒溫保存備用；
用移液管吸取30 mL組織保存液，檢測確定無細菌、內毒素和支原體污染後，進行人脂肪間充質基質細胞（human adipose-derived stromal cells，hADSCs）的分離培養。
②   脂肪間充質基質細胞的分離
向脂肪組織中加入等體積的dPBS，封閉裝有組織的容器，劇烈晃動20 s並靜置5 min，待脂肪組織與dPBS完全分層後，吸棄組織下層液體，使用dPBS重複漂洗脂肪組織，直至下層液體無明顯紅色；
將洗滌後的脂肪組織按照每20 mL添加至50 mL離心管中進行分裝，加入等體積的dPBS，400 g離心5 min，分為上層油脂層、中層脂肪組織層、下層dPBS和血細胞沉澱，去除上層油脂層、下層dPBS和血細胞沉澱；
向脂肪組織中加入兩倍體積的1 mg/mL Ⅰ型膠原酶（消化液），封閉裝有組織的容器，轉移至37℃預熱的恒溫空氣搖床中120 rpm/min消化1 h。
③   脂肪間充質基質細胞的收集
將消化完成後的組織於室溫500 g離心8 min，離心後分為上層油脂層、中層脂肪組織層、下層消化液和底層細胞沉澱，吸棄上層油脂層、中層脂肪組織層和下層消化液，用dPBS重懸底層細胞沉澱，並用100 μm篩網過濾至50 mL離心管中，500 g離心5 min，去除上清液，得到含有P0代脂肪間充質基質細胞的細胞沉澱；
向離心管中加入與脂肪組織等體積的完全培養基，混合均勻使消化的細胞充分游離於完全培養基中，得到含有P0代脂肪間充質基質細胞的細胞懸液。
二、脂肪間充質基質細胞的培養
脂肪間充質基質細胞的培養增殖過程採用不同的培養基M1（αMEM+10% FBS，αMEM購自賽默飛世爾，FBS購自依科賽生物）或M2（DMEM/F-12+5% Helios UltraGRO-Advanced，DMEM/F-12購自賽默飛世爾，Helios UltraGRO-Advanced購自Helios BioScience），具體步驟如下：
①   原代培養
將細胞沉澱重懸於與脂肪組織等體積的M1培養基或M2培養基中，取1.5 mL細胞懸液接種於預先加入8.5 mL M1培養基/M2培養基的T75細胞培養瓶中；
將T75細胞培養瓶貼標籤後轉移至細胞培養箱中，37℃、5%CO 2條件下培養，24 h後脂肪間充質基質細胞已基本貼壁，去除上清液並加10 mL M1培養基/M2培養基，此後每隔三天換液一次。
顯微鏡下觀察發現，獲得的原代細胞中除了P0代脂肪間充質基質細胞還存在許多雜細胞和基質成分，脂肪間充質基質細胞呈典型的長梭形。
②   傳代培養
待P0代細胞匯合度達50%~70%，去除培養基，加入10 mL dPBS清洗一次並去除清洗液，再加入1.5 mL消化液Tryple™-Express（1×）消化1~2 min，待大部分細胞變圓脫落，輕輕拍打培養瓶後加入4.5 mL dPBS終止消化；
收集終止後的液體於50 mL離心管中，加入10 mL dPBS清洗一次，400 g離心5 min，上層為消化液和dPBS的混合液，下層白色沉澱即為含有P0代脂肪間充質基質細胞的沉澱，去除上清液，將多個離心管中的白色沉澱收集在一個離心管中，加入M1培養基/M2培養基重懸細胞，定容至30 mL，吹打混勻細胞懸液，取樣進行細胞計數；
細胞計數後400 g離心5 min，去除上清液，加入M1培養基/M2培養基重懸細胞，吹打混勻，定容後接種於細胞培養瓶中，使傳代細胞密度為5000~6000個/cm 2；
在細胞培養瓶上標記細胞批次、代數和培養時間等資訊，置於細胞培養箱中培養，待細胞匯合度達90%左右時，再次傳代，收集P3代和P5代細胞，凍存建立工作細胞庫，分別命名為D1M1-P3（表示來源於供者1的原代脂肪間充質基質細胞在M1培養基中傳代培養至P3代獲得的脂肪間充質基質細胞）、D1M2-P3（表示來源於供者1的原代脂肪間充質基質細胞在M2培養基中傳代培養至P3代獲得的脂肪間充質基質細胞）、D1M1-P5（表示來源於供者1的原代脂肪間充質基質細胞在M1培養基中傳代培養至P5代獲得的脂肪間充質基質細胞）、D1M2-P5（表示來源於供者1的原代脂肪間充質基質細胞在M2培養基中傳代培養至P5代獲得的脂肪間充質基質細胞）。
實施例2 脂肪間充質基質細胞的常規質檢
本實施例中，將凍存的細胞樣品在37℃水浴中快速解凍，隨後重懸於預熱的dPBS中，400g離心5 min，並用dPBS清洗兩次。最後，對脂肪間充質基質細胞（D1M1-P3、D1M2-P3、D1 M1-P5、D1M2-P5）進行計數並用於品質控制。
一、微生物學安全檢測
①   無菌檢測
檢測步驟詳見《中華人民共和國藥典2020年版》（第四部）通則1101 無菌檢查法，簡述如下：
預先採用100 mL 0.9%氯化鈉注射液（購自石家莊四藥有限公司）過濾潤濕一次性三聯集菌器（購自浙江泰林生物技術股份有限公司）的濾膜，隨後將脂肪間充質基質細胞樣品導入集菌器進行過濾，過濾後採用300 mL 0.9%氯化鈉注射液沖洗濾膜2次；
向裝有樣品的三聯集菌器的其中兩個培養器中加入100 mL硫乙醇酸鹽流體培養基（用於檢測厭氧菌和需氧菌），另一培養器中加入100 mL胰酪大豆腖液體培養基（用於檢測真菌和需氧菌）；
以0.9%氯化鈉注射液代替幹細胞樣品作為陰性對照，以金黃色葡萄球菌（加菌量小於100 CFU）作為陽性對照；
將接種後的各實驗組輕輕搖動，每個實驗組選擇一個裝有硫乙醇酸鹽流體培養基的培養器置於30~35℃培養，其餘培養器置於20~25℃培養，共培養14天，培養期間每個工作日觀察並記錄是否有菌生長。
②   支原體檢測
檢測步驟詳見《中華人民共和國藥典2020年版》（第四部）通則3301 支原體檢查法，簡述如下：
按照常規配方配製支原體肉湯培養基、含精氨酸支原體肉湯培養基、支原體半流體培養基和含精氨酸支原體半流體培養基並滅菌，用1 mL 0.9%氯化鈉注射液複溶80萬單位注射用青黴素鈉（購自江西東風藥業股份有限公司），備用；向滅菌後的每800 mL培養基中添加200 mL胎牛血清和80萬單位注射用青黴素鈉，混勻後置於2~8℃儲存；
取每支裝量為10 mL的支原體肉湯培養基4支、含精氨酸支原體肉湯培養基4支、支原體半流體培養基2支、含精氨酸支原體半流體培養基2支，接種幹細胞樣品1.0 mL，置於36℃±1℃培養21天，每隔3天觀察1次；
接種後的第7天，取2支接種有幹細胞樣品的支原體肉湯培養基和2支接種有幹細胞樣品的含精氨酸支原體肉湯培養基進行次代培養；每支支原體肉湯培養基分別轉種至2支支原體半流體培養基和2支支原體肉湯培養基中，每支含精氨酸支原體肉湯培養基分別轉種至2支含精氨酸支原體半流體培養基和2支含精氨酸支原體肉湯培養基，每支培養基的接種量為1 mL，置於36℃±1℃培養21天，每隔3~5天觀察1次。
③   內毒素檢測
檢測步驟詳見《中華人民共和國藥典2020年版》（第四部）通則1143 細菌內毒素檢查法，簡述如下：
用1 mL內毒素檢查用水（購自湛江安度斯生物有限公司）複溶內毒素工作標準品（購自湛江安度斯生物有限公司），渦旋振盪器混勻15 min後進行梯度稀釋，每一步稀釋均採用漩渦振盪器混勻30 s，最終稀釋成4λ以及2λ內毒素標準品溶液；
取細胞凍存液置於37℃水浴鍋快速融化後，1200 rpm離心5 min，取上清液加入內毒素檢查用水進行梯度稀釋，每一步稀釋均採用漩渦振盪器混勻30 s，稀釋倍數不超過最大有效濃度稀釋倍數（MVD），作為幹細胞樣品檢測溶液；最大有效濃度稀釋倍數（MVD）按照公式MVD=C*L/λ計算，其中L為幹細胞樣品的內毒素限值、C為幹細胞樣品檢測溶液的濃度、λ為鱟試劑的標示靈敏度；
另取幹細胞樣品檢測溶液按體積比為1:1加入4λ內毒素標準品溶液，漩渦振盪器混勻30 s，作為幹細胞樣品的內毒素陽性對照液；
分別用0.1 mL內毒素檢查用水複溶8支鱟試劑（購自湛江安度斯生物有限公司）；向2支鱟試劑中加入0.1 mL幹細胞樣品的內毒素陽性對照液，作為平行設置的幹細胞樣品陽性對照管（PPC）；向2支鱟試劑中加入0.1 mL 2λ內毒素標準品溶液，作為平行設置的陽性對照管（PC）；向2支鱟試劑中加入0.1 mL內毒素檢查用水，作為平行設置的陰性對照管（NC）；向2支鱟試劑中加入0.1 mL稀釋倍數不超過MVD的幹細胞樣品檢測溶液，作為平行設置的幹細胞樣品檢測管；
將提前預熱的細菌內毒素凝膠法測定儀的反應孔罩打開，放入反應管，開始倒計時60 min，在60 min結束前的1 min取出反應中的反應管，觀察記錄結果。
結果如表1所示，14天後，裝有幹細胞樣品的集菌器無菌生長，D1M1-P3、D1M2-P3、D1M1-P5、D1M2-P5的無菌檢測結果合格；D1M1-P3、D1M2-P3、D1M1-P5、D1M2-P5的支原體檢測呈陰性，檢測結果合格；D1M1-P3、D1M2-P3、D1M1-P5、D1M2-P5的內毒素檢測呈陰性，檢測結果合格。 [表1]
間充質基質細胞樣品名稱 無菌檢測 支原體檢測 內毒素檢測
D1M1-P3 陰性 陰性 陰性
D1M2-P3 陰性 陰性 陰性
D1M1-P5 陰性 陰性 陰性
D1M2-P5 陰性 陰性 陰性
二、細胞標誌物檢測
檢測D1M1-P3、D1M2-P3、D1M1-P5、D1M2-P5對間充質幹細胞特異性表面標誌物CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR的表現情況（參考文獻M. Dominici等，Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy (2006) Vol. 8, No. 4, 315-317），步驟如下：
向生長狀態良好的間充質基質細胞中加入Tryple™-Express（1×），37℃消化2~3 min，加入3倍Tryple™-Express（1×）體積以上的PBS（1×）終止消化，緩慢沖洗使細胞脫落、鬆散成為單個細胞；吸取細胞懸液至50 mL離心管中，300 g離心5 min；棄上清液，加入1×PBS重懸細胞，300 g離心5 min；棄上清液，加入1 mL 1×PBS重懸細胞，備用。
調節細胞濃度至活細胞密度為(0.5~1)×10 7個細胞/mL，吸取100 μL細胞懸液加入流式管中，隨後分別加入5 μL FITC標記抗人CD34抗體、FITC標記抗人CD45抗體、FITC標記抗人CD11b抗體、FITC標記抗人HLA-DR抗體、FITC標記抗人CD73抗體、FITC標記抗人CD90抗體、APC標記抗人CD19抗體和PE標記抗CD105抗體，並設置對照組分別加入FITC標記鼠源IgG1、APC標記鼠源IgG1和PE標記鼠源IgG1，旋渦振盪使細胞懸液與抗體混勻，避光溫育15 min。
向每管中加入2 mL鞘液，旋渦振盪，300 g離心5 min棄上清液，加入300 μL含1%多聚甲醛的PBS緩衝液重懸細胞，進行流式檢測。
結果如表2所示，D1M1-P3、D1M2-P3、D1M1-P5、D1M2-P5對間充質幹細胞表面陽性標誌物CD73、CD90、CD105的表現率高於95%，對間充質幹細胞陰性標誌物CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR的表現率低於2%。 [表2]
間充質基質細胞樣品名稱 陽性標誌物表現率 陰性標誌物表現率
CD73 CD90 CD105 CD11b CD19 CD34 CD45 HLA-DR
D1M1-P3 98.02% 99.86% 99.68% 0.37% 0.12% 0.45% 0.72% 0.28%
D1M2-P3 99.05% 99.76% 99.58% 0.23% 0.06% 0.07% 0.03% 0.10%
D1M1-P5 98.08% 99.93% 99.94% 0.34% 0.00% 1.21% 0.60% 0.07%
D1M2-P5 97.79% 99.28% 99.50% 0.10% 0.08% 0.04% 0.09% 0.10%
三、細胞活性檢測
①   細胞活率檢測
利用0.9%氯化鈉注射液稀釋幹細胞懸液，與0.4%台盼藍染液按體積比為9:1充分混勻；吸取10 μL混合液至一次性計數板的計數池中，置於10倍物鏡下觀察，分別記錄四個方格中的活細胞總數和死細胞總數，按照以下公式計算細胞活率。 活細胞率（%）=活細胞總數/(活細胞總數+死細胞總數)×100%
結果發現，D1M1-P3、D1M2-P3、D1M1-P5、D1M2-P5的活細胞率均達到80%以上。
②   生長動力學檢測
待P5代間充質基質細胞匯合度達到80%~90%時，使用Tryple™-Express（1×）消化貼壁細胞，製備幹細胞懸液並進行細胞計數；使用培養基將幹細胞懸液的密度分別調整至3.2×10 5個/mL、1.6×10 5個/mL、0.8×10 5個/mL、0.4×10 5個/mL、0.2×10 5個/mL、0.1×10 5個/mL，按100 μL/孔接種於96孔細胞培養板中；空白對照孔加入100 μL完全培養基，各個組均設置6個複孔，37℃、5% CO 2培養4小時；
按DMEM/F12培養基（無酚紅）:CCK8（v/v）=100:10的比例配製檢測試劑，充分混勻；吸棄各孔的培養液，按110 μL/孔加入上述檢測試劑，37℃、5% CO 2溫育2小時；
將樣品置於酶標儀中，檢測450 nm波長處的吸光度OD450，計算不同細胞接種密度孔的吸光度平均值，扣除空白對照孔的吸光度平均值，得到不同細胞接種密度孔的吸光度淨值ΔOD450；以ΔOD450為橫坐標、對應細胞接種數量為縱坐標，擬合線性回歸曲線。
使用培養基將細胞懸液的密度調整至0.1×10 5個/mL，按100 μL/孔接種於96孔細胞培養板中，並設置僅添加100 μL完全培養基的空白對照孔，各個組均設置6個複孔，重複鋪板8塊；
每天取出1板，吸棄樣品孔和空白對照孔的培養液，按110 μL/孔加入檢測試劑（DMEM/F12培養基（無酚紅）:CCK8（v/v）=100:10），37℃、5% CO 2溫育2小時；
將樣品置於酶標儀中，檢測450 nm波長處的吸光度OD450，計算幹細胞樣品的吸光度淨值ΔOD450；連續檢測8天，將ΔOD450代入標準曲線方程，計算每天的細胞數量；以增殖天數為橫坐標、每天的細胞數量為縱坐標，繪製人源脂肪間充質基質細胞的生長曲線，並計算群體倍增時間。
如圖1A和圖1B所示分別為D1M1-P5和D1M2-P5的生長曲線，脂肪間充質基質細胞在培養3天後進入對數生長期，6天後進入平臺期，7天後細胞增殖能力開始下降；D1M1-P5的群體倍增時間為37.5小時，D1M2-P5的群體倍增時間為21.9小時。
③   細胞週期檢測
向生長狀態良好的P5代脂肪間充質基質細胞中加入Tryple™-Express（1×），37℃消化2~3 min，將脫落的細胞置於離心管中，1000 rpm離心3~5 min，小心吸棄上清液；加入1 mL預冷的冰PBS重懸細胞，再次離心沉澱細胞，小心吸棄上清液；加入1 mL預冷的冰PBS重懸細胞。
取4 mL預冷的冰95%乙醇進行低速渦旋震盪，同時逐滴加入1 mL細胞懸液（冰上操作），混勻後4℃固定2小時或更長時間；1000 rpm離心3~5 min，小心吸棄上清液；加入5 mL預冷的冰PBS重懸細胞，再次離心沉澱細胞，小心吸棄上清液，輕輕彈擊離心管底部，適當分散細胞，避免細胞成團。
參考表3，利用細胞週期與細胞凋亡檢測試劑盒（購自四正柏生物），根據待檢測樣品的數量配製碘化吡啶染色液；隨後向幹細胞樣品中加入0.4 mL碘化吡啶染色液，緩慢並充分重懸細胞沉澱，37℃避光溫浴30 min，24小時內完成流式檢測。 [表3]
試劑 1個樣品 6個樣品 12個樣品
染色緩衝液 0.4 mL 2.4 mL 4.8 mL
碘化吡啶染色液（25×） 15 μL 90 μL 180 μL
RNase A（2.5 mg/mL） 4 μL 24 μL 48 μL
如圖1C和圖1D所示為細胞週期流式細胞儀匯出結果，可以看出，處於G1期、S期和G2期的D1M1-P5的比例分別為85.69%、12.56%和1.75%，處於G1期、S期和G2期的D1M2-P5的比例分別為89.07%、6.42%和4.51%。
④   細胞凋亡檢測
向生長狀態良好的P5代脂肪間充質基質細胞中加入Tryple™-Express（1×），37℃消化2~3 min，將脫落的細胞置於離心管中，在1000 rpm下離心3~5 min，小心吸棄上清液；加入0.8 mL 1×Binding Buffer緩衝液（購自四正柏生物）重懸細胞，備用；
取4支流式管分別標記空白管、Annexin-V-FITC管、PI管、幹細胞樣品管，向每支流式管中加入200 μL、密度(2~5)×10 5/mL的幹細胞樣品，並向Annexin-V-FITC管、幹細胞樣品管加入5 μL Annexin-V-FITC，避光溫育10 min；離心後重懸幹細胞，每管加入200 μL binding buffer緩衝液；上機檢測前向PI管加入5 μL PI染料。
結果如圖1E和圖1F所示，D1M1-P5的細胞生存率為92.0%、細胞凋亡率為5.75%，D1M2-P5的細胞生存率為91.4%、細胞凋亡率為0.52%。
四、生物學活性分析
①   成脂肪誘導分化檢測
在實驗開始前，根據OriCell成人脂肪間充質幹細胞成脂誘導分化試劑盒（購自賽業生物科技有限公司）使用說明配製A液和B液，隨後進行以下步驟：
按照2×10 4個/cm 2的細胞密度將細胞接種於六孔板中，每孔加入2 mL完全培養基，於37℃、5% CO 2中培養至細胞匯合度達100%；
吸棄培養基，每孔加入2 mL A液，誘導3天後，更換為2 mL B液，24小時後更換為A液；A液和B液交替作用3次後，繼續使用B液維持培養4~7天，直到脂滴變得足夠大而圓；B液維持培養期間，每隔2~3天換用新鮮的B液；
使用油紅O染色分析，觀察鏡下的紅色脂滴。
②   成骨誘導分化檢測
在實驗開始前，根據OriCell成人脂肪間充質幹細胞成骨誘導分化試劑盒（購自賽業生物科技有限公司）使用說明配製誘導培養基，隨後進行以下步驟：
按照2×10 4個/cm 2的細胞密度將細胞接種於六孔板中，每孔加入2 mL完全培養基，於37℃、5% CO 2中培養至細胞匯合度達80~90%；
吸棄培養基，每孔加入2 mL誘導培養基，每隔3天換液，誘導2~4周後，觀察細胞的形態變化和生長情況；使用茜素紅染色分析，觀察鏡下的紅色鈣結節。
③   成軟骨誘導分化檢測
在實驗開始前，根據OriCell成人脂肪間充質幹細胞成軟骨誘導分化試劑盒（購自賽業生物科技有限公司）使用說明配製成軟骨誘導分化完全培養基，隨後進行以下步驟：
將0.1%明膠加入到6孔培養板中，輕搖能覆蓋孔底，靜置30 min，棄去明膠，待培養板晾乾；將生長狀態良好的P5代脂肪間充質基質細胞按1×10 4個/cm 2細胞密度接至6孔培養板，每孔加入2 mL完全培養基，置於37℃、5% CO 2條件下培養，直至細胞匯合度達到80~90%；誘導孔吸去培養上清液，每隔2~3天向每孔換用新鮮的2 mL成軟骨誘導分化完全培養基和20 μL TGF-β3，置於37℃、5% CO 2條件下繼續誘導培養；對照孔使用完全培養基連續培養。持續誘導14天以上，對細胞進行固定和阿利辛藍染色，顯微鏡下觀察阿利辛藍染色效果。
如圖1G和圖1H所示為脂肪間充質基質細胞在體外培養環境中的分化情況，脂肪間充質基質細胞被定向誘導發生成脂肪分化、成骨分化和成軟骨分化，從油紅O染色結果、茜素紅染色結果和阿利辛藍染色結果可以看出，D1M1-P5和D1M2-P5分別被成功誘導為成脂肪細胞、成骨細胞和成軟骨細胞。
綜合以上質檢結果，說明在不同培養基下培養的P3和P5代幹細胞均為脂肪來源的間充質基質細胞，符合間充質幹細胞基本細胞生物學屬性要求。
實施例3 脂肪間充質基質細胞的異質性檢測
一、脂肪間充質基質細胞的動物體內回輸
取6~8周雄性NCG小鼠（購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司）隨機分組並標號，使用固定器固定小鼠，對小鼠的注射部位進行消毒後，向小鼠尾靜脈緩慢回輸實施例1製備的常規質檢合格的D1M1-P5或D1M2-P5懸液，每只小鼠回輸的劑量為1×10 6個細胞/只，同時設置回輸生理鹽水的對照組；
細胞回輸完畢後，立即將小鼠放入乾淨的籠內錄影觀察，記錄3 min內小鼠的生存情況。觀察發現，回輸D1M1-P5的6只小鼠在3 min內全部死亡，回輸D1M2-P5的6只小鼠和回輸生理鹽水的6只小鼠在3 min內全部存活。3 min觀察完畢後，使用頸椎脫臼法處死並取材組織器官。
二、免疫組化檢測
1、取材
剪開小鼠的皮膚和肌肉組織使胸腔暴露，用眼科剪在右心耳剪一小口，用注射器紮入右心室緩慢行全身灌注5 mL 0.9%生理鹽水，直至流出的液體無明顯血色且較為澄清，開始進行小鼠的肺取材；
打開胸腔，剪斷與肺相連的血管、氣管，取出全肺，用生理鹽水清洗表面血跡並用紗布擦淨肺表面的血液和體液，觀察肺的大體形態特徵。
2、HE染色分析
採用常規方法將取材的肺組織進行石蠟包埋、切片，進行HE染色，置於光學顯微鏡下觀察並採圖。
如圖2A所示為D1M1-P5、D1M2-P5或生理鹽水回輸小鼠體內後，肺組織的病理學檢測結果，與對照組相比，D1M1-P5回輸小鼠體內後，肺部充血明顯，發生嚴重的肺栓塞，而D1M2-P5回輸小鼠體內後，並未發現明顯的肺部充血現象，也未發生肺栓塞。從圖2B的肺栓塞密度也可以看出，回輸D1M1-P5的小鼠肺部出現大量的靜脈血栓，栓塞密度遠高於D1M2-P5組和對照組。
進一步採用螢光PKH26標記的D1M1-P5或D1M2-P5回輸入小鼠肺組織，進行免疫螢光染色，檢測血栓形成。
結果如圖2C和圖2D所示，與免疫組化結果一致，在形成血栓的小鼠肺部觀察到大量的PKH26+ D1M1-P5，說明幹細胞在不同的培養基下進行傳代培養，發生異質性變化。
實施例4 單細胞RNA測序
為探索幹細胞在不同培養基中發生的異質性變化，本實施例採用單細胞RNA測序技術在單細胞水準檢測幹細胞的基因表現圖譜，步驟如下：
一、單細胞懸液的製備
利用樣本緩衝液將實施例1製備的處於對數生長期的脂肪間充質基質細胞D1M1-P5和D1M2-P5稀釋至濃度＜1000個/μL的細胞懸液；取200 μL細胞懸液，加入1 μL Calcein AM染料和1 μL Draq7染料進行細胞染色；
利用40 μm濾膜對染色的細胞懸液進行過濾後，加入到細胞計數器中，置於細胞分析儀（購自BD Rhapsody）中計算細胞濃度和細胞活率；
根據細胞濃度和細胞裝載量稀釋細胞懸液。
二、單細胞分選
將稀釋的細胞懸液添加至BD Cartridge單細胞分選平板（購自BD Biosciences，Cat: 633733）中，放入細胞分析儀，計算細胞裝載量和雙細胞率，評估單細胞的分離效果；
用緩衝液清洗未裝載的細胞懸液，將捕獲磁珠添加至BD Cartridge單細胞分選平板中，放入細胞分析儀中，計算捕獲磁珠與細胞的共同裝載量和雙細胞率，評估捕獲磁珠結合到單細胞孔內的數量；
清洗多餘的捕獲磁珠，將細胞裂解液添加至BD Cartridge單細胞分選平板中進行細胞裂解，使mRNA連接在捕獲磁珠表面的探針上；將捕獲磁珠從BD Cartridge單細胞分選平板中回收至離心管中。
三、單細胞cDNA合成和文庫構建
單細胞cDNA合成和文庫構建使用購自BD Biosciences的試劑盒，具體為單細胞cDNA合成試劑盒（購自BD Biosciences, Cat: 633731）、文庫構建試劑盒（購自BD Biosciences, Cat: 633801）。根據試劑盒中的說明書進行下述操作，簡述如下：
清洗回收的捕獲磁珠，加入逆轉錄試劑（表4）與捕獲磁珠混合均勻，37℃溫育45 min； [表4]
組分 1個反應體系加入量（μL）
反轉錄緩衝液 40
dNTPs（10 mM） 20
二硫蘇糖醇（DTT，0.1 M） 10
附加物（Bead RT/PCR Enhancer） 12
RNA酶抑制劑 10
反轉錄酶 10
無核酸酶水 98
加入核酸外切酶，37℃溫育30 min、80℃溫育20 min，去除捕獲磁珠表面未連接mRNA的探針；
加入隨機引子反應混合液（表5），95℃溫育5 min、1200 rpm 37℃溫育5 min、1200 rpm 25℃溫育15 min；加入引子延伸反應混合液（表6），1200 rpm 25℃溫育10 min、1200 rpm 37℃溫育15 min、1200 rpm 45℃溫育10 min、1200 rpm 55℃溫育10 min，將擴增出的單鏈DNA進行洗脫液洗脫； [表5]
組分 1個反應體系加入量（μL）
延伸緩衝液（WTA Extension Buffer） 20
隨機引子（WTA Extension Primers） 20
無核酸酶水 134
[表6]
組分 1個反應體系加入量（μL）
dNTPs（10 mM） 8
附加物（Bead RT/PCR Enhancer） 12
延伸酶（WTA Extension Enzyme） 6
加入含通用引子和特異性引子的隨機引子延伸產物PCR擴增混合液（表7），按照表8的程式進行PCR擴增反應，富集隨機引子擴增產物，並進行產物純化； [表7]
組分 1個反應體系加入量（μL）
PCR緩衝液 60
通用引子（Universal Oligo） 10
特異性引子（WTA Amplification Primer） 10
[表8]
步驟 迴圈數 溫度（℃） 時間
暖開機 1 95 3 min
變性 13 95 30 s
退火 60 1 min
延伸 72 1 min
終延伸 1 72 2 min
保持 1 4 ∞
加入全轉錄組Index PCR擴增混合液（表9），按照表10的反應程式進行PCR擴增反應（隨機引子擴增產物摩爾濃度為1~2 nM時擴增9個迴圈，隨機引子擴增產物摩爾濃度＞2 nM時擴增8個迴圈），富集擴增產物並進行產物純化，得到單細胞文庫。 [表9]
組分 1個反應體系加入量（μL）
PCR緩衝液 25
建庫上游引子（Library Forward Primer） 5
建庫下游引子（Library Reverse Primer） 5
無核酸酶水 5
[表10]
步驟 迴圈數 溫度（℃） 時間
暖開機 1 95 3 min
變性 8/9 95 30 s
退火 60 30 s
延伸 72 30 s
終延伸 1 72 1 min
保持 1 4 ∞
四、單細胞文庫的品質檢測
利用Qubit儀檢測單細胞文庫的濃度，利用Agilent 2100生物分析儀檢測單細胞文庫的片段長度，發現文庫濃度為0.1~100 ng/μL，文庫片段的長度約460~550 bp。
五、單細胞測序
根據單細胞文庫的濃度和片段長度計算單細胞文庫的摩爾濃度約為1~100 nM，稀釋至標準摩爾濃度0.2~2 nM後，與具有相同摩爾濃度的平衡鹼基文庫PhiX按單細胞文庫:平衡鹼基文庫=1:(0.05~0.5)的比例混合，進行上機測序。
六、測序資料品質評估
利用BD cwl-runner 3.1分析測序數據的總數據量、Q30、成簇資料量和有效簇資料量，對下機測序資料品質進行簡單評估。
對實施例1製備的5095個D1M1-P5和3249個D1M2-P5進行測序，平均測序深度達50K/細胞。
實施例5 亞群聚類
按照BD Protocol進行下述一、二步驟。將下機測序數據BCL檔轉換為FASTQ資料檔案，查看測序資料品質，進行進一步分析：
一、數據預處理
品質控制：過濾去除read1長度＜60、read2長度＜42的序列、read1和read2鹼基品質＜20的序列、以及read1的SNF≥0.55或read2的SNF≥0.80的序列；
比對注釋：將質控後的有效資料與參考基因組GRCh38進行比對，並對比對結果進行注釋；
RSEC演算法調整：通過不斷進行遞迴替換糾錯（recursive substitution error correction，RSEC）演算法，校正比對結果的UMI（Unique Molecular Index）資訊，得到單細胞基因表現矩陣。
二、細胞過濾
利用中位數絕對偏差原理（median absolute deviation，MAD），從細胞層面過濾去除離群細胞：對具有相同barcode的不同基因進行UMI（Unique Molecular Index）計數，結合分析每個細胞中檢測到的基因數和UMI，根據UMI＞中位數-MAD、基因數＞中位數-MAD、線粒體比例＜中位數+MAD的閾值標準，確定有效細胞及其數量，去除低品質細胞、死細胞或空載barcode；
從基因層面去除細胞中零表現的基因，確保每個基因在至少10個細胞中表現。
進一步通過常規方法消除細胞週期、測序深度、線粒體比例等因素對分析結果的影響。
三、降維
為獲得二維資料，採用Seurat的主成分分析（principal component analysis，PCA）方法處理零均值化表現矩陣的前2000個高變基因，進行降維處理，獲取低維空間資訊；隨後，採用uniform manifold approximation and projection（UMAP）方法處理前30個主成分（principle components，PC），實現二維空間的細胞視覺化，步驟包括：
通過NormalizeData函數（normalization.method = “LogNormalize”）進行資料歸一化處理；
通過FindVariableFeature函數（selection.method = “vst”，nfeatures = 2000）選擇基於方差值排序的前2000個基因為高變基因（highly variable genes，HVG）；
通過ScaleData函數標準化2000個高變基因，並去除細胞週期等造成的雜音；
通過RunPCA函數（features = VariableFeatures(object = adsc)）進行資料降維；
通過FindNeighbors函數的共有最鄰近相似度演算法（shared nearest neighbor，SNN）構建臨近圖；
通過FindClusters函數對SNN模型的結果進行參數調整（resolution = 0.1~1），確定細胞亞群的個數；
通過RunUMAP函數的UMAP（uniform manifold approximation and projection）演算法，進行視覺化降維分析。
如圖3A為D1M1-P5和D1M2-P5的細胞亞群聚類結果，包括6個細胞亞群0~5，各亞群在D1M1-P5和D1M2-P5中的占比存在明顯差異；進一步基於GO、KEGG挖掘幹細胞的風險基因，如圖3B和圖3C所示，各亞群對風險基因的表現也存在差異。由此說明幹細胞在不同培養基中發生了異質性改變，D1M1-P5和D1M2-P5的基因表現圖譜完全不同。
四、功能性細胞亞群聚類分析
基於單細胞基因表現矩陣，對幹細胞的全部基因進行基於通路的打分，獲得單細胞通路富集分數矩陣；隨後對單細胞通路富集分數矩陣進行降維和聚類處理，得到功能性細胞亞群聚類結果，原理示意圖如圖4所示，簡述步驟如下：
通過對單細胞的基因表現資料進行通路富集分析，分別調用ssGSEA、AUCell、Seurat三種分析軟體的打分函數計算基因富集到的每個通路在每個幹細胞中的富集分數，得到單細胞通路富集分數矩陣；
基於該單細胞通路富集分數矩陣，利用降維、共有最近鄰相似度演算法（SNN）、統一流形逼近與投影（UMAP）對單細胞進行聚類和視覺化，得到基於基因表現的幹細胞亞群聚類結果。
結果如圖5A、圖5B和圖5C所示，採用ssGSEA、AUCell、Seurat三種不同的打分函數對幹細胞進行功能性聚類，得到了一致性結果，D1M1-P5（即A2105C2P5）和D1M2-P5（即A2105C3P5）的細胞亞群聚類結果都表現出清晰的界限，D1M1-P5均為品質風險幹細胞、D1M2-P5均為非品質風險幹細胞，說明幹細胞採用不同的培養基培養後發生了明顯的功能性改變，與實施例2的結果一致。該功能性細胞亞群聚類分析方法整合了傳統的細胞亞群聚類、差異基因分析和通路富集分析，實現了快速發現細胞功能差異的效果。
根據如圖6所示的培養方式，採用M1或M2培養基將來源於供者1的脂肪間充質基質細胞從P0代傳代至P3代，隨後交換培養基進行傳代培養至P5代，利用功能性細胞亞群聚類分析方法對P3代和P5代細胞進行品質判定。
結果如圖7A、圖7B和圖7C所示，採用M1培養基培養獲得的幹細胞和採用M2培養基培養獲得的幹細胞的功能性細胞亞群聚類結果表現出明顯的差異，採用M1培養基培養獲得的幹細胞均為品質風險幹細胞，採用M2培養基培養獲得的幹細胞均為非品質風險幹細胞，M1和M2培養基使幹細胞發生了顯著的異質性改變。
圖8A和圖8B的動物實驗結果發現，D1M1-P3、D1M2/M1-P5使小鼠發生肺部栓塞，D1M2-P3、D1M1/M2-P5未使小鼠發生肺部栓塞，證實了功能性細胞亞群聚類結果的正確性。
五、幹細胞的單細胞功能分類
根據上述資料預處理、細胞過濾、降維和功能性細胞亞群聚類分析的步驟，分析D1M1-P5、D1M2-P5、D2M1-P5、D2M2-P5、D3M1-P5、D3M2-P5的單細胞RNA測序數據，獲得單細胞亞群聚類結果；
其中，D1M1-P5、D1M2-P5分別表示來源於供者1、M1或M2培養基培養至P5代的脂肪間充質基質細胞，D2M1-P5、D2M2-P5分別表示來源於供者2、M1或M2培養基培養至P5代的脂肪間充質基質細胞，D3M1-P5、D3M2-P5分別表示來源於供者3、M1或M2培養基培養至P5代的脂肪間充質基質細胞；
如圖9A和圖9B所示，利用熱圖分析方法分析不同單細胞亞群的差異表現基因，發現與促栓塞通路（纖維蛋白凝塊形成內在通路、纖維蛋白凝塊形成外在通路和纖維蛋白凝塊-凝血級聯反應形成通路）相關的差異表現基因在幹細胞亞群0和亞群3中表現升高；
進一步利用差異表現基因對亞群0和亞群3的細胞進行分群，結果如圖9C和圖9D所示，採用M1培養基培養獲得的幹細胞主要為品質風險幹細胞（亞群0），採用M2培養基培養獲得的幹細胞主要為非品質風險幹細胞（亞群0）。
實施例6 亞群識別
本實施例依據表11的資料集，基於決策樹、隨機森林或支援向量機（SVM），構建幹細胞質量預測模型，評估單細胞水準的幹細胞質量風險。原理示意圖如圖10所示，其中，D1M1-P5、D1M2-P5分別表示來源於供者1、M1或M2培養基培養至P5代的脂肪間充質基質細胞，D1M1-P3、D1M2-P3分別表示來源於供者1、M1或M2培養基培養至P3代的脂肪間充質基質細胞，D2M1-P5、D2M2-P5分別表示來源於供者2、M1或M2培養基培養至P5代的脂肪間充質基質細胞，D2M3/M2-P5表示來源於供者2、M3（αMEM+5%Helios UltraGRO-Advanced）培養基培養至P3代、隨後M2培養基培養至P5代的脂肪間充質基質細胞。 [表11]
資料集 幹細胞 基因表現資料 功能性細胞亞群聚類結果
訓練集 D1M1-P5 隨機挑選70%單細胞基因表現資料 品質風險幹細胞
D1M2-P5 隨機挑選70%單細胞基因表現資料 非品質風險幹細胞
測試集1 D1M1-P5 剩餘30%單細胞基因表現資料 品質風險幹細胞
D1M2-P5 剩餘30%單細胞基因表現資料 非品質風險幹細胞
測試集2 D1M1-P3 單細胞基因表現資料 品質風險幹細胞
D1M2-P3 單細胞基因表現資料 非品質風險幹細胞
測試集3 D2M1-P5 單細胞基因表現資料 品質風險幹細胞
D2M2-P5 單細胞基因表現資料 非品質風險幹細胞
測試集4 D2M1-P5 單細胞基因表現資料 品質風險幹細胞
D2M3/M2-P5 單細胞基因表現資料 非品質風險幹細胞
步驟如下：
一、初始超參數設置
在隨機森林模型中，估計數（n_estimator）取值為100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000，樹的最大深度（max_depth）為3、5或7；在支援向量機模型中，模型複雜度超參數C取值為0.2、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0、2.2、2.6及3.0，核參數（kemel）為線性、‘poly’、‘rbf’或‘sigmoid’。
二、特徵選擇
利用遞迴式特徵消減技術結合交叉驗證（RFECV）的機器學習方法，對訓練集的每個基因在區分品質風險幹細胞和非品質風險幹細胞上的重要性進行排序；
從重要性最高的基因開始，依次加入一個基因、計算交叉驗證準確率，確定合適的特徵基因及特徵基因數。
如圖11所示，選擇最重要的第一個基因作為特徵基因，不同超參數C的模型在訓練集上的交叉驗證準確率均達到94%以上，選擇最重要的前13個基因（TAGLN、EFEMP1、TPM1、CLU、PTX3、IER3、IGFBP7、MFAP5、IL6、LUM、SERPINE2、CRIM1和RHOB）作為特徵基因，不同超參數C的模型在訓練集上的交叉驗證準確率均達到100%。
三、訓練、測試模型
以13個重要性最高的基因為特徵，建立支援向量機，交叉驗證優化模型係數矩陣（模型權重矩陣），表示特徵基因的重要性得分；
利用測試集1、測試集2、測試集3、測試集4分別測試模型，根據預測準確性調整模型複雜度超參數C；
根據表12所示的測試結果，選擇在所有測試集上具有最高預測準確性的模型（C=0.0005），作為幹細胞質量預測模型。
表12 不同超參數的模型在訓練集和四個測試集上的預測準確率 [表12]
模型複雜度超參數C 訓練集 測試集1 測試集2 測試集3 測試集4
3 1.00 1.00 1.00 0.97 0.72
2.4 1.00 1.00 1.00 0.97 0.72
1.8 1.00 1.00 1.00 0.97 0.72
1.2 1.00 1.00 1.00 0.97 0.72
0.6 1.00 1.00 1.00 0.97 0.72
0.2 1.00 1.00 1.00 0.97 0.72
0.05 1.00 1.00 1.00 0.97 0.76
0.02 1.00 1.00 1.00 0.97 0.77
0.008 1.00 1.00 1.00 0.95 0.82
0.004 1.00 1.00 1.00 0.96 0.83
0.002 1.00 1.00 1.00 0.96 0.83
0.001 1.00 1.00 1.00 0.96 0.84
0.0005 1.00 1.00 1.00 0.97 0.84
0.0001 1.00 1.00 1.00 0.95 0.84
確定的幹細胞質量預測模型（支援向量機，模型複雜度參數C=0.0005）在不同測試集上對不同類別的幹細胞的預測結果如表13所示，在四個測試集上具有較好的預測準確率、精准率、召回率和F1得分，確定的13個特徵基因及對應的權重係數見表14。 [表13]
評估 指標 測試集1 測試集2 測試集3 測試集4
品質風險幹細胞 非品質風險幹細胞 品質風險幹細胞 非品質風險幹細胞 品質風險幹細胞 非品質風險幹細胞 品質風險幹細胞 非品質風險幹細胞
準確率 1.00 1.00 0.97 0.84
精准率 1.00 1.00 1.00 1.00 0.97 0.97 0.70 1.00
召回率 1.00 1.00 1.00 1.00 0.98 0.95 1.00 0.74
F1得分 1.00 1.00 1.00 1.00 0.97 0.96 0.83 0.85
損失值的對數 0.002 0.003 0.132 0.416
[表14]
特徵基因 權重係數
TAGLN -0.133
EFEMP1 -0.116
TPM1 -0.115
CLU 0.130
PTX3 -0.098
IER3 -0.103
IGFBP7 -0.090
MFAP5 -0.092
IL6 -0.097
LUM 0.089
SERPINE2 -0.096
CRIM1 -0.081
RHOB -0.076
四、單細胞水準的幹細胞質量評分
根據特徵基因的表現量和幹細胞質量預測模型確定的每個特徵基因的權重係數，計算單細胞水準的幹細胞質量評分，定量化單個幹細胞的品質風險，計算公式如下：
其中， Gi為第 i個特徵基因的表現量， Wi為第 i個特徵基因的權重係數， n為特徵基因的數量； Wi為正值表示特徵基因表現升高會促進幹細胞的品質風險， Wi為負值表示特徵基因表現升高會抑制幹細胞的品質風險。
利用受試者工作特徵（ROC）曲線和曲線下面積（AUC）評估幹細胞質量評分在不同測試集中的表現以及風險評分閾值。
如圖12所示為測試集1、測試集2、測試集3、測試集4的ROC曲線和對應的AUC，以不同測試集的ROC曲線最高點的數值（具有最高的靈敏度和特異度）作為判斷該測試集的幹細胞是品質風險幹細胞或非品質風險幹細胞的閾值，可以看出，判斷測試集1的幹細胞的品質風險閾值為3.961（AUC=1），判斷測試集2的幹細胞的品質風險閾值為3.961（AUC=1），判斷測試集3的幹細胞的品質風險閾值為5.312（AUC=0.986），判斷測試集4的幹細胞的品質風險閾值為6.680（AUC=0.993），具體結果如圖13A、圖13B、圖13C和圖13D所示。
實施例7 幹細胞質量預測模型的驗證
根據幹細胞質量預測模型確定的幹細胞質量相關的特徵基因和特徵基因的權重係數（表14），本實施例檢測D1M1/M2-P5和D1M2/M1-P5在單細胞水準對特徵基因的表現量，代入幹細胞質量評分公式，計算D1M1/M2-P5和D1M2/M1-P5的每個幹細胞質量評分，並進行幹細胞質量評價，幹細胞質量風險閾值設置為3.961。
結果如圖14所示，D1M2/M1-P5中有99.90%的幹細胞為品質風險幹細胞、有0.10%的幹細胞為非品質風險幹細胞，而D1M1/M2-P5中有0.24%的幹細胞為品質風險幹細胞、有99.76%的幹細胞為非品質風險幹細胞，與圖7A、圖7B、圖7C的功能性細胞亞群聚類結果和圖8A、圖8B所示的動物實驗結果一致。說明幹細胞質量預測模型可以準確預測幹細胞的品質風險。
申請人聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的詳細方法，但本發明並不局限於上述詳細方法，即不意味著本發明必須依賴上述詳細方法才能實施。本發明所屬領域中具有通常知識者應該明瞭，對本發明的任何改進，對本發明產品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護範圍和公開範圍之內。
無
圖1A為D1M1-P5的生長動力學曲線；圖1B為D1M2-P5的生長動力學曲線；圖1C為D1M1-P5的細胞週期檢測結果；圖1D為D1M2-P5的細胞週期檢測結果；圖1E為D1M1-P5的細胞凋亡檢測結果；圖1F為D1M2-P5的細胞凋亡檢測結果；圖1G為D1M1-P5的成脂肪分化、成骨分化和成軟骨分化結果；圖1H為D1M2-P5的成脂肪分化、成骨分化和成軟骨分化； 圖2A為D1M1-P5、D1M2-P5、生理鹽水回輸小鼠後的肺組織和HE染色結果，黑色箭頭表示靜脈血栓；圖2B為每10×倍視野下的小鼠肺組織的栓塞密度統計結果，*p ＜0.05；圖2C為D1M1-P5、D1M2-P5或生理鹽水回輸小鼠後的肺組織免疫螢光結果；圖2D為每10×倍視野下的PKH26+細胞數量； 圖3A為D1M1-P5、D1M2-P5的單細胞測序亞群聚類結果，其中0、1、2、3、4、5分別代表不同的幹細胞亞群；圖3B為基於GO-BP資料庫，不同幹細胞亞群對風險基因的表現，其中C0、C1、C2、C3、C4、C5（對應於圖3A的幹細胞亞群0、1、2、3、4、5）分別代表不同的幹細胞亞群；圖3C為基於KEGG資料庫，不同幹細胞亞群對風險基因的表現，其中C0、C1、C2、C3、C4、C5（對應於圖3A的幹細胞亞群0、1、2、3、4、5）分別代表不同的幹細胞亞群； 圖4為功能性細胞亞群聚類方法原理示意圖； 圖5A為利用ssGSEA打分函數獲得的功能性細胞亞群聚類結果，A2105C2P5（即D1M1-P5）均為品質風險幹細胞、A2105C3P5（即D1M2-P5）均為非品質風險幹細胞；圖5B為利用AUCell打分函數獲得的功能性細胞亞群聚類結果，A2105C2P5（即D1M1-P5）均為品質風險幹細胞、A2105C3P5（即D1M2-P5）均為非品質風險幹細胞；圖5C為利用Seurat打分函數獲得的功能性細胞亞群聚類結果，A2105C2P5（即D1M1-P5）均為品質風險幹細胞、A2105C3P5（即D1M2-P5）均為非品質風險幹細胞； 圖6為幹細胞交叉培養示意圖； 圖7A為利用ssGSEA打分函數獲得的功能性細胞亞群聚類結果，D1M1-P3、D1M1-P5、D1M2/M1-P5均為品質風險幹細胞、D1M2-P3、D1M2-P5、D1M1/M2-P5均為非品質風險幹細胞；圖7B為利用AUCell打分函數獲得的功能性細胞亞群聚類結果，D1M1-P3、D1M1-P5、D1M2/M1-P5均為品質風險幹細胞、D1M2-P3、D1M2-P5、D1M1/M2-P5均為非品質風險幹細胞；圖7C為利用Seurat打分函數獲得的功能性細胞亞群聚類結果，D1M1-P3、D1M1-P5、D1M2/M1-P5均為品質風險幹細胞、D1M2-P3、D1M2-P5、D1M1/M2-P5均為非品質風險幹細胞； 圖8A為D1M1-P3、D1M2-P3、D1M2/M1-P5、D1M2/M1-P5或生理鹽水回輸小鼠後的肺組織和HE染色結果，黑色箭頭表示靜脈血栓；圖8B為每10×倍視野下的小鼠肺組織的栓塞密度統計結果，*p ＜0.05； 圖9A為利用熱圖分析方法分析M1培養基培養獲得的幹細胞，其不同單細胞亞群的差異表現基因的結果圖；圖9B為利用熱圖分析方法分析M2培養基培養獲得的幹細胞，其不同單細胞亞群的差異表現基因的結果圖；圖9C為M1培養基培養獲得的幹細胞的單細胞功能分類結果，其中，0代表品質風險幹細胞、1代表非品質風險幹細胞；圖9D為M2培養基培養獲得的幹細胞的單細胞功能分類結果，其中，0代表非品質風險幹細胞、1代表品質風險幹細胞； 圖10為開發幹細胞質量預測模型的原理示意圖； 圖11為利用遞迴式特徵消減技術結合交叉驗證確定特徵基因數量的結果圖，其中，M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8分別表示具有不同模型複雜度超參數C和決策函數的模型； 圖12為利用受試者工作特徵（ROC）曲線和曲線下面積（AUC）評估品質評分在不同測試集中的表現以及風險評分閾值； 圖13A為測試集1的幹細胞質量評分分佈；圖13B為測試集2的幹細胞質量評分分佈；圖13C為測試集3的幹細胞質量評分分佈；圖13D為測試集4的幹細胞質量評分分佈； 圖14為利用幹細胞質量預測模型確定的幹細胞質量相關的特徵基因和特徵基因的權重係數對交叉培養樣本的幹細胞質量預測結果。

Claims (22)

  1. 一種幹細胞質量評價方法，其包括： 獲取一幹細胞質量相關的一特徵基因的一表現量； 根據該特徵基因的該表現量和該特徵基因的一權重係數，計算一幹細胞質量評分； 根據該幹細胞質量評分評價該幹細胞質量。
  2. 根據請求項1所述的幹細胞質量評價方法，其中該幹細胞質量相關的該特徵基因是在單細胞水準確定的幹細胞質量相關的特徵基因。
  3. 根據請求項1或2所述的幹細胞質量評價方法，其中該幹細胞質量相關的該特徵基因的確定方法包括： 獲取該幹細胞的單細胞基因表現資料和特定品質屬性，形成資料集，該資料集分為訓練集和測試集； 利用該訓練集訓練監督性機器學習模型，通過交叉驗證和測試集測試，調整監督性機器學習模型參數，確定一幹細胞質量預測模型； 根據該幹細胞質量預測模型確定該幹細胞質量相關的該特徵基因。
  4. 根據請求項1-3任一項所述的幹細胞質量評價方法，其中該特徵基因的該權重係數的確定方法包括： 根據該幹細胞質量預測模型確定該特徵基因的該權重係數。
  5. 根據請求項1-4任一項所述的幹細胞質量評價方法，其中該幹細胞的該單細胞基因表現資料的獲取方法包括： 對該幹細胞進行單細胞RNA測序，獲取該幹細胞的該單細胞基因表現資料。
  6. 根據請求項1-5任一項所述的幹細胞質量評價方法，其中該特定品質屬性的獲取方法包括： 根據該幹細胞的培養微環境確定該特定品質屬性； 根據該幹細胞的單細胞基因表觀遺傳資料確定該特定品質屬性；或 根據該幹細胞的該單細胞基因表現資料確定該特定品質屬性； 該根據該幹細胞的該單細胞基因表現資料確定該特定品質屬性包括： 對該幹細胞的該單細胞基因表現資料進行通路富集分析，計算通路在每個該幹細胞中的富集分數，獲得該幹細胞的單細胞通路富集分數矩陣； 對該幹細胞的該單細胞通路富集分數矩陣進行生物資訊分析，獲得該幹細胞的單細胞亞群聚類結果，作為該幹細胞的該特定品質屬性。
  7. 根據請求項1-6任一項所述的幹細胞質量評價方法，其中該對幹細胞的該單細胞通路富集分數矩陣進行生物資訊分析，包括： 對該幹細胞的該單細胞通路富集分數矩陣進行降維和聚類處理。
  8. 根據請求項1-7任一項所述的幹細胞質量評價方法，其中該幹細胞質量評分的計算公式為： 其中，Gi為第i個特徵基因的表現量，Wi為第i個特徵基因的權重係數，n為特徵基因的數量。
  9. 根據請求項1-8任一項所述的幹細胞質量評價方法，其中該根據該幹細胞質量評分評價幹細胞質量的方法包括： 若幹細胞質量評分≥幹細胞質量風險閾值，則該幹細胞為品質風險幹細胞； 若幹細胞質量評分＜該幹細胞質量風險閾值，則該幹細胞為非品質風險幹細胞。
  10. 根據請求項1-9任一項所述的幹細胞質量評價方法，其中該幹細胞質量風險閾值的確定方法包括： 利用受試者工作特徵曲線和曲線下面積分析資料集的幹細胞質量評分，受試者工作特徵曲線最高點的數值為該幹細胞質量風險閾值； 其中，該資料集包含帶有已知特定品質屬性標籤的幹細胞的單細胞基因表現資料。
  11. 根據請求項1-10任一項所述的幹細胞質量評價方法，其中該監督性機器學習模型包括感知機模型、K近鄰演算法、樸素貝葉斯模型、決策樹模型、邏輯回歸、支援向量機、隨機森林、提升方法模型、EM演算法或條件隨機場中的任意一種。
  12. 根據請求項1-11任一項所述的幹細胞質量評價方法，其中該幹細胞質量相關的特徵基因含有至少三種選自下列基因組的基因：TAGLN、EFEMP1、TPM1、CLU、PTX3、IER3、IGFBP7、MFAP5、IL6、LUM、SERPINE2、CRIM1和RHOB。
  13. 根據請求項1-12任一項所述的幹細胞質量評價方法，其中該幹細胞包括成體幹細胞、胚幹細胞、誘導性多能幹細胞或成熟體細胞轉化獲得的幹細胞及其衍生細胞中的任意一種或至少兩種的組合。
  14. 根據請求項1-13任一項所述的幹細胞質量評價方法，其中該幹細胞包括間充質幹細胞、間充質基質細胞、多能基質細胞、多能間充質基質細胞或藥物信號傳導細胞中的任意一種或至少兩種的組合。
  15. 根據請求項1-14任一項所述的幹細胞質量評價，其中該幹細胞包括脂肪源幹細胞、臍帶幹細胞、胎盤源幹細胞、骨髓源幹細胞、牙髓源幹細胞、宮血源幹細胞、羊膜上皮幹細胞、支氣管基底層細胞中的任意一種或至少兩種的組合。
  16. 一種幹細胞的單細胞功能分類方法，其中包括： 對該幹細胞的該單細胞基因表現資料進行通路富集分析，計算通路在每個該幹細胞中的富集分數，獲得該幹細胞的該單細胞通路富集分數矩陣； 對該幹細胞的該單細胞通路富集分數矩陣進行生物資訊分析，獲得該幹細胞的單細胞亞群。
  17. 根據請求項16所述的方法，其中該對該幹細胞的該單細胞通路富集分數矩陣進行生物資訊分析，包括： 對該幹細胞的該單細胞通路富集分數矩陣進行降維和聚類處理。
  18. 根據請求項16或17所述的方法，其中該方法還包括： 分析該幹細胞的該單細胞亞群的差異表現基因，選擇一個或多個通路相關的差異表現基因所在的單細胞亞群，利用該差異表現基因進行降維和聚類處理，獲得該幹細胞的單細胞功能分類結果。
  19. 一種特徵基因的組合，其含有至少三種選自下列基因組的基因：TAGLN、EFEMP1、TPM1、CLU、PTX3、IER3、IGFBP7、MFAP5、IL6、LUM、SERPINE2、CRIM1和RHOB或由其組成。
  20. 一種含有至少三種選自下列基因組的基因：TAGLN、EFEMP1、TPM1、CLU、PTX3、IER3、IGFBP7、MFAP5、IL6、LUM、SERPINE2、CRIM1和RHOB用於幹細胞質量評價的用途。
  21. 一種伺服器，其中該伺服器包括： 一處理器和存儲該處理器可執行指令的一記憶體； 該處理器執行請求項1-15任一項所述的幹細胞質量評價方法或16-18任一項所述的幹細胞的單細胞功能分類方法。
  22. 一種電腦可讀存儲介質，其中所述電腦可讀存儲介質儲存有一電腦程式，該電腦程式執行請求項1-15任一項所述的幹細胞質量評價方法或16-18任一項所述的幹細胞的單細胞功能分類方法。
TW112101383A 2022-01-14 2023-01-12 一種幹細胞質量評價方法 TW202341167A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210047039.3A CN116486918A (zh) 2022-01-14 2022-01-14 一种干细胞质量评价方法
CN2022100470393 2022-01-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202341167A true TW202341167A (zh) 2023-10-16

Family

ID=87223744

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW112101383A TW202341167A (zh) 2022-01-14 2023-01-12 一種幹細胞質量評價方法

Country Status (3)

Country Link
CN (1) CN116486918A (zh)
TW (1) TW202341167A (zh)
WO (1) WO2023134390A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117497062A (zh) * 2023-11-15 2024-02-02 广州瑞能精准医学科技有限公司 一种特发性肺纤维化浆细胞特征基因预后模型构建方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018512876A (ja) * 2015-04-22 2018-05-24 ミナ セラピューティクス リミテッド ｓａＲＮＡ組成物および使用方法
WO2017062505A1 (en) * 2015-10-05 2017-04-13 Cedars-Sinai Medical Center Method of classifying and diagnosing cancer
JP6909454B2 (ja) * 2017-01-26 2021-07-28 日本メナード化粧品株式会社 幹細胞の品質を評価する方法及び幹細胞の品質評価用キット
WO2019240008A1 (ja) * 2018-06-13 2019-12-19 富士フイルム株式会社 情報処理装置、導出方法、及び導出プログラム
CN113658636A (zh) * 2021-07-22 2021-11-16 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种评估多能干细胞质量的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN116486918A (zh) 2023-07-25
WO2023134390A1 (en) 2023-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Carrascosa et al. Methods for growing and titrating African swine fever virus: field and laboratory samples
Larson et al. Sox11 is expressed in early progenitor human multipotent stromal cells and decreases with extensive expansion of the cells
US10035982B2 (en) Method of preparing autologous cells and methods of use for therapy
Biendarra-Tiegs et al. Addressing variability and heterogeneity of induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes
JP2016523550A (ja) 化学的または生物学的物質に対する応答の予測方法
Tylek et al. Platelet lysate outperforms FCS and human serum for co-culture of primary human macrophages and hMSCs
TW202341167A (zh) 一種幹細胞質量評價方法
CN116904545A (zh) 一种基于人源肺类器官的高内涵肺损伤评价体系
TW202349406A (zh) 一種幹細胞質量評價系統
US20230066188A1 (en) Biomarker identifying method and cell producing method
CN111759864B (zh) 羊水干细胞在制备治疗狼疮肾炎的药物中的应用
CN111411082B (zh) 一种培养CD90posi细胞的培养基及其培养方法
AU2022433266A1 (en) Method for evaluating the quality of stem cells
AU2022432379A1 (en) System for evaluating quality of stem cells
Yan et al. Transcriptomic heterogeneity of cultured ADSCs corresponds to embolic risk in the host
CN103305460B (zh) 一种人表皮干细胞的分离和培养方法
Huang Isolation of human placenta‐derived multipotent cells and in vitro differentiation into hepatocyte‐like cells
CN112813021A (zh) 评估药物心血管安全性的细胞模型及方法
Baier et al. Co-Culture of Peripheral Blood Mononuclear Cells and Endothelial Colony Forming Cells from Cord Blood of Preterm Born Babies
TWI782492B (zh) 一種血液中之微小幹細胞取得方法
Roybal et al. Use of manipulated stem cells for prenatal therapy
CN117025741A (zh) 一种羊膜来源间充质干细胞的有效性质量控制方法
Fink et al. Ureter single-cell and spatial mapping reveal cell types, architecture, and signaling networks
CN117511874A (zh) 诱导脐血干细胞向神经干细胞分化的方法
WO2023147029A1 (en) Methods of analyzing soluble tumor necrosis factor receptor 2 (stnfr2) and uses thereof