TW202142253A

TW202142253A - 荷葉萃取物用於製備增加成人海馬齒狀回神經新生之醫藥組合物的用途

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Publication number: TW202142253A
Application number: TW109115040A
Authority: TW
Inventors: 王朝鐘; 張宴綾
Original assignee: 中山醫學大學
Priority date: 2020-05-06
Filing date: 2020-05-06
Publication date: 2021-11-16
Also published as: TWI800726B

Abstract

本發明係一種荷葉萃取物用於製備增加成人海馬齒狀回神經新生之醫藥組合物的用途。

Description

荷葉萃取物用於製備增加成人海馬齒狀回神經新生之醫藥組合物的用途

本領域係一種荷葉萃取物用於製備增加成人海馬齒狀回神經新生之醫藥組合物的用途。

海馬迴(hippocampus)，又稱為海馬體，位於脊椎動物的大腦顳葉內側(medial temporal lobe)且成對出現於大腦左右兩側半球，被稱作海馬區(hippocampal region)的大腦邊緣系統一部分，海馬區可分為：齒狀回(dentate gyrus,DG)、海馬(cornu ammonis,CA1-4)、下托(subiculum)、前下托(presubiculum)、傍下托(parasubiculum)、內嗅皮質(entorhinal cortex,EC)等區域組成。海馬迴主要掌管學習、短期記憶、長期記憶、情緒行為及空間定位等認知能力，許多研究表明記憶會先快速於海馬迴形成短期記憶(short-term memory)，再逐漸整合至大腦皮質形成長期記憶(long-term memory)並儲存起來。海馬迴在形成記憶的過程中扮演至關重要的角色，若能維持海馬迴中神經細胞的數量，將有機會減緩老年或創傷後所導致的神經退化情形。

失智症(dementia)是一種廣泛的腦部疾病，會導致長期的思考能力和記憶力逐漸下降，嚴重到足以影響日常功能。患者出現的認知功能障礙包括：記憶與學習功能、注意力、語言功能、知覺、空間、動作整合功能、推理、計算、組織和規劃等執行功能、障礙或社交認知功能等。其病因簡單分為腦部神經退化疾病引起之失智症、血管性失智症及其他續發性失智症。大部分患者都是屬於退化性失智症，其中包括阿茲海默症(Alzheimer’s Disease)、額顳葉失智症(Frontotemporal dementia)、路易體失智症(Dementia with Lewy bodies)、帕金森氏症(Parkinson's disease)或亨汀頓症(Huntington's disease)引起的失智症等，另一種為血管性失智症，主要是因腦中風或是慢性腦血管病變造成腦部血液循環不良而導致腦細胞死亡造成智力減退。除了上述兩類之外，還有其他因素導致之失智症，經過治療之後可能有機會可以恢復，這類型失智症的病因包括營養失調、顱內病灶、新陳代謝異常、中樞神經系統感染、中毒或其他因素所引起。

神經退化疾病(Neurodegenerative diseases)

神經退化疾病是個緩慢的病變過程，涉及遺傳與非遺傳之環境因素，隨著年齡增長，腦部結構與功能也會隨之改變，目前全球最常見的神經退化疾病為阿茲海默症(Alzheimer’s disease)與帕金森氏症(Parkinson’s disease)。

阿茲海默症為最常見且不可逆的漸進式神經退化疾病，患者會有記憶力衰退、認知障礙、情緒波動、喪失方向感及最終譫妄等症狀，至今仍無有效的治療方法。阿茲海默症主要病理特徵為神經細胞外出現β-澱粉樣蛋白斑(β-amyloid plaques)以及神經細胞內出現神經元纖維纏結 (neurofibrillary tangles,NFTs)。β-澱粉樣蛋白(amyloid beta，簡稱Aβ)是神經細胞脂肪膜內的大分子蛋白質，會凝結形成具有黏性的蛋白小塊，並逐漸累積形成斑塊，而蛋白小塊會干擾細胞與細胞間之神經突觸信號，進而導致神經元過度興奮(neuronal hyperexcitability)及神經網絡異常(aberrant neuronal network activity)之情形，造成學習與記憶損害。神經元纖維纏結主要是因Tau蛋白過度磷酸化導致微小管(microtubule)扭曲變形，堆積在細胞內而產生，會損傷神經元運輸系統，導致漸進性的神經退化，進而引發失智症(dementia)。而阿茲海默症主要病徵除了β-澱粉樣蛋白斑(β-amyloid plaques)以及神經元纖維纏結外，亦會伴隨神經氈線(neuropil threads)、營養不良性神經突(dystrophic neurites)、星狀細胞及小膠質細胞NF-κB激活等情形，導致神經細胞功能喪失、死亡，而這些病徵通常始於內側顳葉的異源皮質區(allocortex of the medial temporal lobe)，即內嗅皮質區(entorhinal cortex)與海馬迴(hippocampus)，進而影響其他與其連接的皮質區，因此對於主要感覺區、運動區及視覺區的影響相對較小。

帕金森氏症為全球第二常見的漸進式神經退化疾病(progressive neurodegenerative)，好發於60歲以上的老年人，病人會出現震顫(tremor)、肌肉僵硬(muscular rigidity)、行動緩慢(bradykinesia)、步伐異常(postural abnormality)、疲乏(fatigue)、嗅覺衰退(hyposmia depression)及認知能力異常(cognitive problems)等症狀。帕金森氏症的主要病徵為α-突觸核蛋白(α-synuclein)蛋白錯誤摺疊堆積形成的路易氏體(Lewy body)沉積於黑質(substantia nigra)中，導致神經細胞失能。此外，有研究顯示α-synuclein的轉譯後修飾，例如：磷酸化、泛素化，會加速α-synuclein蛋白的聚集並產生神經毒性導致神經細胞死亡。黑質中的多巴胺神經元會分泌多巴胺至大腦中的基底核(basal ganglia)，當黑質緻密部(substantia nigra pars compacta,SNpc)之多巴胺神經元退化，會使得多巴胺(dopamine)分泌減少，此亦為帕金森氏症主要致病因素之一，多巴胺分泌量的減少，使得輸送至控制運動與平衡的紋狀體(striatum)之多巴胺不足，無法與乙醯膽鹼(acetycholine)維持平衡，因而出現運動障礙症狀。而PD症狀是在細胞凋亡70~80%以上才會出現。

肥胖與神經退化疾病

根據世界衛生組織(World Health Organization,WHO)於2016年的統計顯示，全球約有20億人有超重的情形，而肥胖會引發心血管疾病、第二型糖尿病、睡眠呼吸中止症、癌症等併發症，嚴重影響人們的健康，因此，WHO於1996年正式將肥胖列為慢性疾病。先前有研究顯示，過度肥胖者(BMI≧40)及糖尿病患者之認知能力會比一般人差，且罹患癡呆症的機率也較高。另一研究則顯示，肥胖小黑鼠(leptin-deficient mice)的體重比同為6週齡的小黑鼠多了兩倍，但其大腦卻比正常組的老鼠小了10%，且肥胖小鼠海馬迴中的細胞增生指標：磷酸化的組織蛋白(phosphohistone H3)及未成熟神經細胞分化指標：雙皮質素(doublecortin,DCX)表現量皆比正常小鼠低，因此可以得知肥胖會使得神經增生及分化能力大幅降低，然而，在此項研究中表明，肥胖並不會直接影響記憶、學習及認知能力，但以長期而言，神經增生及分化的能力降低，則會間接增加罹患神經退化疾病的可能性。

目前已經有許多研究發現高膽固醇血症(hypercholesterolemia) 與神經退化疾病息息相關，膽固醇代謝異常更是罹患阿茲海默症的重要危險因子之一。家族性高膽固醇血症(familial hypercholesterolemia)是一罕見的遺傳性疾病，患者因低密度脂蛋白接受器(low-density lipoprotein receptor,LDLr)之基因突變，血液中的LDL無法經由肝臟代謝，導致血液中膽固醇數值異常飆高，此現象除了會造成動脈粥狀硬化及心血管疾病外，亦會破壞成人海馬迴神經前驅細胞(neural progenitor cells,NPC)的增生並且影響認知能力。

成年神經新生(adult neurogenesis)

神經細胞是經由神經幹細胞及神經祖細胞依序分化所產生，過去認為神經細胞新生只發生在胚胎期及嬰幼兒期，之後個體便沒有神經新生現象，然而，於1967年，神經生物學家Joseph Altman在成年豚鼠(guinea-pig)之海馬迴中發現新生的神經細胞並首次提出成年哺乳類的大腦中亦有神經新生的想法，此結果在當時引起相當大的爭議，直到1981年，Fernando Nottebohm博士發現成熟雄性金絲雀控制唱歌的腦區：上纹狀體腹側尾核(Hyperstriatum ventral,pars caudal nucleus，簡稱HVc)及nucleus robustus archistriatalis(RA)，於春天時，其神經突觸數目皆會增加，且核區之大小與繁殖結束時期相比，分別會增加99%及76%，以學習並產生單一的新歌曲，當繁殖結束時，神經元數目及腦區大小亦會隨之降低，金絲雀則會產生多樣的歌曲，最終停止創作新歌，直到隔年的春天，雄性金絲雀又會產生新的神經元，並產生與前一年不同的歌曲。1983年，Nottebohm施打睪固酮至雌鳥身上後，成年母金絲雀之HVc具有神經新生及分化之現象且大小會增加為原來的兩倍，而原本不會唱歌的雌鳥會與雄鳥一樣開始唱歌，從而發現成年金絲雀腦部神經元具有自我回復青春(self-rejuvenation)之能力，並因此打破以往「動物一旦成年後，腦一輩子也不會改變」的法則。

時至今日，已有許多研究證實了成年神經新生及分化的兩個主要部位為海馬迴中齒狀回(dentate gyrus,DG)的亞顆粒區(subgranular zone,SGZ)以及側腦室(lateral ventricle)旁的腦室下區(subventricular zone,SVZ)。先前研究發現年輕成年大鼠(9~10週齡)的齒狀回一天約可新生9000個細胞且大部分的細胞會分化形成顆粒神經元(granule neurons)，並且存在8個月以上。除了在齧齒類動物發現成年神經新生的現象外，Maura Boldrini等科學家於2018年發表的結果顯示出成年人之海馬迴直到老年後(65歲以上)仍不斷保有神經新生的能力，他們收集28個死亡26小時內的健康人類海馬迴組織(年齡範圍涵蓋14~79歲)，利用免疫組織化學染色法及免疫螢光法觀察未成熟神經細胞標記蛋白：雙皮質素(doublecortin,DCX)、成熟神經元之神經核標記蛋白：NeuN及未成熟神經祖細胞(immature neural progenitor cells)標記蛋白：SOX2與Nestin於海馬迴的分布及表現量，結果顯示出靜態幹細胞庫(quiescent stem cell pool)、血管生成(angiogenesis)及神經可塑性(neuroplasticity)會隨著年齡上升而下降，但是海馬齒狀回面積與齒狀回中神經祖細胞、未成熟及成熟顆粒神經元及神經膠質之數目不管在哪個年齡層中皆沒有顯著的變化，因而證實成人海馬迴直至老年仍有神經新生的現象。

過去有研究更發現到人類海馬齒狀回每日約有700個新生的神經元，然而，新生的神經細胞並不會使腦區無止境的擴大，當腦細胞過多時會進行細胞程序性死亡(programmed cell death)，可能有助於成年哺乳動物之腦神經維持自我更新的能力。目前許多科學家認為，有些健康的老人並未隨其年齡增長而降低認知能力或是罹患神經精神疾病(neuropsychiatric disease)，主要是因為他們的海馬迴持續保有神經新生的能力，因此，如何有效增加成年神經新生並維持其存活率與功能，是減緩神經退化性疾病的重要議題。

人類神經母細胞瘤(SH-SY5Y)

SH-SY5Y細胞株為June L.Biedler於1970年從轉移至骨癌的腦神經母細胞瘤(metastatic bone tumor biopsy cell line,SK-N-SH)取出，並經由三次克隆所建立(SK-N-SH→SH-SY→SH-SY5→SH-SY5Y)，具懸浮型及貼附型兩種細胞生長型態，會表達酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase)、多巴胺β羥化酶(dopamine-β-hydroxylase)及多巴胺轉運體(dopamine transporter)，與多巴胺神經元(dopaminergic neurons)的特性相似，因此現今常被應用於神經科學的研究中。

神經新生相關蛋白和訊息傳遞路徑

雙皮質素(Doublecortin,DCX)為一種微管結合蛋白(microtubule-associated protein,MAP)，在大腦皮質發育的過程擔任neuronal dispersion與cortex lamination的關鍵蛋白，主要於神經元生成的前兩週表達，可用來識別神經前驅細胞(neuronal precursor cells)與早期遷移(migration)、分化(differentiation)的未成熟神經元，因此常被作為神經新生的重要指標。

神經元核蛋白(Neuronal nuclei,NeuN)又稱為RNA binding protein fox-1 homolog 3(Rbfox3)，只會專一表現在神經元的細胞核中，為一種對有絲***後的神經元具高度特異性之RNA結合蛋白，主要負責調控RNA的轉錄及神經元的剪接，並參與突觸生成與神經元分化，因此常被用來標記成熟神經元之神經核或有絲***後的神經元，而有些細胞並不會表達NeuN，例如：交感神經節細胞、視網膜感光細胞及齒狀核神經元等細胞。

巢蛋白(Nestin)為神經上皮幹細胞蛋白，屬於第六型中間纖維(intermediate filament)蛋白，主要在大腦發育過程中的神經幹細胞表達，當大腦發育成熟後，其表現量會急遽下降，而被神經纖維蛋白(neurofilament)取代。此外，Nestin亦會表達於許多不同組織、幹細胞或祖細胞中，例如：胰島、骨骼肌、衛星細胞、睾丸、毛囊、心臟及骨隨的非造血部份(non-hematopoietic fraction)等組織，目前常被當作神經上皮幹細胞或未成熟神經祖細胞的分子標記。另外，有研究顯示Nestin在許多惡性腫瘤中的表現量也很高，例如：骨肉瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤、黑色素瘤、胰腺癌及***癌，與膠質母細胞瘤的浸潤、腫瘤的血管新生及上皮及非上皮細胞瘤的擴散相關，因此亦常被視為侵襲性表徵(invasive phenotype)之分子標記。

腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)為中樞神經系統中最豐富的神經滋養因子(neurotrophin)，成熟的BDNF是由儲存於軸突或樹突的前驅BDNF(proBDNF)進行切割所形成，而成熟的BDNF會連接到肌鈣蛋白受體激酶B(tropomyosin receptor kinase B，TrkB)，並分別活化Ras/MAPK/ERK路徑、IRS-1/PI3K/AKT路徑及PLC/DAG/IP3路徑，最終增加磷酸化的CREB之表現量，以調節神經生長、分化及重塑。此外，在大腦缺血、低血糖症、神經毒性及麩胺酸神經系統過度活化 (glutamatergic hyperactivity)所導致的興奮性毒性(excitotoxicity)等有害情況下則具有神經保護功效。先前研究顯示BDNF的表現量在帕金森氏症、多發性硬化症及亨丁頓舞蹈症等神經退化性疾病中明顯較低，BDNF會刺激並調控神經幹細胞生成新的神經元以取代失去功能的神經元，因此，在學習與記憶方面扮演至關重要的角色。另外，研究亦發現海馬迴的萎縮會伴隨著腦源性神經營養因子分泌量減少以及出現失憶等情形。因此，若能有效增加患者腦中BDNF的分泌可以改善神經退化之情形。

荷葉(Nelumbo nucifera Leaf)

蓮花，學名Nelumbo nucifera Gaertn.。英文名East Indian Lotus。別名為蓮、蓮花、芙蕖、芙蓉、菡萏、荷花、莩蕖、水芝、澤芝、水芙蓉、玉華，屬於蓮科(Nelumbonaceae)蓮屬(Nelumbo)蓮種(N.nucifera)，二名法為Nelumbo nucifera。荷花為多年生草本挺水植物，常生於水澤、池塘、湖沼或水田內，野生或栽培，其地下莖肥大而長，有節，即為蓮藕，其葉大而圓，直徑約30~60公分，上面呈現暗綠色，下側則為淡綠色，其花於夏日開紅、黃或白色的花，而花托呈現倒三角形，即為蓮蓬。

荷花之根、莖、葉、花、果實及種子皆含有生物鹼、類黃酮、糖苷及維生素等成分，具有抗氧化、抗發炎及降脂等功效。其中荷葉中含有生物鹼、類黃酮、維生素C、酒石酸、草酸、琥珀酸、三萜、醣苷、鞣質及多酚等成分，具有抗氧化、抗發炎、抗癌、抗、抗真菌、降血脂及降血糖等多重功效。荷葉含有多種生物鹼(alkaloids)，其中荷葉鹼(nuciferine)與N-去甲荷葉鹼(N-nornuciferine)為荷葉中兩個主要的生物鹼，許多研究指出生物鹼能抑制脂肪分化及胰脂酶，生物鹼亦能透過抑制酪氨酸酶 (tyrosinase)及酪氨酸酶相關蛋白2(tyrosinase-related protein-2)之表現量進而降低黑色素生成。除此之外，生物鹼亦有抗發炎、抗氧化、抗癌、抗老化、降低血糖及高血壓等多重藥理活性。近年來更有研究指出，生物鹼可以執行抗氧化、增加γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid，GABA)濃度、降低β-澱粉樣蛋白(β-amyloid)沉澱與α-突觸核蛋白(α-synuclein)聚集、抑制單胺氧化酶(monoamine oxidase)及乙醯膽鹼水解酶(acetylcholinesterase)活性等功能來減緩阿茲默症、帕金森氏症及亨丁頓舞蹈症等神經退化疾病。

過去研究顯示出荷葉中主要含有荷葉苷、聚合前花青素、槲皮素、異槲皮苷等類黃酮成分可執行抗氧化、抗發炎等功效且能降低糖尿病神經病變所引起的腳步麻痺、痛楚等不適症狀。另外，荷葉中含有沒食子酸、咖啡酸、兒茶酸具有抗肥胖、抗發炎、抗氧化及抗癌等作用。先前研究中亦指出荷葉萃取物能有效減緩酒精性肝炎、糖尿病，並且可透過抑制PI3K/AKT/ERK路徑降低三陰性乳癌之血管新生及轉移。

現今人口老化已成為全球不容小覷的重要議題，隨著人類平均壽命的增加，人們罹患神經退化性疾病的比率亦與日俱增，其中，阿茲海默症及帕金森氏症之盛行率更是在老年人口中大幅增加，且會隨著年齡增長而有倍增的趨勢。美國疾病防治中心於2016年指出阿茲海默症已成為美國國人十大死因中之第六名，而台灣於2019年的統計中則發現65歲以上老年人口佔總人口比率高達14.9%，根據台灣失智症協會推估，截至民國154年，我國65歲以上失智人口數將成長為現今的2~3倍。神經退化疾病除了對患者造成生活上的不便外，病患及其家屬更要長期承受巨大的經濟與身心負擔，因此如何降低神經退化疾病之發生率已成為全球不容忽視的公共議題。

海馬迴在認知能力的調控中扮演至關重要的角色，其齒狀回亞顆粒區直至老年皆有成年神經新生(adult hippocampal neurogenesis,AHN)之現象，然而神經新生的發生率會隨年齡增長而降低，過去已有研究證實促進小鼠海馬迴神經新生及增加神經幹細胞增生與遷移之功效為改善神經退化性疾病。

根據本發明之另一方面，本發明揭示一荷葉萃取物透過促進一個體中海馬迴成年神經新生之用途，其中所述用途可用以預防或治療一個體罹患神經退化性疾病或失智症。

據此，本發明係為關於一種荷葉萃取物用於製備增加一個體中成人海馬齒狀回神經新生之用途，其中該荷葉萃取物組合為一荷葉水萃取物或一荷葉醇類萃取物。

根據本發明之一方面，其中該荷葉萃取物組合物係為一醫藥組合物或一食品組合物。

根據本發明之一方面，其中該醫藥組合物進一步包括一醫藥上可接受之載體、佐藥或賦形劑；於本發明的另一具體實施例中，該荷葉萃取物可用於製備一食品，該食品係選自由食物、飲料、保健食品和膳食補充物所組成之群組。

在一實施例中其中該荷葉萃取物為一荷葉水萃取物，其中該一荷葉水萃取物係將荷葉以水進行萃取所得者。於本發明的一個具體實施例中，該荷葉水萃取物係將乾燥的荷葉經磨碎後，經溶解、過濾、離心及冷凍乾燥方式獲得。在另一實施例中其中該荷葉萃取物為一荷葉醇類萃取物，其中該荷葉醇類萃取物係由上述之乾燥荷葉水萃取物以一醇類進行萃取所得者。

本文所用之術語「預防」係指遲延罹患疾病個體之症狀發作或減少疾病出現，「治療」表示緩解或改善感病個體之症狀。

本文所用之術語「個體」表示動物，尤其哺乳動物。在一較佳實施例中，術語「個體」表示「人類」。

本文所用之術語「有效劑量」係指活性成分單獨或與其他藥物組合使用以顯示具有促進小鼠海馬迴成年神經新生的作用，進而達到減緩或預防神經退化相關疾病。各動物間的有效劑量轉換係屬一般該領域者技藝人士根據習知知識可輕易換算。

在投予至小鼠時，荷葉水萃取物之有效劑量至少為約10g/kg；更佳地，荷葉水萃取物之有效劑量為約1g/kg至100g/kg。而在投予至人時，荷葉水萃取物之有效劑量至少為約1.1g/kg；更佳地，荷葉水萃取物之有效劑量為約0.11g/kg至11g/kg。

在投予至小鼠時，荷葉醇類萃取物之有效劑量至少為約1g/kg；更佳地，荷葉水萃取物之有效劑量為約0.1g/kg至10g/kg。而在投予至人時，荷葉水萃取物之有效劑量至少為約0.11g/kg；更佳地，荷葉水萃取物之有效劑量為約0.01g/kg至1.1g/kg。

本發明係為一荷葉萃取物可增加海馬迴DCX蛋白之表現量並且活化BDNF/TrkB/CREB訊息傳遞路徑，以促進小鼠海馬迴神經新生。

本發明之荷葉水萃取物的主要有效的成分如下：6.11±0.15μg/mg没食子酸(gallic acid)、7.42±0.69μg/mg兒茶素(catechin)、3.55±0.04 μg/mg菜豆苷(peltatoside),4.65±0.14μg/mg盧丁(rutin)、2.83±0.1μg/mg異槲皮苷(isoquercitrin)和8.81±0.18μg/mg槲皮素-3-0葡萄糖醛酸苷(miquelianin),0.75±0.05μg黃芪素(astragalin)等成分。

本發明之荷葉醇萃取物的主要有效成分如下：0.37±0.07μg/mg没食子酸(gallic acid)、24.8±1.84μg/mg兒茶素(catechin)、0.24±0.04μg/mg咖啡酸(caffeic acid)、0.55±0.08μg/mg ρ-香豆酸(ρ-coumaric acid)、1.30±0.23μg/mg阿魏酸(ferulic acid)、29.07±1.08μg/mg菜豆苷(peltatoside)、8.89±0.34μg/mg蘆丁(rutin)、50.65±1.24μg/mg異槲皮苷(isoquercitrin)、89.05±2.47μg/mg槲皮素-3-0葡萄糖醛酸苷(miquelianin)、3.43±0.24μg/mg黃芪素(astragalin)、1.20±0.18μg/mg荷葉鹼(nuciferine)、6.70±0.18μg/mg槲皮苷(quercitrin)、0.51±0.15μg/mg柚皮苷(naringenin)、4.7±0.14μg/mg橙皮素(hesperetin)等主要成分。

而根據此項用途，本發明提出一種荷葉萃取物組合用於增加一個體之成人海馬齒狀回神經新生之方法，其中該方法可用來預防或治療一個體罹患一退化性神經疾病或失智症。

根據本發明之一方面，其中該荷葉萃取物透過BDNF/TrkB/CREB訊息傳遞路徑促進該個體中成年海馬齒狀回神經新生。

在一實施例中，其中該個體罹患一退化性神經疾病，其中該退化性神經疾病為阿茲海默症或帕金森氏症。在另一實施例中其中該個體罹一患失智症。

圖1為在海馬齒狀回的亞顆粒區中具有DCX表現的神經組細胞染色結果。A、以200倍的放大倍數拍攝具有代表性的顯微照片。紅色箭頭指的為具有DCX表現的細胞。B、定量DCX陽性染色的強度。數據表示為平均值±標準差(n=6)，通過學生t檢驗進行統計分析，*表示該組與對照組相比其p值<0.05,**表示該組與對照組相比其p值<0.01。

圖2為在海馬齒狀回的亞顆粒區中具有NeuN表現的神經組細胞染色結果。A、以200倍的放大倍數拍攝具有代表性的顯微照片，箭頭指的為具有NeuN表現的細胞。B、定量NeuN陽性染色的強度。數據表示為平均值±標準差(n=6)，通過學生t檢驗進行統計分析，*表示該組與對照組相比其p值<0.05,**表示該組與對照組相比其p值<0.01。

圖3為在海馬齒狀回的亞顆粒區中具有PCNA表現的神經組細胞染色結果。A、以200倍的放大倍數拍攝具有代表性的顯微照片。紅色箭頭指的為具有PCNA表現的細胞。B、定量PCNA陽性染色的強度。數據表示為平均值±標準差(n=6)，通過學生t檢驗進行統計分析。*表示該組與對照組相比其p值<0.05,**表示該組與對照組相比其p值<0.01。

圖4為荷葉萃取物能增加小鼠血清中BDNF的表現量。數據表示為平均值±SD(n=6)，以one-way ANOVA進行統計分析，*表示該組與對照組相比其p值<0.05。

圖5為荷葉萃取物能增加小鼠海馬迴中DCX蛋白表現量。小鼠以荷葉水萃取物(10g/kg)或荷葉醇類萃取物(1g/kg)餵養14天後A.以西方墨點法偵測小鼠大腦海馬迴中DCX的表現量，β-actin表現量當陰性對照組。B.根據A的結果進行定量分析，數據表示為來自3次獨立實驗的平均值±SD，以one-way ANOVA進行統計分析，與對照組相比* p<0.05。

圖6為荷葉萃取物活化BDNF/TrkB/p-CREB訊息傳遞路徑促使海馬迴新生。小鼠以荷葉水萃取物(10g/kg)或荷葉醇類萃取物(1g/kg)餵養14天。A.以西方墨點法偵測小鼠大腦海馬迴中BDNF、TrkB和CREB的蛋白質表現，β-actin表現量當作陰性對照組。B.根據A的結果進行定量分析，數據表示為來3次獨立實驗的平均值±SD，以one-way ANOVA進行統計分析，*表示該組與對照組相比其p值<0.05。

圖7為荷葉醇類萃取物對於SH-SY5Y細胞存活測試。將SH-SY5Y細胞與不同濃度的荷葉醇類萃取物在96孔盤中作用24小時，並透過MTT測定法分析細胞存活率。數據表示為每次處理三個重複的平均值±SD，並用學生t檢驗進行統計學分析，*表示該組與對照組相比其p值<0.05。

圖8為荷葉醇類萃取物對於SH-SY5Y細胞增生測試。將SH-SY5Y細胞與不同濃度的荷葉醇類萃取物和BrdU在96孔盤中作用24小時，透過BrdU測定法分析細胞增生率。數據表示為每次處理三個重複的平均值±SD，並用學生t檢驗進行統計學分析，*表示該組與對照組相比其p值<0.05。

圖9為荷葉醇類萃取物促進SH-SY5Y細胞中DCX的表現。將SH-SY5Y細胞與不同濃度的荷葉醇類萃取物中作用24小時。A.以西方墨點法偵測SH-SY5Y細胞中DCX蛋白質的表現量，β-actin表現量當作陰性對照組。B.根據A的結果進行定量分析，數據表示為來自3次獨立實驗的平均值±SD，以學生t檢驗進行統計學分析，*表示該組與對照組相比其p值<0.05。

藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明實際應用範圍，僅為本發明之較佳實施例，而非限制本發明的範圍。故，凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的改變與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。

實驗材料與方法

荷葉萃取物之製備

荷葉水萃取物之製備：將荷葉進行冷凍乾燥，冷凍後低溫低壓抽乾水分，於4℃下以研磨機研磨成粉，置於-20℃冷凍櫃中保存。欲進行萃取時，秤取100g乾燥荷葉粉末並加入3000mL二次水，攪拌均勻後於4℃浸放一小時，之後以抽氣過濾法過濾粗渣，收集濾液，並以超速冷凍乾燥製成荷葉水萃取物(Nelumbo nucifera leaves water extract,NLWE)。

荷葉水萃取物的主要有效的成分如下：6.11±0.15μg/mg没食子酸(gallic acid)、7.42±0.69μg/mg兒茶素(catechin)、3.55±0.04μg/mg菜豆苷(peltatoside),4.65±0.14μg/mg盧丁(rutin)、2.83±0.1μg/mg異槲皮苷(isoquercitrin)和8.81±0.18μg/mg槲皮素-3-0葡萄糖醛酸苷(miquelianin),0.75±0.05μg黃芪素(astragalin)等成分。

荷葉醇類萃取物之製備：秤取100g乾燥荷葉水萃物，加入500毫升甲醇於50℃水浴萃取3小時，再以抽氣過濾法過濾，收集濾液，並反覆萃取3~5次。接著利用減壓濃縮法將萃取後的濾液進行乾燥。乾燥後的萃取物藉由500毫升二次去離子水回溶，接著加入200毫升正己烷(n-hexane)並以分液漏斗均勻混合兩溶液，進行移除色素作用，靜置隔夜後，收集水層溶液，再加入180乙酸乙酯(ethyl acetate)萃取水層中之成分，混合均勻並靜置隔夜，收集上層溶液，並重複萃取3~5次，再以減壓濃縮法去除乙酸乙酯，最後溶於20毫升二次去離子水並進行真空冷凍乾燥，所得之粉末即為荷葉醇類萃取物(Nelumbo nucifera leaves alcoholic extract,NLAE)，置於-20℃冰箱保存。在進行細胞實驗之前，須將粉末溶於50%酒精溶液後進行無菌過濾。進行高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)進行荷葉醇類萃取物分析，結果顯示每毫克的荷葉醇類萃取物含有0.37±0.07μg没食子酸(gallic acid)、24.8±1.84μg兒茶素(catechin)、0.24±0.04μg咖啡酸(caffeic acid)、0.55±0.08μg ρ-香豆酸(ρ-coumaric acid)、1.30±0.23μg阿魏酸(ferulic acid)、29.07±1.08μg菜豆苷(peltatoside)、8.89±0.34μg蘆丁(rutin)、50.65±1.24μg異槲皮苷(isoquercitrin)、89.05±2.47μg槲皮素-3-0葡萄糖醛酸苷(miquelianin)、3.43±0.24μg黃芪素(astragalin)、1.20±0.18μg荷葉鹼(nuciferine)、6.70±0.18μg槲皮苷(quercitrin)、0.51±0.15μg柚皮苷(naringenin)、4.7±0.14μg橙皮素(hesperetin)等主要有效成分。

動物的飼養和分組：選購國家實驗動物中心5週齡的雄性C57BL/6小黑鼠，共計，購入時之小鼠體重約為20克，飼養於中山醫學大學實驗動物中心，生活週期為光照12小時、黑暗12小時，光照時間為早上6時至下午6時，溫度維持於室溫22±2℃，濕度則為60±5%。將36隻小鼠養至16週齡後進行隨機分組。主要分為控制組、藥物組(包含：荷葉水萃取物組(劑量為每公斤重量餵食10g NLWE)或荷葉醇類萃取物組(劑量為每公斤重量餵食1g NLAE)。控制組動物餵食一般飼料，藥物組則將荷葉水萃取物或荷葉醇類萃取物拌入一般飼料中供小鼠食用。動物經14天的餵藥處理後，以高壓桶裝二氧化碳將動物安樂死，進行心臟採血。利用PBS進行灌流洗去老鼠全身血液，待小鼠血液洗淨後，每一組再取6隻小鼠利用4%多聚甲醛(paraformaldehyde)灌流進行前固定，待固定完畢後取下小鼠大腦以利後續進行組織免疫染色和觀察海馬齒狀回中DCX、NeuN和PCNA的分布及表現量。而每組之另外6隻小鼠則是在PBS灌流結束後取新鮮海馬迴組織進行西方墨點法，觀察DCX、BDNF、TrkB和p-CREB等蛋白表現量。

免疫組織化學染色法：將小鼠大腦進行石蠟包埋，以3μm連續切片，切完後放入38℃的水中，使其完全伸展，再將切片置於有蛋白：甘油為1：1的玻片中央，並於38℃之乾燥檯上烘乾。以65~70℃烘箱30分鐘，以100%二甲苯脫蠟3次，每次5分鐘，待脫蠟完畢則以高濃度到低濃度之酒精進行回水，依序為100%、95%、80%、75%和二次去離子水，各5分鐘。將回水後的玻片置於檸檬酸溶液(0.01M,pH=6)隔水加熱至100℃持續20分鐘進行抗原回復，待冷卻後，以含有0.1% Tween 20的PBS溶液(PBST)清洗3次，再以DAB(3,3’-Diaminobenzidine)呈色劑抑制劑反應10分鐘，反應完畢後加入欲偵測蛋白的一級抗體，於37℃之濕潤的避光盒中作用1小時，再以PBST清洗3次，接著用過氧化物酶多聚體(horseradish peroxidase multimer)於室溫處理20分鐘，以PBST清洗3次，並加入等比例的DAB呈色劑和DAB過氧化氫(1：1)約1分鐘使組織呈色，以二次去離子水清洗5分鐘。利用蘇木素(hematoxylin)作背景染色30秒，以二次去離子水洗淨多餘染劑後，即可用濃度低到高的酒精脫水(依序為70%、80%、95%、和100%酒精)各5分鐘，最後浸入二甲苯後，以封片膠進行封片。

BDNF定量分析：利用酵素連結免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)進行BDNF定量，根據購買BDNF ELISA試劑盒(ab212166,abcam)之產品說明進行以下實驗。首先，加入50μl之小鼠血清至中欲測的孔盤內，再加入50μl抗體組合(antibody cocktail)，將盤子密封置於搖動器上，於室溫反應1小時。待反應完成後以350μl清洗緩衝液PT(wash buffer PT)清洗3次，清洗後去除多餘的液體，加入100μl TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)受質，置於搖動器上，於室溫避光反應10分鐘，再加入100μl終止溶液，置於搖動器上，於室溫反應1分鐘，並以酵素免疫分析儀在波長450nm下測定吸光值。同時以人類BDNF標準品來製作標準曲線，並計算小鼠血清中BDNF的含量，結果單位以pg/ml表示。

本研究採用人類神經母細胞瘤SH-SY5Y所建立的細胞模式，觀察荷葉萃取物促進神經增生之功效。

培養方法：SH-SY5Y細胞株培養於含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、1.5g/l碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)、2mML-谷氨酰胺(L-glutamine)、1mM丙酮酸鈉(sodium pyruvate)、0.1mM非必需氨基酸溶液(non-essential amino acids solution,NEAA)及1mM三合一的抗生素(Pencillin/Streptomycin/Amphotericine B,PSA)的Dulbecco的改良Eagle中高葡萄糖培養液中(Dulbecco's Modified Eagle Medium-High glucose,pH 7.2-7.4)並置於溫度37℃、溼度95%且含5% CO₂的細胞培養箱培養，每2~3天換一次新鮮培養基，直到細胞長至約8~9分滿後進行繼代培養。

繼代培養：當細胞長至8~9分滿後，移除舊有的培養液，用5ml磷酸鹽緩衝鹽水(phosphate buffer saline，PBS)清洗細胞1~2次後移除PBS，接著加入2ml 0.5%胰蛋白酶-EDTA緩衝液於37℃反應數分鐘後，輕拍培養瓶使細胞自培養瓶脫落，再加入3ml的培養液終止胰蛋白酶的作用，將打下來的細胞移至離心管，以每分鐘為1000的轉速(1000rpm)進行離心5分鐘，去除上清液並加入2ml新鮮培養液將細胞均勻打散之後，取1ml的細胞加入含9ml新鮮培養液之培養瓶中繼續培養。

細胞存活率分析

MTT分析法是一種用於測量細胞存活率之試。MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)是一可以接受氫離子的黃色染料，會作用於細胞粒線體中的呼吸鏈上，原理為活細胞粒腺體中的琥珀酸脫氫酶(succinate dehydro genase,SDH)和細胞色素C(cytochrome C)可將MTT的四氮唑環(tetrazolium bromide)還原成藍紫色的甲

(formazan)結晶，並沉積於細胞中。而死亡細胞的SDH會消失，無法將MTT代謝還原，因此，藉由偵測吸光值可得知細胞還原MTT的能力，以推測細胞存活率。

將SH-SY5Y種於96孔盤(1×10⁴細胞/孔)中培養24小時，接著處理不同濃度之荷葉醇類萃取物(0,25,50,100μg/mL)。處理24小時候，將舊有培養液移除，加入含0.5mg/ml MTT之培養液，反應4小時後移除培養液，加入200μl異丙醇(isopropanol)將結晶溶出，利用酵素免疫分析儀讀取波長563nm的吸光值，以觀察細胞存活率。

細胞增殖分析

溴脫氧尿嘧啶(bromodeoxyuridine,BrdU)是一種合成的核苷，為胸腺嘧啶核苷(thymidine)的類似物，於DNA複製時會與thymidine競爭結合至新合成的DNA中，透過免疫化學方法以可偵測BrdU的抗體檢測標記在 DNA上的BrdU，因此，可用於偵測細胞之增殖能力。本研究所使用之BrdU細胞增殖分析套組選購自Merck Millipore QIA58並根據該產品操作手冊進行以下實驗。

將SH-SY5Y種於96孔盤中(1×10⁴細胞/孔)培養24小時，接著加入180μL不同濃度之荷葉醇類萃取物(0,25,50,100μg/ml)和20μl BrdU，作用24小時候，移除上清液後加入200μl固定/變性溶液(Fixative/Denaturing solution)於25℃靜置30分鐘，移除內容物，加入100μl anti-BrdU抗體(依1：2000的比例進行稀釋)於25℃靜置1小時，移除內容物，以wash buffer清洗3次後加入200μl過氧化物酶山羊抗小鼠IgG(依1：2000的比例進行稀釋)於25℃反應30分鐘，移除內容物，以清洗溶液(wash buffer)清洗3次後再以去離子水流動清洗後加入100μl受質溶液(substrate solution)，於25℃下避光靜置15分鐘，最後加入100μl終止溶液(stop solution)終止反應，於30分鐘內利用酵素免疫分析儀讀取波長450nm的吸光值，以觀察細胞增生情形。

免疫墨點法

動物海馬迴組織蛋白萃取：取小鼠左右兩側海馬迴，加入150μL蛋白質裂解液(本研究使用RIPA buffer來做為蛋白質裂解液，其中包括了50mM NaCl,0.5% Deoxycholic acid,50mM Tris-Base,1% NP-40,1% SDS,10μg/mL PMSF,10μg/mL Leupeptin,1% Protease inhibitor,Phosphatase inhibitor,pH7.5)至玻璃試管中，以研磨機於冰上磨5分鐘，再利用4℃超高速離心機12,000rpm離心20分鐘，吸取上清液至新的小管並放置於-20℃保存，此即動物海馬迴組織蛋白。

細胞蛋白萃取：將SH-SY5Y培養於75T培養瓶(2.37×10⁶細胞/瓶)24小時，接著處理不同濃度之荷葉萃取物(0,25,50,100μg/mL)24小時後，以PBS洗兩次後，加入2mL trypsin將細胞打下來，並以3mL培養液中和trypsin，再以1000rpm離心5分鐘，去除上清液，以PBS清洗1次，1000rpm離心5分鐘，去除PBS後，加入100μL蛋白質裂解液(RIPA buffer)，於冰上以研磨機磨3分鐘，再利用4℃超高速離心機12,000rpm離心20分鐘，吸取上清液至新的eppendorf，此即細胞蛋白液，並放置於-20℃保存。

將各組的海馬迴組織或細胞蛋白質萃取物進行蛋白質定量，根據定量的結果將各組稀釋成相同濃度，加入5倍樣品緩衝液(5x sample buffer)混合均勻，並置於100℃加熱10分鐘。將上述欲分析的蛋白質檢體進行蛋白質電泳，接著透過蛋白質轉漬將膠體上的蛋白質轉漬到硝化纖維膜。將該硝化纖維膜以5%脫脂牛奶於室溫反應1小時以阻斷非特異性抗原結合；之後，加入一級抗體於4℃作用一晚後，以PBST清洗3次(5分鐘/次)，再加入二級抗體室溫下作用1小時，再以PBST清洗3次(5分鐘/次)後加入HRP呈色劑並於冷光儀下偵測訊號。

統計分析

動物實驗各指標的試驗結果先利用Sigma plot 10.0統計軟體進行分析。以one-way ANOVA進行分析，且以Duncan’s Multiple Range Test比較控制組與實驗組之間是否具統計顯著差異(p<0.05)。細胞實驗的試驗結果以Student’s t test比較各組別間之差異，當p<0.05時表示具有統計顯著差異。

實驗結果

NLWE及NLAE對小鼠海馬齒狀回SGZ神經新生之影響

為了觀察荷葉萃取物是否能促進小鼠齒狀回SGZ神經新生，在小鼠犧牲後，取其海馬迴並利用免疫化學組織染色法，觀察未成熟神經元分化之指標蛋白(DCX)、成熟神經元之神經核指標蛋白(NeuN)、細胞增生指標(PCNA)。結果顯示，控制組之海馬齒狀回SGZ幾乎沒有DCX及PCNA的表現，只有少量的NeuN表現，而餵食荷葉萃取物的組別，其海馬齒狀回SGZ之DCX、NeuN及PCNA表現量皆顯著比控制組多，尤其是餵食NLAE後，DCX、NeuN及PCNA表現量增加之情形更為顯著。由上述結果得知荷葉水萃取物(NLWE)和荷葉醇類萃取物(NLAE)皆能有效促進C57BL/6小鼠海馬齒狀回SGZ之神經新生(圖1-3)。

NLWE及NLAE對小鼠血清BDNF含量之影響

BDNF是大腦中主要的神經滋養因子，主要表現於海馬迴、小腦及大腦皮質中，在長期記憶的形成中扮演重要的角色。根據過去研究可得知BDNF能夠促進大腦神經細胞突觸的形成、增加突觸可塑性、促進神經幹細胞的增生與分化以及抵抗氧化發炎等有害因子對大腦的傷害，因此本研究欲進一步探討NLWE和NLAE是否能透過增加BDNF的分泌，以促進海馬迴神經新生。結果顯示出相對於控制組，餵食NLWE或NLAE小鼠的血清中BDNF含量有顯著的增加(p<0.05)且NLAE組之增加幅度比NLWE組更為顯著。由此結果可得知，餵食NLWE及NLAE皆能有效提升BDNF的分泌量(圖4)。

NLWE及NLAE對小鼠海馬迴神經新生相關蛋白之影響

根據先前研究顯示出DCX為未成熟神經元分化的重要指標，而 BDNF/TrkB/p-CREB訊息傳遞路徑可調節神經生長、分化及重塑，因此本研究以西方墨點法觀察小鼠海馬迴中神經新生相關蛋白之表現，以進一步分析荷葉萃取物(NLWE、NLAE)促進神經新生之機制。結果顯示出餵食NLWE及NLAE組別的小鼠海馬迴中DCX、BDNF、TrkB、p-CREB的蛋白質表現量皆比控制組來得高，特別是餵食NLAE組別的結果更為顯著(圖5-6)，因此根據上述實驗結果得知NLWE和NLAE能透過增加DCX蛋白表現量、活化BDNF/TrkB/CREB訊息傳遞路徑，以促進小鼠海馬迴神經新生。

NLAE對人類神經母細胞瘤SH-SY5Y之毒性試驗

為確保所使用的NLAE劑量不會造成SH-SY5Y細胞死亡，本實驗將SH-SY5Y細胞種於96孔盤(1×10⁴cells/well)，培養24小時之後，以不同濃度之NLAE(0,25,50,100μg/mL)進行作用24小時，接著以MTT assay分析細胞存活率。結果顯示出高濃度之NLAE(100μg/mL)不會造成SH-SY5Y細胞存活率下降，然而與控制組相比，處理NLAE組別的細胞存活率反而有顯著增加的趨勢，並且會隨著藥物濃度增加而遞增。由上述結果可得知，本實驗所選用NLAE的劑量皆不會造成細胞死亡，反而有促進細胞增生的趨勢(圖7)。

NLAE對人類神經母細胞瘤SH-SY5Y之增生試驗

為了評估NLPE促進SH-SY5Y增生之作用，將SH-SY5Y細胞種於96孔盤(1×10⁴cells/well)培養24小時。接著同時加入不同濃度之NLAE(0,25,50,100μg/ml)和BrdU於細胞中進行24小時的作用並以BrdU細胞增生套組偵測，結果顯示出處理NLAE組別的細胞增生之情形與控制組相比有顯著增加的趨勢，且其增生能力會隨著濃度上升而更為顯著，因此證明了 NLAE能有效促進SH-SY5Y細胞增生(圖8)。

NLAE對促進SH-SY5Y神經新生相關蛋白之影響

由上述細胞增殖分析之結果得知NLAE有效促進SH-SY5Y細胞增生，因此進一步分析神經新生相關蛋白的表現量來證實其促進增生之機制。將SH-SY5Y培養於75T培養瓶(2.37×10⁶細胞/瓶)24小時，以不同濃度之NLAE(0,25,50,100μg/ml)作用24小時，接著以西方墨點法觀察神經新生相關蛋白之表現，結果顯示出SH-SY5Y處理NLAE後，其未成熟神經元分化指標蛋白DCX之表現量比控制組高且增加幅度隨劑量上升而更為顯著，由上述實驗可得知NLAE可透過增加DCX之表現，來促進SH-SY5Y神經新生作用(圖9)。

Claims

一種荷葉萃取物用於製備促進一個體中成年海馬齒狀回神經新生之一組合物的用途，其中該荷葉萃取物為一荷葉水萃取物或一荷葉醇類萃取物。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該荷葉萃取物透過活化BDNF/TrkB/CREB訊息傳遞路徑促進成年海馬齒狀回神經新生。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組合物係為一醫藥組合物或一食品組合物。
如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該醫藥組合物用於預防或治療一退化性神經疾病。
如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該退化性神經疾病為阿茲海默症或帕金森氏症。
如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該醫藥組合物用於預防或治療失智症。
如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該食品組合物係為食物、飲料、保健食品和膳食補充物。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該個體為人類。
如申請專利範圍第8項所述之用途，該荷葉水萃物之每一天之投予量為0.11-11g/kg。
如申請專利範圍第8項所述之用途，該荷葉多酚萃取物之每一天之投予量為0.01-1.1g/kg。