TW202234045A - 目標物質檢測方法、設備和試劑 - Google Patents

Abstract

在第1反應場所中，在固定於固相的第1捕捉物質和用標示物質標示的第2捕捉物質之間，藉由將目標物質夾在中間（sandwich），形成複合體；將含標示物質部分由前述複合體中分離，使其移動至第2反應場所；在第2反應場所，藉由基於標示物質的信號（signal），檢測目標物質，提供目標物質的檢測方法。藉由此技術，可以比傳統技術更高靈敏度且價格便宜地檢測試樣中的目標物質。

Description

目標物質檢測方法、設備和試劑

本發明係有關於檢測試樣中的目標物質（target substance）的檢測方法和檢測設備，特別是有關於可以高靈敏度且價格便宜地檢測利用免疫反應捕捉到的目標物質的檢測方法、以及檢測設備和試劑。 【技術背景】

一直以來，已知免疫測定法（immunoassay）係藉由檢測與疾病相關的特定抗原或抗體作為生物標記（biomarker）來定量分析疾病的發現或治療的效果。近年來，更有效的生物標記的檢測為目的，對於進行微量生物標記檢測的高靈敏度檢測（high sensitivity detection）的需求不斷提高。免疫測定法的其中一者的酵素結合免疫吸附分析法（Enzyme-liked Immunosorbent Assay；ELISA）《本說明書中，也稱為『ELISA』》，係在試樣溶液中所包含的目標的抗原、抗體或核酸，用與特異抗體或目標抗體結合的抗原、互補的核酸捕捉的同時，利用酶促反應檢測的方法，由於成本等優勢，被廣泛地使用。

酵素結合免疫吸附分析法（ELISA），係可以定量檢測目標物質的檢測方法，現今普遍採用的酵素結合免疫吸附分析法（ELISA），係在96小井（well）微量盤（microplate）上進行作業，步驟數量多，變成需要繁雜的作業；又，因為經過複數的反應步驟，獲得測量結果需要大量的勞動和時間，因此，尋求縮短作業時間和反應時間；還有，也尋求更進一步的高靈敏度檢測。

為了達成高靈敏度檢測，被認為要提高酵素（enzyme）和受質（substrate）的反應性；因此，提出將免疫複合體（immune complex）《標示化合物（labelled compound）》從固態游離出來，使其在自由液體介質（free liquid medium）中反應的技術《專利文獻1》。於此專利文獻1中，將生物素（biotin）或功能化偶氮染料（functionalized azo dyes）和卵白素（avidin）引入免疫複合體，設計成免疫複合體的構造成分；舉例來說，作為標示化合物，以鏈黴親和素－生物素鍵結（streptavidin-biotin binding）為媒介，製備與信息基團（reporter group）結合的基團；在固相上形成免疫複合體，以鏈黴親和素－生物素鍵結（streptavidin-biotin binding）為媒介，將信息基團引入免疫複合體。然後，加入過量的鏈黴親和素（streptavidin），複合體中的鏈黴親和素，被加入的鏈黴親和素取代，免疫複合體中的信息基團游離出來。所以，於此技術中，檢測在自由液體介質內的信息基團，可以探討檢體中的被檢物濃度；比起檢測鍵結於被固定在固相的免疫複合體的信息分子，檢測游離出來的信息分子，在與分析試劑的反應性這一點，是較有利的。

另一方面，藉由微細加工技術，開發了在微米級（micrometer scale；μm scale）的微小容器中進行反應的微型反應器（microreactor），使用反應場所變成為小空間的微型反應器的話，可以期待反應速度被提升。運用微小流徑或反應腔室（reaction chamber）在微型反應器上實現淬取或分離等的實驗作業，這樣的情形稱為晶片上實驗室（Lab-on-a-Chip）。因此，有人提出在圓盤型的碟片（disc）上作成微型反應器，藉由旋轉產生的離心力，分配試樣液體，分離生物材料（biological material）《專利文獻2》。又，也有人提出在圓盤型的碟片（disk）上作成複數的腔室（chambers）或流徑（flow path）、儲器（reservoir）等，藉由使碟片旋轉，執行試劑的液體輸送和廢液，將在小井中進行的免疫測定的程序（procedure）以微型反應器執行《專利文獻3》。

再進一步，在微型反應器中的免疫測定，以檢測低濃度的目標物質為目標，使用標示珠（labelled beads）的方法《專利文獻4》已經被提出。舉例來說，於專利文獻4中，顯示設計了已充填在表面有抗體改質（modify）的標示珠的珠子（beads）充填部分或檢測區域的圓盤形狀的碟片，因而，揭示：注入碟片的試樣異體中的抗原被標示珠上的抗體捕捉的同時，在標示珠上與抗原鍵結的標示珠複合體，藉由碟片的旋轉，被送出到檢測區域，被固定在檢測區域的抗體捕捉到；此已鍵結的標示珠複合體，藉由光碟片設備的光學讀取裝置計算數量，檢測試樣中的目標物質。

又，近年來，利用珠子和凹下狀態裝設飛升《或稱：毫微微升》（femtoliter）尺寸的微小井（microwell）的陣列（array）組合的方法，執行酵素結合免疫吸附分析法（ELISA）的系統已被開發出來；詳細地說，相對於試樣溶液中的抗原，在珠子上建構三明治《或稱：雙抗夾心》酵素結合免疫吸附分析法（Sandwich ELISA）《抗體、抗原、酵素標示抗體（enzyme labelled antibody）的免疫複合體》，接下來，在凹下狀態裝設飛升尺寸的微小井的陣列上，引入受質的同時也引入含有珠子的溶液，被引入的珠子的一部分，靠著重力，被收存於微小井內；然後，除去未收存使用的珠子，將陣列影像化。由於微小井設計成一個小井只能放入一個珠子，只有收存了形成免疫複合體的珠子的小井，藉由標示酵素，將受質轉變成螢光物質，螢光小井作數位計數的話，即使目標物質的濃度低也可以執行其檢測《非專利文獻1、2》。

【專利文獻】

【專利文獻1】特表平6-505802 【專利文獻2】特開2008-185423 【專利文獻3】特表2002-503331 【專利文獻4】特開2012-255772 【非專利文獻】

【非專利文獻1】David H. Wilson等，The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing， Journal of Laboratory Automation 2016，卷 21(4) 頁533-547 【非專利文獻2】飯野亮太，由單分子數位 ELISA產生的感染．疾病生物標示物的超高靈敏度檢測，https://groups.ims.ac.jp/organization/iino_g/pdf/2013ultraprecision.pdf

[發明所要解決的問題]

但是，於專利文獻1所記載的技術，僅僅揭示：使標示物質的信息分子游離於自由液體介質，於該液體中與受質反應，希望可以檢測低濃度的目標物質的檢測敏感度提高或反應性提高的表現則不充分。

再說，於專利文獻2中，並未揭示任何有關高靈敏度地進行免疫測定法。於專利文獻3中，將免疫複合體的形成與檢測在相同的反應場所進行的傳統酵素結合免疫吸附分析法（ELISA）的步驟，只是一個在微型反應器（microreactor）裡的實現；更進一步，於微型反應器，由於將反應場所變小，可以提高反應速度和反應性的一方面，也有因反應容量變小產生信號強度變小的問題；因此，利用專利文獻2和專利文獻3所記載的技術實施免疫測定的情形時，高靈敏度的檢測器或相機成為必要，變成有高成本的問題。同樣地，非專利文獻1和2所記載的系統，由於螢光檢測需要高性能相機（high-performance camera）和螢光光譜儀（fluorescence spectroscope），因此無法解決系統價格高的問題。

專利文獻4中，揭示：藉由將檢測目標作為標示珠，使用通用的光碟片執行免疫測定的技術。一般來說，微型反應器（microreactor）中的粒狀物的運送變成阻塞的原因，於專利文獻4的技術，在檢測區域將抗體固化，由於捕捉支撐流至該檢測區域的抗原的標示珠，部分標示珠的積聚是不可避免的，隨著不同情形，會有實際處理發生困難的問題。又，在檢測區域捕捉到的標示珠太靠近的話，會變成檢測錯誤的原因，有這樣的問題。 此外，專利文獻4所記載的技術中，因為標示珠流下時被固化的抗體和支撐在標示珠的抗原之間進行抗原抗體反應，檢測區域全區變成該抗原抗體反應的反應場所；由於反應性受到抗原與抗體的接觸頻率的影響，檢測區域全區變成反應場所的該技術，係抗原抗體反應效率趨向變低。又，標示珠的捕捉、和其檢測《亦即，抗原檢測》，由於在相同的反應場所進行，當反應效率低的情形時，檢測靈敏度就降低了。更進而，由於隨著抗體的流下速度而固化的抗體捕捉標示珠變得困難，有檢測靈敏度、或檢測速度變得更差的問題。

再進一步，專利文獻3和4中，進行免疫測定（immunoassay）的情形時，以固定在檢測區域的抗體為介質，為了捕捉目標物質，必須預先施行在微型反應器（microreactor）內部的檢測區域將抗原固化的前置處置，產生供檢查的微型反應器的準備變的繁雜的問題。 此外，非專利文獻1和2所記載的技術中，到引入的珠子的微小井的收存率低，可以做各小井的檢測的充分靈敏度無法得到，又有可能會影響檢測數據的可靠性的問題。

本發明，提供能夠以較傳統技術更高靈敏度且價格便宜地檢測試樣中的目標物質的技術做為目標之一。 [解決問題的方法]

本發明，依據其一個面向，提供目標物質的檢測方法，包含：在第1反應場所中，在固定在固相的第1捕捉物質和用標示物質標示的第2捕捉物質之間，藉由將目標物質夾在中間（sandwich），形成複合體，將含標示物質部分由前述複合體分離，使其移動至第2反應場所，在第2反應場所，藉由基於標示物質的信號（signal），檢測目標物質；本發明提供目標物質的檢測方法。

依據本發明的理想實施態樣，前述固相，係選自面體（hedron）、板狀體（plates）、顆粒狀體（granule）、纖維狀體（fibrous bodies）、機織織物（woven fabrics）、不織布《或稱：無紡布》（non-woven fabrics）、薄膜（films）和片料（sheets）所成群類的至少一者。再者，所謂纖維狀體（fibrous bodies），意指細線狀物質以單獨存在或以相互纏繞的棉花狀或塊狀存在的狀態；機織織物（woven fabric），意指纖維狀物做成編織的布狀之物；不織布，意指沒有編織纖維而纏繞起來的片狀物。又，薄膜（film）和片料（sheet），意指主要使用人造材料中的高分子原料之物作為對象的薄的膜狀物，較薄之物稱為薄膜（films），較厚之物稱為片料（sheet）；薄膜和片料的稱呼，由於是習慣性使用，隨著不同情形，對於片料，包含層積纖維狀的原料所製造之物、機織織物、不織布，片料是一部分重複的概念。 依據本發明的其他理想實施態樣，前述固相，係顆粒狀體（granule），係選自磁性粒子（magnetic particles）、乳膠粒子（latex particle）、和樹脂粒子（resin particle）所成群類的至少一者。 依據本發明的其他理想實施態樣，前述第1捕捉物質，係選自與目標物質特定性地結合的抗體、抗體片段（antibody fragment）、修飾抗體（modified antibody）、核酸適配體（aptamer）和核酸所成群類至少一者。 依據本發明的其他理想實施態樣，前述第2捕捉物質，係選自目標物質特定性地結合的抗體、抗體片段（antibody fragment）、修飾抗體（modified antibody）、核酸適配體（aptamer）和核酸所成群類的至少一者。 依據本發明的其他理想實施態樣，包含：在前述複合體形成之後，除去未形成前述複合體的前述第2捕捉物質。

依據本發明的其他理想實施態樣，前述標示物質，係選自金屬膠體粒子（metal colloidal particle）、酵素（enzyme）、發光物質（luminescent substance）和螢光物質（fluorescent substance）所成群類的至少一者。 依據本發明的其他理想實施態樣，包含於前述第2反應場所，使基於標示物質的信號發生。 依據本發明的其他理想實施態樣，包含：前述標示物質係酵素；於前述第2反應場所，與受質反應，使信號發生。 依據本發明的其他理想實施態樣，包含：前述標示物質係金屬膠體粒子（metal colloidal particle）；於前述第2反應場所，使基於金屬膠體粒子的信號發生。

依據本發明的其他理想實施態樣，包含：於前述第2反應場所，執行放大基於標示物質的信號的放大反應（amplification reaction）。 依據本發明的其他理想實施態樣，包含：前述標示物質係金屬膠體粒子；前述放大反應，係藉由以金屬離子作為受質的還原反應，使金屬膠體粒子生長的反應。 依據本發明的其他理想實施態樣，含有前述標示物質部份由前述複合體分離，藉由選自加熱處置、酸鹼值調節處置、氧化還原處置、酵素處置和競合反應處置所成群類的至少一者處置來進行。 依據本發明的其他理想實施態樣，前述信號，係透射光（transmitted light）、反射光（reflected light）、散射光（scattered light）、發光（luminescence）和螢光（fluorescence）的至少一者。 依據本發明的其他理想實施態樣，前述第2反應場所的容量，比前述第1反應場所的容量小。 依據本發明的其他理想實施態樣，由前述複合體分離的含前述標示物質部分，不包含固相。

本發明，提供目標物質的檢測設備，至少包含： 本發明，依據又一方的其他局面，在固定在固相的第1捕捉物質和用標示物質標示的第2捕捉物質之間，藉由將目標物質夾在中間（sandwich），形成複合體，含標示物質部分由前述複合體分離的第1反應場所；及 在第1反應場所，利用由前述複合體分離的部份的基於標示物質的信號（signal），檢測目標物質的第2反應場所；及 將由前述複合體分離的部份從第1反應場所移動至第2反應場所的通道； 本發明，提供目標物質的檢測設備。

依據本發明的其他局面，係檢測目標物質的方法中所使用的試劑，包含：在第1反應場所，在固定在固相的第1捕捉物質和用標示物質標示的第2捕捉物質之間，藉由將目標物質夾在中間，形成複合體，由前述複合體將含標示物質部分分離，使其移動至第2反應場所，在第2反應場所，藉由基於標示物質的信號（signal），檢測目標物質的方法中所使用的試劑；本發明提供具有分離含標示物質部分的作用的試劑。 依據本發明的理想實施態樣，前述試劑，為了達成將含標示物質部分分離的作用，包含：選自酸鹼值調節劑（pH regulator）、變性劑（denaturant）、還原劑（reducing agent）、酵素（enzyme）、競爭劑（competitor）、以及醇類（alcohol）或酯類（ester）和它們的衍生物所成群類的至少一者。 依據本發明的其他理想實施態樣，前述試劑，為了達成將含標示物質部分分離的作用，包含酸鹼值調節劑（pH regulator）。 【發明的成果】

依據本發明的檢測方法和檢測設備，結合目標物質形成複合體的標示物質，移至不同於形成複合體的第1反應場所的第2反應場所，以標示物質為基礎，可以進行目標物質的檢測。因此，可以將第2反應場所做成特定於檢測適合的場所，可以提高目標物質的檢測靈敏度。

更進一步，舉例來說，將第2反應場所做成微小空間的情形時，可以更進一步高靈敏度地檢測目標物質。又，將第2反應場所做成微小空間的情形時，被檢測物質以微小流徑為媒介，變成被運送。此處，依據本發明，結合在固相的前述複合體之中，由於只需將含有標示物質的一部分轉移至第2反應場所，例如，固相可以留置在第1反應場所，轉移過程中的堵塞問題就減少了。因而，使用像微型反應器般的微小空間，可以適當地實行高靈敏度的檢測。 又，依據本發明的試劑，可以提供適用於這種檢測的試劑。

＜本發明的檢測方法＞ 本發明的檢測方法，包含：(1) 在第1反應場所中，在固定在固相的第1捕捉物質和用標示物質標示的第2捕捉物質之間，藉由將目標物質夾在中間（sandwich），形成複合體的步驟，和(2) 將含標示物質部分由前述複合體分離《包括物理性結合的消滅和化學鍵結的切斷》，使其移動至第2反應場所，在第2反應場所，藉由基於標示物質的信號（signal），檢測目標物質的步驟。

前述步驟(1)，靠著以下步驟可以執行，舉例來說，(1-1) 於第1反應場所，使第1捕捉物質固定在固相的步驟，及(1-2) 調製以標示物質標示的第2捕捉物質和含有目標物質的試樣的混合液的步驟，及(1-3) 在第1反應場所，藉由使前述混合液與固定在固相的第1捕捉物質反應，生成以固相－第1捕捉物質－目標物質－第2捕捉物質－標示物質顯示的複合體的步驟。步驟(1-3)之後，也可以設計洗淨步驟，用來從第1反應場所排除前述複合體以外的物質。又，步驟(1-2)各別準備含有目標物質的試樣和含有已標示的第2捕捉物質的溶液，在引入第1反應場所前實行混合二者，或者，任何一者先引入第1反應場所後，再將另一者引入第1反應場所，任何方式都可以；後者的情形時，也可以同時進行步驟(1-3)。

前述步驟(2)，靠著以下步驟可以執行，舉例來說，(2-1) 將含標示物質部分由前述複合體中分離的步驟，(2-2) 將已分離的含標示物質部分移動至第2反應場所的步驟，(2-3) 在第2反應場所，藉由以含有前述標示物質部分的基於標示物質的信號，檢測以第1捕捉物質和第2捕捉物質捉到的目標物質數量為基礎的信號的步驟。在步驟(2-3)之前，也可以設計將為了產生基於標示物質的信號所必需的顯色劑（color former）等藥劑與含標示物質部分混合的步驟。

此處，被檢測的信號，係以與目標物質結合而形成前述複合體的標示物質為基礎的物質，由於其數量與形成複合體的目標物質相關，可以藉由本發明進行目標物質的檢測。又，在轉移至第2反應場所，結合在固相形成前述複合體之中，由於只有含標示物質部分，與固相一起轉移時容易產生阻塞的問題酒會減少，因此，本發明的檢測方法，適用於像使用微型反應器般的微小空間的檢測。

再者，於本說明書中，如『第1捕捉物質－目標物質－第2捕捉物質－標示物質』般地以連字符號（hyphen）連結來表示的情形，意指相互地以物理性的或化學性的鍵結。又，『第2捕捉物質－標示物質』，也有以『含有標示物質的第2捕捉物質』或單獨以『第2捕捉物質』來陳述的情形。

以下，利用圖1，說明本發明之檢測方法的一個實施態樣。圖1係表示本發明的檢測方法的一個實施態樣概念的概要圖。還有，為了將說明簡單化，在圖1中，係將目標物質作為抗原、第1和第2捕捉物質作為初級抗體（primary antibody）的情形來表示。

在初期狀態，圖1中的四個角包圍起來的反應場所《第1反應場所》中，準備用來捕捉目標物質的第1捕捉物質被固定的固相《圖1(a)》；於此處，引入含有目標物質的溶液《圖1(b)》，則目標物質藉由特定的第1捕捉物質被捕捉。利用適當洗淨作業除去被捕捉的目標物質以外的物質後，引入由標示物質標示過的第2捕捉物質，第2捕捉物質結合在目標物質，目標物質被夾在第1捕捉物質和第2捕捉物質之間的複合體，形成於固相上《圖1(c)》；靠著洗淨作業，從系統將剩餘的第2捕捉物質除去，亦即，對應被捕捉的目標物質的份額的標示物質，變成固定在固相的狀態。

然後，對於形成的複合體，給予酵素、氧化還原劑、酸或鹼做成的試劑、熱、光、振動等《圖1(d)》，將含標示物質部分從固相中分離；還有，此分離部分《含標示物質部分》，可以是只有標示物質，也可以是某些分子團與標示物質結合的狀態；分子團，並未侷限第1捕捉物質－目標物質－第2捕捉物質的複合體、或目標物質－第2捕捉物質的複合體、像第2捕捉物質、原本的分子團依其原樣殘存之物《亦即，切斷分子間的鍵結生成之物》，也可以是切斷原本分子團內的分子內鍵結（intramolecular bonding）被片段化之物。

含有分離的標示物質部分，從固相切離而游離《圖1(e)》，被引入圖1中的圓角方形所示之檢測反應場所《第2反應場所》；此時，引入檢測反應場所《第2反應場所》的溶液內存在的標示物質《含標示物質部分》，由於能夠評價被捕捉的目標物質的數量，測量標示物質的存在《數量》的話，就可以測量目標物質的存在《數量》。換言之，於本發明，在進行檢測反應的第2反應場所，與目標物質結合的相當標示物質以外的固相或目標物質，沒有必要存在。

然後，圖1所示之實施態樣中，在檢測反應場所《第2反應場所》，與標示物質反應的反應物質也被引入《圖1(f1)(f2 _b)》；舉例來說，標示物質是酵素的情形時，引入作為反應物質的受質（substrate），對於受質，選擇與酵素反應而轉變成螢光物質之物、或藉由與酵素反應而產生上色的物質，藉由檢測產生螢光或上色，測量目標物質《圖1(g1)》。

又，標示物質是金屬膠體粒子等不溶性粒子的情形時，藉由依其原樣測量該當粒子的混濁度（turbidity）或光的散射（scattering）、吸光率（absorbance）的變化，可以檢測目標物質《圖1(f2 _a)》；標示物質是金屬膠體粒子的情形時，在金屬膠體粒子表面更生成金屬膠體粒子而使粒子直徑變大作為目的，作為反應物質，可以加入產生膠體增敏反應（sensitization reaction）的金屬鹽溶液等的試劑，此種情形，藉由膠體的成長，可以檢測放大的散射光或吸光率《圖1(g2)》。

如此，由於從固相中分離含有參與檢測反應的標示物質部分、引入檢測反應場所《第2反應場所》，即是在使用微型反應器進行免疫測定情形時，通過流徑的物質尺寸可以大幅減小，可以將反應物質滑順且容易地移動至檢測反應場所《第2反應場所》。 以上，利用圖1，顯示本發明的檢測方法的一個實施態樣的概念，但本發明並非限定於前述。依照後述的標示物質，可以依其原樣檢測標示物質的情形時，例如，不需要引入受質的情形、或不需要標示物質的放大《增敏》的情形時，在檢測反應場所《第2反應場所》，就不需要與標示物質反應的反應物質。 又，標示物質的放大《增敏》反應，也不需要非在檢測反應場所《第2反應場所》執行，也可以在第1反應場所分離含標示物質部分後、引入第2反應場所前之間，進行放大《增敏》反應。在這種情況下，從第1反應場所到第2反應場所之間，也可以設計進行不同於第1反應場所和第2反應場所的放大反應的反應場所。 關於第1、第2反應場所，將於後說明。

＜目標物質＞ 本發明的檢測方法中，成為分析對象的目標物質，只要是免疫學或基因學可以檢測的物質的話，並無特別限制。舉例來說，例示的有細菌或病毒等的病原體（pathogen）、還有各種蛋白質、胜肽（peptide）、核酸、外泌體《或稱：胞外體》（exosome）、各種低分子化合物等。

＜第1捕捉物質＞ 本發明的第1捕捉物質，係具有捕捉在固相上的目標物質的功能的物質，在固相上固定而使用，例如，目標物質是抗原的情形時，使用對於目標物質有特異性反應的抗體；目標物質是抗體的情形時，使用對於目標物質有特異性反應的抗原。

再進一步，作為本發明之第1捕捉物質，前述之抗原和抗體之外，也可以使用核酸或核酸適配體（aptamer）、配體（ligand）《受質、抑制劑（inhibitor）、競爭劑（competitor）》、受體（receptor）。舉例來說，目標物質是細菌來源的去氧核醣核酸（DNA）的情形時，可以使用與該 DNA 互補的核酸分子作為第1捕捉物質；又，目標物質是如轉錄因子（transcription factor）的序列特異性DNA結合蛋白轉錄因子（sequence-specific DNA-binding protein transcription factor）可以使用具有特定序列的DNA作為第1捕捉物質。

作為第1捕捉物質所使用的抗體，可以是多株抗體（polyclonal antibody），也可以是單株抗體（monoclonal antibody），但是從反應特異性的觀點來看，使用單株抗體較為優選。

作為第1捕捉物質所使用的抗體，也包含抗體及相關抗體與具有實質的相當反應性的抗體片段（antibody fragment）並修飾抗體。作為抗體片段，可列舉使用的有：抗原結合區段（Fab fragment；fragment, antigen binding）、F(ab’)2區段、Fab’ 區段、scFv區段等。

＜第2捕捉物質＞ 本發明的第2捕捉物質，結合在被第1捕捉物質捕捉的目標物質，固定在固相的第1捕捉物質和第2捕捉物質之間，目標物質夾在中間，形成固定在固相的複合體，亦即，以固相－第1捕捉物質－目標物質－第2捕捉物質《具有標示物質的第2捕捉物質》的順序結合的複合體。目標物質是抗原的情形時，第2捕捉物質，與第1捕捉物質相同，使用對於目標物質有特異性反應的抗體；另一方面，目標物質是抗體的情形時，可以使用對於該抗體有特異性反應的抗原，又，可以是與該抗體結合的抗體、或是與第1捕捉物質不同的抗體、更進一步是與產生該抗體的宿主不同的宿主所製造的抗體，也可以使用。因此，第2捕捉物質是抗體的情形時，就會形成固相－抗原《第1捕捉物質》－目標物質－抗原《第2捕捉物質》或抗體《第2捕捉物質》所形成的複合體、或固相－抗體《第1捕捉物質》－目標物質－抗原《第2捕捉物質》或抗體《第2捕捉物質》所形成的免疫複合體。

更進一步，作為本發明的第2捕捉物質，前述抗原及抗體以外，也可以使用核酸或核酸適配體（aptamer）、如生物素（biotin）－卵白素（avidin）的配體（ligand）－受體的特異性組合。舉例來說，目標物質是細菌來源的去氧核醣核酸（DNA）的情形時，可以使用含有目標區域的互補的核酸分子作為第2捕捉物質；又，目標物質是如轉錄因子（transcription factor）的序列特異性DNA結合蛋白轉錄因子（sequence-specific DNA-binding protein transcription factor）的情形時，可以使用具有特定序列的DNA作為第2捕捉物質。

作為第2捕捉物質來使用的抗體，可以是多株抗體（polyclonal antibody），也可以是單株抗體（monoclonal antibody），但是從反應特異性的觀點來看，使用單株抗體較為優選。

作為第2捕捉物質來使用的抗體，也包含抗體及相關抗體與具有實質的相當反應性的抗體片段（antibody fragment）並修飾抗體。作為抗體片段，可列舉使用的有：抗原結合區段（Fab fragment；fragment, antigen binding）、F(ab’)2區段、Fab’ 區段、scFv區段等。

＜標示物質＞ 標示物質是標示第2捕捉物質的物質，只要能檢測產生某些信號的物質的話，並沒有特別的限制；例如，可以是酵素、金屬膠體粒子、螢光物質或顯色物質、發光物質、螢光來源物質或顯色來源物質、發光來源物質、用顏料著色的聚苯乙烯乳膠（polystyrene latex）等的合成乳膠、或天然橡膠乳膠（natural rubber latex）等的乳膠、用結合酵素或螢光物質的卵白素（avidin）可以檢測的生物素（biotin）。 作為較理想的標示物質，可列舉的有：酵素、金屬膠體粒子、螢光物質、發光物質、顯色物質、螢光來源物質、發光來源物質或顯色來源物質；作為更為理想的標示物質，係金屬膠體粒子、酵素、發光物質、螢光物質；作為又更為理想的標示物質，可列舉的有：酵素、金屬膠體粒子。 再者，第2捕捉物質是抗體的情形時，包括：作為第2捕捉物質的抗體配備標示物質的情形、和識別該抗體的抗體《例如：二級抗體（secondary antibody）》配備標示物質的情形；於後者的情形時，配備標示物質的抗體，其本身就做成標示物質。 標示物質和第2捕捉物質的結合方法並沒有限制，例如，藉由物理性吸附的結合、化學性鍵結、利用親和性的結合、以及這些的組合等的結合方法，都可以使用。藉由一般已知的技術，可以使標示物質和第2捕捉物質結合。

基於標示物質的信號，包括：標示物質本身是信號源、從標示物質發出的信號；或標示物質成為反應基底、在其他化合物的作用下發出的標示物質的信號；標示物質成為催化劑、與分別加入的受質反應、由於生成其他的生成物、該生成物發出的信號、或藉由其他標示物質參與的反應發出的信號。也就是，對於『產生基於標示物質的信號』、『生成基於標示物質的信號』，並非只意味藉由標示物質與其他物質發生反應而產生《生成》信號，還包含標示物質單獨地產生《生成》信號的情形。與此相關聯的，對於『產生基於標示物質的信號』、『生成基於標示物質的信號』，並非只有藉由標示物質參與的物理的、化學的及生化學的反應而生成信號，還包括靠著標示物質吸收能量而產生信號的概念。

舉例來說，標示物質是酵素的話，加入在反應系統內酵素能催化的酵素受質，酶促反應（enzymatic reaction）的受質藉由反應生成信號；受質可以是經由酶促反應而上色的顯色團（chromophore）《顯色來源物質》、或經由酶促反應而螢光發射（fluorescence emission）的螢光團《螢光來源物質》、經由酶促反應而發光的發光物質《發光來源物質》。標示物質是顯色來源物質等的話，將這些作為反應原料《受質》，用來生成顯色物質的反應試劑《酵素、化合物》引入第2反應場所，生成信號。 此外，標示物質是生物素時，在結合與信號物質結合的卵白素的情形等時，則變成藉由附加信號物質於標示物質而產生基於標示物質的信號。 又，標示物質利用吸收能量發生信號的例子，例如，吸光率（absorbance）或吸收光譜（absorption spectrum）等，光學物理量的減少是一個信號的例子，可以舉出。

以標示物質為基礎產生的信號《以標示物質為基礎被生成的信號》，理想的是可以光學檢測的信號。作為相關的信號的具體實例，標示物質或由標示物質反應而生成的生成物，亦即有：來自信號物質的透射光（transmitted light）、反射光（reflected light）、散射光（scattered light）、螢光（fluorescence）、磷光、發光（luminescence）的任一者可列舉，藉由相關的信號，可以檢測標示物質或其生成物。

作為標示物質而得以使用的螢光物質，例如，異氰酸螢光素（fluorescein isocyanate）、含銪類（europium）金屬染料、綠色螢光蛋白（green fluorescent protein；GFP蛋白）可以例示；作為發光物質，例示的有螢光素－螢光素酶（Luciferin－luciferase）發光類等。

作為標示物質而得以使用的酵素《以下，適合稱為『標示酵素』》，是通常酵素結合免疫吸附分析法（ELISA）所使用的各種酵素即可，例如，山葵過氧化酶（horseradish peroxidase；HRP）、β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）、鹼性磷酸酶（alkaline phosphatase）等可以列舉使用。

第2捕捉物質是抗體的情形時，將這些酵素，藉由戊二醛法（glutaraldehyde method）、高碘酸法（periodic acid method）或馬來醯亞胺法（maleimide method），結合於所要的第2捕捉物質，就可以標示。又，將這些酵素用前述方法結合於第2捕捉物質是抗體的二級抗體，藉由使此二級抗體結合於第2捕捉物質是抗體，也可以標示。又，使用其他方法，也可以調製經由基因工程結合抗體和酵素表達做成抗體酵素複合體（antibody-enzyme complex），於此情形，因為無須靠著既定的方法使酵素結合於抗體，可以得到不會失去酵素活性、與抗體結合的酵素標示體。

又，為了以比色方式定量這些酵素的催化活性（catalytic activity），作為可以使用的色素，可以列舉的有：5-氨基水楊酸（5-amino salicylic acid）、鄰苯二胺（o-phenylene diamine）、2,2'-疊氮基二（3-乙基苯並噻唑啉）-6'-磺酸《ABTS》（2,2'-azinodi (3-ethyl benzthiazolin) -6'-sulfonic acid；ABTS）、鄰-硝基苯基-β-D-半乳糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactoside）和對-硝基苯基磷酸二鈉（p-nitrophenyl phosphate disodium）。因應標示酵素的種類選擇這些色素，舉例來說，標示酵素是過氧化酶（peroxidase）《HRP》情形時，選用2,2'-疊氮基二（3-乙基苯並噻唑啉）-6'-磺酸《ABTS》；是β-半乳糖苷酶（β‐D‐galactosidase）情形時，選用鄰-硝基苯基-β-D-半乳糖苷；又，是鹼性磷酸酶（alkaline phosphatase）情形時，選用對-硝基苯基磷酸二鈉，適當地選擇。 再進一步，作為發光受質，例如，是鹼性磷酸酶（alkaline phosphatase）情形時，可以選用二氧雜環丁烷（dioxetane）類化合物；是過氧化酶（peroxidase）情形時，可以選用發光胺《或稱：流明諾》（luminol）。作為螢光受質，是鹼性磷酸酶（alkaline phosphatase）情形時，可以選用4-甲基伞形酮磷酸酯（4-methylumbelliferyl phosphate）；是過氧化酶（peroxidase）情形時，可以選用刃天青（resazurin）、試鹵靈（resorufin）衍生物，但並未侷限於此。

用來作為標示物質的金屬膠體粒子，可以使用適當選擇的各種金屬膠體粒子，舉例來說，可被列舉的有：金膠體、銀膠體、白金膠體等的金屬膠體，還有，這些的複合金屬膠體。做為複合金屬膠體，白金支撐金膠體（platinum-supported colloidal gold）、白金支撐鈀膠體（platinum-supported colloidal palladium）等可被列舉。 本發明中較為優選的金屬膠體粒子，列舉出金膠體粒子、它的複合金屬，或銀膠體粒子；更理想的是金膠體粒子。

金屬膠體粒子的粒子直徑，通常是1奈米（nm）〜500奈米；用於標示的金屬膠體粒子，使用1奈米（nm）〜500奈米程度之物。又，光學檢測的情形時的金屬膠體粒子《金屬粒子》的粒子直徑，理想的是10奈米（nm）〜10微米（μm）。此處，視所選光學檢測系統的靈敏度（sensitivity）、精確度（accuracy）、測量條件等而定，在檢測上適切的金屬粒子的粒子直徑不同，例如，檢測系統使用的通用光學讀取（optical pickup）的情形時，通常是100奈米〜10微米，更適合的是100奈米〜5微米，又更適合的是200奈米〜5微米，若是在1微米〜3微米的範圍，就可以更容易地檢測。 又，使用將雷射（LASER；Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation）和光電二極體（photodiode）組合來檢測散射光的簡便檢測系統的情形時，金屬膠體粒子的粒子直徑若是100奈米以上的話則可，150奈米以上的話則可以比較容易地檢測，粒子直徑若是200奈米以上的話，則可以充分地檢測。較合適的是100奈米〜3微米，更合適的是200奈米〜1微米。再者，視檢測反應場所的構造或大小、檢測時間等的測量條件，也有將散射光強度更進一步變強的1微米〜3微米的範圍成為合適的情形。

含標示物質部分，被引入進行檢測反應的反應場所《第2反應場所》，然後在第2反應場所中，進行基於標示物質的信號的檢測。

詳細內容將於後說明，舉例來說，標示物質是酵素的情形時，另外加入的受質與標示物質即酵素發生反應，藉由受質所成的生成物而發生信號的情形時，在微小井（micro well）《微小的容量》形成第2反應場所，則由於與對應標示物質的受質等的接觸概率（probability）升高，反應速度加大，信號生成效率（efficiency）提高，可以縮短檢測時間。另一方面，反應容量變小，則由於成為信號來源的物質的量也減少，信號變的微弱。

又，在適用微型反應器的情形時，對於第2反應場所的微小井的試樣《含標示物質部分》的轉移，使用微流徑（micro flow path）。標示物質是金屬膠體粒子等不溶性物質的情形時，為了避免流徑的阻塞，結合在第2捕捉物質的金屬膠體粒子等的標示物質的粒子直徑越小越好；於此情形，這些標示物質的粒子直徑，因應已形成的流徑寬度做成合適的範圍，舉例來說，微型反應器的流徑直徑是15微米的情形時，標示物質的粒子直徑，較合於理想的是200奈米以下，係1奈米〜100奈米，更合於理想的是1奈米〜80奈米，特別合於理想的是1奈米〜50奈米。 粒子尺寸變小，則基於它們所得到的光學信號也變得微弱。

像這樣信號微弱的情形，藉由在微小井進行放大反應，使反應速度提高的同時，伴隨因放大反應而加大信號強度，可以使該檢測成為容易。再進一步，標示物質《結合標示物質的複合體或其片段（fragment）》的大小，因為可以做成適合在微流徑內的轉移的尺寸，可以防止微流徑內的阻塞並轉移至第2反應場所，能夠避免在測量時產生障礙。

相關的信號放大方法，可以使用一般已知的方法，例如，標示物質或以其為基礎生成的信號物質是螢光物質的情形時，可以是利用光敏感劑（photosensitizer）使螢光強度或螢光壽命（fluorescence lifetime）加大的方法。又，標示物質是酵素的情形等，在酵素參與信號生成的情形時，藉由進行在標示物質以外併用其他酵素的酵素循環方法（enzyme cycling method），也可以進行信號放大。

作為酵素循環反應系統，可以使用一般已知的循環反應系統。一般已知的酵素循環反應系統，有菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸（NAD；nicotinamide adenine dinucleotide）循環《NAD循環》、輔酶A（coenzyme A）循環《CoA循環》、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate；ATP）《ATP循環》已廣為人知；又進一步，如特開平4-335898號公報或特開2014-124165號公報之記載，藉由將硫代還原態菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Thio-NAD(P)H；Thio-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）《硫代NAD(P)H》作為信號物質以幾何級數放大，靠著比色法（colorimetric method），實施高靈敏度的蛋白質或核酸的定量或光學檢測的方法可以例示。

於特開2014-124165號公報中，揭示使硫代NAD(P)H在反應系統內積蓄並放大的反應，依據該公報，標示物質的酵素是鹼性磷酸酶（alkaline phosphatase；ALP）的情形時，鹼性磷酸酶的酶促反應生成物，可以變成酵素循環反應的受質，加入磷酸化受質《具有磷酸基的雄固醇（androsterone）衍生物》，使用3α-羥基類固醇去氫酶（3α-hydroxysteroid dehydrogenase）等，實行酵素循環法，可以做為例示。再者，標示物質的酵素，並未限定於鹼性磷酸酶，使用糖苷酶（glycosidase）、半乳糖苷酶（galactosidase）、果糖苷酶（fructosidase）、甘露糖苷酶（mannosidase）或過氧化物酶（peroxidase），藉由使用具有特定功能基或鍵結的雄固醇衍生物做為相關酵素的受質，可以實行酵素循環法。還有，此情形，藉由酵素循環反應，生成的硫代菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸《硫代NADH》（Thio NADH）等變成信號物質，吸光率（absorbance）測量其數量，或靠著計測生成的硫代NADH等形成的顏色變化，可以進行基於標示物質的信號的檢測。

另一方面，標示物質是金屬膠體粒子的情形的信號放大方法，例如，可舉出使膠體粒子成長且粒子直徑變大的增敏反應（sensitization reaction）。依據此，可以將與轉移相關的金屬膠體粒子做成微小尺寸、將與檢測相關的金屬膠體粒子做成大的尺寸。金屬膠體粒子，依其粒子直徑的大小，吸光率等的光學特性有大的變化；隨著粒子直徑變大，產生的信號增大，光學檢測變得容易。又，隨著粒子直徑變化，表面電漿子（surface plasmon）特性也變化，伴隨著此，最大吸收波長（maximum absorption wavelength）也變化；由於粒子直徑改變，光學測量波長也使符合最大吸收的測量成為可能，光學檢測更容易成為可能。因此，可以實現微型反應器中的反應物質《標示物質》圓順地運送及檢測靈敏度提高的這兩部分。增敏反應（sensitization reaction），例如，可以依據特開2009-192270號公報所記載的方法。

此處，於本發明中，舉例來說，標示物質中使用金屬膠體的情形時，藉由利用該金屬膠體的催化活性、或併用還原劑，在標示物質的金屬膠體表面，藉由將含有各別反應系統加入的金離子或銀離子的金屬鹽溶液中的金屬離子還原，使其積聚，由於金屬膠體的粒子直徑變大，也使可以檢測信號增大。

作為對應增敏作用的金屬膠體粒子，核心金屬種類對於氧化還原的穩定性高的種類是較為優選的；再者，核心金屬膠體粒子，可以是單一金屬做成，也可以是複合金屬。相關的金屬膠體粒子，作為標示物質，可以列舉：金膠體、白金膠體等的金屬膠體，還有這些的複合金屬膠體之外，用紅色或藍色等各種顏料著色的聚苯乙烯乳膠（polystyrene latex）等的合成乳膠、或天然橡膠乳膠（natural rubber latex）等的乳膠。這些之中，金膠體等的金屬膠體是特別優選的，例如，金膠體粒子、白金膠體粒子、鈀膠體粒子等可以列舉。又，複合金屬膠體粒子，可列舉金膠體粒子被白金膠體粒子支撐的白金－金膠體粒子等。

相關的金屬膠體粒子可以藉由一般已知的方法來製造，若是金膠體粒子的話，例如，氯金(III)酸（HAuCl ₄；tetrachloroauric acid）水溶液在沸騰下，藉由檸檬酸（citric acid）等還原劑還原，可以調製金膠體粒子。又，在調製後的金膠體粒子的存在下，再進一步，藉由檸檬酸或抗壞血酸（ascorbic acid）等還原劑將氯鉑(IV)酸（H ₂[PtCl ₆]；chloroplatinic acid）還原的話，則可以製造白金－金膠體粒子。

相關的金屬膠體粒子的增敏反應，從含有金屬離子的溶液中經由還原反應使金屬析出，使其積聚在金屬膠體粒子表面，使金屬膠體粒子的粒子直徑成長而可以進行。作為金屬離子供給來源的金屬鹽，可以舉出屬於元素週期表第4、5、6週期的金屬的鹽，但是較理想的是使用金、白金、銀、鈀（palladium）、鎳（nickel）、鈷（cobalt）、銅等的鹽。被析出的金屬，可以是與金屬膠體粒子相同種類的金屬，也可以是不同種類的金屬，只要還原反應可以在容易的條件下進行，則沒有限制。 舉例來說，鈀－白金膠體粒子，藉由使用含有鎳離子、鈷離子、銅離子的金屬離子的任一者的溶液作為增敏劑溶液，可以使該膠體粒子成長。 又，例如，金膠體粒子，使用含有氯金酸《氯金(III)酸》（chloroauric acid；H[AuCl₄]）的增敏劑溶液作為金離子的供給來源，使金離子積聚在作為標示物質的金膠體粒子表面，可以使該膠體粒子成長。又，金膠體粒子，使用含有硝酸銀的增敏劑溶液，可以使銀離子積聚在金膠體粒子表面，使其成長作為複合金屬膠體粒子。白金－金膠體粒子，利用白金的催化活性，使用含有硝酸銀、硫酸銅等的銅的鹽的增敏劑溶液，可以是其成長。

增敏劑溶液，含有變成前述金屬離子供給來源的各種金屬鹽做為必要成分，因應需要，可以更進而含有錯合劑（complexing agent）、酸鹼值調整劑（pH regulator）、緩衝劑（buffer）、穩定劑（stabilizer）等。作為這樣的增敏劑溶液，可以使用傳統已知的無電式電鍍（electroless plating）溶液。

作為錯合劑，可列舉氨（ammonia）、檸檬酸鹽（citrate）、酒石酸鹽（tartrate）、乳酸鹽（lactate）等。作為酸鹼值調整劑，可列舉醋酸鹽（acetate）、丙酸鹽（propionate）、銨鹽（ammonium salt）等。作為穩定劑，可列舉各種界面活性劑（surfactant）等。

為了促進金屬離子的還原反應，也可以使用含有還原劑的溶液。作為還原劑，可列舉的有：檸檬酸、抗壞血酸、次磷酸鈉（sodium hypophosphate）、水合肼（hydrazine hydrate）、硫酸肼（hydrazine Sulfate）、硼氫化鈉（sodium borhydride）、二甲胺硼烷（dimethylamine borane）、甲醛（formaldehyde）、羅謝爾鹽（Rochelle Salt）《或稱：酒石酸鉀鈉（potassium sodium tartrate）》、葡萄糖（glucose）、乙二醇（ethylene glycol），但並未侷限於這些物質。所使用的還原劑，適當選擇對還原的金屬離子合適之物。

再者，增敏反應，也可以藉由含有金屬離子成分和還原劑的兩部分的增敏劑溶液進行，也可以在增敏反應之前，將含有金屬離子成分的金屬鹽溶液、和含有還原劑的還原劑溶液混合；特別是，將金屬鹽溶液和還原劑溶液各別加入反應系統的方法是優選。又，藉由金屬膠體粒子催化活性（catalytic activity），即使不加入還原劑溶液，也可以實行增敏反應。

＜含標示分子部分的切斷方法＞ 本發明的檢測方法中，在第1反應場所，第1捕捉物質－目標物質－第2捕捉物質《含有標示物質的第2捕捉物質》的複合體形成於固相上之後，從該複合體切斷《使其分離》含標示物質部分，從固相游離至溶液中。如同前述，此分離部分如果含有標示物質即可，不需要含有標示物質的第2捕捉物質保持原樣；也就是，標示物質和第2捕捉物質的鍵結切斷而分離也可以，固相和第1捕捉物質的鍵結切斷也可以，只要是標示物質或含標示物質部分被分離，切斷複合體內的任何一種鍵結都可以。適當的情況，含標示物質部分是從已形成的複合體分離的含標示物質部分；更適當的情況是，不含第1捕捉物質的含標示物質部分；又更適當的情況是，不含第1捕捉物質和第2捕捉物質、只有標示物質。

如同前述，標示物質與第2捕捉物質的結合方法沒有限制，舉例來說，可以運用靠物理吸附的結合、化學鍵結、利用親和性的結合、及這些方式的組合等的結合方法。藉由一般已知的方法，可以使標示物質和第2捕捉物質結合。

切斷《分離》含標示物質部分的方法，可以例示的方法有：利用從外場（external field）投與熱、光、振動等物理能量來切斷的方法、加入氧化劑或還原劑做成的切斷試劑的方法。切斷試劑，可以是切斷固相和第1捕捉物質的結合的物質，也可以是切斷複合體內的其他結合的物質。理想上，是可以從形成在固相上的複合體分離含標示物質部分之物；特別理想的話，是切斷目標物質與第2捕捉物質之間、或第2捕捉物質與標示物質之間的結合之物。

切斷結合的試劑，例示的有：酸鹼值調節劑、變性劑（denaturant）、還原劑（reducing agent）、酵素（enzyme）、競爭劑（competitor）、以及醇類（alcohol）或酯類（ester）和它們的衍生物。理想上，酸鹼值調節劑、變性劑、還原劑、酵素、競爭劑等作為例示；更理想的話，酸鹼值調節劑、變性劑、還原劑、酵素等作為例示。 酸鹼值調節劑，含有酸、鹼或它們的鹽類，係使酸鹼值改變的話合物或組成物。酸可以是無機酸或有機酸的任一者，鹼也可以是無機鹼或有機鹼的任一者。作為相關的酸或鹼，可例示：鹽酸（hydrochloric acid）、硼酸（boric acid）、碳酸（carbonic acid）、硝酸（nitric acid）、醋酸（acetic acid）、苯硼酸（boronic acid）、甲酸（formic acid）、檸檬酸（citric acid）、磷酸（phosphoric acid）、草酸（oxalic acid）、乳酸（lactic acid）、蘋果酸（malic acid）、水楊酸（salicylic acid）、甘氨酸鹽酸（glycine hydrochloric acid）、甘氨酸氫氧化鈉（glycine sodium hydroxide）、氫氧化鈉（sodium hydroxide）、三乙胺（triethylamine）、二甲胺（dimethylamine）、甲胺類（methyl amines）等的胺類（amines）、氨（ammonia）、碳酸氫鈉（sodium hydrogen carbonate）或它們的鹽類，但並非限制於此。這些物質之中，強酸和強鹼是較為理想的，氣具體實例，可列舉：鹽酸、硝酸、甲酸、磷酸、草酸、甘氨酸鹽酸、甘氨酸氫氧化鈉、氫氧化鈉、三乙胺、二甲胺、甲胺類等的胺類。 變性劑（denaturant）係使蛋白質或核酸的高階結構（higher-order structure）改變的試劑，例示的有尿素或胍鹽（guanidine salt）等的蛋白質變性劑、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate）等的界面活性劑，但並非限定於此。 作為還原劑，例示的有2-巰基乙醇（2-Mercaptoethanol）和二硫蘇糖醇（dithiothreitol）做為切斷雙硫鍵（disulfide bond）之物。 酵素係水解複合體構造成分的一部分之物，例示的有胃蛋白酶（pepsin）、木瓜蛋白酶（papain）、無花果苷（ficin）、核酸酶（nuclease）或特異性作用在構造成分的特定鍵結的酵素。 競爭劑（competitor），對於目標物質與第1或第2捕捉物質的結合，發生競爭的促效劑（agonist）、拮抗劑（antagonist）、競爭性抗體（competing antibodies）可以作為例示。 切斷試劑的種類或濃度，因應作為對象的複合體的構造或結合力而適當選擇，在標示物質的功能不會失去活性的範圍加以調整。

此處，想要特異性切斷複合體的隨意部分，可以預先將連結器（linker）引入複合體的預定部分。此連結器係，例如，在使固相與第1捕捉物質、或標示物質與第2捕捉物質結合之際，於使這兩個對象物質間連結的目的下，可以使用。連結器（linker），如果是在兩末端具有可以形成化學鍵結的預定功能基或反應基的話，以連結器兩端的功能基為媒介。可以使標示物質和第2捕捉物質等的對象物質間連結。連結器，並未侷限於使固相與第1捕捉物質、或標示物質與第2捕捉物質結合為目的才能使用。作為連結器兩末端的功能基或反應基，例如，可列舉有：形成醯胺鍵（amide bond）、雙硫鍵（disulfide bond）、酯鍵（ester bond）等的共價鍵（covalent bond）之物質；於此情形，藉由水解或還原劑處理連結器末端結合部位，可以切斷複合體。

又，連結器和對象物質的結合機制並未限定於前述共價鍵，也可以是例如，物理性吸附、離子結合、像生物素－卵白素般的利用分子間的親和性的結合、以及這些的組合等的結合。

再來，構成連結器的分子構造並未限定，可以使用蛋白質、胜肽（peptides）、糖鏈（sugar chain）、核酸（nucleic acid）、聚乙二醇（polyethylene glycol）等的合成聚合物（synthetic polymer）。又，更進一步，也可以使用形成親和性的生物素－卵白素等；於此情形，藉由以內肽酶（endopeptidase）、糖解酵素（glycolytic enzyme）、內切核酸酶（endonuclease）等的酵素、酸、界面活性劑等處理連結器，可以在連結器中間切斷連結。

相關的連結器部分的切斷，靠著外部環境的物理性能量或酵素等的切斷試劑，可以切斷。 具體來說，例如，切斷雙硫鍵（disulfide bond）的情形時，憑藉使在分子內具有巰基（thiol group）的還原劑、如2-巰基乙醇（2-Mercaptoethanol）和二硫蘇糖醇（dithiothreitol）發生作用，可以切斷。又，若是生物素－卵白素結合的話，藉由加入酸鹼值調節劑使反應系統的酸鹼值改變、或使用洗脫緩衝（elution buffer），可以切斷前述結合。再者，連結器分子是由糖鏈構成的情形時，靠著作用於構成的單糖與單糖的結合的特異性酵素，可以切斷特定的結合。

再者，使用具有組氨酸標籤（Histidine tag）的連結器的情形時，例如，使具有組氨酸標籤連結器分子結合在第1捕捉物質，藉由將以螯合基（chelate group）衍生化（derivatization）的鎳固化在固相表面，以組氨酸標籤為媒介，可以將第1捕捉物質固定在固相。此處，若加入對於組氨酸標籤是競爭劑的組氨酸（Histidine）或咪唑（imidazole）作為切斷試劑的話，因為可以使組氨酸標籤從鎳解離，含有標示物質的複合體可以從固相分離。

前述之切斷試劑，在加入之後，可以移除，也可以是其失去活性；例如，藉由加入酸鹼值調節劑，反應場所從中性傾向酸性或鹼性的情形時，進一步加入酸鹼值調節劑以恢復中性的處置是合適的。

＜固相＞ 固相係第1捕捉物質結合的不溶性固體。固相，係在第1反應場所複合體結合的支架，加工成可以放置在第1反應場所的型態、形狀和尺寸。

固相的型態或形狀，沒有特別限定，作為例示，有面體（hedron）《反應容器面，亦即具有反應容器內面等預定的面積的面》、或收納在反應容器內的板狀體（plates）、顆粒狀體（granule）、纖維狀體（fibrous bodies）、機織織物（woven fabrics）、不織布《或稱：無紡布》（non-woven fabrics）、薄膜（films）和片料（sheets）等。板狀體、顆粒狀體和纖維狀體，可以是空心（hollow）、實心（solid）、多孔（porous）等的任一種態樣。顆粒狀體的形狀，可以選擇球狀、環狀、扁平狀、柱狀、無定形等的各種形狀。球狀，例如，可以選自磁性顆粒（magnetic particle）、乳膠顆粒（latex particle）和樹脂顆粒（resin particle）中的至少一種。 再者，固相和第1捕捉物質之間的結合，例如，可以使用物理性吸附、共價結合、離子結合、利用親和性的結合、以及這些的組合等的結合模式。適當的方式，藉由共價結合、離子結合，以比親和力或吸附力產生的結合力更強的結合，第1捕捉物質被固定於固相。 相關的固相之中，適當使用比表面積（specific surface area）大者，例如，適當使用板狀體、顆粒狀體、纖維狀體、機織織物、不織布；而顆粒狀體、纖維狀體、機織織物、不織布更適當使用；顆粒狀體又更適當使用。由於比表面積大者較合於理想，板狀體和顆粒狀體，粒子直徑越小越為理想。

＜反應場所＞ 本發明相關之目標物質的檢測方法，將試樣引入至具有預先已固化第1捕捉物質的固相的第1反應場所，使固相上的第1捕捉物質和式樣中的目標物質發生反應，經過洗淨作業後，引入第2捕捉物質，將目標物質夾在中間，形成複合體。接著，進行洗淨作業，將剩餘的第2捕捉物質排出至反應系統外。如同前述，切斷複合體的結合，使含標示物質部分分離，使此含標示物質部分分離的步驟在第1反應場所進行。

第1反應場所進行，只要是能夠做到固相－第1捕捉物質－目標物質－第2捕捉物質《含有標示物質的第2捕捉物質》的複合體的形成、和將含標示物質部分由此複合體分離的場所，並沒有特別的限制。 再者，從複合體分離出來的含標示物質部分，由運送性等的觀點來看，不含有固相較為優選；因此，較理想的是，在固相與第1捕捉物質之間、在第1捕捉物質的中途、在目標物質與第2捕捉物質之間、在第2捕捉物質的中途、或第2捕捉物質與標示物質之間，將複合體分離；使含標示物質部分游離出來。 作為第1反應場所，例如，可以使用試管（test tube）、微管（microtube）、微量盤（microplate）、微型反應器（microreactor）中的腔室（chamber）、生物碟片（biodisc）等。又，在第1反應場所的作業，可以手動進行，也可以自動進行。在第1反應場所的作業是自動化的情形時，例如，可以用以微型反應器的形態執行的設備構成第1反應場所，再進一步將其以碟片（disc）態樣構成也可以。

第2反應場所，與第1反應場所分別在不同位置，係在第1反應場所分離出來的含標示物質部分被引入的反應場所。又，第2反應場所，如同前述藉由基於標示物質的信號，係檢測目標物質的場所。第1反應場所中，前述複合體以外的成分，藉由洗淨排出至系統外，然後進行含標示物質部分的切斷步驟，因此，在第2反應場所，妨礙測定的雜質減少，含標示物質部分以高純度狀態被引入。在第2反應場所生成基於標示物質的信號。

第2反應場所，以微小容量《微小井》做成是較理想的。又，以小於第1反應場所的反應容量的容量做成，則特別合於理想。第2反應場所，可以採用各種反應容器的形式。較適當的是，設計複數的微小井，將在第1反應場所分離出來的含標示物質部分的溶液，分配到複數的微小井；複數的微小井內，從收存含標示物質部分的微小井，檢測信號；而從沒有收存標示物質的微小井無法檢測出信號。因此，靠著計數來自微小井的信號的『有』、『無』，對於式樣中的目標物質的存在，可以進行明確的判定。又，採用極限稀釋法（limiting dilution method），將標示物質至微小井的分配依循卜松分配（Poisson distribution）作為前提，藉由校正，對於所得到的檢測結果，可以計算出目標物質濃度的近似值。 第2反應場所，以微小井做成的話，在第2反應場所進行標示物質參與的化學反應《包含生化學反應》的情形時，可以增大反應效率，也可以伴隨此而提高反應速度。以下，關於在第2反應場所實施有關標示物質的化學反應的情形，更進一步詳細說明。

微小井的容量，係考量反應速度和產生信號的強度而設計。各微小井的容量，最好是在1Ï10 ^-8〜100微升的範圍內做成。

更進一步，微小井，設計1個以上的個數，適當的是設計在10 ²個〜10 ⁷個的範圍。第2反應場所的總微小井的總容量應大於在第1反應場所中分離出的含標示物質部分的溶液的總容量，適當設計微小井的容量及其個數。複數的微小井也可以設計成陣列（array）狀。

微小井，藉由做成裝入第1反應場所的試樣溶液的全數量的個數，因應該個數，可以將反應場所的容量做得比第1反應場所小。舉例來說，第2反應場所，因應微小井的數目，可以做成第1反應場所的1／10 ²〜1／10 ⁷的容量。

陣列可以做成各種形狀，列舉有圓形、三角形、四角形《例如：正方形》、正六角形、正八角形等的形狀，也可以是微量盤的態樣或圓盤《碟片狀》的態樣。

在微小井，也可以將特異性結合於含標示物質部分的物質做成固定化，舉例來說，藉由用生物素預先標示待分離的含標示物質部分，將溶液引入預先固定了生物素的微小井中，可以將含有目標誤植部分有效率地留置在微小井中。

如此一來，藉由設計了複數的微小井，在第1反應場所中，含有被分離的含標示物質部分的溶液分配至各微小井，可以在微小空間中高效率地實行反應。因此，試樣中的目標物質即使濃度低，也可以更準確地檢測到其存在。

為了進行在微小井的反應和信號檢測，第2反應場所也可以做成將複數的微小井收存在反應設備中的態樣的構造。

＜反應設備＞ 該反應設備，係被稱為微型反應器（microreactor）的反應設備。反應設備，在它的內部，做成微小井和微小井連通，同時，以供給口為媒介，具備與外部相連的供給流徑的構造。又，在反應設備，可以適當装設用來將廢液排出置設備外的排出口或存放廢液的貯槽（reservoir）、和從微小井到排出口或貯槽的轉移廢液的排出流徑。微小井和供給流徑已做成在反應設備內部，從第1反應場所引入的溶液和試劑、用來密封微小井的油等，從供給口供給至反應設備內。

在反應設備內，沿著流徑配置各微小井。在相關的情形時，微小井個別地以連通流徑的形式凹下設置。再者，反應設備做成後述的碟片（disc）形狀的情形時，微小井在流徑側邊凹下設置在碟片的外周側。

反應設備內設置的流徑，以比微小井大的尺寸做成。流徑可以因應微小井的容量適當設計，舉例來說，流徑寬度設計在1〜1000微米（micrometer），流徑的深度適當設計在1〜1000微米，流徑寬度與從第1反應場所引入的溶液所含有的標示物質的大小相比較，由於形成足夠的寬度，可以圓順轉移含標示物質部分。

在反應設備內的試劑溶液的轉，可以利用幫浦（pump）或移液管（pipette）的泵作用（pumping）進行。又，也可以將微型反應器做成碟片狀，利用碟片旋轉產生的旋轉力和離心力，進行流體的轉移。

反應設備做成碟片狀的情形時，藉由旋轉力或離心力，可以將試樣溶液輸送的話，關於流徑的形狀，沒有特別的限定。流徑可以從碟片中心部分的附近朝向外側，做成放射狀，也可以做成螺旋狀。又，流徑也可以設計成波紋管狀（bellows）或分支（branches）來做成。做成螺旋狀的情形時，也可以做成同心圓狀的複數流徑，也可以只做成1個流徑。還有，也可以將流徑的一部分變成螺旋狀的形狀，更還有，也可以做成複數的螺旋狀的流徑。為了藉由離心力或旋轉力將要引入反應設備內的溶液等做液體輸送，供給口裝設在碟片的中心側。

為了得到用來將從供給口引入的溶液等作液體輸送的離心力或旋轉力，例如，以500〜7,000每分鐘轉速（rpm；Revolution(s) Per Minute）的旋轉數，藉由1秒〜10分鐘實行，從第1反應場所引入的溶液或分別加入的試劑等預期可以充滿設置在反應設備內的微小井而適當設計微小井的形狀、數量、流徑的寬度。

第2反應場所設計了複數的微小井的情形時，從第1反應場所引入的具有含標示物質部分的溶液的數量，設定為比第2反應場所的複數微小井的總容量少的容量，並且與流徑連通而形成的第2反應場所總微小井總數的10%以上，較理想的是30%以上，更理想的是50%以上，再更理想的是70%以上，特別是90%以上充滿的溶液數量是所期望的。

從第1反應場所供給的溶液數量比構成第2反應場所的微小井的總容量還過剩的情形時，也可以在流徑的終點處設置存放溶液或廢液的貯槽，或者，也可以做成多餘的試樣液體從流徑的終點流出的構造。

反應設備，可以使用例如丙烯酸樹脂（acrylic resin）、聚碳酸酯樹脂（polycarbonate resin）、矽氧樹脂（silicone resin）等的各種塑膠，或玻璃、聚矽氧（silicone）等的無機材料等的一般熟知的材料，以一般熟知的製作。該組成分，為了可肉眼或光學的觀察流徑和小井的狀況，較理想的是須透明。

又，反應設備，可以使用一般已知的方法製作。舉例來說，使具有流徑和微小井的組形（pattern）的片料（sheet）或板子（plate）與具有試樣液體的供給部分的平坦的片料（sheet）或板子（plate）貼合，就可以製造出來；也可以藉由運用機器加工或光蝕刻法（photolithography）的蝕刻（etching）來做成。再進一步，為了使從微小井入射到檢測器的信號的光量增大，也可以在微小井或其背面做成反射層。

在第2反應場所，基於標示物質的信號，藉由指定的檢測方法被檢測。檢測方法，係於無須接觸情況，就能夠檢測信號之物，加以適當使用；舉例來說，為了檢測來自信號物質的透射光（transmitted light）、反射光（reflected light）、散射光（scattered light）、螢光（fluorescence）、磷光、發光（luminescence），可以使用電荷耦合攝影機（charge-coupled-device camera；CCD camera）、互補金屬氧化物半導體攝影機（Complementary Metal Oxide Semiconductor camera；CMOS camera）、光學讀取（optical pickup）、光電二極體（photodiode）等的光學傳感器（optical sensor）。 又，散射光（scattered light），可以用具備雷射（LASER；Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation）和光電二極體的檢測系統測定。光學讀取雖然也具備雷射和光電二極體，但光學讀取是測定來自目標的入射光方向的反射光《返回光（return light）》，亦即吸光率（absorbance）。另一方面，散射光（scattered light）檢測的檢測系統，在檢測與入射光方向不同的方向上散射的光這一點，是與光學讀取不同之處。 舉例來說，因為散射光強度增加與溶液中的金屬〔膠體〕粒子的濃度成比例，藉由測定散射光強度，可以測定溶液中的金屬〔膠體〕粒子的濃度。又，當金屬〔膠體〕顆粒的粒子直徑在指定範圍內時，散射光強度與粒子直徑具有相關性；又，因應粒子直徑，特定方向的散射光強度會改變。因此，以散射光檢測系統作為檢測方法來設計的情形，也可以檢測基於標示物質的信號。

再者，以在第2反應場所的基於標示物質的信號的生成，可以將具有含標示物質部分的溶液和生成基於標示物質的信號的試劑同時引入微小井，也可以將具有含標示物質部分的溶液和這些試劑分別引入微小井。更進一步，實行信號放大反應的情形時，前述之外還加上，也可以將混合好的信號放大必要的試劑類引入微小井、也可以分別地引入微小井。又，例如，增敏劑溶液是以複數的溶液組成時，可以在已混合它們的狀態下引入微小井，也可以個別地引入。

相關的混合，可以使用其他的腔室，將具有含標示物質部分的溶液和其他的試劑類《與標示物質發生反應的受質、酵素、其他反應物質》進行混合以後，將混合溶液引入微小井；也可以在從第1反應場所將具有含標示物質部分的溶液引入作為第2反應場所的微小井之前的流徑上，將試劑混入。

標示物質和受質等的反應速度，可以藉適當調整試劑的組成分或受質的濃度而調整。因此，輸送異體產生的標示物質和試劑、或試劑中的成分之間的反應，可以受到抑制。更進一步，這些被引入微小井後，因為反應速度大幅度增加，能夠適切地實行預設目標反應。

再者，藉著給予熱等來自外部的能量，引發反應，做成試劑也是可以的。

再者，也可以將試劑成分的一部分，以乾燥狀態，預先配置在微小井或流徑。舉例來說，藉由將包含在增敏劑溶液內的金屬鹽成分或還原劑，以乾燥狀態，配置在第1反應場所和第2反應場所之間的流徑中，靠著被引入流徑內的溶液，溶解個別的試劑、調製增敏劑溶液和還原劑溶液，與包含在溶液中的標示物質的反應在進行時，可以將溶液引入微小井。又，作為其他的態樣，將金屬鹽成分或還原劑以預先乾燥狀態配置在微小井內，藉著引入含有標示物質的溶液使其溶解，也可以啟動反應。

前述第1反應場所，構造是碟片（disc）的態樣的情形時，可以做成構成第1反應場所的第1碟片和構成第2反應場所的第2碟片重疊為一整體的反應設備。在相關的情形時，設計成第2碟片面朝向檢測器側，再進一步，將試樣溶液從第1碟片運送至第2碟片，要作成連通口。

＜目標物質的檢測方法1《抗體檢查》＞ 在本發明相關的目標物質的例示的檢測方法1中，將針對目標物質的抗原固定在聚苯乙烯珠子（Polystyrene beads）表面；然後，進行封閉（blocking），將聚苯乙烯珠子裝填在指定容量的腔室中；引入含有目標物質《抗體》的血清等的試樣，在一定時間內使其接觸珠子產生反應後，用緩衝液洗淨，接著引入2次抗體《已標示的抗體》溶液，在一定時間內使其反應；如此一來，在珠子上形成了抗原－抗體－二次抗體的三明治形式的免疫複合體；用緩衝液洗淨後，引入將酸鹼值變成2〜4的切斷試劑《酸鹼值調節劑》，使含標示物質部分從形成在固相上的免疫複合體游離出來。

在腔室中，裝設了作成比過濾器或珠子直徑小的溶出口，切斷處置以後，從溶出口取出含有標示物質的溶液。然後，把用來使溶液中的基於標示物質的信號生成的試劑混合至該溶液中，標示物質是顯色物質、或螢光物質、發光物質、金屬膠體粒子等信號物質其本身的情形時，不需要相關的試劑。標示物質是酵素的情形時，混合經由酶促反應發出螢光、發光或顯色的受質。再進一步，標示物質是生物素（biotin）等的情形時，混合與卵白素（avidin）結合的信號物質。再者，酵素參與在信號生成的情形等，該反應中受酸鹼值影響的情形時，切斷試劑投與後，由於藉由中和劑再調節至酸鹼值7附近，而實行信號生成反應。 再者，於溶出口處，可以設計能開閉的蓋子。又，也可以設計為靠著推壓腔室內的溶液，使溶液從溶出口流出的構造。

然後，因應需要，混合用來放大信號的試劑，將溶液引入裝設了複數的微小井的反應設備中，分配至各微小井。經過指定的時間後，或者，使用光學方法立即檢測來自微小井的信號。

藉由相關的方法，可以實施檢測目標物質的免疫測定法。

＜目標物質的檢測方法2《抗原檢查》＞ 在本發明相關的目標物質的例示的檢測方法2中，可以實施稱為三明治方式的免疫測定法。首先，使用磷酸鹽緩衝生理鹽水（Phosphate-buffered saline）《以下，稱為PBS》或緩衝液，將針對目標物質的抗體稀釋成適當的濃度，固定在聚苯乙烯珠子（Polystyrene beads）表面；接下來，進行封閉（blocking），將聚苯乙烯珠子裝填在指定容量的腔室中；引入含有目標物質《抗原》的血清等的試樣，在一定時間內使其接觸珠子產生反應後，用緩衝液洗淨，接著引入已標示的一次抗體至腔室內，使其與抗原結合；如此一來，在珠子上形成了抗體－抗原－抗體的三明治形式的免疫複合體；然後，依照與前述檢測方法1相同的順序，可以實施檢測目標物質的免疫測定法。

以下，關於本發明的理想實施態樣，更進一步，參照附圖加以說明。 本發明的檢測方法，例如，可以藉由圖2所示之設備來實行。

圖2顯示在如光碟（Compact Disc；CD）、數位多功能光碟（Digital Versatile Disc；DVD）、藍光光碟（Blu-ray Disc；BD）的圓盤形塑膠碟片中形成的微型反應器（microreactor）。數字10，表示接受指定數量的被檢測試樣，用來暫時收存的細長形試樣存放部分，在碟片1的內部側《以下，簡稱為『內部側』》的端部分，設有開口在碟片1上方的試樣加入口11。在試樣存放部分10的內部，用標示物質標示的第2捕捉物質收納在浸漬過的保持構件中。 數字20，表示第1捕捉物質被固定的聚苯乙烯珠子（polystyrene beads）等的固相被充滿的捕捉區域，形成第1反應場所。試樣存放部分10的碟片1的外部側《以下，簡稱為『外部側』》的端部分，以流徑12與捕捉區域20的內部側的端部分相連通。捕捉區域20的外部的端部分，連通沿著碟片1的圓周向相反方向分叉的 T字型的分叉管（bifurcation tub）30的入口，向分叉管30的碟片1的逆時針方向（counterclockwise direction）分叉的出口，以流徑31為媒介，連通廢液儲器40，向碟片1的順時針方向分叉的出口，以流徑32為媒介，連通出口51。 在T字型的分叉管30的內部，裝設了切換液體的流入方向的閥。此相關的閥，係可將內部的插塞（plug）在閉鎖狀態和釋放狀態間切換之物，能夠藉由電力、磁力、電磁力、機械機制、慣性、離心力、熱，使其動作的各種方式，都可以使用。又，裝設在內部的插塞，可以例示有金屬片、珠子、空氣、磁鐵、熱熔樹脂（heat-meltable resin）或油脂（grease）等；較理想的是，希望用能夠藉離心力在分叉管內移動以切換閉鎖位置的機制之物《例如，珠子或空氣等》，作為插塞。

出口51連通試樣分析用碟片，而該碟片具有裝設在碟片1的下層的第2反應場所。從第1反應場所被送出的試樣溶液，由出口51，經圖示未顯示的流徑為媒介，被引入試樣分析用碟片，運送至第2反應場所。在碟片1的下方，例如特開2012-255772號公報、特表2002-530786號公報所記載，已配置光碟的讀取設備，可以檢測來自第2反應場所的信號。

在試樣存放部分10的內部側的端部分附近，已連接流徑60a的一端，第1儲液器（liquid reservoir）61、第2儲液器62、第3儲液器63、第4儲液器64、和第5儲液器65，從試樣存放部分10的一側，依此順序排成直列，以流徑60a、60b、60c、60d、60e為媒介而連通起來。在第1〜3的儲液器61〜63，收存洗去固定在捕捉區域20中形成的固相的複合體《亦即，－第1捕捉物質－目標物質－第2捕捉物質（包含標示物質）》所成的複合體以外的物質的清洗液。再者，於本實施態樣，雖裝設存放清洗液的3個儲液器，但並非侷限於此，只要裝設1個以上即可。

第4儲液器64，收存切斷試劑，該切斷試劑用來將在捕捉區域20形成的複合體《亦即，固定在固相的第1捕捉物質－目標物質－第2捕捉物質（包含標示物質）》，只切出含標示物質部分，從捕捉區域20外方的端部分排出至分叉管30。

在第5儲液器65，收存用來推壓收存在第1〜4儲液器61〜64的液體，朝向捕捉區域20的方向，使其流出的液壓液（hydraulic fluid）。作為液壓液，通常，選擇不會與試樣溶液混合之液體。

在流徑60a、60b、60c、60d、60e處，已充滿空氣，伴隨著來自第5儲液器65的液體的推壓，被送出至下游側。在捕捉區域20和流徑12之間，裝設了圖中未顯示的感測器（sensor），通過流徑的物體是空氣或是液體，可以檢測出來；藉由該感測器，可以檢測液體的通過，也可以確認從哪一個儲液器的液體流進。

檢測時，從試樣加入口11注入試樣溶液，充滿試樣存放部分10，在試樣存放部分10內，使試樣溶液接觸以標示物質標示的第2捕捉物質。然後，使碟片1以逆時針方向旋轉。之後，靠碟片1旋轉的離心力，收存在第5儲液器65的液壓液從流徑60e流出，推壓收存在第1〜4儲液器61〜64的液體及各流徑60a、60b、60c、60d、60e的空氣，收存在試樣存放部分10的試樣溶液，以流徑12為媒介，從捕捉區域20的內部側端部分流進去，此時，試樣溶液中含有目標物質的話，在捕捉區域20形成〔固相－第1捕捉物質－目標物質－第2捕捉物質（包含標示物質）〕做成的複合體。

接著，碟片1以逆時針方向旋轉，則收存在第1〜3儲液器61〜63的清洗液，經過試樣存放部分10，流進捕捉區域20；在捕捉區域20形成的前述複合體以外的物質，以分叉管30和流徑31為媒介，從捕捉區域20排出至廢液儲器40。然後，收存在第4儲液器64的切斷試劑，經過試樣存放部分10，流進捕捉區域20；從在捕捉區域20形成的前述複合體只切出含標示物質部分。當藉由感測器（sensor）檢測到切斷試劑流進捕捉區域20，則暫時碟片1的旋轉停止，此時使碟片1順時針方向旋轉，如此一來，切斷試劑中具有前述被切出的含標示物質部分的溶液，從捕捉區域20，以分叉管30和流徑32為媒介，轉移至第2反應場所50；如果在流徑32的中途空間52配置顯色劑（color former）或增敏劑的話，則在第2反應場所50，以含標示物質部分與顯色劑或增敏劑混合的狀態，轉移至試樣分析用碟片；因為在第2反應場所50中，變成產生可以檢測標示物質的信號的狀態，就可以使用適當讀取設備檢測信號。

【實施例】 以下，關於本發明，將藉由實施例更進一步詳細說明，再者，本發明並未侷限於實施例之記載。

＜參考例1＞白金－金膠體懸浮液的調製 將所使用的玻璃器具全部以王水洗淨。將390毫升（mL）的超純水（ultrapure water）放入燒瓶中，使其沸騰，於此沸騰水中加入氯金(III)酸（chloroauric acid）水溶液《水溶液1公升（L）含金1公克（g），片山化學工業公司製造》30毫升，然後，加入1%重量比的檸檬酸鈉（sodium citrate）水溶液60毫升；加入檸檬酸鈉水溶液後，加入氯鉑(IV)酸（chloroplatinic acid）水溶液《水溶液1公升含白金1公克，和光純學工業公司製造》數十毫升；然後在5分鐘後，加入1%重量比的檸檬酸鈉水溶液60毫升，進行4小時的回流（reflux），得到白金－金膠體懸浮液（platinum-gold colloid suspension）。又，使用於各實施例之前，適當加入試劑和還原劑，將膠體粒子直徑調整至100奈米（nm）以上，以便準確檢測含標示物質部分的分離。

＜參考例2＞單株抗體的調節 市售的新冠病毒核衣殼蛋白（SARS-CoV 2 Nucleocapsid Protein）《以下，單稱為『SARS-CoV 2 NP』》《CUSABIO公司》作為免疫用抗原，依照一般的方法，取得SARS-CoV 2 NP單株抗體《以下，單稱為『抗NP抗體』。

具體的說，將小鼠（mouse）《BALB/c（巴比賽），5週大、日本SLC》用100微克的新冠病毒核衣殼蛋白《SARS-CoV-2 NP》免疫3次，取脾臟細胞進行細胞融合（cell fusion）。在細胞融合方面，使用小鼠的骨髓癌細胞（myeloma cell）即SP2/0-Ag14細胞（mouse hybridoma）《Shulman等人，1978》；在細胞的培養方面，於達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基（Dulbecco's Modified Eagle Medium；DMEM）《Gibco》中，加入左旋麩醯胺酸（L‐glutamine）0.3毫克／毫升（mg／mL）、苄青黴素鉀（Penicillin G potassium）100單位／毫升、硫酸鏈黴素（streptomycin sulfate）100微克／毫升、慶大黴素（Gentacin）40微克／毫升《達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基（DMEM）》，這再加入胎牛血清（fetal bovine serum；FBS）達到10%用作為培養液。 細胞融合，將免疫小鼠的脾臟細胞和SP2/0-Ag14細胞混合，再加入聚乙二醇溶液（polyethylene glycol solution）《Sigma》，即可進行；融合的細胞在HAT-RPMI《含有0.1毫莫耳（mM）次黃嘌呤鈉（Sodium Hypoxanthine）、0.4微莫耳（μM）氨基蝶呤（Aminopterin）和 0.1毫莫耳（mM）胸苷（Thymidine）的添加血清RPMI（Gibco）》培養基培養，藉由酵素結合免疫吸附分析法（Enzyme-liked Immunosorbent Assay；ELISA）在培養上清層（supernatant）中確認產生抗體。將產生抗體的細胞放在HT-RPMI《含有0.1毫莫耳（mM）次黃嘌呤鈉（Sodium Hypoxanthine）和 0.1毫莫耳（mM）胸苷（Thymidine）的添加血清RPMI》培養基培養，使其增生。

選殖（cloning）的細胞，接種至已接種2,6,10,14-四甲基十五烷（2,6,10,14-tetramethyl-pentadecane）的小鼠《BALB/c（巴比賽），退休，日本SLC》的腹腔內，抽取腹水。將該腹水放入蛋白G管柱（protein G column），以純化單株抗體；最後得到83株針對SARS-CoV-2NP的單株抗體產生細胞。

＜參考例3＞金膠體懸浮液的調製 氯金(III)酸（chloroauric acid）水溶液《水溶液1公升（L）含金1公克（g），片山化學工業公司製造》作為原料，依照一般方法調整金膠體粒子；具體地說，藉由加熱使其沸騰的純水99毫升中，加入1%(v/w)氯金(III)酸水溶液1毫升，然後在1分鐘後，加入1%(v/w)檸檬酸鈉（sodium citrate）水溶液1.5毫升，加熱5分鐘使其沸騰後，放置在室溫冷卻。接下來，於此溶液中加入200毫莫耳碳酸鉀（potassium carbonate）水溶液，調製成酸鹼值9.0，再加入超純水使全部數量成為1000毫升，得到金膠體粒子懸浮的金膠體粒子懸浮液。再者，沒有得到預期的粒子直徑的情形時，適當調整針對氯金(III)酸的還原劑的加入量，製作所需要的粒子直徑的金膠體粒子。

＜實施例1＞含有酸鹼值調節劑的標示物質《白金－金膠體粒子》部分的分離 （1）白金－金膠體標示抗體溶液的調製 對於選自在參考例2取得的抗NP抗體的1個抗NP抗體，依照以下的順序進行白金－金膠體標示。將抗NP抗體的蛋白質當量（protein equivalent weight）1微克《以下，表示蛋白質當量，係以由純化蛋白質的重量分析而來的重量數值表示》和在參考例1調製的粒子直徑120奈米的白金－金膠體粒子懸浮液1毫升混合，在室溫靜置2分鐘，使抗NP抗體結合在白金－金膠體粒子的表面；然後，加入10%牛血清白蛋白（bovine serum albumin）《以下，寫為『BSA』》水溶液，使最後濃度針對全部液體量變成1.0%，藉由用BSA封閉白金－金膠體粒子的殘留表面來製備白金－金膠體標示抗NP抗體溶液。然後，以離心分離《600 ×ｇ，25分鐘》該溶液，使白金－金膠體標示抗NP抗體沉澱，除去上清層，取得白金－金膠體標示抗NP抗體。將取得的白金－金膠體標示抗NP抗體懸浮在含有10%蔗糖（saccharose）和1%BSA和0.5% 曲拉通X-100（Triton X-100；C ₁₄H ₂₂O(C ₂H ₄O)n）《商品名》的50毫莫耳三羥甲基胺基甲烷鹽酸緩衝液《或稱：Tris鹽酸緩衝液》（Tris Hydrochloric Acid Buffer；Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride buffer solution）《酸鹼值7.4》，做成白金－金膠體標示抗體溶液。

（2）用酸鹼值調節劑作切斷處置 在參考例2取得的抗NP抗體中，與用於白金－金膠體標示的抗NP抗體不同的抗體，在Tris鹽酸緩衝液中，調整至20微克／毫升，製作抗體稀釋液；在96小井（well）微量盤（microplate）的各小井，加入該抗體稀釋液100微升，靜置15〜18小時，將抗體固相化。然後，施予封閉處置，加入調整為10奈克／毫升（ng／mL）的SARS-CoV-2 NP溶液50微升、和白金－金膠體標示抗體溶液50微升，在37℃靜置10分鐘；接下來，用TBS－T《Tris鹽酸緩衝液－吐溫20（或稱：聚山梨醇酯20）》（Tris Buffered Saline with Tween 20）清洗，排出清洗液後，加入酸鹼值不相同的各種試劑100微升，在室溫靜置2分鐘後，回收小井內的溶液。所用的試劑和酸鹼值顯示在表1。酸鹼值係使用酸鹼度測定計（pH-meter）《LAQUA 堀場公司製造》測定。 再者，檸檬酸溶液（citric acid solution）的酸鹼值，將檸檬酸和檸檬酸三鈉鹽（trisodium citrate）混合並調整，做成期望的酸鹼值的溶液《pH2.94〜pH6.96》。又，磷酸溶液，將磷酸二氫鈉（sodium dihydrogen phosphate）和磷酸氫二鈉（disodium hydrogen phosphate）混合並調整，做成中性附近的期望的酸鹼值《pH6.99〜pH8.56》，將磷酸二氫鈉（sodium dihydrogen phosphate）和磷酸氫二鈉（disodium hydrogen phosphate）混合並調整，做成鹼性的期望的酸鹼值《pH11.33〜pH12.85》。關於甘氨酸鹽酸緩衝液（glycine hydrochloric acid buffer）、甘氨酸氫氧化鈉緩衝液（glycine NaOH buffer）和三乙胺溶液（triethylamine solution），加入鹽酸或氫氧化鈉來調製所要的酸鹼值。又，鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液，改變稀釋的倍數來調節酸鹼值。

【表1】

酸鹼值調節劑	酸鹼值
鹽酸	1.89
甘氨酸鹽酸	1.53	2.48	3.18
檸檬酸	2.94	3.97	4.92	5.93	6.96
磷酸(中性)	6.99	7.97	8.56
甘氨酸氫氧化納	8.60	8.98	10.51
三乙胺	9.73	10.53	11.63
磷酸(鹼性)	11.33	12.09	12.85
氫氧化納	13.90

（3）白金－金膠體粒子的測定 經由前述的作業而回收的溶液中，測定所含有的白金－金膠體粒子的量。具體地說，回收的溶液引入到試樣管（sample cell）中，對於試樣管，用650奈米（nm）的雷射光束（laser beam）照射而獲得散射光，以設置在預定位置的光電二極管（photodiode）測量該散射光。

由於溶液中的白金－金膠體粒子的濃度和散射光強度增加成比例，藉著測定，可以定量分析溶液中的白金－金膠體粒子的濃度。亦即，藉著以酸鹼值調節劑處理免疫複合體，可以檢測從固相或免疫複合體分離出來的『含白金－金膠體粒子部分』。

再者，白金－金膠體標示抗NP抗體，《在抗原以外的地方》非特異性吸附的情形時，靠著清洗作業無法除去，藉由酸鹼值調節劑而分離，混入測定試樣中。此處，與前述相同處置的小井中，只加入白金－金膠體標示抗NP抗體溶液100微升，在37℃靜置10分鐘，接著，用TBS－T《Tris鹽酸緩衝液－吐溫20（或稱：聚山梨醇酯20）》（Tris Buffered Saline with Tween 20）清洗，加入酸鹼值調節劑液100微升，在室溫靜置2分鐘後，從小井回收溶液，進行散射光測定。每次對個別的酸鹼值調節劑進行相同的作業，所得到的散射光強度作為每種酸鹼值調節劑的空白值（blank value）。

空白值，由於能夠估計在小井內來自非特異性吸附的白金－金膠體標示抗NP抗體的白金－金膠體粒子的散射光強度，從測定值減去該空白值，作為已形成的免疫複合體的『含白金－金膠體粒子部分』的散射光強度。其結果顯示於表3。

圖3，係顯示各試劑的酸鹼值和切斷特性的關係的圖。在圖3的下方，已顯示各試劑的酸鹼值和散射光強度的值；在圖3的上側，以圖形（graph）表示各值，圖形橫軸是酸鹼值，縱軸是散射光強度。從圖3可以看出，酸鹼值是中性附近的情形時，散射光強度低，也就是，加入的中性試劑，對複合體的『含白金－金膠體粒子部分』表現出較低的切斷性能；另一方面，加入的試劑是酸性或鹼性的情形時，散射光強度會提高，藉由酸或鹼等的酸鹼值調節劑，顯示可以切斷結合在固相的複合體《固相－抗NP抗體－SARS-CoV-2 NP－白金－金膠體標示抗NP抗體》的『含白金－金膠體粒子部分』。 特別是，酸鹼值低於4的酸鹼值調節劑《酸》、酸鹼值10.6以上作成的酸鹼值調節劑《鹼》具有良好的切斷性能，更進一步，酸鹼值11.6以上的酸鹼值調節劑《鹼》顯示具有極優的切斷性能。

＜實施例2＞含有氫氧化鈉的標示物質《白金－金膠體粒子》部分的分離 實施例1的結果，由於氫氧化鈉溶液的切斷力特別良好，改變氫氧化鈉的濃度，再進一步進行評價從結合在固相的複合體《固相－抗NP抗體－SARS-CoV-2 NP－白金－金膠體標示抗NP抗體》的含標示物質部分的切斷性能。

氫氧化鈉的濃度，做成0.01毫莫耳、0.1毫莫耳、1毫莫耳、10毫莫耳、100毫莫耳、1莫耳。使用調整成各濃度的氫氧化鈉水溶液100微升以外，施行與實施例1相同的處置，結果顯示在圖4。

圖4，係顯示對於複合體的氫氧化鈉的切斷性能的圖。在圖4的下方，已顯示氫氧化鈉的各濃度的酸鹼值和散射光強度的值；在圖4的上側，以圖形（graph）表示各值，圖形橫軸是氫氧化鈉的莫耳濃度，縱軸是散射光強度。 從圖4可看出，在10毫莫耳以上的濃度，氫氧化鈉使免疫複合體的含金膠體粒子部分游離出來，是很明顯的了。再者，10毫莫耳的氫氧化鈉溶液的酸鹼值是11.87。

＜實施例3＞含有變性劑（denaturant）的標示物質《白金－金膠體粒子》部分的分離 準備微量盤（microplate），該微量盤具備用與實施例1相同的方法將抗NP抗體固化施予封閉處置的小井。然後，將此微量盤的小井作為固相，對於形成的複合體《固相－抗NP抗體－SARS-CoV-2 NP－白金－金膠體標示抗NP抗體》，用變性劑（denaturant）取代酸鹼值調節劑，使其作用以外，與實施例1相同，回收小井的溶液，與實施例1（3）相同，進行白金－金膠體粒子量的測定。再者，關於變形劑，使用8莫耳尿素、6莫耳鹽酸胍（guanidine hydrochloride）、或1%十二烷基硫酸鈉（SDS；sodium dodecyl sulfate）。其結果顯示於圖5。在者，為了比較，使用1莫耳氫氧化鈉進行相同的處置的結果，一併顯示在圖5。

圖5係對於結合在固相的免疫複合體的變性劑的作用以游離出來的金膠體《含金膠體粒子部分》的散射光強度顯示的圖。作為比較的數據，顯示使用1莫耳氫氧化鈉的情形。從圖5可以看出，任何一種變性劑都能使含白金－金膠體粒子部分游離出來，是很清楚的。

＜實施例4＞含有標示物質《鹼性磷酸酶（alkaline phosphatase）》部分的分離 將實施例1中在微量盤的用於固相化的抗NP抗體，以化學鍵結在磁性粒子《JSR生命科學（JSR Life Sciences）公司製造》並固化。又，使用鹼性磷酸酶標示套組（alkaline phosphatase labeling kit）《同仁化學公司》，實施例1中用於白金－金膠體標示抗NP抗體的抗NP抗體100微克，用鹼性磷酸酶（alkaline phosphatase）《ALP》加以標示，調製ALP標示抗NP抗體溶液。 抗NP抗體固化後的4毫克／毫升的磁性粒子的分散液（dispersion）24微升中，加入用Tris鹽酸緩衝液－吐溫20（Tris Buffered Saline with Tween 20）《TBS－T》稀釋1000倍的ALP標示抗體溶液120微升，加入1.2或12奈克／毫升（ng／mL）的SARS-CoV-2 NP溶液120微升，在37℃靜置30分鐘。 將磁性粒子適當地磁化（magnetize），用TBS－T清洗，加入100毫莫耳甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液（glycine-sodium hydroxide buffer）《酸鹼值10.0》或100毫莫耳三乙胺緩衝液（triethylamine buffer）《酸鹼值11.5》200微升，就由在室溫攪拌2分鐘，使ALP《含ALP標示部分》游離在液體中；然後，以磁性粒子磁化的狀態，收集上清層《含ALP標示部分》，用TBS稀釋100倍而中和的液體5微升中，加入以下顯色試劑反應試液《硫代煙醯胺腺嘌呤二核苷酸循環試劑》100微升，將其設置在微量盤檢測儀（microplate reader）SH-9000《Corona Electric Co.》，以405奈米（nm）的吸光率（absorbance），隨時間測量在37°C的顯色反應。

硫代煙醯胺腺嘌呤二核苷酸循環試劑（ThioNAD（thionicotinamide adenine dinucleotide） Cycling Reagent） 100毫莫耳 Tris鹽酸緩衝液（Tris Hydrochloric Acid Buffe）r酸鹼值9.8 1.8 毫莫耳 硫代煙醯胺腺嘌呤二核苷酸（ThioNAD） 0.9 毫莫耳 還原態的菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide; NADH） 3.8 毫莫耳 氯化鎂（magnesium chloride；MgCl ₂） 25單位／毫升 3α-羥基類固醇脫氫酶（3α-hydroxysteroid dehydrogenase） 5 毫莫耳 雄固醇 3-磷酸鹽（androsterone 3- phosphate）

如表2所示，無論用甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液《酸鹼值10.0》或三乙胺緩衝液《酸鹼值11.5》的任一者處置的情形時，405奈米的顯色反應可用吸光率測量；亦即，藉由本處置，顯示可以使含有作為標示物質的ALP的部分從固相游離出來，同時也保持ALP的酵素活性。

【表2】

100毫莫耳甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液 《酸鹼值10.0》	100毫莫耳三乙胺緩衝液 《酸鹼值11.5》
抗原濃度 (奈克/毫升)	吸光率 [毫吸光度單位(mAbs)]	抗原濃度 (奈克/毫升)	吸光率 [毫吸光度單位(mAbs)]
0	0	0	0
1.2	-2	1.2	95
12.0	51	12.0	394

於此試驗中，用95毫吸光度單位（mAbs）《光程距離（optical path length）＝3.03毫米》可以檢測1.2奈克／毫升的抗原；思考中和時的100倍的稀釋量，則變成可以檢測12皮克／毫升（pg／mL）的抗原，從抗原的分子量《49.7千道爾頓（kDa）》換算的話，則可以知道能夠檢測0.2皮莫耳（pM）的抗原分子或鹼性磷酸酶（alkaline phosphatase；ALP）標示抗體。 鹼性磷酸酶（ALP）1分子在體積1皮升（pL）的微小井中的情形時，該ALP濃度變成1皮莫耳（pM）。微小井的形狀做成1Î1Î1000微米的話，其光程距離是1毫米，推估在ALP1分子的反應所生成的吸光率超過100毫吸光度單位（mAbs）《從本實施例的測定值做》線性推估（linear estimation），則1皮莫耳的話，在光程距離1毫米，變成166毫吸光度單位（mAbs），顯示可以充分地檢測。

＜實施例5＞金膠體粒子的增敏處置 將在參考例3中調整過的金膠體粒子懸浮液《粒子直徑約12奈米》用純水調整至4.36奈莫耳（nM）的濃度，將其的2微升加進1莫耳氫氧化鈉（NaOH）100微升中，使之混合。此1莫耳氫氧化鈉的處置，係針對複合體的酸鹼值調節劑的概要式進行的切斷處置。加入1莫耳鹽酸（HCl）100微升，將其中和，此中和液6.35微升中，加入10毫莫耳沃波爾緩衝液（Walpole buffer）《酸鹼值2.0》972微升和12.1毫莫耳氯金酸《氯金(III)酸》（chloroauric acid；H[AuCl₄]）液1.65微升的混合液，然後加入375毫莫耳羥胺鹽酸鹽（hydroxylamine hydrochloride）20微升，加以混合，在室溫靜置10分鐘，進行增敏反應（sensitization reaction）。然後，做離心使溶液中的金膠體粒子沉降，除去上清層，用超純水清洗。如此所得到的金膠體粒子分散液的1微升，從貼了碳帶（carbon tape）的試樣架（sample holder）上滴下，除去空氣（deaerated），用電子顯微鏡TM4000Plus《日立製作所製造》攝影，加壓電壓為15千伏特（kilovolt；kv），放大倍數為1000。拍攝5視野（field of vision）以上，藉由分析圖像，計算平均粒子直徑和標準差。再者，替代4.36奈莫耳金膠體粒子分散液，使用不含有金膠體粒子的超純水，進行相同的增敏處置，作為比較目標。結果顯示在圖6。

圖6係表示因增敏反應產生的金膠體粒子直徑的變化；圖6的縱軸表示粒子直徑。從圖6也可看出，藉由增敏反應，可以使4.36奈莫耳金膠體粒子分散液中的金膠體粒子成長至粒子直徑約3〜5微米的粒子。另一方面，未含有金膠體粒子的情形時，也觀察到金膠體粒子的沉澱，但由於粒子明顯小於經過增敏處置的粒子，因此兩者在檢測上可明顯區分。再者，調整反應條件的話，自然可以調節粒子直徑，因而顯然地可以做出適合檢測系統的粒子直徑的金膠體粒子。 如此，使用與微小金膠體粒子結合的標示抗體，形成免疫複合體以後，《從固相》分離出含金膠體粒子部分的情形時，顯示對於含在分離部分的金膠體粒子可以進行增敏反應，更進一步可以光學上充分檢測增敏後的金粒子。

＜實施例6＞金屬粒子的粒子直徑產生的散射光強度的變化 （1）各種粒子直徑的金膠體粒子及白金膠體粒子的配製 依照參考例1，配製粒子直徑120奈米的白金－金膠體粒子；又，依照參考例3，配製粒子直徑12奈米和200奈米的金膠體粒子；粒子直徑500奈米和1000奈米的金〔膠體〕粒子，由市售品《NANOPARTz, A11-500-CIT-DIH-1-50, A11-1000-NPC-DIH-1-100》取得。將個別的粒子做成分散在溶液中的狀態。

（2）散射光強度的測定 前述中製作的各種粒子直徑的金膠體粒子分散液，稀釋為可以測量散射光的範圍的濃度，用與實施例1相同的方法，實行散射光的測量。所得到的散射光強度的值除以濃度，計算 1奈莫耳的散射光強度。該結果，可以了解因應金膠體粒子的粒子直徑的增加，散射光強度就增加。結果顯示在圖7。 圖7係顯示金屬膠體粒子的粒子直徑和散射光強度的關係的圖。橫軸是粒子直徑《奈米（nm）》，縱軸是以對數表示的散射光強度。從圖7也可看出，因為射光強度從120奈米開始顯著增加，以雷射（LASER）光源和光電二極體等的簡單的散射光檢測系統，顯示從100奈米程度就可以檢測金屬膠體粒子。

＜實施例7＞含標示物質《白金－金膠體粒子》部分為基礎的抗原檢測 實施例1中用於固相化的抗NP抗體，以Tris鹽酸緩衝液調整為20微克／毫升（μg／mL），製作抗體稀釋液。將該液與磁性粒子《JSR生命科學（life science）公司製造》混合，以化學鍵結將抗NP抗體固化在磁性粒子上；然後，固化在磁性粒子上的抗NP抗體、和調節成10、100、1000、10000皮克／毫升（pg／mL）濃度的SARS-CoV-2 NP溶液的各個、和在實施例1調整後的白金－金膠體標示抗NP抗體，於37℃使其反應30分鐘。反應後的各溶液，分別以0.45微米離心式過濾器《默克（Merck）公司》離心過濾，回收磁性粒子，用TBS-T清洗5次。然後，將1莫耳氫氧化鈉加入，對於結合在磁性粒子的複合體《磁性粒子－抗NP抗體－SARS-CoV-2 NP－白金－金膠體標示抗NP抗體》進行切斷處置《溶出》，測量回收的溶出液的散射光強度。測量結果顯示於圖8。 圖8係溶出的白金－金膠體粒子《含白金－金膠體粒子部分》的濃度以散射光強度表示的圖；縱軸是以對數表示的散射光強度，橫軸是抗原濃度。從圖8可以看出，以白金－金膠體粒子為基礎的散射光強度與抗原濃度成比例；亦即，伴隨抗原濃度升高，溶出的白金－金膠體粒子也增加，對於藉由抗原抗體反應形成在固相的複合體，實行有效的切斷處置，更進一步，含被切斷的標示物質部分分離、溶出，並適當地被檢測，已獲得實證。

＜實施例8＞分離含有競爭劑（competitor）的標示物質《鹼性磷酸酶（ALP；alkaline phosphatase）》的部分 與實施例7相同，將抗NP抗體固化的磁性粒子以TBS《Tris鹽酸緩衝液》調整為4毫克／毫升，其24微升中，各別加入0、0.1、1、10奈克／毫升濃度的SARS-CoV-2 NP120微升，製作混合液。然後，製作的各混合液中，加入ALP標示抗NP抗體120微升，攪拌之，在37℃反應10分鐘後，每個110微升各別注入1.5毫升管（tube）中；然後，在磁化（magnetize）時，用TBS-T對管中的磁性粒子實行5次清洗，加入用TBS-T調整為666微克／毫升的抗NP抗體液30微升，在室溫反應10分鐘後，回收上清層。再者，此處，加入了抗NP抗體的液體中所含的抗NP抗體，與之前添加的ALP標示抗NP抗體相同的抗體，只是未進行ALP標示；係變成對ALP標示抗NP抗體的競爭劑。 接下來，回收的上清層中，與實施例4相同，加入硫代煙醯胺腺嘌呤二核苷酸循環試劑《Thio NAD 循環試劑》100微升，將其設置在微量盤檢測儀（microplate reader）SH-9000《Corona Electric Co.》，以405奈米（nm）的吸光率（absorbance），隨時間測量在37°C的顯色反應。減去在無抗原條件下《空白值》的值，計算60分鐘後的吸光率。該結果確認在SARS-CoV-2 NP 10奈克／毫升時的31mAbs的吸光率的顯色反應；亦即，確認函ALP標示部分從複合體《磁性粒子－抗NP抗體－SARS-CoV-2 NP－ALP標示抗NP抗體》的切斷、溶出。 [產業方面的利用性]

依據本發明，由於可以高靈敏度且價格便宜地檢測目標物質，所以能夠作為醫療領域以外、各種產業領域中的物質檢測方法及設備。

1:碟片（disc） 10:試樣存放部分 11:試樣加入口 12:流徑 20:捕捉區域 30:分叉管 31、32:流徑 40:廢液儲器 50:第2反應場所 51:出口 52:空間 60a、60b、60c、60d、60e:流徑 61、62、63、64、65:儲液器

【圖1】係說明本發明的檢測方法的一個實施態樣的概要的圖。 【圖2】係顯示適用於進行檢測方法的微型反應器的一個實施態樣的平面示意圖。 【圖3】係表示實施例1中的各試劑的酸鹼值和切斷特性（cutting characteristic）之關係的圖。 【圖4】係表示實施例2中的氫氧化鈉（NaOH）的濃度《酸鹼值》和切斷特性之關係的圖。 【圖5】係表示實施例3中的各種變性劑（denaturant）的切斷特性的圖。 【圖6】係顯示由於實施例5的增敏反應（sensitization reaction）引起的金膠體（gold colloid）粒子直徑的變化的圖。 【圖7】係表示實施例6中的金屬膠體粒子的粒子直徑和散射光（scattered light）強度的關係的圖。 【圖8】係表示實施例7中被溶出的金膠體粒子《含有金膠體粒子的部分》的濃度《對應抗原濃度》和散射光（scattered light）強度的關係的圖。

Claims (20)

1. 一種目標物質的檢測方法，包含： 在第1反應場所中，在固定在固相的第1捕捉物質和用標示物質標示的第2捕捉物質之間，藉由將目標物質夾在中間（sandwich），形成複合體；將含有標示物質的部分由前述複合體中分離，使其移動至第2反應場所；在第2反應場所，藉由基於標示物質的信號（signal）檢測目標物質；係此目標物質檢測方法。
2. 如申請專利範圍第1項所述之目標物質的檢測方法，其中前述固相，係選自面體（hedron）、板狀體（plate）、顆粒狀體（granule）、纖維狀體（fibrous body）、機織織物（woven fabric）、不織布《或稱：無紡布》（non-woven fabric）、薄膜（film）和片料（sheet）所成群類的至少一者。
3. 如申請專利範圍第2項所述之目標物質的檢測方法，其中前述固相，係顆粒狀體（granule），係選自磁性粒子（magnetic particles）、乳膠粒子（latex particle）、和樹脂粒子（resin particle）所成群類的至少一者。
4. 如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之目標物質的檢測方法，其中前述第1捕捉物質，係選自與目標物質特異性地結合的抗體、抗體片段（antibody fragment）、修飾抗體（modified antibody）、核酸適配體（aptamer）和核酸所成群類至少一者。
5. 如申請專利範圍第1至4項之任一項所述之目標物質的檢測方法，其中前述第2捕捉物質，係選自目標物質特異性地結合的抗體、抗體片段（antibody fragment）、修飾抗體（modified antibody）、核酸適配體（aptamer）和核酸所成群類的至少一者。
6. 如申請專利範圍第1至5項之任一項所述之目標物質的檢測方法，包含：在前述複合體形成之後，除去未形成前述複合體的前述第2捕捉物質之目標物質的檢測方法。
7. 如申請專利範圍第1至6項之任一項所述之目標物質的檢測方法，其中前述標示物質，係選自金屬膠體粒子（metal colloidal particle）、酵素（enzyme）、發光物質（luminescent substance）和螢光物質（fluorescent substance）所成群類的至少一者。
8. 如申請專利範圍第1至7項之任一項所述之目標物質的檢測方法，包含：於前述第2反應場所，使基於標示物質的信號發生之目標物質的檢測方法。
9. 如申請專利範圍第8項所述之目標物質的檢測方法，包含前述標示物質係酵素；於前述第2反應場所，與受質反應使信號發生之目標物質的檢測方法。
10. 如申請專利範圍第8項所述之目標物質的檢測方法，包含：前述標示物質係金屬膠體粒子（metal colloidal particle）；於前述第2反應場所，使以金屬膠體粒子為基礎的信號發生之目標物質的檢測方法。
11. 如申請專利範圍第8至10項之任一項所述之目標物質的檢測方法，包含於前述第2反應場所，執行放大基於標示物質的信號的放大反應（amplification reaction）之目標物質的檢測方法。
12. 如申請專利範圍第11項所述之目標物質的檢測方法，包含：前述標示物質係金屬膠體粒子；前述放大反應，係藉由以金屬離子作為受質的還原反應，使金屬膠體粒子生長的反應之目標物質的檢測方法。
13. 如申請專利範圍第1至12項之任一項所述之目標物質的檢測方法，其中含有前述標示物質的部份由前述複合體的分離，藉由選自加熱處置、酸鹼值調節處置、氧化還原處置、酵素處置和競合反應處置所成群類的至少一者處置來進行之目標物質的檢測方法。
14. 如申請專利範圍第1至13項之任一項所述之目標物質的檢測方法，其中前述信號，係透射光（transmitted light）、反射光（reflected light）、散射光（scattered light）、發光（luminescence）和螢光（fluorescence）的至少一者。
15. 如申請專利範圍第1至14項之任一項所述之目標物質的檢測方法，其中前述第2反應場所的容量，比前述第1反應場所的容量小。
16. 如申請專利範圍第1至15項之任一項所述之目標物質的檢測方法，其中由前述複合體分離的含有前述標示物質部分，不包含固相。
17. 一種目標物質的檢測設備，至少包含： 在固定在固相的第1捕捉物質和用標示物質標示的第2捕捉物質之間，藉由將目標物質夾在中間（sandwich），形成複合體，將含標示物質部分由前述複合體分離的第1反應場所；及 在第1反應場所，利用由前述複合體分離的部份的基於標示物質的信號（signal），檢測目標物質的第2反應場所；及 將由前述複合體分離的部份從第1反應場所移動至第2反應場所的通道； 係此種目標物質的檢測設備。
18. 一種試劑，係檢測目標物質的方法中所使用的試劑， 包含：在第1反應場所，在固定在固相的第1捕捉物質和用標示物質標示的第2捕捉物質之間，藉由將目標物質夾在中間，形成複合體，由前述複合體將含標示物質部分分離，使其移動至第2反應場所，在第2反應場所，藉由基於標示物質的信號（signal），檢測目標物質的方法中所使用的試劑；具有分離含有目標物質部分的作用的試劑。
19. 如申請專利範圍第18項所述之試劑，為了達成將含標示物質部分分離的作用，包含：選自酸鹼值調節劑（pH regulator）、變性劑（denaturant）、還原劑（reducing agent）、酵素（enzyme）、競爭劑（competitor）、以及醇類（alcohol）或酯類（ester）和它們的衍生物所成群類的至少一者。
20. 如申請專利範圍第19項所述之試劑，為了達成將含標示物質部分分離的作用，包含酸鹼值調節劑。

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