TW202241512A - 結合ctla-4的抗體及其用途 - Google Patents

Abstract

本公開關於在受試者中清除調節性T細胞（Treg）和/或增加CD8+ T細胞/Treg細胞比例的方法、在受試者中治療難治性癌症的方法、治療癌症的組合療法、減少CTLA4抗體治療癌症副作用的方法、實現癌症患者長週期給藥或者必要時給藥的方法、抗CTLA-4單重鏈抗體的給藥方法、單位劑量組合物、抗CTLA-4單重鏈抗體在製備藥物中的用途、確定抗腫瘤藥物的給藥劑量的方法以及確定抗腫瘤藥物的給藥形式的方法。

Description

結合CTLA-4的抗體及其用途

本國際專利申請要求於2021年4月21日提交的中國專利申請號CN202110429291.6和2022年4月14日提交的中國專利申請號202210392059.4的權益，以上申請的全部內容通過引用併入本文。 本發明關於生物醫藥領域，並具體關於結合CTLA-4的抗體及其在癌症治療中的用途。更具體地，本發明關於在受試者中清除調節性T細胞（Treg）和/或增加CD8+ T細胞/Treg細胞比例的方法、在受試者中治療難治性癌症的方法、治療癌症的組合療法、減少CTLA4抗體治療癌症副作用的方法、實現癌症患者長週期給藥或者必要時給藥的方法、抗CTLA-4單重鏈抗體的給藥方法、單位劑量組合物、抗CTLA-4單重鏈抗體在製備藥物中的用途、確定抗腫瘤藥物的給藥劑量的方法以及確定抗腫瘤藥物的給藥形式的方法。

癌症免疫療法是癌症治療中的最新突破，它利用患者自身的免疫系統攻擊腫瘤細胞。在腫瘤微環境中促進強大的CD8 T細胞依賴性細胞毒性應答對於產生有效的抗腫瘤免疫應答非常重要。然而，腫瘤傾向於藉由利用T細胞抑制機制來逃避免疫監視。

T細胞的活化需要雙重正訊號的刺激實現，即第一訊號和第二訊號。第一訊號藉由抗原識別過程，即TCR與MHC分子-抗原肽複合物的特異性結合實現。第二訊號啟動依靠協同共刺激分子實現，其中T細胞表面的CD28分子與抗原呈遞細胞表面相應配體CD80/CD86（B7-1/B7-2）結合，從而最終啟動免疫應答。CTLA-4是負向調控T細胞活化/增殖的重要免疫檢查點，活化的T細胞往往會藉由上調表達CTLA-4，藉由與CD28競爭性結合配體CD80/CD86（B7-1/B7-2）實現其負向調控，阻止T細胞的活化和增殖。腫瘤細胞往往也會藉由表達CTLA-4抑制免疫應答，從而實現「免疫逃逸」。因此，基於上述理論開發的CTLA-4抑制劑藥物，藉由阻斷CTLA-4相關的抑制訊號促進免疫細胞的活化，實現抗腫瘤免疫功能的恢復和增強。

CTLA-4單藥以及聯合用藥已經在多種腫瘤中具有優異的抗腫瘤效應。例如，已經獲批的伊匹單抗（Ipilimumab）在治療晚期轉移性黑色素瘤等腫瘤上取得了較好的療效。此外，來自不同抗CTLA-4藥物的臨床試驗均顯示出抗CTLA-4高劑量組相較於低劑量組有接近翻倍的療效增益；同時，高劑量單藥組也表現出不錯的臨床獲益。在多個類型的晚期實體瘤中，聯合用藥亦展示出顯著的療效增益：藉由聯合使用CTLA-4，聯合治療組相較於原單藥治療展現出2-3倍的ORR提升；在部分難治性瘤種或對單免疫治療不敏感的瘤種中（如肉瘤，胃癌，宮頸癌等）聯合CTLA-4後，療效獲得突破 ^1-23。

儘管療效增益顯著，但目前的抗CTLA-4單抗和聯合治療均受到其毒性特徵限制了療效進一步上探的潛力。目前受限於毒性天花板，該靶點的臨床應用模式普遍採用低劑量的非維持治療。然而，對於HCC等瘤種目前已有資料顯示，療效與CTLA-4劑量顯著正相關，即使是目前已獲批的用藥形式（伊匹單抗 4週期+納武單抗維持）仍存在多數患者不易耐受導致停藥的現實問題，由此突顯出開發改善該靶點藥物安全性的下一代產品的必要性和巨大價值。因此，下一代抗體進一步挖掘將是藉由療效增強和安全性改善潛在帶來更高的臨床獲益。

在一方面，本公開關於抗CTLA-4單重鏈抗體，例如全人源單重鏈抗體。相比於具有經典抗體結構(即包含兩條重鏈和兩條輕鏈的抗體結構)的傳統抗體，本公開的抗CTLA-4單重鏈抗體具有更低的空間位阻和高親和力，高組織滲透性能和高穩定性等特點。本發明人令人驚訝的發現，相比於傳統抗體，本公開的抗CTLA-4單重鏈抗體實現了低體內暴露量，以及窄範圍且可控的不良反應；其具有較短的半衰期，但藥效（包括抗腫瘤效應和Treg清除效應）延續時間長。

在一方面，本公開關於在受試者中清除調節性T細胞（Treg）和/或增加CD8+ T細胞/Treg細胞比例的方法。根據本發明的實施方案，所述方法包括給予受試者施用抗CTLA-4單重鏈抗體。例如全人源單重鏈抗體的步驟。在一些實施方案中，所述受試者是癌症患者。

在一些實施方案中，所述受試者為子宮內膜癌、腎非透明細胞癌、腎透明細胞癌、非小細胞肺癌、頭頸癌、乳腺癌、去勢抵抗性***癌、睾丸癌、尿路上皮癌、肝癌、食管癌、間皮瘤、黑色素瘤、神經內分泌瘤患者。

在一方面，本公開關於在受試者中治療難治性癌症的方法。根據本發明的實施方案，所述方法包括給予受試者施用抗CTLA-4單重鏈抗體。在一些實施方案中，所述難治性癌症對一種或多種免疫檢查點抑制劑例如PD-1/PD-L1軸訊號通路抑制劑不回應或耐受。在一些實施方案中，所述癌症為HCC。在另一些實施方案中，所述癌症為去勢抵抗性***癌（CRPC）。

在一方面，本公開關於一種治療癌症的方法。根據本發明的實施方案，所述方法包括對所述受試者施用抗CTLA-4單重鏈抗體和第二治療劑的步驟。在一些實施方案中，所述第二治療劑選自一種或多種免疫檢查點抑制劑，例如PD-1/PD-L1軸訊號通路抑制劑。

在一些實施方案中，所述第二治療劑是抗PD-1單克隆抗體，例如派姆單抗(Perbrolizumab)、納武單抗(Nivolumab)或特瑞普利(Toripalimab)。

在一些實施方式中，所述第二治療劑是靶向於HER-2、HER-3、EGFR、EpCAM、PD-1/PD-L1、CD27、CD28、ICOS、CD40、CD122、OX43、4-1BB、GITR、B7-H3、B7-H4、BTLA、LAG-3、CD15、CD52、CA-125、CD34、A2AR、VISTA、TIM-3、KIR、CD30、CD33、CD38、CD20、CD24、CD90、CA-15-3、CA-19-9、CEA、CD99、CD117、CD31、CD44、CD123、CD133、ABCB5和CD45等的抗體或抗原結合片段。

在一些實施方案中，所述第二治療劑為化療藥物，例如選自紫杉醇、順鉑、卡鉑、吉西他濱、培美曲塞、奧沙利鉑、表柔比星、5-氟尿嘧啶等。

在一些實施方案中，所述第二治療劑在抗CTLA-4單重鏈抗體之前，與抗CTLA-4單重鏈抗體同時，或在抗CTLA-4單重鏈抗體之後施用。

在一方面，本公開關於預防和/或減少CTLA4抗體治療癌症副作用的方法。根據本發明的實施方案，所述方法包括給予所述受試者施用抗CTLA-4單重鏈抗體。

在一方面，本公開關於抗CTLA-4單重鏈抗體的給藥方法。根據本發明的實施方案，所述方法包括將所述抗CTLA-4單重鏈抗體以靜脈滴注的形式輸入患者體內，所述抗CTLA-4單重鏈抗體以0.9%氯化鈉或5%葡萄糖溶液的形式提供，所述抗CTLA-4單重鏈抗體在所述溶液中的濃度為0.1mg/mL-10.0mg/mL，所述靜脈滴注的時間不超過4小時。

在一些實施方案中，上述方法包括給予受試者以0.2mg~1mg/kg體重的劑量施用抗CTLA-4單重鏈抗體。

在一些實施方案中，上述方法包括的給藥週期為每週~每12週給藥一次，例如，給藥週期為每週、每2週、每3週、每4週、每5週、每6週、每7週、每8週、每9週、每10週、每11週或每12週給藥一次。需要說明的是，本文中所述的「給藥週期」是指相鄰兩次給藥間隔的時間。

在一些實施方案中，以0.3-0.6mg/kg、0.3~0.55mg/kg、0.3~0.5mg/kg、0.3~0.45mg/kg、0.35~0.6mg/kg、0.35~0.55mg/kg、0.35~0.5mg/kg、0.35~0.45mg/kg、0.45~0.6mg/kg、0.45~0.55mg/kg或0.45~0.5mg/kg的劑量向受試者施用抗CTLA-4單重鏈抗體。

在一些實施方案中，以0.3-0.6mg/kg、0.3~0.55mg/kg、0.3~0.5mg/kg、0.3~0.45mg/kg、0.35~0.6mg/kg、0.35~0.55mg/kg、0.35~0.5mg/kg、0.35~0.45mg/kg、0.45~0.6mg/kg、0.45~0.55mg/kg或0.45~0.5mg/kg每3週一次給予受試者施用抗CTLA-4單重鏈抗體。

在一些實施方案中，以0.3mg/kg的劑量每週一次給予受試者施用抗CTLA-4單重鏈抗體。

在一些實施方案中，以0.45mg/kg的劑量每3週一次給予受試者施用抗CTLA-4單重鏈抗體。

在一些實施方案中，以0.6mg/kg的劑量每3週一次給予受試者施用抗CTLA-4單重鏈抗體。

在一方面，本公開關於實現癌症患者長週期給藥或者必要時給藥的方法。根據本發明的實施方案，所述方法包括給予所述受試者施用抗CTLA-4單重鏈抗體。

在一些實施方案中，所述長週期給藥是指給藥週期不小於4週，較佳地，不小於6週、7週、8週、9週、10週、11週或12週，例如，6週或12週。

在一些實施方案中，所述受試者的不能維持疾病穩定（SD）、部分緩解（PR）、完全緩解（CR）狀態，是必要時給藥的指示。其中，SD是指靶病灶最大徑之和縮小未達PR，或增大未達PD；PR是指靶病灶最大徑之和減少大於等於30%，至少維持4週；CR是指所有靶病灶消失，無新病灶出現，且腫瘤標誌物正常，至少維持4週；PD是指靶病灶最大徑之和至少增加20%，或出現新病灶。

在一些實施方案中，所述受試者的不能維持SD、PR或CR狀態，給予所述受試者施用抗CTLA-4單重鏈抗體直到受試者恢復SD、PR或CR狀態。

在一些實施方案中，所述施用抗CTLA-4單重鏈抗體的持續時間為2~4個給藥週期。

在一些實施方案中，向受試者以0.2mg~1mg/kg體重的劑量施用所述抗CTLA-4單重鏈抗體，較佳為0.3-0.6mg/kg。

在一方面，本公開關於一種單位劑量組合物。根據本發明的實施方案，包含20-200 mg的抗CTLA-4單重鏈抗體。例如30-200mg，40-200mg，50-200mg，60-200mg，70-200mg，80-200mg，90-200mg，100-200mg，60-100mg，20mg，25mg，30mg，35mg，40mg，45mg，50mg，55mg，60mg，65mg，70mg，75mg，80mg，85mg，90mg，95mg，100mg，110mg，120mg，130mg，140mg，150mg，160mg，170mg，180mg，190mg，200mg。

在一方面，本公開關於抗CTLA-4單重鏈抗體在製備藥物中的用途，所述藥物用於治療受試者中的CTLA-4相關疾病例如癌症，所述藥物配製成以0.2mg~1mg/kg劑量施用病人的形式。

在上述方法，單位劑量組合物或用途的一些實施方案中，所述抗CTLA-4單重鏈抗體具有CDR，所述CDR具有SEQ ID NO: 1~24任一所示的胺基酸序列。

在上述方法，單位劑量組合物或用途的一些實施方案中，抗CTLA-4單重鏈抗體具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有SEQ ID NO:1~8任一所示的胺基酸序列；所述CDR2具有SEQ ID NO:9~16任一所示的胺基酸序列；所述CDR3具有SEQ ID NO:17~24任一所示的胺基酸序列。

在上述方法，單位劑量組合物或用途的一些實施方案中，抗CTLA-4單重鏈抗體具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3分別具有SEQ ID NO:1、9和17所示的胺基酸序列。

在上述方法，單位劑量組合物或用途的一些實施方案中，抗CTLA-4單重鏈抗體具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3分別具有SEQ ID NO:2、10和18所示的胺基酸序列。

在上述方法，單位劑量組合物或用途的一些實施方案中，抗CTLA-4單重鏈抗體具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3分別具有SEQ ID NO:3、11和19所示的胺基酸序列。

在上述方法，單位劑量組合物或用途的一些實施方案中，抗CTLA-4單重鏈抗體具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3分別具有SEQ ID NO:4、12和20所示的胺基酸序列。

在上述方法，單位劑量組合物或用途的一些實施方案中，抗CTLA-4單重鏈抗體具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3分別具有SEQ ID NO:5、13和21所示的胺基酸序列。

在上述方法，單位劑量組合物或用途的一些實施方案中，抗CTLA-4單重鏈抗體具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3分別具有SEQ ID NO:6、14和22所示的胺基酸序列。

在上述方法，單位劑量組合物或用途的一些實施方案中，抗CTLA-4單重鏈抗體具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3分別具有SEQ ID NO:7、15和23所示的胺基酸序列。

在上述方法，單位劑量組合物或用途的一些實施方案中，抗CTLA-4單重鏈抗體具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3分別具有SEQ ID NO:8、16和24所示的胺基酸序列。

在上述方法，單位劑量組合物或用途的一些實施方案中，所述抗CTLA-4單重鏈抗體具有重鏈可變區，所述重鏈可變區具有SEQ ID NO:25~32任一所示的胺基酸序列。

在上述方法，單位劑量組合物或用途的一些實施方案中，所述抗CTLA-4單重鏈抗體具有SEQ ID NO:33~40任一所示的胺基酸序列。

在一方面，本公開關於一種抗CTLA-4單重鏈抗體的給藥方法，所述抗CTLA-4單重鏈抗體具有SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列。根據本發明的實施方案，所述方法包括將所述抗CTLA-4單重鏈抗體以靜脈滴注的形式輸入患者體內，所述抗CTLA-4單重鏈抗體以0.9%氯化鈉或5%葡萄糖溶液的形式提供，所述抗CTLA-4單重鏈抗體在所述溶液中的濃度為0.1mg/mL-10.0mg/mL，所述靜脈滴注的時間不超過4小時。

在一些實施方案中，將所述抗CTLA-4單重鏈抗體以0.2mg~1mg/kg的劑量輸入患者體內，較佳以0.3~0.6mg/kg的劑量輸入患者體內。在一些實施方案中，給藥週期為每週~每12週給藥一次，在一些實施方案中，給藥週期為每週、每2週、每3週、每4週、每5週、每6週、每7週、每8週、每9週、每10週、每11週或每12週給藥一次。

在一些實施方案中，將所述抗CTLA-4單重鏈抗體以0.3~0.6 mg/kg、0.3~0.55mg/kg、0.3~0.5mg/kg、0.3~0.45mg/kg、0.35~0.6mg/kg、0.35~0.55mg/kg、0.35~0.5mg/kg、0.35~0.45mg/kg、0.45~0.6mg/kg、0.45~0.55mg/kg或0.45~0.5mg/kg的劑量輸入患者體內，每3週給藥一次。

在一些實施方案中，將所述抗CTLA-4單重鏈抗體以0.3 mg/kg的劑量輸入患者體內，每週給藥1次。

在一些實施方案中，將所述抗CTLA-4單重鏈抗體以0.45 mg/kg的劑量輸入患者體內，每3週給藥一次。

在一些實施方案中，將所述抗CTLA-4單重鏈抗體以0.6 mg/kg的劑量輸入患者體內，每3週給藥一次。

在一方面，本公開關於一種單位劑量組合物。根據本發明的實施方案，單位劑量組合物包含60-100 mg的抗CTLA-4單重鏈抗體，所述抗CTLA-4單重鏈抗體具有上文中所述的的胺基酸序列，例如選自SEQ ID NO:33~40任一所示的胺基酸序列。需要說明的是，本申請所述的「單位劑量組合物」是指適於一次性給藥的劑量份組合物，即，所述單位劑量組合物包含適於一次性給藥的活性成分的量。根據本發明實施方案的單位劑量組合物一次性給藥安全性高、療效好。在一些實施方案中，單位劑量組合物包含80 mg的抗CTLA-4單重鏈抗體。

在一方面，本公開關於抗CTLA-4單重鏈抗體在製備藥物中的用途，所述抗CTLA-4單重鏈抗體具有上文中所述的的胺基酸序列，例如選自SEQ ID NO:33~40任一所示的胺基酸序列，所述藥物用於治療CTLA-4相關疾病例如癌症，所述藥物配製成以0.2mg~1mg/kg劑量施用病人的形式。

在一些實施方案中，將所述藥物配製成以0.3mg/kg~0.6mg/kg的劑量每3週一次劑量施用的形式；較佳地，將所述藥物配置成以0.3~0.45mg/kg的劑量每3週一次劑量施用的形式；較佳地，將所述藥物配置成以0.45mg/kg的劑量每3週一次劑量施用的形式。

在一方面，本公開關於一種「Tick-Tock鐘擺運動」式抗腫瘤藥物的給藥劑量確定方法。根據本發明的實施方案，所述方法包括：1)將待測定藥物按照預定劑量梯度在廣泛瘤種中進行劑量爬坡實驗，以便獲得待測定藥物在預定劑量下的療效資料以及毒性資料；2）基於待測定藥物在預定劑量下的療效資料以及毒性資料，確定待測定藥物在所述預定劑量下是否在特定瘤種中進行劑量擴展實驗；3）重複步驟2），以便確定待測定藥物在更高預定劑量下是否在特定瘤種中進行劑量擴展實驗。

在一些實施方案中，劑量爬坡實驗和劑量擴展實驗兩部分可以同時進行：即在劑量爬坡過程中，一旦出現安全性可靠且具有療效訊號發生的劑量組，即進行該劑量在特定瘤種中的劑量擴展，與此同時繼續進行更高劑量在廣泛實體瘤中的爬坡，一旦確定下一個「可擴展劑量」繼續依照上述方法進行擴展，最終將在「擴展」部分中同一瘤種中獲得不同的劑量水平資料，以及同一劑量水平在特定瘤種的資料，最終選定「各瘤種最適宜劑量」進入後續二期和三期（PH2/3）開發。

在一些實施方案中，所述方法包括「劑量爬坡」和「劑量擴展」部分；所述「劑量爬坡」部分為：按照i3+3劑量爬坡演算法（圖1、圖2），根據每個劑量水平的劑量限制性毒性以及綜合毒性表現結合演算法進行「爬升」、「停留」或者「降級」的決定，確定獲得「療效訊號」的劑量組。所述「劑量擴展」步驟為：就各劑量組中呈現出的PD/PK特徵，療效狀況進行評估，定期經科學審評討論確認該劑量「是否具有良好的獲益/風險比」後，可以從某一劑量即開始在特定的瘤種中進行劑量擴展。在一些實施方案中，繼續進行劑量爬坡以繼續探索藥物的安全性邊際，進一步確認下一個具有良好的獲益/風險比的劑量；若更高劑量組的「獲益/風險比」仍被上述科學審評確認為可接受和具備擴展潛力，同樣會按照上述方式在特定的瘤種中進行擴展。

在一些實施方案中，所述抗腫瘤藥物為抗CTLA-4單重鏈抗體。

在一些實施方案中，所述抗CTLA-4單重鏈抗體的CDRs、重鏈可變區、重鏈具有SEQ ID NO:1~40所示的胺基酸序列。

在一方面，本公開關於一種確定抗腫瘤藥物的給藥形式的方法。根據本發明的實施方案，所述方法包括：將待測藥物施於測試模型，在預定給藥劑量、給藥次數和給藥週期的進行試驗，以便獲得待測藥物的優勢給藥形式，其中，測試模型的SD、PR或CR處於穩定狀態，是優勢給藥形式的指示。

在一些實施方案中，進一步包括將第二治療劑施於測試模型，在預定給藥劑量、給藥次數和給藥週期的進行試驗，以便獲得第二治療劑的優勢給藥形式，其中，測試模型的SD、PR或CR依然處於穩定狀態，是第二治療劑的優勢給藥形式的指示。

在一些實施方案中，測試模型的SD、PR或CR不能維持穩定狀態，將待測藥物再次施於測試模型，以便使得測試模型的SD、PR或CR重新處於穩定狀態。

在一些實施方案中，除預先設定的待測抗腫瘤藥物的給藥持續時間和給藥劑量或給藥週期外，允許增加格外的給藥週期，和增加新的隊列以探索新的給藥間隔。該探索實驗可能實現的結局有：可能特定的瘤種具備有特定的藥物劑量和間隔模式和週期數；並且必要時，尚會進一步探索「必要時」（PRN）給藥的模式，即預先設定的給藥持續時間結束（如4個給藥週期），如結果為SD、PR或CR，則以第二藥物（如PD-1）進行維持，在後續治療過程中進行定期腫瘤評估，如果出現疾病進展或者進展趨勢可能時，臨時加用待測的抗腫瘤藥物，如抗CTLA-4單重鏈抗體若干給藥週期（如2-4個給藥週期），用以作為「鞏固」治療目的，直至患者再次出現疾病穩定或者緩解後停用重複上述邏輯，或者出現疾病進展從而放棄本藥物方案。

在一些實施方案中，所述抗CTLA-4單重鏈抗體的CDRs、重鏈可變區、重鏈具有SEQ ID NO:1~40所示的胺基酸序列。

在一方面，本公開關於抗CTLA-4單重鏈抗體，用於在受試者中清除調節性T細胞（Treg）和/或增加CD8+ T細胞/Treg細胞比例。

在一方面，本公開關於抗CTLA-4單重鏈抗體，用於在受試者中治療難治性癌症。

在一方面，本公開關於抗CTLA-4單重鏈抗體和第二治療劑，用於治療癌症。

在一方面，本公開關於抗CTLA-4單重鏈抗體，用於減少CTLA4抗體治療癌症時副作用。

在一方面，本公開關於抗CTLA-4單重鏈抗體，用於實現癌症患者長週期給藥或者必要時給藥。

上述技術方案的附加技術特徵和技術效果與前面所述內容相同，在此不再贅述。

除非本文另有定義，與本發明結合使用的科學和技術術語及其縮寫應具有本發明所屬領域中具有通常知識者通常理解的含義。以下列舉了本文中使用的部分術語和縮寫。

抗體：antibody，Ab；免疫球蛋白：immunoglobulin，Ig； 重鏈：heavy chain，HC；輕鏈：light chain，LC； 重鏈可變區：heavy chain variable domain，VH； 重鏈恆定區：heavy chain constant domain，CH； 輕鏈可變區：light chain variable domain，VL； 輕鏈恆定區：light chain constant domain，CL； 互補決定區：complementarity determining region，CDR； Fab片段：antigen binding fragment，Fab； Fc區：fragment crystallizable region，Fc； 單克隆抗體：monoclonal antibody，mAb； 單重鏈抗體：缺失輕鏈的抗體

本公開所提及的術語「抗體」為單重鏈抗體。抗體還包括鼠源抗體、人源化抗體、嵌合抗體、人抗體以及其它來源的抗體。抗體可以含有另外的改變，如非天然胺基酸，Fc效應功能突變和醣基化位點突變。抗體還包括翻譯後修飾的抗體、包含抗體的抗原決定簇的融合蛋白，以及包含對抗原識別位點的任何其它修飾的免疫球蛋白分子，只要這些抗體展現出所期望的生物活性。換句話說，抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即至少含有一個抗原結合結構域的分子。

如本文所用，「可變區」(重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL)表示成對的輕鏈和重鏈結構域部分，其直接參與抗體和抗原的結合。每個VH和VL區由以下順序從N末端到C末端排列的三個高變區或互補決定區(CDR)和四個框架區(FR)組成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

如本文所用，術語「CDR」是指抗體可變序列內的互補決定區。對於每個可變區，在重鏈和輕鏈的每個可變區中有三個CDR，其稱為CDR1、CDR2和CDR3。這些CDR的確切邊界根據不同的系統而不同定義。Kabat等人(Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987)和(1991))描述的系統不僅提供了適用於抗體可變區的明確的殘基編號系統，而且還提供了限定三個CDR的殘基邊界。這些CDR可以稱為Kabat CDR。每個互補決定區可以包含由Kabat定義的「互補決定區」的胺基酸殘基。Chothia等人(Chothia & Lesk, J. Mol. Biol, 196:901-917 (1987)和Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989))發現，Kabat CDR內的某些子部分採用幾乎相同的肽骨架構象，儘管在胺基酸序列水平上具有多樣性。這些子部分分別稱為L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中「L」和「H」分別表示輕鏈和重鏈區。這些區域可以稱為Chothia CDR，其具有與Kabat CDR重疊的邊界。還有其它CDR邊界定義可以不嚴格遵循上述系統之一，但是仍將與Kabat CDR重疊。本文使用的方法可以利用根據任何這些系統定義的CDR，儘管較佳實施方案使用Kabat或Chothia定義的CDR。本申請使用Kabat系統來定義CDR序列。

在一些實施方案中，所述胺基酸修飾不改變抗體的CDR序列，即在可變區的框架區(FR)中進行所述胺基酸修飾。

在一些實施方案中，所述一個或幾個胺基酸修飾是指1-10個胺基酸修飾或1-5個胺基酸修飾，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸修飾。

在一些實施方案中，所述胺基酸修飾選自胺基酸殘基的取代、缺失、添加和/或***。在一些實施方案中，所述胺基酸修飾是胺基酸取代，例如保守取代。

在本公開的單重鏈抗體的一些實施方案中，所述抗體具有以下VH： a. 包含與SEQ ID NO: 25的胺基酸序列具有至少80%序列同一性，例如至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列的VH； b. 包含與SEQ ID NO: 26的胺基酸序列具有至少80%序列同一性，例如至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列的VH； c. 包含與SEQ ID NO: 27的胺基酸序列具有至少80%序列同一性，例如至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列的VH； d. 包含與SEQ ID NO: 28的胺基酸序列具有至少80%序列同一性，例如至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列的VH； e. 包含與SEQ ID NO: 29的胺基酸序列具有至少80%序列同一性，例如至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列的VH； f. 包含與SEQ ID NO: 30的胺基酸序列具有至少80%序列同一性，例如至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列的VH； g. 包含與SEQ ID NO: 31的胺基酸序列具有至少80%序列同一性，例如至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列的VH； h. 包含與SEQ ID NO: 32的胺基酸序列具有至少80%序列同一性，例如至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的胺基酸序列的VH。

如本發明所屬領域中具有通常知識者所理解的，兩個胺基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性可以藉由參數「序列同一性」描述。可以藉由例如使用數學演算法測定兩種序列間的序列同一性的百分比。此類數學演算法的非限制性實例包括Myers和Miller (1988) CABIOS 4:11-17的演算法、Smith等 (1981) Adv. Appl. Math. 2:482的局部同源性演算法、Needleman和Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453的同源性比對演算法、Pearson和Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448的用於搜索同源性的方法、和Karlin和Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264的演算法的修改形式，記載於Karlin和Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877的演算法。藉由使用基於此類數學演算法的程式，可以實施用於測定序列同一性的序列比較(即比對)。程式可以由電腦適當執行。此類程式的實例包括但不限於PC/Gene程式的CLUSTAL、ALIGN程式(Version 2.0)、和Wisconsin遺傳學套裝軟體的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、和TFASTA。可以例如藉由使用初始參數實施使用這些程式的比對。

在本公開的抗CTLA-4單重鏈抗體的一些實施方案中，所述抗體可以具有如SEQ ID NO: 33~40任一所示的胺基酸序列。

本公開關於受試者中清除調節性T細胞（Treg）和/或增加CD8+ T細胞/Treg細胞比例的方法、治療難治性癌症的方法、療癌症的方法、減少CTLA4抗體治療癌症副作用的方法。

如本文所用，術語「治療」是指治療性處理，其中目的是反轉、減輕、改善、抑制、減緩或停止與疾病或病症相關的狀況的進展或嚴重性。術語「治療」包括減少或減輕疾病或病症的至少一種副作用或症狀。如果減少一種或多種症狀或臨床標誌物，則治療通常是「有效的」。或者，如果疾病的進展減少或停止，則治療是「有效的」，也就是說，「治療」不僅包括症狀的改善，而且還包括在缺乏治療的情況下預期的症狀的進展或惡化的停止，至少減慢。有益或期望的臨床結果包括但不限於減輕一種或多種症狀、減少疾病程度，穩定(即不惡化)疾病狀態、延遲或減緩疾病進展、改善或緩解疾病狀態、和緩解(不管是部分還是全部)，無論是可檢測的還是檢測不到的。

如本文所用，術語「受試者」、「患者」和「個體」在本文中可互換使用，並且是指動物，例如人類。術語受試者還包括「非人哺乳動物」，例如如大鼠、小鼠、兔、綿羊、貓、狗、牛、豬和非人靈長類動物。在較佳的實施方案中，所述受試者是人類受試者。

在上述方法的一些實施方案中，所述疾病是癌症。癌症的具體實例包括但不限於：基底細胞癌、膽管癌；膀胱癌；骨癌；乳腺癌；腹膜癌；宮頸癌；膽管癌；絨毛膜癌；結腸和直腸癌；結締組織癌；消化系統癌症；子宮內膜癌；食道癌；眼癌；頭頸癌；胃癌；膠質母細胞瘤；肝癌；腎癌；喉癌；白血病；肺癌(例如，小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌和肺鱗狀細胞癌)；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；黑色素瘤；骨髓瘤；神經內分泌瘤(例如，神經母細胞瘤)；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；***癌；視網膜母細胞瘤；橫紋肌肉瘤；直腸癌；呼吸系統癌；唾液腺癌；肉瘤；皮膚癌；鱗狀細胞癌；睾丸癌；甲狀腺癌；子宮或子宮內膜癌；泌尿系統癌症； B細胞淋巴瘤；慢性淋巴細胞性白血病(CLL)；急性成淋巴細胞性白血病(ALL)；毛細胞白血病；慢性成髓細胞性白血病等。在較佳的實施方案中，所述癌症選自、肝癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌、晚期神經內分泌瘤(NEN)。

在上述方法的一些實施方案中，所述治療難治性癌症為原發性肝癌（HCC）或去勢抵抗性***癌（CRPC）。

在上述方法的一些實施方案中，所述方法還包括施用一種或多種另外的療法的步驟。例如，在一些實施方案中，所述療法選自化學療法、放射療法、免疫療法和手術療法。

在一些實施方案中，所述免疫療法選自針對免疫檢查點分子的療法、CAR-T細胞療法和CAR-NK細胞療法。例如，所述免疫檢查點分子可以選自PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3、TIGIT和CD103。

在一些實施方案中，所述化學療法選自包括表柔比星、奧沙利鉑和5-氟尿嘧啶的聯合化療方案。 實施例

下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本發明所屬領域中具有通常知識者應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。

以下實驗，以具有SEQ ID NO:33所示胺基酸序列的抗CTLA-4單重鏈抗體為例，探索了抗CTLA-4單重鏈抗體的給藥劑量、方式、Treg殺傷效應、藥代動力學活性和抗腫瘤效果。 實施例 1. 抗 CTLA-4 單重鏈抗體的劑量爬坡和劑量擴展

本實施例關於評估抗CTLA-4單重鏈抗體在晚期實體瘤受試者中的安全性、耐受性、藥代動力學和抗腫瘤活性的I期、開放標籤、國際多中心研究。本試驗分為2個部分：「劑量爬坡」和「劑量擴展」。第1部分為劑量爬坡階段，按照i3+3劑量爬坡演算法（圖1，圖2），根據每個劑量水平的劑量限制性毒性（DLT）以及綜合毒性表現（包含遲發性毒性反應）結合演算法進行「爬升」、「停留」或者「降級」的決定，與此同時尚有再次嘗試的可能，除非該隊列所表現的毒性條件直接觸發DU（將至前一劑量水平並不再嘗試該劑量）。

該爬坡方法除給與臨床試驗爬坡更大靈活性的同時，簡單直觀的視覺圖表亦易於操作，並且其底層數學原理使得該方法相較於以往傳統爬坡方式，優化了「錯誤估計」的風險，從而保證了各劑量組隊列的安全性評估更為準確和公平。

與此同時，試驗隊列在第一部分隨著劑量的爬升，預計將會在某一劑量組開始出現療效訊號。考慮到免疫藥物的效應特點，往往會存在多個「臨床可用劑量」的情況。已有研究提示同一藥物對於不同類型腫瘤的「最優目標劑量」並不一致（參見例如伊匹單抗已獲批瘤種及用藥方法），並且最大限制劑量（MTD）並非必要探及。

因此，除安全性評估外，本試驗就各劑量組中呈現出的PD/PK特徵、療效狀況（腫瘤的影像學改變，腫瘤標記物變化等）進行評估，定期經由臨床醫生為主的科學審評討論確認該劑量「是否具有良好的獲益/風險比」後，可以從某一劑量即開始在特定的瘤種中進行劑量擴展（Tock階段）。與此同時，仍然繼續進行劑量爬坡以繼續探索本藥物的安全性邊際，進一步確認下一個具備「拓展」潛力（具有良好的獲益/風險比）的劑量（Tick階段）。若更高劑量組的「獲益/風險比」仍被上述臨床醫生為主組成的SRC確認為可接受和具備擴展潛力，同樣會按照上述方式在特定的瘤種中進行擴展（Tock階段）。由此，類似鐘擺運動（Tick-Tock），不斷藉由廣泛實體瘤中的劑量爬坡完成安全性確認的同時完成「獲益/風險比」評價，一經確認即立即推送至擴展部分，在選定的「療效驗證模型」（具備潛力的特定瘤種）中進行POC驗證；與此同時，試驗將繼續進入下一個「鐘擺週期」。

此方法相較於以往「找到MTD後進入下一步」的理念，充分考慮了免疫藥物量效多樣化（不同瘤種的「最優劑量水平」不同，「起效劑量」亦可能不同）的特點，瘤種差異等因素，保證爬坡倫理安全性的同時，加速了進入劑量擴展的速度。同時，由於「鐘擺模式」這一設定，將使得劑量擴展階段的各瘤種會具有不同的劑量水平下的資料，這樣有利於更全面的理解和分析「同一劑量下不同瘤種」和「同一瘤種不同劑量下」的藥代藥效特點以及臨床獲益差異。此外，考慮到可能存在的「特定瘤種的敏感起效劑量不同」假設，保留了擴展階段隊列設置的靈活性，允許根據在上述「鐘擺模式」任何劑量階段中發現的新訊號增加額外的探索隊列，從而增加該試驗設計針對抗CTLA-4單重鏈抗體所具備的潛在應用提供足夠的靈活性和相容性。

已經完成了2個隊列，合計19位患者中的劑量爬坡試驗，其中0.3mg/kg，每週一次給藥：7人；0.6mg/kg，每三週一次給藥：6人；0.45mg/kg，每三週一次給藥：6人。所涉及的腫瘤包含：子宮內膜癌、腎非透明細胞癌、腎透明細胞癌、非小細胞肺癌、頭頸癌、乳腺癌、去勢抵抗性***癌、睾丸癌、尿路上皮癌、肝癌、食管癌、間皮瘤、陰莖癌、結直腸癌等。

在安全性方面，相較於其他CTLA-4類藥物報導的涉及多器官的不良事件（最常見前5種分別為皮疹、腹瀉或結腸炎、肝炎、垂體炎、肺炎等），抗CTLA-4單重鏈抗體的不良反應集中在消化道，主要是腹瀉（2級或3級）或結腸炎（1級或2級）。抗CTLA-4單重鏈抗體的毒性譜相較同靶點藥物窄/集中，且現有資料提示抗CTLA-4單重鏈抗體暴露後發生的消化道症狀和病理發現相較同靶點藥物的報導呈現明顯的「分離」現象：G3腹瀉為單純性水樣瀉，部分患者伴隨無黏液膿血便且無腹痛的G1-2結腸炎，但鏡下病理大多輕微，該現象與臨床前發現相類似。

腸鏡及病理活檢提示：除1例患者（腹腔注射12劑後發生）出現典型的潰瘍性結腸炎表現外，其他患者均提示不典型表現（報告提示「腸炎不能除外，可能有關」）或活檢鏡下輕度炎症細胞活動，且上述患者腹瀉症狀可在藥物干預後快速緩解，相關消化道綜合診斷（腹瀉/腸炎）均可藉由臨床使用抗腹瀉藥物及常規用量的激素（等量0.5mg-1mg/kg潑尼松）得到良好控制並最終緩解。

除消化道相關不良事件外，僅在0.3mg/kg，每週一次給藥劑量組報導3例皮疹（≤2級），而在其他劑量組均未提示皮膚相關不良事件。未觀察到明確的免疫相關肝炎、垂體炎、肺炎、腎炎發生。3級治療相關不良反應（TRAE）均為腹瀉，無4級或以上TRAE發生。

0.45mg/kg Q3W劑量組受試者有6人，腹瀉0人，結腸炎0人，疲勞0人，皮疹0人，瘙癢1人，整體耐受性良好。

以下表1顯示了0.3 mg/kg QW和0.6 mg/kg Q3W劑量組中的不良事件匯總。

表 1. 各個劑量組中的不良事件結果匯總

	抗 CTLA-4 單重鏈抗體 0.3 mg/kg QW	抗 CTLA-4 單重鏈抗體 0.6 mg/kg Q3W
級別	所有級別 N (%)	1/2級 N (%)	≥3級 N (%)	所有級別 N (%)	1/2級 N (%)	≥3級 N (%)
受試者人數	7 (100.0)	7 (100.0)	7 (100.0)	6 (100.0)	6 (100.0)	6 (100.0)
發生TRAE 受試者數量	5 (71.4)	5 (71.4)	2 (28.6)	4 (66.7)	3 (50.0)	1 (16.7)
腹瀉	3 (42.9)	1 (14.3)	2 (28.6)	3 (50.0)	2 (33.3)	1 (16.7)
結腸炎	2 (28.6)	2 (28.6)	0 (0.0)	1 (16.7)	1 (16.7)	0 (0.0)
疲勞	3 (42.9)	3 (42.9)	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)
皮疹	3 (42.9)	3 (42.9)	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)
瘙癢	2 (28.6)	2 (28.6)	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)

實施例 2. 抗 CTLA-4 單重鏈抗體的體外和體內 Treg 殺傷效應

在體外ADCC殺傷試驗中評價了抗CTLA-4單重鏈抗體的人T _reg細胞清除活性。在該實驗中，人T _reg細胞在體外從未分化的CD4 T細胞分化得到，然後用標記鈣黃綠素AM標記，之後與抗體和原代人PBMC共孵育數個小時。對上清液中鈣黃綠素AM的數值檢測發現，抗CTLA-4單重鏈抗體（PR218）相較伊匹木單抗模擬物（PR149）具有強效的T _reg細胞殺傷活性（圖3）。相反在原代人總T細胞中無明顯的由抗CTLA-4單重鏈抗體介導的細胞殺傷。

為評估療效模型中腫瘤浸潤細胞群的改變，在小鼠模型中進行了另一項抗CTLA-4單重鏈抗體研究性試驗。對每一隻敲入人CTLA-4基因的C57BL/6小鼠皮下接種MC38腫瘤細胞（1 × 10 ⁶），腫瘤接種後第10天的平均腫瘤大小為373 mm ³。將動物隨機分組，接受人IgG1 10 mg/kg（G1）、伊匹木單抗模擬物 10 mg/kg（G2）、hIgG1 HCAb（PR271）5.4 mg/kg（G3）和抗CTLA-4單重鏈抗體5.4 mg/kg（G4）和1.5 mg/kg（G5）給藥。在第3天給予小鼠第二劑，24小時後實施安樂死，收集腫瘤、脾臟和血液樣本進行FACS分析。

主要終點是確定給藥後攜帶有腫瘤的小鼠中腫瘤、血液和脾臟中不同免疫細胞群比例的變化。採用單向重複測量方差分析（ANOVA）方法分析不同組之間的細胞群差異。採用Bonferroni's多重比較方法與溶媒組進行比較。

如圖4和表2中的結果所示，在腫瘤樣本中，於5.4mg/kg或1.5mg/kg劑量抗CTLA-4單重鏈抗體給藥組中觀察到CD4 ⁺T細胞中的T _reg比例降低，而在使用伊匹木單抗模擬物時未觀察到變化。在脾臟和血液樣本中，使用抗CTLA-4單重鏈抗體或伊匹木單抗模擬物時均未觀察到CD4 ⁺細胞中的T _reg比例有明顯改變。

表 2. T 細胞和 NK 細胞的比例

樣本	T 細胞和 NK 細胞的平均比例
分組	T 細胞	CD4+ T 細胞	CD8+ T 細胞	T reg	NK 細胞	NKT 細胞
腫瘤	第1組：hlgG（10 mg/kg）	5.76	2.11	1.93	16.94	2.50	0.27
第2組：伊匹木單抗模擬物（10 mg/kg）	6.29	2.22	2.33	12.05	2.14	0.32
第3組：hIgG1 HCAb（5.4 mg/kg）	5.79	1.85	2.47	15.50	1.67	0.29
第4組：抗CTLA-4單重鏈抗體（5.4 mg/kg）	6.01	2.20	2.05	4.88	2.01	0.28
第5組：抗CTLA-4單重鏈抗體（1.5 mg/kg）	5.95	1.80	2.40	2.74	2.80	0.33
脾臟	第1組：hlgG（10 mg/kg）	28.28	15.32	9.17	13.93	2.24	0.80
第2組：伊匹木單抗模擬物（10 mg/kg）	30.55	17.52	8.56	15.87	2.52	1.11
第3組：hIgG1 HCAb（5.4 mg/kg）	29.30	14.91	9.79	14.24	2.74	1.11
第4組：抗CTLA-4單重鏈抗體（5.4 mg/kg）	27.16	15.46	7.30	14.62	3.15	1.16
第5組：抗CTLA-4單重鏈抗體（1.5 mg/kg）	30.60	16.02	10.42	13.68	2.88	1.04
血液	第1組：hlgG（10 mg/kg）	30.35	18.45	10.73	0.60	3.49	0.19
第2組：伊匹木單抗模擬物（10 mg/kg）	33.39	19.77	11.41	1.15	4.40	0.47
第3組：hIgG1 HCAb（5.4 mg/kg）	36.06	20.39	13.21	0.49	3.85	0.58
第4組：抗CTLA-4單重鏈抗體（5.4 mg/kg）	29.03	17.43	9.14	0.72	4.81	0.60
第5組：抗CTLA-4單重鏈抗體（1.5 mg/kg）	33.35	18.79	12.05	0.39	4.18	0.56

實施例 3. 抗 CTLA-4 單重鏈抗體的藥代動力學結果雌性C57BL/6小鼠單次靜脈給藥後的抗CTLA-4單重鏈抗體藥代動力學

本研究的目的是確定雌性C57BL/6小鼠靜脈給藥後抗CTLA-4單重鏈抗體（PR218）的PK特徵。6隻SPF級C57BL/6小鼠（雌性）分別給予1和5 mg/kg的抗CTLA-4單重鏈抗體（N = 3）。在以下時間點採集血液血清樣本：給藥前、0.083 hr、第1、2、4、7、10和14天。藉由ELISA方法測定C57BL/6小鼠血清中的抗CTLA-4單重鏈抗體濃度。根據平均濃度-時間資料確定血清中的PR218 PK參數（t _1/2、C _max、總清除率 [CL]、穩態分佈容積 [Vss]、平均停留時間 [MRT]和濃度-時間曲線下面積 [AUC]）。採取非房室分析方法估計參數（WinNonlin ^®Professional 6.4, Pharsight, Mountain View, USA）。在使用WinNonlin進行的PK參數計算中，排除任何低於可計量水平的數值。

圖5中顯示了1 mg/kg和5 mg/kg靜脈劑量給藥後抗CTLA-4單重鏈抗體的平均血清濃度-時間曲線圖。抗CTLA-4單重鏈抗體的血清濃度隨著劑量的增高而增高，隨著時間的推移，呈雙相特徵。

在雌性C57BL/6小鼠中，1mg/kg 抗CTLA-4單重鏈抗體靜脈給藥後，t _1/2、C _max、時間0至末次可計量濃度間的濃度-時間曲線下面積（AUC _last）、AUC _INF、CL _Z、MRT _last和V _ss分別是2.22 ± 0.0281天、10.4 ± 0.758 µg/mL、16.1 ± 1.48 天*µg/mL、16.2 ± 1.52 天*µg/mL、62.1±58.0 mL/kg/天、2.05 ± 0.228天和134±12.1 mL/kg（表3）。

在雌性C57BL/6小鼠中，5mg/kg 抗CTLA-4單重鏈抗體靜脈給藥後，t _1/2、C _max、AUC _last、AUC _INF、CL _Z、MRT _last和V _ss分別是1.94 ± 0.718天、36.6±15.9 µg/mL、73.3±15.3 天*µg/mL、74.0±15.9 天*µg/mL、69.8±15.4 mL/kg/天、2.41±0.144天和176±40.5 mL/kg（表3）。

在1 mg/kg-5 mg/kg劑量範圍內，終末清除半衰期和CLz保持恆定，平均值分別約為2.1天和66.0 mL/kg/天。以AUCINF為參數測得的總暴露量顯示，在1 mg/kg-5 mg/kg劑量範圍內，與劑量成比例增高。資料表明，1 mg/kg-5 mg/kg的靜脈劑量範圍內，抗CTLA-4單重鏈抗體在小鼠中的PK呈線性。

表 3. 雌性 C57BL/6 小鼠中抗 CTLA-4 單重鏈抗體的藥代動力學參數

PK 參數	單位	1 mg/kg	5 mg/kg
平均值	SD	平均值	SD
t 1/2	天	2.22	0.0281	1.94	0.718
C max	µg/mL	10.4	0.758	36.6	15.9
AUC last	天*µg/mL	16.1	1.48	73.3	15.3
AUC INF	天*µg/mL	16.2	1.52	74.0	15.9
CL Z	mL/kg/天	62.1	5.80	69.8	15.4
MRT last	天	2.05	0.228	2.41	0.144
V SS	mL/kg	134	12.1	176	40.5

食蟹猴單次靜脈推注給藥後抗CTLA-4單重鏈抗體的藥代動力學研究

按照1、3和10 mg/kg劑量單次靜脈推注給予抗CTLA-4單重鏈抗體後，在食蟹猴中評價了抗CTLA-4單重鏈抗體的PK。將總計18隻食蟹猴（9隻雄性和9隻雌性）隨機分配至3組中，在每一劑量水平下測試。

在以下時間點採集用於PK評估的血液樣本：給藥前、給藥後0.033、0.5、2、4、8、24、48、72、96、120、144、312、480、648和816 hr（第35天）。採用經過驗證的ELISA方法測定抗CTLA-4單重鏈抗體的血清濃度。根據平均濃度-時間資料確定血清中的抗CTLA-4單重鏈抗體PK參數（t _1/2、C ₀時的C _max、CL、V _ss、AUC）。採取非房室分析估計參數。

為檢測抗CTLA-4單重鏈抗體給藥後生成的抗藥抗體（ADA），在以下時間點採集血液血清樣本：給藥前、給藥後312 hr（第14天）、480 hr（第21天）、816 hr（第35天）。採用經過驗證的點化學發光方法檢測ADA濃度。

給藥前，所有動物均未顯示任何可測得的ADA。在給藥後第14天，多數動物顯示ADA陰性，但1 mg/kg組3隻雌性動物中的1隻、3 mg/kg組3隻雌性動物中的2隻和10 mg/kg組所有3隻雄性和3隻雌性動物中的1隻例外，顯示ADA陽性，但效價較低。第21天，1 mg/kg組3隻雌性動物中的1隻、3 mg/kg組3隻雄性中的2隻和3隻雌性動物中的2隻和10 mg/kg組所有3隻雄性和3隻雌性動物中的1隻顯示ADA陽性，但效價較低。

第35天時，ADA陽性率增高，分別有1 mg/kg組3隻雄性中的1隻和3隻雌性中的2隻、3 mg/kg組3隻雄性中的2隻和所有雌性和10 mg/kg組所有3隻雄性和3隻雌性動物中的2隻顯示ADA陽性。

圖6顯示了食蟹猴中單次1、3和10 mg/kg靜脈劑量給藥後抗CTLA-4單重鏈抗體的平均血清濃度-時間曲線圖。

食蟹猴中靜脈給予1、3和10 mg/kg劑量的抗CTLA-4單重鏈抗體後，初始時間點C ₀達到的C _max（首次注射後立即測量的濃度）分別為25.2 ± 2.33 µg/mL、82.9 ± 12.6 µg/mL和244 ± 22.9 µg/mL；t1/2分別是3.02 ± 0.490天、2.77 ± 0.482天和2.55 ± 0.412天；AUC _last分別是26.2 ± 3.74 µg*天/mL、75.9 ± 4.48 µg*天/mL和231 ± 23.0 µg*天/mL；AUC _INF分別是26.6 ± 3.71 µg*天/mL、76.8 ± 4.69 µg*天/mL和233 ± 23.2 µg*天/mL；CL分別是38.4 ± 6.05 mL/天/kg、39.2 ± 2.52 mL/天/kg和43.3 ± 4.38 mL/天/kg；Vd分別是112 ± 14.3 mL/kg、109±8.67 mL/kg和118 ± 19.3 mL/kg（表4）。

1、3和10 mg/kg劑量組間，t _1/2和CL保持恆定。在1 mg/kg - 10 mg/kg劑量範圍內，C ₀和以AUC _INF為參數測量的總暴露量顯示與劑量成比例增高。資料表明，在1 mg/kg - 10 mg/kg靜脈劑量範圍內，抗CTLA-4單重鏈抗體在食蟹猴中的PK呈線性。

表 4. 雄性和雌性食蟹猴中抗 CTLA-4 單重鏈抗體的藥代動力學參數

PK 參數	抗 CTLA-4 單重鏈抗體靜脈給藥
1 mg/kg （ N=6 ）	3 mg/kg （ N=6 ）	10 mg/kg （ N=6 ）
平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD
C0（µg/mL）	25.2	2.33	82.9	12.6	244	22.9
t1/2（天）	3.02	0.490	2.77	0.482	2.55	0.412
Vd（mL/kg）	112	14.3	109	8.67	118	19.3
CL（mL/天/kg）	38.4	6.05	39.2	2.52	43.3	4.38
AUClast （µg*天/mL）	26.2	3.74	75.9	4.48	231	23.0
AUCinf （µg*天/mL）	26.6	3.71	76.8	4.69	233	23.2

實施例 4. 抗 CTLA-4 單重鏈抗體在 患者體內的藥代動力學結果藥物資訊 抗CTLA-4單重鏈抗體注射劑，每瓶含有4.0mL藥液，含80mg的抗CTLA-4單重鏈抗體（具有SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列），當日給藥，給藥量按體重計算，保存於2-8℃下，使用原始包裝直立儲存藥品。

配藥方式為：從瓶中抽取所需劑量的抗CTLA-4單重鏈抗體，加入0.9%氯化鈉注射液或5%葡萄糖注射液輸液袋中稀釋，稀釋濃度範圍為0.12mg/mL~10.0mg/mL。

要求靜脈滴注稀釋液90分鐘以上，但不應超過4小時，即輸注時間控制在90分鐘~4小時內。如果抗CTLA-4單重鏈抗體注射劑配製成50 mL的稀釋液，應控制滴注速率為0.21mL/min~0.56mL/min；如果抗CTLA-4單重鏈抗體注射劑配製成100 mL的稀釋液，應控制滴注速率為0.42mL/min~1.1 mL/min。靜脈滴注時，需採用含有0.2微米的線上濾膜、無菌、無致熱源、低蛋白結核的篩檢程式的靜脈滴注器，靜脈輸注後，使用20mL 0.9%氯化鈉注射液或5%葡萄糖注射液沖靜脈滴注器管道。 給藥資訊

給予一部分癌症患者輸注抗CTLA-4單重鏈抗體注射劑，分為三隊列給藥：第一個隊列患者給藥設計是0.3mg/kg，每週一次給藥；第二個隊列患者給藥設計是0.6mg/kg，每三週一次給藥；第三個隊列患者給藥設計是0.45mg/kg，每三週一次給藥。

另一部分癌症患者輸注伊匹木單抗(Ipilimumab)，分為2個隊列給藥：第一個隊列患者給藥設計是0.3mg/kg，每三週一次給藥；第二個隊列患者給藥設計是3mg/kg，每三週一次給藥。 資料獲取

在患者（Australia Patients）給藥前以及給藥一個迴圈後不同時間點採集外周血，以檢測藥代動力學（PK）資料及血清中的抗CTLA-4單重鏈抗體濃度以及抗藥抗體（ADA）。

採用經全面驗證的電化學發光方法（ECL）檢測人血清中抗CTLA-4單重鏈抗體的濃度。分析方法的定量下限（LLOQ）為20.5 ng/mL，定量上限為5000.0 ng/mL，超出定量上限的樣品可進行最高400倍稀釋。樣品在室溫、冷藏及冷凍條件下均有很好的穩定性。

採用經全面驗證的橋接電化學發光方法（ECL）分析抗藥抗體（ADA），採用多層級的分析方法，即首先對所有樣品進行篩選試驗，其次對疑似抗體陽性樣品的特異性進行確證試驗，對已確定抗體陽性的樣品進行效價試驗。該分析方法篩選分析靈敏度為34.0 ng/mL。在採集的樣品藥物濃度水平下藥物耐受良好。

採取非房室分析方法估計PK參數。

在晚期實體瘤受試者中測試的各劑量水平抗CTLA-4單重鏈抗體的血清抗CTLA-4單重鏈抗體濃度-時間曲線見圖7，PK參數總結見表5。

表 5 受試者中抗 CTLA-4 單重鏈抗體的藥代動力學參數

在晚期實體瘤受試者中觀察到的PK特性與臨床前預測的類似： 半衰期短（大約2~4天），因而多次給藥後積蓄小；對比伊匹木單抗的半衰期為14.7天； 暴露量（AUC）與預測值接近，遠低於伊匹木單抗同劑量下的暴露量； AUC 隨劑量增加而增加，與劑量基本呈比例； 另外，資料顯示抗CTLA-4單重鏈抗體免疫原性低：13位患者中只有一人在一個訪視時檢測到ADA陽性，效價為2。

實施例 5. 抗 CTLA-4 單重鏈抗體的抗腫瘤活性藥物資訊

抗CTLA-4單重鏈抗體注射劑，每瓶含有4.0mL藥液，含80mg的抗CTLA-4單重鏈抗體（具有SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列），當日給藥，給藥量按體重計算，保存於2-8℃下，使用原始包裝直立儲存藥品。

配藥方式為：從瓶中抽取所需劑量的抗CTLA-4單重鏈抗體，加入0.9%氯化鈉注射液或5%葡萄糖注射液輸液袋中稀釋，稀釋濃度範圍為0.12mg/mL~10.0mg/mL。

要求靜脈滴注稀釋液90分鐘以上，但不應超過4小時，即輸注時間控制在90分鐘~4小時內。如果抗CTLA-4單重鏈抗體注射劑配製成50 mL的稀釋液，應控制滴注速率為0.21mL/min~0.56mL/min；如果抗CTLA-4單重鏈抗體注射劑配製成100 mL的稀釋液，應控制滴注速率為0.42mL/min~1.1 mL/min。靜脈滴注時，需採用含有0.2微米的線上濾膜、無菌、無致熱源、低蛋白結核的篩檢程式的靜脈滴注器，靜脈輸注後，使用20mL 0.9%氯化鈉注射液或5%葡萄糖注射液沖靜脈滴注器管道。 抗腫瘤評估

給腫瘤患者輸注抗CTLA-4單重鏈抗體注射劑，在腫瘤患者中共進行了2次抗腫瘤評估，每次抗腫瘤評估中，分為三隊列給藥：第一個隊列患者給藥設計是0.3mg/kg，每週一次給藥；第二個隊列患者是0.6mg/kg，每三週一次給藥；第三個隊列患者是0.45mg/kg，每三週一次給藥。

臨床療效方面，11例患者完成了第1次腫瘤評估，其中9例維持疾病穩定（SD）。HCC患者中觀察到腫瘤較基線縮小22%，AFP下降至正常水平。CRPC患者實現「PSA緩解」，PSA從基線210 μg/L下降超過50%至91μg/L，維持至今（近8月），最近一次複查顯示PSA仍維持在78 μg/L，患者感覺良好。EC和PRCC兩位患者觀察到6-14%腫瘤退縮。7例患者完成了第2次腫瘤評估，2例維持疾病穩定（SD），1例疾病緩解（PR，腫瘤較基線下降約50%，AFP維持正常至今），1例RCC患者觀察到部分靶病灶顯著退縮。抗CTLA-4單重鏈抗體的治療結果總結於表6中。

表 6. 抗 CTLA-4 單重鏈抗體的 抗腫瘤效應

	劑量水平	評估患者數	PR數	SD數	PD數	測試結果
第一次 腫瘤評估	0.3MG/KG QW	6	0	5	1	子宮內膜癌(EC)縮小14％ PRCC縮小14%
0.6MG/KG Q3W	4	0	3	1	***癌（CRPC）: PSA從基線210 ΜG/L下降至91ΜG/L
0.45MG/KG Q3W	1	0	1	-	肝細胞癌（HCC）患者AFP從170µG/L下降至5µG/L，腫瘤較基線縮小22%到正常水平
第二次 腫瘤評估	0.3MG/KG QW	4	0	1	3
0.6MG/KG Q3W	2	0	1	1	腎癌（RCC）:SD(TL3  38%減少，TL5 48%增加)
0.45MG/KG Q3W	1	1	-	-	肝細胞癌（HCC） 患者AFP 將至正常範圍（7µG/L），腫瘤較基線縮小48.9%，到正常水平

實施例 6. 抗 CTLA-4 單重鏈抗體在 典型患者中的治療結果患者1

給予癌症患者1靜脈輸注抗CTLA-4單重鏈抗體，患者資訊如下表7所示，患者先前接受過外科手術和放射治療，先前服用倫伐替尼、索拉非尼和SHR1701-001（2020-Sep-08, 恒瑞PD-1; PD），停藥原因不明，並且先前接受過PD-1/PD-L1免疫治療。

表 7. 患者 1 的資訊

	患者1
性別	男性（亞裔）
年齡	64
診斷	2010年7月20日診斷為 HCC
腫瘤類型	TNM = T? N? M1 IV期臨床
既往疾病	慢性乙型肝炎；額葉海綿狀血管瘤；輕度十二指腸炎；胃食管反流病; 右耳輕度聽力下降；中度貧血；中度血小板減少症；皮膚乾燥
基線血液學	輕度淋巴細胞減少，血小板減少，中度貧血
基準生化	中度AST和ALT升高而無黃疸；低白蛋白血症
既往癌症	無
基線腫瘤評估	總目標病變的總和（右上肝，右腎） 非標靶：左胸腔積液；多發性肝轉移；多個淋巴結轉移
第6週的腫瘤評估	右上肝病變從15cm減少到8cm，減少約47％ 右腎病變從6cm下降到3.6cm約減少40％ 兩個肝內轉移/原始病變從2-2.5cm和3.4-4.4cm顯著增加

給予患者1輸注抗CTLA-4單重鏈抗體注射劑，其中每瓶含有4.0mL藥液，含80mg的抗CTLA-4單重鏈抗體（序列如SEQ ID NO:33所示），當日給藥，給藥量按體重計算，保存於2-8℃下，使用原始包裝直立儲存藥品。

配藥方式為：從瓶中抽取所需劑量的抗CTLA-4單重鏈抗體，加入0.9%氯化鈉注射液或5%葡萄糖注射液輸液袋中稀釋，稀釋濃度範圍為0.12mg/mL~10.0mg/mL。

要求靜脈滴注稀釋液90分鐘以上，但不應超過4小時，即輸注時間控制在90分鐘~4小時內。如果抗CTLA-4單重鏈抗體注射劑配製成50 mL的稀釋液，應控制滴注速率為0.21mL/min~0.56mL/min；如果抗CTLA-4單重鏈抗體注射劑配製成100 mL的稀釋液，應控制滴注速率為0.42mL/min~1.1 mL/min。靜脈滴注時，需採用含有0.2微米的線上濾膜、無菌、無致熱源、低蛋白結核的篩檢程式的靜脈滴注器，靜脈輸注後，使用20mL 0.9%氯化鈉注射液或5%葡萄糖注射液沖靜脈滴注器管道。

患者1的給藥劑量0.45mg/kg，每三週一次給藥，給藥三次。

患者輸注抗CTLA-4單重鏈抗體後的指標性狀如表8-9所示。

表 8 ：患者 1 病變指標

	位置	基線	6 週	12 週	16 週
目標病變	右上肝	14.5*10cm	12*8cm	8.5*4.5cm	7.5*4.0cm
右腎	8*7cm	3*5.5cm	3*2cm	3*2cm
基線變化	NA	22%	48.9%	53.3%
非目標	肺	Present	Not present	Not present	Present
肝	Present	Present	Not present	Not present
LN	Present	未確定	Not present	Present
總體反應	SD	PR	PR

表 9 ：患者 1 其它指標

指標	2020-10	2020-11	2020-12	2021-1	2021-2
AFP	170	5	5	7	9
生物化學	肝功能升高； G3總膽紅素升高
肝活檢	其特徵與慢性肝炎相符……炎症性狀並不完全是特異性的，鑒別診斷將包括藥物性肝損傷（包括自身免疫性特徵），自身免疫性肝炎和感染……建議進行輔助檢查……”

由表8和表9可以看出，患者1輸注抗CTLA-4單重鏈抗體後，腫瘤明顯減小，腫瘤基線變化超50%，腫瘤生物標誌物明顯減少，肝功明顯恢復。 患者2

給予癌症患者2靜脈輸注抗CTLA-4單重鏈抗體，患者資訊如下表10所示，患者先前接受過***切除術（2001年2月15日）和未接受放射治療，先前進行過Docetaxel、Cabazitaxel、Cosudex、Zoladex化療，沒有接受過PD-1/PD-L1免疫治療，現在服用過地高辛（Digoxin）；利伐沙班（rivaroxaban）；維拉帕米（verapamil）；鈣鹽；維生素D；地諾單抗（denosumab）；二噻嗪（dithiazide）藥物。

表 10. 患者 2 的資訊

	患者 2
性別	男性
年齡	80
診斷	***浸潤性腺癌（高分化）
腫瘤類型	TNM = Tx Nx M1 Ⅳ期臨床
既往癌症	無
既往疾病	骨質疏鬆症；***癌；抗凝治療；心房顫動；高血壓；骨轉移； 液體瀦留；直立性暈厥；右腳踝扭傷；右臂骨折
基線腫瘤評估	總靶病變（右腋窩）為30mm；骨轉移
第1次腫瘤評估	PR
第2次腫瘤評估	SD

給予患者2輸注的抗CTLA-4單重鏈抗體注射劑，每瓶含有4.0mL藥液，含80mg的抗CTLA-4單重鏈抗體，當日給藥，給藥量按體重計算，保存於2-8℃下，使用原始包裝直立儲存藥品。

配藥方式為：從瓶中抽取所需劑量的抗CTLA-4單重鏈抗體，加入0.9%氯化鈉注射液或5%葡萄糖注射液輸液袋中稀釋，稀釋濃度範圍為0.12mg/mL~10.0mg/mL。

要求靜脈滴注稀釋液90分鐘以上，但不應超過4小時，即輸注時間控制在90分鐘~4小時內。如果抗CTLA-4單重鏈抗體注射劑配製成50 mL的稀釋液，應控制滴注速率為0.21mL/min~0.56mL/min；如果抗CTLA-4單重鏈抗體注射劑配製成100 mL的稀釋液，應控制滴注速率為0.42mL/min~1.1 mL/min。靜脈滴注時，需採用含有0.2微米的線上濾膜、無菌、無致熱源、低蛋白結核的篩檢程式的靜脈滴注器，靜脈輸注後，使用20mL 0.9%氯化鈉注射液或5%葡萄糖注射液沖靜脈滴注器管道。

患者2的給藥劑量0.6mg/kg，每三週一次給藥，給藥三次。

患者抗CTLA-4單重鏈抗體給藥後的指標性狀如表11-12所示。

表 11. 患者 2 病變指標

	位置	基線	6 週	12 週	9 個月
目標病變	淋巴結	30mm	30mm	30mm	23mm
腎上腺	15mm	15mm	15mm	18mm
非目標	骨頭	Present	Present	Present	Present
總體反應	SD具有PSA回應（下降幅度超過50％）

表 12. 患者 2 其它指標

臨床症狀	G2腹瀉加重
內視鏡檢查	確診的免疫相關性結腸炎
活檢	A.迴腸活檢-無明顯異常。 B. CAECUM BIOPSY-輕度局灶性結腸炎。 C.肝撓曲性活檢-局灶性活動性結腸炎。 D. SIGMOID BIOPSY-局灶性活動性結腸炎。 E.直腸活檢-活動性結腸炎伴凋亡增加
生物標誌物	2020-5	2020-6	2020-12	2021-2
PSA	240	92	89	78

由表11和表12可以看出，患者2輸注抗CTLA-4單重鏈抗體後，腫瘤明顯減小，腫瘤基線變化超50%，腫瘤生物標誌物明顯減少。

綜上所述，結合臨床資料及觀察，抗CTLA-4單重鏈抗體的總體臨床表現包括：患者對於抗CTLA-4單重鏈抗體的耐受性良好，所發生的不良事件符合同靶點毒性預期，較同類靶點藥物毒性譜更集中於消化道系統，而較少發生於皮膚肝腎肺等器官，且未觀察到嚴重的消化系統特異性病理改變及其相關臨床風險（消化道穿孔風險，嚴重的腸黏膜損傷等）。包含起始劑量在內的不同劑量組，均觀察到了明確的抗腫瘤效應，且在部分難治性瘤種中（如多線治療失敗後的冷腫瘤「CRPC」；多線治療失敗後的末線HCC；）觀測到符合現行指南所規定的「顯著臨床獲益」（「疾病緩解」；「腫瘤標記物PSA緩解」等）並持續至今。

抗CTLA-4單重鏈抗體的半衰期短（約2-4天，相對於伊匹單抗的半衰期為14.7天），因而多次給藥後積蓄小。暴露量（AUC）與預測值接近，遠低於伊匹木單抗同劑量下的暴露量。AUC隨劑量增加而增加。出人意料的是，在較短的半衰期、較低的藥物積蓄和暴露量的情況下，在患者中仍然觀察到長時間維持的PD標誌物變化（CD8 T細胞/Treg比例、ICOS+ T細胞和Ki67+ T細胞增加）和顯著的抗腫瘤效應。此發現支持抗CTLA-4單重鏈抗體的Q3W給藥，同時表明抗CTLA-4單重鏈抗體在短半衰期減小藥物暴露的同時仍然可以維持可靠的長時間藥效，具備進一步開發長週期給藥或者必要時給藥的臨床應用可能性。

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序列表Gly Phe Thr Val Ser Lys Asn Tyr Met Ser（SEQ ID NO:1） Gly Phe Asn Val Ser Lys Asn Tyr Met Ser（SEQ ID NO:2） Gly Phe Asn Val Ser Lys Asn Tyr Met Ser（SEQ ID NO:3） Gly Phe Thr Val Ser Lys Asn Tyr Met Ser（SEQ ID NO:4） Gly Phe Thr Val Ser Lys Asn Tyr Met Ser（SEQ ID NO:5） Gly Phe Thr Val Ser Lys Asn Tyr Met Ser（SEQ ID NO:6） Gly Phe Thr Val Ser Lys Asn Tyr Met Ser（SEQ ID NO:7） Gly Phe Thr Val Ser Lys Asn Tyr Met Ser（SEQ ID NO:8） Val Val Tyr Ser Gly Gly Ser Lys Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly（SEQ ID NO:9） Val Val Tyr Ser Gly Gly Ser Lys Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly（SEQ ID NO:10） Val Val Tyr Ser Gly Gly Ser Lys Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly（SEQ ID NO:11） Val Val Tyr Ser Gly Gly Ser Lys Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly（SEQ ID NO:12） Val Val Tyr Ser Gly Gly Ser Lys Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly（SEQ ID NO:13） Val Val Tyr Ser Gly Gly Ser Lys Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly（SEQ ID NO:14） Val Val Tyr Ser Gly Gly Ser Lys Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly（SEQ ID NO:15） Val Val Tyr Ser Gly Gly Ser 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Thr Met Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys （SEQ ID NO:39） Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Val Ser Lys Asn Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Val Val Tyr Ser Gly Gly Ser Lys Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Val Pro His Ser Pro Ser Ser Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys （SEQ ID NO:40）

無

圖1是根據本發明實施方案的「劑量爬坡」和「劑量擴展」實驗的示意圖； 圖2是根據本發明實施方案的i3+3劑量爬坡演算法展示圖； 圖3是根據本發明實施方案的抗CTLA-4單重鏈抗體殺傷Treg細胞的結果圖；ISO：同種型對照； 圖4是根據本發明實施方案的抗CTLA-4單重鏈抗體殺傷腫瘤樣本中CD45 ⁺細胞中的T _reg細胞的結果圖；其中，G1：hIgG1，10 mg/kg；G2：伊匹木單抗模擬物，10 mg/kg；G3：hIgG1 HCAb，5.4 mg/kg；G4：HBM4003，5.4 mg/kg；G5：HBM4003，1.5 mg/kg； 圖5是根據本發明實施方案的1 mg/kg和5 mg/kg靜脈劑量給藥後抗CTLA-4單重鏈抗體的平均血清濃度-時間曲線圖； 圖6是根據本發明實施方案的食蟹猴中單次1、3和10 mg/kg靜脈劑量給藥後抗CTLA-4單重鏈抗體的平均血清濃度-時間曲線圖； 圖7是根據本發明實施方案的抗CTLA-4單重鏈抗體在患者體內的藥代動力學結果； 其中，A和B: 0.3 mg/kg首次給藥後C1D1~C1D7和0.45 mg/kg及0.6 mg/kg首次給藥後C1D1~C1D21的血清抗CTLA-4單重鏈抗體濃度-時間曲線，A為對數尺度作圖，B為線性尺度作圖。C和D: 0.3 mg/kg多次給藥後C1D22~C1D28的血清抗CTLA-4單重鏈抗體濃度-時間曲線，C為對數尺度作圖，D為線性尺度作圖。

無。

Claims (23)

1. 一種在受試者中清除調節性T細胞（Treg）和/或增加CD8+ T細胞/Treg細胞比例的方法，其中，給予受試者施用抗CTLA-4單重鏈抗體。
2. 如請求項1所述的方法，其中，所述受試者為癌症患者； 任選地，所述受試者為子宮內膜癌、腎非透明細胞癌、腎透明細胞癌、非小細胞肺癌、頭頸癌、乳腺癌、去勢抵抗性***癌、睾丸癌、尿路上皮癌、肝癌、食管癌、間皮瘤、黑色素瘤或神經內分泌瘤患者。
3. 一種在受試者中治療難治性癌症的方法，其中，給予受試者施用抗CTLA-4單重鏈抗體。
4. 如請求項3所述的方法，其中，所述難治性癌症對一種或多種免疫檢查點抑制劑例如PD-1/PD-L1軸訊號通路抑制劑不回應或耐受。
5. 如請求項3或4所述的方法，其中，所述治療難治性癌症為原發性肝癌（HCC）或去勢抵抗性***癌（CRPC）。
6. 一種治療癌症的方法，其中，包括對所述受試者施用抗CTLA-4單重鏈抗體和任選地第二治療劑的步驟。
7. 如請求項6所述的方法，其中，所述第二治療劑選自一種或多種免疫檢查點抑制劑例如PD-1/PD-L1軸訊號通路抑制劑； 任選地，所述第二治療劑抗PD-1單克隆抗體，例如派姆單抗(Perbrolizumab)、納武單抗(Nivolumab)、或特瑞普利(Toripalimab)。
8. 如請求項6所述的方法，其中，所述第二治療劑為化療藥物，例如紫杉醇或卡鉑。
9. 一種預防和/或減少CTLA4抗體治療癌症時副作用的方法，其中，向所述受試者施用抗CTLA-4單重鏈抗體。
10. 一種抗CTLA-4單重鏈抗體的給藥方法，其中，包括將所述抗CTLA-4單重鏈抗體以0.1mg/mL-10.0mg/mL的濃度藉由靜脈滴注的形式輸入患者體內；較佳地，所述抗CTLA-4單重鏈抗體以0.9%氯化鈉或5%葡萄糖溶液的形式提供；較佳地，所述靜脈滴注的時間不超過4小時。
11. 如請求項1~10任一項所述的方法，其中，給予受試者以0.2mg~1mg/kg體重的劑量施用抗CTLA-4單重鏈抗體； 任選地，給藥週期為每週~每12週給藥一次，任選地，給藥週期為每週、每2週、每3週、每4週、每5週、每6週、每7週、每8週、每9週、每10週、每11週或每12週給藥一次； 較佳地，以0.3-0.6mg/kg的劑量向受試者施用抗CTLA-4單重鏈抗體； 較佳地，以0.3mg/kg-0.6mg/kg的劑量每3週一次給予受試者施用抗CTLA-4單抗重鏈抗體； 較佳地，以0.3mg/kg-0.45mg/kg的劑量每3週一次給予受試者施用抗CTLA-4單抗重鏈抗體； 較佳地，以0.3mg/kg的劑量每週一次給予受試者施用抗CTLA-4單重鏈抗體； 較佳地，以0.45mg/kg的劑量每3週一次給予受試者施用抗CTLA-4單重鏈抗體； 較佳地，以0.6mg/kg的劑量每3週一次給予受試者施用抗CTLA-4單重鏈抗體。
12. 一種實現癌症患者長週期給藥或者必要時給藥的方法，其中，向所述受試者施用抗CTLA-4單重鏈抗體。
13. 如請求項12所述的方法，其中，所述長週期給藥是指給藥週期不小於4週，較佳地，不小於6週、7週、8週、9週、10週、11週或12週，例如，6週或12週。
14. 如請求項12所述的方法，其中，所述受試者的不能維持疾病穩定（SD）、部分緩解（PR）或完全緩解（CR）狀態，是必要時給藥的指示； 任選地，所述受試者不能維持SD、PR或CR狀態，給予所述受試者施用抗CTLA-4單重鏈抗體直到受試者恢復SD、PR或CR狀態； 任選地，所述施用抗CTLA-4單重鏈抗體的持續時間為2~4個給藥週期； 任選地，向受試者以0.2mg~1mg/kg體重的劑量施用所述抗CTLA-4單重鏈抗體，較佳為0.3-0.6mg/kg。
15. 一種單位劑量組合物，其包含20-200 mg的抗CTLA-4單重鏈抗體。
16. 如請求項15所述的單位劑量組合物，其中，包含60-100mg的所述抗CTLA-4單重鏈抗體，較佳地，包含80mg的所述抗CTLA-4單重鏈抗體。
17. 一種抗CTLA-4單重鏈抗體在製備藥物中的用途，所述藥物用於治療受試者中的CTLA-4相關疾病例如癌症，所述藥物配製成以0.2mg~1mg/kg劑量施用的形式。
18. 如請求項17所述的用途，所述藥物配製成以0.3mg/kg-0.6mg/kg的劑量每3週一次劑量施用的形式； 較佳地，0.45mg/kg-0.6mg/kg的劑量每3週一次給予受試者施用抗CTLA-4單抗重鏈抗體； 較佳地，所述藥物配置成以0.45mg/kg的劑量每3週一次劑量施用的形式。
19. 如請求項1~18任一項所述的方法、單位劑量組合物或用途，其中，所述抗CTLA-4單重鏈抗體具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有SEQ ID NO:1~8任一所示的胺基酸序列；所述CDR2具有SEQ ID NO:9~16任一所示的胺基酸序列；所述CDR3具有SEQ ID NO:17~24任一所示的胺基酸序列； 任選地，抗CTLA-4單重鏈抗體具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3分別具有SEQ ID NO:1，9和17所示的胺基酸序列； 任選地，抗CTLA-4單重鏈抗體具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3分別具有SEQ ID NO:2，10和18所示的胺基酸序列； 任選地，抗CTLA-4單重鏈抗體具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3分別具有SEQ ID NO:3，11和19所示的胺基酸序列； 任選地，抗CTLA-4單重鏈抗體具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3分別具有SEQ ID NO:4，12和20所示的胺基酸序列； 任選地，抗CTLA-4單重鏈抗體具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3分別具有SEQ ID NO:5，13和21所示的胺基酸序列； 任選地，抗CTLA-4單重鏈抗體具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3分別具有SEQ ID NO:6，14和22所示的胺基酸序列； 任選地，抗CTLA-4單重鏈抗體具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3分別具有SEQ ID NO:7，15和23所示的胺基酸序列； 任選地，抗CTLA-4單重鏈抗體具有CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3分別具有SEQ ID NO:8，16和24所示的胺基酸序列。
20. 如請求項19所述的方法、單位劑量組合物或用途，其中，所述抗CTLA-4單重鏈抗體具有重鏈可變區，所述重鏈可變區具有SEQ ID NO:25~32任一所示的胺基酸序列。
21. 如請求項19所述的方法、單位劑量組合物或用途，其中，所述抗CTLA-4單重鏈抗體具有SEQ ID NO:33~40任一所示的胺基酸序列。
22. 一種「鐘擺運動」式抗腫瘤藥物的給藥劑量確定方法，其中， 1) 將待測定藥物按照預定劑量梯度在廣泛瘤種中進行劑量爬坡實驗，以便獲得待測定藥物在預定劑量下的療效資料以及毒性資料； 2) 基於待測定藥物在預定劑量下的療效資料以及毒性資料，確定待測定藥物在所述預定劑量下是否在特定瘤種中進行劑量擴展實驗， 3) 重複步驟2)，以便確定待測定藥物在更高預定劑量下是否在特定瘤種中進行劑量擴展實驗。
23. 一種確定抗腫瘤藥物的給藥形式的方法，其包括： 將待測藥物施於測試模型，在預定給藥劑量、給藥次數和給藥週期的進行試驗，以便獲得待測藥物的優勢給藥形式，其中，測試模型的SD、PR或CR處於穩定狀態，是優勢給藥形式的指示； 較佳地，進一步包括將第二治療劑施於測試模型，在預定給藥劑量、給藥次數和給藥週期的進行試驗，以便獲得第二治療劑的優勢給藥形式， 其中，測試模型的SD、PR或CR依然處於穩定狀態，是第二治療劑的優勢給藥形式的指示； 任選地，測試模型的SD、PR或CR不能維持穩定狀態，將待測藥物再次施於測試模型，以便使得測試模型的SD、PR或CR重新處於穩定狀態。

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