TW202330914A - 用於鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(otc)缺乏症之活體內核酸酶介導的治療之組成物及方法 - Google Patents
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Abstract
本案提供用於治療鳥胺酸胺甲醯基轉移酶缺乏症的雙載體系統。該雙載體系統包括(a)包含第一AAV rh79衣殼及第一載體基因體之基因編輯AAV,該第一載體基因體包含5’ ITR、編碼巨核酸酶的序列及3’ ITR,該巨核酸酶在調控序列的控制下靶向PCSK9,該調控序列指導該巨核酸酶在包含PCSK9基因的標靶細胞中的表現;及(b)包含第二AAV rh79衣殼及第二載體基因體之供體AAV載體,該第二載體基因體包含:5’ITR、5’同源性定向重組(HDR)臂、編碼鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(OTC)的轉殖基因及指導該轉殖基因在標靶細胞中表現的調控序列、3’ HDR臂、及3’ ITR。
Description
本案係關於用於鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(OTC)缺乏症之活體內核酸酶介導的治療之組成物及方法。
鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(ornithine transcarbamylase,OTC)缺乏症(ornithine transcarbamylas deficiency,OTCD)是一種與高死亡率相關的X性聯尿素循環病症。雖然腺相關病毒(AAV)新生兒基因療法是治療遲發性OTC缺乏症的一種有希望的治療方法,但由於非整合性基因體在肝細胞增殖過程中遺失,因此僅能提供短期治療效果。
巨核酸酶(meganuclease)在染色體中產生雙股斷裂(double strand break,DSB),而導致DNA修復。在供體DNA存在下,會發生同源性定向修復(homology directed repair,HDR),並用來自供體基因的新訊息置換染色體中的遺傳訊息。
安全港位點(safe harbor site,SHS)是可安全***並表現基因或其他遺傳元件的基因體位點。這些SHS對於有效的人類疾病基因治療;研究基因結構、功能及調控;及細胞標記與追蹤等至關重要。
轉殖基因匣之核酸酶介導的位點特異性整合在基因體安全港中將為OTC缺乏症患者提供長期治療益處。
需要的是用於治療OTC的改良組成物及方法。
本文提供用於在有需要的受試者中治療OTC的組成物、方法、系統及套組,其允許減量或去除天然PCSK9基因並在PCSK9基因座中***及/或表現外源OTC轉殖基因。
在一態樣中,提供用於治療鳥胺酸胺甲醯基轉移酶缺乏症的雙載體系統。該系統包括(a)包含第一AAV衣殼及第一載體基因體之基因編輯AAV,該第一載體基因體包含5’ ITR、編碼巨核酸酶的序列及3’ ITR,該巨核酸酶在調控序列的控制下靶向PCSK9,該調控序列指導巨核酸酶在包含PCSK9基因的標靶細胞中的表現;及(b)包含第二AAV衣殼及第二載體基因體的供體AAV載體,該第二載體基因體包含:5’ITR、5’同源性定向重組(HDR)臂、編碼鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(OTC)之轉殖基因及指導轉殖基因在標靶細胞中表現的調控序列、3’ HDR臂、及3’ ITR。在某些具體實施例中,巨核酸酶為具有SEQ ID NO:3序列之ARCUS巨核酸酶。在某些具體實施例中,編碼巨核酸酶的序列包含SEQ ID NO:2之核苷酸(nt) 1089-2183,或與SEQ ID NO:2之核苷酸(nt) 1089-2183至少90%相同之序列。在某些具體實施例中,編碼OTC的轉殖基因包含SEQ ID NO:5,或與SEQ ID NO:5至少90%相同之序列。在某些具體實施例中,第一及第二AAV衣殼為SEQ ID NO:16之AAVrh79衣殼。
在另一態樣中,提供在有此需要之受試者中治療OTC缺乏症的方法。該方法包括對該具有OTC之受試者共同投予(a)包含第一AAV衣殼及第一載體基因體之基因編輯AAV,該第一載體基因體包含5’ ITR、編碼巨核酸酶的序列及3’ ITR,該巨核酸酶在調控序列的控制下靶向PCSK9,該調控序列指導巨核酸酶在包含PCSK9基因的標靶細胞中的表現;及(b)包含第二AAV衣殼及第二載體基因體的供體AAV載體,該第二載體基因體包含:5’ITR、5’同源性定向重組(HDR)臂、編碼鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(OTC)之轉殖基因及指導轉殖基因在標靶細胞中表現的調控序列、3’ HDR臂、及3’ ITR。在某些具體實施例中,i)第一載體基因體包含SEQ ID NO:2之nt 211至2964,或與SEQ ID NO:2之nt 211至2964具有至少90%同一性的序列;及ii)第二載體基因體包含SEQ ID NO:6之nt 178至3281,或與SEQ ID NO:6之nt 178至3281具有至少90%同一性的序列。
本發明之其他態樣及優點將從本發明以下詳細描述中顯而易見。
本文所提供的是對於患有某些遺傳病症(包括肝代謝性病症)的患者提供穩定、長期的治療效果的組成物、套組及方法。組成物、套組及方法利用靶向標靶細胞的PCSK9基因座的核酸酶,且供體載體提供包括用於整合至PCSK9基因座並從其表現的外源產物的模板,其中***的核酸序列並不編碼PCSK9,且內源性PCSK9的表現被中斷,表現量降低。
在一個具體實施例中,本文所述之測試物由2個載體組成,均使用分支群E衣殼、AAVrh79及肝臟特異性TBG啟動子。第一載體為核酸酶ARCUS,而第二載體為hOTC供體基因匣,兩側是PCSK9外顯子7的500bp同源臂。
在
Pcsk9-hE7-KI.
spf-ash小鼠中,測試物降低了mPCSK9水平,並改善了高蛋白飲食激發後的體重減輕及存活率。與未處理及GFP對照處理的小鼠相比,hOTC被很好地轉導並導致良好的***或缺失%。
在新生的非人類靈長類動物中,在d84肝臟生檢所評估的測試物導致18.6%及11.9%的hOTC轉導,均高於實質上有益於患者的閾值,即約5%的OTC表現細胞。
未觀察到與測試物相關的發現,且ALT及PCSK9水平(作為第0天的百分比)在載體投予後至少3個月內保持低水平和穩定。
在某些具體實施例中,測試物由兩個非複製型重組腺相關病毒(AAV) rh79載體組成:AAVrh79.TBG.M2PCSK9.WPRE.bGH (核酸酶載體)及AAVrh79.hHDR.TBG.hOTCco.bGH (供體載體),其等是在投予前以基因體拷貝(GC)確定的比例混合。根據非臨床研究,該比例可為核酸酶載體與供體載體的1:3比例。在某些實施方案中,以靜脈內(IV)輸注的單一劑量投予測試物,且投予劑量基於受試者體重的GC/kg。
PCSK9
前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶kexin 9 (Proprotein convertase subtilisin kexin 9,PCSK9)是一種絲胺酸蛋白酶,可降低肝臟和肝外低密度脂蛋白(LDL)受體(LDLR;606945)水平並增加血漿LDL膽固醇。PCSK9在血漿膽固醇體內恆定的調控中至關重要。PCSK9與低密度脂質受體家族成員低密度脂蛋白受體(LDLR)、極低密度脂蛋白受體(VLDLR)、脂蛋白元E受體(LRP1/APOER)及脂蛋白元受體2 (LRP8/APOER2)結合,並促進它們在細胞內酸性腔室中降解。
雖然PCSK9基因已被靶向用於治療膽固醇相關疾病,但本文證實PSCK9基因座是用於基因靶向***其他非PCSK9轉殖基因的安全港。因此,本文提供的組成物、套組及方法利用靶向PCSK9基因座的核酸酶,並使用供體模板將治療性轉殖基因***標靶PCSK9基因座。
本文提供的組成物、套組及方法包括基因編輯載體及供體載體,該供體載體提供要在宿主細胞中表現的治療性OTC轉殖基因。
基因編輯組分
本文提供的組成物、套組及方法包括基因編輯組分,該基因編輯組分包含核酸酶(或因此的編碼序列)及指導核酸酶特異性靶向染色體1上的天然PCSK9基因座的序列。如本文所使用,「標靶PCSK9基因座」或「PCSK9基因座」係位於PCSK9編碼序列的外顯子7中。圖6提供人類(h)、恆河猴(rh)及小鼠(m) PCSK9外顯子7剪接位點的排列比對,這些剪接位點在本文中使用SaCas9及靶向PCSK9的巨核酸酶(稱為 ARCUS)進行例示。
本文描述的是組成物,特別是核酸酶,其可用於靶向基因以***轉殖基因,例如,對PCSK9具有特異性的核酸酶。在某些具體實施例中,核酸酶為靶向PCSK9之巨核酸酶。巨核酸酶是內切去氧核糖核酸酶,其特徵在於大的識別位點(12至40個鹼基對的雙股DNA序列),例如I-SceI。當與核酸酶結合時,可在特定位置切割DNA。可將限制酶導入細胞,用於基因編輯或原位基因體編輯。在某些具體實施例中,核酸酶為歸巢核酸內切酶(homing endonuclease) I-CreI家族成員,其識別並切割一組22個鹼基對的識別序列SEQ ID NO:1 - CAAAACGTCGTGAGACAGTTTG。參見例如WO 2009/059195。在一個具體實施例中,核酸酶由SEQ ID NO:2,nt 1089至2183所示之序列、或與其具有至少95%、98%或99%同一性的序列編碼。在一個具體實施例中,核酸酶蛋白質序列為SEQ ID NO:3所示之序列。此類核酸酶有時在本文中稱為ARCUS核酸酶。術語「歸巢核酸內切酶」與術語「巨核酸酶」同義。參見,WO 2018/195449,敘述某些PCSK9巨核酸酶,其完整地併入本文中。
在某些具體實施例、組成物、套組及方法中,核酸酶編碼序列包含在基因編輯載體中。基因編輯載體包括表現匣,該表現匣包含編碼核酸酶的核酸序列及指導核酸酶在包含PCSK9基因的標靶細胞中表現的調控序列。如本文所使用,「載體」為包含核酸序列的生物學或化學部分,其可被導入合適的宿主細胞以複製或表現該核酸序列。包含核酸酶編碼序列的載體為腺相關病毒(AAV)載體。
如本文所使用,「表現匣」係指核酸分子,其包含生物學上有用的核酸序列(例如,編碼蛋白質、酶或其他有用基因產物的基因cDNA、mRNA等)和與其可操作地連接的調控序列,其指導或調節核酸序列及其基因產物的轉錄、轉譯及/或表現。如本文所使用,「可操作地連接的」序列包括與核酸序列鄰接的調控序列和以反式或遠距離作用以控制序列的調控序列二者。此類調控序列通常包括例如啟動子、增強子、內含子、Kozak序列、多腺苷酸化序列及TATA訊號中的一種或多種。表現匣可包含基因序列上游(5’)的調控序列,例如啟動子、增強子、內含子等中的一個或多個,及一個或多個增強子,或基因序列下游(3’)的調控序列,例如,包含多腺苷酸化位點的3’非轉譯區,以及其他元件。在其他具體實施例中,術語「轉殖基因」係指***標靶細胞中的來自外源的一個或多個DNA序列。通常,此類用於產生病毒載體的表現匣含有用於本文所述基因產物的編碼序列,其兩側為病毒基因體的包裝訊號,以及其他表現控制序列,例如本文所述的那些。
除了用於核酸酶之編碼序列外,基因編輯載體還包括指導核酸酶在宿主細胞中表現的調控序列。調控元件包括啟動子,例如肝臟特異性啟動子甲狀腺素結合球蛋白(thyroxin binding globulin,TBG)啟動子。在某些具體實施例中,TBG啟動子具有SEQ ID NO:2之核苷酸211至907的序列,其包括增強子序列。
除了啟動子外,基因編輯匣、表現匣及/或載體還可包含一種或多種適當的「調控元件」或「調控序列」,其包含但不限於增強子;轉錄因子;轉錄終止子;有效的RNA處理訊號,諸如剪接和多腺苷酸化訊號(polyA);穩定細胞質mRNA的序列,例如土撥鼠肝炎病毒(WHP)轉錄後調控元件(WPRE);提高轉譯效率的序列(即Kozak共通序列);增強蛋白質穩定性的序列;且當需要時,增強編碼產物分泌的序列。在某些具體實施例中,載體包括牛生長激素(bGH) polyA,例如SEQ ID NO:2之核苷酸2750至2964中所示的那些。合適的增強子包括α1-微球蛋白/比庫蛋白(bikunin)增強子。合適的WPRE包括SEQ ID NO:2之核苷酸2202至2743中所示的那些。這些控制序列或調控序列可操作地連接至核酸酶編碼序列或轉殖基因編碼序列。在某些具體實施例中,包括SV40內含子,諸如SEQ ID NO:2之核苷酸939至1071中所示的那些。
在某些具體實施例中,核酸酶載體基因體包括下列成分。反向末端重複(Inverted Terminal Repeat,ITR):ITR為相同的反向互補序列,源自AAV2 (145個鹼基對[bp],GenBank:NC_001401),位於載體基因體的所有成分的兩側。當反式提供AAV和腺病毒輔助功能時,ITR既充當載體DNA複製的起點,且充當載體基因體的包裝信號。因此,ITR序列代表載體基因體複製及包裝所需的唯一順式序列。人類甲狀腺素結合球蛋白(Thyroxine-Binding Globulin,TBG)啟動子:該調控元件賦予肝臟組織特異性轉殖基因表現(410 bp,GenBank:L13470.1)。編碼序列:轉殖基因是一種工程化的巨核酸酶(ARCUS;1095 bp,365個胺基酸)。其源自歸巢核酸內切酶I-CreI的變異體,分離自萊茵衣藻(
Chlamydomonas reinhardtii),可高效且特異性地識別及編輯
PCSK9基因。WPRE (土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件):源自土撥鼠肝炎病毒(Woodchuck Hepatitis Virus,WHV) (GenBank:MT612432.1)的順式作用RNA元件已***PolyA訊號上游之編碼序列的3’非轉譯區。WPRE是一種肝炎病毒衍生序列,且以前曾用作病毒基因載體中的順式作用調控組件,以達到足夠水平的轉殖基因產物表現並提高製造過程中的病毒力價。WPRE被認為藉由改善轉錄物終止並增強3’端轉錄物加工來增加轉殖基因產物表現,因此增加多腺苷酸化轉錄物的數量和PolyA尾的大小,並導致更多的轉殖基因mRNA可用於轉譯。包含於載體中的WPRE為一種突變版本,在土撥鼠肝炎病毒X蛋白(WHX)蛋白開放閱讀框(ORF)的推定啟動子區域包含5個點突變,以及在WHX蛋白ORF之起始密碼子中的一個額外點突變(ATG突變為TTG)。基於對以含有WPRE mut6-GFP融合構築體之慢病毒轉導的各種人類細胞株進行靈敏的流式細胞術分析,這種突變體WPRE (稱為mut6)被認為足以消除截短WHX蛋白的表現(Zanta-Boussif et al., 2009)。
牛生長激素Poly A (bGH PolyA):bGH PolyA訊號(208 bp,GenBank:MT267334)促進順式轉殖基因mRNA的有效多腺苷酸化。該元件用作轉錄終止訊號、新生轉錄本3’端處的特定切割事件以及長多腺苷酸尾的添加。
在某些具體實施例中,基因編輯載體進一步包括一個或多個核定位訊號(nuclear localization signal,NLS)。參見例如,Lu et al. Types of nuclear localization signals and mechanisms of protein import into the nucleus, Cell Commun Signal (May 2021) 19:60。在一個具體實施例中,載體包含SEQ ID NO:2之nt 1095至1115所示之NLS。
供體載體
組成物、套組及方法包括供體載體,其提供用於OTC治療性轉殖基因的編碼序列。供體載體包含表現匣,該表現匣含有編碼轉殖基因的核酸序列,及指導轉殖基因在標靶細胞中表現的調控序列。
用於核酸酶介導的位點特異性整合OTC轉殖基因匣至基因體之PCSK9安全港中的組成物、套組及方法為OTC缺乏症患者提供長期治療益處。提供用於OTC的工程化編碼序列,在本文中稱為hOTCco2,並顯示於SEQ ID NO:4中。提供具有SEQ ID NO:4序列之核酸或與SEQ ID NO:4共享至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或至少99.9%同一性的序列。在一個具體實施例中,核酸與SEQ ID NO:5所示之天然OTC編碼序列共享少於80%、少於79%、少於78%、少於77%、少於76%、少於75%、少於74%、少於73%、少於72%、少於71%、或少於70%同一性。
在一些具體實施例中,轉殖基因匣包括TBG啟動子、轉殖基因編碼序列、及poly A序列。
除了啟動子外,轉殖基因、表現匣及/或載體(編輯或供體)還可包含一種或多種適當的「調控元件」或「調控序列」,其包含但不限於增強子;轉錄因子;轉錄終止子;有效的RNA處理訊號,諸如剪接和多腺苷酸化訊號(polyA);穩定細胞質mRNA的序列,例如土撥鼠肝炎病毒(WHP)轉錄後調控元件(WPRE);提高轉譯效率的序列(即Kozak共通序列);增強蛋白質穩定性的序列;且當需要時,增強編碼產物分泌的序列。合適的polyA序列之實例包括,例如,SV40、牛生長激素(bGH)、及TK polyA。合適的增強子之實例包括,例如,α胎兒蛋白(alpha fetoprotein)增強子、TTR小啟動子/增強子、LSP (TH-結合球蛋白啟動子/α1-微球蛋白/比庫蛋白增強子)等。這些控制序列或調控序列可操作地連接至核酸酶編碼序列或轉殖基因編碼序列。
在某些具體實施例中,供體載體基因體包括下列:反向末端重複(ITR):ITR為相同的反向互補序列,源自AAV2 (145 bp,GenBank:NC_001401),位於載體基因體的所有成分的兩側。當反式提供AAV和腺病毒輔助功能時,ITR既充當載體DNA複製的起點,且充當載體基因體的包裝信號。因此,ITR序列代表載體基因體複製及包裝所需的唯一順式序列。5’及3’同源臂:同源依賴性重組臂(亦稱為hHDR)由內源性人類
PCSK9基因座之外顯子7中的切割位點側翼的序列組成。同源臂包含在
PCSK9基因之外顯子7中的ARCUS巨核酸酶切割位點的序列500 bp上游(5’同源臂)及500 bp下游(3’同源臂)。人甲狀腺素結合球蛋白(TBG)啟動子:該調控元件賦予肝臟組織特異性轉殖基因表現(434 bp,GenBank:L13470.1)。編碼序列:轉殖基因是人類鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(OTC)基因(1068 bp,356個胺基酸)的密碼子優化版本。牛生長激素poly A (BGH PolyA):bGH PolyA訊號(215 bp,GenBank:MT267334)促進順式轉殖基因mRNA的有效多腺苷酸化。該元件用作轉錄終止訊號、新生轉錄本3’端處的特定切割事件以及長多腺苷酸尾的添加。
除了轉殖基因匣外,供體載體還包括轉殖基因匣的同源性定向重組(HDR)臂5’及3’,以促進將轉殖基因同源性定向重組至內源性基因體中。同源臂指向標靶PCSK9基因座,並可具有不同的長度。在另一具體實施例中,HDR臂約為500 bp。理想情況下,HDR臂與標靶PCSK9基因座具有高度互補性,但不需100%互補。在一些具體實施例中,在每個HDR臂中允許1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個錯誤配對。用於靶向PCSK9外顯子7之合適HDR臂序列顯示於圖14及SEQ ID NO:7-12。在一個具體實施例中,HDR臂序列為顯示於SEQ ID NO:13及14中那些。
AAV
病毒載體
基因編輯載體及供體載體以重組AAV的形式提供。「重組AAV」或「rAAV」是包含兩個元件的DNAse抗性病毒顆粒,即AAV衣殼及至少包含包裝在AAV衣殼內的非AAV編碼序列的載體基因體。除非另有說明,此術語可與短語「rAAV載體」或「AAV載體」互換使用。rAAV是一種「複製缺陷病毒」或「病毒載體」,因為其缺乏任何功能性AAV rep基因或功能性AAV cap基因並且不能產生子代。在某些具體實施例中,僅AAV序列是AAV反向末端重複序列(ITR),通常位於載體基因體的5’和3’端末端,以便允許位於ITR之間的基因和調控序列被包裝在AAV衣殼內。
腺相關病毒(AAV)病毒載體是具有AAV蛋白衣殼的AAV DNase抗性顆粒,其中包裝有用於遞送至靶細胞的核酸序列。AAV衣殼由60個衣殼(cap)蛋白次單元VP1、VP2和VP3組成,其等以大約1:1:10至1:1:20的比例依二十面體對稱排列,具體取決於所選擇之AAV。
表現匣位於用於包裝至病毒衣殼中的載體基因體中。例如,關於AAV載體基因體,表現匣的成分在5’端末端及3’端末端的兩側是AAV反向末端重複序列。例如,5’ AAV ITR、表現匣、3’ AAV ITR。
供體及核酸酶載體二者的AAV衣殼來源是AAVrh79,如2019年9月6日公開的WO 2019/169004中所述,其藉由引用併入本文。在一個具體實施例中,AAVrh79衣殼包含AAVrh79 vp1蛋白、AAVrh79 vp2蛋白及AAVrh79 vp3蛋白的異質群體。在一個具體實施例中,AAVrh79衣殼是藉由從編碼SEQ ID NO:16之1至738的預測胺基酸序列的核酸序列表現而產生的。可選擇地,從除了vp1-獨立區域(unique region)(約aa 1至137)或vp2-獨立區域(約aa 1至203)以外的核酸序列中共同表現vp3蛋白的序列,由SEQ ID NO:15產生的vp1蛋白,或由與SEQ ID NO:15至少70%同一的核酸序列產生的vp1蛋白,其編碼SEQ ID NO:16之1至738的預測胺基酸序列。在其他具體實施例中,藉由從編碼SEQ ID NO:16之至少約胺基酸138至738的預測胺基酸序列的核酸序列表現製造AAVrh79 vp2蛋白,從包含SEQ ID NO:15之至少核苷酸412至2214的序列製造vp2蛋白,或從編碼SEQ ID NO:16之至少約胺基酸138至738的預測胺基酸序列的與SEQ ID NO:15之至少核苷酸412至2214有至少70%同一的核酸序列製造vp2蛋白,藉由從編碼SEQ ID NO:16之至少約胺基酸204至738的預測胺基酸序列的核酸序列表現製造AAVrh79 vp3蛋白,從包含SEQ ID NO:15之至少核苷酸610至2214的序列製造vp3蛋白,或從編碼SEQ ID NO:16之至少約胺基酸204至738的預測胺基酸序列的與SEQ ID NO:15之至少核苷酸610至2214有至少70%同一的核酸序列製造vp3蛋白。
在某些具體實施例中,AAVrh79衣殼包含:vp1蛋白的異質群體,該vp1蛋白為編碼SEQ ID NO:16之胺基酸序列的核酸序列的產物;vp2蛋白的異質群體,該vp2蛋白為編碼SEQ ID NO:16之至少約胺基酸138至738的胺基酸序列之核酸序列的產物;及vp3蛋白的異質群體,該vp3蛋白為編碼SEQ ID NO:16之至少胺基酸204至738的核酸序列的產物。
AAVrh79 vp1、vp2及vp3蛋白含有在SEQ ID NO:16之天冬醯胺酸-甘胺酸對中具有胺基酸修飾的亞群,該亞群包含至少二個高度脫醯胺化天冬醯胺酸(N),及可選擇地進一步包含含有其他脫醯胺化胺基酸的亞群,其中脫醯胺化導致胺基酸發生變化。相對於SEQ ID NO:16的數目,觀察到在N-G對N57、N263、N385及/或N514處的高度脫醯胺化。已在其他殘基中觀察到脫醯胺化作用,如下表及實施例中所示。在某些具體實施例中,AAVrh79可具有其他脫醯胺化殘基,例如,典型上少於10%及/或可具有其他修飾,包括甲基化(例如,~R487) (在給定的殘基處典型上少於5%,更典型為少於1%)、異構化(例如,在D97) (在給定的殘基處典型上少於5%,更典型為少於1%)、磷酸化(例如,如果存在,在約10至約60%、或約10至約30%、或約20至約60%的範圍內) (例如,在S149、~S153、~S474、~T570、~S665中的一處或多處)、或氧化(例如,在W248、W307、W307、M405、M437、M473、W480、W480、W505、M526、M544、M561、W621、M637、及/或W697中的一處或多處)。可選擇地,W可氧化成犬尿胺酸。
表1–AAVrh79脫醯胺化
基於 VP1 編號之 AAVrh79 脫醯胺化 | 脫醯胺化 % |
N57+脫醯胺化 | 65-90、70-95、80-95、75-100、80-100、或90-100 |
N94+脫醯胺化 | 5 - 15,約10 |
~N254+脫醯胺化 | 10 - 20 |
~N263+脫醯胺化 | 75 - 100 |
~N305+脫醯胺化 | 1 - 5 |
~N385+脫醯胺化 | 65-90、70-95、80-95、75-100、80-100、或90-100 |
~N410+脫醯胺化 | 1 - 25, |
N479+脫醯胺化 | 1 - 5,1-3 |
~N514+脫醯胺化 | 65-90、70-95、80-95、75-100、80-100、或90-100 |
~Q601+脫醯胺化 | 0 - 1 |
N653+脫醯胺化 | 0 - 2 |
在某些具體實施例中,AAVrh79衣殼在上表中確定的一個或多個位置上被修飾,在下文提供的範圍內,如使用胰蛋白酶質譜法所測定的。在某些具體實施例中,N之後的一個或多個位置或甘胺酸如本文所述被修飾。殘基數目係基於本文提供的AAVrh79序列。參見SEQ ID NO:16。
在某些具體實施例中,編碼AAVrh79 vp1衣殼蛋白之核酸序列提供於SEQ ID NO:15。在其他具體實施例中,可選擇與SEQ ID NO:15有70%至99.9%同一性的核酸序列以表現AAVrh79衣殼蛋白。在某些其他具體實施例中,核酸序列是與SEQ ID NO:15至少約75%同一的、至少80%同一的、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%同一的、至少99%或至少99.9%同一的。然而,可選擇編碼SEQ ID NO:16之胺基酸序列的其他核酸序列用於製造rAAV衣殼。在某些具體實施例中,核酸序列具有SEQ ID NO:15之核酸序列,或編碼SEQ ID NO:16之與SEQ ID NO:15有至少70%至99%同一的、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一的序列。在某些具體實施例中,核酸序列具有SEQ ID NO:15之核酸序列,或編碼SEQ ID NO:16之vp2衣殼蛋白(約aa 138至738)的與SEQ ID NO:15的約nt 412至約nt 2214有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一的序列。在某些具體實施例中,核酸序列具有SEQ ID NO:15之約nt 610至約nt 2214核酸序列,或編碼SEQ ID NO:16之vp3衣殼蛋白(約aa 204至738)的與ntSEQ ID NO:15有至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%同一的序列。
在某些具體實施例中,rAAV79載體具有包含載體基因體之AAVrh79衣殼,該載體基因體包含含有AAV反向末端重複序列的核酸分子及編碼產物的非AAV核酸序列,該產物可操作地連接至指導產物表現的序列。在某些具體實施例中,AAVrh79衣殼的特徵在於包含選自下列AAVrh79 vp1蛋白、AAVrh79 vp2蛋白、及AAVrh79 vp3蛋白的異質群體:藉由從編碼SEQ ID NO:16之1至738的預測胺基酸序列之核酸序列表現製造的vp1蛋白、從SEQ ID NO:15製造的vp1蛋白、或從編碼SEQ ID NO:16之1至738的預測胺基酸序列的SEQ ID NO:15具有至少70%至100%同一性的核酸序列製造的vp1蛋白、選自下列之AAVrh79 vp2蛋白的異質群體:從編碼SEQ ID NO:16之至少約胺基酸138至738的預測胺基酸序列之核酸序列表現製造的vp2蛋白、從包含SEQ ID NO:15之至少核苷酸412至2214之序列製造的vp2蛋白、或編碼SEQ ID NO:16之至少約胺基酸138至738的預測胺基酸序列之與SEQ ID NO:15的至少核苷酸412至2214有至少70%至100%同一性的核酸序列製造的vp2蛋白、及選自下列之AAVrh79 vp3蛋白的異質群體:從編碼SEQ ID NO:16之至少約胺基酸204至738的預測胺基酸序列之核酸序列表現製造的vp3蛋白、從包含SEQ ID NO:15之至少核苷酸610至2214之序列製造的vp3蛋白、或編碼SEQ ID NO:16之至少約胺基酸204至738的預測胺基酸序列之與SEQ ID NO:15的至少核苷酸610至2214有至少70%同一性的核酸序列製造的vp3蛋白。在某些具體實施例中,rAAVrh79衣殼之特徵在於AAVrh79 vp1蛋白、AAVrh79 vp2及AAVrh79 vp3蛋白的異質群體,其為編碼SEQ ID NO:16之胺基酸序列的核酸序列的產物;vp2蛋白的異質群體,其為編碼SEQ ID NO:16之至少約胺基酸138至738的胺基酸序列之核酸序列的產物;及vp3蛋白的異質群體,其為編碼SEQ ID NO:16之至少胺基酸204至738的核酸序列的產物。在某些具體實施例中,AAVrh79衣殼之特徵在於AAVrh79 vp1蛋白、vp2蛋白及vp3蛋白,其包含分別相對於SEQ ID NO:16之胺基酸1至738 (vp1)、138至738 (vp2)、及204至738 (vp3)的異質群體,其中:AAVrh79 vp1、AAVrh79 vp2及AAVrh79 vp3蛋白之異質群體包含具有胺基酸修飾的亞群,其在在相對於SEQ ID NO:16之至少二個位置的天冬醯胺酸-甘胺酸對中包含至少50%至100%的二個高度脫醯胺化天冬醯胺酸(N),及可選擇地進一步包含含有其他脫醯胺化胺基酸的亞群,其中該脫醯胺化導致胺基酸發生變化。在某些具體實施例中,基於SEQ ID NO:16,高度脫醯胺化位置為N57、N263、N385及N514,並使用質譜法測量。在某些具體實施例中,AAVrh79衣殼蛋白各自獨立地在基於SEQ ID NO:16的位置N57以60%至約100%,在位置N263以60%至約100%,在位置N385以60%至約100%,在位置N514以60%至約100%脫醯胺化,並使用質譜法測量。可選擇用於測量脫醯胺化或其他轉譯後修飾的其他合適的技術。
在某些具體實施例中,rAAV79衣殼包含AAVrh79 vp1蛋白,該AAVrh79 vp1蛋白在SEQ ID NO:16位置N57處具有約80至85%脫醯胺化;在SEQ ID NO:16位置N263處具有約82%至約88%脫醯胺化;在SEQ ID NO:3位置N385處具有約90%至約96%脫醯胺化;及/或在SEQ ID NO:16位置N514處具有約85%至約90%脫醯胺化,可選擇地在其他位置具有轉譯後修飾,如使用質譜法測量。可選擇地,在位置N94、N254、N305、N410、N479、Q601、N653具有脫醯胺化;通常在AAVrh79的VP1、VP2及vp3蛋白群體中發現這些位置的脫醯胺化少於10%、少於5%、少於3%、或少於2%。可選擇地,基於SEQ ID NO:16之殘基,在位置S149處觀察到磷酸化;在某些具體實施例中,不超過0%的衣殼蛋白在此位置處具有磷酸化。在某些具體實施例中,在位置W248、W307、M437、M473、M480、W505、M637及/或W697處觀察到氧化;在某些具體實施例中,少於10%的衣殼蛋白在這些位置中的任一處被氧化。轉譯後修飾可使用質譜法或其他合適的技術來測定。
本發明亦包括編碼突變體AAVrh79的核酸序列,其中一個或多個殘基已被改變以減少脫醯胺化或本文所測定之其他修飾。此類核酸序列可用於製造突變體rAAVrh79衣殼。
如本文所使用,「載體基因體」係指包裝於形成病毒顆粒之rAAV衣殼內的核酸序列。此類核酸序列包含AAV反向末端重複序列(ITR)。在本文的實施例中,載體基因體至少從5’至3’包含AAV 5’ ITR;含有轉殖基因或編碼序列之表現匣,該編碼序列可操作地連接至指導其表現的調控序列;及AAV 3’ ITR。ITR為在載體生產過程中負責基因組複製及包裝的遺傳元件,並且是產生rAAV所需的唯一病毒順式元件。在一個較佳具體實施例中,可為了方便而使用來自AAV2的ITR序列或其刪除版本(ΔITR)。在某些具體實施例中,ITR可為顯示於SEQ ID NO:2之核苷酸1至130及3052至3181、及SEQ ID NO:6之核苷酸1至130及3345至3474中的那些。
已經描述被稱為ΔITR的5’ ITR的縮短版本,其中刪除了D-序列和末端解析位點(terminal resolution site;trs)。在某些具體實施例中,載體基因體包括縮短的130個鹼基對之AAV2 ITR,其中該外部「a」元件被刪除。在使用內部A元件作為模板進行載體DNA擴增的過程中,縮短的ITR恢復成145個鹼基對的野生型長度。在其他具體實施例中,使用全長AAV 5’及3’ ITR。在其他具體實施例中,可選擇全長或工程化ITR。來自AAV2(與衣殼不同來源AAV)的ITR或除全長ITR以外的ITR均可被選擇。ITR來自與在生產期間提供rep功能的AAV相同的AAV來源或反式互補AAV。
為了用於產生AAV病毒載體(例如,重組(r) AAV),表現匣可攜帶在任何合適的載體上,例如,血漿,其被遞送至包裝宿主細胞。可對用於本發明的質體進行工程化,使其適合於在活體外原核細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等之中複製及包裝。合適的轉染技術及包裝宿主細胞是已知的及/或可由本領域技術人員容易地設計。
產生和分離適於用作載體的AAV的方法是本領域已知的。通常可參見,例如Grieger & Samulski, 2005, “Adeno-associated virus as a gene therapy vector:Vector development, production and clinical applications,”
Adv. Biochem. Engin/Biotechnol.99:119-145;Buning
et al.,2008, “Recent developments in adeno-associated virus vector technology,”
J. Gene Med.10:717-733;及以下所引用之參考文獻,其各藉由引用而完整地併入本文。為了將轉殖基因包裝至病毒粒子中,ITR是唯一需要在與包含表現匣的核酸分子相同的構築體中順式的AAV成分。cap和rep基因可以反式提供。
術語「AAV中間體」或「AAV載體中間體」係指組裝的rAAV衣殼,其缺少包裝在其中的所需基因體序列。這些亦可稱為「空」衣殼。此類衣殼可不包含可檢測的表現匣基因體序列,或僅包含不足以達到基因產物表下的部分包裝的基因體序列。這些空衣殼非功能性地將感興趣的基因轉移至宿主細胞中。
本文所述的重組腺相關病毒(AAV)可使用已知的技術產生。參見例如,WO 2003/042397;WO 2005/033321;WO 2006/110689;US 7588772 B2。此類方法涉及培養含有編碼AAV衣殼蛋白之核酸序列的宿主細胞;功能性rep基因;至少由AAV反向末端重複(ITR)及轉殖基因組成的表現匣;及足夠的輔助功能以允許將表現匣包裝至AAV衣殼蛋白中。已經描述了產生衣殼的方法、其編碼序列和生產rAAV病毒載體的方法。參見例如,Gao, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6081-6086 (2003)及US 2013/0045186A1。
在一個具體實施例中,提供了用於生產重組AAV的生產細胞培養物。此類細胞培養物含有在宿主細胞中表現AAV衣殼蛋白的核酸;適於包裝至AAV衣殼中的核酸分子,例如含有AAV ITR的載體基因體及編碼基因產物的非AAV核酸序列,該基因產物可操作地連接至指導產物在宿主細胞中表現的序列;足夠的AAVrep功能和腺病毒輔助功能,以允許將核酸分子包裝至重組AAV衣殼中。在一個具體實施例中,細胞培養物由哺乳動物細胞(例如人類胚胎腎293細胞等)或昆蟲細胞(例如昆蟲桿狀病毒)組成。
可選擇地,rep功能由除提供衣殼的AAV之外的AAV提供。例如,rep可為,但不限於,AAV1 rep蛋白、AAV2 rep蛋白、AAV3 rep蛋白、AAV4 rep蛋白、AAV5 rep蛋白、AAV6 rep蛋白、AAV7 rep蛋白、AAV8 rep蛋白;或rep 78、rep 68、rep 52、rep 40、rep68/78及rep40/52;或其片段;或另一來源。可選擇地,rep及cap序列在細胞培養物中位於相同的遺傳元件上。在rep序列及cap基因之間可能有一個間隔子。任何這些AAV或突變體AAV衣殼序列都可在指導其在宿主細胞中表現的外源調節控制序列的控制之下。
在一個具體實施例中,細胞是在合適的細胞培養物(例如HEK 293)細胞中製造的。用於製造本文所述之基因治療載體的方法包括本領域熟知的方法,例如用於生產基因治療載體的質體DNA的產生、載體的產生及載體的純化。在一些具體實施例中,基因治療載體為AAV載體,產生的質粒為編碼AAV基因體及感興趣之基因的AAV順式質體,含有AAV rep和cap基因的AAV轉質體,以及腺病毒輔助質體。載體生成過程可以包括下列方法步驟,例如開始細胞培養、細胞繼代、細胞接種、以質體DNA轉染細胞、轉染後培養基更換為無血清培養基,及含有載體的細胞和培養基的收取。粗製細胞收取物收取的含載體之細胞及培養基在本文中稱為粗製細胞收取物。在另一個系統中,基因治療載體藉由感染基於昆蟲桿狀病毒的載體被導入昆蟲細胞。對於這些生產系統的評論,通常可參見例如,Zhang et al., 2009, “Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production,” Human Gene Therapy 20:922-929,其中每一內容均藉由引用而完整地併入本文。製造及使用這些及其他AAV生產系統的方法亦描述於下列美國專利案,各專利案之內容均藉由引用而完整地併入本文:5,139,941;5,741,683;6,057,152;6,204,059;6,268,213;6,491,907;6,660,514;6,951,753;7,094,604;7,172,893;7,201,898;7,229,823;及7,439,065。
粗製細胞收取物之後可為標的方法步驟,諸如載體收取物的濃縮、載體收穫物的透析過濾、載體收穫物的微流化、載體收穫物的核酸酶消化、微流化中間體的過濾、經層析之粗製物純化、經超高速離心之粗製物純化、經切向流過濾之緩衝液交換,及/或配製和過濾以製備主體載體(bulk vector)。
在高鹽濃度下進行兩步親和性層析純化,然後使用陰離子交換樹脂層析純化載體藥物產品並移除空衣殼。這些方法在國際專利公開號WO 2017/160360中有更詳細的描述,其藉由引用併入本文。用於AAV8之純化方法,國際專利公開號WO 2017/100676,及rh10,國際專利公開號WO 2017/100704,及用於AAV1,國際專利公開號WO 2017/100674,其全部藉由引用併入本文。
為了計算空顆粒和完整顆粒的含量,將所選樣品(例如,在本文的實例中經過碘克沙醇(iodixanol)梯度純化的製劑,其中GC #=顆粒#)的VP3帶體積相對於加載的GC顆粒進行繪製。所得線性等式(y=mx+c)用於計算測試物峰值的帶狀體積中的顆粒的數量。然後將加載的每20 μL顆粒數量(pt)乘以50,以得到顆粒(pt)/mL。將Pt/mL除以GC/mL得到顆粒與基因體拷貝的比率(pt/GC)。Pt/mL–GC/mL得到空pt/mL。空pt/mL除以pt/mL並×100得到空顆粒的百分比。
一般而言,用於測定具有包裝的基因體的空衣殼和AAV載體顆粒的方法是本技術領域已知的。參見例如,Grimm et al.,
Gene Therapy(1999) 6:1322-1330;Sommer et al., Molec. Ther. (2003) 7:122-128。為了測試變性的衣殼,該方法包含使經過處理的AAV儲料經受SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(由能夠分離三種衣殼蛋白的任何凝膠組成,例如在緩衝液中含有3-8%三乙酸鹽的梯度凝膠),然後運行凝膠直到分離出樣品材料,並且將凝膠印漬到尼龍或硝酸纖維素膜(較佳為尼龍)上。然後,將抗AAV衣殼抗體用作與變性的衣殼蛋白結合的初級抗體,較佳為抗AAV衣殼單株抗體,最佳為B1抗AAV2單株抗體(Wobus et al.,
J. Virol. (2000) 74:9281-9293)。然後使用次級抗體,該次級抗體與初級抗體結合並含有一種用於檢測與初級抗體的結合的裝置,更佳為含有與其共價結合的檢測分子的抗IgG抗體,最佳為與辣根過氧化物酶共價連接的綿羊抗小鼠IgG抗體。用於檢測結合之方法用於半定量地確定初級抗體與次級抗體之間的結合,較佳為能夠檢測放射性同位素發射、電磁輻射或比色變化的檢測方法,最佳為化學發光檢測套組。例如,對於SDS-PAGE,可從管柱濾分中提取樣品並在含有還原劑(例如,DTT)的SDS-PAGE上樣緩衝液中加熱,並且在預製的梯度聚丙烯醯胺凝膠(例如,Novex)上解析衣殼蛋白。可根據製造商的說明使用SilverXpress (Invitrogen,CA)或其他合適的染色方法(即SYPRO紅寶石色或考馬斯染色(coomassie stain))進行銀染色。在一個具體實施例中,可藉由定量即時PCR (Q-PCR)測量管柱濾分中的AAV載體基因體(vg)的濃度。將樣品稀釋並用DNase I (或另一種合適的核酸酶)消化以去除外源性DNA。在核酸酶去活化後,使用引子和對引子之間的DNA序列具有特異性的TaqMan™螢光探針進一步稀釋和擴增樣品。在Applied Biosystems Prism 7700 Sequence Detection System上測量每種樣品達到定義的螢光水平所需的週期的數量(閾值週期,Ct)。含有與AAV載體中所含序列相同的序列的質體DNA用於在Q-PCR反應中產生標準曲線。從樣品獲得的週期閾值(Ct)的值用於藉由相對於質粒標準曲線的Ct值對其進行標準化來確定載體基因體力價。亦可使用基於數字PCR的端點測定。
在一方面,使用優化的q-PCR方法,其利用廣譜絲胺酸蛋白酶,例如蛋白酶K (例如可從Qiagen商購獲得)。更具體而言,優化的qPCR基因體力價分析與標準分析相似,除了在DNaseI消化之後,將樣品以蛋白酶K緩衝液稀釋並以蛋白酶K處理,然後加熱去活化。適當地,將樣品以等量於樣品大小的蛋白酶K緩衝液稀釋。蛋白酶K緩衝液可濃縮至2倍或更高。通常,蛋白酶K處理約為0.2 mg/mL,但可在0.1 mg/mL至約1 mg/mL之間變化。處理步驟通常在約55℃下進行約15分鐘,但可在較低溫度(例如,約37℃至約50℃)下進行較長一段時間(例如,約20分鐘至約30分鐘),或在較高溫度(例如,高至約60℃)下進行較短一段時間(例如,約5至10分鐘)。類似地,加熱去活化通常在約95℃下保持約15分鐘,但溫度可降低(例如,約70℃至約90℃)並延長時間(例如,約20分鐘至約30分鐘)。然後將樣品稀釋(例如,1000倍)並如標準分析中所述進行TaqMan分析。
另外或可替代地,可使用微滴數位化PCR(ddPCR)。例如,藉由ddPCR確定單股及自我互補AAV載體基因體力價的方法已被敘述。參見例如,M. Lock et al, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr; 25(2):115-25. Doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14。ddPCR方法直接測量衣殼化載體基因體的濃度。樣品以DNase I處理以消化樣品中存在的任何非衣殼化DNA,然後以蛋白酶K處理以破壞衣殼。然後將樣品稀釋至適合測定範圍。將樣品與ddPCR Supermix混合,並使用靶向對
PCSK9基因(ARCUS)具有特異性之巨核酸酶的序列特異性引子,結合與此相同區域雜交的螢光標記探針,完成檢測。將20微升的ddPCR反應混合物在Bio-Rad液滴產生器中處理,並將ddPCR反應混合物分配成≥10,000個液滴。液滴生成後,ddPCR反應混合物進行PCR擴增,並使用Bio-Rad Droplet Reader讀取擴增的ddPCR反應混合物。
感染單位(IU)測定可用於確定rAAV載體在RC32細胞(表現rep2的HeLa細胞)中的生產性攝取和複製。採用與先前公開的類似的96孔端點格式。簡而言之,RC32細胞將被rAAV BDS的系列稀釋和Ad5的均勻稀釋共同感染,每個rAAV稀釋12次重複。感染後72小時,細胞將被裂解,並進行qPCR以檢測rAAV載體在輸入上的擴增。將進行終點稀釋50%組織培養感染劑量(TCID
50)計算(Spearman-Karber)以確定感染力價,以IU/mL表示。由於「感染性」值取決於每個顆粒與細胞的接觸、受體結合、內化、轉運到細胞核和基因體複製,因此它們受測定幾何形狀以及所用細胞株中存在的適當受體和結合後途徑的影響。受體和結合後途徑通常不保留在永生化細胞株中,因此感染性測定力價不是存在的「感染性」顆粒數量的絕對量度。然而,包裹的GC與「感染單位」的比率(描述為GC/IU比率)可用作衡量批次間產品一致性的指標。
簡而言之,將具有包裝基因體序列的rAAV顆粒與基因體缺陷型AAV中間體分離的方法包括對包含重組AAV病毒顆粒和AAV衣殼中間體的懸浮液進行快速高效液相層析,其中AAV病毒顆粒和AAV中間體與在高pH平衡的強陰離子交換樹脂結合,AAV病毒顆粒和AAV中間體與在高pH平衡的強陰離子交換樹脂結合,並經受鹽梯度,同時監測洗提液在約260和約280處的紫外線吸光度。可根據選定的AAV調整pH值。參見,例如,WO 2017/160360 (AAV9)、WO 2017/100704 (AAVrh10)、WO 2017/100676 (例如,AAV8)、及WO 2017/100674 (AAV1)],其等藉由引用而併入本文。在此方法中,當A260/A280的比值達到轉折點時,從洗提的濾分中收集AAV全衣殼。在一個實例中,對於親和層析步驟,滲濾後的產物可應用於有效捕獲AAV2血清型的Capture Select
TMPoros-AAV2/9親和樹脂(Life Technologies)。在這些離子條件下,顯著比例的殘留細胞DNA和蛋白質流過管柱,而AAV顆粒被有效捕獲。
雙載體系統
在另一態樣中,提供用於治療遺傳病症的雙載體系統。該系統包括(a)基因編輯組分,其包括編碼靶向PCSK9之巨核酸酶的核酸序列及指導該核酸酶在包含PCSK9基因之標靶細胞中表現的調控序列;及(b)供體載體,其包含編碼用於從PCSK9基因座表現之OTC的核酸序列,其中該系統進一步包含指導該核酸酶特異性靶向天然PCSK9基因座的序列。雙載體之組分如本文所述。
在一個具體實施例中,基因編輯載體之表現匣包括SEQ ID NO:2之核苷酸211至2964的序列或與SEQ ID NO:2之核苷酸211至2964的序列共享至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或至少99.9%同一性的序列。
在一個具體實施例中,供體載體之表現匣包括SEQ ID NO:6之核苷酸178至3281的序列或與SEQ ID NO:6之核苷酸178至3281的序列共享至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或至少99.9%同一性的序列。
雖然如果基因編輯載體與模板載體的比率為約1比約1,則該系統可為有效的,但希望供體模板載體的存在量超過基因編輯載體。在一具體實施例中,編輯載體(a)與供體載體(b)的比例為約1:3至約1:100,或約1:10。在某些具體實施例中,編輯載體(a)與供體載體(b)的比例為約1:3。在某些具體實施例中,編輯載體(a)與供體載體(b)的比例為約1:2。在某些具體實施例中,編輯載體(a)與供體載體(b)的比例為約1:2.5。在某些具體實施例中,編輯載體(a)與供體載體(b)的比例為約1:3.5。在某些具體實施例中,編輯載體(a)與供體載體(b)的比例為約1:4。在某些具體實施例中,編輯載體(a)與供體載體(b)的比例為約1:4.5。在某些具體實施例中,編輯載體(a)與供體載體(b)的比例為約1:5。
在一個具體實施例中,雙載體系統包括包含AAV衣殼及第一載體基因體的基因編輯AAV,該第一載體基因體包含5’ ITR、編碼在調控序列控制下靶向PCSK9的巨核酸酶的序列(該調控序列指導該巨核酸酶在包含PCSK9基因之標靶細胞中的表現)、及3’ ITR;及(b)包含AAV衣殼及第二載體基因體之供體AAV載體,其該第二載體基因體包含:5’ ITR、5’同源性定向重組(HDR)臂、OTC轉殖基因及指導轉殖基因在標靶細胞中之表現的調控序列、3’ HDR臂、及3’ ITR。
醫藥組成物
在另一態樣中,提供一種醫藥組成物,其包含第一rAAV原液(stock),該rAAV原液包含rAAV基因編輯載體,該rAAV基因編輯載體包含表現匣,該表現匣包含編碼靶向PCSK9(例如,SEQ ID NO:3之蛋白質序列)之巨核酸酶的核酸序列及指導該核酸酶在包含PCSK9基因之標靶細胞中表現的調控序列;及第二rAAV原液,其包含rAAV供體載體,該rAAV供體載體包含轉殖基因匣,該轉殖基因匣包含編碼OTC轉殖基因(例如,SEQ ID NO:4之編碼序列)之核酸序列及指導轉殖基因在標靶細胞中表現的調控序列。醫藥組成物含有可選擇的載劑、賦形劑、及/或防腐劑。在一些具體實施例中,供體載體進一步包括轉殖基因匣之同源性定向重組(HDR)臂5’及3’。在一個具體實施例中,用於供體載體、基因編輯載體、或二者的AAV衣殼為AAVrh79衣殼。
如本文所使用,「載劑」包括任何及所有的溶劑、分散介質、媒劑、塗料、稀釋劑、抗細菌及抗真菌劑、等滲及吸收延遲劑、緩衝劑、載劑溶液、懸浮液、膠體等。此類用於醫藥活性物質的介質及試劑的用途為技術領域中所熟知的。補充活性成分亦可摻入組成物中。短語「醫藥上可接受的」係指當投予宿主時不會產生過敏或類似不良反應的分子實體及組成物。遞送媒劑,例如脂質體、奈米膠囊、微粒、微球、脂質顆粒、囊泡等可用於將本發明之組成物導入適當的宿主細胞中。特別是,可將rAAV載體遞送載體基因體調配用於遞送包封在脂質顆粒、脂質體、囊泡、奈米球或奈米顆粒等之中。
在一個具體實施例中,組成物包括適於遞送至受試者的最終調配物,例如,為緩衝至生理學上可相容的pH及鹽濃度的水性液體懸浮劑。可選擇地,一或多種表面活性劑可存在於調配物中。在另一具體實施例中,組成物可作為濃縮物輸送,將其稀釋後投予受試者。在其他具體實施例中,組成物可被凍乾並在投予時重構(reconstituted)。
本領域熟知的用於製備調配物的方法和藥劑已被描述,例如,描述於“Remington’s Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Company, Easton, Pa。調配物可例如含有賦形劑、載劑、穩定劑、或稀釋劑,諸如無菌水、鹽水、聚亞烷基二醇(諸如聚乙二醇)、植物油、或氫化萘、防腐劑(諸如十八烷基二甲基芐基、氯化銨、六甲氯銨(hexamethonium chloride)、氯化烷基二甲基苄基銨(benzalkonium chloride)、氯化苯索寧(benzethonium chloride)、苯酚、丁醇或芐醇、對羥基苯甲酸烷基酯(alkyl parabens)(諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯)、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇和間甲酚)、低分子量多肽、蛋白質(諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)、親水聚合物(諸如聚乙烯吡咯啶酮、胺基酸(諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸及離胺酸)、單醣、二糖、及其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖、及糊精、螯合劑(諸如EDTA)、糖類(諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇;成鹽反離子,諸如鈉;金屬複合物(例如鋅-蛋白質複合物);及/或非離子表面活性劑,諸如TWEEN™、PLURONICS™或聚乙二醇(PEG)。
活性成分亦可包埋於微膠囊中,例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備,例如,分別在膠體藥物遞送系統(例如,脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米顆粒和奈米膠囊)或粗滴乳液中的羥甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊。此類技術揭示於Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)。
適當的表面活性劑或表面活性劑之組成物可選自無毒非離子表面活性劑之中。在一個具體實施例中,選擇終止於一級羥基的雙官能嵌段共聚物表面活性劑,例如Pluronic® F68 [BASF],亦稱為泊洛沙姆(Poloxamer) 188,其具有中性pH,平均分子量為8400。可選擇其他表面活性劑和其他泊洛沙姆,即由兩側是兩個聚氧乙烯(聚(環氧乙烷))親水鏈的聚氧丙烯(聚(環氧丙烷))中央疏水鏈所構成的非離子三嵌段共聚物、SOLUTOL HS 15 (聚乙烯二醇(Macrogol)-15羥基硬脂酸酯)、LABRASOL (聚氧基辛基甘油酯(Polyoxy capryllic glyceride))、聚氧基10油基醚、TWEEN(聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯)、乙醇和聚乙二醇。在一個具體實施例中,調配物包含泊洛沙姆。這些共聚物通常用字母「P」(用於泊洛沙姆)跟三個數字命名:前兩個數字x100給出聚氧丙烯核心的近似分子量,最後一個數字x10給出聚氧乙烯含量百分比。在一個具體實施例中,選擇泊洛沙姆188。表面活性劑可以懸浮液的高至約0.0005%至約0.001%的量存在。
以足夠的量將載體投予轉染細胞並提供足夠程度的基因轉移和表現,以提供治療益處而沒有不適當的副作用,或具有醫學上可接受的生理作用,這可由醫學領域的技術人員確定。習知和醫藥上可接受的投予途徑包括,但不限於直接遞送至所需器官(例如,肝臟(可選擇地經由肝動脈)、肺臟、心臟、眼、腎臟)、經口、吸入、鼻內、鞘內、氣管內、動脈內、眼內、靜脈內、肌肉內、皮下、皮內和其他腸胃外投予途徑。在某些具體實施例中,投予途徑為IV。如果需要,可組合投予途徑。
病毒載體的劑量主要取決於例如所欲治療的症狀、患者的年齡、體重和健康等因素,因此可能因患者而異。例如,病毒載體的治療有效人類劑量通常為在約25至約1000微升至約100 mL溶液範圍內,該溶液含有濃度約1 x 10
9至1 x 10
16基因體病毒載體。調整劑量以平衡治療益處與任何副作用,並且此類劑量可以根據使用重組載體的治療應用而變化。可監測轉殖基因產物的表現程度以確定產生之病毒載體(較佳為含有袖珍基因之AAV載體)的投予頻率。可選擇地,類似於為治療目的而描述的那些劑量方案可用於使用本發明的組成物進行免疫。
可將複製缺陷病毒組成物配製成劑量單位,以含有在約1.0 x 10
9GC至約1.0 x 10
16GC範圍內的複製缺陷病毒的量(以治療平均體重為70 kg的受試者),包括在該範圍內的所有整數或分數量,且對於人類患者較佳為1.0 x 10
12GC至1.0 x 10
14GC。在一個具體實施例中,將組成物配製成每劑量含有至少1x10
9、2x10
9、3x10
9、4x10
9、5x10
9、6x10
9、7x10
9、8x10
9、或9x10
9GC,包括在該範圍內的所有整數或分數量。在另一具體實施例中,將組成物配製成每劑量含有至少1x10
10、2x10
10、3x10
10、4x10
10、5x10
10、6x10
10、7x10
10、8x10
10、或9x10
10GC,包括在該範圍內的所有整數或分數量。在另一具體實施例中,將組成物配製成每劑量含有至少1x10
11、2x10
11、3x10
11、4x10
11、5x10
11、6x10
11、7x10
11、8x10
11、或9x10
11GC,包括在該範圍內的所有整數或分數量。在另一具體實施例中,將組成物配製成每劑量含有至少1x10
12、2x10
12、3x10
12、4x10
12、5x10
12、6x10
12、7x10
12、8x10
12、或9x10
12GC,包括在該範圍內的所有整數或分數量。在另一具體實施例中,將組成物配製成每劑量含有至少1x10
13、2x10
13、3x10
13、4x10
13、5x10
13、6x10
13、7x10
13、8x10
13、或9x10
13GC,包括在該範圍內的所有整數或分數量。在另一具體實施例中,將組成物配製成每劑量含有至少1x10
14、2x10
14、3x10
14、4x10
14、5x10
14、6x10
14、7x10
14、8x10
14、或9x10
14GC,包括在該範圍內的所有整數或分數量。在另一具體實施例中,將組成物配製成每劑量含有至少1x10
15、2x10
15、3x10
15、4x10
15、5x10
15、6x10
15、7x10
15、8x10
15、或9x10
15GC,包括在該範圍內的所有整數或分數量。在一個具體實施例中,對於人類施用,劑量可在每劑量為1x10
10至約1x10
12GC之範圍,包括該範圍內的所有整數或分數量。
取決於待治療區域的大小、使用的病毒力價、投予途徑和方法的期望效果,這些上述劑量可以各種體積的載劑、賦形劑或緩衝劑調配物投予,範圍從約25至約1000微升,或更高的體積,包括在該範圍內的所有數量。
可選擇任何合適的投予路徑。因此,醫藥組成物可調配用於任何合適的投予路徑,例如,液體溶液或懸浮液形式(作為例如用於靜脈投予、經口投予等)。或者,醫藥組成物可為固體形式(例如,錠劑或膠囊形式,例如用於經口投予)。在一些具體實施例中,醫藥組成物可為粉末、滴劑、氣溶膠等形式。
在一態樣中,本文提供一種在調配物緩衝劑中包含微小病毒(parvovirus)載體的藥物組成物,該微小病毒載體包含如本文所述的至少一種基因編輯載體及至少一種供體載體。在某些具體實施例中,醫藥組成物包含不同載體群的組合。在一個具體實施例中,提供了在調配物緩衝劑中包含本文所述的單一rAAV群的醫藥組成物。本文提供的方法提供兩種單獨的含載體之懸浮液的共同投予。
方法
本文提供之組成物係用於治療鳥胺酸胺甲醯基轉移酶缺乏症。本文提供一種藉由共同投予本文所述之雙載體系統來治療人類病症的方法。在某些具體實施例中,本文提供用於治療鳥胺酸胺甲醯基轉移酶缺乏症之組成物,其包含非複製型重組腺相關病毒血清型rh79載體:AAVrh79.TBG.M2PCSK9.WPRE.bGH及AAVrh79.hHDR.TBG.hOTCco.bGH。
在一個具體實施例中,提供治療受試者之OTC缺乏症的方法。該方法包括對患有OTC缺乏症之受試者共同投予基因編輯AAV載體,該基因編輯AAV載體包含編碼靶向PCSK9之核酸酶的序列及指導該核酸酶在包含PCSK9基因之標靶細胞中表現的調控序列;及供體AAV載體,其包含轉殖基因及指導OTC轉殖基因在標靶細胞中之表現的調控序列。在一個具體實施例中,受試者為新生兒。
在某些具體實施例中,基因編輯AAV載體及供體載體經由相同路徑基本上同時遞送。在其他具體實施例中,先遞送基因編輯載體。在其他具體實施例中,先遞送供體載體。
在一個具體實施例中,rAAV之劑量為每劑量約1 x 10
9GC至約1 x 10
15基因體拷貝(GC)(以治療平均體重70 kg的受試者),且較佳為對於人類患者為1.0 x 10
12GC至2.0 x 10
15GC。在另一具體實施例中,劑量少於約1 x 10
14GC/kg受試者體重。在某些具體實施例中,投予患者的劑量為至少約1.0 x 10
9GC/kg、約1.5 x 10
9GC/kg、約2.0 x 10
9GC/g、約2.5 x 10
9GC/kg、約3.0 x 10
9GC/kg、約3.5 x 10
9GC/kg、約4.0 x 10
9GC/kg、約4.5 x 10
9GC/kg、約5.0 x 10
9GC/kg、約5.5 x 10
9GC/kg、約6.0 x 10
9GC/kg、約6.5 x 10
9GC/kg、約7.0 x 10
9GC/kg、約7.5 x 10
9GC/kg、約8.0 x 10
9GC/kg、約8.5 x 10
9GC/kg、約9.0 x 10
9GC/kg、約9.5 x 10
9GC/kg、約1.0 x 10
10GC/kg、約1.5 x 10
10GC/kg、約2.0 x 10
10GC/kg、約2.5 x 10
10GC/kg、約3.0 x 10
10GC/kg、約3.5 x 10
10GC/kg、約4.0 x 10
10GC/kg、約4.5 x 10
10GC/kg、約5.0 x 10
10GC/kg、約5.5 x 10
10GC/kg、約6.0 x 10
10GC/kg、約6.5 x 10
10GC/kg、約7.0 x 10
10GC/kg、約7.5 x 10
10GC/kg、約8.0 x 10
10GC/kg、約8.5 x 10
10GC/kg、約9.0 x 10
10GC/kg、約9.5 x 10
10GC/kg、約1.0 x 10
11GC/kg、約1.5 x 10
11GC/kg、約2.0 x 10
11GC/kg、約2.5 x 10
11GC/kg、約3.0 x 10
11GC/kg、約3.5 x 10
11GC/kg、約4.0 x 10
11GC/kg、約4.5 x 10
11GC/kg、約5.0 x 10
11GC/kg、約5.5 x 10
11GC/kg、約6.0 x 10
11GC/kg、約6.5 x 10
11GC/kg、約7.0 x 10
11GC/kg、約7.5 x 10
11GC/kg、約8.0 x 10
11GC/kg、約8.5 x 10
11GC/kg、約9.0 x 10
11GC/kg、約9.5 x 10
11GC/kg、約1.0 x 10
12GC/kg、約1.5 x 10
12GC/kg、約2.0 x 10
12GC/kg、約2.5 x 10
12GC/kg、約3.0 x 10
12GC/kg、約3.5 x 10
12GC/kg、約4.0 x 10
12GC/kg、約4.5 x 10
12GC/kg、約5.0 x 10
12GC/kg、約5.5 x 10
12GC/kg、約6.0 x 10
12GC/kg、約6.5 x 10
12GC/kg、約7.0 x 10
12GC/kg、約7.5 x 10
12GC/kg、約8.0 x 10
12GC/kg、約8.5 x 10
12GC/kg、約9.0 x 10
12GC/kg、約9.5 x 10
12GC/kg、約1.0 x 10
13GC/kg、約1.5 x 10
13GC/kg、約2.0 x 10
13GC/kg、約2.5 x 10
13GC/kg、約3.0 x 10
13GC/kg、約3.5 x 10
13GC/kg、約4.0 x 10
13GC/kg、約4.5 x 10
13GC/kg、約5.0 x 10
13GC/kg、約5.5 x 10
13GC/kg、約6.0 x 10
13GC/kg、約6.5 x 10
13GC/kg、約7.0 x 10
13GC/kg、約7.5 x 10
13GC/kg、約8.0 x 10
13GC/kg、約8.5 x 10
13GC/kg、約9.0 x 10
13GC/kg、約9.5 x 10
13GC/kg、或約1.0 x 10
14GC/kg受試者體重。
以足夠的量將載體投予轉染細胞並提供足夠程度的基因轉移和表現,以提供治療益處而沒有不適當的副作用,或具有醫學上可接受的生理作用,這可由醫學領域的技術人員確定。在某些具體實施例中,使用IV投予。
如果產生足夠量的功能性酶或蛋白質以改善患者的狀況,則本文所述的系統可對治療有用。在某些具體實施例中,低至5%水平的健康患者的基因表現水平將為患者提供足夠的治療效果。在其他具體實施例中,基因表現水平係在人類(或其他獸醫受試者)中觀察到的正常範圍(水平)的至少約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%。例如,「功能性酶」意指編碼野生型酶(例如OTCase)的基因,其提供野生型酶或其與疾病無關之天然變體或多晶型物的至少約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或約相同、或大於100%的生物活性水平。類似地,無可檢測量的酶的患者可藉由將酶功能遞送至低於100%的活性水平來挽救,並可選擇地隨後接受進一步的治療。在某些具體實施例中,在藉由供體模板遞送基因功能的情況下,患者的表現水平可高於「正常」、健康受試者中的水平。如本文所述,本文所述的治療可與其他治療結合使用,即用於受試者(患者)診斷的護理標準。
在一個具體實施例中,該方法進一步包含向受試者投予免疫抑制共同療法。此類免疫抑制共同療法可在遞送rAAV或所揭示之組成物之前開始,例如,如果檢測到AAV衣殼的中和抗體水平過高。在某些具體實施例中,作為預防措施,也可以在遞送rAAV之前開始共同治療。在某些具體實施例中,免疫抑制共同療法在rAAV遞送後開始,例如,如果在治療後觀察到不希望的免疫反應。
用於此類共同治療的免疫抑製劑包括,但不限於,糖皮質素、類固醇、抗代謝物、T細胞抑制劑、巨環內酯(例如,雷帕黴素(rapamycin)或雷帕黴素類似物)、及細胞抑制劑,包括烷化劑、抗代謝物、細胞毒性抗生素、抗體或對免疫親和素有活性之藥劑。免疫抑制劑可包括強體松(prednisolone)、氮芥(nitrogen mustard)、亞硝脲(nitrosourea)、鉑化合物、胺甲喋呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azathioprine)、巰嘌呤(mercaptopurine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、放線菌素(dactinomycin)、蒽環類(anthracycline)、絲裂黴素C(mitomycin C)、博來黴素(bleomycin)、光輝黴素(mithramycin)、IL-2受體-(CD25-)或CD3-導向的抗體、抗IL-2抗體、環孢素(cyclosporin)、他克莫司(tacrolimus)、西羅莫司(sirolimus)、IFN-β、IFN-γ、類鴉片(opioid)、或TNF-α (腫瘤壞死因子-α)結合劑。在某些具體實施例中,免疫抑制治療可在rAAV投予前0、1、2、7或更多天開始,或在rAAV投予後0、1、2、3、7或更多天開始。此類治療可涉及在同一天單一藥物(例如強體松)或共同投予二種或多種藥物,(例如,強體松、嗎替麥考酚酯(micophenolate mofetil,MMF)及/或西羅莫司(即,雷帕黴素))。於基因治療投予後能以相同劑量或調整劑量繼續使用一種或多種這些藥物。此類療法可根據需要持續約1週(7天)、兩週、三週、約60天或更長。在某些具體實施例中,選擇不含他克莫司的方案。
在另一具體實施例中,該方法包括與標準OTC療法共同治療。OTC缺乏症的治療主要集中在血氨水平的飲食管理上,以避免高氨血症或在高氨血症發作期間從血液中去除過量的氨(NORD, 2021)。患有OTC缺乏症的個體遵循飲食限制,限制他們的蛋白質攝取量以控制血氨水平。嬰兒的飲食限制必須仔細平衡,他們需要攝入足夠的蛋白質以確保正常生長,同時避免可能引發高氨血症發作的過量蛋白質攝取(Berry and Steiner, 2001)。因此,嬰兒著重高熱量、低蛋白質的飲食,並輔以必需胺基酸。在高氨血症發作中,可在24小時內從患者的飲食中去除所有蛋白質(NORD, 2021)。
有幾種藥物被設計來刺激從血流中去除氮。苯基丁酸鈉(Buphenyl)被美國食品藥物管理局(FDA)批准用於治療OTC缺乏症患者的慢性高氨血症。一旦代謝,Buphenyl轉化為苯乙酸鹽,它與麩醯胺酸結合形成苯基乙醯基麩醯胺酸,由腎臟***,為氮***提供了替代途徑。苯丁酸甘油(glycerol phenylbutyrate)(Ravicti)亦被FDA批准用於治療患有尿素循環病症之患者的慢性高氨血症。如同Buphenyl,Ravicti被轉化為苯乙酸鹽,並遵循相同的***氮的機制(Lichter-Konecki et al., 1993; Gordon, 2003; Magellan, 2021)。最後,Ammonul (苯乙酸鈉和苯甲酸鈉)被FDA批准作為治療患有尿素循環病症之患者的急性高氨血症的輔助療法。Ammonul的苯乙酸鈉成分遵循與Buphenyl和Ravicti產生的苯乙酸鹽代謝物相同的氮***機制。Ammonul的苯甲酸鈉成分與甘胺酸結合形成馬尿酸,馬尿酸由腎臟排出並通過此過程去除氮。苯甲酸鈉亦可以口服製劑提供用於長期維持OTC缺乏症,並且因為被認為具有較少的副作用而通常優於Buphenyl和Ravicti (Lichter-Konecki et al., 1993)。
許多患有OTC缺乏症的人接受精胺酸或瓜胺酸治療,這是確保蛋白質合成以正常速度進行所必需的。瓜胺酸通常被選擇用於精胺酸的慢性治療,因為它會將天冬胺酸鹽結合到尿素循環中,這表示其為該途徑貢獻一個額外的氮分子(Lichter-Konecki et al., 1993;Magellan, 2021)。
在進展至嘔吐及嗜睡的高氨血症發作中,可能需要住院治療,並且個體可能會以含有精氨酸及Ammonul的靜脈輸液治療。若這些治療不成功,可能需要血液濾過或血液透析以迅速降低血氨水平(Lichter-Konecki et al., 1993)。
肝移植是預防新生兒嚴重OTC缺乏症患者高氨血症危機及神經發育惡化的最有效策略。對於輕度或管理良好的OTC缺乏症患者,壓力源可在任何年齡段引起危及生命的高氨血症事件。對此類事件的恐懼,加上這些患者因飲食限制和可伴有顯著副作用之氮清除劑的長期治療而面臨的生活品質下降,促使許多患者尋求肝移植,即使他們的病情得到妥善管理(Lichter-Konecki et al., 1993)。
在一態樣中,提供治療患有鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(OTC)缺乏症之患者的方法,其使用包含巨核酸酶之核酸酶表現匣,其在如本文所述之TBG啟動子的控制下識別人類PCSK9基因內的位點。該方法進一步包括投予攜帶SEQ ID NO:4之OTC轉殖基因或與其共享至少90%同一性之序列的表現匣,如本文所述。
存在多種用於測量體外OTC表現和活性水平的測定法。參見,例如,X Ye, et al, 1996 Prolonged metabolic correction in adult ornithine transcarbamylase-deficient mice with adenoviral vectors. J Biol Chem 271:3639–3646)或活體內。例如,OTC酶活性可使用液相層析質譜穩定同位素稀釋法檢測標準化為[1,2,3,4,5-13C5]瓜胺酸(98% 13C)的瓜胺酸的形成。該方法從先前開發的用於檢測N-乙醯麩胺酸鹽合成酶活性的測定法調整[Morizono H,
et al, Mammalian N-acetylglutamate synthase. Mol Genet Metab. 2004;81(Suppl 1):S4–11.]。將新鮮冷凍肝臟切片稱重並在含有10 mM HEPES、0.5% Triton X-100、2.0 mM EDTA和0.5 mM DTT的緩衝劑中短時間地均質化。調整均質化緩衝劑的體積以獲得50 mg/ml組織。使用含250 μg肝組織之50 mM Tris-乙酸鹽、4 mM鳥胺酸、5 mM胺甲醯磷酸鹽,在pH 8.3中測量酶活性。加入新鮮製備的溶於50 mM Tris-乙酸鹽pH 8.3中的50 mM胺甲醯磷酸鹽開始酶活性,使其在25°C下進行5分鐘,並藉由加入等體積的含5 mM 13C5-瓜胺酸之30%TCA來淬滅。藉由5分鐘的微量離心分離碎片,並將上清液轉移到小瓶中用於質譜分析。在等度條件下將10 μL樣品注入Agilent 1100系列LC-MS,流動相為93%溶劑A (含1 ml三氟乙酸之1L水):7%溶劑B (含1 ml三氟乙酸之1L的1:9水/乙腈)。將對應於瓜胺酸之峰[176.1質量電荷比(m/z)]及13C5-瓜胺酸(181.1 m/z)量化,並將它們的比率與每次測定運行的瓜胺酸標準曲線獲得的比率進行比較。將樣品標準化為總肝臟組織或使用Bio-Rad蛋白質測定套組(Bio-Rad, Hercules, CA)測定的蛋白質濃度。亦可使用不需要肝臟生檢的其他測定。一種此類測定是血漿胺基酸測定,其中評估麩醯胺酸與瓜胺酸的比例,如果麩醯胺酸高(>800微升/升)而瓜胺酸低(例如,個位數),懷疑是尿素循環缺陷。可測量血漿氨水平,每升約100微莫耳的濃度表示OTCD。如果患者過度換氣,則可以評估血中氣體;呼吸性鹼中毒在OTCD中很常見。尿液中的乳清酸(Orotic acid),例如每毫莫耳肌酸大於約20微莫耳,是OTCD的指徵,在異嘌呤醇(allopurinol)激發試驗後尿乳清酸鹽升高也是如此。OTCD的診斷標準已被提出於Tuchman
et al, 2008, Urea Cycle Disorders Consortium (UCDC) of the Rare Disease Clinical Research Network (RDCRN). Tuchman M,
et al., Consortium of the Rare Diseases Clinical Research Network. Cross-sectional multicenter study of patients with urea cycle disorders in the United States. Mol Genet Metab. 2008;94:397–402,其藉由引用併入本文。亦可參見,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK154378/,其提供目前OTCD之護理標準的討論。
在某些具體實施例中,如本文所述,可投予醫藥組成物中的核酸酶表現匣、病毒載體(例如,rAAV)或任何相同的載體用於患者的基因編輯。在某些具體實施例中,該方法有用於非胚胎的基因編輯。在某些具體實施例中,患者為嬰兒(例如,從出生至約4個月)。在某些具體實施例中,患者年齡大於嬰兒,例如,12月或更大。
如本文所使用,「一」、「一種」或「該」可意指一種或大於一種。例如,「一種」細胞可意指單一細胞或多個細胞。
如本文所使用,術語「特異性」意指核酸酶僅在稱為識別序列之鹼基對的特定序列處或僅在特定的一組識別序列處識別和切割雙股DNA分子的能力。該組識別序列將共享某些保留位置或序列模體,但可在一個或多個位置簡併。高度特異性的核酸酶只能切割一個或很少的識別序列。特異性可藉由本領域已知的任何方法確定。
本文所述之(基因編輯及供體)表現匣可被工程化為任何合適的遺傳元件以遞送至標靶細胞,諸如載體。如本文所使用,「載體」為包含核酸序列的生物學或化學部分,其可被導入合適的宿主細胞以複製或表現該核酸序列。
「質體」或「質體載體」在本文中通常是由在載體名稱之前及/或之後的小寫p指定。可根據本發明使用的質體、其他選殖和表現載體、其特性以及其構築/操作方法對於本領域技術人員而言是顯而易見的。
如本文中所使用,術語「可操作地連接的」係指與目的基因相鄰的表現控制序列、及反向或遠距離起作用以控制目的基因的表現控制序列。
用於描述核酸序列或蛋白質的術語「外源性」意指核酸或蛋白質並非天然存在於其在染色體或宿主細胞中所存在的位置。外源核酸序列亦指源自並***相同表現匣或宿主細胞中的序列,但其以非天然狀態存在,例如不同拷貝數,或在不同調控元件的控制下。
當涉及蛋白質或核酸使用時,術語「異源的」表示蛋白質或核酸包含在自然界中彼此之間沒有相同關係的兩個或更多個序列或子序列。舉例而言,核酸通常是重組產生的,具有二或多個來自無關基因的序列,其排列以產生新的功能性核酸。例如,在一個具體實施例中,該核酸具有來自一個基因的啟動子,其被安排為指導來自不同基因的編碼序列的表現。
如本文所使用,術語「宿主細胞」可指其中由質體產生的載體(例如,重組AAV)的包裝細胞株。或者,術語「宿主細胞」可指希望其轉殖基因的表現之標的細胞。因此,「宿主細胞」係指含有外源或異源核酸序列的原核或真核細胞,該核酸序列已藉由任何方法導入細胞中,例如,電穿孔、磷酸鈣沉澱、顯微注射、轉化、病毒感染、轉染、微脂體遞送、膜融合技術、高速DNA包覆的小丸、病毒感染和原生質體融合。在本文某些具體實施例中,術語「宿主細胞」係指用於活體外評估本文所述組成物的各種哺乳動物物種的細胞培養物。在本文其他具體實施例中,術語「宿主細胞」係指用於產生和包裝病毒載體或重組病毒的細胞。在另一個具體實施例中,術語「宿主細胞」欲指在體內針對本文所述的疾病或症狀進行治療的受試者的標靶細胞。在某些具體實施例中,術語「宿主細胞」為肝臟細胞或肝細胞。
「受試者」為哺乳動物,例如,人類、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、貓、馬、牛、豬、或非人類靈長類動物,諸如猴子、黑猩猩、狒狒或大猩猩。患者係指人類。獸醫受試者係指非人類哺乳動物。在某些具體實施例中,受試者的PCSK9基因並沒有缺陷。
在某些具體實施例中,受試者患有OTC缺乏症或有發展成OTC缺乏症的風險。在某些具體實施例中,受試者有OTCD突變的書面遺傳確認。在某些具體實施例中,受試者具有,或先前具有高氨血症危機(HAC)。在某些具體實施例中,受試者目前正在接受OTC缺乏症治療,例如,以至少一種氮清除劑療法及/或蛋白質限制飲食。
在某些具體實施例中,受試者為男性。在某些具體實施例中,理想的是在出生後數小時內治療受試者,例如年齡至少12小時、年齡24小時、年齡36小時或年齡48小時。在其他具體實施例中,理想的是在出生後數天內治療受試者,例如出生後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天。在其他具體實施例中,理想的是在出生後數週內治療受試者,例如出生後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或16週。在其他具體實施例中,理想的是在出生後數月內治療受試者,例如出生後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24個月。在某些具體實施例中,受試者在24小時至4月齡時接受治療。在一些具體實施例中,受試者為男性嬰兒,在24小時至4月齡時接受治療,並具有與新生兒發作的OTC缺乏症一致的OTCD突變的書面基因確認,具有或不具有當前或過去的高氨血症危機(HAC),目前正接受至少一種氮清除劑治療及限制蛋白質的飲食。建議的研究人群包括需求未得到滿足的受試者,並且由於發病率和死亡率降低以及存活率增加,有可能觀察到復發性高氨血症事件的頻率和嚴重程度穩定或改善,同時可能會在52週的協議時間範圍內推遲對肝移植的需求。
「複製缺陷病毒」或「病毒載體」係指一合成或人工的病毒顆粒,其中含有感興趣基因的表現盒被包裝於病毒殼體或套膜中,其中任何病毒基因體序列亦被包裝於病毒衣殼或套膜內為複製缺陷的,即它們不能產生子代病毒體但保留感染標靶細胞的能力。在一個具體實施例中,病毒載體的基因體不包括編碼複製所需的酶的基因(基因體可被工程化為「不含病毒基因的(gutless)」-僅含感興趣的基因,側接人工基因體擴增和包裝所需的訊號),但這些基因可在生產過程中提供。因此,其被認為用於基因治療是安全的,因為除非存在複製所需的病毒酶,否則不會發生子代病毒顆粒的複製和感染。
在核酸序列的情況下,術語「序列同一性」、「序列同一性百分比」或「同一性百分比」係指當用於最大對應排列比對時,兩個序列中相同的殘基。序列同一性比較的長度可超過基因體的全長、基因編碼序列的全長或至少約500至5000個核苷酸的片段是受期望的。然而,亦受期望的是較小片段之間的同一性,例如至少約九個核苷酸、通常至少約20至24個核苷酸、至少約28至32個核苷酸、至少約36個或更多個核苷酸。類似地,對於胺基酸序列,可在蛋白質的全長或其片段上容易地確定「序列同一性百分比」。適當地,片段長度為至少約8個胺基酸,並可多至約700個胺基酸。本文描述了適當片段的實例。
當提及胺基酸或其片段時,術語「實質上同源」或「實質上相似」表示當利用適當的胺基酸***或刪除與另一胺基酸(或其互補股)最佳排列比對時,經排列比對的序列中存在至少約95%至99%的胺基酸序列同一性。較佳地,同源是在全長序列、或其蛋白質,例如,cap蛋白、rep蛋白、或其長度為至少8個胺基酸、或更理想地為至少15個胺基酸的片段。本文描述了適當片段的實例。
術語「高度保守的」是指至少80%同一性,較佳為至少90%同一性,更佳為大於97%同一性。藉由本領域技術人員已知的運算法和電腦程式,本領域技術人員可易於確定同一性。
一般而言,當於兩不同腺相關病毒之間指「同一性」、「同源性」或「相似性」時,參照「排列比對的(aligned)」序列來測定「同一性」、「同源性」或「相似性」。「排列比對的」序列或「排列比對」係指多個核酸序列或蛋白質(胺基酸)序列,與參考序列相比,通常包含缺失或額外的鹼基或胺基酸的校正。在實例中,使用已公開的AAV9序列作為參考點進行AAV排列比對。使用許多公開或市售Multiple Sequence Alignment Programs進行排列比對。這類程式之實例包括「Clustal Omega」、「Clustal W」、「CAP Sequence Assembly」、「MAP」及「MEME」,其等可透過網際網路上的Web伺服器進行訪問。此類程式的其他來源是本領域技術人員已知的。或者,亦可使用Vector NTI公用程式。還有許多技術領域中已知可用於測量核苷酸序列同一性的演算法,包括上述程序中包含的演算法。作為另一實例,可使用Fasta™ (GCG版本6.1中的程序)比較多核苷酸序列,Fasta™提供在查詢和搜尋序列之間最佳重疊區域的排列比對和百分比序列同一性。例如,核酸序列之間的百分比序列同一性可使用Fasta™及其默認參數決定(字組大小為6及用於得分矩陣的NOPAM因數),如GCG版本6.1中所提供,藉由引用併入本文。胺基酸序列也可使用多序列排序比對程式,例如,「Clustal Omega」、「Clustal X」、「MAP」、「PIMA」、「MSA」、「BLOCKMAKER」、「MEME」及「Match-Box」程式。一般而言,此等程式之任一者皆於內定值下使用,儘管本項技術領域中具通常知識者可根據需要改變這些設定。或者,熟悉技術者可以利用提供至少由參考的算法及程式提供的同一性的程度或排列比對之另一算法或電腦程式。參見,例如,J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., “A comprehensive comparison of multiple sequence alignments”, 27(13): 2682-2690 (1999)。
如本文所使用,術語「約」係指與參考整數及其之間的值相差±10%的變體。例如,「約」40個鹼基對,包括±4(即,36-44個,包括整數36、37、38、39、40、41、42、43、44個)。對於其他值,尤其是參考百分比時(例如,90%同一性,約10%變異,或約36%錯配),術語「約」包括範圍內的所有值,包括整數和分數。
如本說明書上下文和申請專利範圍所使用的,術語「包含」、「含有」、「包括」、及其變體包括其他組分、元件、整數、步驟等。相反地,術語「由…組成」及其變體為排除其他組分、元素、整數、步驟等。
除非在本說明書中另有定義,本文使用的技術和科學術語具有與本領域中具有普通技術人員通常理解的含義相同的含義,並參考已公開內容,這些內容為本領域技術人員提供對本案說明書中使用的許多術語的一般指導。
實施例
我們描述了一種用於治療鳥胺酸胺甲醯基轉移酶缺乏症(OTCD)的基因體編輯方法,該方法可導致嬰兒期致命的高氨血症發作。基因體編輯的目標是使治療效果在所有OTCD患者中持久並達成,而與他們的突變無關。我們藉由使用兩種AAV載體治療倖存的新生兒來實現此一目標:一個是遞送核酸酶以在安全港位點產生雙股斷裂,而第二個是遞送OTC袖珍基因以嵌入此位點。我們的假設是,新生兒肝臟的肝細胞***將有助於有效嵌入OTC基因,並將通過稀釋消除未整合的輸入載體基因體。我們決定使用PCSK9基因作為安全港位點和一種稱為ARCUS的巨核酸酶來靶向它,這是基於我們之前在成年獼猴中的研究,該研究顯示在AAV遞送ARCUS後PCSK9安全、有效且穩定地減少。我們對OTCD基因體編輯的初步研究是在通過對內源性PCSK9基因的外顯子7進行生殖細胞系修飾而對PCSK9 ARCUS核酸酶敏感的OTC缺陷小鼠中進行的。將這兩種載體注射至新生兒小鼠體內導致有效嵌入人類OTC袖珍基因,並在受到高蛋白飲食激發時防護致死性高氨血症。在準備臨床研究時,我們評估了新生兒和嬰兒獼猴的關鍵安全性和有效性參數。共有24隻動物接受AAV載體的治療,分析包括在3個月和12個月時檢測肝臟生檢。在這些研究中,我們評估了以下參數對編輯效率和毒性的影響:轉殖基因(人類IX因子及人類OTC)、驅動ARCUS的啟動子、分支群E衣殼、轉殖基因側翼的供體長度及投予時獼猴的年齡。我們發現AAV載體的注射是非常安全的,在任何受ARCUS治療的動物中都沒有轉胺酶升高或肝臟組織病理學的證據。靈長類動物模型中療效的關鍵量度是藉由原位雜交和免疫染色測量的轉導效率,以分別檢測表現人類OTC mRNA和蛋白質的細胞。在第一個載體中使用帶有TBG啟動子的新型進化枝E衣殼驅動ARCUS,並在供體載體上使用500 bp側翼同源臂,使用載體獲得最高且最一致的結果。以此組合,我們達到10.0 ± 6.4% (N=6)轉導,其高於我們認為可以為患者提供實質益處的閾值,即約5% OTC表現細胞。初步數據表明,編輯水平穩定超過一年,且當注射到至多3個月齡的獼猴時,可達到有效的靶向***。PCSK9標靶基因座之分子分析表明,絕大多數的載體基因體嵌入是通過非同源末端連接(NHEJ)而不是同源性定向修復(homology directed repair,HDR)。總之,OTCD的新生兒形式的大量未滿足需求值得考慮實驗性療法,例如本報告中描述的基因體編輯。
實施例
1–
材料與方法
AAV載體是根據先前建立的程序和製造商的說明構築的。AAVhu37衣殼或AAVrh79衣殼用於如本文所述的實驗,其中指明。
所有動物程序均按照賓夕法尼亞大學機構動物護理和使用委員會(the Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Pennsylvania)批准的方案進行。
實施例
2–
新生兒
NHP
中的
ARCUS2
介導之
hOTC
基因靶向
新生兒(1-16日齡)或嬰兒(3-4月齡)恆河猴用於非GLP順應性的POC藥理學研究。ARCUS巨核酸酶靶向存在於人類及恆河猴獼猴
PCSK9基因的22-bp序列。因此,恆河猴獼猴用於評估在靶編輯(on-target editing) (藥理學)及安全性/毒理學。此外,新生和嬰兒恆河猴具有與人類嬰兒相似的解剖學和生理學特徵,將允許用於預期的臨床ROA (IV)用途。預計解剖結構和ROA的相似性將產生具有代表性的矢量分布和轉導輪廓,從而能夠更準確地評估測試物的藥理學和毒性,包括靶向和脫靶編輯以及臨床病理學,這在新生小鼠中是不可能的。
圖1A顯示本文提供的研究時間軸。圖1B提供有關投予組別的訊息,而示意性的載體顯示於圖2中。新生兒NHP (1-16日)被投予了ARCUS2核酸酶載體及具有不同長度HDR臂(500 bp臂或短HDR臂)的供體載體。圖3是顯示來自實驗的數據匯總表。所有14隻新生獼猴都良好地耐受載體輸注(即,沒有明顯的臨床後遺症)並且隨著時間的推移體重增加(圖4E)。肝酶水平在正常範圍內,除了在第14天一些動物的ALT水平短暫和適度升高(圖4B)。與僅投予AAV.Arcus的成年NHP相比,新生兒和嬰兒NHP的肝臟炎症大大減少(圖4J)。胰臟是唯一在其中鑑定出任何***或缺失的非肝臟組織(圖4I)。
對投予前從新生兒採集的第0天血漿樣品的分析顯示3隻動物(21-111、21-113、21-122)對於AAVrh79具有高水平(≥400)的結合抗體(圖3)。此等預先存在的抗AAVrh79抗體將阻斷AAV基因轉移。
隨著時間的推移,在所有新生動物中追蹤PCSK9水平,包括僅投予供體的對照動物。第0天的PCSK9水平在新生兒之間有所不同(圖4A)。九隻動物在載體投予後表現出PCSK9水平降低的趨勢,包括一隻僅投予供體的對照動物,而其餘五隻動物在投予後表現出PCSK9水平持續或短暫升高(圖4A)。
在第84天及在1年時,進行肝臟生檢。肝臟中hOTC的轉導效率藉由使用hOTC-及ARCUS-特異性探針的雙ISH檢測轉殖基因mRNA,並藉由OTC免疫螢光檢測人類OTC蛋白,然後在掃描的載玻片上定量(圖4C–ISH;圖4D–4F)。在投予時具有預先存在的抗AAVrh79結合抗體的三隻動物(21-111、21-113和21-122)藉由兩種方法並不顯示出任何OTC陽性肝細胞。兩隻僅投予供體的對照動物持續表現出低水平(≤2%)的hOTC轉導。在共同投予AAVrh79.TBG.PI.ARCUS.WPRE.bGH和AAVrh79.rhHDR.TBG.hOTCco.bGH供體載體(GTP-506)的兩隻動物中檢測到最高的轉導效率(藉由ISH為27.8%及23.6%)。亦發現陽性的表現hOTC的肝細胞以群集存在。此等水平高於使患者受益的閾值,即約5%的OTC表現細胞。數據證實,從供體載體中的強TBG啟動子及長同源臂驅動ARCUS產生最大的編輯。此外,在NB研究中,於F9供體載體中使用相同的ARCUS載體和相同的同源臂觀察到類似的高水平編輯。小鼠OTCD藥理學研究證實,對含有不同同源臂的供體進行一致的高編輯,包括本研究中長同源臂載體的小鼠相關性。以GTP-506編輯NB NHPs的水平足以顯示出強大的治療效果。
在第84天對來自每隻動物的肝臟生檢樣品進行分子分析以測量每個二倍體基因體的轉殖基因拷貝數、mRNA表現水平、在靶編輯及脫靶編輯(圖4H)。與轉導效率分析一致,第6組中的兩隻動物(21-157及21-175)具有最高的hOTC載體GC (圖4F)、hOTC mRNA (圖4G)及在靶***或缺失%(圖 4H)。動物中的ARCUS載體GC比hOTC載體GC低2倍至7倍,而ARCUS mRNA水平比hOTC mRNA水平低23倍和765倍(圖4F及4G)。
在本研究的第84天肝臟生檢樣品中,藉由ITR-seq評估的脫靶(OT)活性確定了2到40個潛在的脫靶。在多隻動物中檢測到一些脫靶位點,包括給予人類因子IX (hfIX)供體載體的動物。脫靶編輯進一步以潛在脫靶位點上的擴增子序列為特徵。圖14A提供脫靶位點的列表,連同染色體位點和與脫靶共通序列的最佳匹配。圖14B為顯示OT1-OT10的***或缺失百分比的圖表。在ARCUS + 供體動物中,對OT1、OT4及OT5的編輯明顯高於非核酸酶對照。新生兒/嬰兒的脫靶編輯低於成年NHP。
新生/嬰兒靈長類動物正在生長的肝臟非常容易接受供體基因的定點***。OTC的水平始終超過5%的治療閾值,這種效果似乎非常持久。此外,新生兒/嬰兒靈長類動物對全身性AAV的毒性具有耐受性。比較NHP及OTCD小鼠模型時,劑量及位點特異性整合(site-specific integration)之間存在極佳的相關性。
總之,我們確定一種ARCUS載體及hOTCco供體載體組合,當共同投予新生獼猴時,在投予後3個月可在肝臟中達到12-18.6%的轉導效率,二者均高於使患者受益的閾值,即約5% OTC-表現肝細胞。正在對本研究中的動物進行長期效率和安全性評估。投予後1年進行第二次肝生檢,以評估hOTC轉導的穩定性、肝臟組織病理學及肝臟中的靶向和脫靶。
實施例
3
–
PCSK9-hE7-KI
小鼠模型
由於人類和獼猴
PCSK9基因中的ARCUS靶向序列與鼠類
Pcsk9基因並不保守,我們不能使用ARCUS在小鼠基因體基因座中進行基因體編輯。因此,我們委託Jackson Laboratory生成嵌入(knock-in)小鼠模型,該模型將包括鼠類
Pcsk9基因外顯子7的區域置換成包含外顯子7的人類
PCSK9基因的區域,命名為
PCSK9-hE7-KI小鼠(圖5A-5C)。此模型可用於評估活體內基因體編輯和基因靶向效率。然後,我們將
PCSK9-hE7-KI小鼠與sparse fur ash (
spf
ash )小鼠雜交。
spf
ash 小鼠在
Otc基因外顯子4末端處的剪接供體位點具有G到A的點突變,其導致
OtcmRNA的異常剪接及OTC mRNA和蛋白質表現皆減少20倍(Hodges and Rosenberg, 1989)。受影響的動物有5-10%的殘留OTC活性,並可通過一般飲食(chow diet)生存,但牠們會出現高氨血症,在高蛋白飲食時可能是致命的(Yang et al., 2016)。
PCSK9-hE7-KI.spf
ash 小鼠模型可用於評估人類
OTC體內基因靶向的功效,並證實靶向效率和功效的相關性。然而,由於新生小鼠體型較小,血液臨床病理學和基因靶向臨床療效的評價只能在小鼠斷奶後,一旦牠們達到足夠的體重,並作為終末程序進行。
圖6顯示代表PCSK9-hE7嵌入對偶基因的人類PCSK9序列、小鼠PCSK9 (mPCSK9)及恆河猴PCSK9 (rhPCSK9)的265 bp序列的序列排列比對。在此265 bp區域中,人類和恆河猴序列之間有6個錯配。由於***了各種LINE和LTR,囓齒動物和靈長類動物的序列分歧超出了這個窗口。人類和小鼠之間的外顯子7存在2個胺基酸差異。藉由測定的ELISA,hE7-KI小鼠表現正常水平的mPCSK9。
實施例
4–
在
Pcsk9-hE7-KI.spf
ash
幼畜中活體內
OTC
基因靶向
Pcsk9
基因座
此非GLP順應性的藥理學研究旨在評估在新生PCSK9-hE7-KI.
spf
ash 小鼠中,人類
OTC基因的ARCUS巨核酸酶介導的嵌入是否可在經由預期的臨床ROA (IV)的單次共同投予ARCUS核酸酶表現載體與人類
OTC供體載體後在標靶組織中達到治療性人類OTC表現來用於治療OTC缺乏症(肝臟)。實驗設計的示意圖顯示於圖8A中。
在第0天,將劑量為1.0 x 10
13GC/kg的表現ARCUS巨核酸酶之AAVrh79載體(AAVrh79.TBG.PI.ARCUS.WPRE.bGH)與劑量為3.0 x 10
13GC/kg的三種不同AAVrh79 hOTCco供體載體中的一種的組合以IV共同投予新生(PND 1–2)雄性
PCSK9-hE7-KI.spf
ash 小鼠(圖8B)。在此研究中評估的ARCUS巨核酸酶表現載體(AAVrh79.TBG.PI.ARCUS.WPRE.bGH)與主要臨床候選者相同,而各hOTCco供體載體與主要臨床候選者相同,除了HDR臂之外。具體而言,雖然臨床候選者包括人類HDR序列的長版本(AAVrh79.hHDR.TBG.hOTCco.bGH),但此研究中評估的hOTCco供體載體包括小鼠-人類雜交HDR序列(AAVrh79.mhHDR.TBG.hOTCco.bGH)、人類HDR序列的較短版本(AAVrh79.shHDR.TBG.hOTCco.bGH)或沒有HDR序列(AAVrh79.TBG.hOTCco.bGH)。圖7顯示HDR臂與人類、嵌入小鼠和NHP序列的同源性比較。作為陰性對照,向另外的年齡匹配的
PCSK9-hE7-KI.spf
ash 小鼠投予不表現巨型核酸酶的AAVrh79載體(AAVrh79.TBG.PI.EGFP.WPRE.bGH)與AAVrh79.mhHDR.TBG.hOTCco.bGH的組合。
生存期間的評估包括每天進行的活力監測、體重測量、高蛋白飲食激發後的血漿PCSK9及血漿NH
3和尿乳清酸水平之評估,以及在第120天進行部分肝切除術,以評估在三分之二肝臟部分切除術後的人類
OTC轉導的穩定性。在第49天及第170天,各群組的一個子群接受為期10天的高蛋白飲食激發,然後在激發結束時進行屍檢。在屍檢時,收集肝臟以評估人類
OTC基因的嵌入,包括評估人類
OTCmRNA表現(原位雜交)、OTC蛋白表現(免疫染色)和藉由染色及/或酶活性測定所評估的OTC酶活性。分離肝臟DNA以評估在靶編輯(擴增子序列、牛津奈米孔長讀取定序(Oxford nanopore long-read sequencing))和評估載體基因體拷貝。
以具有mhHDR臂的載體投予的小鼠顯示出與野生型小鼠相當的存活率,在10天的高蛋白飲食激發後,以shHDR治療的小鼠達到80%的存活率(圖9A)。所有經治療的小鼠都比未經治療的KI-spf-ash小鼠維持更好的體重(圖9B)。與未經治療的小鼠相比,經mHDR治療的小鼠的血漿氨水平顯著地降低(圖9C)。
在第48天測量mPCSK9水平,所有治療的小鼠都顯示出降低(圖9D)。***或缺失百分比在HDR類型中相當一致(圖9E)。在以shHDR及mhHDR治療的小鼠中hOTC水平增加(圖9F)。
實施例
5–
評估在
Pcsk9-hE7-KI.spf
ash
幼畜中的功效及確定最小有效劑量
這項計劃的GLP順應性的藥理學研究旨在評估新生PCSK9-hE7-KI.
spf
ash 小鼠模型中IV投予AAV的療效並確定MED。表現ARCUS巨核酸酶的AAVrh79載體(AAVrh79.TBG.PI.ARCUS.WPRE.bGH)將是為計劃的GLP順應性的毒理學研究所製造的毒理學載體批次。本研究不使用包括人類HDR序列長版本(AAVrh79.hHDR.TBG.hOTCco.bGH)測試物,而是利用包括小鼠-人類雜交HDR序列的hOTCco供體載體(AAVrh79.mhHDR.TBG.hOTCco.bGH)。此載體將以與臨床候選者之毒理學載體批次相當的方法製造。
我們已選擇於本研究中使用供體載體中具有小鼠-人類雜交HDR序列(AAVrh79.mhHDR.TBG.hOTCco.bGH),以使我們能夠有效地研究這種方法的藥理學,其中供體序列與PCSK9-hE7-KI.
spf
ash 小鼠中的序列直接同源。
此研究將評估N=60隻新生兒(PND 1-2)新生PCSK9-hE7-KI.
spf
ash 小鼠且N=15隻年齡匹配的雄性PCSK9-hE7-KI.WT (野生型)作為對照。研究將包括一個屍檢時間點(90天) (參見圖15A中的研究設計)。對於功效評估,小鼠將從第81天到第90天接受為期10天的高蛋白飲食激發。將評估生存、身體狀況及生物標誌物變化。小鼠將接受三種劑量水平的測試物中的一種(1.0 x 10
12GC/kg核酸酶載體及3.0 x 10
12GC/kg供體載體、3.3 x 10
12GC/kg核酸酶載體及1.0 x 10
13GC/kg供體載體、或1.0 x 10
13GC/kg核酸酶載體及3.0 x 10
13GC/kg;每劑量N=20)或媒劑(磷酸鹽緩衝食鹽水[PBS];N=20)。劑量在圖15B中註明。
生存期間的評估將包括每天的活力檢查、存活監測、體重測量、高蛋白飲食激發後血清PCSK9水平、血漿NH
3及尿乳清酸水平的評估。屍檢將在第90天進行。在屍檢時,將收集血液用於CBC/差異和血清臨床化學分析。將收集表列的組織用於組織病理學評估。收集肝臟以評估人類
OTC基因的嵌入,包括評估人類
OTCmRNA表現(原位雜交)、OTC蛋白表現(免疫染色)、及藉由染色及/或酶活性測定所評估的OTC酶活性。亦分離肝臟DNA以評估在靶編輯(擴增子序列)及評估載體基因體拷貝。
將根據下述的分析來確定MED:經AAV治療的新生PCSK9-hE7-KI.
spf
ash 相較於經媒劑治療的新生PCSK9-hE7-KI.
spf
ash 對照小鼠之在高蛋白飲食後的存活、高蛋白飲食激發結束時的血漿NH
3水平、人類
OTCmRNA及蛋白質表現、OTC酶活性、及在靶編輯。
實施例
8
–
在
Pcsk9-hE7-KI.spf
ash
幼畜中的毒理學研究
將在新生(PND 1-2) PCSK9-hE7-KI.
spf
ash 小鼠中進行為期6個月的GLP順應性安全性研究,以研究IV共同投予後測試物的安全性、耐受性、藥理學和藥物動力學。期間分析,包括在靶編輯、脫靶編輯、轉殖基因表現和組織病理學分析,將在第60天和第180天進行,因為這些時間點將使核酸酶依賴性基因***有足夠的時間在投予後達到穩定的平台水平(plateau level)。新生PCSK9-hE7-KI.
spf
ash 小鼠將接受三種劑量水平的測試物中的一種(1.0 x 10
12GC/kg核酸酶載體及3.0 x 10
12GC/kg供體載體、3.3 x 10
12GC/kg核酸酶載體及1.0 x 10
13GC/kg供體載體、或1.0 x 10
13GC/kg核酸酶載體及3.0 x 10
13GC/kg;每劑量N=20)或媒劑(磷酸鹽緩衝食鹽水[PBS];N=20)。在測試物或媒劑投予後,生存期間的評估將包括臨床觀察每天監測痛苦和異常行為的跡象、體重測量及血液臨床血清化學(特別是ALT、AST和總膽紅素)。
在測試物投予後第60天,將群組1、3、5和7安樂死,並將對包括但不限於腦、脊髓、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、生殖器官、腎上腺和淋巴結的綜合組織列表進行組織病理學分析。器官將酌情稱重。
將收集並分析肝臟樣品用於藉由擴增子序列和AMP序列的在靶編輯、藉由ITR序列和擴增子序列的脫靶編輯、載體生物分布和轉殖基因表現。在肝臟樣品中,生物分布將藉由PCR評估,巨核酸酶RNA表現將藉由RT-PCR進行分析。將對高度灌注的器官進行巨核酸酶RNA分析,並對具有可檢測到巨核酸酶RNA表現的組織進行評估,以便通過擴增子序列進行在靶編輯。具有可檢測的在靶編輯的組織將進一步評估脫靶編輯。
對於載體生物分布,將開發對於雙載體ARCUS及hOTCco之轉殖基因具有特異性的qPCR檢測。將使用AAV順式質體作為標靶序列的替代物以評估分析的效率、線性、精確度、再現性及檢測限度。測定的定量下限(LLOQ)將在開始對測試組織或***物進行測定之前確定。將實施一項資格計劃,將轉殖基因特異性測定與先前進行的資格研究聯繫起來。測試的基質將包括感興趣的標靶,用於生物分布的肝臟。將根據在生物分布研究過程中測試的所有樣品中加強的標靶對照的回收率以及從先前進行的資格研究中去掉的數據,進一步評估基質效應。
實施例
9
–
在嬰兒
(6-9
週齡
)NHP
的毒理學研究
將在嬰兒(6-9週)恆河猴中進行為期1年的GLP順應性安全性研究,以研究IV共同投予後測試物的安全性、耐受性、藥理學和藥物動力學。期間分析,包括在靶編輯、脫靶編輯、轉殖基因表現和組織病理學分析,將在第90天進行,因為此時間點將使核酸酶依賴性基因***有足夠的時間在投予後達到穩定的平台水平。嬰兒恆河猴將接受1.0 x 10
13GC/kg核酸酶載體及3.0 x 10
13GC/kg;N=4)或媒劑(磷酸鹽緩衝食鹽水[PBS]/表面活性劑;N=2)。在測試物或媒劑投予後,生存期間的評估將包括臨床觀察每天監測痛苦和異常行為的跡象、體重測量及血液臨床血清化學(特別是ALT、AST和總膽紅素)。研究設計顯示於圖16。
在測試物投予後第90天,將媒劑對照組及群組3中的一隻動物安樂死,並將對包括但不限於腦、脊髓、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、生殖器官、腎上腺和淋巴結的綜合組織列表進行組織病理學分析。器官將酌情稱重。在90天時,其餘動物將接受肝生檢。
將收集並分析肝臟樣品用於藉由擴增子序列和AMP序列的在靶編輯、藉由ITR序列和擴增子序列的脫靶編輯、載體生物分布和轉殖基因表現。在肝臟樣品中,生物分布將藉由PCR評估,巨核酸酶RNA表現將藉由RT-PCR進行分析。將對高度灌注的器官進行巨核酸酶RNA分析,並對具有可檢測到巨核酸酶RNA表現的組織進行評估,以便通過擴增子序列進行在靶編輯。具有可檢測的在靶編輯的組織將進一步評估脫靶編輯。
對於載體生物分布,將開發對於雙載體ARCUS及hOTCco之轉殖基因具有特異性的qPCR檢測。將使用AAV順式質體作為標靶序列的替代物以評估分析的效率、線性、精確度、再現性及檢測限度。測定的定量下限(LLOQ)將在開始對測試組織或***物進行測定之前確定。將實施一項資格計劃,將轉殖基因特異性測定與先前進行的資格研究聯繫起來。測試的基質將包括感興趣的標靶,用於生物分布的肝臟。將根據在生物分布研究過程中測試的所有樣品中加強的標靶對照的回收率以及從先前進行的資格研究中去掉的數據,進一步評估基質效應。
本說明書中引用的所有文件均藉由引用併入本文,與此同時提出的序列表的序列及文本亦藉由引用併入本文。美國臨時專利申請號63/301,917 (2022年1月21日申請)、63/331,384 (2022年4月15日申請)、63/364,861 (2022年5月17日申請)、63/370,049 (2022年8月1日申請)、及63/379,067 (2022年10月11日申請)各藉由引用以其全文併入本文。雖然已經參考特定實施例描述了本發明,但是應當理解,可在不脫離本發明的精神的情況下進行修改。此類修改旨在落入後附之申請專利範圍內。
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無
圖1A顯示一項研究的時間軸,該研究包含在PCSK9基因座中藉由ARCUS2嵌入(knock-in)hOTC袖珍基因。圖1B顯示組別(G) 1-7的研究設計。動物21-111、21-122及21-113在投予前為AAV結合抗體(BAb)陽性。
圖2顯示用於ARCUS2介導的基因校正的雙AAV載體系統的示意圖,其中AAV供體載體包含hOTC供體模板序列,如圖1A-1B所示之研究中所使用。如圖所示,使用不同的HDR臂。
圖3為圖1A-2所述之實驗的實驗結果圖。細節提供於圖4A-4K。
圖4A-4K顯示圖1A-2中所述之實驗結果。圖4A顯示以第0天之百分比顯示的各組PCSK9水平。圖4B顯示以U/L顯示的各組ALT水平。在指定的時間點進行肝生檢,並使用特定探針進行雙重原位雜交(in situ hybridization,ISH)以檢測hOTC及ARCUS。圖4C顯示藉由ISH量化的OTC轉殖基因的轉導效率,並繪製為轉導的肝細胞百分比。圖4D顯示藉由IF量化的OTC轉殖基因的轉導效率。圖4E顯示NHP的體重。圖4F顯示藉由定量PCR分析的肝臟中載體GC。圖4G顯示獼猴肝臟中hOTC及核酸酶的表現,其藉由對從肝臟生檢樣品分離的總RNA進行定量PCR測量,隨後進行反轉錄,並呈現為經GAPDH水平標準化的相對表現水平。圖4H顯示在指定時間點藉由擴增子定序對
rhPCSK9靶向座進行的***或缺失分析(Indel analysis)。圖4I顯示所指之組織中的在靶***或缺失(on-target indel)。唯一具有***或缺失的非肝組織係胰臟。圖4J顯示以4x10
13GC/kg治療之新生兒及嬰兒NHP與僅以AAV.Arcus治療之成年的LFT (IU/mL)之間的比較。圖4K顯示一些群組2及群組3之動物在1年屍檢時的OTC酶活性染色。
縮寫:GAPDH,甘油醛-3-磷酸酯去氫酶;GC,基因體拷貝;hOTC,人類鳥胺酸胺甲醯基轉移酶;OT,脫靶;PCR,聚合酶連鎖反應;
rhPCSK9,前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(恆河猴基因);RNA,核糖核酸。
圖5A及5B顯示PCSK9-hE7-KI小鼠模型的示意圖。圖5A顯示小鼠pcsk9外顯子7的示意圖,其被人類pcsk9外顯子7置換(hE7包含ARCUS靶向序列)。圖5B顯示PCSK9-hE7-KI小鼠模型與其他疾病小鼠模型雜交的示意圖,諸如OTC
spf ash、KI-
spf ash模型。
PCSK9-hE7-KI嵌入小鼠模型首先藉由以包含外顯子7的人類
PCSK9基因區域置換包含鼠類
Pcsk9基因之外顯子7的區域而生成。然後將
PCSK9-hE7-KI小鼠與稀疏皮毛和異常皮膚(sparse fur ash,spf
ash)小鼠雜交,該spf
ash小鼠由於
Otc基因之外顯子4末端的剪接供體位點處的G突變為A的點突變,OTC表現降低了20倍。來自此雜交的小鼠被稱為
PCSK9-hE7-KI.spf
ash 小鼠並如本文所述使用。
縮寫:bp,鹼基對;E6,外顯子6;E7:外顯子7;E8,外顯子8;HDR,同源依賴性重組;
PCSK9,前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(基因,人類);
Pcsk9,前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(基因,小鼠)。圖5C顯示人類外顯子7區域的序列及在鼠類
Pcsk9基因座中交換的部分相鄰內含子序列(SEQ ID NO:17)。
圖6顯示代表pcsk9-hE7嵌入對偶基因的人類PCSK9序列、小鼠PCSK9 (mPCSK9)及恆河猴PCSK9 (rhPCSK9)的265 bp序列的序列排列比對。
圖7顯示用於ARCUS2介導的基因校正的雙AAV載體系統的供體構築體示意圖,其中AAV供體載體包含hOTC供體模板序列。顯示具有嵌入小鼠模型(圖5)、NHP及人類標靶區域的構造中HDR臂的同源性。
圖8A顯示在PCSK9-hE7-KI.spf-ash幼畜(部分OTC缺失模型)中進行的包含藉由ARCUS2在PCSK9基因座中嵌入hOTC袖珍基因的研究的時間軸。
圖8B顯示每組將接受用於圖8A研究的載體和劑量。
圖9A-9F顯示圖8A-8B所示小鼠之研究、以圖7所示載體處理、或未經處理(KI WT)並餵食高蛋白(HP)飲食10天的結果。圖9A顯示存活概率。圖9B顯示作為導入HP飲食之前的體重重量百分比。圖9C顯示HP飲食第10天的血漿NH
3水平。圖9D顯示在第48天的mPCSK9蛋白水平。圖9E顯示第59天藉由擴增子序列測量之***或缺失%。圖9F顯示在第59天測量的肝生檢樣品中的載體轉導水平,繪製為每二倍體細胞的AAV基因體拷貝數(GC)。
圖10為用於治療OTC缺乏症的雙載體方法的示意圖。兩種載體都使用分支群E衣殼、AAVrh79及肝臟特異性TBG啟動子。第一載體為核酸酶ARCUS,而第二載體為hOTC供體基因匣,兩側是PCSK9外顯子7的500bp同源臂。
圖11為圖10中描述的雙載體方法的供體構築體的質體圖譜。從ITR至ITR的質體序列顯示於SEQ ID NO:6。
圖12為圖10中描述的雙載體方法的核酸酶構築體的質體圖譜。從ITR至ITR的質體序列顯示於SEQ ID NO:2。
圖13為顯示本文提供之供體構築體中所使用之例示性HDR序列的表格。
圖14A-14B顯示針對圖4A-4K所述實驗的脫靶編輯的擴增子序列驗證結果。圖14A提供脫靶位點的列表,連同染色體位置和與脫靶共通序列的最佳匹配。圖14B為顯示OT1-OT10的***或缺失百分比的圖表。在ARCUS+供體動物中,對OT1、OT4及OT5的編輯明顯高於非核酸酶對照。
圖15A顯示在PCSK9-hE7-KI.spf-ash幼畜中進行的包含藉由ARCUS2在PCSK9基因座中嵌入hOTC袖珍基因的MED研究的時間軸,如實施例7中所討論。
圖15B顯示在圖15A所示研究的研究設計。
圖16顯示在NHP中進行的1年毒性研究的部分研究設計,如實施例9中所討論。
TW202330914A_111141560_SEQL.xml
無。
Claims (18)
- 一種用於治療鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(ornithine transcarbamylase,OTC)缺乏症之雙載體系統,該系統包含: (a)包含第一AAV rh79衣殼及第一載體基因體之基因編輯AAV,該第一載體基因體包含5’ ITR、編碼巨核酸酶的序列及3’ ITR,該巨核酸酶具有SEQ ID NO:3序列且在調控序列的控制下靶向PCSK9,該調控序列指導該巨核酸酶在包含PCSK9基因的標靶細胞中的表現;及 (b)包含第二AAV rh79衣殼及第二載體基因體之供體AAV載體,該第二載體基因體包含:5’ITR、5’同源性定向重組(homology directed recombination,HDR)臂、包含SEQ ID NO:4序列或與SEQ ID NO:4有至少90%同一的序列之編碼OTC之轉殖基因及指導該轉殖基因在標靶細胞中表現的調控序列、3’ HDR臂、及3’ ITR。
- 如請求項1之雙載體系統,其中該編碼巨核酸酶的序列包含SEQ ID NO:2之核苷酸(nt) 1089-2183、或與SEQ ID NO:2之核苷酸(nt) 1089-2183有至少90%同一的序列。
- 如請求項1或2之雙載體系統,其中該編碼OTC之轉殖基因包含SEQ ID NO:4。
- 如請求項1至3中任一項之雙載體系統,其中該第一AAV衣殼及該第二AAV衣殼為SEQ ID NO:16之AAVrh79衣殼。
- 如請求項1至3中任一項之雙載體系統,其中(a)的基因編輯AAV載體與(b)的供體AAV載體的比例為1:3。
- 如請求項1至5中任一項之雙載體系統,其中該核酸酶受TBG啟動子控制。
- 如請求項1至6中任一項之雙載體系統,其中該轉殖基因受TBG啟動子控制。
- 如請求項1至7中任一項之雙載體系統,其中 i)該第一載體基因體包含SEQ ID NO:2之nt 211至2964、或與SEQ ID NO:2之nt 211至2964共享至少90%同一性之序列;及 ii)該第二載體基因體包含SEQ ID NO:6之nt 178至3281、或與SEQ ID NO:6之nt 178至3281共享至少90%同一性之序列。
- 一種治療人類OTC缺乏症之方法,其藉由共同投予如請求項1至8中任一項之雙載體系統。
- 一種治療受試者的OTC(鳥胺酸胺甲醯基轉移酶)缺乏症之方法,該方法包含:向患有OTC之該受試者共同投予: (a)包含第一AAV rh79衣殼及第一載體基因體之基因編輯AAV,該第一載體基因體包含5’ ITR、編碼具有SEQ ID NO:3序列之巨核酸酶的序列及3’ ITR,該巨核酸酶在調控序列的控制下靶向PCSK9,該調控序列指導該巨核酸酶在包含PCSK9基因的標靶細胞中的表現;及 (b)包含第二AAV rh79衣殼及第二載體基因體之供體AAV載體,該第二載體基因體包含:5’ITR、5’同源性定向重組(HDR)臂、包含SEQ ID NO:4之序列或與SEQ ID NO:4有至少90%同一的序列之編碼OTC之轉殖基因及指導該轉殖基因在標靶細胞中表現的調控序列、3’ HDR臂、及3’ ITR。
- 如請求項10之方法,其中 i)該第一載體基因體包含SEQ ID NO:2之nt 211至2964、或與SEQ ID NO:2之nt 211至2964共享至少90%同一性之序列;及 ii)該第二載體基因體包含SEQ ID NO:6之nt 178至3281、或與SEQ ID NO:6之nt 178至3281共享至少90%同一性之序列。
- 如請求項9至11中任一項之方法,其中(a)的該基因編輯AAV載體及(b)的該供體載體實質上同時經由IV遞送。
- 如請求項9至12中任一項之方法,其中(a)的該基因編輯AAV載體以約1 x 10 13GC/kg之劑量懸浮於注射用之媒劑中。
- 如請求項9至13中任一項之方法,其中(b)的該AAV供體載體以約3 x 10 13GC/kg之濃度懸浮於注射用之媒劑中。
- 如請求項9至14中任一項之方法,其中該受試者年齡為1日齡至4月齡。
- 如請求項9至15中任一項之方法,其中該受試者為男性。
- 一種如請求項1至8中任一項之雙載體系統之用途,其用於在有需要的受試者中治療OTC缺乏症。
- 一種如請求項1至8中任一項之雙載體系統之用途,其用於製備在有需要的受試者中治療OTC缺乏症之藥物。
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