TW202144365A - 稠環嘧啶化合物在製備治療癌症的藥物中的應用 - Google Patents

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馮振華
王飛瀾
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本披露提供了某些稠環嘧啶化合物的新的治療用途，特別地用於治療患有表達升高的成纖維細胞生長因子受體癌基因伴侶2（FGFR1OP2）或表達FGFR1-FGFR1OP2融合蛋白的癌症的患者。

Description

稠環嘧啶化合物在製備治療癌症的藥物中的應用
本披露涉及某些稠環嘧啶化合物的新的治療用途，特別地用於治療患有表達升高的成纖維細胞生長因子受體癌基因伴侶2（FGFR1OP2）或FGFR1-FGFR1OP2融合蛋白水平的癌症的患者。
成纖維細胞生長因子受體癌基因伴侶2（FGFR1OP2）是具有尚不清楚的功能的天然蛋白。據信，它參與傷口癒合。當與成纖維細胞生長因子受體1（FGFR1）融合時，它可以引起組成性激酶活性，從而導致8p11骨髓增生症候群。Grand, E.K.,等人,“Identification of a novel gene, FGFR1OP2, fused to FGFR1 in 8p11 myeloproliferative syndrome [8p11骨髓增生症候群中與FGFR1融合的新穎的基因FGFR1OP2的鑑定].”Genes Chromosomes Cancer [基因、染色體和癌症] (2004) 40:78-83。
如US10494378B2中所述的稠環嘧啶化合物（將其內容通過引用併入本文）被稱為Janus激酶（JAK）、FGFR激酶、FLT3激酶和Src家族激酶的抑制劑，並且在治療各種免疫系統疾病、自身免疫性疾病、細胞增殖性疾病、過敏性障礙和心血管疾病中具有效用。例如，一種這樣的化合物（MAX-40279）在臨床試驗中作為FLT3激酶和FGFR激酶的雙重抑制劑以治療具有導致FLT3激酶表達和/或激活增加的突變的患者的急性骨髓性白血病（AML）。
需要新的治療和替代治療以治療患有治療抗性癌症的患者。
令人驚訝地發現，FGFR1OP2和FGFR1之間的締合不僅可以通過融合，其中，由於8p11骨髓增生症候群中，由於易位事件，FGFR1OP2與FGFR1融合而形成表現出組成性激酶活性的融合多肽，而且還可能由非共價結合產生，其中FGFR1OP2結合FGFR1，而且結合複合物也表現出組成性激酶活性，例如在FGFR1OP2過表達的情況下。據發現，FGFR1OP2在多種癌症中高表達，而不僅僅是在肌增生症候群中。
進一步發現，當本文所述的稠環嘧啶化合物與成纖維細胞生長因子受體1（FGFR1）結合或融合時，該化合物有效地特異性抑制成纖維細胞生長因子受體癌基因伴侶2（FGFR1OP2）。此外，據發現FGFR1OP2在多種癌症（而不僅僅是在肌增生症候群）中高表達，這響應於使用如本文所述的稠環嘧啶化合物治療。如本文所述的稠環嘧啶化合物被認為在FGFR1OP2與FGFR1結合時以及在FGFR1OP2與FGFR1融合時結合並阻斷FGFR1-FGFR1OP2複合。
因此，本披露提供了治療有需要的患者中癌症的方法，其中該癌症表達升高的FGFR1OP2水平，該方法包括向所述患者施用有效量的如本文所述的呈游離或藥學上可接受的鹽形式的稠環嘧啶化合物，例如如下文所述的具有式 (I) 的化合物或化合物1，例如如US10494378B2中所述的（將其內容通過引用併入本文）。
本披露進一步提供了如本文所述的呈游離或藥學上可接受的鹽形式的稠環嘧啶化合物用於治療癌症，這些癌症表達升高的FGFR1OP2，以及如本文所述的呈游離或藥學上可接受的鹽形式的稠環嘧啶化合物在製造用於治療癌症的藥物中的用途，這些癌症表達升高的FGFR1OP2水平。
本披露的進一步適用領域將通過下文提供的具體實施方式而變得顯而易見。應當理解的是，該具體實施方式和具體實例，在指示本發明的優選的實施例的同時，僅用於說明目的，而並非旨在限制本發明的範圍。
以下對一個或多個優選的實施例的說明本質上僅僅是示例性的並且決不是意在限制本發明、其應用、或用途。
在第一個實施例中，本披露提供了治療有需要的患者中癌症的方法（方法1），其中該癌症 (i) 表現出升高的FGFR1OP2水平；和/或 (ii) 特徵在於表達FGFR1OP2-FGFR1融合蛋白的易位突變，該方法包括施用有效量的呈游離或藥學上可接受的鹽形式的具有式 (I) 的化合物：
Figure 02_image001
其中，P選自氫或氘； X選自CH或S； Y選自N或CR5 ； U選自化學鍵或CH； V選自N或CH； W選自N或CR6 ； R1 、R2 、R3 和R6 各自獨立地選自由以下組成的組：氫、氘、鹵素、取代或未取代的烷基、
Figure 02_image003
、
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、環烷基和雜環烷基；R7 、R8 、R9 、R10 和R15 各自獨立地選自由以下組成的組：氫、氘、鹵素、羥基、氨基、取代或未取代的烷基、烷氧基、
Figure 02_image011
和雜環烷基；R11 是氫、氘或烷基；或R6 、R2 和與它們所附接的環上的兩個原子一起形成“取代或未取代的5元至7元碳雜環”；或R6 、R3 和與它們所附接的環上的兩個原子一起形成“取代或未取代的5元至7元碳雜環”；“取代或未取代的5元至7元碳雜環”中的雜原子選自由氮、氧和硫組成的組； R4 是氫、氘、取代或未取代的烷基、烷氧基、環烷基、或取代或未取代的雜環烷基； R5 是氫、氘、鹵素、或烷基； 在R1 、R2 、R3 和R6 的定義中，“取代或未取代的烷基”中“取代的”意指被以下取代基取代，這些取代基選自由以下組成的組：鹵素、羥基、氨基、烷基、烷氧基、
Figure 02_image013
、
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
和雜環烷基，在多個取代基存在的情況下，這些取代基是相同或不同的；R12 是氫、氘或烷基； 在R7 、R8 、R9 、R10 和R15 的定義中，“取代或未取代的烷基”中“取代的”意指被以下取代基取代，這些取代基選自由以下組成的組：氘、鹵素、羥基、氨基、烷基、烷氧基、
Figure 02_image021
、
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image023
和雜環烷基，在多個取代基存在的情況下，這些取代基是相同或不同的；R13 是氫或烷基； 在R4 的定義中，“取代或未取代的烷基”和“取代或未取代的雜環烷基”中“取代的”意指被以下取代基取代，這些取代基選自由以下組成的組：羥基、烷基、
Figure 02_image025
、
Figure 02_image027
、
Figure 02_image023
和雜環烷基，在多個取代基存在的情況下，這些取代基是相同或不同的；R14 是氫、烷基、羥基甲基或烷氧基； “取代或未取代的5元至7元碳雜環”中“取代的”意指被一個或多於一個烷基取代 [例如，如US10494378B2中所述，將其內容通過引用併入本文]，其呈游離或藥學上可接受的鹽形式。
例如，本披露提供了 1.1    方法1，其中具有式 (I) 的化合物是呈游離或藥學上可接受的鹽形式的化合物1：
Figure 02_image030
。 1.2    方法1.1，其中化合物1呈藥學上可接受的酸加成鹽形式。 1.3    方法1.2，其中化合物1的藥學上可接受的酸加成鹽形式選自富馬酸鹽、磷酸鹽、酒石酸鹽、和己二酸鹽。優選富馬酸。 1.4    方法1.3，其中化合物1的藥學上可接受的酸加成鹽形式呈結晶形式[例如，如WO 2019228171A1中所述，將其內容通過引用併入本文]。 1.5    任一項前述方法，其中如使用基因表達譜，例如，使用RNA定序或即時定量PCR（RT-qPCR）測量，癌症表現出升高的FGFR1OP2水平。 1.6    任一項前述方法，其中如使用對於FGFR1OP2的免疫測定，例如，使用西方墨點法、ELISA或原位雜交測量，癌症表現出升高的FGFR1OP2水平。 1.7    任一項前述方法，其中如使用基因表達譜測量，癌症表現出升高的FGFR1OP2水平，並且該癌症中FGFR1OP2的基因表達大於五個mRNA轉錄本/百萬個mRNA轉錄本（TPM），例如至少9 TPM，例如至少10 TPM，例如至少12 TPM，例如，其中TPM按以下所述計算：Wagner GP,等人,“Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples [使用RNA序列數據測量mRNA豐度：樣品之間的RPKM測量不一致].”Theory Biosci.[生物科學理論] 2012 Dec;131(4):281-5。 1.8    任一項前述方法，其中癌症表達FGFR1OP2-FGFR1融合蛋白；例如，其中FGFR1OP2-FGFR1融合蛋白表現出組成性激酶活性、二聚誘導、組成性訊息傳遞、和/或轉化活性；例如，其中FGFR1OP2的前2個捲曲螺旋結構域與FGFR1的羧基末端部分（包括其酪胺酸激酶結構域）融合的蛋白質，例如，該蛋白質包含來自FGFR1OP2的132個胺基酸和來自FGFR1的394個胺基酸。 1.9    任一項前述方法，其中癌症表達FGFR1OP2-FGFR1融合蛋白，該FGFR1OP2-FGFR1融合蛋白表現出組成性激酶活性，例如，其中融合由染色體易位引起以形成編碼該FGFR1OP2-FGFR1融合蛋白的基因。 1.10   任一項前述方法，其中如使用對於FGFR1OP2-FGFR1融合蛋白的免疫所檢測，例如，使用西方墨點法、原位雜交、或ELISA檢測，癌症表達FGFR1OP2-FGFR1融合蛋白。 1.11   任一項前述方法，其中如使用基因表達譜，例如，使用RNA定序或即時定量PCR（RT-qPCR）所檢測，癌症表達FGFR1OP2-FGFR1融合蛋白。 1.12   任一項前述方法，其中如使用PCR或DNA探針以檢測導致編碼FGFR1OP2-FGFR1融合蛋白的基因的突變所檢測，癌症表達FGFR1OP2-FGFR1融合蛋白。 1.13   任一項前述方法，該方法包括以下步驟 a) 獲得生物樣品，其選自來自患者的血液或腫瘤組織，其中該生物樣品被認為含有癌細胞； b) (i) 使用基因表達譜和/或免疫測定檢測生物樣品中升高的FGFR1OP2表達水平；或者 (ii) 使用基因表達譜、PCR、DNA探針、或免疫測定檢測生物樣品中FGFR1OP2-FGFR1融合蛋白或編碼FGFR1OP2-FGFR1融合蛋白的基因；以及 c) 如果該生物樣品表現出升高的FGFR1OP2表達水平或者存在FGFR1OP2-FGFR1融合蛋白或編碼FGFR1OP2-FGFR1融合蛋白的基因，則向該患者施用呈游離或藥學上可接受的鹽形式的有效劑量的具有式 (I) 的化合物，例如化合物1。 1.14   任一項前述方法，其中癌症表現出結合FGFR1的FGFR1OP2以表現組成性激酶活性。 1.15   任一項前述方法，其中癌症選自癌、肉瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病和骨髓瘤。 1.16   任一項前述方法，其中癌症是實體瘤。 1.17   任一項前述方法，其中癌症選自腎上腺癌、膀胱癌、乳腺癌、腦癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、黑素瘤、間皮瘤、非小細胞肺癌、非黑素瘤皮膚癌、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、***癌、肉瘤、皮膚癌、小細胞肺癌、胃癌、和甲狀腺癌。 1.18   任一項前述方法，其中癌症選自十二指腸腺癌、膽管癌、胃癌、肝癌、室管膜瘤、髓母細胞瘤、胰腺癌、膠質瘤、和脈絡叢腫瘤。 1.19   方法1-1.12中任一項，其中癌症是血癌，例如，選自白血病、淋巴瘤、和骨髓瘤；例如，其中該癌症是急性髓性白血病（AML）。 1.20   任一項前述方法，其中具有式 (I) 的化合物與FGFR1OP2-FGFR1融合蛋白結合，例如，在與FGFR1OP2的Leu48對應的胺基酸和與FGFR1的Gly487和Asp641 Mg2+ MG776對應的胺基酸處。 1.21   任一項前述方法，其中具有式 (I) 的化合物與FGFR1OP2-FGFR1結合複合物結合，例如，在與FGFR1OP2的Arg62和Gln70對應的胺基酸和與FGFR1的Gln426和Leu417對應的胺基酸處。 1.22   任一項前述方法，其中具有式 (I) 的化合物的劑量是20至125 mg的口服日劑量。 1.23   任一項前述方法，其中在用具有式 (I) 的化合物治療前、治療中或治療後，患者另外接受放射療法和/或化學療法。 1.24   任一項前述方法，其中除具有式 (I) 的化合物外，患者接受激酶抑制劑，例如，其中該患者接受帕納替尼（ponatinib）。
本披露進一步提供了如上文所述的呈游離或藥學上可接受的鹽形式的具有式 (I) 的化合物用於治療癌症，該癌症 (i) 表現出升高的FGFR1OP2水平；和/或 (ii) 特徵在於表達FGFR1OP2-FGFR1融合蛋白的易位突變，例如，用於上述方法1及以下中的任一項。
本披露進一步提供了如上文所述的呈游離或藥學上可接受的鹽形式的具有式 (I) 的化合物在製造用於治療癌症的藥物中的用途，該癌症 (i) 表現出升高的FGFR1OP2；和/或 (ii) 特徵在於表達FGFR1OP2-FGFR1融合蛋白的易位突變，例如，用於上述方法1及以下中的任一項。
如全篇所用，範圍被用作描述範圍內每個值的簡寫。可以選擇該範圍內的任一值作為該範圍的終點。此外，本文所引用的所有參考文獻均通過引用以其全部內容結合在此。在本披露中的定義與所引用的參考文獻中的定義發生衝突時，以本披露為准。
優選實施例的詳細描述 在以下實例中進一步說明本發明，這些實例意指示例性地而並非限制。
實例1：實體瘤中迷你PDX測定和FGFR1OP2表達水平
迷你患者源異種移植（迷你PDX）用於評估不同腫瘤對化合物1（MAX-40279）治療的敏感性。在該實驗中，通過口服施用化合物1在迷你PDX中治療來自患者的臨床腫瘤樣品，並分析這些樣品中FGFR1OP2表達水平。
腫瘤組織獲取由各參與醫院的倫理委員會批准，並經每位患者書面知情同意，並根據國家和機構關於人體組織實驗使用的規定進行。如果腫瘤體積≥500 mm3 且壞死面積＜ 30%，則對患者樣品進行校正。然後在生物安全櫃中用漢克氏平衡鹽溶液（Hank’s balanced salt solution）（HBSS）洗滌腫瘤組織以去除非腫瘤組織和壞死腫瘤組織。
將腫瘤組織顆粒化後，將它們在37°C下用膠原酶消化1-4 h。通過在600g 下離心5 min來沉澱細胞，然後用磁珠去除血細胞和成纖維細胞。然後將細胞用HBSS洗滌，並且填充到中空纖維膠囊（上海立迪生物技術股份有限公司（Shanghai LIDE Biotech Co., LTD））中。這些膠囊允許小分子藥物、大分子抗體藥物和各種小於500 KD的生長因子自由進出，而腫瘤細胞則保留在裝置中。經由小皮膚切口將膠囊皮下植入，每只小鼠（5周齡的nu/nu小鼠）3粒膠囊。
將帶有迷你PDX膠囊的小鼠用化合物1處理7天，以12 mg/kg的劑量，每天一次通過口服施用。
之後，將植入的膠囊去除，並且使用CellTiter Glo發光細胞活性測定（CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay）試劑盒（G7571，普洛麥格公司（Promega），麥迪遜，威斯康辛州，美國），根據製造商的指示評估腫瘤細胞增殖。使用分光光度計（SpectraMax M3，分子儀器公司（Molecular Devices），桑尼維爾市，加利福尼亞州，美國）以相對亮度單位（RLU）來測量發光。使用下式計算腫瘤細胞生長抑制（TCGI）（%）：TCGI%=（1-[治療組第7天的平均RLU-第0天的平均RLU]/[載體組第7天的平均RLU-第0天的平均RLU]）× 100%，每個實驗均一式六份進行，並且報告了平均值。採用雙向ANOVA來統計p值。
圖1描繪了在迷你PDX中處理的4個樣品的初始篩選，顯示與安慰劑相比，化合物1在口服施用7天後提供有效的TCGI。
在第7天對來自治療組或載體組的另外兩個膠囊進行校正以檢測RNA和全外顯子定序（WES）。
根據製造商的說明經由單細胞全長mRNA擴增試劑盒（Single Cell Full Length mRNA-Amplification Kit）（南京諾唯贊生物科技有限公司（Vazyme biotech co., ltd.））進行RNA提取。簡言之，將單細胞裂解物在4°C下解凍並且離心。接下來，在96孔PCR板中，將0.5 µL的基因組DNA消化混合物（0.1 U的DNA酶I（擴增級）和2× 無RNA酶的水中的DNA酶I反應緩衝液）添加至1 µL的單細胞裂解物中，並且在25 °C下孵育5 min。基因組DNA消化後，將0.5 µL的變性混合物（無RNA酶的水中的8 mM EDTA和0.02% NP40）添加至消化的樣品中，隨後在7°C下孵育5 min以使DNA酶I失活並且使RNA去飽和。將樣品板立即置於冰上。將一微升的RT混合物（無RNA酶的水中的3× VILO反應混合物合3× SuperScript酶混合物）添加至樣品板中，並且在25°C下孵育10 min，42°C下孵育60 min，以及85°C下孵育5 min。
使用Qubit 2.0螢光計（生命技術公司（Life technologies），卡爾斯巴德，美國）測量cDNA產品的濃度。利用最後一步合成的1 ng cDNA構建定序文庫。將Nextera® XT DNA文庫製備試劑盒（依諾米那公司（Illumina）#FC-131-1024）用於文庫製備。
經由Discover-sc® 單細胞WGA試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司），採用全基因組擴增（WGA）方法製備WES文庫。所有實驗操作均嚴格遵守製造商的說明。使用Qubit 2.0螢光計測量WGA產品的濃度。我們的實驗操作嚴格遵循製造商的協議，僅減少了DNA的輸入。將TruSeq DNA無PCR文庫製備試劑盒（目錄號FC-121-3003，依諾米那公司，聖地亞哥，加利福尼亞州，美國）應用於無PCR文庫製備。每個樣品從500 ng的總擴增DNA開始製備文庫。
使用2100生物分析儀（安捷倫科技公司（Agilent Technologies））檢查文庫的大小和數量。在Hiseq X十（Hiseq X ten）平臺上經由配對末端150策略進行定序，該配對末端150策略具有約3000-4000萬個配對讀數用於RNA定序（mRNA）。修整低質量的讀數（Phred質量得分＜20）和每個讀數的前20 bp。隨後，使用巴羅斯-惠勒比對儀（Burrow-Wheeler-Aligner）（BWA）v0.7.7a算法，將這些讀數與參考基因組（GRCh37，UCSC釋放hg19）進行對比。然後採用DESeq2（版本3.10）量化包括FGFR1OP2的基因的表達水平。BWA用於精確的SNP和***缺失（Indel，***/缺失）鑑定。使用具有默認設置的Mutect2調用體細胞突變。關注FGFR和FGFR1OP2中的突變。
表1-6中顯示了FGFR1OP2表達與腫瘤在迷你PDX測定中對治療的響應性之間的高度相關性： 表1-對於腦癌，FGFR1OP2 TPM對比P
患者# 類型 P值 效果 （P ≤ 0.05） TPM中的FGFG1OP2表達
1 CNS癌症 0.28 無效 0.529
2 LGG 0.94 無效 1.643
3 膠質瘤 0.99 無效 3.690
4 髓母細胞瘤 0.54 無效 4.068
5 髓母細胞瘤 0.02 有效 19.065
6 LGG 0.03 有效 22.687
7 脈絡叢腫瘤 0.02 有效 23.250
8 膠質瘤 0.04 有效 15.319
9 室管膜瘤 0.0001 有效 25.098
表2-對於胰腺癌，FGFR1OP2 TPM對比P
患者# P值 效果 （P ≤ 0.05） TPM中的FGFG1OP2表達
1 0.85 無效 0.000
2 0.23 無效 8.219
3 0.28 無效 4.483
4 0.51 無效 7.485
5 0.09 無效 3.151
6 0.03 有效 8.219
7 0.03 有效 21.000
（注釋：患者6是離群值，因為該藥物在TPM ＜ 9時有效；在所有其他情況下，該藥物在TPM ＞ 9時有效）。 表3-對於肝癌，FGFR1OP2 TPM對比P
患者# P值 效果 （P ≤ 0.05） FGFG1OP2 在TPM中的表達
1 0.1589 無效 5.179281
2 0.0275 有效 11.66406
3 0.0023 有效 19.84548
表4-對於膽管癌，FGFR1OP2 TPM對比P
患者# P值 效果 （P ≤ 0.05） FGFG1OP2 在TPM中的表達
1 0.9972 無效 1.872244
2 0.0117 有效 22.30583
3 0.0412 有效 9.900412
表5-對於胃癌，FGFR1OP2 TPM對比P
患者# P值 效果 （P ≤ 0.05） FGFG1OP2 在TPM中的表達
1 0.87 無效 0.684
2 0.002 有效 10.343
表6-對於其他癌症，FGFR1OP2 TPM對比P
患者# 類型 P值 效果 （P ≤ 0.05） FGFG1OP2 在TPM中的表達
1 結腸癌 0.99 無效 0.190
2 膽囊癌 0.37 無效 2.500
3 生殖細胞瘤 0.89 無效 3.998
4 橫紋肌體瘤（Rhabdomyosoid tumor） 0.45 無效 5.164
5 橫紋肌體瘤 0.95 無效 8.764
6 十二指腸腺癌 0.04 有效 9.335
這些數據表明，具有式 (I) 的化合物，特別是化合物1，可有效治療具有高表達FGFG1OP2，例如大於9 TPM的多種癌症類型。來自患者的30個腫瘤樣品中，化合物1的有效率為13/30= 43%。在所有情況中除了一種情況外，化合物1對表達FGFR1OP2 TPM ＞ 9的腫瘤均有效，即使在這種情況下，表達水平仍相對較高（8.219 TPM）。如果將這些情況分為化合物1有效的情況與化合物1無效的情況，顯然第一組中FGFG1OP2的表達要高得多： 表7-效果與FGFG1OP2表達之間的相關性概述
N=30 p＜0.05 p＞0.05
平均TPM 16.77 3.63
中值TPM 19.07 3.69
實例2：臨床樣品中FGFG1OP2的檢測
臨床樣品中FGFR1OP2的檢測可以通過多種方式進行。
RNA定序：通過RNA定序（RNA-seq）對從AML患者全血樣品中分離的RNA進行基因表達分析，根據製造商的說明經由PAXgene全血RNA管（BD）對RNA進行收集。然後使用PAX血液RNA試劑盒（PAX Blood RNA Kit）（BD）提取總RNA。下一步是使用TruSeq RNA文庫製備試劑盒（TruSeq RNA Library Prep Kit）v2（依諾米那公司）創建RNA-Seq文庫，並且在Hiseq X Ten平台中定序。表達值以TPM（每百萬轉錄本）計算，並用於確定四個時間點（第一次PK運行（給藥前）、週期1第15天（給藥前）、週期1第28天（給藥前）、治療終止訪問）中的mRNA差異表達。圖2（治療前TPM中的基因組表達）和圖3（第0天、第15天和第28天的基因組表達，表達為外顯子模型的每千鹼基的片段/百萬個映射片段（FPKM）））中描述了對表達高水平FGFR1OP2的PR患者的RNA-Seq分析。
在超過30種類型的腫瘤中檢測到升高的FGFG1OP2表達。80%的AML表現出升高的FGFR1OP2。圖4提供了一些腫瘤類型（主要是表8中給出的腫瘤類型）的數據： 表8
ACC 頭頸癌
BLCA 膀胱癌
BRCA 乳腺癌
CESC 子宮頸癌
COADREAD 結腸直腸癌
DLBC B細胞淋巴瘤
ESCA 頭頸癌
GBM 腦癌
HNSC 頭頸癌
KIRC 腎癌
LAML AML
LGG 腦癌
LUAD 肺癌
LUSC 肺癌
MESO 間皮瘤
OV 卵巢癌
PAAD 胰腺癌
PCPG 嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤
SARC 軟組織肉瘤
SKCM 皮膚癌
STAD 胃癌
TGCT 關節/腱癌
THCA 甲狀腺癌
THyM 胸腺瘤癌
UCS 子宮
檢測臨床樣品中FGFR1OP2的其他方法包括如下的PCR測定和免疫測定。
RT-qPCR測定：將RNA從PAXgene全血RNA管（BD）中的全血樣品中分離，並且使用PAX血液RNA試劑盒（BD）提取。根據製造商的協議，使用RT2 分析器PCR陣列系統（SA生物科學公司（SA Biosciences Corp），弗雷德裡克，馬里蘭州）進行即時定量PCR（RT-qPCR）分析，其重點是凝血級聯和經典補體途徑。使用RT2 第一鏈試劑盒（RT2 First Strand Kit）（凱杰公司（Qiagen），日耳曼敦，馬里蘭州，美國），然後使用RT2 SYBR Green/Rox Mastermix試劑盒（凱杰公司，日耳曼敦，馬里蘭州，美國），在應用生物系統公司（Applied Biosystems）7900HT（應用生物系統公司，福斯特城，加利福尼亞州，美國）中在推薦條件下通過qPCR測定，將500 ng的總RNA用於產生cDNA。用SDS 2.3軟件（應用生物系統公司，福斯特城，加利福尼亞州，美國）分析RT-qPCR結果。FGFR1OP2的引物是FGFR1OP2-F：AGCGAGTAGAAGCCATGAAACA和FGFR1OP2-R：CCCATAACTAACGTGGACCGT。
ELISA測定：採用FGFR1OP2 ELISA試劑盒（MBS9319814，MYBioSource公司）分析AML中骨髓液和血清中的蛋白表達。在4°C下，用在磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）中稀釋的抗原（0.3 μg/孔）包被微量滴定板（96孔）持續40 h，並且隨後用在PBS中的10%脫脂奶封閉1 h。將患者血清用5%脫脂奶在PBS中以1:100稀釋，在室溫下孵育1 h，並用在PBS中的0.1%吐溫20洗滌三次，並且用PBS洗滌一次。添加以1,000倍稀釋的抗原。將同樣的稀釋液用於兔抗人IgG。室溫下孵育1 h後，將板用前述方法洗滌，並且添加2,2’-連氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）基質。室溫下孵育30 min後，用酶標儀測量405 nm下的光密度（OD405）。抗體效價表示為陽性反應中最高稀釋度的倒數。
雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
無
圖1是來自迷你PDX載體（mini-PDX vehicle）的細胞的RLU（ATP酶活性）。將來源於患者的癌細胞嵌入迷你PDX載體中，然後將其植入小鼠中培養7天。將小鼠用MAX-40279（12 mpk，PO，BID）處理或不處理。7天後，收集迷你PDX載體中的細胞並且用ATP酶活性表示細胞活力。 圖2是患者中MAX40279的候選靶標的基因表達。TPM用於定量RNA-seq數據中的基因表達。 圖3是MAX40279治療前或治療後患者血液中FGFR/FLT3相關基因的表達。使用FPKM值估計基因表達水平。C0D0意指招募後的治療前。C1D15表示MAX40279處理15天，而C1D28表示28天。 圖4是所有癌症中高表達的FGFR1OP2的比率。將TPM＞5定義為高表達。使用TCGA數據計算每個癌症中高表達的FGFR1OP2的比率。

Claims (12)

  1. 一種具有式 (I) 的化合物或其藥學上可接受的鹽在製備用於治療患者中的癌症的藥物中的應用，其中該癌症 (i) 表現出升高的FGFR1OP2水平和/或 (ii) 特徵在於表達FGFR1OP2-FGFR1融合蛋白的易位突變：
    Figure 03_image032
    其中，P選自氫或氘； X選自CH或S； Y選自N或CR5 ； U選自化學鍵或CH； V選自N或CH； W選自N或CR6 ； R1 、R2 、R3 和R6 各自獨立地選自由以下組成的組：氫、氘、鹵素、取代或未取代的烷基、
    Figure 03_image003
    、
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image033
    、環烷基和雜環烷基；R7 、R8 、R9 、R10 和R15 各自獨立地選自由以下組成的組：氫、氘、鹵素、羥基、氨基、取代或未取代的烷基、烷氧基、
    Figure 03_image011
    和雜環烷基；R11 是氫、氘或烷基；或R6 、R2 和與它們所附接的環上的兩個原子一起形成“取代或未取代的5元至7元碳雜環”；或R6 、R3 和與它們所附接的環上的兩個原子一起形成“取代或未取代的5元至7元碳雜環”；“取代或未取代的5元至7元碳雜環”中的雜原子選自由氮、氧和硫組成的組； R4 是氫、氘、取代或未取代的烷基、烷氧基、環烷基、或取代或未取代的雜環烷基； R5 是氫、氘、鹵素、或烷基； 在R1 、R2 、R3 和R6 的定義中，“取代或未取代的烷基”中“取代的”意指被以下取代基取代，這些取代基選自由以下組成的組：鹵素、羥基、氨基、烷基、烷氧基、
    Figure 03_image013
    、
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    和雜環烷基，在多個取代基存在的情況下，這些取代基是相同或不同的；R12 是氫、氘或烷基； 在R7 、R8 、R9 、R10 和R15 的定義中，“取代或未取代的烷基”中“取代的”意指被以下取代基取代，這些取代基選自由以下組成的組：氘、鹵素、羥基、氨基、烷基、烷氧基、
    Figure 03_image021
    、
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image023
    和雜環烷基，在多個取代基存在的情況下，這些取代基是相同或不同的；R13 是氫或烷基； 在R4 的定義中，“取代或未取代的烷基”和“取代或未取代的雜環烷基”中“取代的”意指被以下取代基取代，這些取代基選自由以下組成的組：羥基、烷基、
    Figure 03_image025
    、
    Figure 03_image027
    、
    Figure 03_image023
    和雜環烷基，在多個取代基存在的情況下，這些取代基是相同或不同的；R14 是氫、烷基、羥基甲基或烷氧基； “取代或未取代的5元至7元碳雜環”中“取代的”意指被一個或多於一個烷基取代。
  2. 如請求項1所述的應用，其中該呈游離或藥學上可接受的鹽形式的具有式 (I) 的化合物是化合物1：
    Figure 03_image036
    。
  3. 如請求項2所述的應用，其中該化合物1呈藥學上可接受的酸加成鹽形式。
  4. 如請求項3所述的應用，其中該化合物1的藥學上可接受的酸加成鹽形式選自富馬酸鹽、磷酸鹽、酒石酸鹽、和己二酸鹽；優選地，該化合物1的可接受的酸加成鹽形式是富馬酸鹽。
  5. 如請求項3或4所述的應用，其中該化合物1的藥學上可接受的酸加成鹽形式呈結晶形式。
  6. 如前述請求項中任一項所述的應用，其中該癌症表現出升高的FGFR1OP2水平。
  7. 如前述請求項中任一項所述的應用，其中如使用基因表達譜測量，該癌症表現出升高的FGFR1OP2水平，並且該癌症中FGFR1OP2的基因表達大於五個mRNA轉錄本/百萬個mRNA轉錄本（TPM），例如至少9 TPM，例如至少10 TPM，例如至少12 TPM。
  8. 如前述請求項中任一項所述的應用，其中該癌症表達FGFR1OP2-FGFR1融合蛋白。
  9. 如前述請求項中任一項所述的應用，其中該癌症選自癌、肉瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病和骨髓瘤，例如實體瘤，例如腎上腺癌、膀胱癌、乳腺癌、腦癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、黑素瘤、間皮瘤、非小細胞肺癌、非黑素瘤皮膚癌、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、***癌、肉瘤、皮膚癌、小細胞肺癌、胃癌、或甲狀腺癌、例如十二指腸腺癌、膽管癌、胃癌、肝癌、室管膜瘤、髓母細胞瘤、胰腺癌、膠質瘤、和脈絡叢腫瘤，或血癌，例如選自白血病、淋巴瘤、和骨髓瘤、例如急性髓性白血病（AML）。
  10. 如前述請求項中任一項所述的應用，其中該具有式 (I) 的化合物的劑量是口服日劑量20至125 mg。
  11. 如前述請求項中任一項所述的應用，其中該患者另外接受放射療法和/或化學療法。
  12. 一種治療有需要的患者中癌症的方法，其中該癌症 (i) 表現出升高的FGFR1OP2水平和/或 (ii) 特徵在於表達FGFR1OP2-FGFR1融合蛋白的易位突變，該方法包括以下步驟 a) 獲得生物樣品，其選自來自該患者的血液或腫瘤組織，其中該生物樣品被認為含有癌細胞； b) (i) 使用基因表達譜和/或免疫測定檢測生物樣品中升高的FGFR1OP2表達水平；或者 (ii) 使用基因表達譜、PCR、DNA探針、或免疫測定檢測生物樣品中FGFR1OP2-FGFR1融合蛋白或編碼FGFR1OP2-FGFR1融合蛋白的基因；以及 c) 如果該生物樣品表現出升高的FGFR1OP2表達水平或者存在FGFR1OP2-FGFR1融合蛋白或編碼FGFR1OP2-FGFR1融合蛋白的基因，則向該患者施用如上所述的呈游離或藥學上可接受的鹽形式的有效劑量的具有式 (I) 的化合物，例如化合物1。
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