TW202204407A - 雙特異性抗體 - Google Patents

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TW202204407A TW110111315A TW110111315A TW202204407A TW 202204407 A TW202204407 A TW 202204407A TW 110111315 A TW110111315 A TW 110111315A TW 110111315 A TW110111315 A TW 110111315A TW 202204407 A TW202204407 A TW 202204407A
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赤堀泰
田中健人
谷津彩香
市川淳也
大塚敏明
上妻志保
橋本隆二
中山麻紀子
篠崎直也
中村健介
渡邊一郎
古薗信二
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國立大學法人三重大學
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Abstract

提供可作為抗腫瘤劑使用的新穎抗體、及包含含該抗體等之分子作為有效成分的抗腫瘤劑。 一種抗體或其結合片段，其包含： 由序列識別號54所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH1、 由序列識別號55所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH2、 由序列識別號56所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH3、 由序列識別號57所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL1、或者是由序列識別號57所表示的胺基酸序列中第7號之胺基酸為W及/或者是第8號之胺基酸為K的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL1、 由序列識別號58所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL2、以及 由序列識別號59所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL3、或者是由序列識別號57所表示的胺基酸序列中第2號之胺基酸為A或者是S的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL3。

Description

雙特異性抗體
本發明關於對癌症之治療有用的抗體、雙特異性抗體等。
NY-ESO-1係藉由重組cDNA表現庫血清學分析(Serological analysis of recombinant cDNA expression libraries；SEREX)法而自食道癌所鑑定之分子(非專利文獻1)，LAGE-1別名亦稱為NY-ESO-2，為自腫瘤cDNA基因庫(cDNA library)的代表性差異分析(Representational difference analysis)所鑑定之分子(非專利文獻2)。任一分子都已知於正常組織中在睪丸為局部表現，但機能未明。NY-ESO-1、LAGE-1因被報告在黑色素瘤、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、軟組織肉瘤、骨髓瘤等廣泛的癌症種類之表現(非專利文獻3)，而暗示與癌症之關聯性。又，關於與惡性度之關聯，有以下等之報告：比起在黑色素瘤的原發病灶，NY-ESO-1在轉移病灶的表現較高(非專利文獻4)；於泌尿道上皮細胞癌中，與初期之癌症比較，NY-ESO-1、LAGE-1在進行癌(advanced cancer)中為高表現(非專利文獻5)；比起在染色體正常的骨髓瘤中，NY-ESO-1在有染色體異常之高風險的骨髓瘤中較高表現(非專利文獻6)。由此等之資訊，NY-ESO-1、LAGE-1作為癌症特異性高的分子而受到注目，且作為癌症疫苗療法的潛在藥物標的而進行許多的研究開發，但迄今未有受到許可的醫藥品。
已知NY-ESO-1、LAGE-1之第157號至第165號的9-mer的NY-ESO肽：SLLMWITQC係與HLA(組織相容性白血球抗原(Histocompatibility Leukocyte Antigen))-A2形成複合體(HLA/NY-ESO肽複合體)，且於細胞外呈現(非專利文獻7)。如上述地，NY-ESO-1、LAGE-1的表現為癌症特異性，因此暗示HLA/NY-ESO肽複合體為僅於HLA-A2陽性且NY-ESO-1或是LAGE-1陽性的癌細胞上存在之癌症特異性的治療標的(非專利文獻8)。而且，作為與HLA/NY-ESO肽複合體結合的分子，而有TCR(專利文獻1、2)、抗體(專利文獻3、專利文獻8)的報告。
作為對於癌症標的分子之結合分子的用途之一，有CD3雙特異性(bispecific)抗體，其係以將T細胞往癌細胞誘導且顯示藉由細胞毒殺之抗腫瘤效果的T細胞重定向(T cell redirection)為機制(非專利文獻9、10)。作為現在上市中的CD3雙特異性抗體醫藥品，可舉出為對於CD19之BiTE(雙特異性T細胞銜接抗體，bispecfic T-cell engager)的博納吐單抗 (Blinatumomab)。在急性淋巴母細胞性白血病(ALL)被許可，且以其他血液癌症為對象的臨床試驗係進行中。但是就雙特異性的抗體型式而言，係不具有Fc區的串聯scFv(taFv)，相較於作為治療用抗體所通常使用之IgG型的抗體，被投予至患者之際的血中半衰期非常短(非專利文獻11)。
作為血中半衰期與IgG型的抗體同等級之具有異二聚體Fc區的雙特異性(bispecific)抗體，使用了杵-進入-臼(knobs-into-holes)、CrossMAb、DuoBody(註冊商標)等(專利文獻4、5、6、7)各樣的抗體型式之CD3雙特異性抗體的研究、臨床試驗係進行中，且有報告利用對於HLA/NY-ESO肽複合體之抗體的CD3雙特異性抗體(非專利文獻12)。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]WO2005/113595 [專利文獻2]WO2017/109496 [專利文獻3]WO2010/106431 [專利文獻4]WO1998/050431 [專利文獻5]WO2006/106905 [專利文獻6]WO2011/028952 [專利文獻7]WO2011/131746 [專利文獻8]WO2021/003357 [非專利文獻]
[非專利文獻1]Proc Natl Acad Sci U S A.;94(5):1914-8(1997). [非專利文獻2]Int J Cancer.;76(6):903-8(1998). [非專利文獻3]Immunol Cell Biol.;84(3):303-17(2006). [非專利文獻4]J Surg Res.;98(2):76-80(2001). [非專利文獻5]Cancer Res.;61(12):4671-4(2001). [非專利文獻6]Blood.;105(10):3939-44(2005). [非專利文獻7]J Exp Med.;187(2):265-70(1998). [非專利文獻8]J Immunol.;176(12):7308-16(2006). [非專利文獻9]Nature;314 (6012);628-31(1985). [非專利文獻10]Int Rev Immunol.;4(2);159-73(1989). [非專利文獻11]Drug Des Devel Ther.;10;757-765(2016). [非專利文獻12]日本第21次癌症免疫學會論文集；O13-4
[發明欲解決之課題]
本發明之目的為提供可作為抗腫瘤劑使用的新穎之抗HLA-A2/NY-ESO抗體、及包含含該抗體等之與HLA-A2/NY-ESO結合的分子作為有效成分的抗腫瘤劑。 [用以解決課題之手段]
本發明人等為了解決上述課題而專心致力進行研究，創作出新穎之抗HLA-A2/NY-ESO抗體、及包含該抗體等之與HLA-A2/NY-ESO結合的分子，完成了本發明。
亦即，本發明包含以下的發明。 [1]一種與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段，其包含： 由序列識別號54所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH1、 由序列識別號55所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH2、 由序列識別號56所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH3、 由序列識別號57所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL1、或者是由序列識別號57所表示的胺基酸序列中第7號之胺基酸為W及/或者是第8號之胺基酸為K的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL1、 由序列識別號58所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL2、以及 由序列識別號59所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL3、或者是由序列識別號59所表示的胺基酸序列中第2號之胺基酸為A或者是S的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL3。
[2]如[1]之抗體或其結合片段，其包含選自包含以下(i)～(v)之群之群組的1個或2個以上之群的CDRH1～CDRH3及CDRL1～CDRL3， (i)由序列識別號54所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH1、 由序列識別號55所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH2、 由序列識別號56所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH3、 由序列識別號57所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL1、 由序列識別號58所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL2、及 由序列識別號59所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL3； (ii)由序列識別號54所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH1、 由序列識別號55所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH2、 由序列識別號56所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH3、 由序列識別號57所表示的胺基酸序列中第7號之胺基酸為W的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL1、 由序列識別號58所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL2、及 由序列識別號59所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL3； (iii)由序列識別號54所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH1、 由序列識別號55所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH2、 由序列識別號56所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH3、 由序列識別號57所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL1、 由序列識別號58所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL2、及 由序列識別號59所表示的胺基酸序列中第2號之胺基酸為A的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL3； (iv)由序列識別號54所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH1、 由序列識別號55所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH2、 由序列識別號56所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH3、 由序列識別號57所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL1、 由序列識別號58所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL2、及 由序列識別號59所表示的胺基酸序列中第2號之胺基酸為S的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL3；以及 (v)由序列識別號54所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH1、 由序列識別號55所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH2、 由序列識別號56所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH3、 由序列識別號57所表示的胺基酸序列中第7號之胺基酸為W而第8號之胺基酸為K的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL1、 由序列識別號58所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL2、及 由序列識別號59所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL3。
[3]如[1]之抗體或其結合片段，其包含： 由序列識別號27所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140的胺基酸序列、或與序列識別號38或者是序列識別號39所表示的胺基酸序列具有95%以上之序列相同性的胺基酸序列而成之重鏈可變區；及由序列識別號27或者是序列識別號52所表示的胺基酸序列之胺基酸編號156～266的胺基酸序列、或與序列識別號40所表示的胺基酸序列具有95%以上之序列相同性的胺基酸序列而成之輕鏈可變區。
[4]如[1]之抗體或其結合片段，其包含： (H1)由序列識別號6所表示的胺基酸序列而成之重鏈可變區 (H2)由序列識別號18所表示的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (H3)由序列識別號29所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (H4)由序列識別號26所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (H5)由序列識別號27所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (H6)由序列識別號28所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (H7)由序列識別號36所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (H8)由序列識別號47所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (H9)由序列識別號48所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (H10)由序列識別號50所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (H11)由序列識別號51所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (H12)由序列識別號52所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (H13)由序列識別號53所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (H14)由序列識別號30所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、或者是 (H15)由序列識別號156所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區；以及 (L1)由序列識別號8所表示的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (L2)由序列識別號20所表示的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (L3)由序列識別號29所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (L4)由序列識別號26所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (L5)由序列識別號27所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (L6)由序列識別號28所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (L7)由序列識別號36所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (L8)由序列識別號47所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (L9)由序列識別號48所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (L10)由序列識別號50所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (L11)由序列識別號51所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (L12)由序列識別號52所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (L13)由序列識別號53所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (L14)由序列識別號30所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、或者是 (L15)由序列識別號156所表示的胺基酸序列之第161號～第271號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區。
[5]如[4]之抗體或其結合片段，其包含： (H1L1)由序列識別號6所表示的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號8所表示的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (H2L2)由序列識別號18所表示的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號20所表示的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (H3L3)由序列識別號29所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號29所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (H4L4)由序列識別號26所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號26所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (H5L5)由序列識別號27所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號27所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (H6L6)由序列識別號28所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號28所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (H7L7)由序列識別號36所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號36所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (H8L8)由序列識別號47所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號47所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (H9L9)由序列識別號48所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號48所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (H10L10)由序列識別號50所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號50所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (H11L11)由序列識別號51所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號51所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (H12L12)由序列識別號52所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號52所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (H13L13)由序列識別號53所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號53所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (H14L14)由序列識別號30所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號30所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區；或 (H15L14)由序列識別號156所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號156所表示的胺基酸序列之第161號～第271號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區。
[6]如[1]～[5]中任一者之抗體或其結合片段，其為scFv。 [7]如[6]之抗體或其結合片段，其為： (s1)由序列識別號70所表示的胺基酸序列之第21號～第266號的胺基酸序列而成之scFv； (s2)包含由序列識別號18所表示的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號20所表示的胺基酸序列而成之輕鏈可變區的scFv； (s3)由序列識別號29所表示的胺基酸序列之第21號～第266號的胺基酸序列而成之scFv； (s4)由序列識別號26所表示的胺基酸序列之第21號～第266號的胺基酸序列而成之scFv； (s5)由序列識別號27所表示的胺基酸序列之第21號～第266號的胺基酸序列而成之scFv； (s6)由序列識別號28所表示的胺基酸序列之第21號～第266號的胺基酸序列而成之scFv； (s7)由序列識別號36所表示的胺基酸序列之第21號～第266號的胺基酸序列而成之scFv； (s8)由序列識別號47所表示的胺基酸序列之第21號～第266號的胺基酸序列而成之scFv； (s9)由序列識別號48所表示的胺基酸序列之第21號～第266號的胺基酸序列而成之scFv； (s10)由序列識別號50所表示的胺基酸序列之第21號～第266號的胺基酸序列而成之scFv； (s11)由序列識別號51所表示的胺基酸序列之第21號～第266號的胺基酸序列而成之scFv； (s12)由序列識別號52所表示的胺基酸序列之第21號～第266號的胺基酸序列而成之scFv； (s13)由序列識別號53所表示的胺基酸序列之第21號～第266號的胺基酸序列而成之scFv； (s14)由序列識別號30所表示的胺基酸序列之第21號～第266號的胺基酸序列而成之scFv；或 (s15)由序列識別號156所表示的胺基酸序列之第21號～第271號的胺基酸序列而成之scFv。
[8]一種多核苷酸，其編碼如[1]～[7]中任一者之抗體或其結合片段。 [9]一種載體，其包含如[8]之多核苷酸。 [10]一種宿主細胞，其包含如[8]之多核苷酸或如[9]之載體。 [11]一種製造與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段之方法，其包含：(i)培養如[10]之宿主細胞的步驟；及(ii)從步驟(i)中所得之培養物純化抗體或其結合片段步驟。 [12]一種與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段，其可藉由如[11]之方法得到。 [13]一種與HLA-A2/NY-ESO結合的抗體或其結合片段，其具有下述(i)或(ii)記載之性質： (i)與如[7]記載之抗體或其結合片段所辨識之HLA-A2/NY-ESO上的部位結合； (ii)於對人類HLA-A2/NY-ESO之結合上與如[7]記載之抗體或其結合片段競爭。 [14]一種醫藥組成物，其包含如[1]～[7]、[12]及[13]中任一者之抗體或其結合片段、如[8]之多核苷酸、如[9]之載體、或如[10]之細胞作為有效成分。 [15]一種與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的分子，其包含如[1]～[7]、[12]及[13]中任一者之抗體或其結合片段。 [16]如[15]之分子，其為多重特異性抗體。 [17]如[15]之分子，其為雙特異性抗體。 [18]如[15]～[17]中任一者之分子，其包含與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段。
[19]如[18]之分子，其中與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段為包含下列之與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段： (CCH1)由序列識別號141所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH1、 (CCH2)由序列識別號142所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH2或者是由序列識別號142所表示的胺基酸序列中第3號之胺基酸為N或S的胺基酸序列而成之重鏈CDRH2、 (CCH3)由序列識別號143所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH3、 (CCL1)由序列識別號144所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL1、 (CCL2)由序列識別號145所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL2或者是由序列識別號145所表示的胺基酸序列中第2號之胺基酸為N的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL2、以及 (CCL3)由序列識別號146所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL3。
[20]如[19]之分子，其中與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段包含： (CH1)由序列識別號136所表示的胺基酸序列之第2號～第119號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (CH2)由序列識別號137所表示的胺基酸序列之第2號～第119號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (CH3)由序列識別號147所表示的胺基酸序列之第2號～第119號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (CH4)由序列識別號138所表示的胺基酸序列之第2號～第119號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (CH5)由序列識別號139所表示的胺基酸序列之第2號～第119號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (CH6)由序列識別號140所表示的胺基酸序列之第2號～第119號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (CH7)由序列識別號155所表示的胺基酸序列之第272號～第389號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (CH8)由序列識別號156所表示的胺基酸序列之第277號～第394號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、或者是 (CH9)由序列識別號157所表示的胺基酸序列之第277號～第394號的胺基酸序列而成之重鏈可變區；以及 (CL1)由序列識別號136所表示的胺基酸序列之第135號～第243號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (CL2)由序列識別號137所表示的胺基酸序列之第135號～第241號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (CL3)由序列識別號147所表示的胺基酸序列之第135號～第243號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (CL4)由序列識別號138所表示的胺基酸序列之第135號～第241號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (CL5)由序列識別號139所表示的胺基酸序列之第135號～第243號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (CL6)由序列識別號140所表示的胺基酸序列之第135號～第243號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (CL7)由序列識別號155所表示的胺基酸序列之第405號～第511號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (CL8)由序列識別號156所表示的胺基酸序列之第410號～第516號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、或者是 (CL9)由序列識別號157所表示的胺基酸序列之第410號～第516號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區。
[21]如[20]之分子，其中與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段包含： (CH1CL1)由序列識別號136所表示的胺基酸序列之第2號～第119號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、及由序列識別號136所表示的胺基酸序列之第135號～第243號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (CH2CL2)由序列識別號137所表示的胺基酸序列之第2號～第119號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、及由序列識別號137所表示的胺基酸序列之第135號～第241號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (CH3CL3)由序列識別號147所表示的胺基酸序列之第2號～第119號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、及由序列識別號147所表示的胺基酸序列之第135號～第243號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (CH4CL4)由序列識別號138所表示的胺基酸序列之第2號～第119號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、及由序列識別號138所表示的胺基酸序列之第135號～第241號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (CH5CL5)由序列識別號139所表示的胺基酸序列之第2號～第119號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、及由序列識別號139所表示的胺基酸序列之第135號～第243號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (CH6CL6)由序列識別號140所表示的胺基酸序列之第2號～第119號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、及由序列識別號140所表示的胺基酸序列之第135號～第243號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (CH7CL7)由序列識別號155所表示的胺基酸序列之第272號～第389號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、及由序列識別號155所表示的胺基酸序列之第272號～第389號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (CH8CL8)由序列識別號156所表示的胺基酸序列之第277號～第394號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、及由序列識別號156所表示的胺基酸序列之第410號～第516號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區；或 (CH9CL9)由序列識別號157所表示的胺基酸序列之第277號～第394號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號157所表示的胺基酸序列之第410號～第516號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區。 [22]如[18]～[21]中任一者之分子，其中與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段為scFv。
[23]如[22]之分子，其中scFv包含： (CS1)由序列識別號136所表示的胺基酸序列之第2號～第243號的胺基酸序列而成之scFv； (CS2)由序列識別號137所表示的胺基酸序列之第2號～第241號的胺基酸序列而成之scFv； (CS3)由序列識別號147所表示的胺基酸序列之第2號～第243號的胺基酸序列而成之scFv； (CS4)由序列識別號138所表示的胺基酸序列之第2號～第241號的胺基酸序列而成之scFv； (CS5)由序列識別號139所表示的胺基酸序列之第2號～第243號的胺基酸序列而成之scFv； (CS6)由序列識別號140所表示的胺基酸序列之第2號～第243號的胺基酸序列而成之scFv； (CS7)由序列識別號155所表示的胺基酸序列之第272號～第511號的胺基酸序列而成之scFv； (CS8)由序列識別號156所表示的胺基酸序列之第277號～第516號的胺基酸序列而成之scFv；或者是 (CS9)由序列識別號157所表示的胺基酸序列之第277號～第516號的胺基酸序列而成之scFv。
[24]如[18]～[23]中任一者之分子，其包含由N末端朝向C末端依以下順序包含與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv、與CD3特異性地結合的scFv及Fc區(i)而成之第1多肽；以及 包含Fc區(ii)之第2多肽；且較佳為於Fc區(i)與Fc區(ii)會合而成。 [25]如[24]之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如[1]之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。 [26]如[24]之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如[2]之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。 [27]如[24]之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如[3]之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。 [28]如[24]之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如[4]之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。 [29]如[24]之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如[5]之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。
[30]如[19]～[24]中任一者之分子，其中與CD3特異性地結合的scFv係為scFv的如[18]之與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段。 [31]如[19]～[24]中任一者之分子，其中與CD3特異性地結合的scFv係為scFv的如[19]之與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段。 [32]如[19]～[24]中任一者之分子，其中與CD3特異性地結合的scFv係為scFv的如[20]或[21]之與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段。 [33]如[19]～[24]中任一者之分子，其中與CD3特異性地結合的scFv係為scFv的如[23]之與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段。
[34]如[24]～[33]中任一者之分子，其包含選自包含下述群組的胺基酸序列：序列識別號85所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號87所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號88所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號89所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號90所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號91所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號92所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號93所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號94所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號95所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號96所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號86所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號149所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列及序列識別號150所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列。 [35]如[24]～[33]中任一者之分子，其包含選自包含下述群組的胺基酸序列：序列識別號155所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號156所表示的胺基酸序列之第21號～第516號的胺基酸序列、序列識別號157所表示的胺基酸序列之第21號～第516號的胺基酸序列。 [36]如[24]～[34]中任一者之分子，其中第1多肽包含序列識別號85、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、86、149或150所表示的胺基酸序列之第529號～第745號的胺基酸序列。 [37]如[24]～[33]及[35]中任一者之分子，其中第1多肽包含序列識別號155所表示的胺基酸序列之第529號～第745號的胺基酸序列、序列識別號156所表示的胺基酸序列之第534號～第750號的胺基酸序列、或序列識別號157所表示的胺基酸序列之第534號～第750號的胺基酸序列。
[38]如[34]或[36]之分子，其中第1多肽包含選自包含下述群組的胺基酸序列：序列識別號85所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號87所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號88所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號89所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號90所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號91所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號92所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號93所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號94所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號95所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號96所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號86所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號149所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列及序列識別號150所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列。 [39]如[35]或[37]之分子，其中第1多肽包含選自包含下述群組的胺基酸序列：序列識別號155所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列之群組、包含序列識別號156所表示的胺基酸序列之第20號～第750號的胺基酸序列之群組、或包含序列識別號157所表示的胺基酸序列之第20號～第750號的胺基酸序列。 [40]如[24]～[39]中任一者之分子，其中第2多肽係包含序列識別號84所示的胺基酸序列之第20號～第246號的胺基酸序列而成。
[41]如[18]～[23]中任一者之分子，其包含第1多肽、第2多肽、及第3多肽， 第1多肽係由N末端朝向C末端依以下順序包含與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv、與CD3特異性地結合的scFv及Fc區(i)而成， 第2多肽係由包含Fc區(ii)之免疫球蛋白重鏈而成， 第3多肽係由免疫球蛋白輕鏈而成， 較佳為第2多肽與第3多肽會合，且 第1多肽與第2多肽於各自的Fc區會合。 [42]如[41]之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如[1]之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。 [43]如[41]之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如[2]之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。 [44]如[41]之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如[3]之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。 [45]如[41]之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如[4]之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。 [46]如[41]之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如[5]之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。
[47]如[42]～[46]中任一者之分子，其中與CD3特異性地結合的scFv係為scFv的如[18]之與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段。 [48]如[42]～[46]中任一者之分子，其中與CD3特異性地結合的scFv係為scFv的如[19]之與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段。 [49]如[42]～[46]中任一者之分子，其中與CD3特異性地結合的scFv係為scFv的如[20]或[21]記載之與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段。 [50]如[42]～[46]中任一者之分子，其中與CD3特異性地結合的scFv係為scFv的如[23]之與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段。 [51]如[41]～[50]中任一者之分子，其中第2多肽包含序列識別號99所表示的胺基酸序列之胺基酸編號20～242的胺基酸序列。 [52]如[41]～[51]中任一者之分子，其中第3多肽包含序列識別號100所表示的胺基酸序列。
[53]如[41]～[52]中任一者之分子，其中第1多肽包含選自包含下述群組的胺基酸序列：序列識別號85所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號87所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號88所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號89所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號90所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號91所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號92所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號93所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號94所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號95所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號96所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號86所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號149所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列及序列識別號150所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列。
[54]如[41]～[53]中任一者之分子，其中第1多肽包含選自包含下述群組的胺基酸序列：序列識別號85所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號87所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號88所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號89所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號90所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號91所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號92所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號93所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號94所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號95所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號96所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列及序列識別號86所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號149所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列及序列識別號150所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列。
[55]如[18]～[23]中任一者記載之分子，其包含第1多肽、第2多肽、以及第3多肽，且較佳為第1多肽與第2多肽於Fc區(i)與Fc區(ii)會合而且第1多肽於抗體重鏈之可變區及恆定區CH1與第3多肽會合而成， 該第1多肽係由N末端朝向C末端依以下順序包含與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv、與CD3特異性地結合的抗體重鏈之可變區及恆定區CH1以及免疫球蛋白Fc區(i)而成， 該第2多肽係包含免疫球蛋白的鉸鏈區及Fc區(ii)而成， 該第3多肽包含由可變區及恆定區而成之抗體輕鏈。 [56]如[55]之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如[1]之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。 [57]如[55]之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如[2]之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。 [58]如[55]之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如[3]之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。 [59]如[55]之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如[4]之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。 [60]如[55]之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如[5]之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。 [61]如[18]～[21]中任一者之分子，其中與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段為Fab。 [62]如[56]～[61]中任一者之分子，其中與CD3特異性地結合的Fab係為Fab的如[18]之與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段。 [63]如[56]～[61]中任一者之分子，其中與CD3特異性地結合的Fab係為Fab的如[19]之與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段。 [64]如[56]～[61]中任一者之分子，其中與CD3特異性地結合的Fab係為Fab的如[20]或[21]之與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段。 [65]如[55]～[64]中任一者之分子，其中第1多肽係包含序列識別號160所表示的胺基酸序列之第21號～第394號的胺基酸序列而成。 [66]如[55]～[65]中任一者之分子，其中第1多肽包含下述(i)～(iii)中任意1個所記載的胺基酸序列： (i)序列識別號160所表示的胺基酸序列之第20號～第724號的胺基酸序列； (ii)序列識別號197所表示的胺基酸序列之第20號～第719號的胺基酸序列； (iii)序列識別號198所表示的胺基酸序列第20號～第719號的胺基酸序列。 [67]如[55]～[66]中任一者之分子，其中第2多肽係包含序列識別號84所示的胺基酸序列之第20號～第246號的胺基酸序列而成。 [68]如[56]～[67]中任一者之分子，其中第3多肽係包含序列識別號161所表示的胺基酸序列之第21號～第127號的胺基酸序列而成。 [69]如[56]～[68]中任一者之分子，其中第3多肽係包含序列識別號161所表示的胺基酸序列之第21號～第233號的胺基酸序列而成。 [70]如[15]～[69]中任一者之分子，其係於該分子所包含的1個或2個以上之多肽所具有的胺基酸序列中，自該序列的羧基末端有1個或2個胺基酸缺失而成。 [71]一種多核苷酸，其包含編碼如[15]～[70]中任一者之分子所包含的胺基酸序列之核苷酸序列。 [72]一種載體，其包含如[71]之多核苷酸。 [73]一種宿主細胞，其包含如[71]之多核苷酸或如[72]之載體。 [74]一種製造與人類HLA/NY-ESO及人類CD3特異性地結合的分子之方法，其包含：(i)培養[73]之宿主細胞的步驟；及(ii)從步驟(i)中所得之培養物純化抗體或其結合片段的步驟。 [75]一種與人類HLA/NY-ESO及人類CD3特異性地結合的分子，其可藉由如[74]之方法而得到。 [76]一種醫藥組成物，其包含如[15]～[70]及[75]中任一者之分子、如[71]之多核苷酸、如[72]之載體、或如[73]之宿主細胞作為有效成分。 [77]如[14]或[76]之醫藥組成物，其係抗癌劑。 [78]如[77]之醫藥組成物，其中癌症為選自包含腎臟癌、黑色素瘤、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、結膜癌、口腔癌、喉頭癌、咽癌、甲狀腺癌、肺癌(非小細胞肺癌(腺癌、鱗狀上皮細胞癌、大細胞癌)、小細胞肺癌)、乳癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌、闌尾癌、肛門癌、肝癌、膽囊癌、膽管癌、胰臟癌、腎上腺癌、膀胱癌、***癌、子宮癌、***癌、脂肪肉瘤、血管肉瘤、軟骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、伊文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、骨肉瘤、未分化多形性肉瘤(undifferentiated pleomorphic sarcoma)、纖維黏液樣肉瘤、惡性周邊神經鞘腫瘤(malignant peripheral nerve sheath tumor)、後腹膜肉瘤、滑膜肉瘤、子宮肉瘤、胃腸道間質瘤、平滑肌肉瘤、上皮樣肉瘤、B細胞淋巴瘤、T/NK細胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)、骨髓性白血病、淋巴性白血病(lymphocytic leukemia)、骨髓增生性疾病、骨髓增生不良症候群、多發性骨髓瘤、睪丸癌及卵巢癌之群組的1個或2個以上。 [79]如[76]～[78]中任一者之醫藥組成物，其係與其他的藥劑組合而使用。 本說明書包含為本案之優先權的基礎之日本國專利申請編號2020-061476號的揭示內容。 [發明之效果]
如按照本發明，則可得到與HLA-A2/NY-ESO結合的抗體、以及與HLA-A2/NY-ESO結合且與CD3結合的新穎之雙特異性抗體(雙特異性分子)。又，可得到含有該種抗體(分子)作為有效成分的新穎之醫藥組成物。該抗體、或是該分子等具有細胞毒殺活性，作為癌症等之治療劑或預防劑而為有用。
[用以實施發明的形態]
以下，詳細地說明本發明。 1.定義 於本發明中，「基因」係意指包含編碼蛋白質的胺基酸之鹼基序列的核苷酸鏈或其互補鏈，例如為包含編碼蛋白質的胺基酸之鹼基序列的核苷酸鏈或其互補鏈之多核苷酸、寡核苷酸、DNA、mRNA、cDNA、cRNA等包含在「基因」的意義中。該基因為單股、雙股或三股以上之核苷酸，DNA鏈與RNA鏈之集合體(aggregate)、核糖核苷酸(RNA)與去氧核糖核苷酸(DNA)於單股的核苷酸鏈上混在者及包含該種核苷酸鏈的雙股或三股以上之核苷酸亦包含在「基因」的意義中。於本發明中，鹼基序列與核苷酸序列同義。
於本發明中，「多核苷酸」、「核苷酸鏈」、「核酸」及「核酸分子」同義，例如DNA、RNA、探針、寡核苷酸、引子等亦包含在「多核苷酸」的意義中。該多核苷酸係由單股、雙股或三股以上之鏈而成的多核苷酸，DNA鏈與RNA鏈之集合體、核糖核苷酸(RNA)與去氧核糖核苷酸(DNA)於單股的多核苷酸鏈上混在者及包含該種多核苷酸鏈的雙股或三股以上之鏈的集合體亦包含在「多核苷酸」的意義中。
於本發明中，「多肽」、「肽」及「蛋白質」同義。 於本發明中，有時將「抗原」用於「免疫原」之意思。 於本發明中，「細胞」中亦包含源自動物個體之各種細胞、繼代培養細胞、初代培養細胞、細胞株、重組細胞及微生物等。
於本發明中，「抗體」與免疫球蛋白同義。但是，所謂本發明之抗HLA/NY-ESO抗體之情形的「抗體」，係以具有恆定區與可變區的免疫球蛋白之意思使用。抗體若為天然物、或藉由部分或者是完全合成所製造的免疫球蛋白，則不被特別限定。後述之「分子」包含本發明之抗HLA/NY-ESO抗體。
於本發明中，「NY-ESO肽」意指由NY-ESO-1與LAGE-1之第157號至第165號的9胺基酸構成之肽(SLLMWITQC：序列識別號1)。
於本發明中，「HLA-A2/NY-ESO」意指NY-ESO肽及組織相容性白血球抗原-A2(HLA-A2)之複合體，亦標記為「HLA/NY-ESO」。
於本發明中，「抗HLA-A2/NY-ESO抗體」意指與HLA-A2/NY-ESO結合的抗體，換言之為會辨識HLA-A2/NY-ESO的抗體。同樣地，「抗HLA-A2/NY-ESO scFv」意指與HLA/NY-ESO結合，換言之為會辨識HLA-A2/NY-ESO的scFv。「抗HLA-A2/NY-ESO抗體」及「抗HLA-A2/NY-ESO scFv」亦各自標記為「抗HLA/NY-ESO抗體」及「抗HLA/NY-ESO scFv」。
基本的4鏈抗體之結構，係由2個相同的輕鏈(L鏈)、及2個相同的重鏈(H鏈)所構成。輕鏈係藉由1個共價雙硫鍵而與重鏈結合。2個重鏈係因應重鏈的同型(isotype)，而藉由1個或複數之雙硫鍵而彼此結合。各自的輕鏈、重鏈具有持有規律之間隔的鏈內雙硫鍵。於重鏈與輕鏈存有胺基酸序列顯示非常高類似性的恆定區及胺基酸序列之類似性低的可變區。輕鏈係於胺基末端具有後接有恆定區(CL)的可變區(VL)。重鏈係於胺基末端具有後接有3個恆定區(CH1/CH2/CH3)的可變區(VH)。VL與VH成對，CL與重鏈的第一恆定區(CH1)並排。VL與VH成對，而形成單一之抗原結合部位。
就本發明之抗體的恆定區而言，並未特別限定，但就用以治療或預防人類之疾病的本發明之抗體而言，較佳為使用人類抗體。就人類抗體之重鏈恆定區而言，可舉出例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cε等。就人類抗體之輕鏈恆定區而言，可舉出例如Cκ、Cλ等。
Fab包含重鏈之VH與後接於其的CH1、及輕鏈之VL與後接於其的CL。VH與VL包含互補性決定區(CDR)。
Fc(亦稱為Fc區)為重鏈之恆定區的羧基末端區域，包含CH2與CH3，且為二聚體。本發明之Fc可為天然的序列之Fc，亦可為於天然的序列有變異進行的變異型之Fc(稱為「變異型Fc」)，於本發明之多重特異性分子及雙特異性分子中，較佳的Fc區為變異型Fc，更佳為可形成異二聚體之1組的Fc。就1組的Fc而言，可舉出後述之第1多肽所包含的Fc(i)及第2多肽所包含的Fc(ii)之組合，若是1組的Fc可會合(異二聚體形成)，則不受限於該等。
就變異型Fc而言，可例示WO2013/063702所揭示之包含在具有經提升之安定性的異多聚體(heteromultimer)中的變異Fc區(包含異二聚體Fc區)、WO1996/27011所揭示之包含在異種多聚體中的包含由具有「突起」及「空隙」的IgG抗體所誘導之免疫球蛋白的CH3域之Fc、WO2009/089004所揭示之包含藉由將1以上之胺基酸殘基取代為帶電胺基酸而在靜電上有利之異二聚體中包含的CH3域之Fc、WO2014/110601所揭示之包含在使用了立體結構變異及/或pI(等電點)變異之異種二聚體中的異種二聚體Fc區、WO2010/151792所揭示之包含含有使對蛋白質A之結合消失或減少的變異之CH3域的異二聚體之Fc等，但不受限於該等。
可變區由被稱為高度可變區(HVR：hypervariable region)之具有極度之可變性的區域、與藉由該區域而被分離之被稱為架構區(FR：Framework region)之比較不變的區域而成。天然的重鏈與輕鏈之可變區包含藉由3個高度可變區而被接續的4個FR，各鏈之高度可變區藉由FR而與其他的鏈之高度可變區一起被保持為極靠近，有助於抗體之抗原結合部位的形成。
已知於抗體分子的重鏈及輕鏈中有各自3處的互補性決定區(CDR：Complemetarity determining region)。互補性決定區亦稱為高度可變區，於抗體的重鏈及輕鏈之可變區內，為一級結構之變異性特別高的部位，於重鏈及輕鏈的多肽鏈之一級結構上通常各自分離在3個部位。於本發明中，針對抗體之互補性決定區，而將重鏈的互補性決定區自重鏈胺基酸序列之胺基末端側標記為CDRH1、CDRH2、CDRH3，將輕鏈的互補性決定區自輕鏈胺基酸序列之胺基末端側標記為CDRL1、CDRL2、CDRL3。此等之部位在立體結構之上互相鄰接，決定對於會結合之抗原的特異性。
於本發明中，CDR的位置與長度係藉由IMGT之定義(Developmental and Comparative Immunology 27 (2003) 55-77)來決定。
FR為CDR殘基以外的可變區。可變區一般而言具有FR1、FR2、FR3、FR4之4個FR。
重鏈以及輕鏈中包含的CDR與FR係由胺基末端朝向羧基末端，而分別被依FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4、以及FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4的順序配置。
CDR與FR的位置亦可藉由該技術領域中周知的各樣的定義，例如於IMGT以外還可藉由Kabat、Chothia、AbM、contact等之定義來決定。
於本發明中，「抗體的抗原結合片段」意指由重鏈可變區及輕鏈可變區所構成之具有與抗原之結合活性的抗體之部分片段。就「抗體的抗原結合片段」而言，可舉出例如Fab、F(ab’)2 、scFv、Fab’、Fv、單域抗體(sdAb)等之抗原結合片段，但不受限於該等。該抗體的抗原結合片段除了藉由以木瓜酵素、胃蛋白酶等之酵素處理抗體蛋白質的全長分子而獲得者，亦可為使用重組基因而於適當的宿主細胞中所生產的重組蛋白質。於本發明中，「抗體的結合片段」與「抗體的抗原結合片段」同義。
於本發明中，抗體會結合之「部位」、亦即抗體所辨識之「部位」意指抗體所結合或辨識之抗原上的部分肽或部分高次結構。
於本發明中，亦將該部位稱為抗原決定區、抗體的結合部位。於本發明中，「變異抗體」意指具有於原抗體所具有的胺基酸序列中胺基酸取代、缺失、附加(附加中包含***)(以下，總稱為「變異」)而成之胺基酸序列，且與本發明之HLA/NY-ESO結合的多肽。該變異抗體中之變異胺基酸的數目為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40或50個。本發明之「抗體」亦包含該變異抗體。
於本發明中，「1或數個」中之「數個」係指2～10個。 於本說明書中，「分子」係包含上述之抗體、抗體的抗原結合片段之分子，進一步包含由抗體或源自該等之複數之抗原結合片段所形成的多重特異性之分子。
於本說明書中，「多重特異性的分子」、「多重特異性(之)分子」及「多重特異性分子」同義，若為能夠與1個分子上的複數之彼此不同的抗原決定區、及/或2個以上之分子上的彼此不同的抗原決定區結合的分子，則不被特別限定。就多重特異性的分子而言，亦包含含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)之抗體。此種多重特異性的分子中包含：具有不同的2種類以上之重鏈及輕鏈的完全長抗體分子、亦即IgG型多重特異性分子；及包含具有2種類以上之VL及VH之抗原結合片段的分子、亦即組合Fab、Fab’、Fv、scFv、sdAb等而衍生的分子、亦即串聯scFv、雙抗體(diabody)、單股雙抗體、三抗體(triabody)等，但不受限於此等。作為多重特異性分子，亦包含其他藉由使抗原結合片段基因上、或是化學上連結不具有免疫球蛋白骨架而具有抗原結合性之蛋白質而產生的分子。於本發明中，除了不包含抗體或其抗原結合片段之情形，有時亦將此種多重特異性分子稱為「多重特異性的抗體」、「多重特異性抗體」等。
就本發明之抗HLA/NY-ESO抗體或該抗體的抗原結合片段、或是本發明之分子產生的活性、性質而言，可舉出例如生物學活性、物理化學性質(亦稱為物性)等，具體而言，可舉出細胞毒殺活性、ADCC活性、抗腫瘤活性(皆於後述)等之各種生物活性、對於抗原或抗原決定區之結合活性、製造或保存時的安定性、熱安定性等之物性。
於本發明中，「於嚴格條件下雜交」意指在含5×SSC的溶液中於65℃進行雜交，繼而以各自清洗之條件或與其同等之條件在含2×SSC-0.1%SDS的水溶液中於65℃進行20分鐘、在含0.5×SSC-0.1%SDS的水溶液中於65℃進行20分鐘、以及在含0.2×SSC-0.1%SDS的水溶液中於65℃進行20分鐘雜交。SSC為150mMNaCl-15mM檸檬酸鈉的水溶液，而n×SSC意指n倍濃度的SSC。
於本發明中「細胞毒殺」係指以某種形式於細胞引起病理的變化，且不只是直接的外傷而意指DNA的切斷或鹼基之二聚體的形成、染色體的切斷、細胞***構造的損傷、各種酵素活性的降低等所有的細胞之結構或機能上的損傷。於本發明中「細胞毒殺活性」意指引起上述細胞毒殺。
於本發明中「抗體依賴性細胞毒殺活性」係指「抗體依賴性細胞毒殺作用(antibody dependent cellular cytotoxicity；ADCC)活性」，意指NK細胞透過抗體而毒殺腫瘤細胞等之標的細胞的作用活性。
於本發明中「藉由T細胞重定向之細胞毒殺活性」意指透過包含抗腫瘤抗原抗體與抗HLA/NY-ESO抗體的多重特異性的分子，而引起上述細胞毒殺。亦即意指抗腫瘤抗原抗體與標的腫瘤細胞結合，且抗HLA/NY-ESO抗體與T細胞結合，藉此而使標的腫瘤細胞與T細胞的距離接近，透過T細胞活性化而誘導細胞毒殺。該分子可包含在醫藥組成物中。
2.抗原 2-1.HLA/NY-ESO抗原 於本發明中，「HLA/NY-ESO」係與HLA/NY-ESO蛋白質以相同之意義使用。
HLA/NY-ESO為HLA-A2、β2-微球蛋白、NY-ESO肽之三者複合體。HLA-A2為HLA之對偶基因的一種，已知為在高加索人種(Caucasian)頻率最高的對偶基因。HLA係在細胞的內質網內形成β2-微球蛋白與自體蛋白之肽片段的三者複合體，而於細胞外呈現，且於T細胞之TCR(T細胞受體)受到辨識。NY-ESO肽(SLLMWITQC：序列識別號1，圖8)為由NY-ESO-1、LAGE-1之第157號至第165號的9胺基酸而成之肽，有報告其由HLA-A2呈現。
2-2.CD3抗原 於本發明中，「CD3」係以與CD3蛋白質相同之意義使用。 CD3係作為多分子T細胞受體複合體的一部分而於T細胞上表現，為γ鏈、δ鏈、ε鏈、ζ鏈、η鏈之5種類的多肽(分子量依序為25000-28000、21000、20000、16000、22000)的複合體。
就CD3複合體而言，可舉出γ、δ、ε、ζ、η鏈。此等亦被稱為次單元。抗CD3抗體藉由與T細胞結合，而透過T細胞活性化來誘導細胞毒殺。許多的抗CD3抗體與CD3ε結合。
各自於NCBI/基因銀行以登錄號：NM_000733(NM_000733.3)登錄編碼人類CD3ε之cDNA的核苷酸序列，於NCBI/GenPept以登錄號：NP_000724(NM_000724.1)登錄人類CD3ε的胺基酸序列。於基因銀行以登錄號：NM_001283615.1登錄編碼食蟹猴CD3之cDNA的核苷酸序列。於序列表的序列識別號151(圖147)記載人類CD3ε的胺基酸序列。
2-3.抗原之調製 本發明中使用之上述抗原蛋白質：HLA/NY-ESO、CD3(以下亦將HLA/NY-ESO、CD3整合而記載為該抗原蛋白質)，係可藉由從動物組織(包含體液)、源自該組織的細胞或者是該細胞培養物之純化及單離、基因重組、生體外轉譯(in vitro translation)、化學合成等來調製。
該抗原蛋白質的cDNA可藉由所謂的PCR法而取得，其係例如以表現該抗原蛋白質的mRNA之臟器的cDNA基因庫為模板，使用特異性地增幅該抗原蛋白質的cDNA之引子而進行聚合酶連鎖反應(以下稱為「PCR」)(Saiki,R. K.,et al.,Science(1988)239,487-49)。
該抗原蛋白質的cDNA亦包含：與包含與編碼於人類或大鼠表現的該抗原蛋白質之核苷酸序列互補的核苷酸序列之多核苷酸於嚴格條件下雜交，且編碼具有與該抗原蛋白質同等之生物活性的蛋白質之多核苷酸。
進而，該抗原蛋白質的cDNA亦包含：為從於人類或大鼠表現的該抗原蛋白質基因座所轉錄之剪接變異體或與其於嚴格條件下雜交之多核苷酸，且編碼具有與該抗原蛋白質同等之生物活性的蛋白質之多核苷酸。
該抗原蛋白質基因的核苷酸序列亦包含編碼下述蛋白質之核苷酸序列：由在人類或大鼠之該抗原蛋白質的胺基酸序列、或自此等之序列除去訊息序列的胺基酸序列中有1至數個胺基酸經取代、缺失或附加的胺基酸序列而成，且具有與該抗原蛋白質同等之生物活性的蛋白質。
該抗原蛋白質亦包含：由從人類或大鼠之該抗原蛋白質的基因座所轉錄之剪接變異體所編碼的胺基酸序列或在該胺基酸序列中有1或數個胺基酸經取代、缺失或附加的胺基酸序列而成，且具有與該抗原蛋白質同等之生物活性的蛋白質。
2-4.對抗原蛋白質之結合特異性 本發明之抗HLA/NY-ESO抗體及其抗原結合片段等會辨識HLA/NY-ESO。亦即，與HLA/NY-ESO抗原結合。並未知悉HLA/NY-ESO有在小鼠、大鼠、食蟹猴等之非人類動物的存在。
本發明之多重特異性分子所包含的抗CD3抗體及其結合片段等會辨識CD3抗原，亦即與CD3抗原結合。該抗CD3抗體等較佳為與人類CD3、猴CD3等結合，更佳為與人類CD3及食蟹猴CD3結合。另一方面，該較佳的抗CD3抗體並不與大鼠及/或小鼠的CD3結合。
本發明之多重特異性分子的抗腫瘤活性，係例如可(i)對經移植人類末梢血液淋巴細胞的非人類動物、較佳為大鼠或小鼠、更佳為內在性之效應功能(effector function)不全的大鼠或小鼠(例如，免疫不全的大鼠或小鼠)，移植人類癌細胞、人類癌組織等；或是(ii)對經基因嵌入人類CD3基因的非人類動物、較佳為大鼠或小鼠，移植經基因導入HLA及NY-ESO的小鼠癌細胞等，而進行評價。可藉由使用該免疫不全動物或基因嵌入動物來進行評價，而利用小鼠及/或大鼠的活體來實施各種測定、免疫組織化學等，此係於包含本發明之多重特異性分子的醫藥、非臨床開發等中為較佳。 於本發明中「辨識」、亦即「結合」意指非為非特異性吸附之結合。就是否辨識、亦即是否結合的判定基準而言，可舉出例如解離常數(Dissociation Constant：以下稱為「KD」)。本發明之較佳的抗體等對於HLA/NY-ESO或CD3之KD值為1×10-5 M以下、5×10-6 M以下、2×10-6 M以下、1×10-6 M以下，對於HLA/NY-ESO之較佳的KD值為5×10-7 M以下、2×10-7 M以下、1×10-7 M以下、5×10-8 M以下、2×10-8 M以下、1×10-8 M以下、5×10-9 M以下、或2×10-9 M以下，更佳為1×10-9 M以下。作為具有優異之抗原結合活性的本發明之抗HLA/NY-ESO scFv，可例示NYA-1143、NYA-2023、NYA-2143、NYA-2044、NYA-2045、NYA-2060、NYA-2061、NYA-3061，NYA-1143、NYA-2044、NYA-2045及NYA-2143等對於HLA/NY-ESO之KD值為1×10-9 M以下(實施例4等)。
本發明中之抗原與抗體的結合，可藉由SPR法、BLI法等之活體分子間相互作用解析系統、或是ELISA法、RIA法等來測定或判定。細胞表面上表現之抗原與抗體的結合，可藉由流動式細胞測量術等來測定。
SPR法(表面電漿共振(Surface Plasmon Resonance)解析法)，係藉由反應動力學的(kinetics)解析來測量結合速率常數(Ka值)與解離速率常數(Kd值)，藉此而作為求得為親和性之指標的解離常數(KD值)等之分析手法使用。就用於SPR解析的機器而言，可例示Biacore(商標)(GE Healthcare公司製)、ProteOn(商標)(BioRad公司製)、SPR-Navi(商標)(BioNavis公司製)、Spreeta(商標)(Texas Instruments公司製)、SPRi-PlexII(商標)(HORIBA公司製)、Autolab SPR(商標)(Metrohm公司製)等。
BLI法(生物膜層干涉技術(BioLayer Interferometry))，係使用生物膜層干涉之測量活體分子間相互作用的方法。就用於使用BLI法之相互作用解析的機器而言，可例示Octet系統(Pall ForteBio公司製)等。
ELISA(酵素結合免疫吸附分析法(Enzyme-linked ImmunoSorbent Assay))法係以特異抗體或是抗原捕捉試料溶液中所包含之目標的抗原或是抗體，並且利用酵素反應來檢出、定量的方法。將經酵素標識之抗原或是抗體納入反應系統，而檢出酵素活性。於酵素活性的檢出，係使用因反應而吸光光譜會變化的基質，以吸光度測定來進行數值化。
細胞-ELISA係將位於細胞表面之測定對象以整個細胞來捕捉，並且利用酵素反應來檢出、定量的方法。
RIA法(放射免疫分析(Radio Immunoassay)法)係可藉由使用放射性物質標識抗體，且測定來自抗體之放射能，而進行抗體的定量。
流動式細胞測量術係使細胞分散於流體中，將該流體稀薄地流動而光學性地分析個別細胞的手法。以螢光色素所標識的抗體係藉由抗原抗體反應而與細胞表面抗原結合，且測定由結合於細胞之經標識的抗體所致螢光強度，藉此而定量抗體的抗原結合性。
本發明之抗HLA/NY-ESO抗體等之中，作為具有優異之抗原結合特異性者，可例示為抗HLA/NY-ESO scFv的NYA-0001、NYA-1143、NYA-1163、NYA-2023、NYA-2027、NYA-2035、NYA-2044、NYA-2045、NYA-2047、NYA-2048、NYA-2060、NYA-2061、NYA-2143及NYA-3061(實施例6等)。
3.與HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段 3-1　抗HLA/NY-ESO或其結合片段 本發明提供：辨識HLA/NY-ESO且進行結合的抗體或其結合片段。
如前所述，HLA/NY-ESO係包含HLA-A2與9mer之NY-ESO肽(SLLMWITQC：序列識別號1)的複合體。NY-ESO肽係源自為細胞內蛋白質且為癌症睪丸抗原(Cancer-Testis Antigens)之NY-ESO-1或LAGE-1的肽。HLA/NY-ESO係於癌細胞表面呈現。
本發明之抗HLA/NY-ESO抗體及該抗體的抗原結合片段(以下亦記載為本發明之抗體等)可為單株抗體及多株抗體之任一者。本發明之單株抗體的類型並未特別限定，可舉出例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等之IgG、IgM、IgA1、IgA2等之IgA、IgD、Ig等。單株抗體的同型及亞型(subclass)可藉由例如歐氏擴散法(Ouchterlony method)、ELISA法、RIA法等來決定。就本發明之單株抗體而言，可舉出源自非人類動物的抗體(非人類動物抗體)、人類抗體、嵌合化抗體(亦稱為「嵌合抗體」)、人類化抗體等，較佳為可使用人類抗體。本發明之抗體的範圍中亦包含抗體的變異體(後述之「變異抗體」)，例如人類抗體的範圍中亦包含人類變異抗體。
就非人類動物抗體而言，可舉出源自哺乳類、鳥類等之脊椎動物之抗體等。就源自哺乳類的抗體而言，可舉出源自小鼠抗體、大鼠抗體等之齧齒類的抗體等。就源自鳥類的抗體而言，可舉出雞抗體等。
就嵌合化抗體而言，可舉出使源自非人類動物抗體的可變區與人類抗體(人類免疫球蛋白)恆定區結合而成之抗體等，但不受限於該等。
就人類化抗體而言，可舉出將非人類動物抗體之可變區中之CDR移植至人類抗體(人類免疫球蛋白之可變區)者、除了CDR以外亦將非人類動物抗體之架構區的序列一部分移植至人類抗體者、將源自該等之任意的非人類動物抗體的1個或2個以上之胺基酸以人類型之胺基酸取代者等，但不受限於該等。
抗體可利用習知的種種方法來製作。作為習知的方法，可藉由使用融合瘤的方法或藉由細胞免疫法等來製作，且藉由基因重組的手法來製作。又，亦已知悉取得源自從人類抗體庫選出的噬菌體展現(Phage display)之人類抗體的方法。例如，可使用噬菌體展現法，其係使人類抗體之可變區作為scFv表現於噬菌體表面，而選擇與抗原結合的噬菌體。可藉由解析以與抗原結合所選出之噬菌體的基因，而決定編碼與抗原結合的人類抗體之可變區之DNA序列。倘若明白與抗原結合的scFv的DNA序列，則可藉由製作具有該序列的表現載體，且導入至適當的宿主而使其表現來取得人類抗體(WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu.Rev.Immunol(1994)12,433-455)。
亦可使用如此進行所得之具有高活性的抗體作為先導抗體(lead antibody)，且使編碼該先導抗體之基因變異，而製作更高活性的變異體(後述之「變異抗體」)。
就本發明之抗HLA/NY-ESO抗體或其抗原結合片段之重鏈中包含的CDRH1～CDRH3而言，可舉出較佳為由序列識別號54(圖61)所表示的胺基酸序列而成之CDRH1、由序列識別號55(圖61)所表示的胺基酸序列而成之CDRH2、以及由序列識別號56(圖61)所表示的胺基酸序列或者是由序列識別號56(圖61)所表示的胺基酸序列中第6號之胺基酸為N(Asn)的胺基酸序列而成之重鏈CDRH3的組合。可舉出更佳為由序列識別號6(圖13)所表示的胺基酸序列而成之NYA-0001重鏈可變區、由序列識別號18(圖25)所表示的胺基酸序列而成之NYA-0082重鏈可變區、由序列識別號27(圖34)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140而成之NYA-2023重鏈可變區、由序列識別號28(圖35)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140而成之NYA-2027重鏈可變區、由序列識別號29(圖36)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140而成之NYA-1143重鏈可變區、由序列識別號26(圖33)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140而成之NYA-1163重鏈可變區、由序列識別號27(圖34)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140而成之NYA-2023重鏈可變區、由序列識別號28(圖35)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140而成之NYA-2027重鏈可變區、由序列識別號36(圖43)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140而成之NYA-2035重鏈可變區、由序列識別號47(圖54)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140而成之NYA-2044重鏈可變區、由序列識別號48(圖55)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140而成之NYA-2045重鏈可變區、由序列識別號50(圖57)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140而成之NYA-2047重鏈可變區、由序列識別號51(圖58)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140而成之NYA-2048重鏈可變區、由序列識別號52(圖59)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140而成之NYA-2060重鏈可變區、由序列識別號53(圖60)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140而成之NYA-2061重鏈可變區、或由序列識別號30(圖37)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140而成之NYA-2143重鏈可變區中包含的CDRH1～CDRH3的組合。 進一步可舉出由序列識別號156(圖152)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140而成之NYA-3061重鏈可變區中包含的CDRH1～CDRH3的組合。
就本發明之抗HLA/NY-ESO抗體或其抗原結合片段之輕鏈中包含的CDRL1～CDRL3而言，可舉出較佳為由序列識別號57(圖61)所表示的胺基酸序列或者是由序列識別號57(圖61)所表示的胺基酸序列中第7號之胺基酸為W(Trp)或者是第8號之胺基酸為K(Lys)的胺基酸序列而成之CDRL1、由序列識別號58(圖61)所表示的胺基酸序列而成之CDRL2、以及由序列識別號59(圖61)所表示的胺基酸序列或者是由序列識別號59(圖61)所表示的胺基酸序列中第2號之胺基酸為A(Ala)或者是S(Ser)的胺基酸序列而成之CDRL3的組合。
可舉出更佳為由序列識別號8(圖15)所表示的胺基酸序列而成之NYA-0001輕鏈可變區、由序列識別號20(圖27)所表示的胺基酸序列而成之NYA-0082輕鏈可變區、由序列識別號29(圖36)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號156～266而成之NYA-1143輕鏈可變區、由序列識別號26(圖33)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號156～266而成之NYA-1163輕鏈可變區、由序列識別號27(圖34)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號156～266而成之NYA-2023輕鏈可變區、由序列識別號28(圖35)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號156～266而成之NYA-2027輕鏈可變區、由序列識別號36(圖43)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號156～266而成之NYA-2035輕鏈可變區、由序列識別號47(圖54)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號156～266而成之NYA-2044輕鏈可變區、由序列識別號48(圖55)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號156～266而成之NYA-2045輕鏈可變區、由序列識別號50(圖57)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號156～266而成之NYA-2047輕鏈可變區、由序列識別號51(圖58)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號156～266而成之NYA-2048輕鏈可變區、由序列識別號52(圖59)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號156～266而成之NYA-2060輕鏈可變區、由序列識別號53(圖60)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號156～266而成之NYA-2061輕鏈可變區、或由序列識別號30(圖37)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號156～266而成之NYA-2143輕鏈可變區中包含的CDRL1～CDRL3的組合。 進一步可舉出由序列識別號156(圖152))所表示的胺基酸序列之胺基酸編號161～271而成之NYA-3061輕鏈可變區中包含的CDRL1～CDRL3的組合。
就本發明之抗HLA/NY-ESO抗體或其抗原結合片段之重鏈中包含的CDRH1～CDRH3及輕鏈中包含的CDRL1～CDRL3而言，可舉出較佳為：由序列識別號54(圖61)所表示的胺基酸序列而成之CDRH1、由序列識別號55(圖61)所表示的胺基酸序列而成之CDRH2、由序列識別號56(圖61)所表示的胺基酸序列或者是由序列識別號56(圖61)所表示的胺基酸序列中第6號之胺基酸為N(Asn)的胺基酸序列而成之重鏈CDRH3；由序列識別號57(圖61)所表示的胺基酸序列或者是由序列識別號57(圖61)所表示的胺基酸序列中第7號之胺基酸為N(Asn)及/或者是第8號之胺基酸為K(Lys)的胺基酸序列而成之CDRL1、由序列識別號58(圖61)所表示的胺基酸序列而成之CDRL2、以及由序列識別號59(圖61)所表示的胺基酸序列或者是由序列識別號59所表示的胺基酸序列中第2號之胺基酸為A(Ala)或者是S(Ser)的胺基酸序列而成之CDRL3的組合。可舉出更佳為由以序列識別號6及8所各自表示的胺基酸序列而成之NYA-0001重鏈可變區及輕鏈可變區、由序列識別號29(圖36)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140及156～266而成之NYA-1143重鏈可變區及輕鏈可變區、由序列識別號26(圖33)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140及156～266而成之NYA-1163重鏈可變區及輕鏈可變區、由序列識別號27(圖34)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140及156～266而成之NYA-2023重鏈可變區及輕鏈可變區、由序列識別號28(圖35)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140及156～266而成之NYA-2027重鏈可變區及輕鏈可變區、由序列識別號36(圖43)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140及156～266而成之NYA-2035重鏈可變區及輕鏈可變區、由序列識別號47(圖54)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140及156～266而成之NYA-2044重鏈可變區及輕鏈可變區、由序列識別號48(圖55)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140及156～266而成之NYA-2045重鏈可變區及輕鏈可變區、由序列識別號50(圖57)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140及156～266而成之NYA-2047重鏈可變區及輕鏈可變區、由序列識別號51(圖58)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140及156～266而成之NYA-2048重鏈可變區及輕鏈可變區、由序列識別號52(圖59)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140及156～266而成之NYA-2060重鏈可變區及輕鏈可變區、由序列識別號53(圖60)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140及156～266而成之NYA-2061重鏈可變區及輕鏈可變區、或由序列識別號30(圖37)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140及156～266而成之NYA-2143重鏈可變區及輕鏈可變區中所各自包含的CDRH1～CDRH3及CDRL1～CDRL3的組合。 進一步可舉出由序列識別號156(圖152)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140及161～271而成之NYA-3061重鏈可變區及輕鏈可變區中所各自包含的CDRH1～CDRH3及CDRL1～CDRL3的組合。
就本發明之抗HLA/NY-ESO抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區而言，可舉出包含上述重鏈CDR或彼等之組合者作為較佳例，可例示更佳為NYA-0001重鏈可變區、NYA-0082重鏈可變區、NYA-1143重鏈可變區、NYA-1163重鏈可變區、NYA-2023重鏈可變區、NYA-2027重鏈可變區、NYA-2035重鏈可變區、NYA-2044重鏈可變區、NYA-2045重鏈可變區、NYA-2047重鏈可變區、NYA-2048重鏈可變區、NYA-2060重鏈可變區、NYA-2061重鏈可變區、NYA-2143重鏈可變區、及NYA-3061重鏈可變區。各自的重鏈可變區的胺基酸序列如上所述。
就本發明之抗HLA/NY-ESO抗體或其抗原結合片段之輕鏈可變區而言，可舉出包含上述輕鏈CDR或彼等之組合者作為較佳例，可例示更佳為NYA-0001輕鏈可變區、NYA-0082輕鏈可變區、NYA-1143輕鏈可變區、NYA-1163輕鏈可變區、NYA-2023輕鏈可變區、NYA-2027輕鏈可變區、NYA-2035輕鏈可變區、NYA-2044輕鏈可變區、NYA-2045輕鏈可變區、NYA-2047輕鏈可變區、NYA-2048輕鏈可變區、NYA-2060輕鏈可變區、NYA-2061輕鏈可變區、NYA-2143輕鏈可變區、及NYA-3061輕鏈可變區。各自的輕鏈可變區的胺基酸序列如上所述。
就本發明之抗HLA/NY-ESO抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區及輕鏈可變區而言，可舉出包含上述重鏈及輕鏈的CDR或彼等之組合者作為較佳例，可例示更佳為NYA-0001重鏈可變區及輕鏈可變區、NYA-0082重鏈可變區及輕鏈可變區、NYA-1143重鏈可變區及輕鏈可變區、NYA-1163重鏈可變區及輕鏈可變區、NYA-2023重鏈可變區及輕鏈可變區、NYA-2027重鏈可變區及輕鏈可變區、NYA-2035重鏈可變區及輕鏈可變區、NYA-2044重鏈可變區及輕鏈可變區、NYA-2045重鏈可變區及輕鏈可變區、NYA-2047重鏈可變區及輕鏈可變區、NYA-2048重鏈可變區及輕鏈可變區、NYA-2060重鏈可變區及輕鏈可變區、NYA-2061重鏈可變區及輕鏈可變區、及NYA-2143重鏈可變區及輕鏈可變區的組合、及NYA-3061重鏈可變區及輕鏈可變區的組合。
就本發明之抗HLA/NY-ESO抗體或其抗原結合片段之重鏈而言，可舉出包含上述較佳或更佳的重鏈可變區者作為較佳例，可例示更佳為NYA-0001重鏈、NYA-0082重鏈、NYA-1143重鏈、NYA-1163重鏈、NYA-2023重鏈、NYA-2027重鏈、NYA-2035重鏈、NYA-2044重鏈、NYA-2045重鏈、NYA-2047重鏈、NYA-2048重鏈、NYA-2060重鏈、NYA-2061重鏈、NYA-2143重鏈、及NYA-3061重鏈。
就本發明之抗HLA/NY-ESO抗體或其抗原結合片段之輕鏈而言，可舉出包含上述較佳或更佳的輕鏈可變區者作為較佳例，可例示更佳為NYA-0001輕鏈、NYA-0082輕鏈、NYA-1143輕鏈、NYA-1163輕鏈、NYA-2023輕鏈、NYA-2027輕鏈、NYA-2035輕鏈、NYA-2044輕鏈、NYA-2045輕鏈、NYA-2047輕鏈、NYA-2048輕鏈、NYA-2060輕鏈、NYA-2061輕鏈、NYA-2143輕鏈、及NYA-3061輕鏈。
就本發明之抗HLA/NY-ESO抗體或其抗原結合片段之重鏈及輕鏈而言，可舉出各自包含上述較佳或更佳的重鏈可變區及輕鏈可變區者作為較佳例，可例示更佳為NYA-0001、NYA-1143、NYA-1163、NYA-2023、NYA-2027、NYA-2035、NYA-2044、NYA-2045、NYA-2047、NYA-2048、NYA-2060、NYA-2061、NYA-2143、及NYA-3061之重鏈及輕鏈的組合。
抗體的抗原結合片段意指該抗體所具有的機能之中至少保持抗原結合性之片段或其修飾物。就該抗體的機能而言，一般來說可舉出抗原結合活性、調節抗原活性的活性、抗體依賴性細胞毒殺活性及補體依賴性細胞毒殺活性等。就本發明之抗體等及作成包含本發明之抗體等的多重特異性的分子之情形的機能而言，可舉出例如T細胞的重定向、T細胞的活性化、因將T細胞活性化所致癌細胞之細胞毒殺活性。
就抗體的抗原結合片段而言，若為該抗體所具有的活性之中至少保持抗原結合性之該抗體的片段，則不被特別限定，但可舉出例如使Fab、Fab’、F(ab’)2 、Fv、重鏈及輕鏈之Fv以適當的連接子連結而成的單股Fv(scFv)、單域抗體(sdAb)、等，但不受限於該等。如同保有連接子部分的scFv，包含本發明之抗體的抗原結合片段以外的部分的分子亦包含在本發明之抗體的抗原結合片段的意義中。
抗體蛋白質的胺基末端及/或羧基末端之胺基酸有1或者是數個或其以上缺失而成，且保持該抗體所具有的機能之至少一部分的分子，亦包含在抗體的抗原結合片段的意義中。本發明之抗體或者是其抗原結合片段、或其修飾物(後述)亦包含該種抗體的抗原結合片段的修飾物。
本發明之抗體或其抗原結合片段之一個樣態為scFv。scFv係藉由將抗體的重鏈可變區與輕鏈可變區以多肽的連接子連結而可獲得(Pluckthun A.The Pharmacology of Monoclonal Antibodies113,Rosenburg及Moore編,Springer Verlag,New York,269-315(1994), Nature Biotechnology(2005),23,1126-1136)。又，亦可使用以多肽連接子使2個scFv結合而製作的串聯scFv作為雙特異性分子。進一步亦可使用由3個以上之scFv而成的三抗體等作為多重特異性分子。
就對HLA/NY-ESO特異性的scFv(亦稱為「抗HLA/NY-ESO scFv」)而言，可例示較佳為包含上述CDRH1～CDRH3及CDRL1～CDRL3者，可例示更佳為包含上述重鏈可變區及輕鏈可變區者，可例示更進一步較佳為NYA-0001(序列識別號70(圖71)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～266)、NYA-0082(序列識別號18(圖25)所表示的胺基酸序列及序列識別號20(包含圖27所表示的胺基酸序列)、NYA-1143(序列識別號29(圖36)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～266)、NYA-1163(序列識別號26(圖33)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～266)、NYA-2023(序列識別號27(圖34)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～266)、NYA-2027(序列識別號28(圖35)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～266)、NYA-2035(序列識別號36(圖43)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～266)、NYA-2044(序列識別號47(圖54)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～266)、NYA-2045(序列識別號48(圖55)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～266)、NYA-2047(序列識別號50(圖57)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～266)、NYA-2048(序列識別號51(圖58)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～266)、NYA-2060(序列識別號52(圖59)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～266)、NYA-2061(序列識別號53(圖60)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～266)、及NYA-2143(序列識別號30(圖37)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～266)。進一步可例示NYA-3061(序列識別號156(圖152)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～271)。
抗HLA/NY-ESO scFv之較佳的樣態中包含FLAG-His標記融合於羧基末端側者(亦僅稱為「標記附加物」)。就較佳的標記附加物而言，可舉出NYA-0001標記附加物(序列識別號70(圖71)之胺基酸編號20～292)、NYA-1143標記附加物(序列識別號29(圖36)之胺基酸編號20～292)、NYA-1163標記附加物(序列識別號26(圖33)之胺基酸編號20～292)、NYA-2023標記附加物(序列識別號27(圖34)之胺基酸編號20～292)、NYA-2027標記附加物(序列識別號28(圖35)之胺基酸編號20～292)、NYA-2035標記附加物(序列識別號36(圖43)之胺基酸編號20～292)、NYA-2044標記附加物(序列識別號47(圖54)之胺基酸編號20～292)、NYA-2045標記附加物(序列識別號48(圖55)之胺基酸編號20～292)、NYA-2047標記附加物(序列識別號50(圖57)之胺基酸編號20～292)、NYA-2048標記附加物(序列識別號51(圖58)之胺基酸編號20～292)、NYA-2060標記附加物(序列識別號52(圖59)之胺基酸編號20～292)、NYA-2061標記附加物(序列識別號53(圖60)之胺基酸編號20～292)、及NYA-2143標記附加物(序列識別號30(圖37)之胺基酸編號20～292)。
彼等之中，NYA-2023及其標記附加物、NYA-2047及其標記附加物、NYA-2048及其標記附加物、NYA-2060及其標記附加物、以及NYA-2061及其標記附加物，係於Fc附加型雙特異性分子中，具有優異之生物活性、物性等，為更佳。
又，使抗HLA/NY-ESO scFv及其標記附加物於宿主細胞中表現之情形，可使訊息肽附加於其胺基末端。就經訊息肽附加之抗HLA/NY-ESO scFv標記附加物的胺基酸序列而言，可舉出序列識別號70、29、26～28、36、47、48、50～53及30(圖71、36、33～35、43、54、55、57～60及37)。
scFv可藉由噬菌體展現法(Nature Biotechnology(2005),23,(9),p.1105-1116)來取得，其係使抗體之可變區作為單股抗體(scFv)表現於噬菌體表面，而選擇與抗原結合的噬菌體。可藉由解析以與抗原結合所選出之噬菌體的基因，而決定編碼與抗原結合的人類抗體之可變區之DNA序列。倘若明白與抗原結合的scFv的DNA序列，則可藉由製作具有該序列的表現載體，且導入至適當的宿主而使其表現來取得人類抗體(WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu.Rev.Immunol(1994)12,p.433-455、Nature Biotechnology(2005)23(9),p.1105-1116)。
本發明之抗體亦可為具有單一之重鏈可變區而不具輕鏈序列的抗體。此種抗體被稱為單域抗體(single domain antibody：sdAb)或奈米抗體(nanobody)，有報告其保持抗原結合能(Muyldemans S.et.al.,Protein Eng.,(1994)7(9),1129-35,Hamers-Casterman C.et.al.,Nature(1993)363(6428),446-448)。此等之抗體亦包含在本發明中之抗體的抗原結合片段的意義中。
又，本發明中包含將抗體之重鏈及輕鏈的全長序列使用適當的連接子而連結的單股免疫球蛋白(single chain immunoglobulin)(Lee,H-S,et.al.,Molecular Immunology(1999)36,61-71;Shirrmann,T.et.al.,mAbs(2010),2(1),1-4)。此種單股免疫球蛋白能夠藉由二聚體化，而保持與原來為四聚體之抗體類似的結構與活性。本發明之抗HLA/NY-ESO抗體亦可為單股免疫球蛋白。 於本發明之scFv中，亦可重鏈可變區及輕鏈可變區形成雙硫鍵。
本發明之抗HLA/NY-ESO抗體若與HLA/NY-ESO結合，則亦可為由源自複數之不同抗體之部分所構成的抗體，可舉出例如，在複數之不同抗體間交換重鏈及/或輕鏈而成者、交換重鏈及/或輕鏈的全長而成者、只交換可變區或只交換恆定區而成者、交換CDR的全部或只交換一部分而成者等。嵌合化抗體的重鏈可變區與輕鏈可變區亦可源自不同的本發明之抗HLA/NY-ESO抗體。人類化抗體的重鏈及輕鏈之可變區中之重鏈CDR1至重鏈CDR3以及輕鏈CDR1至輕鏈CDR3，亦可源自2種或其以上之本發明之抗HLA/NY-ESO抗體。人類抗體的重鏈及輕鏈之可變區中之重鏈CDR1至重鏈CDR3以及輕鏈CDR1至輕鏈CDR3，亦可為2種或其以上之本發明之抗HLA/NY-ESO抗體所具有的之CDR的組合。
包含由後述多核苷酸中所含的核苷酸序列所編碼之胺基酸序列，且與HLA/NY-ESO結合的抗體亦包含在本發明之抗HLA/NY-ESO抗體中，其中前述多核苷酸與包含編碼本發明之抗HLA/NY-ESO抗體中包含的胺基酸序列之核苷酸序列的多核苷酸之互補鏈於嚴格條件下雜交。
亦可為包含與後述胺基酸序列90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%以上相同之胺基酸序列，且與HLA/NY-ESO結合的抗體或其抗原結合片段，其中上述胺基酸序列為本發明之抗HLA/NY-ESO抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區中包含的胺基酸序列(較佳為序列識別號27所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140的胺基酸序列、序列識別號38所表示的胺基酸序列、序列識別號39所表示的胺基酸序列、或序列識別號160、序列識別號197或者是序列識別號198所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140的胺基酸序列)、及/或輕鏈可變區中包含的胺基酸序列(較佳為序列識別號27所表示的胺基酸序列之胺基酸編號156～266的胺基酸序列、序列識別號52所表示的胺基酸序列之胺基酸編號156～266的胺基酸序列、序列識別號40所表示的胺基酸序列、序列識別號160所表示的胺基酸序列之胺基酸編號161～271的胺基酸序列、或序列識別號197或者是序列識別號198所表示的胺基酸序列之胺基酸編號156～266的胺基酸序列)。
相較於藉由IMGT的定義來決定之情形，使用與IMGT不同的定義(例如Kabat、Chothia、AbM、Contact等)來決定之情形，輕鏈可變區的位置與長度係有時會於藉由IMGT的定義而決定之該輕鏈可變區胺基酸序列的羧基末端進一步包含1個或2個以上之胺基酸，例如精胺酸或甘胺酸。本發明之抗體或其結合片段亦包含具有此種輕鏈可變區的抗體或其結合片段。
就本發明之抗體等而言，亦可為對本發明之抗HLA/NY-ESO抗體的結合片段導入變異，而使對於HLA/NY-ESO、尤其是人類及/或食蟹猴的HLA/NY-ESO之結合能最佳化者。作為導入變異之具體的方法，可舉出使用易錯(error-prone)PCR法之隨機突變誘發法、使用NNK庫(NNK library)之部位特異性胺基酸變異導入、利用結構資訊之部位特異性變異導入、及彼等之組合。
3-2.抗HLA/NY-ESO抗體之變異體(變異抗體) 本發明之抗HLA/NY-ESO抗體的變異抗體中，較佳為可進行對於蛋白質的分解或者是氧化之感受性的降低、生物活性或機能維持、改善或者是降低或變化之抑制、抗原結合能之改善或者是調節、或物理化學性質或者是機能的性質之賦予等。蛋白質係已知位於其表面之特定的胺基酸側鏈變化而該蛋白質的機能或活性會變化，該種例子中包含天冬醯胺酸側鏈之脫醯胺化、天冬胺酸側鏈之異構化等。為了防止該種胺基酸側鏈的變化而經取代為別的胺基酸者亦包含在本發明之變異抗體的範圍中。
作為本發明之變異抗體之例，可舉出具有於抗體所具有的胺基酸序列中經保存性胺基酸取代而成之胺基酸序列的抗體。保存性胺基酸取代係指在與胺基酸側鏈有關聯的胺基酸群內發生之取代。
較佳的胺基酸群如下：酸性群=天冬胺酸、麩胺酸；鹼性群=離胺酸、精胺酸、組胺酸；非極性群=丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、***酸、甲硫胺酸、色胺酸；及非帶電極性家族=甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。其他的較佳的胺基酸群如以下：脂肪族羥基群=絲胺酸及蘇胺酸；含醯胺群=天冬醯胺酸及麩醯胺酸；脂肪族群=丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；以及芳香族群=***酸、色胺酸及酪胺酸。該變異抗體中之胺基酸取代，係較佳為在不使原抗體所具有的抗原結合活性降低之範圍進行。
本發明之抗HLA/NY-ESO抗體、其抗原結合片段、其變異體(變異抗體或其抗原結合片段)、或本發明之分子亦包含：具有於NYA-2023等之本發明之抗體所具有的胺基酸序列中經進行保存性胺基酸取代及/或其他的變異而成之胺基酸序列，且與HLA/NY-ESO結合的變異抗體、彼等之抗原結合片段、包含彼等之分子等；具有於源自包含NYA-2023等之本發明之抗體的CDRH1至CDRH3及CDRL1至CDRL3中任意之胺基酸序列中有保存性胺基酸取代及/或其他的變異進行的胺基酸序列，且與HLA/NY-ESO結合的包含該CDR之嵌合化抗體、人類化抗體、人類抗體、彼等之抗原結合片段、包含彼等之分子等。
3-3.抗HLA/NY-ESO抗體的結合片段 作為本發明之一個樣態，而提供本發明之抗HLA/NY-ESO抗體的抗原結合片段(以下僅稱為「結合片段」)。本發明之抗HLA/NY-ESO抗體的結合片段包含：嵌合化抗體、人類化抗體、或、人類抗體的結合片段。抗體的結合片段意指該抗體所具有的機能之中至少保持抗原結合性之片段或其修飾物。就該抗體的機能而言，一般來說可舉出抗原結合活性、調節抗原活性的活性(例如促效(agonist)活性)、於細胞內使抗原內在化的活性、阻礙或者是促進與與抗原進行相互作用的物質之相互作用的活性等。
就抗體的結合片段而言，若為該抗體所具有的活性之中至少保持抗原結合性之該抗體的片段，則不被特別限定。作為此種抗體的結合片段，可舉出例如、Fab、Fab’、F(ab’)2 、Fab輕鏈的羧基末端與Fab重鏈的胺基末端以適當的連接子經連結而成之單股Fab(scFab)、Fv、重鏈及輕鏈之Fv以適當的連接子經連結而成之單股Fv(scFv)、具有單一之重鏈可變區而不具輕鏈序列的單域抗體(sdAb)、或亦稱為奈米抗體(nanobody)。(Muyldemans S.et.al.,Protein Eng.,(1994)7 (9),1129-35,Hamers-Casterman C.et.al.,Nature(1993)363 (6428),446-448)]等，但不受限於該等。如同保有連接子部分的scFab、scFv，包含本發明之抗體的結合片段以外的部分的分子亦包含在本發明之抗體的結合片段的意義中。
3-4.抗HLA/NY-ESO抗體或其結合片段的修飾物、複合體 本發明提供抗體或其結合片段的修飾物。本發明之抗體或其結合片段的修飾物意指對本發明之抗體或其結合片段施予化學或生物學性修飾而成者。化學性修飾物包含：對胺基酸骨架的化學部分之鍵結、N-鍵結或O-鍵結碳水化合物鏈的化學修飾物等。生物學性修飾物包含：經轉譯後修飾(例如，對N-鍵結或O-鍵結之糖鏈附加、胺基末端區域或羧基末端區域之處理、脫醯胺化、天冬胺酸之異構化、甲硫胺酸之氧化)者；藉由使用原核生物宿主細胞使其表現而甲硫胺酸殘基經附加於胺基末端者。又，為了能夠進行本發明之抗體或抗原的檢出或單離而經標識者，例如酵素標識體、螢光標識體、親和性標識體亦包含在該修飾物的意義中。此種本發明之抗體或其結合片段的修飾物有用於原本的本發明之抗體或其結合片段之安定性及血中滯留性的改善、抗原性的減少、該抗體或抗原的檢出或單離等。
就化學性修飾物中包含的化學部分而言，可例示聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇等之水溶性聚合物。
就生物學性修飾物而言，可舉出藉由酵素處理或細胞處理等而施予修飾者、藉由基因重組而附加標記等其他的肽而成之融合體、以及以表現內因性或外生性之糖鏈修飾酵素的細胞作為宿主所調製而成者等。
該修飾可在抗體或其結合片段中之任意的位置、或所欲之位置實施，亦可於1個或2個以上之位置進行相同或2種以上之不同的修飾。
但是，此等之重鏈序列之缺失、或是重鏈或輕鏈序列之修飾，對於抗體的抗原結合能及效應功能(補體的活性化、抗體依賴性細胞毒殺作用等)不太會帶來影響。
因此，本發明中亦包含受到該缺失或修飾之抗體。可舉出例如：於重鏈羧基末端有1或2個胺基酸缺失之缺失體(Journal of Chromatography A;705;129-134(1995))；重鏈羧基末端之甘胺酸、離胺酸的2胺基酸殘基缺失且另外位於羧基末端的脯胺酸殘基被醯胺化而成之該缺失體(Analytical Biochemistry,360:75-83(2007))；抗體之重鏈或輕鏈的胺基末端之麩醯胺酸或麩胺酸殘基被焦麩胺醯基(pyroglutamyl)化修飾而成之抗體(國際專利公開WO2013/147153號)等(將該等整合而稱為「缺失體」)。但是，只要保有抗原結合能及效應功能，本發明相關之抗體的重鏈及輕鏈之羧基末端的缺失體不受限於上述之種類。本發明相關之抗體包含2條以上之鏈(例如重鏈)之情形，該2條以上之鏈(例如重鏈)可為選自包含完全長及上述之缺失體之群組的重鏈之任意一種，亦可為組合任意二種而成者。各缺失體之量比或分子數比會受到生產本發明相關之抗體之哺乳類培養細胞的種類及培養條件影響，但就本發明相關之抗體的主成分而言，可舉出在2條重鏈的雙方有羧基末端之1個胺基酸殘基缺失之情形。
進而，即使於本發明之抗體或其抗原結合片段(本發明之分子、多重特異性分子、雙特異性分子等所包含者等)有源自表現載體及/或訊息序列等之1至數個胺基酸被附加於胺基末端及/或羧基末端(且其一部分或全部如前述地經修飾)，若維持所欲之抗原結合活性，則包含在本發明之抗體的修飾物或其抗原結合片段的修飾物之範圍中，包含該種抗體或抗原結合片段的修飾物之分子亦包含在本發明之分子的範圍中。
於本發明中「抗體或其結合片段」，係「抗體或其抗原結合片段的修飾物」亦包含於其意義中。又，本發明之分子、多重特異性的分子、雙重特異性的分子等中包含的「抗體或其抗原結合片段」，係該「抗體或其抗原結合片段的修飾物」亦包含在其意義中。
又，能夠藉由調節與本發明之抗體結合的糖鏈修飾(醣苷化、脫岩藻醣化(defucosylation)等)，而增強抗體依賴性細胞毒殺活性。就抗體之糖鏈修飾的調節技術而言，已知國際專利公開WO99/54342號、WO00/61739號、WO02/31140號等，但不受限於該等。
本發明中亦包含以連接子連接上述之抗體與其他的分子而成之複合體(Immunoconjugate)。就該抗體與放射性物質或具有藥理作用之化合物(藥物)結合的抗體-藥物複合體之例而言，可舉出ADC(抗體-藥物結合物(Antibody-Drug Conjugate))(Methods Mol Biol.(2013)1045:1-27;Nature Biotechnology(2005)23, p.1137-1146)。
進而本發明中亦包含連結了此等之抗體與其他的機能性多肽的複合體。就此種抗體-肽複合體之例而言，可舉出該抗體與白蛋白結合多肽之複合體(Protein Eng Des Sel.(2012)(2):81-8)。
本發明之抗體包含上述之抗體的修飾物、糖鏈修飾經調節之抗體、複合體，本發明之抗體的結合片段包含上述之抗體的修飾物、糖鏈修飾經調節之抗體、複合體的結合片段。
4.生產抗體的方法 本發明之抗體，係例如可藉由將編碼重鏈可變區之DNA或編碼輕鏈可變區之DNA***表現載體，使表現用的宿主細胞在該載體轉形，培養宿主細胞，而作為重組抗體使細胞生產。
編碼抗體之DNA，係藉由連結編碼重鏈可變區之DNA與編碼重鏈恆定區之DNA而可得到編碼重鏈之DNA，再藉由連結編碼輕鏈可變區之DNA與編碼輕鏈恆定區之DNA而可得到編碼輕鏈之DNA。
本發明之抗HLA/NY-ESO抗體，係可將上述之編碼重鏈之DNA及編碼輕鏈之DNA***表現載體，使宿主細胞在該載體轉形，培養該宿主細胞而使其生產。這時，可將上述之編碼重鏈之DNA及編碼輕鏈之DNA導入相同之表現載體，且使用該載體來轉形宿主細胞；亦可將編碼重鏈之DNA與編碼輕鏈之DNA***不同的載體，且使用2個載體來轉形宿主細胞。這時，亦可將編碼重鏈可變區及輕鏈可變區之DNA導入已預先導入編碼重鏈恆定區之DNA及編碼輕鏈恆定區之DNA的載體。又，該載體亦可包含編碼會促進來自宿主細胞之抗體之分泌的訊息肽之DNA。此情形，先以同框(in-frame)連結編碼訊息肽之DNA與編碼抗體之DNA。可藉由在抗體被生產之後除去訊息肽，而獲得為成熟蛋白質之抗體。
這時，可將編碼重鏈可變區之DNA、編碼輕鏈可變區之DNA、連結編碼重鏈可變區之DNA及編碼重鏈恆定區之DNA而成之DNA、連結編碼輕鏈可變區之DNA與編碼輕鏈恆定區之DNA而成之DNA，與啟動子、強化子、多腺苷酸化訊息等之元素進行機能性地連結。此處機能性地連結係指、元素以發揮其機能的方式連結。
表現載體若為在動物細胞、細菌、酵母等之宿主中能夠複製者，則不被特別限定，可舉出例如習知的質體、噬菌體等。就表現載體的構築所使用的載體而言，可舉出例如pcDNA(商標)(ThermoFissher SCIENTIFIC公司)、Flexi(註冊商標)載體(Promega公司)、pUC19、pUEX2(Amersham公司製)、pGEX-4T、pKK233-2(Pharmacia公司製)、pMAM-neo(Clontech公司製)等。就宿主細胞而言，可使用大腸菌、枯草菌等之原核細胞，亦可使用酵母、動物細胞等之真核細胞，但較佳為使用真核細胞。例如，作為動物細胞，若使用為人類胎兒腎細胞株之HEK293細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞等即可。表現載體若以習知的方法導入宿主細胞，並轉形宿主細胞即可。可舉出例如電穿孔法、磷酸鈣沉澱法、DEAE-葡聚糖轉染法等。所生產的抗體可使用通常在蛋白質所使用的分離、純化方法來純化。例如，若適當選擇並組合親和性層析法、其他的層析法、過濾器、超過濾、鹽析、透析等即可。
5.與HLA/NY-ESO結合的分子 本發明之分子包含本發明之抗HLA/NY-ESO抗體或其抗原結合片段。本發明之分子係較佳為具有2以上之抗原結合部位的多重特異性分子。亦即，係能夠與1個分子上的2個以上之彼此不同的抗原決定區或2個以上之分子上的彼此不同的抗原決定區結合的分子，且包含複數之彼此不同的抗原結合片段。此種多重特異性分子中包含IgG型多重特異性分子、具有2種類以上之可變區的多重特異性分子，例如串聯scFv(taFv)、單股雙抗體、雙抗體及三抗體般的抗體片段、進行共價結合或非共價結合而被連結的抗體片段，但不受限於此等。多重特異性的分子亦可包含Fc。
本發明之多重特異性的分子可於本發明之抗HLA/NY-ESO抗體或其抗原結合片段之外，包含1個或2個以上之其餘抗體或該抗體的抗原結合片段。就其餘抗體的抗原結合片段而言，可舉出例如Fab、F(ab)’、Fv、scFv、sdAb。
本發明之較佳的多重特異性分子進一步包含抗CD3抗體或其抗原結合片段，且亦與CD3特異性地結合。
本發明之多重特異性分子所包含的抗CD3抗體或其抗原結合片段，若為與人類CD3結合的抗體或其結合片段，則並未特別限定，但較佳為亦與食蟹猴等之非人類靈長類的CD3結合。就更佳的抗CD3抗體或其抗原結合片段而言，可例示包含由序列識別號141所表示的胺基酸序列而成之重鏈可變區CDRH1、由序列識別號142所表示的胺基酸序列而成之重鏈可變區CDRH2、由序列識別號143所表示的胺基酸序列而成之重鏈可變區CDRH3、由序列識別號144所表示的胺基酸序列而成之輕鏈可變區CDRL1、由序列識別號145所表示的胺基酸序列而成之輕鏈可變區CDRL2、及由序列識別號146所表示的胺基酸序列而成之輕鏈可變區CDRL3(以上，圖142)而成的抗體或其抗原結合片段。
就該包含CDRH1～CDRH3及CDRL1～CDRL3之更佳的抗體或其抗原結合片段而言，可例示包含由序列識別號136(圖137)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號2～119的胺基酸序列而成之C3E-7034重鏈可變區、由序列識別號137(圖138)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號2～119的胺基酸序列而成之C3E-7036重鏈可變區、由序列識別號138(圖139)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號2～119的胺基酸序列而成之C3E-7085重鏈可變區、由序列識別號139(圖140)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號2～119的胺基酸序列而成之C3E-7088重鏈可變區、由序列識別號140(圖141)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號2～119的胺基酸序列而成之C3E-7093重鏈可變區、由序列識別號155(圖151)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號272～389的胺基酸序列而成之C3E-7096重鏈可變區、由序列識別號156(圖152)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號277～394的胺基酸序列而成之C3E-7096重鏈可變區、由序列識別號157(圖153)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號277～394的胺基酸序列而成之C3E-7097重鏈可變區而成的抗體或其抗原結合片段。
又，就該包含CDRH1～CDRH3及CDRL1～CDRL3之更佳的抗體或其抗原結合片段而言，可例示包含由序列識別號136(圖137)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號135～243的胺基酸序列而成之C3E-7034輕鏈可變區、由序列識別號137(圖138)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號135～241的胺基酸序列而成之C3E-7036輕鏈可變區、由序列識別號138(圖139)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號135～241的胺基酸序列而成之C3E-7085輕鏈可變區、由序列識別號139(圖140)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號135～243的胺基酸序列而成之C3E-7088輕鏈可變區、由序列識別號140(圖141)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號135～243的胺基酸序列而成之C3E-7093輕鏈可變區、由序列識別號155(圖151)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號405～511的胺基酸序列而成之C3E-7096輕鏈可變區、由序列識別號156(圖152)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號410～516的胺基酸序列而成之C3E-7096輕鏈可變區、由序列識別號157(圖153)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號410～516的胺基酸序列而成之C3E-7097輕鏈可變區而成的抗體或其抗原結合片段。
又，就該包含CDRH1～CDRH3及CDRL1～CDRL3之更佳的抗體或其抗原結合片段而言，可例示包含由序列識別號136(圖137)所表示的胺基酸編號2～119及135～243而成之C3E-7034重鏈可變區及輕鏈可變區的組合、由序列識別號137(圖138)所表示的胺基酸編號2～119及135～241而成之C3E-7036重鏈可變區及輕鏈可變區的組合、由序列識別號147(圖143)所表示的胺基酸編號2～119及135～243而成之C3E-7078重鏈可變區及輕鏈可變區的組合、由序列識別號138(圖139)所表示的胺基酸編號2～119及135～241而成之C3E-7085重鏈可變區及輕鏈可變區的組合、由序列識別號139(圖140)所表示的胺基酸編號2～119及135～243而成之C3E-7088重鏈可變區及輕鏈可變區的組合、由序列識別號140(圖141)所表示的胺基酸編號2～119及135～243而成之C3E-7093重鏈可變區及輕鏈可變區的組合、由序列識別號155(圖151)所表示的胺基酸編號272～389及405～511而成之C3E-7096重鏈可變區及輕鏈可變區的組合、由序列識別號156(圖152)所表示的胺基酸編號277～394及410～516而成之C3E-7096重鏈可變區及輕鏈可變區的組合、由序列識別號157(圖153)所表示的胺基酸編號277～394及410～516而成之C3E-7097重鏈可變區及輕鏈可變區的組合而成的抗體或其抗原結合片段。
進一步就該包含CDRH1～CDRH3及CDRL1～CDRL3之更佳的抗體或其抗原結合片段而言，可例示包含由序列識別號136(圖137)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號2～243的胺基酸序列而成之C3E-7034scFv、由序列識別號137(圖138)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號2～241的胺基酸序列而成之C3E-7036scFv、由序列識別號147(圖143)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號2～243的胺基酸序列而成之C3E-7078scFv、由序列識別號138(圖139)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號2～241的胺基酸序列而成之C3E-7085scFv、由序列識別號139(圖140)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號2～243的胺基酸序列而成之C3E-7088scFv、由序列識別號140(圖141)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號2～243的胺基酸序列而成之C3E-7093scFv、及彼等之scFv中任意一個的抗體或抗體的結合片段等。對CD3特異性的scFv(亦稱為「抗CD3 scFv」)之較佳的樣態中包含於羧基末端側附加有FLAG-His標記者(亦僅稱為「標記附加物」)。就較佳的標記附加物而言，可例示C3E-7034(序列識別號136：圖137)、C3E-7036(序列識別號137：圖138)、C3E-7085(序列識別號138：圖139)、C3E-7088(序列識別號139：圖140)及C3E-7093(序列識別號140：圖141)，可舉出更佳為C3E-7085。
作為本發明之多重特異性分子的較佳例，可舉出雙特異性分子。「雙特異性」意指能夠與同一分子之2個彼此不同的抗原決定區或2個分子上的彼此不同的抗原決定區結合，且包含具有此種雙特異性之抗體或抗原結合片段。本發明之雙特異性分子與HLA/NY-ESO結合，且會進一步與CD3結合。
作為本發明之雙特異性分子，可舉出具有以下的結構(型式)者。
雙重scFv型的雙特異性分子，係與不同抗原決定區結合的2種scFv與二聚體之Fc的一方各自以連接子被連結或無連接子而被直接結合。或是，與不同抗原決定區結合的2種類的scFv各自於CH、CL以連接子被連結，且進一步與二聚體之Fc的一方各自以連接子被連結。該雙特異性分子為經置入會形成異二聚體之變異的Fc於2種類的不同scFv各個的下游異種會合之型式。將雙重scFv型的雙特異性分子稱為雙重型雙特異性分子、或僅稱為雙重型(圖6A(b))。
於本發明中，例如若使用包含抗HLA-A2/NY-ESO scFv與抗CD3scFv的雙重型雙特異性分子即可。
或是，作為本發明之雙特異性分子，亦可為與不同抗原決定區結合的Fab與scFv係於二聚體之Fc的一方使第1抗體之Fab透過連接子而結合，且於另一方使第2抗體之scFv透過連接子而結合的雙特異性分子。該雙特異性分子為經置入會形成異二聚體之變異的Fc於Fab及scFv之各自下游異種會合之型式。將此種雙特異性分子稱為混成型雙特異性分子、或混成型(圖6A(a))。於本發明中可使用例如包含抗HLA-A2/NY-ESO Fab與抗CD3scFv的混成型。
進一步，亦可為於二聚體之Fc的一方使第1抗體之Fab與第2抗體之scFv透過連接子結合而成的雙特異性分子。此情形，可使Fab結合於Fc，且使scFv結合於該Fab，亦可為使scFv結合於Fc，且使Fab結合於該scFv。較佳為使Fab結合且使scFv結合於該Fab。Fab與scFv的結合，若於Fab的可變區使scFv透過連接子而結合即可。該雙特異性分子為經置入會形成異二聚體之變異的Fc於以連接子連結了scFv與Fab的下游會合之型式。將此種雙特異性分子稱為scFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子或scFv-Fab-異二聚體Fc型(圖6A(c))。
於本發明中，例如若使用包含抗CD3scFv與抗HLA-A2/NY-ESO Fab的scFv-Fab-異二聚體Fc型即可。
進一步，亦可於二聚體之Fc的一方，使具有以連接子連結了第1抗體與第2抗體之2種類的scFv之型式的taFv(圖3(c))，透過連接子或不透過連接子而直接結合。將此種雙特異性分子稱為taFv-異二聚體Fc型雙特異性分子或taFv-異二聚體Fc型(圖3(d))。該雙特異性分子為經置入會形成異二聚體之變異的Fc於taFv的下游異種會合之型式。第1抗體與第2抗體連結於taFv的順序不受限定，但相對於將最初的雙特異性分子稱為taFv-異二聚體Fc型，而將使第1抗體與第2抗體連結於taFv的順序相反之情形稱為taFv(逆)-異二聚體Fc型(亦稱為taFv(逆)-Fc型)。
於圖6A(a)呈示混成型雙特異性分子，於圖6A(b)呈示雙重型雙特異性分子，於圖6A(c)呈示scFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子之結構。又，於圖3(a)呈示scFv，於圖3(b)呈示Fab，於圖3(c)呈示taFv，於圖3(d)呈示taFv-異二聚體Fc型雙特異性分子，於圖3(e)呈示taFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子之結構。進一步於圖6B(a)呈示taFv-異二聚體Fc型雙特異性分子(與圖3(d)相同)，於圖6B(b)呈示taFv(逆)-異二聚體Fc型雙特異性分子，於圖6B(c)呈示taFv(逆)-異二聚體Fc型雙特異性分子所包含的第1多肽，於圖6(d)呈示taFv(逆)-異二聚體Fc型雙特異性分子所包含的第2多肽之結構。 本發明之雙特異性分子具有複數之多肽會合之結構。
於本發明中，例如就taFv而言，若使用抗HLA-A2/NY-ESOscFv與抗CD3scFv的taFv即可。taFv-異二聚體Fc型雙特異性分子較佳為(a)包含由N末端朝向C末端依以下順序包含與HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv、與CD3特異性地結合的scFv及免疫球蛋白Fc區(i)而成之第1多肽、與包含免疫球蛋白的鉸鏈區及Fc區(ii)而成之第2多肽；更佳為(b)第1多肽與第2多肽於Fc區(i)與Fc區(ii)中會合而成。第1多肽及第2多肽之Fc區亦可包含用以形成異二聚體之變異。於圖3(d)呈示taFv-異二聚體Fc型雙特異性分子之例。如圖3(d)所示，第1多肽之Fc區(i)部分與以塗黑所示之第2多肽之Fc區(ii)部分結合，且第1多肽與第2多肽會合。圖3(f)呈示第1多肽，圖3(g)呈示第2多肽。例如，於圖3(d)中，以白色所表示的scFv為抗HLA-A2/NY-ESO scFv，以右上斜線所表示的scFv為抗CD3 scFv。
本發明之更佳的taFv-異二聚體Fc型雙特異性分子所包含的第1多肽，係包含序列識別號85所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號87所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號88所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號89所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號90所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號91所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號92所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號93所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號94所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號95所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號96所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號86所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號149所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號150所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號155所表示的胺基酸序列之第20號～第511號的胺基酸序列、序列識別號156所表示的胺基酸序列之第20號～第516號的胺基酸序列、或序列識別號157所表示的胺基酸序列之第20號～第516號的胺基酸序列；更進而較佳的taFv-異二聚體Fc型雙特異性分子所包含的第1多肽，係包含序列識別號85、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、86、149、150或155所表示的胺基酸序列之第529號～第745號的胺基酸序列、或是序列識別號156或157所表示的胺基酸序列之第534號～第750號的胺基酸序列；進一步更進而較佳的taFv-異二聚體Fc型雙特異性分子所包含的第1多肽，係由序列識別號85所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列、序列識別號87所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列、序列識別號88所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列、序列識別號89所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列、序列識別號90所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列、序列識別號91所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列、序列識別號92所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列、序列識別號93所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列、序列識別號94所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列、序列識別號95所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列、序列識別號96所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列、序列識別號86所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列)、序列識別號149所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列、序列識別號150所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列或序列識別號155所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列而成。或是由序列識別號156所表示的胺基酸序列之第20號～第750號的胺基酸序列或序列識別號157所表示的胺基酸序列之第20號～第750號的胺基酸序列而成。
本發明之較佳的taFv-異二聚體Fc型雙特異性分子所包含的第2多肽，係包含源自人類抗體的鉸鏈區及變異型Fc而成，更進而較佳的taFv-異二聚體Fc型雙特異性分子所包含的第2多肽，係包含序列識別號84所示的胺基酸序列之第20號～第246號的胺基酸序列而成。 此等之中，作為本發明之較佳的taFv-異二聚體Fc型雙特異性分子，可例示由序列識別號85所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列而成之第1多肽及由序列識別號84所示的胺基酸序列之第21號～第246號而成之第2多肽會合而成的NYF-0016、由序列識別號87所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列而成之第1多肽及由序列識別號84所示的胺基酸序列之第21號～第246號而成之第2多肽會合而成的NYF-0022、由序列識別號88所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列而成之第1多肽及由序列識別號84所示的胺基酸序列之第21號～第246號而成之第2多肽會合而成的NYF-0023、由序列識別號89所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列而成之第1多肽及由序列識別號84所示的胺基酸序列之第21號～第246號而成之第2多肽會合而成的NYF-0027、由序列識別號90所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列而成之第1多肽及由序列識別號84所示的胺基酸序列之第21號～第246號而成之第2多肽會合而成的NYF-0035、由序列識別號91所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列而成之第1多肽及由序列識別號84所示的胺基酸序列之第21號～第246號而成之第2多肽會合而成的NYF-0044、由序列識別號92所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列而成之第1多肽及由序列識別號84所示的胺基酸序列之第21號～第246號而成之第2多肽會合而成的NYF-0045、由序列識別號93所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列而成之第1多肽及序列識別號84所示的胺基酸序列之第21號～第246號而成之第2多肽會合而成的NYF-0047、由序列識別號94所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列而成之第1多肽及由序列識別號84所示的胺基酸序列之第21號～第246號而成之第2多肽會合而成的NYF-0048、由序列識別號95所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列而成之第1多肽及由序列識別號84所示的胺基酸序列之第21號～第246號而成之第2多肽會合而成的NYF-0060、由序列識別號96所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列而成之第1多肽及由序列識別號84所示的胺基酸序列之第21號～第246號而成之第2多肽會合而成的NYF-0061、由序列識別號86所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列而成之第1多肽及由序列識別號84所示的胺基酸序列之第21號～第246號而成之第2多肽會合而成的NYF-0019、由序列識別號149所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列而成之第1多肽及由序列識別號84所示的胺基酸序列之第21號～第246號而成之第2多肽會合而成的NYF-0014、以及由序列識別號150所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列而成之第1多肽及由序列識別號84所示的胺基酸序列之第21號～第246號而成之第2多肽會合而成的NYF-0082。
進一步，作為本發明之較佳的taFv-異二聚體Fc型雙特異性分子，可例示由序列識別號155所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列而成之第1多肽及由序列識別號84所示的胺基酸序列之第20號～第246號而成之第2多肽會合而成的NYZ-0038、由序列識別號156所表示的胺基酸序列之第20號～第750號的胺基酸序列而成之第1多肽及由序列識別號84所示的胺基酸序列之第20號～第246號而成之第2多肽會合而成的NYZ-0082、由序列識別號157所表示的胺基酸序列之第20號～第750號的胺基酸序列而成之第1多肽及由序列識別號84所示的胺基酸序列之第20號～第246號而成之第2多肽會合而成的NYZ-0083。
彼等之中，NYF-0023、NYF-0047、NYF-0048、NYF-0060、NYF-0061、NYZ-0038、NYZ-0082、及NYZ-0083係具有特別優異之生物活性、物性等，而為較佳。
進一步，於二聚體之Fc的一方，使第1抗體之taFv透過連接子或不透過連接子而直接結合，於另一方的Fc使第1抗體或者是第2抗體之Fab透過連接子或不透過連接子而直接結合。該雙特異性分子係於taFv-異二聚體Fc型的第2多肽之Fc區(ii)(黑色實心)側的上游附加有Fab之型式。將此種雙特異性分子稱為taFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子或taFv-Fab-異二聚體Fc型(圖3)。
於本發明中，就t aFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子所包含的taFv而言，例如若使用抗HLA-A2/NY-ESO scFv與抗CD3scFv的taFv即可，就Fab而言，例如若使用HLA/NY-ESO Fab即可。
taFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子，係較佳為(a)包含由N末端朝向C末端依以下順序包含與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv、與CD3特異性地結合的scFv及免疫球蛋白Fc區(i)而成之第1多肽、由包含Fc區(ii)之免疫球蛋白重鏈而成之第2多肽、及由免疫球蛋白輕鏈而成之第3多肽；更佳為(b)第2多肽與第3多肽會合，且(c)第1多肽與第2多肽於Fc區(i)與Fc區(ii)中會合而成。於圖3(e)呈示taFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子之例，於圖3(f)呈示第1多肽，於圖3(h)呈示第2多肽，於圖3(i)呈示第3多肽。如圖3(e)所示，第1多肽之Fc區(i)部分與以塗黑所示之由包含Fc區(ii)之免疫球蛋白重鏈而成之第2多肽在第1多肽之Fc區(i)部分與第2多肽之Fc區(ii)部分結合，且進一步免疫球蛋白輕鏈結合於第2多肽。該較佳的taFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子亦可為以下：Fab結合於包含taFv及免疫球蛋白之Fc區的taFv-異二聚體Fc型雙特異性分子而成。就較佳的taFv-Fab異二聚體Fc型雙特異性分子所包含的第1多肽中包含之胺基酸序列而言，可例示序列識別號85所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號87所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號88所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號89所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號90所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號91所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號92所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號93所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號94所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號95所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號96所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號86所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號149所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列及序列識別號150所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列，進一步較佳的taFv-Fab異二聚體Fc型雙特異性分子所包含的第1多肽，係由序列識別號85所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列、序列識別號87所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列、序列識別號88所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列、序列識別號89所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列、序列識別號90所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列、序列識別號91所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列、序列識別號92所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列、序列識別號93所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列、序列識別號94所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列、序列識別號95所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列、序列識別號96所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列及序列識別號86所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列、序列識別號149所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列、或序列識別號150所表示的胺基酸序列之第21號～第745號的胺基酸序列而成。
本發明之較佳的taFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子所包含的第2多肽，係包含人類抗體或人類化抗體重鏈之可變區、CH1域及鉸鏈區、以及變異型Fc而成，更佳的taFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子所包含的第2多肽，係包含序列識別號99所表示的胺基酸序列之第20號～第242號的胺基酸序列而成。
本發明之較佳的taFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子所包含的第3多肽，係包含人類抗體或人類化抗體輕鏈之可變區及恆定區而成，更佳的taFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子所包含的第3多肽，係包含序列識別號100所表示的胺基酸序列之第21號～第131號而成。
該較佳的taFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子所包含的第2多肽之中可變區及CH1域以及第3多肽係構成Fab，且較佳的Fab為抗HLA/NY-ESO抗體之Fab，例如NYA-0001之Fab。
於本發明中，就scFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子所包含的scFv而言，例如若使用抗HLA-A2/NY-ESO scFv或抗CD3scFv即可，就Fab而言，例如若使用HLA/NY-ESO Fab或抗CD3 Fab即可。
scFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子，係較佳為(a)包含由N末端朝向C末端依以下順序包含與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv、與CD3特異性地結合的抗體重鏈之可變區及恆定區CH1以及免疫球蛋白Fc區(i)而成之第1多肽、包含免疫球蛋白的鉸鏈區及Fc區(ii)而成之第2多肽、以及包含由可變區及恆定區而成的抗體輕鏈之第3多肽；更佳為(b)第1多肽與第2多肽於Fc區(i)與Fc區(ii)中會合，且第1多肽於抗體重鏈之可變區及恆定區CH1中與第3多肽(之抗體輕鏈)會合而成。第1多肽及第2多肽之Fc區可為野生型，亦可包含會形成異二聚體之變異。於圖6A(c)呈示scFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子之例。圖6A(c)的右半部為第1多肽及第3多肽，左半部為第2多肽。如圖6A(c)所示，第1多肽之Fc區(i)部分與以塗黑所示之第2多肽之Fc區(ii)部分會合，且第1多肽與第3多肽會合。例如，於圖6A(c)中，以右上斜線所表示的scFv為抗HLA-A2/NY-ESO scFv，以白色及格子圖案及橫線所表示的Fab為抗CD3 Fab。
就較佳的scFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子所包含的第1多肽中包含之胺基酸序列而言，可例示序列識別號160所表示的胺基酸序列之第21號～第394號的胺基酸序列，可例示進一步較佳為第20號～第724號的胺基酸序列。
又，就較佳的scFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子所包含的第1多肽中包含之其他的胺基酸序列而言，可例示序列識別號197所表示的胺基酸序列之第21號～第389號的胺基酸序列，可例示進一步較佳為第20號～第719號的胺基酸序列。 進一步，就較佳的scFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子所包含的第1多肽中包含之其他的胺基酸序列而言，可例示序列識別號198所表示的胺基酸序列之第21號～第389號的胺基酸序列，可例示進一步較佳為第20號～第719號的胺基酸序列。
本發明之較佳的scFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子所包含的第2多肽，係包含源自人類抗體的鉸鏈區及變異型Fc而成，更進而較佳的scFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子所包含的第2多肽，係包含序列識別號84所示的胺基酸序列之第20號～第246號的胺基酸序列而成。
本發明之較佳的scFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子所包含的第3多肽，係包含源自人類抗體的輕鏈而成，就更佳的scFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子所包含的第3多肽而言，可例示序列識別號161所示的胺基酸序列之第21號～第127號的胺基酸序列，可例示更進一步較佳為第21號～第233號的胺基酸序列。
此等之中，作為本發明之較佳的scFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子，可例示由序列識別號160所表示的胺基酸序列之第20號～第724號的胺基酸序列而成之第1多肽、由序列識別號84所示的胺基酸序列之第20號～第246號而成之第2多肽、及由序列識別號161所示的胺基酸序列之第21號～第233號而成之第3多肽會合而成的NYZ-1010。
又，作為本發明之較佳的scFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子，亦可例示由序列識別號197所表示的胺基酸序列之第20號～第719號的胺基酸序列而成之第1多肽、由序列識別號84所示的胺基酸序列之第20號～第246號而成之第2多肽、及由序列識別號161所示的胺基酸序列之第21號～第233號而成之第3多肽會合而成的NYZ-1007。
進一步，作為本發明之較佳的scFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子，亦可例示由序列識別號198所表示的胺基酸序列之第20號～第719號的胺基酸序列而成之第1多肽、由序列識別號84所示的胺基酸序列之第20號～第246號而成之第2多肽、及由序列識別號161所示的胺基酸序列之第21號～第233號而成之第3多肽會合而成的NYZ-1017。
本發明之雙特異性分子所包含的1個、2個或3個以上之肽可為前述之「缺失體」，亦即可於其羧基末端、特別是源自抗體重鏈之羧基末端有1或2個(或其以上)的胺基酸變異(包含缺失)。例如，為本發明之較佳的scFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子之一的NYZ-1010中包含的第1多肽所具有的胺基酸序列之羧基末端可為序列識別號160之第724號Lys、1胺基酸缺失而成之第723號Gly、包含彼等的混合物之任一者。同樣地，本發明之較佳的scFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子所包含的第2多肽所具有的胺基酸序列之羧基末端可為序列識別號84之第246號Lys、1胺基酸缺失而成之第245號Gly、包含彼等的混合物之任一者。
本發明之雙特異性分子所包含的scFv及Fab較佳為人類化抗體或人類抗體之scFv及Fab，Fc較佳為人類抗體之Fc。
於本發明之雙特異性分子所包含的可變區中，可由抗體之胺基末端側起依重鏈可變區、輕鏈可變區的順序結合，或是亦可依輕鏈可變區、重鏈可變區的順序結合。亦可於兩可變區之間具有連接子(任意)。又，亦可於胺基末端側的可變區之胺基末端具有甘胺酸殘基(任意)。在串聯scFv型的雙特異性分子，亦可於羧基末端側的可變區之羧基末端有連接子、FLAG標記、及/或、His標記結合(任意)。作為較佳的樣態之一，可例示由胺基末端起依重鏈可變區、第1連接子、輕鏈可變區、第2連接子、FLAG標記、及His標記的順序結合而成者。
連接子亦包含單股多肽或單股寡肽、或是PEG、核苷酸、糖鏈、化合物等之合成品。其他，若為結合二個多肽者，則不被特別限定，能夠使用習知的連接子。
就連接子的長度而言，例如肽連接子之情形為5～30胺基酸。雙特異性分子中包含複數之連接子之情形，可全部使用相同之長度的肽連接子，亦可使用不同長度的肽連接子。
就肽連接子而言，可例示例如(Gly･Gly･Gly･Gly･Ser)(序列識別號161)的重複，但亦可於此等有1～數個與Gly、Ser不同的胺基酸殘基附加。
如上述之本發明之多重特異性抗體、尤其是雙特異性抗體可採用的結構(型式)之中，較佳者為taFv-異二聚體Fc型、taFv-Fab-異二聚體Fc型及scFv-Fab-異二聚體Fc型，更佳者為taFv-異二聚體Fc型，由N末端朝向C末端依抗HLA/NY-ESO scFv、抗CD3 scFv的順序位置之型(taFv-異二聚體Fc型)係相較於其相反地位置之型(taFv(逆)-異二聚體Fc型)，而更進一步較佳(實施例11等)。又，其他的更佳者為scFv-Fab-異二聚體Fc型。
包含由後述多核苷酸中包含的核苷酸序列所編碼之胺基酸序列，且與HLA/NY-ESO結合，較佳為進一步亦與CD3結合的分子亦包含在本發明中，其中前述多核苷酸與包含編碼本發明之分子所包含的胺基酸序列之核苷酸序列的多核苷酸之互補鏈於嚴格條件下雜交。
包含與本發明之分子所包含的胺基酸序列90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%以上相同之胺基酸序列，且與HLA/NY-ESO結合，較佳為進一步亦與CD3結合的分子亦包含在本發明中。
本發明之抗體、其結合片段及包含彼等之多重特異性抗體，係具備優異之生物學活性、物理化學性質(以下稱為「物性」。)、安全性、體內藥物動力學等之性質。(a)就生物學活性或其指標而言，可例示抗原結合活性、生體外細胞毒殺活性、生體內抗腫瘤活性等。例如，對於HLA/NY-ESO之解離常數(KD值)為100nM以下或50nM以下，較佳為20nM以下或10nM以下，更佳為5nM以下。又，例如對於為內因性人類NY-ESO表現細胞株的U266B1及/或NCI-H1703，使用人類末梢血液單核細胞作為作用細胞(effector cell)所發揮之細胞毒殺活性的EC50 值為20nM以下，較佳為10nM以下，更佳為5nM以下(就生體外細胞毒殺活性的測定及計算而言，可例示實施例8記載之方法，但不受限於其)。進一步，例如將人類鱗狀上皮細胞肺癌細胞株NCI-H1703的6×107 細胞/mL懸浮液0.1mL移植至NOG小鼠的皮下，4日後將人類末梢血液單核細胞的3.75×107 細胞/mL懸浮液尾靜脈內移植0.2mL，14日後起每週1次，3次投予抗體後測定腫瘤體積，此時相對於經投予溶媒之對照組的腫瘤增殖抑制活性為50%以上，較佳為75%以上，更佳為90%以上(就生體內抗腫瘤活性的測定及計算而言，可例示實施例9記載之方法，但不受限於其)。(b)生物醫藥品(biopharmaceuticals)中包含的雜質由於涉及醫藥品的安全性，因而被要求切實地將在製造時及保存中之增加的有無予以規格設定且進行管理。其中又以HMWS(聚集體)為主要的雜質之一，亦涉及免疫原性風險或藥效的降低等，因此為應特別嚴格管理的項目。雜質的管理不僅於製造時，亦包含製造步驟中或製造後之經時性的安定性(增加的有無)而有實施評價的必要。醫藥品的有效期間係根據長期安定性試驗的結果而設定，經時性地安定的抗體可設定更長的有效期間。因此，就成為以生物醫藥品為目標來挑選較佳的抗體之際的指標之本發明之物理化學性質而言，可舉出耐酸性(HMWS生成抑制等)、溶液安定性(HMWS生成抑制等)。又，就其他的指標而言，可例示：對於適於本發明之抗體或者是其結合片段或包含彼等之分子的生產之宿主細胞、例如Expi293F細胞導入編碼彼等所包含之胺基酸序列之基因而得的重組細胞之培養物中的產量多、產率高等。具有彼等之物理化學性質特徵的本發明之較佳的抗體、其抗原結合片段、及含有彼等之多重特異性抗體：係能夠將彼等之溶液暴露於酸性條件下，且能夠實施彼等的製造、例如蛋白質A、離子交換等之層析法、病毒不活性化等之步驟或變得容易；因即使將彼等作成溶液也能壓低HMWS的生成，所以能夠實施彼等的製造、製劑化、包含彼等之醫藥品的流通或保存等或變得容易；能夠效率良好地生產彼等。關於耐酸性，例如於pH3.5、室溫下保溫1小時，接著藉由粒徑篩析層析法測定HMWS所計算之產生的HMWS之含量為5%以下，較佳為2%以下，更佳為1%以下(就用於耐酸性評價之HMWS含量的測定及計算而言，可例示實施例19-1記載之方法，但不受限於此)。關於溶液安定性，例如使由25mM組胺酸及5%山梨醇溶解成pH6.0、濃度25mg/ml，於25℃保存6天，接著藉由粒徑篩析層析法測定HMWS所計算之HMWS的含量為20%以下，較佳為10%以下(就用於溶液安定性評價之HMWS含量的測定及計算而言，可例示實施例19-2記載之方法，但不受限於此)。就生產效率或產率的測定及計算而言，可例示實施例20及21記載之方法，但不受限於其。(c)就安全性或其指標而言，可例示抗原辨識特性、投予時之所見等。例如，辨識野生型NY-ESO肽上的複數之胺基酸，與類似於野生型NY-ESO肽但具有不相同的胺基酸序列之同源性肽並不結合，而起因於脫靶效應(off-target effects)的副作用風險低。又，於ISPRI 網路免疫原性篩選(Web-Based Immunogenicity Screening) (EpiVax, Inc)中免疫原性低，可預測起因於抗體的細胞激素產生等之副作用風險低。又，例如將本發明之雙特異性抗體中所包含的NYF-0023、NYF-0045、NYF-0047、NYF-0048、NYF-0060、NYF-0061、NYZ-0082、或、NYZ-1010對Balb/c小鼠投予，結果在血中半衰期無法確認到有成為問題之所見，亦無法確認到有體重減少、其他顯著的毒性所見。又，將NYZ-0082、或NYZ-1010對食蟹猴單次投予，結果在血中半衰期無法確認到有成為問題之所見所見，針對一般狀態、體重、攝食量、體溫測定、及血漿中細胞激素量無法確認到有起因於投予之變化。(d)就動態或其指標而言，可例示血中半衰期等。例如，將在本發明中取得的數個雙特異性抗體對Balb/c小鼠、或食蟹猴投予，結果在血中半衰期無法確認到有成為問題之所見。可較佳使醫藥組成物含有此種具備優異之生物學活性、物理化學性質、安全性、體內藥物動力學等之性質的本發明之抗體、其結合片段及分子。就具有(a)記載之抗原結合活性及(b)記載之諸性質的本發明之較佳的抗體或其抗原結合片段而言，可例示NYA-1143、NYA-1163、NYA-2023、NYA-2027、NYA-2035、NYA-2044、NYA-2045、NYA-2047、NYA-2048、NYA-2060、NYA-2031、NYA-2047、NYA-2061、NYA-2143及NYA-3061，可例示更佳為NYA-2047、NYA-2061、NYA-2143及NYA-3061，但不受限於該等。又，就具有(a)～(d)記載之性質的本發明之較佳的多重特異性抗體而言，可例示NYF-0016、NYF-0019、NYF-0022、NYF-0023、NYF-0027、NYF-0035、NYF-0044、NYF-0045、NYF-0047、NYF-0048、NYF00058、NYF-0060、NYF-0061、NYZ-0038、NYZ-0082、NYZ-0088及NYZ-1010，可例示更佳為NYF-0061、NYZ-0038、NYZ-0082、NYZ-0088、NYZ-1007、NYZ-1010、NYZ-1017，但不受限於該等。
於本發明中，抗體會結合之「部位」、亦即抗體所辨識之「部位」意指抗體所結合或辨識之抗原上的部分肽或部分高次結構。於本發明中，亦將該部位稱為抗原決定區、抗體的結合部位。就本發明之抗HLA/NY-ESO抗體所結合或辨識之HLA/NY-ESO上的部位而言，可例示HLA/NY-ESO肽中之複數之胺基酸、部分高次結構等。
本發明亦包含與本發明之抗體或結合片段「與相同之部位結合的抗體或其結合片段」。與某抗體「與相同之部位結合的抗體」意指與該抗體所辨識之抗原分子上的部位結合的其他的抗體。若第二抗體與第一抗體所結合之抗原分子上的部分肽或部分立體結構結合，則可判定第一抗體與第二抗體與相同之部位結合。本發明之第一抗體具有上述(a)記載之抗原結合活性之情形，與HLA/NY-ESO上的相同之部位結合的第二抗體，其具有同樣的活性之或然率極高，且本發明亦包含該第二抗體。又，於對HLA/NY-ESO之結合上與本發明之第一抗體競爭的抗體亦若是具有(a)記載之抗原結合活性，則包含在本發明中。與該種本發明之單株抗體所辨識之HLA/NY-ESO上的部位結合的抗體、於對HLA/NY-ESO之結合上與本發明之單株抗體競爭的抗體、及彼等之結合片段，係較佳為具有(a)記載之生體外細胞毒殺活性及生體內抗腫瘤活性以及(b)～(d)記載之性質之中1個或2個以上、更佳為彼等之3個以上，最佳為具有全部。
抗體的結合部位，係可藉由免疫測定法等發明所屬技術領域中具有通常知識者周知的方法來決定。例如，可製作將抗原的胺基酸序列由C末端或N末端適當刪去而成之一連的肽，探討抗體對彼等之反應性，於決定大致的辨識部位之後，進一步合成短的肽而探討抗體對彼等之肽的反應性，藉此而決定結合部位。或例如，可藉由刪除抗原或者是抗原片段肽等的胺基酸序列之中特定的部位或區域或者是以別的胺基酸序列取代或者是對胺基酸序列導入變異，且探討抗體對彼等之肽的反應性，而決定結合部位。抗原片段肽可使用基因重組、肽合成等之技術來調製。
抗體會辨識抗原之部分高次結構或與其結合之情形，該抗體的結合部位可使用X射線結構分析，藉由特定出鄰接該抗體之抗原上的胺基酸殘基而決定。例如，可藉由使抗體或其片段及抗原或其片段結合而結晶化，且進行結構分析，而特定出與抗體具有相互作用距離之抗原上的胺基酸殘基。相互作用距離為8Å以下，較佳為6Å以下，更佳為4Å以下。具有該種與抗體之相互作用距離的胺基酸殘基，能夠以1個或其以上來構成抗體的抗原結合部位(抗原決定區)。該胺基酸殘基為2個以上之情形，各胺基酸可在一維序列(primary sequence)上並不彼此鄰接。
本發明之抗HLA/NY-ESO抗體或其結合片段係特異性地辨識存在於HLA/NY-ESO的胺基酸序列中的複數之胺基酸。辨識彼等複數之胺基酸、於對HLA/NY-ESO之結合上與本發明之抗體或其結合片段競爭、或與彼等複數之胺基酸具有相互作用距離的抗體或其結合片段，亦包含在本發明中。進一步，包含該種抗體或其結合片段之多重特異性抗體，亦包含在本發明中。
6.醫藥組成物 本發明包含抗癌劑，其作為有效成分而包含本發明之抗HLA/NY-ESO抗體或者是與HLA/NY-ESO結合的多重特異性分子。
本發明之抗癌劑可使用於選自惡性腫瘤、肉瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、胚細胞瘤、腦腫瘤、類癌、神經胚細胞瘤、視網膜胚細胞瘤、腎胚細胞瘤的一種或複數種。具體而言，惡性腫瘤可舉出腎癌、黑色素瘤、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、結膜癌、口腔癌、喉頭癌、咽癌、甲狀腺癌、肺癌(非小細胞肺癌(腺癌、鱗狀上皮細胞癌、大細胞癌)、小細胞肺癌)、乳癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌、闌尾癌、肛門癌、肝癌、膽囊癌、膽管癌、胰臟癌、腎上腺癌、膀胱癌、***癌、子宮癌、***癌等，肉瘤可舉出脂肪肉瘤、血管肉瘤、軟骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、伊文氏肉瘤、骨肉瘤、未分化多形性肉瘤、纖維黏液樣肉瘤、惡性周邊神經鞘腫瘤、後腹膜肉瘤、滑膜肉瘤、子宮肉瘤、胃腸道間質瘤、平滑肌肉瘤、上皮樣肉瘤等，淋巴瘤可舉出B細胞淋巴瘤、T/NK細胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤等，白血病可舉出骨髓性白血病、淋巴性白血病、骨髓增生性疾病、骨髓增生不良症候群等，骨髓瘤可舉出多發性骨髓瘤等，胚細胞瘤可舉出睪丸癌、卵巢癌等，腦腫瘤可舉出神經膠質瘤、腦脊髓膜瘤等。
本發明之抗癌劑可含有治療有效量的抗HLA/NY-ESO抗體或與HLA/NY-ESO結合的多重特異性分子與藥學上可容許的擔體、稀釋劑、助溶劑、乳化劑、保存劑、佐劑等。「藥學上可容許的擔體」等可因應對象疾病的種類或藥劑的投予形態而自廣泛範圍適當選擇。本發明之抗癌劑的投予方法可適當選擇，但例如可注射投予，可採用局部注入、腹腔內投予、選擇性靜脈內注入、靜脈注射、皮下注射、臟器灌注液注入等。又，注射用的溶液可使用由鹽溶液、葡萄糖溶液、或鹽水與葡萄糖溶液之混合物、各種的緩衝液等而成之擔體(carrier)來進行製劑化。又，亦能以下述方法調製注射液：以粉末狀態進行製劑化，於使用時與前述液體擔體混合。
關於其他的投予方法，亦可於製劑開發時適當選擇。例如於經口投予之情形，可適用經口液劑或散劑、丸劑、囊劑及錠劑等。於經口液劑之情形，可作為懸浮劑及糖漿劑等之類的經口液體調整物，而使用水、蔗糖、山梨醇、果糖等之醣類、PEG等之二醇類、芝麻油、大豆油等之油類、對羥苯甲酸烷酯等之防腐劑、草莓風味、薄荷等之風味劑類等來製造。散劑、丸劑、囊劑及錠劑，可使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇等之賦形劑、澱粉、海藻酸鈉等之崩散劑、硬脂酸鎂、滑石等之潤滑劑、聚乙烯醇、羥丙基纖維素、明膠等之結合劑、脂肪酸酯等之表面活性劑、甘油等之塑化劑等來製劑化。於所謂容易投予之點，錠劑及囊劑為此發明之組成物中的較佳單位投予形態。於製造錠劑或囊劑之際，係使用固體的製造擔體。
對用於治療有效的抗HLA/NY-ESO抗體或與HLA/NY-ESO結合的多重特異性分子之量，係按照治療之病徵的性質、患者的年齡或狀態來變更，最終來說若醫師決定即可。例如，1次每1kg體重0.0001mg～100mg。規定的投予量可1～180日中投予1次，亦可設為每1日2次、3次、4次或其以上之分次投予而以適當的間隔投予。
又，本發明亦包含醫藥組成物，其作為有效成分而包含本發明之抗HLA/NY-ESO抗體或包含與HLA/NY-ESO結合的多重特異性分子所包含的胺基酸序列之多核苷酸、包含該多核苷酸之載體、及包含該多核苷酸或載體之細胞、以及該多核苷酸、該載體及該細胞之任意者。該醫藥組成物較佳為抗癌劑。
進而，本發明之醫藥組成物可與其他的藥劑組合而使用。就其他的藥劑而言，化學治療劑、放射線療法、生物醫藥品等並未特別限定，與本發明之醫藥組成物同時或以不同的時程，能夠作為包含本發明之醫藥組成物的單一製劑、或作為2個以上之不同的製劑或者是療法，而投予或適用。 [實施例]
以下於實施例中進一步詳細地說明本發明，但本發明不受限於此等。
此外，於下述實施例中，有關於基因操作之各操作只要沒有特別明示，則根據「分子選殖(Molecular Cloning)」(Sambrook, J., Fritsch, E.F.及Maniatis, T.著, 由Cold SpringHarbor Laboratory Press於1989年發行)所記載之方法及其他之發明所屬技術領域中具有通常知識者使用之實驗書所記載之方法來進行，或於使用市售的試藥或套組之情形則按照市售品的說明書進行。用於基因合成或載體構築之必要的引子合成，因應需要而委託合成(Fasmac Co., Ltd.、Thermo Fisher Scientific公司、及Eurofins Genomics公司)。
(實施例1)　源自人類抗體噬菌體資料庫(phage library)之抗HLA/NY-ESO抗體的取得 1)-1　HLA/NY-ESO抗原蛋白質之調製 將由使HLA-A* 0201(基因銀行：ASA47534.1)之截短型(生物素連接酶(Biotin ligase)辨識序列附加：序列識別號33)與β2-微球蛋白(UniProtKB-P61769：序列識別號34)各個表現之大腸菌(BL21(DE3)，Agilent Technologies公司)調製之各包涵體(inclusion body)與NY-ESO肽：SLLMWITQC(序列表之序列識別號1)藉由高倍數稀釋而再摺疊(refolding)後，以凝膠過濾管柱(Superdex 200 10/300，GE Healthcare公司)調製HLA-A* 0201/β2-微球蛋白/NY-ESO肽複合體(以下標記為HLA/NY-ESO)。
使用MAGEC-1肽：ILFGISLREV(序列表之序列識別號2)作為陰性對照(negative control)抗原，同樣地進行再摺疊，調製HLA-A* 0201/β2-微球蛋白/MAGEC-1肽複合體(=以下標記為HLA/MC1)。進一步，所調製的HLA/NY-ESO及HLA/MC1，係以大腸菌的生物素連接酶進行生物素化後，以凝膠過濾管柱(Superdex 200 10/300、GE Healthcare公司)進行劃分，調製各生物素化蛋白質。
1)-2　具有與HLA/NY-ESO之結合能力的scFv之單離 由人類抗體噬菌體資料庫單離與HLA/NY-ESO結合的scFv。首先，將噬菌體添加至生物素化HLA/MC1經固相化而成之鏈親和素磁珠(Dynabeads streptavidin) M-280(Thermo Fisher Scientific公司)，回收不結合的噬菌體。接著，添加生物素化HLA/NY-ESO經固相化而成之鏈親和素磁珠M-280Ag，藉由使用磁座(DynaMag‐2，Thermo Fisher Scientific公司)的清洗操作來除去不結合的噬菌體。
然後，使大腸菌(XL-1 Blue，Agilent Technologies公司)感染與HLA/NY-ESO結合的噬菌體，將與HLA/NY-ESO結合的噬菌體回收、增幅。實施合計3次的篩選(panning)後，由多株的噬菌質粒(phagemid)轉載至於scFv的羧基末端附加FLAG標記、His標記之大腸菌用的表現載體之後，將大腸菌轉形，在IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(Sigma-Aldrich公司)存在下使scFv表現，供予利用ELISA之篩選。
1)-3　利用ELISA之HLA/NY-ESO結合scFv的篩選 對384孔Maxi-sorp盤(黑色，Nunc公司)添加以PBS(含有0.138M氯化鈉、0.0027M氯化鉀的0.01M磷酸緩衝生理食鹽水(pH7.4)，Sigma-Aldrich公司)稀釋為1μg/mL的中性親和素(NeutrAvidin)(Life Technologies公司)各50μL，於4℃靜置一晚進行固相化。以含0.05%之Tween-20(Bio-Rad公司)的PBS(ELISA緩衝液)清洗3次後，添加以PBS稀釋為1μg/mL之實施例1)-2中亦使用的生物素化HLA/NY-ESO，而於室溫振盪1小時。以ELISA緩衝液清洗3次後，以酪蛋白阻斷劑(Blocker Casein)(Thermo Fisher Scientific公司)進行阻斷，以ELISA緩衝液清洗3次。然後，添加已表現scFv之大腸菌的培養液，使其於室溫反應2小時。以ELISA緩衝液清洗3次後，添加50μL之以ELISA緩衝液稀釋為5000倍的山葵過氧化酶(Horseradish peroxidase(HRP))標識抗FLAG抗體(Sigma-Aldrich公司)，使其於室溫反應1小時。以ELISA緩衝液清洗5次後，添加SuperSignal Pico ELISA化學螢光受質(Thermo Fisher Scientific公司)，以讀盤儀(plate reader)(Envision 2104 Multilabel Reader，Perkin Elmer公司)測定10分鐘後的化學發光，分離與HLA/NY-ESO結合的ELISA陽性選殖株(clone)。
1)-4　ELISA陽性選殖株NY-R119的核苷酸序列及胺基酸序列之決定 從1)-3中所取得之ELISA陽性選殖株之中，作為對HLA/NY-ESO之結合能強且辨識特異性優異之scFv而挑選NY-R119。以Dye Terminator法(BigDye(註冊商標)Terminator v3.1，Thermo Fisher Scientific公司)實施NY-R119之重鏈及輕鏈可變區的核苷酸序列的解析。用於序列解析的引子序列如下。 引子A：5’-CTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGA-3’(序列表之序列識別號3(圖10)) 引子B：5’-ATAACAATTTCACACAGGAAA CAGCTATGA-3’(序列表之序列識別號4(圖11))
將編碼所決定之NY-R119的重鏈之可變區之cDNA的核苷酸序列呈示於序列識別號5(圖12)，將胺基酸序列呈示於序列識別號6(圖13)。
將編碼所決定之NY-R119的輕鏈之可變區之cDNA的核苷酸序列呈示於序列識別號7(圖14)，將胺基酸序列呈示於序列識別號8(圖15)。
IMGT之CDR定義中之NY-R119的CDR序列，係各自CDRH1呈示於序列識別號54(圖61)，CDRH2呈示於序列識別號55(圖61)，CDRH3呈示於序列識別號56(圖61)，CDRL1呈示於序列識別號57(圖61)，CDRL2呈示於序列識別號58(圖61)，CDRL3呈示於序列識別號59(圖61)。
1)-5　NYA-0001之製作 1)-5-1　NYA-0001表現載體的構築 為了調製各種評價用試樣，構築NY-R119之哺乳培養用表現載體。又將於哺乳培養細胞所表現之NY-R119命名為NYA-0001。NY-R119與NYA-0001的scFv部分、重鏈及輕鏈之可變區、以及CDRH1～3及CDRL1～3由同一胺基酸序列而成。以In-Fusion HD選殖套組(CLONTECH公司)將編碼NYA-0001之DNA片段***以pcDNA3.3(Thermo Fisher Scientific公司)為骨架的哺乳動物細胞用表現載體，構築NYA-0001表現載體。
所構築之NYA-0001表現載體的核苷酸序列係進行再解析，確認NYA-0001全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號69(圖70)所示核苷酸序列。又，由上述核苷酸序列，該序列所編碼之NYA-0001全長的胺基酸序列為序列識別號70(圖71)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第266號的胺基酸序列為NYA-0001，第267號至第292號的胺基酸序列為Flag-His標記。又，第46號至第53號的胺基酸序列為CDRH1，第71號至第78號的胺基酸序列為CDRH2，第117號至第129號的胺基酸序列為CDRH3。又，第181號至第188號的胺基酸序列為CDRL1，第206號至第208號的胺基酸序列為CDRL2，第245號至第256號的胺基酸序列為CDRL3。
1)-5-2　NYA-0001表現、純化 Expi293F細胞(Thermo Fisher Scientific公司)係按照手冊進行繼代、培養。以Expi293 Expression medium (Thermo Fisher Scientific公司)稀釋處於對數增殖期的Expi293F細胞培養液，使其成為2.5×106 個細胞/mL，用於NYA-0001的生產。於20mL的Opti-Pro SFM培養基(Thermo Fisher Scientific公司)中加入NYA-0001表現載體0.3mg與0.9mg的聚乙烯亞胺(polyethylenimine) (Polyscience #24765)而溫和地攪拌，於進一步放置5分鐘之後添加至Expi293F細胞。在37℃、8%CO2 培養箱以135rpm振盪培養6天所得之培養上清液以0.2μm過濾器(Millipore公司)過濾，得到NYA-0001的培養上清液。純化係以Ni Sepharose excel(GE Healthcare公司)沖提後進行濃縮，以經25mM組胺酸、300mM NaCl、5%山梨醇、pH6.0平衡之凝膠過濾管柱(Superdex 200 Increase、GE Healthcare公司)進行純化。純化蛋白質試樣係供予分析用粒徑篩析層析法(SEC)，決定純度與濃度之後，用於各種評價。
(實施例2)　NYA-0001變異體之製作 2)-1　NYA-0001變異體的取得 使用以NYA-0001基因為模板而利用PCR來導入變異之方法(Error-prone-based library)、或對CDR之全殘基的各殘基每個合成隨機變異為20種類的胺基酸的寡聚物而構築資料庫之方法(oligo‐based library)，構築噬菌體資料庫，進行高結合能選殖株的篩選，作為高結合能變異體而取得NYA-0060、NYA-0068、NYA-0082，決定各核苷酸序列。
將編碼取得之NYA-0060的重鏈之可變區之cDNA的核苷酸序列呈示於序列識別號9(圖16)，將胺基酸序列呈示於序列識別號10(圖17)。
將編碼取得之NYA-0060的輕鏈之可變區之cDNA的核苷酸序列呈示於序列識別號11(圖18)，將胺基酸序列呈示於序列識別號12(圖19)。
將編碼取得之NYA-0068的重鏈之可變區之cDNA的核苷酸序列呈示於序列識別號13(圖20)，將胺基酸序列呈示於序列識別號14(圖21)。
將編碼取得之NYA-0068的輕鏈之可變區之cDNA的核苷酸序列呈示於序列識別號15(圖22)，將胺基酸序列呈示於序列識別號16(圖23)。
將編碼取得之NYA-0082的重鏈之可變區之cDNA的核苷酸序列呈示於序列識別號17(圖24)，將胺基酸序列呈示於序列識別號18(圖25)。
將編碼取得之NYA-0082的輕鏈之可變區之cDNA的核苷酸序列呈示於序列識別號19(圖26)，將胺基酸序列呈示於序列識別號20(圖27)。
2)-2　利用由NYA-0060、NYA-0068、NYA-0082鑑定之變異部位及組合的高結合能變異體之製作 以In-Fusion HD選殖套組(CLONTECH公司)將編碼具有NYA-0060、NYA-0068各自之變異部位的NYA-1163、NYA-2023之DNA片段***以pcDNA3.3(Thermo Fisher Scientific公司)為骨架的哺乳動物細胞用表現載體，構築哺乳動物細胞用scFv表現載體。
又，作為由NYA-0060、NYA-0068、NYA-0082鑑定之變異部位及彼等之組合，而設計NYA-2027、NYA-1143、NYA-2143。藉由對1)-5中構築之NYA-0001表現載體導入部位特異性變異、或者是以In-Fusion HD選殖套組(CLONTECH公司)將編碼目標scFv之DNA片段***以pcDNA3.3(Thermo Fisher Scientific公司)為骨架的哺乳動物細胞用表現載體，而構築各哺乳動物細胞用scFv表現載體。
所構築之scFv表現載體的核苷酸序列係進行再解析，確認NYA-1163全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號21(圖28)所示核苷酸序列。
確認NYA-2023全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號22(圖29)所示核苷酸序列。
確認NYA-2027全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號23(圖30)所示核苷酸序列。
確認NYA-1143全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號24(圖31)所示核苷酸序列。
確認NYA-2143全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號25(圖32)所示核苷酸序列。
又，由上述核苷酸序列，確認該序列所編碼之NYA-1163、NYA-2023、NYA-2027、NYA-1143及NYA-2143全長的胺基酸序列。
NYA-1163全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號26(圖33)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第266號的胺基酸序列為NYA-1163，第267號至第292號的胺基酸序列為Flag-His標記。又，第46號至第53號的胺基酸序列為CDRH1，第71號至第78號的胺基酸序列為CDRH2，第117號至第129號的胺基酸序列為CDRH3。又，胺基酸編號181號至188號為CDRL1，胺基酸編號206號至208號為CDRL2，胺基酸編號245號至256號為CDRL3。
NYA-2023全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號27(圖34)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第266號的胺基酸序列為NYA-2023，第267號至第292號的胺基酸序列為Flag-His標記。又，第46號至第53號的胺基酸序列為CDRH1，第71號至第78號的胺基酸序列為CDRH2，第117號至第129號的胺基酸序列為CDRH3。又，胺基酸編號181號至188號為CDRL1，胺基酸編號206號至208號為CDRL2，胺基酸編號245號至256號為CDRL3。
NYA-2027全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號28(圖35)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第266號的胺基酸序列為NYA-2027，第267號至第292號的胺基酸序列為Flag-His標記。又，第46號至第53號的胺基酸序列為CDRH1，第71號至第78號的胺基酸序列為CDRH2，第117號至第129號的胺基酸序列為CDRH3。又，胺基酸編號181號至188號為CDRL1，胺基酸編號206號至208號為CDRL2，胺基酸編號245號至256號為CDRL3。
NYA-1143全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號29(圖36)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第266號的胺基酸序列為NYA-1143，第267號至第292號的胺基酸序列為Flag-His標記。又，第46號至第53號的胺基酸序列為CDRH1，第71號至第78號的胺基酸序列為CDRH2，第117號至第129號的胺基酸序列為CDRH3。又，胺基酸編號181號至188號為CDRL1，胺基酸編號206號至208號為CDRL2，胺基酸編號245號至256號為CDRL3。
NYA-2143全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號30(圖37)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第266號的胺基酸序列為NYA-2143，第267號至第292號的胺基酸序列為Flag-His標記。又，第46號至第53號的胺基酸序列為CDRH1，第71號至第78號的胺基酸序列為CDRH2，第117號至第129號的胺基酸序列為CDRH3。又，胺基酸編號181號至188號為CDRL1，胺基酸編號206號至208號為CDRL2，胺基酸編號245號至256號為CDRL3。
此外，NYA-1163的CDR序列全部與NYA-0001的CDR序列相同。又，NYA-1143、NYA-2143及NYA-2023的CDR序列係相同，CDRH1呈示於序列識別號54(圖61)，CDRH2呈示於序列識別號55(圖61)，CDRH3呈示於序列識別號56(圖61)，CDRL1呈示於序列識別號60(圖62)，CDRL2呈示於序列識別號58(圖61)，CDRL3呈示於序列識別號59(圖61)。進一步，NYA-2027的CDR序列係CDRH1呈示於序列識別號54(圖61)，CDRH2呈示於序列識別號55(圖61)，CDRH3呈示於序列識別號56(圖61)，CDRL1呈示於序列識別號57(圖61)，CDRL2呈示於序列識別號58(圖61)，CDRL3呈示於序列識別號61(圖63)。
又，設計將高結合能選殖株的篩選之際所觀察到的結合變異部位組合而成之NYA-1154，對NYA-0001表現載體導入部位特異性變異，藉此而構築以pcDNA3.3(Thermo Fisher Scientific公司)為骨架的NYA-1154表現載體。所構築之scFv表現載體的核苷酸序列係進行再解析，確認為序列識別號31(圖38)所示核苷酸序列。由上述核苷酸序列，確認該序列所編碼之NYA-1154全長的胺基酸序列(序列識別號32(圖39))。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第266號的胺基酸序列為NYA-1154，第267號至第292號的胺基酸序列為Flag-His標記。又，第46號至第53號的胺基酸序列為CDRH1，第71號至第78號的胺基酸序列為CDRH2，第117號至第129號的胺基酸序列為CDRH3。又，胺基酸編號181號至188號為CDRL1，胺基酸編號206號至208號為CDRL2，胺基酸編號245號至256號為CDRL3。
NYA-1154的CDR序列係各自為CDRH1呈示於序列識別號54(圖61)，CDRH2呈示於序列識別號55(圖61)，CDRH3呈示於序列識別號62(圖64)，CDRL1呈示於序列識別號57(圖61)，CDRL2呈示於序列識別號58(圖61)，CDRL3呈示於序列識別號63(圖64)。
以與1)-5-2同樣的方法使NYA-1163、NYA-2023、NYA-2027、NYA-1143、NYA-2143及NYA-1154表現，純化各目標scFv。純化蛋白質試樣係供予分析用SEC，決定純度與濃度之後，用於各種測定。
2)-3　NYA-1143變異體製作 2)-3-1　NYA-2035之製作 作為NYA-1143之變異體而設計NYA-2035，藉由對哺乳動物細胞用NYA-1143表現載體導入部位特異性變異來構築NYA-2035表現載體。所構築之scFv表現載體的核苷酸序列係進行再解析，確認為序列識別號35(圖42)所示核苷酸序列。由上述核苷酸序列，決定該序列所編碼之NYA-2035全長的胺基酸序列(序列識別號36(圖43))。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第266號的胺基酸序列為NYA-2035，第267號至第292號的胺基酸序列為Flag-His標記。又，第46號至第53號的胺基酸序列為CDRH1，第71號至第78號的胺基酸序列為CDRH2，第117號至第129號的胺基酸序列為CDRH3。又，胺基酸編號181號至188號為CDRL1，胺基酸編號206號至208號為CDRL2，胺基酸編號245號至256號為CDRL3。IMGT之CDR定義中之NYA-2035的CDR序列，係各自CDRH1呈示於序列識別號54(圖61)，CDRH2呈示於序列識別號55(圖61)，CDRH3呈示於序列識別號56(圖61)，CDRL1呈示於序列識別號64(圖65)，CDRL2呈示於序列識別號58(圖61)，CDRL3呈示於序列識別號59(圖61)。
2)-3-2　NYA-1143CDR接枝變異體之製作 以物性提升為目標，設計NYA-1143CDR接枝變異體。將NYA-1143之VH及VL的架構區之序列、與於KABAT et al.(Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda,MD.(1991))中所既定之人類的子群･一致序列或胚原序列(germline sequence)的架構區進行比較。其結果，作為於其架構區中具有高序列相同性的受體，針對VH係選擇人類胚原序列IGHV3_30*15與人類γ鏈子群3的一致序列，針對VL係選擇人類胚原序列IGLV1-44*01。接著，使各受體之架構區的胺基酸殘基與NYA-1143的胺基酸殘基對齊，鑑定使用不同胺基酸的殘基。
接著，使用NYA-1143的三維模型，參考由Queen et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033 (1989))所賦予之基準等，選擇應植入受體上的框架殘基。藉由以上之手法，作為NYA-1143之VH部分的CDR接枝變異胺基酸序列，而設計NYA-1143-VH01、NYA-1143-VH02、NYA-1143-VH03。各該胺基酸序列為序列識別號37(圖44)、38(圖45)、39(圖46)。作為NYA-1143之VL部分的CDR接枝變異胺基酸序列，而設計NYA-1143-VL01。各該胺基酸序列為序列識別號40(圖47)。
組合所設計之各VH及VL序列，設計以下所示各種scFv。將以NYA-1143-VH01的胺基酸序列取代了NYA-1143之VH部分的scFv命名為NYA-2044。又將以NYA-1143-VL01的胺基酸序列取代了NYA-2044之VL部分的scFv命名為NYA-2045。
將以NYA-1143-VH02的胺基酸序列取代了NYA-1143之VH部分的scFv命名為NYA-2047。又將以NYA-1143-VL01的胺基酸序列取代了NYA-2047之VL部分的scFv命名為NYA-2048。
將以NYA-1143-VH03的胺基酸序列取代了NYA-1143之VH部分的scFv命名為NYA-2060。又將以NYA-1143-VL01的胺基酸序列取代了NYA-2060之VL部分的scFv命名為NYA-2061。
所設計之各種NYA-1143CDR接枝變異體，係將DNA片段全合成(FASMAC公司)，以In-Fusion HD 選殖套組(CLONTECH公司)結合DNA片段，藉此而構築以pcDNA3.3(Thermo Fisher Scientific公司)為骨架的哺乳動物細胞用scFv表現載體。
所構築之scFv表現載體的核苷酸序列係進行再解析，確認NYA-2044全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號41(圖48)所示核苷酸序列。
確認NYA-2045全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號42(圖49)所示核苷酸序列。
確認NYA-2047全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號43(圖50)所示核苷酸序列。
確認NYA-2048全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號44(圖51)所示核苷酸序列。
確認NYA-2060全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號45(圖52)所示核苷酸序列。
確認NYA-2061全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號46(圖53)所示核苷酸序列。
又，由上述核苷酸序列，決定該序列所編碼之NYA-2044、NYA-2045、NYA-2047、NYA-2048、NYA-2060、及NYA-2061全長的胺基酸序列。此外，NYA-2044、NYA-2045、NYA-2047、NYA-2048、NYA-2060、及NYA-2061的CDR序列係與NYA-1143相同。
NYA-2044全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號47(圖54)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第266號的胺基酸序列為NYA-2044，第267號至第292號的胺基酸序列為Flag-His標記。又，第46號至第53號的胺基酸序列為CDRH1，第71號至第78號的胺基酸序列為CDRH2，第117號至第129號的胺基酸序列為CDRH3。又，胺基酸編號181號至188號為CDRL1，胺基酸編號206號至208號為CDRL2，胺基酸編號245號至256號為CDRL3。
NYA-2045全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號48(圖55)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第266號的胺基酸序列為NYA-2045，第267號至第292號的胺基酸序列為Flag-His標記。又，第46號至第53號的胺基酸序列為CDRH1，第71號至第78號的胺基酸序列為CDRH2，第117號至第129號的胺基酸序列為CDRH3。又，胺基酸編號181號至188號為CDRL1，胺基酸編號206號至208號為CDRL2，胺基酸編號245號至256號為CDRL3。
NYA-2047全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號50(圖57)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第266號的胺基酸序列為NYA-2047，第267號至第292號的胺基酸序列為Flag-His標記。又，第46號至第53號的胺基酸序列為CDRH1，第71號至第78號的胺基酸序列為CDRH2，第117號至第129號的胺基酸序列為CDRH3。又，胺基酸編號181號至188號為CDRL1，胺基酸編號206號至208號為CDRL2，胺基酸編號245號至256號為CDRL3。
NYA-2048全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號51(圖58)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第266號的胺基酸序列為NYA-2048，第267號至第292號的胺基酸序列為Flag-His標記。又，第46號至第53號的胺基酸序列為CDRH1，第71號至第78號的胺基酸序列為CDRH2，第117號至第129號的胺基酸序列為CDRH3。又，胺基酸編號181號至188號為CDRL1，胺基酸編號206號至208號為CDRL2，胺基酸編號245號至256號為CDRL3。
NYA-2060全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號52(圖59)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第266號的胺基酸序列為NYA-2060，第267號至第292號的胺基酸序列為Flag-His標記。又，第46號至第53號的胺基酸序列為CDRH1，第71號至第78號的胺基酸序列為CDRH2，第117號至第129號的胺基酸序列為CDRH3。又，胺基酸編號181號至188號為CDRL1，胺基酸編號206號至208號為CDRL2，胺基酸編號245號至256號為CDRL3。
NYA-2061全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號53(圖60)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第266號的胺基酸序列為NYA-2061，第267號至第292號的胺基酸序列為Flag-His標記。又，第46號至第53號的胺基酸序列為CDRH1，第71號至第78號的胺基酸序列為CDRH2，第117號至第129號的胺基酸序列為CDRH3。又，胺基酸編號181號至188號為CDRL1，胺基酸編號206號至208號為CDRL2，胺基酸編號245號至256號為CDRL3。
2)-3-3　NYA-1143變異體的表現、純化 以與1)-5-2同樣的方法使2)-3-1及2)-3-2中製作之NYA-2035、NYA-2044、NYA-2045、NYA-2047、NYA-2048、NYA-2060、及NYA-2061表現，純化各目標scFv。純化蛋白質試樣係供予分析用SEC，決定純度與濃度之後，用於各種測定。
(實施例3)　抗HLA/NY-ESOh參照抗體之scFv製作 設計對HLA/NY-ESO具有高結合能的抗體3M4E5及T1(WO2010/106431)之scFv，將3M4E5之scFv命名為NYC-0003，將T1之scFv命名為NYC-0004。
將NYC-0003及NYC-0004之各DNA片段全合成(Thermo Fisher Scientific公司)，以In-Fusion HD 選殖套組(CLONTECH公司)構築以pcDNA3.3(Thermo Fisher Scientific公司)為骨架的哺乳動物細胞用scFv表現載體。
所構築之scFv表現載體的核苷酸序列係進行再解析，確認NYC-0003及NYC-0004全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號65(圖66)及序列識別號66(圖67)所示核苷酸序列。又，由上述核苷酸序列，該序列所編碼之NYC-0003全長的胺基酸序列為序列識別號67(圖68)所示胺基酸序列，而且NYC-0004全長的胺基酸序列為序列識別號68(圖69)所示胺基酸序列。
以與1)-5-2同樣的方法，使NYC-0003及NYC-0004表現，純化各目標scFv。各純化蛋白質試樣係供予分析用SEC，決定純度與濃度之後，用於各種測定。
(實施例4)　利用Biacore之對HLA/NY-ESO之結合能評價 使用Biacore T200，對經固定化之抗His抗體作為配體而捕捉(capture)抗HLA/NY-ESO scFv，且作為分析物而測定抗原。抗原係使用1)-1中調製的HLA/NY-ESO。抗His抗體(His Capture kit，GE Healthcare公司)係對感測晶片CM5(GE Healthcare公司)，按照套組說明書進行固定化。以HBS-EP+(GE Healthcare公司)稀釋為0.5μg/mL而進行評價的各抗HLA/NY-ESO scFv，以10μL/min接觸60秒鐘而進行固定化。然後，將以HBS-EP+稀釋之複數濃度的HLA/NY-ESO作為分析物而以流速30μL/min添加各試樣120秒鐘，藉由測定600秒鐘解離之單循環動力學(Single-cycle kinetics)解析而計算KD ，且將結果記載於表1。顯示相較於母抗體 NYA-0001，其變異體皆對HLA/NY-ESO之結合變強。又相較於NYC-0004，NYA-1143、NYA-2023、NYA-2143、NYA-2044、NYA-2045、NYA-2060及NYA-2061係結合強，且其中NYA-1143、NYA-2044、NYA-2045、NYA-2143顯示顯示KD 為1nM以下。
[表1]
選殖株名 KD (nM)
NYA-0001 33.8
NYA-1143 1.0
NYA-1163 13.0
NYA-2023 2.4
NYA-2027 11.2
NYA-2035 3.2
NYA-2044 0.8
NYA-2045 0.8
NYA-2047 5.3
NYA-2048 6.3
NYA-2060 1.1
NYA-2061 1.5
NYA-2143 0.9
NYC-0003 8.1
NYC-0004 2.8
(實施例5)　抗HLA/NY-ESO scFv之NY-ESO肽內的辨識胺基酸解析 將人類淋巴母芽細胞(lymphoblastoid cell)融合細胞株T2(ATCC)細胞以含20%FBS之AIM-V培養基(Thermo Fisher Scientific公司)調整為適當的濃度，以最終濃度成為50μM之方式添加經以DMSO溶解為5mM的NY-ESO肽(序列識別號1)、點突變NY-ESO肽1F、2M、3A、4A、5A、6L、7F、8A、9A(序列識別號121(圖122)、122(圖123)、123(圖124)、124(圖125)、125(圖126)、126(圖127)、127(圖128)、128(圖129)、129(圖130))、gp100肽(序列識別號130(圖131))(皆為Sigma Genosys公司)之溶液，或是添加1/100量的DMSO，於37℃保溫4小時。以含20%FBS之AIM-V培養基清洗2次後，以含5%FBS之PBS調製為適當的濃度，添加LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit(ThermoFisher Scientific公司)，於4℃靜置30分鐘。以含5%FBS之PBS清洗2次後，將細胞分為2邊，以含5%FBS之PBS以105 細胞/孔接種於96孔U形底微量盤，離心後除去上清液。針對一方的細胞，將以含5%FBS之PBS稀釋為100nM之抗HLA/NY-ESO scFv添加25μL/孔，於4℃靜置30分鐘。以含5%FBS之PBS清洗2次後，將以含5%FBS之PBS稀釋之Penta-His Alexa Fluor488(QIAGEN公司)添加25μL/孔，於4℃靜置30分鐘。以含5%FBS之PBS清洗2次後，將以含5%FBS之PBS稀釋之抗小鼠IgG Alexa Fluor488(Thermo Fisher Scientific公司)添加25μL/孔，於4℃靜置30分鐘。以含5%FBS之PBS清洗2次後，以Mildform 10N(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)固定一晚後，以含5%FBS之PBS進行再懸浮。為了以HLA/肽複合體量進行標準化，針對另一方的細胞，將以含5%FBS之PBS稀釋為10μg/mL之HLA-A2抗體BB7.2-Alexa Fluor 488、或是小鼠IgG2b-Alexa Fluor 488，添加25μL/孔，於4℃靜置30分鐘。以含5%FBS之PBS清洗2次後，以Mildform 10N(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)固定一晚後，以含5%FBS之PBS進行再懸浮。將此等細胞懸浮液以流式細胞儀(CantoII，Becton Dickinson公司)進行檢出。數據解析以Flowjo(Treestar公司)進行，測定T2細胞之去除死細胞的劃分(fraction)之Alexa Fluor 488的幾何學的平均螢光強度(gMFI)。顯示經T2細胞上的HLA/肽複合體量標準化之各scFv的結合性之值、標準化gMFI係以下式計算。
標準化gMFI=(A/B)×((C/D)/(E/F)) ・A/B=相對gMFI A：添加抗體之添加DMSO或是各肽的T2細胞之gMFI B：未添加抗體之添加DMSO或是各肽的T2細胞之gMFI ・(C/D)/(E/F)=添加DMSO或是各肽的T2細胞之HLA/肽複合體量校正值 C：添加HLA-A2抗體之添加DMSO或是各肽的T2細胞之gMFI D：添加小鼠IgG2b抗體之添加DMSO或是各肽的T2細胞之gMFI E：添加HLA-A2抗體之添加DMSO的T2細胞之gMFI F：添加小鼠IgG2b抗體之添加DMSO的T2細胞之gMFI
如圖1所示，由於與野生型NY-ESO肽比較，抗HLA/NY-ESO scFv NYA-0001、1143、2044、2045、2047、2048、2060、2061係對於添加在第1、4、5、7號之胺基酸導入點突變之肽的T2之結合性降低至一半以下，因此暗示辨識NY-ESO肽之第1、4、5、7號的胺基酸。同樣地，暗示NYA-1154係辨識第1、5號，NYA-1163係辨識第1、3、4、5、6、7號，NYA-2023、2027、2035係辨識第1、4、5號，NYA-2143係辨識第1、5、7號。在另一方面，暗示NYC-0003、0004係辨識第4、5號。
(實施例6)　抗HLA/NY-ESO scFv之抗原結合特異性評價 由人類蛋白質體(Swiss-Prot)之中，為了檢索有結合之可能性的與NY-ESO肽：SLLMWITQC(序列識別號1)胺基酸序列類似但不相同的人類肽(以下稱為「同源性肽」)，而進行被暗示本抗體多數所辨識之第1、4、5號為一致的9-mer肽之檢索。關於所檢索到的9-mer肽，以NetMHCPan2.8預測對於HLA-A0201之結合性，且選擇被預測IC50為500nM以下之圖2A所示9-mer肽作為用以評價抗HLA/NY-ESO scFv之結合特異性的同源性肽。將T2細胞以含20%FBS之AIM-V培養基(Thermo Fisher Scientific公司)調製為適當的濃度，以最終濃度成為50μM之方式添加經以DMSO溶解為5mM的NY-ESO肽(序列識別號1)、同源性肽DOLPP1、IL20RB、PRKD2、CD163、P2RY8(序列識別號131(圖132)、132(圖133)、133(圖134)、134(圖135)、135(圖136))、gp100肽(序列識別號130(圖131))(皆為Sigma Genosys公司)之溶液，或是添加1/100量的DMSO，以與實施例5同樣的方法評價各抗體之結合性。顯示經T2細胞上的HLA/肽複合體量標準化之各scFv的結合性之值、標準化gMFI係以下式計算。
標準化gMFI=(A/B)×((C/D)/(E/F)) ・A/B=相對gMFI A：添加抗體之添加DMSO或是各肽的T2細胞之gMFI B：未添加抗體之添加DMSO或是各肽的T2細胞之gMFI ・(C/D)/(E/F)=添加DMSO或是各肽的T2細胞之HLA/肽複合體量校正值 C：添加HLA-A2抗體之添加DMSO或是各肽的T2細胞之gMFI D：添加小鼠IgG2b抗體之添加DMSO或是各肽的T2細胞之gMFI E：添加HLA-A2抗體之添加DMSO的T2細胞之gMFI F：添加小鼠IgG2b抗體之添加DMSO的T2細胞之gMFI
如圖2B所示，抗HLA/NY-ESO scFv NYA-0001、1143、1163、2023、2027、2035、2044、2045、2047、2048、2060、2061、2143對任一添加同源性肽的細胞都不結合，暗示特異性高。在另一方面，NYA-1154、NYC-0003、0004可觀察到對一部分的添加同源性肽的T2細胞之結合。
(實施例7)　Fc附加型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子之製作 7)-1　Fc附加型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子表現載體之製作 7)-1-1　taFv-異二聚體Fc型雙特異性分子表現載體之製作 為了評價taFv-異二聚體Fc型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子，而設計各分子的表現載體。抗HLA/NY-ESO抗體係使用為NYA-1143、NYA-2143、NYA-1163、NYA-2023、NYA-2027、NYA-2035、NYA-2044、NYA-2045、NYA-2047、NYA-2048、NYA-2060及NYA-2061。抗CD3抗體係使用為人類化抗CD3scFv之C3E-7085(WO2018/117237)。異二聚體Fc序列係使用經導入使效應功能降低且使異多聚體形成之變異的Fc序列(WO2014/190441)。
合成編碼經導入使效應功能降低且使異多聚體形成之變異的Fc(HC1或者是HC2)之DNA片段(FASMAC公司)，以In-Fusion HD選殖套組(CLONTECH公司)製作以pcDNA3.3(Thermo Fisher Scientific公司)為骨架的哺乳動物細胞用表現載體，且命名為「p_HC1」。
製作對以GGGGS連接子連結了NYA-1143與C3E-7085而成之taFv的羧基末端併入有編碼HC2之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，且命名為「p_NYF-0016-HC2」。
對以GGGGS連接子連結了NYA-2143與C3E-7085而成之taFv的羧基末端併入有編碼HC2之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，係藉由對p_NYF-0016-HC2導入部位特異性變異來製作，且命名為「p_NYF-0019-HC2」。
對以GGGGS連接子連結了NYA-1163與C3E-7085而成之taFv的羧基末端併入有編碼HC2之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，係藉由使用In-Fusion HD選殖套組(CLONTECH公司)，將p_NYF-0016-HC2之編碼NYA-1143之鹼基序列部分以編碼NYA-1163之DNA片段取代而製作，且命名為「p_NYF-0022-HC2」。
對以GGGGS連接子連結了NYA-2023與C3E-7085而成之taFv的羧基末端併入有編碼HC2之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，係藉由對p_NYF-0016-HC2導入部位特異性變異來製作，且命名為「p_NYF-0023-HC2」。
對以GGGGS連接子連結了NYA-2027與C3E-7085而成之taFv的羧基末端併入有編碼HC2之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，係藉由對於對以GGGGS連接子連結了NYA-0001與C3E-7085而成之taFv的羧基末端併入有編碼HC2之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，施加部位特異性變異導入而製作，且命名為「p_NYF-0027-HC2」。
對以GGGGS連接子連結了NYA-2035與C3E-7085而成之taFv的羧基末端併入有編碼HC2之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，係藉由對p_NYF-0016-HC2導入部位特異性變異來製作，且命名為「p_NYF-0035-HC2」。
對以GGGGS連接子連結了NYA-2044與C3E-7085而成之taFv的羧基末端併入有編碼HC2之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，係藉由使用In-Fusion HD選殖套組(CLONTECH公司)，將p_NYF-0016-HC2之編碼NYA-1143之鹼基序列部分以編碼NYA-2044之DNA片段取代而製作，且命名為「p_NYF-0044-HC2」。
對以GGGGS連接子連結了NYA-2045與C3E-7085而成之taFv的羧基末端併入有編碼HC2之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，係藉由使用In-Fusion HD選殖套組(CLONTECH公司)，將p_NYF-0016-HC2之編碼NYA-1143之鹼基序列部分以編碼NYA-2045之DNA片段取代而製作，且命名為「p_NYF-0045-HC2」。
對以GGGGS連接子連結了NYA-2047與C3E-7085而成之taFv的羧基末端併入有編碼HC2之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，係藉由使用In-Fusion HD選殖套組(CLONTECH公司)，將p_NYF-0016-HC2之編碼NYA-1143之鹼基序列部分以編碼NYA-2047之DNA片段取代而製作，且命名為「p_NYF-0047-HC2」。
對以GGGGS連接子連結了NYA-2048與C3E-7085而成之taFv的羧基末端併入有編碼HC2之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，係藉由使用In-Fusion HD選殖套組(CLONTECH公司)，將p_NYF-0016-HC2之編碼NYA-1143之鹼基序列部分以編碼NYA-2048之DNA片段取代而製作，且命名為「p_NYF-0048-HC2」。
對以GGGGS連接子連結了NYA-2060與C3E-7085而成之taFv的羧基末端併入有編碼HC2之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，係藉由對p_NYF-0044-HC2導入部位特異性變異來製作，且命名為「p_NYF-0060-HC2」。
對以GGGGS連接子連結了NYA-2061與C3E-7085而成之taFv的羧基末端併入有編碼HC2之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，係藉由對p_NYF-0045-HC2導入部位特異性變異來製作，且命名為「p_NYF-0061-HC2」。
p_HC1的核苷酸序列係進行再解析，確認HC1全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號71(圖72)所示核苷酸序列。
p_NYF-0016-HC2的核苷酸序列係進行再解析，確認NYF-0016-HC2全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號72(圖73)所示核苷酸序列。
p_NYF-0019-HC2的核苷酸序列係進行再解析，確認NYF-0019-HC2全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號73(圖74)所示核苷酸序列。
p_NYF-0022-HC2的核苷酸序列係進行再解析，確認NYF-0022-HC2全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號74(圖75)所示核苷酸序列。
p_NYF-0023-HC2的核苷酸序列係進行再解析，確認NYF-0023-HC2全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號75(圖76)所示核苷酸序列。
p_NYF-0027-HC2的核苷酸序列係進行再解析，確認NYF-0027-HC2全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號76(圖77)所示核苷酸序列。
p_NYF-0035-HC2的核苷酸序列係進行再解析，確認NYF-0035-HC2全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號77(圖78)所示核苷酸序列。
p_NYF-0044-HC2的核苷酸序列係進行再解析，確認NYF-0044-HC2全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號78(圖79)所示核苷酸序列
p_NYF-0045-HC2的核苷酸序列係進行再解析，確認NYF-0045-HC2全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號79(圖80)所示核苷酸序列。
p_NYF-0047-HC2的核苷酸序列係進行再解析，確認NYF-0047-HC2全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號80(圖81)所示核苷酸序列。
p_NYF-0048-HC2的核苷酸序列係進行再解析，確認NYF-0048-HC2全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號81(圖82)所示核苷酸序列。
p_NYF-0060-HC2的核苷酸序列係進行再解析，確認NYF-0060-HC2全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號82(圖83)所示核苷酸序列。
p_NYF-0061-HC2的核苷酸序列係進行再解析，確認NYF-0061-HC2全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號83(圖84)所示核苷酸序列。
又，由上述核苷酸序列，確認該序列所編碼之HC1、NYF-0016-HC2、NYF-0019-HC2、NYF-0022-HC2、NYF-0023-HC2、NYF-0027-HC2、NYF-0035-HC2、NYF-0044-HC2、NYF-0045-HC2、NYF-0047-HC2、NYF-0048-HC2、NYF-0060-HC2、NYF-0061-HC2全長的胺基酸序列。
HC1全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號84(圖85)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第20號至第246號的胺基酸序列為HC。
NYF-0016-HC2全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號85(圖86)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第511號的胺基酸序列為NYA-1143-C3E-7085taFv，第512號至第513號的胺基酸序列為連接子，第514號至第745號的胺基酸序列為HC2。
NYF-0019-HC2全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號86(圖87)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第511號的胺基酸序列為NYA-2143-C3E-7085taFv，第512號至第513號的胺基酸序列為連接子，第514號至第745號的胺基酸序列為HC2。
NYF-0022-HC2全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號87(圖88)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第511號的胺基酸序列為NYA-1163-C3E-7085taFv，第512號至第513號的胺基酸序列為連接子，第514號至第745號的胺基酸序列為HC2。
NYF-0023-HC2全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號88(圖89)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第511號的胺基酸序列為NYA-2023-C3E-7085taFv，第512號至第513號的胺基酸序列為連接子，第514號至第745號的胺基酸序列為HC2。
NYF-0027-HC2全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號89(圖90)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第511號的胺基酸序列為NYA-2027-C3E-7085taFv，第512號至第513號的胺基酸序列為連接子，第514號至第745號的胺基酸序列為HC2。
NYF-0035-HC2全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號90(圖91)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第511號的胺基酸序列為NYA-2035-C3E-7085taFv，第512號至第513號的胺基酸序列為連接子，第514號至第745號的胺基酸序列為HC2。
NYF-0044-HC2全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號91(圖92)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第511號的胺基酸序列為NYA-2044-C3E-7085taFv，第512號至第513號的胺基酸序列為連接子，第514號至第745號的胺基酸序列為HC2。
NYF-0045-HC2全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號92(圖93)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第511號的胺基酸序列為NYA-2045-C3E-7085taFv，第512號至第513號的胺基酸序列為連接子，第514號至第745號的胺基酸序列為HC2。
NYF-0047-HC2全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號93(圖94)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第511號的胺基酸序列為NYA-2047-C3E-7085taFv，第512號至第513號的胺基酸序列為連接子，第514號至第745號的胺基酸序列為HC2。
NYF-0048-HC2全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號94(圖95)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第511號的胺基酸序列為NYA-2048-C3E-7085taFv，第512號至第513號的胺基酸序列為連接子，第514號至第745號的胺基酸序列為HC2。
NYF-0060-HC2全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號95(圖96)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第511號的胺基酸序列為NYA-2060-C3E-7085taFv，第512號至第513號的胺基酸序列為連接子，第514號至第745號的胺基酸序列為HC2。
NYF-0061-HC2全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號96(圖97)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第511號的胺基酸序列為NYA-2061-C3E-7085taFv，第512號至第513號的胺基酸序列為連接子，第514號至第745號的胺基酸序列為HC2。
7)-1-2　taFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子表現載體之製作 設計taFv-Fab-異二聚體Fc型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子表現用載體。抗HLA/NY-ESO抗體係使用NYA-0001。抗CD3抗體係使用為人類化抗CD3scFv之C3E-7085(WO2018/117237)。異二聚體Fc序列係使用經導入使效應功能降低且使異多聚體形成之變異的Fc序列(WO2014/190441)。
製作經併入有NYA-0001之重鏈可變區、及源自人類IgG之CH1域、及使效應功能降低且編碼HC1-k delete之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，且命名為「p_NYA-0001-Fab-HC1-k delete」。又製作經併入有NYA-0001輕鏈可變區、編碼源自人類IgG之CL區之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，且命名為「p_NYA-0001-LC」。
p_NYA-0001-Fab-HC1-k delete的核苷酸序列係進行再解析，確認NYA-0001-Fab-HC1-k delete全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號97(圖98)所示核苷酸序列。
p_NYA-0001-LC的核苷酸序列係進行再解析，確認NYA-0001-LC全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號98(圖99)所示核苷酸序列。
又，由上述核苷酸序列，確認該序列所編碼之NYA-0001-Fab-HC1-k delete及NYA-0001-LC全長的胺基酸序列。
NYA-0001-Fab-HC1-k delete全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號99(圖100)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第20號至第139號的胺基酸序列為可變區，第140號至第468號的胺基酸序列為恆定區。又，第45號至第52號的胺基酸序列為CDRH1(序列識別號54(圖61))，第70號至第77號的胺基酸序列為CDRH2(序列識別號55(圖61))，第116號至第128號的胺基酸序列為CDRH3(序列識別號56(圖61))。
NYA-0001-LC全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號100(圖101)所示胺基酸序列。第1號至第20號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第131號的胺基酸序列為可變區，第132號至第237號的胺基酸序列為恆定區。又，胺基酸編號46號至53號為CDRL1(序列識別號57(圖61))，胺基酸編號71號至73號為CDRL2(序列識別號58(圖61))，胺基酸編號110號至121號為CDRL3(序列識別號59(圖61))。
7)-2　Fc附加型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子的表現 7)-2-1　taFv-異二聚體Fc型雙特異性分子的表現 Expi293F細胞(Thermo Fisher Scientific公司)係按照手冊進行繼代、培養。以Expi293 Expression medium(Thermo Fisher Scientific公司)稀釋處於對數增殖期的Expi293F細胞培養液，使其成為2.5×106 個細胞/mL，用於各種雙特異性分子的生產。於20mL的Opti-Pro SFM培養基(Thermo Fisher Scientific公司)中加入以1:1.5之比率混合載體p_NYF-0016-HC2、p_HC1之載體混合物、0.3mg與0.9mg的聚乙烯亞胺(Polyscience #24765)而溫和地攪拌，於進一步放置5分鐘之後添加至Expi293F細胞。將在37℃、8%CO2 培養箱以135rpm振盪培養6天所得之培養上清液以0.2μm過濾器(Millopore公司)過濾，得到taFv-異二聚體Fc型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子(NYF-0016)的培養上清液。將使構成NYF-0016之各載體表現而得之胺基酸的序列，呈示於序列表之序列識別號85(圖86)及84(圖85)。
以同樣的手法使用p_NYF-0019-HC2、p_HC1，而進行taFv-異二聚體Fc型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子(NYF-0019)的培養上清液的表現、調製。將使構成NYF-0019之各載體表現而得之胺基酸的序列，呈示於序列表之序列識別號86(圖87)及84(圖85)。
使用p_NYF-0022-HC2、p_HC1，而進行taFv-異二聚體Fc型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子(NYF-0022)的培養上清液的表現、調製。將使構成NYF-0022之各載體表現而得之胺基酸的序列，呈示於序列表之序列識別號87(圖88)及84(圖85)。
使用p_NYF-0023-HC2、p_HC1，而進行taFv-異二聚體Fc型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子(NYF-0023)的培養上清液的表現、調製。將使構成NYF-0023之各載體表現而得之胺基酸的序列，呈示於序列表之序列識別號88(圖89)及84(圖85)。
使用p_NYF-0027-HC2、p_HC1，而進行taFv-異二聚體Fc型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子(NYF-0027)的培養上清液的表現、調製。將使構成NYF-002 7之各載體表現而得之胺基酸的序列，呈示於序列表之序列識別號89(圖90)及84(圖85)。
使用p_NYF-0035-HC2、p_HC1，而進行taFv-異二聚體Fc型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子(NYF-0035)的培養上清液的表現、調製。將使構成NYF-0035之各載體表現而得之胺基酸的序列，呈示於序列表之序列識別號90(圖91)及84(圖85)。
使用p_NYF-0044-HC2、p_HC1，而進行taFv-異二聚體Fc型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子(NYF-0044)的培養上清液的表現、調製。將使構成NYF-0044之各載體表現而得之胺基酸的序列，呈示於序列表之序列識別號91(圖92)及84(圖85)。
使用p_NYF-0045-HC2、p_HC1，而進行taFv-異二聚體Fc型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子(NYF-0045)的培養上清液的表現、調製。將使構成NYF-0045之各載體表現而得之胺基酸的序列，呈示於序列表之序列識別號92(圖93)及84(圖85)。
使用p_NYF-0047-HC2、p_HC1，而進行taFv-異二聚體Fc型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子(NYF-0047)的培養上清液的表現、調製。將使構成NYF-0047之各載體表現而得之胺基酸的序列，呈示於序列表之序列識別號93(圖94)及84(圖85)。
使用p_NYF-0048-HC2、p_HC1，而進行taFv-異二聚體Fc型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子(NYF-0048)的培養上清液的表現、調製。將使構成NYF-0048之各載體表現而得之胺基酸的序列，呈示於序列表之序列識別號94(圖95)及84(圖85)。
使用p_NYF-0060-HC2、p_HC1，而進行taFv-異二聚體Fc型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子(NYF-0060)的培養上清液的表現、調製。將使構成NYF-0060之各載體表現而得之胺基酸的序列，呈示於序列表之序列識別號95(圖96)及84(圖85)。
使用p_NYF-0061-HC2、p_HC1，而進行taFv-異二聚體Fc型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子(NYF-0061)的培養上清液的表現、調製。將使構成NYF-0061之各載體表現而得之胺基酸的序列，呈示於序列表之序列識別號96(圖97)及84(圖85)。
7)-2-2　taFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子的表現 以與7)-2-1同樣的手法，使用以1:1:1.5之比率混合p_NYF-0023-HC2、p_NYA-0001-Fab-HC1-k delete及p_NYA-0001-LC之載體混合物，而進行taFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子(NYF-0058)的培養上清液的表現、調製。將使構成NYF-0058之各載體表現而得之胺基酸的序列，呈示於序列表之序列識別號88(圖89)的胺基酸編號20～745、序列識別號99(圖100)的胺基酸編號20～468及序列識別號100(圖101)的胺基酸編號21～237。
7)-3　Fc附加型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子的純化 以蛋白質A親和性層析法與凝膠過濾層析法的2階段步驟，由7)-2中所得之培養上清液純化各種雙特異性分子。
對經PBS pH7.4平衡之MabSelectSuRe管柱(GE Healthcare Bioscience社：亦僅稱為「GE Healthcare社」)供予培養上清液，使目標的雙特異性分子吸附。以PBS除去非吸附成分之後，將吸附成分以醋酸緩衝液pH3.5進行沖提。沖提劃分係以Tris緩衝液 pH9.5將pH調製為中性之後，進行濃縮，供予預先經25mM組胺酸、300mM NaCl、5%山梨醇、pH5.5平衡之凝膠過濾管柱 Superdex 200 10/300(GE Healthcare Bioscience公司)。由以凝膠過濾層析法所得之波峰劃分回收相當於目標的異二聚體之劃分，藉由SDS-聚丙烯醯胺電泳(SDS-PAGE)，確認了有目標的抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子形成。純化蛋白質試樣係供予分析用SEC，決定純度與濃度之後用於各種評價。
(實施例8)　Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子之細胞毒殺活性評價 8)-1　標的細胞之調製 將內因性人類NY-ESO表現細胞株(U266B1及NCI-H1703)、及內因性人類NY-ESO非表現細胞株(AGS及CFPAC-1)以含10%FBS之RPMI1640培養基(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)調製為1×106 細胞/mL的濃度，各細胞懸浮液每1mL添加100μL的鉻(Cr51 )放射性核種(PerkinElmer公司)，於37℃、5%CO2 的條件下培養2小時。將以含10%FBS之RPMI1640培養基清洗2次之後，使用以含10%FBS之RPMI1640培養基進行再懸浮成1×105 細胞/mL者作為標的細胞。
8)-2　作用細胞之調製 於37℃解凍市售之冷凍人類PBMC(Cellular Technology Limited公司)，於移到在含10%FBS之RPMI1640培養基添加了Anti-aggregate Wash試藥(Cellular Technology Limited公司)之溶液中而清洗2次之後，以含10%FBS之RPMI1640培養基調製為1×106 細胞/mL，作成作用細胞。
8)-3　細胞毒殺測定 將8)-1中取得之各標的細胞以50μL/孔添加在96孔U形底微量盤。於其中以50μL/孔添加經調製為各種濃度之實施例7中調製之各種Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子，以100μL/孔添加實施例8)-2中調製之作用細胞，室溫下進行1000rpm×1分鐘離心後，於37℃、5%CO2 的條件下培養20-24小時。將上清液50μL回收於LumaPlate(PerkinElmer公司)，使其於50℃乾燥約2小時之後，以讀盤儀(TopCount：PerkinElmer公司)進行測定。試驗以三重複實施，細胞溶解率係以下式計算。 細胞溶解率(%)=(A-B)/(C-B)×100 A:試樣孔之計數。 B:背景(未添加抗體之孔)計數之平均值(n=3)。於添加抗體時添加50μL之測定用培養基。除此以外係進行與試樣孔同樣的操作。C:最大釋出(以界面活性劑使標的細胞溶解之孔)計數之平均值(n=3)。於添加抗體時添加50μL之測定用培養基。界面活性劑係添加100μL，且與試樣孔同樣地將50μL份量移到LumaPlate而實施測定。
如圖4A-F所示，對於內因性人類NY-ESO表現細胞株(U266B1、及、NCI-H1703)，顯示各種抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子之細胞毒殺活性。使用解析軟體(Sigmaplot，版本12.0)之四參數對數曲線(Four Parameter Logistics Curve)的算式計算EC50 ，將U266B1細胞株的結果記載於表2，將NCI-H1703細胞株的結果記載於表3。不適用(Not Applicable，NA)係表示未計算相關係數R值，無法進行曲線擬合。另一方面，如圖4G-L所示，無法確認到對於內因性人類NY-ESO非表現細胞株(AGS及CFPAC-1)之細胞毒殺活性。
[表2]
　 名稱 EC50 (nM)
1 NYF-0016 0.30
2 NYF-0019 0.20
3 NYF-0022 1.30
4 NYF-0023 0.90
5 NYF-0027 2.68
6 NYF-0035 0.97
7 NYF-0044 0.10
8 NYF-0045 0.18
9 NYF-0047 0.93
10 NYF-0048 1.10
11 NYF-0058 0.95
12 NYF-0060 0.39
13 NYF-0061 0.40
[表3]
　 名稱 EC50 (nM)
1 NYF-0016 0.90
2 NYF-0019 4.28
3 NYF-0022 NA*
4 NYF-0023 1.16
5 NYF-0027 6.40
6 NYF-0035 2.10
7 NYF-0044 1.11
8 NYF-0045 5.76
9 NYF-0047 7.63
10 NYF-0048 4.21
11 NYF-0058 1.03
12 NYF-0060 0.74
13 NYF-0061 1.04
*NA=不適用
(實施例9)　Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子的人類PBMC植入模型中之生體內活性評價 將人類鱗狀上皮細胞肺癌細胞株NCI-H1703(ATCC)以含50%Matrigel(CORNING公司)之PBS調製成6×107 細胞/mL，將0.1mL移植到NOG小鼠(雌性，6～7週齡)的皮下(第0天)。於第4天將人類PBMC以PBS調製成3.75×107 細胞/mL，將0.2mL進行尾靜脈內移植。由約1週後(第6～7天)起經時性地以電子數位卡尺測量腫瘤的長徑(mm)及短徑(mm)，藉由以下所示算式計算估算腫瘤體積。 估算腫瘤體積(mm3 )=各個體的估算腫瘤體積之平均值 各個體的估算腫瘤體積積=長徑×短徑2 /2
於第14天實施按腫瘤體積的分組成各組n=5～6，將各種抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子進行尾靜脈內投予(1mg/kg，僅NYF-0058為了以同莫耳量進行比較而為1.5mg/kg)。投予係於第14天、第21天、第28天實施。於各種抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子投予組中確認到抗腫瘤效果(圖5A-C)。藉由以下所示算式計算第31～32天的腫瘤生長抑制率(%)，記載於表4。
腫瘤生長抑制率(%)=100-(各組的估算腫瘤體積/媒液對照的估算腫瘤體積×100)
[表4]
　 名稱 腫瘤生長抑制率(%)
1 NYF-0016 100.0
2 NYF-0019 98.8
3 NYF-0022 90.3
4 NYF-0023 98.6
5 NYF-0027 99.1
6 NYF-0035 92.5
7 NYF-0044 100.0
8 NYF-0045 95.4
9 NYF-0047 78.9
10 NYF-0048 96.3
11 NYF-0058 88.5
12 NYF-0060 88.8
13 NYF-0061 100.0
(實施例10)　各種Fc附加型型式抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子之製作 10)-1　各種Fc附加型型式抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子表現載體之製作 10)-1-1　混成型雙特異性分子表現載體之製作 為了評價混成型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子，而設計各分子的表現載體。抗HLA/NY-ESO抗體係使用NYA-1143。抗CD3抗體係使用為人類化抗CD3scFv之C3E-7085(PCT/JP2017/046006)。異二聚體Fc序列係使用經導入使效應功能降低且使異多聚體形成之變異的Fc序列(WO2014/190441)。
製作經併入有NYA-1143之重鏈可變區、及源自人類IgG之CH1域、及編碼經導入使效應功能降低且使異多聚體形成之變異的Fc區之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，且命名為「p_NYA-1143-Fab-HC1-k delete」。又製作經併入有NYA-1143輕鏈可變區、編碼源自人類IgG之CL區之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，且命名為「p_NYA-1143-LC」。又，製作對人類化抗CD3scFv(C3E-7085)之羧基末端併入有編碼經導入使效應功能降低且使異多聚體形成之變異的Fc區之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體「p_C3E-7085-HC2-k delete」。
p_NYA-1143-Fab-HC1-k delete的核苷酸序列係進行再解析，確認NYA-1143-Fab-HC1-k delete全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號101(圖102)所示核苷酸序列。
p_NYA-1143-LC的核苷酸序列係進行再解析，確認NYA-1143-LC全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號102(圖103)所示核苷酸序列。
p_C3E-7085-HC2-k delete的核苷酸序列係進行再解析，確認C3E-7085-HC2-k delete全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號103(圖104)所示核苷酸序列。
又，由上述核苷酸序列，確認該序列所編碼之NYA-1143-Fab-HC1-k delete、NYA-1143-LC及C3E-7085-HC2-k delete全長的胺基酸序列。
NYA-1143-Fab-HC1-k delete全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號104(圖105)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第139號的胺基酸序列為可變區，第140號至第468號的胺基酸序列為恆定區。又，第45號至第52號的胺基酸序列為CDRH1(序列識別號54(圖61))，第70號至第77號的胺基酸序列為CDRH2(序列識別號55(圖61))，第116號至第128號的胺基酸序列為CDRH3(序列識別號56(圖61))。
NYA-1143-LC全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號105(圖106)所示胺基酸序列。第1號至第20號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第131號的胺基酸序列為可變區，第132號至第237號的胺基酸序列為恆定區。又，胺基酸編號46號至53號為CDRL1(序列識別號60(圖62))，胺基酸編號71號至73號為CDRL2(序列識別號58(圖61))，胺基酸編號110號至121號為CDRL3(序列識別號59(圖61))。
C3E-7085-HC2-k delete全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號106(圖107)所示胺基酸序列。第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第260號的胺基酸序列為C3E-7085，第261號至第262號的胺基酸序列為連接子，第263號至第493號的胺基酸序列為經導入使效應功能降低且使異二聚體形成之變異的Fc。
10)-1-2　雙重型雙特異性分子表現載體之製作 為了評價雙重型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子，而設計以下的表現載體。製作對NYA-1143之羧基末端併入有編碼經導入使效應功能降低且使異多聚體形成之變異的Fc區之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體「p_NYA-1143-HC1-k delete」。
p_NYA-1143-HC1-k delete的核苷酸序列係進行再解析，確認NYA-1143-HC1-k delete全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號107(圖108)所示核苷酸序列。又，由上述核苷酸序列，確認該序列所編碼之NYA-1143-HC1-k delete全長的胺基酸序列。NYA-1143-HC1-k delete全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號108(圖109)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第266號的胺基酸序列為NYA-1143，第267號至第268號的胺基酸序列為連接子，第269號至第499號的胺基酸序列為經導入使效應功能降低且使異二聚體形成之變異的Fc。
10)-1-3 scFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子表現載體之製作 為了評價scFv-Fab-異二聚體Fc型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子，而設計各分子的表現載體。抗HLA/NY-ESO抗體係使用NYA-1154，抗CD3抗體係使用C3E-7085。異二聚體Fc序列係使用經導入使效應功能降低且使異多聚體形成之變異的Fc序列。
製作對C3E-7085之羧基末端併入有NYA-1154之重鏈可變區、及源自人類IgG之CH1域、及編碼經導入使效應功能降低且使異多聚體形成之變異的Fc區之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，且命名為「p_C3E-7085-NYA-1154-Fab-HC2-k delete」。又製作經併入有NYA-1154輕鏈可變區、編碼源自人類IgG之CL區之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，且命名為「p_NYA-1154-LC」。又製作經併入有編碼HC1-k delete DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，且命名為「p_OAA-HC1-k delete」。
p_C3E-7085-NYA-1154-Fab-HC2-k delete的核苷酸序列係進行再解析，確認C3E-7085-NYA-1154-Fab-HC2-k delete全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號109(圖110)所示核苷酸序列。
p_NYA-1154-LC的核苷酸序列係進行再解析，確認NYA-1154-LC全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號110(圖111)所示核苷酸序列。
p_OAA-HC1-k delete的核苷酸序列係進行再解析，確認OAA-HC1-k delete全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號111(圖112)所示核苷酸序列。
又，由上述核苷酸序列，確認該序列所編碼之C3E-7085-NYA-1154-Fab-HC2-k delete、NYA-1154-LC及OAA-HC1-k delete全長的胺基酸序列。
C3E-7085-NYA-1154-Fab-HC2-k delete全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號112(圖113)所示胺基酸序列。第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第260號的胺基酸序列為C3E-7085，第261號至第385號的胺基酸序列為連接子，第266號至第385號的胺基酸序列為NYA-1154-重鏈可變區。又，胺基酸編號386號至第714號的胺基酸序列為HC2-k delete。
NYA-1154-LC全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號113(圖114)所示胺基酸序列。第1號至第20號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第131號的胺基酸序列為可變區，第132號至第237號的胺基酸序列為恆定區。又，胺基酸編號46號至53號為CDRL1(序列識別號57(圖61))，胺基酸編號71號至73號為CDRL2(序列識別號58(圖61))，胺基酸編號110號至121號為CDRL3(序列識別號63(圖64))。
OAA-HC1-k delete全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號114(圖115)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第20號至第245號的胺基酸序列為OAA-HC1-k delete。
10)-1-4　各種型式評價用taFv-異二聚體Fc型雙特異性分子表現載體之製作 為了評價各種型式評價用taFv-異二聚體Fc型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子，而設計各分子的表現載體。抗HLA/NY-ESO抗體係使用NYA-1143及NYA-1154。抗CD3抗體係使用為人類化抗CD3scFv之C3E-7085。異二聚體Fc序列係使用經導入使效應功能降低且使異多聚體形成之變異的Fc序列。
製作對以GGGGS連接子連結了NYA-1154與C3E-7085而成之taFv的羧基末端併入有編碼HC2-k delete之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，且命名為「p_NYF-0010-HC2-k delete」。
製作對以GGGGS連接子連結了C3E-7085與NYA-1154而成之taFv的羧基末端併入有編碼HC2-k delete之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，且命名為「p_NYF-0004-HC2-k delete」。
製作對以GGGGS連接子連結了NYA-1143與C3E-7085而成之taFv的羧基末端併入有編碼HC2-k delete之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，且命名為「p_NYF-0011-HC2-k delete」。
p_NYF-0010-HC2-k delete的核苷酸序列係進行再解析，確認NYF-0010-HC2-k delete全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號115(圖116)所示核苷酸序列。
p_NYF-0004-HC2-k delete的核苷酸序列係進行再解析，確認NYF-0004-HC2-k delete全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號116(圖117)所示核苷酸序列。
p_NYF-0011-HC2-k delete的核苷酸序列係進行再解析，確認NYF-0011-HC2-k delete全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號117(圖118)所示核苷酸序列。
又，由上述核苷酸序列，確認該序列所編碼之NYF-0010-HC2-k delete、NYF-0004-HC2-k delete及NYF-0011-HC2-k delete全長的胺基酸序列。
NYF-0010-HC2-k delete全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號118(圖119)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第511號的胺基酸序列為NYA-1154-C3E-7085taFv，第512號至第513號的胺基酸序列為連接子，第514號至第744號的胺基酸序列為HC2-k delete。
NYF-0004-HC2-k delete全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號119(圖120)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第511號的胺基酸序列為C3E-7085-NYA-1154taFv，第512號至第513號的胺基酸序列為連接子，第514號至第744號的胺基酸序列為HC2-k delete。
NYF-0011-HC2-k delete全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號120(圖121)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第511號的胺基酸序列為NYA-1143-C3E-7085taFv，第512號至第513號的胺基酸序列為連接子，第514號至第745號的胺基酸序列為HC2-k delete。
10)-2　各種型式Fc附加型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子的表現 10)-2-1　混成型雙特異性分子的表現 以與7)-2-1同樣的手法，使用以1:1:1.5之比率混合p_NYA-1143-Fab-HC1-k delete、p_C3E-7085-HC2-k delete及p_NYA-1143-LC之載體混合物，而進行混成型雙特異性分子(NYG-3143)的培養上清液的表現、調製。將使構成NYG-3143之各載體表現而得之胺基酸的序列，呈示於序列表之序列識別號104(圖105)、序列識別號105(圖106)及106(圖107)。
10)-2-2　雙重型雙特異性分子的表現 以與7)-2-1同樣的手法，使用以2:1之比率混合p_NYA-1143-HC1-k delete、p_C3E-7085-HC2-k delete之載體混合物，而進行雙重型雙特異性分子(NYG-2143)的培養上清液的表現、調製。將使構成NYG-2143之各載體表現而得之胺基酸的序列，呈示於序列表之序列識別號108(圖109)及106(圖107)。
10)-2-3　scFv-Fab-異二聚體Fc型雙特異性分子的表現 以與7)-2-1同樣的手法，使用以1:1:1.5之比率混合p_C3E-7085-NYA-1154-Fab-HC2-k delete、p_OAA-HC1-k delete、p_NYA-1154-LC之載體混合物，而進行scFv-Fab-異二聚體Fc型(scFv-Fab-Fc型)雙特異性分子(NYF-0003)的培養上清液的表現、調製。將使構成NYF-0003之各載體表現而得之胺基酸的序列，呈示於序列表之序列識別號112(圖113)、序列識別號113(圖114)及114(圖115)。
10)-2-4　各種型式評價用taFv-異二聚體Fc型雙特異性分子的表現 以與7)-2-1同樣的手法，使用p_NYF-0010-HC2-k delete、p_OAA-HC1-k delete，而進行taFv-異二聚體Fc型(taFv-Fc型)抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子(NYF-0010)的培養上清液的表現、調製。將使構成NYF-0010之各載體表現而得之胺基酸的序列，呈示於序列表之序列識別號118(圖119)及114(圖115)。
使用p_NYF-0004-HC2-k delete、p_OAA-HC1-k delete，而進行taFv(逆)-異二聚體Fc型(taFv(逆)-Fc型)抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子(NYF-0004)的培養上清液的表現、調製。將使構成NYF-0004之各載體表現而得之胺基酸的序列，呈示於序列表之序列識別號119(圖120)及114(圖115)。
使用p_NYF-0011-HC2-k delete、p_OAA-HC1-k delete，而進行taFv-Fc型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子(NYF-0011)的培養上清液的表現、調製。將使構成NYF-0011之各載體表現而得之胺基酸的序列，呈示於序列表之序列識別號120(圖121)及114(圖115)。
10)-3　各種型式Fc附加型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子的純化 以蛋白質A親和性層析法與陶瓷羥磷灰石的2階段步驟，由10)-2-1及10)-2-2中所得之培養上清液純化各種雙特異性分子。
對經PBS pH7.4平衡之MabSelectSuRe管柱(GE Healthcare Bioscience公司)供予培養上清液，使目標的雙特異性分子吸附。以PBS除去非吸附成分之後，將吸附成分以醋酸緩衝液pH3.6進行沖提。沖提劃分係以Tris緩衝液pH9.5將pH調製為中性，進行緩衝液交換為25mM組胺酸、150mM NaCl、5%山梨醇、pH5.5。將以10mM磷酸鉀/50mM MES/pH6.5之緩衝液進行5倍稀釋的目標劃分溶液供予至經10mM磷酸鉀/50mM MES/pH6.5之緩衝液平衡的陶瓷羥磷灰石管柱(Bio-Scale CHT-1型 羥磷灰石管柱:日本Bio-Rad公司)。實施利用氯化鈉之線性濃度梯度沖提，收集相當於目標的異二聚體之劃分。供予至預先經25mM組胺酸、300mM NaCl、5%山梨醇、pH6.0平衡之凝膠過濾管柱 Superdex 200 10/300(GE Healthcare Bioscience公司)。由以凝膠過濾層析法所得之波峰劃分回收相當於目標的異二聚體之劃分，進行緩衝液交換為25mM組胺酸、150mM NaCl、5%山梨醇、pH5.5。藉由SDS-聚丙烯醯胺電泳(SDS-PAGE)，確認了有目標的抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子形成。純化蛋白質試樣係供予分析用SEC，決定純度與濃度之後，用於各種評價。
又以與7)-3同樣的手法，以蛋白質A親和性層析法與凝膠過濾層析法的2階段步驟，由10)-2-3及10)-2-4中所得之培養上清液純化各種雙特異性分子。藉由SDS-聚丙烯醯胺電泳(SDS-PAGE)，確認了有目標的抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子形成。純化蛋白質試樣係供予分析用SEC，決定純度與濃度之後，用於各種評價。
(實施例11)　各種型式Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子的生體外活性評價 11)-1　混成體、雙重體、taFv-Fc體抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子的生體外活性評價 11)-1-1　標的細胞之調製 使用將U266B1細胞株以與實施例8)-1同樣的方法調製者作為標的細胞。
11)-1-2　作用細胞之調製 使用將市售之冷凍人類PBMC(Cellular Technology Limited公司)以與實施例8)-2同樣的方法調製者作為作用細胞。
11)-1-3　細胞毒殺測定 將實施例11)-1-1中取得之各標的細胞以50μL/孔添加在96孔U形底微量盤。於其中以50μL/孔添加經調製為各種濃度之實施例10中調製之各種型式抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子，以100μL/孔添加實施例11)-1-2中調製之作用細胞，室溫下進行1000rpm×1分鐘離心後，於37℃、5%CO2 的條件下培養20～24小時。將上清液50μL回收於LumaPlate(PerkinElmer公司)，使其於50℃乾燥約2小時之後，以讀盤儀(TopCount:PerkinElmer公司)進行測定。試驗以三重複實施，細胞溶解率係以下式計算。細胞溶解率(%)=(A-B)/(C-B)×100 A:試樣孔之計數。 B:背景(未添加抗體之孔)計數之平均值(n=3)。於添加抗體時添加50μL之測定用培養基。除此以外係進行與試樣孔同樣的操作。C:最大釋出(以界面活性劑使標的細胞溶解之孔)計數之平均值(n=3)。於添加抗體時添加50μL之測定用培養基。界面活性劑係添加100μL，且與試樣孔同樣地將50μL份量移到LumaPlate而實施測定。如圖7A所示，顯示由taFv-Fc體所致細胞毒殺活性。使用解析軟體(Sigmaplot，版本12.0)之四參數對數曲線的算式計算EC50 ，將結果記載於表5。不適用(NA)係表示未計算相關係數R值，無法進行曲線擬合。無法確認到由混成體、雙重體所致細胞毒殺活性。
[表5]
　 形式 名稱 EC50 (nM)
1 混成 NYG-3143 NA*
2 雙重 NYG-2143 NA*
3 taFv-Fc NYF-0011 0.27
*NA=不適用
11)-2　scFv-Fab-Fc體、taFv-Fc體、taFv(逆)-Fc體抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子的生體外活性評價 11)-2-1　標的細胞之調製 使用將U266B1細胞株以與實施例8)-1同樣的方法調製者作為標的細胞。
11)-2-2　作用細胞之調製 使用將市售之冷凍人類PBMC(Cellular Technology Limited公司)以與實施例8)-2同樣的方法調製者作為作用細胞。
11)-2-3　細胞毒殺測定 將11)-2-1中取得之各標的細胞以50μL/孔添加在96孔U形底微量盤。於其中以50μL/孔添加經調整為各種濃度之實施例10中調製之各種型式抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子，以100μL/孔添加實施例11)-2-2中調製之作用細胞，室溫下進行1000rpm×1分鐘離心後，於37℃、5%CO2 的條件下培養20-24小時。將上清液50μL回收於LumaPlate(PerkinElmer公司)，使其於50℃乾燥約2小時之後，以讀盤儀(TopCount:PerkinElmer公司)進行測定。試驗以三重複實施，細胞溶解率係以下式計算。細胞溶解率(%)=(A-B)/(C-B)×100 A:試樣孔之計數。 B:背景(未添加抗體之孔)計數之平均值(n=3)。於添加抗體時添加50μL之測定用培養基。除此以外係進行與試樣孔同樣的操作。C:最大釋出(以界面活性劑使標的細胞溶解之孔)計數之平均值(n=3)。於添加抗體時添加50μL之測定用培養基。界面活性劑係添加100μL，且與試樣孔同樣地將50μL份量移到LumaPlate而實施測定。如圖7B所示，顯示由taFv-Fc體所致細胞毒殺活性。使用解析軟體(Sigmaplot，版本12.0)之四參數對數曲線的算式計算EC50 ，將結果記載於表6。不適用(NA)係表示未計算相關係數R值，無法進行曲線擬合。scFv-Fab-異二聚體Fc體、taFv(逆)-異二聚體Fc體與taFv-異二聚體Fc體比較而為低活性。
[表6]
　 形式 名稱 EC50 (nM)
1 scFv-Fab-異二聚體Fc NYF-0003 NA*
2 taFv-異二聚體Fc NYF-0010 0.13
3 taFv(逆)-異二聚體Fc NYF-0004 0.88
*NA=不適用
(實施例12)　對NYF-0061導入變異及進行型式變更的各種Fc附加型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子之製作 12)-1　對NYF-0061導入變異及進行型式變更的各種Fc附加型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子表現載體之製作 以物性提升為目標而設計NYF-0061之變異體，製作構成各分子之以下的載體。
對包含編碼NYF-0061的胺基酸序列之核苷酸序列的載體p_NYF-0061-HC2之C3E-7085序列導入變異，且命名為「p_NYZ-0038-HC2」。
對包含編碼NYF-0061的胺基酸序列之核苷酸序列的載體p_NYF-0061-HC2之NYA-2061序列及C3E-7085序列導入變異，且命名為「p_NYZ-0082-HC2」及「p_NYZ-0083-HC2」。
p_NYZ-0038-HC2的核苷酸序列係進行再解析，確認NYZ-0038-HC2全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號152(圖148)所示核苷酸序列。
p_NYZ-0082-HC2的核苷酸序列係進行再解析，確認NYZ-0082-HC2全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號153(圖149)所示核苷酸序列。
p_NYZ-0083-HC2的核苷酸序列係進行再解析，確認NYZ-0083-HC2全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號154(圖150)所示核苷酸序列。
又，由上述核苷酸序列，確認該序列所編碼之NYZ-0038-HC2、NYZ-0082-HC2、NYZ-0083-HC2全長的胺基酸序列。
NYZ-0038-HC2全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號155(圖151)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第511號的胺基酸序列為NYA-2061-C3E-7096taFv，第512號至第513號的胺基酸序列為連接子，第514號至第745號的胺基酸序列為HC2。
NYZ-0082-HC2全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號156(圖152)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第516號的胺基酸序列為NYA-3061-C3E-7096taFv，第517號至第518號的胺基酸序列為連接子，第519號至第750號的胺基酸序列為HC2。
NYZ-0083-HC2全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號157(圖153)所示胺基酸序列。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第516號的胺基酸序列為NYA-3061-C3E-7097taFv，第517號至第518號的胺基酸序列為連接子，第519號至第750號的胺基酸序列為HC2。
又為了探討使NYF-0061往scFv-Fab-異二聚體Fc型的型式變更，而設計構成各分子之以下的載體。 製作對NYA-3061之羧基末端併入有編碼依(i)C3E-7085之重鏈可變區、(ii)源自人類IgG之CH1域、及(iii)經導入使效應功能降低且使異多聚體形成之變異的Fc區的順序附加而成之多肽所包含的胺基酸序列之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，且命名為「p_NYZ-1010-HC2」。又製作經併入有編碼於C3E-7085輕鏈可變區之羧基末端有源自人類IgG之CL區附加而成之多肽所包含的胺基酸序列之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，且命名為「p_C3E-7085-LC」。
p_NYZ-1010-HC2的核苷酸序列係進行再解析，確認NYZ-1010-HC2全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號158(圖154)所示核苷酸序列。
p_C3E-7085-LC的核苷酸序列係進行再解析，確認C3E-7085-LC全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號159(圖155)所示核苷酸序列。
又，由上述核苷酸序列，確認該序列所編碼之NYZ-1010-HC2、C3E-7085-LC全長的胺基酸序列。
NYZ-1010-HC2全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號160(圖156)所示胺基酸序列。第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第271號的胺基酸序列為NYA-3061，第272號至第276號的胺基酸序列為連接子，第277號至第394號的胺基酸序列為C3E-7085-重鏈可變區。又，第395號至第724號的胺基酸序列為恆定區。
C3E-7085-LC全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號161(圖157)所示胺基酸序列。第1號至第20號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第127號的胺基酸序列為可變區，第128號至第233號的胺基酸序列為恆定區。又，胺基酸編號46號至53號為CDRL1(序列識別號144(圖142))，胺基酸編號71號至73號為CDRL2(序列識別號145(圖142))，胺基酸編號110號至117號為CDRL3(序列識別號146(圖142))。
12)-2　對NYF-0061導入變異及進行型式變更的各種Fc附加型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子的表現及純化 以與7)-2-1同樣的手法使用p_NYZ-0038-HC2、p_HC1，而進行taFv-異二聚體Fc型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子(NYZ-0038)的培養上清液的表現、調製。將使構成NYZ-0038之各載體表現而得之胺基酸的序列，呈示於序列表之序列識別號155(圖151)及84(圖85)。
使用p_NYZ-0082-HC2、p_HC1，而進行taFv-異二聚體Fc型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子(NYZ-0082)的培養上清液的表現、調製。將使構成NYZ-0082之各載體表現而得之胺基酸的序列，呈示於序列表之序列識別號156(圖152)及84(圖85)。
使用p_NYZ-0083-HC2、p_HC1，而進行taFv-異二聚體Fc型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子(NYZ-0083)的培養上清液的表現、調製。將使構成NYZ-0083之各載體表現而得之胺基酸的序列，呈示於序列表之序列識別號157(圖153)及84(圖85)。
使用p_NYZ-1010-HC2、p_C3E-7085-LC及p_HC1，而進行scFv-Fab-異二聚體Fc型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子(NYZ-1010)的培養上清液的表現、調製。將使構成NYZ-1010之各載體表現而得之胺基酸的序列，呈示於序列表之序列識別號160(圖156)、序列識別號161(圖157)及84(圖85)。
上述調製的各培養上清液，係以與7)-3同樣的手法進行純化。純化蛋白質試樣係供予分析用SEC，決定純度與濃度之後用於各種評價。
(實施例13)　利用Biacore之對HLA/NY-ESO之結合能評價 使用Biacore T200，對經固定化之抗Human IgG(Fc)抗體作為配體而捕捉(capture)各Fc附加型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子，且作為分析物而測定抗原。抗原係使用1)-1中調製的HLA/NY-ESO。抗Human IgG(Fc)抗體(Human antibody Capture kit，GE Healthcare公司)係對感測晶片CM5(GE Healthcare公司)，按照套組說明書進行固定化。以HBS-EP+(GE Healthcare公司)稀釋為0.5μg/mL而進行評價的各Fc附加型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子以10μL/min接觸60秒鐘而進行固定化。然後，將以HBS-EP+稀釋之複數濃度的HLA/NY-ESO作為分析物而以流速30μL/min添加各試樣120秒鐘，藉由測定600秒鐘解離之單循環動力學解析而計算KD ，且將結果記載於表7。NYZ-0038、NYZ-0082、NYZ-0083、及NYZ-1010皆保持與NYF-0061同等級的結合。
[表7]
選殖株名 KD (nM)
NYF-0061 1.5
NYZ-0038 1.5
NYZ-0082 1.8
NYZ-0083 1.7
NYZ-1010 1.9
(實施例14)　CD3e基因剔除人類淋巴母芽細胞融合細胞株T2細胞之製作 為了使用CRISPR技術將CD3e由人類淋巴母芽細胞融合細胞株T2(ATCC)細胞的基因體序列予以基因剔除，以電穿孔(LONZA公司)導入Cas9表現質體(GE Healthcare公司)與sgRNA表現質體。導入後，進行利用極限稀釋法的細胞選殖。藉由利用導入細胞中之基因體DNA解析的目標的基因片段缺失及在全RNA的RT-PCR解析而取得無法確認到CD3e基因表現的細胞，供予以後的實驗。
(實施例15)　Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子之NY-ESO肽內的辨識胺基酸解析 將實施例14中製作之CD3e基因剔除T2細胞以含20%FBS之AIM-V培養基(Thermo Fisher Scientific公司)調製為適當的濃度，且以與實施例5)同樣的手法，添加NY-ESO肽(序列識別號1)、點突變NY-ESO肽1F、2M、3A、4A、5A、6L、7F、8A、9A(序列識別號121(圖122)、122(圖123)、123(圖124)、124(圖125)、125(圖126)、126(圖127)、127(圖128)、128(圖129)、129(圖130))、gp100肽(序列識別號130(圖131))(皆為Sigma Genosys公司)，將經LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit(Thermo Fisher Scientific公司)染色的細胞分為2邊，以含5%FBS之PBS以105 細胞/孔接種於96孔U形底微量盤，離心後除去上清液。針對一方的細胞，將以含5%FBS之PBS稀釋為100nM之實施例12中調製之各種Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子添加25μL/孔，於4℃靜置30分鐘。以含5%FBS之PBS清洗2次後，將以含5%FBS之PBS稀釋之PE結合F(ab’)2 片段抗人類IgG(PE conjugated F(ab’)2 Fragment Anti-Human IgG，Jackson Immuno Research Laboratories公司)添加25μL/孔，於4℃靜置30分鐘。以含5%FBS之PBS清洗2次後，以Mildform 10N(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)固定一晚後，以含5%FBS之PBS進行再懸浮。為了以HLA/肽複合體量進行標準化，針對另一方的細胞，將以含5%FBS之PBS稀釋為10μg/mL之HLA-A2抗體BB7.2-Alexa Fluor 488(BioRAD公司)、或是小鼠IgG2b-Alexa Fluor 488(BioRAD公司)添加25μL/孔，於4℃靜置30分鐘。以含5%FBS之PBS清洗2次後，以Mildform 10N(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)固定一晚後，以含5%FBS之PBS進行再懸浮。將此等細胞懸浮液以流式細胞儀(CantoII，Becton Dickinson公司)進行檢出。數據解析以Flowjo(Treestar公司)進行，測定CD3e基因剔除T2細胞的死細胞除去劃分之PE或是Alexa Fluor 488的幾何學的平均螢光強度(gMFI)。顯示經CD3e基因剔除T2細胞上的HLA/肽複合體量標準化之各Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子的結合性之值、標準化gMFI係以下式計算。 標準化gMFI=(A/B)×((C/D)/(E/F)) ・A/B=相對gMFI A:添加抗體之添加DMSO或是各肽的CD3e基因剔除T2細胞之PE gMFI B:未添加抗體之添加DMSO或是各肽的CD3e基因剔除T2細胞之PE gMFI ・(C/D)/(E/F)=添加DMSO或是各肽的CD3e基因剔除T2細胞之HLA/肽複合體量校正值 C:添加HLA-A2抗體之添加DMSO或是各肽的CD3e基因剔除T2細胞之Alexa488 gMFI D:添加小鼠IgG2b抗體之添加DMSO或是各肽的CD3e基因剔除T2細胞之Alexa488 gMFI E:添加HLA-A2抗體之添加DMSO的CD3e基因剔除T2細胞之Alexa488 gMFI F:添加小鼠IgG2b抗體之添加DMSO的CD3e基因剔除T2細胞之Alexa488 gMFI
如圖158A所示，由於與野生型NY-ESO肽比較，Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子NYZ-0038、0082、0083、1010係對於添加在第1、4、5、7號之胺基酸導入點突變之肽的CD3e基因剔除T2之結合性降低至4分之1以下，因此暗示強力地辨識NY-ESO肽之第1、4、5、7號的胺基酸。
(實施例16)　Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子之抗原結合特異性評價 以與實施例6)同樣的手法，而選定NY-ESO肽:SLLMWITQC(序列識別號1)序列中被暗示本抗體4種類特別強力地辨識之第1、4、5號的胺基酸序列為一致之圖2A所示9-mer肽作為同源性肽，且實施結合特異性評價．(Thermo Fisher Scientific公司)調製為適當的濃度，以最終濃度成為50μM之方式添加經以DMSO溶解為5mM的NY-ESO肽(序列識別號1)、同源性肽DOLPP1、IL20RB、PRKD2、CD163、P2RY8(序列識別號131(圖132)、132(圖133)、133(圖134)、134(圖135)、135(圖136))、gp100肽(序列識別號130(圖131))(皆為Sigma Genosys公司)之溶液，或是添加1/100量的DMSO，以與實施例15同樣的方法評價各抗體之結合性。顯示經CD3e基因剔除T2細胞之上的HLA/肽複合體量標準化之各Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子的結合性之值、標準化gMFI係以下式計算。 標準化gMFI=(A/B)×((C/D)/(E/F)) A:添加抗體之添加DMSO或是各肽的CD3e基因剔除T2細胞之PE gMFI B:未添加抗體之添加DMSO或是各肽的CD3e基因剔除T2細胞之PE gMFI ・(C/D)/(E/F)=添加DMSO或是各肽的CD3e基因剔除T2細胞之HLA/肽複合體量校正值 C:添加HLA-A2抗體之添加DMSO或是各肽的CD3e基因剔除T2細胞之Alexa488 gMFI D:添加小鼠IgG2b抗體之添加DMSO或是各肽的CD3e基因剔除T2細胞之Alexa488 gMFI E:添加HL A-A2抗體之添加DMSO的CD3e基因剔除T2細胞之Alexa488 gMFI F:添加小鼠IgG2b抗體之添加DMSO的CD3e基因剔除T2細胞之Alexa488 gMFI
如圖158B所示，Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子NYZ-0038、0082、0083、1010對任一添加同源性肽的細胞都不結合，暗示特異性極高。
(實施例17)　Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子之細胞毒殺活性評價 17)-1　標的細胞之調製 以與實施例8)-1同樣的手法，調製內因性人類NY-ESO表現細胞株(U266B1及NCI-H1703)、及內因性人類NY-ESO非表現細胞株(AGS及CFPAC-1)的懸浮液，作為標的細胞使用。
17)-2　作用細胞之調製 以與實施例8)-2同樣的手法，調製市售之冷凍人類PBMC(Cellular Technology Limited公司)懸浮液，作為作用細胞使用。
17)-3　細胞毒殺測定 將實施例17)-1中取得之各標的細胞以50μL/孔添加在96孔U形底微量盤。於其中以50μL/孔添加經調製為各種濃度之實施例12中調製之各種Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子，以100μL/孔添加實施例17)-2中調製之作用細胞，室溫下進行1000rpm×1分鐘離心後，於37℃、5%CO2 的條件下培養20-24小時。將上清液50μL回收於LumaPlate(PerkinElmer公司)，使其於50℃乾燥約2小時之後，以讀盤儀(TopCount:PerkinElmer公司)進行測定。試驗以三重複實施，細胞溶解率係以下式計算。細胞溶解率(%)=(A-B)/(C-B)×100 A:試樣孔之計數。 B:背景(未添加抗體之孔)計數之平均值(n=3)。於添加抗體時添加50μL之測定用培養基。除此以外係進行與試樣孔同樣的操作。 C:最大釋出(以界面活性劑使標的細胞溶解之孔)計數之平均值(n=3)。於添加抗體時添加50μL之測定用培養基。界面活性劑係添加100μL，且與試樣孔同樣地將50μL份量移到LumaPlate而實施測定。
如圖159A-D所示，對於內因性人類NY-ESO表現細胞株(U266B1、及、NCI-H1703)，顯示各種抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子之細胞毒殺活性。使用解析軟體(Sigmaplot，版本12.0)之四參數對數曲線的算式計算EC50 ，將U266B1細胞株的結果記載於表8，將NCI-H1703細胞株的結果記載於表9。另一方面，如圖159E-H所示，無法確認到對於內因性人類NY-ESO非表現細胞株(AGS及CFPAC-1)之細胞毒殺活性。
[表8]
   名稱 EC50 (nM)
1 NYZ-0038 1.01
2 NYZ-0082 0.45
3 NYZ-0083 0.25
4 NYZ-1010 0.96
[表9]
   名稱 EC50 (nM)
1 NYZ-0038 0.61
2 NYZ-0082 1.00
3 NYZ-0083 0.71
4 NYZ-1010 2.56
(實施例18)　Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子的人類PBMC植入模型中之生體內活性評價 將人類鱗狀上皮細胞肺癌細胞株NCI-H1703(ATCC)以含50%Matrigel(CORNING公司)之PBS調製成6×107 細胞/mL，將0.1mL移植到NOG小鼠(雌性，6～7週齡)的皮下(第0天)。於第4天將人類PBMC以PBS調製成3.75×107 ～5x107 細胞/mL，將0.2mL進行尾靜脈內移植。由約1週後(第6～7天)起經時性地以電子數位卡尺測量腫瘤的長徑(mm)及短徑(mm)，藉由以下所示算式計算估算腫瘤體積。
估算腫瘤體積(mm3 )=各個體的估算腫瘤體積之平均值 各個體的估算腫瘤體積積=長徑×短徑2 /2
於第14天實施按腫瘤體積的分組成各組n=5，將各種抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子進行尾靜脈內投予(NYZ-1010為1mg/kg，NYZ-1010為了以同莫耳量進行比較而為1.2mg/kg)。投予係於第14天、第21天實施。於各種抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子投予組中確認到抗腫瘤效果(圖160A-D)。藉由以下所示算式計算第28～29天的腫瘤生長抑制率(%)，記載於表10。 腫瘤生長抑制率(%)=100-(各組的估算腫瘤體積/媒液對照的估算腫瘤體積×100)
[表10]
   名稱 腫瘤生長抑制率(%)
1 NYZ-0038 100.0
2 NYZ-0082 100.0
3 NYZ-0083 99.8
4 NYZ-1010 99.9
(實施例19)　各種Fc附加型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子之物理化學性質的比較 19)-1　酸處理評價 將7)-2-1中製作之NYF-0016及各種NYA-1143CDR接枝變異體(NYF-0044、NYF-0045、NYF-0047、NYF-0048、NYF-0060及NYF-0061)使用Amicon(Millipore公司)進行離心濃縮，進行緩衝液交換為25mM醋酸鈉、5%山梨醇、pH5.5後，將濃度調製為15mg/ml (NYF-0016為10mg/ml)。接著，各試樣係使用Xpress Micro Dialyzer (Scienova公司)進行對100mM醋酸鈉、pH3.5透析或者是作為對照用而進行對25mM醋酸鈉、5%山梨醇、pH5.5透析後回收試樣，且於室溫靜置1小時。接著將各試樣的pH使用500mM Tris-HCl、pH9.0調回pH5.0。各試樣係以使用ACQUITY UPLC BEH200 SEC 1.7μm4.6*150 mm(Waters公司)之粒徑篩析層析法(SEC)進行分析。移動相係使用0.2M Ki/200mM KCl/pH7.0，以流速0.2ml/min進行分析(檢出波長280nm)。將各試樣中所包含之多聚體的含量(%)進行各波峰解析，藉由面積標準化法(area normalization method)計算，將結果記載於圖162。NYF-0016藉由酸處理而多聚體增加至96%。另一方面，各種NYA-1143CDR接枝變異體，係酸處理所致之多聚體形成量改善至降低。尤其是NYF-0047、NYF-0048、NYF-0060及NYF-0061，係酸處理所致之多聚體形成量減少至1%以下，耐酸性大幅改善。
19)-2　溶液安定性評價 使用7)-2-1中製作之NYF-0061及12)-2中製作之NYZ-0038、NYZ-0082、NYZ-0083、NYZ-1010，以Amicon Ultra-4(Millipore公司)進行離心濃縮，進行緩衝液交換為25mM組胺酸、5%山梨醇、pH6.0後，添加25mM組胺酸、5%山梨醇、pH6.0，將試樣濃度調製為25mg/ml，作為評價用試樣。又，各評價用試樣之開始時的高分子量物質(high molecular weights speices，HMWS)，係使用使用AdvanceBio SEC 300A 2.7μm 4.6×300mm(Agilent公司)之粒徑篩析層析法，藉由面積標準化法來計算。移動相係使用0.2M Ki/200mM KCl/pH7.0，以流速0.2ml/min進行分析(檢出波長280nm)。各試樣的溶液安定性試驗，係於25℃保存6日(NYF-0061為7日)後，以與上述同條件實施粒徑篩析層析法，以面積標準化法計算各試樣的HMWS(%)，將結果記載於表11。NYF-0061之保存時間經過所致HMWS(%)約增加至10.6%。另一方面，NYZ-0038、NYZ-0082、NYZ-0083及NYZ-1010之保存時間經過所致HMWS(%)止於約2%以下的增加。所以，相較於NYF-0061，NYZ-0038、NYZ-0082、NYZ-0083及NYZ-1010之溶液安定性優異。 [表11]
選殖株名 HMWS(%)
NYF-0061 10.6
NYZ-0038 2.1
NYZ-0082 1.7
NYZ-0083 1.9
NYZ-1010 0.8
(實施例20)　抗HLA/NY-ESO之scFv製作 20)-1　抗HLA/NY-ESO之scFv表現載體的構築 設計被認為對HLA-A2/NY-ESO-1具有高結合能的抗體mAb24955N、mAb24956N、mAb28075P、mAb28105P、mAb28113P及mAb29822P2 (WO2021/ 003357)之scFv，將mAb24955N之scFv命名為NYC-0005，將mAb24956N之scFv命名為NYC-0006，將mAb28075P之scFv命名為NYC-0007，將mAb28105P之scFv命名為NYC-0008，將mAb28113P之scFv命名為NYC-0009，將mAb29822P2之scFv命名為NYC-0010。 設計以pcDNA3.4(Thermo Fisher Scientific公司)為骨架的各種NYC-0005、NYC-0006、NYC-0007、NYC-0008、NYC-0009及NYC-0010之哺乳動物細胞用scFv表現用載體。進一步為了使載體骨架及型式成為一致來比較哺乳動物細胞中之表現量，而設計NYA-2047、NYA-2061、NYA-3061之哺乳動物細胞用scFv表現用載體。 所構築之scFv表現載體的核苷酸序列係進行再解析，確認NYA-2047、NYA-2061、NYA-3061、NYC-0005、NYC-0006、NYC-0007、NYC-0008、NYC-0009及NYC-0010之全長的核苷酸序列各自為序列表之序列識別號43(圖50)、46(圖53)、163(圖164)、165(圖166)、167(圖168)、169(圖170)、171(圖172)、173(圖174)、及175(圖176)所示核苷酸序列。又，由上述核苷酸序列，該序列所編碼之NYA-2047全長的胺基酸序列為序列識別號50(圖57)所示胺基酸序列，NYA-2061全長的胺基酸序列為序列識別號53(圖60)所示胺基酸序列，NYA-3061全長的胺基酸序列為序列識別號164(圖165)所示胺基酸序列，NYC-0005全長的胺基酸序列為序列識別號166(圖167)所示胺基酸序列，NYC-0006全長的胺基酸序列為序列識別號168(圖169)所示胺基酸序列，NYC-0007全長的胺基酸序列為序列識別號170(圖171)所示胺基酸序列，NYC-0008全長的胺基酸序列為序列識別號172(圖173)所示胺基酸序列，NYC-0009全長的胺基酸序列為序列識別號174(圖175)所示胺基酸序列，NYC-0010全長的胺基酸序列為序列識別號176(圖177)所示胺基酸序列。
20)-2　抗HLA/NY-ESO之scFv表現、純化 Expi293F細胞(Thermo Fisher Scientific公司)之培養及基因導入係與1)-5-2所記載之方法同樣地實施。為了評價生產量，而於基因導入之後在37℃、8%CO2 培養箱以135rpm振盪培養4天，將所得之培養上清液以0.2μm過濾器(Thermo Fisher Scientific公司)過濾，得到抗HLA/NY-ESO scFv的培養上清液。純化係使用Ni Sepharose excel(Cytiva公司)實施，將沖提液供予分析用粒徑篩析層析法(SEC)，決定濃度。將生產量呈示於表12。NYA-2047、NYA-2061、NYA-3061之利用Ni Sepharose excel的純化後沖提液中之培養上清液每1L換算的生產量，係相較於NYC-0005、NYC-0006、NYC-0007、NYC-0008、NYC-0009及NYC-0010而皆較多。 [表12]
選殖株名 每1L的生產量 (mg)
NYA-2047 53.3
NYA-2061 45.7
NYA-3061 52.5
NYC-0005 2.5
NYC-0006 1.1
NYC-0007 10.8
NYC-0008 0.5
NYC-0009 2.4
NYC-0010 1.8
各scFv之Ni Sepharose excel沖提液係進行濃縮，以經25mM組胺酸、300mM NaCl、5%山梨醇、pH5.5平衡之凝膠過濾管柱(Superdex 200 Increase、Cytiva)進行純化。純化蛋白質試樣係供予分析用粒徑篩析層析法(SEC)，決定純度與濃度之後，用於各種評價。
(實施例21)　抗HLA/NY-ESO之scFv-異二聚體Fc的表現、純化 21)-1　抗HLA/NY-ESO之scFv-異二聚體Fc表現載體的構築 為了比較不同型式中之生產性，而構築使抗HLA/NY-ESO的scFv經型式變換為Fc融合體而成之的表現載體。異二聚體Fc序列(以下記載為HC-h及HC-k)係使用(Nat Biotechnol. 1998Jul; 16(7)677-81.)所報告者。 設計被認為對HLA-A2/NY-ESO-1具有高結合能的抗體mAb24955N、mAb24956N、mAb28075P、mAb28105P、mAb28113P及mAb29822P2 (WO2021/ 003357)之scFv-異二聚體Fc，將mAb24955N之scFv-異二聚體Fc命名為NYC-0011，將mAb24956N之scFv-異二聚體Fc命名為NYC-0012，將mAb28075P之scFv-異二聚體Fc命名為NYC-0013，將mAb28105P之scFv-異二聚體Fc命名為NYC-0014，將mAb28113P之scFv-異二聚體Fc命名為NYC-0015，將mAb29822P2之scFv-異二聚體Fc命名為NYC-0016。又，將NYA-2047之scFv-異二聚體Fc命名為NYD-2047，將NYA-2061之scFv-異二聚體Fc命名為NYD-2061，將NYA-3061之scFv-異二聚體Fc命名為NYD-3061。 設計以pcDNA3.3或pcDNA3.4(Thermo Fisher Scientific公司)為骨架的各種HC-h、NYC-0011-HC-k、NYC-0012-HC-k、NYC-0013-HC-k、NYC-0014-HC-k、NYC-0015-HC-k及NYC-0016-HC-k之哺乳動物細胞用表現載體。進一步為了使載體骨架及型式成為一致來比較哺乳動物細胞中之表現量，而設計NYD-2047-HC-k、NYD-2061-HC-k、NYD-3061-HC-k之哺乳動物細胞用表現載體。 所構築之scFv-異二聚體Fc表現載體的核苷酸序列係進行再解析，確認HC-h、NYD-2047-HC-k、NYD-2061-HC-k、NYD-3061-HC-k、NYC-0011-HC-k、NYC-0012-HC-k、NYC-0013-HC-k、NYC-0014-HC-k、NYC-0015-HC-k及NYC-0016-HC-k之全長的核苷酸序列各自為序列表之序列識別號177(圖178)、179(圖180)、181(圖182)、183(圖184、185(圖186)、187(圖188)、189(圖190)、191(圖192)、193(圖194)及195(圖196)所示核苷酸序列。又，由上述核苷酸序列，該序列所編碼之HC-h全長的胺基酸序列為序列識別號178(圖179)所示胺基酸序列，NYD-2047-HC-k全長的胺基酸序列為序列識別號180(圖181)所示胺基酸序列，NYD-2061-HC-k全長的胺基酸序列為序列識別號182(圖183)所示胺基酸序列，NYD-3061-HC-k全長的胺基酸序列為序列識別號184(圖185)所示胺基酸序列，NYC-0011-HC-k全長的胺基酸序列為序列識別號186(圖187)所示胺基酸序列，NYC-0012-HC-k全長的胺基酸序列為序列識別號188(圖189)所示胺基酸序列，NYC-0013-HC-k全長的胺基酸序列為序列識別號190(圖191)所示胺基酸序列，NYC-0014-HC-k全長的胺基酸序列為序列識別號192(圖193)所示胺基酸序列，NYC-0015-HC-k全長的胺基酸序列為序列識別號194(圖195)所示胺基酸序列，NYC-0016-HC-k全長的胺基酸序列為序列識別號196(圖197)所示胺基酸序列。
21)-2　抗HLA/NY-ESO之scFv-異二聚體Fc的表現、純化 Expi293F細胞(Thermo Fisher Scientific公司)之培養及基因導入係與1)-5-2所記載之方法同樣地實施。將用於各選殖株之製作的質體之組合呈示於以下的表13。 [表13]
選殖株名 HC-k HC-h
NYD-2047 NYD-2047-HC-k HC-h
NYD-2061 NYD-2061-HC-k HC-h
NYD-3061 NYD-3061-HC-k HC-h
NYC-0011 NYC-0011-HC-k HC-h
NYC-0012 NYC-0012-HC-k HC-h
NYC-0013 NYC-0013-HC-k HC-h
NYC-0014 NYC-0014-HC-k HC-h
NYC-0015 NYC-0015-HC-k HC-h
NYC-0016 NYC-0016-HC-k HC-h
為了評價生產量，而於基因導入之後在37℃、8%CO2 培養箱以135rpm振盪培養4天，將所得之培養上清液以0.2μm過濾器(Thermo Fisher Scientific公司)過濾，得到抗HLA/NY-ESO scFv-異二聚體Fc的培養上清液。純化係對經PBS pH7.4平衡之MabSelectSuRe樹脂(Cytiva公司)供予培養上清液，使目標的抗HLA/NY-ESO之scFv-異二聚體Fc吸附。以PBS除去非吸附成分之後，以醋酸緩衝液進行沖提，沖提液係以Tris緩衝液將pH調製為中性之後，將沖提液供予分析用粒徑篩析層析法(SEC)，決定純度與濃度。將培養上清液每1L換算的生產量呈示於表14。相較於NYC-0011、NYC-0012、NYC-0013、NYC-0014、NYC-0015及NYC-0016，NYD-2047、NYD-2061、NYD-3061之利用MabSelectSuRe樹脂的純化後沖提液中之培養上清液每1L換算的生產量皆較多。 [表14]
選殖株名 每1L的生產量(mg)
NYD-2047 93.3
NYD-2061 112.2
NYD-3061 127.5
NYC-0011 17.2
NYC-0012 4.2
NYC-0013 54.1
NYC-0014 1.8
NYC-0015 12.2
NYC-0016 16.6
各scFv-異二聚體Fc的MabSelectSuRe樹脂沖提液係進行濃縮，以經25mM組胺酸、300mM NaCl、5%山梨醇、pH5.5平衡之凝膠過濾管柱(Superdex 200 Increase、Cytiva)進行純化。純化蛋白質試樣係供予分析用粒徑篩析層析法(SEC)，使用可確保純度與量的NYD-2047、NYD-2061、NYD-3061、NYC-0011、NYC-0013、及NYC-0015作為溶液安定性評價用試樣。而且，NYC-0016由於目標物於SEC中之預期沖提時間無法檢出，而判斷培養上清液中目標物並未表現。
(實施例22)　抗HLA/NY-ESO之scFv-異二聚體Fc的溶液安定性評價 使用以實施例21調製的NYD-2047、NYD-2061、NYD-3061、NYC-0011、NYC-0013、及NYC-0015，以Amicon Ultra-4(Millipore公司)進行離心濃縮，進行緩衝液交換為PBS後，添加PBS且將試樣濃度調整為5mg/ml，作為評價用試樣。又，各評價用試樣之開始時的HMWS(%)，係使用使用AdvanceBio SEC 300A 2.7μm 4.6×150mm(Agilent公司)之粒徑篩析層析法，藉由面積標準化法來計算。移動相係使用0.2M Ki/200mM KCl/pH7.0，以流速0.2ml/min進行分析(檢出波長280nm)。各試樣的加速劣化試驗係於40℃保存1日、7日後，以與上述同條件實施粒徑篩析層析法，以面積標準化法計算各試樣的HMWS(%)。將顯示各試樣之於40保存之際的經時變化之結果呈示於圖163。 NYD-2047、NYD-2061、NYD-3061之保存時間經過所致HMWS(%)各增加到8.7、8.1、4.4%。另一方面，NYC-0011、NYC-0013、及NYC-0015之保存時間經過所致HMWS(%)各顯著地增加為71.8、42.4、97.3%。 由以上之結果來看，相較於NYC-0011、NYC-0013、及NYC-0015，NYD-2047、NYD-2061及NYD-3061係溶液安定性優異。又，NYD-3061係於評價試樣中HMWS(%)最低且溶液安定性最優異。
(實施例23)　利用Biacore之對HLA/NY-ESO之結合能評價 使用相當於構成NYC-0011、NYC-0013、及NYC-0015的抗HLA/NY-ESO之scFv的NYC-0005、NYC-0007、NYC-0008，而評價對HLA/NY-ESO之結合能。 使用Biacore T200，對經固定化之抗His抗體作為配體而捕捉(capture)上述抗HLA/NY-ESO scFv，且作為分析物而測定抗原。抗原係使用1)-1中調製的HLA/NY-ESO。抗His抗體(His Capture kit，Cytiva公司)係對感測晶片CM5(Cytiva公司)，按照套組說明書進行固定化。以HBS-EP+(Cytiva公司)稀釋為0.5μg/mL而進行評價的各抗HLA/NY-ESO scFv以10μL/min接觸60秒鐘而進行固定化。然後，將以HBS-EP+稀釋之複數濃度的HLA/NY-ESO作為分析物而以流速30μL/min添加各試樣120秒鐘，藉由測定600秒鐘解離之單循環動力學解析而計算KD ，且將結果記載於表15。於作為陽性對照使用的NYA-2047之對HLA/NY-ESO的結合能可安定地確認之條件下，確認了NYC-0005、NYC-0007、NYC-0008係對HLA/NY-ESO結合。 [表15]
選殖株名 KD
NYC-0005 9.3nM
NYC-0007 1.0μM
NYC-0008 7.9nM
[產業上利用之可能性]
本發明之雙特異性抗體可作為癌症等之治療劑或預防劑利用。 本說明書中所引用之全部的出版物、專利及專利申請係直接藉由引用而編入本說明書中。 [序列表非關鍵詞文字]
序列識別號1:NY-ESO中之肽的胺基酸序列(圖8) 序列識別號2:MAGEC-1中之肽的胺基酸序列(圖9) 序列識別號3:scFv序列分析用引子1(圖10) 序列識別號4:scFv序列分析用引子2(圖11) 序列識別號5:NYA-0001之重鏈可變區的核苷酸序列(圖12) 序列識別號6:NYA-0001之重鏈可變區的胺基酸序列(圖13) 序列識別號7:NYA-0001之輕鏈可變區的核苷酸序列(圖14) 序列識別號8:NYA-0001之輕鏈可變區的胺基酸序列(圖15) 序列識別號9:NYA-0060之重鏈可變區的核苷酸序列(圖16) 序列識別號10:NYA-0060之重鏈可變區的胺基酸序列(圖17) 序列識別號11:NYA-0060之輕鏈可變區的核苷酸序列(圖18) 序列識別號12:NYA-0060之輕鏈可變區的胺基酸序列(圖19) 序列識別號13:NYA-0068之重鏈可變區的核苷酸序列(圖20) 序列識別號14:NYA-0068之重鏈可變區的胺基酸序列(圖21) 序列識別號15:NYA-0068之輕鏈可變區的核苷酸序列(圖22) 序列識別號16:NYA-0068之輕鏈可變區的胺基酸序列(圖23) 序列識別號17:NYA-0082之重鏈可變區的核苷酸序列(圖24) 序列識別號18:NYA-0082之重鏈可變區的胺基酸序列(圖25) 序列識別號19:NYA-0082之輕鏈可變區的核苷酸序列(圖26) 序列識別號20:NYA-0082之輕鏈可變區的胺基酸序列(圖27) 序列識別號21:NYA-1163標記附加物的核苷酸序列(圖28) 序列識別號22:NYA-2023標記附加物的核苷酸序列(圖29) 序列識別號23:NYA-2027標記附加物的核苷酸序列(圖30) 序列識別號24:NYA-1143標記附加物的核苷酸序列(圖31) 序列識別號25:NYA-2143標記附加物的核苷酸序列(圖32) 序列識別號26:NYA-1163標記附加物的胺基酸序列(圖33)，NYA-1163為胺基酸編號21～266 序列識別號27:NYA-2023標記附加物的胺基酸序列(圖34)，NYA-2023為胺基酸編號21～266 序列識別號28:NYA-2027標記附加物的胺基酸序列(圖35)，NYA-2027為胺基酸編號21～266 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序列識別號195:NYC-0016-HC-k全長的核苷酸序列(圖196) 序列識別號196:NYC-0016-HC-k全長的胺基酸序列(圖197) 序列識別號197:NYZ-1007-HC之全長胺基酸序列(圖198) 序列識別號198:NYZ-1017-HC之全長胺基酸序列(圖199)
無。
圖1為呈示抗HLA/NY-ESO scFv NYA-0001、1143、1154、1163、2023、2027、2035、2044、2045、2047、2048、2060、2061、2143、NYC-0003、0004對於添加各種點突變肽的T2細胞之標準化gMFI之表。*/底線表示與各scFv對於添加NY-ESO肽的T2細胞之標準化gMFI比較，而為一半以下。 圖2A為呈示所選擇之同源性肽資訊之表。藉由NetMHCPan2.8而預測對於HLA-A0201之結合性，且以半抑制濃度(IC50 )表示。 圖2B為呈示抗HLA/NY-ESO scFv NYA-0001、1143、1154、1163、2023、2027、2035、2044、2045、2047、2048、2060、2061、2143、NYC-0003、0004對於添加各種同源性肽的T2細胞之標準化gMFI之表。*/底線表示與各scFv對於添加DMSO的 T2細胞之標準化gMFI比較，而為較大值。 圖3為呈示本實施例所示之抗體的型式之圖。(a)scFv：以連接子(linker)連結了抗體H鏈可變區(VH，後述)及抗體L鏈可變區(VL，後述)(皆為白色)之型式。本實施例中將抗HLA-A2/NY-ESO及CD3的scFv用於評價。(b)Fab：包含VH(白色)與抗體H鏈恆定區(CH1： 格子圖案)及VL(白色)與抗體L鏈恆定區(橫線)之型式。本實施例中將抗HLA-A2/NY-ESO Fab等用於評價。(c)taFv：以連接子連結了2種類的scFv(白色與右上斜線)之型式。本實施例中將包含抗HLA-A2/NY-ESO scFv與抗CD3 scFv的taFv用於評價。(d)taFv-異二聚體Fc型：於taFv的C末端側有經置入會形成異二聚體之變異的Fc(左上斜線)附加(亦稱為第1多肽)，且與另一個Fc(黑色實心：亦稱為第2多肽)異種會合之型式。本實施例中將包含抗HLA-A2/NY-ESO scFv與抗CD3 scFv的taFv-異二聚體Fc用於評價。(e)taFv-Fab-異二聚體Fc型：於上述taFv-異二聚體Fc型附加有Fab之型式。本實施例中將包含抗HLA-A2/NY-ESO scFv與抗CD3 scFv的taFv及使用了HLA-A2/NY-ESO Fab的taFv-Fab-異二聚體Fc等用於評價。(f)呈示taFv-異二聚體Fc型及taFv-Fab-異二聚體Fc型所共通的第1多肽。第1多肽係由N末端朝向C末端，依以下順序包含與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv、與CD3特異性地結合的scFv及Fc區(i)而成。(g)呈示taFv-異二聚體Fc型的第2多肽。第2多肽係包含鉸鏈區及Fc區(ii)而成。(h)呈示taFv-Fab-異二聚體Fc型的第2多肽。第2多肽係包含免疫球蛋白重鏈而成，該免疫球蛋白重鏈包含鉸鏈區及Fc區(ii)。(i)呈示taFv-Fab-異二聚體Fc型的第3多肽。第3多肽係包含免疫球蛋白輕鏈而成。 圖4A為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYF-0016、NYF-0019、NYF-0022、NYF-0023、NYF-0027、NYF-0035、NYF-0044、NYF-0047對於內因性人類NY-ESO表現U266B1細胞，在人類PBMC共存下具有細胞毒殺活性之圖。圖中的誤差槓表示標準偏差(n=3)。 圖4B為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYF-0016、NYF-0058對於內因性人類NY-ESO表現U266B1細胞，在人類PBMC共存下具有細胞毒殺活性之圖。圖中的誤差槓表示標準偏差(n=3)。 圖4C為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYF-0023、NYF-0045、NYF-0048、NYF-0060、NYF-0061對於內因性人類NY-ESO表現U266B1細胞，在人類PBMC共存下具有細胞毒殺活性之圖。圖中的誤差槓表示標準偏差(n=3)。 圖4D為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYF-0016、NYF-0019、NYF-0022、NYF-0023、NYF-0027、NYF-0035、NYF-0044、NYF-0047對於內因性人類NY-ESO表現NCI-H1703細胞，在人類PBMC共存下具有細胞毒殺活性之圖。圖中的誤差槓表示標準偏差(n=3)。 圖4E為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYF-0016、NYF-0058對於內因性人類NY-ESO表現NCI-H1703細胞，在人類PBMC共存下具有細胞毒殺活性之圖。圖中的誤差槓表示標準偏差(n=3)。 圖4F為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYF-0023、NYF-0045、NYF-0048、NYF-0060、NYF-0061對於內因性人類NY-ESO表現NCI-H1703細胞，在人類PBMC共存下具有細胞毒殺活性之圖。圖中的誤差槓表示標準偏差(n=3)。 圖4G為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYF-0016、NYF-0019、NYF-0022、NYF-0023、NYF-0027、NYF-0035、NYF-0044、NYF-0047對於內因性人類NY-ESO非表現AGS細胞，在人類PBMC共存下不顯示細胞毒殺活性之圖。圖中的誤差槓表示標準偏差(n=3)。 圖4H為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYF-0016、NYF-0058對於內因性人類NY-ESO非表現AGS細胞，在人類PBMC共存下不顯示細胞毒殺活性之圖。圖中的誤差槓表示標準偏差(n=3)。 圖4I為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYF-0023、NYF-0045、NYF-0048、NYF-0060、NYF-0061對於內因性人類NY-ESO非表現AGS細胞，在人類PBMC共存下不顯示細胞毒殺活性之圖。圖中的誤差槓表示標準偏差(n=3)。 圖4J為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYF-0016、NYF-0019、NYF-0022、NYF-0023、NYF-0027、NYF-0035、NYF-0044、NYF-0047對於內因性人類NY-ESO非表現CFPAC-1細胞，在人類PBMC共存下不顯示細胞毒殺活性之圖。圖中的誤差槓表示標準偏差(n=3)。 圖4K為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYF-0016、NYF-0058對於內因性人類NY-ESO非表現CFPAC-1細胞，在人類PBMC共存下不顯示細胞毒殺活性之圖。圖中的誤差槓表示標準偏差(n=3)。 圖4L為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYF-0023、NYF-0045、NYF-0048、NYF-0060、NYF-0061對於內因性人類NY-ESO非表現CFPAC-1細胞，在人類PBMC共存下不顯示細胞毒殺活性之圖。圖中的誤差槓表示標準偏差(n=3)。 圖5A為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYF-0016、NYF-0019、NYF-0044、NYF-0047於人類PBMC植入模型中具有抗腫瘤活性之圖。圖中的誤差槓表示標準誤差(僅NYF-0044第32天為n=4，其他為n=5)。 圖5B為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYF-0016、NYF-0022、NYF-0023、NYF-0027、NYF-0035、NYF-0058於人類PBMC植入模型中具有抗腫瘤活性之圖。圖中的誤差槓表示標準誤差(n=5，僅媒液對照(Vehicle control)組為n=6)。 圖5C為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYF-0016、NYF-0045、NYF-0048、NYF-0060、NYF-0061於人類PBMC植入模型中具有抗腫瘤活性之圖。圖中的誤差槓表示標準誤差(n=5)。 圖6A為呈示本實施例所示之抗體的型式之圖。(a)混成(Hybrid)型：於Fab及scFv各自的C末端側有經置入會形成異二聚體之變異的Fc(斜線及黑色實心)附加，且2個Fc會合之型式。本實施例中將包含抗HLA-A2/NY-ESO Fab與抗CD3 scFv的混成型用於評價。(b)雙重(Dual)型：於2種類的不同scFv各自的C末端側有經置入會形成異二聚體之變異的Fc(左上斜線及黑色實心)附加，且2個Fc異種會合之型式。本實施例中將包含抗HLA-A2/NY-ESO scFv與抗CD3 scFv的雙重型用於評價。(c)scFv-Fab-異二聚體Fc型：於以連接子(linker)連結了scFv與Fab的C末端側有經置入會形成異二聚體之變異的Fc(左上斜線)附加，且與另1個Fc(黑色實心)會合之型式。本實施例中將包含抗CD3 scFv(右上斜線)與抗HLA-A2/NY-ESO Fab的scFv-Fab-異二聚體Fc型用於評價。又，包含抗HLA-A2/NY-ESO scFv(右上斜線)與抗CD3 Fab的scFv-Fab-異二聚體Fc型亦用於評價。 圖6B為呈示本實施例所示之抗體的型式之圖。(a)taFv-異二聚體Fc型：與圖3(d)相同。於taFv的C末端側有經置入會形成異二聚體之變異的Fc(左上斜線)附加，且與另1個Fc(黑色實心)異種會合之型式。本實施例中將包含抗HLA-A2/NY-ESO scFv與抗CD3 scFv的taFv-異二聚體Fc型用於評價。(b)taFv(逆)-異二聚體Fc型：經交換上述taFv-異二聚體Fc型中之2個scFv的順序者。本實施例中將包含抗CD3 scFv與抗HLA-A2/NY-ESO scFv的taFv(逆)-異二聚體Fc型用於評價。(c)呈示taFv(逆)-異二聚體Fc型的第1多肽。第1多肽係由N末端朝向C末端，依以下順序包含與CD3特異性地結合的scFv、與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv及Fc區(i)而成。(d)呈示taFv(逆)-異二聚體Fc型的第2多肽。第2多肽係包含鉸鏈區及Fc區(ii)而成。 圖7A為呈示各種抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、混成體(NYG-3143)、雙重體(NYG-2143)、taFv-異二聚體Fc體(NYF-0011)對於內因性人類NY-ESO表現U266B1細胞之在人類PBMC共存下的細胞毒殺活性之圖。圖中的誤差槓表示標準偏差(n=3)。 圖7B為呈示各種抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、scFv-Fab-異二聚體Fc體(NYF-0003)、taFv-異二聚體Fc體(NYF-0010)、taFv(逆)-異二聚體Fc體(NYF-0004)對於內因性人類NY-ESO表現U266B1細胞之在人類PBMC共存下的細胞毒殺活性之圖。圖中的誤差槓表示標準偏差(n=3)。 圖8為NY-ESO中之肽的胺基酸序列(序列識別號1)。 圖9為MAGEC-1中之肽的胺基酸序列(序列識別號2)。 圖10為scFv序列分析用引子1(序列識別號3)。 圖11為scFv序列分析用引子2(序列識別號4)。 圖12為NYA-0001之重鏈可變區的核苷酸序列(序列識別號5)。 圖13為NYA-0001之重鏈可變區的胺基酸序列(序列識別號6)。 圖14為NYA-0001之輕鏈可變區的核苷酸序列(序列識別號7)。 圖15為NYA-0001之輕鏈可變區的胺基酸序列(序列識別號8)。 圖16為NYA-0060之重鏈可變區的核苷酸序列(序列識別號9)。 圖17為NYA-0060之重鏈可變區的胺基酸序列(序列識別號10)。 圖18為NYA-0060之輕鏈可變區的核苷酸序列(序列識別號11)。 圖19為NYA-0060之輕鏈可變區的胺基酸序列(序列識別號12)。 圖20為NYA-0068之重鏈可變區的核苷酸序列(序列識別號13)。 圖21為NYA-0068之重鏈可變區的胺基酸序列(序列識別號14)。 圖22為NYA-0068之輕鏈可變區的核苷酸序列(序列識別號15)。 圖23為NYA-0068之輕鏈可變區的胺基酸序列(序列識別號16)。 圖24為NYA-0082之重鏈可變區的核苷酸序列(序列識別號17)。 圖25為NYA-0082之重鏈可變區的胺基酸序列(序列識別號18)。 圖26為NYA-0082之輕鏈可變區的核苷酸序列(序列識別號19)。 圖27為NYA-0082之輕鏈可變區的胺基酸序列(序列識別號20)。 圖28為NYA-1163標記附加物的核苷酸序列(序列識別號21)。 圖29為NYA-2023標記附加物的核苷酸序列(序列識別號22)。 圖30為NYA-2027標記附加物的核苷酸序列(序列識別號23)。 圖31為NYA-1143標記附加物的核苷酸序列(序列識別號24)。 圖32為NYA-2143標記附加物的核苷酸序列(序列識別號25)。 圖33為NYA-1163標記附加物的胺基酸序列(序列識別號26)，NYA-1163為胺基酸編號21～266。 圖34為NYA-2023標記附加物的胺基酸序列(序列識別號27)，NYA-2023為胺基酸編號21～266。 圖35為NYA-2027標記附加物的胺基酸序列(序列識別號28)，NYA-2027為胺基酸編號21～266。 圖36為NYA-1143標記附加物的胺基酸序列(序列識別號29)，NYA-1143為胺基酸編號21～266。 圖37為NYA-2143標記附加物的胺基酸序列(序列識別號30)，NYA-2143為胺基酸編號21～266。 圖38為NYA-1154標記附加物的核苷酸序列(序列識別號31)。 圖39為NYA-1154標記附加物的胺基酸序列(序列識別號32)，NYA-1154為胺基酸編號21～266。 圖40為HLA-A*0201(基因銀行(GenBank)：ASA47534.1)之截短型(truncated form)的胺基酸序列(序列識別號33)。 圖41為β2-微球蛋白的胺基酸序列(序列識別號34)。 圖42為NYA-2035標記附加物的核苷酸序列(序列識別號35)。 圖43為NYA-2035標記附加物的胺基酸序列(序列識別號36)，NYA-2035為胺基酸編號21～266。 圖44為NYA-1143-VH01的胺基酸序列(序列識別號37)。 圖45為NYA-1143-VH02的胺基酸序列(序列識別號38)。 圖46為NYA-1143-VH03的胺基酸序列(序列識別號39)。 圖47為NYA-1143-VL01的胺基酸序列(序列識別號40)。 圖48為NYA-2044標記附加物的核苷酸序列(序列識別號41)。 圖49為NYA-2045標記附加物的核苷酸序列(序列識別號42)。 圖50為NYA-2047標記附加物的核苷酸序列(序列識別號43)。 圖51為NYA-2048標記附加物的核苷酸序列(序列識別號44)。 圖52為NYA-2060標記附加物的核苷酸序列(序列識別號45)。 圖53為NYA-2061標記附加物的核苷酸序列(序列識別號46)。 圖54為NYA-2044標記附加物的胺基酸序列(序列識別號47)，NYA-2044為胺基酸編號21～266。 圖55為NYA-2045標記附加物的胺基酸序列(序列識別號48)，NYA-2045為胺基酸編號21～266。 圖56為NYA-0082的胺基酸序列(序列識別號49)。 圖57為NYA-2047標記附加物的胺基酸序列(序列識別號50)，NYA-2047為胺基酸編號21～266。 圖58為NYA-2048標記附加物的胺基酸序列(序列識別號51)，NYA-2048為胺基酸編號21～266。 圖59為NYA-2060標記附加物的胺基酸序列(序列識別號52)，NYA-2060為胺基酸編號21～266。 圖60為NYA-2061標記附加物的胺基酸序列(序列識別號53)，NYA-2061為胺基酸編號21～266。 圖61為NYA-0001重鏈之CDRH1～CDRH3、及輕鏈之CDRL1～L3的胺基酸序列(序列識別號54～59)。 圖62為NYA-2023之CDRL1的胺基酸序列(序列識別號60)。 圖63為NYA-2027之CDRL3的胺基酸序列(序列識別號61)。 圖64為NYA-1154之CDRH3及CDRL3的胺基酸序列(序列識別號62及63)。 圖65為NYA-0035之CDRL1的胺基酸序列(序列識別號64)。 圖66為NYC-0003標記附加物的核苷酸序列(序列識別號65)。 圖67為NYC-0004標記附加物的核苷酸序列(序列識別號66)。 圖68為NYC-0003標記附加物的胺基酸序列(序列識別號67)，NYC-0003為胺基酸編號21～263。 圖69為NYC-0004標記附加物的胺基酸序列(序列識別號68)，NYC-0004為胺基酸編號21～263。 圖70為NYA-0001標記附加物的核苷酸序列(序列識別號69)。 圖71為NYA-0001標記附加物的胺基酸序列(序列識別號70)，NYA-0001為胺基酸編號21～266。 圖72為HC1的核苷酸序列(序列識別號71)。 圖73為NYF-0016-HC2的核苷酸序列(序列識別號72)。 圖74為NYF-0019-HC2的核苷酸序列(序列識別號73)。 圖75為NYF-0022-HC2的核苷酸序列(序列識別號74)。 圖76為NYF-0023-HC2的核苷酸序列(序列識別號75)。 圖77為NYF-0027-HC2的核苷酸序列(序列識別號76)。 圖78為NYF-0035-HC2的核苷酸序列(序列識別號77)。 圖79為NYF-0044-HC2的核苷酸序列(序列識別號78)。 圖80為NYF-0045-HC2的核苷酸序列(序列識別號79)。 圖81為NYF-0047-HC2的核苷酸序列(序列識別號80)。 圖82為NYF-0048-HC2的核苷酸序列(序列識別號81)。 圖83為NYF-0060-HC2的核苷酸序列(序列識別號82)。 圖84為NYF-0061-HC2的核苷酸序列(序列識別號83)。 圖85為HC1的胺基酸序列(序列識別號84)。 圖86為NYF-0016-HC2的胺基酸序列(序列識別號85)，NYA-1143為胺基酸編號21～266，C3E-7085為胺基酸編號272～511。 圖87為NYF-0019-HC2的胺基酸序列(序列識別號86)，NYA-2143為胺基酸編號21～266，C3E-7085為胺基酸編號272～511。 圖88為NYF-0022-HC2的胺基酸序列(序列識別號87)，NYA-1163為胺基酸編號21～266，C3E-7085為胺基酸編號272～511。 圖89為NYF-0023-HC2的胺基酸序列(序列識別號88)，NYA-2023為胺基酸編號21～266，C3E-7085為胺基酸編號272～511。 圖90為NYF-0027-HC2的胺基酸序列(序列識別號89)，NYA-2027為胺基酸編號21～266，C3E-7085為胺基酸編號272～511。 圖91為NYF-0035-HC2的胺基酸序列(序列識別號90)，NYA-2035為胺基酸編號21～266，C3E-7085為胺基酸編號272～511。 圖92為NYF-0044-HC2的胺基酸序列(序列識別號91)，NYA-2044為胺基酸編號21～266，C3E-7085為胺基酸編號272～511。 圖93為NYF-0045-HC2的胺基酸序列(序列識別號92)，NYA-2045為胺基酸編號21～266，C3E-7085為胺基酸編號272～511。 圖94為NYF-0047-HC2的胺基酸序列(序列識別號93)，NYA-2047為胺基酸編號21～266，C3E-7085為胺基酸編號272～511。 圖95為NYF-0048-HC2的胺基酸序列(序列識別號94)，NYA-2048為胺基酸編號21～266，C3E-7085為胺基酸編號272～511。 圖96為NYF-0060-HC2的胺基酸序列(序列識別號95)，NYA-2060為胺基酸編號21～266，C3E-7085為胺基酸編號272～511。 圖97為NYF-0061-HC2的胺基酸序列(序列識別號96)，NYA-2061為胺基酸編號21～266，C3E-7085為胺基酸編號272～511。 圖98為NYA-0001-Fab-HC1-k delete的核苷酸序列(序列識別號97)。 圖99為NYA-0001-LC的核苷酸序列(序列識別號98)。 圖100為NYA-0001-Fab-HC1-k delete的胺基酸序列(序列識別號99)，NYA-0001之重鏈可變區為胺基酸編號20～139。 圖101為NYA-0001-LC的胺基酸序列(序列識別號100)，NYA-0001之輕鏈可變區為胺基酸編號21～131。 圖102為NYA-1143-Fab-HC1-k delete的核苷酸序列(序列識別號101)。 圖103為NYA-1143-LC的核苷酸序列(序列識別號102)。 圖104為C3E-7085-HC2-k delete的核苷酸序列(序列識別號103)。 圖105為NYA-1143-Fab-HC1-k delete的胺基酸序列(序列識別號104)，NYA-1143之重鏈可變區為胺基酸編號20～139。 圖106為NYA-1143-LC的胺基酸序列(序列識別號105)，NYA-1143之輕鏈可變區為胺基酸編號21～131。 圖107為C3E-7085-HC2-k delete的胺基酸序列(序列識別號106)，C3E-7085為胺基酸編號21～260。 圖108為NYA-1143-HC1-k delete的核苷酸序列(序列識別號107)。 圖109為NYA-1143-HC1-k delete的胺基酸序列(序列識別號108)，NYA-1143為胺基酸編號21～266。 圖110為C3E-7085-NYA-1154-Fab-HC2-k delete的核苷酸序列(序列識別號109)。 圖111為NYA-1154-LC的核苷酸序列(序列識別號110)。 圖112為OAA-HC1-k delete的核苷酸序列(序列識別號111)。 圖113為C3E-7085-NYA-1154-Fab-HC2-k delete的胺基酸序列(序列識別號112)，C3E-7085為胺基酸編號21～260、NYA-1154之重鏈可變區為胺基酸編號266～285。 圖114為NYA-1154-LC的胺基酸序列(序列識別號113)，NYA-1154之輕鏈可變區為胺基酸編號21～131。 圖115為OAA-HC1-k delete的胺基酸序列(序列識別號114)。 圖116為NYF-0010-HC2-k delete的核苷酸序列(序列識別號115)。 圖117為NYF-0004-HC2-k delete的核苷酸序列(序列識別號116)。 圖118為NYF-0011-HC2-k delete的核苷酸序列(序列識別號117)。 圖119為NYF-0010-HC2-k delete的胺基酸序列(序列識別號118)，NYA-1154為胺基酸編號21～266，C3E-7085為胺基酸編號272～511。 圖120為NYF-0004-HC2-k delete的胺基酸序列(序列識別號119)，C3E-7085為胺基酸編號21～260，NYA-1154為胺基酸編號272～511。 圖121為NYF-0011-HC2-k delete的胺基酸序列(序列識別號120)，NYA-1143為胺基酸編號21～266，C3E-7085為胺基酸編號272～511。 圖122為點突變NY-ESO肽1F的胺基酸序列(序列識別號121)。 圖123為點突變NY-ESO肽2M的胺基酸序列(序列識別號122)。 圖124為點突變NY-ESO肽3A的胺基酸序列(序列識別號123)。 圖125為點突變NY-ESO肽4A的胺基酸序列(序列識別號124)。 圖126為點突變NY-ESO肽5A的胺基酸序列(序列識別號125)。 圖127為點突變NY-ESO肽6L的胺基酸序列(序列識別號126)。 圖128為點突變NY-ESO肽7F的胺基酸序列(序列識別號127)。 圖129為點突變NY-ESO肽8A的胺基酸序列(序列識別號128)。 圖130為點突變NY-ESO肽9A的胺基酸序列(序列識別號129)。 圖131為gp100肽的胺基酸序列(序列識別號130)。 圖132為同源性肽DOLPP1的胺基酸序列(序列識別號131)。 圖133為同源性肽IL20RB的胺基酸序列(序列識別號132)。 圖134為同源性肽PRKD2的胺基酸序列(序列識別號133)。 圖135為同源性肽CD163的胺基酸序列(序列識別號134)。 圖136為同源性肽之P2RY8的胺基酸序列(序列識別號135)。 圖137為C3E-7034的胺基酸序列(序列識別號136)。 圖138為C3E-7036的胺基酸序列(序列識別號137)。 圖139為C3E-7085的胺基酸序列(序列識別號138)。 圖140為C3E-7088的胺基酸序列(序列識別號139)。 圖141為C3E-7093的胺基酸序列(序列識別號140)。 圖142為C3E-7085重鏈之CDRH1～CDRH3、及輕鏈之CDRL1～CDRL3的胺基酸序列(序列識別號141～146)。 圖143為C3E-7078的胺基酸序列(序列識別號147)。 圖144為NYF-0014-HC2的核苷酸序列(序列識別號148)。 圖145為NYF-0014-HC2的胺基酸序列(序列識別號149)，NYA-0001為胺基酸編號21～266，C3E-7085為胺基酸編號272～511。 圖146為NYF-0082-HC2的胺基酸序列(序列識別號150)，NYA-0082為胺基酸編號21～266，C3E-7085為胺基酸編號272～511。 圖147為人類CD3ε的胺基酸序列(序列識別號151)。 圖148為NYZ-0038-HC2全長的核苷酸序列(序列識別號152)。 圖149為NYZ-0082-HC2全長的核苷酸序列(序列識別號153)。 圖150為NYZ-0083-HC2全長的核苷酸序列(序列識別號154)。 圖151為NYZ-0038-HC2全長的胺基酸序列(序列識別號155)，NYA-2061為胺基酸編號21～266，C3E-7096為胺基酸編號272～511。 圖152為NYZ-0082-HC2全長的胺基酸序列(序列識別號156)，NYA-3061為胺基酸編號21～271，C3E-7096為胺基酸編號277～516。 圖153為NYZ-0083-HC2全長的胺基酸序列(序列識別號157)，NYA-3061為胺基酸編號21～271，C3E-7097為胺基酸編號277～516。 圖154為NYZ-1010-HC2全長的核苷酸序列(序列識別號158)。 圖155為C3E-7085-LC全長的核苷酸序列(序列識別號159)。 圖156為NYZ-1010-HC2全長的胺基酸序列(序列識別號160)，NYA-3061為胺基酸編號21～271，C3E-7085重鏈可變區為胺基酸編號277～394。 圖157為C3E-7085-LC全長的胺基酸序列(序列識別號161)。 圖158A為圖158A為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子NYZ-0038、0082、0083、1010對於添加各種點突變肽的CD3e基因剔除T2細胞之標準化gMFI之表。*/底線表示與各Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子對於添加NY-ESO肽的CD3e基因剔除T2細胞之標準化gMFI比較，而為一半以下，*粗字表示為4分之1以下。 圖158B為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子NYZ-0038、0082、0083、1010對於添加各種同源性肽的CD3e基因剔除T2細胞之標準化gMFI之表。*/底線表示與各Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子對於添加DMSO的CD3e基因剔除T2細胞之標準化gMFI比較，而為較大之值。 圖159A為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYZ-0038、0082、0083對於內因性人類NY-ESO表現U266B1細胞，在人類PBMC共存下具有細胞毒殺活性之圖。圖中的誤差槓表示標準偏差(n=3)。 圖159B為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYZ-1010對於內因性人類NY-ESO表現U266B1細胞，在人類PBMC共存下具有細胞毒殺活性之圖。圖中的誤差槓表示標準偏差(n=3)。 圖159C為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYZ-0082、1010對於內因性人類NY-ESO表現NCI-H1703細胞，在人類PBMC共存下具有細胞毒殺活性之圖。圖中的誤差槓表示標準偏差(n=3)。 圖159D為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYZ-0038、0083對於內因性人類NY-ESO表現NCI-H1703細胞，在人類PBMC共存下具有細胞毒殺活性之圖。圖中的誤差槓表示標準偏差(n=3)。 圖159E為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYZ-0038、0082、0083對於內因性人類NY-ESO非表現AGS細胞，在人類PBMC共存下不顯示細胞毒殺活性之圖。圖中的誤差槓表示標準偏差(n=3)。 圖159F為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYZ-1010對於內因性人類NY-ESO非表現AGS細胞，在人類PBMC共存下不顯示細胞毒殺活性之圖。圖中的誤差槓表示標準偏差(n=3)。 圖159G為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYZ-0082、1010對於內因性人類NY-ESO非表現CFPAC-1細胞，在人類PBMC共存下不顯示細胞毒殺活性之圖。圖中的誤差槓表示標準偏差(n=3)。 圖159H為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYZ-0038、0083對於內因性人類NY-ESO非表現CFPAC-1細胞，在人類PBMC共存下不顯示細胞毒殺活性之圖。圖中的誤差槓表示標準偏差(n=3)。 圖160A為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYZ-0038於人類PBMC植入模型中具有抗腫瘤活性之圖。圖中的誤差槓表示標準誤差(n=5)。 圖160B為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYZ-0082於人類PBMC植入模型中具有抗腫瘤活性之圖。圖中的誤差槓表示標準誤差(n=5)。 圖160C為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYZ-0083於人類PBMC植入模型中具有抗腫瘤活性之圖。圖中的誤差槓表示標準誤差(n=5)。 圖160D為呈示Fc附加型抗HLA-A2/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子、NYZ-1010於人類PBMC植入模型中具有抗腫瘤活性之圖。圖中的誤差槓表示標準誤差(n=5)。 圖161為肽連接子的胺基酸序列(序列識別號162)。 圖162為呈示將各種Fc附加型抗HLA/NY-ESO-抗CD3雙特異性分子酸處理之情形的多聚體的含量(%)之圖。 圖163為呈示抗HLA/NY-ESO之scFv-異二聚體Fc的溶液安定性評價的結果之圖。 圖164為NYA-3061全長的核苷酸序列(序列識別號163)。 圖165為NYA-3061全長的胺基酸序列(序列識別號164)。 圖166為NYC-0005全長的核苷酸序列(序列識別號165)。 圖167為NYC-0005全長的胺基酸序列(序列識別號166)。 圖168為NYC-0006全長的核苷酸序列(序列識別號167)。 圖169為NYC-0006全長的胺基酸序列(序列識別號168)。 圖170為NYC-0007全長的核苷酸序列(序列識別號169)。 圖171為NYC-0007全長的胺基酸序列(序列識別號170)。 圖172為NYC-0008全長的核苷酸序列(序列識別號171)。 圖173為NYC-0008全長的胺基酸序列(序列識別號172)。 圖174為NYC-0009全長的核苷酸序列(序列識別號173)。 圖175為NYC-0009全長的胺基酸序列(序列識別號174)。 圖176為NYC-0010全長的核苷酸序列(序列識別號175)。 圖177為NYC-0010全長的胺基酸序列(序列識別號176)。 圖178為HC-h全長的核苷酸序列(序列識別號177)。 圖179為HC-h全長的胺基酸序列(序列識別號178)。 圖180為NYD-2047-HC-k全長的核苷酸序列(序列識別號179)。 圖181為NYD-2047-HC-k全長的胺基酸序列(序列識別號180)。 圖182為NYD-2061-HC-k全長的核苷酸序列(序列識別號181)。 圖183為NYD-2061-HC-k全長的胺基酸序列(序列識別號182)。 圖184為NYD-3061-HC-k全長的核苷酸序列(序列識別號183)。 圖185為NYD-3061-HC-k全長的胺基酸序列(序列識別號184)。 圖186為NYC-0011-HC-k全長的核苷酸序列(序列識別號185)。 圖187為NYC-0011-HC-k全長的胺基酸序列(序列識別號186)。 圖188為NYC-0012-HC-k全長的核苷酸序列(序列識別號187)。 圖189為NYC-0012-HC-k全長的胺基酸序列(序列識別號188)。 圖190為NYC-0013-HC-k全長的核苷酸序列(序列識別號189)。 圖191為NYC-0013-HC-k全長的胺基酸序列(序列識別號190)。 圖192為NYC-0014-HC-k全長的核苷酸序列(序列識別號191)。 圖193為NYC-0014-HC-k全長的胺基酸序列(序列識別號192)。 圖194為NYC-0015-HC-k全長的核苷酸序列(序列識別號193)。 圖195為NYC-0015-HC-k全長的胺基酸序列(序列識別號194)。 圖196為NYC-0016-HC-k全長的核苷酸序列(序列識別號195)。 圖197為NYC-0016-HC-k全長的胺基酸序列(序列識別號196)。 圖198為NYZ-1007-HC2全長的胺基酸序列(序列識別號197)，NYA-2061為胺基酸編號21～266，C3E-7085重鏈可變區為胺基酸編號272～389。 圖199為NYZ-1017-HC2全長的胺基酸序列(序列識別號198)，NYA-2047為胺基酸編號21～266，C3E-7085重鏈可變區為胺基酸編號277～389。
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無。

Claims (79)

  1. 一種與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段，其包含： 由序列識別號54所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH1、 由序列識別號55所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH2、 由序列識別號56所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH3、 由序列識別號57所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL1、或者是由序列識別號57所表示的胺基酸序列中第7號之胺基酸為W及/或者是第8號之胺基酸為K的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL1、 由序列識別號58所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL2、以及 由序列識別號59所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL3、或者是由序列識別號59所表示的胺基酸序列中第2號之胺基酸為A或者是S的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL3。
  2. 如請求項1之抗體或其結合片段，其包含選自包含以下(i)～(v)之群之群組的1個或2個以上之群的CDRH1～CDRH3及CDRL1～CDRL3， (i)由序列識別號54所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH1、 由序列識別號55所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH2、 由序列識別號56所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH3、 由序列識別號57所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL1、 由序列識別號58所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL2、及 由序列識別號59所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL3； (ii)由序列識別號54所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH1、 由序列識別號55所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH2、 由序列識別號56所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH3、 由序列識別號57所表示的胺基酸序列中第7號之胺基酸為W的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL1、 由序列識別號58所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL2、及 由序列識別號59所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL3； (iii)由序列識別號54所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH1、 由序列識別號55所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH2、 由序列識別號56所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH3、 由序列識別號57所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL1、 由序列識別號58所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL2、及 由序列識別號59所表示的胺基酸序列中第2號之胺基酸為A的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL3 (iv)由序列識別號54所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH1、 由序列識別號55所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH2、 由序列識別號56所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH3、 由序列識別號57所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL1、 由序列識別號58所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL2、及 由序列識別號59所表示的胺基酸序列中第2號之胺基酸為S的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL3；以及 (v)由序列識別號54所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH1、 由序列識別號55所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH2、 由序列識別號56所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH3、 由序列識別號57所表示的胺基酸序列中第7號之胺基酸為W而第8號之胺基酸為K的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL1、 由序列識別號58所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL2、及 由序列識別號59所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL3。
  3. 如請求項1之抗體或其結合片段，其包含：由序列識別號27所表示的胺基酸序列之胺基酸編號21～140的胺基酸序列、或與序列識別號38或者是序列識別號39所表示的胺基酸序列具有95%以上之序列相同性的胺基酸序列而成之重鏈可變區；及由序列識別號27或者是序列識別號52所表示的胺基酸序列之胺基酸編號156～266的胺基酸序列、或與序列識別號40所表示的胺基酸序列具有95%以上之序列相同性的胺基酸序列而成之輕鏈可變區。
  4. 如請求項1之抗體或其結合片段，其包含： (H1)由序列識別號6所表示的胺基酸序列而成之重鏈可變區 (H2)由18所表示的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (H3)由序列識別號29所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (H4)由序列識別號26所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (H5)由序列識別號27所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (H6)由序列識別號28所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (H7)由序列識別號36所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (H8)由序列識別號47所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (H9)由序列識別號48所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (H10)由序列識別號50所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (H11)由序列識別號51所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (H12)由序列識別號52所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (H13)由序列識別號53所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (H14)由序列識別號30所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、或者是 (H15)由序列識別號156所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區；以及 (L1)由序列識別號8所表示的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (L2)由序列識別號20所表示的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (L3)由序列識別號29所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (L4)由序列識別號26所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (L5)由序列識別號27所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (L6)由序列識別號28所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (L7)由序列識別號36所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (L8)由序列識別號47所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (L9)由序列識別號48所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (L10)由序列識別號50所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (L11)由序列識別號51所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (L12)由序列識別號52所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (L13)由序列識別號53所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (L14)由序列識別號30所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、或者是 (L15)由序列識別號156所表示的胺基酸序列之第161號～第271號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區。
  5. 如請求項4之抗體或其結合片段，其包含： (H1L1)由序列識別號6所表示的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號8所表示的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (H2L2)由序列識別號18所表示的胺基酸序列而成之重鏈可變 區及由序列識別號20所表示的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (H3L3)由序列識別號29所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號29所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (H4L4)由序列識別號26所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號26所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (H5L5)由序列識別號27所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號27所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (H6L6)由序列識別號28所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號28所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (H7L7)由序列識別號36所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號36所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (H8L8)由序列識別號47所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號47所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (H9L9)由序列識別號48所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號48所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (H10L10)由序列識別號50所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號50所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (H11L11)由序列識別號51所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號51所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (H12L12)由序列識別號52所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號52所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (H13L13)由序列識別號53所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號53所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (H14L14)由序列識別號30所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號30所表示的胺基酸序列之第156號～第266號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區；或 (H15L14)由序列識別號156所表示的胺基酸序列之第21號～第140號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號156所表示的胺基酸序列之第161號～第271號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區。
  6. 如請求項1至5中任一項之抗體或其結合片段，其為scFv。
  7. 如請求項6之抗體或其結合片段，其為： (s1)由序列識別號70所表示的胺基酸序列之第21號～第266號的胺基酸序列而成之scFv； (s2)包含由序列識別號18所表示的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號20所表示的胺基酸序列而成之輕鏈可變區的scFv； (s3)由序列識別號29所表示的胺基酸序列之第21號～第266號的胺基酸序列而成之scFv； (s4)由序列識別號26所表示的胺基酸序列之第21號～第266號的胺基酸序列而成之scFv； (s5)由序列識別號27所表示的胺基酸序列之第21號～第266號的胺基酸序列而成之scFv； (s6)由序列識別號28所表示的胺基酸序列之第21號～第266號的胺基酸序列而成之scFv； (s7)由序列識別號36所表示的胺基酸序列之第21號～第266號的胺基酸序列而成之scFv； (s8)由序列識別號47所表示的胺基酸序列之第21號～第266號的胺基酸序列而成之scFv； (s9)由序列識別號48所表示的胺基酸序列之第21號～第266號的胺基酸序列而成之scFv； (s10)由序列識別號50所表示的胺基酸序列之第21號～第266號的胺基酸序列而成之scFv； (s11)由序列識別號51所表示的胺基酸序列之第21號～第266號的胺基酸序列而成之scFv； (s12)由序列識別號52所表示的胺基酸序列之第21號～第266號的胺基酸序列而成之scFv； (s13)由序列識別號53所表示的胺基酸序列之第21號～第266號的胺基酸序列而成之scFv； (s14)由序列識別號30所表示的胺基酸序列之第21號～第266號的胺基酸序列而成之scFv；或 (s15)由序列識別號156所表示的胺基酸序列之第21號～第271號的胺基酸序列而成之scFv。
  8. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至7中任一項之抗體或其結合片段。
  9. 一種載體，其包含如請求項8之多核苷酸。
  10. 一種宿主細胞，其包含如請求項8之多核苷酸或如請求項9之載體。
  11. 一種製造與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段之方法，其包含：(i)培養如請求項10之宿主細胞的步驟；及(ii)從步驟(i)中所得之培養物純化抗體或其結合片段的步驟。
  12. 一種與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段，其可藉由如請求項11之方法而得到。
  13. 一種與HLA-A2/NY-ESO結合的抗體或其結合片段，其具有下述(i)或(ii)記載之性質： (i)與如請求項7之抗體或其結合片段所辨識之HLA-A2/NY-ESO上的部位結合； (ii)於對人類HLA-A2/NY-ESO之結合上，與如請求項7之抗體或其結合片段競爭。
  14. 一種醫藥組成物，其作為有效成分而包含如請求項1至7、12及13中任一項之抗體或其結合片段、如請求項8之多核苷酸、如請求項9之載體、或如請求項10之細胞。
  15. 一種與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的分子，其包含如請求項1至7、12及13中任一項之抗體或其結合片段。
  16. 如請求項15之分子，其為多重特異性抗體。
  17. 如請求項15之分子，其為雙特異性抗體。
  18. 如請求項15至17中任一項之分子，其包含與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段。
  19. 如請求項18之分子，其中與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段包含下列之與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段： (CCH1)由序列識別號141所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH1、 (CCH2)由序列識別號142所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH2或者是由序列識別號142所表示的胺基酸序列中第3號之胺基酸為N或S的胺基酸序列而成之重鏈CDRH2、 (CCH3)由序列識別號143所表示的胺基酸序列而成之重鏈CDRH3、 (CCL1)由序列識別號144所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL1、 (CCL2)由序列識別號145所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL2或者是由序列識別號145所表示的胺基酸序列中第2號之胺基酸為N的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL2、以及 (CCL3)由序列識別號146所表示的胺基酸序列而成之輕鏈CDRL3。
  20. 如請求項19之分子，其中與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段包含： (CH1)由序列識別號136所表示的胺基酸序列之第2號～第119號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (CH2)由序列識別號137所表示的胺基酸序列之第2號～第119號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (CH3)由序列識別號147所表示的胺基酸序列之第2號～第119號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (CH4)由序列識別號138所表示的胺基酸序列之第2號～第119號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (CH5)由序列識別號139所表示的胺基酸序列之第2號～第119號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (CH6)由序列識別號140所表示的胺基酸序列之第2號～第119號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (CH7)由序列識別號155所表示的胺基酸序列之第272號～第389號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、 (CH8)由序列識別號156所表示的胺基酸序列之第277號～第394號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、或者是 (CH9)由序列識別號157所表示的胺基酸序列之第277號～第394號的胺基酸序列而成之重鏈可變區；以及 (CL1)由序列識別號136所表示的胺基酸序列之第135號～第243號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (CL2)由序列識別號137所表示的胺基酸序列之第135號～第241號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (CL3)由序列識別號147所表示的胺基酸序列之第135號～第243號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (CL4)由序列識別號138所表示的胺基酸序列之第135號～第241號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (CL5)由序列識別號139所表示的胺基酸序列之第135號～第243號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (CL6)由序列識別號140所表示的胺基酸序列之第135號～第243號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (CL7)由序列識別號155所表示的胺基酸序列之第405號～第5111號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、 (CL8)由序列識別號156所表示的胺基酸序列之第410號～第516號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區、或者是 (CL9)由序列識別號157所表示的胺基酸序列之第410號～第516號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區。
  21. 如請求項20之分子，其中與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段包含： (CH1CL1)由序列識別號136所表示的胺基酸序列之第2號～第119號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、及由序列識別號136所表示的胺基酸序列之第135號～第243號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (CH2CL2)由序列識別號137所表示的胺基酸序列之第2號～第119號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、及由序列識別號137所表示的胺基酸序列之第135號～第241號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (CH3CL3)由序列識別號147所表示的胺基酸序列之第2號～第119號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、及由序列識別號147所表示的胺基酸序列之第135號～第243號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (CH4CL4)由序列識別號138所表示的胺基酸序列之第2號～第119號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、及由序列識別號138所表示的胺基酸序列之第135號～第241號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (CH5CL5)由序列識別號139所表示的胺基酸序列之第2號～第119號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、及由序列識別號139所表示的胺基酸序列之第135號～第243號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (CH6CL6)由序列識別號140所表示的胺基酸序列之第2號～第119號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、及由序列識別號140所表示的胺基酸序列之第135號～第243號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (CH7CL7)由序列識別號155所表示的胺基酸序列之第272號～第389號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、及由序列識別號155所表示的胺基酸序列之第405號～第511號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區； (CH8CL8)由序列識別號156所表示的胺基酸序列之第277號～第394號的胺基酸序列而成之重鏈可變區、及由序列識別號156所表示的胺基酸序列之第410號～第516號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區；或 (CH9CL9)由序列識別號157所表示的胺基酸序列之第277號～第394號的胺基酸序列而成之重鏈可變區及由序列識別號157所表示的胺基酸序列之第410號～第516號的胺基酸序列而成之輕鏈可變區。
  22. 如請求項18至21中任一項之分子，其中與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段為scFv。
  23. 如請求項22之分子，其中scFv包含： (CS1)由序列識別號136所表示的胺基酸序列之第2號～第243號的胺基酸序列而成之scFv； (CS2)由序列識別號137所表示的胺基酸序列之第2號～第241號的胺基酸序列而成之scFv； (CS3)由序列識別號147所表示的胺基酸序列之第2號～第243號的胺基酸序列而成之scFv； (CS4)由序列識別號138所表示的胺基酸序列之第2號～第241號的胺基酸序列而成之scFv； (CS5)由序列識別號139所表示的胺基酸序列之第2號～第243號的胺基酸序列而成之scFv； (CS6)由序列識別號140所表示的胺基酸序列之第2號～第243號的胺基酸序列而成之scFv； (CS7)由序列識別號155所表示的胺基酸序列之第272號～第511號的胺基酸序列而成之scFv； (CS8)由序列識別號156所表示的胺基酸序列之第277號～第516號的胺基酸序列而成之scFv；或者是 (CS9)由序列識別號157所表示的胺基酸序列之第277號～第516號的胺基酸序列而成之scFv。
  24. 如請求項18至23中任一項之分子，其包含由N末端朝向C末端依以下順序包含與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv、與CD3特異性地結合的scFv及Fc區(i)而成之第1多肽；以及、 包含Fc區(ii)之第2多肽；且較佳為於Fc區(i)與Fc區(ii)會合而成。
  25. 如請求項24之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如請求項1之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。
  26. 如請求項24之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如請求項2之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。
  27. 如請求項24之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如請求項3之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。
  28. 如請求項24之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如請求項4之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。
  29. 如請求項24之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如請求項5之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。
  30. 如請求項19至24中任一項之分子，其中與CD3特異性地結合的scFv係為scFv的如請求項18之與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段。
  31. 如請求項19至24中任一項之分子，其中與CD3特異性地結合的scFv係為scFv的如請求項19之與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段。
  32. 如請求項19至24中任一項之分子，其中與CD3特異性地結合的scFv係為scFv的如請求項20或21之與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段。
  33. 如請求項19至24中任一項之分子，其中與CD3特異性地結合的scFv係為scFv的如請求項23之與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段。
  34. 如請求項24至33中任一項之分子，其包含選自包含下述群組的胺基酸序列：包含序列識別號85所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號87所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號88所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號89所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號90所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號91所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號92所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號93所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號94所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號95所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號96所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號86所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號149所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列及序列識別號150所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列。
  35. 如請求項24至33中任一項之分子，其包含選自包含下述群組的胺基酸序列：包含序列識別號155所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號156所表示的胺基酸序列之第21號～第516號的胺基酸序列、序列識別號157所表示的胺基酸序列之第21號～第516號的胺基酸序列。
  36. 如請求項24至34中任一項之分子，其中第1多肽包含序列識別號85、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、86、149或150所表示的胺基酸序列之第529號～第745號的胺基酸序列。
  37. 如請求項24至33及35中任一項之分子，其中第1多肽包含序列識別號155所表示的胺基酸序列之第529號～第745號的胺基酸序列、序列識別號156所表示的胺基酸序列之第534號～第750號的胺基酸序列、或序列識別號157所表示的胺基酸序列之第534號～第750號的胺基酸序列。
  38. 如請求項34或36之分子，其中第1多肽包含選自包含下述群組的胺基酸序列：包含序列識別號85所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號87所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號88所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號89所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號90所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號91所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號92所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號93所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號94所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號95所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號96所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號86所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號149所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列及序列識別號150所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列。
  39. 如請求項35或37之分子，其中第1多肽包含選自包含下述群組的胺基酸序列：包含序列識別號155所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列之群組、包含序列識別號156所表示的胺基酸序列之第20號～第750號的胺基酸序列之群組、或包含序列識別號157所表示的胺基酸序列之第20號～第750號的胺基酸序列。
  40. 如請求項24至39中任一項之分子，其中第2多肽係包含序列識別號84所示的胺基酸序列之第20號～第246號的胺基酸序列而成。
  41. 如請求項18至23中任一項之分子，其包含第1多肽、第2多肽及、第3多肽， 第1多肽係由N末端朝向C末端依以下順序包含與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv、與CD3特異性地結合的scFv及Fc區(i)而成， 第2多肽係由包含Fc區(ii)之免疫球蛋白重鏈而成， 第3多肽係由免疫球蛋白輕鏈而成， 較佳為第2多肽與第3多肽會合，且 第1多肽與第2多肽於各自的Fc區會合。
  42. 如請求項41之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如請求項1之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。
  43. 如請求項41之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如請求項2之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。
  44. 如請求項41之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如請求項3之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。
  45. 如請求項41之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如請求項4之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。
  46. 如請求項41之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如請求項5之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。
  47. 如請求項42至46中任一項之分子，其中與CD3特異性地結合的scFv係為scFv的如請求項18之與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段。
  48. 如請求項42至46中任一項之分子，其中與CD3特異性地結合的scFv係為scFv的如請求項19之與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段。
  49. 如請求項42至46中任一項之分子，其中與CD3特異性地結合的scFv係為scFv的如請求項20或21之與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段。
  50. 如請求項42至46中任一項之分子，其中與CD3特異性地結合的scFv係為scFv的如請求項23之與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段。
  51. 如請求項41至50中任一項之分子，其中第2多肽包含序列識別號99所表示的胺基酸序列之胺基酸編號20～242的胺基酸序列。
  52. 如請求項41至51中任一項之分子，其中第3多肽包含序列識別號100所表示的胺基酸序列。
  53. 如請求項41至52中任一項之分子，其中第1多肽包含選自包含下述群組的胺基酸序列：序列識別號85所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號87所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號88所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號89所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號90所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號91所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號92所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號93所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號94所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號95所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號96所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號86所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列、序列識別號149所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列及序列識別號150所表示的胺基酸序列之第21號～第511號的胺基酸序列。
  54. 如請求項41至53中任一項之分子，其中第1多肽包含選自包含下述群組的胺基酸序列：序列識別號85所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號87所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號88所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號89所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號90所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號91所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號92所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號93所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號94所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號95所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號96所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列及序列識別號86所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列、序列識別號149所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列及序列識別號150所表示的胺基酸序列之第20號～第745號的胺基酸序列。
  55. 如請求項18至23中任一項之分子，其包含第1多肽、第2多肽、以及第3多肽，且較佳為第1多肽與第2多肽於Fc區(i)與Fc區(ii)會合而且第1多肽於抗體重鏈之可變區及恆定區CH1與第3多肽會合而成， 該第1多肽係由N末端朝向C末端依以下順序包含與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv、與CD3特異性地結合的抗體重鏈之可變區及恆定區CH1以及免疫球蛋白Fc區(i)而成， 該第2多肽係包含免疫球蛋白的鉸鏈區及Fc區(ii)而成， 該第3多肽包含由可變區及恆定區而成之抗體輕鏈。
  56. 如請求項55之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如請求項1之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。
  57. 如請求項55之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如請求項2之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。
  58. 如請求項55之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如請求項3之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。
  59. 如請求項55之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如請求項4之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。
  60. 如請求項55之分子，其中與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的scFv係為scFv的如請求項5之與人類HLA/NY-ESO特異性地結合的抗體或其結合片段。
  61. 如請求項18至21中任一項之分子，其中與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段為Fab。
  62. 如請求項56至61中任一項之分子，其中與CD3特異性地結合的Fab係為scFv的如請求項18之與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段。
  63. 如請求項56至61中任一項之分子，其中與CD3特異性地結合的Fab係為scFv的如請求項19之與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段。
  64. 如請求項56至61中任一項之分子，其中與CD3特異性地結合的Fab係為scFv的如請求項20或21之與CD3特異性地結合的抗體或其結合片段。
  65. 如請求項55至64中任一項之分子，其中第1多肽包含序列識別號160所表示的胺基酸序列之第21號～第394號的胺基酸序列。
  66. 如請求項55至65中任一項之分子，其中第1多肽包含下述(i)～(iii)中任意1個所記載的胺基酸序列： (i)序列識別號160所表示的胺基酸序列之第20號～第724號的胺基酸序列； (ii)序列識別號197所表示的胺基酸序列之第20號～第719號的胺基酸序列； (iii)序列識別號198所表示的胺基酸序列第20號～第719號的胺基酸序列。
  67. 如請求項55至66中任一項之分子，其中第2多肽係包含序列識別號84所示的胺基酸序列之第20號～第246號的胺基酸序列而成。
  68. 如請求項56至67中任一項之分子，其中第3多肽係包含序列識別號161所表示的胺基酸序列之第21號～第127號的胺基酸序列而成。
  69. 如請求項56至68中任一項之分子，其中第3多肽係包含序列識別號161所表示的胺基酸序列之第21號～第233號的胺基酸序列而成。
  70. 如請求項15至69中任一項之分子，其係於該分子所包含的1個或2個以上之多肽所具有的胺基酸序列中，自該序列的羧基末端有1個或2個胺基酸缺失而成。
  71. 一種多核苷酸，其包含編碼如請求項15至70中任一項之分子所包含的胺基酸序列之核苷酸序列。
  72. 一種載體，其包含如請求項71之多核苷酸。
  73. 一種宿主細胞，其包含如請求項71之多核苷酸或如請求項72之載體。
  74. 一種製造與人類HLA/NY-ESO及人類CD3特異性地結合的分子之方法，其包含：(i)培養如請求項73之宿主細胞的步驟；及(ii)從步驟(i)中所得之培養物純化抗體或其結合片段的步驟。
  75. 一種與人類HLA/NY-ESO及人類CD3特異性地結合的分子，其可藉由如請求項74之方法而得到。
  76. 一種醫藥組成物，其作為有效成分而包含如請求項15至70中任一項之分子、如請求項71之多核苷酸、如請求項72之載體、或如請求項73之宿主細胞。
  77. 如請求項14或76之醫藥組成物，其係抗癌劑。
  78. 如請求項77之醫藥組成物，其中癌症為選自包含腎癌、黑色素瘤、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、結膜癌、口腔癌、喉頭癌、咽癌、甲狀腺癌、肺癌(非小細胞肺癌(腺癌、鱗狀上皮細胞癌、大細胞癌)、小細胞肺癌)、乳癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌、闌尾癌、肛門癌、肝癌、膽囊癌、膽管癌、胰臟癌、腎上腺癌、膀胱癌、***癌、子宮癌、***癌、脂肪肉瘤、血管肉瘤、軟骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、伊文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、骨肉瘤、未分化多形性肉瘤(undifferentiated pleomorphic sarcoma)、纖維黏液樣肉瘤、惡性周邊神經鞘腫瘤(malignant peripheral nerve sheath tumor)、後腹膜肉瘤、滑膜肉瘤、子宮肉瘤、胃腸道間質瘤、平滑肌肉瘤、上皮樣肉瘤、B細胞淋巴瘤、T/NK細胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、骨髓性白血病、淋巴性白血病(lymphocytic leukemia)、骨髓增生性疾病、骨髓增生不良症候群、多發性骨髓瘤、睪丸癌及卵巢癌之群組的1個或2個以上。
  79. 如請求項76至78中任一項之醫藥組成物，其係與其他的藥劑組合而使用。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2022000081A (es) * 2019-07-03 2022-04-27 Regeneron Pharma Proteínas de unión al antígeno anti carcinoma de células escamosas esofágico 1 de nueva york (ny-eso-1) y métodos de uso.
WO2023176881A1 (ja) * 2022-03-16 2023-09-21 第一三共株式会社 多重特異的分子と免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせ
WO2023239736A1 (en) * 2022-06-09 2023-12-14 Amgen Inc. Methods of screening for peptide-hla class i alloreactivity
TW202413410A (zh) * 2022-08-18 2024-04-01 英商英美偌科有限公司 多域結合分子
WO2024038193A1 (en) * 2022-08-18 2024-02-22 Immunocore Limited Multi-domain binding molecules

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU665190B2 (en) 1990-07-10 1995-12-21 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
EP0656941B1 (en) 1992-03-24 2005-06-01 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
CA2177367A1 (en) 1993-12-03 1995-06-08 Andrew David Griffiths Recombinant binding proteins and peptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
AU751659B2 (en) 1997-05-02 2002-08-22 Genentech Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
DK2180007T4 (da) 1998-04-20 2017-11-27 Roche Glycart Ag Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
EP2314686B2 (en) 2000-10-06 2023-06-21 Kyowa Kirin Co., Ltd. Cells producing antibody compositions
JP2003111595A (ja) * 2001-06-25 2003-04-15 Kyogo Ito 腫瘍抗原
JP4773434B2 (ja) 2004-05-19 2011-09-14 イムノコア リミテッド 高親和性ｎｙ−ｅｓｏｔ細胞受容体
KR101374454B1 (ko) 2005-03-31 2014-03-17 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 회합제어에 의한 폴리펩티드 제조방법
JP6157046B2 (ja) 2008-01-07 2017-07-05 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
WO2010106431A2 (en) 2009-03-20 2010-09-23 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd High affinity t-cell receptor-like ny-eso-1 peptide antibodies, methods, and uses thereof
KR20120027055A (ko) 2009-06-26 2012-03-20 리제네론 파라마큐티칼스 인코포레이티드 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
SG10201800757TA (en) 2010-04-20 2018-02-27 Genmab As Heterodimeric antibody fc-containing proteins and methods for production thereof
DK2773671T3 (da) 2011-11-04 2021-11-15 Zymeworks Inc Udformning af stabilt heterodimert antistof med mutationer i fc-domænet
JP6280031B2 (ja) 2012-03-29 2018-02-14 中外製薬株式会社 抗ｌａｍｐ５抗体およびその利用
JP6203838B2 (ja) 2012-06-27 2017-09-27 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 少なくとも２つの異なる結合実体を含む、テーラーメイドの高度に選択的かつ多重特異的なターゲティング実体を選択および作製するための方法、ならびにその使用
CN105051069B (zh) 2013-01-14 2019-12-10 Xencor股份有限公司 新型异二聚体蛋白
AU2014273817B2 (en) 2013-05-31 2019-03-14 Zymeworks Bc Inc. Heteromultimers with reduced or silenced effector function
RU2018102526A (ru) * 2015-06-24 2019-07-25 Еурека Терапьютикс, Инк. Конструкции, направленные на комплексы пептида ny-eso-1/мнс, и их применение
GB201522592D0 (en) 2015-12-22 2016-02-03 Immunocore Ltd T cell receptors
TWI781108B (zh) * 2016-07-20 2022-10-21 比利時商健生藥品公司 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗體、結合ｇｐｒｃ５ｄ與ｃｄ３之雙特異性抗原結合分子及其用途
EP3561057A4 (en) * 2016-12-22 2020-09-16 Daiichi Sankyo Company, Limited ANTI-CD3 ANTIBODY AND MOLECULE CONTAINING LEDIT ANTIBODY
JP2020061476A (ja) 2018-10-11 2020-04-16 ソニーセミコンダクタソリューションズ株式会社 固体撮像装置及び電子機器
MX2022000081A (es) 2019-07-03 2022-04-27 Regeneron Pharma Proteínas de unión al antígeno anti carcinoma de células escamosas esofágico 1 de nueva york (ny-eso-1) y métodos de uso.

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