TW202233838A

TW202233838A - Ｒｐｓ２５基因之表現及／或功能調節劑

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Publication number: TW202233838A
Application number: TW110141414A
Authority: TW
Inventors: 鈴木利佳; 浅野成宏; 栗田光將; 鈴木高尾; 山上正輝; 阿賈亞拉姆什雷斯塔; 川野邊峻哲; 梅本忠士
Original assignee: 日商住友製藥股份有限公司; 日商璐庫薩那生物技術股份有限公司
Priority date: 2020-11-06
Filing date: 2021-11-05
Publication date: 2022-09-01
Also published as: WO2022097727A1; JPWO2022097727A1; CN116507727A; US20240018516A1; EP4252846A1

Abstract

一種調節RPS25基因的表現及/或功能之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽，上述單股反義寡核苷酸係各核苷酸以磷酸基及/或經修飾之磷酸基進行結合，上述單股反義寡核苷酸包含間隔區域、結合至前述間隔區域的3’末端之3’翼區域及結合至上述間隔區域的5’末端之5’翼區域，上述間隔區域為由去氧核糖所構成之核酸，其可包含醣部經修飾之核酸，上述3’翼區域及上述5’翼區域為經修飾之核苷酸，上述單股反義寡核苷酸的鹼基長為12~30mer，上述反義寡核苷酸的鹼基序列為：以對於序列識別號1或序列識別號2所記載之鹼基序列中之以與上述反義寡核苷酸相同的鹼基長所構成之至少1個標的區域而言互補的鹼基序列為基準，具有90%以上且100%以下的序列同一性之鹼基序列；對於在上述標的區域中1或數個鹼基發生缺失、取代、***或附加而得之鹼基序列而言互補的鹼基序列；或在嚴苛的條件下對具有上述標的區域之寡核苷酸進行雜交之鹼基序列。

Description

ＲＰＳ２５基因之表現及／或功能調節劑

本發明係關於調節RPS25基因的表現及/或其功能之反義寡核苷酸，以及包含該等之RPS25基因之表現及/或功能調節劑。

Ribosomal Protein S25(RPS25)基因為編碼出核糖體40S次單元的構成蛋白質之一之基因。針對上述RPS25基因所編碼出之構成蛋白質(RPS25蛋白質)在核糖體40S次單元中之立體結構亦已得到闡明。(非專利文獻1)

RPS25蛋白質係作為蛋白質合成過程的一部分，結合至能夠開始加帽非依存性轉譯(cap-independent translation)之RNA元件，並控制轉譯。上述RPS25蛋白質所結合之上述RNA元件被稱為Internal ribosome entry site(IRES)。所謂IRES，係特定而言在病毒中常見到之加帽非依存性轉譯機制之一。(非專利文獻2)

Repeat associated non-ATG轉譯(RAN轉譯)係於2011年首次在脊髓小腦失調症第8型的患者中得到確認(非專利文獻3)。所謂RAN轉譯，係意味藉由重複特定的序列而ATG非依存性地轉譯成蛋白質(二肽重複(DPR)等)之機制。隨後，在於C9orf72基因上具有變異之肌肉萎縮性側索硬化症(ALS)(以下，有時表述為「C9orf72 ALS」)、亨丁頓氏症(Huntington’s disease)、肌強直性營養不良等複數種重複疾病(以特定的基因序列發生重複為原因而發病之疾患)中亦報導RAN轉譯的參與。已針對由RAN轉譯所產生之DPR與病理狀態之關係進行研究，實際上，已報導DPR的去除對於病理狀態的改善係發揮出效果。(非專利文獻4、非專利文獻5)

於2019年，RPS25蛋白質被報導為對RAN轉譯所引發之二肽重複的產生有重大貢獻之分子。藉由減弱RPS25基因，源自於RAN轉譯依存性GGGGCC重複序列之DPR或源自於CAG重複序列之DPR的產生便受到抑制。GGGGCC重複序列係已知為屬於肌肉萎縮性側索硬化症的家族性變異之一之C9orf72基因異常伸長變異。CAG重複序列係已知為亨丁頓基因(Huntingtin gene)及ATXN2基因的異常伸長變異。已得知在由具有C9orf72基因變異之患者所建立而得之induced purulipotent stem cell(iPSC)所衍生之運動神經細胞中，藉由減弱RPS25基因，源自於GGGGCC重複序列之DPR的產生便受到抑制，同時亦抑制運動神經細胞死亡。(非專利文獻6)

非專利文獻6所揭示之針對於RPS25基因之反義寡核苷酸為翼部分經2’-O-甲基化RNA(2’-OMe核酸)修飾，且核苷間經硫代磷酸酯化之間隔體(gapmer)。另外，該反義寡核苷酸的鹼基序列包含上述RPS25基因的有義股的一部分鹼基序列。 [先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]國際公開第2019/084068號 [專利文獻2]國際公開第2011/052436號 [專利文獻3]國際公開第2014/046212號 [專利文獻4]國際公開第2015/125783號 [專利文獻5]國際公開第2020/158910號 [專利文獻6]國際公開第99/14226號 [非專利文獻]

[非專利文獻1]Science (2011) 331(6018):730-736. [非專利文獻2]Genes Dev. (2009) 23(23):2753-2764. [非專利文獻3]Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2011) 108(1):260-265 [非專利文獻4]Neuron (2015) 88:667-677 [非專利文獻5]Neuron (2020) 105:645-662 [非專利文獻6]Nat. Neurosci. (2019) 22(9):1383-1388 [非專利文獻7]Mol. Gen. Genet. (1979) 169:1-6 [非專利文獻8]Curr. Opin. Struct. Biol. (2014) 24:165-169 [非專利文獻9]J. Med. Chem. (2016) 59:9645-9667 [非專利文獻10]Nature (2015) 518(7539):409-412

[發明所欲解決之課題]

儘管在專利文獻1中，已報導藉由阻礙RPS25基因而抑制DPR的產生，但並不清楚藉由使用反義等核酸之方式是否可看出同樣的效果。此外，非專利文獻5所記載之反義寡核苷酸雖然會抑制RPS25基因的表現，但抑制作用為部分性，為了用作醫藥品，係謀求創建出效果更高的針對於RPS25基因之反義寡核苷酸。

本發明係有鑑於上述情事而完成，本發明所欲解決之課題係在於提供調節RPS25基因的表現及/或功能之單股反義寡核苷酸，以及包含該等之RPS25基因之表現及/或功能調節劑。 [解決課題之手段]

本發明者等人為了解決上述課題而致力進行研究之結果，發現結合至RPS25基因並有效地調節該RPS25基因的表現之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽(以下,有時稱為「本發明之反義寡核苷酸」)，遂完成本發明。即，本發明係如以下者。

[1]本發明之反義寡核苷酸為調節RPS25基因的表現及/或功能之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽，上述單股反義寡核苷酸係各核苷酸以磷酸基及/或經修飾之磷酸基進行結合，上述單股反義寡核苷酸包含間隔區域、結合至上述間隔區域的3’末端之3’翼區域及結合至上述間隔區域的5’末端之5’翼區域，上述間隔區域為由去氧核糖所構成之核酸，其可包含醣部經修飾之核酸，上述3’翼區域及5’翼區域為經修飾之核酸，上述單股反義寡核苷酸的鹼基長為12~30mer，上述單股反義寡核苷酸的鹼基序列為：以對於序列識別號1或序列識別號2所記載之鹼基序列中之以與上述單股反義寡核苷酸相同的鹼基長所構成之至少1個標的區域而言互補的鹼基序列為基準，具有90%以上且100%以下的序列同一性之鹼基序列；對於在上述標的區域中1或數個鹼基發生缺失、取代、***或附加而得之鹼基序列而言互補的鹼基序列；或在嚴苛的條件下對具有上述標的區域之寡核苷酸進行雜交之鹼基序列。

本發明之反義寡核苷酸係經修飾之核酸配置於間隔區域、5’翼區域及3’翼區域。在包含醣部經修飾之核酸之去氧核糖配置於間隔區域之情況，該經修飾之核酸較佳為5’-CP核酸(5’-cyclopropyl nucleic acid)。配置於5’翼區域及3’翼區域之經修飾之核酸，就2’位經修飾之核酸而言，為2’-MOE核酸(2’-O-methoxyethyl nucleic acid)、2’-OMe核酸(2’-O-methyl nucleic acid)及MCE(2’-O-(2-N-methylcarbamoyl)ethyl nucleic acid)，就交聯型經修飾之核酸而言，為2’,4’-BNA(Locked Nucleic Acid，以下有時稱為「LNA」)、AmNA(醯胺交聯型經修飾之核酸，Amido-bridged nucleic acid)、GuNA(胍交聯型經修飾之核酸，Guanidino-bridged nucleic acid)及/或scpBNA(2’-O,4’-C-Spirocyclopropylene bridged nucleic acid)，較佳係包含此等經修飾之核酸中之至少1者。藉由設為此種構成，本發明之反義寡核苷酸對RPS25 mRNA或mRNA前驅物可期待較高的結合親和性。此外，本發明之反義寡核苷酸為所謂的間隔體型單股反義寡核苷酸，因而在後述之經由RNA分解酵素之RPS25基因的分解反應中係作為觸媒而發揮功能。因此，被認為即便是少量的投予，亦持續地產生預定的效果。

[2]較佳係上述單股反義寡核苷酸的鹼基序列為以對於序列識別號1或序列識別號2所記載之鹼基序列中之以與上述單股反義寡核苷酸相同的鹼基長所構成之至少1個標的區域而言互補的鹼基序列為基準，具有95%以上且100%以下的序列同一性之鹼基序列。

[3]較佳係上述單股反義寡核苷酸的鹼基序列為對於序列識別號1或序列識別號2所記載之鹼基序列中之以與上述單股反義寡核苷酸相同的鹼基長所構成之至少1個標的區域而言互補的鹼基序列。

[4]較佳係上述間隔區域的鹼基數為5~20mer，上述3’翼區域為1~5mer的經修飾之核酸，上述5’翼區域為1~5mer的經修飾之核酸。

[5]較佳係上述單股反義寡核苷酸的鹼基長為14~22mer。

[6]較佳係上述3’翼區域中之上述經修飾之核酸包含選自由2’-MOE核酸、LNA、AmNA、GuNA及scpBNA所組成之群組之至少1者，上述5’翼區域中之上述經修飾之核酸包含選自由2’-MOE核酸、LNA、AmNA、GuNA及scpBNA所組成之群組之至少1者。

[7]較佳係上述單股反義寡核苷酸的至少1個核苷酸間鍵為硫代磷酸酯鍵。

[8]較佳係上述單股反義寡核苷酸的至少1個核苷酸間鍵為磷酸二酯鍵。

[9]較佳係上述單股反義寡核苷酸的鹼基序列為：以對於在序列識別號1所記載之鹼基序列中從5’末端算起位於8號~10號、27號~29號、34號~40號、79號、98號、101號~106號、123號~129號、140號、160號~161號、180號~191號、208號~221號、242號~243號、255號~268號、285號~286號、292號~304號、321號~328號、340號~344號、365號或429號~454號之鹼基起連續的14~22mer所構成之標的區域而言互補的鹼基序列為基準，具有90%以上且100%以下的序列同一性之鹼基序列；對於在上述標的區域中1或數個鹼基發生缺失、取代、***或附加而得之鹼基序列而言互補的鹼基序列；或在嚴苛的條件下對具有上述標的區域之寡核苷酸進行雜交之鹼基序列。

[10]較佳係上述單股反義寡核苷酸的鹼基序列為以對於在序列識別號1所記載之鹼基序列中從5’末端算起位於8號、10號、28號~29號、35號~37號、101號~104號、123號~126號、129號、160號、180號~187號、209號~220號、258號~267號、285號、295號~297號、300號~304號、321號~327號、341號、344號、365號或429號~454號之鹼基起連續的14~22mer所構成之標的區域而言互補的鹼基序列為基準，具有90%以上且100%以下的序列同一性之鹼基序列，上述3’翼區域為2~5mer，上述5’翼區域為2~5mer。

[11]較佳係上述單股反義寡核苷酸的鹼基序列為對於序列識別號1所記載之鹼基序列中從5’末端算起位於36號、102號~103號、123號~126號、185號~187號、213號~214號、220號、259號~260號、263號~265號、295號~296號、300號、302號~303號、322號~327號、429號~431號、435號或438號~454號之鹼基起連續的14~22mer所構成之標的區域而言互補的鹼基序列。

[12]較佳係上述單股反義寡核苷酸的鹼基序列為選自由下列者所組成之群組之1種鹼基序列：序列識別號18、24~25、28~29、38、48~49、53、58~59、63~64、66~68、79~80、84、86~91、93~95、97、99~105、113~119、121~123、125、127~130、140、162、169、171~173、183、188、190、304~306、309、310、312、313、317、321~323、326~327、331~332、334、337、340~344、346、348、349、351、353、355~364、366~367、371~382、385、386、388、389、391、394、396、397、407、408、410、418~424、426~427及431~432的鹼基序列。

[13]較佳係上述單股反義寡核苷酸的鹼基序列為：以對於在序列識別號2所記載之鹼基序列中從5’末端算起位於1號、75號、233號、261號、278號~280號、390號~392號、417號~423號、445號~447號、460號~461號、510號、561號~562號、589號、605號、626號~628號、632號~634號、696號~697號、1034號~1035號、1103號~1107號、1128號~1129號、1196號~1197號、1398號、1408號~1412號、1478號~1480號、1715號、1749號~1751號、2047號~2049號、2121號~2123號、2260號~2268號、2342號、2406號或2585號~2587號之鹼基起連續的14~22mer所構成之標的區域而言互補的鹼基序列為基準，具有90%以上且100%以下的序列同一性之鹼基序列；對於在上述標的區域中1或數個鹼基發生缺失、取代、***或附加而得之鹼基序列而言互補的鹼基序列；或在嚴苛的條件下對具有上述標的區域之寡核苷酸進行雜交之鹼基序列。

[14]較佳係上述單股反義寡核苷酸的鹼基序列為以對於在序列識別號2所記載之鹼基序列中從5’末端算起位於1號、278號~279號、417號~420號、561號、605號、627號、632號~634號、697號、1035號、1128號、1196號~1197號、1409號~1410號、1478號、1715號、1750號、2047號~2049號、2342號、2406號或2585號~2587號之鹼基起連續的14~22mer所構成之標的區域而言互補的鹼基序列為基準，具有90%以上且100%以下的序列同一性之鹼基序列，上述3’翼區域為2~5mer，上述5’翼區域為2~5mer。

[15]本發明所涉及之雙股反義寡核苷酸為雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽，其包含上述單股反義寡核苷酸，及對上述單股反義寡核苷酸進行雜交之第二股寡核苷酸，上述第二股寡核苷酸的鹼基序列為以對於上述單股反義寡核苷酸的鹼基序列而言互補的鹼基序列為基準，具有90%以上且100%以下的序列同一性之鹼基序列。

[16]本發明所涉及之反義寡核苷酸複合體為反義寡核苷酸複合體或其製藥學上可容許的鹽，其具有上述單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽或者上述雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽，及結合至上述單股反義寡核苷酸或上述第二股寡核苷酸之附加物質，上述附加物質係選自由聚乙二醇、胜肽、烷基鏈、配位體化合物、抗體、蛋白質及醣鏈所組成之群組。

[17]本發明所涉及之醫藥品包含上述單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽、上述雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽或者上述反義寡核苷酸複合體或其製藥學上可容許的鹽作為有效成分。

[18]本發明所涉及之RPS25基因之表現及/或功能調節劑包含上述單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽、上述雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽或者上述反義寡核苷酸複合體或其製藥學上可容許的鹽作為有效成分。

[19]本發明所涉及之RAN轉譯所引發之二肽重複產生阻礙劑包含上述單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽、上述雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽或者上述反義寡核苷酸複合體或其製藥學上可容許的鹽作為有效成分。

[20]本發明所涉及之針對於重複疾病之治療劑包含上述單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽、上述雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽或者上述反義寡核苷酸複合體或其製藥學上可容許的鹽作為有效成分。

[21]本發明所涉及之針對於重複疾病之預防劑包含上述單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽、上述雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽或者上述反義寡核苷酸複合體或其製藥學上可容許的鹽作為有效成分。

[22]較佳係在上述治療劑及上述預防劑中，上述重複疾病為選自由C9orf72 ALS、於C9orf72基因上具有變異之額顳葉退化症(FTLD)(以下，有時表述為「C9orf72 FTLD」)、亨丁頓氏症、脊髓小腦失調症、齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮症、脊髓延髓性肌肉萎縮症、Friedreich失調症、脆性X相關震顫失調症候群及肌強直性營養不良所組成之群組之至少1者。

[23]本發明所涉及之調節RPS25基因的表現之方法包含將上述單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽、上述雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽或者上述反義寡核苷酸複合體或其製藥學上可容許的鹽作為有效成分，投予至表現出上述RPS25基因之細胞、組織或個體之步驟。

[24]本發明所涉及之重複疾病的治療方法或預防方法包含將上述單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽、上述雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽或者上述反義寡核苷酸複合體或其製藥學上可容許的鹽作為有效成分，投予至罹患上述重複疾病之個體之步驟。上述重複疾病較佳為選自由C9orf72 ALS、C9orf72 FTLD、亨丁頓氏症、脊髓小腦失調症、齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮症、脊髓延髓性肌肉萎縮症、Friedreich失調症、脆性X相關震顫失調症候群及肌強直性營養不良所組成之群組之至少1者。

[25]本發明係提供C9orf72 ALS的治療方法或預防方法，其包含將上述單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽、上述雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽或者上述反義寡核苷酸複合體或其製藥學上可容許的鹽投予至個體。

[26]本發明係提供上述單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽、上述雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽或者上述反義寡核苷酸複合體或其製藥學上可容許的鹽，其係使用於C9orf72 ALS的治療或預防。

[27]本發明係提供上述單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽、上述雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽或者上述反義寡核苷酸複合體或其製藥學上可容許的鹽，其係使用於製造C9orf72 ALS的治療劑或預防劑。 [發明效果]

根據本發明，能夠提供調節RPS25基因的表現及/或功能之單股反義寡核苷酸，以及包含該等之RPS25基因之表現及/或功能調節劑。

以下，針對本發明之一實施形態(以下，有時記為「本實施形態」)進行說明。惟，本實施形態並不限定於此。在本說明書中，「I~J」之形式的表述係意味範圍的上限及下限(即I以上且J以下)。在於I中無單位的記載且僅於J中記載單位之情況，I的單位與J的單位相同。

≪調節RPS25基因的表現及/或功能之單股反義寡核苷酸≫ 本實施形態之單股反義寡核苷酸為調節RPS25基因的表現及/或功能之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽，上述單股反義寡核苷酸係各核苷酸以磷酸基及/或經修飾之磷酸基進行結合，上述單股反義寡核苷酸包含間隔區域、結合至上述間隔區域的3’末端之3’翼區域及結合至上述間隔區域的5’末端之5’翼區域，上述間隔區域為由去氧核糖所構成之核酸，其可包含醣部經修飾之核酸，上述3’翼區域及5’翼區域為經修飾之核酸，上述反義寡核苷酸的鹼基長為12~30mer，上述反義寡核苷酸的鹼基序列為：以對於序列識別號1或序列識別號2所記載之鹼基序列中之以與上述反義寡核苷酸相同的鹼基長所構成之至少1個標的區域而言互補的鹼基序列為基準，具有90%以上且100%以下的序列同一性之鹼基序列；對於在上述標的區域中1或數個鹼基發生缺失、取代、***或附加而得之鹼基序列而言互補的鹼基序列；或在嚴苛的條件下對具有上述標的區域之寡核苷酸進行雜交之鹼基序列。以下詳細地進行說明。

＜用語的定義等＞首先，以下針對本說明書中所使用之用語的定義等進行說明。

(RPS25基因) 在本實施形態中，「RPS25基因」可藉由Mol. Gen. Genet. (1979) 169:1-6(非專利文獻7)、CURR. OPIN. STRUCT. BIOL. (2014) 24:165-169(非專利文獻8)加以定義。作為「RPS25」的同義語，可列舉40S ribosomal protein S25、ribosomal protein S25、Small ribosomal subunit protein eS25、Rps25、2810009D21Rik、ribosomal protein s25、Ribosomal Protein S25、S25、eS25及核糖體蛋白質等。

(單股反義寡核苷酸) 在本實施形態中，所謂「單股反義寡核苷酸」或「反義寡核苷酸」(以下,有時稱為「ASO」)，係意味對於標的基因的mRNA、mRNA前驅物或ncRNA(非編碼RNA)(以下,有時將此等三者統稱為「標的RNA」)而言互補的寡核苷酸或其藥理學上可容許的鹽。反義寡核苷酸係由DNA、RNA及/或該等的類似體所構成。反義寡核苷酸係藉由與作為標的之mRNA、mRNA前驅物或ncRNA形成雙股而抑制作為標的之mRNA、mRNA前驅物或ncRNA的作用。在反義寡核苷酸中，包含具有對於作為標的之mRNA、mRNA前驅物或ncRNA的鹼基序列而言完全互補的鹼基序列者；具有在該互補的鹼基序列中1個或數個鹼基發生缺失、取代、***或附加而得之鹼基序列者；以及在其鹼基序列中包含形成搖擺鹼基對之鹼基者。此外，本發明之反義寡核苷酸亦可進一步包含後述之「醣部為經修飾之醣之經修飾之核酸」(受到醣修飾之經修飾之核苷酸)以外之該領域中公知的經修飾之核苷酸。作為該領域中公知的經修飾之核苷酸，除了受到醣修飾之經修飾之核苷酸以外，尚可列舉例如後述之受到磷酸基修飾之經修飾之核苷酸、受到核酸鹼基修飾之經修飾之核苷酸等。另外，本實施形態中之反義寡核苷酸係其兩末端的結構並無特別限制，例如，可為-OH，亦可為-OR(惟，R表示烷基鏈、磷酸酯體或後述之附加物質)。此外，本實施形態中之單股反義寡核苷酸可為單股的形態，亦可與後述之第二股寡核苷酸進行雜交而採取雙股的形態。有時將由上述單股反義寡核苷酸及對上述單股反義寡核苷酸進行雜交之第二股寡核苷酸所構成之雙股寡核苷酸稱為「雙股反義寡核苷酸」。

(寡核苷酸) 在本實施形態中，所謂「寡核苷酸」，係意味相同或不同的核苷酸經磷酸二酯鍵或其他鍵連結2~30個而得之核苷酸的聚合物。上述寡核苷酸亦可理解為如以下結構式所示，由核酸鹼基部、磷酸部及醣部所構成。

【化1】

上述寡核苷酸係大致區分成天然型寡核苷酸及非天然型寡核苷酸。所謂「天然的寡核苷酸」，係意味由天然存在之核苷酸所構成之寡核苷酸。所謂「非天然的寡核苷酸」，係意味包含至少1個後述之經修飾之核苷酸作為構成單元之寡核苷酸。作為「非天然型寡核苷酸」，較佳係可列舉醣部經修飾之經修飾之醣衍生物；磷酸二酯鍵的1個非交聯氧原子經硫原子置換之硫代磷酸酯衍生物；磷酸二酯鍵的2個非交聯氧原子經硫原子置換之二硫代磷酸酯衍生物；磷酸二酯鍵經三酯化之酯衍生物；磷酸二酯鍵經醯胺化之磷醯胺衍生物；磷酸二酯鍵經亞硼酸酯化之硼烷磷酸酯衍生物；磷酸二酯鍵的非交聯氧原子被取代成烷基之烷基膦酸酯(例如甲基膦酸酯、甲氧基丙基膦酸酯等)衍生物；磷酸二酯鍵被取代成醯胺鍵之醯胺衍生物：核酸鹼基經修飾之經修飾之鹼基衍生物。更佳係上述非天然的寡核苷酸可列舉醣部經修飾之交聯型經修飾之醣衍生物；磷酸二酯鍵的1個非交聯氧原子經硫原子置換之硫代磷酸酯衍生物；磷酸二酯鍵經酯化之酯衍生物；及醣部經後述之經修飾之醣(例如交聯型醣)修飾，且磷酸二酯鍵的1個非交聯氧原子經硫原子置換，或磷酸二酯鍵的非交聯氧原子被取代成烷基之受到烷基膦酸酯化之衍生物等。

(核苷) 在本實施形態中，所謂「核苷」，係意味嘌呤鹼基或嘧啶鹼基與醣進行結合而得之化合物。有時將天然存在之核苷稱為「天然核苷」。有時將非天然存在之經修飾之核苷稱為「經修飾之核苷」。特定而言，有時將醣部分經修飾之經修飾之核苷稱為「經修飾之醣核苷」。

(核苷酸) 在本實施形態中，所謂「核苷酸」，係意味磷酸基結合至上述核苷的醣而得之化合物。有時將天然存在之核苷酸稱為「天然核苷酸」。有時將非天然存在之經修飾之核苷酸稱為「經修飾之核苷酸」或「經修飾之核酸」。作為「經修飾之核苷酸」或「經修飾之核酸」，可列舉磷酸基結合至上述經修飾之核苷的醣部而得之化合物、後述之經修飾之磷酸基結合至上述經修飾之核苷的醣部而得之化合物及後述之經修飾之磷酸基結合至天然核苷的醣部而得之化合物等。

(醣修飾、經修飾之醣) 在本實施形態中，所謂「醣修飾」，係意味上述核苷酸的醣部受到修飾。有時將經修飾之醣部特別稱為「經修飾之醣」。經施以醣修飾之經修飾之核苷酸能夠利用作為經修飾之核酸，可列舉例如AmNA、GuNA、scpBNA、2’-O-烷基(例如2’-O-甲基核酸、2’-MOE核酸等)、2’-F、5’-甲基-DNA、LNA、ENA(2’-O,4’-C-Ethylene-Bridged Nucleic Acid)、S-cEt(2’,4’-constrained Ethyl Nucleic Acid)、5’-CP核酸(5’-cyclopropyl Nucleic Acid)等。作為LNA，可列舉例如包含後述之記號「A(L)」、「5(L)」、「G(L)」、「T(L)」所示之結構者。作為AmNA，可列舉例如包含後述之記號「A(Y)」、「5(Y)」、「G(Y)」、「T(Y)」所示之結構者。作為GuNA，可列舉例如包含後述之記號「A(Gx)」、「5(Gx)」、「G(Gx)」、「T(Gx)」所示之結構者。作為scpBNA，可列舉例如包含後述之記號「A(S)」、「5(S)」、「G(S)」、「T(S)」所示之結構者。作為2’-MOE核酸，可列舉例如包含後述之記號「A(m)」、「5(m)」、「G(m)」、「T(m)」所示之結構者。作為5’-CP核酸，可列舉例如包含後述之記號「A(5’-CP)」、「5(5’-CP)」、「G(5’-CP)」、「T(5’-CP)」所示之結構者。作為2’-OMe核酸，可列舉例如包含後述之記號「A(M)」、「C(M)」、「G(M)」、「U(M)」所示之結構者。作為MCE核酸，可列舉例如包含後述之「A(Mx)」、「C(Mx)」、「G(Mx)」、「U(Mx)」所示之結構者。

(醣修飾以外之該領域中公知的核苷酸的修飾) 上述醣修飾以外之該領域中公知的核苷酸的修飾能夠利用作為用於製造本發明之單股反義寡核苷酸之經修飾之核酸。作為核苷酸的修飾，係已知後述之磷酸基修飾、核酸鹼基修飾。此種核苷酸的修飾可列舉例如W. Brad Wan et. Al. J. Med. Chem. (2016) 59:9645-9667.(非專利文獻9)等所記載之核苷酸的修飾。此等核苷酸的修飾可基於上述文獻所引用之文獻中所述之該領域中公知的方法予以施行。

(磷酸基) 在本實施形態中，所謂「磷酸基」，係意味上述核苷酸的磷酸部的鍵結樣式為天然存在之磷酸二酯鍵(後述之記號「-」所示之鍵結)者。

(磷酸基修飾、經修飾之磷酸基) 在本實施形態中，所謂「磷酸基修飾」，係意味上述核苷酸的磷酸部受到修飾。有時將經修飾之磷酸部特別稱為「經修飾之磷酸基」。作為包含上述經修飾之磷酸基之鍵結樣式，可列舉例如硫代磷酸酯鍵(後述之記號「∧」所示之鍵結)、二硫代磷酸酯鍵、胺基磷酸酯鍵(後述之記號「=」所示之鍵結)或硼烷磷酸酯鍵(後述之記號「×」所示之鍵結)、烷基膦酸酯等。

(核酸鹼基修飾、經修飾之核酸鹼基) 在本實施形態中，所謂「核酸鹼基修飾」，係意味上述核苷酸的核酸鹼基部受到修飾。有時將經修飾之核酸鹼基部特別稱為「經修飾之核酸鹼基」。作為經修飾之核酸鹼基，可列舉例如5-甲基胞嘧啶、5-羥基甲基胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶等。

(DNA或RNA的類似體) 所謂上述DNA或RNA的類似體，係意味持有類似於DNA或RNA之結構之分子。可列舉例如胜肽核酸(pNA)、N-嗎啉基核酸等。

(ncRNA) 在本實施形態中，所謂「ncRNA」，係意味不參與蛋白質的轉譯之RNA的總稱。作為上述ncRNA，可列舉例如核糖體RNA、轉移RNA、miRNA、Natural Antisense Transcript(NAT)等。

(寡核苷酸的核酸鹼基部) 作為上述寡核苷酸的核酸鹼基部，可列舉胸腺嘧啶、胞嘧啶基、腺嘌呤基、鳥嘌呤基、5-甲基胞嘧啶基、尿嘧啶基、2-側氧基-4-羥基-5-甲基-1,2-二氫嘧啶-1-基、2-側氧基-4-胺基-1,2-二氫嘧啶-1-基、4-胺基-5-甲基-2-側氧基-1,2-二氫嘧啶-1-基及2-側氧基-4-羥基-1,2-二氫嘧啶-1-基等。作為上述核酸鹼基部，較佳係可列舉胸腺嘧啶、胞嘧啶基、腺嘌呤基、鳥嘌呤基、5-甲基胞嘧啶基及尿嘧啶基等。該核酸鹼基之中，尿嘧啶(U)與胸腺嘧啶(T)有互換性。尿嘧啶(U)及胸腺嘧啶(T)中之任一者皆可形成與互補鏈的腺嘌呤(A)之鹼基對。此外，在反義寡核苷酸的核酸鹼基部中亦相同。

(標的RNA) 在本實施形態中，所謂「標的RNA」，係意味其功能因上述單股反義寡核苷酸進行結合而受到抑制之RNA。換言之，在本實施形態中，所謂標的RNA，係意味RPS25的mRNA及mRNA前驅物。作為上述標的RNA，可列舉例如具有序列識別號1所記載之鹼基序列之人類RPS25的mRNA(以下，有時稱為「hRPS25」)、具有序列識別號2所記載之鹼基序列之人類RPS25的mRNA前驅物(以下，有時稱為「hpRPS25」)、具有序列識別號3所記載之鹼基序列之猴RPS25的mRNA(以下，有時稱為「cRPS25」)、具有序列識別號4所記載之鹼基序列之猴RPS25的mRNA前驅物、具有序列識別號5所記載之鹼基序列之小鼠RPS25的mRNA(以下，有時稱為「mRPS25」)、具有序列識別號6所記載之鹼基序列之小鼠RPS25的mRNA前驅物等。

(與標的RNA之結合) 在本實施形態中，所謂「與標的RNA之結合」，係意味單股反義寡核苷酸的核酸鹼基藉由與標的RNA之互補性而與該標的RNA的核酸鹼基共同形成雙股核酸。上述雙股核酸只要在上述標的RNA的至少一部分形成即可。另外，與上述標的RNA之結合的強度可藉由例如熱安定性的指標予以測定。作為上述熱安定性的指標，可列舉例如上述雙股核酸的熔解溫度(Tm值)等。作為上述Tm值，較佳為40~90℃，更佳為50~70℃。

(標的區域) 上述所謂標的區域，係意味RPS25的mRNA及mRNA前驅物中之與上述單股反義寡核苷酸進行結合之區域。在上述標的區域中，包含由所示之鹼基序列所構成之標的區域及RPS25的mRNA前驅物上之區域。

(mRNA前驅物) 上述所謂mRNA前驅物，係意味從DNA轉錄而得之RNA的初級轉錄物。即，上述mRNA前驅物為包含外顯子區域、內含子區域及非轉譯區域(Untranslated region：UTR)之RNA。上述mRNA前驅物亦可理解為轉錄後施行剪接前之RNA。若上述mRNA前驅物受到剪接，則成為mRNA。

(與標的區域之結合) 上述所謂與標的區域之結合，係意味本發明之單股反義寡核苷酸與標的區域形成雙股。惟，本發明之單股反義寡核苷酸並非一定需要與標的區域整體形成雙股，只要與標的區域的一部分區域形成雙股即可。即，本發明之單股反義寡核苷酸較佳為與標的區域具有完全的互補性者，但在與RPS25的標的RNA進行結合之前提下，只要與標的區域的至少一部分區域互補即可。

(標的區域的一部分) 上述所謂標的區域的一部分，係意味標的區域中之10~15個核苷酸鹼基長的區域。

(與標的區域的至少一部分互補) 上述所謂與標的區域的至少一部分互補，係意味與標的RNA上之標的區域的至少一部分區域的鹼基互補。在此處，亦包含與至少一部分區域所對應之mRNA或mRNA前驅物上之區域的鹼基互補。

＜單股反義寡核苷酸的鹼基序列＞本實施形態所涉及之單股反義寡核苷酸的鹼基序列為： (A)以對於在序列識別號1所記載之鹼基序列中從5’末端算起位於8號~10號、27號~29號、34號~40號、79號、98號、101號~106號、123號~129號、140號、160號~161號、180號~191號、208號~221號、242號~243號、255號~268號、285號~286號、292號~304號、321號~328號、340號~344號、365號或429號~454號之鹼基起連續的12~30mer(較佳為14~22mer)所構成之標的區域而言互補的鹼基序列為基準，具有90%以上且100%以下的序列同一性之鹼基序列，或以對於在序列識別號2所記載之鹼基序列中從5’末端算起位於1號、75號、233號、261號、278號~280號、390號~392號、417號~423號、445號~447號、460號~461號、510號、561號~562號、589號、605號、626號~628號、632號~634號、696號~697號、1034號~1035號、1103號~1107號、1128號~1129號、1196號~1197號、1398號、1408號~1412號、1478號~1480號、1715號、1749號~1751號、2047號~2049號、2121號~2123號、2260號~2268號、2342號、2406號或2585號~2587號之鹼基起連續的12~30mer(較佳為14~22mer)所構成之標的區域而言互補的鹼基序列為基準，具有90%以上且100%以下的序列同一性之鹼基序列； (B)對於在上述標的區域中1或數個鹼基發生缺失、取代、***或附加而得之鹼基序列而言互補的鹼基序列；或 (C)在嚴苛的條件下對具有上述標的區域之寡核苷酸進行雜交之鹼基序列。此外，在本實施形態中，序列表所示之各鹼基序列係設為僅用於顯示出核酸鹼基部的序列資訊。除了上述核酸鹼基部以外尚包含醣部及磷酸部之寡核苷酸的結構資訊係設為以後述之表3-1~表3-17及表4-1~表4-5所示之記載形式來表示。

在本實施形態中，所謂「序列同一性」，係意味使用該技術領域中公知的數學演算法使2個鹼基序列進行比對之情況之最適的比對(較佳係該演算法為了進行最適的比對，可考慮將間隔導入序列中之一者或兩者)中，相對於重疊的全部鹼基序列而言，同一鹼基的比例(%)。只要是熟習該項技術者，即可輕易地確認鹼基序列的「序列同一性」。可使用例如NCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)。

本實施形態所涉及之單股反義寡核苷酸的鹼基序列較佳係與對於序列識別號1或序列識別號2所記載之鹼基序列中之上述預定的標的區域而言互補的鹼基序列具有95%以上且100%以下的序列同一性，更佳係具有98%以上且100%以下的序列同一性，再佳係具有100%的序列同一性。

在本實施形態中，作為「1或數個鹼基發生缺失、取代、***或附加而得之鹼基序列」，可列舉例如藉由缺失、取代、***或附加而相對於發生缺失、取代、***或附加之前之鹼基序列而言具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上或99%以上的序列同一性之鹼基序列。作為「1或數個鹼基」的具體數目，上述缺失、取代、***或附加可各自獨立地存在於1處、2處、3處、4處或5處，亦可組合出現複數個。

在本實施形態中，所謂「嚴苛的條件」，係指在包含6×SSC(1×SSC的組成：0.15M的NaCl、0.015M的檸檬酸鈉，pH7.0)、0.5%SDS、5×Denhardt溶液、100μg/mL的變性鮭魚***DNA及50%(v/v)甲醯胺之溶液中，於室溫保溫培養12小時，進一步以0.5×SSC於50℃以上的溫度洗淨之條件。再者，亦包含更嚴苛的條件，例如於45℃或60℃保溫培養12小時、以0.2×SSC或0.1×SSC洗淨、洗淨時在60℃或65℃以上的溫度條件下進行洗淨等更嚴格的條件。

在本實施形態的一面向中，上述標的區域較佳為在序列識別號1所記載之鹼基序列中從5’末端算起位於8號、10號、28號~29號、35號~37號、101號~104號、123號~126號、129號、160號、180號~187號、209號~220號、258號~267號、285號、295號~297號、300號~304號、321號~327號、341號、344號、365號或429號~454號之鹼基起連續的12~30mer或14~22mer所構成之鹼基序列。在本實施形態的一面向中，上述標的區域較佳為在序列識別號2所記載之鹼基序列中從5’末端算起位於1號、278號~279號、417號~420號、561號、605號、627號、632號~634號、697號、1035號、1128號、1196號~1197號、1409號~1410號、1478號、1715號、1750號、2047號~2049號、2342號、2406號或2585號~2587號之鹼基起連續的12~30mer或14~22mer所構成之鹼基序列，上述3’翼區域為2~5mer，上述5’翼區域為2~5mer。

在本實施形態的另一面向中，上述標的區域較佳為序列識別號1所記載之鹼基序列中從5’末端算起位於36號、102號~103號、123號~126號、185號~187號、213號~214號、220號、259號~260號、263號~265號、295號~296號、300號、302號~303號、322號~327號、429號~431號、435號或438號~454號之鹼基起連續的12~30mer、14~22mer或14~20mer所構成之鹼基序列。

上述單股反義寡核苷酸可與RPS25的標的區域進行結合。在本說明書中，所謂本發明之單股反義寡核苷酸的「與RPS25的標的區域之結合」，係含括本發明之單股反義寡核苷酸對RPS25的mRNA之直接結合及對RPS25的mRNA前驅物之直接結合。

作為本發明之單股反義寡核苷酸的一態樣，係調節RPS25基因的表現之單股寡核苷酸，其持有表1-1~表1-9所記載之任一鹼基序列，該單股寡核苷酸係與表1-1~表1-9所記載之人類RPS25的mRNA中之標的區域互補。另外，該單股寡核苷酸只要包含表1-1~表1-9所記載之鹼基序列，則亦可各自向3’側及/或5’側延伸1~5個鹼基。上述標的區域可說是在人類RPS25的mRNA中，特定而言，與人類RPS25基因的表現調節相關聯之區域(例如持有反義核苷酸易於結合之mRNA的二級結構之區域)。例如，在表1-1中，在5’末端位置為「8」且3’末端位置為「22」之情況，序列識別號1所記載之鹼基序列中之從5’末端算起第8號至第22號的鹼基序列係成為對應之單股反義寡核苷酸(序列名「h8-22」)所作為標的之人類RPS25的mRNA中之標的區域。

在上述表1-1~表1-9及後述之表2-1~表2-5中，記號「A’」、記號「C’」、記號「G’」及記號「T’」係各自選自天然核苷(後述之a、A、c、C、g、G、t及U)或經修飾之核苷(包含經修飾之醣核苷)。另外，作為經修飾之醣核苷，記號「A’」係選自後述之A(M)、A(m)、A(L)、A(Y)、A(Gx)、A(5’-CP)、A(Mx)或A(S)，記號「C’」係選自後述之5(x)、C(M)、5(m)、5(L)、5(Y)、5(Gx)、5(5’-CP)、C(Mx)或5(S)，記號「G’」係選自後述之G(M)、G(m)、G(L)、G(Y)、G(Gx)、G(5’-CP)、G(Mx)或G(S)，記號「T’」係選自後述之U(M)、T(m)、T(L)、T(Y)、T(Gx)、T(5’-CP)、U(Mx)或T(S)。

作為本發明之單股反義寡核苷酸的一態樣，係調節RPS25基因的表現之單股寡核苷酸，其持有表2-1~表2-5所記載之任一鹼基序列，該單股寡核苷酸係與表2-1~表2-5所記載之人類RPS25的mRNA前驅物中之標的區域互補。另外，該單股寡核苷酸只要包含表2-1~表2-5所記載之鹼基序列，則亦可各自向3’側及/或5’側延伸1~5個鹼基。上述標的區域可說是在人類RPS25的mRNA前驅物中，特定而言，與人類RPS25基因的表現調節相關聯之區域(例如顯示出反義核苷酸易於結合之mRNA前驅物的二級結構之區域等)。例如，在表2-1中，在5’末端位置為「1」且3’末端位置為「15」之情況，序列識別號2所記載之鹼基序列中之從5’末端算起第1號至第15號的鹼基序列係成為對應之單股反義寡核苷酸(序列名「hp1-15」)所作為標的之人類RPS25的mRNA前驅物中之標的區域。

在本實施形態的一面向中，上述單股反義寡核苷酸的鹼基序列較佳為選自由下列者所組成之群組之1種鹼基序列：序列識別號7、9、11~12、17~19、23~25、27~29、31、33、36~38、46~50、52~53、58~61、63~68、70、73~74、79~81、84~107、111、113~130、136、140、143、148、150、159、161~162、169~173、183~186、188~190、203、208~212、229、232~234、238、298~300、303~313、317、319、321~323、326~338、340~349、351~367、370~382、385~398、400~411、413、415、416、418~427及430~432的鹼基序列。

在本實施形態的一面向中，上述單股反義寡核苷酸的鹼基序列更佳為選自由下列者所組成之群組之1種鹼基序列：序列識別號18、24~25、28~29、38、48~49、53、58~59、63~64、66~68、79~80、84、86~88、91、93~95、97、99、101~105、113~119、121~123、125、127~130、140、162、169、171~173、183、188、190、304~306、309、310、312、313、317、321~323、326、327、331、332、334、337、340~342、344、346、348、349、351、353、355~364、366~367、371~382、385、386、388、389、391、394、396、397、407、408、410、418~424、426、427、431及432的鹼基序列。

在本實施形態的一面向中，上述單股反義寡核苷酸的鹼基序列再佳為選自由下列者所組成之群組之1種鹼基序列：序列識別號24~25、28、64、80、91、94、97、113~114、116、119、127、129~130、162、172、183、305、306、309、312、322、323、326、331、340、341、346、348、349、351、355、358~361、363、366、367、372~379、381、382、386、394、397、419、421~424、426、431及432的鹼基序列。

＜藥理學上可容許的鹽＞本實施形態所涉及之單股反義寡核苷酸亦可為藥理學上可容許的鹽的形態。在此處，所謂「藥理學上可容許的鹽」，係意味本發明之單股反義寡核苷酸的鹽，其係本發明之單股反義寡核苷酸的生理學上可容許的鹽，即，保持該單股反義寡核苷酸所期望的生物學的活性，且不保持不期望的毒物學效果之鹽。另外，針對後述之雙股反義寡核苷酸及反義寡核苷酸複合體亦相同。

＜製藥學上可容許的鹽＞在本實施形態的一面向中，上述單股反義寡核苷酸亦可為製藥學上可容許的鹽的形態。在此處，所謂「製藥學上可容許的鹽」，係意味上述藥理學上可容許的鹽，且其係酸加成鹽或鹼加成鹽。作為酸加成鹽，可列舉例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、氫碘酸鹽、硝酸鹽及磷酸鹽等無機酸鹽，以及檸檬酸鹽、草酸鹽、酞酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、琥珀酸鹽、蘋果酸鹽、醋酸鹽、甲酸鹽、丙酸鹽、安息香酸鹽、三氟醋酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽及樟腦磺酸鹽等有機酸鹽。此外，作為鹼加成鹽，可列舉例如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、鋇鹽及鋁鹽等無機鹼鹽，以及三甲基胺、三乙基胺、吡啶、甲基吡啶、2,6-二甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、參(羥甲基)胺基甲烷[參(羥基甲基)甲基胺]、第三丁基胺、環己基胺、二環己基胺及N,N-二苄基乙基胺等有機鹼鹽等。再者，可列舉與精胺酸、離胺酸、鳥胺酸、天冬胺酸或麩胺酸等鹼性胺基酸或酸性胺基酸之鹽(胺基酸鹽)。另外，針對後述之雙股反義寡核苷酸及反義寡核苷酸複合體亦相同。

＜單股反義寡核苷酸的結構＞本實施形態所涉及之單股反義寡核苷酸包含間隔區域、結合至上述間隔區域的3’末端之3’翼區域及結合至上述間隔區域的5’末端之5’翼區域(參照例如圖1)。上述單股反義寡核苷酸較佳為單股的形態。在本實施形態的一面向中，上述單股反義寡核苷酸亦可與後述之第二股寡核苷酸進行雜交而採取雙股的形態(雙股反義寡核苷酸)。上述第二股寡核苷酸的鹼基序列較佳為為以對於上述單股反義寡核苷酸的鹼基序列而言互補的鹼基序列為基準，具有90%以上且100%以下的序列同一性之鹼基序列。

上述單股反義寡核苷酸為所謂的間隔體型單股反義寡核苷酸。間隔體型單股反義寡核苷酸係藉由以下機制阻礙標的RNA的功能。首先，該單股反義寡核苷酸結合至標的RNA的標的區域(圖2的上部至中央部)。接著，屬於RNA分解酵素之RNaseH識別出該單股反義寡核苷酸與標的RNA之複合體並進行結合(圖2的中央部)。然後，由於RNaseH所引發之酵素分解反應，標的RNA被切斷、分解。此時，上述單股反義寡核苷酸並未受到RNaseH所引發之酵素分解的影響(圖2的下部)。因此，上述單股反義寡核苷酸能夠結合至另一標的RNA並將該RNA切斷、分解。如此，間隔體型單股反義寡核苷酸在上述RNaseH所引發之酵素分解反應中係作為觸媒而發揮功能，因而被認為即便是少量的投予，亦持續地產生預定的效果。

此外，上述單股反義寡核苷酸在本實施形態中能夠適合地使用於藉由如上述之機制調節RPS25基因的表現(亦包含經由調節RPS25的mRNA前驅物的成熟而產生作用之情況)。再者，根據本實施形態，即便是在屬於臨床應用時通常所使用之投予途徑之髓腔內投予，亦可發揮上述單股反義寡核苷酸所引發之調節RPS25基因的表現之效果。在此處，所謂「調節RPS25基因的表現」，係至少意味抑制RPS25基因的表現，就結果而言，係至少意味抑制RPS25蛋白質的功能(RAN轉譯等)。

(間隔區域) 上述間隔區域較佳為5~20mer的由去氧核糖所構成之核酸，其可包含醣部經修飾之核酸。換言之，上述間隔區域亦可理解為5~20mer的醣部可受到修飾之包含去氧核糖之核酸。此外，上述間隔區域亦可理解為由5~20mer的醣部為去氧核糖之天然核苷酸、非天然核苷酸或此等兩者所構成。上述間隔區域係藉由醣部為去氧核糖或經修飾之去氧核糖，而能夠與屬於標的RNA之RPS25的mRNA等共同形成RNaseH能夠識別之複合體。在此處，作為包含經修飾之去氧核糖之核酸，可列舉例如5’-CP核酸。

上述間隔區域的鹼基數較佳為5~20mer，更佳為6~17mer，再佳為7~13mer，再更佳為7~11mer。

作為醣部為去氧核糖之天然核苷酸，可列舉例如去氧腺苷一磷酸、去氧鳥苷一磷酸、胸苷一磷酸、去氧胞苷一磷酸、去氧-5-甲基胞苷一磷酸(亦稱為5-甲基去氧胞苷)等。換言之，作為構成上述間隔區域之天然核苷酸，可列舉包含後述之記號a、g、t及c各自所對應之結構式者。

作為醣部為去氧核糖或經修飾之去氧核糖之非天然核苷酸，可列舉例如5’-CP核酸、2-硫代-胸苷一磷酸、2-胺基腺苷一磷酸、7-去氮鳥苷一磷酸等。

另外，上述間隔區域在產生本發明的效果之前提下，醣部為去氧核糖之天然核苷酸的一部分醣部亦可為經修飾之醣。即，在本實施形態的一面向中，上述間隔區域亦可為一部分醣部為去氧核糖且另一部分醣部為經修飾之醣(例如經修飾之去氧核糖)之核酸。

(3’翼區域) 上述3’翼區域為經修飾之核酸。換言之，上述3’翼區域亦可理解為由經修飾之核苷酸所構成。上述3’翼區域中之上述經修飾之核酸較佳係包含選自由下列者所組成之群組之至少1者：就2’位經修飾之核酸而言，2’-O-甲基核酸、2’-MOE核酸及MCE核酸，就交聯型經修飾之核酸而言，LNA、AmNA、GuNA及scpBNA。一般認為上述3’翼區域及後述之上述5’翼區域係藉由由上述預定的經修飾之核苷酸所構成而對標的RNA可期待較高的結合親和性，進而可有效地抑制標的RNA的功能。在本實施形態的一面向中，上述3’翼區域亦可為醣部為經修飾之醣之經修飾之核酸。作為醣部為經修飾之醣之經修飾之核酸，可例示上述(醣修飾、經修飾之醣)所列舉者。在本實施形態的一面向中，3’翼區域中之上述經修飾之核酸亦可僅由2’-MOE核酸所構成。另外，上述3’翼區域中之經修飾之核酸亦可在1個單股反義寡核苷酸之中包含複數種。

上述3’翼區域的鹼基數較佳為1~5mer，更佳為2~5mer，再佳為2~4mer，再更佳為3~4mer。

(5’翼區域) 上述5’翼區域為經修飾之核酸。換言之，上述5’翼區域亦可理解為由經修飾之核苷酸所構成。上述5’翼區域中之上述經修飾之核酸較佳係包含選自由下列者所組成之群組之至少1者：就2’位經修飾之核酸而言，2’-O-甲基核酸、2’-MOE核酸及MCE核酸，就交聯型經修飾之核酸而言，LNA、AmNA、GuNA及scpBNA。在本實施形態的一面向中，上述5’翼區域亦可為醣部為經修飾之醣之經修飾之核酸。作為醣部為經修飾之醣之經修飾之核酸，可例示上述(醣修飾、經修飾之醣)所列舉者。在本實施形態的一面向中，5’翼區域中之上述經修飾之核酸亦可僅由2’-MOE核酸所構成。另外，上述5’翼區域中之經修飾之核酸亦可在1個單股反義寡核苷酸之中包含複數種。在本實施形態的另一面向中，3’翼區域及5’翼區域中之上述經修飾之核酸亦可僅由2’-MOE核酸所構成。

上述5’翼區域的鹼基數較佳為1~5mer，更佳為2~5mer，再佳為2~4mer。

在本實施形態的一面向中，較佳係上述間隔區域的鹼基數為6~17mer，上述3’翼區域的鹼基數為2~4mer，上述5’翼區域的鹼基數為2~4mer。

在本實施形態的一面向中，更佳係上述間隔區域的鹼基數為7~13mer，上述3’翼區域的鹼基數為2~4mer，上述5’翼區域的鹼基數為2~4mer。

在本實施形態的一面向中，再佳係上述間隔區域的鹼基數為7~11mer，上述3’翼區域的鹼基數為2~4mer，上述5’翼區域的鹼基數為2~4mer。

(其他構成) 在本實施形態的一面向中，單股反義寡核苷酸亦可進一步包含結合至上述3’翼區域的3’末端之天然核苷酸。結合至上述3’翼區域的3’末端之天然核苷酸的鹼基數可為1或數個，亦可為1個。

(間隔體型結構的表述方法) 本發明之單股反義寡核苷酸為間隔體型。在表述間隔體型結構時，有時係使用「X-Y-Z」或「X-Y-Z-W」的表述方法。在上述表述方法中，「X」表示5’翼區域的鹼基數，「Y」表示間隔區域的鹼基數，「Z」表示3’翼區域的鹼基數，「W」表示結合至3’翼區域的3’末端之天然核苷的鹼基數。

作為「X-Y-Z」，可列舉2-8-4、2-8-3、2-8-5、2-9-2、2-9-3、2-9-4、2-9-5、2-10-3、2-10-4、2-10-5、2-11-3、2-11-4、2-11-5、2-12-3、2-12-4、2-12-5、3-8-2、3-8-3、3-8-4、3-8-5、3-9-3、3-9-4、3-9-5、3-10-3、3-10-4、3-10-5、3-11-3、3-11-4、3-11-5、3-12-3、3-12-4、3-12-5、3-13-3、4-8-2、4-8-3、4-8-4、4-8-5、4-9-3、4-9-4、4-9-5、4-10-3、4-10-4、4-10-5、4-11-2、4-11-3、4-11-4、4-11-5、5-8-2、5-8-3、5-8-4、5-8-5、5-9-2、5-9-3、5-9-4、5-9-5、5-10-2、5-10-3、5-10-4、5-10-5、5-11-2、5-11-3、5-11-4、5-11-5等。例如，在表述為「2-8-4」之情況，係意味5’翼區域為2mer的寡核苷酸，間隔區域為8mer的寡核苷酸，3’翼區域為4mer的寡核苷酸。

作為「X-Y-Z-W」，可列舉2-8-4-1、2-8-3-1、2-8-5-1、2-9-2-1、2-9-3-1、2-9-4-1、2-9-5-1、2-10-3-1、2-10-4-1、2-10-5-1、2-11-3-1、2-11-4-1、2-11-5-1、2-12-3-1、2-12-4-1、2-12-5-1、3-8-2-1、3-8-3-1、3-8-4-1、3-8-5-1、3-9-2-1、3-9-3-1、3-9-4-1、3-9-5-1、3-10-3-1、3-10-4-1、3-10-5-1、3-11-3-1、3-11-4-1、3-11-5-1、3-12-3-1、3-12-4-1、3-12-5-1、4-8-2-1、4-8-3-1、4-8-4-1、4-8-5-1、4-9-3-1、4-9-4-1、4-9-5-1、4-10-3-1、4-10-4-1、4-10-5-1、4-11-2-1、4-11-3-1、4-11-4-1、4-11-5-1、5-8-2-1、5-8-3-1、5-8-4-1、5-8-5-1、5-9-2-1、5-9-3-1、5-9-4-1、5-9-5-1、5-10-2-1、5-10-3-1、5-10-4-1、5-10-5-1、5-11-2-1、5-11-3-1、5-11-4-1、5-11-5-1等。例如，在表述為2-8-4-1之情況，係意味5’翼區域為2mer的寡核苷酸，間隔區域為8mer的寡核苷酸，3’翼區域為4mer的寡核苷酸，結合至3’翼區域的3’末端之天然核苷為1個核苷酸。

本發明之單股反義寡核苷酸的鹼基長為12~30mer，較佳為12~22mer，更佳為14~20mer，再佳為14~18mer，特佳為15~17mer。在本發明之單股反義寡核苷酸的鹼基長為12~22mer、14~20mer、14~18mer、15~17mer之情況，特定而言，對RPS25的mRNA之結合或對RPS25的mRNA前驅物之結合較強，可更有效地施行RPS25基因的表現的調節。另外，在天然核苷進一步結合至3’翼區域的3’末端之情況，上述反義寡核苷酸的鹼基長係設為包含上述天然核苷的鹼基數在內來計數。

在本實施形態中，上述單股反義寡核苷酸係各核苷藉由磷酸基及/或經修飾之磷酸基進行結合，較佳係藉由磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵進行結合。

作為本發明之單股反義寡核苷酸的一態樣，係具有由5~20mer所構成之間隔區域、由2~5mer所構成之5’翼區域及由2~5mer所構成之3’翼區域之間隔體型單股反義寡核苷酸。在此處，該間隔區域係位於該5’翼區域與該3’翼區域之間。又，在該5’翼區域及該3’翼區域中，較佳係各自包含至少1個2’-MOE核酸、LNA、AmNA、GuNA或scpBNA。在該5’翼區域及該3’翼區域中，亦可包含經2’-O-烷基化或2’-F化之核苷酸。作為2’-O-烷基化核苷酸，亦可使用D-核呋喃糖的2’-O-烷基化(例如2’-O-甲基化等)核苷酸。此外，上述間隔體型單股反義寡核苷酸亦可藉由與第二股寡核苷酸之雜交而形成雙股。

＜雙股反義寡核苷酸＞本實施形態所涉及之雙股反義寡核苷酸為雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽，其包含上述單股反義寡核苷酸，及對上述單股反義寡核苷酸進行雜交之第二股寡核苷酸。上述第二股寡核苷酸的鹼基序列較佳為以對於上述單股反義寡核苷酸的鹼基序列而言互補的鹼基序列為基準，具有90%以上且100%以下的序列同一性之鹼基序列。

上述雙股反義寡核苷酸可在溶液中進行解離，而分離成上述單股反義寡核苷酸及上述第二股寡核苷酸。經分離之上述單股反義寡核苷酸可結合至上述之標的RNA。另外，上述單股反義寡核苷酸在與上述第二股寡核苷酸之關係中，亦可理解為「第一股寡核苷酸」。另外，構成上述雙股反義寡核苷酸之寡核苷酸之中，上述第一股寡核苷酸具有針對於上述之標的RNA之反義股，由上述第一股寡核苷酸及上述第二股寡核苷酸所構成之雙股寡核苷酸在便宜上係稱為「雙股反義寡核苷酸」。

≪單股反義寡核苷酸的製造方法≫ 本發明之單股反義寡核苷酸可藉由經由亞磷醯胺(phosphoramidite)法之固相合成予以製造。例如，首先使用市售的核酸自動合成機在固相擔體上合成具有預定的鹼基序列之單股寡核苷酸。接著，使用鹼性物質等切出由固相擔體所合成之單股寡核苷酸，施行脫保護，獲得粗體的單股寡核苷酸。然後，將所獲得之粗體的單股寡核苷酸使用HPLC等進行精製。不限於上述製造法，本發明之單股反義寡核苷酸可按照熟習該項技術者所公知的方法，藉由適宜變更核酸的鹼基序列、修飾部位等而予以製造。此外，針對AmNA、GuNA及scpBNA，可分別藉由國際公開第2011/052436號(專利文獻2)、國際公開第2014/046212號(專利文獻3)及國際公開第2015/125783號(專利文獻4)所記載之方法予以製造。針對2’-MOE核酸，可藉由使用能夠以試劑之形式購入之亞醯胺(amidite)予以製造。針對5’-CP核酸，可藉由國際公開第2020/158910號(專利文獻5)所記載之方法予以製造。針對LNA，可藉由國際公開第99/14226號(專利文獻6)所記載之方法予以製造。

≪雙股反義寡核苷酸的製造方法≫ 本發明之雙股反義寡核苷酸係首先使用與上述單股反義寡核苷酸同樣的製造方法，製造以對於該單股反義寡核苷酸而言互補的鹼基序列作為基準具有預定的序列同一性之寡核苷酸(第二股寡核苷酸)。然後，可藉由使上述單股反義寡核苷酸及上述第二股寡核苷酸進行雜交而予以製造。

≪反義寡核苷酸複合體≫ 本實施形態所涉及之反義寡核苷酸複合體具有上述單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽或者上述雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽，及結合至上述單股反義寡核苷酸或上述第二股寡核苷酸之附加物質。上述附加物質係選自由聚乙二醇、胜肽、烷基鏈(例如飽和脂肪族烴等)、配位體化合物、抗體、蛋白質及醣鏈(例如碳水化合物、多醣等)所組成之群組。

在本實施形態的一面向中，上述反義寡核苷酸複合體具有上述單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽，及結合至上述單股反義寡核苷酸之附加物質，上述附加物質係選自由聚乙二醇、胜肽、烷基鏈(例如飽和脂肪族烴等)、配位體化合物、抗體、蛋白質及醣鏈(例如碳水化合物、多醣等)所組成之群組。

在本實施形態的另一面向中，上述反義寡核苷酸複合體具有上述雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽，及結合至上述單股反義寡核苷酸或上述第二股寡核苷酸之附加物質，上述附加物質係選自由聚乙二醇、胜肽、烷基鏈(例如飽和脂肪族烴等)、配位體化合物、抗體、蛋白質及醣鏈(例如碳水化合物、多醣等)所組成之群組。

在本實施形態中，所謂「附加物質」，係意味結合至上述單股反義寡核苷酸或上述第二股寡核苷酸之物質，其係用於賦予預定的作用之物質。上述附加物質可結合至上述單股反義寡核苷酸的5’末端，亦可結合至3’末端，亦可結合至5’末端及3’末端兩者。此外，上述附加物質可結合至上述第二股寡核苷酸的5’末端，亦可結合至3’末端，亦可結合至5’末端及3’末端兩者。在本實施形態的一面向中，上述附加物質較佳係結合至上述單股反義寡核苷酸或上述第二股寡核苷酸的5’末端或3’末端中之任一者。此外，上述附加物質亦可與上述單股反義寡核苷酸或上述第二股寡核苷酸直接以共價鍵進行結合。上述附加物質亦可經由連結子物質與上述單股反義寡核苷酸或上述第二股寡核苷酸進行結合。作為上述連結子物質，可列舉例如由烷基、聚乙二醇、胜肽、二硫化物、核酸等及/或此等之組合所構成之連結子。使上述附加物質結合至上述單股反義寡核苷酸或上述第二股寡核苷酸之方法可列舉例如後述之實施例所記載之方法。

作為用作上述附加物質之胜肽，可列舉例如如以下者，但並不限於此等。CPPs(Cell Penetrating Peptides：細胞膜穿透性胜肽)、核移行性胜肽、TAT(Trans-Activator of Transcription protein)、聚精胺酸、升糖素樣胜肽-1類似胜肽、合成環狀RGD胜肽、腦移行性胜肽

作為用作上述附加物質之配位體化合物，可列舉例如如以下者，但並不限於此等。N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)、醣類(葡萄糖、甘露糖等)、脂質類(膽固醇、棕櫚酸、二十二碳六烯酸等)、維生素類(葉酸、維生素A、維生素E(生育酚)等)、胺基酸、單胺受體配位體(茚達曲林(Indatraline)等)

作為用作上述附加物質之抗體，可列舉例如如以下者，但並不限於此等。抗胰島素受體抗體、抗運鐵蛋白受體抗體、抗LDL受體相關蛋白質抗體、抗CD22抗體、抗CD30抗體、抗HER2抗體

作為用作上述附加物質之蛋白質，可列舉例如如以下者，但並不限於此。白蛋白

≪RPS25基因的表現調節劑≫ 本實施形態所涉及之RPS25基因的表現調節劑包含本發明之單股反義寡核苷酸、上述雙股反義寡核苷酸或上述反義寡核苷酸複合體作為有效成分。在本實施形態的一面向中，上述表現調節劑亦可理解為針對於RPS25基因之表現抑制劑。在本實施形態的另一面向中，上述表現調節劑亦可理解為針對於RAN轉譯之抑制劑。在本實施形態的另一面向中，上述表現調節劑亦可理解為經由抑制RAN轉譯之二肽重複的表現抑制劑。本發明之單股反義寡核苷酸係藉由結合至RPS25的mRNA或mRNA前驅物而抑制RPS25基因的表現，抑制其轉譯產物所引發之RAN轉譯。本發明之RPS25基因的表現調節劑的投予方法及製劑只要是該領域中公知的投予方法及製劑，則皆能夠利用。

≪含有單股反義寡核苷酸等作為有效成分之醫藥組成物≫ 本實施形態所涉及之醫藥組成物包含本發明之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽、上述雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽或者上述反義寡核苷酸複合體或其製藥學上可容許的鹽作為有效成分。本實施形態之醫藥組成物的投予方法及製劑只要是該領域中公知的投予方法及製劑，則皆能夠利用。以下，有時將上述醫藥組成物表述為「反義寡核苷酸等的醫藥組成物」。

上述醫藥組成物係用於治療或預防與RPS25基因相關之疾患，即，可由藉由RAN轉譯所產生之二肽重複所引起之疾患。換言之，上述醫藥組成物可用於治療或預防可藉由抑制RPS25基因的表現而期待症狀的改善之疾患。有時將此種疾患表述為「重複疾病」。作為重複疾病的具體例，可列舉例如以C9orf72 ALS、C9orf72 FTLD、亨丁頓氏症、脊髓小腦失調症(第1、2、3、6、7、8、12、17型)、齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮症、脊髓延髓性肌肉萎縮症、Friedreich失調症、脆性X相關震顫失調症候群、肌強直性營養不良等為首之多種精神神經疾患及肌肉疾患等。

≪針對於重複疾病之治療劑及預防劑≫ 本實施形態所涉及之針對於重複疾病之治療劑包含上述單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽、上述雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽或者上述反義寡核苷酸複合體或其製藥學上可容許的鹽作為有效成分。本實施形態所涉及之針對於重複疾病之預防劑包含上述單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽、上述雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽或者上述反義寡核苷酸複合體或其製藥學上可容許的鹽作為有效成分。上述重複疾病較佳為選自由C9orf72 ALS、C9orf72 FTLD、亨丁頓氏症、脊髓小腦失調症、齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮症、脊髓延髓性肌肉萎縮症、Friedreich失調症、脆性X相關震顫失調症候群及肌強直性營養不良所組成之群組之至少1者。

＜C9orf72 ALS＞上述所謂C9orf72 ALS，係意味具有存在於C9orf72基因的外顯子1a區域與外顯子1b區域之間之內含子區域之GGGGCC序列異常地反覆伸長之變異之ALS。就ALS的成因基因而言，C9orf72基因為最高頻率，佔散發性ALS的約6%，家族性ALS的約40%。ALS為由於運動神經細胞選擇性死滅而使肌肉萎縮之神經退化性疾患。ALS係藉由組合上位/下位運動神經障礙的臨床特徵或電生理學特徵來加以診斷。具體而言，若腦幹、頸髓、胸髓、腰髓4個區域之中，在1個區域有顯示出上位/下位運動神經障礙之表現，且在其他區域可看出肌電圖表現，則診斷為laboratory-supported probable，若在2個區域則診斷為probable，若在3個區域則診斷為definite。

＜C9orf72 FTLD＞上述所謂C9orf72 FTLD，係意味具有存在於C9orf72基因的外顯子1a區域與外顯子1b區域之間之內含子區域之GGGGCC序列異常地反覆伸長之變異之FTLD。上述FTLD可看出進行性異常行為或認知功能障礙，日常生活因該等而受到阻礙，除此以外，尚可見到脫抑制行為或冷漠/嗜睡或固執/常同性或口部過度活動及飲食習慣的變化等中之3個項目以上的症狀。在上述FTLD在影像檢查表現中可見到額葉或顳葉前部的萎縮，或者代謝或血流的低下，鑑別為特定的疾患之情況，係診斷為行為異常型FTLD。在上述FTLD可看出物品稱呼的障礙、詞語理解的障礙，除此以外，尚可看出針對於對象物之知識的障礙或表層性失讀/失寫等症狀，在前方優勢的顳葉可見到萎縮，可鑑別出特定的疾患之情況，係診斷為語義性認知症FTLD。

＜亨丁頓氏症＞上述所謂亨丁頓氏症，係意味由於存在於亨丁頓基因的外顯子1區域之CAG序列異常地反覆伸長而發病之顯示出常染色體顯性遺傳形式之遺傳性神經退化性疾患。上述亨丁頓氏症係呈現出以不隨意運動為特徵之運動障礙、精神症狀及認知症狀。在可看出特定的神經表現，且藉由基因診斷可看出CAG序列的異常伸長變異之情況，或者，在顯示出進行性過程，可看出常染色體顯性遺傳的家族史、特定的神經表現及臨床檢查表現，藉由鑑別診斷否定類似疾患之情況，係診斷為亨丁頓氏症。

＜脊髓小腦失調症(第1、2、3、6、7、8、12、17型)及齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮症＞上述所謂脊髓小腦失調症(第1、2、3、6、7、8、12、17型)及齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮症，係意味由於存在於各疾患中之責任基因上之特定的3個鹼基序列(CAG或CTG)異常地反覆伸長而發病之顯示出常染色體顯性遺傳形式之遺傳性神經退化性疾患。在脊髓小腦失調症第1、2、3、6、7、12及17型以及齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮症中，可看出CAG的重複序列。在脊髓小腦失調症第8型中，可看出CTG的重複序列。上述脊髓小腦失調症及齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮症係以小腦性或後索性運動失調或痙攣性下身麻痺為主要症候，以呈緩徐進行性為基本，組合基因診斷或神經病理學診斷等來加以診斷。

＜脊髓延髓性肌肉萎縮症＞上述所謂脊髓延髓性肌肉萎縮症，係意味由於存在於雄激素受體基因的外顯子區域之CAG序列異常地反覆伸長而發病之遺傳性疾患。上述脊髓延髓性肌肉萎縮症係組合神經表現(脊髓延髓症狀、下位運動神經徵候、手指震顫、四肢腱反射低下)、臨床表現/檢查表現、基因診斷等來加以診斷。

＜Friedreich失調症＞上述所謂Friedreich失調症，係意味由於frataxin基因的變異而發病之顯示出常染色體隱性形式之遺傳性神經退化性疾患。上述Friedreich失調症大多係由存在於第1內含子之GAA序列異常地反覆伸長所造成。

＜脆性X相關震顫失調症候群＞上述所謂脆性X相關震顫失調症候群，係意味存在於FMP1基因的5’UTR之CGG序列異常地反覆伸長而發病之遺傳性神經退化性疾患。上述脆性X相關震顫失調症候群係組合臨床症狀(小腦失調、運動時震顫、帕金森氏症候群(Parkinsonism)、認知症、智力障礙)、經由MRI檢查之中小腦腳徵候、基因診斷等來加以診斷。

＜肌強直性營養不良＞上述所謂肌強直性營養不良，係意味由於存在於DMPK基因的3’UTR之CUG序列異常地反覆伸長而發病之採取常染色體顯性遺傳形式之遺傳性肌肉疾患。

＜個體＞上述所謂個體，係意味哺乳動物。上述個體較佳為人類、猴、狨猿、犬、豬、兔、豚鼠、大鼠及小鼠。上述個體更佳為人類。

在投予本發明之單股反義寡核苷酸或其醫藥組成物(包含針對於C9orf72 ALS之治療劑及預防劑)時，其投予方法及劑型並無特別限定。即，只要是該分野中之公知的投予方法及製劑，則皆可用作本發明之反義寡核苷酸等的投予方法及製劑。作為投予方法，可列舉例如經口投予、非經口投予等。作為非經口投予，可列舉點眼投予、***內投予、直腸內投予、鼻腔內投予、經皮投予、靜脈內注射、點滴、皮下、腹腔內或肌肉內注入、經由吸引或吸入之肺投予、髓腔內投予、腦室內投予等。

在本發明之反義寡核苷酸等的製劑中，可視需要混合賦形劑、黏合劑、濕潤劑、崩解劑、潤滑劑、稀釋劑、矯味劑、芳香劑、溶解輔助劑、懸浮化劑、乳化劑、安定化劑、保存劑、張力劑等各種醫藥用添加劑。

在局部投予本發明之反義寡核苷酸等的醫藥組成物之情況，可使用例如經皮貼片、軟膏、洗劑、乳霜、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液劑、散劑等製劑。

在經口投予本發明之反義寡核苷酸等的醫藥組成物之情況，可使用例如散劑、顆粒劑、經溶解於水或非水性介質中之懸浮液或溶液、膠囊、粉末劑、錠劑等製劑。

在非經口、髓腔內或腦室內投予本發明之反義寡核苷酸等的醫藥組成物之情況，可使用例如無菌水溶液等製劑。

本發明之單股反義寡核苷酸的有效投予量可依所投予之個體的性別、年齡、體重、症狀等而任意地決定。再者，亦可因應投予的方法、途徑、頻率等而任意地決定。例如，作為投予量，可列舉0.01~100mg/kg等。較佳為0.1~50mg/kg，更佳為0.1~10mg/kg。

≪調節RPS25基因的表現之方法≫ 本實施形態中之調節RPS25基因的表現之方法包含將上述單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽、上述雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽或者上述反義寡核苷酸複合體或其製藥學上可容許的鹽作為有效成分，投予至表現出上述RPS25基因之細胞、組織或個體之步驟。

在本實施形態中，將上述單股反義寡核苷酸等投予至細胞、組織或個體之方法可以in vitro施行，亦可以in vivo施行。在以in vivo投予之情況，其投予途徑係使用上述之投予途徑。

在本實施形態中，作為「表現出RPS25基因之細胞」，可列舉例如構成中樞神經系統之神經細胞、構成末梢神經系統之神經細胞，除此以外，構成皮膚組織之細胞等。

本實施形態中之重複疾病的治療方法或預防方法包含將上述單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽、上述雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽或者上述反義寡核苷酸複合體或其製藥學上可容許的鹽作為有效成分，投予至罹患上述重複疾病之個體之步驟。

作為上述重複疾病，可列舉上述之精神神經疾患、肌肉疾患等。投予至個體時之劑型、投予途徑及投予量可適宜採用上述者。

以上，針對本實施形態所涉及之反義寡核苷酸進行說明。具備上述構成之上述單股反義寡核苷酸能夠調節RPS25基因的表現。在此處，對RPS25基因的表現之抑制活性(減弱活性)可藉由公知的方法予以測定。作為減弱活性的測定方法，可列舉例如Nature (2015) 518(7539):409-12(非專利文獻10)所記載之方法等。此外，亦可藉由對後述之HEK293T細胞之反義寡核苷酸的轉染予以測定。

≪對RPS25基因的表現之抑制活性的評估方法≫ ＜反義寡核苷酸向細胞之導入＞使用脂轉染法、電穿孔法或經由直接添加之導入等方法對「表現出RPS25基因之細胞」處置反義寡核苷酸6小時至3日。所使用之細胞只要是RPS25基因會進行表現之細胞即可，可列舉例如HEK293T細胞，更佳為神經細胞，再佳為源自人類之神經細胞。經處置反義寡核苷酸之細胞可在處置後立即回收，亦可去除反義寡核苷酸並繼續進行培養。

＜RPS25 mRNA量的評估＞對從所回收而得之細胞所萃取出之全部RNA實施反轉錄反應，藉由對所獲得之互補DNA使用RPS25基因特異性探針實施即時PCR法等而測定RPS25 mRNA的量。作為用於即時PCR之探針，可列舉例如Taqman探針。作為反應方法，可列舉例如重複「(cDNA的變性)-(黏接)-(伸長反應)」的3步驟或「(cDNA的變性)-(黏接及伸長反應)」的2步驟任意的次數之方法。2或3步驟的重複次數係例如為25~45次，較佳為35~40次。(cDNA的變性)溫度係例如為90℃~98℃，較佳為92℃~95℃。(黏接)溫度係例如為40℃~70℃，較佳為50℃~60℃。(伸長反應)溫度係例如為65℃~75℃，較佳為用於反應之聚合酶的最適溫度。(黏接及伸長反應)溫度係例如為55℃~70℃。

＜RPS25蛋白質量的評估＞將所回收而得之細胞進行溶解，獲得萃取物。使用西方墨點法(Western blotting)、ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)等免疫化學手法評估上述萃取物中所包含之RPS25蛋白質的量。在西方墨點法中，泳動、轉錄、檢測各步驟可使用任意的儀器。膜與一級抗體或二級抗體的反應時間及反應溫度能夠任意地設定，例如於4℃一晚或於室溫1~3小時。

另外，本發明並不限定於上述實施形態。例如，上述單股反義寡核苷酸包含以下實施態樣。

作為本發明之單股反義寡核苷酸的一態樣，係調節RPS25基因的表現之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽，上述單股反義寡核苷酸係各核苷酸以磷酸基及/或經修飾之磷酸基進行結合，上述單股反義寡核苷酸包含間隔區域、結合至上述間隔區域的3’末端之3’翼區域及結合至上述間隔區域的5’末端之5’翼區域，上述間隔區域為由去氧核糖所構成之核酸，其可包含醣部經修飾之核酸，上述3’翼區域及5’翼區域為經修飾之核酸，上述單股反義寡核苷酸的鹼基長為12~30mer，上述單股反義寡核苷酸的鹼基序列為：以對於序列識別號1或序列識別號2所記載之鹼基序列中之以與上述單股反義寡核苷酸相同的鹼基長所構成之至少1個標的區域而言互補的鹼基序列為基準，具有90%以上且100%以下的序列同一性之鹼基序列。

作為本發明之單股反義寡核苷酸的另一態樣，上述單股反義寡核苷酸的鹼基序列為以對於序列識別號1或序列識別號2所記載之鹼基序列中之以與上述單股反義寡核苷酸相同的鹼基長所構成之至少1個標的區域而言互補的鹼基序列為基準，具有95%以上且100%以下的序列同一性之鹼基序列。

作為本發明之單股反義寡核苷酸的另一態樣，上述單股反義寡核苷酸的鹼基序列為對於序列識別號1或序列識別號2所記載之鹼基序列中之以與上述單股反義寡核苷酸相同的鹼基長所構成之至少1個標的區域而言互補的鹼基序列。

作為本發明之單股反義寡核苷酸的另一態樣，上述間隔區域的鹼基數為5~20mer的由去氧核糖所構成之核酸，其可包含醣部經修飾之核酸，上述3’翼區域為1~5mer的經修飾之核酸，上述3’翼區域中之上述經修飾之核酸為2’位經修飾之核酸及/或交聯型經修飾之核酸，上述5’翼區域為1~5mer的經修飾之核酸，上述5’翼區域中之上述經修飾之核酸為2’位經修飾之核酸及/或交聯型經修飾之核酸。

作為本發明之單股反義寡核苷酸的另一態樣，上述單股反義寡核苷酸的鹼基長為14~22mer，上述間隔區域的鹼基數為6~17mer的由去氧核糖所構成之核酸，其可包含醣部經修飾之核酸，上述3’翼區域為2~5mer的經修飾之核酸，上述3’翼區域中之經修飾之核酸包含選自由LNA、AmNA、GuNA及scpBNA所組成之群組之至少1者，上述5’翼區域為2~5mer的經修飾之核酸，上述5’翼區域中之經修飾之核酸包含選自由LNA、AmNA、GuNA及scpBNA所組成之群組之至少1者，上述單股反義寡核苷酸的至少1個核苷酸間鍵為硫代磷酸酯鍵。

作為本發明之單股反義寡核苷酸的另一態樣，上述單股反義寡核苷酸的鏈長為14~20mer，上述間隔區域的鹼基數為7~13mer的由去氧核糖所構成之核酸，其可包含醣部經修飾之核酸，上述間隔區域中之核酸包含選自由5-甲基去氧胞苷及5’-CP核酸所組成之群組之至少1者，上述3’翼區域為2~4mer的經修飾之核酸，上述3’翼區域中之經修飾之核酸包含選自由2’-MOE核酸、AmNA、GuNA及scpBNA所組成之群組之至少1者，上述5’翼區域為2~4mer的經修飾之核酸，上述5’翼區域中之經修飾之核酸包含選自由2’-MOE核酸、AmNA、GuNA及scpBNA所組成之群組之至少1者。

作為本發明之單股反義寡核苷酸的另一態樣，上述單股反義寡核苷酸的鹼基長為14~18mer，上述間隔區域為7~11mer，上述3’翼區域為2~4mer的經修飾之核酸，上述3’翼區域中之經修飾之核酸包含選自由AmNA、GuNA及scpBNA所組成之群組之至少1者，上述5’翼區域為2~4mer的經修飾之核酸，上述5’翼區域中之經修飾之核酸包含選自由AmNA、GuNA及scpBNA所組成之群組之至少1者。 [實施例]

以下，說明本發明所涉及之實施例，但本發明並不限定於此等。

≪針對於RPS25基因之單股反義寡核苷酸的製作≫ 首先，設計表3-1~表3-17及表4-1~4-5所示之單股反義寡核苷酸。針對所設計而得者的一部分，依以下流程製作針對於RPS25基因之單股反義寡核苷酸。

包含2’-O-甲基核酸、2’-MOE核酸、AmNA、scpBNA、5’-CP核酸及/或GuNA作為經修飾之核酸，以及/或者核酸鹼基部為5-甲基胞嘧啶之核酸之單股反義寡核苷酸係使用核酸自動合成機(nS-8型，GeneDesign股份有限公司製)，以0.2μmol規模加以合成。鏈長的伸長係以標準的亞磷醯胺實驗指南來實施。此時，固相擔體係使用CPG樹脂。此外，用於形成硫代磷酸酯化(PS)骨架之硫化係使用DDTT(((Dimethylamino-methylidene)amino)-3H-1,2,4-dithiazaoline-3-thione)等。包含2’-MOE核酸、AmNA及/或scpBNA之單股反義寡核苷酸係以末端的5’位的羥基未經DMTr(4,4’-二甲氧基三苯甲)基保護且3’位擔載於固相之形式獲得。繼而，藉由進行鹼處理而從固相擔體切出上述單股反義寡核苷酸，以溶液的狀態進行回收。然後，藉由從所回收而得之溶液中餾去溶媒而獲得粗生成物。藉由將所獲得之粗生成物以逆相HPLC進行精製而獲得經精製之單股反義寡核苷酸。藉由LC-MS(Waters公司製)確認所獲得之各單股反義寡核苷酸的純度及結構。

針對表3-14中之實施例412~416，係藉由使用具有對應之附加物質之亞磷醯胺而依照上述實驗指南進行合成(例如圖3~7的化合物合成)。作為具有附加物質之亞磷醯胺，在實施例412中，係使用α-Tocopherol-TEG phosphoramidite(Glen research，product code：10-1977-02)，在實施例413及414中，係使用5’-Palmitate-C6 CE-Phosphoramidite(Link technologies Ltd，item number：2199)。在實施例415、416中，首先係使用對應之亞磷醯胺(5’-amino-modifier C6(Glen research，catalog no. 10-1906-02))依照上述實驗指南合成在5’-位具有胺基之寡核苷酸(胺基ASO)。對於所獲得之胺基ASO，在實施例415中，係使用依照以下所示之方法所合成之8-(((1R,3S)-3-(3,4-二氯苯基)-2,3-二氫-1H-茚-1-基)(甲基)胺基)-8-側氧基辛酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯，合成化合物。在實施例416中，對於上述胺基ASO，使Docosahexaenoic acid(DHA，Fujifilm，catalog no. 90310)進行縮合，合成化合物。

8-(((1R,3S)-3-(3,4-二氯苯基)-2,3-二氫-1H-茚-1-基)(甲基)胺基)-8-側氧基辛酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯[2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 8-(((1R,3S)-3-(3,4-dichlorophenyl)-2,3-dihydro-1H-inden-1-yl)(methyl)amino)-8-oxooctanoate]的合成【化2】

在辛二酸N,N’-二琥珀醯亞胺酯(101mg，0.274mmol)及N-甲基嗎啉(0.040mL，0.365mmol)的N,N-二甲基乙醯胺(1mL)懸浮液中，於0℃加入茚達曲林鹽酸鹽(10mg，0.030mmol)的N,N-二甲基乙醯胺的溶液。然後，將反應液升溫至40℃，攪拌2小時。將所獲得之反應液於減壓下進行乾燥，將所獲得之粗生成物以矽膠管柱層析進行精製，獲得標題化合物與辛二酸N,N’-二琥珀醯亞胺酯之混合物7.0mg。 LC/MS：545[M+H]

將上述方法所製造而得之單股反義寡核苷酸列舉於下述表3-1~3-17及表4-1~4-5。表3-1~3-17中所示之單股反義寡核苷酸為針對於人類RPS25的mRNA(序列識別號1)之單股反義寡核苷酸。另外，實施例463及464係相當於陰性對照。

表4-1~4-5中所示之單股反義寡核苷酸為針對於人類RPS25的mRNA前驅物(序列識別號2)之單股反義寡核苷酸。

在本說明書中，有時使用下述記號或表述來表示對應之結構。

【化3】

【化4】

在以上所示之結構式中，R ¹及R ²各自獨立地表示氫原子或者直鏈或分枝的碳數1至3的烷基。在此處，上述「=」所示之鍵結中之R ¹及R ²均表示甲基。R ³、R ⁴及R ⁵各自獨立地表示氫原子、直鏈或分枝的碳數1至7的烷基或者碳數3至7的環烷基。在此處，在上述「Gx」所示之GuNA中之R ³及R ⁵均為氫原子，且R ⁴為甲基之情況，係表示為「Gm」，在R ³為氫原子，且R ⁴及R ⁵均為甲基之情況，係表視為「Gdm」，在R ³及R ⁵為氫原子，且R ⁴為第三丁基之情況，係表示為「GtB」。

≪RPS25基因的表現評估≫ RPS25基因的表現評估係因應所製造而得之單股反義寡核苷酸，分成使用人類胎兒腎細胞之表現評估及使用小鼠初代培養神經細胞之表現評估來施行。此外，上述RPS25基因的表現評估亦可使用源自人類iPS細胞之神經細胞來施行。本實施例中之所謂基因表現評估，係意味藉由測定由反轉錄反應所獲得之互補DNA（cDNA）量而評估mRNA量。以下，針對各表現評估的具體流程進行說明。

＜使用人類胎兒腎細胞之表現評估＞將人類胎兒腎細胞HEK293T(ATCC(註冊商標)CRL-3216(商標))於培養培養基中，在37℃、5%CO ₂的條件下進行培養。作為HEK293T細胞的培養培養基，係使用以下組成者。

(HEK293T細胞的培養培養基組成) Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)：SIGMA公司製，Cat#D6429 10%胎牛血清(FBS)：biowest公司製，Cat#S1820 100倍稀釋青黴素-鏈黴素混合溶液：Nacalai Tesque公司製Cat#09367-34(含有青黴素10000單位/ml、鏈黴素10000μg/ml、安定劑)

首先，在施行人類RPS25基因的表現量測定之前日，將HEK293T細胞(12000 cells/well)接種於96孔盤中，在37℃、5%CO ₂的條件下培養一晚。然後，將經以磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)稀釋之各單股反義寡核苷酸(終濃度0.5nM、5nM、15nM或50nM)以脂轉染法轉染至上述細胞。作為陰性對照組，係使用經轉染未溶解有單股反義寡核苷酸之PBS之細胞。將經轉染之細胞於增殖培養基中，在37℃、5%CO ₂的條件下培養48小時。然後，去除上述增殖培養基，使用Taqman Fast Cells-to-CT Kit(Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#4399003)對所萃取出之全部RNA實施反轉錄反應。利用由此反轉錄反應所獲得之互補DNA(cDNA)，以Taqman gene expression assays(Applied Biosystems公司製)，使用經預先設計之基因特異性探針(參照下述)實施即時PCR(95℃；3秒，60℃；30秒，進行40個循環)。

(人類RPS25基因的表現評估中所使用之基因特異性探針一覽) human RPS25：Hs01568661_g1 human GAPDH：4326317E(內部對照)

將上述方法所求出之針對於人類RPS25 mRNA之各單股反義寡核苷酸中之人類RPS25 mRNA的表現比率示於表5-1~表5-7、表6-1及表6-2。此時，將陰性對照組中所求出之人類RPS25 mRNA的表現比率設為1.00。將表現比率為0.80以下者判斷為能夠抑制人類RPS25 mRNA的表現之單股反義寡核苷酸。另外，表中，「-」所示者係意味未施行測定。一般認為若mRNA的表現受到抑制，則隨後之向蛋白質之轉譯等亦受到抑制。因此，上述表現比率為0.80以下者，可判斷為能夠調節人類RPS25基因的功能之單股反義寡核苷酸。

以同樣的方法，將針對於人類RPS25的mRNA前驅物之各單股反義寡核苷酸中之人類RPS25 mRNA的表現比率示於表7-1~表7-5。另外，用於脂轉染法之各單股反義寡核苷酸係以終濃度成為50nM或100nM之方式進行調整。

＜使用小鼠初代培養神經細胞之表現評估＞將小鼠初代培養神經細胞於培養培養基中，在37℃、5%CO ₂的條件下進行培養。作為小鼠初代培養神經細胞的培養培養基，係使用以下組成者。

(小鼠初代培養神經細胞的培養培養基組成) B-27 Electrophysiology Kit：gibco公司製，Cat#A1413701 100倍稀釋200mM-L-麩醯胺酸溶液：Nacalai Tesque公司製：Cat#16948-04 100倍稀釋青黴素-鏈黴素混合溶液：Nacalai Tesque公司製Cat#09367-34(含有青黴素10000單位/ml、鏈黴素10000μg/ml、安定劑)

首先，將小鼠初代培養神經細胞(源自小鼠胎兒大腦)以各細胞(40000 cells/well)接種於96孔盤中，在37℃、5%CO ₂的條件下培養5日。然後，將經以磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)稀釋之各單股反義寡核苷酸(終濃度0.01μM、0.1μM或1μM)添加至上述培養培養基中。作為陰性對照組，係將未溶解有單股反義寡核苷酸之PBS添加至上述培養培養基中。將細胞於培養培養基中，在37℃、5%CO ₂的條件下培養48小時。然後，去除上述培養培養基，使用Taqman Fast Cells-to-CT Kit(Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#4399003)對所萃取出之全部RNA實施反轉錄反應。利用由此反轉錄反應所獲得之互補DNA(cDNA)，以Taqman gene expression assays(Applied Biosystems公司製)，使用經預先設計之基因特異性探針(參照下述)實施即時PCR(95℃；3秒，60℃；30秒，進行40個循環)。

(小鼠RPS25基因的表現評估中所使用之基因特異性探針一覽) mouse Rps25：Mm02342783_g1 mouse GAPDH：4352339E(內部對照)

將上述方法所求出之各單股反義寡核苷酸中之小鼠RPS25 mRNA的表現比率示於表8。此時，將陰性對照組中所求出之小鼠RPS25 mRNA的表現比率設為1.00。一般認為若mRNA的表現受到抑制，則隨後之向蛋白質之轉譯等亦受到抑制，因而在上述表現比率為0.80以下之情況，可判斷為能夠調節小鼠RPS25基因的功能之單股反義寡核苷酸。另外，h451-465-A的單股反義寡核苷酸所結合之標的區域為在人類RPS25基因與小鼠RPS25基因之間，序列保守之區域。

≪使用源自人類iPS細胞之運動神經細胞之評估≫ 從人類iPS細胞分化誘導出運動神經細胞，用於評估。細胞的維持、分化誘導係於以下所記載之培養基中，在37℃、5%CO ₂的條件下施行。

(培養基組成一覽) (SNL細胞用培養基) DMEM(Sigma-Aldrich公司製，Cat#D6429)， 100倍稀釋青黴素/鏈黴素混合溶液(Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#15140-122) 10倍稀釋胎牛血清(Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#10437-028) (iPS細胞用培養基) 靈長類ES/iPS細胞用培養基(REPROCELL公司製，Cat#RCHEMD001B) 100倍稀釋青黴素/鏈黴素混合溶液(Thermo Fisher Scientific公司製，cat#15140-122) (混合培養基A) DMEM/Ham’s F12 GlutaMAX(Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#10565-018) 2mM L-glutamine(Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#25030-081) Non-Essential Amino Acid(NEAA)(Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#11140-050) 100倍稀釋青黴素/鏈黴素混合溶液(Thermo Fisher Scientific公司製，cat#15140-122) 2μg/mL Heparin(Sigma-Aldrich公司製，H-4784) N2 supplement(Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#17502-048) (混合培養基B) Neurobasal medium(Thermo Fisher Scientific公司製，cat#21103-049) 2mM L-glutamine(Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#25030-081) Non-Essential Amino Acid(NEAA)(Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#11140-050) Antibiotic-Antimycotic(Thermo Fisher Scientific公司製，cat#15240-062) 2μg/mL Heparin(Sigma-Aldrich公司製，H-4784) N2 supplement(Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#17502-048) 10ng/mL IGF-1(PeproTech公司製，cat#100-11) 10ng/mL Human CNTF(PeproTech公司製，cat#450-13) 10ng/mL Human GDNF(R&D System公司製，cat#212-GD-050) B27 supplement(Thermo Fisher Scientific公司製，cat#12587010) 200μM Ascorbic acid Sigma-Aldrich公司製，Cat#A5960) 10ng/mL Human BDNF(Peprotech公司製，Cat#450-02) (神經細胞用培養基) Neurobasal medium Electro(Thermo Fisher Scientific公司製，cat#A14098-01) 2mM L-glutamine(Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#25030-081) Non-Essential Amino Acid(NEAA)(Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#11140-050) Antibiotic-Antimycotic(Thermo Fisher Scientific公司製，cat#15240-062) 2μg/mL Heparin(Sigma-Aldrich公司製，H-4784) N2 supplement(Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#17502-048) 10ng/mL IGF-1(PeproTech公司製，cat#100-11) 10ng/mL Human CNTF(PeproTech公司製，cat#450-13) 10ng/mL Human GDNF(R&D System公司製，cat#212-GD-050) B27 supplement，Electro(Thermo Fisher Scientific公司製，cat#A14097-01) 200μM Ascorbic acid Sigma-Aldrich公司製，Cat#A5960) 10ng/mL Human BDNF(Peprotech公司製，Cat#450-02) 25μM 2-mercaptoethanol(Thermo Fisher Scientific公司製，cat#21985-0123) 0.1%牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司製，cat#A9576)

＜餵養細胞的絲裂黴素處理＞作為用於接種人類iPS細胞之餵養細胞，係調製經絲裂黴素處理之SNL細胞(Cell Biolabs公司製，Cat#CBA-316)。SNL細胞的絲裂黴素處理係施行如下。首先，在10cm培養皿(Iwaki公司製，Cat#3020-100)中加入0.1%明膠(富士Film和光純藥公司製，Cat#190-15805)，在37℃、5%CO ₂條件下之保溫培養箱中將上述培養皿靜置1小時以上(以下，有時將此操作稱為「明膠處理」)。然後，從上述培養皿中吸引去除多餘的明膠，使用SNL細胞用培養基，以每1盤培養皿成為1~2×10 ⁶個之方式接種已解凍之SNL細胞。每3~4日將細胞稀釋成8~16倍並進行繼代，使其增殖至所需之細胞數。接著，將每1盤培養皿2~4×10 ⁶個SNL細胞接種於經施行0.1%明膠處理之15cm培養皿(Iwaki公司製，Cat#3030-150)中。將上述細胞培養至成為80~90%匯合後，將經以SNL細胞用培養基稀釋成0.4mg/mL之絲裂黴素C(協和Kirin公司製，YJ Code 4231400D1031)以成為終濃度6.2μg/mL之方式添加至上述培養皿中。在37℃、5%CO ₂條件下之保溫培養箱中將上述培養皿靜置2小時15分鐘。然後，從上述培養皿中去除培養基，以PBS洗淨上述SNL細胞1次。將2.5%胰蛋白酶/EDTA(Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#15090-046)以PBS稀釋之後(終濃度0.25%)，添加至上述SNL細胞中並於室溫靜置1分鐘。然後，將上述SNL細胞回收至管中並進行離心，以CELLBANKER(R)(ZENOAQ Resource公司製，Cat#CB011)進行懸浮，加以凍結保存。

＜人類iPS細胞的維持＞在10cm培養皿中添加0.1%明膠，在37℃、5%CO ₂條件下之保溫培養箱中靜置1小時以上。使用SNL細胞用培養基將經絲裂黴素處理過之SNL細胞進行懸浮。然後，將1.5×10 ⁶個上述SNL細胞接種於10cm培養皿中，培養2~3日。繼而，從上述培養皿中去除SNL細胞用培養基，以PBS洗淨上述SNL細胞。然後，將經以包含1/1000量的Y-27632(Tocris公司製，Cat#1254)之iPS細胞用培養基懸浮之人類iPS細胞(201B7株，從iPS Academia Japan股份有限公司取得，AJ-H1-01)接種於上述培養皿中。接種之日的後天以後，每日實施培養基更換，直至分化誘導開始。

＜從人類iPS細胞向運動神經細胞之分化誘導＞藉由在人類iPS細胞的細胞培養液中添加Y-27632(終濃度10μM)而將上述iPS細胞暴露於上述Y-27632 1小時以上。除去培養上清液，以PBS洗淨上述細胞之後，添加Cell dissociation sulution(CTK溶液)(REPROCELL公司製，Cat#RCHETP002)並於室溫使其進行反應1分鐘。去除CTK溶液，以PBS洗淨上述細胞2次以後，添加iPS細胞用培養基1mL。以細胞刮勺將上述細胞剝離，通過細胞濾網(Becton Dickinson公司製，Cat#352350)將細胞塊分散，獲得細胞的懸浮液。將所獲得之懸浮液移至6孔盤(Corning公司製，Cat#3471)。更換成在混合培養基A中添加LDN193189(Stemgent公司製，Cat#04-0074)(終濃度0.3μM)、SB431542(Tocris公司製，Cat#1614)(終濃度2μM)、CHIR-99021(Stemgent公司製，Cat#04-0004-10)(終濃度3μM)及Y-27632(終濃度10μM)而得之培養基，在37℃、5%CO ₂的條件下，於保溫培養箱中培養細胞(培養第0日)。

在培養第2日及第4日，以吸量管去除培養液，更換成在混合培養基A中添加LDN193189(終濃度0.3μM)、SB431542(終濃度2μM)及CHIR-99021(終濃度3μM)而得之新鮮培養基。在培養第7日、第9日及第11日，以吸量管去除培養液，更換成在混合培養基A中添加LDN193189(終濃度0.3μM)、SB431542(終濃度2μM)、CHIR-99021(終濃度3μM)、Purmorphamine(富士Film和光純藥公司製，Cat#166-23991)(終濃度0.5μM)及Retinoic Acid(Sigma-Aldrich公司製，Cat#R2625)(終濃度0.1μM)而得之新鮮培養基。在培養第14日及第16日，以吸量管去除培養液，更換成在混合培養基A中添加Purmorphamine(終濃度0.5μM)、Retinoic Acid(終濃度0.1μM)、Human BDNF(終濃度10ng/mL)、Ascorbic Acid(Sigma-Aldrich公司製，Cat#A5960)(終濃度200μM)而得之新鮮培養基。

在培養第18日，更換成在混合培養基B中添加Purmorphamine(終濃度0.5μM)、Retinoic Acid(終濃度0.1μM)及Compound E(Calbiochem公司製，Cat#565790)(終濃度0.1μM)而得之新鮮培養基。在培養第21日，將細胞塊以PBS洗淨後，進行離心分離並去除上清液。將Accutase(Innovative Cell Technologies公司製，Cat#AT104)、Y27632(終濃度10μM)添加至上述細胞塊中並於37℃保溫培養10分鐘。將上述細胞塊加以冰冷之後，藉由吸量管吸放操作使上述細胞塊分散。離心(300×g，5分鐘，4℃)後，重複將沉澱之細胞進行回收並懸浮於混合培養基B中之操作2次。藉由以上操作，獲得源自於iPS細胞之運動神經細胞。所獲得之運動神經細胞係懸浮於CELLBANKER(R)中，加以分注並冷凍保存。

＜源自人類iPS細胞之運動神經細胞的培養及單股反義核苷酸的評估＞在96 Well Optical Btm Plt Polybase Black w/ Lid Cell Culture Sterile PS(Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#165305)中添加經以PBS稀釋6.66倍之Poly-L-Ornitine Solution(PLO)溶液(Sigma-Aldrich公司製，Cat#P4957)，於室溫靜置2小時以上。以PBS洗淨3次後，將經以PBS稀釋之iMatrix以成為0.5μg/cm ²之方式添加至盤中，於4℃靜置一晚。接著，將前項中經凍結保存之源自人類iPS細胞之運動神經細胞進行解凍，懸浮於神經細胞用培養基中。然後，以離心分離來去除上清液，將上述細胞再懸浮於包含1/100量的Culture One Supplement(Thermo Fisher Scientific公司製，A3320201)、Compound E(終濃度0.1μM)之神經細胞用培養基中。將此細胞以成為30000個/孔之方式接種於經塗覆之96孔盤上，在37℃、5%CO ₂條件下之保溫培養箱中培養28日。以每2~3日1次的頻率更換半量的神經細胞培養基。從培養開始至第7日，係使用包含Culture One Supplement、Compound E之培養基當作神經細胞用培養基。

接種後，在培養第1、11、18、26日(分別表述為D1、D11、D18、D26)，將經以PBS稀釋之各單股反義寡核苷酸(終濃度0.01μM、0.1μM、1μM)添加至培養培養基中。作為陰性對照組，係使用將未溶解有單股反義寡核苷酸之PBS添加至培養培養基中而得之細胞。將細胞於培養培養基中，在37℃、5%CO ₂的條件下培養48小時或72小時之後，去除包含單股反義核苷酸之培養基，以神經細胞培養基繼續施行培養(每2~3日實施1次半量培養基更換)。然後，去除上述培養培養基，使用Taqman Fast Cells-to-CT Kit(Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#4399003)對所萃取出之全部RNA實施反轉錄反應。利用由此反轉錄反應所獲得之互補DNA(cDNA)，以Taqman gene expression assays(Applied Biosystems公司製)，使用經預先設計之基因特異性探針(參照下述)實施即時PCR(95℃；3秒，60℃；30秒，進行40個循環)，將結果示於表9。表9中之「表現抑制率」為藉由以下式(1)所算出之值。 (表現抑制率)=1-(表現比率) (式(1)) 上述表現抑制率的值為越大的值，越判斷為能夠抑制人類RPS25 mRNA的表現之單股反義寡核苷酸。

≪RPS25蛋白質的表現評估≫ RPS25蛋白質的表現評估係因應所製造而得之單股反義寡核苷酸，使用人類胎兒腎細胞施行表現評估。本實施例中之所謂蛋白質表現量評估，係意味評估從mRNA所轉譯出之蛋白質量。以下，針對表現評估的具體流程進行說明。

＜經由西方墨點法之蛋白質的定量解析＞首先，將HEK293T細胞(500000 cells/well)接種於6孔盤中，在37℃、5%CO ₂的條件下培養一晚。然後，將經以磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)稀釋之各單股反義寡核苷酸(終濃度50nM)使用脂轉染法轉染至上述細胞。作為陰性對照組，係使用經轉染未溶解有單股反義寡核苷酸之PBS之細胞。將經轉染之細胞於增殖培養基中，在37℃、5%CO ₂的條件下培養48小時。然後，去除上述增殖培養基，以PBS洗淨後，以細胞刮勺回收細胞。將回收液在2700×g、5分鐘、4℃的條件下進行離心，使細胞進行沉澱。去除上清液後，添加包含1/100量的Protease Inhibitor(Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#1860932)之1mL的RIPA Lysis and Extraction buffer(Themo Fisher Scientific公司製，Cat#89900)，藉由超音波破碎機將細胞加以破碎。然後，在15000×g、10分鐘4℃的條件下進行離心，將上清液作為樣品。所回收而得之樣品係使用Pierce(商標)BCA Protein Assay kit(Thermo Scientific公司製，Cat#23225)施行蛋白質定量。以各樣品的濃度成為一定之方式進行調整之後，添加Pierce(商標)Lane Marker Reducing Sample Buffer(Thermo Fisher Scientifier公司製，Cat#39000)，於95℃施行加熱處理5分鐘。以蛋白質量成為10μg~20μg/泳道之方式疊加所調製而得之樣品，施行電泳。電泳係使用Criterion(商標)TDX(商標)預製凝膠4~15%(BIO-RAD公司製，Cat#5671085J10)，在200V定電壓條件下施行30分鐘。就泳動緩衝液而言，係使用經稀釋成1×濃度之Running Buffer Solution (10×) for SDS-PAGE(Nacalai Tesque公司製，Cat#30329-61)。

泳動後，以半乾方式施行轉印。就膜而言，係使用Trans-Blot Turbo Transfer Pack(BIO-RAD公司製，Cat#1704157)，就轉印裝置而言，係使用BIO-RAD Trans-Blot Turbo Transfer System的Standard protocol(30分鐘)。轉印後，將膜以TBST洗淨。另外，TBST的組成為包含0.06%聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯(Tween-20)(Nacalai Tesque公司製，Cat#28353-85)之經稀釋成1×濃度之Tris緩衝生理食鹽水(pH7.4)(Nacalai Tesque公司製，Cat#35438-81)。洗淨後，藉由以Blocking One(Nacalai Tesque公司製，Cat#03953-95)或PVDF Blocking Reagent(東洋紡股份有限公司製，Cat#NYPBR01)在室溫條件下振盪1小時而施行阻斷(blocking)。阻斷後，以TBST洗淨，添加經稀釋之一級抗體，在4℃條件下振盪一晚。一級抗體及稀釋溶媒係如下。・RPS25 抗體：Anti-RPS25 antibody(Abcam公司製，Cat#ab102940) 溶媒：Canget signal Solution 1(東洋紡股份有限公司製，Cat#NKB-101) ・β-actin 抗體：β-Actin (13E5) Rabbit mAb (HRP conjugate)(Cell Signaling公司製，Cat#5125) 溶媒：Blocking One

一級抗體振盪後，以TBST洗淨，添加經稀釋之二級抗體，於室溫振盪1小時。二級抗體及稀釋溶媒係如下。・RPS25 抗體：Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody(Invitrogen公司製，Cat#A24537) 溶媒：Canget Signal Solution 2(東洋紡股份有限公司製，Cat#NKB-101) 二級抗體振盪後，以TBST洗淨，使用ECL prime (Amersham公司製，Cat#RPN2232)施行檢測。另外，在檢測及解析中，係使用Amersham Imager 680。

將上述方法所求出之各單股反義寡核苷酸中之人類RPS25蛋白質的表現比率示於表10。此時，將陰性對照組中所求出之人類RPS25蛋白質的表現比率設為1.00。由於蛋白質表現比率低於0.80，故可判斷為能夠調節RPS25基因的功能之單股反義寡核苷酸。

≪單股反義寡核苷酸的細胞毒性評估≫ 將作為人類子宮頸癌細胞之HeLa-S3細胞於增殖培養基中，在37℃、5%CO ₂條件下進行培養。作為增殖培養基，係使用以下組成者。

(用於細胞毒性評估之增殖培養基的組成) 10%胎牛血清(FBS)：GIBCO公司製，CAT#10437028 1%非必須胺基酸(NEAA)：GIBCO公司製，Cat#11140050 Dulbecco’s Modified Eagle Medium低葡萄糖(含有L-麩醯胺酸、酚紅)(富士Film和光純藥公司製，Cat#041-29775))

在實驗前日，將上述細胞(1.0×10 ⁴cells/ well)接種於96孔盤中。將所接種之細胞在37℃、5%CO ₂的條件下培養一晚後，以Opti-Minimum Essential Medium (Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#31985070)添加已形成與Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific公司製公司製，Cat#L3000-015)之複合體之各單股反義寡核苷酸(終濃度：1~200nM)，在37℃、5%CO ₂的條件下將上述細胞培養24小時。然後，在上述增殖培養基中添加Caspase-Glo 3/7 Assay System(Promega公司製，Cat#G8093)或Celltiter-Glo 2.0 Assay(Promega公司製，Cat#G9242)，並評估凋亡蛋白酶活性及細胞生存率。將上述方法所求出之各單股反義寡核苷酸中之細胞毒性評估結果(細胞生存率)示於表11-1~表11-3。

≪單股反義寡核苷酸的血清中安定性評估≫ 對包含400pmol的單股反義寡核苷酸之Tris-EDTA緩衝液(pH=8.0)溶液(4μL)混合小鼠血清(20μL)或人類血清(20μL)後，添加礦物油(15μL)。將此溶液於37℃保溫培養後，混合8mol/L尿素溶液(10μL)，使血清中之核酸分解酵素失活。添加超純水(10μL)後，藉由離心分離而分離成包含單股反義寡核苷酸之水層及礦物油層，將水層藉由LC-MS(Waters公司製)進行分析，由所獲得之單股反義寡核苷酸的UV-層析圖的面積強度算出殘存之單股反義寡核苷酸。所謂「殘存寡核苷酸(%)」，係表示相對於在緊接於與血清混合後進行分析之時點之未分解的單股反義寡核苷酸而言，在72小時後之未分解的單股反義寡核苷酸的殘存率。

將在72小時後殘存率為50%以上者判斷為安定的單股反義寡核苷酸。

≪RPS25基因的in vivo表現評估≫ RPS25基因的表現評估係藉由實施小鼠腦室內投予並測定前額葉皮質各部位的mRNA量而施行。本實施例中之所謂基因表現評估，係意味藉由測定由反轉錄反應所獲得之互補DNA(cDNA)量而評估mRNA量。以下，針對各表現評估的具體流程進行說明。

使用異氟烷(Pfizer公司製，Cat#114133403)對FVB小鼠(日本CLEA)施加麻醉。接著，使用安裝於50μL Hamilton syringe(Hamilton公司製，Cat#705LT)之2段針(Top公司製，醫療儀器核准編號15800BZZ01460000)，將已溶解於人工腦脊髓液(Tocris Bioscience公司製，Cat#3525/25mL)中之反義寡核苷酸以10μL/個體投予至已麻醉之FVB小鼠。就陰性對照組的小鼠而言，係僅以10μL/個體投予人工腦脊髓液。

投予後設置一定的飼育期之後，使上述FVB小鼠進行安樂死，採取腦、頸髓、腰髓3個部位。所採取之組織係浸漬於RNA later(Applied Biosystems公司製，Cat#AM7024)中並靜置一晚之後，於-80℃進行保管。從所保管之組織樣品中萃取出RNA係使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司製，Cat#74106)來實施。從所萃取出之mRNA進行反轉錄反應係使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystem公司製，Cat#4368814)來實施。就反轉錄反應而言，係將1μg的mRNA稀釋成20μL來使用。利用由此反轉錄反應所獲得之互補DNA(cDNA)，以Taqmanexpression assays(Applied Biosystems公司製)，使用經預先設計之基因特異性探針(參照下述)實施即時PCR(95℃；3秒，60℃；30秒，進行40個循環)。

將上述方法所求出之各單股反義寡核苷酸中之小鼠RPS25 mRNA的表現比率示於表12。此時，將陰性對照組中所求出之小鼠RPS25 RNA的表現比率設為1.00。一般認為若mRNA的表現受到抑制，則隨後之向蛋白質之轉譯等亦受到抑制，因而在上述表現比率為0.80以下之情況，可判斷為能夠調節小鼠RPS25基因的功能之單股反義寡核苷酸。另外，表12所列舉之單股反義寡核苷酸所結合之標的區域為在人類RPS25基因與小鼠RPS25基因之間，序列保守之區域。

≪CAG重複表現神經細胞中之RAN轉譯抑制作用評估≫ 藉由對從健常iPS細胞所分化誘導出之pan-neuron導入具有CAG102重複之慢病毒載體而製作CAG重複表現神經細胞。設定可使用所製作而得之CAG重複表現神經細胞來檢測RAN轉譯產物之條件，藉由測定各反義寡核苷酸處置時之上述CAG重複表現神經細胞中之RAN轉譯產物量而評估RAN轉譯抑制活性。以下，記載評估流程。

以下記載所使用之培養基組成。 (StemFit AK03N)：Ajinomoto公司製 (Neural Induction Medium) Neurobasal Medium(Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#21103-49) Neural Induction Supplement(Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#A1647801)：1/50量

(Neural Expansion Medium) Neurobasal Medium(Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#21103-49) Advanced DMEM(Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#12634) Neural Induction Supplement(Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#A1647801)1/50量

(NB培養基) Neurobasal Medium(Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#21103049) 1/50 SM1 Neural Supplement(StemCell公司製，Cat#05711) 1/100 N2 Neural Supplement(StemCell公司製，Cat#07152) 10ng/mL Human BDNF(Peprotech公司製，Cat#450-02) 10ng/mL Human GDNF(R&D System公司製，cat#212-GD-050) 100μM Ascorbic Acid(東京化成者製，Cat#A0537) 100μM N6,2’-O-Dibutyryladenosine-3’,5’-cyclic Monophosphate Sodium Salt(Nacalai公司製，Cat#11540-61) 100倍稀釋青黴素/鏈黴素混合溶液(Thermo Fisher Scientific公司製，cat#15140-122) 0.1μM Compound E(Calbiochem公司製，Cat#56790)

(BP培養基) BrainPhys Neuronal Medium(StemCell公司製，Cat#05790) 1/50 SM1 Neural Supplement(StemCell公司製，Cat#05711) 1/100 N2 Neural Supplement(StemCell公司製，Cat#07152) 10ng/mL Human BDNF(Peprotech公司製，Cat#450-02) 10ng/mL Human GDNF(R&D System公司製，cat#212-GD-050) 100μM Ascorbic Acid(東京化成者製，Cat#A0537) 100μM N6,2’-O-Dibutyryladenosine-3’,5’-cyclic Monophosphate Sodium Salt(Nacalai公司製，Cat#11540-61) 100倍稀釋青黴素/鏈黴素混合溶液(Thermo Fisher Scientific公司製，cat#15140-122) 0.1μM Compound E(Calbiochem公司製，Cat#56790)

＜人類iPS細胞的維持＞在6孔盤中添加經以PBS稀釋100倍之iMAtrix-511(Nippi公司製，Cat#892012)，對盤進行塗覆。使用包含10μM的Y-27632(Tocris公司製，Cat#1254)之StemFitAK-03N培養基(Ajinomoto公司製)將已解凍之iPS細胞(201B7株，從iPS Academia Japan股份有限公司取得，AJ-H1-01)以200,000 cells/盤接種於上述盤中。在接種之翌日，更換成不包含Y-27632之StemFitAK-03N培養基，以後每隔2-3日以不包含Y-27632之AK-03培養基實施1次培養基更換。細胞培養係每1週施行1次繼代。細胞的繼代係依下列流程施行。首先，在已去除培養基之盤中以350μL/孔添加Accutase(Funakoshi公司製，Cat#AT104)，藉由於37℃處置5分鐘而使細胞剝離。接著，使用PBS將細胞分散，對細胞數進行計測之後，以成為5000~15000 cells/孔之方式，以含有10μM的Y-27632、1/150量的iMAtrix之StemFitAK03N培養基接種細胞。

＜從人類iPS細胞之pan-neuron的分化誘導＞以前述方法將iPS細胞進行繼代，以300000 cells/孔接種於6孔盤中。在接種之翌日，確認為15~25%匯合，將培養基取代成PSC Neural Induction Medium。每隔2日以PSC Neural Induction Medium施行1次培養基更換。在初次以PSC Neural Induction Medium進行取代之後第7日施行本細胞的繼代。具體而言，首先，藉由在10cm培養皿中添加Geltrex(商標)hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix並於37℃靜置1小時以上而進行塗覆。從培養細胞中去除培養基，以PBS洗淨後，添加Accutase來將細胞剝離。已剝離之細胞係通過細胞濾網(Falcon公司製，Cat#352360)進行回收，藉由日立製作所公司製himacCF7D2以900rpm離心4分鐘。以PBS進行再懸浮後，對細胞數進行計數，分取所需細胞數並再度以900rpm離心4分鐘。在沉澱之細胞中添加包含5μM的Y-27632之Neural Expansion Medium，施行再懸浮，以3~6×10 ⁶cells/dish接種細胞。在接種之翌日，更換成不包含Y-27632之Neural Expansion Medium，繼續進行細胞培養。細胞儲備液係在繼代第2次以上製作。具體而言，以與繼代同樣的流程將細胞剝離之後，以成為1×10 ⁷cells/mL之方式以Bambanker(日本Genetics公司製，Cat#CS-04-001)將細胞進行懸浮，加以凍結。

＜pan-neuron的維持培養＞喚醒已凍結之pan-neuron儲備液(凍結儲備液)。具體而言，首先，藉由於37℃處置1小時以上而對6孔盤塗覆geltrex。接著，在凍結儲備液中加入已加溫至37℃之Neural Expansion Medium(含有5μM Y-27632)而將細胞融解，將全量接種於1孔中。翌日，取代成不包含Y-27632之Neural Expansion Medium。將細胞融解之後3日後，去除培養基，以PBS洗淨後，添加Accutase，於室溫靜置1分鐘。去除Accutase，以PBS將細胞剝離，對細胞數進行計數。分取所需細胞數後，以300×g離心4分鐘，去除上清液後，以成為1×10 ⁵cells/mL之方式以包含5μM Y-27632之NB培養基施行再懸浮。懸浮後，以100μL/孔將細胞接種於96孔U型盤(Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#174929)中，以1000rpm離心4分鐘後，在37℃、5%CO ₂條件下培養細胞。與細胞的接種同時地添加包含CAG102重複之慢病毒溶液(5μL)及反義寡核苷酸溶液(終濃度1μM)。在接種細胞2日後，以100μL/孔添加不包含Y-27632之BP培養基，然後，每隔2~3日以不包含Y-27632之BP培養基施行半量培養基更換。在培養第7日、第14日，以成為終濃度1μM之方式添加反義寡核苷酸。

＜慢病毒調製方法＞在pCDH-EF1-MCS質體載體(System Biosciences公司製，Cat#CD502A-1-SBI)的NheI-SwaI間***包含(CAG)×120重複之HTT基因部分序列+3×抗原決定位標籤(Myc、Flag、V5)(表13、序列識別號788)。將該質體載體及慢病毒包裝質體載體(Invitrogen公司製，Cat# ViraPower Packaging mix K497500)轉染至HEK293T細胞(Takara Bio公司製，Cat#TransIT-293 V2700)。質體載體導入條件係依照製造商的操作說明書。將經轉染之細胞培養3日後，回收培養上清液。利用PEG-it(System Bioscience LV825A-1)將培養上清液中之慢病毒進行濃縮，懸浮於PBS中。使所製作而得之慢病毒感染HEK293T，並以免疫染色確認產生目標分子。

＜免疫染色及觀察＞在細胞培養第23日，為了進行免疫染色，將細胞以4%多聚甲醛進行固定(於室溫靜置15分鐘)。固定後，以PBS洗淨細胞(添加後靜置5分鐘×3次)，添加阻斷緩衝液(3%BSA[Sigma公司製，Cat#A9576-50ML]、0.3%Triton X-100[Nacalai Tesque公司製，Cat#：35501-02]in PBS)，藉由於室溫靜置1小時而施行上述細胞的阻斷。阻斷後，將經以阻斷緩衝液稀釋之以下一級抗體添加至細胞中，於4℃靜置一晚。・抗cMyc抗體(Abcom公司製，Cat#ab9106)1190倍稀釋・抗V5抗體(Thermo Fisher Scientific公司製，Cat#R960-25)1000倍稀釋

翌日，以PBS-T(3%BSA、0.3%Triton X-100 in PBS)洗淨細胞後(添加後靜置5分鐘×3次)，添加經以阻斷緩衝液稀釋之以下二級抗體，於4℃靜置一晚。・Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus(Invitrogen公司製，Cat#A32766)1000倍稀釋・Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594(Invitrogen公司製，Cat#A32766)1000倍稀釋・Hoechst 33342 solutopn(1mg/mL)(WAKO code：346-07951)

翌日，以PBS-T(3%BSA、0.3%Triton X-100 in PBS)洗淨細胞後(添加後靜置5分鐘×3次)，使用共焦定量影像細胞儀Cell Voyager CQ1(橫河電機公司製)觀察上述細胞。針對由通常轉譯所產生之胜肽(以Myc標籤檢測)，在經處置反義寡核苷酸之細胞組與未處置之細胞組間進行比較，所產生之胜肽的量並無差異。另一方面，針對由RAN轉譯所產生之胜肽(以V5標籤檢測)，經處置反義寡核苷酸之細胞組相較於未處置之細胞組而言，係特異性地減少。

如以上，針對本發明之實施形態及實施例進行說明，但最初開始亦已預定適宜組合上述各實施形態及各實施例的構成。

此次所揭示之實施形態及實施例應被認為在所有方面皆為例示性，並非限制性。本發明的範圍係以申請專利範圍來表示，而並非上述之實施形態及實施例，其意圖包含與申請專利範圍均等的意義，及在範圍內之所有變更。

[圖1]圖1為示出本實施形態所涉及之單股反義寡核苷酸的構成的一例之模式圖。 [圖2]圖2為說明使用本實施形態所涉及之單股反義寡核苷酸時，RPS25基因的表現受到抑制之機制之模式圖。 [圖3]圖3為示出實施例412中所使用之單股反義寡核苷酸的化學結構之模式圖。 [圖4]圖4為示出實施例413中所使用之單股反義寡核苷酸的化學結構之模式圖。 [圖5]圖5為示出實施例414中所使用之單股反義寡核苷酸的化學結構之模式圖。 [圖6]圖6為示出實施例415中所使用之單股反義寡核苷酸的化學結構之模式圖。 [圖7]圖7為示出實施例416中所使用之單股反義寡核苷酸的化學結構之模式圖。

<![CDATA[<110>  日商大日本住友製藥股份有限公司（Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd.）]]>
                 日商璐庫薩那生物技術股份有限公司（Luxna Biotech Co., Ltd.）
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          gctttggtga cagagcaaga gactgtctca aaaaaggggg cggggaggtg cggtggaaga     1740
          taatgggccc ctaatttaaa ggaaaagtaa agatagatga tcgttaaaaa ctgtaggatt     1800
          ctctgttacg aaacgtcaga ttaagcaggt gcagtgatac ccttgtattt ctagctactt     1860
          gggaggccaa ggcaggagga tcatttgagc caaggagttt gagtacattc tgggcacctt     1920
          tgagaggacc cccctctccc agcctttttt tttttctttt aaatagagat gctgttttgc     1980
          tctgttgccc aggctggtct cctgggctca agagatccac ctgtccaaag tgctgggatt     2040
          ataggcatga gccactacac ctggccaaaa cagaaacctt aatagtatgt ttttgttttt     2100
          ttttttttgg tttttttttt tttttttttt aaagacagtc tcactctgtc gcccaggctg     2160
          gagtgcagag gggcaatctt ggctcactgc aaccaccaac tcctgggttc aggcagtcct     2220
          cacacctcag cctcccaagt acctgggatt acaaacacgt gccaccatgc ctcactaatt     2280
          tttgtatctt cggtagagat ggggtttcac catgttggcc aggctggtgt gcaactcctt     2340
          acctcaagct gtctgcccgc cttcacctcc caaagtggtg ggattacgag catgagccac     2400
          catgcccaac caaaaacctt actagtttct attatagcat ctattaagca tctcatccta     2460
          ctatcttctc tccctaggac ttatcaaact ggtttcaaag cacagagctc aagtaattta     2520
          caccagaaat accaagggcg gagatgctcc agctgctggt gaagatgcat gaataggtga     2580
          gtaggaatgc gtgggctcat ggagtaggag gtagatacaa agctatggtt ctgattcttg     2640
          taattttttt tttacaggtc caaccaattg tacatttgga aaaataaaac tttattaaat     2700
          caaa                                                                  2704
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  2693]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  小鼠]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          agcgaggctg ctgtggtcta cacgactctc tgagcttcgc catggtaagg cccgcgaggg       60
          ttgagcagtg gggttcagag gatcgggcgg tgctgggggg aggtggaggc gaccctacac      120
          ggactgcttc gtgacccgcg ggcctgcctc tccgggcggc tgccgccatc gtgtccatgt      180
          gctccggcgg cggcgcctgg gtgggtgaag ggctgcgatc ggggtgcatg ggaccaccat      240
          gtgactggcc tgcactcccg ctttcttccc ctagcctccc aaagacgaca agaagaagaa      300
          agatgccgga aagtcggcca aaaaggataa agacccagta aataaatctg gtggcaaggc      360
          caagaagaag gtaggcgata gctatttgta atgggaatct gtgggacctg tcgtgaactt      420
          gtgctgtaag tttttcccca gataccgaat tctaaaatca catagtcact ttaagaatac      480
          agtggtgtaa tacttttata aagtaatggt attaaacctt attaatgtta cgaccctttt      540
          aagatggttc cccttttgac caccagctgt gaaattacta tttgtttttt caagatgggt      600
          ttctctgaat agccctgact gtcctgaact cactctgtag accaggctgg cctcgaactt      660
          agaaatctgc ctgcctcggc ctcccgagtg ctgggattaa aggcatgtgc caccactgcc      720
          cagctcatga aattattttt ttttttatga aattattttt gttgttgcta cttaatagtt      780
          ttgctactgc tatgaactgt aaggcatatg tctggtcttc agggtatctg atagcgactc      840
          caaagttgcc aatgcaataa gccaagaagt ctctaatttc cctgagatga tcgtgacaga      900
          gctttctcag atgcttgatg ttagggagca aagggatggt tctgactggt tctcatttgt      960
          tttgatgagc agaagtggtc caaaggcaaa gttcgggaca agttgaacaa tcttgtcctg     1020
          ttcgacaaag cgacatacga caagctctgt aaggaggttc cgaactataa gcttattact     1080
          ccagccgtgg tctctgagag actgaagatt cgcggttcct tggccagggc agcccttcag     1140
          gagctcctta gtaaaggtag gtgatgtgcc cttgttctta ccagtgcatt gtcttgttgg     1200
          gagcagtatg actggaaaga cttatgaagg atagactgac ttccagagtc ttaagtttta     1260
          gtaacttcag tgtcctgcat tcctttgcag tccttgaatt cctggccctt tttatttatt     1320
          tatttattgc ttctccgtta attgggatta aagtccagag taccaccttg ccttgttatt     1380
          ttggaatgcc atctcacttt gttgtccggg caaattattc tcctgcctct ggtgggattt     1440
          tttttgtttg tttgtttttt tgtttttcga gacagggttt cctctgtgta gccctggctg     1500
          tcctggaact cactctgtag accaggctgg ccttgaatta agaaatctgc ccgcctctgc     1560
          ctcccgagtg ctgggattaa aggcgtgcgc caccacgccc ggcttggcta tagttttaag     1620
          tacataaact tagcagatag gatctaggtg ttgttacaag tataaactat ggtccttaac     1680
          atagaggtgg tggcccctta agtctgtgcc aaggatgtgg aagagtttgt gtagttactc     1740
          ctgtaaccac aacacttcca tggcaaaatg gacttaccca ggagctcagg ccaactctgc     1800
          acggcacccg ctgtacagca gcgtgagaca tactgcctca acaggatgga agaaaagact     1860
          gacttcagat agggtgattc tctctacgtg caaatacact aaattattag taaatcctaa     1920
          aaacagctac attgatggct ggcttgttgg tcttcctgtc ctagacagag ttgggattaa     1980
          gggtacacgc ttgtgagccc agcacactga aggctaaaag ggtcagcacc aaatcccagg     2040
          ccggcttgga agttagagta tgacctggca ccctaagaat taaggagttc tgtctggaaa     2100
          agaaatagga aatgtacact tggtatctgc tatatgagga actctggcat ccttggagct     2160
          ggagagatga tttccttctc agataccaaa tgcacgtgtg taaggcaaga accttcaaac     2220
          actttgaatt ttctccttag gacttatcaa gctggtttca aagcacagag cccaagtaat     2280
          ttacaccaga aacacaaagg gtggggacgc tccagctgct ggcgaagatg catgaacagg     2340
          tgggaagaaa agtttcttgg tgtagaagta tcactcgtgc cctttatgag atgttgcggt     2400
          tatgactttg tttttttttg tttgttttac aggttcaatc agctgtacat ttggaaaaat     2460
          aaaactttat tgaatcaaat gaatgggtgc atctgtttcc taaggcagcc ggggaggatt     2520
          tggtcttagg aataatagct ggaattggtt tgttggccat gaagtcagat gcaattgcgc     2580
          ctgggaacct tcagcttttc cctttacgtg gttgcttgct tcttgttgca gcttcggttt     2640
          tgaattgatg cctgaaagaa aataaaaact tagcaagact aatggtaaat cta            2693
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  h8-22-A ASO for hRPS25 mRNA]]>
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          <![CDATA[<221>  modified_base]]>
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          <![CDATA[<223>  m5c]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          cgtcaagatg tcgga                                                        15
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  h9-23-A ASO for hRPS25 mRNA]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  modified_base]]>
          <![CDATA[<222>  (2)..(2)]]>
          <![CDATA[<223>  m5c]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  modified_base]]>
          <![CDATA[<222>  (13)..(13)]]>
          <![CDATA[<223>  m5c]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          tcgtcaagat gtcgg                                                        15
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  h10-24-A ASO for hRPS25 mRNA]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  modified_base]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(1)]]>
          <![CDATA[<223>  m5c]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  modified_base]]>
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          <![CDATA[<223>  m5c]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  modified_base]]>
          <![CDATA[<222>  (14)..(14)]]>
          <![CDATA[<223>  m5c]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          ctcgtcaaga tgtcg                                                        15
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  h27-41-A ASO for hRPS25 mRNA]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  modified_base]]>
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          <![CDATA[<223>  m5c]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  modified_base]]>
          <![CDATA[<222>  (14)..(14)]]>
          <![CDATA[<223>  m5c]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          gcagcagaca ccgca                                                        15
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  h28-42-A ASO for hRPS25 mRNA]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  modified_base]]>
          <![CDATA[<222>  (3)..(3)]]>
          <![CDATA[<223>  m5c]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  modified_base]]>
          <![CDATA[<222>  (13)..(13)]]>
          <![CDATA[<223>  m5c]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          agcagcagac accgc                                                        15
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  h29-43-A ASO for hRPS25 mRNA]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  modified_base]]>
          <![CDATA[<222>  (13)..(13)]]>
          <![CDATA[<223>  m5c]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  modified_base]]>
          <![CDATA[<222>  (14)..(14)]]>
          <![CDATA[<223>  m5c]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          tagcagcaga caccg                                                        15
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  h30-44-A ASO for hRPS25 mRNA]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  modified_base]]>
          <![CDATA[<222>  (14)..(14)]]>
          <![CDATA[<223>  m5c]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          atagcagcag acacc                                                        15
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  h32-46-A ASO for hRPS25 mRNA]]>
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          <![CDATA[<221>  modified_base]]>
          <![CDATA[<222>  (14)..(14)]]>
          <![CDATA[<223>  m5c]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          gaatagcagc agaca                                                        15
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<400>  15]]>
          agaatagcag cagac                                                        15
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          gagaatagca gcaga                                                        15
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          ggagaatagc agcag                                                        15
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
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          cggagaatag cagca                                                        15
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          acagctgggg ttata                                                        15
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          aaatgtacag ctggt                                                        15
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          cagagtttat catag                                                        15
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          caaatgtaca gctgg                                                        15
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          tccaaatgta cagct                                                        15
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          tttccaaatg tacag                                                        15
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          ttttccaaat gtaca                                                        15
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          tttttccaaa tgtac                                                        15
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          atttttccaa atgta                                                        15
          <![CDATA[<210>  192]]>
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          cggacaaaaa ggaag                                                        15
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          ttcacacccc tgaag                                                        15
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          cttcacaccc ctgaa                                                        15
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          acttcacacc cctga                                                        15
          <![CDATA[<210>  196]]>
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          tcccctaata ctgcg                                                        15
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          gtcccctaat actgc                                                        15
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          aatgcaacca ggtcc                                                        15
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          gtaggagggc agcgg                                                        15
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          ctgtaggagg gcagc                                                        15
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          atagcagcag acacc                                                        15
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          agaatagcag cagac                                                        15
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          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  480]]>
          gagaatagca gcaga                                                        15
          <![CDATA[<210>  481]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  h35-49 ASO for hRPS25 mRNA]]>
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          ggagaatagc agcag                                                        15
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          cggagaatag cagca                                                        15
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          <![CDATA[<211>  15]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          tcggagaata gcagc                                                        15
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          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          ctcggagaat agcag                                                        15
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          gctcggagaa tagca                                                        15
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          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          agctcggaga atagc                                                        15
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          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          cgtccttctt cttct                                                        15
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          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<400>  489]]>
          ttcttggccg acttt                                                        15
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          <![CDATA[<220>]]>
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          tttcttggcc gactt                                                        15
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          tctttcttgg ccgac                                                        15
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          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  h102-116 ASO for hRPS25 mRNA]]>
          <![CDATA[<400>  493]]>
          gtctttcttg gccga                                                        15
          <![CDATA[<210>  494]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  494]]>
          tgtctttctt ggccg                                                        15
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          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          tctttgtctt tcttg                                                        15
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          gatttgttca ctggg                                                        15
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          ccggatttgt tcact                                                        15
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          tttttggcct tgccc                                                        15
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          ggtttgtttt ggccg                                                        15
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          tagcttgagg taagg                                                        15
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          atagcttgag gtaag                                                        15
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          <![CDATA[<211>  15]]>
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          agatagcttg aggta                                                        15
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          acgggcagat agctt                                                        15
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          gtaaggtttt tggct                                                        15
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          tagtaaggtt tttgg                                                        15
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          <![CDATA[<211>  15]]>
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          ctagtaaggt ttttg                                                        15
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          tttgtatcta cctcc                                                        15
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          agctttgtat ctacc                                                        15
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          ctggttggac ctgta                                                        15
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          gctggttgga cctgt                                                        15
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          agctggttgg acctg                                                        15
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          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<400>  786]]>
          ggttggacct gtaaa                                                        15
          <![CDATA[<210>  787]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  hp2584-2598 ASO for hRPS25 pre-mRNA]]>
          <![CDATA[<400>  787]]>
          tggttggacc tgtaa                                                        15
          <![CDATA[<210>  788]]>
          <![CDATA[<211>  703]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Myc, Flag, V5]]>
          <![CDATA[<400>  788]]>
          gctagccacc atggcgaccc tggaaaagat gatgaaggcc ttcgagtccc tcaagtcctt       60
          ccagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca      120
          gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca      180
          gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca      240
          gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca      300
          gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca      360
          gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca      420
          gccgccaccg ccgccgccgc cgccgccgcc tcctcagctt cctcagccgc cgccgcaggc      480
          acagccgctg ctgcctcagc cgcagccgcc cccgccgccg cccccgccgc cacccggccc      540
          ggctgtggct gtggagccgc aagaattcgg aggagatatc gaacaaaaac tcatctcaga      600
          agaggatctg tgactacaaa gacgacgacg acaagcggta agcctatccc taaccctctc      660
          ctcggtctcg attctacgta gctcgagtct agagggcccg ttt                        703

Claims

一種調節RPS25基因的表現及/或功能之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽，前述單股反義寡核苷酸係各核苷酸以磷酸基及/或經修飾之磷酸基進行結合，前述單股反義寡核苷酸包含間隔區域、結合至前述間隔區域的3’末端之3’翼區域及結合至前述間隔區域的5’末端之5’翼區域，前述間隔區域為由去氧核糖所構成之核酸，其可包含醣部經修飾之核酸，前述3’翼區域及前述5’翼區域為經修飾之核酸，前述單股反義寡核苷酸的鹼基長為12~30mer，前述單股反義寡核苷酸的鹼基序列為：以對於序列識別號1或序列識別號2所記載之鹼基序列中之以與前述單股反義寡核苷酸相同的鹼基長所構成之至少1個標的區域而言互補的鹼基序列為基準，具有90%以上且100%以下的序列同一性之鹼基序列；對於在前述標的區域中1或數個鹼基發生缺失、取代、***或附加而得之鹼基序列而言互補的鹼基序列；或在嚴苛的條件下對具有前述標的區域之寡核苷酸進行雜交之鹼基序列。
如請求項1之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽，其中，前述單股反義寡核苷酸的鹼基序列為以對於序列識別號1或序列識別號2所記載之鹼基序列中之以與前述單股反義寡核苷酸相同的鹼基長所構成之至少1個標的區域而言互補的鹼基序列為基準，具有95%以上且100%以下的序列同一性之鹼基序列。
如請求項1之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽，其中，前述單股反義寡核苷酸的鹼基序列為對於序列識別號1或序列識別號2所記載之鹼基序列中之以與前述單股反義寡核苷酸相同的鹼基長所構成之至少1個標的區域而言互補的鹼基序列。
如請求項1至3中任一項之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽，其中，前述間隔區域的鹼基數為5~20mer，前述3’翼區域為1~5mer的經修飾之核酸，前述5’翼區域為1~5mer的經修飾之核酸。
如請求項1至4中任一項之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽，其中，前述單股反義寡核苷酸的鹼基長為14~22mer。
如請求項1至5中任一項之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽，其中，前述3’翼區域中之前述經修飾之核酸包含選自由2’－MOE核酸、LNA、AmNA、GuNA及scpBNA所組成之群組之至少1者，前述5’翼區域中之前述經修飾之核酸包含選自由2’－MOE核酸、LNA、AmNA、GuNA及scpBNA所組成之群組之至少1者。
如請求項1至6中任一項之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽，其中，前述單股反義寡核苷酸的至少1個核苷酸間鍵為硫代磷酸酯鍵。
如請求項1至7中任一項之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽，其中，前述單股反義寡核苷酸的至少1個核苷酸間鍵為磷酸二酯鍵。
如請求項1至8中任一項之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽，其中，前述單股反義寡核苷酸的鹼基序列為：以對於在序列識別號1所記載之鹼基序列中從5’末端算起位於8號~10號、27號~29號、34號~40號、79號、98號、101號~106號、123號~129號、140號、160號~161號、180號~191號、208號~221號、242號~243號、255號~268號、285號~286號、292號~304號、321號~328號、340號~344號、365號或429號~454號之鹼基起連續的14~22mer所構成之標的區域而言互補的鹼基序列為基準，具有90%以上且100%以下的序列同一性之鹼基序列；對於在前述標的區域中1或數個鹼基發生缺失、取代、***或附加而得之鹼基序列而言互補的鹼基序列；或在嚴苛的條件下對具有前述標的區域之寡核苷酸進行雜交之鹼基序列。
如請求項1至9中任一項之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽，其中，前述單股反義寡核苷酸的鹼基序列為以對於在序列識別號1所記載之鹼基序列中從5’末端算起位於8號、10號、28號~29號、35號~37號、101號~104號、123號~126號、129號、160號、180號~187號、209號~220號、258號~267號、285號、295號~297號、300號~304號、321號~327號、341號、344號、365號或429號~454號之鹼基起連續的14~22mer所構成之標的區域而言互補的鹼基序列為基準，具有90%以上且100%以下的序列同一性之鹼基序列，前述3’翼區域為2~5mer，前述5’翼區域為2~5mer。
如請求項1至10中任一項之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽，其中，前述單股反義寡核苷酸的鹼基序列為以對於在序列識別號1所記載之鹼基序列中從5’末端算起位於36號、102號~103號、123號~126號、185號~187號、213號~214號、220號、259號~260號、263號~265號、295號~296號、300號、302號~303號、322號~327號、429號~431號、435號或438號~454號之鹼基起連續的14~22mer所構成之標的區域而言互補的鹼基序列為基準，具有90%以上且100%以下的序列同一性之鹼基序列。
如請求項1至11中任一項之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽，其中，前述單股反義寡核苷酸的鹼基序列為選自由下列者所組成之群組之1種鹼基序列：序列識別號18、24~25、28~29、38、48~49、53、58~59、63~64、66~68、79~80、84、86~91、93~95、97、99~105、113~119、121~123、125、127~130、140、162、169、171~173、183、188、190、304~306、309、310、312、313、317、321~323、326、327、331、332、334、337、340~344、346、348、349、351、353、355~364、366、367、371~382、385、386、388、389、391、394、396、397、407、408、410、418~424、426、427、431及432的鹼基序列。
如請求項1至8中任一項之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽，其中，前述單股反義寡核苷酸的鹼基序列為：以對於在序列識別號2所記載之鹼基序列中從5’末端算起位於1號、75號、233號、261號、278號~280號、390號~392號、417號~423號、445號~447號、460號~461號、510號、561號~562號、589號、605號、626號~628號、632號~634號、696號~697號、1034號~1035號、1103號~1107號、1128號~1129號、1196號~1197號、1398號、1408號~1412號、1478號~1480號、1715號、1749號~1751號、2047號~2049號、2121號~2123號、2260號~2268號、2342號、2406號或2585號~2587號之鹼基起連續的14~22mer所構成之標的區域而言互補的鹼基序列為基準，具有90%以上且100%以下的序列同一性之鹼基序列；對於在前述標的區域中1或數個鹼基發生缺失、取代、***或附加而得之鹼基序列而言互補的鹼基序列；或在嚴苛的條件下對具有前述標的區域之寡核苷酸進行雜交之鹼基序列。
如請求項1至8及13中任一項之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽，其中，前述單股反義寡核苷酸的鹼基序列為以對於在序列識別號2所記載之鹼基序列中從5’末端算起位於1號、278號~279號、417號~420號、561號、605號、627號、632號~634號、697號、1035號、1128號、1196號~1197號、1409號~1410號、1478號、1715號、1750號、2047號~2049號、2342號、2406號或2585號~2587號之鹼基起連續的14~22mer所構成之標的區域而言互補的鹼基序列為基準，具有90%以上且100%以下的序列同一性之鹼基序列，前述3’翼區域為2~5mer，前述5’翼區域為2~5mer。
一種雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽，其包含如請求項1至14中任一項之單股反義寡核苷酸，及對前述單股反義寡核苷酸進行雜交之第二股寡核苷酸，前述第二股寡核苷酸的鹼基序列為以對於前述單股反義寡核苷酸的鹼基序列而言互補的鹼基序列為基準，具有90%以上且100%以下的序列同一性之鹼基序列。
一種反義寡核苷酸複合體或其製藥學上可容許的鹽，其具有如請求項1~14中任一項之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽或者如請求項15之雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽，及結合至前述單股反義寡核苷酸或前述第二股寡核苷酸之附加物質，前述附加物質係選自由聚乙二醇、胜肽、烷基鏈、配位體化合物、抗體、蛋白質及醣鏈所組成之群組。
一種醫藥品，其包含如請求項1~14中任一項之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽、如請求項15之雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽或者如請求項16之反義寡核苷酸複合體或其製藥學上可容許的鹽作為有效成分。
一種RPS25基因之表現及/或功能調節劑，其包含如請求項1~14中任一項之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽、如請求項15之雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽或者如請求項16之反義寡核苷酸複合體或其製藥學上可容許的鹽作為有效成分。
一種RAN轉譯所引發之二肽重複的產生阻礙劑，其包含如請求項1~14中任一項之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽、如請求項15之雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽或者如請求項16之反義寡核苷酸複合體或其製藥學上可容許的鹽作為有效成分。
一種針對於重複疾病之治療劑，其包含如請求項1~14中任一項之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽、如請求項15之雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽或者如請求項16之反義寡核苷酸複合體或其製藥學上可容許的鹽作為有效成分。
一種針對於重複疾病之預防劑，其包含如請求項1~14中任一項之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽、如請求項15之雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽或者如請求項16之反義寡核苷酸複合體或其製藥學上可容許的鹽作為有效成分。
如請求項20之針對於重複疾病之治療劑或如請求項21之針對於重複疾病之預防劑，其中，前述重複疾病為選自由C9orf72 ALS、C9orf72 FTLD、亨丁頓氏症(Huntington’s disease)、脊髓小腦失調症、齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮症、脊髓延髓性肌肉萎縮症、Friedreich失調症、脆性X相關震顫失調症候群及肌強直性營養不良所組成之群組之至少1者。
一種重複疾病的治療方法或預防方法，其包含將如請求項1~14中任一項之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽、如請求項15之雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽或者如請求項16之反義寡核苷酸複合體或其製藥學上可容許的鹽投予至個體。
如請求項23之重複疾病的治療方法或預防方法，其中，前述重複疾病為選自由C9orf72 ALS、C9orf72 FTLD、亨丁頓氏症、脊髓小腦失調症、齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮症、脊髓延髓性肌肉萎縮症、Friedreich失調症、脆性X相關震顫失調症候群及肌強直性營養不良所組成之群組之至少1者。
如請求項1~14中任一項之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽、如請求項15之雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽或者如請求項16之反義寡核苷酸複合體或其製藥學上可容許的鹽，其係使用於C9orf72 ALS的治療或預防。
如請求項1~14中任一項之單股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽、如請求項15之雙股反義寡核苷酸或其製藥學上可容許的鹽或者如請求項16之反義寡核苷酸複合體或其製藥學上可容許的鹽，其係使用於製造C9orf72 ALS的治療劑或預防劑。