TW202325855A - 用於合成似升糖素胜肽2(glp-2)類似物的方法 - Google Patents

用於合成似升糖素胜肽2(glp-2)類似物的方法 Download PDF

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Abstract

本發明係有關用於獲得似升糖素胜肽2 (GLP-2)類似物(例如，杰帕魯肽(glepaglutide))的方法。特別是，本文所述之方法使用針對GLP-2類似物的多步驟純化方法，該GLP-2類似物由固相胜肽合成法(SPPS)所合成。

Description

用於合成似升糖素胜肽2(GLP-2)類似物的方法
本發明係有關用於獲得似升糖素胜肽2 (GLP-2)類似物的方法。
人類GLP-2為一具有下列序列之33個胺基酸的胜肽：Hy-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH (SEQ ID NO: 10)，其中Hy為氫。其係由前升糖素(proglucagon)在腸道的腸內分泌L細胞中以及在腦幹的特定區域中之特定轉譯後處理(post-translational processing)衍生而來。GLP-2結合至一屬於第II類升糖素胰泌素家族(class II glucagon secretin family)的單一G蛋白偶聯受體。
GLP-2已被報導會經由隱窩(crypts)中之幹細胞增生的刺激以及藉由絨毛(villi)中之細胞凋亡的抑制而誘導小腸黏膜上皮的顯著生長(Drucker等人，1996，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7911-7916)。GLP-2對結腸亦具有生長效果。此外，GLP-2抑制胃排空及胃酸分泌(Wojdemann等人，1999，J. Clin. Endocrinol. Metab. 84: 2513-2517)，增進腸道障壁功能(Benjamin等人，2000，Gut 47: 112-119)，經由葡萄糖運輸蛋白(glucose transporter)之向上調節而刺激腸道的己糖運輸(Cheeseman，1997，Am. J. Physiol. R1965-71)，以及增加腸道血液流動(Guan等人，2003，Gastroenterology，125: 136-147)。
本領域已認知到，似升糖素胜肽2受體類似物對於腸道疾病的治療具有治療潛力。然而，原始hGLP-2，一種33個胺基酸的胃腸道胜肽，由於其在人體內非常短的半衰期，就全長的GLP-2而言為大約7分鐘[1-33]且就截斷的(truncated) GLP-2而言為大約27分鐘[3-33]，在臨床情境(clinical setting)中沒那麼有用。大部分而言，短的半衰期係由於酵素二肽基肽酶IV (DPP-IV)降解所致。據此，本領域中已嘗試欲開發具有更好的藥物動力學特徵之GLP-2受體促效劑，特別是為了改進GLP-2分子的半衰期。透過範例，已建議了具有取代的GLP-2類似物，諸如，例如在位置2處含有Gly取代的GLP-2類似物([hGly2] GLP-2，替度魯肽(teduglutide))，其將半衰期從7分鐘(原始GLP-2)增至大約2小時。具有脂肪酸鏈之胜肽藥物的醯化亦已證實對於延長全身性循環以及增加酵素安定性而不破壞生物效力而言是有益的。然而，儘管彼等嘗試已改進了GLP-2類似物的藥物動力學，且其等在本領域中有時被描述為「長效的(long acting)」，必須牢記的是，其係與半衰期為數小時而非數分鐘的原始hGLP-2相比較。此從而意謂著GLP-2類似物仍需要每天被投予患者一或多次。
WO 2006/117565描述了GLP-2類似物，其等相較於[hGly 2]GLP-2包含一或多個取代，且其等改進了體內生物活性及/或改進了化學安定性，例如，如體外安定性分析之評估。特別是，所述之GLP-2類似物在野生型GLP-2序列之位置8、16、24及/或28之一或多者處具有取代，選擇性地結合了在位置2處以及位置3、5、7、10及11之一或多者處的進一步取代，及/或胺基酸31至33之一或多者的刪除。彼等取代亦可與添加N端或C端安定化胜肽序列相結合。
在WO 2006/117565揭示之分子中，ZP1848 (亦稱為杰帕魯肽(glepaglutide))已被設計成具有改進的化學安定性及/或生物活性。包括ZP1848及其代謝物(亦即，杰帕魯肽)之GLP-2類似物的劑量方案係描述於WO 2018/229252中。
廣義而言，本發明係涉及用於合成及純化似升糖素胜肽2 (GLP-2)類似物(例如，ZP1848)的改進方法。
據此，本發明係有關用於產生由固相胜肽合成法(SPPS)所合成之似升糖素胜肽2 (GLP-2)類似物的方法，其中GLP-2類似物由下式表示： R 1-His-Gly-Glu-Gly-X5-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-X11-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-IIe-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Z 2-R 2(SEQ ID NO: 11) 其中： R 1為氫、C 1-4烷基(例如，甲基)、乙醯基、甲醯基、苄醯基或三氟乙醯基； X5為Ser或Thr； X11為Ala或Ser； R 2為NH 2或OH；以及 Z 2係不存在或1-6個胺基酸單元之Lys的胜肽序列； 或其醫藥上可接受之鹽或衍生物。
在第一態樣中，本發明提供一種產生由固相胜肽合成法(SPPS)所合成之GLP-2類似物的方法，其包含下列步驟： i) 以粗製的GLP-2類似物填充管柱； ii) 以第一緩衝液系統調整該管柱之pH； 其中步驟ii)包括當胜肽在管柱上時通過胜肽之等電點。
在本發明上下文中，且如圖1所示，在管柱上調整pH之步驟稱為「Pre-RPC1」。在此Pre-RPC1期間，發生O à N醯基轉移。應當理解，當胜肽在管柱上時，發生醯基轉移。換言之，步驟ii)包括當胜肽在管柱上時通過胜肽之等電點，以進行O à N醯基轉移。
更詳細而言，在已發表之方法中，在GLP-2類似物之胜肽切割期間，發生N à O醯基轉移。此類醯基轉移為本領域中所認知，且眾所周知，在後續純化步驟之前，將溶液中胜肽之pH調整至中性並回到酸性條件會減少彼等雜質，以有效進行O à N醯基轉移。
在本發明之前，此pH調整係於溶液中進行。然而，針對本發明之GLP-2類似物，觀察到不需要的沉澱。令人驚訝地，發明人發現，此O à N醯基轉移可在管柱上進行，其避免材料損失及沉澱引起的處理複雜性。
據發明人所知，此一在管柱組成上通過胜肽之等電點為一種新穎的通用方法，且在管柱上而非在溶液中有效進行此「轉化」或「純化」步驟。
換言之，本發明提供一種當GLP-2類似物在管柱上時在GLP-2類似物上進行O à N醯基轉移的方法(Pre-RPC1)。
在此類型之胜肽合成中需要使用磷酸鹽緩衝液，係因已知其能有效移除不需要的寡聚物及C端脫醯胺產物。然而，所主張結構之GLP-2類似物已知會在磷酸鹽緩衝液中沈澱出來，使得磷酸鹽緩衝液的使用在O à N醯基轉移上存在問題。因此，更令人驚訝的是，發明人能使用磷酸鹽緩衝液以避免材料損失。此使用pH調整步驟在管柱上進行醯基轉移提供了進一步之優勢，亦即節省了處理步驟(溶液中個別的pH調整)。
適用地，第一緩衝液系統為磷酸鹽緩衝液系統。換言之，第一緩衝液系統係基於磷酸鹽緩衝液/磷酸。
胜肽之等電點pH(I)可使用本領域中已知之方法計算或可以實驗方式測量。其為分子總電荷為零(中性電荷)或統計平均值為電中性時的pH。
應當理解，在本發明中，此通過等電點構成管柱之pH從酸性pH增加。亦即，當胜肽在管柱上時通過胜肽之等電點可包含將管柱之酸性pH調整至中性pH (pH7)，以及適用地調整至微鹼性(鹼性) pH，例如≥7.2，例如約7.5。
據此，在一些實施例中，用於純化由固相胜肽合成法(SPPS)所合成之GLP-2類似物的方法包含下列步驟： i) 以粗製的GLP-2類似物填充管柱； ii) 以第一緩衝液系統調整管柱之pH； 其中步驟ii)包括依序使用緩衝液將管柱之pH升至大於7.5，接著將管柱之pH降至酸性pH。 [ Pre-RPC1]
酸性pH為pH小於7，例如小於5，例如小於3。
適用地，管柱之pH降至≤2.5，亦即2.5或更小。
適用地，步驟ii)在管柱上實施O à N醯基轉移，並將乙醯化及三氟乙醯化雜質水解。在管柱上進行此方應可防止不需要的沈澱，同時達到所需的化學轉換。
在本文所述之範例中，管柱為C18管柱，儘管本發明不限於此。適用之管柱對本領域技術人員而言將顯而易見。在一些實施例中，管柱為C18管柱。在一些實施例中，管柱為C8管柱。
有利地，可在與後續純化步驟相同的管柱上達到此管柱上的O à N醯基轉移。
本發明進一步提供一種通過四步驟層析純化方法(本文中稱為RPC1-4)而純化由SPPS所合成之GLP-2類似物的方法。如上所述，可在與第一「純化」步驟(RPC1)相同的管柱上進行管柱上的O à N醯基轉移(Pre-RPC1)。或者，四步驟層析純化方法可在由SPPS所合成之GLP-2類似物上進行，其已在溶液中經歷pH調整過程，以進行O à N醯基轉移。
在一些實施例中，本發明可提供一種用於純化由SPPS所合成之GLP-2類似物的五步驟層析純化方法，本方法包含： (1) Pre-RPC1 i) 以GLP-2類似物填充管柱； ii) 以第一緩衝液系統調整管柱之pH； 其中步驟ii)包括依序使用緩衝液將管柱之pH升至大於7.5，接著將管柱之pH降至酸性pH；隨後 (2) RPC1 i) 使用第一緩衝液系統溶析出含有GLP-2類似物的池；隨後 (3) RPC2 i) 以在步驟(2)中獲得的含有GLP-2類似物的池填充管柱；以及 ii) 以第二緩衝液系統洗滌管柱，以溶析出含有GLP-2類似物的池； 其中第二緩衝液系統包括三氟醋酸；隨後 (4) RPC3 i) 以在步驟(3)中獲得的含有GLP-2類似物的池填充管柱；以及 ii) 以第三緩衝液系統洗滌管柱，以溶析出含有GLP-2類似物的池； 其中第三緩衝液系統包括醋酸/醋酸銨；隨後 (5) RPC4 i) 以在步驟(4)中獲得的含有GLP-2類似物的池填充管柱；以及 ii) 以第四緩衝液系統洗滌管柱，以溶析出含有GLP-2類似物的池； 其中第四緩衝液系統包括醋酸/醋酸銨。
應當理解，從任何步驟中獲得的含有GLP-2類似物的池可被直接填充在管柱上以進行下一步驟或可被蒸發濃縮。
在一些實施例中，本方法進一步包含脫鹽步驟，其中將步驟(5)中獲得的GLP-2類似物填充在管柱上，並以包含10 mM AcOH及乙腈之緩衝液系統洗滌。
在進一步之態樣中，本發明係有關一種由固相胜肽合成法(SPPS)合成GLP-2類似物的方法，其中Z 2為1-6個胺基酸單元之Lys的胜肽序列，且其中在合成期間Z 2中之Lys單元之至少一者係以三苯甲基保護基保護。
三苯甲基為： 。
適用地，Z 2為2-6個胺基酸單元之Lys的胜肽序列，且本方法包含下列步驟： i) 將第一個P-Lys(Trt)-OH附接至具有連接子的固態胜肽樹脂； ii) 從Lys(Trt)胺基酸單元移除P基； iii) 將第二個P-Lys(Trt)-OH附接至該附接至具有連接子之固態胜肽樹脂的Lys(Trt)胺基酸單元； iv) 從第二個Lys(Trt)胺基酸單元移除P基； v) 附接後續之胺基酸單元，直至合成出GLP-2類似物； vi) 從固態胜肽樹脂切割GLP-2類似物；以及 vii) 純化GLP-2類似物。 其中每一P為保護基，例如Fmoc。
在SPPS期間採用此Lys(Trt)策略導致消除了存在於Lys(Boc)粗製的產物中附加在 t-Bu尖峰的所有Lys(Boc) → Lys( t-Bu)，包括在相對滯留時間1.1下存在的最有問題者。
在一些實施例中，Z 2為6個胺基酸單元之Lys的胜肽序列，且Lys 39及Lys 38係附接為P-Lys(Trt)-OH。在一些實施例中，Z 2之剩餘的Lys胺基酸單元係附接為P-Lys(Boc)-OH。亦即，在合成期間離胺酸尾端為[K(Boc)] 4[K(Trt)] 2。
令人驚訝地，發明人發現，6個胺基酸單元之Lys中的2個的三苯甲基保護(例如，Lys 39及Lys 38的保護)足以防止從粗製的產物中形成 t‑Bu雜質。不希望受理論束縛，針對Lys 39及Lys 38使用Lys(Trt)的理由係因：i) 在Fmoc/ t-Bu SPPS中使用Lys(Boc)導致形成Lys- t-Bu加合物(Pawlas等人，Peptides，2014，108)；以及ii) PolyPeptide Group未公開的研究發現，最接近C端的Lys(Boc)側鏈(亦即，本文所述胜肽中之Lys 39及Lys 38)係負責形成最接近主尖峰容析出之附加的 t-Bu雜質。發明人觀察到，離C端更遠的Lys(Boc)殘基導致進一步溶析出之+56 Da加合物的形成，且在該意義上於下游處理期間問題較少。因此，基於彼等原因，僅將Lys(Trt)用於該等被理解為與關鍵Lys-t-Bu加合物形成有關的Lys位置是合理的，亦即Lys 38及Lys 39。
現將透過範例且未限制在參照附圖而描述本發明之實施例。然而，鑑於本揭示內容，本發明之各種進一步態樣及實施例對本領域技術人員而言將顯而易見。
本文中使用的「及/或」應被視為兩個指定特徵或組分(有或無另一者)中之每一者的具體揭示。舉例而言，「A及/或B」將被視為(i) A、(ii) B及(iii) A與B之每一者的具體揭示，如同每一者在本文中單獨列出的一般。
除非上下文中另有規定，否則上述特徵之描述及定義不限於本發明之任何特定態樣或實施例，且同樣適用於所述之所有態樣及實施例。
本發明提供用於純化GLP-2類似物的方法。如本文所述，純化步驟(除非另有陳述)在管柱上進行。適用地，管柱為C18管柱。
純化之層析方法為本領域中習知。在一態樣中，本發明係涉及令人驚訝的見解，亦即涉及化學修飾之純化步驟(亦即，醯基轉移)可在管柱上而非溶液中進行。本發明進一步提供一種用於GLP-2類似物的四步驟層析純化過程。如本文所述，此四步驟層析純化過程產生高產率及低雜質水平的GLP-2。
據此，本發明之用於純化GLP-2類似物的方法適用地包含一系列基於管柱的方法。彼等方法包含以含有GLP-2類似物之溶液填充管柱的步驟，接著以緩衝液系統洗滌及溶析，在每一情況下獲得包含GLP-2類似物的池。每一洗滌過程包含超過一個步驟。應當理解，如同層析純化之正常情況，改變溶析液(緩衝液)係典型上藉由施加梯度而達成。
在一些實施例中，用於純化由固相胜肽合成法(SPPS)所合成之GLP-2類似物的方法包含下列步驟： i) 以GLP-2類似物填充管柱； ii) 藉由以第一緩衝液系統洗滌而調整管柱之pH； 其中第一緩衝液系統包含： 緩衝液A：0.1% H 3PO 4； 緩衝液B：MeCN； 緩衝液C：45mM H 3PO 4pH 2.2 + 100mM NaCl；以及 緩衝液D：45mM H 3PO 4pH 7.5-8.0 + 100mM NaCl； 其中管柱以95%緩衝液C及5%緩衝液B之混合物預平衡； 且其中以下列順序進行洗滌： 步驟1：95%緩衝液C及5%緩衝液B之混合物； 步驟2：95%緩衝液D及5%緩衝液B之混合物，直至pH大於7.5； 步驟3：95%緩衝液C及5%緩衝液B之混合物，直至pH小於2.5。
步驟1為均衡或平衡管柱，其在基於管柱之純化中為常規。
步驟2及3在本文中可稱為「Pre-RPC1」。如本文所述，有利的是，在Pre-RPC1中之pH調整會影響常規上在溶液中進行的O à N醯基轉移，以移除合成期間由不需要的N à O醯基轉移產生的雜質。
在步驟3後，管柱可由含有93% A及7% B之溶液洗滌。適用地，洗滌進一步包含： 步驟4：將緩衝液B之含量從7%線性增至22% (緩衝液A從93%至78%)，適用地超過12個管柱體積；以及 步驟5：22%緩衝液B及78%緩衝液A之混合物，適用地直至完成溶析，以獲得含有GLP-2類似物的池。
步驟4及5皆為GLP-2類似物之溶析，且在本文中稱為「RPC1」或胜肽之「第一尺寸」層析純化。此純化為胜肽及雜質與管柱介質及溶析介質之間交互作用差異的結果。
在一些實施例中，用於純化由固相胜肽合成法(SPPS)所合成之GLP-2類似物的方法進一步包含下列步驟： iii) 以在步驟ii)中獲得的含有GLP-2類似物的池填充管柱；以及 iv) 以第二緩衝液系統洗滌管柱； 其中第二緩衝液系統2包含： 緩衝液A：0.1% TFA；以及 緩衝液B：MeCN； 其中管柱以90%緩衝液A及10%緩衝液B之混合物預平衡； 且其中以下列順序進行洗滌： 步驟1：90%緩衝液A及10%緩衝液B之混合物； 步驟2：將緩衝液B之含量從10%線性增至19% (緩衝液A從90%至81%)，適用地超過1個管柱體積；以及 步驟3：將緩衝液B之含量從19%線性增至30% (緩衝液A從81%至70%)，適用地超過12個管柱體積，接著繼續洗滌管柱，以溶析出含有GLP-2類似物的池。
步驟iii)及iv) 在本文中可稱為「RPC2」或「第二尺寸」。
在一些實施例中，用於純化由固相胜肽合成法(SPPS)所合成之GLP-2類似物的方法進一步包含下列步驟： v) 以在步驟iv)中獲得的含有GLP-2類似物的池填充管柱；以及 vi) 以第三緩衝液系統洗滌管柱； 其中管柱以85%緩衝液A及15%緩衝液B之混合物預平衡 其中第三緩衝液系統包含： 緩衝液A：100 mM NH 4OAc + 0.5% AcOH；以及 緩衝液B：MeCN； 且其中以下列順序進行洗滌： 步驟1：85%緩衝液A及15%緩衝液B之混合物； 步驟2：將緩衝液B之含量從15%線性增至29% (緩衝液A從85%至71%)，適用地超過1個管柱體積； 步驟3：將緩衝液B之含量從29%線性增至37% (緩衝液A從71%至63%)，適用地超過10個管柱體積；以及 步驟4：30%緩衝液A及70%緩衝液B之混合物，以溶析出含有GLP-2類似物的池。
步驟v)及vi)在本文中可稱為「RPC3」或「第三尺寸」。
在一些實施例中，用於純化由固相胜肽合成法(SPPS)所合成之GLP-2類似物的方法進一步包含下列步驟： vii) 以在步驟vi)中獲得的含有GLP-2類似物的池填充管柱；以及 viii) 以第四緩衝液系統洗滌管柱； 其中第四緩衝液系統包含： 緩衝液A：5 mM NH 4OAc + 0.1% AcOH； 緩衝液B：MeCN；以及 緩衝液C：100 mM NH 4OAc + 0.5% AcOH； 其中管柱以90%緩衝液C及10%緩衝液B之混合物預平衡； 且其中以下列順序進行洗滌： 步驟1：90%緩衝液C及10%緩衝液B之混合物，適用地1個管柱體積； 步驟2：90%緩衝液A及10%緩衝液B之混合物，適用地1個管柱體積； 步驟3：將緩衝液B之含量從10%線性增至13% (緩衝液A從90%至87%)，適用地超過1個管柱體積；以及 步驟4：將緩衝液B之含量從13%線性增至25% (緩衝液A從87%至75%)，適用地超過12個管柱體積，以溶析出含有GLP-2類似物的池。
步驟vii)及viii)在本文中可稱為「RPC4」或「第四尺寸」。
在一些實施例中，用於純化由固相胜肽合成法(SPPS)所合成之GLP-2類似物的方法進一步包含下列步驟： ix) 以在步驟viii)中獲得的含有GLP-2類似物的池填充管柱；以及 x) 以脫鹽緩衝液系統洗滌管柱； 其中脫鹽緩衝液系統包含： 緩衝液A：10 mM AcOH；以及 緩衝液B：MeCN 其中管柱以95% A及5% B之混合物預平衡； 且其中以下列順序進行洗滌： 步驟1：95% A及5% B之混合物；以及 步驟2：將緩衝液B之含量從5%線性增至50% (緩衝液A從95%至50%)，適用地超過1個管柱體積。
步驟ix)及x)可稱為「脫鹽」或「SPE」。
用於純化由固相胜肽合成法(SPPS)所合成之GLP-2類似物的方法可進一步包含冷凍乾燥步驟。
適用地，管柱為C18管柱，儘管本發明不限於此。可使用任何適用的管柱。
在進一步之態樣中，本發明係有關一種由固相胜肽合成法(SPPS)合成GLP-2類似物的方法，其中Z 2為1-6個胺基酸單元之Lys的胜肽序列，且其中在合成期間Z 2中之Lys單元之至少一者係以三苯甲基保護基保護。
在Z 2為1-6個胺基酸單元之Lys的胜肽序列之一些實施例中，由固相胜肽合成法(SPPS)合成GLP-2類似物的方法包含下列步驟： i) 將Fmoc-Lys(Trt)-OH附接至具有連接子的固態胜肽樹脂； ii) 從Lys(Trt)胺基酸單元移除Fmoc基； iii) 附接後續之胺基酸單元，直至合成出GLP-2類似物； iv) 從固態胜肽樹脂切割GLP-2類似物；以及 v) 純化GLP-2類似物。
在Z 2為2-6個胺基酸單元之Lys的胜肽序列之一些實施例中，合成GLP-2類似物的方法包含下列步驟： i) 將第一個Fmoc-Lys(Trt)-OH附接至具有連接子的固態胜肽樹脂； ii) 從Lys(Trt)胺基酸單元移除Fmoc基； iii) 將第二個Fmoc-Lys(Trt)-OH附接至該附接至具有連接子之固態胜肽樹脂的Lys(Trt)胺基酸單元； iv) 從第二個Lys(Trt)胺基酸單元移除Fmoc基； v) 附接後續之胺基酸單元，直至合成出GLP-2類似物； vi) 從固態胜肽樹脂切割GLP-2類似物；以及 vii) 純化GLP-2類似物。
其中Z 2為6個胺基酸單元之Lys的胜肽序列，該模體從而可為[K(Boc)] 4[K(Trt)] 2。在其他實施例中，該模體可為[K(Boc)] 4[K(Trt)] 2、[K(Boc)] 3[K(Trt)] 3、[K(Boc)] 2[K(Trt)] 4、[K(Boc)] 1[K(Trt)] 5或[K(Trt)] 6。亦即，在(v)中附接後續之Lys胺基酸單元的步驟可以Trt或Boc進行保護。
在一些實施例中，該模體為[K(Boc)] 4[K(Trt)] 2或[K(Trt)] 6。在一些實施例中，該模體為[K(Boc)] 4[K(Trt)] 2。 定義
除非另有指明，否則針對特定術語提供下列定義，其等用於上述書面描述中。
在整個說明書及申請專利範圍中，使用天然胺基酸的常規單字母及三字母代碼。本發明胜肽中之所有胺基酸殘基較佳為L-組態。 GLP-2類似物
本發明之似升糖素胜肽2 (GLP-2)類似物係以下式表示： R 1-Z 1-His-Gly-Glu-Gly-X5-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-X11-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-IIe-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Z 2-R 2其中： R 1為氫、C 1-4烷基(例如，甲基)、乙醯基、甲醯基、苄醯基或三氟乙醯基； X5為Ser或Thr； X11為Ala或Ser； R 2為NH 2或OH；以及 Z 1及Z 2係獨立地不存在或1-6個胺基酸單元之Lys的胜肽序列； 或其醫藥上可接受之鹽或衍生物。
Z 1及Z 2係獨立地存在及/或不存在或1-6個胺基酸單元之Lys (亦即，1、2、3、4、5或6個Lys殘基)的胜肽序列。Lys殘基可具有D-或L-組態，但較佳為具有L-組態。特別較佳之序列Z為四、五或六個連續離胺酸殘基且特別是六個連續離胺酸殘基的序列。示例性序列Z係顯示於WO 01/04156中。
在一些實施例中，R 1為氫。在一些實施例中，X5為Thr。在一些實施例中，X11為Ala。在一些實施例中，R 2為NH 2。
在一些實施例中，Z 1係不存在。
在一些實施例中，Z 2為1-6個胺基酸單元之Lys的胜肽序列。在一些實施例中，Z 2為2-6個胺基酸單元之Lys的胜肽序列。在一些實施例中，Z 2為3-6個胺基酸單元之Lys的胜肽序列。在一些實施例中，Z 2為4-6個胺基酸單元之Lys的胜肽序列。在一些實施例中，Z 2為5-6個胺基酸單元之Lys的胜肽序列。在一些實施例中，Z 2為6個胺基酸單元之Lys的胜肽序列。在一些實施例中，Z 2為1-2個胺基酸單元之Lys的胜肽序列。
在一些實施例中，本發明之似升糖素胜肽2 (GLP-2)類似物係以下式表示： R 1-His-Gly-Glu-Gly-X5-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-X11-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-IIe-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Z 2-R 2其中： R 1為氫、C 1-4烷基(例如，甲基)、乙醯基、甲醯基、苄醯基或三氟乙醯基； X5為Ser或Thr； X11為Ala或Ser； R 2為NH 2或OH； 以及 Z 2係不存在或1-6個胺基酸單元之Lys的胜肽序列； 或其醫藥上可接受之鹽或衍生物。
在一些實施例中，Z 2為1-6個胺基酸單元之Lys的胜肽序列。
在本發明之一些實施例中，在上式中，X5為Thr及/或X11為Ala。彼等似升糖素胜肽2 (GLP-2)類似物之範例包括下列： ZP1848  H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH 2(SEQ ID NO: 1) ZP2949  H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKKK-OH (SEQ ID NO: 2)； ZP2711  H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKK-OH (SEQ ID NO: 3)； ZP2469  H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDK-OH (SEQ ID NO: 4)； ZP1857  H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH 2(SEQ ID NO: 5)；或 ZP2530  H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-OH (SEQ ID NO: 6)。
在本發明之一些實施例中，似升糖素胜肽2 (GLP-2)類似物為ZP1848  H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH 2(SEQ ID NO: 1)。
亦即，GLP-2類似物由下式表示： H-His 1-Gly 2-Glu 3-Gly 4-Thr 5-Phe 6-Ser 7-Ser 8-Glu 9-Leu 10-Ala 11-Thr 12-Ile 13-Leu 14-Asp 15-Ala 16-Leu 17-Ala 18-Ala 19-Arg 20-Asp 21-Phe 22-Ile 23-Ala 24-Trp 25-Leu 26-Ile 27-Ala 28-Thr 29-Lys 30-Ile 31-Thr 32-Asp 33-Lys 34-Lys 35-Lys 36-Lys 37-Lys 38-Lys 39-NH 2。
在本發明之一些實施例中，在上式中，X5為Ser及/或X11為Ser。似升糖素胜肽2 (GLP-2)類似物之範例包括下列： ZP1846  H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH 2(SEQ ID NO: 7)； ZP1855  H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH 2(SEQ ID NO: 8)；或 ZP2242  H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK-OH (SEQ ID NO: 9)。
在本發明之一實施例中，似升糖素胜肽2 (GLP-2)類似物為ZP1846  H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH 2(SEQ ID NO: 7)。
亦即，GLP-2類似物由下式表示： H-His 1-Gly 2-Glu 3-Gly 4-Ser 5-Phe 6-Ser 7-Ser 8-Glu 9-Leu 10-Ser 11-Thr 12-Ile 13-Leu 14-Asp 15-Ala 16-Leu 17-Ala 18-Ala 19-Arg 20-Asp 21-Phe 22-Ile 23-Ala 24-Trp 25-Leu 26-Ile 27-Ala 28-Thr 29-Lys 30-Ile 31-Thr 32-Asp 33-Lys 34-Lys 35-Lys 36-Lys 37-Lys 38-Lys 39-NH 2。
在一些實施例中，GLP-類似物係選自於下列： ZP1848  H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH 2(SEQ ID NO: 1) ZP2949  H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKKK-OH (SEQ ID NO: 2)； ZP2711  H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKK-OH (SEQ ID NO: 3)； ZP2469  H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDK-OH (SEQ ID NO: 4)； ZP1846  H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH 2 (SEQ ID NO: 7)； ZP1855  H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH 2(SEQ ID NO: 8)；或 ZP2242  H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK-OH (SEQ ID NO: 9)。
本發明涉及製造及純化GLP2類似物的方法。彼等胜肽旨在用作藥物物質。本發明包括藉由本發明方法獲得的GLP類似物。
應當理解，本發明之胜肽(藥物物質)可以鹽或其他衍生物之形式提供。據此，將理解到，在純化及選擇性之進一步步驟後，最終可獲得作為鹽或其他衍生物的胜肽。鹽包括醫藥上可接受之鹽，例如酸加成鹽及鹼性鹽。酸加成鹽之範例包括鹽酸鹽、檸檬酸鹽、氯化物鹽及醋酸鹽。較佳地，該鹽為醋酸鹽。一般而言，較佳為，該鹽不為氯化物鹽。鹼性鹽之範例包括其中陽離子係選自於鹼金屬(例如，鈉及鉀)、鹼土金屬(例如，鈣)及銨離子 +N (R 3) 3(R 4)(其中R 3及R 4獨立地表示選擇性地經取代之C 1-6-烷基、選擇性地經取代之C 2-6-烯基、選擇性地經取代之芳基或選擇性地經取代之雜芳基)的鹽。醫藥上可接受之鹽的其他範例係描述於「Remington’s Pharmaceutical Sciences」，第 17 版，Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.)，Mark Publishing Company，Easton，PA，U.S.A.，1985及更新版本，以及Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology中。
較佳地，該鹽為醋酸鹽，其可遵照本文所述之步驟RPC1-RPC4及後續之脫鹽而獲得。
在較佳之實施例中，本發明GLP-2類似物之醋酸鹽係選自於由ZP1848-醋酸鹽、ZP2949-醋酸鹽、ZP2711-醋酸鹽、ZP2469-醋酸鹽、ZP1857-醋酸鹽、ZP2530-醋酸鹽、ZP1846-醋酸鹽、ZP1855-醋酸鹽及ZP2242-醋酸鹽組成之群組。在本發明上下文中，術語「ZP1848-醋酸鹽」意指呈醋酸鹽形式之ZP1848分子。GLP-2類似物之醋酸鹽可以化學式(GLP-2類似物), x(CH 3COOH)表示，其中x為1.0至8.0，亦即，其中x為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0或8.0。在GLP-2類似物之醋酸鹽的任何組成物中，可能會有具有不同數量之醋酸鹽分子的分子，因此x不一定為整數。在一些情況下，x為4.0至8.0、x為6.0至8.0，或x為4.0至6.5。在一些情況下，x為4.0至6.0、x為2.0至7.0、x為3.0至6.0、x為4.0至6.0，或x為4.0至8.0。如本發明所定義之GLP-2類似物之醋酸鹽的進一步討論可在WO2020/265064中找到，其之揭示內容通過引用併入本文中。
在一較佳之實施例中，GLP-2類似物係最終作為ZP1848-醋酸鹽或H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH 2醋酸鹽(SEQ ID NO: 1)或(H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH 2), x(CH 3COOH)(其中x為1.0至8.0)獲得。
藉由例如冷凍乾燥，可獲得包含似升糖素胜肽2 (GLP-2)類似物之醋酸鹽的固體組成物。固體組成物適合與用於製造液體製劑之賦形劑一起配製。舉例而言，可獲得具有下式之包含似升糖素胜肽2 (GLP-2)類似物之醋酸鹽的固體組成物： (H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2), x(CH 3COOH)，其中x為1.0至8.0。
每一GLP-2類似物8.0個醋酸鹽分子的上限等於醋酸鹽含量為小於11%的醋酸鹽，且可配製成在25°C下所測量的黏度介於0.8與2.0 mPa/sec之間。
與每一GLP-2類似物分子相關聯之醋酸鹽分子的數量範圍定義了此製劑組分的分子量範圍。舉例而言，針對ZP1848之醋酸鹽，與每一GLP-2類似物分子相關聯之醋酸鹽分子的數量範圍定義了ZP1848-醋酸鹽的分子量範圍。透過範例，1個醋酸鹽當量與每一ZP1848分子提供的分子量 = 4316 + 60 = 4376 Da。據此，增加之醋酸鹽當量與ZP1848的分子量如下：1個醋酸鹽當量 = 4376 Da；2個醋酸鹽當量 = 4436 Da；3個醋酸鹽當量 = 4496 Da；4個醋酸鹽當量 =4556 Da；5個醋酸鹽當量 = 4616 Da；6個醋酸鹽當量 = 4676 Da；7個醋酸鹽當量 = 4736 Da以及8個醋酸鹽當量 = 4796 Da。此反過來將分子量範圍定義如下：1-8個醋酸鹽當量 = 4376 Da - 4796 Da；4-8個醋酸鹽當量 = 4556 Da - 4796 Da，以及6-8個醋酸鹽當量 = 4676 Da - 4796 Da。如本發明所定義之GLP-2類似物的醋酸鹽之進一步討論可在 WO2020/265064中找到，其之揭示內容通過引用併入本文中。
本發明之GLP-2類似物的其他衍生物包括與金屬離子(例如，Mn 2+及Zn 2+)之配位錯合物、酯(例如，體內可水解之酯)、游離酸或鹼、水合物或脂質。使用本領域中熟習之技術，可在化合物中存在的羥基或羧酸基與適當的羧酸或醇反應伴侶之間形成酯。 醫療條件
本發明之GLP-2類似物製劑可用作醫藥試劑，如WO2020/065064之第26頁(「醫療條件」)中所述，其內容通過引用整體併入。 範例 材料及方法
始終使用本領域中已知之製造治療性胜肽的良好生產規範(GMP)的標準設備及原料。 範例 1 ：一般胜肽合成 1.1 Ramage- 連接子之附接及經由亞化學計量下填 (downloading) 的第一下填步驟
將DEG AM-樹脂(6.18 kg，4.20莫耳，1.0當量，0.68 mmol/g)添加至反應器中。隨後，添加DMF (25L，50-58°C)。在攪拌＞ 20分鐘後，將樹脂排空，並將額外的DMF (25L，50-58°C)添加至反應器中，並攪拌混合物。針對樹脂之去質子化，添加哌啶(2.5 L)，並將混合物攪拌15分鐘。添加額外的DMF，並排空反應器。樹脂以DMF分批洗滌一次。隨後，繼續以DMF洗滌，直至洗滌溶液之氯醌測試(Chloranil test)顯示陰性(表明洗滌溶液中不存在哌啶)。最終，樹脂以DMF分批洗滌一次。
在50-58°C下將Fmoc-Ramage-OH連接子及Oxyma (各0.9當量，3.78莫耳)溶解於DMF (8L)中。將溶液添加至含有去質子化樹脂的反應器中。添加額外的DMF (17 L)。隨後，將分成四部分的DIC (2.25當量)以5分鐘之間隔添加至反應器中，總添加時間為15分鐘，同時將溫度保持在50-58°C下。前三個部分各含有13%的DIC總添加量，且最後一部分為61%。在添加第一部分的DIC後，將混合物攪拌總時間45分鐘。隨後，添加額外的DMF，並將反應器排空。最終，樹脂以DMF分批洗滌兩次。
在50-58°C下將AcOH及Oxyma (各2當量，8.40莫耳)溶解於8 L之DMF中，並添加至反應器中。添加額外的DMF (17 L)，接著在攪拌下以3分鐘之間隔添加分成四部分的DIC (5.0當量)，總時間為9分鐘；其他用於偶聯連接子之條件如上述。在添加最後一部分DIC後，將反應混合物攪拌6分鐘。添加額外的DMF，並將反應器排空。最終，樹脂以DMF分批洗滌一次。 1.2 Fmoc-Lys 39(Trt)-OH 之附接及經由 競爭性加帽 (co-capping) 的第二下填步驟
在攪拌下將DMF (25L，50-58°C)添加至由先前步驟獲得的樹脂中。隨後，將哌啶(2.5 L)添加至反應器中，並將混合物攪拌20分鐘。將反應器排空。添加相同量的DMF，並以哌啶重複處理。隨後，添加額外的DMF，並將反應器排空。樹脂以DMF分批洗滌一次。隨後，繼續以DMF洗滌，直至氯醌測試得到陰性。隨後，樹脂以DMF進行分批洗滌一次。
在50-58°C下將Fmoc-Lys 39(Trt)-OH及Oxyma (各1.5當量，6.30莫耳)溶解於8 L之DMF中，並添加至含有去保護樹脂之反應器中。將額外的DMF (17 L)及AcOH (2.70當量，11.34莫耳)添加至反應器中。隨後，在攪拌下以四個5分鐘之間隔添加分成四部分的DIC (3.75當量)，同時將溫度保持在50-58°C下。前三個部分各含有13%的DIC總添加量，且最後一部分為61%。在添加最後一部分DIC後，將混合物攪拌30分鐘(總攪拌時間為45分鐘)。藉由凱斯測試(Kaiser test)檢查偶聯(陰性測試結果表明樹脂上沒有游離的胺基)，並將額外的DMF添加至反應器中。隨後，將反應器排空，且樹脂以DMF分批洗滌一次並排空。 1.3 Fmoc-Lys 38(Trt)-OH 、 Fmoc-Lys 37(Boc)-OH 、 Fmoc-Lys 36(Boc)-OH 、 Fmoc-Lys 35(Boc)-OH 、 Fmoc-Lys 34(Boc)-OH 之附接
在攪拌下將DMF (25L，53°C)添加至由先前步驟獲得的樹脂中。隨後，將哌啶(625 ml)添加至反應器中，並將混合物攪拌10分鐘。之後，添加哌啶(1875 ml)，並將混合物攪拌10分鐘。隨後，將反應器排空。包含以哌啶進行去保護之步驟係重複兩次。在最後一次去保護步驟後，以DMF稀釋混合物。隨後，將反應器排空，且樹脂以DMF分批洗滌一次。樹脂繼續以DMF洗滌，直至氯醌測試得到陰性。隨後，樹脂以DMF進行分批洗滌一次。
在50-58°C下將Fmoc保護的胺基酸及Oxyma (各2.0當量，4.20莫耳)溶解於DMF (8L)中，並添加至含有去保護之樹脂的反應器中。添加額外的DMF (17 L)，接著分部分添加DIC (5.0當量)，如Ramage-連接子之附接( 範例 1.1)所述。在添加第一個DIC部分後，允許在50-58°C之攪拌下進行偶聯，總時間為35-40分鐘。藉由凱斯測試檢查偶聯。隨後，將樹脂進行加帽，其係藉由將AcOH (2當量，5莫耳)添加至反應中並攪拌兩分鐘。添加額外的DMF，並將反應器排空。最終，樹脂以DMF分批洗滌一次。 1.4 Fmoc-Asp 33(OtBu)-OH 之附接
在攪拌下將DMF (25L，53°C)添加至由先前步驟獲得的樹脂中。隨後，將哌啶(625 ml)添加至反應器中，並將混合物攪拌5分鐘。之後，將哌啶(1875 ml)添加至反應器中，並將混合物攪拌5分鐘。隨後，將反應器排空。重複該兩步驟去保護，但在每次哌啶添加後伴隨10分鐘的攪拌。在以哌啶進行的最後一次去保護步驟後，以DMF稀釋混合物。隨後，將反應器排空，且樹脂以DMF分批洗滌一次。樹脂繼續以DMF洗滌，直至氯醌測試得到陰性。隨後，樹脂以DMF進行分批洗滌一次。
在50-58°C下將Fmoc保護的胺基酸及Oxyma (各2.0當量，4.20莫耳)溶解於DMF (8L)中，並添加至含有去保護之樹脂的反應器中。添加額外的DMF (17 L)。隨後，將DIC (5.0當量)分部分添加至反應器中，如 範例 1.1所述。在添加第一個DIC部分後，允許在50-58°C之攪拌下進行偶聯35-40分鐘。藉由凱斯測試檢查偶聯，且樹脂以AcOH (2當量)進行加帽2分鐘，並以DMF洗滌，如 範例 1.3所述。 1.5 Fmoc-Thr 32(tBu)-OH 、 Fmoc-Thr 29(tBu)-OH 、 Fmoc-Ala 28-OH 、 Fmoc-Leu 26-OH 、 Fmoc-Ile 23-OH 、 Fmoc-Arg 20(Pbf)-OH 之附接
在50-58°C下將Oxyma (711 g)溶解於DMF (8 L)並添加至含有樹脂之反應器中，接著添加DMF (17 L)。藉由將哌啶(625 ml)添加至含有Oxyma/DMF及樹脂之反應器中並將混合物攪拌5分鐘而進行Fmoc去保護。隨後，將哌啶(1875 ml)添加至反應器中，並將混合物攪拌5分鐘。將反應器排空。重複兩步驟去保護。在以哌啶進行的最後一次去保護步驟後，以DMF稀釋混合物。隨後，將反應器排空，且樹脂分批洗滌一次。樹脂繼續以DMF洗滌，直至氯醌測試得到陰性。隨後，樹脂以DMF進行分批洗滌一次。
在50-58°C下將Fmoc保護的胺基酸及Oxyma (各2.0當量，4.20莫耳)溶解於DMF (8L)中，並添加至含有去保護之樹脂的反應器中。添加額外的DMF (17 L)，並將DIC (5.0當量)分部分添加至反應器中，如 範例 1.1所述。在添加第一個DIC部分後，允許混合物在50-58°C之攪拌下反應30分鐘。添加額外的DMF，接著將反應器排空。樹脂以DMF進行分批洗滌一次。
重複偶聯步驟，如上述。不同之處為在添加第一個DIC部分後允許反應進行35-40分鐘。使用各1當量之胺基酸、Oxyma及DIC，將Fmoc-Arg 20(Pbf)-OH偶聯三次。藉由凱斯測試檢查偶聯，且樹脂以AcOH (2當量)進行加帽2分鐘，如 範例 1.3所述。添加額外的DMF，並將反應器排空。最終，樹脂以DMF分批洗滌一次。 1.6 Fmoc-Lys 30(Boc)-OH 之附接
以Oxyma及哌啶處理胜肽樹脂，如 範例 1.4所述，不同之處為在第一次添加哌啶後進行10分鐘的兩步驟去保護及攪拌，以及在第二次添加哌啶後進行19分鐘的兩步驟去保護及攪拌
重複添加Oxyma，且在每次添加哌啶後藉由攪拌樹脂10分鐘進行具有哌啶的兩步驟去保護。添加額外的DMF，接著將反應器排空。樹脂以DMF進行分批洗滌一次。樹脂繼續以DMF洗滌，直至氯醌測試得到陰性。隨後，樹脂以DMF進行分批洗滌一次。
在50-58°C下將Fmoc保護的胺基酸及Oxyma (各2.0當量，4.2莫耳)溶解於DMF (8L)中，並添加至含有去保護之樹脂的反應器中。添加額外的DMF (17 L)。隨後，將DIC (5.0當量)分部分添加至反應器中，如 範例 1.1所述。在添加第一個DIC部分後，允許在50-58°C之攪拌下進行偶聯35-40分鐘。隨後，藉由凱斯測試檢查偶聯，且樹脂以AcOH (2當量)進行加帽2分鐘。添加額外的DMF，並將反應器排空。最終，樹脂以DMF分批洗滌一次。 1.7 Fmoc-Ser 8(tBu)-OH 及 Fmoc-Thr 5(tBu)-OH 之附接
將Oxyma添加至反應器中，如 範例 1.5所述。藉由將哌啶(625 ml)添加至含有Oxyma/DMF及樹脂之反應器中並將混合物攪拌10分鐘而進行Fmoc去保護。隨後，將哌啶(1875 ml)添加至反應器中，並將混合物攪拌10分鐘。將反應器排空。將兩步驟去保護重複兩次。在去保護後，以DMF稀釋混合物。隨後，將反應器排空，且樹脂以DMF分批洗滌一次。樹脂繼續以DMF洗滌，直至氯醌測試得到陰性。隨後，樹脂以DMF進行分批洗滌一次。
在50-58°C下將Fmoc保護的胺基酸及Oxyma (各2.0當量，4.20莫耳)溶解於DMF (8L)中，並添加至含有去保護之樹脂的反應器中。添加額外的DMF (17 L)，並將DIC (5.0當量)分部分添加至反應器中，如 範例 1.1所述。在添加第一個DIC部分後，允許在50-58°C之攪拌下進行偶聯35-40分鐘。藉由凱斯測試檢查偶聯，且樹脂以AcOH (2當量)進行加帽2分鐘。添加額外的DMF，並將反應器排空。最終，樹脂以DMF分批洗滌一次。 1.8 Fmoc-Gly 4-OH 之附接
將Oxyma添加至反應器中，且藉由以哌啶處理而進行Fmoc基之去保護，如 範例 1.7所述，包括施加氯醌測試。
在50-58°C下將Fmoc保護的胺基酸及Oxyma (各2.0當量，4.20莫耳)溶解於DMF (8L)中，並添加至含有去保護之樹脂的反應器中。添加額外的DMF (17 L)，並將DIC (5.0當量)分部分添加至反應器中，如 範例 1.1所述。在添加第一個DIC部分後，以攪拌進行偶聯30分鐘。添加額外的DMF，接著將反應器排空。樹脂以DMF進行分批洗滌一次。
在添加第一個DIC部分後，重複上述偶聯步驟，並允許進行35-40分鐘。隨後，藉由凱斯測試檢查偶聯，且樹脂以AcOH (2當量)進行加帽2分鐘。添加額外的DMF，並將反應器排空。最終，樹脂以DMF分批洗滌一次。 1.9 Boc-His 1(Trt)-Gly 2-OH 之附接
在50-58°C下將Oxyma (711 g)溶解於DMF (8 L)並添加至含有樹脂之反應器中。添加額外的DMF (17 L)。藉由將哌啶(625 ml)添加至含有Oxyma/DMF及樹脂之反應器中並將混合物攪拌5分鐘而進行Fmoc去保護。隨後，將哌啶(1875 ml)添加至反應器中，並將混合物攪拌5分鐘。將反應器排空。
重複添加Oxyma，且在每次添加哌啶後藉由攪拌樹脂10分鐘進行具有哌啶的兩步驟去保護。添加額外的DMF，接著將反應器排空。樹脂以DMF進行分批洗滌一次。樹脂繼續以DMF洗滌，直至氯醌測試得到陰性。隨後，樹脂以DMF進行分批洗滌一次。
在50-58°C下將Boc-His 1(Trt)-Gly 2-OH及Oxyma (各1.5當量，3.15莫耳)溶解於DMF (8L)中，並添加至含有去保護之樹脂的反應器中。添加額外的DMF (17 L)。隨後，將DIC (3.75當量)分部分添加至反應器中，如 範例 1.1所述。在添加第一個DIC部分後，允許在50-58°C之攪拌下進行偶聯60分鐘。隨後，藉由凱斯測試檢查偶聯。將額外的DMF添加至反應器中，並將反應器排空。最終，樹脂以DMF分批洗滌一次。 1.10 其餘胺基酸： Fmoc-Glu 3(OtBu)-OH 、 Fmoc-Phe 6-OH 、 Fmoc-Ser 7(tBu)-OH 、 Fmoc-Glu 9(OtBu)-OH 、 Fmoc-Leu 10-OH 、 Fmoc-Ala 11-OH 、 Fmoc-Thr 12(tBu)-OH 、 Fmoc-Ile 13-OH 、 Fmoc-Leu 14-OH 、 Fmoc-Asp 15(OtBu)-OH 、 Fmoc-Ala 16-OH 、 Fmoc-Leu 17-OH 、 Fmoc-Ala 18-OH 、 Fmoc-Ala 19-OH 、 Fmoc-Asp 21(OtBu)-OH 、 Fmoc-Phe 22-OH 、 Fmoc-Ala 24-OH 、 Fmoc-Trp 25(Boc)-OH 、 Fmoc-Ile 27-OH 、 Fmoc-Ile 31-OH 之附接
進行具有哌啶的Oxyma處理及去保護，如 範例 1.9所述。在去保護後，添加額外的DMF。隨後，將反應器排空。樹脂以DMF進行分批洗滌一次。樹脂繼續以DMF洗滌，直至氯醌測試得到陰性。隨後，樹脂以DMF進行分批洗滌一次。
在50-58°C下將Fmoc胺基酸及Oxyma (各2.0當量，4.20莫耳)溶解於DMF (8L)中，並添加至含有去保護之樹脂的反應器中。將額外的DMF (17 L)添加至反應器中，並添加DIC (5.0當量)，如 範例 1.1所述。在添加第一個DIC部分後，允許在50-58°C之攪拌下進行偶聯35-40分鐘。隨後，藉由凱斯測試檢查偶聯，且樹脂以AcOH (2當量)進行加帽2分鐘。添加額外的DMF，並將反應器排空。最終，樹脂以DMF分批洗滌一次。 1.11 從樹脂上去保護及切割胜肽
在合成完成後，經保護之胜肽樹脂以DMF分批洗滌三次、在50-58°C下以DMF洗滌兩次，並在室溫下以DMF洗滌一次。隨後，胜肽樹脂以異丙醇洗滌5次。胜肽樹脂最終在25-35°C下乾燥，並在2-8°C下儲存。
將TFA (68.1 kg)、DTT (1.75 L)、TIS (1.25 L)及水(1.25 L)添加至反應器中。將如 範例 1.1-1.10所述而製備之胜肽樹脂(10 kg對應於0.8莫耳)添加至溶液中。將獲得的混合物在25°C下攪拌135分鐘。隨後，將溫度降至低於0°C，並將冷的(＜ 0°C) MTBE (150 L)緩慢添加至反應器中。在添加MTBE期間，溫度保持在＜ 10°C，同時從沈澱的樹脂上切割胜肽。在完全沈澱後，混合物在＜ 10°C下攪拌45±15分鐘。隨後，將混合物過濾，並以MTBE洗滌兩次，且以含有MTBE (3體積)及乙腈(1體積)之混合物的溶液洗滌一次。在過濾後，將獲得的濾餅進行真空乾燥1-3小時。 1.12 Pre RPC1 (O à N 醯基轉移 )
常規上，O à N醯基轉移使用下列程序在溶液中進行。將含有AcOH/MeCN/H 2O + 1% NH 4OAc (w/w)(10%/50%/40%)之溶液添加至乾燥樹脂中。將混合物攪拌過夜。隨後，將混合物過濾，並以相同溶液洗滌濾餅。將含有粗製胜肽(最大3600 g，相當於約0.8莫耳的胜肽)之兩次切割的合併濾液儲存在5°C下。
根據本發明之方法，在管柱上進行如本文所述之O à N醯基轉移，特別是在範例3中。 1.13 純化 RPC1 ( 第一尺寸 )
在RPC1中使用的緩衝液： ‧ 緩衝液A：0.1% H 3PO 4‧ 緩衝液B：MeCN ‧ 緩衝液C：45 mM H 3PO 4，pH 2.2 + 100 mM NaCl ‧ 緩衝液D：45 mM H 3PO 4，pH 7.7-8.0 + 100 mM NaCl
將來自去保護及切割步驟之溶液以0.2 M醋酸銨水溶液稀釋至其體積的5倍。將溶液過濾，並將最大15 g/L之管柱體積施加至以C18矽膠裝填的管柱(管柱尺寸：45x(50-45 cm))，該管柱以含有95% C及5% B之溶液進行預平衡。在施加胜肽溶液後，以平衡溶液洗滌管柱，接著以含有95% D及5% B之溶液洗滌，直至溶析液之pH為＞ 7.5為止。在溶析前，以含有95% C及5% B之溶液洗滌管柱，直至pH為＜ 2.5。(Pre-RPC1.)
隨後，以含有93% A及7% B之溶液洗滌管柱。藉由施加梯度而溶析出所吸附的胜肽：流動相在12個管柱體積內從7% B (93% A)變為22% B (78% A)。梯度保持在22% B (78% A)，之後以22% B等度溶析，直至溶析尖峰之UV達到40-45%。在280 nm下監控溶析，並藉由RP-HPLC分析所收集的分液。重複此過程以純化來自去保護及切割步驟之剩餘的池，並匯集顯示胜肽純度＞ 85%的分液。在以水將合併的分液稀釋至其體積的兩倍之後，藉由在C18管柱上施加最大15 g/L之管柱體積，將顯示純度＞ 55%及＜ 85%之分液進行重新層析。在藉由施加梯度而溶析出主尖峰之前，收集來自初步運行的分液：流動相在1個管柱體積期間從10% B (90% A)變為14% B (86% A)，接著在9個管柱體積內從14% B (86% A)變為23% B (77% A)，之後以23% B (77% A)等度溶析，直至溶析尖峰之UV達到95%。
在藉由施加梯度而溶析出主尖峰之後，收集來自初步運行的分液：流動相在1個管柱體積期間從10% B (90% A)變為14% B (86% A)，接著在9個管柱體積內從14% B (86% A)變為22% B (78% A)，之後以22% B (78% A)等度溶析，直至溶析尖峰之UV達到90%。將重新層析後純度＞ 85%之分液與主池混合，產生RPC1的最終池。因此，針對3.6 kg粗製胜肽之純化，所述過程包括三個主要運行，以及一個前面及一個後面重新運行，產生最終的RPC1池。 1.14 純化 RPC2 ( 第二尺寸 )
在RPC2中使用的緩衝液： ‧ 緩衝液A：0.1% TFA ‧ 緩衝液B：MeCN
將來自RPC1之最終池以水稀釋至其體積的兩倍，並將最大13 g/L之管柱體積施加至以C18矽膠裝填的RPC管柱(管柱尺寸：45x(50-45 cm))，該管柱以含有90% A及10% B之溶液進行預平衡。在施加胜肽後，以五個管柱體積的平衡溶液洗滌管柱。以梯度溶析出所吸附的胜肽：流動相在1個管柱體積期間從10% B (90% A)變為19% B (81% A)，接著在12個管柱體積期間從19% B (81% A)變為30% B (70% A)。之後，等度溶析，直至溶析尖峰之UV達到其最大值之40-45%。隨後，梯度變為60% B (40% A)，並保持此值，直至所有胜肽被溶析出。在280 nm下監控溶析，並藉由RP-HPLC分析所收集的分液。重複此過程以純化來自RPC1之剩餘的池，並匯集顯示純度＞ 92的分液及雜質des-Ile 27-Ala 28＜ 0.5%。在以水稀釋後，收集在主尖峰之前顯示純度＞ 50%及＜ 92%及/或雜質 des-Ile 27-Ala 28＞ 0.5%及＜ 1.5%的分液，並收集在主尖峰之後的分液，其顯示純度＞ 50%及＜ 92%，藉由在C18管柱上施加最大20 g/L之管柱體積而進行重新層析，並藉由施加梯度而溶析：流動相在1個管柱體積期間從10% B (90% A)變為20% B (80% A)，接著在9個管柱體積內從20% B (80% A)變為30% B (70% A)，之後以30% B (70% A)等度溶析，直至溶析尖峰之UV達到45%。
將重新層析後獲得的純度＞ 92%雜質及des-Ile 27-Ala 28＜ 0.5%的分液與主池混合，產生RPC2的最終池。 1.15 純化 RPC3 ( 第三尺寸 )
在RPC3中使用的緩衝液： ‧ 緩衝液A：100 mM NH 4OAc + 0.5% AcOH ‧ 緩衝液B：MeCN
將來自RPC2之最終池以水稀釋至其體積的兩倍，並將最大13 g/L之管柱體積施加至以C18矽膠裝填的RPC管柱(管柱尺寸：45x(50-45 cm))，該管柱以含有85% A及15% B之溶液進行預平衡。在施加胜肽後，以平衡溶液洗滌管柱。以梯度溶析出所吸附的胜肽：流動相在1個管柱體積期間從15% B (85% A)變為29% B (71% A)，接著在10個管柱體積期間從29% B (71% A)變為37% B (63% A)。之後，等度溶析，直至UV信號達到其最大值之30%。隨後，梯度變為70% B (30% A)，並保持在此值直至UV信號達到基線。在280 nm下監控溶析，並以氨水將收集到的分液pH調整至5.8-6.0。藉由RP-HPLC分析收集的分液，並匯集該等顯示胜肽純度＞ 96.5%且主尖峰之前無單一雜質＞ 0.5%的分液，產生RPC3的最終主池。重複此過程以純化來自RPC2之剩餘的池。 1.16 純化 RPC4 ( 第四尺寸 )
在RPC4中使用的緩衝液： ‧ 緩衝液A：5 mM NH 4OAc + 0.1% AcOH ‧ 緩衝液B：MeCN ‧ 緩衝液C：100 mM NH 4OAc + 0.5% AcOH
將來自RPC3之最終池以水稀釋至其體積的兩倍，並將醋酸銨添加至所獲得的溶液中，以在池中得到最終濃度約100 mM的醋酸銨。將最大15 g/L之管柱體積施加至裝填有Amberchrom XT20的RPC管柱(管柱尺寸：45x(40-35 cm) )，該管柱以90% C及10% B進行預平衡。在施加胜肽後，以一個管柱體積的平衡溶液及一個管柱體積的90% A及10% B洗滌管柱。以梯度溶析出所吸附的胜肽：流動相在1個管柱體積期間從10% B (90% A)變為13% B (87% A)，接著在12個管柱體積期間從13% B (87% A)變為25% B (75% A)。當UV信號達到其最大值之40%時，梯度隨後變為60% B (40% A)，並保持此值，直至所有胜肽被溶析出。在280 nm下監控溶析，並以氨水將收集到的分液pH調整至5.8-6.0。重複此過程以純化來自RPC3之剩餘的池。藉由RP-HPLC分析收集的分液，並匯集顯示胜肽純度＞ 98.0%且無個別雜質 ＞ 0.5%的分液。在以水稀釋後，收集在主尖峰之前顯示純度＞ 80.0%及＜ 98.0%及/或雜質Des-Ser 7/8/Aspartimide ＞ 0.5%的分液，並收集在主尖峰之後的分液，其顯示純度＞ 80.0%及＜ 98.0%，及/或雜質 Des-Ser 7/8/Aspartimide ＞ 0.5%，藉由在Amberchrom XT20管柱上施加最大15 g/L之管柱體積而進行重新層析。藉由施加梯度而溶析出產物：流動相在1個管柱體積期間從10% B (90% A)變為13% B (87% A)，接著在9個管柱體積內從13% B (87% A)變為25% B (75% A)，之後以25% B (75% A)等度溶析，直至溶析尖峰之UV達到30%。以氨水將分液pH調整至5.8-6.0，並藉由RP-HPLC分析。將重新層析後所獲得的純度＞ 98.0%且無個別雜質＞ 0.5%之池與主池混合，產生RPC4的最終池。 1.17 脫鹽 ( SPE)
用於脫鹽的緩衝液： ‧ 緩衝液A：10 mM AcOH ‧ 緩衝液B：MeCN
來自RPC4之最終池藉由添加水而稀釋至其兩倍體積，接著添加醋酸銨，以在池中得到最終濃度約100 mM。將該池施加至裝填有Amberchrom XT20的管柱(管柱尺寸：45x40 cm)，該管柱以95% A及5% B進行預平衡。在施加胜肽後，以平衡溶液洗滌管柱。以梯度溶析出所吸附的胜肽：流動相在1個管柱體積期間從5% B (95% A)變為50% B。梯度保持在此值，直至所有胜肽被溶析出。在280 nm下監控溶析，並藉由RP-HPLC分析收集的分液。 1.18 純化的胜肽之分離
來自脫鹽步驟之產物在＜ 40°C之減壓下進行蒸發。在此處理中，將MeCN蒸發，並將胜肽溶液減至初始體積之大約30%，接著以水稀釋，產生約25 g/L之最終胜肽濃度。將濃縮的胜肽通過0.45/0.22 µm過濾器過濾，接著經由冷凍乾燥分離，產生約1.3 kg之純化的胜肽(總純化產率＞ 35%)，其藉由RP-HPLC顯示純度＞ 97.75%且無單一雜質＞ 0.5%。 範例 2 ：藉由使用 Fmoc-Lys(Trt)-OH 而優化粗製的胜肽
在ZP1848合成的開發期間，應注意的是，Lys(Boc) 6之存在的確如預期的，產生許多三級丁基化副產物(+56 Da)。特別是，彼等之中有些在接近主尖峰處被溶析出，因此亦可在純化的溶液中找到( 圖 2，上圖)。不希望受任何理論的束縛，發明人相信，此+56雜質與三級丁基之切割有關，因此+56部分被認為位於離胺酸尾端某處，最有可能是在37或38。
以[Lys(Trt)] 6進行ZP1848合成消除了高度三級丁基化副產物( 圖 2，下圖)，儘管由於從合成中其他處之保護基轉移而仍可觀察到一些丁基化副產物。
Lys(Trt)不一定用於尾端的每一離胺酸殘基，儘管其可能如此。
由於Fmoc-Lys(Trt)-OH為一種比Fmoc-Lys(Boc)-OH更昂貴的建構組元，特別是在莫耳基礎上，具有成本效益之過程可能僅將此建構組元應用於一些胺基酸偶聯。
此外，發明人觀察到，由使用Lys 39(Boc)及Lys 38(Boc)殘基衍生的三級丁基化副產物Lys 39- t-Bu及Lys 38- t-Bu為最難以從粗製胜肽移除的雜質，以獲得所需的胜肽。將彼等兩個殘基的保護基從Boc變為Trt可防止形成Lys 39- t-Bu及Lys 38- t-Bu三級丁基化副產物。據此，發明人已確定，僅將Lys(Trt)用於前兩個偶聯(亦即，針對Lys 39及Lys 38殘基)，以得到[K(Boc)] 4[K(Trt)] 2模體，有助於消除最接近主尖峰所溶析出的三級丁基化副產物( 圖 3，位於9.487之尖峰)，因此，允許獲得更純的粗製產物。此反而允許更潔淨的純化過程，從而得到更高產率及更純的最終產物。 範例 3 ：在 Pre-RPC1 中之管柱上 O 至 N 醯基轉移
在ZP1848之切割期間( 範例 1.11)發生N à O醯基轉移。當將粗製的沉澱產物溶解於AcOH/MeCN/1%水性NH 4OAc (1:5:4)並靜置過夜以進行Trp(Boc)脫羧時，亦發現到乙醯化(亦即，胜肽鏈之截斷)及三氟乙醯化雜質(亦即，胜肽鏈之三氟乙醯酯)。
已知在純化步驟前將pH調整至中性並回到酸性條件會減少彼等雜質，從而進行O à N醯基轉移。參見，例如，(a) Bergmann M, Brand E, Weimann F. Z Physiol Chem. 1923；131:1–17；(b) Phillips AP, Baltzly R. J Am Chem Soc. 1947；69:200–204。
在將胜肽產物添加至管柱之前，O à N醯基轉移通常在溶液中進行。為了進行轉移，通常使用磷酸鹽緩衝液/磷酸降低pH。
然而，結果發現，當在胜肽產物溶液中使用磷酸鹽緩衝液/磷酸時，ZP1848在中性pH下沈澱(關於磷酸鹽緩衝液不相容性之進一步細節，參見WO2020/065064之範例4，其之揭示內容通過引用併入本文中)。進一步發現，由於在純化前胜肽產物溶液中之醋酸含量高，因此將pH升至中性pH而不沈澱是不可行的，係因其將需要非常大量的NaOH，且非常不切實際。
此外，ZP1848在含有NaCl、磷酸鹽、NaOH及高離子強度的中性pH溶液中沈澱。
此範例之目的為比較在溶液中及在管柱上進行O à N醯基轉移時的結果。
在下 表 4.1中，ZP1848之各種製劑係於100 mM NaCl及45 mM磷酸鹽(緩衝液係描述於 範例 1.12中)中以不同的pH及/或濃度製備，以反映出在溶液中與在RPC1下存在於管柱中的條件相同。 表 4.1 ：包含磷酸鹽之各種胜肽產物溶液
製劑編號 ZP1848 之濃度 [mg/mL] pH 觀察到沈澱 ( 有或無 )
1 10 2.2 無
2 2 2.2 無
3 10 7.5 有
4 2 7.5 有
5 10 7.0 有
6 2 7.0 無
7 0.2 7.5 有
8 0.5 7.5 有
表 4.1中之數據清楚證實，當在溶液中與RPC1期間之管柱上使用相同條件時，ZP1848會沈澱。在樣本製備後，在數分鐘內發生沈澱。此外，結果顯示，ZP1848即使在pH 7.5之低濃度(0.2及0.5 mg/mL)下亦沈澱。
令人意外地發現，有可能在第一純化步驟之前在用於純化的C18管柱上進行此pH處理。尤其令人意外的是，可使用磷酸鹽緩衝液而不會造成材料損失。實際上，由於Pre-RPC1及RPC1在相同管柱上進行，因此從純化順序中排除了處理步驟。
在切割時， 圖 4中之數據顯示，在管柱上進行pH處理後，TFA及醯基雜質以及醯基轉移皆降低。此外，亦評估了由於胜肽在中性pH下與磷酸鹽緩衝液不相容(可能會沈澱)而在管柱上的可能產率損失。在 圖 4之實驗中，在pH處理前及pH處理後使用100 mg，ZP1848之量被量化為89 mg (約10 mg之損失可解釋為在切割/沈澱期間的產物處置所致)。因此，管柱上的損失被視為可忽略不計，且未觀察到由於管柱上的pH處理而造成的產率損失。總之，在管柱上進行O à N醯基轉移可防止不需要的沈澱，同時達到所需的化學轉換。此外，藉由將pH升至中性，O à N醯基轉移以及乙醯化及三氟乙醯化雜質之水解可增加大約5%的產率。亦即，從RPC1步驟溶析出之產物量比填充量高出大約5%。 範例 4 ：粗製胜肽之純化及不需要知組分的移除
如 範例 1中之概述，使用Fmoc-SPPS之五步驟(「預(Pre)」步驟及四個「尺寸」)層析純化過程(Pre RPC1 + RPC1-RPC4)可導致ZP1848產品純度為98.2%。結果發現，當以具有UV或MS檢測功能之分析型HPLC進行評估時，ZP1848產物含有不超過0.5%的個別雜質。純化過程之每一步驟皆用於移除特定不需要的組分，例如胜肽雜質(亦即，高分子量(HMW)截斷、刪除或其他不需要的衍生物)或用於改進最終物質之純度。彼等不需要的組分可包含共價或非共價雜質，其中生理活性被改變、失活或未知副作用，且應盡可能減少。在ZP1848產物中，C端脫醯胺之至少一物種、HMW化合物，以及從天門冬胺酸形成的天門冬胺酸相關雜質(例如，Iso-Asp/Beta-Asp及Aspartimide之形成)為特別不需要的雜質。 特定雜質 – C 端脫醯 胺產物、 Lys 39-OH 雜質及天門冬胺酸相關雜質之移除
RPC步驟之順序為目前為止的關鍵，RPC1需要在RPC2及3之前進行，係因RPC1移除雜質，否則將遮蔽了在彼等兩個步驟中必須看到的細節。
在第一尺寸(RPC-1)中使用磷酸鹽緩衝液，在第二者中為TFA，而第三及第四者為醋酸銨。乙腈(MeCN)係用作所有純化步驟的有機修飾劑。為了評估純化功效，藉由HPLC或LC-MS分析主要組分之每一步驟後的分液。所得純度、主要不需要知雜質及特別難以移除之雜質的結果係列於下 表 4.1中。可以看出，通過依序之純化步驟而減少天門冬胺酸相關雜質(Iso-Asp/Beta-Asp及aspartimide之形成)，以達到最終產物純度≥98%。 表 4.1
樣本 C 端脫醯 胺(Lys 39-OH雜質) 天門冬胺酸相關雜質 純度
粗製物 2.9% ＞10% ~45%
在RPC1之後 0% 8.4% 89%
在RPC2之後 0% 1.7% 96%
在RPC3之後 0% 0.9% 98%
在RPC4之後 0% 0.5% ≥98%
第一個RPC係用於分離主要組分及用於移除特定雜質，亦即天門冬胺酸相關雜質及C端脫醯胺雜質。在此步驟中亦移除大多數截斷的末端胺基酸部分。在RPC1前之粗製物中，C端脫醯胺產物Lys 39-OH雜質之水平相對較高(2.9%)，且在運行RPC1之後，其僅在最後分液中溶析出，使得此純化步驟在移除此雜質時非常有效。若使用RPC2，則C端脫醯胺產物Lys 39-OH雜質亦在超過5個含有大於50% ZP1848的分液中溶析出。此顯示RPC1及磷酸鹽緩衝液的使用能非常有效地減少此雜質，而RPC2則無效，並影響整體產率及純度。
磷酸鹽緩衝液的使用特別適合用於此目的，而TFA及醋酸銨無法成功將C端脫醯胺產物與主要產物分離。第二、第三及第四步驟提高了純度，且亦用於移除天門冬胺酸相關雜質。 寡聚物 之移除
寡聚物主要在純化前生成，並在粗製溶液(切割酸性條件)中觀察到。 表 4.2顯示了ZP1848在整個純化過程中的寡聚物含量。共價鍵接之寡聚產物在粗製溶液中的量為1.8%，但在O à N醯基轉移後稍微增至2.4%。寡聚物主要在RPC1中被移除，部分在RPC2中被移除，且在最終產物中的量則低於0.1%。數據亦顯示，在整個純化過程中未進一步生成寡聚物。 表 4.2 ：代表性批次之ZP1848在整個純化過程中的寡聚物含量
樣本 ID SEC 結果 [ 寡聚物 之面積 %]
粗製物 1.8
在RPC1之前 2.4
在RPC2之前 0.36
在RPC3之前 ＜ 0.05
API ~0.07
從 表 4.2中可看出，在RPC1之後，寡聚物明顯減少，且在RPC2之後，其等僅以微量(亦即，少量)存在。在管柱上之pH處理期間，預期寡聚物的量不會增加。
(無)
圖 1顯示O à N醯基轉移(Pre-RPC1)之概況及用於純化由SPPS所合成之GLP-2類似物的四步驟(RPC1-4)層析純化過程。
圖 2顯示藉由+56 Da EIC MS的三個合成ZP1848的圖。主尖峰在約 28分鐘。上圖：來自以[K(Boc)] 6合成之純化的ZP1848 – 標註了剩餘的+56 Da雜質。中圖：來自以[K(Boc)] 6合成的粗製物。下圖：來自以[K(Trt)] 6合成的粗製物。
圖 3顯示藉由+56 Da EIC MS的兩個Fmoc-K 6-NH 2粗製物的圖。上圖：來自[K(Boc)] 6樹脂的粗製物。下圖：來自[K(Boc)] 4[K(Trt)] 2樹脂的粗製物。
圖 4顯示ZP1848切割後的圖。上圖：在切割溶液中1½小時後(如 範例 1.11之程序)。下圖：在RPC1中以pH處理後(如 範例 1.12之程序)。
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(無)

Claims (15)

  1. 一種產生由固相胜肽合成法(SPPS)合成之GLP-2類似物的方法，其中該GLP-2類似物由下式表示： R 1-His-Gly-Glu-Gly-X5-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-X11-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-IIe-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Z 2-R 2其中： R 1為氫、C 1-4烷基(例如，甲基)、乙醯基、甲醯基、苄醯基或三氟乙醯基； X5為Ser或Thr； X11為Ala或Ser； R 2為NH 2或OH；以及 Z 2係不存在或1-6個胺基酸單元之Lys的胜肽序列； 或其醫藥上可接受之鹽或衍生物； 該方法包含下列步驟： i) 以粗製的GLP-2類似物填充管柱； ii) 以第一緩衝液系統調整該管柱之pH； 其中步驟ii)包括當該胜肽在該管柱上時通過該胜肽之等電點，其係藉由將該管柱之pH從酸性pH增至中性或弱鹼性pH。
  2. 如請求項1之方法，其中該第一緩衝液系統為磷酸鹽緩衝液系統。
  3. 如請求項1或請求項2之方法，其中Z 2為1-6個胺基酸單元之Lys的胜肽序列。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中增加該管柱之酸性pH包含將pH增至中性pH (pH7)。
  5. 如請求項1至3中任一項之方法，其中增加該管柱之酸性pH包含將pH增至pH ≥7.2，例如pH為約7.5。
  6. 如前述請求項中任一項之方法，其中該方法包含： (1) i) 以該GLP-2類似物填充管柱； ii) 以第一緩衝液系統調整該管柱之pH；隨後 iii) 溶析出含有該GLP-2類似物的池； 其中該第一緩衝液系統包括磷酸鹽緩衝液/磷酸；隨後 (2) i) 以在步驟(1)中獲得的含有該GLP-2類似物的池填充管柱；以及 ii) 以第二緩衝液系統洗滌該管柱，以溶析出含有該GLP-2類似物的池； 其中該第二緩衝液系統包括三氟醋酸；隨後 (3) i) 以在步驟(2)中獲得的含有該GLP-2類似物的池填充管柱；以及 ii) 以第三緩衝液系統洗滌該管柱，以溶析出含有該GLP-2類似物的池； 其中該第三緩衝液系統包括醋酸/醋酸銨；隨後 (4) i) 以在步驟(3)中獲得的含有該GLP-2類似物的池填充管柱；以及 ii) 以第四緩衝液系統滌該管柱，以溶析出含有該GLP-2類似物的池； 其中該第四緩衝液系統包括醋酸/醋酸銨。
  7. 如前述請求項中任一項之方法，其中在合成期間Z 2中之該Lys單元之至少一者係以三苯甲基保護基保護。
  8. 如請求項7之方法，其中Z 2為2-6個胺基酸單元之Lys的胜肽序列，且該方法包含下列步驟： i) 將第一個P-Lys(Trt)-OH附接至具有連接子的固態胜肽樹脂； ii) 從該Lys(Trt)胺基酸單元移除該P基； iii) 將第二個P-Lys(Trt)-OH附接至該附接至具有連接子之固態胜肽樹脂的Lys(Trt)胺基酸單元； iv) 從該第二個Lys(Trt)胺基酸單元移除該P基； v) 附接後續之胺基酸單元，直至合成出該GLP-2類似物； vi) 從該固態胜肽樹脂切割該GLP-2類似物；以及 vii) 純化該GLP-2類似物。 其中每一P為保護基。
  9. 如前述請求項中任一項之方法，其中X5為Thr及/或X11為Ala。
  10. 如請求項9之方法，其中該GLP-2類似物係選自於下列： ZP1848  H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH 2(SEQ ID NO: 1) ZP2949  H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKKK-OH (SEQ ID NO: 2)； ZP2711  H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKK-OH (SEQ ID NO: 3)； ZP2469  H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDK-OH (SEQ ID NO: 4)； ZP1857  H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH 2(SEQ ID NO: 5)；以及 ZP2530  H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-OH (SEQ ID NO: 6)。
  11. 如請求項9之方法，其中該GLP-2類似物係選自於下列： ZP1848  H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH 2(SEQ ID NO: 1) ZP2949  H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKKK-OH (SEQ ID NO: 2)； ZP2711  H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKK-OH (SEQ ID NO: 3)；以及 ZP2469  H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDK-OH (SEQ ID NO: 4)。
  12. 如請求項9之方法，其中該GLP-2類似物為： ZP1848  H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH 2(SEQ ID NO: 1)。
  13. 如請求項1至8中任一項之方法，其中X5為Ser及/或X11為Ser。
  14. 如請求項13之方法，其中該GLP-2類似物係選自於下列： ZP1846  H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH 2(SEQ ID NO: 7)； ZP1855  H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH 2(SEQ ID NO: 8)；以及 ZP2242  H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK-OH (SEQ ID NO: 9)。
  15. 如請求項13之方法，其中該GLP-2類似物為： ZP1846  H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH 2(SEQ ID NO: 7)。
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