TW202200175A - 牛樟芝萃取物(Ant-Ex)減少血管收縮素轉換酶2(ACE-2)蛋白質表現 - Google Patents

Abstract

本文揭露的治療方法，乃用以降低或預防受試者的血管收縮素轉化酶2（ACE-2）相關症狀所引發之風險，該方法包括向該受試者施以有效劑量的牛樟芝萃取物（Ant-Ex） 或餾分物三號(簡稱AE-F03），並說明Ant-Ex或AE-F03在減少ACE-2表現的作用：以及其作為藥物或營養補充劑以治療、降低、預防或減輕ACE-2相關症狀的用途。

Description

牛樟芝萃取物(Ant-Ex)減少血管收縮素轉換酶2(ACE-2)蛋白質表現

此為2020年4月28日向美國臨時申請編號63/016,665的專利申請書。

牛樟芝，又稱牛樟薄孔菌是一種帶有鮮紅色子實體的台灣特有多孔菌屬藥用真菌，它僅生長於腐朽潮涇的牛樟樹幹內壁。蕈類一般在民間傳統用藥中也用於治療癌症、高血壓、宿醉、食物或藥物中毒等。

據研究報告顯示，牛樟芝萃取物和其分離純化的化合物具有多種生物活性功能，包括抗癌、抗發炎、保肝、抗氧化、保護神經和調節免疫等等。 牛樟芝的萃取物含有各種代謝產物；包括三萜類化合物、苯類化合物、木脂素、琥珀酸、馬來酸衍生物以及多醣體，其中三萜類化合物是子實體的主要成分，而其有效抗癌、抗發炎、調節免疫和抗糖尿病等特性，使得牛樟芝引起大眾關注。

ACE-2是一種單羧肽酶，已知可在腎素-血管收縮素系統和其他受質；如apelin激素中裂解多個胜肽。 ACE-2幾乎不表現於血液循環系統中，但廣泛表現於腎臟和胃腸道中，肺臟中的表現濃度則相對較低。

此次揭露內容牛樟芝萃取物（Ant-Ex）或餾分物三號(簡稱AE-F03）的功效，顯示出其在減少ACE-2方面的有效性，以及用於治療、降低、預防或減輕ACE-2相關症狀造成的風險。

至於治療、降低、預防或減輕ACE-2相關症狀的方法，包括向受試者施以牛樟芝萃取物或其餾分物三號(簡稱AE-F03）的有效劑量。

本文提供了牛樟芝萃取物或其AE-F03在作為治療、降低、預防或減輕ACE-2相關症狀的藥物或營養補充品中的用途。

此外，本文也揭露了以牛樟芝萃取物或其AE-F03降低ACE-2表現的作用。

在某些具體實施物（embodiments）中，其受試者為哺乳動物，但仍以人類最為合宜。

本文所揭露與ACE-2相關的症狀，可以是與血壓相關的疾病或症狀，諸如慢性心臟衰竭、左心室肥大、急性心臟衰竭和心肌病變，也可以是充血性心臟衰竭，動脈高血壓或心肌梗塞等。

本文所揭露與ACE-2相關的症狀可以是細胞增生障礙，典型的細胞增生疾病包括平滑肌細胞增生疾病等，進一步可造成血管狹窄。

本文所揭露與ACE-2相關的症狀可以是腎臟疾病或病症，或與kinetensin（血管收縮素）相關的病症，其典型疾病包括異常的血管通透性等，局部和全身性過敏反應、濕疹、哮喘、過敏性休克等。

本文所揭露與ACE-2相關的症狀；可以是發炎症狀，所謂發炎症狀包括：全身性發炎反應症候群（SIRS）、多發性創傷，發炎性腸道疾病、急慢性疼痛、類風濕關節炎的骨質破壞、牙周病、痛經、早產、局灶性損傷後腦水腫 、瀰漫性軸索損傷、過敏性疾病、傷口癒合或疤痕形成等。

本文所揭露與ACE-2相關的症狀，可以是一般病毒感染，或是冠狀病毒感染，典型冠狀病毒感染，包括嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒感染症（SARS-CoV），中東呼吸症候群冠狀病毒感染症（MERS-CoV）或新型冠狀病毒感染症（SARS-CoV-2）等。

本文所揭露的牛樟芝萃取物透過以下方法取得：以95％的（v / v）乙醇萃取牛樟芝的乾燥子實體得到餾分物三號(簡稱AE-F03）。

本文所揭露任何作法中，其受試者皆已經或正接受相關疾病的其他治療。

本專利發明實施方式的技術特徵、優點及細節將於下文附圖及本專利申請書中詳加闡述。

本申請書所揭露是治療、減輕受試者與ACE-2相關的症狀風險的方法，該方法包括向受試者施以有效劑量的牛樟芝萃取物(Ant-Ex)或其餾分物三號(AE-F03)，以降低與ACE-2相關的症狀的風險，AE-F03中包含以下成分Antcin K、DSA、DEA和3β、15α-Dihydroxylanosta-7,9(11),24-trien-21-oic acid (DLTO, 15α-二羥基羊毛脂-7,9（11），24-三烯-21-油酸)。從牛樟芝或任何其他已知來源中萃取和純化分離出AE-F03，同理可證，所得出的AE-F03即是至少混合上述成分的組合物。 在實施方式中，本文所提出的Ant-Ex或AE-F03可有效用於治療因ACE-2所引發的疾病，正如本文指出，ACE-2濃度升高可導致對ACE-2具敏感性的的任何醫學病症。

ACE-2引發的症狀包括與ACE-2受質或其代謝產物相關的症狀。從實施方式中得知，因ACE-2的活性異於平常水平，將導致與其受質或代謝產物相關的疾病，例如高血壓、或高血壓相關疾病、免疫失調、病毒感染率增高、新冠病毒感染症或動脈高血壓等。

從實施方式中，我們得知與高血壓有關的疾病和病症包括：充血性心臟衰竭（CHF）、慢性心臟衰竭、左心室肥大、急性心臟衰竭、心肌梗塞或心肌病變等。

從實施方式中，我們得知與ACE-2相關的症狀，包括細胞異常增生，例如平滑肌細胞增生，也就是肌肉內動脈內膜中的平滑肌細胞增生導致動脈粥狀硬化，動脈粥狀硬化為血管外科手術和冠狀動脈手術後血管狹窄的主要原因，根據動物實驗顯示，腎素-血管收縮酶系統於血管損傷反應中扮演著十分重要的角色。

從實施方式中，我們得知與ACE-2相關的症狀，包括腎臟疾病或病症，例如腎衰竭，這顯示出ACE-2在腎臟中的表現與ACE(血管收縮素轉化酶)具同源性的事實，ACE-2調製的化合物可以單獨或與已知的成分結合成ACE抑制劑，用於治療和預防腎臟疾病或病症。

從實施方式中，我們得知與ACE-2相關的症狀包括交感神經興奮，例如急性心肌梗塞（AMI）和一些心室心律不整，已知ACE-2可從kinetensin（血管收縮素）中切割C端氨基酸（亮氨酸），kinetensin是序列號23（SEQ ID NO：23參見美國專利號09 / 163,648）具有9個氨基酸的胜肽，根據實驗報告指出，可能誘導肥大細胞的組織胺劑量依賴性產生，以及增加組織胺劑量依賴性，實驗報告也說明了，經皮下注射到老鼠體內時，其血管通透性降低。 因此，透過來自kinetensin的C端氨基酸的水解蛋白，來調節kinetensin在血漿或組織中的水平，對於治療因kinetensin異常而引起的病症是有幫助的，其中包括由肥大細胞異常釋放的組織胺或血管通透性異常引起的症狀，而過量的組織胺與局部或全身性過敏反應有關，例如溼疹、哮喘、過敏性休克等，這些情形都包含在「與ACE-2相關的症狀」中。

從實施方式中，我們得知與ACE-2相關的症狀包括全身性發炎症候群（SIRS）、敗血症、多發性創傷、發炎症腸道病症、急慢性疼痛、類風濕性關節炎及牙周病中的骨質破壞，其他疾病諸如：痛經、早產、局部性腦損傷水腫、瀰漫性軸索損傷、中風、顱內動脈破裂導致蜘蛛膜下腔出血、過敏性疾病（包括哮喘）、成人呼吸窘迫症候群、傷口癒合和疤痕形成等。

所謂的「治療」一詞所指，包括治癒或改善症狀。

所謂「緩解」一詞所指，未必是疾病得到治癒的結果，本文所指「緩解」是指疾病或症狀的發展得到控制、減緩、穩定或延遲，延遲的時間長度可能有所不同，這取決於患者的病史或治療對象的個人體質，所謂延遲或減輕疾病發展的作法，是在一定的時間範圍內減少發生一種或多種疾病症狀發生的可能性，或降低症狀發生時的程度，與之在一定的時間範圍內未使用該作法的情形交叉比較，實驗基礎通常是來自於數量足以在統計學得出顯著結果的受試者臨床研究數據。

所謂「給藥」一詞所指，包括允許Ant-Ex或AE-F03得以就其預期功能的施以藥物，例如降低ACE-2的表現、抑制ACE-2的功能，或治療與ACE-2相關的症狀。給藥方式包括：非消化道給藥（例如，皮下注射、靜脈內注射和肌內注射）、腹膜內注射、腸道內、吸入、透皮等，其給藥方式的選擇取決於所欲治療的症狀、疾病或感染的嚴重程度。 實施方式中，所謂注射可以是大劑量注射或連續輸注。

Ant-Ex或AE-F03可做為有效降低以下病毒感染率的用藥來源，包括：嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒感染症（SARS-CoV）、中東呼吸症候群冠狀病毒感染.症（MERS-CoV）或新型冠狀病毒感染症（SARS-CoV-2）或其他任何冠狀病毒感染症，本文所使用的專業用語「有效劑量」，是指不具毒性且足以提供病毒感染治療所需的抗病毒劑量，正確的劑量將因受試者而異，取決於受試者的性別、年齡，以及一般狀況例如：感染的嚴重程度、特定的抗病毒劑及給藥方式等。

儘管可以將Ant-Ex或AE-F03作為藥物施以受病毒感染（尤其是冠狀病毒）的任何患者，但Ant-Ex或AE-F03的用途仍是以治療哺乳動物宿主為主，尤其是人類 。

有鑑於Ant-Ex或AE-F03產生的抑制作用，我們預測這些萃取物不僅可用於病毒感染的治療，也可用於預防，無論是用於治療或預防病毒感染，針對冠狀病毒感染，其劑量基本上應該相同。

根據給藥途徑，將Ant-Ex或AE-F03以特殊材質包覆或放置於特定的材料中，以保護其免受自然環境影響，因為環境可能會對其預期的治療功效產生不良結果，可將Ant-Ex或AE-F03以單獨形態給藥，也可與藥理學上可接受的載體一起給藥，此外，AE-F03也可以混合物的形式給藥，Ant-Ex或AE-F03可以在ACE-2誘導的症狀發作前後給藥，也可作為前體藥物，在體內轉化為另一種形式。

為了易於給藥，並使劑量重量均等，因此將上述化合物配製成劑量單位形式。本文所使用的劑量單位，是指根據待治療患者的病歷資料計算出物理上的離散單位，每個劑量應包含經計算可直接使用，或與藥理學上可接受的載體結合，產生具治療效果的活性物質的劑量。Ant-Ex或AE-F03可以製成各種給藥形式，包括片劑、錠劑、丸劑或糖衣錠等，也可以裝在適當的容器中，例如膠囊，或者以懸液劑的形態裝到瓶子中。

如本文所述，「藥理學上可接受的載體」包括任何以溶劑、稀釋劑或其他液體載體、膠狀分散體或懸液劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑或乳化劑、防腐劑、固體粘合劑、潤滑劑等做成的劑型，換句話說，就是Ant-Ex或AE-F03在藥理學上可接受的承載材料、組成物或媒介物，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包囊材料。視AE-F03給藥的情形，使其發揮預期的功能。雷明頓的藥物科學，〈Remington's Pharmaceutical Sciences，第十五版〉，E·W·馬丁（馬丁．伊斯頓·麥克出版社1975）揭露了用於配製藥物組成物的各種載體及其製造技術。

除非任何常規載體與Ant-Ex或AE-F03不相容，例如產生不良的生物學效應或以有害的方式與Ant-Ex或AE的任何成分相互作用，否則載體的使用範圍皆揭露於本文，在本文發明的藥物組合物中，以包含載體或助劑的總重量為基礎，其活性劑的比例最好在至少0.5％至多99％的劑量之間，例如Ant-Ex或AE-F03佔藥物組合物重量的比例為5％-70％。適用於腸內或消化道外的藥用有機或無機、固體或液體載體皆可作為藥物組合物載體，作為藥理學上可接受的載體的材料包括糖類：例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；醣類：澱粉，例如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素、黃芪粉、麥芽、明膠、滑石；賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟；油類，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；二醇類，例如丙二醇； 多元醇類，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯類，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂緩衝液，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；吸附劑； 等滲鹽水〈輸液）：林格氏液；乙醇類：磷酸鹽緩衝溶液； 以及其他藥物製劑中無毒相容性材料。

所謂化合物的「有效劑量」是指治療，降低與ACE-2相關的症狀時所必需且足夠的劑量。有效劑量可以根據諸如受試者的年齢和體重、疾病的類型或Ant-Ex或AE-F03的純度等因素而作出調整，技術人員可根據上述因素加以測定即可確定有關Ant-Ex或AE-F03的有效劑量。

有效劑量可透過細胞培養或動物實驗中標準藥理學程序，同時考慮Ant-Ex或AE-F03的毒性和治療功效來確定，例如，用於確定LD50（半數致死毒性劑量）和ED50（半數治療效果劑量），毒性和治療效果之間的劑量比即為治療指數（可表示為比率LD50/ED50），治療指數大者，此化合物之治療效果較佳，雖然表現出毒性副作用的化合物仍有其作用，但應注意將此類化合物的遞輸系統，務必以標靶形態遞輸至受影響組織部位，以最大程度地降低對未受影響細胞的潛在損害。 例如未受感染的細胞，從而減少副作用。

通常以Ant-Ex或AE-F03給藥，一開始選用劑量約為50-250mg / kg，本文揭露的有效劑量，從典型的每日、每一週、兩週或三週，其劑量範圍約從50mg / kg、60mg / kg、70mg / kg、80mg / kg、90、100 mg / kg、120 mg / kg、150 mg / kg、180 mg / kg、200 mg / kg到250 mg / kg或更高，具體劑量取決於上文所述因素。至於幾天、幾週、幾個月或更長時間的重複給藥，取決於病症本身，持續治療直至出現抑制、減輕或治癒疾病的預期治療效果，實施方式中，給藥頻率是每週一次或2週、3週、4週，5週、6週、7週、8週、9週或10週一次。 或每月1次，每2個月或3個月一次或更長時間。典型的給藥作法包括一開始每3週施以約100mg / kg的劑量，隨後維持每6週施以一次約50mg / kg的劑量，或隨後維持每3週施以約80mg / kg的劑量。然而，這取決於業者希望達到的藥物動力學中藥效衰減的時程，其他劑量也可能是有其效果，例如，考慮在合併治療中每3週給藥一次80mg / kg，透過常規技術和測定很容易監測該療法的進展，給藥方式也可以隨時間調整。

在實施方式中，對於體重正常的成年患者，可以施以約0.1至5.0mg / kg的劑量，實施例（example）中，本文的Ant-Ex或AE-F03的劑量則為50-250mg / kg。特定的劑量（即數量、時間和重複給藥）將取決於特定的個體及其病史，還有藥物本身的特性（例如半衰期以及其他技術上應注意事項 ）。

一般技術

除非另有說明，本發明的實踐將採用分子生物學（包括重組技術）、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規技術，這些技術在本領域的技術範圍內。分子選殖(等書籍)：A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).

至於一般通用技術則無需進一步闡述，相信此領域的技術人員可根據以上描述，最大程度地運用本發明相關技術，因此以下具體實施方式僅作為說明，且不限於本文所揭露其餘相關部分。本文引用的所有出版物，僅於相關目的或主題時引用參照。

實施例

以下實施例可詳細描述本發明相關技術，然有關本發明專利的各個方面和技術特徵不限於以下實施例。

全長形式的ACE-2是一種膜結合酶（〜98％），而其較短的可溶形式（〜2％）的ACE-2於血液中的循環水平非常低（2020年Renhong等之理論），因此於活體測量上皮細胞表面的膜結合酶ACE-2在技術上有其挑戰性，而大多數期刊報告中的人體實驗證據中也顯示，可溶性ACE-2以非常低的水平存在於人體血液循環（2020年，Ramchand等之理論）。另外有些觀察和實驗結果進一步顯示；調節ACE-2的表現濃度於某些疾病（如心肌梗塞，動脈粥樣硬化，腎臟病，肝硬化，糖尿病和炎症性肺損傷等），將有助於保護作用的產生（2012年，Tikellis和Thomas之理論）。

然而，先前與SARS感染症相關的冠狀病毒研究顯示，該病毒透過其表面棘蛋白與肺泡中的ACE-2結合，然後引起肺部損傷甚至肺功能衰竭（2005年庫巴〈Kuba〉等之理論），近期研究證實，新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的入侵取決於膜結合酶（全長）ACE-2，ACE-2可作為SARS-CoV-2棘蛋白的受體，透過棘蛋白與ACE-2的結合，及跨膜絲氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）對ACE-2的蛋白水解切割，有助於病毒入侵、複製，甚至在細胞間傳播，同樣地，在細胞融合系統中，在沒有外因性蛋白水解酶（例如胰蛋白酶）的情況下，當SARS-CoV-2  S蛋白無法使合胞體形成時，SARS-CoV-2蛋白可有效介入導效應細胞與靶細胞之間合胞體的形成，（2020年Shyam Xia等之理論）。一般認知，ACE-2在口腔粘膜上皮細胞、肺泡II型肺泡（AT2）、複層上皮組織、迴腸和結腸的腸上皮細胞、膽管細胞、心肌、近端腎小管和膀胱尿道上皮細胞中的表現和分佈較高，報告顯示，那些具有高ACE-2細胞表現的器官可能是SARS-CoV-2感染的潛在目標。

在正常的人體肺組織中，ACE-2也表現在I型和II型肺泡上皮細胞中，此外，病毒受體ACE-2的表現，集中在少量的II型肺泡（AT2）細胞中，使得這些AT2細胞很可能成為SARS-CoV-2的靶細胞，有趣的是，在0.64％的人當中，其肺細胞存在著ACE-2，而AT2細胞中的ACE-2表現則佔了其中的80％以上。

實施例 1 ：牛樟芝的萃取和純化分離。

(i) 牛樟芝萃取物（Ant-Ex）

Ant-Ex的萃取方法：牛樟芝屬多孔菌科，其子實體功效經中央研究院生物醫學科學研究院生物化學研究所的陳水田（Shui-Tein Chen）教授實驗證實。方法如下：將乾燥研磨（45℃，48小時）的牛樟芝子實體（50 g）粉末，用體積2-20（v / w）的95％乙醇（37℃、攪拌7小時）萃取，及攝氏100度的水（攪拌5小時），然後將萃取液合併以提取萃取物。

傾析出萃取物，並透過Whatman 一號濾紙過濾，並以45℃減壓的旋轉濃縮儀除去溶劑，最後將產物冷凍乾燥，得到粗萃取物Ant-Ex粉末（16g，32％，w / w），為了分離出抑制ACE-2生成的化合物，以高效液相層析法分析Ant-Ex萃取物，發現內含一些已知化合物（圖11）接著將Ant-Ex用不同的溶劑進一步分餾，得到餾分物三號（簡稱AE-F03）。

(ii) 牛樟芝餾分物三號（簡稱AE-F03）

AE-F03的萃取方法：從上述牛樟芝萃取物（Ant-Ex）中，首先用正己烷200mL洗滌樣本，攪拌2小時3次，並保留殘餘物，然後，將樣本依次用20％的乙醇洗滌1次，（攪拌2小時）；30％的乙醇洗滌8次；35％的乙醇洗滌1次，分離並保留洗滌後的殘留物（圖12）。

將萃取液進一步傾析並透過Whatman 一號濾紙過濾，以45℃減壓的旋轉濃縮儀除去溶劑，最後將產物冷凍乾燥，得到AE-F03粉末。

透過高效液相層析法分析測定AE-F03的含量（圖13），圖中高峰的滯留時間似乎與具有相同多重性標準的化合物一致。

實施例 2 ：牛樟芝萃取物（ Ant-Ex ）降低血管收縮轉化酶 2 （ ACE-2 ）蛋白質和 mRNA 表現。

(i) Ant-Ex降低ACE-2蛋白表現

將人體肺癌CL1-5和CL1-0細胞與12.5-50 µg / mL 的Ant-Ex培養0-24小時，透過西方墨點法分析ACE-2蛋白表現量。ACE-2抗體則是購自Proteintech生物科技公司（目錄號：21115-1-AP），來自同一細胞的肌動蛋白和GAPDH（丙二醯化）也被檢測為蛋白質定量對照。

在本文揭露中，將肺癌細胞CL1-5和CL1-0作為樣本細胞，以檢測Ant-Ex或AE-F03對ACE-2表現的影響，首先在CL1-5細胞中分析Ant-Ex對ACE-2表現的影響。如圖1所示，ACE-2在CL1-5細胞中以既定的組成形式表現，如西方墨點法所示，以50 µg / mL的Ant-Ex作為治療，24小時後顯著降低ACE-2蛋白的表現，另外，透過西方墨點法得知，以12.5-50μg/ mL的AE-F03作為治療也降低了CL1-5細胞中的ACE-2蛋白表現（圖十（A））。

隨後，分析時間變化對Ant-Ex的給藥劑量及ACE-2的影響，結果顯示，透過西方墨點法確定，50μg/ mL的Ant-Ex在降低ACE-2蛋白表現方面，隨時間變化而有所不同（圖2）。

接著，將CL1-5和CL1-0細胞暴露於不同濃度的Ant-Ex中24小時，然後以西方墨點法評估ACE-2的蛋白表現，如圖3和圖4所示，Ant-Ex在降低CL1-5和CL1-0細胞中ACE-2蛋白表現方面，隨劑量變化而有所不同。

測定AE-F03中純化的三萜類在CL1-5細胞中抑制ACE-2的潛能，結果顯示出AE-F03在降低ACE-2表現的方面，隨劑量變化而有所不同。（圖十（A））。

(ii) Ant-Ex降低ACE-2 mRNA表現。

將肺癌CL1-5細胞與50 µg / mL 的Ant-Ex培養1-3小時，並透過RT-qPCR分析ACE-2 mRNA的表現水平。

一般認知，ACE-2 mRNA主要表現在小腸、結腸、十二指腸、腎臟、睾丸和膽囊中。 正常情況下，ACE-2 mRNA在肺臟中的表現濃度較低，但在某些條件下，可以觀察到所選細胞中ACE-2表現量上揚，接著可以檢測到Ant-Ex對CL1-5細胞中ACE-2 mRNA表現的影響，結果顯示50μg/ mL的Ant-Ex降低ACE-2 mRNA的表現（圖5），值得注意的是，在施以Ant-Ex 3小時後，ACE-2 mRNA的表現降至約77％（表一、表二和圖5），顯示出ACE-2 mRNA的表現水平與ACE-2蛋白表現水平呈現出一致性，結果發現，以Ant-Ex治療肺癌細胞，其ACE-2 mRNA和蛋白質表現水平均降低。

表一

	試驗 #1	試驗 #2
	ACE-2/GAPDH	% （相較於控制組） (ACE-2 mRNA)	ACE-2/GAPDH	% （相較於控制組） (ACE-2 mRNA)
控制組 1小時	67.25	100	49.25	100
控制組 3小時	29.29	100	26.56	100
Ant-Ex處理 1小時	16.22	24.12	12.69	25.77
Ant-Ex處理 3小時	22.75	77.67	16.63	62.26

表二

試驗 #3
	ACE-2/GAPDH	% （相較於控制組） (ACE-2 mRNA)
控制組 1小時	13.4	100
Ant-Ex處理 1小時	5.10	38.09
Ant-Ex處理 2小時	5.27	39.33
Ant-Ex處理 3小時	6.15	45.94

以上結果證實Ant-Ex和AE-F03，不論在抑制ACE-2 mRNA或蛋白的表現均具有潛力。

實施例 3 ： Ant-Ex 和 AE-F03 抑制 ACE-2 的酶活性。

測定各種濃度的Ant-Ex，AE-F03、Antcin （樟芝酸）A、Antcin B、Antcin C、Antcin H、Antcin K、脫氫磺脲酸（DSA）和脫氫表皮酸（DEA），以觀測它們是否影響ACE-2的酶活性，該測定利用活性ACE2裂解基於MCA的合成肽受質從其終止劑釋放游離螢光團的能力（圖6（A）），釋放的MCA可以使用螢光微量盤檢測儀輕鬆定量。

報告顯示，野生和固態培養的牛樟芝甲醇萃取物均能抑制ACE(血管收縮素轉化酶)，其IC50值（半抑制濃度）分別為0.312 mg / mL和0.172 mg / mL，但沒有關於確切的抑制機制，以及相對可靠的化合物資訊，人們開始關注，由於ACE-2是病毒結合位點，使用ACE抑制劑理論上可能會增加SARS-CoV-2感染的風險，然而就一般所知，ACE抑制劑無法抑制ACE-2，因為ACE和ACE-2是完全不同的酵素。

透過以蛋白質和細胞為基礎的測定法，已證明Ant-Ex有效抑制ACE-2的酶活性（圖6）。如圖10（B）所示，透過對ACE-2蛋白的酶活性測定，顯示出AE-F03具有抑制ACE-2的能力，在Ant-Ex或AE-F03的主要成分中，除Antcin B以外，所有這些測試的化合物均具有抑制ACE-2酶活性的能力，如圖7和10（C)所示，尤其是DSA和Antcin K更是最強的抑制劑，其對酶活性的抑制超過30％。

實施例 4 ： Ant-Ex 和 AE-F03 抑制棘蛋白與 ACE-2 的結合。

為了確認ACE-2的表現和酶活性的降低，是否與抑制病毒結合有關，以攜帶SARS-CoV-2 S蛋白及螢光素酶報導基因的偽病毒，以及ACE-2蛋白過度表現的細胞表面（圖8（A））進行測定以觀測ACE（血管收縮素轉化酶）是否抑制了SARS-CoV-2 Spike蛋白（S蛋白）與ACE-2在細胞表面的相互作用。

此外，將Vero-E6細胞以有效濃度的Ant-Ex（圖9（A））或AE-F03（圖10（D））以37ºC預先處理1小時，然後吸附於100 PFU（MOI = 0.01）的SARS-CoV-2中，於37ºC下放置1小時。除去病毒，並在細胞中加入有效濃度的化合物新鮮培養基，培養1天，固定細胞並用抗SARS-CoV-2N蛋白抗體和抗人體IgG-488免疫染色標記。為進行細胞活力測試，將Vero-E6細胞置於37ºC有效濃度的ACE下1天，接著透過CCK-8高靈敏度細胞增殖試劑來確認細胞活力，以高內涵螢光顯微影像系統進行定量，並且將未經化合物處理的感染率設定為100％，透過Prism軟體計算50％抑制濃度（IC 50半數抑制濃度）和50％細胞毒性濃度（CC 50半數毒性濃度）。

根據圖8（B）所示，Ant-Ex明顯抑制了S蛋白與ACE-2之間的相互作用，又如圖9（A）和10（D）所示，Ant-Ex以68.5μg/ mL的IC50（半數抑制濃度）明顯抑制了SARS-CoV-2感染Vero-E6細胞（圖9（A）），而AE-F03則以82.92μg/ mL的IC50（半數抑制濃度）抑制SARS-CoV-2感染Vero-E6細胞，（圖10（D）），上述實驗明顯地表示出，將Ant-Ex、AE-F03或其成分作為重要的預防試劑或藥物來給與，防止受試者因ACE-2受體結合SARS-CoV-2或其他病毒而受到感染 。

其他實施方式

本說明書中所揭露的技術特徵可能以任何方式組合使用，若有性質相同、等效或相似者亦可替代本說明書中所揭露的方法，因此，除非另有明確說明，否則所揭露的技術特徵僅是一系列相似或等效技術的實施例。

根據以上描述，本領域的技術人員可以很快確認本發明的技術特徵，並且在不悖離本文的精神和範圍的情況下，對本發明進行修正以適應各種用途和條件，因此，其他實施方式也在本申請專利範圍之內。

等效項

儘管本文已描述和說明了幾個發明實施方式，本領域的普通技術人員可以很容易設想到用於執行該功能的各種其他手段（步驟）或構想，或取得本文所述的研發成果，或一項或多項技術特點，而任何此類修改或變動都被視為本文所述的發明實施例的範疇內。本領域一般技術人員可輕鬆理解到，本文描述的所有參數、尺寸、材料和配置均是示例性的，而實際參數、尺寸、材料或配置將取決於使用本發明的教示或其具體應用方式，本領域技術人員將理解到，僅能以常規實驗來確定本文描述的發明實施例的許多等效項。因此可以理解到，前述實施方式僅透過示例的方式表示，並且在所附專利申請書及其等效項的範圍內，以不同於具體描述和申請專利的方法來實踐本發明的實施方式。本文揭露的發明實施方式包括本文描述的每個單獨的技術特徵、系統、物品、材料、套件或方法。此外，如果兩個或多個此類技術特徵、系統、物品、材料、套件或方法的任何組合不相互矛盾，則皆包括在本文揭露的發明範圍內。

本文所有用語和措辭的定義，應可解釋為字典所定義的用詞，並引用至定義本文內文或專業用語的一般含義。

本文揭露的所有參考文獻，包括本專利申請書所引用與其主題相關者皆併入本文中，在某些情況下，其引用可涵蓋整份參考文件。

除非本文有截然不同含義的明確說明，否則在說明書和專利權申請書內文中使用的冠詞所謂「一個」應解釋為「至少一個」。

在說明書和申請書中使用的字詞如「或」這個字詞時，應解釋為包含該字詞所連結元件（或事項等）的「一個或兩個」，也就是在某些情況下連結兩個存在的元件，在其他情況下， 以「或」這個字詞連接的多個元件應以相同的方式解釋，也就是內文用語連接的元件中的如：「一個或多個」，除了句子中以「或」這個字詞明確標識的特定元件外，應可選擇其他元件，無論與上述特定元件是否相關。因此在非限制性實施方式中，對「或」這個字詞的引用 ，例如「A或B」，應與諸如「包括」的字詞之類的開放性用語連結使用，若實施方式中所指僅有A（可選擇元件則不包括B）；在另一實施例中，若實施方式中所指僅有B（可選擇元件則不包括A）； 又另一個實施方式中，所謂至少包含A和B，可選擇則包括其他元件，等等。

本文於說明書和申請書中針對「或」這個字詞的解釋，應與上文所定義的含義相同。例如，當用於分隔所列中的項目時，「或」這個字詞應被解釋為具包含性的用語，也就是包括至少一個，但也包括一系列元件中的一個以上，以及其他具可選性未列出的項目。，另外還有明確指出數量的用語，例如「僅有」或「只有」，或在專利申請書中使用「由...組成」這個用語時，指的是僅有一個或眾多列出中的一個元件。一般而言，此處「或」這個字詞僅應解釋為具排他性的用語（例如：「A或B其中一個」）。另外當出現例如「僅有…」、「只有…」、「只有其中之一」或「主要由……組成」等排他性用語在本權利申請書中使用時，應具有專利法領域中的普通含義。

如本文在說明書和申請書中列出一個或多個項目時，所謂「至少一個」這個用語時，應解釋為包含所列出項目中任何一個或多個元件，但不一定表示所列出項目中至少都要有一個元件，且不排除所列項目中的任何元件的組合。上述定義還允許所謂「至少一個」，除所列項目中具體指出的元件之外，其它則視為可選擇元件，無論與上述元件是否具相關性，因此在非限制性實施方式中，所謂「A或B中的至少一個」的用語指的是，可任選A或B，或者是A、B兩者都可選，且其數量包含一個或多個，依實施方式的不同規定，有時亦可選擇其他元件，等等。

除此之外，本文任何方法中的所有手段（步驟）或動作，除非明確指出截然不同的定義或規定，否則其實施順序不侷限於該方法所敘述的順序。

圖一：牛樟芝萃取物可降低血管收縮素轉化酶二(ACE-2)的蛋白質表現。以牛樟芝萃取物(Ant-Ex) 50 ug/mL 用於人類肺癌細胞CL1-5，二十四小時後透過西方點墨法分析ACE-2蛋白質表現量。其中ACE-2抗體購自Proteintech（目錄編號：21115-1-AP）

圖二：牛樟芝萃取物(Ant-Ex) 以時間依賴性方式降低血管收縮素轉化酶二(ACE-2)的蛋白質表現。以牛樟芝萃取物50 ug/mL 用於人類肺癌細胞CL1-5，0~24小時後透過西方點墨法分析ACE-2蛋白質表現量。其中ACE-2抗體購自Proteintech（目錄編號：21115-1-AP)

圖三：牛樟芝萃取物(Ant-Ex) 以劑量依賴性方式降低血管收縮素轉化酶二(ACE-2)的蛋白質表現。以牛樟芝萃取物12.5~50 ug/mL 用於人類肺癌細胞CL1-5，24小時後透過西方點墨法分析ACE-2蛋白質表現量。其中ACE-2抗體購自Proteintech（目錄編號：21115-1-AP)

圖四：牛樟芝萃取物(Ant-Ex) 以劑量依賴性方式降低血管收縮素轉化酶二(ACE-2)的蛋白質表現。以牛樟芝萃取物12.5~50 ug/mL 於人類肺癌細胞CL1-5培養24小時，箭頭標示處為ACE-2蛋白質帶，同時亦測量GAPDH作為蛋白質定量的控制組。

圖五：牛樟芝萃取物(Ant-Ex) 降低血管收縮素轉化酶二(ACE-2)的訊息RNA表現。以牛樟芝萃取物50 ug/mL 於人類肺癌細胞CL1-5培養1,2,3小時，透過RT-qPCR方法分析訊息RNA表現量。

圖六：牛樟芝萃取物(Ant-Ex) 抑制血管收縮素轉化酶二(ACE-2)的酵素活性。(A) ACE-2活性測定的原理。(B) 牛樟芝萃取物(Ant-Ex 1, 5, 10 mg/mL)可降低酶活性約(40%)，抑制作用如柱狀圖所示。(C) 對不同濃度的牛樟芝萃取物(Ant-Ex 40, 200, 400 uM) 進行 ACE-2 酶活性測定，結果顯示 Ant-Ex 的 Ki 約為 590.9 uM。

圖七：牛樟芝萃取物(Ant-Ex)中各種成分對於抑制血管收縮素轉化酶二(ACE-2)的酵素活性，如圖八(A)中所述的評量系統。其中測試的成份為Antcin（樟芝酸）A、Antcin B、Antcin C、Antcin H、Antcin K、脫氫磺脲酸（DSA）和脫氫表皮酸（DEA），測定的每種成分，其抑制效果見柱狀圖。除Antcin B外，所有這些測試化合物均具有對ACE-2酶活性的抑制能力，其中的脫氫磺脲酸（DSA）、Antcin A、Antcin K有較強的抑制作用。

圖八：牛樟芝萃取物(Ant-Ex)對SARS-CoV-2刺突蛋白（S蛋白）和ACE-2受體相互作用的細胞抑制試驗。 (A) 該細胞檢測系統的原理和流程圖。該系統包含具有 SARS-CoV-2 S 蛋白並攜帶螢光素酶報告基因的偽病毒和可在細胞表面過度表達 ACE-2 蛋白的 293T 細胞。 (B) Ant-Ex (0 - 50 μg/mL) 可抑制刺突蛋白與 ACE-2 受體的相互作用，在 50 μg/mL 時抑制率約為 80% (p＜0.05)。

圖九：牛樟芝萃取物(Ant-Ex)對於感染SARS-CoV-2的Vero-E6細胞抑制試驗。(A) Vero-E6 細胞在 37 ºC 下用指定濃度的 Ant-Ex 預處理 1 小時，然後用 100 PFU（MOI = 0.01）的新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）吸附在 37 ºC 1 小時。之後去除病毒，將含有指定濃度化合物的新鮮培養基加入細胞培養1天。將細胞固定並用抗 SARS-CoV-2 N 蛋白抗體和抗人類 IgG-488 抗體進行免疫染色。對於細胞存活測試，Vero-E6 細胞用指定濃度的 Ant-Ex 在 37ºC 下處理 1 天。由細胞計數試劑盒-8 (CCK-8) 確定細胞的存活。螢光信號通過高內涵成像量化，未經化合物處理的感染率設定為100%。 (B) 對於 ACE-2 表現測試，Vero-E6 細胞用指定濃度的化合物在 37 ºC 下處理 24 小時。將細胞固定並用抗 hACE-2 抗體 (GTX01160) 加抗兔子 IgG-568 進行免疫染色。螢光信號通過高內涵成像量化，未經化合物處理的表現量設定為100%。

圖十：(A) AE-F03可降低血管收縮素轉化酶二(ACE-2)的蛋白質表現(約36%) ，且無明顯的細胞毒性。其中加入有無AE-F03 12.5~50 ug/mL 用於人類肺癌細胞CL1-5培養24小時，同時亦測量GAPDH作為蛋白質定量的控制組。 (B) AE-F03 抑制血管收縮素轉化酶二(ACE-2)的酵素活性。 ACE-2 蛋白用 100 μg/mL 或不加 AE-F03 處理 30 分鐘，然後用含有螢光組成的基質再處理10分鐘。如果有抑制作用則螢光強度降低。該酶活性測定的原理在圖八(A)中提到。 AE-F03處理後，ACE-2的酵素活性被抑制約10%。(C) AE-F03的主要成分Antcin K、DSA和DEA也具有抑制ACE-2的能力，通過抑制試驗（每種化合物20 μg/mL或不作為對照）。 DSA 是最強的抑制試劑，抑制效果超過 30%。(D) Vero-E6 細胞在 37 ºC 下用指定濃度的 AE-F03 預處理 1 小時，然後在 37 ºC 下用 100 PFU（MOI = 0.01）的 SARS-CoV-2 吸附 1 小時。之後去除病毒，將含有指定濃度化合物的新鮮培養基加入細胞培養1天。將細胞固定並用抗 SARS-CoV-2 N 蛋白抗體和抗人類 IgG-488 進行免疫染色。對於細胞存活測試，Vero-E6 細胞用指定濃度的 化合物在 37ºC 下處理 1 天。由細胞計數試劑盒-8 (CCK-8) 確定細胞的存活。螢光信號通過高內涵成像量化，未經化合物處理的感染率設定為100%。以軟體計算IC50半數抑制濃度和CC50半數毒性濃度。

圖十一：(A) Ant-Ex的高效液相層析圖譜 (B) 在Ant-Ex中組成各個化合物的滯留時間(RT)、面積、高度和名稱。

圖十二：從Ant-Ex分離製備出AE-F03的流程圖。

圖十三：(A) AE-F03的高效液相層析圖譜 (B) 在AE-F03中組成各個化合物的滯留時間(RT)、面積、高度和名稱。

Claims (21)

1. 一種用以降低及預防受試者因血管收縮素轉化酶（ACE-2）相關症狀的風險的治療方法，該方法包括向受試者施以治療有效劑量的牛樟芝萃取物（Ant-Ex）或餾分物三號（AE-F03）。
2. 如請求項1所述的治療方法，其受試者應為哺乳動物。
3. 如請求項2所述的治療方法，其受試者為人類。
4. 如請求項1所述的治療方法，其中與ACE-2相關的症狀，指的是與血壓相關的疾病或症狀。
5. 如請求項1所述的治療方法，其中與ACE-2相關的症狀數據得自下列疾病或症狀：慢性心臟衰竭，左心室肥大、急性心臟衰竭和心肌病變。
6. 如請求項1所述的治療方法，其中與ACE-2相關的症狀包括：充血性心臟衰竭、動脈高血壓或心肌梗塞。
7. 如請求項1所述的治療方法，其中與ACE-2相關的症狀包括細胞增生性異常疾病。
8. 如請求項7所述的治療方法，其中所述細胞增生性異常疾病指的是平滑細胞增生異常。
9. 如請求項8所述的治療方法，所述平滑細胞增生異常包括血管狹窄。
10. 如請求項1所述的治療方法，其中與ACE-2相關症狀包括腎臟疾病或症狀。
11. 如請求項1所述的治療方法，其中與ACE-2相關症狀包括與Kinetensin（血管收縮素）相關的疾病。
12. 如請求項11所述的治療方法，其中所述Kinetensin相關的疾病包括：異常的血管通透性、局部和全身性發炎反應、溼疹、哮喘和過敏性休克。
13. 如請求項1所述的治療方法，其中與ACE-2相關症狀也包括發炎症狀。
14. 如請求項13所述的治療方法，其中所述發炎症狀相關者包括：全身性發炎症候群（SIRS）、多發性創傷，發炎症性腸道症、急慢性疼痛、類風濕性骨關節炎的骨質破壞、牙周病、痛經、早產、局灶性腦損傷、瀰漫性軸索損傷、過敏性疾病、傷口癒合和疤痕形成。
15. 如請求項1所述的治療方法，其中ACE-2相關症狀包括病毒感染。
16. 如請求項15所述的治療方法，其中所述病毒感染包括冠狀病毒感染。
17. 如請求項16所述的治療方法，其中所述冠狀病毒感染包括：嚴重急呼吸疾病症候群冠狀病毒感染症（SARS-CoV）、中東呼吸症候群冠狀病毒感染症（MERS-CoV）或新型嚴重急呼吸疾病症候群冠狀病毒感染症（SARS-CoV-2）。
18. 如請求項1所述的治療方法，其中所述牛樟芝萃取物（Ant-Ex）可透過以下方法取得： 以95％（v / v）的乙醇萃取牛樟芝的子實體。
19. 如請求項1所述的治療方法，其中所述牛樟芝萃取物（Ant-Ex）包含餾分物三號（AE-F03）。
20. 牛樟芝萃取物（Ant-Ex）或餾分物三號（AE-F03），作為藥物或營養補充劑時，其作用在於治療、降低、預防或減輕與ACE-2相關症狀的用途。
21. 牛樟芝萃取物（Ant-Ex）或餾分物三號（AE-F03）在降低ACE-2表現中的用途。

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