TW202330027A - 抗ｃｄ－４７抗體製劑 - Google Patents

Abstract

本發明關於抗-CD47抗體製劑、製備該製劑的方法以及該製劑的用途。

Description

抗CD-47抗體製劑

本發明關於抗-CD47抗體製劑、製備該製劑的方法以及該製劑的用途。

CD47(分化群47)在20世紀80年代首次被確定為人類卵巢癌的腫瘤抗原。CD47也稱為整聯蛋白相關蛋白(IAP)、卵巢癌抗原OA3、Rh-相關抗原和MER6，是一種屬於免疫球蛋白超家族的多次膜受體，具有一個免疫球蛋白樣結構域和五個跨膜區，其作為信號調節蛋白α(SIRPα)的配體，與SIRPα的NH₂末端的V樣結構域結合。SIRPα主要表達於骨髓細胞，包括巨噬細胞、粒細胞、樹突狀細胞(DCs)、肥大細胞和它們的前體細胞，包括造血幹細胞。正常細胞上CD47與巨噬細胞上的SIRPα相互結合，釋放“不要吃我”的信號，抑制巨噬細胞的吞噬作用，是先天免疫系統中巨噬細胞識別自我和非我的重要機制。CD47在人類腫瘤細胞和組織中上廣泛表達，包括急性髓系白血病(AML)、慢性粒細胞白血病、急性淋巴細胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多發性骨髓瘤(MM)、膀胱癌和其它實體腫瘤。腫瘤細胞藉由高表達的CD47與巨噬細胞表面SIRPα結合，逃避巨噬細胞的吞噬作用，並促進腫瘤生長。CD47免疫檢查點被認為 是腫瘤免疫治療的一個潛在有效並可廣泛應用的靶點。目前，已開發出多種針對CD47與SIRPα的相互作用的特異性阻斷劑。正在開展的多項臨床前和臨床試驗涉及針對治療彌漫性大B淋巴細胞淋巴瘤、急性髓系白血病以及晚期實體瘤等的藥物，包括抗-CD47抗體以及SIRPα融合蛋白等。這些藥物藉由單藥或者與其他抗腫瘤治療藥物聯用方式給藥。以Forty Seven公司開發的抗-CD47抗體Hu5F9為例，一項用於評估Hu5F9治療22例淋巴瘤患者的效果的臨床I期試驗中，Hu5F9與利妥昔單抗聯用可使50%對利妥昔單抗單用無效的患者產生客觀緩解。在2019年公佈的臨床數據中，Hu5F9與阿紮胞苷聯用治療14例復發性/難治性急性髓系白血病病人的完全緩解率可達36%，治療11例骨髓抑制綜合症的患者中，聯用的緩解率更可達55%。

與任何蛋白質治療劑一樣，抗體在製造或儲存過程中會受到諸如聚集、變性、交聯、脫醯胺化、異構化、氧化和剪切等物理和化學不穩定性的影響。當製劑中包含高濃度抗體時，更難以保持抗體物理穩定性和化學穩定性。因此，確定最佳製劑條件，提高抗體在生產、儲存和使用過程中的穩定性很重要。

因此，本發明提供了一種包含高濃度抗-CD47抗體或其抗原結合片段的藥物製劑，特別地，所述的抗體或其抗原結合片段具有高效的抗腫瘤活性，且不引起顯著的紅細胞凝集反應，以滿足更多的臨床需求，且包含所述抗體或其抗原結合片段的藥物製劑在多種模擬藥品生產或運輸過程中可能發生的物理應力條件下表現出良好的穩定性。

本發明提供了含有抗-CD47抗體或其抗原結合片段的藥物製劑，尤其是穩定的高濃度抗體液體製劑。

在一個方面，本發明提供了一種藥物製劑，pH值為約5.0至約8.5，或約5.5至約7.0，其包含(i)抗-CD47抗體或其抗原結合片段；(ii)緩衝劑，(iii)穩定劑，和(iv)表面活性劑。

在一些實施方案中，本發明的藥物製劑包含的緩衝劑為組胺酸鹽緩衝劑或枸櫞酸鹽緩衝劑。在一些實施方案中，其中該組胺酸鹽緩衝劑是組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑。在一些實施方案中，其中該枸櫞酸鹽緩衝劑是枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝劑。

在一些實施方案中，其中該緩衝劑的濃度為約10mM至約80mM，較佳地為約20mM至約50mM，例如，約20mM、約30mM、約40mM、約50mM、約60mM或約70mM。

在一些實施方案中，本發明的藥物製劑包含的穩定劑選自糖、胺基酸和多元醇中的至少一種。

在一些實施方案中，其中該穩定劑至少包含一種胺基酸，例如精胺酸，較佳地為鹽酸精胺酸。

在一些實施方案中，其中該穩定劑由胺基酸組成，較佳地為鹽酸精胺酸。

在一些實施方案中，其中該糖較佳為蔗糖。

在一些實施方案中，其中該穩定劑由胺基酸和糖組成，較佳地為鹽酸精胺酸和蔗糖。

在一些實施方案中，其中該胺基酸的濃度為約1mg/mL至約100mg/mL，例如約5mg/mL至約40mg/mL。

在一些實施方案中，其中該糖的濃度為約10mg/mL至約100mg/mL，較佳地為約20mg/mL至約80mg/mL。

在一些實施方案中，其中該胺基酸和糖的(質量)濃度比為約1：1至約1：15，例如約1：1、約1：2、約1：3、約1：4、約1：5、約1：6、約1：7、約1：8、約1：9、約1：10、約1：11、約1：12、約1：13、約1：14或約1：15。

在一些實施方案中，本發明的藥物製劑包含的表面活性劑選自聚山梨酯類表面活性劑，較佳地為聚山梨酯-80或聚山梨酯-20。

在一些實施方案中，其中該表面活性劑的濃度為約0.002%(w/v)至約0.5%(w/v)，較佳地為約0.01%(w/v)至約0.05%(w/v)，例如，約0.01%(w/v)、約0.02%(w/v)或約0.03%(w/v)，較佳地為約0.02%(w/v)。

在一些實施方案中，本發明的藥物製劑包含的抗-CD47抗體或其抗原結合片段的濃度為約10-150mg/mL，選地為約40-120mg/mL，例如，約20mg/mL、約50mg/mL、約60mg/mL、約80mg/mL、約100mg/mL或約110mg/mL。

在一些實施方案中，本發明的藥物製劑的pH值為約5.5至約7.5、約5.5至約7.0，例如約6.0至約7.0，較佳約6.0至約6.5，更佳約6.5。

在一個方面，本發明提供了一種藥物製劑，其包含：

(i)約10-150mg/mL的抗-CD47抗體或其抗原結合片段；

(ii)約10-80mM的枸櫞酸鹽緩衝劑或組胺酸鹽緩衝劑；

(iii)約5-40mg/mL的鹽酸精胺酸和約0-80mg/mL的蔗糖；和

(iv)約0.01%(w/v)至約0.05%(w/v)的聚山梨酯-80；

pH值為約6.0-7.0。

在一個方面，本發明提供了一種藥物製劑，其包含：

(i)約40-120mg/mL的抗-CD47抗體或其抗原結合片段；

(ii)約20-80mM的枸櫞酸鹽緩衝劑或組胺酸鹽緩衝劑；

(iii)約5-40mg/mL的鹽酸精胺酸和20-80mg/mL的蔗糖，其中，鹽酸精胺酸和蔗糖的質量濃度比為1：1至1：15，

(iv)約0.01%(w/v)至約0.05%(w/v)的聚山梨酯-80；

pH值為約6.0-7.0。

在一個方面，本發明提供了一種藥物製劑，其包含：

(i)約40-120mg/mL的抗-CD47抗體或其抗原結合片段；

(ii)約20-80mM的枸櫞酸鹽緩衝劑；

(iii)約5-40mg/mL的鹽酸精胺酸，和

(iv)約0.01%(w/v)至約0.05%(w/v)的聚山梨酯-80；

pH值為約6.0-7.0。

在一些實施方案中，本發明的藥物製劑為液體形式的，其還進一步包含溶媒，該溶媒包括但不限於水，例如注射用水、抑菌注射用水(BWFI)或雙蒸水或其中至少兩種以上的組合。

在一個方面，本發明還提供了一種凍乾形式的藥物製劑，其由以上所述的本發明的藥物製劑凍乾製得。

在一個方面，本發明還提供了一種重構的藥物製劑，其由本發明所述的凍乾形式的藥物製劑用重構介質重構製得。

在一些實施方案中，該重構介質包括但不限於注射用水(WFI)、抑菌注射用水(BWFI)、氯化鈉溶液(例如0.9%(w/v)NaCl)和葡萄糖溶液(例如5%(w/v)葡萄糖)中的至少一種。

在一些實施方案中，本發明的重構的藥物製劑，還進一步包含溶媒，該溶媒包括但不限於水，例如注射用水、抑菌注射用水(BWFI)或雙蒸水或其中兩種以上的組合。

在一些實施方案中，本發明的藥物製劑(包括液體形式藥物製劑、凍乾形式的藥物製劑、或重構的藥物製劑)為可注射或可輸注的液體形式製劑。

在一個方面，本發明還提供了一種製品，其包含裝有本發明所述的藥物製劑(包括液體形式藥物製劑、凍乾形式的藥物製劑、或重構的藥物製劑)的容器。

適用於本發明的藥物製劑中的抗-CD47抗體或其抗原結合片段可以是任何的抗-CD47抗體或其抗原結合片段。

較佳地，本發明的藥物製劑中的抗-CD47抗體或其抗原結合片段具有高效的抗腫瘤活性，且不引起顯著的紅細胞凝集反應，以滿足更多的臨床需求。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含選自重鏈可變區(VH)的HCDR1、HCDR2和HCDR3中的一個至三個，其中該VH包含SEQ ID NO：1、3、5、6或7所示的胺基酸序列。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含選自重鏈互補決定區1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3中的一個至三個，該HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，該HCDR3包含SEQ ID NO：13或17或21所示的胺基酸序列。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含選自輕鏈可變區(VL)的LCDR1、LCDR2和LCDR3中的一個至三個，其中所的VL包含SEQ ID NO2、4、8、9或10所示的胺基酸序列。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含選自輕鏈互補決定區1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3中的一個至三個，該LCDR1包含SEQ ID NO：14的所示胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：15或18或22所示的胺基酸序列，該LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)的三個CDR，即HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及輕鏈可變區(VL)的三個CDR，即LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該VH包含SEQ ID NO：1、3、5、6或7所示的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：2、4、8、9或10所示的胺基酸序列。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)的三個CDR，即HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及輕鏈可變區(VL)的三個CDR，即LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中該VH和VL選自：

(1)包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列的VL；

(2)包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列的VL；

(3)包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO：8、9或10所示的胺基酸序列的VL；

(4)包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO：9或10所示的胺基酸序列的VL；或

(5)包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO：8、9或10所示的胺基酸序列的VL。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含重鏈互補決定區1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3和輕鏈互補決定區1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO：13或17或21所示的胺基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列、LCDR2包含SEQ ID NO：15或18或22所示的胺基酸序列，和LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含重鏈互補決定區1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3和輕鏈互補決定區1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列， HCDR3包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列、LCDR2包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列和LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，其中該VH包含與SEQ ID NO：1、3、5、6或7所示的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL)，其中該VL包含與SEQ ID NO：2、4、8、9或10所示的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含與SEQ ID NO：1、3、5、6或7所示的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列，和該VL包含與SEQ ID NO：2、4、8、9或10所示的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含與SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列，和該VL包含與SEQ ID NO： 8所示的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH和VL選自：

(1)包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列的VL；

(2)包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列的VL；

(3)包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO：8、9或10所示的胺基酸序列的VL；

(4)包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO：9或10所示的胺基酸序列的VL；或

(5)包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO：8、9或10所示的胺基酸序列的VL。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列和該VL包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列和該VL包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列和該VL包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列和該VL包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列和該VL包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列和該VL包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列和該VL包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列和該VL包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列和該VL包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列和該VL包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區例如人IgG1恆定區、人IgG4恆定區、人IgG4P恆定區或人IgG1TM恆定區。本發明的人IgG4P恆定區是突變的人IgG4，其具有S228P的胺基酸取代(根據EU編號)。在一些實施方案中，人IgG1TM恆定區是突變的人IgG1恆定區，其具有L234F、L235E和P331S的胺基酸取代(根據EU編號)。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含輕鏈恆定區，例如人κ或λ恆定區。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段是單株抗體。在一些實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段是鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體。在一些實施方案中，至少部分的本發明的抗-CD47抗體或其抗原結合片段的框架序列是人共有框架序列。在一個實施方案中，抗-CD47抗體或其抗原結合片段是全長抗體、單域抗體例如VHH、Fab、Fab’、Fab’-SH、(Fab’)₂、單鏈抗體例如scFv、Fv、dAb(domain antibody)或雙(多)特異性抗體。

另一方面，本發明的藥物製劑中所含的抗-CD47抗體可以替換為包含抗-CD47抗體或其片段的免疫綴合物或免疫融合物。

在一些實施方案中，該藥物製劑是含水藥物製劑。考慮例如期望劑量體積和施用模式來決定製劑中存在的抗體的濃度。本發明的藥物 製劑包含高濃度的抗-CD47抗體。在一些實施方案中，抗-CD47抗體濃度為約10mg/mL至約150mg/mL，例如約10mg/mL、約20mg/mL、約30mg/mL、約40mg/mL、約50mg/mL、約60mg/mL、約70mg/mL、約80mg/mL、約90mg/mL、約100mg/mL、約110mg/mL、約120mg/mL、約130mg/mL、約140mg/mL或約150mg/mL，並且包括介於之間的所有值。在一些實施方案中，抗體濃度為約50mg/mL或約80mg/mL。

另一方面，發明還提供了本文所述的藥物製劑(包括液體形式藥物製劑、凍乾形式的藥物製劑、或重構的藥物製劑)，用於治療或預防CD47相關的疾病。

另一方面，本發明提供了治療或預防CD47相關的疾病的方法，該方法包括向受試者施用有效量的本文所述的藥物製劑(包括液體形式藥物製劑、凍乾形式的藥物製劑、或重構的藥物製劑)。

另一方面，本發明還提供了本文所述的藥物製劑(包括液體形式藥物製劑、凍乾形式的藥物製劑、或重構的藥物製劑)用於治療或預防CD47相關的疾病的用途。

另一方面，本發明還提供了抗-CD47抗體或其抗原結合片段用於製備本發明的藥物製劑(包括液體形式藥物製劑、凍乾形式的藥物製劑、或重構的藥物製劑)的用途，該藥物製劑用於治療或預防CD47相關的疾病。

在一些實施方案中，該CD47相關的疾病包括各種血液癌和實體瘤，包括但不限於膀胱癌、結腸直腸癌、胰腺癌、淋巴瘤、白血病、多發性骨髓瘤、(惡性)黑色素瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、神經膠質瘤、膠 質母細胞瘤、骨髓瘤、子宮內膜癌、腎癌、(良性)胎記瘤、***癌、甲狀腺癌、子宮頸癌、胃癌、肝癌。

另一方面，本發明還提供了本文所述的藥物製劑(包括液體形式藥物製劑、凍乾形式的藥物製劑、或重構的藥物製劑)在製備治療或預防CD47相關的疾病的藥物中的用途。

在一個實施方案中，其中CD47相關的疾病較佳地為癌症，例如該癌症包括血液癌和實體瘤，例如膀胱癌、胰腺癌、淋巴瘤、白血病、多發性骨髓瘤、(惡性)黑色素瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、神經膠質瘤、膠質母細胞瘤、骨髓瘤、子宮內膜癌、腎癌、(良性)胎記瘤、***癌、甲狀腺癌、子宮頸癌、胃癌、肝癌、結腸癌、卵巢癌、尿路上皮癌等。

本發明的藥物製劑還能與其他治療劑或治療方式組合，用於治療或預防CD47相關的疾病。

本發明還涵蓋本文所述的任何實施方案的任意組合。本文所述的任何實施方案或其任何組合適用於本文所述的發明的任何和所有抗-CD47抗體或其片段、方法和用途。

圖1顯示了抗體HMA02h14-48與Raji細胞表面CD47的結合活性。

圖2顯示了抗體HMA02h14-48與Toledo細胞表面CD47的結合活性。

圖3顯示了抗體HMA02h14-48與REC-1細胞表面CD47的結合活性。

圖4顯示了抗體HMA02h14-48阻斷人CD47與SIRPα的相互作用的活性。

圖5顯示了抗體HMA02h14-48對人MΦ吞噬Raji細胞的作用。

圖6顯示了抗體HMA02h14-48對人MΦ吞噬Toledo細胞的作用。

圖7顯示了抗體HMA02h14-48對人MΦ吞噬REC-1細胞的作用。

圖8顯示了抗體HMA02h14-48對人MΦ吞噬HL-60細胞的作用。

圖9顯示了抗體HMA02h14-48對紅細胞體外凝集活性的影響。

圖10顯示了抗體HMA02h14-48結合人紅細胞表面CD47的能力。

圖11顯示了Hu5F9和HMA02h14-48對Toledo腫瘤生長的抑制。

圖12顯示了Hu5F9和HMA02h14-48對REC-1腫瘤生長的抑制。

定義

除非另有說明，本發明的實施將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規技術，這些都在本領域的技術範圍內。

為了可以更容易地理解本發明，某些科技術語具體定義如下。除非本文其它部分另有明確定義，否則本文所用的科技術語都具有本發明所屬技術領域具有通常知識者通常理解的含義。關於本領域的定義及術語，專業人員具體可參考Current Protocolsin Molecular Biology(Ausubel)。胺基酸殘基的縮寫是本領域中所用的指代20個常用L-胺基酸之一的標準3字母和/或1字母代碼。本文(包括申請專利範圍)所用單數形式包括其相應的複數形式，除非文中另有明確規定。

術語“約”是指如所屬技術領域具有通常知識者所確定的特定值或組成的可接受誤差範圍內的值或組成，其部分取決於如何測量或確定該值或組成，即測量系統的限制。比如，“約”可以是指根據本領域中的實踐在1個或大於1個標准偏差內。或者，“約”可以是指多達5%、10%或20%的範圍(即，±5%、±10%或±20%)。

術語“和/或”當用於連接兩個或多個可選項時，應理解為意指可選項中的任一項或可選項中的任意兩項或更多項。

如本文中所用，術語“包含”或“包括”意指包括該要素、整數或步驟，但是不排除任意其他要素、整數或步驟。在本文中，當使用術語“包含”或“包括”時，除非另有指明，否則也涵蓋由所述及的要素、整數或步驟 組成的情形。例如，當提及“包含”某個具體序列的抗體可變區時，也旨在涵蓋由該具體序列組成的抗體可變區。

術語“整聯蛋白相關蛋白(IAP)”、“CD47”當用於本文中時是指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物如靈長類動物(例如人)和齧齒類動物(例如，小鼠和大鼠))的任何天然CD47，除非另有說明。該術語涵蓋“全長”未加工的CD47以及由細胞內加工產生的任何形式的CD47或其任何片段。該術語還包括天然存在的CD47的變體，例如，剪接變體或等位變體。在一些實施方案中，CD47是指來自人的CD47全長或其片段(諸如其缺乏信號肽的成熟片段)。在一些實施方案中，人CD47是指與NCBI登錄號NP_001768.1所示的胺基酸序列一致的CD47或其片段。在一些實施方案中，該術語也涵蓋包含CD47或其片段的融合蛋白。

“SIRPα”是指野生型信號調節蛋白α、或含有野生型信號調節蛋白α的胺基酸序列的重組或非重組多肽、或天然或天然存在的信號調節蛋白α的等位基因變體。

本文術語“親和力”指分子(例如抗體)的單一結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間全部非共價相互作用總和的強度。除非另有指示，如本文中使用的，“結合親和力”指反映結合對的成員(例如抗體和抗原)之間1：1相互作用的內在結合親和力。分子X對其配偶體Y的親和力通常可以用解離常數(K_D)來表述。本領域中已知測定結合親和力的分析的實例包括表面電漿共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如，ForteBio)。

本文術語“CD47相關的疾病”是指與CD47的表達或功能或活性相關或與CD47介導的信號轉導活性相關的非生理狀態，包括但不限於癌症。在一些實施方案中，該疾病將受益於阻斷CD47相關的信號轉導。

本文術語“信號轉導”是指通常由蛋白質間相互作用諸如CD47對其受體的結合啟動的生化因果關係，該關係導致信號從細胞的一部分傳遞至細胞的另一部分。一般地，傳遞包括引起信號轉導的系列反應中的一種或多種蛋白質上的一個或多個酪胺酸、絲胺酸或蘇胺酸殘基的特定磷酸化。倒數第二過程通常包括細胞核事件，從而導致基因表達的變化。

本文術語“活性”或“生物活性”，或術語“生物性質”或“生物特徵”此處可互換使用，並包括但不局限於表位/抗原親和力和特異性、在體內或體外中和或拮抗CD47活性的能力、增強或激活CD47活性、IC₅₀、抗體的體內穩定性和抗體的免疫原性質。本領域公知的抗體的其它可鑑定的生物學性質或特徵包括，例如，交叉反應性(即通常與靶定肽的非人同源物，或與其它蛋白質或組織的交叉反應性)，和保持哺乳動物細胞中抗體高表達水平的能力。可以使用本領域公知的技術觀察、測定或評估前面提及的性質或特徵，該技術包括但不局限於ELISA、FACS或BIACORE電漿共振分析、體外或體內中和測定、受體結合、細胞因子或生長因子的產生和/或分泌、信號轉導和不同來源(包括人類、靈長類或任何其它來源)的組織切片的免疫組織化學。

本文術語“抗體”是指具有所需生物活性的任何形式的抗體。因此，其以最廣義使用，具體包括但不限於單株抗體(包括全長單株抗體)、 多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人源化抗體、人抗體、嵌合抗體、CrossMab抗體、或駱駝源化單結構域抗體。

術語“全抗體”、“全長抗體”和“完整抗體”在本文中可互換地用來指包含由二硫鍵相互連接的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的糖蛋白。每條重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由3個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。VH區和VL區可以進一步再劃分為超變區(為互補決定區(CDR)，其間插有較保守的區域(為構架區(FR))。“互補決定區”或“CDR區”或“CDR”是抗體可變結構域中在序列上高變並且形成在結構上確定的環(“超變環”)和/或含有抗原接觸殘基(“抗原接觸點”)的區域。CDR主要負責與抗原表位結合。重鏈和輕鏈的CDR通常被稱作CDR1、CDR2和CDR3，從N-端開始順序編號。位於抗體重鏈可變結構域內的CDR依次被稱作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位於抗體輕鏈可變結構域內的CDR依次被稱作LCDR1、LCDR2和LCDR3。每個VH和VL由三個CDR和4個FR組成，從胺基端到羧基端以如下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是顯示出多種效應子功能。

在一個給定的VH或VL胺基酸序列中，各CDR的精確胺基酸序列邊界可以使用許多公知方案的任意一種方案或其組合確定，該方案包括例如：Chothia方案(Chothia等人，Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,196,901-917(1987))；Kabat方案(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)和Contact(University College London)；North方案(North等人，A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations”,Journal of Molecular Biology,406,228-256(2011))。本發明中的抗-CD47抗體的CDR可以根據本領域的任何方案或其組合及人為評估確定邊界。

抗體的輕鏈可以基於其恆定結構域的胺基酸序列歸入兩種類型(稱為kappa(κ)和lambda(λ))中的一種。抗體的重鏈可以根據取決於其重鏈恆定區的胺基酸序列而劃分為主要5種不同的類型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，並且這些類型中的幾種可以進一步劃分成亞類，如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1以及IgA2。

“IgG形式的抗體”是指抗體的重鏈恆定區所屬的IgG形式。例如，IgG4形式的抗體是指其重鏈恆定區來自IgG4。

本文術語“單株抗體”是指獲自基本均質抗體群的抗體，即組成該群的各個抗體除可少量存在的可能天然存在的突變之外是相同的。單株抗體是高度特異性的，針對單一抗原表位。相比之下，常規(多株)抗體製備物通常包括大量針對不同表位(或對不同表位有特異性)的抗體。修飾語“單株”表明獲自基本均質抗體群的抗體的特徵，且不得解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。

本文術語抗體的“抗原結合片段”包括抗體的片段或衍生物，通常該抗原結合片段包括該抗體的抗原結合區或可變區的至少一個片段 (例如一個或多個CDR)，並保持該抗體的至少一些結合特性。抗原結合片段的實例包括但不限於Fab，Fab'，F(ab')₂和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子，例如sc-Fv；由抗體片段形成的奈米抗體(nanobody)和多特異性抗體。當抗原的結合活性在莫耳濃度基礎上表示時，結合片段或衍生物通常保持其來源抗體的抗原結合活性的至少10%。較佳結合片段或衍生物保持其來源抗體的抗原結合活性的至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更高。

表位是抗體所結合的抗原區域。表位可以由連續的胺基酸形成或者藉由蛋白的三級折疊而並置的非連續胺基酸形成。

本文術語“嵌合抗體”是具有第一抗體的可變結構域和第二抗體的恆定結構域的抗體，其中第一抗體和第二抗體來自不同物種。通常可變結構域獲自齧齒動物等實驗動物的抗體，而恆定結構域序列獲自人抗體，使得與該實驗動物抗體相比，所得嵌合抗體在人受試者中誘導不良免疫應答的可能性較低。

本文術語“人源化抗體”是指含有來自人和非人(例如小鼠、大鼠)抗體的序列的抗體形式。一般而言，人源化抗體包含至少一個、通常兩個可變結構域，其中所有或基本所有的超變環相當於非人免疫球蛋白的超變環，而所有或基本所有的構架(FR)區是人免疫球蛋白的構架區。人源化抗體視需要可包含至少一部分的人免疫球蛋白恆定區(Fc)。在一些情況下，如所屬技術領域具有通常知識者所知悉，可以在人源化抗體(例如，可變結構域、構架區、和/或恆定區(如果存在))中引入胺基酸突變，例 如以改善抗體的某些性質；這樣的抗體形式也仍落入本發明“人源化抗體”的範疇。

如所屬技術領域具有通常知識者所知悉，抗體可以具有用於生產該抗體的細胞的糖鏈形式。例如，當在小鼠中、在小鼠細胞中或在來源於小鼠細胞的融合瘤中產生時，抗體可含有小鼠糖鏈。或者，如果在大鼠中、在大鼠細胞中或在來源於大鼠細胞的融合瘤中產生時，抗體可含有大鼠糖鏈。

本文術語“Fc區”用於定義免疫球蛋白重鏈中至少含有恆定區一部分的C端區。該術語包括天然序列Fc區和Fc區變體。天然序列Fc區涵蓋天然存在的各種免疫球蛋白Fc序列，例如各種Ig亞型以及其同種異型的Fc區(Gestur Vidarsson等，IgG subclasses and allotypes：from structure to effector functions，20 October 2014,doi：10.3389/fimmu.2014.00520.)。在一個實施方案中，人IgG重鏈Fc區自Cys226，或自Pro230延伸至重鏈的羧基端。然而，Fc區的C端賴胺酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有規定，Fc區或恆定區中的胺基酸殘基的編號方式依照EU編號系統，又稱作EU索引，如描述於Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991。

本文中的術語“Fc區變體”或“變體Fc區”在本文中可互換使用，指相對於天然序列Fc區包含修飾的Fc區。本發明的Fc區變體按照組成它們的胺基酸修飾來定義。

在本文中，“免疫綴合物”是與一個或多個其它物質(包括但不限於細胞毒性劑或標記)綴合的抗體。“免疫融合物”是與一個或多個其它的肽或多肽藉由共價連接而融合的抗體。

術語“藥物製劑”指如下形式的製備物，使得容許活性組分的生物學活性有效，且不含別的對會施用製備物的受試者有不可接受的毒性的成分，通常其包含活性成分和可藥用賦形劑，或由其組成。較佳地，此類製備物是無菌的。

術語“抗-CD47抗體製劑”，意指包含抗-CD47抗體作為活性成分和可藥用賦形劑的製備物。經該組合後，作為活性成分的抗-CD47抗體適於治療性或預防性施與人類或非人類動物。本發明的抗體製劑可以例如製備成水性形式的液體製劑，例如，即用式預填裝注射器，或者製備成凍乾製劑，在即將使用前藉由溶解和/或懸浮於生理可接受的溶液中進行重構(即，複溶)。在一些實施方案中，抗-CD47抗體製劑是液體製劑形式。

“可藥用賦形劑”為那些可合理施用於受試哺乳動物以提供有效劑量的所採用的組分。適合的藥用賦形劑是本領域中眾所周知的，包括但不限於緩衝劑、穩定劑、表面活性劑、溶媒等。

“穩定的”藥物製劑是指製劑中的蛋白質(例如抗體)在儲存於特定條件下之後基本上保持可接受程度的其物理穩定性和/或化學穩定性和/或生物活性。本領域已知多種分析技術可以用於測定蛋白質的穩定性，參見例如Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs(1991)and Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90(1993)。可以在選定的溫度和選定的儲存時 間測量穩定性。在一個實施方案中，藥物製劑在室溫或在40℃穩定至少4週，和/或在2-8℃穩定至少6個月，較佳穩定至少1年，並且更佳穩定至少2年。在一個實施方案中，藥物製劑較佳地在冷凍(冷凍至例如-70℃)和解凍後該製劑是穩定的。

經一段儲存時間後，製劑不顯示聚集、沉澱、混濁和/或變性；或顯示非常少的聚集、沉澱、混濁和/或變性，則可以認為抗體在製劑中“保持其物理穩定性”。可以藉由光散射法測定製劑中的亞可見聚集物、SEC-HPLC可以用於測定製劑中的可溶性聚集物。此外，可以藉由目視檢查製劑的外觀和可見異物、或者藉由OD350nm法檢測製劑的濁度、或者藉由非還原型CE-SDS法測定製劑的純度，來指示製劑的穩定性。“可接受程度的”物理穩定性可以表示於特定溫度下儲存特定時間之後，在製劑中檢測到抗體單體的百分比變化值不超過10%。在一些實施方案中，可接受程度的物理穩定性可以表現為抗體單體的百分比變化值不超過10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、或1%。抗體單體的百分比變化值不超過10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、或1%，則藥物製劑亦可被視為是穩定的。

經一段儲存時間後，如果製劑中的抗體不顯示顯著的化學改變，則可以認為抗體在製劑中“保持其化學穩定性”。化學穩定性可以藉由檢測和/或定量抗體的化學改變形式來評估。例如，可以藉由陽離子交換色譜(CEX)或成像毛細管等電聚焦電泳(icIEF)檢測製劑中抗體的電荷變異體。在一個實施方案中，藉由測定在特定溫度下儲存特定時間之後製劑中抗體的電荷變異體百分比變化值來測量製劑的穩定性，其中該變化值越 小，則製劑的穩定性越高。“可接受程度”的化學穩定性可以表示於特定溫度下儲存特定時間之後製劑中電荷變異體(例如主組分或酸性組分或鹼性組分)的百分比變化值不超過30%，例如20%。在一些實施方案中，可接受程度的化學穩定性可以表現為主組分電荷變異體的百分比變化值不超過約25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、或1%。酸性組分電荷變異體的百分比變化值少於約25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%，則藥物製劑亦可被視為是穩定的。

經一段儲存時間後，如果製劑中的抗體不顯示顯著的生物活性改變，則可以認為抗體在製劑中“保持其生物活性”。例如，可以藉由ELISA、FACS或BIACORE等檢測抗體與抗原結合作用。“可接受程度”的生物活性表示於特定溫度下儲存特定時間之後製劑中抗體生物活性的百分比變化值不超過30%、20%或10%。

術語“凍乾製劑”是指藉由液體製劑的冷凍乾燥處理得到或能夠得到的組成物。較佳地，其為具有少於5%、較佳少於3%水含量的固體組成物。

w/v是指重量體積比。在無另外說明時，例如0.01%(w/v)是指0.1mg/mL。

術語“重構的”製劑是指將固體製劑(例如凍乾製劑)溶解和/或懸浮於生理可接受的溶液中得到的液體製劑。該重構，可用重構介質包括但不限於注射用水、抑菌注射用水(BWFI)、氯化鈉溶液(例如0.9%(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5%(w/v)葡萄糖)進行。

術語“等滲”的製劑意指目的製劑具有與人血基本上相同的滲透壓。等滲製劑將通常具有約250至350mOsm/kg的滲透壓。例如，可以使用蒸氣壓或冰點式滲透壓計來測量等滲性。

如文中所用，術語“溶媒”是指可用於溶解或懸浮活性成分和非活性成分以形成可藥用製劑的液體。可用於本發明的溶媒包括但不限於水例如注射用水、抑菌注射用水(BWFI)、雙蒸水或其組合。

術語“癌”及“癌症”指或描述哺乳動物中特徵通常為細胞生長不受調控的生理疾患。此定義中包括良性和惡性癌症以及休眠腫瘤或微轉移。

在根據本發明的一些實施方案中，疾病或病徵的“治療”是指改善疾病或病徵(即，減緩或阻止或減少疾病的進展或其臨床症狀的至少一個)。在另一些實施方案中，“治療”是指緩解或改善至少一個身體參數，包括可能不能被患者辨別出的那些物理參數。在另一些實施方案中，“治療”是指在身體上(例如，可辨別的症狀的穩定)、生理上(例如，身體參數的穩定)或在這兩方面調節疾病或病徵。除非在本文中明確描述，否則用於評估疾病的治療和/或預防的方法在本領域中通常是已知的。

在根據本發明的再一些實施方案中，疾病或病徵的“預防”包括對疾病或病徵或特定疾病或病徵的症狀的發生或發展的抑制。在一些實施方式中，具有癌症家族病史的受試者是預防性方案的候選。通常，在癌症的背景中，術語“預防”是指在癌症的病徵或症狀發生前，特別是在具有癌症風險的受試者中發生前的藥物施用。

在某些實施方式中，經本發明的方法"治療"癌症，若病患個體顯示下列一或多項，則認為該個體獲得了成功治療：癌細胞的數量減少或完全消失；腫瘤大小減少；抑制或缺乏癌細胞浸潤至外圍器官包括例如癌擴散至軟組織及骨；抑制或缺乏腫瘤轉移；抑制或缺乏腫瘤生長；緩解一或多種與該特定癌相關的症狀；減少發病率及死亡率；改善生活質量；減少腫瘤的腫瘤發生性、腫瘤發生頻率或腫瘤發生能力；減少腫瘤中的癌幹細胞的數量或頻率；使腫瘤發生細胞分化成非腫瘤發生狀態；或一些效應的組合。

“抑制腫瘤生長”是指腫瘤細胞生長可藉以被抑制的任何機制。在某些實施方式中，腫瘤細胞生長藉由延緩腫瘤細胞增生而被抑制。在某些實施方式中，腫瘤細胞生長藉由停止腫瘤細胞增生而被抑制。在某些實施方式中，腫瘤細胞生長藉由殺死腫瘤細胞而被抑制。在某些實施方式中，腫瘤細胞生長藉由誘導腫瘤細胞凋亡而被抑制。在某些實施方式中，腫瘤細胞生長藉由誘導腫瘤細胞分化而被抑制。在某些實施方式中，腫瘤細胞生長藉由剝奪腫瘤細胞養分而被抑制。在某些實施方式中，腫瘤細胞生長藉由預防腫瘤細胞移動而被抑制。在某些實施方式中，腫瘤細胞生長藉由預防腫瘤細胞入侵而被抑制。

在本文中，“序列同一性”是指在比較窗中以逐個核苷酸或逐個胺基酸為基礎的序列相同的程度。可以藉由以下方式計算“(百分比)序列同一性”：將兩條最佳比對的序列在比較窗中進行比較，確定兩條序列中存在相同核酸鹼基(例如，A、T、C、G、I)或相同胺基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、 Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數目以得到匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗中的總位置數(即，窗大小)，並且將結果乘以100，以產生序列同一性百分比。為了確定序列同一性百分數而進行的最佳比對，可以按本領域已知的多種方式實現，例如，使用可公開獲得的計算機軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)軟件。所屬技術領域具有通常知識者可以確定用於比對序列的適宜參數，包括為實現正在比較的全長序列範圍內或目標序列區域內最大比對所需要的任何算法。在本發明中，就抗體序列而言，胺基酸序列同一性百分數藉由將候選抗體序列與參考抗體序列最佳比對後，在一個較佳方案中按照Kabat編號規則進行最佳比對後，予以確定。

本文術語“凝集”表示細胞結塊，而術語“血凝反應”表示特定的一類細胞(即血紅細胞)結塊。因此，血凝反應是凝集的一種類型。

本文中對照抗體“Hu5F9”是根據專利US2015/0183874 A1中公開的5F9可變區序列，由GenScript重組表達的IgG4P形式的抗-CD47抗體。對照抗體“SRF231”是根據專利US20180201677A1中公開的2.3D11可變區序列，由GenScript重組表達的IgG4P形式的抗-CD47抗體。

藥物製劑

本發明提供的藥物製劑是穩定的。在本領域中已知多種方法可以用於檢測抗體製劑的穩定性。例如，可以藉由非還原型CE-SDS和SEC-HPLC等方法，分析抗體製劑的純度和評估抗體的聚集水平；可以藉由毛細管等電聚焦電泳(cIEF)、成像毛細管等電聚焦電泳(icIEF)和離子交換色譜(IEX)等，分析抗體製劑中的電荷變異體；可以藉由 ELISA、FACS或BIACORE等檢測抗體與抗原結合作用，分析製劑中抗體的生物活性穩定性。

在一個實施方案中，在40℃高溫儲存至少4週、-70℃/5℃重複凍融、和/或在2-8℃儲存至少6個月(較佳至少1年，並且更佳至少2年)後，本發明的抗體製劑澄清、微乳光或無可見異物。

在一個實施方案中，在40℃高溫儲存至少4週、-70℃/5℃重複凍融、和/或在2-8℃儲存至少6個月(較佳至少1年，並且更佳至少2年)後，本發明的抗體製劑中的抗-CD47抗體純度在至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%以上，如藉由體積排阻色譜法或藉由非還原型CE-SDS所測定。

在一個實施方案中，在40℃高溫儲存至少4週、-70℃/5℃重複凍融、和/或在2-8℃儲存至少6個月(較佳至少1年，並且更佳至少2年)後，本發明的抗體製劑中抗-CD47抗體的至少50%，較佳至少55%，是非鹼性及非酸性形式(亦即，主峰或主要電荷形式)，如藉由成像毛細管等電聚焦電泳法所測定。

在一個實施方案中，在40℃高溫儲存至少4週、-70℃/5℃重複凍融，和/或在2-8℃儲存至少6個月(較佳至少1年，並且更佳至少2年)後，本發明的抗體製劑中抗-CD47抗體的生物活性變化值不超過30%，如藉由ELISA測定抗體與抗原的特異性結合活性。

本發明提供了一種穩定的藥物製劑，其包含(i)抗-CD47抗體或其抗原結合片段；(ii)緩衝劑；(iii)穩定劑；和(iv)表面活性劑。

(I)抗-CD47抗體

適用於本發明的藥物製劑的抗體可以是任何抗-CD47抗體。在一些實施方案中，本文所述的“抗-CD47抗體”是指這樣的抗體，其能夠以足夠的親和力結合CD47蛋白以致該抗體可以用作靶向CD47的診斷劑和/或治療劑。例如，本文提供的抗CD47的抗體的解離常數(KD)

100nM、

10nM、

5nM、

4nM、

3nM、

2nM、

1nM、

0.9nM、或

0.8nM。在一些實施方案中，該抗體結合全長人CD47或其片段(尤其是其胞外結合片段)。在一些實施方案中，抗-CD47抗體結合包含全長CD47或其片段的蛋白。在一些實施方案中，抗-CD47抗體結合細胞表面表達的CD47或其片段。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體能夠阻斷CD47與SIRPα相互作用，具有高效的抗腫瘤活性，且不引起顯著水平的紅細胞凝集反應。

在一些實施方案中，抗-CD47抗體為在中國申請202010282924.0(2020年4月10遞交)中所述的抗-CD47抗體。為本申請的目的，該中國申請的全部內容特此併入本文作為參考。

本發明的抗體可變區CDR的精確胺基酸序列邊界可使用許多公知的方案(例如Kabat、Chothia、AbM、Contact或North)中的任何方案來確定。應該注意，基於不同的定義系統獲得的同一抗體的可變區的CDR的邊界可能有所差異。即不同指派系統下定義的同一抗體可變區的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本發明定義的具體CDR序列限定抗體時，該抗體的範圍還涵蓋了這樣的抗體，其可變區序列包含該具體 CDR序列，但是由於應用了不同的方案(例如不同的指派系統或組合)而導致其所聲稱的CDR邊界與本發明所定義的具體CDR邊界不同。

在一些實施方案中，本文所述的抗-CD47抗體分子的CDR邊界是基於Kabat指派系統確定的。

具有不同特異性(即，針對不同抗原的不同結合位點)的抗體具有不同的CDR。然而，儘管CDR在抗體與抗體之間是不同的，但是CDR內只有有限數量的胺基酸位置直接參與抗原結合。使用Kabat、Chothia、AbM、Contact和North方法中的至少兩種，可以確定最小重疊區域，從而提供用於抗原結合的“最小結合單位”。最小結合單位可以是CDR的一個子部分。正如所屬技術領域具有通常知識者明瞭，藉由抗體的結構和蛋白折疊，可以確定CDR序列其餘部分的殘基。因此，本發明也考慮本文所給出的任何CDR的變體。在一些實施方案中，本發明的抗-CD47抗體或其抗原結合片段在一個CDR的變體中，最小結合單位的胺基酸殘基可以保持不變，而根據Kabat或IMGT定義的其餘CDR殘基可以被保守胺基酸殘基替代。

在一些實施方案中，本文所述的抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含選自重鏈互補決定區1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3中的一個至三個，其中該HCDR1包含與SEQ ID NO：11的胺基酸序列一致或與之相比具有至少1個且不超過3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)的胺基酸序列，HCDR2包含與SEQ ID NO：12的胺基酸序列一致或與之相比具有至少1個且不超過3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)的胺基酸序列，HCDR3包含與SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：21的胺基酸序列一致或與之相比具有至少1個且不超過3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)的胺基酸序列。

在一些實施方案中，本文所述的抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含選自輕鏈互補決定區1(HCDR1)、LCDR2和LCDR3中的一個至三個，其中該LCDR1包含與SEQ ID NO：14的胺基酸序列一致或與之相比具有至少1個且不超過3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)的胺基酸序列，LCDR2包含與SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：22的胺基酸序列一致或與之相比具有至少1個且不超過3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)的胺基酸序列，LCDR3包含與SEQ ID NO：16的胺基酸序列一致或與之相比具有至少1個且不超過3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)的胺基酸序列。

在一些實施方案中，本文所述的抗-CD47抗體或其抗原結合片段還涵蓋這樣的抗體或其抗原結合片段，其中在重鏈可變區的三個CDR上，相對於本文具體公開的三個CDR，共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)的序列，和/或在輕鏈可變區的三個CDR上，相對於本文具體公開的三個CDR，共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)的序列。

在一些實施方案中，本文所述的抗-CD47抗體或其抗原結合片段還涵蓋這樣的抗體或其抗原結合片段，其中與本文具體公開抗體的重 鏈可變區和/或輕鏈可變區相比，該重鏈可變區和/或輕鏈可變區有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過6、5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸取代，更佳胺基酸保守取代)的胺基酸序列由該胺基酸序列組成，較佳地，該胺基酸改變不發生在CDR區中。

在一些實施方案中，本文所述的抗-CD47抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區(VH)包含與選自SEQ ID NO：1、3、5、6或7的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。在一些實施方案中，本發明該抗-CD47抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區(VL)包含與選自SEQ ID NO：2、4、8、9或10的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。

在本發明的一個實施方案中，本文所述的胺基酸改變包括胺基酸的取代、***或缺失。較佳的，本文所述的胺基酸改變為胺基酸取代，較佳地為保守取代，例如不顯著改變抗體活性的保守取代。

在較佳的實施方案中，胺基酸改變發生在CDR外的區域(例如在FR中)。更佳地，本發明所述的胺基酸改變發生在重鏈可變區外和/或輕鏈可變區外的區域。在一些實施方案中，胺基酸改變發生在重鏈恆定區和/或輕鏈恆定區。

在本發明的一個實施方案中，本文所述的胺基酸改變包括胺基酸的取代、***或缺失。較佳的，本文所述的胺基酸改變為胺基酸取代，較佳地為保守取代。在一個較佳的方面，保守取代來自以下表A中 所示的示例性取代殘基，較佳地為表A中所示較佳的保守胺基酸取代殘基。

在一些實施方案中，包含胺基酸改變的本文所述的抗體與本文所公開的具體抗體具有相當或相似的性質。

在一些實施方案中，本文所述的抗-CD47抗體包括對CDR、輕鏈可變區、重鏈可變區、輕鏈或重鏈的翻譯後修飾。

在一些實施方案中，本文所述的抗-CD47抗體是全長抗體、單域抗體或雙(多)特異性抗體。在一些實施方案中，抗-CD47抗體片段例如VHH、Fab抗體、Fab’抗體、Fab’-SH、(Fab’)₂抗體、單鏈抗體例如scFv、Fv、或dAb(domain antibody)。

在一些實施方案中，本文所述的抗-CD47抗體，是任何IgG形式的抗體，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4形式的抗體。在一些實施方案中，抗-CD47抗體是IgG4P形式的抗體，即對人IgG4恆定區內的鉸鏈區進行修飾Ser228Pro(S228P，根據EU編號)，以避免或減少鏈交換。

在一些實施方案中，本文所述的抗體Fc區可引入一個或多個胺基酸修飾，以此產生Fc區變體。Fc區變體可包含在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如取代)的人Fc區序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc區)，例如在Bruhns和Jönsson發表在Immunol Rev.2015 Nov；268(1)：25-51的文章中，在第44頁上，總結了多個對人IgG1進行改造以增強或降低其對FcγR的結合及增強或降低相應的功能。

在一些實施方案中，本文所述的抗-CD47抗體包含Fc區變體，該Fc區變體具有降低或缺乏的Fc γ R結合活性。在一些實施方案中，該Fc區變體具有胺基酸取代，具體地，該胺基酸取代選自免疫球蛋白重鏈E233、L234、L235、N297和P331的位置處包含其它的胺基酸取代。在 一些實施方案中，該Fc區變體的胺基酸取代為E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。

在一些實施方案中，本文中的抗體經改變以增加或降低抗體糖基化的程度。對抗體的糖基化位點的添加或缺失可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一個或多個糖基化位點而方便地實現。糖基化可以被改變以例如增加抗體對“抗原”的親和力。可以藉由例如改變抗體序列內一個或多個糖基化位點來完成這種修飾。例如，可以進行一個或多個胺基酸取代，其導致消除一個或多個可變區框架糖基化位點，從而消除該位點的糖基化。這種無糖基化可以增加抗體對抗原的親和力。這樣的方法在例如美國專利No.5,426,300中有所描述。當抗體包含Fc區時，可以改變附著於其上的糖類。在一些應用中，除去不想要的糖基化位點的修飾是有用的，例如除去岩藻糖模塊以提高抗體依賴性的細胞介導的細胞毒性(ADCC)功能。在其它應用中，可以進行半乳糖苷化修飾以修飾補體依賴性細胞毒性(CDC)。

在一些實施方案中，本文所述的抗-CD47抗體是經半胱胺酸工程改造的抗體，例如“硫代MAb”，其中抗體的一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。

在一些實施方案中，本文中的抗體可進一步被修飾為含有本領域中已知且輕易獲得的其他非蛋白質部分。該非蛋白質部分包括，但不限於，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實例包括，但不限於，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二烷、聚-1,3,6-三烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二 醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。

在一些實施方案中，藥物製劑是含水藥物製劑。考慮例如期望劑量體積和施用模式來決定製劑中存在的抗體的濃度。本發明的藥物製劑包含高濃度的抗-CD47抗體。在一些實施方案中，抗-CD47抗體濃度為約10mg/mL至約150mg/mL，例如約10mg/mL、約20mg/mL、約30mg/mL、約40mg/mL、約50mg/mL、約60mg/mL、約70mg/mL、約80mg/mL、約90mg/mL、約100mg/mL、約110mg/mL、約120mg/mL、約130mg/mL、約140mg/mL或約150mg/mL，並且包括介於之間的所有值和範圍。在一些實施方案中，抗體濃度為約50mg/mL或約80mg/mL。

免疫綴合物和免疫融合物

在一些實施方案中，本發明的藥物製劑中的抗-CD47抗體可以替換為包含抗CD47-抗體或其片段的免疫綴合物，該免疫綴合物包含本文中提供的任何抗-CD47抗體或其抗原結合片段和其它物質。在一個實施方案中，該其它物質例如細胞毒性劑，其包括任何對細胞有害的藥劑。

在一些實施方案中，本發明提供包含提供的任何抗CD47-抗體或其抗原結合片段的免疫融合物的藥物製劑。

(II)緩衝劑

如本文所用的術語“緩衝劑”表示一種藥用賦形劑，其用於穩定藥物製劑的pH。合適的緩衝劑是本領域中熟知的，包括但不限於組胺酸緩衝劑、枸櫞酸鹽緩衝劑、琥珀酸鹽緩衝劑、醋酸鹽緩衝劑、精胺酸緩衝劑、磷酸鹽緩衝劑或其混合物。本發明提供的緩衝劑的濃度為約10mM至 約80mM，較佳地為約10mM至約50mM。在一個實施方案中，緩衝劑的濃度為約10mM、約20mM、約30mM、約40mM或約50mM，較佳地為約20mM。

“枸櫞酸鹽緩衝劑”是一種包含枸櫞酸鹽離子的緩衝劑。枸櫞酸鹽緩衝劑可包括枸櫞酸、枸櫞酸鈉、枸櫞酸鉀等中的一種或多種。在一些實施方案中，枸櫞酸鹽緩衝劑是枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝劑。

“組胺酸緩衝劑”是指包含組胺酸離子的緩衝劑。組胺酸緩衝劑可以包括組胺酸、鹽酸組胺酸、乙酸組胺酸、磷酸組胺酸、硫酸組胺酸等中的一種或多種。在一些實施方案中，組胺酸緩衝液是組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液。

獨立於所用的緩衝劑，可以用本領域中已知的酸或鹼(例如鹽酸、醋酸、磷酸和枸櫞酸、氫氧化鈉和氫氧化鉀)將溶液pH值調節為約5.0-7.0。在一個實施方案中，pH值調節為約5.0-7.0、約5.0-6.5、約5.0-6.0、約5.5-7.0、約6.0-7.0、或約6.5-7.0，較佳地pH值調節為約5.0、約5.5、約6.0、約6.5、約7.0，更佳地pH值調節為約6.5。

在一些實施方案中，本發明的藥物製劑包含約20mM的醋酸鹽緩衝劑，pH值為約5.0-6.5，較佳地pH值為約5.0或約5.5。在一個實施方案中，本發明的藥物製劑包含約20mM的枸櫞酸鹽緩衝劑(如枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝劑)，pH值為約5.0-6.5，較佳地pH值為約6.0或約6.5。在一個實施方案中，本發明的藥物製劑包含約20mM的磷酸酸鹽緩衝劑，pH值為約5.0-6.5，較佳地pH值為約6.5。在一個實施方案中，本發明的藥物製劑包含約20mM的組胺酸鹽緩衝劑(如組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝液)， pH值為約5.0-6.5，較佳地pH值為約5.5、約6.0或約6.5，更佳地pH值為約6.5。

(III)穩定劑

如本文所用的術語“穩定劑”表示一種藥用賦形劑，其用於保護活性藥物成分和/或製劑免於在生產、儲存和應用過程中發生化學和/或物理降解。

本發明的藥物製劑包含至少一種穩定劑，穩定劑可選自胺基酸、糖、多元醇和鹽及其組合。

如本文所用的術語“胺基酸”表示具有位於羧基基團的α-位的胺基部分的藥用有機分子。胺基酸的實例包括但不限於精胺酸、甘胺酸、鳥胺酸、賴胺酸、組胺酸、谷胺酸、天冬胺酸、異亮胺酸、亮胺酸、丙胺酸、***酸、酪胺酸、色胺酸、蛋胺酸、絲胺酸、脯胺酸。在各種情況下採用的胺基酸較佳為L型胺基酸。鹼性胺基酸諸如精胺酸、組胺酸或賴胺酸，較佳以其無機鹽的形式(有利地以鹽酸鹽形式，即作為胺基酸鹽酸鹽)使用。在本發明中使用的較佳的胺基酸為精胺酸，較佳地為鹽酸精胺酸。所用鹽酸精胺酸的濃度為約1mg/mL至約100mg/mL，5mg/mL至約40mg/mL，例如約5mg/mL、約10mg/mL、約15mg/mL、約20mg/mL、約26mg/mL、約32mg/mL、約50mg/mL、約60mg/mL、約70mg/mL、約80mg/mL或約90mg/mL，更佳地為約26mg/mL。

如本文所用的術語“糖”包括單糖和寡糖。單糖是不能被酸水解的單體碳水化合物，包括簡單糖及其衍生物(例如胺基糖)。糖通常以其D構型使用。單糖的實例包括葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖、核 糖、脫氧核糖、神經胺酸。寡糖是由多於一個單體糖單元組成的碳水化合物，這些單體糖單元藉由支鏈或直鏈糖苷鍵連接。寡糖內的單體糖單位可以相同或不同。根據單體糖單元的數量不同，寡糖為二糖、三糖、四糖、五糖等。與多糖相比，單糖和寡糖溶於水。寡糖的實例包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麥芽糖和棉子糖。在本發明中使用的較佳的糖為蔗糖和海藻糖(即，α，α-D-海藻糖)，最佳地為蔗糖。可用的海藻糖為海藻糖二水合物。在一些實施方案中，藥物製劑中糖(例如蔗糖)的濃度為約10mg/mL至約100mg/mL，較佳地為約20mg/mL至約80mg/mL，例如約20mg/mL、約30mg/mL、約50mg/mL、約65mg/mL或約80mg/mL。

如本文所用術語“多元醇”表示指具有一個以上的羥基基團的藥用醇。合適的多元醇包括但不限於甘露醇、山梨醇、甘油(丙三醇)、葡聚糖、阿糖醇、丙二醇、聚乙二醇以及它們的組合。在一些實施方案中，多元醇(例如甘露醇、山梨醇)在藥物製劑中濃度為約20mg/mL至約100mg/mL。在一些實施方案中，多元醇(例如甘露醇、山梨醇)在藥物製劑中濃度為約40mg/mL至約60mg/mL，較佳地為約45mg/mL。

本發明的藥物製劑包含的“鹽”指無機鹽，例如氯化鈉、氯化鎂、氯化鈣。

在一些實施方案中，本發明藥物製劑中的穩定劑為胺基酸，較佳地為精胺酸。在一個實施方案中，穩定劑為胺基酸和糖的組合，較佳地，胺基酸為精胺酸，糖為蔗糖或海藻糖。在一個實施方案中，穩定劑為胺基酸和多元醇的組合，較佳地，胺基酸為精胺酸，多元醇為山梨醇或甘 露醇。在一個實施方案中，穩定劑為胺基酸和鹽的組合，較佳地，胺基酸為精胺酸，鹽為氯化鈉。

在一些實施方案中，本發明藥物製劑中的穩定劑為精胺酸，其中精胺酸的濃度為約5mg/mL至約40mg/mL，較佳地為約26mg/mL和約32mg/mL。在一個實施方案中，本發明藥物製劑中穩定劑為精胺酸和蔗糖的組合，其中精胺酸和蔗糖的質量濃度比為約1：1至約1：20，例如約1：1、約1：2、約1：3、約1：4、約1：5、約1：6、約1：7、約1：8、約1：9、約1：10、約1：11、約1：12、約1：13、約1：14、約1：15、約1：16、約1：17、約1：18、約1：19和約1：20。

在一個實施方案中，本發明藥物製劑是等滲的。

(IV)表面活性劑

本發明的藥物製劑還可包含表面活性劑。術語“表面活性劑”一般包括保護蛋白質例如抗體免受空氣/溶液界面誘導的應力、溶液/表面誘導的應力的影響以減少抗體的聚集或使製劑中顆粒物的形成最小化的試劑。本發明的藥物製劑中的表面活性劑可為非離子型表面活性劑，諸如聚山梨酯(例如聚山梨酯-20，聚山梨酯-80等)或泊洛沙姆(例如泊洛沙姆-188等)。

本發明藥物製劑中所含的表面活性劑的量可隨製劑的特定目的特性、特定環境、和使用製劑的特定目的而改變。在一些實施方案中，表面活性劑(例如聚山梨酯-80)在藥物製劑中的濃度為約0.002%(w/v)(i.e.,0.02mg/mL)至約0.5%(w/v)(i.e.,5mg/mL)、約0.01%(w/v)(i.e.,0.1mg/mL)至約0.1%(w/v)(i.e.,1mg/mL)。在一些實施方案 中，表面活性劑(例如聚山梨酯-80)在藥物製劑中的濃度為約0.01%(w/v)(i.e.,0.1mg/mL)至約0.05%(w/v)(i.e.,0.5mg/mL)，較佳地為約0.01%(w/v)(i.e.,0.1mg/mL)、約0.02%(w/v)(i.e.,0.2mg/mL)或約0.03%(w/v)(i.e.,0.3mg/mL)，更佳地為約0.02%(w/v)(i.e.,0.2mg/mL)。

出於其他考慮，也可在本發明製劑中使用其它的賦形劑。該賦形劑包括，例如，調味劑、抗微生物劑、甜味劑、抗靜電劑、抗氧化劑、明礬等等。這些和另外已知的藥物賦形劑和/或適用於本發明製劑的添加劑是本領域公知的，例如，列出於“The Handbook of Pharmaceutical Excipients，第4版，Rowe等人編，American Pharmaceuticals Association(2003)；和Remington：the Science and Practice of Pharmacy，第21版，Gennaro編，Lippincott Williams & Wilkins(2005)”。

根據本發明該藥物製劑也可提供為凍乾形式或由凍乾形式重構的液體形式。“凍乾形式”藉由本領域中已知的凍乾方法製得。凍乾物通常具有約0.1%(w/w)至5%(w/w)的殘留水分含量，並且以粉末或物理穩定的餅狀物形式存在。“重構形式”可藉由在添加重構介質後使凍乾物快速溶解而獲得。合適的重構介質包括但不限於注射用水(WFI)、抑菌注射用水(BWFI)、氯化鈉溶液(例如0.9%(w/v)NaCl)和葡萄糖溶液(例如5%(w/v)葡萄糖)。

製劑的製備

可以使用本領域已知方法來生產本文所述任何抗-CD47抗體，例如包括下述步驟的方法，即在適合於生成此類抗體的條件下培養含有以適合於表達的方式編碼本文所述任何抗-CD47抗體的核酸的宿主細胞 (HEK293細胞或以HEK293細胞為基礎改造而得到的HEK293T、HEK293F、HEK293E細胞；CHO細胞或以CHO細胞為基礎改造而得到的CHO-S、CHO-dhfr-、CHO/DG44、ExpiCHO)，回收細胞培養液，並利用常規的純化方法純化抗體。

用於將治療性抗體純化至藥用級的技術是本領域公知的。例如，Tugcu等(Maximizing productivity of chromatography steps for purification of monoclonal antibodies,Biotechnology and Bioengineering 99(2008)599-613)描述了在蛋白A捕獲步驟後使用離子交換色譜(陰離子IEX和/或陽離子CEX色譜)的抗體三管柱純化方法。Kelley等(Weak partitioning chromatography for anion exchange purification of monoclonal antibodies.Biotechnol Bioeng.2008 Oct 15；101(3)：553-66.)描述了兩柱純化法，其中在蛋白A親和色譜後使用弱分配陰離子交換樹脂。

在獲得足夠純度的抗體後，可以按照本領域已知的方法，製備包含抗體的製劑。例如，可以採用如下步驟進行製備：(1)在發酵結束後將發酵液離心澄清去除細胞等雜質以獲得上清；(2)使用親和層析(例如對IgG1、IgG2和IgG4型抗體具有特異親和力的蛋白A管柱)捕獲抗體；(3)進行病毒滅活；(4)精製純化(一般可以採用CEX陽離子交換層析)，以去除蛋白中的雜質；(5)病毒過濾(使病毒滴度降低，例如4log10以上)；(6)超濾/滲濾(可以用於將蛋白置換於利於其穩定的製劑緩衝劑中並濃縮至合適的濃度供注射用)。參見例如，Minow B,Rogge P,Thompson K.Implementing a Fully Disposable MAb Manufacturing Facility.BioProcess Int.10(6)2012：48-58。

治療方法或用途

在一方面，本發明提供預防、診斷或治療受試者CD47相關的疾病的方法。該方法包括向需要的患者施用有效量的本文所述的藥物製劑。

在一方面，本發明提供抗-CD47抗體或其抗原結合片段在生產或製備用於預防、診斷或治療受試者CD47相關的疾病的藥物製劑中的用途。

在一方面，本發明提供的藥物製劑，用於預防或治療受試者CD47相關的疾病。針對藉由使用標準方法鑑定的受試者中CD47相關的疾病，可以施用本發明公開的藥物製劑。

在一些實施方案中，本文所述的CD47相關的疾病指與受試者中CD47表達、活性和/或信號傳遞異常相關的疾病，包括但不限於癌症。在一些實施方案中，CD47相關的疾病中，編碼CD47的核酸(水平或含量)升高，或CD47表達升高，或CD47蛋白質水平升高、或活性升高，或活性信號傳遞增強。

在一些實施方案中，該疾病的治療將受益於抑制核酸或蛋白質水平的CD47，或受益於阻斷CD47與其配體的結合或CD47介導的信號傳遞。

本文術語“受試者”或“患者”或“個體”包括任何人或非人動物。術語“非人動物“包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，諸如非人靈長類動物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。在一些實施方案中，受試者可以是哺乳動物，例如，靈長類，較佳地，高 級靈長類，例如，人類(例如，患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的風險的個體)。在一個實施方案中，受試者患有本文所述疾病(例如，癌症)或具有患有本文所述疾病的風險。在某些實施方案中，受試者接受或已經接受過其它治療，例如化療治療和/或放射療法。

在一些實施方案中，該癌症包括各種血液癌和實體瘤，以及轉移性病灶。在一個實施方案中，實體瘤的例子包括惡性腫瘤。癌症可以處於早期、中期或晚期或是轉移性癌。該癌症例如膀胱癌胰腺癌、淋巴瘤、白血病、多發性骨髓瘤、(惡性)黑色素瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、神經膠質瘤、膠質母細胞瘤、骨髓瘤、子宮內膜癌、腎癌、(良性)胎記瘤、***癌、甲狀腺癌、子宮頸癌、胃癌、肝癌。在一些實施方案中，該淋巴瘤選自Burkitt淋巴瘤、彌漫性大細胞淋巴瘤或套細胞淋巴瘤。在一些實施方案中，該白血病為早幼粒細胞白血病。

本發明藥物製劑可以藉由任何合適的方式給藥，包括經口、腸胃外，肺內和鼻內給藥，並且如果需要局部治療，則可以病灶內給藥。腸胃外輸注包括肌內，靜脈內，動脈內，腹膜內或皮下給藥。給藥可以藉由任何合適的途徑進行，例如藉由注射，例如靜脈內或皮下注射，部分取決於給藥是短暫的還是長期的。本文考慮了各種給藥方案，包括但不限於在各個時間點上的單次或多次給藥，推注給藥和脈衝輸注。

在一些實施方案中，可以將本發明所述的藥物製劑與另一治療劑聯合施用於受試者或個體來治療疾病。例如，為了治療癌症，可以將本文所述藥物製劑與另一抗癌治療(例如化療或不同的抗體治療)聯合施用。在一些實施方案中，該治療劑例如化療劑、放療劑、細胞因子、疫苗、 其他抗體、免疫調節劑或者其他生物大分子藥物。在一些實施方案中，治療方式包括外科手術；放射療法、局部照射或聚焦照射等。上述聯合療法包括組合給藥(其中兩種以上治療劑被包含在相同或分開的製劑中)和分別給藥，其中，本發明的藥物製劑的給藥可以發生在另外的治療劑和/或佐劑和/或治療方式的給藥前、同時和/或之後。

抗體的“治療有效量”會取決於例如要治療的狀況，狀況的嚴重程度和過程，施用抗體是為了預防還是治療目的，先前的療法，患者的臨床史和對抗體的響應，所使用的抗體的類型，和主治內科醫師的斟酌。將抗體以一次或在一系列治療中合適地施用於患者，而且可在診斷後的任何時間施用於患者。可作為唯一治療或與在治療所討論的狀況中有用的其它藥物或療法聯合施用抗體。

作為一般建議，施用於人的抗體的治療有效量會在約0.01至約50mg/kg患者體重的範圍中，無論是藉由一次或多次施用。在一些實施方案中，所使用的抗體為例如每日施用約0.01至約45mg/kg，約0.01至約40mg/kg，約0.01至約35mg/kg，約0.01至約30mg/kg，約0.01至約25mg/kg，約0.01至約20mg/kg，約0.01至約15mg/kg，約0.01至約10mg/kg，約0.01至約5mg/kg，或約0.01至約1mg/kg。在一些實施方案中，以約15mg/kg施用抗體。然而，其它劑量方案也可能是有用的。劑量可以作為單劑或作為多劑(例如2或3劑)施用，諸如輸注。組合治療中施用的抗體的劑量可以與單一治療相比降低。此療法的進展容易藉由常規技術來監測。

製品或試劑盒

本發明提供製品或試劑盒，其包含裝有本發明藥物製劑的容器，而且視需要提供使用它的說明書。合適的容器包括例如瓶，管形瓶，袋和注射器。容器可以用各種材料製成，諸如玻璃，塑料(諸如聚氯乙烯或聚烯烴)，或金屬合金(諸如不銹鋼或哈斯特鎳合金)。容器裝有藥物製劑，而且該容器上或關聯的標簽可指示使用說明。製品可進一步包括從商業和用戶立場看想要的其它材料，包括其它緩衝劑，稀釋劑，濾器，針頭，注射器，和印有使用說明書的包裝插頁。在一些實施方案中，該製品進一步包括一種或多種另一藥劑(例如化療劑和抗腫瘤劑)。對於該一種或多種藥劑合適的容器包括例如瓶，管形瓶，袋和注射器。

組合產品

在一方面，本發明還提供了組合產品，其包含本發明的藥物製劑，以及一種或多種其它治療劑。本發明的組合產品可用於本發明的治療方法中。

本發明包括本文所述的特定實施方案的任何組合。應當理解，儘管描述了特定的內容和實施例來表明本發明較佳的實施方案，但是這僅僅是說明性的，用於舉例，本發明還涵蓋對所屬技術領域具有通常知識者來說顯而易見的針對本發明的較佳實施方案的進行修改的實施方案。出於所有目的，包括引文在內的本文所引用的所有公開物、專利及專利申請將以引用的方式全部併入本文作為參考。

[具體實施方式]

本發明藥物製劑中抗體的製備和活性驗證

實施例1 融合瘤抗體的製備與篩選

利用融合瘤技術獲得抗-CD47抗體，採用帶有Fc標簽的人CD47胞外結構域的重組蛋白CD47-Fc(ACROBiosystems，Cat：CD7-H5256)作為抗原免疫小鼠。將CD47-Fc重組蛋白與完全或不完全弗氏佐劑(Sigma-Aldrich)混合並乳化後，免疫SJL(北京維通利華實驗動物技術有限公司)和BALB/c(揚州大學醫學中心)小鼠。小鼠經過一輪免疫(完全弗氏佐劑)以及兩輪加強免疫(不完全弗氏佐劑)後，並於每次加強免疫後取血，分別藉由ELISA技術檢測免疫後小鼠血清與重組人CD47-Fc(ACROBiosystems，Cat：CD7-H5256)蛋白結合活性，同時藉由流式細胞術(FACS)檢測小鼠血清與過表達人CD47的CHO細胞(GenScript構建)的結合效價。選取血清效價高的小鼠的脾臟細胞與骨髓瘤細胞系SP2/0(ATCC)融合。在融合前四天，將人CD47胞外結構域的重組蛋白CD47-Fc腹腔注射於小鼠體內以加強免疫。融合當日，將小鼠安樂死後，取小鼠脾臟細胞進行勻質化以獲得單細胞懸液。使用電融合儀將小鼠脾臟細胞與鼠骨髓瘤細胞系SP2/0融合(3：1)。將融合後的細胞重新懸浮於含HAT(次黃嘌呤，胺基蝶呤和胸腺嘧啶脫氧核苷，GIBCO，Cat：21060016)培養基篩選出成功融合的融合瘤細胞。收集融合瘤細胞的上清液，藉由兩輪ELISA篩選出具有分泌特異性結合人CD47抗體的融合瘤細胞。隨後利用CD47相關的功能篩選實驗(例如與人或食蟹猴的CD47結合特異性；無促紅細胞凝集的活性；促進巨噬細胞對腫瘤細胞吞噬)，鑑定融合瘤分泌上清活性，陽性的融合瘤純株進行單輪或多輪亞選殖以得到單株。經篩選，125G4A4為最終選定的融合瘤純株。

將候選融合瘤細胞125G4A4擴大培養，經過7-10天培養後，收集上清，離心並過濾以去除細胞及碎片。將上清流過Protein A的純化管柱(GenScript)，繼而用含有0.05M Tris和1.5M NaCl(pH 8.0)的緩衝劑清潔平衡後，用0.1M枸櫞酸鈉(pH 3.5)沖提，並立刻用九分之一體積的1M Tris-HCl(pH 9)中和，然後用PBS緩衝劑透析。最終得到融合瘤抗體125G4A4用於進一步表徵。

1.1 FACS檢測抗體與過表達人CD47蛋白的CHO-K1細胞的結合活性

將人CD47蛋白(NCBI登錄號：NP_001768.1)過表達於倉鼠卵巢細胞系CHO-K1中，建立過表達人CD47蛋白的CHO-K1細胞系。將此細胞與經梯度稀釋後的抗體125G4A4以及對照抗體C0774CK230-C(即Hu5F9)共孵育(最高濃度300nM，三倍稀釋，共12個濃度點)，4℃孵育50分鐘。用冰的PBS將細胞洗滌兩次，加入iFluor647標記的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體(Genscript)，4℃避光孵育40分鐘。將細胞用冰的PBS洗滌兩次後，藉由Calibur(BD Biosciences)流式細胞儀檢測螢光信號，並根據其平均螢光強度(MFI)用GraphPad擬合濃度依賴的曲線並計算EC₅₀。如表1所示，最終得到的融合瘤抗體125G4A4與過表達人CD47蛋白的CHO-K1具有較高的結合活性，EC₅₀為0.22nM。

1.2 FACS檢測抗體與腫瘤細胞株表面上CD47結合活性

人Burkitt淋巴瘤細胞株Raji細胞表面內源性表達人CD47，將抗體125G4A4以及對照抗體Hu5F9梯度稀釋到含2%胎牛血清(FBS,Gibco,Cat：10100147)的PBS中(最高濃度46.3nM，三倍稀釋，共8個 濃度點)，將稀釋後的抗體與Raji細胞(購自ATCC)(每孔5*10⁵個細胞)混合後，4℃孵育1小時。然後用含2%胎牛血清(FBS)的PBS將細胞洗滌三次，加入PE標記的小鼠抗人IgG Fc抗體(Biolegend,Cat：409304)，4℃避光孵育1小時。將細胞用含2%胎牛血清(FBS)的PBS洗滌三次後，藉由CantoII(BD Biosciences)流式細胞儀檢測螢光信號，並根據其平均螢光強度(MFI)用GraphPad擬合濃度依賴的曲線並計算EC₅₀。如表1所示，融合瘤抗體125G4A4與Raji細胞具有結合活性，EC₅₀為0.84±0.02nM。

1.3 抗-CD47抗體阻斷人CD47與SIRPα的相互作用

利用ELISA的方法檢測125G4A4在阻斷人CD47與SIRPα結合的能力。將人CD47胞外段與人IgG Fc端重組蛋白hCD47-Fc(ACROBiosystems,Cat：CD7-H5256)包被於96孔板，4℃孵育過夜。用PBST(含有0.5%的Tween-20的PBS)洗板3次後，加入含1% BSA的PBST封閉2小時。用PBST洗板三次後，加入梯度稀釋的抗體125G4A4以及對照抗體Hu5F9(最高濃度66.7nM，三倍稀釋，共8個濃度點)與終濃度為2.5μg/ml的SIRPα-His重組蛋白(ACROBiosystems,Cat：SIA-5225)的混合物，並在室溫孵育1小時。PBST洗板3次，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗His-tag二抗(CWBIO,Cat：CW0285M)，用以檢測被包被的CD47捕獲的SIRPα。將96孔板在37℃孵育30分鐘後，用PBST洗板5次，加入TMD(Surmodics，Cat：TMBW-1000-01)顯色液，避光孵育15分鐘。加入2N H₂SO₄終止顯色反應。在酶標儀上讀取OD₄₅₀。吸光度值反應了與CD47結合的SIRPα的量，用Graphpad擬合出濃度依賴 的曲線並計算抗-CD47抗體阻斷CD47與SIRPα結合的IC₅₀。如表1所示，125G4A4能有效阻斷CD47與SIRPα的相互作用，IC₅₀為3.06nM。

1.4 抗-CD47抗體誘導人紅細胞凝集活性的檢測

已知現有技術中，大多數的抗-CD47抗體具有誘導紅細胞凝集的特性。普遍認為，該特性與治療性抗-CD47抗體出現的貧血等副作用密切相關。為此，我們藉由體外紅細胞凝集實驗對本發明中抗-CD47抗體進行評估以篩選無促紅細胞凝集特性的抗體。具體的方法如下，採集健康捐贈者的新鮮人的血液，用PBS洗五次後，稀釋成含10%人紅細胞的懸液，將紅細胞懸液與實驗抗體(抗體125G4A4以及對照抗體Hu5F9，最高濃度667nM，三倍稀釋，總共12個濃度點)混合後加入到圓底96孔板中，在室溫孵育16個小時後拍照並根據細胞在孔中的表現判定結果。如果發生了紅細胞的凝集，則細胞會平鋪成網狀，孔中呈現出一個較大的片狀細胞層，直徑大於陰性對照孔；相反的，如果未發生凝集，則紅細胞會沉積在孔底，孔中會出現較小的點狀的細胞團的沉澱。125G4A4在本實驗中未發生明顯的誘導紅細胞凝集特性。

1.5 檢測抗-CD47抗體對人巨噬細胞吞噬腫瘤細胞作用的影響

基於流式細胞術的測定方法檢測本發明抗體125G4A4促進巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的能力。採集健康捐贈者的新鮮血液，用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare,Cat：17-1440-02)經密度梯度離心得到外周血單個核細胞(PBMC)。利用人總單核細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec,Cat：130-096-537)進一步分離得到單核細胞，加入巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF,R&D Systems,Cat：216-MC)貼壁培養連續7天，將單核細 胞誘導分化為巨噬細胞。在進行吞噬試驗實驗當天，將上述已經完成分化的巨噬細胞置於無血清的培養基中饑餓2個小時。同時將靶腫瘤細胞Raji按照CFSE(eBioscience,Cat：65-0850-85)說明書推薦的標記步驟進行螢光標記。將標記好的腫瘤細胞與巨噬細胞按照4：1的比例混合，同時加入待測濃度的實驗抗體在37℃孵育2小時。然後用PBS將細胞洗滌兩次後用胰酶(Gibco,Cat：25200072)消化，加入APC標記的抗CD14抗體(Biolegend,Cat：325608)，在含2%胎牛血清的PBS中冰上避光孵育30分鐘。將細胞洗滌兩次並藉由流式細胞術進行分析。計算CD14陽性的巨噬細胞群體中CFSE陽性的細胞占比。如表1該，125G4A4能有效促進巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬效應。

實施例2 融合瘤抗體人源化改造

2.1 測定融合瘤抗體可變區序列

利用融合瘤測序的方法，將融合瘤純株125G4A4的細胞進行擴大培養並利用TRIzol(購自Ambio)提取總RNA，利用抗體特異性的 引子將其反轉錄為DNA(Takara，PrimerScript 1^st Strand cDNA Synthesis Kit)，並使用抗體特異性引子對編碼鼠免疫球蛋白V-區域的基因片段進行擴增，藉由序列測定分析，得到融合瘤抗體可變區序列，125G4A4抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列分別如SEQ.ID No.：1和2所示，核苷酸序列分別如SEQ.ID No.：19和20所示。

2.2 構建和表達嵌合抗體

根據CD47作用機理，本發明具體實施例中使用人IgG4(S228P)的恆定區作為抗體的重鏈恆定區，以人輕鏈κ鏈恆定區作為抗體輕鏈恆定區。將IgG4核心鉸鏈區228位的絲胺酸突變為脯胺酸(S228P)可增強核心鉸鏈區的二硫鍵連接，減少IgG4 Fab臂交換，大大減少了半分子的形成。重鏈和輕鏈恆定區基因合成後，重鏈和輕鏈可變區基因藉由EcoRI、BamHI雙酶切載體PTT5，同源重組進載體。經測序正確後將抗體重鏈、輕鏈按莫耳比1.5：1的比例共轉染HEK293細胞。培養120小時後離心收集上清純化得到嵌合抗體。

在進行抗體人源化設計之前，需要將一些在CDR區的轉錄後修飾(post translational modification,PTM)的位點進行突變以避免對蛋白構像進而對其功能產生影響。經過PTM分析，在125G4A4的CDR鑑定出2個PTM位點，包括在重鏈存在一個NSS糖基化位點，和在輕鏈存在的一個DG異構化位點。NSS糖基化位點和DG異構化位點分別突變為QSS和EG。根據本實例純化得到突變後的嵌合抗體命名為Ch-125G4-m35。Ch-125G4-m35抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列分別如SEQ.ID No.：3和4所示。

2.3 嵌合抗體人源化設計

將嵌合抗體125G4A4m抗體可變區序列經過和PDB_Antibody database數據庫做Blast對比，選定與其相似度最高的人骨架序列進行人源化：125G4A4 m重鏈可變區和人germline IGHV1-69，輕鏈可變區和人germline IGKV1-16有較高序列同源性。再藉由Kabat指派系統定義可變區CDR的胺基酸序列及其精確邊界。繼而將與鼠源抗體可變區CDR段嫁接至人骨架序列中，以實現抗體的人源化。

為了保持抗體活性，可利用計算機模擬技術，應用分子對接分析可變區及其周邊的框架胺基酸序列，考察其空間立體結合方式。藉由計算靜電力，范德華力，親疏水性和熵值，分析各候選的抗體基因序列中可與CD47作用及維護空間構架的關鍵胺基酸個體，將其嫁接回已經選擇的人抗體基因框架，並在此基礎上標出必須保留的框架區胺基酸位點，合成人源化抗體。抗體框架區一些關鍵位點要回復突變為嵌合抗體Ch-125G4-m35的抗體框架區序列。根據回復突變數目和排列，分別設計出多條不同的人源化重鏈可變區(SEQ.ID No.：5，SEQ.ID No.：6，SEQ.ID No.：7)以及輕鏈可變區(SEQ.ID No.：8，SEQ.ID No.：9，SEQ.ID No.：10)(見表2)。本發明最後確定的人源化抗體Hu-125G4A4-48，在後續的實驗中將其命名為HMA02h14-48。該抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列分別如SEQ.ID No.：7和8所示。

2.4 人源化抗體表達

將上述人源化設計的重鏈和輕鏈可變區的DNA片段擴增並選殖至包含表達人抗體恆定區的載體中構建表達抗體的質粒(pCDNA3.4，購至Thermo Cat# A14697)。將重鏈和輕鏈的表達載體共轉染Expire293細胞(Thermo Cat#A14525)，於37℃培養6天後，收集上清，根據前述方法，藉由Protein A親和純化，得到重組抗體用於抗體的進一步表徵。人源化抗體為IgG4 S228P(IgG4P)亞型。

實施例3 人源化抗體的篩選

藉由檢測人源化抗體與食蟹猴B細胞的結合能力，人巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的能力及紅細胞凝集能力篩選高活性的人源化抗體。

檢測人源化抗體與猴B細胞的結合能力：利用流式細胞術方法檢測125G4A4人源化系列抗體與食蟹猴B細胞表面CD47的結合進行測定。具體方法如下：從食蟹猴血(由上海益諾思生物技術股份有限公司提供)中，用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare,Cat：17-1440-02)經 密度梯度離心分離獲得外周血單個核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs)。PBMC與125G4A4人源化系列抗體或isotype(IgG4P)在含2%胎牛血清的PBS中，4℃孵育30分鐘。然後將細胞洗滌三次，與二抗(PE標記的小鼠抗人IgG Fc抗體，Biolegend,Cat：409304)在含2%胎牛血清的PBS中，4℃避光孵育30分鐘。將細胞洗滌三次並藉由流式細胞術進行分析。用與食蟹猴有交叉反應性的抗人CD20的抗體(Brilliant Violet 421^TM標記的抗人CD20 Antibody，Biolegend，Cat：302330)標記B細胞，在Canto II(BD Biosciences)上進行流式細胞儀檢測，得到其平均螢光強度(MFI)。

按照實施例1.5及1.4中描述方法分別檢測巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的能力及紅細胞凝集能力。

結果如表5所示，125G4A4人源化系列抗體在測試濃度條件下與食蟹猴B細胞上表達的CD47結合，促進巨噬細胞對腫瘤細胞Raji的吞噬能力，其中Hu-125G4A4m-48在33nM時吞噬效率最強，其它活性與嵌合抗體Ch-125G4m-m35相近，回突變數目較少。故選定其做進一步測試，後續測試命名為HMA02h14-48。

實施例4 FACS檢測HMA02h14-48與腫瘤細胞的結合能力

人Burkitt淋巴瘤細胞株Raji細胞(上海生命科學研究院，SIBS,CCL-86^TM/ATCC)，人彌漫性大細胞淋巴瘤Toledo細胞(ATCC^® CRL-2631^TM))以及人套細胞淋巴瘤REC-1細胞(ATCC^® CRL-3004^TM)表面內源性表達人CD47，如前述實施例1.2所描述的檢測方法，利用流式細胞術檢測人源化抗體HMA02h14-48與上述腫瘤細胞表面CD47的結合。抗體濃度最高為667nM，梯度稀釋，總共測試8個濃度。

結果如圖1-3所示，HMA02h14-48與Hu5F9均與腫瘤細胞Raji,Toledo和REC-1細胞表面表達的CD47結合，HMA02h14-48在達到平臺期時的最大螢光強度高於Hu5F9，其EC₅₀和最大螢光強度見表6。

本實施例中以及其他實施例中使用的陰性同型對照抗體(isotype)為人IgG4P，購自上海睿智化學研究有限公司。

實施例5 Biacore檢測抗體HMA02h14-48與人CD47的親和力

Biacore藉由測量表面電漿共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)進行結合動力學參數的測定。此技術檢測抗體與抗原的結合(ka)和解離(kd)的微觀速率常數，藉由計算得到抗體與抗原的親和力數值。Biacore儀器(Biacore T200)及試劑均購自GE Healthcare。將抗人Fc抗體固定於sensor chip CM5。將純化的抗體(HMA02H14-48和Hu5F9)稀釋於流動相緩衝劑(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05% Tween-20,pH 7.4)，流過包板了抗人Fc抗體的CM5芯片。然後 將梯度稀釋過的人CD47-His(ACROBiosystems，Cat：CD7-H5227)融合蛋白流過檢測芯片以測量抗原與抗體的結合，進而將流動相緩衝劑流過芯片以檢測抗原與抗體的解離。收集不同濃度下，抗原與抗體的結合和解離信號數據，藉由1：1 Langmuir模型擬合，計算抗原與抗體的親和力。

結果如表7所示，HMA02h14-48與人CD47高親和力結合，K_D值為7.77E-10(M)。

實施例6 ELISA檢測HMA02h14-48阻斷人CD47和SIRPα相互作用的活性

如前述實施例1.3所描述的檢測方法，利用ELISA檢測HMA02h14-48在阻斷人CD47與SIRPα相互作用的能力。抗體濃度最高為67nM，梯度稀釋，總共測試8個濃度。

結果如圖4所示，本發明抗體HMA02h14-48阻斷人CD47和SIRPα相互作用，IC₅₀=1.58nM。

實施例7 HMA02h14-48對人巨噬細胞吞噬腫瘤細胞作用的影響

根據實施例1.5描述的方法，檢測HMA02h14-48促進人巨噬細胞對人Burkitt淋巴瘤細胞株Raji細胞，人彌漫性大細胞淋巴瘤Toledo細胞，人套細胞淋巴瘤REC-1細胞以及人早幼粒細胞白血病細胞系HL-60 細胞的吞噬效果。抗體濃度最高為100μg/mL，梯度稀釋，總共測試8個濃度。

從結果顯示，相比對照抗體Hu5F9以及SRF231，HMA02h14-48能促進巨噬細胞對人Burkitt淋巴瘤細胞株Raji的吞噬作用，最高吞噬效率可達36.5%，在0.1~100μg/ml不同濃度下的吞噬率均高於Hu5F9以及SRF231。HMA02h14-48對於人套細胞淋巴瘤REC-1的最高吞噬效率可達84.6%，並且在低濃度0.1μg/ml的情況下也可維持吞噬率於70%左右，高於Hu5F9以及SRF231。HMA02h14-48促進巨噬細胞對於Toledo細胞的吞噬，吞噬率可達94.2%。HMA02h14-48能促進巨噬細胞對腫瘤細胞HL-60的吞噬作用，最高吞噬效率可達65%。

實施例8 檢測HMA02h14-48對紅細胞體外凝集活性的影響

人紅細胞在PBS中稀釋到10%，與滴入的CD47抗體在圓底96孔板內在室溫孵育16小時。未沉澱的紅細胞的存在是證明血細胞凝聚的證據，與未凝聚的紅細胞沉澱形成白色圓點相比，未沉澱的紅細胞呈網狀，面積大於陰性同型對照抗體(見圖9)。陰性同型對照抗體(Isotype)的檢測結果作為正常標準。

如前述實施例1.4所述的方法，對抗體HMA0214-48進行促紅細胞凝集的檢測。抗體濃度最高為667nM，梯度稀釋，總共測試12個濃度。

結果如圖9所示，CD47抗體Hu5F9顯示在等於或高於0.9nM的濃度下，紅細胞會顯著凝集，而本發明中抗體HMA02h14-48在0.004~667nM不同濃度下無明顯的引起人紅細胞在體外的凝集。

實施例9 FACS檢測HMA02h14-48與人紅細胞結合能力

已知現有技術中，治療性抗-CD47抗體在臨床應用的時候，經常出現貧血的副作用。普遍認為抗-CD47抗體與紅細胞表面的CD47結合，進而造成巨噬細胞對紅細胞的吞噬，可能是貧血發生的另一大主要原因。本發明中，我們利用流式細胞術的方法對HMA02h14-48與人紅細胞結合能力進行檢測，以評估抗體的風險。具體的，來源於健康捐獻者的紅細胞與稀釋後的HMA02h14-48(最高濃度667nM，共8個測試濃度)在含2%胎牛血清的PBS中，4℃孵育30分鐘。然後將細胞洗滌三次，與二抗(PE標記的小鼠抗人IgG Fc抗體，Biolegend,Cat：409304)在含2%胎牛血清的PBS中，4℃避光孵育30分鐘。將細胞用含2%胎牛血清(FBS)的PBS洗滌三次後，並藉由Canto II(BD Biosciences)流式細胞儀檢測螢光信號，並根據其平均螢光強度(MFI)，用GraphPad擬合濃度依賴的曲線並計算EC₅₀。

結果如圖10所示，HMA02h14-48結合人紅細胞表面CD47的最大平均螢光強度低於對照抗體Hu5F9。其EC₅₀最大平均螢光強度見表9。

實施例10 人源化抗體HMA02h14-48對Toledo腫瘤生長的抑制

目的：在NOD-Scid小鼠上建立Toledo皮下腫瘤模型，研究本發明抗體的抗腫瘤活性。

方法：用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基培養人彌漫性大細胞淋巴瘤細胞Toledo(ATCC® CRL-2631^TM)。將腫瘤細胞懸浮於RPMI1640中，按1×10⁷細胞/隻的劑量植入雄性NOD-Scid小鼠(上海靈暢生物科技有限公司)右肋皮下。

在腫瘤細胞接種後15天，將小鼠按腫瘤體積隨機分成6組，用PBS分別稀釋Hu5F9和HMA02h14-48抗體，以10mg/kg的劑量按表10所示方案給藥。陰性同型對照抗體(isotype)IgG4P購自上海睿智化學研究有限公司。

定期測量腫瘤體積(腫瘤體積=0.5×長徑×短徑2)和小鼠體重。用Excel軟件中student t檢驗對腫瘤體積變化和體重進行統計學分析，p<0.05為有顯著性統計學差異。統計給藥後各抗體治療組的腫瘤消退率。

各治療組腫瘤消退率計算公式為：[(D₀腫瘤平均體積-D_t腫瘤平均體積)/D₀腫瘤平均體積]×100%。

小鼠相對體重計算公式為：(測量當天小鼠體重/分組時小鼠體重)×100%。

結果：

實驗結果如表11和圖11所示。

Isotype對照抗體組腫瘤生長良好，而其餘治療組在給予抗體後，均出現了皮下腫瘤較起始體積逐漸縮小，直至完全消失的現象。其中，Hu5F9和HMA02h14-48抗體各劑量組均在第11天測量時達到腫瘤完全 消失的效應(消退率100%)，與對照抗體對照組比較，腫瘤體積變化具有極顯著性差異。並且停藥後，持續觀察動物至第67天，仍然沒有發現腫瘤重新生長的跡象。此外，HMA02h14-48各劑量組動物狀態良好，第21天小鼠體重較治療前未見明顯差異。而Hu5F9高劑量組第21天的體重較第0天時降低了約5%，但與起始體重比較未見統計學差異(p>0.05)；而低劑量組未見體重下降的情況，提示Hu5F9對體重的影響具有一定的量效關係。

綜合以上數據，Hu5F9和HMA02h14-48抗體治療均具有極其顯著的抗腫瘤效應，10mg/kg單次給藥就可以使腫瘤完全消失，且持續時間長。

實施例11 人源化抗體HMA02h14-48對REC-1腫瘤生長的抑制

目的：在NOD-Scid小鼠上建立REC-1皮下腫瘤模型，研究本發明抗體的抗腫瘤活性。

方法：用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基培養人套細胞淋巴瘤細胞REC-1(ATCC^® CRL-3004^TM)。將腫瘤細胞懸浮於RPMI1640中，按5×10⁶細胞/隻的劑量植入雄性NOD-Scid小鼠(上海靈暢生物科技有限公司)右肋皮下。

在腫瘤細胞接種後11天，將小鼠按腫瘤體積隨機分成5組，用PBS稀釋Hu5F9和HMA02h14-48抗體，按表12所示方案給藥。抗體Hu5F9由GenScript製備，抗體HMA02h14-48根據實施例2方法製備。同型對照抗體(isotype)IgG4p購自上海睿智化學研究有限公司。

定期測量腫瘤體積(腫瘤體積=0.5×長徑×短徑²)、小鼠體重。統計給藥後第12天抗體治療組的腫瘤抑制率和消退率。

腫瘤抑制率計算公式為：[(對照組腫瘤平均體積變化-給藥組腫瘤平均體積變化)/對照組腫瘤平均體積變化]×100%。用Excel軟件中Student t檢驗對腫瘤體積變化和體重進行統計學分析，p<0.05為有顯著性統計學差異。

各治療組腫瘤消退率計算公式為：[(D0腫瘤平均體積-Dt腫瘤平均體積)/D0腫瘤平均體積]×100%。

小鼠相對體重計算公式為：(測量當天小鼠體重/分組時小鼠體重)×100%。

結果：

實驗結果如表13和圖12所示。

給藥後12天，與Isotype組比較，抗體Hu5F9在單次給藥3mg/kg的劑量下對腫瘤生長的抑制率為16.7%(p>0.05)；抗體HMA02h14-48在單次給藥1mg/kg，3mg/kg和10mg/kg的劑量下對腫瘤生長的抑制率分別為3.8%(p>0.05)，54.7%(p<0.01)和107.2%(p<0.001)。其中，HMA02h14-48抗體高劑量組在第10天測量時達到腫瘤完全消失的效應(消退率100%)，此外，各抗體治療組小鼠相對體重未見明顯差異。

綜合以上數據，在REC-1模型上，HMA02h14-48抗體治療具有劑量依賴性，10mg/kg單次給藥就可以使腫瘤完全消失。

材料與方法

在製劑的製備過程中使用的主要材料信息。

製劑穩定性檢測項目和檢測方法

蛋白含量(單位為mg/mL)

使用紫外分光光度計(LUNATIC，Lunatic-16)測定樣品中的蛋白濃度。

體積排阻色譜法(SEC-HPLC)

該方法主要依據分子的尺寸大小或流體動力學半徑差異來進行分子的分離。藉由SEC-HPLC，抗體可以分離出三種主要形式：高分子量形式(High Molecular Weight Species,HMMS)、主峰(主要是抗體單體)、和低分子量形式(Low Molecular Weight Species,LMMS)。抗體純度可以計算為色譜圖上主峰面積占所有峰面積之和的百分比。藉由SEC-HPLC法，可以測量製劑產品中抗體單體的百分數，以及可溶性聚集物和片段的含量。關於SEC-HPLC法的進一步描述，可以參見例如，J.Pharm.Scien.,83：1645-1650,(1994)；Pharm.Res.,11：485(1994)；J.Pharm.Bio.Anal.,15：1928(1997)；J.Pharm.Bio.Anal.,14：1133-1140(1986)。

可以使用如下參數進行SEC-HPLC檢測：

色譜管柱：TSK-gel ^®G3000SWXL(7.8×300mm,5μm)

流動相：100mM PB，100mM Na₂SO₄‧10H₂O，pH 6.7±0.1

流速：0.7mL/min

管柱溫：Not controlled(不控)

檢測波長：280nm

上樣量：1μL

進樣器溫度：15℃

運行時間：25min

上樣濃度：50mg/mL

非還原毛細管凝膠電泳(CE-SDS-NR)

非還原型CE-SDS法是一種以毛細管為分離通道進行的單株抗體純度測定方法。在CE-SDS中，蛋白遷移由SDS結合引起的表面電荷來驅動，而該表面電荷與蛋白質的分子量成正比。由於所有的SDS-蛋白質複合物都具有相似的質量-電荷比，故可以在毛細管的分子篩凝膠基質中，實現基於分子的大小或流體動力學半徑的電泳分離。該方法已經被廣泛地用於監測變性的完整抗體的純度。關於CE-SDS法的進一步描述，可以參見例如Richard R.等，Application of CE SDS gel in development of biopharmaceutical antibody-based products,Electrophoresis,2008,29,3612-3620。

簡言之，在離心管中加入100μg蛋白，加樣品緩衝劑十二烷基硫酸鈉溶液(SDS-MW)至終體積為95μL、再加入2μL內標(10kDa蛋白質)、5μL 250mM碘乙醯胺(IAM)，混勻後在70℃孵育10分鐘。孵育後將樣品冷卻至室溫，然後轉移90μL至PCR管中。CE-SDS分離在(SCIEX生產，型號PA800 PLUS)上進行。採用紫外檢測器檢測蛋白的遷移，獲得電泳譜圖。抗體製劑純度可以計算為IgG主峰的峰面積占所有峰面積之和的百分比。

成像毛細管等電聚焦電泳法(icIEF法)

該方法可以提供電荷變異體的定量分佈情況。icIEF基於分子在pH梯度中的電荷差異(表觀pI值)來實現分子分離的目的。在icIEF中，分離管柱通常是短毛細管(例如，5cm長，100μm內徑的二氧化矽毛細管)，蛋 白質在高電壓下在毛細管管柱中聚焦，並藉由在280nM操作的全管柱成像檢測系統對聚焦進行實時在線監測。該技術的一個優點是，可以藉由該全管柱檢測系統同時記錄抗體樣品的各種電荷變異體。一般而言，在icIEF中，將樣品與尿素和icIEF緩衝劑混合，其中該緩衝劑含有甲基纖維素、pI分子量標準和ampholytes。然後，可以在icIEF分析儀例如iCE280分析儀(Protein Simple,Santa Clara,CA)上，使用icIEF管柱例如Protion Simple組裝的icIEF管柱，在樣品聚焦一定時間後，測定280nm的吸光度，獲得聚焦mAb電荷變異體的譜圖。在iCEIF譜圖中，在主峰(即主要組分)之前沖提的蛋白相關峰被分類為酸性組分；相對地，在主峰之後沖提的蛋白相關峰被分類為鹼性組分。主成分、酸性組分和鹼性組分的相對量可以表示為占總峰面積的百分數。關於icIEF的進一步描述，可以參見例如，Salas-Solano O等，Robustness of icIEF methodology for the analysis of monoclonal antibodies：an interlaboratory study,J Sep Sci.2012 Nov；35(22)：3124-9.doi：10.1002/jssc.201200633.Epub 2012 Oct 15。

簡言之，可按如下進行icIEF檢測：將抗體樣品稀釋(或脫鹽)至約5mg/mL，取4μL至96μL緩衝劑中(該緩衝劑中含有4%兩性電解質、0.35%甲基纖維素、1% PI marker(碘化丙啶標記物)、500mM精胺酸、4M尿素)。混勻後在Maurice蛋白表徵分析儀(Protein Simple,Santa Clara,CA)上進行成像毛細管等電聚焦譜圖分析。

蛋白活性(ELISA)

可採用ELISA(酶聯免疫測定試驗)檢測製劑中抗體結合其抗原的結合能力，評價抗體的生物活性。

滲透壓

製劑樣品的滲透壓根據冰點降低原理在Advanced Instruments的3250滲透壓儀上進行測量。

pH

製劑樣品的pH值採用玻璃電極藉由電位法測定，所用儀器為METTLER TOLEDO的S400-B pH計，在測量樣品前先用pH值為4.01、7.00和9.21的標準溶液校準pH計。

實施例12. 藥物製劑穩定性研究1

上文實施例2製備的抗體HMA02h14-48用於藥物製劑的實施例，此抗體在藥物製劑研究中被稱為mAb1。

設計如表16的各組候選處方，考察不同的pH/緩衝劑、抗體濃度、穩定劑或表面活性劑的濃度對抗體穩定性的影響。

實驗方法

1)分別取mAb1抗體樣品(樣品信息見表15，其中枸櫞酸鹽緩衝體系是枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝劑)，按照表16的方案加入對應緩衝液溶液和鹽酸精胺酸母液，調整鹽酸精胺酸至目標濃度，對於E6，同時添加枸櫞酸鹽緩衝劑母液調整枸櫞酸鹽至目標濃度；對於E3和E5，採用對應含鹽酸精胺酸的組胺酸鹽緩衝劑進行換液，並濃縮抗體，其他處方樣品直接濃縮；2)加入對應的蔗糖母液(當需要時)和聚山梨酯80母液；3)加入對應緩衝劑溶液調整各組分至目標濃度；4)於生物安全櫃中以0.22μm一次性無菌濾器過濾除菌，分裝(1mL/瓶)，加塞，軋蓋，貼簽。

考察方案：按照表17的留取樣計劃進行40℃高溫、凍融(-70℃±10℃/5℃±3℃)穩定性考察。

表16中，枸櫞酸鹽緩衝劑是枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝劑，組胺酸鹽緩衝劑是組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝劑。

X：蛋白含量，SEC-HPLC,CE-SDS-NR,icIEF；Y：ELISA

結果和分析

(1)蛋白含量檢測結果

蛋白含量檢測結果見表18。T0時，各候選處方樣品蛋白含量均滿足實驗設計要求，且無明顯差異。與T0相比，經過-70℃/5℃凍融5個循環、40℃高溫放置4週後，各候選處方的蛋白含量均未見明顯的變化，高溫和凍融穩定性良好。

(2)SEC-HPLC純度

SEC-HPLC純度檢測結果見表19和20。T0時，各候選處方樣品的SEC-HPLC純度均無明顯差異。

與T0相比，隨著40℃高溫考察時間的延長，所有處方的SEC-HPLC主峰純度未發生明顯變化，高溫穩定性良好。

凍融考察結果表明，與T0相比，經過凍融5個循環，各處方樣品SEC-HPLC純度均未發生明顯變化，說明各候選處方中mAb1抗體均具有良好的凍融穩定性。

(3)CE-SDS-NR純度

CE-SDS-NR純度檢測結果見表21。研究結果顯示，T0時，各候選處方的CE-SDS-NR純度均無明顯差異。與T0相比，在40℃放置4週後，所有候選處方樣品單體純度未發生明顯變化，高溫穩定性良好。

經過凍融5個循環後，所有候選處方單體純度未發生明顯變化，處方間無明顯差異。

(4)icIEF純度

icIEF純度檢測結果見表22和23。T0時，各候選處方樣品的icIEF結果未見明顯差異。與T0相比，40℃條件下考察4週後，各處方的主峰純度均未發生明顯變化，高溫穩定性良好。

經凍融條件考察5個循環後，所有處方的主峰純度、酸峰和鹼峰含量均無明顯變化，凍融穩定性良好。

(5)ELISA法檢測蛋白相對結合活性

活性檢測結果見表24。T0時，各候選處方樣品的活性均在70%~130%的範圍內，且無明顯差異。與T0相比，經40℃高溫放置4週 以及凍融5個循環後，各處方的活性均維持在70%~130%範圍內，均符合質量要求。

綜上，藉由40℃高溫考察4週內或經凍融條件考察5個循環後，不同藥物製劑間，蛋白含量、SEC-HPLC、CE-SDS-NR和icIEF純度均未見明顯差異，均具有高溫穩定性和凍融穩定性良好。

實施例13：藥物製劑穩定性研究2

綜合前述的研究結果，在等滲條件下，設計藥物製劑進一步對比確認1)鹽酸精胺酸和蔗糖配比的影響，2)聚山梨酯80濃度的影響。以瞭解處方中鹽酸精胺酸、蔗糖、聚山梨酯80在邊界用量下，製劑的穩定性表現。

實驗方法

分別取mAb1抗體樣品(樣品信息見表25，其中枸櫞酸鹽緩衝體系是枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝劑)，按照表26的方案加入對應緩衝劑溶液(20mM枸櫞酸鹽緩衝劑(其為枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝劑)，1)對於F1、F2、F7、F8，加入鹽酸精胺酸母液和聚山梨酯80母液，最後加緩衝液將各組分調整至目標濃度；2)對於F3、F4，加入鹽酸精胺酸母液、蔗糖母液和聚山梨酯80母液，並加緩衝液將各組分調整至目標濃度；3)對於F5，加入對應的蔗糖母液和聚山梨酯80母液，最後加緩衝液將各組分調整至目標濃度；4)對於F6，採用20mM枸櫞酸鹽緩衝劑將鹽酸精胺酸稀釋後至目標濃度後進行抗體濃縮，再加入對應的蔗糖母液和聚山梨酯80母液，並加緩衝液調整各組分至目標濃度；5)於生物安全櫃中以0.22μm一次性無菌濾器過濾除菌，分裝(1mL/瓶)，加塞，軋蓋，貼簽。

考察方案：按照表27的留取樣計劃進行40℃高溫穩定性考察。

X：蛋白含量，SEC-HPLC,CE-SDS-NR,icIEF；Y：ELISA

實驗結果

(1)滲透壓檢測結果

各候選藥物製劑的滲透壓檢測結果見表28，所有候選處方樣品滲透壓均是等滲的。

(2)蛋白含量檢測結果

蛋白含量檢測結果見表29。T0時，各候選處方樣品蛋白濃度均滿足實驗設計要求，且處方間無明顯差異。與T0相比，40℃高溫放置4週，各候選處方的蛋白含量均未見明顯的變化，40℃高溫穩定性良好。

(3)SEC-HPLC純度

SEC-HPLC純度檢測結果見表30。T0時，各候選處方樣品的SEC-HPLC純度均無明顯差異。與T0相比，在高溫40℃考察4週後，所有處方SEC主峰純度均未發生明顯變化，40℃高溫穩定性良好。

(4)CE-SDS-NR純度

CE-SDS-NR純度檢測結果見表31。研究結果顯示，T0時，各候選處方的CE-SDS-NR純度均無明顯差異。與T0相比，在高溫40℃放置4週後，所有候選處方樣品單體純度均未發生明顯變化，40℃高溫穩定性良好。

(5)icIEF純度

icIEF純度檢測結果見表32。與T0相比，在高溫40℃條件下考察4週後，各處方的主峰純度無明顯變化，40℃高溫穩定性良好。

(6)ELISA法檢測蛋白結合相對活性

活性檢測結果見表33。T0時，各候選處方樣品的活性均在70%~130%的範圍內，且無明顯差異。與T0相比，在高溫40℃放置4週後，各處方的活性均維持在70%~130%範圍內，具有良好的活性穩定性，處方間無明顯差異。

綜上，藉由40℃高溫考察4週，不同處方間，蛋白含量、以及SEC-HPLC、CE-SDS-NR和icIEF純度均未見明顯差異。未發現不同鹽酸精胺酸和蔗糖濃度配比對蛋白穩定性有明顯影響。

本發明的序列：

以上描述了本發明的示例性實施方案和實施例，所屬技術領域具有通常知識者應當理解的是，這些公開內容僅是示例性的，在本發明的範圍內可以進行各種其它替換、適應和修改。因此，本發明不限於文中列舉的具體實施方案和實施例。

TW202330027A_111138267_SEQL.xml

Claims (36)

1. 一種穩定的藥物製劑，其包含

   (i)抗-CD47抗體或其抗原結合片段；

   (ii)緩衝劑；

   (iii)穩定劑；和

   (iv)表面活性劑；

   pH值為約5.0至約8.5，且

   其中該抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含

   (1)選自重鏈可變區(VH)的HCDR1、HCDR2和HCDR3中的一個至三個，其中該VH包含SEQ ID NO：1、3、5、6或7所示的胺基酸序列；和/或

   (2)選自輕鏈可變區(VL)的LCDR1、LCDR2和LCDR3中的一個至三個，其中該VL包含SEQ ID NO：2、4、8、9或10所示的胺基酸序列。
2. 如請求項1所述的藥物製劑，其中該抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含

   VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和

   VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中所述的VH和VL選自：

   (1)包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列的VH和包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列的VL；

   (2)包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列的VH和包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列的VL；

   (3)包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列的VH和包含SEQ ID NO：8、9或10所示的胺基酸序列的VL；

   (4)包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列的VH和包含SEQ ID NO：9或10所示的胺基酸序列的VL；或

   (5)包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列的VH和包含SEQ ID NO：8、9或10所示的胺基酸序列的VL。
3. 如請求項1所述的藥物製劑，其中該抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含

   (1)選自重鏈互補決定區1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3中的一個至三個，該HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，該HCDR3包含SEQ ID NO：13或17或21所示的胺基酸序列；和/或

   (2)選自輕鏈互補決定區1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3中的一個至三個，該LCDR1包含SEQ ID NO：14的所示胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：15或18或22所示的胺基酸序列，該LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
4. 如請求項3所述的藥物製劑，其中該抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含

   (1)重鏈互補決定區1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列和該HCDR3包含SEQ ID NO：13或17或21所示的胺基酸序列；和/或

   (2)輕鏈互補決定區1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其中該LCDR1包含SEQ ID NO：14的所示胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：15或18或22所示的胺基酸序列和該LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
5. 如請求項3所述的藥物製劑，其中，該抗-CD47抗體或其抗原結合片段中

   (1)該HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，和該HCDR3包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列；和/或

   (2)該LCDR1包含SEQ ID NO：14的所示胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，和該LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
6. 如請求項1至3中任一項所述的藥物製劑，其中該抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含

   (1)重鏈可變區(VH)，其包含與SEQ ID NO：1、3、5、6或7所示的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和/或

   (2)輕鏈可變區(VL)，其包含與SEQ ID NO：2、4、8、9或10所示的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
7. 如請求項6所述的藥物製劑，其中該VH包含SEQ ID NO：1、3、5、6或7中任一所示的胺基酸序列，該VL包含SEQ ID NO：2、4、8、9或10中任一所示的胺基酸序列。
8. 如請求項7所述的藥物製劑，其中該VH和VL選自：

   (1)包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列的VH；和包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列的VL；

   (2)包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列的VH；和包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列的VL；

   (3)包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列的VH；和包含SEQ ID NO：8、9或10所示的胺基酸序列的VL；

   (4)包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列的VH；和包含SEQ ID NO：9或10所示的胺基酸序列的VL；或

   (5)包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列的VH；和包含SEQ ID NO：8、9或10所示的胺基酸序列的VL。
9. 如請求項1所述的藥物製劑，其中該抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列，該VL包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。
10. 如請求項1至9中任一項所述的藥物製劑，其中該抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含重鏈恆定區，如人IgG1恆定區、人IgG1TM恆定區、人IgG4恆定區或人IgG4P恆定區。
11. 如請求項1至10中任一項所述的藥物製劑，其中該抗-CD47抗體或其抗原結合片段包含輕鏈恆定區，例如人輕鏈κ鏈恆定區。
12. 如請求項1至11中任一項所述的藥物製劑，其中該抗-CD47抗體是鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
13. 如請求項1至12中任一項所述的藥物製劑，其中該抗-CD47抗體或其抗原結合片段是全長抗體、單鏈抗體、單域抗體例如VHH、Fab、Fab’、Fab’-SH、(Fab’)₂、單鏈抗體例如scFv、Fv、dAb(domain antibody)或雙(多)特異性抗體。
14. 如請求項1至13中任一項所述的藥物製劑，其中該緩衝劑為組胺酸鹽緩衝劑或枸櫞酸鹽緩衝劑。
15. 如請求項1至14中任一項所述的藥物製劑，其中該緩衝劑的濃度為約10mM至約80mM，較佳地為約20mM至約50mM，例如，約20mM或約50mM。
16. 如請求項1至15中任一項所述的藥物製劑，其中該穩定劑選自糖、胺基酸和多元醇中的至少一種。
17. 如請求項1至16中任一項所述的藥物製劑，其中該穩定劑至少包含一種胺基酸，例如精胺酸，較佳地為鹽酸精胺酸。
18. 如請求項1至17中任一項所述的藥物製劑，其中該穩定劑由胺基酸和糖組成，較佳地為鹽酸精胺酸和蔗糖。
19. 如請求項16至18中任一項所述的藥物製劑，其中該胺基酸的濃度為約1mg/mL至約100mg/mL，例如5mg/mL至40mg/mL。
20. 如請求項16至19中任何一項所述的藥物製劑，其中該糖的濃度為約10mg/mL至約100mg/mL，較佳地為約20mg/mL至約80mg/mL。
21. 如請求項16至20中任一項所述的藥物製劑，其中該胺基酸和糖的質量濃度比為約1：1至約1：15。
22. 如請求項1至21中任一項所述的藥物製劑，其中該表面活性劑選自聚山梨酯類表面活性劑，較佳地為聚山梨酯-80或聚山梨酯-20。
23. 如請求項1至22中任一項所述的藥物製劑，其中該表面活性劑的濃度為約0.002%(w/v)至約0.5%(w/v)，較佳地為約0.01%(w/v)至約0.05%(w/v)，例如，約0.01%(w/v)、約0.02%(w/v)或約0.03%(w/v)，較佳地為約0.02%(w/v)。
24. 如請求項1至23中任一項所述的藥物製劑，其中該抗-CD47抗體的濃度為約10-150mg/mL，較佳地為約40-120mg/mL，例如，約20mg/mL、約50mg/mL、約60mg/mL、約80mg/mL、約100mg/mL或約110mg/mL。
25. 如請求項1至24中任一項所述的藥物製劑，其中該pH值為約5.5至約7.0，較佳約6.0至約7.0。
26. 如請求項1至13中任一項所述的藥物製劑，其包含：

    (i)約10-150mg/mL的抗-CD47抗體或其抗原結合片段；

    (ii)約10-80mM的枸櫞酸鹽緩衝劑或組胺酸鹽緩衝劑；

    (iii)約5-40mg/mL的鹽酸精胺酸和約0-80mg/mL的蔗糖；和

    (iv)約0.01%(w/v)至約0.05%(w/v)的聚山梨酯-80；

    pH值為約6.0-7.0。
27. 如請求項1至13中任一項所述的藥物製劑，其包含：

    (i)約40-120mg/mL的抗-CD47抗體或其抗原結合片段；

    (ii)約20-50mM的枸櫞酸鹽緩衝劑或組胺酸鹽緩衝劑；

    (iii)約5-40mg/mL的鹽酸精胺酸和約20-80mg/mL的蔗糖，其中鹽酸精胺酸和蔗糖的質量濃度比為約1：1至約1：15，

    (iv)約0.01%(w/v)至約0.05%(w/v)的聚山梨酯-80；

    pH值為約6.0-7.0。
28. 如請求項1至13中任一項所述的藥物製劑，其包含：

    (i)約40-120mg/mL的抗-CD47抗體或其抗原結合片段；

    (ii)約20-50mM的枸櫞酸鹽緩衝劑；

    (iii)約5-40mg/mL的鹽酸精胺酸；和

    (iv)約0.01%(w/v)至約0.05%(w/v)的聚山梨酯-80；

    pH值為約6.0-7.0。
29. 如請求項1至28中任一項所述的藥物製劑，其為液體形式，其還進一步包含溶媒，例如水。
30. 一種凍乾形式的藥物製劑，其由如請求項1至29中任一項所述的藥物製劑凍乾製得。
31. 一種重構的藥物製劑，其由如請求項30所述的凍乾形式的藥物製劑用重構介質重構製得，該重構介質選自注射用水、抑菌注射用水、氯化鈉溶液和葡萄糖溶液中的至少一種。
32. 如請求項31所述的重構的藥物製劑，其還進一步包含溶媒，例如水。
33. 一種如請求項1至29中任一項所述的藥物製劑、如請求項30所述的凍乾形式的藥物製劑、和/或如請求項31或32所述的重構的藥物製劑的用途，其用於製備治療有需要的受試者與CD47相關的疾病的藥物，其中CD47相關的疾病較佳地為癌症，該癌症包括血液癌和實體瘤，例如膀胱癌、胰腺癌、淋巴瘤、白血病、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、神經膠質瘤、膠質母細胞瘤、骨髓瘤、子宮內膜癌、腎癌、胎記瘤、***癌、甲狀腺癌、子宮頸癌、胃癌、肝癌、結腸癌、卵巢癌、尿路上皮癌等。
34. 一種製品，其包含裝有如請求項1至29中任一項所述的藥物製劑、如請求項30所述的凍乾形式的藥物製劑、和/或如請求項31或32所述的重構的藥物製劑的容器。
35. 一種治療或預防有需要的受試者CD47相關的疾病的方法，其包括對該受試者施用有效量的如請求項1至29中任一項所述的藥物製劑、如請求項30所述的凍乾形式的藥物製劑、和/或如請求項31或32所述的重構的藥物製劑。
36. 如請求項35所述的方法，其中該CD47相關的疾病較佳地為癌症，該癌症包括血液癌和實體瘤，例如膀胱癌、胰腺癌、淋巴瘤、白血病、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、神經膠質瘤、膠質母細胞瘤、骨髓瘤、子宮內膜癌、腎癌、胎記瘤、***癌、甲狀腺癌、子宮頸癌、胃癌、肝癌、結腸癌、卵巢癌、尿路上皮癌等。

Images