TW202328434A

TW202328434A - γδＴ細胞之工程改造及其組成物

Info

Publication number: TW202328434A
Application number: TW111129165A
Authority: TW
Inventors: 伊斯特凡科法克斯
Original assignee: 英商伽馬三角洲療法有限公司
Priority date: 2021-08-03
Filing date: 2022-08-03
Publication date: 2023-07-16
Also published as: AU2022322052A1; CN117795083A; KR20240040799A; AR126690A1; CA3228168A1; CO2024002241A2; WO2023012475A1

Abstract

本發明提供了藉由用病毒載體(例如，具有β反轉錄病毒假型及反轉錄病毒科病毒載體骨架之病毒載體)轉導來工程改造γδ T細胞(例如，vδ1 T細胞及vδ2 T細胞)的方法。進一步提供了經工程改造之γδ T細胞之組成物及其使用方法。

Description

γδ　T細胞之工程改造及其組成物

對癌症T細胞免疫療法日益增長之關注集中在經工程改造之T細胞作為治療部分的明顯能力上。伽瑪德爾塔T細胞(γδ T細胞)代表在其表面上表現獨特、界定性γδ T細胞受體(TCR)的T細胞之子集。此TCR由一個伽瑪(γ)及一個德爾塔(δ)鏈組成。人類γδ T細胞可廣泛地分類為一或兩種類型：周邊血液駐留γδ T細胞及非造血組織駐留γδ T細胞。大多數血液駐留γδ T細胞表現Vδ2 TCR，而此現象在組織駐留γδ T細胞之中不太常見，後者更頻繁地使用Vδ1及/或其他Vδ鏈。

相對於αβ T細胞，缺少高效轉導γδ T細胞以表現所需轉殖基因的方法。因此，在此領域中需要用於轉導γδ T細胞以產生足夠品質及數量的γδ T細胞群以用作療法，例如用作過繼性T細胞療法的改進方法。

在一態樣中，本發明之特徵在於藉由用具有β反轉錄病毒假型及反轉錄病毒科病毒載體骨架之病毒載體轉導γδ T細胞群來產生經工程改造之γδ T細胞群的方法。β反轉錄病毒假型可為狒狒內源性病毒(BaEV)。β反轉錄病毒假型可為RD114。

在一些實施例中，反轉錄病毒科病毒載體骨架為反轉錄病毒載體骨架(例如，慢病毒骨架、γ反轉錄病毒骨架、或α反轉錄病毒骨架)。

經工程改造之γδ T細胞可為Vδ1 T細胞。經工程改造之γδ T細胞可為Vδ2 T細胞。經工程改造之γδ T細胞可為非Vδ1/Vδ2 T細胞。

在一些實施例中，病毒載體包括轉殖基因。轉殖基因可編碼細胞表面受體(例如，嵌合抗原受體(CAR))及/或細胞介素(例如，分泌細胞介素或膜結合細胞介素)。在一些實施例中，轉殖基因編碼IL-15 (例如，分泌IL-15或膜結合IL-15)。在一些實施例中，病毒載體包括第一轉殖基因及第二轉殖基因。在一些實施例中，第一轉殖基因編碼CAR且第二轉殖基因編碼裝甲蛋白(例如，細胞介素，例如，IL-15，例如，分泌IL-15或膜結合IL-15)。

在一些實施例中，CAR靶向CD19、CD20、ROR1、CD22、癌胚抗原、α胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮腫瘤抗原、***特異性抗原、黑素瘤相關抗原、突變的p53、突變的ras、HER2/Neu、葉酸結合蛋白、HIV-1包膜醣蛋白gpl20、HIV-1包膜醣蛋白gp41、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、間皮素、GD3、HERV-K、IL-llRα、κ鏈、λ鏈、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII、VEGFR2、組合HER2-HER3、組合HER1-HER2、NY-ESO-1、滑膜肉瘤X斷點2 (SSX2)、黑素瘤抗原(MAGE)、由T細胞識別之黑素瘤抗原1 (MART-1)、gp100、***特異性抗原(PSA)、***特異性膜抗原(PSMA)、***幹細胞抗原(PSCA)、g9d2、或其組合。

在另一態樣中，本發明之特徵在於產生經工程改造之γδ T細胞群的方法。該方法包括提供起始γδ T細胞群及在不存在病毒載體的情況下，培養起始γδ T細胞群持續第一培養期以產生經預敏化之(primed) γδ T細胞群。該方法可進一步包括在以有效轉導至少3% (例如，至少4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、或基本上全部)之經預敏化之γδ T細胞之量的具有β反轉錄病毒假型之病毒載體存在下，培養經預敏化之γδ T細胞群持續第二培養期，由此產生經工程改造之γδ T細胞群。

在一些實施例中，病毒載體係以有效轉導至少20%之經預敏化之γδ T細胞之量。

在一些實施例中，第一培養期為1天或更長時間(例如，1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、或更長時間，例如，1-3天、3-5天、5-7天、7-10天、或更長時間)。在一些實施例中，第一培養期為2天或更長時間(例如，2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、或更長時間，例如，1-3天、3-5天、5-7天、7-10天、或更長時間)。在一些實施例中，第一培養期為5天或更長時間(例如，5天、6天、7天、8天、9天、10天、或更長時間，例如，5-7天、7-10天、或更長時間)。在一些實施例中，第一培養期為7天或更長時間(例如，7天、8天、9天、10天、或更長時間，例如，7-10天、或更長時間)。

在一些實施例中，第二培養期為2天或更長時間(例如，2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、或更長時間，例如，2-4天、4-7天、7-10天、10-14天、或更長時間)。在一些實施例中，第二培養期為7天或更長時間(例如，8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、或更長時間，例如，7-10天、10-14天、或更長時間)。

在一些實施例中，經預敏化之γδ T細胞群表現ASCT-1及/或ASCT-2。在一些實施例中，經預敏化之γδ T細胞群缺少VSV-G進入受體(例如，LDL受體)之功能性表現。

在一些實施例中，病毒載體以不大於10 (例如，不大於5，例如，約1至約5)之感染複數(MOI)與經預敏化之γδ T細胞一起培養。

在另一態樣中，本發明之特徵在於產生經工程改造之γδ T細胞群的方法，該方法藉由提供起始γδ T細胞群；及在IL-15及以有效轉導至少3% (例如，至少4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、或基本上全部)之起始γδ T細胞群之量的具有β反轉錄病毒假型之病毒載體存在下，培養起始γδ T細胞群來進行，由此產生經工程改造之γδ T細胞群。

在一些實施例中，起始γδ T細胞群缺少ASCT-1及/或ASCT-2之表現。在一些實施例中，經工程改造之γδ T細胞群表現ASCT-1及/或ASCT-2。起始γδ T細胞群可缺少VSV-G進入受體(例如，LDL受體)之功能性表現。

在一些實施例中，病毒載體以不大於10 (例如，不大於5，例如，約1至約5)之MOI與起始γδ T細胞群一起培養。

在一些實施例中，病毒載體具有β反轉錄病毒假型BaEV或RD114。

在一些實施例中，病毒載體包括反轉錄病毒科病毒載體骨架。反轉錄病毒科病毒載體骨架可為反轉錄病毒載體骨架(例如，慢病毒骨架、γ反轉錄病毒骨架、或α反轉錄病毒骨架)。

在一些實施例中，病毒載體包括轉殖基因。轉殖基因可編碼細胞表面受體，例如，嵌合抗原受體(CAR)及/或細胞介素(例如，分泌細胞介素或膜結合細胞介素)。在一些實施例中，轉殖基因編碼IL-15 (例如，分泌IL-15或膜結合IL-15)。在一些實施例中，病毒載體包括第一轉殖基因及第二轉殖基因。在一些實施例中，第一轉殖基因編碼CAR且第二轉殖基因編碼裝甲蛋白(例如，細胞介素，例如，IL-15，例如，分泌IL-15或膜結合IL-15)。

在一些實施例中，CAR靶向CD19、CD20、ROR1、CD22、癌胚抗原、α胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮腫瘤抗原、***特異性抗原、黑素瘤相關抗原、突變的p53、突變的ras、HER2/Neu、葉酸結合蛋白、HIV-1包膜醣蛋白gpl20、HIV-1包膜醣蛋白gp41、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、間皮素、GD3、HERV-K、IL-llRα、κ鏈、λ鏈、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII、VEGFR2、組合HER2-HER3、組合HER1-HER2、NY-ESO-1、SSX2、MAGE、MART-1、gp100、PSA、PSMA、PSCA、g9d2、或其組合。

在另一態樣中，本發明之特徵在於藉由用病毒載體轉導γδ T細胞群來產生表現CAR之γδ T細胞群的方法，該病毒載體包括編碼CAR之轉殖基因；β反轉錄病毒假型；及反轉錄病毒科病毒載體骨架。

在另一態樣中，本發明之特徵在於藉由用病毒載體轉導γδ T細胞群來產生表現CAR及裝甲蛋白之γδ T細胞群的方法，該載體包括編碼CAR之第一轉殖基因；編碼裝甲蛋白之第二轉殖基因；β反轉錄病毒假型；及反轉錄病毒科病毒載體骨架。在一些實施例中，裝甲蛋白為細胞介素(例如，膜結合細胞介素或分泌細胞介素(例如，膜結合IL-15或分泌IL-15)。

在一些實施例中，β反轉錄病毒假型為BaEV。在其他實施例中，β反轉錄病毒假型為RD114。

γδ T細胞可為Vδ1 T細胞。γδ T細胞可為Vδ2 T細胞。γδ T細胞可為非Vδ1/Vδ2 T細胞。

在另一態樣中，本發明之特徵在於產生表現CAR之γδ T細胞群的方法，該方法藉由提供起始γδ T細胞群及在不存在病毒載體的情況下，培養起始γδ T細胞群持續第一培養期以產生經預敏化之γδ T細胞群來進行。該方法可進一步包括在具有β反轉錄病毒假型及編碼CAR之轉殖基因的病毒載體存在下，培養經預敏化之γδ T細胞群持續第二培養期，其中病毒載體係以有效轉導至少3% (例如，至少4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、或基本上全部)之經預敏化之γδ T細胞之量，由此產生表現CAR之γδ T細胞群。

在另一態樣中，本發明之特徵在於產生表現CAR及裝甲蛋白之γδ T細胞群的方法，該方法藉由提供起始γδ T細胞群及在不存在病毒載體的情況下，培養起始γδ T細胞群持續第一培養期以產生經預敏化之γδ T細胞群來進行。該方法可進一步包括在具有β反轉錄病毒假型、編碼CAR之第一轉殖基因、及編碼裝甲蛋白之第二轉殖基因的病毒載體存在下，培養經預敏化之γδ T細胞群持續第二培養期，其中病毒載體係以有效轉導至少3% (例如，至少4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、或基本上全部)之經預敏化之γδ T細胞之量，由此產生表現CAR及裝甲蛋白之γδ T細胞群。在一些實施例中，轉殖基因編碼IL-15 (例如，分泌IL-15或膜結合IL-15)。在一些實施例中，病毒載體包括第一轉殖基因及第二轉殖基因。在一些實施例中，第一轉殖基因編碼CAR且第二轉殖基因編碼裝甲蛋白(例如，細胞介素，例如，IL-15，例如，分泌IL-15或膜結合IL-15)。

在一些實施例中，經預敏化之γδ T細胞群表現ASCT-1及/或ASCT-2。在一些實施例中，經預敏化之γδ T細胞群缺少VSV-G進入受體(例如，LDL受體)之功能性表現。在一些實施例中，大於95%之經預敏化之γδ T細胞群缺少足夠水準之VSV-G進入受體表現(例如，LDL受體)來介導可偵測的VSV-G進入(例如，如藉由基於BlaM-Vpr之檢定所量測)。在一些實施例中，大於96%之經預敏化之γδ T細胞群缺少足夠水準之VSV-G進入受體表現(例如，LDL受體)來介導可偵測的VSV-G進入(例如，如藉由基於BlaM-Vpr之檢定所量測)。在一些實施例中，大於97%之經預敏化之γδ T細胞群缺少足夠水準之VSV-G進入受體表現(例如，LDL受體)來介導可偵測的VSV-G進入(例如，如藉由基於BlaM-Vpr之檢定所量測)。在一些實施例中，大於98%之經預敏化之γδ T細胞群缺少足夠水準之VSV-G進入受體表現(例如，LDL受體)來介導可偵測的VSV-G進入(例如，如藉由基於BlaM-Vpr之檢定所量測)。在一些實施例中，大於99%之經預敏化之γδ T細胞群缺少足夠水準之VSV-G進入受體表現(例如，LDL受體)來介導可偵測的VSV-G進入(例如，如藉由基於BlaM-Vpr之檢定所量測)。

在一些實施例中，病毒載體以不大於10 (例如，不大於5，例如，約1至約5)之MOI與經預敏化之γδ T細胞一起培養。

在另一態樣中，本發明之特徵在於產生表現CAR之γδ T細胞群的方法，該方法藉由提供起始γδ T細胞群；及在IL-15及具有β反轉錄病毒假型及編碼CAR之轉殖基因的病毒載體存在下，培養起始γδ T細胞群來進行，其中病毒載體係以有效轉導至少3% (例如，至少4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、或基本上全部)之起始γδ T細胞群之量，由此產生表現CAR之經工程改造之γδ T細胞群。

在另一態樣中，本發明之特徵在於產生表現CAR及裝甲蛋白之γδ T細胞群的方法，該方法藉由提供起始γδ T細胞群；及在IL-15及具有β反轉錄病毒假型、編碼CAR之第一轉殖基因、及編碼裝甲蛋白之第二轉殖基因的病毒載體存在下，培養起始γδ T細胞群來進行，其中病毒載體係以有效轉導至少3% (例如，至少4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、或基本上全部)之起始γδ T細胞群之量，由此產生表現CAR及裝甲蛋白之經工程改造之γδ T細胞群。在一些實施例中，裝甲蛋白為細胞介素，例如，IL-15，例如，分泌IL-15或膜結合IL-15。

在一些實施例中，起始γδ T細胞群缺少ASCT-1及/或ASCT-2之表現。經工程改造之γδ T細胞群可表現ASCT-1及/或ASCT-2。起始γδ T細胞群可缺少VSV-G進入受體(例如，LDL受體)之功能性表現。在一些實施例中，大於95%之經預敏化之γδ T細胞群缺少足夠水準之VSV-G進入受體表現(例如，LDL受體)來介導可偵測的VSV-G進入(例如，如藉由基於BlaM-Vpr之檢定所量測)。在一些實施例中，大於96%之經預敏化之γδ T細胞群缺少足夠水準之VSV-G進入受體表現(例如，LDL受體)來介導可偵測的VSV-G進入(例如，如藉由基於BlaM-Vpr之檢定所量測)。在一些實施例中，大於97%之經預敏化之γδ T細胞群缺少足夠水準之VSV-G進入受體表現(例如，LDL受體)來介導可偵測的VSV-G進入(例如，如藉由基於BlaM-Vpr之檢定所量測)。在一些實施例中，大於98%之經預敏化之γδ T細胞群缺少足夠水準之VSV-G進入受體表現(例如，LDL受體)來介導可偵測的VSV-G進入(例如，如藉由基於BlaM-Vpr之檢定所量測)。在一些實施例中，大於99%之經預敏化之γδ T細胞群缺少足夠水準之VSV-G進入受體表現(例如，LDL受體)來介導可偵測的VSV-G進入(例如，如藉由基於BlaM-Vpr之檢定所量測)。

在一些實施例中，β反轉錄病毒假型為BaEV或RD114。

在另一態樣中，本發明之特徵在於藉由如本文描述之方法產生的經工程改造之γδ T細胞群。

在一些實施例中，至少10% (例如，至少11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、或基本上全部)之群體表現CAR。在一些實施例中，至少50% (例如，至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、或基本上全部)之經工程改造之γδ T細胞群表現CAR。在一些實施例中、至少10% (例如，至少11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、或基本上全部)之經工程改造之γδ T細胞群表現裝甲蛋白，例如，細胞介素(例如，分泌細胞介素或膜結合細胞介素(例如，IL-15，例如，分泌IL-15或膜結合IL-15)。在一些實施例中，至少50% (例如，至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、或基本上全部)之經工程改造之γδ T細胞群表現裝甲蛋白，例如，細胞介素(例如，分泌細胞介素或膜結合細胞介素(例如，IL-15，例如，分泌IL-15或膜結合IL-15)。在一些實施例中，至少10% (例如，至少11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、或基本上全部)之經工程改造之γδ T細胞群表現CAR及裝甲蛋白，例如，細胞介素(例如，分泌細胞介素或膜結合細胞介素(例如，IL-15，例如，分泌IL-15或膜結合IL-15)。在一些實施例中，至少50% (例如，至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、或基本上全部)之經工程改造之γδ T細胞群表現CAR及裝甲蛋白，例如，細胞介素(例如，分泌細胞介素或膜結合細胞介素(例如，IL-15，例如，分泌IL-15或膜結合IL-15)。

在另一態樣中，本發明之特徵在於藉由如本文描述之方法產生的表現CAR之γδ T細胞群。

在另一態樣中，本發明之特徵在於藉由如本文描述之方法產生的表現CAR及裝甲蛋白之γδ T細胞群。在一些實施例中，裝甲蛋白為細胞介素(例如，分泌細胞介素或膜結合細胞介素(例如，IL-15，例如，分泌IL-15或膜結合IL-15)。

應瞭解，本文所述之本發明之態樣及實施例包括「包含態樣及實施例」、「由態樣及實施例組成」及「基本上由態樣及實施例組成」。除非另外指出，否則如本文所用之單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個參考物。

如本文所用之術語「約」係指為熟習此項技術領域者容易知曉的相應值之常見誤差範圍。在本文中提及「約」值或參數包括(且描述)關於該值或參數本身之實施例。在一些情況下，「約」涵蓋相對於指定值的+20%，在一些情況下+10%，在一些情況下+5%，在一些情況下+1%，或在一些情況下+0.1%之變化，因為此等變化對於執行所揭示之方法而言係合適的。

如本文使用，術語「經工程改造之γδ T細胞」係指表現轉殖基因(亦即，經轉導至經工程改造之γδ T細胞或其母體細胞中之基因)的γδ T細胞。

如本文使用，術語「經預敏化之γδ T細胞」係指受培養條件影響之起始群(例如，內源性γδ T細胞群)。在一些情況下，相對於其經歷培養條件之前的未經預敏化之對應物，經預敏化之γδ T細胞具有不同功能病毒進入受體概況。在一些實施例中，經預敏化之γδ T細胞群為經擴增的γδ T細胞群。

如本文使用，「經擴增的γδ細胞群」係指包括γδ T細胞之造血細胞群，該等細胞以誘導γδ細胞擴增，亦即，增加γδ細胞數目之條件及持續時間來培養。同樣地，如本文使用，「經擴增的Vδ1 T細胞群」係指包括Vδ1 T細胞之造血細胞群，該等細胞以誘導Vδ1 T細胞擴增，亦即，增加Vδ1細胞數目之條件及持續時間來培養。類似地，如本文使用，「經擴增的Vδ2 T細胞群」係指包括Vδ2 T細胞之造血細胞群，該等細胞以誘導Vδ2 T細胞擴增，亦即，增加Vδ2細胞數目之條件及持續時間來培養。

如本文使用，γδ T細胞「群」係指三個或更多個γδ T細胞(例如，至少10、至少10 ²、至少10 ³、至少10 ⁴、至少10 ⁵、至少10 ⁶、至少10 ⁷、至少10 ⁸、至少10 ⁹、至少10 ¹⁰、至少10 ¹¹、至少10 ¹²、或至少10 ¹³)個γδ T細胞(例如，經工程改造之γδ T細胞)之群組。特定細胞類型之群體(例如，內源性γδ T細胞群、經預敏化之γδ T細胞群、或經工程改造之γδ T細胞群)係指該類型之細胞而並非更廣泛群體內之不同類型之細胞。例如，若10 ⁸個T細胞之起始群之10%之細胞為γδ T細胞，則起始γδ T細胞群為10 ⁷個。

如本文使用，「裝甲蛋白」係指由轉殖基因編碼之蛋白，該轉殖基因在由γδ T細胞(例如，表現CAR之γδ T細胞)表現時，例如經由旁分泌傳訊(例如，細胞介素傳訊)來增加持久生存或增加γδ T細胞針對靶細胞之免疫原性，以改良例如細胞持續生存、細胞生存力、活化及其他所需特性。裝甲蛋白可為膜結合蛋白或可溶性蛋白。例如，裝甲蛋白包括膜結合蛋白，諸如膜結合受體(例如，αβ TCR、天然細胞毒性受體(例如，NKp30、NKp44、或NKp46)、細胞介素受體(例如，IL-12受體)及/或趨化因子受體(例如，CCR2受體)及/或膜結合配位體或細胞介素(例如，膜結合IL-15、膜結合IL-7、膜結合CD40L、膜結合4-1BB、膜結合4-1BBL、膜結合CCL19)。另外地或可替代地，裝甲蛋白可為可溶性蛋白，諸如可溶性配位體或細胞介素(例如，可溶性IL-15、可溶性IL-7、可溶性IL-12、可溶性CD40L、可溶性4-1BBL及/或可溶性CCL19)。在一些實施例中，裝甲蛋白不為抗原特異性的。

如本文使用，「IL-15」係指天然或重組IL-15或其變異體，其充當一或多個IL-15受體(IL-15R)亞單位(例如，突變體、突變蛋白、類似物、亞單位、受體複合物、片段、同功型、及其擬肽)之促效劑。如同IL-2，IL-15為可支持IL-2依賴性細胞系CTLL-2之增殖的已知T細胞生長因子。IL-15首先由Grabstein等人( Science264.5161: 965-969, 1994)報導為114個胺基酸之成熟蛋白。如本文使用，術語「IL-15」意謂天然或重組IL-15及突變蛋白、類似物、其亞單位、或其複合物(例如，受體複合物，例如，壽司肽，如PCT公開案第WO 2007/046006號所描述)，且其每一者可刺激CTLL-2細胞之增殖。在CTLL-2增殖檢定中，用成熟形式之IL-15之重組表現前體及同框融合體轉染的細胞之上清液可誘導CTLL-2細胞增殖。

人類IL-15可根據Grabstein等人( Science264.5161: 965-969, 1994)描述之程序或習知程序諸如聚合酶鏈反應(PCR)來獲得。人類IL-15 cDNA在1993年2月19日寄存於ATCC®且被指定登錄號69245。

人類IL-15之胺基酸序列(基因ID 3600)在登錄定位子NP000576.1 GI：10835153 (同功型1)及NP_751915.1 GI：26787986 (同功型2)下發現於Genbank中。鼠(小家鼠( Mus musculus)) IL-15胺基酸序列(基因ID 16168)在登錄定位子NP_001241676.1 GI：363000984下發現於Genbank中。

IL-15亦可係指衍生自各種哺乳動物物種，包括例如人類、猿、牛、豬、馬、及鼠的IL-15。如本文提及，IL-15「突變蛋白」或「變異體」為基本上與天然哺乳動物IL-15之序列同源，但是由於胺基酸缺失、***、或取代而具有不同於天然哺乳動物IL-15多肽之胺基酸序列的多肽。變異體可包含保守取代序列，意味著給定胺基酸殘基藉由具有類似生理化學特性之殘基來置換。保守取代之實例包括一個脂族殘基取代另一個脂族殘基，諸如Ile、Val、Leu、或Ala彼此取代，或一個極性殘基取代另一個極性殘基，諸如在Lys與Arg；Glu與Asp；或Gln與Asn之間的取代。其他此等保守取代，例如，具有類似疏水性特性之整個區域之取代，為熟知的。天然存在之IL-15變異體亦由本發明涵蓋。此等變異體之實例為由替代mRNA剪接事件或IL-15蛋白之蛋白分解切割所產生的蛋白質，其中IL-15結合性質得以保持。mRNA之替代剪接可產生截短但具有生物活性的IL-15蛋白。可歸因於蛋白分解之變化包括例如，由於蛋白分解自IL-15蛋白中移除一或多個末端胺基酸(通常1-10個胺基酸)所導致的在不同類型宿主細胞中表現後的N或C末端中之差異。在一些實施例中，蛋白質之末端可例如用化學基團諸如聚乙二醇來修飾以改變其物理性質(Yang等人 Cancer76:687-694, 1995)。在一些實施例中，蛋白質之末端或內部可用額外胺基酸來修飾(Clark-Lewis等人 PNAS90:3574-3577, 1993)。

如本文使用，「非造血細胞」包括基質細胞及上皮細胞。基質細胞為任何器官之非造血結締組織細胞且支持該器官之實質細胞之功能。基質細胞之實例包括纖維母細胞、外被細胞、間質細胞、角質細胞、內皮細胞、及非血液學腫瘤細胞。上皮細胞為裝襯整個身體中之血管及器官之內腔及表面的非造血細胞。它們通常在形狀上為鱗狀、柱狀、或立方體樣且可被排列成單個細胞層，或二或更多個細胞層。

如本文使用，「非造血組織駐留γδ T細胞」、「非造血組織衍生」、及「非造血組織-天然γδ T細胞」係指在組織外植時，存在於非造血組織中之γδ T細胞。非造血組織駐留γδ T細胞可獲自任何合適人類或非人類動物非造血組織。非造血組織為除了血液或骨髓以外的組織。在一些實施例中，γδ T細胞不獲自諸如血液或滑液之生物流體的特定類型之樣品。此等合適人類或非人類動物非造血組織之實例包括皮膚或其一部分(例如，真皮或表皮)，胃腸道(例如，胃腸上皮、結腸、小腸、胃、闌尾、盲腸、或直腸)、乳腺組織、肺(較佳地其中組織不藉由支氣管肺泡灌洗來獲得)、***、肝臟、及胰腺。在一些實施例中，非造血組織駐留γδ T細胞可衍生自淋巴組織，諸如胸腺、脾臟、或扁桃體。γδ T細胞亦可駐留於人類癌症組織，例如，乳腺及***中。在一些實施例中，γδ T細胞不獲自人類癌症組織。非造血組織樣品可藉由標準技術例如，藉由外植(例如，生檢)來獲得。非造血組織駐留γδ T細胞包括例如Vδ1 T細胞、雙陰性(DN) T細胞、Vδ2 T細胞、Vδ3 T細胞、及Vδ5 T細胞。

如本文使用，片語「以有效……之量」係指誘導可偵測結果(例如，相對於其起始群，具有統計上顯著增加數目的細胞之數目，例如，p＜0.05)的量。

如本文使用，「經擴增的γδ細胞群」係指包括γδ T細胞之造血細胞群，該等細胞以誘導γδ細胞擴增，亦即，增加γδ細胞數目之條件及持續時間來培養。同樣地，如本文使用，「經擴增的Vδ1 T細胞群」係指包括Vδ1 T細胞之造血細胞群，該等細胞以誘導Vδ1 T細胞擴增，亦即，增加Vδ1細胞數目之條件及持續時間來培養。類似地，如本文使用，「經擴增的Vδ2 T細胞群」係指包括Vδ2 T細胞之造血細胞群，該等細胞以誘導Vδ2 T細胞擴增，亦即，增加Vδ2細胞數目之條件及持續時間來培養

術語「標誌物」在本文中係指DNA、RNA、蛋白質、碳水化合物、醣脂、或基於細胞的分子標誌物，其在患者之樣品中之表現或存在可藉由標準方法(或本文揭示之方法)來偵測。

「表現」所關注標誌物之細胞或細胞群為如下細胞或細胞群，其中編碼蛋白質之mRNA或蛋白質本身(包括其片段)被確定為存在於細胞或群體中。標誌物之表現可藉由各種手段來偵測。例如，在一些實施例中，標誌物之表現係指細胞上之標誌物之表面密度。例如用作流式細胞術之讀出的平均螢光強度(MFI)代表細胞群上之標誌物之密度。熟習此項技術者理解MFI值取決於染色參數(例如，濃度、持續時間、及溫度)及螢光染料組成。然而，在合適對照之情形中考量時，MFI可為定量的。例如，若在相當條件下染色，標誌物之抗體之MFI顯著高於相同細胞群上之合適同型對照抗體之MFI，則可認為細胞群表現該標誌物。另外地或可替代地，根據習知流式細胞術分析方法(例如，藉由根據同型或「螢光減一」(FMO)對照來設定門)，使用正性及負性門，可在逐個細胞的基礎上認為細胞群表現標誌物。藉由此量度，若偵測到的對標誌物陽性的細胞之數目顯著高於背景(例如，藉由對同型對照進行門控)，可認為群體「表現」標誌物。

如本文使用，「VSV-G進入受體之功能性表現」係指足以在至少5%之靶細胞群中介導可偵測的VSV-G進入的VSV-G進入受體表現水準，如藉由基於β內醯胺酶-Vpr (BlaM-VpR)之檢定所量測。參見，例如Cavrois等人 Nat Biotechnol. 11:1151-1154, 2002。相反地，在「缺少VSV-G進入受體之功能性表現」的細胞群中，大於95%之細胞群缺少足以介導可偵測的VSV-G進入的VSV-G進入受體表現水準，如藉由基於BlaM-Vpr之檢定所量測。

如本文使用，當群體之表現以陽性細胞之百分比來陳述且該百分比與參考群體之陽性細胞之對應百分比進行比較時，百分比差異為各相應群體之母體群體之百分比。例如，若標誌物在群體A之10%之細胞上表現且相同標誌物在群體B之1%之細胞上表現，則認為群體A之標誌物陽性細胞頻率比群體B大9% (亦即，10%-1%，而不是10%÷1%)。當頻率乘以母體群體中之細胞數目時，計算細胞絕對數目之差。在以上給出之實例中，若在群體A中有100個細胞且在群體B中有10個細胞，則相對於群體B，群體A具有100倍細胞數目，亦即，(10% x 100) ÷ (1% x 10)。

標誌物之表現水準可為核酸表現水準(例如，DNA表現水準或RNA表現水準，例如，mRNA表現水準)。可使用確定核酸表現水準之任何合適方法。在一些實施例中，核酸表現水準使用qPCR、rtPCR、RNA-seq、多重qPCR或RT-qPCR、微陣列分析、基因表現系列分析(SAGE)、MASSARRAY®技術、原位雜交(例如，FISH)、或其組合來確定。

如本文使用，細胞之「參考群體」係指對應於所關注細胞的細胞群，相對於該群體來量測所關注細胞之表型。例如，非造血組織衍生的γδ細胞之分離群體上標誌物之表現水準可與造血組織衍生的γδ T細胞(例如，血液駐留γδ細胞，例如，衍生自相同供體或不同供體之血液駐留γδ細胞)或在不同條件下(例如，在實質性TCR活化存在下、在外源性TCR活化劑(例如，抗CD3)存在下、或在與基質細胞(例如，纖維母細胞)實質性接觸中)擴增之非造血組織衍生的γδ T細胞上相同標誌物之表現水準進行比較。群體亦可與較早狀態下的自身進行比較。例如，參考群體可為在其擴增之前的分離細胞群體。在此情況下，經擴增的群體與其在擴增步驟之前的自身組成進行比較，亦即，在此情況下，其過去組成為參考群體。

如本文使用，術語「嵌合抗原受體」或可替代地「CAR」係指重組多肽構築體，其包括胞外抗原結合域、跨膜域、及視情況傳播對細胞進行活化之活化信號及/或共刺激信號的胞內域。在一些實施例中，CAR包括CAR融合蛋白之N端的視情況選用之前導序列。

本發明部分地基於γδ T細胞可用β反轉錄病毒假型病毒載體轉導至高水準的意外發現。相對於其他淋巴球類型，γδ T細胞不容許反轉錄病毒轉導，例如，使用VSV-G假型病毒載體。VSV-G載體容易地轉導αβ T細胞以及NK細胞，該等細胞為γδ T細胞之最接近的細胞類型。因此，不預期β反轉錄病毒假型病毒載體能夠轉導γδ T細胞。此外，本發明亦基於在病毒載體存在下的γδ T細胞之最佳培養條件及持續時間的發現，以便用載體轉導群體γδ T細胞。本文所述之轉導方法允許高效轉導γδ T細胞以便產生表現所需轉殖基因之經工程改造之γδ T細胞群。 轉導方法

在一態樣中，本發明提供了一種藉由用包括β反轉錄病毒假型及反轉錄病毒科(例如，反轉錄病毒)載體骨架之病毒載體轉導γδ T細胞(例如，Vδ1 T細胞、Vδ2 T細胞、及/或非Vδ1/Vδ2 T細胞)群來產生經工程改造之γδ T細胞群的方法。反轉錄病毒載體骨架可為例如慢病毒骨架、γ反轉錄病毒骨架、或α反轉錄病毒骨架。β反轉錄病毒假型可為例如BaEV或RD114。在一些實施例中，β反轉錄病毒假型為BaEV。在一些實施例中，β反轉錄病毒假型為RD114。

在另一態樣中，本發明提供了一種產生經工程改造之γδ T細胞群之方法，該方法藉由提供起始γδ T細胞群，在不存在病毒載體的情況下將γδ T細胞預敏化，及在以有效轉導至少3% (例如，至少4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、或基本上全部)之經預敏化之γδ T細胞之量的病毒載體存在下，培養經預敏化之γδ T細胞群來進行。在一些實施例中，在以有效轉導至少5%之經預敏化之γδ T細胞之量的病毒載體存在下，培養經預敏化之γδ T細胞群。在一些實施例中，在以有效轉導至少20%之經預敏化之γδ T細胞之量的病毒載體存在下，培養經預敏化之γδ T細胞群。

經預敏化之γδ T細胞可藉由在不存在病毒載體的情況下，培養起始γδ T細胞群來獲得。例如，起始γδ T細胞群可培養至少1小時(例如，至少2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、12小時、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、或更長時間，例如，約1小時至約14天、約6小時至約14天、約1天至約14天、約2天至約14天、約5天至約14天、約7天至約14天、約5天至約10天、約5天至約7天、或約7天至約10天)的第一培養期。當例如在不存在病毒載體的情況下培養細胞之後，獲得經預敏化之γδ T細胞時，經預敏化之γδ T細胞可進一步培養至少1天(例如，至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、或更長時間，例如，約1天至約14天、約2天至約14天、約5天至約14天、約7天至約14天、約5天至約10天、約5天至約7天、或約7天至約10天)的第二培養期。第二培養期可為約1天至約14天(例如，約3天至約14天、約3天至約12天、約4天至約1天、約5天至約10天、或約5天至約7天)。

在一些實施例中，病毒載體以不大於約10，例如，不大於約9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、或0.25之感染複數(MOI)與經預敏化之γδ T細胞一起培養。在一些實施例中，病毒載體以不大於約5之感染複數(MOI)與經預敏化之γδ T細胞一起培養。在一些實施例中，病毒載體以不大於約4之感染複數(MOI)與經預敏化之γδ T細胞一起培養。在一些實施例中，病毒載體以不大於約3之感染複數(MOI)與經預敏化之γδ T細胞一起培養。在一些實施例中，病毒載體以不大於約2之感染複數(MOI)與經預敏化之γδ T細胞一起培養。在一些實施例中，病毒載體以不大於約1之感染複數(MOI)與經預敏化之γδ T細胞一起培養。在一些實施例中，病毒載體以不大於約0.5之感染複數(MOI)與經預敏化之γδ T細胞一起培養。在一些實施例中，病毒載體以不大於約0.25之感染複數(MOI)與經預敏化之γδ T細胞一起培養。在一些實施例中，病毒載體以約0.25至約10 (例如，約0.5至約10、約1至約10、或約1至約5)之感染複數(MOI)與經預敏化之γδ T細胞一起培養。

在一些實施例中，γδ T細胞之轉導包括使用轉導增強劑來增強轉導效率。合適轉導增強劑包括例如載體融合素、***及/或纖維連接蛋白。該等方法可包括在培養期間，使γδ T細胞與轉導增強劑接觸。在一些實施例中，該方法進一步包括使細胞與奈韋拉平接觸。在一些實施例中，γδ T細胞之轉導包括用IL-15來補充培養基，該IL-15可增加β反轉錄病毒假型病毒載體之病毒進入受體ASCT-2之γδ T細胞表現。 旋轉接種

在本揭示案之一些實施例中，γδ T細胞可例如藉由離心來旋轉，同時與病毒載體(例如，與一或多種本文所述之額外試劑組合)一起培養。此「旋轉接種」過程可例如約200 x g至約2,000 x g之向心力發生。向心力可為例如約300 x g至約1,200 x g (例如，約300 x g、400 x g、500 x g、600 x g、700 x g、800 x g、900 x g、1,000 x g、1,100 x g、或1,200 x g、或更大)。在一些實施例中，γδ T細胞旋轉約10分鐘至約3小時(例如，約10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、55分鐘、60分鐘、65分鐘、70分鐘、75分鐘、80分鐘、85分鐘、90分鐘、95分鐘、100分鐘、105分鐘、110分鐘、115分鐘、120分鐘、125分鐘、130分鐘、135分鐘、140分鐘、145分鐘、150分鐘、155分鐘、160分鐘、165分鐘、170分鐘、175分鐘、180分鐘、或更大)。在一些實施例中，γδ T細胞在室溫下，諸如在約25℃之溫度下旋轉。

涉及旋轉接種步驟之示例性轉導方案描述於例如Millington等人 PLoS One4:e6461, 2009；Guo等人 Journal of Virology85:9824-9833, 2011；O’Doherty等人 Journal of Virology74:10074-10080, 2000；及Federico等人, Lentiviral Vectors and Exosomes as Gene and Protein Delivery Tools, Methods in Molecular Biology1448, 第4章, 2016中，其每一者之揭示內容以引用方式併入本文。 病毒載體

本文所述之組成物及方法包括使用β反轉錄病毒假型病毒載體來高效轉導γδ T細胞。病毒基因體提供可用於將外源基因高效遞送至哺乳動物細胞中的載體之豐富來源。病毒基因體為用於基因遞送之特別有用的載體，因為包含於此等基因體內之多核苷酸通常藉由普通或特殊轉導併入哺乳動物細胞之細胞核基因體中。該等過程作為天然病毒複製循環之一部分而發生且不需要添加蛋白質或試劑以便誘導基因整合。可為β反轉錄病毒假型之病毒載體之實例包括反轉錄病毒(例如，反轉錄病毒科病毒載體)。反轉錄病毒之實例為：禽類白血病-肉瘤、禽類C型病毒、哺乳動物C型、B型病毒、D型病毒、致癌病毒、HTLV-BLV組、慢病毒、α反轉錄病毒、β反轉錄病毒、γ反轉錄病毒、泡沫病毒(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, Virology, 第三版 (Lippincott-Raven, Philadelphia, (1996)))。其他實例為鼠白血病病毒(MLV)、鼠肉瘤病毒、小鼠乳腺腫瘤病毒、牛白血病病毒、貓白血病病毒、貓肉瘤病毒、禽類白血病病毒、人類T細胞白血病病毒、狒狒內源性病毒(BaEV)、長臂猿白血病病毒、Mason Pfizer猴病毒、猿免疫缺陷病毒、猿肉瘤病毒、勞斯肉瘤病毒、及慢病毒。用於本發明方法的可用β反轉錄病毒來假型化的載體之其他實例描述於例如McVey等人(美國專利第5,801,030號)，其教示以引用方式併入本文。 反轉錄病毒載體

在一些情況下，用於本文所述之方法及組成物之病毒載體為反轉錄病毒載體。可用於本文所述之方法及組成物之一種類型的反轉錄病毒載體為慢病毒載體。慢病毒載體(LV)，反轉錄病毒之子集，以高效率轉導廣泛範圍之***及非***細胞類型，從而賦予轉殖基因穩定、長期的表現。包裝及轉導LV之優化策略之概觀提供於Delenda, The Journal of Gene Medicine 6: S125, 2004中，其揭示內容以引用方式併入本文。

使用基於慢病毒之基因轉移技術依賴於活體外產生帶有高度缺失病毒基因體的重組慢病毒顆粒，所關注轉殖基因容納在該基因體中。具體而言，重組慢病毒經由在容許細胞系中反式共表現以下各者來回收：(1)包裝構築體，亦即，表現Gag-Pol前驅物連同Rev (可替代地反式表現)之載體；(2)表現通常異源性質之包膜蛋白的載體；及(3)轉移載體，其由病毒cDNA組成，該cDNA失去所有開讀框，但是保留複製、外殼化、及表現所需要之序列，待表現之序列***其中。

用於本文所述之方法及組成物之LV可包括5'-長末端重複(LTR)、HIV信號序列、HIV Psi信號5'-剪接位點(SD)、δ-GAG元件、Rev響應元件(RRE)、3'-剪接位點(SA)、延長因子(EF) 1-α啟動子及3'-自身失活LTR (SIN-LTR)中之一或多者。慢病毒載體視情況包括中心聚嘌呤束(cPPT)及土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)，如US 6,136,597所描述，其關於WPRE之揭示內容以引用方式併入本文。慢病毒載體可進一步包括pHR'骨架，其可包括例如如以下所提供。

Lu等人, Journal of Gene Medicine6:963, 2004所描述之Lentigen LV可用於表現DNA分子及/或轉導細胞。用於本文所述之方法及組成物之LV可為5'-長末端重複(LTR)、HIV信號序列、HIV Psi信號5'-剪接位點(SD)、δ-GAG元件、Rev響應元件(RRE)、3'-剪接位點(SA)、延長因子(EF)1-α啟動子及3'-自身失活L TR (SIN-LTR)。熟習此項技術者容易顯而易知視情況該等區域中之一或多者經執行相似功能之另一個區域取代。

增強子元件可用於增加經修飾的DNA分子之表現或增加慢病毒整合效率。用於本文所述之方法及組成物之LV可包括nef序列。用於本文所述之方法及組成物之LV可包括增強載體整合之cPPT序列。cPPT充當(+)-鏈DNA合成之第二來源且在其天然HIV基因體之中間引入部分鏈重疊。在轉移載體骨架中引入cPPT序列強烈增加細胞核傳送及整合至靶細胞之DNA中之基因體之總量。用於本文所述之方法及組成物之LV可包括土撥鼠轉錄後調控元件(WPRE)。WPRE藉由促進轉錄物之細胞核輸出及/或藉由增加新生轉錄物之多聚腺苷酸化效率，由此增加細胞中mRNA之總量，從而在轉錄水準下起作用。在活體外及活體內，將WPRE添加至LV導致自多個不同啟動子之轉殖基因表現水準的實質性改良。用於本文所述之方法及組成物之LV可包括cPPT序列及WPRE序列。載體亦可包括允許自單一啟動子表現多個多肽的IRES序列。

除了IRES序列以外，其他允許表現多個多肽之元件亦可用。用於本文所述之方法及組成物之載體可包括允許表現多於一個多肽的多個啟動子。用於本文所述之方法及組成物之載體可包括允許表現多於一個多肽的蛋白切割位點。允許表現多於一個多肽的蛋白切割位點之實例描述於Klump等人 Gene Ther.; 8:811, 2001，Osborn等人, Molecular Therapy12:569, 2005，Szymczak及Vignali, Expert Opin Biol Ther. 5:627, 2005，及Szymczak等人, Nat Biotechnol. 22:589, 2004中，其關於允許表現多於一個多肽之蛋白切割位點的揭示內容以引用方式併入本文。熟習此項技術者容易顯而易知將來鑑別的其他允許表現多個多肽之元件可用且可用於適合於與本文所述之組成物及方法一起使用之載體中。

其他可與本文所述之組成物及方法結合使用之反轉錄病毒載體(例如，反轉錄病毒骨架)包括γ反轉錄病毒載體。示例性γ反轉錄病毒載體為或衍生自雞融合病毒、貓白血病病毒、finkel-biskis-jinkins鼠肉瘤病毒、gardner-arnstein貓肉瘤病毒、長臂猿白血病病毒、豚鼠c型致癌病毒、hardy-zuckerman貓肉瘤病毒、harvey鼠肉瘤病毒、kirsten鼠肉瘤病毒、koala反轉錄病毒、moloney鼠肉瘤病毒、鼠白血病病毒、豬c型致癌病毒、網狀內皮症病毒、snyder-theilen貓肉瘤病毒、trager鴨脾壞死病毒、毒蛇反轉錄病毒及長毛猴肉瘤病毒。

在某些實施例中，病毒載體骨架衍生自慢病毒(LV)。在某些實施例中，病毒載體骨架衍生自第三代自身失活(SIN)慢病毒載體(LV) (例如，HIV、SIV、或EIAV)。在某些實施例中，病毒載體骨架衍生自未自身失活的LV (例如)。

其他可與本文所述之組成物及方法結合使用之反轉錄病毒載體(例如，反轉錄病毒骨架)包括α反轉錄病毒載體。示例性α反轉錄病毒載體為或衍生自禽類癌米爾希爾(mill hill)病毒2、禽類白血病病毒、禽類成髓細胞瘤病毒、禽類骨髓細胞瘤病毒29、禽類肉瘤病毒ct10、藤波(fujinami)肉瘤病毒、勞斯肉瘤病毒、ur2肉瘤病毒、及y73肉瘤病毒。 β 反轉錄病毒假型

與本文所述之組成物及方法結合使用之病毒載體包括β反轉錄病毒假型包膜基因。β反轉錄病毒包膜基因可來自標準B型或D型β反轉錄病毒。β反轉錄病毒假型可衍生自任何合適β反轉錄病毒。β反轉錄病毒包括例如小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)、地方性鼻腫瘤病毒1型及2型(ENT-1及ENT-2)、猿反轉錄病毒1型、2型(SRV-1及SRV-2)及3型、jaagsiekte綿羊反轉錄病毒(JSRV)、松鼠猴反轉錄病毒(SMRV)、帚尾袋貂( Trichosurus Vulpecula)內源性D型反轉錄病毒(TvERV-D)、小家鼠D型反轉錄病毒(MusD)、猿內源性反轉錄病毒(SERV)、Mason-Pfizer猴病毒MPMV。在一些實施例中，β反轉錄病毒包膜基因來自非β反轉錄病毒載體。該等病毒經由重組及跨物種傳播潛在地獲得β反轉錄病毒假型。合適實例包括BaEV、貓反轉錄病毒RD114、辛諾柏(sin nombre)病毒(SNV)、及網狀內皮症病毒(REV)。可與本文所述之組成物及方法結合使用之包膜基因包括來自在Baillie等人, J. Virol.78: 5784-5798, 2004中描述之病毒的彼等包膜基因，其揭示內容全部以引用方式併入本文。 γδ T 細胞

伽瑪德爾塔T細胞(γδ T細胞)代表在其表面上表現獨特、界定性γδ T細胞受體(TCR)的T細胞之子集。此TCR由一個伽瑪(γ)及一個德爾塔(δ)鏈組成。人類γδ T細胞可廣泛地分類為一或兩種類型：周邊血液駐留γδ T細胞及非造血組織駐留γδ T細胞。大多數血液駐留γδ T細胞表現Vδ2 TCR，而此現象在組織駐留γδ T細胞之中不太常見，後者更頻繁地使用Vδ1及/或其他Vδ鏈。本發明提供了用如本文描述之編碼所需轉殖基因之病毒載體轉導的γδ T細胞。

在一些實施例中，用作本發明描述之經工程改造之γδ T細胞之來源的合適γδ T細胞包括Vδ1細胞、Vδ2細胞、Vδ3細胞、Vδ5細胞、及Vδ8細胞。在一些實施例中，經工程改造之γδ T細胞群衍生自Vδ1細胞或Vδ2細胞群。在一些情況下，經工程改造之γδ T細胞群衍生自非Vδ1/Vδ2 T細胞群。在一些情況下，經工程改造之γδ T細胞群衍生自混合Vδ1細胞及Vδ2細胞群。

本文所述之γδ T細胞(例如，內源性γδ T細胞或經預敏化之γδ T細胞)可缺少水皰性口炎病毒G醣蛋白(VSV-G)進入受體(例如，LDL)。γδ T細胞(例如，內源性γδ T細胞或經預敏化之γδ T細胞)可表現ASCT-1及/或ASCT-2。ASCT-1及/或ASCT-2之表現可允許用β反轉錄病毒假型載體(例如，BaEV及RD114)進行的轉導。VSV-G之表現之缺少可防止用VSV-G假型載體進行的轉導。

在一態樣中，本發明提供了一種經工程改造以表現一或多種轉殖基因的γδ T細胞群，該等轉殖基因可編碼膜結合蛋白(例如，細胞表面受體，諸如嵌合抗原受體(CAR)，αβ TCR，天然細胞毒性受體(例如，NKp30、NKp44、或NKp46)、細胞介素受體(例如，IL-12受體)、趨化因子受體(例如，CCR2受體)及/或膜結合配位體或細胞介素(例如，膜結合IL-15、膜結合IL-7、膜結合CD40L、膜結合4-1BB、膜結合4-1BBL、膜結合CCL19)、可溶性蛋白(例如，可溶性配位體或細胞介素，例如，可溶性IL-15、可溶性IL-7、可溶性IL-12、可溶性CD40L、可溶性4-1BBL及/或可溶性CCL19)、可選擇標誌物(例如，報告基因)、或自殺基因。在一些情況下，本發明提供了一種經工程改造以表現CAR及一或多種額外轉殖基因編碼的蛋白質(例如，裝甲蛋白)的γδ T細胞群。在一些實施例中，一或多種轉殖基因係經密碼子優化的。

在一些實施例中，γδ T細胞用編碼轉殖基因之病毒載體來轉導。在一些實施例中，病毒載體係反轉錄病毒載體。在一些實施例中，病毒載體係慢病毒載體。在一些此等實施例中，細胞可穩定表現轉殖基因。在一些實施例中，細胞可瞬時表現轉殖基因。

在一態樣中，本發明之特徵在於經工程改造之γδ T細胞之細胞群(例如，分離的細胞群) (例如，至少10、10 ²、10 ³、10 ⁴、10 ⁵、10 ⁶、10 ⁷、10 ⁸、10 ⁹、10 ¹⁰、10 ¹¹、10 ¹²、或10 ¹³個細胞)，其中細胞群之至少3% (例如，至少4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、或基本上全部)為表現轉殖基因(例如，CAR及/或一或多種額外蛋白質)的經工程改造之γδ T細胞。 收穫及擴增 γδ T 細胞之方法

本發明之經工程改造之γδ T細胞可衍生自任何合適自體或同種異體γδ T細胞或其群體。在一些實施例中，用作本發明描述之經工程改造之γδ T細胞之來源的合適γδ T細胞包括Vδ1細胞、Vδ2細胞、Vδ3細胞、Vδ5細胞、及Vδ8細胞。在一些實施例中，經工程改造之γδ T細胞群衍生自Vδ1細胞或Vδ2細胞群。

例如，本文提供了分離及擴增來自非造血組織諸如皮膚或腸道之Vδ1細胞的方法。在其他實施例中，合適γδ T細胞可衍生自血液(例如，周邊血液)。分離及擴增來自血液之Vδ1細胞的方法包括例如在美國專利第9,499,788號及國際專利公開案第WO 2016/198480號中描述之彼等方法，其每一者以全文引用方式併入本文。在一些實施例中，合適γδ T細胞可衍生自腫瘤組織(例如，腫瘤浸潤γδ T細胞)。可替代地，可經工程改造以表現轉殖基因的合適γδ T細胞可根據以下描述之方法衍生自非造血組織。 分離及擴增來自血液之 γδ T 細胞

在一些實施例中，本發明之經工程改造之γδ T細胞衍生自個體之血液(例如，周邊血液)。例如，經工程改造之γδ T細胞可衍生自血液衍生的Vδ2細胞或血液衍生的Vδ1細胞。

在一些實施例中，周邊血液單核細胞(PBMC)可根據在此項技術中已知之任何合適方法自個體獲得。PBMC可在IL-2存在下，在胺基雙膦酸鹽(例如，唑來膦酸)、合成磷酸抗原(例如，溴醇焦磷酸；BrHPP)、2M3B1PP、或2-甲基-3-丁烯基-1-焦磷酸存在下培養一至兩週以產生富集的Vδ2細胞群。可替代地，固定的抗TCRγδ (例如，泛TCRγδ)可在IL-2存在下，誘導來自PBMC群之Vδ2細胞的優先擴增，例如持續大約14天。在一些實施例中，來自PBMC之Vδ2細胞之優先擴增可在IL-2及IL-4存在下，在培養固定的抗CD3抗體(例如，OKT3)後達成。在一些實施例中，在可溶性抗CD3、IL-2、及IL-4中傳代培養之前，將前述培養物保持約七天。可替代地，人工抗原呈遞細胞可用於促進γδ T細胞諸如Vδ2細胞之優先擴增。例如，在經輻照的aAPC、IL-2及/或IL-21存在下培養之PBMC衍生的γδ T細胞可擴增以產生γδ T細胞群，其包括較高比例之Vδ2細胞、中等比例之Vδ1細胞、及一些雙陰性細胞。在前述方法之一些實施例中，PBMC可經預富集或後富集(例如，經由用TCRγδ特異性試劑來正性選擇或TCRαβ特異性試劑之負性選擇)。擴增γδ T細胞諸如Vδ2細胞之此等方法及其他合適方法藉由Deniger等人, Frontiers in Immunology5, 636: 1-10, 2014來詳細描述，該文獻以全文引用方式併入本文。

在一些實施例中，Vδ1 T細胞可經工程改造以表現轉殖基因(例如，異源靶向構築體)。可使用獲得Vδ1 T細胞群之任何合適方法。例如，以全文引用方式併入本文之Almeida等人( Clinical Cancer Research, 22, 23; 5795-5805, 2016)提供了獲得可經工程改造以表現本文所述之異源靶向構築體的Vδ1 T細胞群之合適方法。例如，在一些實施例中，PBMC使用磁珠分選來預富集，可產生大於90% γδ T細胞。該等細胞可在透氣生物反應袋中，在一或多種因子(例如，TCR促效劑、輔受體促效劑及/或細胞介素，例如IL-4、IL-15及/或IFN-γ)存在下培養多達21天或更長時間。此方法之變化形式及獲得Vδ1 T細胞之其他方法適合作為本發明之一部分。例如，血液衍生的Vδ1 T細胞能夠可替代地使用例如在美國專利第9,499,788號及國際專利公開案第WO 2016/198480號中描述之方法來獲得，該等文獻之每一者以全文引用方式併入本文。 分離及擴增來自非造血組織之非造血組織駐留 γδ T 細胞

如下所述獲得之非造血組織駐留γδ T細胞可為本文所述之轉殖基因的合適媒介物，因為其可展現良好的腫瘤滲透及保留能力。分離及擴增非造血組織駐留γδ T細胞之更詳細方法可發現於例如PCT公開案第WO 2020/095058號、第WO 2020/095059號、第WO 2017/072367號、及GB申請案第2006989.4號中，其每一者以全文引用方式併入本文。

非造血組織駐留γδ T細胞(例如，皮膚衍生的γδ T細胞及/或非Vδ2 T細胞，例如，Vδ1 T細胞及/或DN T細胞)可分離自任何人類或非人類動物非造血組織，該組織可自患者取出以獲得適合於根據本發明之方法進行工程改造之細胞。在一些實施例中，衍生及擴增γδ T細胞的非造血組織為皮膚(例如，人類皮膚)，其可藉由在此項技術中已知之方法來獲得。在一些實施例中，皮膚藉由穿刺生檢來獲得。可替代地，分離及擴增本文提供之γδ T細胞的方法可應用於胃腸道(例如，結腸)、乳腺、肺、***、肝臟、脾臟、及胰腺。γδ T細胞亦可駐留於人類癌症組織，例如，乳腺或***之腫瘤中。在一些實施例中，γδ T細胞可來自人類癌症組織(例如，實體腫瘤組織)。在其他實施例中，γδ T細胞可來自除了人類癌症組織以外的非造血組織(例如，沒有大量腫瘤細胞之組織)。例如，γδ T細胞可來自與附近或相鄰癌症組織分開的皮膚(例如，健康皮膚)區域。

在血液中佔優勢的γδ T細胞主要為Vδ2 T細胞，而在非造血組織中佔優勢的γδ T細胞主要為Vδ1 T細胞，以致於Vδ1 T細胞佔非造血組織駐留γδ T細胞群之約70%-80%。然而，一些Vδ2 T細胞亦存在於非造血組織例如腸道中，其中該等細胞可佔γδ T細胞之約10%-20%。駐留於非造血組織中之一些γδ T細胞既不表現Vδ1，亦不表現Vδ2 TCR，且將其命名為雙陰性(DN) γδ T細胞。該等DN γδ T細胞可能主要為Vδ3表現T細胞，且少數為Vδ5表現T細胞。因此，通常駐留於非造血組織中且藉由本發明之方法來擴增之γδ T細胞較佳地為非Vδ2 T細胞，例如，Vδ1 T細胞，且包含較少量之DN γδ T細胞。

在一些實施例中，關鍵步驟為例如在培養幾天或幾週之後，將非造血組織駐留T細胞(例如，在混合淋巴球群體內，該群體可例如包括αβ細胞、自然殺手(NK)細胞、B細胞、及γδ2及非γδ2 T細胞)與自其中獲得T細胞之組織的非造血細胞(例如，基質細胞，尤其纖維母細胞)人為地分離開來。這允許在之後幾天及幾週中，非造血組織衍生的Vδ1 T細胞及DN γδ T細胞之優先及快速擴增。

通常，非造血組織駐留γδ T細胞能夠在去除與基質細胞(例如，皮膚纖維母細胞)之物理接觸後自發擴增。因此，如上所述之基於支架之培養方法可用於誘導此種分離，從而導致γδ T細胞去抑制以觸發擴增。因此，在一些實施例中，在擴增步驟期間，不存在實質性TCR途徑活化(例如，在培養物中不包括外源性TCR途徑活化劑)。此外，本發明提供了擴增非造血組織駐留γδ T細胞之方法，其中該等方法不涉及與飼養細胞、腫瘤細胞、及/或抗原呈遞細胞接觸。

擴增方案涉及在支持高效γδ T細胞擴增的生物因子之有效混合物存在下，培養非造血組織駐留γδ T細胞。在一個實施例中，擴增γδ T細胞之方法包括提供自非造血組織獲得之γδ T細胞群(例如，分離的非造血組織衍生的γδ T細胞群，例如，根據本文所述之方法分離的群)以及在IL-2及、IL-15、及視情況IL-1β、IL-4及/或IL-21存在下，培養γδ T細胞。該等細胞介素或其類似物可以有效產生經擴增的γδ T細胞群之量與細胞培養一定的持續時間(例如，至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少21天、至少28天、或更長時間，例如，5天至40天、7天至35天、14天至28天、或約21天)。

適合用於預敏化及/或擴增γδ T細胞的許多基礎培養基為可用的，諸如完全培養基，OPTMIZER ^TM、AIM-V、Iscoves培養基以及RPMI-1640 (Life Technologies)及TEXMACS™ (Miltenyi Biotec)。培養基可補充有其他培養基因子，諸如血清、血清蛋白及選擇性劑諸如抗生素。例如，在一些實施例中，培養基包括RPMI-1640，其含有2 mM麩醯胺酸、10% FBS、10 mM HEPES，pH 7.2、1%青黴素-鏈黴素、丙酮酸鈉(1 mM；Life Technologies)、非必需胺基酸(例如，100 µM Gly、Ala、Asn、Asp、Glu、Pro及Ser；1X MEM非必需胺基酸Life Technologies)、及10 μl/L β-巰基乙醇。便利地，細胞在37℃下，在含有5% CO ₂之加濕氣氛中，在合適培養基中培養。

γδ T細胞可如本文描述在任何合適系統中培養，包括攪拌罐發酵罐、氣升式發酵罐、滾瓶、培養袋或培養皿、及其他生物反應器，諸如中空纖維生物反應器。此等系統之用途在此項技術中為熟知的。培養淋巴球之一般方法及技術在此項技術中為熟知的。

本文所述之方法可包括多於一個選擇步驟，例如，多於一個耗竭步驟。藉由負性選擇來富集T細胞群可例如使用針對負性選擇細胞所獨有的表面標誌物之抗體之組合來完成。一種方法係經由負性磁性免疫黏附之細胞分選及/或選擇或流式細胞術，其使用針對存在於負性選擇細胞上之細胞表面標誌物的單株抗體之混合物。 轉殖基因

本發明之經工程改造之γδ T細胞經工程改造以表現所需轉殖基因。經工程改造以表現轉殖基因之γδ T細胞適合用於癌症治療(例如，免疫療法)。本文所述之病毒載體編碼轉殖基因，該轉殖基因然後在經轉導之γδ T細胞中穩定或瞬時表現。可與本文所述之組成物及方法結合使用之轉殖基因包括嵌合抗原受體(CAR)。

在一些情況下，待藉由本發明之經工程改造之γδ T細胞來表現之轉殖基因包括可選擇標誌物(例如，報告基因)或自殺基因。例如，缺少胞內傳訊域的截短的表皮生長因子受體(EGFR)可用作轉殖基因，該轉殖基因用於在發生例如毒性時使用抗EGFR單株抗體來進行活體內耗竭。類似地，CD20可用作轉殖基因，用於使用抗CD20單株抗體來進行活體內耗竭。另一種示例性轉殖基因為促進所投與的經工程改造之γδ T細胞之藥物介導的控制的自殺基因。在發生不良事件時，經由使用自殺基因，經修飾的細胞可自患者體內耗竭。在一個實例中，藥物結合域融合至半胱天冬酶9促細胞凋亡分子。在一些情況下，轉殖基因為胞嘧啶去胺酶。在一些情況下，轉殖基因為胸苷激酶。

另外地或可替代地，藉由本發明之經工程改造之γδ T細胞來表現之轉殖基因編碼膜結合蛋白，諸如膜結合受體(例如，αβ TCR、天然細胞毒性受體(例如，NKp30、NKp44、或NKp46)、細胞介素受體(例如，IL-12受體)及/或趨化因子受體(例如，CCR2受體)及/或膜結合配位體或細胞介素(例如，膜結合IL-15、膜結合IL-7、膜結合CD40L、膜結合4-1BB、膜結合4-1BBL、膜結合CCL19)。膜結合配位體及細胞介素包括天然膜結合配位體及細胞介素(例如，反式呈遞的IL-15及4-1BBL)及合成膜結合組態(例如，人工融合至跨膜蛋白之配位體)。另外地或可替代地，待藉由本發明之經工程改造之γδ T細胞來表現之轉殖基因編碼可溶性蛋白，諸如可溶性配位體或細胞介素(例如，可溶性IL-15、可溶性IL-7、可溶性IL-12、可溶性CD40L、可溶性4-1BBL及/或可溶性CCL19)。

在一些情況下，具有編碼CAR之轉殖基因之經工程改造之γδ T細胞可用有助於免疫原性之額外轉殖基因來裝甲。此等裝甲CAR T細胞表現裝甲蛋白，諸如本文所述之膜結合或可溶性蛋白中之任一種。例如，裝甲蛋白包括膜結合蛋白，諸如膜結合受體(例如，αβ TCR、天然細胞毒性受體(例如，NKp30、NKp44、或NKp46)、細胞介素受體(例如，IL-12受體)及/或趨化因子受體(例如，CCR2受體)及/或膜結合配位體或細胞介素(例如，膜結合IL-15、膜結合IL-7、膜結合CD40L、膜結合4-1BB、膜結合4-1BBL、膜結合CCL19)。另外地或可替代地，待藉由本發明之經工程改造之γδ CAR T細胞來表現之裝甲蛋白包括可溶性蛋白，諸如可溶性配位體或細胞介素(例如，可溶性IL-15、可溶性IL-7、可溶性IL-12、可溶性CD40L、可溶性4-1BBL及/或可溶性CCL19)。

在一些實施例中，本發明之經工程改造之γδ T細胞經工程改造以表現一或多種轉殖基因(例如，本文所述之任一轉殖基因中之一或多者)，用於裝甲γδ T細胞(例如，呈裝甲CAR T細胞形式，如Yeku及Brentjens Biochem. Soc. Trans. 2016, 15: 44, 2, 412-418所描述，其以全文引用方式併入本文)。

在一些實施例中，轉殖基因係經密碼子優化的。

在一些實施例中，經工程改造之γδ T細胞(例如，Vδ1或Vδ2細胞)群之至少3% (例如，至少4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、或基本上全部)表現轉殖基因，例如，CAR或其他膜結合或可溶性蛋白。在一些實施例中，經工程改造之γδ T細胞(例如，Vδ1或Vδ2細胞)群之至少10% (例如，至少10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、或基本上全部)表現轉殖基因，例如，CAR或其他膜結合或可溶性蛋白。在一些實施例中，經工程改造之γδ T細胞(例如，Vδ1或Vδ2細胞)群之至少50% (例如，至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、或基本上全部)表現轉殖基因，例如，CAR或其他膜結合或可溶性蛋白。在一些實施例中，經工程改造之γδ T細胞(例如，Vδ1或Vδ2細胞)群之3%-95% (例如，5%-95%、10%-95%、20%-95%、25%-95%、或50%-95%)表現轉殖基因，例如，CAR或其他膜結合或可溶性蛋白。在一些實施例中，經工程改造之γδ T細胞(例如，Vδ1或Vδ2細胞)群之3%-90% (例如，5%-90%、10%-90%、20%-90%、25%-90%、或50%-90%)表現轉殖基因，例如，CAR或其他膜結合或可溶性蛋白。實例 材料及方法 反轉錄病毒載體產生及滴定

慢病毒載體藉由使用第三代自身失活載體平台來瞬時轉染HEK293細胞而產生，該平台由基因體(GFP或抗CD19嵌合抗原受體)、gag/pol、反轉錄酶(rev)及包膜(VSV-G、BaEV)編碼質體組成。

γ反轉錄病毒載體藉由用鼠白血病病毒基因體質體(GFP或抗CD19嵌合抗原受體)來瞬時轉染FLYRD18細胞而產生。載體在轉染後48小時收穫，經由0.45 um孔徑聚醚碸(PES)過濾器過濾且使用低速離心(在4℃下，6,000 g)來濃縮。

載體滴度藉由在聚凝胺(8 ug/mL)存在下，用濃載體材料之連續稀釋液來轉導人類宮頸癌細胞系(HeLa)而確定。轉導效率在轉導後三天使用BD FACS Lyric流式細胞儀來確定。感染滴度(TU/mL)使用下式來計算：TU/mL = ((經轉導之細胞之數目) x 載體稀釋度 x (%轉導效率/100))/載體體積(mL)。 流式細胞術

免疫分型使用BD FACS Lyric流式細胞儀來執行。細胞使用PerCP-Vio700抗TCR α/β (Miltenyi)、APC抗TCR γ/δ (Miltenyi)及VioBlue抗TCR Vδ1 (Miltenyi)抗體，針對表面標誌物之表現來分析。活細胞使用eFluor 780可固定生存力染料來偵測。CAR19表現使用FITC標記的人類CD19蛋白(AcroBiosystems)來偵測。 γδ T 細胞分離及擴增

Vδ1 γδ T細胞富集的產物(GDX012)使用基於Almeida等人 Clin. Cancer Res. 22: 5795-804, 2016之修改方案來產生。簡言之，αβ耗竭的周邊血液單核細胞使用補充有2.5%自體血漿及Glutamax (ThermoFisher)之無血清培養基(CTS OpTmizer, Thermo Fisher)來擴增。分離細胞在重組IL-4 [rIL4] (100 ng/mL)、重組干擾素-γ [rIFNγ] (70 ng/mL)、重組IL-21 [rIL21] (7 ng/mL)、重組IL-1β [rIL1β] (15 ng/mL、及可溶性OKT-3抗CD3單株抗體(70 ng/mL)存在下生長。細胞在37℃及5% CO2下，在加濕孵育器中孵育。向擴增細胞定期進給含有重組IL-15 [rIL15] (70 ng/mL)、IFNγ (30 ng/mL)、及OKT3 (1 mg/mL)之新鮮培養基。 反轉錄病毒轉導

擴增γδ T細胞用反轉錄病毒載體以所定義感染複數(MOI)來轉導。MOI係指在轉導期間每個細胞所添加的感染顆粒之數目(藉由流式細胞術來量測)。γδ T細胞(1E+06/mL)在纖維連接蛋白塗佈(20 μg/mL)的非組織培養物處理的24孔板中或在載體融合素(1 μg/mL)存在下在24孔板中進行轉導。病毒載體在補充有細胞介素、OKT-3及2.5%自體血漿(如上述)之CTS OpTmizer培養基中稀釋。γδ T細胞及載體儲料在37℃下以1,000 x g旋轉接種2小時。轉導效率在轉導後三天之後，每隔一定間隔使用流式細胞術來確定。在某些實驗中，為了抑制反轉錄酶活性，培養基補充有10 μM最終濃度之奈韋拉平(NVP)，一種非核苷反轉錄酶抑制劑。實例 1. 廣泛趨向性 VSV-G 假型慢病毒載體不能轉導 γδ T 細胞

GFP編碼慢病毒載體分別用水泡性口炎病毒G (VSV-G)或狒狒內源性病毒(BaEV)包膜來假型化。經擴增的γδ T細胞(由Vδ1、Vδ2及非Vδ1/Vδ2細胞組成)用濃病毒載體儲料以所定義感染複數(MOI)來轉導。轉導效率在轉導後三天使用流式細胞術來確定。

流式細胞術分析顯示VSV-G假型慢病毒載體即使在高MOI (MOI 50及以上，圖1A)下亦未能轉導γδ T細胞。相反，用BaEV包膜的慢病毒載體進行的轉導即使在低感染複數下亦產生高轉導效率(圖1B)。用反轉錄酶抑制劑NVP預處理γδ T細胞消除了GFP表現，指示GFP表現係Vδ1細胞中成功轉導及GFP表現之結果。實例 2. 用 VSV-G 假型 CAR 編碼慢病毒載體轉導 Vδ1 γδ T 細胞導致假轉導

為了確定CAR表現是否係載體整合或假轉導之結果，在存在或不存在奈韋拉平(NVP)的情況下，用嵌合抗原受體編碼慢病毒載體來轉導Vδ1 γδ T細胞。奈韋拉平係藉由抑制病毒RNA反轉錄成cDNA來阻斷病毒轉導的反轉錄酶抑制劑。因此，在奈韋拉平存在下，孵育暴露於慢病毒載體之細胞應減少轉殖基因表現。當在奈韋拉平存在下進行用BaEV假型載體的轉導時，CAR表現完全消除，證明CAR表現不由假轉導產生(圖4B及圖6)。相反，在用VSV-G假型慢病毒載體轉導之細胞中，用奈韋拉平處理Vδ1細胞不消除CAR表現。此結果證明VSV-G假型載體不能夠轉導Vδ1細胞，且轉殖基因(CAR)表現係假轉導之結果。假轉導藉由在轉導之後的延長時間段內(轉導後4及8天)監測CAR表現來進一步確認。藉由FACS分析監測載體處理的細胞顯示，CAR表現隨著時間推移而逐漸喪失(圖2A)。此現象亦在存在或不存在NVP的情況下，在各種感染複數下得以證明(圖2B)。總之，結果表明VSV-G假型慢病毒載體不能進入γδ T細胞。實例 3. 細胞介素預敏化係 BaEV 假型慢病毒載體之 Vδ1 γδ T 細胞轉導之主要決定因素

為了研究BaEV轉導效率是否取決於γδ T細胞擴增期間細胞介素預敏化之長度，Vδ1細胞在細胞擴增過程期間的不同時間點來轉導。細胞在開始培養(第0天)或在擴增階段之第7天、第10天、第14天及第15天以MOI=1來轉導。轉導後三天，經轉導之細胞藉由流式細胞術來分析GFP表現。轉導效率在細胞擴增階段期間逐漸增加且在第15天達到最高轉導水準(圖3A)。用NVP處理細胞證明GFP表現係成功載體整合之結果(圖3B)。總之，結果表明初始「細胞介素預敏化」階段係藉由BaEV假型慢病毒載體之成功Vδ1轉導必不可少的。實例 4. Vδ1 γδ T 細胞之轉導效率與感染複數 (MOI) 相關

為了研究BaEV轉導效率是否取決於病毒載體劑量(MOI)，Vδ1 γδ T細胞用遞增量之BaEV包膜假型抗CD19嵌合抗原受體(CAR)編碼慢病毒載體來轉導。轉導後三天，細胞藉由流式細胞術來分析CAR表現。增加MOI顯著增加經轉導之Vδ1細胞之比例(圖4A)。在存在或不存在NVP的情況下以MOI=5進行的CAR轉導之代表性點圖在圖4B中展示。實例 5. BaEV 假型慢病毒載體轉導 Vδ1 及非 Vδ1 (Vδ2 、 Vδ3) γδ T 細胞

為了測試BaEV假型載體是排他性地轉導Vδ1細胞亦或可轉導其他γδ T細胞亞型，在泛-γδ及Vδ1細胞群內確定轉導效率。將 γδ T細胞擴增且在擴增第10天用GFP或CAR編碼BaEV包膜的慢病毒載體以MOI=1來轉導。使用泛-γδ及Vδ1特異性抗體之FACS分析顯示BaEV包膜的載體轉導Vδ1及非Vδ1 (Vδ2、Vδ3及其他) γδ T細胞(圖5)。實例 6. 用 BaEV 假型慢病毒載體轉導 Vδ1 γδ T 細胞可藉由重複轉導來進一步增強

進行研究來確定連續轉導是否可進一步增強經擴增的Vδ1 γδ T細胞中CAR之表現。為此目的，Vδ1細胞以MOI=1轉導一次(第10天)或兩次(第10天及第11天)。三天後，將細胞收集且藉由FACS來分析。流式細胞術分析顯示Vδ1細胞可用單一載體命中來高效地轉導，此效應可藉由連續兩天之雙重轉導來進一步增強(圖6)。實例 7. 在載體融合素存在下之轉導與在纖維連接蛋白存在下一樣高效

為了測試轉導增強劑之選擇是否對Vδ1轉導效率具有任何影響，評估了兩種廣泛地使用之轉導增強劑(纖維連接蛋白及載體融合素)。在細胞擴增之第10天，Vδ1細胞在纖維連接蛋白或載體融合素存在下以各種MOI來轉導且轉導效率在轉導後三天確定。FACS分析顯示載體融合素與纖維連接蛋白一樣高效地增加反轉錄病毒基因轉移(圖7)。實例 8. Vδ1 細胞可用 RD114 假型病毒載體來轉導

為了測試Vδ1 γδ T細胞是否可藉由其他β反轉錄病毒病毒包膜假型載體來轉導，Vδ1 γδ T細胞亦用RD114包膜假型γ反轉錄病毒載體來轉導。細胞如前述進行擴增且在擴增之第10天以MOI=1來轉導。FACS分析顯示與BaEV假型慢病毒載體類似，RD114包膜的γ反轉錄病毒載體能夠以高效率來轉導Vδ1 γδ T細胞(圖8)。 其他實施例

本說明書中提及之所有公開案、專利、及專利申請案均以引用方式併入本文，達到如同明確及個別地指示將各個獨立公開案或專利申請案以引用方式併入的相同程度。

雖然本發明結合其特定實施例來描述，但是應瞭解其能夠進一步修改且本申請案意欲涵蓋本發明之任何變化、用途、或調適，該等變化、用途、或調適通常遵循本發明之原則且包括與本揭示案之背離，該等背離在本發明涉及之技術範圍內的已知或慣常實務內且可應用於以上闡明，且在申請專利範圍內遵循的必需特徵。

其他實施例在申請專利範圍內。

圖1A及1B為展示廣泛趨向性VSV-G假型慢病毒載體不能轉導Vδ1 γδ T細胞的圖表。代表性點圖展示在擴增培養第7天，使用各種感染複數，用VSV-G (圖1A)或BaEV (圖1B)假型GFP編碼慢病毒載體轉導的γδ T細胞。轉導效率在轉導後72小時藉由FACS分析來確定。 UTD ，未經轉導之對照； MOI ，感染複數； NVP ，奈韋拉平 (nevirapine ， RT 抑制劑 ) 。圖2A及2B為展示用VSV-G假型CAR編碼慢病毒載體轉導Vδ1 γδ T細胞導致假轉導的圖表。圖2A展示在存在或不存在奈韋拉平的情況下，用VSV-G假型CAR編碼慢病毒載體以MOI=1轉導之後4 (頂部行)或8 (底部行)天，CAR +ve Vδ1 γδ T細胞之代表性點圖。圖2B為展示在存在或不存在奈韋拉平的情況下，用VSV-G假型CAR編碼慢病毒載體以各種MOI (MOI=5-0.1)轉導之後4 (黑色條)或8 (點線條)天，CAR +ve Vδ1 γδ T細胞之百分比的圖表。 UTD ，未經轉導之對照； MOI ，感染複數； CAR ，嵌合抗原受體； NVP ，奈韋拉平。圖3A及3B為展示細胞介素預敏化係BaEV假型慢病毒載體之Vδ1 γδ T細胞轉導之主要決定因素的圖表。圖3A為展示用GFP編碼BaEV假型慢病毒載體以MOI=1轉導之GFP+ve Vδ1細胞在轉導後三天之百分比的條形圖。細胞在開始培養(第0天)或在擴增階段之第7天、第10天、第14天及第15天進行轉導。圖3B展示在擴增培養之第14天進行轉導之細胞的代表性點圖。 UTD ，未經轉導之對照； MOI ，感染複數； GFP ，綠色螢光蛋白； NVP ，奈韋拉平。圖4A及4B為展示Vδ1 γδ T細胞之轉導效率與感染複數(MOI)相關的圖表。圖4A展示用CAR編碼BaEV假型慢病毒載體以不同MOI轉導之後3天，CAR+ve Vδ1細胞之百分比。細胞在擴增之第10天進行轉導。圖4B示出展示以MOI=5轉導之CAR+ve細胞的代表性點圖。 UTD ，未經轉導之對照； MOI ，感染複數； CAR ，嵌合抗原受體； NVP ，奈韋拉平。圖5A及5B為展示BaEV假型慢病毒載體轉導Vδ1及非Vδ1 (Vδ2、Vδ3) γδ T細胞的圖表。點圖展示CAR (圖5A)及GFP (圖5B)表現Vδ1及非Vδ1 (Vδ2、Vδ3) γδ T細胞。細胞用BaEV假型載體(MOI=5)轉導且轉導效率在轉導後三天藉由對泛-γδ T細胞進行門控，隨後對Vδ1細胞進行門控來確定。圖6為展示用BaEV假型慢病毒載體轉導Vδ1 γδ T細胞可藉由重複轉導來進一步增強的一組圖表。Vδ1細胞在第10天(1次命中)或連續兩天(2次命中：第10天及第11天)用BaEV假型CAR編碼慢病毒載體以MOI=1來轉導。CAR+ve細胞之百分比在轉導之後72小時確定。圖7為展示在載體融合素(vectofusin)存在下之轉導與在纖維連接蛋白(retronectin)存在下一樣高效的圖表。Vδ1細胞在纖維連接蛋白(左)或載體融合素(右)存在下以各種MOI及各種頻率(一次或兩次命中)來轉導。細胞在擴增第10天來轉導且FACS分析在轉導後三天進行。圖8為展示Vδ1細胞可用RD114假型病毒載體來轉導的一組圖表。Vδ1細胞用BaEV假型CAR編碼慢病毒或RD114假型γ反轉錄病毒載體以MOI=1來轉導。點圖展示轉導之後三天的CAR表現Vδ1細胞。

Claims

一種產生經工程改造之γδ T細胞群的方法，該方法包含用包含β反轉錄病毒假型及反轉錄病毒科病毒載體骨架之病毒載體來轉導γδ T細胞群。
如請求項1之方法，其中該β反轉錄病毒假型為狒狒內源性病毒(BaEV)。
如請求項1之方法，其中該β反轉錄病毒假型為RD114。
如請求項1至3中任一項之方法，其中該反轉錄病毒科病毒載體骨架為反轉錄病毒載體骨架。
如請求項4之方法，其中該反轉錄病毒載體骨架為慢病毒骨架。
如請求項4之方法，其中該反轉錄病毒載體骨架為γ反轉錄病毒骨架。
如請求項4之方法，其中該反轉錄病毒載體骨架為α反轉錄病毒骨架。
如請求項1至7中任一項之方法，其中該等經工程改造之γδ T細胞為Vδ1 T細胞。
如請求項1至7中任一項之方法，其中該等經工程改造之γδ T細胞為Vδ2 T細胞。
如請求項1至7中任一項之方法，其中該等經工程改造之γδ T細胞為非Vδ1/Vδ2 T細胞。
如請求項1至10中任一項之方法，其中該病毒載體包含轉殖基因。
如請求項11之方法，其中該轉殖基因編碼細胞表面受體。
如請求項12之方法，其中該細胞表面受體為嵌合抗原受體(CAR)。
如請求項13之方法，其中該CAR靶向CD19、CD20、ROR1、CD22、癌胚抗原、α胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮腫瘤抗原、***特異性抗原、黑素瘤相關抗原、突變的p53、突變的ras、HER2/Neu、葉酸結合蛋白、HIV-1包膜醣蛋白gpl20、HIV-1包膜醣蛋白gp41、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、間皮素、GD3、HERV-K、IL-llRα、κ鏈、λ鏈、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII、VEGFR2、組合HER2-HER3、組合HER1-HER2、NY-ESO-1、滑膜肉瘤X斷點2 (SSX2)、黑素瘤抗原(MAGE)、由T細胞識別之黑素瘤抗原1 (MART-1)、gp100、***特異性抗原(PSA)、***特異性膜抗原(PSMA)、***幹細胞抗原(PSCA)、g9d2、或其組合。
如請求項11至14中任一項之方法，其中該轉殖基因編碼細胞介素。
如請求項15之方法，其中該細胞介素為分泌的。
如請求項15之方法，其中該細胞介素為膜結合的。
如請求項15至17中任一項之方法，其中該細胞介素為IL-15。
一種產生經工程改造之γδ T細胞群的方法，該方法包含： (i) 提供起始γδ T細胞群； (ii) 在不存在病毒載體的情況下，培養該起始γδ T細胞群持續第一培養期以產生經預敏化之γδ T細胞群；及 (iii) 在以有效轉導至少3%之該等經預敏化之γδ T細胞之量的包含β反轉錄病毒假型之病毒載體存在下，培養該經預敏化之γδ T細胞群持續第二培養期，由此產生該經工程改造之γδ T細胞群。
如請求項19之方法，其中該第一培養期為1天或更長時間。
如請求項20之方法，其中該第一培養期為2天或更長時間。
如請求項19至21中任一項之方法，其中該第二培養期為2天或更長時間。
如請求項22之方法，其中該第二培養期為3天或更長時間。
如請求項19至23中任一項之方法，其中該經預敏化之γδ T細胞群表現ASCT-1及/或ASCT-2。
如請求項19至24中任一項之方法，其中該經預敏化之γδ T細胞群缺少VSV-G進入受體之功能性表現。
如請求項19至25中任一項之方法，其中該病毒載體係以有效轉導至少20%之該等經預敏化之γδ T細胞之量。
如請求項19至26中任一項之方法，其中該病毒載體以不大於10之感染複數(MOI)與該等經預敏化之γδ T細胞一起培養。
如請求項27之方法，其中該MOI不大於5。
如請求項28之方法，其中該MOI為1至5。
一種產生經工程改造之γδ T細胞群的方法，該方法包含： (i) 提供起始γδ T細胞群；及 (ii) 在IL-15及以有效轉導至少3%之該起始γδ T細胞群之量的包含β反轉錄病毒假型之病毒載體存在下，培養該起始γδ T細胞群，由此產生該經工程改造之γδ T細胞群。
如請求項30之方法，其中該起始γδ T細胞群缺少ASCT-1或ASCT-2之表現。
如請求項31之方法，其中該起始γδ T細胞群缺少ASCT-1及ASCT-2之表現。
如請求項30至32中任一項之方法，其中該起始γδ T細胞群表現ASCT-1及/或ASCT-2。
如請求項30至33中任一項之方法，其中該起始γδ T細胞群缺少VSV-G進入受體之表現。
如請求項34之方法，其中該VSV-G進入受體為LDL受體。
如請求項30至35中任一項之方法，其中該病毒載體以不大於10之MOI與該起始γδ T細胞群一起培養。
如請求項36之方法，其中該MOI為1至10。
如請求項35至37中任一項之方法，其中該MOI不大於5。
如請求項38之方法，其中該MOI為1至5。
如請求項19至39中任一項之方法，其中該β反轉錄病毒假型為BaEV。
如請求項19至39中任一項之方法，其中該β反轉錄病毒假型為RD114。
如請求項19至41中任一項之方法，其中該病毒載體包含反轉錄病毒科病毒載體骨架。
如請求項42之方法，其中該反轉錄病毒科病毒載體骨架為反轉錄病毒載體骨架。
如請求項43之方法，其中該反轉錄病毒載體骨架為慢病毒骨架。
如請求項43之方法，其中該反轉錄病毒載體骨架為γ反轉錄病毒骨架。
如請求項43之方法，其中該反轉錄病毒載體骨架為α反轉錄病毒骨架。
如請求項19至46中任一項之方法，其中該等經工程改造之γδ T細胞為Vδ1 T細胞。
如請求項19至46中任一項之方法，其中該等經工程改造之γδ T細胞為Vδ2 T細胞。
如請求項19至46中任一項之方法，其中該等經工程改造之γδ T細胞為非Vδ1/Vδ2 T細胞。
如請求項19至49中任一項之方法，其中該病毒載體包含轉殖基因。
如請求項50之方法，其中該轉殖基因編碼細胞表面受體。
如請求項51之方法，其中該細胞表面受體為CAR。
如請求項52之方法，其中該CAR靶向CD19、CD20、ROR1、CD22、癌胚抗原、α胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮腫瘤抗原、***特異性抗原、黑素瘤相關抗原、突變的p53、突變的ras、HER2/Neu、葉酸結合蛋白、HIV-1包膜醣蛋白gpl20、HIV-1包膜醣蛋白gp41、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、間皮素、GD3、HERV-K、IL-llRα、κ鏈、λ鏈、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII、VEGFR2、組合HER2-HER3、組合HER1-HER2、NY-ESO-1、SSX2、MAGE、MART-1、gp100、PSA、PSMA、PSCA、g9d2、或其組合。
如請求項50至53中任一項之方法，其中該轉殖基因編碼細胞介素。
如請求項54之方法，其中該細胞介素為分泌的。
如請求項55之方法，其中該細胞介素為膜結合的。
如請求項54至56中任一項之方法，其中該細胞介素為IL-15。
一種產生表現CAR之γδ T細胞群的方法，該方法包含用病毒載體來轉導γδ T細胞群，該病毒載體包含： (i) 編碼該CAR之轉殖基因； (ii) β反轉錄病毒假型；及 (iii) 反轉錄病毒科病毒載體骨架。
一種產生表現CAR及裝甲蛋白之γδ T細胞群的方法，該方法包含用病毒載體來轉導γδ T細胞群，該病毒載體包含： (i) 編碼該CAR之第一轉殖基因； (ii) 編碼該裝甲蛋白之第二轉殖基因； (iii) β反轉錄病毒假型；及 (iv) 反轉錄病毒科病毒載體骨架。
如請求項59之方法，其中該裝甲蛋白為細胞介素。
如請求項60之方法，其中該細胞介素為分泌的。
如請求項61之方法，其中該細胞介素為膜結合的。
如請求項60至62中任一項之方法，其中該細胞介素為IL-15。
如請求項58至63中任一項之方法，其中該β反轉錄病毒假型為BaEV。
如請求項58至63中任一項之方法，其中該β反轉錄病毒假型為RD114。
如請求項58至65中任一項之方法，其中該反轉錄病毒科病毒載體骨架為反轉錄病毒載體骨架。
如請求項66之方法，其中該反轉錄病毒載體骨架為慢病毒骨架。
如請求項66之方法，其中該反轉錄病毒載體骨架為γ反轉錄病毒骨架。
如請求項66之方法，其中該反轉錄病毒載體骨架為α反轉錄病毒骨架。
如請求項58至69中任一項之方法，其中該等γδ T細胞為Vδ1 T細胞。
如請求項58至69中任一項之方法，其中該等γδ T細胞為Vδ2 T細胞。
如請求項58至69中任一項之方法，其中該等γδ T細胞為非Vδ1/Vδ2 T細胞。
一種產生表現CAR之γδ T細胞群的方法，該方法包含： (i) 提供起始γδ T細胞群； (ii) 在不存在病毒載體的情況下，培養該起始γδ T細胞群持續第一培養期以產生經預敏化之γδ T細胞群；及 (iii) 在包含β反轉錄病毒假型及編碼該CAR之轉殖基因的病毒載體存在下，培養該經預敏化之γδ T細胞群持續第二培養期，其中該病毒載體係以有效轉導至少3%之該等經預敏化之γδ T細胞之量，由此產生表現該CAR之該γδ T細胞群。
一種產生表現CAR及裝甲蛋白之γδ T細胞群的方法，該方法包含： (i) 提供起始γδ T細胞群； (ii) 在不存在病毒載體的情況下，培養該起始γδ T細胞群持續第一培養期以產生經預敏化之γδ T細胞群；及 (iii) 在包含β反轉錄病毒假型、編碼該CAR之第一轉殖基因、及編碼該裝甲蛋白之第二轉殖基因的病毒載體存在下，培養該經預敏化之γδ T細胞群持續第二培養期，其中該病毒載體係以有效轉導至少3%之該等經預敏化之γδ T細胞之量，由此產生表現該CAR及該裝甲蛋白之該γδ T細胞群。
如請求項74之方法，其中該裝甲蛋白為細胞介素。
如請求項75之方法，其中該細胞介素為分泌的。
如請求項75之方法，其中該細胞介素為膜結合的。
如請求項74至77中任一項之方法，其中該細胞介素為IL-15。
如請求項73至78中任一項之方法，其中該第一培養期為7天或更長時間。
如請求項79之方法，其中該第一培養期為10天或更長時間。
如請求項73至80中任一項之方法，其中該第二培養期為7天或更長時間。
如請求項81之方法，其中該第二培養期為14天或更長時間。
如請求項73至82中任一項之方法，其中該經預敏化之γδ T細胞群表現ASCT-1及/或ASCT-2。
如請求項78至83中任一項之方法，其中該經預敏化之γδ T細胞群缺少VSV-G進入受體之功能性表現。
如請求項73至84中任一項之方法，其中該病毒載體係以有效轉導至少20%之該等經預敏化之γδ T細胞之量。
如請求項73至85中任一項之方法，其中該病毒載體以不大於10之MOI與該等經預敏化之γδ T細胞一起培養。
如請求項86之方法，其中該MOI不大於5。
如請求項87之方法，其中該MOI為1至5。
一種產生表現CAR之γδ T細胞群的方法，該方法包含： (i) 提供起始γδ T細胞群；及 (ii) 在IL-15及包含β反轉錄病毒假型及編碼該CAR之轉殖基因的病毒載體存在下，培養該起始γδ T細胞群，其中該病毒載體係以有效轉導至少3%之該起始γδ T細胞群之量，由此產生表現該CAR之經工程改造之γδ T細胞群。
一種產生表現CAR及裝甲蛋白之γδ T細胞群的方法，該方法包含： (i) 提供起始γδ T細胞群；及 (ii) 在IL-15及包含β反轉錄病毒假型、編碼該CAR之第一轉殖基因、及編碼該裝甲蛋白之第二轉殖基因的病毒載體存在下，培養該起始γδ T細胞群，其中該病毒載體係以有效轉導至少3%之該起始γδ T細胞群之量，由此產生表現該CAR及該裝甲蛋白之經工程改造之γδ T細胞群。
如請求項90之方法，其中該裝甲蛋白為細胞介素。
如請求項91之方法，其中該細胞介素為分泌的。
如請求項92之方法，其中該細胞介素為膜結合的。
如請求項91至93中任一項之方法，其中該細胞介素為IL-15。
如請求項89至94中任一項之方法，其中該起始γδ T細胞群缺少ASCT-1或ASCT-2之表現。
如請求項95之方法，其中該起始γδ T細胞群缺少ASCT-1或ASCT-2之表現。
如請求項89至96之方法，其中該經工程改造之γδ T細胞群表現ASCT-1及/或ASCT-2。
如請求項89至97中任一項之方法，其中該起始γδ T細胞群缺少VSV-G進入受體之功能性表現。
如請求項98之方法，其中該VSV-G進入受體為LDL受體。
如請求項89至99中任一項之方法，其中該病毒載體以不大於10之MOI與該起始γδ T細胞群一起培養。
如請求項100之方法，其中該MOI不大於5。
如請求項101之方法，其中該MOI為1至5。
如請求項73至102中任一項之方法，其中該β反轉錄病毒假型為BaEV
如請求項73至102中任一項之方法，其中該β反轉錄病毒假型為RD114。
如請求項73至104中任一項之方法，其中該病毒載體包含反轉錄病毒科病毒載體骨架。
如請求項105之方法，其中該反轉錄病毒科病毒載體骨架為反轉錄病毒載體骨架。
如請求項106之方法，其中該反轉錄病毒載體骨架為慢病毒骨架。
如請求項106之方法，其中該反轉錄病毒載體骨架為γ反轉錄病毒骨架。
如請求項106之方法，其中該反轉錄病毒載體骨架為α反轉錄病毒骨架。
如請求項73至109中任一項之方法，其中該等經工程改造之γδ T細胞為Vδ1 T細胞。
如請求項73至109中任一項之方法，其中該等經工程改造之γδ T細胞為Vδ2 T細胞。
如請求項73至109中任一項之方法，其中該等經工程改造之γδ T細胞為非Vδ1/Vδ2 T細胞。
如請求項58至112中任一項之方法，其中該CAR靶向CD19、CD20、ROR1、CD22、癌胚抗原、α胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮腫瘤抗原、***特異性抗原、黑素瘤相關抗原、突變的p53、突變的ras、HER2/Neu、葉酸結合蛋白、HIV-1包膜醣蛋白gpl20、HIV-1包膜醣蛋白gp41、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、間皮素、GD3、HERV-K、IL-llRα、κ鏈、λ鏈、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII、VEGFR2、組合HER2-HER3、組合HER1-HER2、NY-ESO-1、SSX2、MAGE、MART-1、gp100、PSA、PSMA、PSCA、g9d2、或其組合。
一種經工程改造之γδ T細胞群，其藉由如請求項1至57中任一項之方法來產生。
如請求項114之經工程改造之γδ T細胞群，其中至少10%之該群體表現CAR。
如請求項115之經工程改造之γδ T細胞群，其中至少10%之該群體表現CAR及裝甲蛋白。
如請求項115或116之經工程改造之γδ T細胞群，其中至少50%之該群體表現該CAR。
如請求項115至117中任一項之經工程改造之γδ T細胞群，其中至少50%之該群體表現該CAR及該裝甲蛋白。
一種表現CAR之γδ T細胞群，其藉由如請求項58至113中任一項之方法來產生。