TW202136509A - 用於基因編輯之經修飾引導rna - Google Patents

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美商英特利亞醫療公司
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Abstract

本發明係關於在基因編輯方法中具有改良之活體外及活體內活性的經修飾引導RNA。

Description

用於基因編輯之經修飾引導RNA
本發明係關於使用CRISPR/Cas系統(識別且切割外源性遺傳元件之原核免疫系統之一部分)進行基因編輯的領域。CRISPR/Cas系統依賴於稱為CRISPR相關蛋白質9 (Cas9)之單一核酸酶，其於DNA中誘發位點特異性斷裂。Cas9藉由稱為引導RNA (gRNA)之小RNA分子引導至特定DNA序列。完整引導RNA包含tracrRNA (trRNA)及crisprRNA (crRNA)。包含引導區的crRNA亦可稱為gRNA，應理解為了形成完整gRNA，其應為trRNA或與trRNA共價或非共價締合。trRNA及crRNA可包含於單引導RNA (sgRNA)內或雙引導RNA (dgRNA)之兩個獨立RNA分子中。Cas9與trRNA及crRNA或sgRNA的組合稱為Cas9核糖核蛋白複合物(RNP)。
寡核苷酸及尤其RNA有時在細胞及血清中藉由非酶性的核酸內切酶或核酸外切酶裂解而降解。可在各種位置進行修飾以減少或防止此類降解來合成寡核苷酸。鑒於寡核苷酸合成之循環性質及不完美產率，縮短gRNA同時保持或甚至改良其活性將為所需的，例如以使得可以較高產率獲得gRNA，及/或包含gRNA之組合物具有較大均勻性及/或較少不完全或不正確產物。另外，需要用於預防此類降解、改良gRNA之穩定性且增強基因編輯效率之改良方法及組合物，尤其用於治療應用。
在一些實施例中，提供基因組編輯工具，其包含具有如本文所描述之一或多個縮短區及/或取代之引導RNA (gRNA)。本文所描述之縮短區或取代可有助於以更高產率及/或均勻性合成gRNA，及/或可改良gRNA及gRNA/Cas9複合物之穩定性且改良Cas9 (例如SaCas9、SpyCas9及等效物)裂解目標DNA之活性。
在一些實施例中，提供具有如本文所描述之一或多個縮短區及/或取代之crisprRNA (crRNA)及/或tracrRNA (trRNA)。在一些實施例中，經修飾之crRNA及/或經修飾之trRNA包含雙引導RNA (dgRNA)。在一些實施例中，經修飾之crRNA及/或經修飾之trRNA包含單引導RNA (sgRNA)。本文所描述之縮短區及/或取代可有助於以更高產率及/或均勻性合成gRNA，及/或可改良gRNA及gRNA/Cas9複合物之穩定性且改良Cas9 (例如SauCas9、SpyCas9及等效物)裂解目標DNA之活性。相較於100mer sgRNA或其他短引導RNA，本發明所揭示之引導RNA之合成可增加引導RNA之粗產率。類似地，如藉由全長產物之比例所量測之gRNA樣本純度(例如粗純度)可增加。gRNA可以較高產率獲得，及/或包含gRNA之組合物可具有較大均勻性及/或較少不完全或不正確產物。引導RNA純度可使用離子對反相高效液相層析法(IPRP-HPLC)及離子交換HPLC方法評定，例如與Kanavarioti等人，Sci Rep 9, 1019 (2019) (doi:10.1038/s41598-018-37642-z)中相同。使用波長為260 nm之UV光譜法，可藉由層析圖中之主峰之吸光度與所有峰之累積吸光度的比率測定粗純度及最終純度。合成產率係以最終樣本在260 nm下之吸光度與輸入材料之理論吸光度的比率測定。
涵蓋以下實施例。 實施例1係一種引導RNA (gRNA)，其包含5'端修飾或3'端修飾及gRNA之保守部分，該保守部分包含以下中之一或多者： (a)經縮短髮夾1區或經取代且視情況經縮短髮夾1區，其中(i)經縮短髮夾1區缺乏6至8個核苷酸；及(A)位置H1-1、H1-2或H1-3中之一或多者相對於SEQ ID NO: 400缺失或經取代，及/或(B)位置H1-6至H1-10中之一或多者相對於SEQ ID NO: 400經取代；或(ii)該經縮短髮夾1區缺乏9至10個核苷酸，包括H1-1及/或H1-12；或(iii)該經縮短髮夾1區缺乏5至10個核苷酸且位置N18、H1-12或N中之一或多者相對於SEQ ID NO: 400經取代；或(iv)以下核苷酸對中之至少一者在經取代及視情況經縮短髮夾1中經華特生-克里克(Watson-Crick)配對核苷酸取代：H1-1及H1-12、H1-2及H1-11、H1-3及H1-10、及/或H1-4及H1-9，及該髮夾1區視情況缺乏(aa) H1-5至H1-8中之任一者或兩者，(bb)以下核苷酸對中之一者、兩者或三者：H1-1及H1-12、H1-2及H1-11、H1-3及H1-10、及/或H1-4及H1-9，及/或(cc)該髮夾1區之1至8個核苷酸；及/或 (b)經縮短上莖區，其中該經縮短上莖區缺乏1至6個核苷酸；及/或 (c)在LS6、LS7、US3、US10、B3、N7、N15、N17、H2-2及H2-14中之任一者或多者處相對於SEQ ID NO: 400的取代，其中取代基核苷酸既不為隨後為腺嘌呤之嘧啶，亦不為在嘧啶之前的腺嘌呤。 實施例1.01為如實施例1之gRNA，其中髮夾1區為經取代之髮夾1區且缺乏1個核苷酸。 實施例1.02為如實施例1之gRNA，其中髮夾1區為經取代之髮夾1區且缺乏2個核苷酸。 實施例1.03為如實施例1之gRNA，其中髮夾1區為經取代之髮夾1區且缺乏3個核苷酸。 實施例1.04為如實施例1之gRNA，其中髮夾1區為經取代之髮夾1區且缺乏4個核苷酸。 實施例1.05為如實施例1之gRNA，其中髮夾1區為經取代之髮夾1區且缺乏5個核苷酸。 實施例1.06為如實施例1之gRNA，其中髮夾1區為經取代之髮夾1區且缺乏6個核苷酸。 實施例1.07為如實施例1之gRNA，其中髮夾1區為經取代之髮夾1區且缺乏7個核苷酸。 實施例1.08為如實施例1之gRNA，其中髮夾1區為經取代之髮夾1區且缺乏8個核苷酸。 實施例1.09為如實施例1之gRNA，其中該gRNA包含經取代及視情況經縮短髮夾1，其中H1-1及H1-12經華特生-克里克配對核苷酸取代。 實施例1.10為如前述實施例中任一例之gRNA，其中該gRNA包含經取代及視情況經縮短髮夾1，其中H1-2及H1-11經華特生-克里克配對核苷酸取代。 實施例1.11為如前述實施例中任一例之gRNA，其中該gRNA包含經取代及視情況經縮短髮夾1，其中H1-3及H1-10經華特生-克里克配對核苷酸取代。 實施例1.12為如前述實施例中任一例之gRNA，其中該gRNA包含經取代及視情況經縮短髮夾1，其中H1-4及H1-9經華特生-克里克配對核苷酸取代。 實施例1.13為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-5缺失。 實施例1.14為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-6缺失。 實施例1.15為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-7缺失。 實施例1.16為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-8缺失。 實施例1.17為如前述實施例中任一例之gRNA，其中H1-5、H1-6、H1-7及H1-8中之兩者缺失。 實施例1.18為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-1與H1-12缺失。 實施例1.19為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-2及H1-11缺失。 實施例1.20為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-3及H1-10缺失。 實施例1.21為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-4及H1-9缺失。 實施例1.22為如前述實施例中任一例之gRNA，其中兩對之位置H1-1與H1-12、位置H1-2與H1-11、位置H1-3與H1-10及位置H1-4與H1-9缺失。 實施例1.23為如前述實施例中任一例之gRNA，其中三對之位置H1-1與H1-12、位置H1-2與H1-11、位置H1-3與H1-10及位置H1-4與H1-9缺失。 實施例2為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-1缺失。 實施例3為如實施例1至1.23中任一例之gRNA，其中位置H1-1經取代。 實施例4為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-2缺失。 實施例5為如實施例1至3中任一例之gRNA，其中位置H1-2經取代。 實施例6為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-3缺失。 實施例7為如實施例1至5中任一例之gRNA，其中位置H1-3經取代。 實施例8為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-4缺失。 實施例9為如實施例1至7中任一例之gRNA，其中位置H1-5缺失。 實施例10為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-6缺失。 實施例11為如實施例1至9中任一例之gRNA，其中位置H1-6經取代。 實施例12為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-7缺失。 實施例13為如實施例1至11中任一例之gRNA，其中位置H1-7經取代。 實施例14為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-8缺失。 實施例15為如實施例1至13中任一例之gRNA，其中位置H1-8經取代。 實施例16為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-9缺失。 實施例17為如實施例1至15中任一例之gRNA，其中位置H1-9經取代。 實施例18為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-10缺失。 實施例19為如實施例1至17中任一例之gRNA，其中位置H1-10經取代。 實施例20為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-11缺失。 實施例21為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-12缺失。 實施例22為如實施例1至7中任一例之gRNA，其包含缺乏6至8個核苷酸之經縮短髮夾1區。 實施例23為如前述實施例中任一例之gRNA，其中經縮短髮夾1區具有4個核苷酸之長度。 實施例24為如實施例1至22中任一例之gRNA，其中該經縮短髮夾1區具有5個核苷酸之長度。 實施例25為如實施例1至22中任一例之gRNA，其中該經縮短髮夾1區具有6個核苷酸之長度。 實施例26為如實施例23至25中任一例之gRNA，其中經縮短髮夾1區之4、5或6個核苷酸包括少於或等於2個取代。 實施例27為如實施例26之gRNA，其中經縮短髮夾1區之4、5或6個核苷酸包括一個取代基。 實施例28為如實施例26之gRNA，其中經縮短髮夾1區之4、5或6個核苷酸未經取代。 實施例29為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-2至H1-4缺失。 實施例30為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-2至H1-5缺失。 實施例31為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-9至H1-11缺失。 實施例32為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-8至H1-11缺失。 實施例33為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-2至H1-4及H1-9至H1-11缺失。 實施例34為如實施例33之gRNA，其中該經縮短髮夾1區包含： (a)序列AGAAAU； (b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或 (c)與(a)之序列具有小於或等於1個失配之序列。 實施例35為如實施例1至32中任一例之gRNA，其中位置H1-2至H1-5及H1-9至H1-11缺失。 實施例36為如實施例35之gRNA，其中上莖區之各位置經修飾，視情況其中上莖區之各位置經2'-O-甲基化修飾。 實施例37為如實施例35或36中任一例之gRNA，其中該經縮短髮夾1區包含： (a)序列AAAAU； (b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或 (c)與(a)之序列具有小於或等於1個失配之序列。 實施例38為如實施例1至32中任一例之gRNA，其中位置H1-2至H1-5及H1-8至H1-11缺失。 實施例39為如實施例38之gRNA，其中上莖區之各位置經修飾，視情況其中上莖區之各位置經2'-O-甲基化修飾。 實施例40為如實施例38或39中任一例之gRNA，其中該經縮短髮夾1區包含： (a)序列AAAU； (b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或 (c)與(a)之序列具有小於或等於1個失配之序列。 實施例41為如實施例1至32中任一例之gRNA，其中位置H1-1、H1-3至H1-8及H1-12缺失。 實施例42為如實施例41之gRNA，其中上莖區之各位置經修飾，視情況其中上莖區之各位置經2'-O-甲基化修飾。 實施例43為如實施例41或42中任一例之gRNA，其中該經縮短髮夾1區包含： (a)序列CAAG； (b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或 (c)與(a)之序列具有小於或等於1個失配之序列。 實施例44為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-1至H1-8缺失。 實施例45為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-11至H1-12缺失。 實施例46為如實施例1至32中任一例之gRNA，其中位置H1-2至H1-8缺失。 實施例47為如實施例46之gRNA，其中該經縮短髮夾1區包含： (a)序列AAAGU； (b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或 (c)與(a)之序列具有小於或等於1個失配之序列。 實施例48為如實施例1至32中任一例之gRNA，其中位置H1-3至H1-9缺失。 實施例49為如實施例48之gRNA，其中該經縮短髮夾1區包含： (a)序列ACAGU； (b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或 (c)與(a)之序列具有小於或等於1個失配之序列。 實施例50為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-7經G取代。 實施例51為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-8經C取代。 實施例52為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-7及H1-8經取代。 實施例53為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-7及H1-8分別經G及C取代。 實施例54為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-7及H1-8分別經G及C取代，且位置H1-2至H1-4及H1-9至H1-11缺失。 實施例55為如實施例54之gRNA，其中該經縮短髮夾1區包含： (a)序列AGAGCU； (b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或 (c)與(a)之序列具有小於或等於1個失配之序列。 實施例56為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-6經C取代。 實施例57為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-7經U取代。 實施例58為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-6及H1-7經取代。 實施例59為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-6及H1-7分別經C及U取代。 實施例60為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-6及H1-7分別經G及U取代，且位置H1-2至H1-4及H1-9至H1-11缺失。 實施例61為如實施例60之gRNA，其中該經縮短髮夾1區包含： (a)序列AGCUAU； (b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或 (c)與(a)之序列具有小於或等於1個失配之序列。 實施例62為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-1經C取代。 實施例63為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-12經G取代。 實施例64為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-1及H1-12經取代。 實施例65為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-1及H1-12分別經C及G取代。 實施例66為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-1及H1-12分別經C及G取代，且位置H1-2至H1-4及H1-9至H1-11缺失。 實施例67為如實施例66之gRNA，其中上莖區之各位置經修飾，視情況其中上莖區之各位置經2'-O-甲基化修飾。 實施例68為如實施例66或67中任一例之gRNA，其中該經縮短髮夾1區包含： (a)序列CGAAAG； (b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或 (c)與(a)之序列具有小於或等於1個失配之序列。 實施例69為如實施例1至22中任一例之gRNA，其包含缺乏9至10個核苷酸之經縮短髮夾1區。 實施例70為如實施例69之gRNA，其中經縮短髮夾1區具有2個核苷酸之長度。 實施例71為如實施例69之gRNA，其中經縮短髮夾1區具有3個核苷酸之長度。 實施例72為如實施例70或71之gRNA，其中經縮短髮夾1區之2或3個核苷酸未經取代。 實施例73為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-11至H1-12缺失。 實施例74為如實施例73之gRNA，其中位置H1-1至H1-8及H1-11至H1-12缺失。 實施例75為如實施例74之gRNA，其中經縮短髮夾1區包含： (a)序列AA；或 (b)與(a)之序列具有小於或等於1個失配之序列。 實施例76為如實施例1至21或69至72中任一例之gRNA，其中位置H1-1至H1-9及H1-12缺失。 實施例77為如實施例76之gRNA，其中經縮短髮夾1區包含： (a)序列AG； (b)與(a)之序列具有小於或等於1個失配之序列。 實施例78為如實施例1至21中任一例之gRNA，其包含缺乏5至10個核苷酸之經縮短髮夾1區。 實施例79為如實施例78之gRNA，其中經縮短髮夾1區具有7個核苷酸之長度。 實施例80為如實施例78或79中任一例之gRNA，其中位置H1-4至H1-11缺失。 實施例81為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置N18經取代。 實施例82為如實施例81之gRNA，其中位置N18經C取代。 實施例83為如實施例82之gRNA，其中位置N18經C取代且位置H1-4至H1-11缺失。 實施例84為如實施例83之gRNA，其中該gRNA包含含有位置N18、經縮短髮夾1區及位置N之片段，且該片段包含： (a)序列CACUUG； (b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或 (c)與(a)之序列具有小於或等於1個失配之序列。 實施例85為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-12經取代。 實施例86為如實施例85之gRNA，其中位置H1-12經C取代。 實施例87為如實施例86之gRNA，其中位置H1-12經A取代。 實施例88為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置N經取代。 實施例89為如實施例88之gRNA，其中位置N經A取代。 實施例90為如實施例89之gRNA，其中位置H1-12經C取代且位置N經A取代。 實施例91為如實施例90之gRNA，其中位置H1-12經C取代，位置N經A取代，且位置H1-4至H1-11缺失。 實施例92為如實施例91之gRNA，其中該gRNA包含含有位置N18、經縮短髮夾1區及位置N之片段，且該片段包含： (a)序列AACUCA； (b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或 (c)與(a)之序列具有小於或等於1個失配之序列。 實施例93為如實施例85之gRNA，其中位置H1-12經C取代且位置N經A取代。 實施例94為如實施例93之gRNA，其中位置H1-12經A取代，位置N經A取代，且位置H1-4至H1-11缺失。 實施例95為如實施例94之gRNA，其中該gRNA包含含有位置N18、經縮短髮夾1區及位置N之片段，且該片段包含： (a)序列AACUAA； (b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或 (c)與(a)之序列具有小於或等於1個失配之序列。 實施例96為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含經縮短上莖區。 實施例97為如實施例96之gRNA，其中經縮短上莖區缺乏1至6個核苷酸。 實施例98為如實施例97之gRNA，其中經縮短上莖區具有6個核苷酸之長度。 實施例99為如實施例97之gRNA，其中經縮短上莖區具有7個核苷酸之長度。 實施例100為如實施例97之gRNA，其中經縮短上莖區具有8個核苷酸之長度。 實施例101為如實施例97之gRNA，其中經縮短上莖區具有9個核苷酸之長度。 實施例102為如實施例97之gRNA，其中經縮短上莖區具有10個核苷酸之長度。 實施例103為如實施例97之gRNA，其中經縮短上莖區具有11個核苷酸之長度。 實施例104為如實施例98至103中任一例之gRNA，其中經縮短上莖區之6、7、8、9、10或11個核苷酸包括少於或等於4個取代。 實施例105為如實施例98至103中任一例之gRNA，其中經縮短上莖區之6、7、8、9、10或11個核苷酸包括少於或等於2個取代。 實施例106為如實施例98至103中任一例之gRNA，其中經縮短上莖區之6、7、8、9、10或11個核苷酸包括一個取代。 實施例107為如實施例98至103中任一例之gRNA，其中經縮短上莖區之6、7、8、9、10或11個核苷酸未經取代。 實施例108為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置US3缺失。 實施例109為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置US4缺失。 實施例110為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置US5缺失。 實施例111為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置US8缺失。 實施例112為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置US9缺失。 實施例113為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置US10缺失。 實施例114為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置US4及US9缺失。 實施例115為如實施例114之gRNA，其中位置H1-2至H1-5及H1-8至H1-11缺失。 實施例116為如實施例114或115中任一例之gRNA，其中經縮短上莖區包含： (a)序列GCUGAAAGGC (SEQ ID NO: 1004)； (b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或 (c)與(a)之序列具有小於或等於1個失配之序列。 實施例117為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置US3及US4缺失。 實施例118為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置US9及US10缺失。 實施例119為如實施例118之gRNA，其中位置US3、US4、US9及US10缺失。 實施例120為如實施例119之gRNA，其中位置H1-2至H1-5及H1-8至H1-11缺失。 實施例121為如實施例119或120中任一例之gRNA，其中經縮短上莖區包含： (a)序列GCGAAAGC； (b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或 (c)與(a)之序列具有小於或等於1個失配之序列。 實施例122為如實施例119或121之gRNA，其中位置H1-1及H1-4至H1-12缺失。 實施例123為如實施例119之gRNA，其中位置US3、US4、US8、US9及US10缺失。 實施例124為如實施例123之gRNA，其中經縮短上莖區包含： (a)序列GCGAAGC； (b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或 (c)與(a)之序列具有小於或等於1個失配之序列。 實施例125為如實施例119之gRNA，其中位置US3、US4、US5、US9及US10缺失。 實施例126為如實施例125之gRNA，其中經縮短上莖區包含： (a)序列GCAAAGC (SEQ ID NO: 1005)； (b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或 (c)與(a)之序列具有小於或等於1個失配之序列。 實施例127為如實施例96至107中任一例之gRNA，其中位置US3視情況經G取代。 實施例128為如實施例96至107或127中任一例之gRNA，其中位置US4視情況經C取代。 實施例129為如實施例96至107或127至128中任一例之gRNA，其中位置US9視情況經G取代。 實施例130為如實施例96至107或127至129中任一例之gRNA，其中位置US10視情況經C取代。 實施例131為如實施例96至107或127至130中任一例之gRNA，其中位置US3及US10視情況分別經G及C取代。 實施例132為如實施例96至107或127至131中任一例之gRNA，其中位置US4及US9視情況分別經C及G取代。 實施例133為如實施例132之gRNA，其中位置US3及US10分別經G及C取代，且位置US4及US9分別經C及G取代。 實施例134係實施例133之gRNA，其中位置US5缺失。 實施例135為如實施例133或134之gRNA，其中位置US3及US10分別經G及C取代，且位置US4及US9分別經C及G取代，且位置US8缺失。 實施例136為如實施例135之gRNA，其中位置H1-2至H1-5及H1-8至H1-11缺失。 實施例137為如實施例135或136之gRNA，其中經縮短上莖區包含： (a)序列GCGCGAAGCGC (SEQ ID NO: 1008)； (b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或 (c)與(a)之序列具有小於或等於1個失配之序列。 實施例138為如實施例96至107或127至131中任一例之gRNA，其中位置US3及US10分別經C及G取代。 實施例139為如實施例138之gRNA，其中位置US3及US10分別經C及G取代，且位置US4及US9缺失。 實施例140為如實施例139之gRNA，其中經縮短上莖區包含： (a)序列GCGGAAACGC (SEQ ID NO: 1006)； (b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或 (c)與(a)之序列具有小於或等於1個失配之序列。 實施例141為如實施例96至107或127至131中任一例之gRNA，其中位置US3及US10分別經G及C取代，且位置US4及US9缺失。 實施例142為如實施例141之gRNA，其中經縮短上莖區包含： (a)序列GCCGAAAGGC (SEQ ID NO: 1007)； (b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或 (c)與(a)之序列具有小於或等於1個失配之序列。 實施例143為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置LS6經取代。 實施例144為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置LS7經取代。 實施例145為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置US3經取代。 實施例146為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置US10經取代。 實施例147為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置B3經取代。 實施例148為如實施例147之gRNA，其中位置B3經G取代。 實施例149為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置N7經取代。 實施例150為如實施例149之gRNA，其中位置N7經C取代。 實施例151為如實施例149之gRNA，其中位置N7經U取代。 實施例152為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置N15經取代。 實施例153為如實施例152之gRNA，其中位置N15經C取代。 實施例154為如實施例152之gRNA，其中位置N15經U取代。 實施例155為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置N17經取代。 實施例156為如實施例155之gRNA，其中位置N17經G取代。 實施例157為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H2-2經取代。 實施例158為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H-14經取代。 實施例159為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置LS6及LS7經取代。 實施例160為如實施例159之gRNA，其中位置LS6及LS7分別經U及A取代。 實施例161為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置US3及US10經取代。 實施例162為如實施例161之gRNA，其中位置US3及US10分別經G及C取代。 實施例163為如前述實施例中之任一者之gRNA，其中位置H2-2及H2-14經取代。 實施例164為如實施例163之gRNA，其中位置H2-2及H2-14分別經A及U取代。 實施例165為如實施例164之gRNA，其中位置H2-2及H2-14分別經G及C取代。 實施例166為如前述實施例中之任一者之gRNA，其中位置US3、US10、LS6、LS7、B3、N15、N17、H2-2及H2-14中之至少2、3、4、5、6、7或8者經取代。 實施例167為如實施例166之gRNA，其中位置US3、US10、LS6、LS7、B3、N15、N17、H2-2及H2-14經取代。 實施例168為如前述實施例中之任一者之gRNA，其中以下中之至少2、3、4或5者為真： (a)位置US3及US10分別經G及C取代； (b)位置LS6及LS7分別經U及A取代； (c)位置B3經G取代； (d)位置N15經C取代； (e)位置N17經G取代；及/或 (f)位置H2-2及H2-14分別經A及U取代。 實施例169為如實施例之gRNA，其中位置US3及US10分別經G及C取代；位置LS6及LS7分別經U及A取代；位置B3經G取代；位置N15經C取代；位置N17經G取代；且位置H2-2及H2-14分別經A及U取代。 實施例170為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-4至H1-11缺失。 實施例171為如實施例170之gRNA，其中該經縮短髮夾1區包含： (a)序列ACUU； (b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或 (c)與(a)之序列具有小於或等於1個失配之序列。 實施例172為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置N2經C取代，視情況其中位置H1-4至H1-11缺失。 實施例173為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置US1至US4及US9至US12缺失，視情況其中位置H1-4至H1-11缺失。 實施例174為如實施例173之gRNA，其中位置H1-2至H1-11缺失。 實施例175為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H1-1至H1-12缺失。 實施例176為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置US2至US4及US9至US11缺失。 實施例177為如實施例176之gRNA，其中位置H1-2至H1-11缺失。 實施例178為如實施例176之gRNA，其中位置H1-1及H1-4至H1-12缺失。 實施例179為如實施例1至175中任一例之gRNA，其中位置US3至US5及US8至US10缺失。 實施例180為如實施例1至175中任一例之gRNA，其中位置US3至US4及US7至US10缺失。 實施例181為如實施例1至175中任一例之gRNA，其中位置US3至US10缺失。 實施例182為如實施例1至175中任一例之gRNA，其中位置US2至US5及US8至US11缺失。 實施例183為如實施例1至175中任一例之gRNA，其中位置US2至US6及US8至US11缺失。 實施例184為如實施例1至175中任一例之gRNA，其中位置US2至US11缺失。 實施例185為如實施例1至175中任一例之gRNA，其中位置US1至US5及US8至US12缺失。 實施例186為如實施例1至175中任一例之gRNA，其中位置US1至US5及US7至US12缺失。 實施例187為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置H2-15缺失。 實施例188為如實施例187之gRNA，其中位置H2-14及H2-15缺失。 實施例189為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置N6缺失，視情況其中位置H1-4至H1-11缺失。 實施例190為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置LS6視情況經C取代。 實施例191為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置B3視情況經C取代。 實施例192為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置N1視情況經C取代。 實施例193為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置N7視情況經G取代。 實施例194為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置N15視情況經G取代。 實施例195為如前述實施例中任一例之gRNA，其中位置N17經非嘧啶取代，視情況經G取代。 實施例196為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA為sgRNA。 實施例197為如實施例1至195中任一例之gRNA，該gRNA為crRNA或dgRNA。 實施例198為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含5'端修飾。 實施例199為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含3'端修飾。 實施例200為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含5'端修飾及3'端修飾。 實施例201為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含3'尾。 實施例202為如實施例201之gRNA，其中3'尾包含約1至2個、1至3個、1至4個、1至5個、1至7個、1至10個、至少1至5個、至少1至3個、至少1至4個、至少1至5個、至少1至5個、至少1至7個、或至少1至10個核苷酸。 實施例203為如實施例202之gRNA，其中3'尾包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。 實施例204為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA不包含3'尾。 實施例205為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含髮夾區中之修飾。 實施例206為如前述實施例中之任一者之gRNA，其包含3'端修飾及髮夾區中之修飾。 實施例207為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含3'端修飾、髮夾區修飾及5'端修飾。 實施例208為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含5'端修飾及髮夾區中之修飾。 實施例209為如前述實施例中任一例之gRNA，其進一步包含引導區。 實施例210為如前述實施例中任一例之gRNA，其中3'及/或5'端修飾包含保護端修飾，諸如選自以下之經修飾核苷酸：2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、反向無鹼基修飾之核苷酸，或其組合。 實施例211為如前述實施例中任一例之gRNA，其中髮夾區修飾包含選自以下之經修飾核苷酸：2'-O-甲基(2'-Ome)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯，或其組合。 實施例212為如前述實施例中任一例之gRNA，其中3'及/或5'端修飾包含或進一步包含2'-O-甲基(2'-Ome)修飾之核苷酸。 實施例213為如前述實施例中任一例之gRNA，其中3'及/或5'端修飾包含或進一步包含2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。 實施例214為如前述實施例中任一例之gRNA，其中3'及/或5'端修飾包含或進一步包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。 實施例215為如前述實施例中任一例之gRNA，其中3'及/或5'端修飾包含或進一步包含反向無鹼基修飾之核苷酸。 實施例216為如前述實施例中任一例之gRNA，其中髮夾區修飾包含或進一步包含2'-O-甲基(2'-Ome)修飾之核苷酸。 實施例217為如前述實施例中任一例之gRNA，其中髮夾區修飾包含或進一步包含2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。 實施例218為如前述實施例中任一例之gRNA，其中3'端修飾包含以下中之任一者： i. 最後7、6、5、4、3、2或1個核苷酸中之任一者或多者的修飾； ii.     一個經修飾之核苷酸； iii.    兩個經修飾之核苷酸； iv.     三個經修飾之核苷酸； v. 四個經修飾之核苷酸； vi.    五個經修飾之核苷酸； vii.   六個經修飾之核苷酸；及 viii.  七個經修飾之核苷酸。 實施例219為如前述實施例中任一例之gRNA，其中3'端修飾包含以下中之一或多者： i. 核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯； ii.     2'-Ome修飾之核苷酸； iii.    2'-O-moe修飾之核苷酸； iv.     2'-F修飾之核苷酸； v. 反向無鹼基修飾之核苷酸；及 vi.    (i.)至(v.)中之一或多者之組合。 實施例220為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含3'尾，其包含以下中之一或多者： i. 核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯； ii.     2'-Ome修飾之核苷酸； iii.    2'-O-moe修飾之核苷酸； iv.     2'-F修飾之核苷酸； v. 反向無鹼基修飾之核苷酸；及 vi.    (i.)至(v.)中之一或多者之組合。 實施例221為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含以下中之一或多者： i. 1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個介於核苷酸之間的PS鍵聯； ii.     1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16或18個介於核苷酸之間的PS鍵聯； iii.    約1至3個、1至5個、1至6個、1至7個、1至8個、1至9個或1至10個介於核苷酸之間的PS鍵聯； iv.     約1至3個、1至5個、1至6個、1至7個、1至8個、1至9個、1至10個、1至12個、1至14個、1至16個、1至18個或1至20個介於核苷酸之間的PS鍵聯；及 v. 各核苷酸之間的PS鍵聯。 實施例222為如前述實施例中任一例之gRNA，其中3'端修飾包含至少一個PS鍵聯，且其中存在以下中之一或多者： i. 存在一個PS鍵聯，且該鍵聯介於最後一個核苷酸與倒數第二個核苷酸之間； ii.     最後三個核苷酸之間存在兩個PS鍵聯； iii.    最後四個核苷酸中之任一者或多者之間存在PS鍵聯； iv.     最後五個核苷酸中之任一者或多者之間存在PS鍵聯；及 v. 最後2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸中之任一者或多者之間存在PS鍵聯。 實施例223為如實施例222之gRNA，其中3'端修飾進一步包含至少一個經2'-OMe、2'-O-moe、反向無鹼基或2'-F修飾之核苷酸。 實施例224為如前述實施例中任一例之gRNA，其中3'端修飾包含以下中之任一者： i. 最後1至7個核苷酸中之一或多者的修飾，其中該修飾為PS鍵聯、反向無鹼基核苷酸、2'-Ome、2'-O-moe、2'-F或其組合； ii.     2'-Ome、2'-O-moe、2'-F或其組合對最後一個核苷酸的修飾，及連至該3'尾之後續核苷酸及/或第一核苷酸的任選一或兩個PS鍵聯； iii.    2'-Ome、2'-O-moe、2'-F或其組合對最後一個及/或倒數第二個核苷酸的修飾，及任選一或多個PS鍵聯； iv.     2'-Ome、2'-O-moe、2'-F或其組合對最後一個、倒數第二個及/或倒數第三個核苷酸的修飾，及任選一或多個PS鍵聯； v. 2'-Ome、2'-O-moe、2'-F或其組合對最後一個、倒數第二個、倒數第三個及/或倒數第四個核苷酸的修飾，及任選一或多個PS鍵聯；或 vi.    2'-Ome、2'-O-moe、2'-F或其組合對最後一個、倒數第二個、倒數第三個、倒數第四個及/或倒數第五個核苷酸的修飾，及任選一或多個PS鍵聯。 實施例225為如前述實施例中任一例之gRNA，其中sgRNA包含3'尾，其中該3'尾包含存在於該3'尾之任一個或多個核苷酸的修飾。 實施例226為如實施例225之gRNA，其中3'尾經完全修飾。 實施例227為如實施例225之gRNA，其中gRNA包含經縮短髮夾1區且gRNA包含對至少H2-1至H2-12之修飾。 實施例228為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含以下中之一或多者： i. 如SEQ ID No: 101-190、301-394或795-798中之任一者所示的3'端修飾； ii.     (i)經2'-OMe修飾之核苷酸，其位於gRNA之保守區的最後一個核苷酸處，(ii)三個鄰接的經2'O-moe修飾之核苷酸，其緊接該經2'-OMe修飾之核苷酸的5'，及(iii)介於gRNA保守區之最後三個核苷酸之間的三個鄰接PS鍵聯； iii.    (i) 3'末端之3'端的五個鄰接的經2'-OMe修飾之核苷酸，及(ii)介於gRNA保守區之最後三個核苷酸之間的三個PS鍵聯； iv.     反向無鹼基修飾之核苷酸，其位於gRNA之保守區的最後一個核苷酸處； v. (i)反向無鹼基修飾之核苷酸，其位於gRNA之保守區的最後一個核苷酸處，及(ii)三個鄰接的經2'-OMe修飾之核苷酸，其位於gRNA之保守區的最後三個核苷酸處； vi.    (i) 3'末端之3'端的15個鄰接的經2'O-Me修飾之核苷酸，(ii)五個鄰接的經2'-F修飾之核苷酸，其緊接經2'O-Me修飾之核苷酸的5'，及(iii)介於gRNA保守區之最後三個核苷酸之間的三個PS鍵聯； vii.   (i) gRNA保守區的最後20個核苷酸處交替的經2'-OMe修飾之核苷酸與經2'-F修飾之核苷酸，及(ii) gRNA保守區之最後三個核苷酸之間的三個PS鍵聯； viii.  (i)兩個或三個鄰接的經2'-OMe修飾之核苷酸，及(ii) gRNA保守區之最後三個核苷酸之間的三個PS鍵聯； ix.    gRNA之保守區之最後一個核苷酸與倒數第二個核苷酸之間的一個PS鍵聯；及 x. 15個或20個鄰接的經2'-OMe修飾之核苷酸，及(ii)介於gRNA之保守區之最後三個核苷酸之間的三個PS鍵聯。 實施例229為如前述實施例中任一例之gRNA，其中5'端修飾包含以下中之一或多者： i. 引導區之核苷酸1至7中之任一者或多者的修飾； ii.     一個經修飾之核苷酸； iii.    兩個經修飾之核苷酸； iv.     三個經修飾之核苷酸； v. 四個經修飾之核苷酸； vi.    五個經修飾之核苷酸； vii.   六個經修飾之核苷酸；及 viii.  七個經修飾之核苷酸。 實施例230為如前述實施例中任一例之gRNA，其中5'端修飾包含1與7個之間、1與5個之間、1與4個之間、1與3個之間或1與2個之間的核苷酸修飾。 實施例231為如前述實施例中任一例之gRNA，其中5'端修飾包含以下中之一或多者： i. 核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯； ii.     2'-OMe修飾之核苷酸； iii.    2'-O-moe修飾之核苷酸； iv.     2'-F修飾之核苷酸； v. 反向無鹼基修飾之核苷酸； vi.    去氧核糖核苷酸； vii.   肌苷；及 viii.  (i.)至(vii.)中之一或多者之組合。 實施例232為如前述實施例中任一例之gRNA，其中5'端修飾包含： i. 1、2、3、4、5、6及/或7個介於核苷酸之間的PS鍵聯；或 ii.     約1至2個、1至3個、1至4個、1至5個、1至6個、或1至7個介於核苷酸之間的PS鍵聯。 實施例233為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA為sgRNA且5'端修飾包含至少一個PS鍵聯，且其中： i. 存在一個PS鍵聯，且該鍵聯介於引導區之核苷酸1與2之間； ii.     存在兩個PS鍵聯，且該等鍵聯介於引導區之核苷酸1與2之間及2與3之間； iii.    引導區之核苷酸1與2、2與3及3與4中之任一者或多者之間存在PS鍵聯； iv.     引導區之核苷酸1與2、2與3、3與4及4與5中之任一者或多者之間存在PS鍵聯； v. 引導區之核苷酸1與2、2與3、3與4、4與5及5與6中之任一者或多者之間存在PS鍵聯； vi.    引導區之核苷酸1與2、2與3、3與4、4與5、5與6及6與7中之任一者或多者之間存在PS鍵聯；或 vii.   引導區之核苷酸1與2、2與3、3與4、4與5、5與6、6與7及7與8中之任一者或多者之間存在PS鍵聯。 實施例234為如實施例233之gRNA，其中5'端修飾進一步包含至少一個經2'-OMe、2'-O-moe、反向無鹼基或2'-F修飾之核苷酸。 實施例235為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA為sgRNA，其包含： i. 可變區之核苷酸1至7中之一或多者的修飾，其中該修飾為PS鍵聯、反向無鹼基核苷酸、2'-OMe、2'-O-moe、2'-F、2'-H (去氧核糖核苷酸)、肌苷，及/或其組合； ii.     2'-OMe、2'-O-moe、2'-F、2'-H、肌苷或其組合對引導區之第一核苷酸的修飾，及連至後續核苷酸之任選PS鍵聯； iii.    2'-OMe、2'-O-moe、2'-F、2'-H、肌苷或其組合對可變區之第一及/或第二核苷酸的修飾，及視情況存在的一或多個PS鍵聯； iv.     2'-OMe、2'-O-moe、2'-F、2'-H、肌苷或其組合對可變區之第一、第二及/或第三核苷酸的修飾，及視情況存在的一或多個PS鍵聯； v. 2'-OMe、2'-O-moe、2'-F、2'-H、肌苷或其組合對可變區之第一、第二、第三及/或第四核苷酸的修飾，及視情況存在的一或多個PS鍵聯；或 vi.    2'-OMe、2'-O-moe、2'-F、2'-H、肌苷或其組合對可變區之第一、第二、第三、第四及/或第五核苷酸的修飾，及視情況存在的一或多個PS鍵聯。 實施例236為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA為包含以下中之任一者或多者的sgRNA： i. 如SEQ ID No: 101-190或795-798中之任一者中所示的5'端修飾； ii.     經2'-OMe修飾之核苷酸，其位於引導區之核苷酸1、2及3處； iii.    經2'-OMe修飾之核苷酸，其位於引導區之核苷酸1、2及3處，及介於引導區之核苷酸1與2、2與3、及3與4之間的PS鍵聯； iv.     經2'-OMe修飾之核苷酸，其位於引導區之核苷酸1、2、3、4及5處； v. 經2'-OMe修飾之核苷酸，其位於引導區之核苷酸1、2、3、4及5處，及介於引導區之核苷酸1與2、2與3、3與4、4與5及5與6之間的PS鍵聯； vi.    經2'O-moe修飾之核苷酸，其位於引導區之核苷酸1、2及3處； vii.   經2'O-moe修飾之核苷酸，其位於引導區之核苷酸1、2及3處，及介於引導區之核苷酸1與2、2與3、及3與4之間的PS鍵聯； viii.  反向無鹼基修飾之核苷酸，其位於引導區之核苷酸1處； ix.    反向無鹼基修飾之核苷酸，其位於引導區之核苷酸1處，及經2'-OMe修飾之核苷酸，其位於引導區之核苷酸1、2及3處；及 x.     反向無鹼基修飾之核苷酸，其位於引導區之核苷酸1處；經2'-OMe修飾之核苷酸，其位於引導區之核苷酸1、2及3處；及介於可變區之核苷酸1與2、2與3、3與4、4與5及5與6之間的PS鍵聯。 實施例237為如前述實施例中任一例之gRNA，其中上莖區包含至少一個修飾。 實施例238為如前述實施例中任一例之gRNA，其中上莖修飾包含以下中之任一者或多者： i. 對上莖區中之US1至US12中之任一者或多者的修飾； ii.     上莖區中之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或所有12個核苷酸的修飾；及 iii.    上莖區中之約1至2個、1至3個、1至4個、1至5個、1至6個、1至7個、1至8個、1至9個、1至10個或1至12個核苷酸之修飾。 實施例239為如實施例238之gRNA，其中上莖修飾包含以下中之一或多者： i. 2'-OMe修飾之核苷酸； ii.     2'-O-moe修飾之核苷酸； iii.    2'-F修飾之核苷酸；及 iv.     (i.)至(iii.)中之一或多者之組合。 實施例240為如前述實施例中任一例之gRNA，其中5'端修飾包含以下中之一或多者： i. 如SEQ ID No: 101-190或795-798中之任一者中所示的5'端修飾； ii.     2'-OMe修飾之核苷酸，其位於可變區之核苷酸1、2及3處； iii.    2'-OMe修飾之核苷酸，其位於可變區之核苷酸1、2及3處，及介於可變區之核苷酸1與2、2與3及3與4之間的PS鍵聯； iv.     2'-OMe修飾之核苷酸，其位於可變區之核苷酸1、2、3、4及5處； v. 2'-OMe修飾之核苷酸，其位於可變區之核苷酸1、2、3、4及5處，及介於可變區之核苷酸1與2、2與3、3與4、4與5及5與6之間的PS鍵聯； vi.    2'O-moe修飾之核苷酸，其位於可變區之核苷酸1、2及3處； vii.   2'O-moe修飾之核苷酸，其位於可變區之核苷酸1、2及3處，及介於可變區之核苷酸1與2、2與3及3與4之間的PS鍵聯； viii.  反向無鹼基修飾之核苷酸，其位於可變區之核苷酸1處； ix.    反向無鹼基修飾之核苷酸，其位於可變區之核苷酸1處，及2'-OMe修飾之核苷酸，其位於可變區之核苷酸1、2及3處；及 x. 反向無鹼基修飾之核苷酸，其位於可變區之核苷酸1處；2'-OMe修飾之核苷酸，其位於可變區之核苷酸1、2及3處；及介於可變區之核苷酸1與2、2與3、3與4、4與5及5與6之間的PS鍵聯。 實施例241為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含以下中之任一者或多者： i. SEQ ID No: 101-190、301-395或795-798中之任一者中所示的3'端修飾； ii.     (i)經2'-OMe修飾之核苷酸，其位於sgRNA或gRNA之保守區的最後一個核苷酸處，(ii)三個鄰接的經2'O-moe修飾之核苷酸，其緊接該經2'-OMe修飾之核苷酸的5'，及(iii)介於最後三個核苷酸之間的三個鄰接PS鍵聯； iii.    (i)五個鄰接的經2'-OMe修飾之核苷酸，及(ii)介於最後三個核苷酸之間的三個PS鍵聯； iv.     反向無鹼基修飾之核苷酸，其位於sgRNA或gRNA之保守區的最後一個核苷酸處； v.     (i)反向無鹼基修飾之核苷酸，其位於sgRNA或gRNA之保守區的最後一個核苷酸處，及(ii)三個鄰接的經2'-OMe修飾之核苷酸，其位於sgRNA或gRNA之保守區的最後三個核苷酸處； vi.    (i) 15個鄰接的經2'-OMe修飾之核苷酸，(ii)五個鄰接的經2'-F修飾之核苷酸，其緊接經2'-OMe修飾之核苷酸的5'，及(iii)介於最後三個核苷酸之間的三個PS鍵聯； vii.   (i) gRNA或gRNA之保守區的最後20個核苷酸處交替的經2'-OMe修飾之核苷酸及經2'-F修飾之核苷酸，及(ii)最後三個核苷酸之間的三個PS鍵聯； viii.  (i)兩個或三個鄰接的經2'-OMe修飾之核苷酸，及(ii)介於最後三個核苷酸之間的三個PS鍵聯； ix.    介於最後一個核苷酸與倒數第二個核苷酸之間的一個PS鍵聯；及 x. 15或20個鄰接的經2'-OMe修飾之核苷酸，及(ii)介於最後三個核苷酸之間的三個PS鍵聯。 實施例242為如前述實施例中任一者的gRNA，其包含與SEQ ID No: 1-90、201-290、401-490或601-690中之任一者之核苷酸序列具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70%一致性的核苷酸序列。 實施例243為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含與SEQ ID No: 101-190、301-394、501-594或701-798中之任一者之核苷酸序列具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70%一致性的核苷酸序列，其中在對應於表1A中之參考序列識別符之核苷酸的gRNA之各核苷酸處的修飾等同於或等效於表1A中之參考序列識別符中所示的修飾。 實施例244係一種引導RNA，其包含SEQ ID No: 1-90、201-290、401-490或601-690中之任一者。 實施例245係一種引導RNA，其包含SEQ ID No: 101-190、301-394、501-594或701-798中之任一者，包括表1A之修飾。 實施例246為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含至少一個引導區YA位點處的YA修飾。 實施例247為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含位於至少一個引導區YA位點的YA修飾，該YA修飾不為5'端修飾。 實施例248為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含位於一或多個引導區YA位點處的YA修飾，其中引導區YA位點位於5'末端之5'端的核苷酸8處或其之後。 實施例249為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含位於一或多個引導區YA位點處的YA修飾，其中gRNA包含以下中之一或多者： i. H1-1及H2-1中之一或多者處的修飾； ii.     1、2、3、4或5個引導區YA位點處的YA修飾； iii.    1、2、3、4或5個引導區YA位點處的YA修飾，其中至少一個引導區YA位點之修飾不同於sgRNA之任何5'端修飾； iv.     一或多個引導區YA位點處的YA修飾，其中引導區YA位點位於5'末端之5'端的核苷酸8處或其之後； v. 一或多個引導區YA位點處的YA修飾，其中引導區YA位點位於5'末端之5'端的核苷酸5端、6端、7端、8端、9端或10端內； vi.    一或多個引導區YA位點處的YA修飾，其中引導區YA位點位於引導區之3'末端核苷酸的17、16、15、14、13、12、11、10或9個核苷酸內； vii.   位於引導區YA位點之不同於5'端修飾的YA修飾； viii.  兩個或更多個引導區YA位點處之YA修飾，其中引導區YA位點位於5'末端之5'端的核苷酸8處或其之後； ix.    兩個或更多個引導區YA位點處的YA修飾，其中兩個引導區YA位點位於5'末端之5'端的核苷酸5端、6端、7端、8端、9端或10端內； x.     兩個或更多個引導區YA位點處的YA修飾，其中引導區YA位點位於該引導區之3'末端核苷酸的17、16、15、14、13、12、11、10或9個核苷酸內； xi.     兩個或更多個引導區YA位點處之不同於5'端修飾的YA修飾；及 xii.   兩個或更多個引導區YA位點處的YA修飾，其中引導區YA位點之修飾包含位於該引導區YA位點之5'之至少一個核苷酸不包含的修飾。 實施例250為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含YA修飾，其中該修飾包含2'-氟、2'-H、2'-OMe、ENA、UNA、肌苷或PS。 實施例251為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含YA修飾，其中該修飾改變二核苷酸基元結構以減少RNA核酸內切酶活性。 實施例252為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含YA修飾，其中該修飾干擾核糖核酸酶對YA位點的識別或裂解及/或使RNA結構穩定。 實施例253為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含YA修飾，其中該修飾包含以下中之一或多者： i. 核糖修飾，其選自2'-O-烷基、2'-F、2'-moe、2'-F***糖及2'-H (去氧核糖)； ii.     雙環核糖類似物，諸如LNA、BNA及ENA； iii.    未鎖定之核酸修飾； iv.     鹼基修飾，諸如肌苷、假尿苷及5'-甲基胞嘧啶；及 v. 核苷間鍵聯修飾，諸如硫代磷酸酯。 實施例254為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含位於一或多個保守區YA位點處的YA修飾。 實施例255為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含位於保守區YA位點2、3、4及10中之一或多者處的YA修飾。 實施例256為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含位於保守區YA位點1及8中之一或多者處的YA修飾。 實施例257為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含保守區YA位點1之YA修飾。 實施例258為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含保守區YA位點2之YA修飾。 實施例259為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含保守區YA位點3之YA修飾。 實施例260為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含保守區YA位點4之YA修飾。 實施例261為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含保守區YA位點5之YA修飾。 實施例262為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含保守區YA位點6之YA修飾。 實施例263為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含保守區YA位點7之YA修飾。 實施例264為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含保守區YA位點8之YA修飾。 實施例265為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含保守區YA位點9之YA修飾。 實施例266為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含保守區YA位點10之YA修飾。 實施例267為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含以下中之一或多者： i. 保守區YA位點2、3、4及10之YA修飾； ii.     保守區YA位點2、3及4之YA修飾； iii.    保守區YA位點2、3及10之YA修飾； iv.     保守區YA位點2、4及10之YA修飾； v. 保守區YA位點3、4及10之YA修飾； vi.    保守區YA位點2及10之YA修飾； vii.   保守區YA位點2及4之YA修飾； viii.  保守區YA位點2及3之YA修飾； ix.    保守區YA位點3及4之YA修飾； x. 保守區YA位點3及10之YA修飾； xi.    保守區YA位點4及10之YA修飾 xii.   保守區YA位點1及5之YA修飾； xiii.  保守區YA位點1及6之YA修飾； xiv.   保守區YA位點1及7之YA修飾； xv.    保守區YA位點1及8之YA修飾； xvi.   保守區YA位點1及9之YA修飾； xvii.  保守區YA位點8及5之YA修飾； xviii. 保守區YA位點8及6之YA修飾； xix.   保守區YA位點8及7之YA修飾；及 xx.    保守區YA位點8及9之YA修飾； xxi.   視情況，其中該sgRNA進一步包含保守區YA位點2、3、4及/或10之YA修飾。 實施例268為如前述實施例中任一例之gRNA，其中至少一個經修飾之YA位點包含2'-OMe修飾，其視情況位於YA位點之嘧啶處。 實施例269為 如前述實施例中任一例之gRNA，其中至少一個經修飾之YA位點包含2'-氟修飾，其視情況位於YA位點之嘧啶處。 實施例270為如前述實施例中任一例之gRNA，其中至少一個經修飾之YA位點包含PS修飾，其視情況位於YA位點之嘧啶處。 實施例271為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含引導區，該引導區包含以下核苷酸中之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13者或所有者處之修飾：1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、13、14、17及18，視情況，其中修飾為2'-OMe、2'-氟、2'-H、肌苷或硫代磷酸酯修飾。 實施例272為如前述實施例中任一例之gRNA，其中短sgRNA包含引導區，該引導區包含核苷酸1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、13、14、17及18處之修飾，視情況，其中修飾為2'-OMe、2'-氟、2'-H、肌苷或硫代磷酸酯修飾。 實施例273為如實施例271至272中任一例之gRNA，其中2'-OMe修飾不存在於引導區中之核苷酸6至11及13端。 實施例274為如實施例271至273中任一例之gRNA，其中2'-氟修飾不存在於引導區中之核苷酸1至7、15、16及19端。 實施例275為如實施例271至274中任一例之gRNA，其中硫代磷酸酯修飾不存在於引導區中之核苷酸4、5、11至14、17及18處。 實施例276為如實施例271至275中任一例之gRNA，其中引導區包含未修飾之核苷酸20。 實施例277為如實施例271至276中任一例之gRNA，其中引導區由20個核苷酸組成。 實施例278為如實施例271至277中任一例之gRNA，其中引導區包含核苷酸5至6處之YA位點及核苷酸5處之修飾。 實施例279為如實施例271至278中任一例之gRNA，其中引導區包含核苷酸12至13處之YA位點及核苷酸12處之修飾。 實施例280為如實施例271至279中任一例之gRNA，其中引導區包含核苷酸15至16處之YA位點及核苷酸15處之修飾。 實施例281為如實施例271至280中任一例之gRNA，其中引導區包含核苷酸16至17處之YA位點及核苷酸16處之修飾。 實施例282為如實施例271至281中任一例之gRNA，其中引導區包含核苷酸19至20處之YA位點及核苷酸19處之修飾。 實施例283為如實施例271至277或279至282中任一例之gRNA，其中引導區不包含核苷酸5至6處之YA位點且核苷酸5未經修飾。 實施例284為如實施例271至278或280至283中任一例之gRNA，其中引導區不包含核苷酸12至13處之YA位點且核苷酸12未經修飾。 實施例285為如實施例271至279或281至284中任一例之gRNA，其中引導區不包含核苷酸15至16處之YA位點且核苷酸15未經修飾。 實施例286為如實施例271至280或282至285中任一例之gRNA，其中引導區不包含核苷酸16至17處之YA位點且核苷酸16未經修飾。 實施例287為如實施例271至281或283至286中任一例之gRNA，其中引導區不包含核苷酸19至20處之YA位點且核苷酸19未經修飾。 實施例288為如實施例271至287中任一例之gRNA，其中gRNA包含引導區，該引導區包含以下中之一或多者： i. 核苷酸1處之2'-OMe及硫代磷酸酯修飾； ii.     核苷酸2處之2'-OMe及硫代磷酸酯修飾； iii.    核苷酸3處之2'-OMe及硫代磷酸酯修飾； iv.     核苷酸4處之2'-OMe修飾； v. 核苷酸6處之硫代磷酸酯修飾； vi.    核苷酸7處之硫代磷酸酯修飾； vii.   核苷酸8處之2'-氟及硫代磷酸酯修飾； viii.  核苷酸9處之2'-氟及硫代磷酸酯修飾； ix.    核苷酸10處之2'-氟及硫代磷酸酯修飾； x. 核苷酸11處之2'-氟修飾； xi.    核苷酸13處之2'-氟修飾； xii.   核苷酸14處之2'-氟修飾； xiii.  核苷酸17處之2'-氟修飾；及 xiv.   核苷酸18處之2'-氟修飾。 實施例289為如實施例271至288中任一例之gRNA，其中引導區包含前述實施例中所闡述之各修飾。 實施例290為如實施例271至289中任一例之gRNA，其中引導區包含以下中之至少1、2、3或4者： i. 若核苷酸5與6形成YA位點，則為核苷酸5處之2'-OMe修飾； ii.     若核苷酸12與13形成YA位點，則為核苷酸12處之2'-OMe修飾； iii.    若核苷酸15與16形成YA位點，則為核苷酸15處之硫代磷酸酯修飾； iv.     若核苷酸16與17形成YA位點，則為核苷酸16處之硫代磷酸酯修飾；及 v. 若核苷酸19與20形成YA位點，則為核苷酸19處之硫代磷酸酯或2'-氟修飾。 實施例291為如實施例271至290中任一例之gRNA，其中引導區包含核苷酸5至6處之YA位點及核苷酸5處之2'-OMe修飾。 實施例292為如實施例271至291中任一例之gRNA，其中引導區包含核苷酸12至13處之YA位點及核苷酸12處之2'-OMe修飾。 實施例293為如實施例271至292中任一例之gRNA，其中引導區包含核苷酸15至16處之YA位點及核苷酸15處之硫代磷酸酯修飾。 實施例294為如實施例271至293中任一例之gRNA，其中引導區包含核苷酸16至17處之YA位點及核苷酸16處之硫代磷酸酯修飾。 實施例295為如實施例271至294中任一例之gRNA，其中引導區包含核苷酸19至20處之YA位點及核苷酸19處之硫代磷酸酯修飾。 實施例296為如實施例271至295中任一例之gRNA，其中引導區包含核苷酸19處之2'-氟修飾。 實施例297為如實施例271至296中任一例之gRNA，其中引導區包含未修飾之核苷酸15或在核苷酸15僅包含硫代磷酸酯修飾。 實施例298為如實施例271至297中任一例之gRNA，其中引導區包含未修飾之核苷酸16或在核苷酸16僅包含硫代磷酸酯修飾。 實施例299為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含： i. 1、2、3、4或5個引導區YA位點處之YA修飾； ii.     1、2、3、4或5個引導區YA位點處之YA修飾，其中至少一個引導區YA位點之修飾不同於sgRNA之任何5'端修飾； iii.    一或多個引導區YA位點處之YA修飾，該等引導區YA位點位於5'末端之5'端的核苷酸8處或其之後； iv.     一或多個引導區YA位點處之YA修飾，該等引導區YA位點位於5'末端之5'端的核苷酸5端、6端、7端、8端、9端或10端內； v. 一或多個引導區YA位點處之YA修飾，該等引導區YA位點位於引導區之3'末端核苷酸的17、16、15、14、13、12、11、10或9個核苷酸內； vi.    位於引導區YA位點處之不同於5'端修飾的YA修飾；或 vii.   引導區YA位點處之YA修飾，其中引導區YA位點之修飾包含位於引導區YA位點之5'之至少一個核苷酸不包含的修飾。 實施例300為如實施例300之gRNA，其包含： i. 兩個或更多個引導區YA位點處的YA修飾，該等引導區YA位點位於5'末端之5'端的核苷酸8處或其之後； ii.     兩個或更多個引導區YA位點處的YA修飾，該等引導區YA位點位於5'末端之5'端的核苷酸5端、6端、7端、8端、9端或10端內； iii.    兩個或更多個引導區YA位點處的YA修飾，該等引導區YA位點位於引導區之3'末端核苷酸的17、16、15、14、13、12、11、10或9個核苷酸內； iv.     位於兩個或更多個引導區YA位點處之不同於5'端修飾的YA修飾；或 v.     兩個或更多個引導區YA位點處的YA修飾，其中引導區YA位點之修飾包含位於引導區YA位點之5'之至少一個核苷酸不包含的修飾。 實施例301為如實施例300之gRNA，其包含： i. 三個或更多個引導區YA位點處的YA修飾，該等引導區YA位點位於5'末端之5'端的核苷酸8處或其之後； ii.     三個或更多個引導區YA位點處的YA修飾，該等引導區YA位點位於5'末端之5'端的核苷酸5端、6端、7端、8端、9端或10端內； iii.    三個或更多個引導區YA位點處的YA修飾，該等引導區YA位點位於引導區之3'末端核苷酸的17、16、15、14、13、12、11、10或9個核苷酸內； iv.     位於三個或更多個引導區YA位點處之不同於5'端修飾的YA修飾；或 v.     三個或更多個引導區YA位點處之YA修飾，其中該等引導區YA位點之修飾包含位於該引導區YA位點之5'的至少一個核苷酸不包含的修飾。 實施例302為如實施例299至301中任一例之gRNA，其中5'末端之5'端的核苷酸8至11、13至14及17至18中的至少1、2、3、4、5、6、7或8者包含YA修飾。 實施例303為如實施例302之gRNA，其中5'末端之5'端的核苷酸8至11、13至14及17至18中之至少1、2、3、4、5、6、7或8者之修飾包含2'-氟、2'-H、2'-OMe或PS。 實施例304為如實施例303之gRNA，其中修飾為2'-氟。 實施例305為如實施例303之gRNA，其中修飾為2'-OMe或2'-H。 實施例306為如實施例303之gRNA，其中修飾為PS。 實施例307為如實施例299至306中任一例之gRNA，其中5'末端之5'端的核苷酸6至10中的至少1、2、3、4或5者包含YA修飾，視情況其中該修飾包含2'-氟、2'-H、2'-OMe、肌苷或PS。 實施例308為如實施例307之gRNA，其中該修飾為PS。 實施例309為如實施例307之gRNA，其中該修飾為2'-氟或2'-H。 實施例310為如實施例307之gRNA，其中該修飾為2'-OMe。 實施例311為如實施例299至310中任一例之gRNA，其包含以下中之任一者或多者： i. 5'末端之5'端的核苷酸8至11、13至14及17至18的1、2、3、4、5、6、7或8個YA修飾，其中該等YA修飾視情況為2'-氟修飾及5'末端之核苷酸6至10中之一或多者處之不同於2'-氟的修飾； ii.     5'末端之5'端的核苷酸8至11、13至14及17至18中之一或多者處之不同於PS的YA修飾，及5'末端之5'端的核苷酸6至10處的1、2、3、4或5個YA修飾，視情況其中該等修飾為PS修飾； iii.    5'末端之5'端的核苷酸8至11、13至14及17至18中的1、2、3、4、5、6、7或8個YA修飾，其中該等YA修飾視情況為2'-氟修飾及5'末端之5'端的核苷酸6至10處之不同於2'-氟的修飾； iv.     5'末端之5'端的核苷酸8至11、13至14及17至18中之每一者處之不同於PS的YA修飾，及5'末端之5'端的核苷酸6至10處的1、2、3、4或5個YA修飾，其中該等修飾視情況為PS修飾； v. 5'末端之5'端的核苷酸8至11、13至14及17至18中的1、2、3、4、5、6、7或8個YA修飾，其中YA修飾視情況為2'-氟修飾，及5'末端之5'端的核苷酸6至10中之任一者處的一或多個PS修飾； vi.    5'末端之5'端的核苷酸8至11、13至14及17至18中之任一者處的至少一個2'-氟修飾，及5'末端之5'端之核苷酸6至10的1、2、3、4或5個YA修飾，其中該等修飾視情況為PS修飾； vii.   5'末端之5'端的核苷酸8至11、13至14及17至18中的1、2、3、4、5、6、7或8個YA修飾，其中該等YA修飾視情況為2'-氟修飾及5'末端之5'端的核苷酸6至10中之每一者處之PS修飾；或 viii.  5'末端之5'端的核苷酸8至11、13至14及17至18中之每一者處的2'-氟修飾，及5'末端之5'端的核苷酸6至10處的1、2、3、4或5個YA修飾，其中該等修飾視情況為PS修飾。 實施例312為如實施例299至311中任一例之gRNA，其中： i. 5'末端之5'端的核苷酸4至20包含至少2、3或4個經修飾之YA位點，包括包含2'-OMe修飾的第一個經修飾之YA位點及包含2'-氟修飾或PS修飾的第二個經修飾之YA位點； ii.     5'末端之5'端的核苷酸4至20包含至少2、3或4個經修飾之YA位點，包括包含2'-氟修飾的第一個經修飾之YA位點及包含2'-OMe修飾或PS修飾的第二個經修飾之YA位點； iii.    5'末端之5'端的核苷酸4至20包含至少2、3或4個經修飾之YA位點，包括包含PS修飾的第一個經修飾之YA位點及包含2'-OMe修飾或2'-氟修飾的第二個經修飾之YA位點； iv.     5'末端之5'端的核苷酸4至20包含至少2、3或4個包括YA修飾的經修飾之YA位點； v. 5'末端之5'端的核苷酸4至20包含至少3或4個經修飾之YA位點，包括包含2'-OMe修飾的第一個經修飾之YA位點、包含2'-氟修飾的第二個經修飾之YA位點，及包含PS修飾的第三個經修飾之YA位點； vi.    5'末端之5'端的核苷酸4至20包含至少3或4個經修飾之YA位點，包括包含2'-OMe修飾的第一個經修飾之YA位點、包含2'-氟修飾的第二個經修飾之YA位點、包含2'-氟修飾的第三個經修飾之YA位點，及包含PS修飾的第四個經修飾之YA位點； vii.   5'末端之5'端的核苷酸4至20包含至少3或4個包括YA修飾的經修飾之YA位點； viii.  5'末端之5'端的核苷酸4至20包含至少4個經修飾之YA位點，包括包含2'-OMe修飾的第一個經修飾之YA位點、包含2'-氟修飾的第二個經修飾之YA位點、包含PS修飾的第三個經修飾之YA位點，及包含PS修飾的第四個經修飾之YA位點；或 ix.    5'末端之5'端的核苷酸4至40包含至少4個包括YA修飾的經修飾之YA位點。 實施例313為如實施例299至312中任一例之gRNA，其中5'末端之5'端的核苷酸4至20包含至少5個經修飾之YA位點。 實施例314為如實施例299至313中任一例之gRNA，其中至少5個經修飾之YA位點包括包含PS修飾的第五個經修飾之YA位點，視情況，其中第三個經修飾之YA位點包含2'-氟修飾。 實施例315為 如實施例299至314中任一例之gRNA，其中至少5個經修飾之YA位點中的第一個、第二個及(若適用)第三個、第四個及第五個係以5'至3'方向排列。 實施例316為如實施例299至315中任一例之gRNA，其中至少5個經修飾之YA位點中的第一個、第二個及(若適用)第三個、第四個及第五個係以5'至3'方向排列。 實施例317為如實施例299至316中任一例之gRNA，其中5'末端之5'端的核苷酸4至20包含至少2、3、4或5個包含去氧核糖核苷酸的經修飾之YA位點，視情況，其中去氧核糖核苷酸為YA位點之嘧啶。 實施例318為如實施例299至317中任一例之gRNA，其中： i. 5'末端之5'端的核苷酸8至11中的至少1、2、3或4者包含YA修飾，該YA修飾視情況為2'-氟修飾； ii.     5'末端之5'端的核苷酸8至11、13、14、17及18中的至少1、2、3、4、5、6、7或8者包含YA修飾，視情況其中該等YA修飾若存在於核苷酸8至11處，則為2'-OMe且若存在於核苷酸13、14、17或18處，則為2'-氟； iii.    5'末端之5'端的核苷酸17與18中的至少一者或兩者包含YA修飾，該YA修飾視情況為2'-氟修飾； iv.     5'末端之5'端的核苷酸17與18中的至少一者或兩者包含YA修飾，該YA修飾視情況為2'-氟修飾；或 v. 5'末端之5'端的核苷酸4至14、17及18中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13者包含YA修飾，該YA修飾視情況為2'-氟修飾。 實施例319為如實施例299至318中任一例之gRNA，其中5'末端之5'端的核苷酸4至10中的至少1、2、3、4、5或6者包含YA修飾，該YA修飾視情況為2'-OMe修飾。 實施例320為如實施例299至319中任一例之gRNA，其中5'末端之5'端的核苷酸4至10包含YA修飾，該YA修飾視情況為2'-OMe修飾。 實施例321為如實施例299至320中任一例之gRNA，其中： i. 5'末端之5'端的核苷酸1至3中的至少一者包含5'保護端修飾，該修飾視情況為2'-OMe修飾； ii.     5'末端之5'端的核苷酸1至3中的至少兩者包含5'保護端修飾，該修飾視情況為2'-OMe修飾；或 iii.    5'末端之5'端的核苷酸1至3中的每一者包含5'保護端修飾，該修飾視情況為2'-OMe修飾。 實施例322為如實施例299至321中任一例之gRNA，其中5'末端之5'端的核苷酸11、13、14、17及18中的至少1、2、3、4或5者包含5'端修飾，該修飾視情況為2'-氟修飾。 實施例323為如實施例299至322中任一例之gRNA，其中5'末端之5'端的核苷酸15未經修飾或僅經硫代磷酸酯修飾。 實施例324為如實施例299至323中任一例之gRNA，其中5'末端之核苷酸16未經修飾或僅經硫代磷酸酯修飾。 實施例325為如299至324中任一例之gRNA，其中5'末端之5'端的核苷酸3未經修飾或僅經硫代磷酸酯修飾。 實施例326為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含保守區YA位點1之YA修飾或取代。 實施例327為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含保守區YA位點2之YA修飾或取代。 實施例328為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含保守區YA位點3之YA修飾或取代。 實施例329為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含保守區YA位點4之YA修飾或取代。 實施例330為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含保守區YA位點5之YA修飾或取代。 實施例331為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含保守區YA位點6之YA修飾或取代。 實施例332為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含保守區YA位點7之YA修飾或取代。 實施例333為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含保守區YA位點8之YA修飾或取代。 實施例334為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含保守區YA位點9之YA修飾或取代。 實施例335為如前述實施例中任一例之gRNA，其包含保守區YA位點10之YA修飾或取代。 實施例336為如實施例326至335中任一例之gRNA，其包含： i. 保守區YA位點2、3、4及10之YA修飾； ii.     保守區YA位點2、3及4之YA修飾； iii.    保守區YA位點2、3及10之YA修飾； iv.     保守區YA位點2、4及10之YA修飾； v. 保守區YA位點3、4及10之YA修飾； vi.    保守區YA位點2及10之YA修飾； vii.   保守區YA位點2及4之YA修飾； viii.  保守區YA位點2及3之YA修飾； ix.    保守區YA位點3及4之YA修飾； x. 保守區YA位點3及10之YA修飾；或 xi.    保守區YA位點4及10之YA修飾。 實施例337為如實施例326至336中任一例之gRNA，其包含： i. 保守區YA位點1及5之YA修飾； ii.     保守區YA位點1及6之YA修飾； iii.    保守區YA位點1及7之YA修飾； iv.     保守區YA位點1及8之YA修飾； v. 保守區YA位點1及9之YA修飾； vi.    保守區YA位點8及5之YA修飾； vii.   保守區YA位點8及6之YA修飾； viii.  保守區YA位點8及7之YA修飾；或 ix.    保守區YA位點8及9之YA修飾； 視情況，其中該sgRNA進一步包含保守區YA位點2、3、4及10之YA修飾。 實施例338為如實施例299至337中任一例之gRNA，其中至少一個經修飾之YA位點包含2'-OMe修飾，該修飾視情況位於YA位點之嘧啶處。 實施例339為如實施例299至338中任一例之gRNA，其中至少一個經修飾之YA位點包含2'-氟修飾，該修飾視情況位於YA位點之嘧啶處。 實施例340為如實施例299至339中任一例之gRNA，其中至少一個經修飾之YA位點包含PS修飾，該修飾視情況位於YA位點之嘧啶處。 實施例341為如實施例299至340中任一例之gRNA，其中至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個經修飾之YA位點包含2'-OMe修飾，該修飾視情況位於YA位點之嘧啶處。 實施例342為如實施例299至341中任一例之gRNA，其中至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個經修飾之YA位點包含2'-氟修飾，該修飾視情況位於YA位點之嘧啶處。 實施例343為如實施例299至342中任一例之gRNA，其中至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個經修飾之YA位點包含PS修飾，該修飾視情況位於YA位點之嘧啶處。 實施例344為如實施例299至343中任一例之gRNA，其中至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個經修飾之YA位點包含2'位置處之核糖修飾，該修飾視情況位於YA位點之嘧啶處且視情況選自2'-O-烷基、2'-H及2'-氟修飾。 實施例345為如實施例299至344中任一例之gRNA，其中： i. 保守區YA位點1及8包含2'-氟修飾，該等修飾視情況位於YA位點之嘧啶處； ii.     保守區YA位點5及6；5及7；5及9；6及7；6及9；5、6及7；5、6及9；6、7及9；或5、6、7及9包含2'-OMe修飾，該等修飾視情況位於YA位點之嘧啶處； iii.    保守區YA位點1包含2'-氟修飾且保守區YA位點5及6；5及7；5及9；6及7；6及9；5、6及7；5、6及9；6、7及9；或5、6、7及9包含2'-OMe修飾，該等修飾視情況位於YA位點之嘧啶處； iv.     保守區YA位點8包含2'-氟修飾且保守區YA位點5及6；5及7；5及9；6及7；6及9；5、6及7；5、6及9；6、7及9；或5、6、7及9包含2'-OMe修飾，該等修飾視情況位於YA位點之嘧啶處； v. 保守區YA位點1包含在YA位點之嘧啶處之2'-氟修飾，且YA位點5及6；5及7；5及9；6及7；6及9；5、6及7；5、6及9；6、7及9；或5、6、7及9包含2'-OMe修飾，該等修飾視情況位於YA位點之嘧啶處； vi.    保守區YA位點8包含在YA位點之嘧啶處的2'-氟修飾，且YA位點5及6；5及7；5及9；6及7；6及9；5、6及7；5、6及9；6、7及9；或5、6、7及9包含2'-OMe修飾，該等修飾視情況位於YA位點之嘧啶處； vii.   保守區YA位點1及8包含2'-氟修飾，且保守區YA位點5及6；5及7；5及9；6及7；6及9；5、6及7；5、6及9；6、7及9；或5、6、7及9包含2'-OMe修飾，該等修飾視情況位於YA位點之嘧啶處；或 viii.  保守區YA位點1及8包含在YA位點之嘧啶處的2'-氟修飾，且保守區YA位點5及6；5及7；5及9；6及7；6及9；5、6及7；5、6及9；6、7及9；或5、6、7及9包含2'-OMe修飾，該等修飾視情況位於YA位點之嘧啶處。 實施例346為如實施例299至345中任一例之gRNA，其中保守區YA位點7及9包含YA修飾，該等修飾視情況為2'-OMe修飾。 實施例347為如實施例299至346中任一例之gRNA，其中保守區YA位點5、6、7及9包含YA修飾，該等修飾視情況為2'-OMe修飾。 實施例348為如實施例299至347中任一例之gRNA，其中保守區YA位點8包含2'-氟修飾。 實施例349為如實施例299至348中任一例之gRNA，其中保守區YA位點8包含去氧核糖核苷酸修飾。 實施例350為如實施例299至349中任一例之gRNA，其中保守區YA位點8藉由鹼基取代來消除，視情況，其中鹼基取代消除YA位點8之尿嘧啶，另外視情況，其中鹼基取代為尿嘧啶經鳥嘌呤取代。 實施例351為如實施例299至350中任一例之gRNA，其中保守區YA位點1包含2'-氟修飾。 實施例352為如實施例299至351中任一例之gRNA，其中保守區YA位點1包含PS修飾。 實施例353為如實施例299至352中任一例之gRNA，其中LS5、LS7、LS8、LS9、LS10、LS11及LS12中之1、2、3、4、5、6或7者包含修飾，視情況，其中該等修飾為2'-氟及/或2'-OMe修飾。 實施例354為如實施例299至353中任一例之gRNA，其中LS5、LS7、LS9及LS11之修飾若存在，則包含2'-氟修飾，視情況，其中LS5、LS7、LS9及LS11中的每一者包含2'-氟修飾。 實施例355為如實施例299至354中任一例之gRNA，其中LS8、LS10及LS12之修飾若存在，則包含2'-OMe修飾，視情況，其中LS8、LS10及LS12中的每一者包含2'-OMe修飾。 實施例356為如實施例299至355中任一例之gRNA，其中N2、N3、N4、N5、N6、N7、N10、N11、N16及N17中之1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者包含修飾，該等修飾視情況為2'-OMe修飾。 實施例357為如實施例299至356中任一例之gRNA，其中H2-2包含修飾，視情況，其中H2未以其他方式經修飾。 實施例358為如實施例299至357中任一例之gRNA，其中H2-2包含2'-OMe修飾。 實施例359為如實施例299至358中任一例之gRNA，其中US3、US9及US12包含修飾，視情況，其中US未以其他方式經修飾。 實施例360為如實施例299至359中任一例之gRNA，其中US3、US9及US12包含2'-OMe修飾。 實施例361為如實施例299至360中任一例之gRNA，其中5'末端之5'端的核苷酸6至10包含PS修飾，且5'末端之5'端的核苷酸8至11、13、14、17及18包含2'-氟修飾。 實施例362為如實施例299至361中任一例之gRNA，其中各引導區YA位點包含2'-氟修飾，視情況除5'末端之5'端的核苷酸15及/或16之外。 實施例363為如實施例299至362中任一例之gRNA，其中5'末端之5'端的核苷酸4、8及11包含YA修飾，視情況其中核苷酸4包含2'-OMe修飾且核苷酸8及11包含2'-氟修飾。 實施例364為如實施例299至363中任一例之gRNA，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個經修飾之YA位點包含在YA位點之嘧啶位置處的YA修飾。 實施例365為如實施例364之gRNA，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個經修飾之保守區YA位點包含在YA位點之嘧啶位置處的YA修飾。 實施例366為如實施例299至365中任一例之gRNA，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個經修飾之YA位點包含在YA位點之腺嘌呤位置處的YA修飾。 實施例367為如實施例366之gRNA，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個經修飾之保守區YA位點包含在YA位點之腺嘌呤位置處的YA位點修飾。 實施例368為如實施例299至367中任一例之gRNA，其包含： i. H1-1之修飾； ii.     H2-1之修飾；或 iii.    H1-1及H2-1之修飾。 實施例369為如實施例368之gRNA，其中H1-1及/或H2-1包含2'-OMe修飾。 實施例370為如實施例369之gRNA，其中H1-1及/或H2-1包含2'-氟修飾。 實施例371為如實施例370之gRNA，其中H1-1及/或H2-1包含PS修飾。 實施例372為如實施例299至371中任一例之gRNA，其包含B3處之修飾，視情況，其中B6不包含2'-OMe修飾或包含不同於2'-OMe的修飾。 實施例373為如實施例299至372中任一例之gRNA，其包含B4處之修飾，視情況，其中B6不包含2'-OMe修飾或包含不同於2'-OMe之修飾。 實施例374為如實施例299至373中任一例之gRNA，其包含B5處之修飾，視情況，其中B6不包含2'-OMe修飾或包含不同於2'-OMe的修飾。 實施例375為如實施例299至374中任一例之gRNA，其包含LS10處之修飾，視情況，其中LS10包含不同於2'-氟的修飾。 實施例376為如實施例299至375中任一例之gRNA，其包含N2處之修飾。 實施例377為如實施例299至376中任一例之gRNA，其包含N3處之修飾。 實施例378為如實施例299至377中任一例之gRNA，其包含N4處之修飾。 實施例379為如實施例299至378中任一例之gRNA，其包含N5處之修飾。 實施例380為如實施例299至379中任一例之gRNA，其包含N6處之修飾。 實施例381為如實施例299至380中任一例之gRNA，其包含N7處之修飾。 實施例382為如實施例299至381中任一例之gRNA，其包含N10處之修飾。 實施例383為如實施例299至382中任一例之gRNA，其包含N11處之修飾。 實施例384為如實施例299至383中任一例之gRNA，其中： i. 5'末端之5'端的核苷酸8不包含2'-氟修飾； ii.     5'末端之5'端的核苷酸9不包含2'-氟修飾； iii.    5'末端之5'端的核苷酸10不包含2'-氟修飾； iv.     5'末端之5'端的核苷酸11不包含2'-氟修飾； v. 5'末端之5'端的核苷酸13不包含2'-氟修飾； vi.    5'末端之5'端的核苷酸14不包含2'-氟修飾； vii.   5'末端之5'端的核苷酸17不包含2'-氟修飾；及/或 viii.  5'末端之5'端的核苷酸18不包含2'-氟修飾。 實施例385為如實施例299至384中任一例之gRNA，其中： i. 5'末端之5'端的核苷酸6不包含2'-氟修飾； ii.     5'末端之5'端的核苷酸7不包含2'-氟修飾； iii.    5'末端之5'端的核苷酸8不包含2'-氟修飾； iv.     5'末端之5'端的核苷酸9不包含2'-氟修飾；及/或 v. 5'末端之5'端的核苷酸10不包含2'-氟修飾。 實施例386為如實施例299至385中任一例之gRNA，其中： i. 5'末端之5'端的核苷酸6不包含硫代磷酸酯鍵聯； ii.     5'末端之5'端的核苷酸7不包含硫代磷酸酯鍵聯； iii.    5'末端之5'端的核苷酸8不包含硫代磷酸酯鍵聯； iv.     5'末端之5'端的核苷酸9不包含硫代磷酸酯鍵聯；及/或 v. 5'末端之5'端的核苷酸10不包含硫代磷酸酯鍵聯。 實施例387為如實施例299至386中任一例之gRNA，其中： i. 5'末端之5'端的核苷酸7不包含2'-OMe修飾； ii.     5'末端之5'端的核苷酸8不包含2'-OMe修飾； iii.    5'末端之5'端的核苷酸9不包含2'-OMe修飾；及/或 iv.     5'末端之5'端的核苷酸10不包含2'-OMe修飾。 實施例388為如實施例299至387中任一例之gRNA，其中5'末端之5'端的核苷酸20不包含2'-OMe修飾。 實施例389為如實施例299至388中任一例之gRNA，其中引導RNA包含在5'末端之5'端的核苷酸1至11及13至20中的任一者或多者處的2'-氟修飾且5'末端之5'端的核苷酸12不包含2'-氟修飾。 實施例390為如實施例299至389中任一例之gRNA，其中引導RNA包含在5'末端之5'端的核苷酸1至20中之任一者或多者處的2'-氟修飾，並且： i. 5'末端之5'端的核苷酸11不包含2'-氟修飾； ii.     5'末端之5'端的核苷酸12不包含2'-氟修飾； iii.    5'末端之5'端的核苷酸13不包含2'-氟修飾； iv.     5'末端之5'端的核苷酸14不包含2'-氟修飾； v. 5'末端之5'端的核苷酸17不包含2'-氟修飾；及/或 vi.    5'末端之5'端的核苷酸18不包含2'-氟修飾。 實施例391為如實施例299至390中任一例之gRNA，其中： i. B2不包含2'-OMe修飾； ii.     B3不包含2'-OMe修飾； iii.    B4不包含2'-OMe修飾；及/或 iv.     B5不包含2'-OMe修飾。 實施例392為如實施例299至391中任一例之gRNA，其中： i. LS1不包含2'-OMe修飾； ii.     LS8不包含2'-OMe修飾；及/或 iii.    LS10不包含2'-OMe修飾。 實施例393為如實施例299至392中任一例之gRNA，其中： i. N2不包含2'-OMe修飾； ii.     N3不包含2'-OMe修飾； iii.    N4不包含2'-OMe修飾； iv.     N5不包含2'-OMe修飾； v. N6不包含2'-OMe修飾； vi.    N7不包含2'-OMe修飾； vii.   N10不包含2'-OMe修飾； viii.  N11不包含2'-OMe修飾； ix.    N16不包含2'-OMe修飾；及/或 x. N17不包含2'-OMe修飾。 實施例394為如實施例299至393中任一例之gRNA，其中： i. H1-2不包含硫代磷酸酯鍵聯； ii.     H1-3不包含硫代磷酸酯鍵聯； iii.    H1-4不包含硫代磷酸酯鍵聯； iv.     H1-5不包含硫代磷酸酯鍵聯； v. H1-6不包含硫代磷酸酯鍵聯； vi.    H1-7不包含硫代磷酸酯鍵聯； vii.   H1-8不包含硫代磷酸酯鍵聯； viii.  H1-9不包含硫代磷酸酯鍵聯； ix.    H1-10不包含硫代磷酸酯鍵聯； x. H2-1不包含硫代磷酸酯鍵聯； xi.    H2-2不包含硫代磷酸酯鍵聯； xii.   H2-3不包含硫代磷酸酯鍵聯； xiii.  H2-4不包含硫代磷酸酯鍵聯； xiv.   H2-5不包含硫代磷酸酯鍵聯； xv.    H2-6不包含硫代磷酸酯鍵聯； xvi.   H2-7不包含硫代磷酸酯鍵聯； xvii.  H2-8不包含硫代磷酸酯鍵聯； xviii. H2-9不包含硫代磷酸酯鍵聯； xix.   H2-10不包含硫代磷酸酯鍵聯； xx.    H2-11不包含硫代磷酸酯鍵聯； xxi.   H2-12不包含硫代磷酸酯鍵聯； xxii.  H2-13不包含硫代磷酸酯鍵聯； xxiii. H2-14不包含硫代磷酸酯鍵聯；及/或 xxiv. H2-15不包含硫代磷酸酯鍵聯。 實施例395為如實施例299至394中任一例之gRNA，其中保守區YA位點1、5、6、7及9包含YA修飾，該等YA修飾視情況為2'-OMe修飾；且保守區YA位點8包含修飾，該修飾視情況為2'-氟修飾。 實施例396為如前述實施例中任一例之gRNA，其中以下中之一或多者為真： i. 5'末端之5'端的核苷酸4包含2'-OMe修飾； ii.     5'末端之5'端的核苷酸6至10包含PS修飾； iii.    5'末端之5'端的核苷酸8至11、13、14、17及18包含2'-氟修飾； iv.     LS5、LS7、LS9及LS11包含2'-氟修飾； v. LS8、LS10及LS12包含2'-OMe修飾； vi.    N2、N3、N4、N5、N6、N7、N10、N11、N16及N17包含2'-OMe修飾；且 vii.   N14包含2'-氟修飾。 實施例397為如實施例299至396中任一例之gRNA，其中至少一個YA修飾包含YA位點之嘧啶位置的修飾。 實施例398為如實施例299至397中任一例之gRNA，其中至少一個YA修飾包含YA位點之腺嘌呤位置的修飾。 實施例399為如實施例299至398中任一例之gRNA，其中至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個YA位點包含在YA位點之嘧啶位置處的YA修飾。 實施例400為如實施例299至399中任一例之gRNA，其中至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個YA位點包含在YA位點之腺嘌呤位置處的YA修飾。 實施例401為如實施例299至400中任一例之gRNA，其中至少一個YA修飾包含2'-OMe修飾。 實施例402為如實施例299至401中任一例之gRNA，其中至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個YA位點包含2'-OMe修飾。 實施例403為如實施例299至402中任一例之gRNA，其中每個經修飾之保守區YA位點包含在YA位點之嘧啶位置處的修飾。 實施例404為如實施例299至403中任一例之gRNA，其中每個經修飾之引導區YA位點或每個經修飾之保守區及引導區YA位點包含在YA位點之嘧啶位置處的修飾。 實施例405為如實施例299至404中任一例之gRNA，其中每個經修飾之保守區YA位點包含在YA位點之腺嘌呤位置處的修飾。 實施例406為如實施例299至405中任一例之gRNA，其中每個經修飾之引導區YA位點或每個經修飾之保守區及引導區YA位點包含在YA位點之嘧啶位置處的修飾。 實施例407為如實施例299至406中任一例之gRNA，其為包含LS5處之修飾的sgRNA。 實施例408為如實施例299至407中任一例之gRNA，其為包含LS7處之修飾的sgRNA。 實施例409為如實施例299至408中任一例之gRNA，其為包含LS9處之修飾的sgRNA，視情況，其中若LS9經修飾且LS5、LS7及LS12未經修飾，則LS9之修飾不同於2'-氟。 實施例410為如實施例299至409中任一例之gRNA，其為包含LS12處之修飾的sgRNA，視情況，其中若LS12經修飾且LS9未經修飾，則LS12之修飾不同於2'-OMe。 實施例411為如實施例299至410中任一例之gRNA，其為包含至少一個使二級結構穩定之YA修飾的sgRNA，視情況，其中該二級結構為下莖。 實施例412為如實施例299至411中任一例之gRNA，其為包含LS8及/或LS11之至少一個修飾的sgRNA，視情況，其中LS8及/或LS11之修飾使二級結構穩定。 實施例413為如實施例299至412中任一例之gRNA，其包含使二級結構穩定的YA修飾，該二級結構選自： i. ENA； ii.     LNA；或 iii.    雙環核糖修飾。 實施例414為如實施例299至413中任一例之gRNA，其為包含N6處之修飾的sgRNA。 實施例415為如實施例299至414中任一例之gRNA，其為包含N14處之修飾的sgRNA。 實施例416為如實施例299至415中任一例之gRNA，其為包含N17處之修飾的sgRNA，視情況，其中若N17經修飾且N6及N14未經修飾，則N17之修飾不同於2'-氟且不同於2'-OMe。 實施例417為如實施例299至416中任一例之gRNA，其中5'末端之5'端的核苷酸1至3中的至少1、2或3者包含去氧核糖核苷酸，視情況，其中5'末端之5'端的核苷酸1至3包含PS修飾。 實施例418為如實施例299至417中任一例之gRNA，其中該gRNA為sgRNA且3'末端之3'端的核苷酸1至3中的至少1、2或3者包含去氧核糖核苷酸，視情況，其中3'末端之3'端的核苷酸2至3包含PS修飾。 實施例419為如實施例299至418中任一例之gRNA，其中該gRNA為sgRNA且3'末端之3'端的核苷酸4包含PS修飾，視情況，其中3'末端之3'端的核苷酸4包含2'-OMe修飾。 實施例420為如實施例299至419中任一例之gRNA，其中gRNA為sgRNA且髮夾2包含去氧核糖核苷酸，視情況，其中髮夾1及髮夾2之所有核苷酸或除1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸外之所有核苷酸為去氧核糖核苷酸。 實施例421為如實施例299至420中任一例之gRNA，其中gRNA為sgRNA且髮夾1及髮夾2包含去氧核糖核苷酸，視情況，其中髮夾1及髮夾2之所有核苷酸或除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個核苷酸外之所有核苷酸為去氧核糖核苷酸。 實施例422為如實施例299至421中任一例之gRNA，其中gRNA為sgRNA且自髮夾1之起點至sgRNA之3'端的所有核苷酸或除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個核苷酸外的所有核苷酸為去氧核糖核苷酸，視情況，其中3'末端之3'端的核苷酸1至3為去氧核糖核苷酸。 實施例423為如實施例299至422中任一例之gRNA，其中gRNA為sgRNA且上莖包含去氧核糖核苷酸。 實施例424為如實施例299至423中任一例之gRNA，其中gRNA為sgRNA且上莖中的所有核苷酸或除1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸之外的所有核苷酸為去氧核糖核苷酸。 實施例425為如實施例299至424中任一例之gRNA，其中5'末端之5'端的核苷酸1至3中的至少1、2或3者包含ENA，視情況，其中5'末端之5'端的核苷酸1至3包含PS修飾。 實施例426為如實施例299至425中任一例之gRNA，其中gRNA為sgRNA且3'末端之3'端的核苷酸2至4中的至少1、2或3者包含ENA，視情況，其中3'末端之3'端的核苷酸2至3包含PS修飾。 實施例427為如實施例299至426中任一例之gRNA，其中5'末端之5'端的核苷酸1至3中的至少1、2或3者包含UNA，視情況，其中5'末端之5'端的核苷酸1至3包含PS修飾。 實施例428為如實施例299至427中任一例之gRNA，其中gRNA為sgRNA且3'末端之3'端的核苷酸2至4中的至少1、2或3者包含UNA，視情況，其中3'末端之3'端的核苷酸2至3包含PS修飾。 實施例429為如實施例299至428中任一例之gRNA，其中gRNA為sgRNA且3'末端之3'端的核苷酸4包含PS修飾，視情況，其中3'末端之3'端的核苷酸4包含2'-OMe修飾。 實施例430為如實施例299至429中任一例之gRNA，其中修飾減少gRNA降解而不顯著改變引導物使目標核酸裂解的能力。 實施例431為如實施例299至430中任一例之gRNA，其包含YA修飾，其中該修飾包含2'-氟、2'-H、2'-O-Me、ENA、UNA或PS。 實施例432為如實施例299至431中任一例之gRNA，其包含YA修飾，其中該修飾改變二核苷酸基元結構以減少RNA核酸內切酶活性。 實施例433為如實施例299至432中任一例之gRNA，其包含YA修飾，其中該修飾干擾核糖核酸酶對YA位點的識別或裂解及/或使RNA結構穩定。 實施例434為如實施例299至433中任一例之gRNA，其包含YA修飾，其中該修飾包含以下中之一或多者： i. 核糖修飾，其選自2'-O-烷基、2'-F、2'-moe、2'-F***糖及2'-H (去氧核糖)； ii.     雙環核糖類似物，諸如LNA、BNA及ENA； iii.    未鎖定之核酸修飾； iv.     鹼基修飾，諸如肌苷、假尿苷及5'-甲基胞嘧啶；及 v. 核苷間鍵聯修飾，諸如硫代磷酸酯。 實施例435為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含含有位於核苷酸5處之修飾的引導區，視情況，其中該引導區包含位於核苷酸1至4處之2'-OMe修飾、位於核苷酸1至3及6至10處之硫代磷酸酯修飾，及/或位於核苷酸8至11、13、14、17及18處之2'-F修飾。 實施例436為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含含有位於核苷酸12處之修飾的引導區，視情況，其中該引導區包含位於核苷酸1至4處之2'-OMe修飾、位於核苷酸1至3及6至10處之硫代磷酸酯修飾，及/或位於核苷酸8至11、13、14、17及18處之2'-F修飾。 實施例437為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含含有位於核苷酸5及/或核苷酸12處之2'-OMe修飾的引導區，視情況，其中該引導區包含位於核苷酸1至4處之2'-OMe修飾、位於核苷酸1至3及6至10處之硫代磷酸酯修飾，及/或位於核苷酸8至11、13、14、17及18處之2'-F修飾。 實施例438為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含含有位於核苷酸5及/或核苷酸12處之2'-F修飾的引導區，視情況，其中該引導區包含位於核苷酸1至4處之2'-OMe修飾、位於核苷酸1至3及6至10處之硫代磷酸酯修飾，及/或位於核苷酸8至11、13、14、17及18處之2'-F修飾。 實施例439為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含含有位於核苷酸5及/或核苷酸12處之2'-H修飾的引導區，視情況，其中該引導區包含位於核苷酸1至4處之2'-OMe修飾、位於核苷酸1至3及6至10處之硫代磷酸酯修飾，及/或位於核苷酸8至11、13、14、17及18處之2'-F修飾。 實施例440為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含含有位於核苷酸5及/或核苷酸12處之硫代磷酸酯修飾的引導區，視情況，其中該引導區包含位於核苷酸1至4處之2'-OMe修飾、位於核苷酸1至3及6至10處之硫代磷酸酯修飾，及/或位於核苷酸8至11、13、14、17及18處之2'-F修飾。 實施例441為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含引導區，該引導區包含以下處之修飾： i. 核苷酸8至10； ii.     核苷酸8及9； iii.    核苷酸8及10；或 iv.     核苷酸9及10， 視情況，其中該引導區包含位於核苷酸1至4處之2'-OMe修飾、位於核苷酸1至3及6至7處之硫代磷酸酯修飾，及/或位於核苷酸11、13、14、17及18處之2'-F修飾。 實施例442為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含引導區，該引導區包含以下處之2'-F修飾： i. 核苷酸8至10； ii.     核苷酸8及9； iii.    核苷酸8及10； iv.     核苷酸9及10；或 v. 核苷酸8； 視情況，其中該引導區包含位於核苷酸1至4處之2'-OMe修飾、位於核苷酸1至3及6至7處之硫代磷酸酯修飾，及/或位於核苷酸11、13、14、17及18處之2'-F修飾。 實施例443為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含引導區，該引導區包含以下處之2'-F修飾： i. 核苷酸8至10； ii.     核苷酸8及9； iii.    核苷酸8及10； iv.     核苷酸9及10；或 v. 核苷酸8； 其中核苷酸8至10不包含硫代磷酸酯修飾，且視情況其中引導區包含位於核苷酸1至4處之2'-OMe修飾、位於核苷酸1至3及6至7處之硫代磷酸酯修飾，及/或位於核苷酸11、13、14、17及18處之2'-F修飾。 實施例444為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含引導區，該引導區包含核苷酸8至10處之2'-F修飾，及： i. 位於核苷酸8至10中之1、2或3者處的硫代磷酸酯修飾； ii.     核苷酸8處之硫代磷酸酯修飾； iii.    核苷酸9處之硫代磷酸酯修飾； iv.     核苷酸10處之硫代磷酸酯修飾； v. 核苷酸8及9處之硫代磷酸酯修飾； vi.    核苷酸8及10處之硫代磷酸酯修飾； vii.   核苷酸9及10處之硫代磷酸酯修飾；或 viii.  核苷酸8至10處之硫代磷酸酯修飾 視情況，其中該引導區包含位於核苷酸1至4處之2'-OMe修飾、位於核苷酸1至3及6至7處之硫代磷酸酯修飾，及/或位於核苷酸11、13、14、17及18處之2'-F修飾。 實施例445為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含引導區，該引導區包含： i. 核苷酸5及6處之2'-F或硫代磷酸酯修飾； ii.     核苷酸5及6處之2'-F修飾； iii.    核苷酸5及6處之硫代磷酸酯修飾； iv.     核苷酸5處之2'-F修飾及核苷酸6處之硫代磷酸酯修飾；或 v. 核苷酸6處之2'-F修飾及核苷酸5處之硫代磷酸酯修飾； 視情況，其中該引導區包含位於核苷酸1至4處之2'-OMe修飾、位於核苷酸1至3及7至10處之硫代磷酸酯修飾，及/或位於核苷酸8至11、13、14、17及18處之2'-F修飾。 實施例446為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含引導區，該引導區包含位於核苷酸6至11中之至少1、2、3、4、5或6者處的2'-F修飾，視情況，其中該引導區包含位於核苷酸1至4處之2'-OMe修飾、位於核苷酸1至3處之硫代磷酸酯修飾，及/或位於核苷酸13、14、17及18處之2'-F修飾。 實施例447為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含引導區，該引導區包含位於核苷酸1至4及6至11中之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者處的2'-F修飾，視情況，其中引導區包含位於核苷酸1至3處之硫代磷酸酯修飾及/或位於核苷酸13、14、17及18處之2'-F修飾。 實施例448為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含引導區，該引導區包含位於核苷酸6至11處的2'-F修飾，視情況，其中該引導區包含位於核苷酸1至4處之2'-OMe修飾、位於核苷酸1至3處之硫代磷酸酯修飾，及/或位於核苷酸13、14、17及18處之2'-F修飾。 實施例449為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含引導區，該引導區含有位於核苷酸1至4處之2'-F修飾，視情況，其中該引導區包含位於核苷酸1至3及6至10處之硫代磷酸酯修飾及/或位於核苷酸6至11、13、14、17及18處之2'-F修飾。 實施例450為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含引導區，該引導區包含位於核苷酸9處之2'-F修飾且不包含位於核苷酸9處之硫代磷酸酯修飾，視情況，其中該引導區包含位於核苷酸1至4處之2'-OMe修飾、位於核苷酸1至3及6至8及10處之硫代磷酸酯修飾，及/或位於核苷酸8、10、11、13、14、17及18處之2'-F修飾。 實施例451為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含引導區，該引導區不包含位於核苷酸8至11、13、14、17及18中之至少1、2、3、4、5、6、7或8者處的2'-F修飾，視情況，其中引導區包含位於核苷酸1至4處之2'-OMe修飾及/或位於核苷酸1至3及6至10處之硫代磷酸酯修飾。 實施例452為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含引導區，該引導區不包含位於核苷酸8至11、13、14、17及18處的2'-F修飾，視情況，其中該引導區包含位於核苷酸1至4處之2'-OMe修飾及/或位於核苷酸1至3及6至10處之硫代磷酸酯修飾。 實施例453為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含引導區，該引導區包含位於核苷酸9、11、13及14中之至少1、2、3或4者處的2'-OMe修飾，視情況，其中引導區包含核苷酸1至4處之2'-OMe修飾及/或核苷酸1至3及6至10處之硫代磷酸酯修飾。 實施例454為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含引導區，該引導區包含位於核苷酸9、11、13及14處之2'-OMe修飾，視情況，其中該引導區包含位於核苷酸1至4處之2'-OMe修飾及/或位於核苷酸1至3及6至10處之硫代磷酸酯修飾。 實施例455為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含引導區，該引導區包含位於核苷酸8及10中之一或兩者處的硫代磷酸酯修飾，視情況，其中該引導區包含位於核苷酸1至4處之2'-OMe修飾、位於核苷酸1至3及6至7處之硫代磷酸酯修飾，及/或位於核苷酸8至11、13、14、17及18處之2'-F修飾。 實施例456為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含引導區，該引導區包含位於以下核苷酸中之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13者或所有者處之修飾：1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、13、14、17及18，視情況，其中修飾為2'-OMe、2'-氟或硫代磷酸酯修飾。 實施例457為如前述實施例中任一例之gRNA，其中gRNA包含引導區，該引導區包含位於核苷酸1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、13、14、17及18處之修飾，視情況，其中修飾為2'-OMe、2'-氟或硫代磷酸酯修飾。 實施例458為如前述實施例中任一例之gRNA，其中2'-OMe修飾不存在於引導區中之核苷酸6至11及13端處。 實施例459為如前述實施例中任一例之gRNA，其中2'-氟修飾不存在於引導區中之核苷酸1至7、15、16及19端處。 實施例460為如前述實施例中任一例之gRNA，其中硫代磷酸酯修飾不存在於引導區中之核苷酸4、5、11至14、17及18處。 實施例461為如前述實施例中任一例之gRNA，其中引導區包含未經修飾之核苷酸20。 實施例462為如前述實施例中任一例之gRNA，其中引導區由20個核苷酸組成。 實施例463為如前述實施例中任一例之gRNA，其中引導區包含核苷酸5至6處之YA位點及核苷酸5處之修飾。 實施例464為如前述實施例中任一例之gRNA，其中引導區包含核苷酸12至13處之YA位點及核苷酸12處之修飾。 實施例465為如前述實施例中任一例之gRNA，其中引導區包含核苷酸15至16處之YA位點及核苷酸15處之修飾。 實施例466為如前述實施例中任一例之gRNA，其中引導區包含核苷酸16至17處之YA位點及核苷酸16處之修飾。 實施例467為如前述實施例中任一例之gRNA，其中引導區包含核苷酸19至20處之YA位點及核苷酸19處之修飾。 實施例468為如前述實施例中任一例之gRNA，其中該引導區不包含核苷酸5至6處之YA位點且核苷酸5未經修飾。 實施例469為如前述實施例中任一例之gRNA，其中該引導區不包含核苷酸12至13處之YA位點且核苷酸12未經修飾。 實施例470為如前述實施例中任一例之gRNA，其中該引導區不包含核苷酸15至16處之YA位點且核苷酸15未經修飾。 實施例471為如前述實施例中任一例之gRNA，其中該引導區不包含核苷酸16至17處之YA位點且核苷酸16未經修飾。 實施例472為如前述實施例中任一例之gRNA，其中該引導區不包含核苷酸19至20處之YA位點且核苷酸19未經修飾。 實施例473為如前述實施例中任一例之gRNA，其中該gRNA包含引導區，該引導區包含以下中之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13者或所有者： i. 核苷酸1處之2'-OMe及硫代磷酸酯修飾； ii.     核苷酸2處之2'-OMe及硫代磷酸酯修飾； iii.    核苷酸3處之2'-OMe及硫代磷酸酯修飾； iv.     核苷酸4處之2'-OMe修飾； v. 核苷酸6處之硫代磷酸酯修飾； vi.    核苷酸7處之硫代磷酸酯修飾； vii.   核苷酸8處之2'-氟及硫代磷酸酯修飾； viii.  核苷酸9處之2'-氟及硫代磷酸酯修飾； ix.    核苷酸10處之2'-氟及硫代磷酸酯修飾； x. 核苷酸11處之2'-氟修飾； xi.    核苷酸13處之2'-氟修飾； xii.   核苷酸14處之2'-氟修飾； xiii.  核苷酸17處之2'-氟修飾；及 xiv.   核苷酸18處之2'-氟修飾。 實施例474為如前述實施例中任一例之gRNA，其中該引導區包含前述實施例中所闡述之各修飾。 實施例475為如前述實施例中任一例之gRNA，其中引導區包含以下中之至少1、2、3或4者： i. 若核苷酸5與6形成YA位點，則為核苷酸5處之2'-OMe修飾； ii.     若核苷酸12與13形成YA位點，則為核苷酸12處之2'-OMe修飾； iii.    若核苷酸15與16形成YA位點，則為核苷酸15處之硫代磷酸酯或2'-H修飾； iv.     若核苷酸16與17形成YA位點，則為核苷酸16處之硫代磷酸酯修飾；及 v. 若核苷酸19與20形成YA位點，則為核苷酸19處之硫代磷酸酯或2'-氟修飾。 實施例476為如前述實施例中任一例之gRNA，其中引導區包含核苷酸5至6處之YA位點及核苷酸5處之2'-OMe修飾。 實施例477為如前述實施例中任一例之gRNA，其中引導區包含核苷酸12至13處之YA位點及核苷酸12處之2'-OMe修飾。 實施例478為如前述實施例中任一例之gRNA，其中引導區包含核苷酸15至16處之YA位點及核苷酸15處之硫代磷酸酯修飾。 實施例479為如前述實施例中任一例之gRNA，其中引導區包含核苷酸16至17處之YA位點及核苷酸16處之硫代磷酸酯修飾。 實施例480為如前述實施例中任一例之gRNA，其中引導區包含核苷酸19至20處之YA位點及核苷酸19處之硫代磷酸酯修飾。 實施例481為如前述實施例中任一例之gRNA，其中引導區包含核苷酸19處之2'-氟修飾。 實施例482為如前述實施例中任一例之gRNA，其中引導區包含未經修飾之核苷酸15或僅包含核苷酸15處之硫代磷酸酯修飾。 實施例483為如前述實施例中任一例之gRNA，其中引導區包含未經修飾之核苷酸16或僅包含核苷酸16處之硫代磷酸酯修飾。 實施例484為一種LNP組合物，其包含如前述實施例中任一例之gRNA。 實施例485為一種組合物，其包含與脂質奈米顆粒(LNP)締合之如實施例1至483中任一例之gRNA。 實施例486為一種組合物，其包含如實施例1至483中任一例之gRNA，或如實施例452至453中任一例之組合物，其進一步包含核酸酶或編碼核酸酶的mRNA。 實施例487為如實施例486之組合物，其中該核酸酶為Cas蛋白。 實施例488為如實施例487之組合物，其中該Cas蛋白為Cas9。 實施例489為如實施例488之組合物，其中Cas9為釀膿鏈球菌Cas9或金黃色葡萄球菌Cas9。 實施例490為如實施例485至489中任一例之組合物，其中該核酸酶為切口酶或dCas。 實施例491為如實施例485至490中任一例之組合物，其中該核酸酶經修飾。 實施例492為如實施例491之組合物，其中該經修飾之核酸酶包含核定位信號(NLS)。 實施例493為如實施例484至492中任一例之組合物，其包含編碼核酸酶的mRNA。 實施例494為如實施例493之組合物，其中該mRNA包含SEQ ID NO: 1099-1127或1129-1146中之任一者的序列。 實施例495為一種醫藥調配物，其包含如實施例1至483中任一例之gRNA或如實施例484至494中任一例之組合物及醫藥學上可接受之載劑。 實施例496為一種修飾目標DNA的方法，其包含將Cas蛋白或編碼Cas蛋白之核酸及以下中之任一者或多者遞送至細胞： i. 如實施例1至483中任一例之gRNA； ii.     如實施例484至494中任一例之組合物；及 iii.    如實施例495之醫藥調配物。 實施例497為如實施例496之方法，其中該方法引起基因***或缺失。 實施例498為如實施例496或實施例497之方法，其進一步包含將模板遞送至細胞，其中該模板之至少一部分在Cas蛋白所誘導的雙股斷裂位點處或附近併入至目標DNA中。 實施例499為如實施例1至483中任一例之gRNA，如實施例484至494之組合物，或如實施例495之醫藥調配物，其用於製備供治療疾病或病症用的藥劑。 實施例500為如實施例1至483中任一例之gRNA、如實施例484至494之組合物或如實施例495之醫藥調配物的用途，其用於製造供治療疾病或病症用之藥劑。 實施例A1.    一種引導RNA (gRNA)，其包含5'端修飾或3'端修飾及gRNA之保守部分，該保守部分包含以下中之一或多者： (a)經縮短髮夾1區或經取代且視情況經縮短髮夾1區，其中 (i)以下核苷酸對中之至少一者在經取代及視情況經縮短髮夾1中經華特生-克里克配對核苷酸取代：H1-1及H1-12、H1-2及H1-11、H1-3及H1-10及/或H1-4及H1-9，且該髮夾1區視情況缺乏 (aa)H1-5至H1-8中之任一者或兩者， (bb)以下核苷酸對中之一者、兩者或三者：H1-1及H1-12、H1-2及H1-11、H1-3及H1-10、及/或H1-4及H1-9，及/或 (cc)該髮夾1區之1至8個核苷酸；或 (ii)該經縮短髮夾1區缺乏6至8個核苷酸，較佳6個核苷酸；及 (A)位置H1-1、H1-2或H1-3中之一或多者相對於SEQ ID NO: 400缺失或經取代，及/或 (B)位置H1-6至H1-10中之一或多者相對於SEQ ID NO: 400經取代；或 (iii)該經縮短髮夾1區缺乏5至10個核苷酸，較佳地5至6個核苷酸，且位置N18、H1-12或n中之一或多者相對於SEQ ID NO: 400經取代；及/或 (b)縮短上莖區，其中經縮短上莖區缺乏1至6個核苷酸，且其中經縮短上莖區之6、7、8、9、10或11個核苷酸包括相對於SEQ ID NO: 400少於或等於4個取代；及/或 (c)在LS6、LS7、US3、US10、B3、N7、N15、N17、H2-2及H2-14中之任一者或多者處相對於SEQ ID NO: 400的取代，其中取代基核苷酸既不為隨後為腺嘌呤之嘧啶，亦不為在嘧啶之前的腺嘌呤；及/或 (d)上莖區，其中該上莖修飾包含對該上莖區中之US1至US12中之任一者或多者的修飾。 實施例A2.    如實施例A1之gRNA，其中位置H1-1缺失。 實施例A3.    如實施例A1之gRNA，其中位置H1-1經取代。 實施例A4.    如實施例A1至A3中任一例之gRNA，其中位置H1-2缺失。 實施例A5.    如實施例A1至A3中任一例之gRNA，其中位置H1-2經取代。 實施例A6.    如實施例A1至A5中任一例之gRNA，其中位置H1-3缺失。 實施例A7.    如實施例A1至A5中任一例之gRNA，其中位置H1-3經取代。 實施例A8.    如實施例A1至A7中任一例之gRNA，其中位置H1-4缺失。 實施例A9.    如實施例A1至A7中任一例之gRNA，其中位置H1-5缺失。 實施例A10.  如實施例A1至A9中任一例之gRNA，其中位置H1-6缺失。 實施例A11.  如實施例A1至A9中任一例之gRNA，其中位置H1-6經取代。 實施例A12.  如實施例A1至A11中任一例之gRNA，其中位置H1-7缺失。 實施例A13.  如實施例A1至A11中任一例之gRNA，其中位置H1-7經取代。 實施例A14.  如實施例A1至A13中任一例之gRNA，其中位置H1-8缺失。 實施例A15.  如實施例A1至A13中任一例之gRNA，其中位置H1-8經取代。 實施例A16.  如實施例A1至A15中任一例之gRNA，其中位置H1-9缺失。 實施例A17.  如實施例A1至A15中任一例之gRNA，其中位置H1-9經取代。 實施例A18.  如實施例A1至A17中任一例之gRNA，其中位置H1-10缺失。 實施例A19.  如實施例A1至A17中任一例之gRNA，其中位置H1-10經取代。 實施例A20.  如實施例A1至A19中任一例之gRNA，其中位置H1-11缺失。 實施例A21.  如實施例A1至A20中任一例之gRNA，其中位置H1-12缺失。 實施例A22.  如實施例A1至A21中任一例之gRNA，其中位置H1-11至H1-12缺失。 實施例A23.  如實施例A1至A22中任一例之gRNA，其中位置H1-7經G取代及/或H1-8經C取代。 實施例A24.  如實施例A1至A23中任一例之gRNA，其中位置H1-6及/或H1-7經取代。 實施例A25.  如實施例A1至A24中任一例之gRNA，其中位置H1-6經C取代及/或位置H1-7經U取代。 實施例A26.  如實施例A1至A25中任一例之gRNA，其中位置H1-1及/或H1-12經取代。 實施例A27.  如實施例A1至A26中任一例之gRNA，其中位置H1-1經C取代及/或位置H1-12經G取代。 實施例A28.  如實施例A1至A27中任一例之gRNA，其中位置N18經取代。 實施例A29.  如實施例A28之gRNA，其中位置N18經C取代。 實施例A30.  如實施例A1至A29中任一例之gRNA，其中位置H1-12經取代。 實施例A31.  如實施例A30之gRNA，其中位置H1-12經C或A取代。 實施例A32.  如實施例A1至A31中任一例之gRNA，其中位置n經取代。 實施例A33.  如實施例A32之gRNA，其中位置n經A取代。 實施例A34.  如實施例A1至A33中任一例之gRNA，其包含縮短上莖區，其中經縮短上莖區缺乏1至6個核苷酸。 實施例A35.  如實施例A1至A34中任一例之gRNA，其中gRNA為sgRNA。 實施例A36.  如實施例A1至A35中任一例之gRNA，其中gRNA包含5'端修飾。 實施例A37.  如實施例A1至A36中任一例之gRNA，其中gRNA包含3'端修飾。 實施例A38.  如實施例A1至A37中任一例之gRNA，其中該gRNA包含5'端修飾及3'端修飾。 實施例A39.  如實施例A1至A38中任一例之gRNA，其中該gRNA包含3'尾。 實施例A40.  如實施例A39之gRNA，其中3'尾包含1至2個、1至3個、1至4個、1至5個、1至7個、1至10個核苷酸或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。 實施例A41.  如實施例A1至A38中任一例之gRNA，其中該gRNA不包含3'尾。 實施例A42.  如實施例A1至A41中任一例之gRNA，其包含髮夾區中之修飾。 實施例A43.  如實施例A42之gRNA，其進一步包含3'端修飾。 實施例A44.  如實施例A42之gRNA，其進一步包含3'端修飾及5'端修飾。 實施例A45.  如實施例A42之gRNA，其進一步包含5'端修飾。 實施例A46.  如實施例A1至A45中任一例之gRNA，其進一步包含引導區。 實施例A47.  如實施例A46之gRNA，其中該引導區之長度為17、18、19或20個核苷酸。 實施例A48.  如實施例A1至A47中任一例之gRNA，其中3'及/或5'端修飾包含保護端修飾，視情況為選自以下之經修飾核苷酸：2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、反向無鹼基修飾之核苷酸，或其組合。 實施例A49.  如實施例A1至A48中任一例之gRNA，其中髮夾區中之修飾包含經修飾之核苷酸，其選自2'-O-甲基(2'-Ome)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯或其組合。 實施例A50.  如實施例A1至A49中任一例之gRNA，其中3'及/或5'端修飾包含或進一步包含2'-O-甲基(2'-Ome)修飾之核苷酸。 實施例A51.  如實施例A1至A50中任一例之gRNA，其中3'及/或5'端修飾包含或進一步包含2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。 實施例A52.  如實施例A1至A51中任一例之gRNA，其中該3'及/或5'端修飾包含或進一步包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。 實施例A53.  如實施例A1至A52中任一例之gRNA，其中該3'及/或5'端修飾包含或進一步包含反向無鹼基修飾之核苷酸。 實施例A54.  如實施例A1至A53中任一例之gRNA，其中髮夾區中之修飾包含或進一步包含2'-O-甲基(2'-Ome)修飾之核苷酸。 實施例A55.  如實施例A1至A54中任一例之gRNA，其中髮夾區中之修飾包含或進一步包含2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。 實施例A56.  如實施例A1至A55中任一例之gRNA，其中sgRNA包含3'尾，其中3'尾包含存在於3'尾中之任一個或多個核苷酸的修飾。 實施例A57.  如實施例A56之gRNA，其中該3'尾完全被修飾。 實施例A58.  如實施例A1至A57中任一例之gRNA，其中上莖區包含至少一個修飾。 實施例A59.  如實施例A58之gRNA，其中該上莖修飾包含以下中之任一者或多者： i. 上莖區中之US1至US12中之任一者或多者的修飾；及 ii.     上莖區中之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或所有12個核苷酸的修飾。 實施例A60.  如實施例A59之gRNA，其中該上莖修飾包含以下中之任一者或多者： i. 2'-OMe修飾之核苷酸； ii.     2'-O-moe修飾之核苷酸； iii.    2'-F修飾之核苷酸；及 iv.     (i.)至(iii.)中之一或多者之組合。 實施例A61.  如實施例A1至A60中任一例之gRNA，其包含與SEQ ID No: 1-98、201-294、401-494、601-698或801-875中之任一者之核苷酸序列具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70%一致性的核苷酸序列。 實施例A62.  如前述實施例A1至A61中任一例之gRNA，其包含與SEQ ID No: 101-198、301-394、501-594、701-798或901-975中之任一者之核苷酸序列具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70%一致性的核苷酸序列，其中在對應於表1A中之參考序列識別符之核苷酸的gRNA之各核苷酸處的修飾等同於或等效於表1A中之參考序列識別符中所示的修飾。 實施例A63.  一種引導RNA，其包含SEQ ID NO: 1-98、201-294、401-494、601-698或801-875中之任一者。 實施例A64.  一種引導RNA，其包含SEQ ID NO: 101-198、301-394、501-594、701-798或901-975中之任一者，包括表1A之修飾。 實施例A65.  如實施例A1至A64中任一例之gRNA，其包含一或多個引導區YA位點之YA修飾。 實施例A66.  如實施例A1至A65中任一例之gRNA，其包含YA修飾，其中該修飾包含2'-氟、2'-H、2'-OMe、ENA、UNA、肌苷或PS修飾。 實施例A67.  如實施例A1至A66中任一例之gRNA，其包含一或多個保守區YA位點之YA修飾。 實施例A68.  如實施例A1至A67中任一例之gRNA，其中至少一個經修飾之YA位點包含 (i)2'-OMe修飾，視情況屬於該YA位點之嘧啶； (ii)2'-氟修飾，視情況屬於該YA位點之嘧啶；及/或 (iii)PS修飾，視情況屬於該YA位點之嘧啶； 實施例A69.  一種LNP組合物，其包含如實施例A1至A68中任一例之gRNA。 實施例A70.  一種組合物，其包含與脂質奈米顆粒(LNP)締合之如實施例A1至A68中任一例之gRNA。 實施例A71.  一種組合物，其包含如實施例A1至A68中任一例之gRNA或如實施例A69或A70之組合物，其進一步包含核酸酶或編碼核酸酶之mRNA。 實施例A72.  如實施例A71之組合物，其中核酸酶為Cas蛋白。 實施例A73.  如實施例A72之組合物，其中該Cas蛋白為Cas9。 實施例A74.  如實施例A73之組合物，其中該Cas9為釀膿鏈球菌Cas9或金黃色葡萄球菌Cas9。 實施例A75.  如實施例A71至A74中任一例之組合物，其中該核酸酶為切口酶或dCas。 實施例A76.  如實施例A71至A75中任一例之組合物，其中核酸酶經修飾。 實施例A77.  如實施例A76之組合物，其中該經修飾之核酸酶包含核定位信號(NLS)。 實施例A78.  如實施例A71至A77中任一例之組合物，其包含編碼該核酸酶之mRNA。 實施例A79.  如實施例A78之組合物，其中該mRNA包含SEQ ID NO: 1099-1127或1129-1146中之任一者之序列。 實施例A80.  一種醫藥調配物，其包含如實施例A1至A68中任一例之gRNA或如實施例A69至A79中任一例之組合物及醫藥學上可接受之載劑。 實施例A81.  一種修飾目標DNA的方法，其包含將Cas蛋白或編碼Cas蛋白之核酸及以下中之任一者或多者遞送至細胞： i. 如實施例A1至A68中任一例之gRNA； ii.     如實施例A69至A79中任一例之組合物；及 iii.    如實施例A80之醫藥調配物。 實施例A82.  如實施例A81之方法，其中該方法引起基因***或缺失。 實施例A83.  如實施例A81或A82之方法，其進一步包含將模板遞送至細胞，其中該模板之至少一部分在Cas蛋白所誘導的雙股斷裂位點處或附近併入至目標DNA中。 實施例A84.  如實施例A1至A68中任一例之gRNA，如實施例A69至A79之組合物，或如實施例A80之醫藥調配物，其用於製備供治療疾病或病症用的藥劑。 實施例A85.  一種如實施例A1至A68中任一例之gRNA、如實施例A69至A79之組合物或如實施例A80之醫藥調配物的用途，其用於製造供治療疾病或病症用之藥劑。
本專利申請案主張於2019年12月11日申請之美國臨時申請案第62/946,905號之優先權，該臨時申請案之內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子方式提交且其全文以引用之方式併入本文中。2020年12月9日創建之該ASCII複本名稱為01155-0032-00PCT_ST25.txt且大小為614,499個位元組。
本文提供用於基因編輯方法中之經修飾之引導RNA (gRNA)。經工程改造且經測試之gRNA的序列展示於表1A中。
本文所提供的某些gRNA為用於基因編輯方法中的經修飾之雙引導RNA (dgRNA)。經工程改造且經測試之dgRNA的序列展示於表1中。某些dgRNA在dgRNA的YA位點處具有某些修飾，包括crRNA及/或trRNA中的修飾。
本文所提供的某些gRNA為用於基因編輯方法中的經修飾之單引導RNA (sgRNA)。經工程改造且經測試之gRNA的序列展示於表1中。某些sgRNA在sgRNA中的YA位點處具有某些修飾，包括sgRNA之crRNA部分及/或sgRNA之trRNA部分中的修飾。
本發明進一步提供此等gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)用以活體外(例如在活體外培養的細胞，其用於離體療法，或基因編輯細胞之其他用途)或在個體(諸如人類)之細胞中(例如用於活體內療法)改變目標核酸基因組的用途。表 1A. gRNA 序列之表
引導ID SEQ ID NO. 未經sgRNA 修飾之序列 SEQ ID NO. 經sgRNA 修飾之序列
G015631 1 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUAAGCACCGAGUCGGUGC 101 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUAAGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
G015632 2 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUCAGCACCGAGUCGGUGC 102 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUCAGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
G015633 3 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCCACUUGGCACCGAGUCGGUGC 103 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCCACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
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G015698 68 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGGACCGAGUCGGUCC 168 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGGACCGAGUCGG*mU*mC*mC
G015699 69 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGAACCGAGUCGGUUC 169 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGAACCGAGUCGG*mU*mU*mC
G015700 70 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUCGAGCGAGAAAUCGCGAGUGAAAAUGAGGCUGGUCCGUUGUGAACUUGGAACCGAGUCGGUUC 170 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUCGAGCGAGAAAUCGCGAGUGAAAAUGAGGCUGGUCCGUUGUGAACUUGGAACCGAGUCGG*mU*mU*mC
G015701 71 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUUGAGCGAGAAAUCGCAAGUAAAAAUAAGGCUCGUCCGUUCUGAACUUGGAACCGAGUCGGUUC 171 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUUGAGCGAGAAAUCGCAAGUAAAAAUAAGGCUCGUCCGUUCUGAACUUGGAACCGAGUCGG*mU*mU*mC
G015702 72 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUCGGAGCCGGAAACGGCGAGUCGAAAUGAGGCUGGUCCGUUGUCGGCUCGGAACCGAGUCGGUUC 172 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUCGGAGCCGGAAACGGCGAGUCGAAAUGAGGCUGGUCCGUUGUCGGCUCGGAACCGAGUCGG*mU*mU*mC
G015703 73 CUCACUGAAAAGUGAGUCUGGAGAGCUGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 173 mC*mU*mC*ACUGAAAAGUGAGUCUGGAGAGCUGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
G015704 74 CACUGAAAAGUGAGUCUGGAGAGCUGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 174 mC*mA*mC*UGAAAAGUGAGUCUGGAGAGCUGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
G015705 75 CUGAAAAGUGAGUCUGGAGAGCUGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 175 mC*mU*mG*AAAAGUGAGUCUGGAGAGCUGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
G015706 76 UCUGGAGAGCUGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 176 mU*mC*mU*GGAGAGCUGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
G015707 77 AGUCUGGAGAGCUGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 177 mA*mG*mU*CUGGAGAGCUGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
G015708 78 UGAGUCUGGAGAGCUGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 178 mU*mG*mA*GUCUGGAGAGCUGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
G015709 79 GAAAAGUGAGUCUGGAGAGCUGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 179 mG*mA*mA*AAGUGAGUCUGGAGAGCUGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
G017275 80 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 180 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
G017276 81 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 181 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
G017277 82 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 182 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
G017278 83 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACAAGGGCACCGAGUCGGUGC 183 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACAAGGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
G017279 84 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 184 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
G017280 85 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCGCGAAGCGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 185 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCGCGAAGCGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
G017281 86 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUGAAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 186 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUGAAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
G017282 87 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 187 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
G017283 88 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 188 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
G013773 89 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 189 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmGmAmAmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
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G012402 95 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 195 mA*mC*mA*CAA*A*fU*fA*fC*fCAfGfUCCfAfGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
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  99-100 未使用 199-200 未使用
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C-G015632 202 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUCAGCACCGAGUCGGUGC 302 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUCAGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015633 203 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCCACUUGGCACCGAGUCGGUGC 303 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCCACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015634 204 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUACGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 304 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUACGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015635 205 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAGAGCUGGCACCGAGUCGGUGC 305 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAGAGCUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015636 206 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAGAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 306 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAGAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015637 207 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 307 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015638 208 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 308 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
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C-G015651 221 GUUUUAGAGCCGAAAGGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 321 GUUUUAGAGCCGAAAGGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
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C-G015655 225 GUUUUAGAGCAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 325 GUUUUAGAGCAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015656 226 GUUUUAGAGGAAACAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 326 GUUUUAGAGGAAACAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
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C-G015661 231 GUUUUAGAGACAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 331 GUUUUAGAGACAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015662 232 GUUUUAGAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 332 GUUUUAGAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015663 233 GUUUUAGAAAAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 333 GUUUUAGAAAAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015664 234 GUUUUAGAAAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 334 GUUUUAGAAAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
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C-G015668 238 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCG 338 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAG*mU*mC*mG
C-G015669 239 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUC 339 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGA*mG*mU*mC
C-G015670 240 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGU 340 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCG*mA*mG*mU
C-G015671 241 GUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACUGGCACCGAGUCGGUGC 341 GUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015672 242 GUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAGGCACCGAGUCGGUGC 342 GUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015673 243 GUUUUAGAGAAAAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 343 GUUUUAGAGAAAAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015674 244 GUUUUAGAGGAAACAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAUGGCACCGAGUCGGUGC 344 GUUUUAGAGGAAACAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015675 245 GUUUUAGAGAAAAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAUGGCACCGAGUCGGUGC 345 GUUUUAGAGAAAAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015676 246 GUUUUAGAGGAAACAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACUGGCACCGAGUCGGUGC 346 GUUUUAGAGGAAACAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015677 247 GUUUUAGAGAAAAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAGGCACCGAGUCGGUGC 347 GUUUUAGAGAAAAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015678 248 GUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAGCUAUGGCACCGAGUCGGUGC 348 GUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAGCUAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015679 249 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 349 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
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C-G015681 251 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 351 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015682 252 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGUAUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 352 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGUAUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015683 253 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGUUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 353 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGUUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015684 254 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGAUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 354 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGAUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015685 255 GUUUUCGAGCUAGAAAUAGCAAGUGAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 355 GUUUUCGAGCUAGAAAUAGCAAGUGAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015686 256 GUUUUUGAGCUAGAAAUAGCAAGUAAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 356 GUUUUUGAGCUAGAAAUAGCAAGUAAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015687 257 GUUUUAGAGCGAGAAAUCGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 357 GUUUUAGAGCGAGAAAUCGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015688 258 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCGAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 358 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCGAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015689 259 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCCGGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 359 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCCGGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015690 260 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUGAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 360 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUGAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015691 261 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUGGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 361 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUGGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015692 262 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUCGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 362 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUCGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015693 263 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUUGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 363 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUUGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015694 264 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUGUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 364 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUGUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015695 265 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUCUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 365 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUCUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015696 266 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUUUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 366 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUUUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015697 267 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUGAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 367 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUGAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015698 268 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGGACCGAGUCGGUCC 368 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGGACCGAGUCGG*mU*mC*mC
C-G015699 269 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGAACCGAGUCGGUUC 369 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGAACCGAGUCGG*mU*mU*mC
C-G015700 270 GUUUUCGAGCGAGAAAUCGCGAGUGAAAAUGAGGCUGGUCCGUUGUGAACUUGGAACCGAGUCGGUUC 370 GUUUUCGAGCGAGAAAUCGCGAGUGAAAAUGAGGCUGGUCCGUUGUGAACUUGGAACCGAGUCGG*mU*mU*mC
C-G015701 271 GUUUUUGAGCGAGAAAUCGCAAGUAAAAAUAAGGCUCGUCCGUUCUGAACUUGGAACCGAGUCGGUUC 371 GUUUUUGAGCGAGAAAUCGCAAGUAAAAAUAAGGCUCGUCCGUUCUGAACUUGGAACCGAGUCGG*mU*mU*mC
C-G015702 272 GUUUCGGAGCCGGAAACGGCGAGUCGAAAUGAGGCUGGUCCGUUGUCGGCUCGGAACCGAGUCGGUUC 372 GUUUCGGAGCCGGAAACGGCGAGUCGAAAUGAGGCUGGUCCGUUGUCGGCUCGGAACCGAGUCGG*mU*mU*mC
C-G015703 273 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 373 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015704 274 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 374 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015705 275 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 375 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015706 276 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 376 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015707 277 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 377 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015708 278 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 378 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G015709 279 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 379 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G017275 280 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 380 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G017276 281 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 381 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G017277 282 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 382 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G017278 283 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACAAGGGCACCGAGUCGGUGC 383 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACAAGGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G017279 284 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 384 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G017280 285 GUUUUAGAGCGCGAAGCGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 385 GUUUUAGAGCGCGAAGCGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G017281 286 GUUUUAGAGCUGAAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 386 GUUUUAGAGCUGAAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G017282 287 GUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 387 GUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G017283 288 GUUUUAGAGCAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 388 GUUUUAGAGCAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G013773 289 GUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 389 GUUUUAGAmGmCmGmAmAmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-G013776 290 GUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAGAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 390 GUUUUAGAmGmCmGmAmAmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAGAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
C-SM07-6 291 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 391 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmCmGmAmAmAmGmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG*mU*mG*mC
C-SM12-6 292 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 392 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmAmAmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG*mU*mG*mC
C-SM07-50 293 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 393 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACmGmAmAmAmGmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG*mU*mG*mC
C-SM12-50 294 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 394 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAmAmAmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG*mU*mG*mC
   295-300 未使用 395-399 未使用
   400 參見表2
Nx-G015631 401 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUAAGCACCGAGUCGGUGC 501 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUAAGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015632 402 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUCAGCACCGAGUCGGUGC 502 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUCAGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015633 403 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCCACUUGGCACCGAGUCGGUGC 503 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCCACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015634 404 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUACGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 504 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUACGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015635 405 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAGAGCUGGCACCGAGUCGGUGC 505 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAGAGCUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015636 406 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAGAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 506 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAGAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015637 407 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 507 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015638 408 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 508 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015639 409 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC 509 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAGUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015640 410 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACAGUGGCACCGAGUCGGUGC 510 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACAGUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015641 411 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACAAGGGCACCGAGUCGGUGC 511 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACAAGGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015642 412 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 512 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015643 413 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAGGCACCGAGUCGGUGC 513 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015644 414 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAGGGCACCGAGUCGGUGC 514 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAGGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015645 415 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAGGCACCGAGUCGGUGC 515 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015646 416 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 516 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015647 417 N3 Nx GUUUUAGAGCGCAAAGCGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 517 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCGCAAAGCGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015648 418 N3 Nx GUUUUAGAGCGCGAAGCGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 518 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCGCGAAGCGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015649 419 N3 Nx GUUUUAGAGCGGAAACGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGCU 519 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCGGAAACGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGU*mG*mC*mU
Nx-G015650 420 N3 Nx GUUUUAGAGCGGAAACGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 520 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCGGAAACGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015651 421 N3 Nx GUUUUAGAGCCGAAAGGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 521 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCCGAAAGGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015652 422 N3 Nx GUUUUAGAGCUGAAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 522 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUGAAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015653 423 N3 Nx GUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 523 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015654 424 N3 Nx GUUUUAGAGCGAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 524 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCGAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015655 425 N3 Nx GUUUUAGAGCAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 525 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015656 426 N3 Nx GUUUUAGAGGAAACAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 526 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGGAAACAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015657 427 N3 Nx GUUUUAGAGCAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 527 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015658 428 N3 Nx GUUUUAGAGCGAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 528 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCGAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015659 429 N3 Nx GUUUUAGAGCGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 529 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015660 430 N3 Nx GUUUUAGAGAACAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 530 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGAACAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015661 431 N3 Nx GUUUUAGAGACAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 531 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGACAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015662 432 N3 Nx GUUUUAGAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 532 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015663 433 N3 Nx GUUUUAGAAAAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 533 (mN*)3 Nx GUUUUAGAAAAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015664 434 N3 Nx GUUUUAGAAAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 534 (mN*)3 Nx GUUUUAGAAAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015665 435 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUG 535 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCG*mG*mU*mG
Nx-G015666 436 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGU 536 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUC*mG*mG*mU
Nx-G015667 437 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG 537 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGU*mC*mG*mG
Nx-G015668 438 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCG 538 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAG*mU*mC*mG
Nx-G015669 439 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUC 539 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGA*mG*mU*mC
Nx-G015670 440 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGU 540 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCG*mA*mG*mU
Nx-G015671 441 N3 Nx GUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACUGGCACCGAGUCGGUGC 541 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015672 442 N3 Nx GUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAGGCACCGAGUCGGUGC 542 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015673 443 N3 Nx GUUUUAGAGAAAAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 543 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGAAAAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015674 444 N3 Nx GUUUUAGAGGAAACAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAUGGCACCGAGUCGGUGC 544 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGGAAACAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015675 445 N3 Nx GUUUUAGAGAAAAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAUGGCACCGAGUCGGUGC 545 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGAAAAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015676 446 N3 Nx GUUUUAGAGGAAACAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACUGGCACCGAGUCGGUGC 546 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGGAAACAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015677 447 N3 Nx GUUUUAGAGAAAAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAGGCACCGAGUCGGUGC 547 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGAAAAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015678 448 N3 Nx GUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAGCUAUGGCACCGAGUCGGUGC 548 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAGCUAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015679 449 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 549 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015680 450 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 550 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015681 451 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 551 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015682 452 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGUAUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 552 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGUAUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015683 453 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGUUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 553 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGUUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015684 454 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGAUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 554 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGAUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015685 455 N3 Nx GUUUUCGAGCUAGAAAUAGCAAGUGAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 555 (mN*)3 Nx GUUUUCGAGCUAGAAAUAGCAAGUGAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015686 456 N3 Nx GUUUUUGAGCUAGAAAUAGCAAGUAAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 556 (mN*)3 Nx GUUUUUGAGCUAGAAAUAGCAAGUAAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015687 457 N3 Nx GUUUUAGAGCGAGAAAUCGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 557 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCGAGAAAUCGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015688 458 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCGAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 558 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCGAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015689 459 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCCGGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 559 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCCGGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015690 460 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUGAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 560 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUGAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015691 461 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUGGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 561 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUGGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015692 462 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUCGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 562 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUCGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015693 463 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUUGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 563 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUUGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015694 464 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUGUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 564 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUGUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015695 465 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUCUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 565 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUCUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015696 466 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUUUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 566 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUUUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015697 467 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUGAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 567 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUGAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015698 468 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGGACCGAGUCGGUCC 568 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGGACCGAGUCGG*mU*mC*mC
Nx-G015699 469 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGAACCGAGUCGGUUC 569 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGAACCGAGUCGG*mU*mU*mC
Nx-G015700 470 N3 Nx GUUUUCGAGCGAGAAAUCGCGAGUGAAAAUGAGGCUGGUCCGUUGUGAACUUGGAACCGAGUCGGUUC 570 (mN*)3 Nx GUUUUCGAGCGAGAAAUCGCGAGUGAAAAUGAGGCUGGUCCGUUGUGAACUUGGAACCGAGUCGG*mU*mU*mC
Nx-G015701 471 N3 Nx GUUUUUGAGCGAGAAAUCGCAAGUAAAAAUAAGGCUCGUCCGUUCUGAACUUGGAACCGAGUCGGUUC 571 (mN*)3 Nx GUUUUUGAGCGAGAAAUCGCAAGUAAAAAUAAGGCUCGUCCGUUCUGAACUUGGAACCGAGUCGG*mU*mU*mC
Nx-G015702 472 N3 Nx GUUUCGGAGCCGGAAACGGCGAGUCGAAAUGAGGCUGGUCCGUUGUCGGCUCGGAACCGAGUCGGUUC 572 (mN*)3 Nx GUUUCGGAGCCGGAAACGGCGAGUCGAAAUGAGGCUGGUCCGUUGUCGGCUCGGAACCGAGUCGG*mU*mU*mC
Nx-G015703 473 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 573 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015704 474 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 574 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015705 475 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 575 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015706 476 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 576 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015707 477 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 577 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015708 478 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 578 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G015709 479 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 579 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G017275 480 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 580 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G017276 481 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 581 (mN*)3 Nx GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G017277 482 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 582 (mN*)3 Nx GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G017278 483 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACAAGGGCACCGAGUCGGUGC 583 (mN*)3 Nx GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACAAGGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G017279 484 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 584 (mN*)3 Nx GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G017280 485 N3 Nx GUUUUAGAGCGCGAAGCGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 585 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCGCGAAGCGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G017281 486 N3 Nx GUUUUAGAGCUGAAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 586 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCUGAAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G017282 487 N3 Nx GUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 587 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G017283 488 N3 Nx GUUUUAGAGCAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 588 (mN*)3 Nx GUUUUAGAGCAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G013773 489 N3 Nx GUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 589 (mN*)3 Nx GUUUUAGAmGmCmGmAmAmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-G013776 490 N3 Nx GUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAGAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 590 (mN*)3 Nx GUUUUAGAmGmCmGmAmAmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAGAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
Nx-SM07-6 491 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 591 (mN*)3 Nx GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmCmGmAmAmAmGmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG*mU*mG*mC
Nx-SM12-6 492 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC    592 (mN*)3 Nx GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmAmAmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG*mU*mG*mC
Nx-SM07-50 493 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 593 (mN*)3 Nx GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACmGmAmAmAmGmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG*mU*mG*mC
Nx-SM12-50 494 N3 Nx GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC    594 (mN*)3 Nx GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAmAmAmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG*mU*mG*mC
  495-500 未使用 595-600 未使用
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N20-G015632 602 N20 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUCAGCACCGAGUCGGUGC 702 (mN*)3 N17 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUCAGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
N20-G015633 603 N20 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCCACUUGGCACCGAGUCGGUGC 703 (mN*)3 N17 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCCACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
N20-G015634 604 N20 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUACGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 704 (mN*)3 N17 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUACGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
N20-G015635 605 N20 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAGAGCUGGCACCGAGUCGGUGC 705 (mN*)3 N17 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAGAGCUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
N20-G015636 606 N20 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAGAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 706 (mN*)3 N17 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAGAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
N20-G015637 607 N20 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 707 (mN*)3 N17 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
N20-G015638 608 N20 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 708 (mN*)3 N17 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
N20-G015639 609 N20 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC 709 (mN*)3 N17 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAGUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
N20-G015640 610 N20 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACAGUGGCACCGAGUCGGUGC 710 (mN*)3 N17 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACAGUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
N20-G015641 611 N20 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACAAGGGCACCGAGUCGGUGC 711 (mN*)3 N17 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACAAGGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
N20-G015642 612 N20 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 712 (mN*)3 N17 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
N20-G015643 613 N20 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAGGCACCGAGUCGGUGC 713 (mN*)3 N17 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
N20-G015644 614 N20 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAGGGCACCGAGUCGGUGC 714 (mN*)3 N17 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAGGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
N20-G015645 615 N20 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAGGCACCGAGUCGGUGC 715 (mN*)3 N17 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
N20-G015646 616 N20 GUUUUAGAGCUAGAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 716 (mN*)3 N17 GUUUUAGAGCUAGAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
N20-G015647 617 N20 GUUUUAGAGCGCAAAGCGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 717 (mN*)3 N17 GUUUUAGAGCGCAAAGCGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
N20-G015648 618 N20 GUUUUAGAGCGCGAAGCGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 718 (mN*)3 N17 GUUUUAGAGCGCGAAGCGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
N20-G015649 619 N20 GUUUUAGAGCGGAAACGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGCU 719 (mN*)3 N17 GUUUUAGAGCGGAAACGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGU*mG*mC*mU
N20-G015650 620 N20 GUUUUAGAGCGGAAACGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 720 (mN*)3 N17 GUUUUAGAGCGGAAACGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
N20-G015651 621 N20 GUUUUAGAGCCGAAAGGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 721 (mN*)3 N17 GUUUUAGAGCCGAAAGGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
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N20-G015653 623 N20 GUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC 723 (mN*)3 N17 GUUUUAGAGCGAAAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
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SM12-6 696 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC    796 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmAmAmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG*mU*mG*mC
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SM12-50 698 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAAAUGGCACCGAGUCGGUGC 798 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAmAmAmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG*mU*mG*mC
   699-700 未使用 799-800 未使用
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G019913 858 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCCCGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 958 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUCGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUGAAAAUGAGGCUAGUCCGUGAUCCCGAAAGGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
G019914 859 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUCGAGCUAGAAAUAGCAAGUGAAAAUGAGGCUAGUCCGUGAUCCCGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 959 mA*mC*ACAA*AUACC*AGUCCAGCGmGU*UUUCG*A*mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCmAA*G*UGAAAAU*GAG*G*C*UmAGUCmCGUGA*UCC*C*mGmAmAmAmGmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG*mU*mG*mC
G019915 860 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUCGAGCUAGAAAUAGCAAGUGAAAAUGAGGCUAGUCCGUGAUCCCGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 960 mA*mC*ACAA*AUACC*AGUCCAGCGmGU*UUU*AG*A*mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCmAA*G*UU*AAAAU*AAG*G*C*UmAGUCmCGUU*A*UC*A*C*mGmAmAmAmGmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG*mU*mG*mC
G019916 861 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 961 mA*mC*ACAA*AUACC*AGUCCAGCGmGU*UUU*AG*A*mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCmAA*G*UU*AAAAU*AAG*G*C*UmAGUCmCGUU*A*UC*A*C*mGmAmAmAmGmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG*mU*mG*mC
G020022 862 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 962 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACmGmAmAmAmGGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
G020023 863 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 963 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGmGmCmAmCmCmGfAfGfUfCmGmG*mU*mG*mC
G020024 864 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 964 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGmGmCmAmCmCmGAGUCmGmG*mU*mG*mC
G020025 865 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 965 mA*mC*mACAAAUACCAGUCCAGCGmGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCmAAGUUAAAAUAAGGCUmAGUCmCGUUAUCACmGmAmAmAmGG*mGmCmAmCmCmGAGUCmGmG*mU*mG*mC
G020026 866 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 966 mA*mC*fAfCAfA*AfUfAfCfC*AfGUCCfAfGCfGmGU*UUUAG*fA*mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCmAfA*G*UUfAAfAAfU*fAfAfG*fG*fC*fUmAGUCmCfGUUA*fUfCA*C*fG*mAmAmAmGfG*mGmCmAmCmCmGfA*fG*fUfCmGmGmU*mG*mC
G020027 867 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 967 mA*mC*ACAA*AUACC*AGUCCAGCGmGU*UUUAG*A*mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCmAA*G*UUAAAAU*AAG*G*C*UmAGUCmCGUUA*UCA*C*G*mAmAmAmGG*mGmCmAmCmCmGA*G*UCmGmGmU*mG*mC
G020028 868 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 968 mA*mC*fAfCAfAAfUfAfCfCAfGUCCfAfGCfGmGU*UUUAG*fAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCmAfAG*UUfAAfAAfUfAfAfGfGfCfUmAGUCmCfGUUA*fUfCA*C*fGmAmAmAmGfGmGmCmAmCmCmGfAfGfUfCmGmGmU*mG*mC
G020029 869 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUGAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 969 mA*mC*ACAAAUACCAGUCCAGCGmGU*UUUAG*fA*mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCmAfA*G*UUfAAfAAfU*fAfAfG*fG*fC*fUmAGUCmCfGUGA*fUfCA*C*fG*mAmAmAmGfG*mGmCmAmCmCmGfA*fG*fUfCmGmGmU*mG*mC
G020030 870 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 970 mA*mC*fAfCAfA*AfUfAfCfC*AfGUCCfAfGCfGmGU*UUUfAfG*fA*mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCmAfA*fG*fUfUfAAfAfAfU*fAfAfG*fG*fC*fUmAGfUCmCfGfUUfA*fUfCfA*fC*fG*mAmAmAmGfG*mGmCmAmCmCmGfA*fG*fUfCmGmGmU*mG*mC
G020349 871 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 971 mA*mC*mA*mCAA*A*fU*fA*fC*fCAfGfUCC*fAfGCGmGUUUfUAGmAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCmAmAGUfUmAfAmAfAmUAmAmGmGmCmUmAGUmCmCGUfUAmUmCAmCmGmAmAmAmGmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG*mU*mG*mC
G020350 872 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 972 mA*mC*mA*mCAA*A*fU*fA*fC*fCAfGfUCC*fAfGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
G020351 873 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 973 mA*mC*mA*mCAAAfU*ACfCAfGUCC*AGCGmGUUUfUAGmAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCmAmAGUfUAAAAmUAAGGCmUAGUCCGUfUAUmCACGAAAGGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG*mU*mG*mC
G020352 874 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 974 mA*mC*mA*mCAAAfU*ACfCAfGUCC*AGCGmGUUUUAmGmAmGCmUAmGmAmAmAmUAmGCmAmAGUfUAAAAmUAAGGCmUAGUCCGUfUA*mUmCA*CmGmAmAmAmGmGGmCAmCCGfAfGfUCmGG*mU*mG*mC
G020353 875 ACACAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC 975 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGCmUAmGmAmAmAmUAmGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGmCAmCCGfAfGfUCmGG*mU*mG*mC
   876-900 未使用 976-1000 未使用
在表1A中，(N)x 表示x個鄰接核苷酸，其中x為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。(mN*)3 表示三個鄰接核苷酸，其各自具有任何鹼基、2'-OMe及連至後續核苷酸之3'PS鍵聯。N17 及N20 分別表示17及20個鄰接N (任何核苷酸)。附接至引導ID之「C-」指示sgRNA之保守部分。
核苷酸修飾如下指示於表1A中：m：2'-OMe；*：PS鍵聯；f：2'-氟；(invd)：反向無鹼基；moe：2'-moe；e：ENA；d：去氧核糖核苷酸(亦請注意，T始終為去氧核糖核苷酸)；x：UNA。因此，舉例而言，mA表示2'-O-甲基腺苷；xA表示具有腺嘌呤核鹼基的UNA核苷酸；eA表示具有腺嘌呤核鹼基的ENA核苷酸；且dA表示腺苷去氧核糖核苷酸。表 1B ( 經 RNA 引導之 DNA 結合劑序列之表 ) ：
SEQ ID NO 名稱 序列
1099 Cas9 mRNA序列 GGGUCCCGCAGUCGGCGUCCAGCGGCUCUGCUUGUUCGUGUGUGUGUCGUUGCAGGCCUUAUUCGGAUCCGCCACCAUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCUAGCUAGCCAUCACAUUUAAAAGCAUCUCAGCCUACCAUGAGAAUAAGAGAAAGAAAAUGAAGAUCAAUAGCUUAUUCAUCUCUUUUUCUUUUUCGUUGGUGUAAAGCCAACACCCUGUCUAAAAAACAUAAAUUUCUUUAAUCAUUUUGCCUCUUUUCUCUGUGCUUCAAUUAAUAAAAAAUGGAAAGAACCUCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
1100 Cas9 mRNA序列 GGGUCCCGCAGUCGGCGUCCAGCGGCUCUGCUUGUUCGUGUGUGUGUCGUUGCAGGCCUUAUUCGGAUCCAUGGAUAAGAAGUACUCAAUCGGGCUGGAUAUCGGAACUAAUUCCGUGGGUUGGGCAGUGAUCACGGAUGAAUACAAAGUGCCGUCCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGGAACACCGAUAGACACAGCAUCAAGAAAAAUCUCAUCGGAGCCCUGCUGUUUGACUCCGGCGAAACCGCAGAAGCGACCCGGCUCAAACGUACCGCGAGGCGACGCUACACCCGGCGGAAGAAUCGCAUCUGCUAUCUGCAAGAGAUCUUUUCGAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACCGCCUGGAAGAAUCUUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCAUGAACGGCAUCCUAUCUUUGGAAACAUCGUCGACGAAGUGGCGUACCACGAAAAGUACCCGACCAUCUACCAUCUGCGGAAGAAGUUGGUUGACUCAACUGACAAGGCCGACCUCAGAUUGAUCUACUUGGCCCUCGCCCAUAUGAUCAAAUUCCGCGGACACUUCCUGAUCGAAGGCGAUCUGAACCCUGAUAACUCCGACGUGGAUAAGCUUUUCAUUCAACUGGUGCAGACCUACAACCAACUGUUCGAAGAAAACCCAAUCAAUGCUAGCGGCGUCGAUGCCAAGGCCAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCGAAGUCGCGGCGCCUCGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAGAAAAAGAACGGACUUUUCGGCAACUUGAUCGCUCUCUCACUGGGACUCACUCCCAAUUUCAAGUCCAAUUUUGACCUGGCCGAGGACGCGAAGCUGCAACUCUCAAAGGACACCUACGACGACGACUUGGACAAUUUGCUGGCACAAAUUGGCGAUCAGUACGCGGAUCUGUUCCUUGCCGCUAAGAACCUUUCGGACGCAAUCUUGCUGUCCGAUAUCCUGCGCGUGAACACCGAAAUAACCAAAGCGCCGCUUAGCGCCUCGAUGAUUAAGCGGUACGACGAGCAUCACCAGGAUCUCACGCUGCUCAAAGCGCUCGUGAGACAGCAACUGCCUGAAAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGUCCAAGAAUGGGUACGCAGGGUACAUCGAUGGAGGCGCUAGCCAGGAAGAGUUCUAUAAGUUCAUCAAGCCAAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACCGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGGGAGGAUCUGCUCCGGAAACAGAGAACCUUUGACAACGGAUCCAUUCCCCACCAGAUCCAUCUGGGUGAGCUGCACGCCAUCUUGCGGCGCCAGGAGGACUUUUACCCAUUCCUCAAGGACAACCGGGAAAAGAUCGAGAAAAUUCUGACGUUCCGCAUCCCGUAUUACGUGGGCCCACUGGCGCGCGGCAAUUCGCGCUUCGCGUGGAUGACUAGAAAAUCAGAGGAAACCAUCACUCCUUGGAAUUUCGAGGAAGUUGUGGAUAAGGGAGCUUCGGCACAAAGCUUCAUCGAACGAAUGACCAACUUCGACAAGAAUCUCCCAAACGAGAAGGUGCUUCCUAAGCACAGCCUCCUUUACGAAUACUUCACUGUCUACAACGAACUGACUAAAGUGAAAUACGUUACUGAAGGAAUGAGGAAGCCGGCCUUUCUGUCCGGAGAACAGAAGAAAGCAAUUGUCGAUCUGCUGUUCAAGACCAACCGCAAGGUGACCGUCAAGCAGCUUAAAGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGUUUCGACUCAGUGGAAAUCAGCGGGGUGGAGGACAGAUUCAACGCUUCGCUGGGAACCUAUCAUGAUCUCCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUUGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAAGAUAUCGUCCUGACCUUGACCCUUUUCGAGGAUCGCGAGAUGAUCGAGGAGAGGCUUAAGACCUACGCUCAUCUCUUCGACGAUAAGGUCAUGAAACAACUCAAGCGCCGCCGGUACACUGGUUGGGGCCGCCUCUCCCGCAAGCUGAUCAACGGUAUUCGCGAUAAACAGAGCGGUAAAACUAUCCUGGAUUUCCUCAAAUCGGAUGGCUUCGCUAAUCGUAACUUCAUGCAAUUGAUCCACGACGACAGCCUGACCUUUAAGGAGGACAUCCAAAAAGCACAAGUGUCCGGACAGGGAGACUCACUCCAUGAACACAUCGCGAAUCUGGCCGGUUCGCCGGCGAUUAAGAAGGGAAUUCUGCAAACUGUGAAGGUGGUCGACGAGCUGGUGAAGGUCAUGGGACGGCACAAACCGGAGAAUAUCGUGAUUGAAAUGGCCCGAGAAAACCAGACUACCCAGAAGGGCCAGAAAAACUCCCGCGAAAGGAUGAAGCGGAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAGCUGGGCAGCCAGAUCCUGAAAGAGCACCCGGUGGAAAACACGCAGCUGCAGAACGAGAAGCUCUACCUGUACUAUUUGCAAAAUGGACGGGACAUGUACGUGGACCAAGAGCUGGACAUCAAUCGGUUGUCUGAUUACGACGUGGACCACAUCGUUCCACAGUCCUUUCUGAAGGAUGACUCGAUCGAUAACAAGGUGUUGACUCGCAGCGACAAGAACAGAGGGAAGUCAGAUAAUGUGCCAUCGGAGGAGGUCGUGAAGAAGAUGAAGAAUUACUGGCGGCAGCUCCUGAAUGCGAAGCUGAUUACCCAGAGAAAGUUUGACAAUCUCACUAAAGCCGAGCGCGGCGGACUCUCAGAGCUGGAUAAGGCUGGAUUCAUCAAACGGCAGCUGGUCGAGACUCGGCAGAUUACCAAGCACGUGGCGCAGAUCUUGGACUCCCGCAUGAACACUAAAUACGACGAGAACGAUAAGCUCAUCCGGGAAGUGAAGGUGAUUACCCUGAAAAGCAAACUUGUGUCGGACUUUCGGAAGGACUUUCAGUUUUACAAAGUGAGAGAAAUCAACAACUACCAUCACGCGCAUGACGCAUACCUCAACGCUGUGGUCGGUACCGCCCUGAUCAAAAAGUACCCUAAACUUGAAUCGGAGUUUGUGUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUGAGGAAGAUGAUAGCCAAGUCCGAACAGGAAAUCGGGAAAGCAACUGCGAAAUACUUCUUUUACUCAAACAUCAUGAACUUUUUCAAGACUGAAAUUACGCUGGCCAAUGGAGAAAUCAGGAAGAGGCCACUGAUCGAAACUAACGGAGAAACGGGCGAAAUCGUGUGGGACAAGGGCAGGGACUUCGCAACUGUUCGCAAAGUGCUCUCUAUGCCGCAAGUCAAUAUUGUGAAGAAAACCGAAGUGCAAACCGGCGGAUUUUCAAAGGAAUCGAUCCUCCCAAAGAGAAAUAGCGACAAGCUCAUUGCACGCAAGAAAGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGAUUCGCCGACUGUCGCAUACUCCGUCCUCGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGAAAGAGCAAAAAGCUCAAAUCCGUCAAAGAGCUGCUGGGGAUUACCAUCAUGGAACGAUCCUCGUUCGAGAAGAACCCGAUUGAUUUCCUCGAGGCGAAGGGUUACAAGGAGGUGAAGAAGGAUCUGAUCAUCAAACUCCCCAAGUACUCACUGUUCGAACUGGAAAAUGGUCGGAAGCGCAUGCUGGCUUCGGCCGGAGAACUCCAAAAAGGAAAUGAGCUGGCCUUGCCUAGCAAGUACGUCAACUUCCUCUAUCUUGCUUCGCACUACGAAAAACUCAAAGGGUCACCGGAAGAUAACGAACAGAAGCAGCUUUUCGUGGAGCAGCACAAGCAUUAUCUGGAUGAAAUCAUCGAACAAAUCUCCGAGUUUUCAAAGCGCGUGAUCCUCGCCGACGCCAACCUCGACAAAGUCCUGUCGGCCUACAAUAAGCAUAGAGAUAAGCCGAUCAGAGAACAGGCCGAGAACAUUAUCCACUUGUUCACCCUGACUAACCUGGGAGCCCCAGCCGCCUUCAAGUACUUCGAUACUACUAUCGAUCGCAAAAGAUACACGUCCACCAAGGAAGUUCUGGACGCGACCCUGAUCCACCAAAGCAUCACUGGACUCUACGAAACUAGGAUCGAUCUGUCGCAGCUGGGUGGCGAUGGCGGUGGAUCUCCGAAAAAGAAGAGAAAGGUGUAAUGAGCUAGCCAUCACAUUUAAAAGCAUCUCAGCCUACCAUGAGAAUAAGAGAAAGAAAAUGAAGAUCAAUAGCUUAUUCAUCUCUUUUUCUUUUUCGUUGGUGUAAAGCCAACACCCUGUCUAAAAAACAUAAAUUUCUUUAAUCAUUUUGCCUCUUUUCUCUGUGCUUCAAUUAAUAAAAAAUGGAAAGAACCUCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
1101 Cas9轉錄物之DNA編碼序列 GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCGCCACCATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAGCTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAG
1102 Cas9 DNA編碼序列 ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAG
1103 Cas9 DNA編碼序列1 ATGGATAAGAAGTACTCAATCGGGCTGGATATCGGAACTAATTCCGTGGGTTGGGCAGTGATCACGGATGAATACAAAGTGCCGTCCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGGAACACCGATAGACACAGCATCAAGAAAAATCTCATCGGAGCCCTGCTGTTTGACTCCGGCGAAACCGCAGAAGCGACCCGGCTCAAACGTACCGCGAGGCGACGCTACACCCGGCGGAAGAATCGCATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTTTCGAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACCGCCTGGAAGAATCTTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCATGAACGGCATCCTATCTTTGGAAACATCGTCGACGAAGTGGCGTACCACGAAAAGTACCCGACCATCTACCATCTGCGGAAGAAGTTGGTTGACTCAACTGACAAGGCCGACCTCAGATTGATCTACTTGGCCCTCGCCCATATGATCAAATTCCGCGGACACTTCCTGATCGAAGGCGATCTGAACCCTGATAACTCCGACGTGGATAAGCTTTTCATTCAACTGGTGCAGACCTACAACCAACTGTTCGAAGAAAACCCAATCAATGCTAGCGGCGTCGATGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCGAAGTCGCGGCGCCTCGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAGAAAAAGAACGGACTTTTCGGCAACTTGATCGCTCTCTCACTGGGACTCACTCCCAATTTCAAGTCCAATTTTGACCTGGCCGAGGACGCGAAGCTGCAACTCTCAAAGGACACCTACGACGACGACTTGGACAATTTGCTGGCACAAATTGGCGATCAGTACGCGGATCTGTTCCTTGCCGCTAAGAACCTTTCGGACGCAATCTTGCTGTCCGATATCCTGCGCGTGAACACCGAAATAACCAAAGCGCCGCTTAGCGCCTCGATGATTAAGCGGTACGACGAGCATCACCAGGATCTCACGCTGCTCAAAGCGCTCGTGAGACAGCAACTGCCTGAAAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGTCCAAGAATGGGTACGCAGGGTACATCGATGGAGGCGCTAGCCAGGAAGAGTTCTATAAGTTCATCAAGCCAATCCTGGAAAAGATGGACGGAACCGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGGGAGGATCTGCTCCGGAAACAGAGAACCTTTGACAACGGATCCATTCCCCACCAGATCCATCTGGGTGAGCTGCACGCCATCTTGCGGCGCCAGGAGGACTTTTACCCATTCCTCAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAAATTCTGACGTTCCGCATCCCGTATTACGTGGGCCCACTGGCGCGCGGCAATTCGCGCTTCGCGTGGATGACTAGAAAATCAGAGGAAACCATCACTCCTTGGAATTTCGAGGAAGTTGTGGATAAGGGAGCTTCGGCACAAAGCTTCATCGAACGAATGACCAACTTCGACAAGAATCTCCCAAACGAGAAGGTGCTTCCTAAGCACAGCCTCCTTTACGAATACTTCACTGTCTACAACGAACTGACTAAAGTGAAATACGTTACTGAAGGAATGAGGAAGCCGGCCTTTCTGTCCGGAGAACAGAAGAAAGCAATTGTCGATCTGCTGTTCAAGACCAACCGCAAGGTGACCGTCAAGCAGCTTAAAGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGTTTCGACTCAGTGGAAATCAGCGGGGTGGAGGACAGATTCAACGCTTCGCTGGGAACCTATCATGATCTCCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTTGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAAGATATCGTCCTGACCTTGACCCTTTTCGAGGATCGCGAGATGATCGAGGAGAGGCTTAAGACCTACGCTCATCTCTTCGACGATAAGGTCATGAAACAACTCAAGCGCCGCCGGTACACTGGTTGGGGCCGCCTCTCCCGCAAGCTGATCAACGGTATTCGCGATAAACAGAGCGGTAAAACTATCCTGGATTTCCTCAAATCGGATGGCTTCGCTAATCGTAACTTCATGCAATTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAGGAGGACATCCAAAAAGCACAAGTGTCCGGACAGGGAGACTCACTCCATGAACACATCGCGAATCTGGCCGGTTCGCCGGCGATTAAGAAGGGAATTCTGCAAACTGTGAAGGTGGTCGACGAGCTGGTGAAGGTCATGGGACGGCACAAACCGGAGAATATCGTGATTGAAATGGCCCGAGAAAACCAGACTACCCAGAAGGGCCAGAAAAACTCCCGCGAAAGGATGAAGCGGATCGAAGAAGGAATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAGCACCCGGTGGAAAACACGCAGCTGCAGAACGAGAAGCTCTACCTGTACTATTTGCAAAATGGACGGGACATGTACGTGGACCAAGAGCTGGACATCAATCGGTTGTCTGATTACGACGTGGACCACATCGTTCCACAGTCCTTTCTGAAGGATGACTCGATCGATAACAAGGTGTTGACTCGCAGCGACAAGAACAGAGGGAAGTCAGATAATGTGCCATCGGAGGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAATTACTGGCGGCAGCTCCTGAATGCGAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTTGACAATCTCACTAAAGCCGAGCGCGGCGGACTCTCAGAGCTGGATAAGGCTGGATTCATCAAACGGCAGCTGGTCGAGACTCGGCAGATTACCAAGCACGTGGCGCAGATCTTGGACTCCCGCATGAACACTAAATACGACGAGAACGATAAGCTCATCCGGGAAGTGAAGGTGATTACCCTGAAAAGCAAACTTGTGTCGGACTTTCGGAAGGACTTTCAGTTTTACAAAGTGAGAGAAATCAACAACTACCATCACGCGCATGACGCATACCTCAACGCTGTGGTCGGTACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAACTTGAATCGGAGTTTGTGTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTGAGGAAGATGATAGCCAAGTCCGAACAGGAAATCGGGAAAGCAACTGCGAAATACTTCTTTTACTCAAACATCATGAACTTTTTCAAGACTGAAATTACGCTGGCCAATGGAGAAATCAGGAAGAGGCCACTGATCGAAACTAACGGAGAAACGGGCGAAATCGTGTGGGACAAGGGCAGGGACTTCGCAACTGTTCGCAAAGTGCTCTCTATGCCGCAAGTCAATATTGTGAAGAAAACCGAAGTGCAAACCGGCGGATTTTCAAAGGAATCGATCCTCCCAAAGAGAAATAGCGACAAGCTCATTGCACGCAAGAAAGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGATTCGCCGACTGTCGCATACTCCGTCCTCGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGAAAGAGCAAAAAGCTCAAATCCGTCAAAGAGCTGCTGGGGATTACCATCATGGAACGATCCTCGTTCGAGAAGAACCCGATTGATTTCCTCGAGGCGAAGGGTTACAAGGAGGTGAAGAAGGATCTGATCATCAAACTCCCCAAGTACTCACTGTTCGAACTGGAAAATGGTCGGAAGCGCATGCTGGCTTCGGCCGGAGAACTCCAAAAAGGAAATGAGCTGGCCTTGCCTAGCAAGTACGTCAACTTCCTCTATCTTGCTTCGCACTACGAAAAACTCAAAGGGTCACCGGAAGATAACGAACAGAAGCAGCTTTTCGTGGAGCAGCACAAGCATTATCTGGATGAAATCATCGAACAAATCTCCGAGTTTTCAAAGCGCGTGATCCTCGCCGACGCCAACCTCGACAAAGTCCTGTCGGCCTACAATAAGCATAGAGATAAGCCGATCAGAGAACAGGCCGAGAACATTATCCACTTGTTCACCCTGACTAACCTGGGAGCCCCAGCCGCCTTCAAGTACTTCGATACTACTATCGATCGCAAAAGATACACGTCCACCAAGGAAGTTCTGGACGCGACCCTGATCCACCAAAGCATCACTGGACTCTACGAAACTAGGATCGATCTGTCGCAGCTGGGTGGCGATGGCGGTGGATCTCCGAAAAAGAAGAGAAAGGTGTAATGA
1104 Cas9 mRNA開放閱讀框架(ORF) 2 AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCUAG
1105 Cas9 mRNA ORF 1 AUGGAUAAGAAGUACUCAAUCGGGCUGGAUAUCGGAACUAAUUCCGUGGGUUGGGCAGUGAUCACGGAUGAAUACAAAGUGCCGUCCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGGAACACCGAUAGACACAGCAUCAAGAAAAAUCUCAUCGGAGCCCUGCUGUUUGACUCCGGCGAAACCGCAGAAGCGACCCGGCUCAAACGUACCGCGAGGCGACGCUACACCCGGCGGAAGAAUCGCAUCUGCUAUCUGCAAGAGAUCUUUUCGAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACCGCCUGGAAGAAUCUUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCAUGAACGGCAUCCUAUCUUUGGAAACAUCGUCGACGAAGUGGCGUACCACGAAAAGUACCCGACCAUCUACCAUCUGCGGAAGAAGUUGGUUGACUCAACUGACAAGGCCGACCUCAGAUUGAUCUACUUGGCCCUCGCCCAUAUGAUCAAAUUCCGCGGACACUUCCUGAUCGAAGGCGAUCUGAACCCUGAUAACUCCGACGUGGAUAAGCUUUUCAUUCAACUGGUGCAGACCUACAACCAACUGUUCGAAGAAAACCCAAUCAAUGCUAGCGGCGUCGAUGCCAAGGCCAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCGAAGUCGCGGCGCCUCGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAGAAAAAGAACGGACUUUUCGGCAACUUGAUCGCUCUCUCACUGGGACUCACUCCCAAUUUCAAGUCCAAUUUUGACCUGGCCGAGGACGCGAAGCUGCAACUCUCAAAGGACACCUACGACGACGACUUGGACAAUUUGCUGGCACAAAUUGGCGAUCAGUACGCGGAUCUGUUCCUUGCCGCUAAGAACCUUUCGGACGCAAUCUUGCUGUCCGAUAUCCUGCGCGUGAACACCGAAAUAACCAAAGCGCCGCUUAGCGCCUCGAUGAUUAAGCGGUACGACGAGCAUCACCAGGAUCUCACGCUGCUCAAAGCGCUCGUGAGACAGCAACUGCCUGAAAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGUCCAAGAAUGGGUACGCAGGGUACAUCGAUGGAGGCGCUAGCCAGGAAGAGUUCUAUAAGUUCAUCAAGCCAAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACCGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGGGAGGAUCUGCUCCGGAAACAGAGAACCUUUGACAACGGAUCCAUUCCCCACCAGAUCCAUCUGGGUGAGCUGCACGCCAUCUUGCGGCGCCAGGAGGACUUUUACCCAUUCCUCAAGGACAACCGGGAAAAGAUCGAGAAAAUUCUGACGUUCCGCAUCCCGUAUUACGUGGGCCCACUGGCGCGCGGCAAUUCGCGCUUCGCGUGGAUGACUAGAAAAUCAGAGGAAACCAUCACUCCUUGGAAUUUCGAGGAAGUUGUGGAUAAGGGAGCUUCGGCACAAAGCUUCAUCGAACGAAUGACCAACUUCGACAAGAAUCUCCCAAACGAGAAGGUGCUUCCUAAGCACAGCCUCCUUUACGAAUACUUCACUGUCUACAACGAACUGACUAAAGUGAAAUACGUUACUGAAGGAAUGAGGAAGCCGGCCUUUCUGUCCGGAGAACAGAAGAAAGCAAUUGUCGAUCUGCUGUUCAAGACCAACCGCAAGGUGACCGUCAAGCAGCUUAAAGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGUUUCGACUCAGUGGAAAUCAGCGGGGUGGAGGACAGAUUCAACGCUUCGCUGGGAACCUAUCAUGAUCUCCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUUGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAAGAUAUCGUCCUGACCUUGACCCUUUUCGAGGAUCGCGAGAUGAUCGAGGAGAGGCUUAAGACCUACGCUCAUCUCUUCGACGAUAAGGUCAUGAAACAACUCAAGCGCCGCCGGUACACUGGUUGGGGCCGCCUCUCCCGCAAGCUGAUCAACGGUAUUCGCGAUAAACAGAGCGGUAAAACUAUCCUGGAUUUCCUCAAAUCGGAUGGCUUCGCUAAUCGUAACUUCAUGCAAUUGAUCCACGACGACAGCCUGACCUUUAAGGAGGACAUCCAAAAAGCACAAGUGUCCGGACAGGGAGACUCACUCCAUGAACACAUCGCGAAUCUGGCCGGUUCGCCGGCGAUUAAGAAGGGAAUUCUGCAAACUGUGAAGGUGGUCGACGAGCUGGUGAAGGUCAUGGGACGGCACAAACCGGAGAAUAUCGUGAUUGAAAUGGCCCGAGAAAACCAGACUACCCAGAAGGGCCAGAAAAACUCCCGCGAAAGGAUGAAGCGGAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAGCUGGGCAGCCAGAUCCUGAAAGAGCACCCGGUGGAAAACACGCAGCUGCAGAACGAGAAGCUCUACCUGUACUAUUUGCAAAAUGGACGGGACAUGUACGUGGACCAAGAGCUGGACAUCAAUCGGUUGUCUGAUUACGACGUGGACCACAUCGUUCCACAGUCCUUUCUGAAGGAUGACUCGAUCGAUAACAAGGUGUUGACUCGCAGCGACAAGAACAGAGGGAAGUCAGAUAAUGUGCCAUCGGAGGAGGUCGUGAAGAAGAUGAAGAAUUACUGGCGGCAGCUCCUGAAUGCGAAGCUGAUUACCCAGAGAAAGUUUGACAAUCUCACUAAAGCCGAGCGCGGCGGACUCUCAGAGCUGGAUAAGGCUGGAUUCAUCAAACGGCAGCUGGUCGAGACUCGGCAGAUUACCAAGCACGUGGCGCAGAUCUUGGACUCCCGCAUGAACACUAAAUACGACGAGAACGAUAAGCUCAUCCGGGAAGUGAAGGUGAUUACCCUGAAAAGCAAACUUGUGUCGGACUUUCGGAAGGACUUUCAGUUUUACAAAGUGAGAGAAAUCAACAACUACCAUCACGCGCAUGACGCAUACCUCAACGCUGUGGUCGGUACCGCCCUGAUCAAAAAGUACCCUAAACUUGAAUCGGAGUUUGUGUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUGAGGAAGAUGAUAGCCAAGUCCGAACAGGAAAUCGGGAAAGCAACUGCGAAAUACUUCUUUUACUCAAACAUCAUGAACUUUUUCAAGACUGAAAUUACGCUGGCCAAUGGAGAAAUCAGGAAGAGGCCACUGAUCGAAACUAACGGAGAAACGGGCGAAAUCGUGUGGGACAAGGGCAGGGACUUCGCAACUGUUCGCAAAGUGCUCUCUAUGCCGCAAGUCAAUAUUGUGAAGAAAACCGAAGUGCAAACCGGCGGAUUUUCAAAGGAAUCGAUCCUCCCAAAGAGAAAUAGCGACAAGCUCAUUGCACGCAAGAAAGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGAUUCGCCGACUGUCGCAUACUCCGUCCUCGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGAAAGAGCAAAAAGCUCAAAUCCGUCAAAGAGCUGCUGGGGAUUACCAUCAUGGAACGAUCCUCGUUCGAGAAGAACCCGAUUGAUUUCCUCGAGGCGAAGGGUUACAAGGAGGUGAAGAAGGAUCUGAUCAUCAAACUCCCCAAGUACUCACUGUUCGAACUGGAAAAUGGUCGGAAGCGCAUGCUGGCUUCGGCCGGAGAACUCCAAAAAGGAAAUGAGCUGGCCUUGCCUAGCAAGUACGUCAACUUCCUCUAUCUUGCUUCGCACUACGAAAAACUCAAAGGGUCACCGGAAGAUAACGAACAGAAGCAGCUUUUCGUGGAGCAGCACAAGCAUUAUCUGGAUGAAAUCAUCGAACAAAUCUCCGAGUUUUCAAAGCGCGUGAUCCUCGCCGACGCCAACCUCGACAAAGUCCUGUCGGCCUACAAUAAGCAUAGAGAUAAGCCGAUCAGAGAACAGGCCGAGAACAUUAUCCACUUGUUCACCCUGACUAACCUGGGAGCCCCAGCCGCCUUCAAGUACUUCGAUACUACUAUCGAUCGCAAAAGAUACACGUCCACCAAGGAAGUUCUGGACGCGACCCUGAUCCACCAAAGCAUCACUGGACUCUACGAAACUAGGAUCGAUCUGUCGCAGCUGGGUGGCGAUGGCGGUGGAUCUCCGAAAAAGAAGAGAAAGGUGUAAUGA
1106 Cas9切口酶(D10A)mRNA ORF AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCUAG
1107 dCas9 (D10A H840A) mRNA ORF AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACGCAAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCUAG
1108 Cas9編碼序列，無起始或終止密碼子 GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUC
1109 Cas9切口酶編碼序列，無終止或起始密碼子 GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUC
1110 dCas9編碼序列，無起始或終止密碼子 GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACGCAAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUC
1111 Cas9 mRNA ORF AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACUAG
1112 Cas9編碼序列，無起始或終止密碼子 GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGAC
1113 Cas9切口酶mRNA ORF AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACUAG
1114 Cas9切口酶編碼序列，無起始或終止密碼子 GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGAC
1115 dCas9 mRNA ORF AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACGCAAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACUAG
1116 dCas9編碼序列，無起始或終止密碼子 GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACGCAAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGC
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1119 Cas9切口酶mRNA ORF AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAAGCGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACAGCGGAUAG
1120 Cas9切口酶編碼序列，無起始或終止密碼子 GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGAC GGAAGCGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACAGCGGA
1121 dCas9 mRNA ORF AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACGCAAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGAC GGAAGCGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACAGCGGAUAG
1122 dCas9編碼序列，無起始或終止密碼子 GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACGCAAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGAC GGAAGCGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACAGCGGA
1123 Cas9轉錄物之DNA編碼序列 GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCGCCACCATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAGCTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAG
1124 Cas9轉錄物之DNA編碼序列 GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAGCTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAG
1125 Cas9 ORF ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACcggCTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAaAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAG
1126 Cas9 ORF ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACAGCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCAGACTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAGGAGAGCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGAGACACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGAGACTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCAGAGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGAGCGCCAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGAGCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCAGCATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGAGACAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCAGCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGAGAAGACAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACAGAGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCAGAATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCAGAGGCAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCCCAGAGCTTCATCGAGAGAATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACAGAAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACAGCGTGGAGATCAGCGGCGTGGAGGACAGATTCAACGCCAGCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAGAGACTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACCGGCTGGGGCAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGCATCAGAGACAAGCAGAGCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGAGCGGCCAGGGCGACAGCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCAGCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCAGACACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCAGAGAGAGAATGAAGAGAATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCAGAGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTGGACCACATCGTGCCCCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACAGAGGCAAGAGCGACAACGTGCCCAGCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGAGAAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAGACCAGACAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCAGAGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGAGCAAGCTGGTGAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGAGAGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGAGAAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCAGAAAGAGACCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCAGAGACTTCGCCACCGTGAGAAAGGTGCTGAGCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCAGCAAGGAGAGCATCCTGCCCAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTACAGCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGAGAAGCAGCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACAGCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCAGAAAGAGAATGCTGGCCAGCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCAGCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCAGCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGAGCGCCTACAACAAGCACAGAGACAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACAGAAAGAGATACACCAGCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACCAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGCGGCGACGGCGGCGGCAGCCCCAAGAAGAAGAGAAAGGTGTGA
1127 Cas9轉錄物之DNA編碼序列 GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCGCCACCATGGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACAGCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCAGACTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAGGAGAGCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGAGACACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGAGACTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCAGAGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGAGCGCCAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGAGCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCAGCATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGAGACAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCAGCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGAGAAGACAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACAGAGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCAGAATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCAGAGGCAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCCCAGAGCTTCATCGAGAGAATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACAGAAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACAGCGTGGAGATCAGCGGCGTGGAGGACAGATTCAACGCCAGCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAGAGACTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACCGGCTGGGGCAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGCATCAGAGACAAGCAGAGCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGAGCGGCCAGGGCGACAGCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCAGCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCAGACACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCAGAGAGAGAATGAAGAGAATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCAGAGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTGGACCACATCGTGCCCCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACAGAGGCAAGAGCGACAACGTGCCCAGCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGAGAAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAGACCAGACAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCAGAGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGAGCAAGCTGGTGAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGAGAGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGAGAAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCAGAAAGAGACCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCAGAGACTTCGCCACCGTGAGAAAGGTGCTGAGCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCAGCAAGGAGAGCATCCTGCCCAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTACAGCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGAGAAGCAGCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACAGCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCAGAAAGAGAATGCTGGCCAGCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCAGCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCAGCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGAGCGCCTACAACAAGCACAGAGACAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACAGAAAGAGATACACCAGCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACCAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGCGGCGACGGCGGCGGCAGCCCCAAGAAGAAGAGAAAGGTGTGACTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAG
1128    未使用
1129 Cas9 ORF ATGGACAAGAAGTACTCTATCGGTTTGGACATCGGTACCAACTCTGTCGGTTGGGCCGTCATCACCGACGAATACAAGGTCCCATCTAAGAAGTTCAAGGTCTTGGGTAACACCGACAGACACTCTATCAAGAAGAACTTGATCGGTGCCTTGTTGTTCGACTCTGGTGAAACCGCCGAAGCCACCAGATTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACTTGCAAGAAATCTTCTCTAACGAAATGGCCAAGGTCGACGACTCTTTCTTCCACAGATTGGAAGAATCTTTCTTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCAATCTTCGGTAACATCGTCGACGAAGTCGCCTACCACGAAAAGTACCCAACCATCTACCACTTGAGAAAGAAGTTGGTCGACTCTACCGACAAGGCCGACTTGAGATTGATCTACTTGGCCTTGGCCCACATGATCAAGTTCAGAGGTCACTTCTTGATCGAAGGTGACTTGAACCCAGACAACTCTGACGTCGACAAGTTGTTCATCCAATTGGTCCAAACCTACAACCAATTGTTCGAAGAAAACCCAATCAACGCCTCTGGTGTCGACGCCAAGGCCATCTTGTCTGCCAGATTGTCTAAGAGCAGAAGATTGGAAAACTTGATCGCCCAATTGCCAGGTGAAAAGAAGAACGGTTTGTTCGGTAACTTGATCGCCTTGTCTTTGGGTTTGACCCCAAACTTCAAGTCTAACTTCGACTTGGCCGAAGACGCCAAGTTGCAATTGTCTAAGGACACCTACGACGACGACTTGGACAACTTGTTGGCCCAAATCGGTGACCAATACGCCGACTTGTTCTTGGCCGCCAAGAACTTGTCTGACGCCATCTTGTTGTCTGACATCTTGAGAGTCAACACCGAAATCACCAAGGCCCCATTGTCTGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAAGACTTGACCTTGTTGAAGGCCTTGGTCAGACAACAATTGCCAGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAATCTAAGAACGGTTACGCCGGTTACATCGACGGTGGTGCCTCTCAAGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCAATCTTGGAAAAGATGGACGGTACCGAAGAATTGTTGGTCAAGTTGAACAGAGAAGACTTGTTGAGAAAGCAAAGAACCTTCGACAACGGTTCTATCCCACACCAAATCCACTTGGGTGAATTGCACGCCATCTTGAGAAGACAAGAAGACTTCTACCCATTCTTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCTTGACCTTCAGAATCCCATACTACGTCGGTCCATTGGCCAGAGGTAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGTCTGAAGAAACCATCACCCCATGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGTGCCTCTGCCCAATCTTTCATCGAAAGAATGACCAACTTCGACAAGAACTTGCCAAACGAAAAGGTCTTGCCAAAGCACTCTTTGTTGTACGAATACTTCACCGTCTACAACGAATTGACCAAGGTCAAGTACGTCACCGAAGGTATGAGAAAGCCAGCCTTCTTGTCTGGTGAACAAAAGAAGGCCATCGTCGACTTGTTGTTCAAGACCAACAGAAAGGTCACCGTCAAGCAATTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACTCTGTCGAAATCTCTGGTGTCGAAGACAGATTCAACGCCTCTTTGGGTACCTACCACGACTTGTTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCTTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCTTGGAAGACATCGTCTTGACCTTGACCTTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGATTGAAGACCTACGCCCACTTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAATTGAAGAGAAGAAGATACACCGGTTGGGGTAGATTGAGCAGAAAGTTGATCAACGGTATCAGAGACAAGCAATCTGGTAAGACCATCTTGGACTTCTTGAAGTCTGACGGTTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAATTGATCCACGACGACTCTTTGACCTTCAAGGAAGACATCCAAAAGGCCCAAGTCTCTGGTCAAGGTGACTCTTTGCACGAACACATCGCCAACTTGGCCGGTTCTCCAGCCATCAAGAAGGGTATCTTGCAAACCGTCAAGGTCGTCGACGAATTGGTCAAGGTCATGGGTAGACACAAGCCAGAAAACATCGTCATCGAAATGGCCAGAGAAAACCAAACCACCCAAAAGGGTCAAAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGTATCAAGGAATTGGGTTCTCAAATCTTGAAGGAACACCCAGTCGAAAACACCCAATTGCAAAACGAAAAGTTGTACTTGTACTACTTGCAAAACGGTAGAGACATGTACGTCGACCAAGAATTGGACATCAACAGATTGTCTGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCACAATCTTTCTTGAAGGACGACTCTATCGACAACAAGGTCTTGACCAGATCTGACAAGAACAGAGGTAAGTCTGACAACGTCCCATCTGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAATTGTTGAACGCCAAGTTGATCACCCAAAGAAAGTTCGACAACTTGACCAAGGCCGAAAGAGGTGGTTTGTCTGAATTGGACAAGGCCGGTTTCATCAAGAGACAATTGGTCGAAACCAGACAAATCACCAAGCACGTCGCCCAAATCTTGGACAGCAGAATGAACACCAAGTACGACGAAAACGACAAGTTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACCTTGAAGTCTAAGTTGGTCTCTGACTTCAGAAAGGACTTCCAATTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACTTGAACGCCGTCGTCGGTACCGCCTTGATCAAGAAGTACCCAAAGTTGGAATCTGAATTCGTCTACGGTGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCCAAGTCTGAACAAGAAATCGGTAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACTCTAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAAATCACCTTGGCCAACGGTGAAATCAGAAAGAGACCATTGATCGAAACCAACGGTGAAACCGGTGAAATCGTCTGGGACAAGGGTAGAGACTTCGCCACCGTCAGAAAGGTCTTGTCTATGCCACAAGTCAACATCGTCAAGAAGACCGAAGTCCAAACCGGTGGTTTCTCTAAGGAATCTATCTTGCCAAAGAGAAACTCTGACAAGTTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCAAAGAAGTACGGTGGTTTCGACTCTCCAACCGTCGCCTACTCTGTCTTGGTCGTCGCCAAGGTCGAAAAGGGTAAGTCTAAGAAGTTGAAGTCTGTCAAGGAATTGTTGGGTATCACCATCATGGAAAGATCTTCTTTCGAAAAGAACCCAATCGACTTCTTGGAAGCCAAGGGTTACAAGGAAGTCAAGAAGGACTTGATCATCAAGTTGCCAAAGTACTCTTTGTTCGAATTGGAAAACGGTAGAAAGAGAATGTTGGCCTCTGCCGGTGAATTGCAAAAGGGTAACGAATTGGCCTTGCCATCTAAGTACGTCAACTTCTTGTACTTGGCCTCTCACTACGAAAAGTTGAAGGGTTCTCCAGAAGACAACGAACAAAAGCAATTGTTCGTCGAACAACACAAGCACTACTTGGACGAAATCATCGAACAAATCTCTGAATTCTCTAAGAGAGTCATCTTGGCCGACGCCAACTTGGACAAGGTCTTGTCTGCCTACAACAAGCACAGAGACAAGCCAATCAGAGAACAAGCCGAAAACATCATCCACTTGTTCACCTTGACCAACTTGGGTGCCCCAGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACAGAAAGAGATACACCTCTACCAAGGAAGTCTTGGACGCCACCTTGATCCACCAATCTATCACCGGTTTGTACGAAACCAGAATCGACTTGTCTCAATTGGGTGGTGACGGTGGTGGTTCTCCAAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAA
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1133 Cas9切口酶ORF ATGGACAAGAAGTACTCCATCGGCCTGGCCATCGGCACCAACTCCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCTCCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACTCCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACTCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGTACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCTCCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACTCCTTCTTCCACCGGCTGGAGGAGTCCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGCGGAAGAAGCTGGTGGACTCCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACTCCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCTCCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCCAAGTCCCGGCGGCTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGTCCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGTCCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGTCCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGTCCGACATCCTGCGGGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGTCCGCCTCCATGATCAAGCGGTACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGCGGCAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGTCCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCTCCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACCGGGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCTCCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGCGGCGGCAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACCGGGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGGATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCCGGGGCAACTCCCGGTTCGCCTGGATGACCCGGAAGTCCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCTCCGCCCAGTCCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACTCCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGGAAGCCCGCCTTCCTGTCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAGATCTCCGGCGTGGAGGACCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGGGAGATGATCGAGGAGCGGCTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGCGGTACACCGGCTGGGGCCGGCTGTCCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACCGGAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACTCCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGACTCCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCTCCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACTCCCGGGAGCGGATGAAGCGGATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCTCCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCCGGGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGACGTGGACCACATCGTGCCCCAGTCCTTCCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCCGGTCCGACAAGAACCGGGGCAAGTCCGACAACGTGCCCTCCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGCGGAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCTGTCCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGGCAGCTGGTGGAGACCCGGCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCCGGGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGACTTCCGGAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGGGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGTCCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGTCCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACTCCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGGGACTTCGCCACCGTGCGGAAGGTGCTGTCCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCTCCAAGGAGTCCATCCTGCCCAAGCGGAACTCCGACAAGCTGATCGCCCGGAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACTCCCCCACCGTGGCCTACTCCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGTCCAAGAAGCTGAAGTCCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGCGGTCCTCCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCTCCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCTCCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCTCCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCTCCGAGTTCTCCAAGCGGGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCCATCCGGGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCTCCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGTCCATCACCGGCCTGTACGAGACCCGGATCGACCTGTCCCAGCTGGGCGGCGACGGCGGCGGCTCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGTGA
1134 Cas9切口酶ORF ATGGACAAGAAGTACTCCATCGGCCTGGCCATCGGCACCAACTCCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCTCCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACTCCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACTCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGTACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCTCCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACTCCTTCTTCCACCGGCTGGAGGAGTCCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGCGGAAGAAGCTGGTGGACTCCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACTCCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCTCCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCCAAGTCCCGGCGGCTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGTCCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGTCCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGTCCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGTCCGACATCCTGCGGGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGTCCGCCTCCATGATCAAGCGGTACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGCGGCAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGTCCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCTCCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACCGGGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCTCCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGCGGCGGCAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACCGGGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGGATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCCGGGGCAACTCCCGGTTCGCCTGGATGACCCGGAAGTCCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCTCCGCCCAGTCCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACTCCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGGAAGCCCGCCTTCCTGTCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAGATCTCCGGCGTGGAGGACCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGGGAGATGATCGAGGAGCGGCTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGCGGTACACCGGCTGGGGCCGGCTGTCCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACCGGAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACTCCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGACTCCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCTCCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACTCCCGGGAGCGGATGAAGCGGATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCTCCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCCGGGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGACGTGGACCACATCGTGCCCCAGTCCTTCCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCCGGTCCGACAAGAACCGGGGCAAGTCCGACAACGTGCCCTCCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGCGGAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCTGTCCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGGCAGCTGGTGGAGACCCGGCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCCGGGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGACTTCCGGAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGGGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGTCCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGTCCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACTCCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGGGACTTCGCCACCGTGCGGAAGGTGCTGTCCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCTCCAAGGAGTCCATCCTGCCCAAGCGGAACTCCGACAAGCTGATCGCCCGGAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACTCCCCCACCGTGGCCTACTCCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGTCCAAGAAGCTGAAGTCCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGCGGTCCTCCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCTCCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCTCCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCTCCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCTCCGAGTTCTCCAAGCGGGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCCATCCGGGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCTCCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGTCCATCACCGGCCTGTACGAGACCCGGATCGACCTGTCCCAGCTGGGCGGCGACTGA
1135 Cas9切口酶ORF ATGGACAAGAAGTACTCCATCGGCCTGGCCATCGGCACCAACTCCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCTCCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACTCCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACTCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGTACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCTCCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACTCCTTCTTCCACCGGCTGGAGGAGTCCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGCGGAAGAAGCTGGTGGACTCCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACTCCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCTCCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCCAAGTCCCGGCGGCTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGTCCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGTCCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGTCCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGTCCGACATCCTGCGGGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGTCCGCCTCCATGATCAAGCGGTACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGCGGCAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGTCCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCTCCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACCGGGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCTCCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGCGGCGGCAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACCGGGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGGATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCCGGGGCAACTCCCGGTTCGCCTGGATGACCCGGAAGTCCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCTCCGCCCAGTCCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACTCCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGGAAGCCCGCCTTCCTGTCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAGATCTCCGGCGTGGAGGACCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGGGAGATGATCGAGGAGCGGCTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGCGGTACACCGGCTGGGGCCGGCTGTCCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACCGGAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACTCCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGACTCCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCTCCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACTCCCGGGAGCGGATGAAGCGGATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCTCCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCCGGGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGACGTGGACCACATCGTGCCCCAGTCCTTCCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCCGGTCCGACAAGAACCGGGGCAAGTCCGACAACGTGCCCTCCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGCGGAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCTGTCCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGGCAGCTGGTGGAGACCCGGCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCCGGGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGACTTCCGGAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGGGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGTCCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGTCCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACTCCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGGGACTTCGCCACCGTGCGGAAGGTGCTGTCCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCTCCAAGGAGTCCATCCTGCCCAAGCGGAACTCCGACAAGCTGATCGCCCGGAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACTCCCCCACCGTGGCCTACTCCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGTCCAAGAAGCTGAAGTCCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGCGGTCCTCCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCTCCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCTCCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCTCCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCTCCGAGTTCTCCAAGCGGGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCCATCCGGGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCTCCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGTCCATCACCGGCCTGTACGAGACCCGGATCGACCTGTCCCAGCTGGGCGGCGACGGCTCCGGCTCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGGACGGCTCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGGACTCCGGCTGA
1136 dCas9 ORF ATGGACAAGAAGTACTCCATCGGCCTGGCCATCGGCACCAACTCCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCTCCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACTCCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACTCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGTACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCTCCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACTCCTTCTTCCACCGGCTGGAGGAGTCCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGCGGAAGAAGCTGGTGGACTCCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACTCCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCTCCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCCAAGTCCCGGCGGCTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGTCCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGTCCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGTCCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGTCCGACATCCTGCGGGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGTCCGCCTCCATGATCAAGCGGTACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGCGGCAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGTCCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCTCCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACCGGGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCTCCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGCGGCGGCAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACCGGGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGGATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCCGGGGCAACTCCCGGTTCGCCTGGATGACCCGGAAGTCCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCTCCGCCCAGTCCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACTCCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGGAAGCCCGCCTTCCTGTCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAGATCTCCGGCGTGGAGGACCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGGGAGATGATCGAGGAGCGGCTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGCGGTACACCGGCTGGGGCCGGCTGTCCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACCGGAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACTCCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGACTCCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCTCCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACTCCCGGGAGCGGATGAAGCGGATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCTCCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCCGGGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGACGTGGACGCCATCGTGCCCCAGTCCTTCCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCCGGTCCGACAAGAACCGGGGCAAGTCCGACAACGTGCCCTCCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGCGGAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCTGTCCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGGCAGCTGGTGGAGACCCGGCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCCGGGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGACTTCCGGAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGGGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGTCCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGTCCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACTCCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGGGACTTCGCCACCGTGCGGAAGGTGCTGTCCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCTCCAAGGAGTCCATCCTGCCCAAGCGGAACTCCGACAAGCTGATCGCCCGGAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACTCCCCCACCGTGGCCTACTCCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGTCCAAGAAGCTGAAGTCCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGCGGTCCTCCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCTCCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCTCCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCTCCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCTCCGAGTTCTCCAAGCGGGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCCATCCGGGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCTCCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGTCCATCACCGGCCTGTACGAGACCCGGATCGACCTGTCCCAGCTGGGCGGCGACGGCGGCGGCTCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGTGA
1137 dCas9 ORF ATGGACAAGAAGTACTCCATCGGCCTGGCCATCGGCACCAACTCCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCTCCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACTCCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACTCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGTACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCTCCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACTCCTTCTTCCACCGGCTGGAGGAGTCCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGCGGAAGAAGCTGGTGGACTCCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACTCCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCTCCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCCAAGTCCCGGCGGCTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGTCCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGTCCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGTCCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGTCCGACATCCTGCGGGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGTCCGCCTCCATGATCAAGCGGTACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGCGGCAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGTCCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCTCCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACCGGGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCTCCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGCGGCGGCAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACCGGGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGGATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCCGGGGCAACTCCCGGTTCGCCTGGATGACCCGGAAGTCCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCTCCGCCCAGTCCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACTCCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGGAAGCCCGCCTTCCTGTCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAGATCTCCGGCGTGGAGGACCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGGGAGATGATCGAGGAGCGGCTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGCGGTACACCGGCTGGGGCCGGCTGTCCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACCGGAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACTCCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGACTCCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCTCCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACTCCCGGGAGCGGATGAAGCGGATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCTCCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCCGGGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGACGTGGACGCCATCGTGCCCCAGTCCTTCCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCCGGTCCGACAAGAACCGGGGCAAGTCCGACAACGTGCCCTCCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGCGGAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCTGTCCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGGCAGCTGGTGGAGACCCGGCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCCGGGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGACTTCCGGAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGGGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGTCCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGTCCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACTCCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGGGACTTCGCCACCGTGCGGAAGGTGCTGTCCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCTCCAAGGAGTCCATCCTGCCCAAGCGGAACTCCGACAAGCTGATCGCCCGGAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACTCCCCCACCGTGGCCTACTCCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGTCCAAGAAGCTGAAGTCCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGCGGTCCTCCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCTCCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCTCCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCTCCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCTCCGAGTTCTCCAAGCGGGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCCATCCGGGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCTCCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGTCCATCACCGGCCTGTACGAGACCCGGATCGACCTGTCCCAGCTGGGCGGCGACTGA
1138 dCas9 ORF ATGGACAAGAAGTACTCCATCGGCCTGGCCATCGGCACCAACTCCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCTCCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACTCCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACTCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGTACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCTCCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACTCCTTCTTCCACCGGCTGGAGGAGTCCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGCGGAAGAAGCTGGTGGACTCCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACTCCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCTCCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCCAAGTCCCGGCGGCTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGTCCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGTCCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGTCCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGTCCGACATCCTGCGGGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGTCCGCCTCCATGATCAAGCGGTACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGCGGCAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGTCCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCTCCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACCGGGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCTCCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGCGGCGGCAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACCGGGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGGATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCCGGGGCAACTCCCGGTTCGCCTGGATGACCCGGAAGTCCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCTCCGCCCAGTCCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACTCCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGGAAGCCCGCCTTCCTGTCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAGATCTCCGGCGTGGAGGACCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGGGAGATGATCGAGGAGCGGCTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGCGGTACACCGGCTGGGGCCGGCTGTCCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACCGGAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACTCCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGACTCCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCTCCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACTCCCGGGAGCGGATGAAGCGGATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCTCCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCCGGGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGACGTGGACGCCATCGTGCCCCAGTCCTTCCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCCGGTCCGACAAGAACCGGGGCAAGTCCGACAACGTGCCCTCCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGCGGAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCTGTCCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGGCAGCTGGTGGAGACCCGGCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCCGGGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGACTTCCGGAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGGGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGTCCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGTCCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACTCCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGGGACTTCGCCACCGTGCGGAAGGTGCTGTCCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCTCCAAGGAGTCCATCCTGCCCAAGCGGAACTCCGACAAGCTGATCGCCCGGAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACTCCCCCACCGTGGCCTACTCCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGTCCAAGAAGCTGAAGTCCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGCGGTCCTCCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCTCCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCTCCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCTCCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCTCCGAGTTCTCCAAGCGGGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCCATCCGGGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCTCCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGTCCATCACCGGCCTGTACGAGACCCGGATCGACCTGTCCCAGCTGGGCGGCGACGGCTCCGGCTCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGGACGGCTCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGGACTCCGGCTGA
1139 Cas9 ORF ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACAGCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGTACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACCGGCTGGAGGAGAGCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGCGGAAGAAGCTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGAGCGCCCGGCTGAGCAAGAGCCGGCGGCTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGAGCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGCGGGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCAGCATGATCAAGCGGTACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGCGGCAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCAGCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACCGGGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGCGGCGGCAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACCGGGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGGATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCCGGGGCAACAGCCGGTTCGCCTGGATGACCCGGAAGAGCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGGAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACAGCGTGGAGATCAGCGGCGTGGAGGACCGGTTCAACGCCAGCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGGGAGATGATCGAGGAGCGGCTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGCGGTACACCGGCTGGGGCCGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGAGCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGCTTCGCCAACCGGAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGAGCGGCCAGGGCGACAGCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCAGCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCCGGGAGCGGATGAAGCGGATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCCGGGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACCGGCTGAGCGACTACGACGTGGACCACATCGTGCCCCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTGCTGACCCGGAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCAGCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGCGGAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCTGAGCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGGCAGCTGGTGGAGACCCGGCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACAGCCGGATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCCGGGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGAGCAAGCTGGTGAGCGACTTCCGGAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGGGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGGGACTTCGCCACCGTGCGGAAGGTGCTGAGCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCAGCAAGGAGAGCATCCTGCCCAAGCGGAACAGCGACAAGCTGATCGCCCGGAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTACAGCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGCGGAGCAGCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACAGCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCAGCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCAGCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCAGCAAGCGGGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGAGCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCCATCCGGGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCAGCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACCCGGATCGACCTGAGCCAGCTGGGCGGCGACGGCAGCGGCAGCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGGACGGCAGCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGGACAGCGGCTGA
1140 Cas9 ORF ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACAGCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGTACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACCGGCTGGAGGAGAGCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGCGGAAGAAGCTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGAGCGCCCGGCTGAGCAAGAGCCGGCGGCTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGAGCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGCGGGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCAGCATGATCAAGCGGTACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGCGGCAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCAGCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACCGGGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGCGGCGGCAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACCGGGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGGATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCCGGGGCAACAGCCGGTTCGCCTGGATGACCCGGAAGAGCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGGAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACAGCGTGGAGATCAGCGGCGTGGAGGACCGGTTCAACGCCAGCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGGGAGATGATCGAGGAGCGGCTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGCGGTACACCGGCTGGGGCCGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGAGCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGCTTCGCCAACCGGAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGAGCGGCCAGGGCGACAGCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCAGCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCCGGGAGCGGATGAAGCGGATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCCGGGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACCGGCTGAGCGACTACGACGTGGACCACATCGTGCCCCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTGCTGACCCGGAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCAGCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGCGGAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCTGAGCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGGCAGCTGGTGGAGACCCGGCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACAGCCGGATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCCGGGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGAGCAAGCTGGTGAGCGACTTCCGGAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGGGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGGGACTTCGCCACCGTGCGGAAGGTGCTGAGCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCAGCAAGGAGAGCATCCTGCCCAAGCGGAACAGCGACAAGCTGATCGCCCGGAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTACAGCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGCGGAGCAGCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACAGCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCAGCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCAGCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCAGCAAGCGGGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGAGCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCCATCCGGGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCAGCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACCCGGATCGACCTGAGCCAGCTGGGCGGCGACTGA
1141 Cas9切口酶ORF ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGCCATCGGCACCAACAGCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGTACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACCGGCTGGAGGAGAGCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGCGGAAGAAGCTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGAGCGCCCGGCTGAGCAAGAGCCGGCGGCTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGAGCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGCGGGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCAGCATGATCAAGCGGTACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGCGGCAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCAGCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACCGGGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGCGGCGGCAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACCGGGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGGATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCCGGGGCAACAGCCGGTTCGCCTGGATGACCCGGAAGAGCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGGAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACAGCGTGGAGATCAGCGGCGTGGAGGACCGGTTCAACGCCAGCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGGGAGATGATCGAGGAGCGGCTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGCGGTACACCGGCTGGGGCCGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGAGCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGCTTCGCCAACCGGAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGAGCGGCCAGGGCGACAGCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCAGCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCCGGGAGCGGATGAAGCGGATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCCGGGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACCGGCTGAGCGACTACGACGTGGACCACATCGTGCCCCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTGCTGACCCGGAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCAGCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGCGGAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCTGAGCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGGCAGCTGGTGGAGACCCGGCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACAGCCGGATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCCGGGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGAGCAAGCTGGTGAGCGACTTCCGGAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGGGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGGGACTTCGCCACCGTGCGGAAGGTGCTGAGCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCAGCAAGGAGAGCATCCTGCCCAAGCGGAACAGCGACAAGCTGATCGCCCGGAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTACAGCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGCGGAGCAGCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACAGCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCAGCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCAGCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCAGCAAGCGGGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGAGCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCCATCCGGGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCAGCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACCCGGATCGACCTGAGCCAGCTGGGCGGCGACGGCGGCGGCAGCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGTGA
1142 Cas9切口酶ORF ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGCCATCGGCACCAACAGCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGTACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACCGGCTGGAGGAGAGCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGCGGAAGAAGCTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGAGCGCCCGGCTGAGCAAGAGCCGGCGGCTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGAGCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGCGGGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCAGCATGATCAAGCGGTACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGCGGCAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCAGCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACCGGGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGCGGCGGCAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACCGGGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGGATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCCGGGGCAACAGCCGGTTCGCCTGGATGACCCGGAAGAGCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGGAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACAGCGTGGAGATCAGCGGCGTGGAGGACCGGTTCAACGCCAGCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGGGAGATGATCGAGGAGCGGCTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGCGGTACACCGGCTGGGGCCGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGAGCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGCTTCGCCAACCGGAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGAGCGGCCAGGGCGACAGCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCAGCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCCGGGAGCGGATGAAGCGGATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCCGGGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACCGGCTGAGCGACTACGACGTGGACCACATCGTGCCCCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTGCTGACCCGGAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCAGCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGCGGAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCTGAGCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGGCAGCTGGTGGAGACCCGGCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACAGCCGGATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCCGGGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGAGCAAGCTGGTGAGCGACTTCCGGAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGGGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGGGACTTCGCCACCGTGCGGAAGGTGCTGAGCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCAGCAAGGAGAGCATCCTGCCCAAGCGGAACAGCGACAAGCTGATCGCCCGGAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTACAGCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGCGGAGCAGCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACAGCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCAGCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCAGCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCAGCAAGCGGGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGAGCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCCATCCGGGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCAGCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACCCGGATCGACCTGAGCCAGCTGGGCGGCGACGGCAGCGGCAGCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGGACGGCAGCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGGACAGCGGCTGA
1143 Cas9切口酶ORF ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGcCATCGGCACCAACAGCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGTACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACCGGCTGGAGGAGAGCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGCGGAAGAAGCTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGAGCGCCCGGCTGAGCAAGAGCCGGCGGCTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGAGCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGCGGGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCAGCATGATCAAGCGGTACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGCGGCAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCAGCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACCGGGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGCGGCGGCAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACCGGGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGGATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCCGGGGCAACAGCCGGTTCGCCTGGATGACCCGGAAGAGCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGGAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACAGCGTGGAGATCAGCGGCGTGGAGGACCGGTTCAACGCCAGCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGGGAGATGATCGAGGAGCGGCTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGCGGTACACCGGCTGGGGCCGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGAGCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGCTTCGCCAACCGGAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGAGCGGCCAGGGCGACAGCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCAGCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCCGGGAGCGGATGAAGCGGATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCCGGGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACCGGCTGAGCGACTACGACGTGGACCACATCGTGCCCCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTGCTGACCCGGAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCAGCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGCGGAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCTGAGCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGGCAGCTGGTGGAGACCCGGCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACAGCCGGATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCCGGGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGAGCAAGCTGGTGAGCGACTTCCGGAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGGGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGGGACTTCGCCACCGTGCGGAAGGTGCTGAGCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCAGCAAGGAGAGCATCCTGCCCAAGCGGAACAGCGACAAGCTGATCGCCCGGAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTACAGCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGCGGAGCAGCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACAGCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCAGCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCAGCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCAGCAAGCGGGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGAGCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCCATCCGGGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCAGCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACCCGGATCGACCTGAGCCAGCTGGGCGGCGACTGA
1144 dCas9 ORF ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGcCATCGGCACCAACAGCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGTACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACCGGCTGGAGGAGAGCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGCGGAAGAAGCTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGAGCGCCCGGCTGAGCAAGAGCCGGCGGCTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGAGCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGCGGGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCAGCATGATCAAGCGGTACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGCGGCAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCAGCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACCGGGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGCGGCGGCAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACCGGGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGGATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCCGGGGCAACAGCCGGTTCGCCTGGATGACCCGGAAGAGCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGGAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACAGCGTGGAGATCAGCGGCGTGGAGGACCGGTTCAACGCCAGCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGGGAGATGATCGAGGAGCGGCTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGCGGTACACCGGCTGGGGCCGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGAGCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGCTTCGCCAACCGGAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGAGCGGCCAGGGCGACAGCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCAGCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCCGGGAGCGGATGAAGCGGATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCCGGGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACCGGCTGAGCGACTACGACGTGGACgcCATCGTGCCCCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTGCTGACCCGGAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCAGCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGCGGAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCTGAGCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGGCAGCTGGTGGAGACCCGGCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACAGCCGGATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCCGGGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGAGCAAGCTGGTGAGCGACTTCCGGAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGGGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGGGACTTCGCCACCGTGCGGAAGGTGCTGAGCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCAGCAAGGAGAGCATCCTGCCCAAGCGGAACAGCGACAAGCTGATCGCCCGGAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTACAGCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGCGGAGCAGCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACAGCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCAGCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCAGCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCAGCAAGCGGGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGAGCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCCATCCGGGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCAGCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACCCGGATCGACCTGAGCCAGCTGGGCGGCGACGGCGGCGGCAGCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGTGA
1145 dCas9 ORF ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGCCATCGGCACCAACAGCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGTACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACCGGCTGGAGGAGAGCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGCGGAAGAAGCTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGAGCGCCCGGCTGAGCAAGAGCCGGCGGCTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGAGCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGCGGGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCAGCATGATCAAGCGGTACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGCGGCAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCAGCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACCGGGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGCGGCGGCAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACCGGGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGGATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCCGGGGCAACAGCCGGTTCGCCTGGATGACCCGGAAGAGCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGGAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACAGCGTGGAGATCAGCGGCGTGGAGGACCGGTTCAACGCCAGCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGGGAGATGATCGAGGAGCGGCTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGCGGTACACCGGCTGGGGCCGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGAGCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGCTTCGCCAACCGGAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGAGCGGCCAGGGCGACAGCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCAGCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCCGGGAGCGGATGAAGCGGATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCCGGGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACCGGCTGAGCGACTACGACGTGGACGCCATCGTGCCCCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTGCTGACCCGGAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCAGCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGCGGAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCTGAGCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGGCAGCTGGTGGAGACCCGGCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACAGCCGGATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCCGGGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGAGCAAGCTGGTGAGCGACTTCCGGAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGGGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGGGACTTCGCCACCGTGCGGAAGGTGCTGAGCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCAGCAAGGAGAGCATCCTGCCCAAGCGGAACAGCGACAAGCTGATCGCCCGGAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTACAGCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGCGGAGCAGCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACAGCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCAGCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCAGCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCAGCAAGCGGGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGAGCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCCATCCGGGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCAGCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACCCGGATCGACCTGAGCCAGCTGGGCGGCGACGGCAGCGGCAGCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGGACGGCAGCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGGACAGCGGCTGA
1146 dCas9 ORF ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGcCATCGGCACCAACAGCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGTACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACCGGCTGGAGGAGAGCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGCGGAAGAAGCTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGAGCGCCCGGCTGAGCAAGAGCCGGCGGCTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGAGCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGCGGGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCAGCATGATCAAGCGGTACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGCGGCAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCAGCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACCGGGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGCGGCGGCAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACCGGGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGGATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCCGGGGCAACAGCCGGTTCGCCTGGATGACCCGGAAGAGCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGGAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACAGCGTGGAGATCAGCGGCGTGGAGGACCGGTTCAACGCCAGCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGGGAGATGATCGAGGAGCGGCTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGCGGTACACCGGCTGGGGCCGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGAGCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGCTTCGCCAACCGGAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGAGCGGCCAGGGCGACAGCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCAGCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCCGGGAGCGGATGAAGCGGATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCCGGGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACCGGCTGAGCGACTACGACGTGGACgcCATCGTGCCCCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTGCTGACCCGGAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCAGCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGCGGAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCTGAGCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGGCAGCTGGTGGAGACCCGGCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACAGCCGGATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCCGGGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGAGCAAGCTGGTGAGCGACTTCCGGAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGGGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGGGACTTCGCCACCGTGCGGAAGGTGCTGAGCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCAGCAAGGAGAGCATCCTGCCCAAGCGGAACAGCGACAAGCTGATCGCCCGGAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTACAGCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGCGGAGCAGCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACAGCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCAGCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCAGCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCAGCAAGCGGGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGAGCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCCATCCGGGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCAGCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACCCGGATCGACCTGAGCCAGCTGGGCGGCGACTGA
sgRNA名稱有時用緊接著G之後的一或多個前置零提供。此不影響名稱之含義。因此，舉例而言，G000282、G0282、G00282及G282係指相同sgRNA。類似地，crRNA及或trRNA名稱有時分別用緊接著CR或TR之後的一或多個前置零提供，其不影響名稱之含義。因此，舉例而言，CR000100、CR00100、CR0100及CR100係指相同crRNA，且TR000200、TR00200、TR0200及TR200係指相同trRNA。
對於SEQ ID NO 201-294及301-394，未展示引導區且對應於其餘區之位置相對於針對SEQ ID NO: 1-90及101-190中給定之長度分別各自遞減SEQ ID NO: 1-90、695-698、101-190及795-798 (通常但未必始終為20)中之引導序列之長度。對於SEQ ID NO 401-494及501-594，間隔物為3+x之長度且對應於其餘區之位置各自分別遞減SEQ ID NO: 1-90、695-698、101-190及795-798 (通常但未必始終為20)中之引導序列之長度且相對於針對SEQ ID NO: 1-90、101-190及795-798分別所給出之長度遞增3+x。定義
如本文所用之「編輯效率」或「編輯百分比」或「編輯%」為所關注之目標區域中具有核苷酸***或缺失之序列讀段之總數目相對於藉由Cas RNP裂解之後之序列讀段之總數目的比率。
如本文所用之「區域」描述核酸的保守基團。區亦可稱為「模組」或「域」。sgRNA之區域可執行特定功能，例如導引RNP之核酸內切酶活性，例如如Briner AE等人,Molecular Cell 56:333-339 (2014)中所述。sgRNA之例示性區域描述於表3中。
如本文所用之「髮夾」描述當核酸股摺疊且與相同股之另一段形成鹼基對時而產生的核酸雙螺旋體。髮夾可形成包含環或U-形之結構。在一些實施例中，髮夾可由RNA環構成。髮夾可由在單一核酸分子中結合在一起之兩個互補序列形成，伴以分子之摺疊或起皺。在一些實施例中，髮夾包含莖或莖環結構。如本文所用，「髮夾區」係指sgRNA之保守部分中的髮夾1及髮夾2且髮夾1與髮夾2之間的「n」。
如本文所用，「核糖核蛋白」(RNP)或「RNP複合物」描述sgRNA，例如結合核酸酶(諸如Cas蛋白)描述sgRNA。在一些實施例中，RNP包含Cas9及gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)。
如本文所用之「莖環」描述形成結束於不成對核酸之迴路中之鹼基配對「莖」之核苷酸的二級結構。當同一核酸股之兩個區域在序列上至少部分地互補時且當以相反方向讀取時，可以形成莖。如本文所用之「環」描述鹼基不成對(亦即，不互補)、可以將莖封端的核苷酸區域。「四環」描述4個核苷酸之環。如本文所用，sgRNA之上莖可以包含四環。
如本文中關於聚核苷酸所使用之「經取代」或「取代」係指核鹼基之更改，該更改會改變其用於華特生-克里克配對的較佳鹼基。當引導RNA之某一區域係如本文中所使用之「未經取代」時，該區之序列可與具有間隙且僅匹配(亦即無失配)之spyCas9 sgRNA (SEQ ID NO: 400)之相應保守部分比對，其中若鹼基具有用於華特生-克里克配對之相同較佳標準搭配物鹼基(A、C、G或T/U)，則認為鹼基匹配。
「引導RNA」、「gRNA」及「引導物」在本文中互換使用來指代crRNA (亦稱為CRISPR RNA)或crRNA與trRNA (亦稱為tracrRNA)之組合任一者。crRNA及trRNA可以單一RNA分子(單引導RNA，sgRNA)或以兩個獨立RNA分子(雙引導RNA，dgRNA)形式締合。「引導RNA」或「gRNA」係指各類型。trRNA可為天然產生之序列或與天然產生之序列相比具有修飾或變化之trRNA序列。引導RNA可以包括如本文所描述之經修飾RNA。
在一些實施例中，gRNA (例如sgRNA)包含「引導區」，其有時稱為「間隔子」或「間隔區」，例如Briner AE等人,Molecular Cell 56:333-339 (2014)中關於sgRNA所提及(但在本文中適用於所有引導RNA)。引導區或間隔區有時亦稱作「可變區」、「引導域」或「目標域」。在一些實施例中，「引導區」在其5'端處緊接在「sgRNA之保守部分」之前，且在一些實施例中，sgRNA縮短。例示性「sgRNA之保守部分」展示於表2中。在一些實施例中，「引導區」包含位於crRNA之5'端處的一系列核苷酸。在一些實施例中，引導區包含一或多個YA位點(「引導區YA位點」)。在一些實施例中，引導區包含一或多個YA位點，該等位點位於自給定核苷酸相對於5'端至引導區之末端的位置。此類位置範圍稱為例如「相對於5'末端之5'端的5端、6端、7端、8端、9端或10端」，其中「5端」等中的「端」係指引導區之最多3'核苷酸。(類似地，諸如「gRNA之核苷酸21端」等表述係指gRNA之5'末端之5'端的核苷酸21至位於gRNA之3'端之最末核苷酸的範圍)。另外，來自特定sgRNA區段之5'端的核苷酸(例如6個核苷酸)為該區段之第六個核苷酸，或5'端的「核苷酸6」，例如XXXXXN，其中N為5'端的第6個核苷酸。「位於5'端之第6個核苷酸處或其之後」的核苷酸範圍始於第6個核苷酸且沿著鏈向3'端延續。類似地，當自鏈3'端計數時，鏈3'端之核苷酸(例如5個核苷酸)為第5個核苷酸，例如NXXXX。引導區中之編號位置或範圍係指如自5'端確定的位置，除非指定另一個參考點；例如，引導區中之「核苷酸5」為5'端之第5個核苷酸。
在一些實施例中，gRNA包含與本文所描述之gRNA之相應或指定核苷酸處之「修飾模式匹配」的核苷酸。此意謂與修飾模式匹配的核苷酸具有與本文所描述之gRNA之相應位置處的核苷酸相同的修飾(例如硫代磷酸酯、2'-氟、2'-OMe等)，不論彼等位置處之核鹼基是否匹配。舉例而言，若在第一gRNA中，核苷酸5及6分別具有2'-OMe及硫代磷酸酯修飾，則此gRNA在核苷酸5及6處具有與第二gRNA相同的修飾模式，該第二gRNA亦在核苷酸5及6處分別具有2'-OMe及硫代磷酸酯修飾，不論第一及第二gRNA中之位置5與6處之核鹼基是否相同或不同。然而，核苷酸6而非核苷酸7處之2'-OMe修飾在核苷酸6及7處的修飾模式與核苷酸7而非核苷酸6處之2'-OMe修飾不相同。類似地，與本文所述之gRNA之修飾模式至少75%匹配的修飾模式意謂至少75%核苷酸與本文所述之gRNA之相應位置具有相同修飾。相應位置可藉由成對或結構比對來測定。
釀膿鏈球菌Cas9 (「spyCas9」(亦稱為「spCas9」)) sgRNA之「保守區」展示於表2中。第一列展示核苷酸之編號；第二列展示序列(例如SEQ ID NO: 400)；且第三列展示該等區域。
如本文所用，gRNA中之「經縮短」區係gRNA之保守部分中的相較於表2中所示之保守部分中之對應區缺乏至少1個核苷酸之區。類似地，關於sgRNA之「經縮短」意謂其保守區包含的核苷酸比表2中所示之sgRNA保守區更少。「經縮短」在任何情況下均不暗示對產生gRNA之過程或方式的任何特定限制。在一些實施例中，gRNA包含經縮短髮夾1區，其中(i)經縮短髮夾1區域缺乏6至8個核甘酸；及(A)位置H1-1、H1-2或H1-3中之一或多者相對於SEQ ID NO: 400缺失或經取代及/或(B)位置H1-6至H1-10中之一或多者相對於SEQ ID NO: 400經取代；或(ii)經縮短髮夾1區缺乏9至10個核苷酸，包括H1-1及/或H1-12；或(iii)經縮短髮夾1區缺乏5至10個核苷酸且位置N18、H1-12或N中之一或多者相對於SEQ ID NO: 400經取代(參見表2)。在一些實施例中，非spyCas9 gRNA包含經縮短髮夾1區，其缺乏6至8個核苷酸且其中如例如藉由成對或結構比對測定的與SEQ ID NO: 400中之H1-1、H1-2或H1-3對應之一或多個位置缺失或經取代，如例如藉由成對或結構比對測定的與SEQ ID NO: 400中之H1-6至H1-10對應之一或多個位置經取代。在一些實施例中，非spyCas9 gRNA包含經縮短髮夾1區，其缺乏9至10個核苷酸，包括如例如藉由成對或結構比對測定之與SEQ ID NO: 400中之H1-1及/或H1-12對應之核苷酸。在一些實施例中，非spyCas9 gRNA包含經縮短髮夾1區，其缺乏5至10個核苷酸且如例如藉由成對或結構比對測定之與SEQ ID NO: 400中之N18、H1-12或N對應之一或多個位置經取代。在一些實施例中，gRNA包含縮短上莖區，其中經縮短上莖區缺乏1至6個核苷酸。
如本文所用，「YA位點」係指5'-嘧啶-腺嘌呤-3'二核苷酸。為了清楚起見，藉由修飾鹼基而改變之原始序列中的「YA位點」仍視為所得序列中之(經修飾)之YA位點，不論字面上缺乏YA二核苷酸。「保守區YA位點」存在於sgRNA保守區中。「引導區YA位點」存在於sgRNA引導區中。sgRNA中之未修飾YA位點可以容易被核糖核酸酶-A樣核酸內切酶(例如核糖核酸酶A)裂解。在一些實施例中，gRNA的保守區中包含約10個YA位點。在一些實施例中，sgRNA的保守區中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個YA位點。圖1B中指示例示性保守區YA位點。例示性引導區YA位點在圖1C中未示出，因為引導區可為包括任何數目個YA位點的任何序列。在一些實施例中，sgRNA包含圖1C中所指示之YA位點中之1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者。在一些實施例中，sgRNA在以下位置或其子集包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個YA位點：LS5-LS6；US3-US4；US9-US10；US12-B3；LS7-LS8；LS12-N1；N6-N7；N14-N15；N17-N18；及H2-2至H2-3。在一些實施例中，YA位點包含例如在LS6、LS7、US3、US10、B3、N7、N15、N17、H2-2及H2-14中之任一者或多者處相對於SEQ ID NO: 400的取代(如例如藉由成對或結構比對所測定)，其中取代基核苷酸既不為隨後為腺嘌呤之嘧啶，亦不為在嘧啶之前的腺嘌呤(因此使經取代位置不為YA位點之一部分)。在一些實施例中，YA位點包含修飾，意謂YA位點之至少一個核苷酸經修飾。在一些實施例中，YA位點之嘧啶(亦稱為嘧啶位置)包含修飾(其包括更改緊接嘧啶之糖的3'之核苷間鍵聯的修飾)。在一些實施例中，YA位點之腺嘌呤(亦稱為腺嘌呤位置)包含修飾(其包括更改緊接腺嘌呤之糖的3'之核苷間鍵聯的修飾)。在一些實施例中，YA位點之嘧啶位置及腺嘌呤位置包含修飾。在一些實施例中，本文所述之gRNA引導區或gRNA保守區包含一或多個YA位點(「引導區YA位點」或「保守區YA位點」)。在一些實施例中，本文所述之crRNA或trRNA包含一或多個YA位點。
如本文所論述，與關於spyCas9 gRNA所述之核苷酸對應的核苷酸在另一個gRNA中的位置可藉由成對或結構比對、以序列及/或結構相似性鑑別。結構比對為適用的，其中分子共用相似結構，儘管序列變異相當大。舉例而言，spyCas9與金黃色葡萄球菌Cas9 (「SaCas9」)具有相異的序列，但顯著的結構比對。參見例如Nishimasu等人，Cell 162(5): 1113-1126 (2015)中的圖2(F)。結構比對可用於鑑別saCas9或其他sgRNA中對應於特定位置(諸如spyCas9 sgRNA (例如SEQ ID NO: 400)之保守部分之位置H1-1、H1-2或H1-3、位置H1-6至H1-10、位置H1-12或位置N18或N)的核苷酸(參見表2)。
結構比對涉及：如下鑑別兩個(或更多個)序列的相應殘基：(i)使用第二序列之已知結構，對第一序列之結構模型化或(ii)比較均已知之第一與第二序列的結構；以及鑑別第一序列中之位置與第二序列中之所關注殘基最相似的殘基。基於距離最小化在覆疊結構(例如哪一組成對位置為比對提供最小化均方根偏差)中得到的位置(例如聚核苷酸之戊糖環的核鹼基位置1或1'碳，或多肽之α碳)，利用一些算法鑑別出相應殘基。當鑑別非spyCas9 gRNA中之與關於spyCas9 gRNA所述之位置對應的位置時，spyCas9 gRNA可為「第二」序列。在所關注之非spyCas9 gRNA不具有可獲得之已知結構、但與具有已知結構之另一種非spyCas9 gRNA更密切相關的情況下，可最有效的是使用緊密相關之非spyCas9 gRNA之已知結構將所關注之非spyCas9 gRNA模型化且接著比較該模型與spyCas9 gRNA結構以鑑別出所關注之非spyCas9 gRNA中的所需相應殘基。關於蛋白質之結構模型化及比對，存在大量的文獻；代表性揭示案包括US 6859736；US 8738343；及Aslam等人, Electronic Journal of Biotechnology 20 (2016) 9-13中所引述的彼等文獻。關於基於一或多種已知相關結構將結構模型化的論述，參見例如Bordoli等人,Nature Protocols 4 (2009) 1-13，及其中引述的參考文獻。關於核酸比對，亦參見Nishimasu等人,Cell 162(5): 1113-1126 (2015)的圖2(F)。
如本文所用之「目標序列」係指引導區導引核酸酶執行裂解之核酸序列。在一些實施例中，spyCas9蛋白質可藉由引導區、藉由存在於引導區中的核苷酸導引至目標序列。在一些實施例中，sgRNA不包含間隔區。
如本文所用，「5'端」係指gRNA (包括dgRNA (通常為dgRNA之crRNA的5'端)、sgRNA)中之第一個核苷酸，其中5'位置與另一個核苷酸不連接。
如本文所用，「5'端修飾」係指gRNA包含的引導區在其5'端具有一(1)至約七(7)個核苷酸中之一或多者的修飾，視情況其中gRNA之第一個核苷酸(相對於5'端)經修飾。
如本文所用，「3'端」係指gRNA之端或末端核苷酸，其中3'位置與另一個核苷酸不連接。在一些實施例中，3'端處於3'尾。在一些實施例中，3'端處於gRNA之保守部分中。
如本文所用，「3'端修飾」係指在其3'端具有一(1)至約七(7)個核苷酸中之一或多者之修飾的gRNA，視情況其中gRNA之最後一個核苷酸(亦即，最3'核苷酸)經修飾。若存在3'尾，則3'尾內可存在1至約7個核苷酸。若不存在3'尾，則sgRNA之保守部分內可存在1至約7個核苷酸。
「最後一個」、「倒數第二個」、「倒數第三個」核苷酸等分別指給定序列中的最3'、第二個最3'、第三個最3'核苷酸等。舉例而言，在序列5'-AAACTG-3'中，最後一個、倒數第二個及倒數第三個核苷酸分別為G、T及C。片語「最後3個核苷酸」係指最後一個、倒數第二個及倒數第三個核苷酸；更一般而言，「最後N個核苷酸」係指最後一個至倒數第N個核苷酸(包括端點)。「3'末端之3'端的第三個核苷酸」等效於「倒數第三個核苷酸」。類似地，「5'末端之5'端的第三個核苷酸」等效於「5'末端處之第三個核苷酸」。
如本文所用，「保護端修飾」(諸如保護5'端修飾或保護3'端修飾)係指sgRNA端之七個核苷酸內的一或多個核苷酸之修飾，其減少sgRNA降解，諸如核酸外切降解。在一些實施例中，保護端修飾包含sgRNA端之七個核苷酸內之至少兩個或至少三個核苷酸之修飾。在一些實施例中，修飾包含硫代磷酸酯鍵聯、2'修飾，諸如2'-OMe或2'-氟、2'-H (DNA)、ENA、UNA，或其組合。在一些實施例中，修飾包含硫代磷酸酯鍵聯及2'-OMe修飾。在一些實施例中，至少三個末端核苷酸經修飾，例如經以下修飾：硫代磷酸酯鍵聯，或硫代磷酸酯鍵聯與2'-OMe修飾之組合。涵蓋熟習此項技術者已知之減少核酸外切降解的修飾。
在一些實施例中，包含1至約20個核苷酸的「3'尾」位於sgRNA之3'端處之保守部分之後。
如本文所用，「經RNA引導之DNA結合劑」意謂具有RNA及DNA結合活性之多肽或多肽複合物，或此類複合物之DNA結合次單位，其中DNA結合活性具有序列特異性且視RNA之序列而定。例示性經RNA引導之DNA結合劑包括Cas裂解酶/切口酶及其不活化形式(「dCas DNA結合劑」)。如本文所用，「Cas核酸酶」亦稱作「Cas蛋白」，其涵蓋Cas裂解酶、Cas切口酶及dCas DNA結合劑。Cas裂解酶/切口酶及dCas DNA結合劑包括III型CRISPR系統之Csm或Cmr複合物、其Cas10、Csm1或Cmr2次單位、I型CRISPR系統之級聯複合物、其Cas3次單位及2類Cas核酸酶。如本文所用，「2類Cas核酸酶」為具有RNA引導之DNA結合活性的單鏈多肽，諸如Cas9核酸酶或Cpf1核酸酶。2類Cas核酸酶包括2類Cas裂解酶及2類Cas切口酶(例如H840A、D10A或N863A變異體)，其進一步具有經RNA引導之DNA裂解酶或切口酶活性，及2類dCas DNA結合劑，其中裂解酶/切口酶活性未活化。2類Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9 (例如N497A、R661A、Q695A、Q926A變異體)、HypaCas9 (例如N692A、M694A、Q695A、H698A變異體)、eSPCas9(1.0) (例如K810A、K1003A、R1060A變異體)及eSPCas9(1.1) (例如K848A、K1003A、R1060A變異體)蛋白質及其變體。Cpf1蛋白(Zetsche等人,Cell, 163: 1-13 (2015))與Cas9同源且含有RuvC樣核酸酶域。Zetsche之Cpf1序列以全文引用之方式併入。參見例如Zetsche，表S1及表S3。「Cas9」涵蓋Spy Cas9、本文中所列的Cas9變異體及其等效物。參見例如Makarova等人,Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015)；Shmakov等人,Molecular Cell, 60:385-397 (2015)。
如本文所用，若第一序列與第二序列之比對顯示整個第二序列之X%或更多之位置與第一序列匹配，則第一序列被視為「包含與第二序列具有至少X%一致性的序列」。舉例而言，序列AAGA包含與序列AAG具有100%一致性之序列，因為由於第二序列之全部三個位置均存在匹配，因此比對將得到100%一致性。RNA與DNA之間的差異(一般而言，尿苷交換為胸苷或反之亦然)及核苷類似物(諸如經修飾之尿苷)的存在不會造成聚核苷酸之間一致性或互補性的差異，只要相關核苷酸(諸如胸苷、尿苷或經修飾之尿苷)具有相同補體(例如對於胸苷、尿苷或經修飾之尿苷全體而言，為腺苷；另一實例為胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶，兩者具有鳥苷或經修飾之鳥苷作為補體)。因此，舉例而言，序列5'-AXG (其中X為任何經修飾之尿苷，諸如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷)視為與AUG具有100%一致性，因為兩者與同一序列(5'-CAU)完全互補。例示性比對演算法為此項技術中熟知的史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)及尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)演算法。所屬技術領域中具有通常知識者應理解何種演算法選擇及參數設定適合於給定之待比對之序列對；對於具有一般類似長度及針對胺基酸之＞50%預期一致性或針對核苷酸之＞75%預期一致性的序列而言，由EBI於www.ebi.ac.uk網站伺服器提供之Needleman-Wunsch演算法介面之具有預設設定之Needleman-Wunsch演算法一般為適當的。
「mRNA」在本文中用於指一種聚核苷酸，其為RNA或經修飾之RNA且包含可轉譯成多肽之開放閱讀框架(亦即，可充當受質供核糖體及胺基醯基化tRNA轉譯)。mRNA可包含磷酸酯-糖主鏈，其包括核糖殘基或其類似物，例如2'-甲氧基核糖殘基。在一些實施例中，核酸磷酸酯-糖主鏈中之糖類基本上由核糖殘基、2'-甲氧基核糖殘基或其組合組成。一般而言，mRNA不含大量胸苷殘基(例如0個殘基或小於30、20、10、5、4、3或2個胸苷殘基；或小於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.2%或0.1%的胸苷含量)。mRNA可在其一些或全部尿苷位置處含有經修飾之尿苷。
如本文所用，給定ORF之「最小尿苷含量」為以下之ORF的尿苷含量：(a)每個位置處使用最少尿苷密碼子及(b)編碼與給定ORF相同的胺基酸序列。給定胺基酸之最小尿苷密碼子為具有最少尿苷之密碼子(通常0或1個，除了***酸之密碼子外，其中最小尿苷密碼子具有2個尿苷)。出於評估最少尿苷含量之目的，經修飾之尿苷殘基視為等效於尿苷。
如本文所用，給定ORF之「最小尿苷二核苷酸含量」為以下之ORF的最低可能尿苷二核苷酸(UU)含量：(a)在每個位置處使用最少尿苷密碼子(如上文所論述)及(b)編碼與給定ORF相同的胺基酸序列。尿苷二核苷酸(UU)含量在絕對意義上可表示為ORF中之UU二核苷酸之計數或基於比率，表示為尿苷二核苷酸之尿苷所佔據的位置之百分比(例如，AUUAU之尿苷二核苷酸含量為40%，因為尿苷二核苷酸之尿苷佔據了5個位置中之2個)。出於評估最小尿苷二核苷酸含量之目的，經修飾之尿苷殘基視為等效於尿苷。
如本文所用，給定開放閱讀框架(ORF)之「最小腺嘌呤含量」為以下之ORF的腺嘌呤含量：(a)每個位置處使用最少腺嘌呤密碼子及(b)編碼與給定ORF相同的胺基酸序列。給定胺基酸之最小腺嘌呤密碼子為具有最少腺嘌呤之密碼子(通常0或1個，除了離胺酸及天冬醯胺之密碼子外，其中最小腺嘌呤密碼子具有2個腺嘌呤)。出於評估最小腺嘌呤含量之目的，經修飾之腺嘌呤殘基視為等效於腺嘌呤。
如本文所用，給定開放閱讀框架(ORF)之「最小腺嘌呤二核苷酸含量」為以下之ORF的最低可能腺嘌呤二核苷酸(AA)含量：(a)在每個位置處使用最少腺嘌呤密碼子(如上文所論述)及(b)編碼與給定ORF相同的胺基酸序列。腺嘌呤二核苷酸(AA)含量在絕對意義上可表示為ORF中之AA二核苷酸計數或基於比率，表示為腺嘌呤二核苷酸之腺嘌呤所佔據的位置之百分比(例如，UAAUA之腺嘌呤二核苷酸含量為40%，因為腺嘌呤二核苷酸之腺嘌呤佔據了5個位置中之2個)。出於評估最小腺嘌呤二核苷酸含量之目的，經修飾之腺嘌呤殘基視為等效於腺嘌呤。
如本文所用，「個體」係指動物界之任何成員。在一些實施例中，「個體」係指人類。在一些實施例中，「個體」係指非人類動物。在一些實施例中，「個體」係指靈長類動物。在一些實施例中，個體包括(但不限於)哺乳動物、鳥、爬行動物、兩棲動物、魚、昆蟲及/或蠕蟲。在某些實施例中，非人類個體為哺乳動物(例如嚙齒動物、小鼠、大鼠、兔、猴、犬、貓、綿羊、牛、靈長類動物及/或豬)。在一些實施例中，個體可為基因轉殖動物、經基因工程改造之動物及/或純系。在本發明之某些實施例中，個體為成年人、青年或嬰兒。在一些實施例中，使用術語「個人(individual)」或「患者」且希望可與「個體(subject)」互換。 本文所述之修飾類型
本文揭示在不同位置包含修飾的引導RNA (例如sgRNA、dgRNA及crRNA)。在一些實施例中，包含修飾之gRNA的位置經修飾而具有以下修飾類型中之任一者或多者。 2'-O-甲基修飾
咸信經修飾之糖控制核苷酸糖環之褶皺，該褶皺為影響寡核苷酸對於互補股之結合親和力、雙螺旋體形成及與核酸酶之相互作用的物理特性。糖環上之取代因此可更改此等糖類之構形及褶皺。舉例而言，2'-O-甲基(2'-OMe)修飾可增加寡核苷酸之結合親和力及核酸酶穩定性，但如實例中所示，寡核苷酸中之指定位置處之任何修飾的影響需要憑經驗確定。
術語「mA」、「mC」、「mU」或「mG」可用於表示已經2'-OMe修飾之核苷酸。
核糖核苷酸及經修飾之2'-O-甲基核糖核苷酸可如下描繪：
Figure 02_image001
2'-O-(2-甲氧基乙基)修飾
在一些實施例中，修飾可為2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)。經修飾之2'-O-moe核糖核苷酸可如下描繪：
Figure 02_image003
術語「moeA」、「moeC」、「moeU」或「moeG」可用於表示已經2'-O-moe修飾之核苷酸。 2'-氟修飾
已展示影響核苷酸糖環之另一化學修飾為鹵素取代。舉例而言，核苷酸糖環上之2'-氟基(2'-F)取代可增加寡核苷酸結合親和力及核酸酶穩定性。
在本申請案中，術語「fA」、「fC」、「fU」或「fG」可用於表示已經2'-F取代之核苷酸。
不具有及具有2'-F取代之核糖核苷酸可如下描繪：
Figure 02_image005
硫代磷酸酯修飾
硫代磷酸酯(PS)鍵聯或鍵係指一鍵，其中硫取代磷酸二酯鍵聯(例如核苷酸之間的磷酸二酯鍵聯)中之一個非橋接磷酸酯氧。當硫代磷酸酯用於產生寡核苷酸時，經修飾之寡核苷酸亦可被稱作S-寡核苷酸。
「*」可用於描繪PS修飾。在本申請案中，術語A*、C*、U*或G*可用於表示經PS鍵連接至後續(例如3')核苷酸之核苷酸。在本申請案通篇中，PS修飾係根據其3'碳鍵結至硫代磷酸酯的核苷酸分類；因此，指示PS修飾位於位置1意謂硫代磷酸酯鍵結至核苷酸1之3'碳及核苷酸2之5'碳。因此，在YA位點表示為「經PS修飾」或其類似者的情況下，PS鍵聯介於Y與A之間或介於A與後續核苷酸之間。
在本申請案中，術語「mA*」、「mC*」、「mU*」或「mG*」可以用於表示已經2'-OMe取代且經由PS鍵聯(其有時可以稱為「PS鍵」)連接至後續(例如3')核苷酸的核苷酸。類似地，術語「fA*」、「fC*」、「fU*」或「fG*」可以用於表示已經2'-F取代且經由PS鍵聯連接至後續(例如3')核苷酸的核苷酸。本文所述之實施例涵蓋PS鍵聯或鍵之等效物。
下圖展示將S-取代非橋接磷酸酯氧，從而產生PS鍵聯替代磷酸二酯鍵聯：
Figure 02_image007
反向無鹼基修飾
無鹼基核苷酸係指缺乏含氮鹼基之彼等核苷酸。下圖描繪一種寡核苷酸，其具有缺少鹼基的無鹼基(在此情況下，展示為無嘌呤核酸；無鹼基位點亦可為無嘧啶核酸位點，其中無鹼基位點之描述通常參考華特生-克里克鹼基配對(Watson-Crick base pairing)，例如無嘌呤核酸位點係指缺少含氮鹼基且通常將與嘧啶核酸位點存在鹼基成對的位點)位點，其中鹼基可在呋喃環之1'位置經另一部分取代(例如羥基，如下文所示，以形成核糖或去氧核糖位點，如下文所示，或氫)：
Figure 02_image009
反向鹼基係指鍵聯相對於正常5'至3'鍵聯(亦即，5'至5'鍵或3'至3'鍵聯)呈反向之彼等鹼基。舉例而言：
Figure 02_image011
Figure 02_image013
Figure 02_image015
正常寡核苷酸鍵聯 5'-反向寡核苷酸鍵聯 具有經H取代之3'反向無鹼基位點的3'-反向鍵聯
無鹼基核苷酸可與反向鍵聯連接。舉例而言，無鹼基核苷酸可經由5'至5'鍵聯連接至末端5'核苷酸，或無鹼基核苷酸可經由3'至3'鍵聯連接至末端3'核苷酸。末端5'或3'核苷酸任一者處之反向無鹼基核苷酸亦可稱作反向無鹼基端帽。在本申請案中，術語「invd」指示反向無鹼基核苷酸鍵聯。 去氧核糖核苷酸
在gRNA之情形下，去氧核糖核苷酸(其中糖包含2'-去氧位置)視為一種修飾，原因在於相對於標準RNA，核苷酸因質子取代2'位置處之羥基而經修飾。除非另外指明，否則未修飾之RNA中之存在於位置U處的去氧核糖核苷酸修飾亦可包含T置換U核鹼基。 雙環核糖類似物
例示性雙環核糖類似物包括鎖定之核酸(LNA)、ENA、橋接之核酸(BNA)，或其他LNA樣修飾。在一些情況下，雙環核糖類似物的2'及4'位置經由連接子連接。連接子可具有式-X-(CH2 )n -，其中n為1或2；X為O、NR或S；且R為H或C1-3 烷基，例如甲基。雙環核糖類似物之實例包括LNA，其包含2'-O-CH2 -4'雙環結構(氧基-LNA)(參見WO 98/39352及WO 99/14226)；2'-NH-CH2 -4'或2'-N(CH3 )-CH2 -4' (胺基-LNA)(Singh等人,J. Org. Chem. 63:10035-10039 (1998)；Singh等人,J. Org. Chem. 63:6078-6079 (1998))；及2'-S-CH2 -4' (硫基-LNA)(Singh等人,J. Org. Chem. 63:6078-6079 (1998)；Kumar等人,Biorg. Med. Chem. Lett. 8:2219-2222 (1998))。 ENA
ENA修飾係指包含2'-O ,4'-C -伸乙基修飾的核苷酸。ENA核苷酸之例示性結構展示如下，其中波浪線指示與相鄰核苷酸之連接(或視情況可為末端位置，應理解若3'末端核苷酸為ENA核苷酸，則3'位置可包含羥基而非磷酸酯)。關於ENA核苷酸之進一步論述，參見例如Koizumi等人，Nucleic Acids Res. 31: 3267-3273 (2003)。
Figure 02_image017
UNA
UNA或未鎖定的核酸修飾係指一種包含2',3'-seco-RNA修飾的核苷酸，其中2'與3'碳彼此不直接鍵結。UNA核苷酸之例示性結構展示如下，其中波浪線指示與相鄰磷酸酯的連接或置換磷酸酯的修飾(或視情況可為末端位置)。關於UNA核苷酸之進一步論述，參見例如Snead等人，Molecular Therapy 2: e103, doi:10.1038/mtna.2013.36 (2013)。
Figure 02_image019
鹼基修飾
鹼基修飾為更改核鹼基結構或其相對於主鏈之鍵的任何修飾，包括異構化(如假尿苷)。在一些實施例中，鹼基修飾包括肌苷。在一些實施例中，修飾包含如下減少RNA核酸內切酶活性的鹼基修飾：例如藉由干擾核糖核酸酶對裂解位點的識別及/或藉由使RNA結構(例如二級結構)穩定，從而減少核糖核酸酶對裂解位點的可及性。可以使RNA結構穩定的例示性鹼基修飾為假尿苷及5-甲基胞嘧啶。參見Peacock等人，J Org Chem . 76: 7295-7300 (2011)。在一些實施例中，鹼基修飾可以如下提高或降低核酸的解鏈溫度(Tm)，例如藉由增強華特生-克里克鹼基對的氫鍵、形成非典型鹼基對，或形成錯配的鹼基對。
以上修飾及其等效物包括在本文所述之實施例之範疇內。 YA修飾
YA位點處之修飾(亦稱為YA修飾)可為核苷間鍵聯之修飾、鹼基(嘧啶或腺嘌呤)之修飾(例如藉由化學修飾、取代或以其他方式達成)，及/或糖之修飾(例如在2'位置，諸如2'-O-烷基、2'-F、2'-moe、2'-F***糖、2'-H (去氧核糖)及其類似位置)。在一些實施例中，「YA修飾」為更改二核苷酸基元結構以減少RNA核酸內切酶活性的任何修飾，例如藉由干擾核糖核酸酶對YA位點的識別或裂解及/或藉由使RNA結構(例如二級結構)穩定，從而減少核糖核酸酶對裂解位點的可及性。參見Peacock等人，J Org Chem . 76: 7295-7300 (2011)；Behlke,Oligonucleotides 18:305-320 (2008)；Ku等人，Adv. Drug Delivery Reviews 104: 16-28 (2016)；Ghidini等人，Chem. Commun., 2013, 49, 9036。Peacock等人、Belhke、Ku及Ghidini提供適用作YA修飾的例示性修飾。涵蓋熟習此項技術者已知之減少核酸內切降解的修飾。影響涉及核糖核酸酶裂解之2'羥基的例示性2'核糖修飾為2'-H及2'-O-烷基，包括2'-O-Me。YA位點處之殘基的修飾(諸如雙環核糖類似物、UNA及經修飾之核苷間鍵聯)可為YA修飾。可以使RNA結構穩定的例示性鹼基修飾為假尿苷及5-甲基胞嘧啶。在一些實施例中，YA位點之至少一個核苷酸經修飾。在一些實施例中，YA位點之嘧啶(亦稱為「嘧啶位置」)包含修飾(其包括更改緊接嘧啶之糖的3'之核苷間鍵聯的修飾、嘧啶鹼基之修飾，及核糖之修飾，例如在其2'位置)。在一些實施例中，YA位點之腺嘌呤(亦稱為「腺嘌呤位置」)包含修飾(其包括更改緊接嘧啶之糖的3'之核苷間鍵聯的修飾、嘧啶鹼基之修飾，及核糖之修飾，例如在其2'位置)。在一些實施例中，YA位點之嘧啶及腺嘌呤包含修飾。在一些實施例中，YA修飾減少RNA核酸內切酶活性。
以上修飾及其等效物包括在本文所述之實施例之範疇內。 包含縮短區及/或取代之引導RNA (gRNA)
在一些實施例中，本文提供之gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)包含含有髮夾區之保守部分，其中髮夾區缺乏6至8個核苷酸、9至10個核苷酸或5至10個核苷酸。在一些實施例中，gRNA來自釀膿鏈球菌Cas9 (「spyCas9」)或spyCas9等效物。在一些實施例中，gRNA不來自釀膿鏈球菌Cas9 (「非spyCas9」)。在一些實施例中，6至8個核苷酸、9至10個核苷酸或5至10個核苷酸為鄰接的。
在一些實施例中，髮夾區缺少5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。在一些實施例中，髮夾1部分缺少5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。在一些實施例中，髮夾2部分缺少5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸。在一些實施例中，髮夾區缺少5、6、7、8、9、10、11或12個鄰接核苷酸。在一些實施例中，髮夾1部分缺少5、6、7、8、9、10、11或12個鄰接核苷酸。在一些實施例中，髮夾2部分缺少5、6、7、8、9、10、11或12個鄰接核苷酸。在一些實施例中，髮夾1內存在6至8個缺乏核苷酸、9至10個缺乏核苷酸或5至10個缺乏核苷酸。在一些實施例中，髮夾2內存在6至8個缺乏核苷酸、9至10個缺乏核苷酸或缺乏5至10個缺乏核苷酸。在一些實施例中，髮夾1及髮夾2內存在6至8個缺乏核苷酸、9至10個缺乏核苷酸或5至10個缺乏核苷酸。在一些實施例中，髮夾1或髮夾2內存在6至8個缺乏核苷酸、9至10個缺乏核苷酸或5至10個缺乏核苷酸。在一些實施例中，6至8個缺乏核苷酸、9至10個缺乏核苷酸或5至10個缺乏核苷酸為鄰接的且包括髮夾1與髮夾2之間的「N」。在一些實施例中，5至10個或6至10個缺乏核苷酸包括髮夾1與髮夾2之間的「N」。在一些實施例中，5至10個或6至10個缺乏核苷酸為鄰接的且跨越髮夾1之至少一部分。在一些實施例中，5至10個或6至10個缺乏核苷酸為鄰接的且跨越髮夾2之至少一部分。在一些實施例中，6至8個缺乏核苷酸、9至10個缺乏核苷酸或5至10個缺乏核苷酸為鄰接的且跨越髮夾1之至少一部分及髮夾2之一部分。在一些實施例中，6至8個缺乏核苷酸、9至10個缺乏核苷酸或5至10個缺乏核苷酸為鄰接的且跨越髮夾1之至少一部分及髮夾1與髮夾2之間的「N」。在一些實施例中，5至10個缺乏核苷酸包含SEQ ID NO: 400之核苷酸54-58、54-61或53-60或由其組成。
在一些實施例中，gRNA包含經取代且視情況經縮短髮夾1區，其中以下核苷酸對中之至少一者在經取代及視情況經縮短髮夾1中經華特生-克里克配對核苷酸取代：H1-1及H1-12、H1-2及H1-11、H1-3及H1-10及/或H1-4及H1-9。「華特生-克里克配對核苷酸」包括能夠形成華特生-克里克鹼基對的任何對，包括A-T、A-U、T-A、U-A、C-G及G-C對，及包括具有相同鹼基配對偏好之前述核苷酸中之任一者的經修飾型式的對。在一些實施例中，髮夾1區缺乏H1-5至H1-8中之任一者或兩者。在一些實施例中，髮夾1區缺乏以下核苷酸對中之一個、兩個或三個：H1-1及H1-12、H1-2及H1-11、H1-3及H1-10、及/或H1-4及H1-9。在一些實施例中，髮夾1區缺乏髮夾1區之1至8個核苷酸。在任一前述實施例中，缺乏核苷酸可使得經華特生-克里克配對核苷酸(H1-1及H1-12、H1-2及H1-11、H1-3及H1-10、及/或H1-4及H1-9)取代之一或多個核苷酸對在gRNA中形成鹼基對。
在一些實施例中，gRNA進一步包含缺乏至少1個核苷酸之上莖區，例如表1C中指示或本文其他地方所述之經縮短上莖區中之任一者，其可與本文所述之經縮短或經取代髮夾1區中之任一者組合，包括但不限於以上經編號實施例中所指示且表1A之序列中所表示的組合。 表1C.髮夾1區與上莖區之例示性組合
髮夾1區 可與上莖區中之任一者組合：
經縮短髮夾1區缺乏6至8個核苷酸且位置H1-1、H1-2或H1-3中之一或多者相對於SEQ ID NO: 400缺失或經取代 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
經縮短髮夾1區缺乏6至8個核苷酸且位置H1-6至H1-10中之一或多者相對於SEQ ID NO: 400經取代 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
經縮短髮夾1區缺乏9至10個核苷酸，包括H1-1及/或H1-12 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
經縮短髮夾1區缺乏5至10個核苷酸且位置N18、H1-12或N中之一或多者相對於SEQ ID NO: 400經取代 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
以下核苷酸對中之至少一者在經取代及視情況經縮短髮夾1中經華特生-克里克配對核苷酸取代: H1-1及H1-12、H1-2及H1-11、H1-3及H1-10、及/或H1-4及H1-9 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
以下核苷酸對中之至少一者在經取代及視情況經縮短髮夾1中經華特生-克里克配對核苷酸取代：H1-1及H1-12、H1-2及H1-11、H1-3及H1-10、及/或H1-4及H1-9，且髮夾1區缺乏H1-5至H1-8中之任一者或兩者 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
以下核苷酸對中之至少一者在經取代及視情況經縮短髮夾1中經華特生-克里克配對核苷酸取代：H1-1及H1-12、H1-2及H1-11、H1-3及H1-10、及/或H1-4及H1-9，且髮夾1區缺乏以下核苷酸對中之一者、兩者或三者：H1-1及H1-12、H1-2及H1-11、H1-3及H1-10、及/或H1-4及H1-9 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
以下核苷酸對中之至少一者在經取代及視情況經縮短髮夾1中經華特生-克里克配對核苷酸取代：H1-1及H1-12、H1-2及H1-11、H1-3及H1-10、及/或H1-4及H1-9，且髮夾1區缺乏髮夾1區之1至8個核苷酸 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
H1-2至H1-4或H1-2至H1-5缺失，且H1-9至H1-11缺失 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
H1-2至H1-4或H1-2至H1-5缺失，且H1-8至H1-11缺失 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
H1-1、H1-3至H1-8及H1-12缺失 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
H1-2至H1-8缺失 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
H1-3至H1-9缺失 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
H1-7及H1-8分別經G及C取代，且位置H1-2至H1-4及H1-9至H1-11缺失 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
H1-6及H1-7分別經C及U取代，且位置H1-2至H1-4及H1-9至H1-11缺失 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
H1-1及H1-12分別經C及G取代，且位置H1-2至H1-4及H1-9至H1-11缺失 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
長度為2個核苷酸之經縮短髮夾1區 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
長度為3個核苷酸之經縮短髮夾1區 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
長度為4個核苷酸之經縮短髮夾1區 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
長度為5個核苷酸之經縮短髮夾1區 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
長度為6個核苷酸之經縮短髮夾1區 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
長度為7個核苷酸之經縮短髮夾1區 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
長度為8個核苷酸之經縮短髮夾1區 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
長度為9個核苷酸之經縮短髮夾1區 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
長度為10個核苷酸之經縮短髮夾1區 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
H1-1及H1-12經取代(視情況分別經C及G取代)，且位置H1-2至H1-4及H1-9至H1-11缺失 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
H1-1至H1-8及H1-11至H1-12缺失 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
N18經C取代且H1-4至H1-11缺失 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
H1-12經C取代，位置N經A取代，且位置H1-4至H1-11缺失 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
位置H1-12經A取代，位置N經A取代，且位置H1-4至H1-11缺失。 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
H1-2至H1-4及H1-9至H1-11缺失；H1-7及H1-8視情況經取代 缺乏1個核苷酸之上莖區；或 缺乏2個核苷酸之上莖區；或 缺乏3個核苷酸之上莖區；或 缺乏4個核苷酸之上莖區；或 缺乏5個核苷酸之上莖區；或 缺乏6個核苷酸之上莖區；或 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
H1-2至H1-4及H1-9至H1-11缺失 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
H1-2至H1-5及H1-9至H1-11缺失 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
H1-8經取代且H1-2至5及H1-9至11缺失 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
 H1-6及H1-8取代；且H1-2至5及H1-9至11缺失 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
H1-2至H1-5及H1-8至11缺失 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
H1-1、H1-3、H1-4、H1-9、H1-10及H1-12缺失 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
H1-1、H1-3、H1-4、H1-5、H1-6、H1-7、H1-8、H1-12缺失 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
H1-1至H1-9、H1-11、H1-12缺失 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
H1-6至H1-10缺失；H1-12及N視情況經取代 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
H1-6至H1-10缺失；N18經取代 US3、US4、US9、US10缺失；或 US8缺失；或 US4及US9缺失； US5缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US8缺失且US3、US4、US9、US10經取代；或 US4及US9缺失，且US3及US10經取代； US3、US4、US8、US9、US10缺失；或 US3、US4、US5、US9、US10缺失
在表1C中，在US3、US4、US9及US10經取代之情況下，其可經G-C或C-G鹼基對取代(其中US3與US10成對且US4與US9成對)，例如US3、US4、US9及US10可分別經G、C、G及C取代。類似地，在US3及US10經取代之情況下，其可經G-C或C-G鹼基對取代(其中US3與US10成對)，例如US3及US10可分別經G及C取代或可分別經C及G取代。
在一些實施例中，本文所述之gRNA進一步包含連接區，其中該連接區缺少至少一個核苷酸。在一些實施例中，gRNA在連接區中缺乏至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。在一些實施例中，gRNA在連接區中缺乏至少1至2個、1至3個、1至4個核苷酸、1至5個核苷酸、1至6個核苷酸、1至10個核苷酸或1至15個核苷酸。在一些實施例中，gRNAA在連接區中缺少各核苷酸。
在一些實施例中，gRNA進一步包含引導區。在一些實施例中，引導區在gRNA之5'端處包含前1至10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個或20個核苷酸。在一些實施例中，引導區包含20個核苷酸。在一些實施例中，引導區包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個或更多個核苷酸。在一些實施例中，引導區包含17個核苷酸。在一些實施例中，引導區包含18個核苷酸。在一些實施例中，引導區包含19個核苷酸。
在一些實施例中，引導區之選擇係基於用於編輯之所關注基因內之目標序列而判定。舉例而言，在一些實施例中，gRNA包含與所關注基因之目標序列互補之引導區。
在一些實施例中，所關注基因中之目標序列可與gRNA之引導區互補。在一些實施例中，gRNA之引導區與其所關注基因中之相應目標序列之間的互補性或一致性程度可為約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，gRNA之引導區與所關注基因之目標區域可100%互補或一致。在其他實施例中，gRNA之引導區及所關注基因之目標區域可含有至少一個錯配。舉例而言，gRNA之引導區及所關注基因之目標序列可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個錯配，其中目標序列之總長度為至少約17、18、19、20或更多個鹼基對。在一些實施例中，gRNA之引導區及所關注基因之目標區可含有1至6個錯配，其中引導序列包含至少約17、18、19、20或更多個核苷酸。在一些實施例中，gRNA之引導區及所關注基因之目標區可含有1、2、3、4、5或6個錯配，其中引導序列包含約20個核苷酸。5'末端可包含不視為引導區(亦即，沒有將cas9蛋白導引至目標核酸的功能)之核苷酸。
在一些實施例中，gRNA包含5'端修飾或3'端修飾及gRNA之保守部分，該保守部分包含經縮短髮夾1區，其中 (i)該經縮短髮夾1區缺乏6至8個核苷酸；及(A)位置H1-1、H1-2或H1-3中之一或多者相對於SEQ ID NO: 400缺失或經取代及/或(B)位置H1-6至H1-10中之一或多者相對於SEQ ID NO: 400經取代；或 (ii)該經縮短髮夾1區缺乏9至10個核苷酸，包括H1-1及/或H1-12；或 (iii)該經縮短髮夾1區缺乏5至10個核苷酸且位置N18、H1-12或N中之一或多者相對於SEQ ID NO:400經取代。N18及N分別係指表2中緊接髮夾1之5'及3'的核苷酸。
在一些實施例中，gRNA包含5'端修飾或3'端修飾且gRNA之保守部分包含縮短上莖區，其中經縮短上莖區缺乏1至6個核苷酸。
在一些實施例中，gRNA包含5'端修飾或3'端修飾且gRNA之保守部分包含在LS6、LS7、US3、US10、B3、N7、N15、N17、H2-2及H2-14中之任一者或多者處相對於SEQ ID NO: 400的取代。取代基核苷酸既不為隨後為腺嘌呤之嘧啶，亦不為在嘧啶之前的腺嘌呤。
在一些實施例中，gRNA包含5'端修飾或3'端修飾且gRNA之保守部分包含以上(a)、(b)及(c)中之一或多者。
在一些實施例中，本文所述之gRNA之保守部分在連接區、下莖區或隆突區中進一步包含一或多個缺失或取代。
在一些實施例中，gRNA在髮夾1區(H1-H12)中包含以下缺失中之一或多者。 經縮短髮夾1區
在一些實施例中，本文所述之gRNA之保守部分包含(a)缺乏6至8個核苷酸的經縮短髮夾1區。在一些實施例中，本文所述之gRNA之保守部分包含(a)缺乏6至8個核苷酸的經縮短髮夾1區及經縮短髮夾區中之一或多個缺失或取代。在一些實施例中，髮夾1區缺乏6至8個核苷酸，且位置H1-1、H1-2或H1-3中之一或多者相對於SEQ ID NO: 400缺失或經取代。在一些實施例中，位置H1-1缺失。在一些實施例中，位置H1-1經取代。在一些實施例中，位置H1-2缺失。在一些實施例中，位置H1-2經取代。在一些實施例中，位置H1-3缺失。在一些實施例中，位置H1-3經取代。
在一些實施例中，經縮短髮夾1區缺乏6至8個核苷酸且位置H1-6至H1-10中之一或多者相對於SEQ ID NO: 400經取代。在一些實施例中，位置H1-6經取代。在一些實施例中，位置H1-7經取代。在一些實施例中，位置H1-8經取代。在一些實施例中，位置H1-9經取代。在一些實施例中，位置H1-10經取代。
在一些實施例中，經縮短髮夾1區之長度為4個核苷酸。在一些實施例中，經縮短髮夾1區之長度為5個核苷酸。在一些實施例中，經縮短髮夾1區之長度為6個核苷酸。在其他實施例中，經縮短髮夾1區之4、5或6個核苷酸包括小於或等於2個取代。在其他實施例中，經縮短髮夾1區之4、5或6個核苷酸包括小於或等於1個取代。在其他實施例中，經縮短髮夾1區之4、5或6個核苷酸未經取代。
在一些實施例中，位置H1-1缺失。在一些實施例中，位置H1-1經取代。在一些實施例中，位置H1-2缺失。在一些實施例中，位置H1-2經取代。在一些實施例中，位置H1-3缺失。在一些實施例中，位置H1-3經取代。在一些實施例中，位置H1-4缺失。在一些實施例中，位置H1-4經取代。在一些實施例中，位置H1-5缺失。在一些實施例中，位置H1-5經取代。在一些實施例中，位置H1-6缺失。在一些實施例中，位置H1-6經取代。在一些實施例中，位置H1-7缺失。在一些實施例中，位置H1-7經取代。在一些實施例中，位置H1-8缺失。在一些實施例中，位置H1-8經取代。在一些實施例中，位置H1-9缺失。在一些實施例中，位置H1-9經取代。在一些實施例中，位置H1-10缺失。在一些實施例中，位置H1-10經取代。在一些實施例中，位置H1-11缺失。在一些實施例中，位置H1-11經取代。在一些實施例中，位置H1-12缺失。在一些實施例中，位置H1-12經取代。
在一些實施例中，位置H1-1至H1-2缺失。在一些實施例中，位置H1-1至H1-3缺失。在一些實施例中，位置H1-1至H1-4缺失。在一些實施例中，位置H1-1至H1-5缺失。在一些實施例中，位置H1-1至H1-6缺失。在一些實施例中，位置H1-1至H1-7缺失。在一些實施例中，位置H1-1至H1-8缺失。在一些實施例中，位置H1-1至H1-9缺失。在一些實施例中，位置H1-1至H1-10缺失。
在一些實施例中，位置H1-2至H1-3缺失。在一些實施例中，位置H1-2至H1-4缺失。在一些實施例中，位置H1-2至H1-5缺失。在一些實施例中，位置H1-2至H1-6缺失。在一些實施例中，位置H1-2至H1-7缺失。在一些實施例中，位置H1-2至H1-8缺失。在一些實施例中，位置H1-2至H1-9缺失。在一些實施例中，位置H1-2至H1-10缺失。在一些實施例中，位置H1-2至H1-11缺失。
在一些實施例中，位置H1-3至H1-4缺失。在一些實施例中，位置H1-3至H1-5缺失。在一些實施例中，位置H1-3至H1-6缺失。在一些實施例中，位置H1-3至H1-7缺失。在一些實施例中，位置H1-3至H1-8缺失。在一些實施例中，位置H1-3至H1-9缺失。在一些實施例中，位置H1-3至H1-10缺失。在一些實施例中，位置H1-3至H1-11缺失。在一些實施例中，位置H1-3至H1-12缺失。
在一些實施例中，位置H1-4至H1-5缺失。在一些實施例中，位置H1-4至H1-6缺失。在一些實施例中，位置H1-4至H1-7缺失。在一些實施例中，位置H1-4至H1-8缺失。在一些實施例中，位置H1-4至H1-9缺失。在一些實施例中，位置H1-4至H1-10缺失。在一些實施例中，位置H1-4至H1-11缺失。在一些實施例中，位置H1-4至H1-12缺失。
在一些實施例中，位置H1-5至H1-6缺失。在一些實施例中，位置H1-5至H1-7缺失。在一些實施例中，位置H1-5至H1-8缺失。在一些實施例中，位置H1-5至H1-9缺失。在一些實施例中，位置H1-5至H1-10缺失。在一些實施例中，位置H1-5至H1-11缺失。在一些實施例中，位置H1-5至H1-12缺失。
在一些實施例中，位置H1-6至H1-7缺失。在一些實施例中，位置H1-6至H1-8缺失。在一些實施例中，位置H1-6至H1-9缺失。在一些實施例中，位置H1-6至H1-10缺失。在一些實施例中，位置H1-6至H1-11缺失。在一些實施例中，位置H1-6至H1-12缺失。
在一些實施例中，位置H1-7至H1-8缺失。在一些實施例中，位置H1-7至H1-9缺失。在一些實施例中，位置H1-7至H1-10缺失。在一些實施例中，位置H1-7至H1-11缺失。在一些實施例中，位置H1-7至H1-12缺失。
在一些實施例中，位置H1-8至H1-9缺失。在一些實施例中，位置H1-8至H1-10缺失。在一些實施例中，位置H1-8至H1-11缺失。在一些實施例中，位置H1-8至H1-12缺失。
在一些實施例中，位置H1-9至H1-10缺失。在一些實施例中，位置H1-9至H1-11缺失。在一些實施例中，位置H1-9至H1-12缺失。
在一些實施例中，位置H1-10至H1-11缺失。在一些實施例中，位置H1-10至H1-12缺失。
在一些實施例中，位置H1-11至H1-12缺失。
在一些實施例中，位置H1-2至H1-4及H1-9至H1-11缺失。在一些實施例中，經縮短髮夾1區包含：(a)序列AGAAAU；(b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或(c)與(a)之序列具有小於或等於1個錯配之序列。
在一些實施例中，位置H1-2至H1-5及H1-9至H1-11缺失。在其他實施例中，上莖區之各位置經修飾。在一些實施例中，上莖區之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個位置經修飾。在一些實施例中，上莖區之除了1、2、3、4、5或6個位置以外的所有位置經修飾。在一些實施例中，上莖區之位置之至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%經修飾。視情況，在任一前述實施例中，上莖區之各經修飾位置係經2'-O-甲基化修飾。在其他實施例中，經縮短髮夾1區包含：(a)序列AAAAAU；(b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或(c)與(a)之序列具有小於或等於1個錯配之序列。
在一些實施例中，位置H1-2至H1-5及H1-8至H1-11缺失。在其他實施例中，上莖區之各位置經修飾。視情況，上莖區之各位置係經2'-O-甲基化修飾。在其他實施例中，經縮短髮夾1區包含：(a)序列AAAU；(b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或(c)與(a)之序列具有小於或等於1個錯配之序列。
在一些實施例中，位置H1-1、H1-3至H1-8及H-12缺失。在其他實施例中，上莖區之各位置經修飾。視情況，上莖區之各位置係經2'-O-甲基化修飾。在其他實施例中，經縮短髮夾1區包含：(a)序列CAAG；(b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配的序列；或(c)與(a)之序列具有小於或等於1個錯配的序列。
在一些實施例中，位置H1-2至H1-8缺失。在其他實施例中，上莖區之各位置經修飾。視情況，上莖區之各位置係經2'-O-甲基化修飾。在其他實施例中，經縮短髮夾1區包含：(a)序列AAAGU；(b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或(c)與(a)之序列具有小於或等於1個錯配之序列。
在一些實施例中，位置H1-3至H1-9缺失。在其他實施例中，上莖區之各位置經修飾。視情況，上莖區之各位置係經2'-O-甲基化修飾。在其他實施例中，經縮短髮夾1區包含：(a)序列ACAGU；(b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或(c)與(a)之序列具有小於或等於1個錯配之序列。
在一些實施例中，位置H1-7經G取代。在一些實施例中，位置H1-8經C取代。在一些實施例中，位置H1-7及H1-8為經取代之位置。在一些實施例中，H1-7及H1-8分別經G及C取代。在一些實施例中，位置H1-7及H1-8分別經G及C取代，且位置H1-2至H1-4及H1-9至H1-11缺失。在其他實施例中，經縮短髮夾1區包含：(a)序列AGAGCU；(b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或(c)與(a)之序列具有小於或等於1個錯配之序列。
在一些實施例中，位置H1-6經G取代。在一些實施例中，位置H1-7經U取代。在一些實施例中，位置H1-6及H1-7為經取代之位置。在一些實施例中，位置H1-6及H1-7分別經G及U取代。在一些實施例中，位置H1-6及H1-7分別經G及C取代，且位置H1-2至H1-4及H1-9至H1-11缺失。在其他實施例中，經縮短髮夾1區包含：(a)序列AGCUAU；(b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或(c)與(a)之序列具有小於或等於1個錯配之序列。
在一些實施例中，位置H1-1經C取代。在一些實施例中，位置H1-12經G取代。在一些實施例中，位置H1-1及H1-12為經取代之位置。在一些實施例中，位置H1-1及H1-12分別經C及G取代。在一些實施例中，位置H1-1及H1-12分別經C及G取代，且位置H1-2至H1-4及H1-9至H1-11缺失。在其他實施例中，上莖區之各位置經修飾。視情況，上莖區之各位置係經2'-O-甲基化修飾。在其他實施例中，經縮短髮夾1區包含：(a)序列CGAAAG；(b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配的序列；或(c)與(a)之序列具有小於或等於1個錯配的序列。
在一些實施例中，經縮短髮夾1區缺乏9至10個核苷酸。在一些實施例中，經縮短髮夾1區之長度為2個核苷酸。在一些實施例中，經縮短髮夾1區之長度為3個核苷酸。在其他實施例中，經縮短髮夾1區之2或3個核苷酸未經取代。
在一些實施例中，位置H1-1缺失。在一些實施例中，位置H1-12缺失。在一些實施例中，位置H1-11至H1-12缺失。在其他實施例中，位置H1-1至H1-8及H1-11至H1-12缺失。在其他實施例中，經縮短髮夾1區包含：(a)序列AA；(b)與(a)之序列具有小於或等於1個錯配之序列。
在一些實施例中，位置H1-11至H1-9缺失。在其他實施例中，經縮短髮夾1區包含：(a)序列AG；(b)與(a)之序列具有小於或等於1個錯配的序列。
在一些實施例中，經縮短髮夾1區缺乏5至10個核苷酸。在一些實施例中，經縮短髮夾1區缺乏5至10個核苷酸且位置N18、H1-12或N中之一或多者相對於SEQ ID NO:400經取代。在一些實施例中，經縮短髮夾1區之長度為2個核苷酸。在一些實施例中，經縮短髮夾1區之長度為3個核苷酸。在一些實施例中，經縮短髮夾1區之長度為4個核苷酸。在一些實施例中，經縮短髮夾1區之長度為5個核苷酸。在一些實施例中，經縮短髮夾1區之長度為6個核苷酸。在一些實施例中，經縮短髮夾1區之長度為7個核苷酸。在其他實施例中，位置H1-4至H1-11缺失。
在一些實施例中，本文所述之gRNA之保守部分進一步包含缺乏5至10個核苷酸之經縮短髮夾1區，其中一或多個核苷酸缺失。
在一些實施例中，位置N18經取代。在其他實施例中，位置N18經C取代。在其他實施例中，位置N18經C取代且位置H1-4至H1-11缺失。在其他實施例中，gRNA包含含有位置N18、經縮短髮夾1區及位置N之區段，且該區段包含：(a)序列CACUUG；(b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或(c)與(a)之序列具有小於或等於1個錯配之序列。
在一些實施例中，位置H1-12經取代。在一些實施例中，位置H1-12經C取代。在其他實施例中，位置H1-12經A取代。在一些實施例中，位置N經取代。在其他實施例中，位置N經A取代。在其他實施例中，位置H1-12經C取代且位置N經A取代。在其他實施例中，位置H1-12經C取代，位置N經A取代，且位置H1-4至H1-11缺失。在其他實施例中，gRNA包含含有位置N18、經縮短髮夾1區及位置N之區段，且該區段包含：(a)序列AACUCA；(b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配的序列；或(c)與(a)之序列具有小於或等於1個錯配的序列。
在一些實施例中，位置H1-12經A取代且位置N經A取代。在其他實施例中，位置H1-12經A取代，位置N經A取代，且位置H1-4至H1-11缺失。在其他實施例中，gRNA包含含有位置N18、經縮短髮夾1區及位置N之區段，且該區段包含：(a)序列AACUAA；(b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配的序列；或(c)與(a)之序列具有小於或等於1個錯配的序列。 經縮短上莖區
在一些實施例中，本文所述之gRNA的保守部分為經縮短上莖區。在一些實施例中，經縮短上莖區缺乏1至6個核苷酸。在一些實施例中，上莖區可包含環(例如四環)，且上莖區之長度包括該環中之核苷酸。在一些實施例中，經縮短上莖區之長度為6個核苷酸。在一些實施例中，經縮短上莖區之長度為7個核苷酸。在一些實施例中，經縮短上莖區之長度為8個核苷酸。在一些實施例中，經縮短上莖區之長度為9個核苷酸。在一些實施例中，經縮短上莖區之長度為10個核苷酸。在一些實施例中，經縮短上莖區之長度為11個核苷酸。在其他實施例中，經縮短上莖區之6、7、8、9、10或11個核苷酸包括小於或等於4個取代、小於或等於2個取代或一個取代。在其他實施例中，經縮短上莖區之6、7、8、9、10或11個核苷酸未經取代。
在一些實施例中，位置US3、US4、US5、US8、US9或US10中之一或多者缺失。在一些實施例中，位置US3缺失。在一些實施例中，位置US4缺失。在一些實施例中，位置US5缺失。在一些實施例中，位置US8缺失。在一些實施例中，位置US9缺失。在一些實施例中，位置US10缺失。應注意，在諸如SEQ ID NO: 400之序列中，其中US6、US7及US8各自為A殘基，US6、US7及US8中之任一者之缺失為等效的。
在一些實施例中，位置US4及US9缺失。在其他實施例中，位置H1-2至H1-5及H1-8至H1-11缺失。在其他實施例中，經縮短上莖區包含：(a)序列GCUGAAAGGC (SEQ ID NO: 1004)；(b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配的序列；或(c)與(a)之序列具有小於或等於1個錯配的序列。
在一些實施例中，位置US3及US4缺失。在一些實施例中，位置US9及US10缺失。在一些實施例中，位置US3、US4、US9及US10缺失。
在一些實施例中，具有本文所述之經縮短上莖區之gRNA的保守部分進一步包含經縮短髮夾區1。在其他實施例中，位置H1-2至H1-5及H1-8至H1-11缺失。在其他實施例中，位置H1-2至H1-5及H-12缺失。在其他實施例中，經縮短上莖區包含：(a)序列GCGAAAGC；(b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配的序列；或(c)與(a)之序列具有小於或等於1個錯配的序列。在其他實施例中，位置H1及H1-4至H1-12缺失。
在一些實施例中，位置US3、US4、US8、US9及US10缺失。在其他實施例中，經縮短上莖區包含：(a)序列GCGAAGC；(b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配的序列；或(c)與(a)之序列具有小於或等於1個錯配的序列。
在一些實施例中，位置US3、US4、US5、US9及US10缺失。在其他實施例中，經縮短上莖區包含：(a)序列GCAAAGC (SEQ ID NO: 1005)；(b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配的序列；或(c)與(a)之序列具有小於或等於1個錯配的序列。
在一些實施例中，位置US3視情況經G取代。在一些實施例中，位置US4視情況經C取代。在一些實施例中，位置US9視情況經G取代。在一些實施例中，位置US10視情況經C取代。
在一些實施例中，位置US3及US10視情況分別經G及C取代。在一些實施例中，位置US4及US9視情況分別經C及G取代。
在一些實施例中，位置US3及US10分別經G及C取代，且位置US4及US9分別經C及G取代。在一些實施例中，位置US5缺失。在一些實施例中，位置US3及US10分別經G及C取代，且位置US4及US9分別經C及G取代，且位置US8缺失。視情況，代替位置US8之缺失，位置US6或US7中之一者可缺失，因為US6、US7、US8各自包含A。在一些實施例中，位置H1-2至H1-5及H1-8至H1-11缺失。在其他實施例中，經縮短上莖區包含：(a)序列GCGCGAAGCGC；(b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配的序列；或(c)與(a)之序列具有小於或等於1個錯配的序列。
在一些實施例中，位置US3及US10分別經C及G取代。在一些實施例中，位置US3及US10分別經C及G取代，且位置US4及US9缺失。在一些實施例中，經縮短上莖區包含：(a)序列GCGGAAACGC (SEQ ID NO: 1006)；(b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配的序列；或(c)與(a)之序列具有小於或等於1個錯配的序列。
在一些實施例中，位置US3及US10分別經G及C取代，且位置US4及US9缺失。在一些實施例中，經縮短上莖區包含：(a)序列GCCGAAAGGC (SEQ ID NO: 1007)；(b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或(c)與(a)之序列具有小於或等於1個錯配之序列。 YA位點取代及修飾
在一些實施例中，本文所述之gRNA之保守部分具有在LS6、LS7、US3、US10、B3、N7、N15、N17、H2-2及H2-14中之任一者或多者處相對於SEQ ID NO: 400之取代。取代基核苷酸既不為隨後為腺嘌呤之嘧啶，亦不為在嘧啶之前的腺嘌呤。
在一些實施例中，位置LS6、LS7、US3、US10、B3、N7、N15、N17、H2-2及H2-14中之一者經取代。在一些實施例中，位置LS6經取代。在一些實施例中，位置LS7經取代。在一些實施例中，位置US3經取代。在一些實施例中，位置US10經取代。在一些實施例中，位置B3視情況經G取代。在一些實施例中，位置N7視情況經C或經U取代。在一些實施例中，位置N15視情況經C或經U取代。在一些實施例中，位置N17視情況經G取代。在一些實施例中，位置H2-2經取代。在一些實施例中，位置H-14經取代。
在一些實施例中，位置LS6、LS7、US3、US10、B3、N7、N15、N17、H2-2及H2-14中之兩者經取代。在一些實施例中，位置LS6及LS7視情況分別經U及A取代。在一些實施例中，位置US3及US10視情況分別經G及C取代。在一些實施例中，位置H2-2及H2-14視情況分別經A及U取代。在一些實施例中，位置H2-2及H2-14視情況分別經G及C取代。
在一些實施例中，位置US3、US10、LS6、LS7、B3、N15、N17、H2-2及H2-14中之至少2、3、4、5、6、7或8者經取代。在一些實施例中，位置US3、US10、LS6、LS7、B3、N15、N17、H2-2及H2-14經取代。
在一些實施例中，以下中之至少2、3、4、5者或全部為真： (a)位置US3及US10分別經G及C取代； (b)位置LS6及LS7分別經U及A取代； (c)位置B3經G取代； (d)位置N15經C取代； (e)位置N17經G取代；及/或 (f)位置H2-2及H2-14分別經A及U取代。
在一些實施例中，本文所述之gRNA之保守部分具有本文所述之經縮短上莖區及經縮短髮夾1區兩者。
在一些實施例中，位置H1-4至H1-11缺失。在其他實施例中，經縮短髮夾1區包含：(a)序列ACUU；(b)與(a)之序列具有小於或等於2個錯配之序列；或(c)與(a)之序列具有小於或等於1個錯配之序列。
在一些實施例中，位置N2經C取代。在一些實施例中，位置US1至US4及US9至US12缺失。視情況，位置H1-2至H1-11缺失。視情況，位置H1-4至H1-11缺失。
在一些實施例中，位置US2至US4及US9至US11缺失。在其他實施例中，位置H1-2至H1-11缺失或位置H1-1及H1-4至H1-12缺失。
在一些實施例中，本文所述之gRNA之保守部分包含本文所述之經縮短上莖區與髮夾1區截斷(亦即，位置H1-1至H1-12缺失)。
在一些實施例中，本文所述之gRNA之保守部分進一步包含上莖區中之以下缺失中之一或多者。在一些實施例中，位置US3至US5及US8至US10缺失。在一些實施例中，位置US3至US4及US7至US10缺失。在其他實施例中，位置US3至US10缺失。在其他實施例中，位置US2至US5及US8至US11缺失。在其他實施例中，位置US2至US6及US8至US11缺失。在其他實施例中，位置US2至US11缺失。在其他實施例中，位置US1至US5及US8至US12缺失。在其他實施例中，位置US1至US5及US7至US12缺失。
在一些實施例中，本文所述之gRNA之保守部分進一步包含經縮短髮夾2區。在一些實施例中，位置H2-15缺失。在一些實施例中，位置H2-14及H2-15缺失。
在一些實施例中，本文所述之gRNA之保守部分在連接區、下莖區或隆突區中進一步包含一或多個缺失或取代。在一些實施例中，位置N6缺失，視情況其中位置H1-4至H1-11缺失。在一些實施例中，位置LS6視情況經C取代。在一些實施例中，位置B3視情況經C取代。在一些實施例中，位置N1視情況經C取代。在一些實施例中，N7視情況經G取代。在一些實施例中，位置N15視情況經G取代。在一些實施例中，位置N17經非嘧啶取代，視情況經G取代。 經修飾之引導RNA (gRNA)
在一些實施例中，本文所述之gRNA經修飾。在本文所述之gRNA的上下文中，術語「經修飾」或「修飾」包括上文所述之修飾，包括例如(a)末端修飾，例如5'端修飾或3'端修飾，包括5'或3'保護端修飾；(b)核鹼基(或「鹼基」)修飾，包括鹼基置換或移除；(c)糖修飾，包括2'、3'及/或4'位置處之修飾；(d)核苷間鍵聯修飾；及(e)主鏈修飾，其可包括磷酸二酯鍵聯及/或核糖之修飾或置換。核苷酸在給定位置處之修飾包括緊接著核苷酸之糖之3'之磷酸二酯鍵聯的修飾或置換。因此，舉例而言，包含5'端之第一糖與第二糖之間之硫代磷酸酯的核酸被視為包含位置1處的修飾。術語「經修飾gRNA」通常係指具有對鹼基、糖及磷酸二酯鍵聯或主鏈部分中之一或多者(包括核苷酸磷酸酯，全部如本文中詳述及例示)之化學結構的修飾的gRNA。
例示性修飾模式展示於表1中。下文論述其他例示性模式。 引導區及/或YA位點之修飾
在一些實施例中，gRNA包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多個YA位點處之修飾。在一些實施例中，YA位點之嘧啶包含修飾(其包括更改緊接著嘧啶之糖之3'的核苷間鍵聯的修飾)。在一些實施例中，YA位點之腺嘌呤包含修飾(其包括更改緊接著腺嘌呤之糖之3'的核苷間鍵聯的修飾)。在一些實施例中，YA位點之嘧啶及腺嘌呤包含修飾，諸如糖、鹼基或核苷間鍵聯修飾。YA修飾可為本文所闡述之任何類型的修飾。在一些實施例中，YA修飾包含硫代磷酸酯、2'-OMe或2'-氟中之一或多者。在一些實施例中，YA修飾包含嘧啶修飾，其包含硫代磷酸酯、2'-OMe、2'-H、肌苷或2'-氟中之一或多者。在一些實施例中，YA修飾在含有一或多個YA位點的RNA雙螺旋區內包含雙環核糖類似物(例如LNA、BNA或ENA)。在一些實施例中，YA修飾在含有YA位點的RNA雙螺旋區內包含雙環核糖類似物(例如LNA、BNA或ENA)，其中YA修飾位於YA位點遠端。 包括YA位點修飾的引導區修飾
在一些實施例中，引導區包含1、2、3、4、5個或更多個可以包含YA修飾的YA位點(「引導區YA位點」)。在一些實施例中，位於相對於5'末端之5'端的5端、6端、7端、8端、9端或10端的一或多個YA位點(其中「5端」等係指相對於引導區之3'端的位置5，亦即，引導區中之最多3'核苷酸)包含YA修飾。在一些實施例中，位於相對於5'末端之5'端的5端、6端、7端、8端、9端或10端的兩個或更多個YA位點包含YA修飾。在一些實施例中，位於相對於5'末端之5'端的5端、6端、7端、8端、9端或10端的三個或更多個YA位點包含YA修飾。在一些實施例中，位於相對於5'末端之5'端的5端、6端、7端、8端、9端或10端的四個或更多個YA位點包含YA修飾。在一些實施例中，位於相對於5'末端之5'端的5端、6端、7端、8端、9端或10端的五個或更多個YA位點包含YA修飾。經修飾之引導區YA位點包含YA修飾。
在一些實施例中，經修飾之引導區YA位點位於引導區之3'末端核苷酸之17、16、15、14、13、12、11、10或9個核苷酸內。舉例而言，若經修飾之引導區YA位點位於引導區之3'末端核苷酸之10個核苷酸內且引導區具有20個核苷酸長度，則經修飾之引導區YA位點中的經修飾核苷酸位於位置11至20中之任一位置處。在一些實施例中，YA修飾位於引導區之3'末端核苷酸的YA位點20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1核苷酸內。在一些實施例中，YA修飾位於引導區之3'末端核苷酸的20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1核苷酸內。
在一些實施例中，經修飾之引導區YA位點位於5'末端之5'端的核苷酸4、5、6、7、8、9、10或11處或其之後。
在一些實施例中，經修飾之引導區YA位點不同於5'端修飾。舉例而言，gRNA可包含如本文所述之5'端修飾且進一步包含經修飾之引導區YA位點。或者，gRNA可包含經修飾之5'端及未修飾之引導區YA位點。或者，gRNA可包含經修飾之5'端及未修飾之引導區YA位點。
在一些實施例中，經修飾之引導區YA位點包含位於引導區YA位點5'之至少一個核苷酸不包含的修飾。舉例而言，若核苷酸1至3包含硫代磷酸酯，核苷酸4僅包含2'-OMe修飾，且核苷酸5為YA位點之嘧啶且包含硫代磷酸酯，則經修飾之引導區YA位點包含位於引導區YA位點5'之至少一個核苷酸(核苷酸4)不包含的修飾(硫代磷酸酯)。在另一實例中，若核苷酸1至3包含硫代磷酸酯，且核苷酸4為YA位點之嘧啶且包含2'-OMe，則經修飾之引導區YA位點包含位於引導區YA位點5'之至少一個核苷酸(核苷酸1至3中之任一者)不包含的修飾(2'-OMe)。若未修飾之核苷酸位於經修飾之引導區YA位點5'，則亦始終滿足此條件。
在一些實施例中，經修飾之引導區YA位點包含如上文針對YA位點所述的修飾。
引導區修飾(包括引導區YA位點修飾)之其他實施例闡述於本文中其他地方，包括於上述發明內容中及包含修飾(包括上述YA位點處之修飾)之gRNA之論述中及本文中其他地方。gRNA之引導區可根據任何實施例修飾，其包含本文所闡述之經修飾引導區。在可行的情況下，本發明在別處闡述的任何實施例可以與任一前述實施例組合。 保守區YA位點修飾
保守區YA位點1至10說明於圖1C中。在一些實施例中，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個保守區YA位點包含修飾。
在一些實施例中，保守區YA位點1、8或1及8包含YA修飾。在一些實施例中，保守區YA位點1、2、3、4及10包含YA修飾。在一些實施例中，YA位點2、3、4、8及10包含YA修飾。在一些實施例中，保守區YA位點1、2、3及10包含YA修飾。在一些實施例中，YA位點2、3、8及10包含YA修飾。在一些實施例中，YA位點1、2、3、4、8及10包含YA修飾。在一些實施例中，1、2、3、4、5、6、7或8個其他保守區YA位點包含YA修飾。
在一些實施例中，保守區YA位點2、3、4及10中之1、2、3或4者包含YA修飾。在一些實施例中，1、2、3、4、5、6、7或8個其他保守區YA位點包含YA修飾。
在一些實施例中，經修飾之保守區YA位點包含如上文針對YA位點所述的修飾。
保守區YA位點修飾之其他實施例闡述於上述發明內容中。在可行的情況下，本發明在別處闡述的任何實施例可以與任一前述實施例組合。 對末端核苷酸之修飾
在一些實施例中，gRNA之5'及/或3'端區經修飾。 3'末端區修飾
在一些實施例中，3'末端區域中之末端(亦即，最後) 1、2、3、4、5、6或7個核苷酸經修飾。在全篇中，此修飾可以稱為「3'端修飾」。在一些實施例中，3'末端區中之末端(亦即，最後) 1、2、3、4、5、6或7個核苷酸包含超過一個修飾。在一些實施例中，3'末端區中之末端(亦即，最後) 1、2、3、4、5、6或7個核苷酸中之至少一者經修飾。在一些實施例中，3'末端區中之末端(亦即，最後) 1、2、3、4、5、6或7個核苷酸中之至少兩者經修飾。在一些實施例中，3'末端區中之末端(亦即，最後) 1、2、3、4、5、6或7個核苷酸中之至少三者經修飾。在一些實施例中，修飾包含PS鍵聯。在一些實施例中，對3'末端區的修飾為3'保護端修飾。在一些實施例中，3'端修飾包含3'保護端修飾。
在一些實施例中，3'端修飾包含經修飾之核苷酸，其選自2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、反向無鹼基修飾之核苷酸，或其組合。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含反向無鹼基修飾之核苷酸。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含最後7、6、5、4、3、2或1個核苷酸中之任一者或多者之修飾。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含一個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含兩個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含三個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含四個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含五個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含六個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含七個經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含介於1至7個之間或介於1至5個之間的核苷酸之修飾。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含gRNA之3'端處之1、2、3、4、5、6或7個核苷酸的修飾。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含gRNA之3'端處之約1至3、1至5、1至6或1至7個核苷酸之修飾。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含以下中之任一者或多者：核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、2'-O-Me修飾之核苷酸、2'-O-moe修飾之核苷酸、2'-F修飾之核苷酸、反向無鹼基修飾之核苷酸，及其組合。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含1、2、3、4、5、6或7個介於核苷酸之間的PS鍵聯。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含至少一個經2'-O-Me、2'-O-moe、反向無鹼基或2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含一個PS鍵聯，其中該鍵聯介於最後一個核苷酸與倒數第二個核苷酸之間。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含最後三個核苷酸之間的兩個PS鍵聯。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含最後四個核苷酸之間的四個PS鍵聯。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含最後四個核苷酸中之任一者或多者之間的PS鍵聯。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含最後五個核苷酸中之任一者或多者之間的PS鍵聯。在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含最後2、3、4、5、6或7個核苷酸中之任一者或多者之間的PS鍵聯。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含最後1至7個核苷酸中之一或多者的修飾，其中該修飾為PS鍵聯、反向無鹼基核苷酸、2'-O-Me、2'-O-moe、2'-F或其組合。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含2'-O-Me、2'-O-moe、2'-F或其組合對最後一個核苷酸的修飾，及視情況存在的連至3'尾之後續核苷酸及/或第一個核苷酸的一或兩個PS鍵聯。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含2'-OMe、2'-O-moe、2'-F或其組合對最後一個及/或倒數第二個核苷酸的修飾，及視情況存在的一或多個PS鍵聯。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含2'-OMe、2'-O-moe、2'-F或其組合對最後一個、倒數第二個及/或倒數第三個核苷酸的修飾，及視情況存在的一或多個PS鍵聯。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含2'-OMe、2'-O-moe、2'-F或其組合對最後一個、倒數第二個、倒數第三個及/或倒數第四個核苷酸的修飾，及視情況存在的一或多個PS鍵聯。
在一些實施例中，3'端修飾包含或進一步包含2'-O-Me、2'-O-moe、2'-F或其組合對最後一個、倒數第二個、倒數第三個、倒數第四個及/或倒數第五個核苷酸的修飾，及視情況存在的一或多個PS鍵聯。
在一些實施例中，包含3'端修飾的gRNA包含或進一步包含3'尾，其中該3'尾包含存在於3'尾之任一個或多個核苷酸的修飾。在一些實施例中，3'尾完全被修飾。在一些實施例中，3'尾包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9或1至10個核苷酸，視情況其中此等核苷酸中之任一者或多者經修飾。
在一些實施例中，提供包含3'端修飾之gRNA，其中3'端修飾包含如SEQ ID NO: 101至190或795至798中之任一者中所示的3'端修飾。在一些實施例中，提供包含3'保護端修飾之gRNA。
在一些實施例中，提供包含3'端修飾的agRNA，其中該3'端修飾包含(i) gRNA之保守區之最後一個核苷酸處之經2'-OMe修飾之核苷酸；(ii)緊接著經2'-OMe修飾之核苷酸之5'的三個鄰接的經2'O-moe修飾之核苷酸；及(iii)最後三個核苷酸之間的三個鄰接PS鍵聯。
在一些實施例中，提供包含3'端修飾的gRNA，其中該3'端修飾包含(i) sgRNA保守區或gRNA保守區之最後一個核苷酸的五個鄰接之經2'-OMe修飾之核苷酸，及(ii)最後三個核苷酸之間的三個PS鍵聯。
在一些實施例中，提供包含3^端修飾的gRNA，其中該3'端修飾在sgRNA保守區或gRNA保守區之最後一個核苷酸處包含反向無鹼基修飾之核苷酸。
在一些實施例中，提供包含3'端修飾的gRNA，其中3'端修飾包含(i) gRNA保守區之最後一個核苷酸處的反向無鹼基修飾之核苷酸；及(ii) gRNA保守區或gRNA保守區之最後三個核苷酸處的三個鄰接的經2'-OMe修飾之核苷酸。
在一些實施例中，提供一種gRNA，其包含(i) gRNA保守區之最後一個核苷酸的15個鄰接之經2'-OMe修飾之核苷酸；(ii)緊接著經2'-OMe修飾之核苷酸之5'的五個鄰接的經2'-F修飾之核苷酸；及(iii)最後三個核苷酸之間的三個PS鍵聯。
在一些實施例中，提供一種gRNA，其包含(i)在gRNA保守區之最後20個核苷酸處交替的經2'-OMe修飾之核苷酸及經2'-F修飾之核苷酸，及(ii)最後三個核苷酸之間的三個PS鍵聯。
在一些實施例中，提供包含3'端修飾之gRNA，其中3'端修飾包含(i)兩個或三個鄰接的經2'-OMe修飾之核苷酸及(ii)最後三個核苷酸之間的三個PS鍵聯。
在一些實施例中，提供包含3'端修飾之gRNA，其中該3'端修飾包含最後一個核苷酸與倒數第二個核苷酸之間的一個PS連接。
在一些實施例中，提供一種gRNA，其包含(i) 15或20個鄰接的經2'-OMe修飾之核苷酸及(ii)最後三個核苷酸之間的三個PS鍵聯。
在一些實施例中，gRNA包含5'端修飾及3'端修飾。 3'尾
在一些實施例中，gRNA包含3'末端，其包含3'尾，該3'尾在後面且為gRNA保守部分之3'。在一些實施例中，3'尾包含1至約20個核苷酸、1至約15個核苷酸、1至約10個核苷酸、1至約5個核苷酸、1至約4個核苷酸、1至約3個核苷酸，及1至約2個核苷酸。在一些實施例中，3'尾包含約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。在一些實施例中，3'尾包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。在一些實施例中，3'尾包含1個核苷酸。在一些實施例中，3'尾包含2個核苷酸。在一些實施例中，3'尾包含3個核苷酸。在一些實施例中，3'尾包含4個核苷酸。在一些實施例中，3尾包含約1至2個、1至3個、1至4個、1至5個、1至7個、1至10個、至少1至5個、至少1至3個、至少1至4個、至少1至5個、至少1至5個、至少1至7個或至少1至10個核苷酸。
在一些實施例中，3'尾包含1至20個核苷酸且位於gRNA保守部分之3'端之後。
在一些實施例中，3'尾包含或進一步包含以下中之一或多者：保護端修飾、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、2'-OMe修飾之核苷酸、2'-O-moe修飾之核苷酸、2'-F修飾之核苷酸、反向無鹼基修飾之核苷酸，及其組合。
在一些實施例中，3'尾包含或進一步包含核苷酸之間的一或多個硫代磷酸酯(PS)鍵聯。在一些實施例中，3'尾包含或進一步包含一或多個經2'-OMe修飾之核苷酸。在一些實施例中，3'尾包含或進一步包含一或多個經2'-O-moe修飾之核苷酸。在一些實施例中，3'尾包含或進一步包含一或多個經2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，3'尾包含或進一步包含一或多個經反向無鹼基修飾之核苷酸。在一些實施例中，3'尾包含或進一步包含一或多個保護端修飾。在一些實施例中，3'尾包含或進一步包含以下中之一或多者之組合：核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、經2'-OMe修飾之核苷酸、經2'-O-moe修飾之核苷酸、經2'-F修飾之核苷酸，及經反向無鹼基修飾之核苷酸。
在一些實施例中，gRNA不包含3'尾。 5'末端區修飾
在一些實施例中，5'末端區經修飾，例如gRNA中前1、2、3、4、5、6或7個核苷酸經修飾。在全篇中，此修飾可以稱為「5'端修飾」。在一些實施例中，5'末端區中前1、2、3、4、5、6或7個核苷酸包含超過一個修飾。在一些實施例中，5'端處之末端(亦即，前) 1、2、3、4、5、6或7個核苷酸中的至少一者經修飾。在一些實施例中，5'末端區中之末端1、2、3、4、5、6或7個核苷酸中之至少兩者經修飾。在一些實施例中，5'末端區中之末端1、2、3、4、5、6或7個核苷酸中之至少三者經修飾。在一些實施例中，5'端修飾為5'保護端修飾。
在一些實施例中，gRNA之5'及3'端區(例如末端)兩者均經修飾。在一些實施例中，僅gRNA之5'端區經修飾。在一些實施例中，gRNA保守部分中僅3'末端區(加或減3'尾)經修飾。
在一些實施例中，gRNA包含在gRNA之5'末端區之前7個核苷酸中之1、2、3、4、5、6或7者處的修飾。在一些實施例中，gRNA包含在3'末端區之7個末端核苷酸中之1、2、3、4、5、6或7者處的修飾。在一些實施例中，5'末端區之前4個核苷酸中之2、3或4者，及/或3'末端區之末端4個核苷酸中之2、3或4者經修飾。在一些實施例中，5'末端區之前4個核苷酸中的2、3或4者經由硫代磷酸酯(PS)鍵連接。
在一些實施例中，對5'末端及/或3'末端之修飾包含2'-O-甲基(2'-O-Me)或2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)修飾。在一些實施例中，修飾包含對核苷酸之2'-氟(2'-F)修飾。在一些實施例中，修飾包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。在一些實施例中，修飾包含反向無鹼基核苷酸。在一些實施例中，修飾包含保護端修飾。在一些實施例中，修飾包含超過一個修飾，其選自保護端修飾、2'-O-Me、2'-O-moe、2'-氟(2'-F)、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯，及反向無鹼基核苷酸。在一些實施例中，涵蓋等效修飾。
在一些實施例中，gRNA包含5'末端處之前一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個核苷酸之間的一或多個硫代磷酸酯(PS)鍵聯。在一些實施例中，gRNA包含3'末端處之最後一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個核苷酸之間的一或多個PS鍵聯。在一些實施例中，gRNA包含3'末端處之最後一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個核苷酸與5'末端之5'端的前一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個核苷酸之間的一或多個PS鍵聯。在一些實施例中，除PS鍵聯以外，5'及3'末端核苷酸可包含2'-O-Me、2'-O-moe或2'-F修飾之核苷酸。
在一些實施例中，gRNA包含5'端修飾，例如其中引導區之第一個核苷酸經修飾。在一些實施例中，gRNA包含5'端修飾，其中引導區之第一個核苷酸包含5'保護端修飾。
在一些實施例中，5'端修飾包含經修飾之核苷酸，其選自2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、反向無鹼基修飾之核苷酸，或其組合。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含反向無鹼基修飾之核苷酸。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含gRNA引導區之核苷酸1至7中之任一者或多者的修飾。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含一個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含兩個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含三個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含四個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含五個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含六個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含七個經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含1至7個、1至5個、1至4個、1至3個或1至2個核苷酸的修飾。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含5'端之1、2、3、4、5、6或7個核苷酸之修飾。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含5'端之約1至3個、1至4個、1至5個、1至6個或1至7個核苷酸的修飾。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含gRNA之5'端處之第一個核苷酸的修飾。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含gRNA之5'端的第一及第二核苷酸的修飾。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含gRNA之5'端之第一、第二及第三核苷酸的修飾。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含gRNA之5'端之第一、第二、第三及第四核苷酸的修飾。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含gRNA之5'端之第一、第二、第三、第四及第五核苷酸的修飾。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含gRNA之5'端之第一、第二、第三、第四、第五及第六核苷酸的修飾。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含gRNA之5'端之第一、第二、第三、第四、第五、第六及第七核苷酸的修飾。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯，及/或2'-O-Me修飾之核苷酸及/或2'-O-moe修飾之核苷酸，及/或2'-F修飾之核苷酸，及/或反向無鹼基修飾之核苷酸，及/或其組合。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含核苷酸之間的1、2、3、4、5、6及/或7個PS鍵聯。在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含核苷酸之間的約1至2個、1至3個、1至4個、1至5個、1至6個或1至7個PS鍵聯。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含至少一個PS鍵聯，其中若存在一個PS鍵聯，則該鍵聯介於引導區之核苷酸1與2之間。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含至少兩個PS鍵聯，且該鍵聯介於引導區之核苷酸1與2之間及2與3之間。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含引導區之核苷酸1與2、2與3及3與4中之任一者或多者之間的PS鍵聯。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含引導區之核苷酸1與2、2與3、3與4及4與5中之任一者或多者之間的PS鍵聯。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含引導區之核苷酸1與2、2與3、3與4、4與5及5與6中之任一者或多者之間的PS鍵聯。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含引導區之核苷酸1與2、2與3、3與4、4與5、5與6及7與8中之任一者或多者之間的PS鍵聯。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含引導區之核苷酸1至7中之一或多者的修飾，其中該修飾為PS鍵聯、反向無鹼基核苷酸、2'-O-Me、2'-O-moe、2'-F或其組合。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含2'-O-Me、2'-O-moe、2'-F或其組合對引導區之第一核苷酸的修飾，及任選的連至後續核苷酸的PS鍵聯。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含2'-O-Me、2'-O-moe、2'-F或其組合對引導區之第一及/或第二核苷酸的修飾，及視情況存在的第一與第二核苷酸之間及/或第二與第三核苷酸之間的一或多個PS鍵聯。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含2'-O-Me、2'-O-moe、2'-F或其組合對該可變區之第一、第二及/或第三核苷酸的修飾，及視情況存在的第一與第二核苷酸之間、第二與第三核苷酸之間及/或第三與第四核苷酸之間的一或多個PS鍵聯。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含2'-O-Me、2'-O-moe、2'F或其組合對該可變區之第一、第二、第三及/或第四核苷酸的修飾，及視情況存在的第一與第二核苷酸之間、第二與第三核苷酸之間、第三與第四核苷酸之間及/或第四與第五核苷酸之間的一或多個PS鍵聯。
在一些實施例中，5'端修飾包含或進一步包含2'-O-Me、2'-O-moe、2'-F或其組合對該可變區之第一、第二、第三、第四及/或第五核苷酸的修飾，及視情況存在的第一與第二核苷酸之間、第二與第三核苷酸之間、第三與第四核苷酸之間、第四與第五核苷酸之間及/或第五與第六核苷酸之間的一或多個PS鍵聯。
在一些實施例中，提供包含5'端修飾之gRNA，其中5'端修飾包含如SEQ ID NO: 101至190或795至798中之任一者中所示的5'端修飾。
在一些實施例中，sgRNA包含含有5'保護端修飾的5'端修飾。在一些實施例中，提供包含5'端修飾的gRNA，其中5'端修飾包含引導區之核苷酸1、2及3處的經2'-OMe修飾之核苷酸。
在一些實施例中，提供包含5'端修飾的gRNA，其中5'端修飾包含引導區之核苷酸1、2及3處之經2'-OMe修飾之核苷酸及引導區之核苷酸1與2、2與3及3與4之間的PS鍵聯。
在一些實施例中，提供包含5'端修飾的gRNA，其中5'端修飾包含在引導區之核苷酸1、2、3、4及5處的2'-OMe修飾之核苷酸。
在一些實施例中，提供包含5'端修飾的gRNA，其中5'端修飾包含引導區之核苷酸1、2、3、4及5處之經2'-OMe修飾之核苷酸及引導區之核苷酸1與2、2與3、3與4、4與5、及5與6之間的PS鍵聯。
在一些實施例中，提供包含5'端修飾的gRNA，其中5'端修飾包含在引導區之核苷酸1、2及3處之經2'O-moe修飾之核苷酸。
在一些實施例中，提供包含5'端修飾的gRNA，其中5'端修飾包含引導區之核苷酸1、2及3處之經2'O-moe修飾之核苷酸及引導區之核苷酸1與2、2與3及3與4之間的PS鍵聯。
在一些實施例中，提供包含5'端修飾的gRNA，其中5'端修飾包含引導區之核苷酸1處的反向無鹼基修飾之核苷酸。
在一些實施例中，提供包含5'端修飾的gRNA，其中5'端修飾包含在引導區之核苷酸1處的反向無鹼基修飾之核苷酸及引導區之核苷酸1、2及3處的2'-OMe修飾之核苷酸。
在一些實施例中，提供包含5'端修飾之gRNA，其中5'端修飾包含在引導區之核苷酸1處之反向無鹼基修飾之核苷酸、在引導區之核苷酸1、2及3處之2'-OMe修飾之核苷酸及在引導區之核苷酸1與2、2與3、3與4、4與5及5與6之間的PS鍵聯。
在一些實施例中，提供包含5'端修飾及3'端修飾之gRNA。在一些實施例中，gRNA包含5'及3'末端處之經修飾之核苷酸，及表3中所述之一或多個其他區中的經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，sgRNA包含5'或3'端處的經修飾之核苷酸。例示性修飾模式描述於下文及表1中。 上莖修飾
在一些實施例中，提供包含上莖修飾的gRNA，其中上莖修飾包含對上莖區中之US1至US12中之任一者或多者的修飾。
在一些實施例中，提供包含上莖修飾的gRNA，其中上莖修飾包含上莖區中之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或所有12個核苷酸的修飾。
在一些實施例中，提供包含上莖修飾之gRNA，其中上莖修飾包含上莖區中約1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9、1至10或1至12個核苷酸之修飾。
在一些實施例中，提供包含上莖修飾之gRNA，其中上莖修飾在YA位點中包含1、2、3、4或5個YA修飾。在一些實施例中，提供包含上莖修飾的sgRNA，其中上莖修飾包含至少1、2、3、4或5個YA修飾。在一些實施例中，提供包含上莖修飾的sgRNA，其中上莖修飾包含一個YA修飾。在一些實施例中，提供包含上莖修飾的sgRNA，其中上莖修飾包含2個YA修飾。在一些實施例中，上莖修飾包含3個YA修飾。在一些實施例中，一或多個YA修飾處於YA位點中。在一些實施例中，一或多個YA修飾位於YA位點的遠端。
在一些實施例中，提供包含上莖修飾的gRNA，其中上莖修飾包含經2'-OMe修飾之核苷酸。在一些實施例中，提供包含上莖修飾的gRNA，其中上莖修飾包含2'-O-moe修飾之核苷酸。在一些實施例中，提供包含上莖修飾的gRNA，其中上莖修飾包含2'-F修飾之核苷酸。
在一些實施例中，提供包含上莖修飾之gRNA，其中上莖修飾包含2'-OMe修飾之核苷酸、2'-O-moe修飾之核苷酸、2'-F修飾之核苷酸及/或其組合。
在一些實施例中，sgRNA包含如表1中之任一序列中所示的上莖修飾。在一些實施例中，將此類上莖修飾與例如如表1中之相應序列所示的5'保護端修飾組合。在一些實施例中，將此類上莖修飾與例如如表1中之相應序列所示的3'保護端修飾組合。在一些實施例中，將此類上莖修飾與如表1中之相應序列所示的5'及3'端修飾組合。
在一些實施例中，gRNA包含5'端修飾及上莖修飾。在一些實施例中，gRNA包含3'端修飾及上莖修飾。在一些實施例中，gRNA包含5'端修飾、3'端修飾及上莖修飾。 髮夾修飾
在一些實施例中，gRNA包含髮夾區中之修飾。在一些實施例中，髮夾區修飾包含至少一個經修飾之核苷酸，其選自2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸及/或其組合。
在一些實施例中，髮夾區修飾處於髮夾1區中。在一些實施例中，髮夾區修飾處於髮夾2區中。在一些實施例中，修飾位於髮夾1及髮夾2區內，視情況其中髮夾1與2之間的「n」亦經修飾。
在一些實施例中，提供包含髮夾修飾的gRNA，其中髮夾修飾包含YA位點中之1、2或3個YA修飾。在一些實施例中，提供包含髮夾修飾的gRNA，其中髮夾修飾包含至少1、2、3、4、5或6個YA修飾。在一些實施例中，提供包含髮夾修飾的gRNA，其中髮夾修飾包含一個YA修飾。在一些實施例中，提供包含髮夾修飾的gRNA，其中髮夾修飾包含2個YA修飾。在一些實施例中，髮夾修飾包含3個YA修飾。在一些實施例中，一或多個YA修飾處於YA位點中。在一些實施例中，一或多個YA修飾位於YA位點的遠端。
在一些實施例中，髮夾修飾包含或進一步包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。
在一些實施例中，髮夾修飾包含或進一步包含2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。
在一些實施例中，髮夾區修飾包含至少一個經修飾之核苷酸，其選自2'H修飾之核苷酸(DNA)、PS修飾之核苷酸、YA修飾、2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸，及/或其組合。
在一些實施例中，gRNA包含3'端修飾及髮夾區中之修飾。
在一些實施例中，gRNA包含5'端修飾及髮夾區中之修飾。
在一些實施例中，gRNA包含上莖修飾及髮夾區中之修飾。
在一些實施例中，gRNA包含如表1A中之序列中之任一者中所示之髮夾修飾。在一些實施例中，此類髮夾修飾與如表1A中之相應序列所示之5'端修飾組合。在一些實施例中，此類髮夾修飾與如表1A中之相應序列所示之3'端修飾組合。在一些實施例中，此類髮夾修飾與如表1A中之相應序列所示之5'端及3'端修飾組合。
在一些實施例中，gRNA包含3'端修飾、髮夾區中之修飾、上莖修飾及5'端修飾。 例示性經修飾之gRNA
在一些實施例中，本文所述之gRNA包含表1A中所示之序列中之任一者或由其組成。另外，包含表1A中所示之任一序列之修飾的gRNA涵蓋在內且藉由SEQ ID No在其中加以鑑別。亦即，核苷酸可以相同或不同，但所示修飾模式可與表1A之引導序列的修飾模式相同或相似。修飾模式包括gRNA (例如5'末端區、下莖區、隆突區、上莖區、連接區、髮夾1區、髮夾2區、3'尾區)之修飾的相對位置及一致性。
在一些實施例中，修飾模式含有表1A之序列欄中所示之任一序列之修飾或該序列之一或多個區域內之修飾的至少50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%。在一些實施例中，修飾模式為與表1A之序列欄中所示的任一序列之修飾模式至少50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%一致。在一些實施例中，修飾模式與表1A中所示之序列之一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7或8個)區(例如5'末端區、下莖區、隆突區、上莖區、連接區、髮夾1區、髮夾2區及/或3'末端區)至少50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%一致。
舉例而言，在一些實施例中，涵蓋gRNA，其中修飾模式與5'末端區內之序列之修飾模式至少50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%一致。在一些實施例中，涵蓋gRNA，其中修飾模式在下莖內至少50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%一致。在一些實施例中，涵蓋gRNA，其中修飾模式在隆突內至少50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%一致。在一些實施例中，涵蓋gRNA，其中修飾模式在上莖內至少50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%一致。在一些實施例中，涵蓋gRNA，其中修飾模式在連接內至少50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%一致。在一些實施例中，涵蓋gRNA，其中修飾模式在髮夾1內至少50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%一致。在一些實施例中，涵蓋gRNA，其中修飾模式在髮夾2內至少50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%一致。在一些實施例中，涵蓋gRNA，其中修飾模式在3'末端內至少50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%一致。在一些實施例中，修飾模式在0、1、2、3、4、5或6個核苷酸處不同於表1A之序列，或此類序列之區(例如5'末端、下莖、隆突、上莖、連接、髮夾1、髮夾2、3'末端)的修飾模式。在一些實施例中，gRNA包含的修飾在0、1、2、3、4、5或6個核苷酸處不同於表1A之序列之修飾。在一些實施例中，gRNA包含的修飾在0、1、2、3、4、5或6個核苷酸處不同於表1A之序列之區(例如5'末端、下莖、隆突、上莖、連接、髮夾1、髮夾2、3'末端)之修飾。
在一些實施例中，gRNA包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。在一些實施例中，gRNA包含2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)修飾之核苷酸。在一些實施例中，gRNA包含2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。在一些實施例中，gRNA包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。在一些實施例中，sgRNA包含YA修飾。
在一些實施例中，gRNA包含5'端修飾、3'端修飾，或5'及3'端修飾，諸如保護端修飾。在一些實施例中，5'端修飾包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。在一些實施例中，5'端修飾包含2'-O-甲基(2'-O-Me)、2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)及/或2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。在一些實施例中，5'端修飾包含至少一個硫代磷酸酯(PS)鍵，及2'-O-甲基(2'-O-Me)、2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)及/或2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸中之一或多者。末端修飾可以包含硫代磷酸酯(PS)、2'-O-甲基(2'-O-Me)、2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)及/或2'-氟(2'-F)修飾。本文所述之實施例亦涵蓋等效端修飾。在一些實施例中，gRNA包含與gRNA之一或多個區之修飾組合之端修飾。
涵蓋經修飾之sgRNA，如上文所述，其包含5'端修飾、3'端修飾、上莖修飾、髮夾修飾及3'末端修飾之組合。下文描述例示性經修飾之gRNA。
在一些實施例中，提供gRNA，其包含SEQ ID NO: 1-98、201-294、401-494、601-698、801-875中所描述之序列中之任一者或由其組成。在一些實施例中，提供gRNA，其對SEQ ID NO: 101-198、301-394、501-594、701-798或901-975中所描述之序列中之任一者具有損害或由其組成，包括表1A中所示之修飾。
在一些實施例中，提供gRNA，其包含SEQ ID NO: 201-294之序列中之任一者，其中gRNA進一步包含與目標序列互補且將Cas9導引至其目標以進行裂解之引導區。在一些實施例中，提供gRNA，其包含SEQ ID NO: 301-394之經修飾序列中之任一者，其中gRNA進一步包含與目標序列互補且將Cas9導引至其目標以進行裂解之引導區。在一些情況下，提供gRNA，其包含與SEQ ID NO: 1-98、201-294、401-494、601-698或801-875中之任一者之核酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70%一致性之核酸。在一些實施例中，提供gRNA，其包含與SEQ ID NO: 101-198、301-394、501-594、701-798或901-975中之任一者之核酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70%一致性之核酸，其中修飾模式與表1A中之參考序列識別符中所示之修飾模式一致。前述gRNA中之任一者進一步包含三個鍵聯5'末端處之前四個核苷酸之硫代磷酸酯(PS)鍵及三個鍵聯3'末端處之最後四個核苷酸之PS鍵。
在一些實施例中，gRNA包含在其5'端處之前4個核苷酸中之1、2、3或4者處之修飾。在一些實施例中，5'末端處之前三個或四個核苷酸，及3'末端處之最後三個或四個核苷酸經修飾。在一些實施例中，5'端處之前四個核苷酸，及3'末端處之最後四個核苷酸經由硫代磷酸酯(PS)鍵連接。在一些實施例中，修飾包含2'-O-Me。在一些實施例中，修飾包含2'-F。在一些實施例中，修飾包含2'-O-moe。
在一些實施例中，若所提及之核苷酸存在於gRNA中，則gRNA包含5'端處之前4個核苷酸中之1、2、3或4者處的修飾。在一些實施例中，gRNA包含3'端(sgRNA之3'尾或保守部分)處之最後4個核苷酸中之1、2、3或4者處的修飾。在一些實施例中，5'末端處之前四個核苷酸與3'末端處之最後四個核苷酸經由PS鍵連接，且5'末端處之前三個核苷酸及3'末端處之最後三個核苷酸包含2'-O-Me或2'-O-moe修飾。
在一些實施例中，5'末端處之前四個核苷酸與3'末端處之最後四個核苷酸經由PS鍵連接，且5'末端處之前三個核苷酸及3'末端處之最後三個核苷酸包含2'-F修飾。
在一些實施例中，若所提及的核苷酸存在於gRNA中，則提供sgRNA，其中LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12經2'-O-Me修飾。在一些實施例中，gRNA之隆突區中之各核苷酸經2'-O-Me修飾。在一些實施例中，gRNA之上莖區中之各核苷酸經2'-O-ME修飾。在一些實施例中，gRNA之連接區中之N16、N17及N18經2'-O-Me修飾。在一些實施例中，gRNA之髮夾1區中剩餘的各核苷酸經2'-O-Me修飾。在一些實施例中，gRNA之髮夾2區中剩餘的各核苷酸經2'-O-Me修飾。
在一些實施例中，提供gRNA，其在以下中之一或多者中包含5'端修飾及一或多個修飾：上莖區；髮夾1區；及髮夾2區，其中5'端修飾在5'末端的前七個核苷酸內包含至少兩個硫代磷酸酯鍵聯。
在一些實施例中，提供gRNA，其在以下中之一或多者中包含5'端修飾及一或多個修飾：上莖區；髮夾1區；及髮夾2區，其中5'端修飾在5'端處包含一或多個硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，一或多個硫代磷酸酯鍵使5'末端核苷酸連接。
在一些實施例中，提供gRNA，其在以下中之一或多者中包含5'端修飾及一或多個修飾：上莖區；髮夾1區；及髮夾2區，其中5'端修飾在5'末端的前七個核苷酸內包含一或多個硫代磷酸酯鍵聯。
在一些實施例中，本發明包含gRNA，其包含SEQ ID NO: 201-294或301-394之經修飾序列中之任一者，其中gRNA進一步包含與目標序列至少部分互補且視情況將Cas9導向至其目標以進行裂解之5'引導區。
在一些實施例中，本發明包含gRNA，其包含與SEQ ID NO: 1-98、201-294、401-494、601-698或801-875中之任一者之核苷酸具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70%一致性之核苷酸，其中修飾模式與參考序列識別符中所示之修飾模式一致。亦即，核苷酸A、U、C及G相較於序列中所示可相差99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70%，但修飾保持不變。
在一些實施例中，提供gRNA，其在所提及之核苷酸存在於引導物中的情況下在以下處包含經2'-O-Me修飾之核苷酸：5'末端中之前三個核苷酸；下莖中之LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12；隆突區中之B1及B2；上莖區中之各核苷酸；連接區中之N16、N17及N18；髮夾1區中之各核苷酸；髮夾1與髮夾2之間的一個核苷酸；髮夾2區中之各核苷酸；及3'末端處之最後四個核苷酸。在一些實施例中，sgRNA進一步包含5'末端處之前四個核苷酸之間的三個PS鍵及3'末端處之最後四個核苷酸之間的三個PS鍵。
在一些實施例中，提供gRNA，其在所提及之核苷酸存在於引導物中的情況下在以下處包含經2'-O-Me修飾之核苷酸：5'末端中之前三個核苷酸；下莖中之LS1、LS6、LS7、LS8、LS11及LS12；隆突區中之B1至B6；上莖區中之各核苷酸；連接區中之N16、N17及N18；髮夾1區中之各核苷酸；髮夾1與髮夾2之間的一個核苷酸；髮夾2區中之各核苷酸；及3'末端處之最後四個核苷酸。在一些實施例中，sgRNA進一步包含5'末端處之前四個核苷酸之間的三個PS鍵及3'末端處之最後四個核苷酸之間的三個PS鍵。
在一些實施例中，提供gRNA，其在以下處包含經2'-F修飾之核苷酸：下莖中之LS9及LS10；連接區中之15-N18；髮夾2區中之H2-9至HS-15；及3'末端區中之倒數第二個、倒數第三個及倒數第四個核苷酸。
在一些實施例中，提供gRNA，其在以下處包含經2'-F修飾之核苷酸，下莖中之各核苷酸；連接區中之15-N18；髮夾2區中之H2-9至HS-15；及3'末端區中之倒數第二個、倒數第三個及倒數第四個核苷酸。
在一些實施例中，提供一種gRNA，其在所提及之核苷酸存在於引導物中的情況下包含：在LS8、LS10、LS12、H1-2、H1-4、H1-6、H1-8、H1-10、H1-12、H2-1、H2-3、H2-5、H2-7、H2-9、H2-11、H2-13、H2-15處之經2'-OMe修飾之核苷酸及在3'末端處之最後一個及倒數第三個核苷酸；及在LS7、LS9、LS11、H1-1、H1-3、H1-5、H1-7、H1-9、H1-11、H1-13、H2-2、H2-4、H2-6、H2-8、H2-10、H2-12、H2-14處之2'-F修飾及在3'末端處之倒數第二個及倒數第四個核苷酸。
前述修飾模式中之任一者可以與上文(例如發明內容章節或表1中)所述之實施例中所闡述的修飾模式組合(在其不重疊的範圍內)。在前述修飾模式與發明內容章節或表1A中所闡述之修飾模式之組合將引起不相容修飾(例如同一位置將為2'-OMe與2'-氟)的情況下，以發明內容章節或表1A中所闡述的修飾為準。 sgRNA；其域/區
在一些實施例中，本文所提供之gRNA為sgRNA。Briner AE 等人,Molecular Cell 56:333-339 (2014)描述sgRNA之功能域，在本文中稱為「域」，包括負責靶向之「間隔」域、「下莖」、「隆突」、「上莖」 (其可包括四環)、「連接」及「髮夾1」及「髮夾2」域。參見Briner等人，第334頁，圖1A。如本文中其他地方詳細描述，一或多個域(例如髮夾1及/或上莖)可在本文所述之sgRNA中縮短。
表3提供如本文所用之sgRNA的域示意圖。在表3中，區之間的「n」表示核苷酸的可變數目，例如0至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大。在一些實施例中，n等於0。在一些實施例中，n等於1。 5'末端區
在一些實施例中，sgRNA包含位於5'末端處的核苷酸，如表3中所示。在一些實施例中，sgRNA之5'末端包含間隔子或引導區，其功能為將Cas蛋白(例如Cas9蛋白)導引至目標核苷酸序列。在一些實施例中，5'末端不包含引導區。在一些實施例中，5'末端包含間隔子及功能不為將Cas蛋白導引至目標核苷酸區域之其他核苷酸。 下莖
在一些實施例中，sgRNA包含當線性地查看時由隆突區及上莖區分離之下部莖(LS)區。參見表3。
在一些實施例中，下莖區包含1至12個核苷酸，例如在一個實施例中，下莖區包含LS1至LS12。在一些實施例中，下莖區包含的核苷酸比表3中所示更少。在一些實施例中，下莖區包含的核苷酸比表3中所示更多。當下莖區包含的核苷酸比表3之示意圖中所示更少或更多時，應維持如熟習此項技術者將顯而易見之修飾模式。
在一些實施例中，當以相反方向讀取時，下莖區具有核酸序列互補之核苷酸。在一些實施例中，下莖之核酸序列中之互補性產生sgRNA中之莖的二級結構(例如該等區可彼此鹼基配對)。在一些實施例中，當以相反方向讀取時，下莖區彼此可不完全互補。 隆突
在一些實施例中，sgRNA包含隆突區，其包含六個核苷酸B1-B6。當線性地查看時，隆突區分為兩個區。參見表3。在一些實施例中，隆突區包含六個核苷酸，其中前兩個核苷酸之後為上莖區，之後為隆突之最後四個核苷酸。在一些實施例中，隆突區包含的核苷酸比表3中所示更少。在一些實施例中，隆突區包含的核苷酸比表3中所示更多。當隆突區包含的核苷酸比表3之示意圖中所示更少或更多時，應維持如熟習此項技術者將顯而易見之修飾模式。
在一些實施例中，隆突之存在導致sgRNA中之上莖模組與下莖模組之間的定向扭結。 上莖
在一些實施例中，上莖區為經縮短上莖區，諸如本文其他地方描述之經縮短上莖區中之任一者。
在其他實施例中，sgRNA包含上莖區，其包含12個核苷酸。在一些實施例中，上莖區包含環序列。在一些情況下，環為四環(由四個核苷酸組成之環)。在一些實施例中，上莖區包含的核苷酸比表3中所示更多。
當上莖區包含的核苷酸比表3之示意圖中所示更少或更多時，應維持如熟習此項技術者將顯而易見之修飾模式。
在一些實施例中，當以相反方向讀取時，上莖區具有核酸序列互補之核苷酸。在一些實施例中，上莖區之核酸序列中之互補性產生sgRNA中之莖的二級結構(例如該等區可彼此鹼基配對)。在一些實施例中，當以相反方向讀取時，上莖區彼此可以不完全互補。 連接
在一些實施例中，sgRNA包含位於下莖區與髮夾1區之間的連接區。在一些實施例中，連接區包含18個核苷酸。在一些實施例中，連接區包含如表3中所示之核苷酸N1至N18。在一些實施例中，連接區包含取代(例如在位置N18)或缺乏核苷酸，諸如具有取代或缺乏本文中其他地方詳細描述之核苷酸的連接區中之任一者。
在一些實施例中，連接區包含的核苷酸比表3中所示更少。在一些實施例中，連接區包含的核苷酸比表3中所示更多。當連接區包含的核苷酸比表3之示意圖中所示更少或更多時，應維持如熟習此項技術者將顯而易見之修飾模式。
在一些實施例中，當以相反方向讀取時，連接區具有核酸序列互補之核苷酸。在一些實施例中，核酸序列中之互補性產生sgRNA中之莖及/或莖環之二級結構(例如連接區中之某些核苷酸可彼此鹼基配對)。在一些實施例中，當以相反方向讀取時，連接區彼此可以不完全互補。 髮夾
在一些實施例中，sgRNA包含一或多個髮夾區。在一些實施例中，髮夾區位於連接區下游(例如距其3')。在一些實施例中，將緊接著連接區下游之核苷酸之區稱為「髮夾1」或「H1」。在一些實施例中，將距髮夾1為3'之核苷酸之區稱為「髮夾2」或「H2」。在一些實施例中，髮夾區包含髮夾1與髮夾2。在一些實施例中，sgRNA包含髮夾1或髮夾2。
在一些實施例中，髮夾1區為經縮短髮夾1區，諸如本文其他地方描述之經縮短髮夾1區中之任一者。
在其他實施例中，髮夾1區包含12個緊鄰連接區下游之核苷酸。在一些實施例中，髮夾1區域包含如表3中所示之核苷酸H1-1至H1-12。
在一些實施例中，髮夾2區包含15個在髮夾1區下游之核苷酸。在一些實施例中，髮夾2區包含如表3中所示之核苷酸H2-1至H2-15。
在一些實施例中，一或多個核苷酸存在於髮夾1區與髮夾2區之間。髮夾1區與髮夾2區之間的一或多個核苷酸可經修飾或未經修飾。在一些實施例中，髮夾1與髮夾2藉由一個核苷酸分離。在一些實施例中，髮夾區包含的核苷酸比表3中所示更少。在一些實施例中，髮夾區包含的核苷酸比表3中所示更多。當髮夾區包含的核苷酸比表3之示意圖中所示更少或更多時，應維持如熟習此項技術者將顯而易見之修飾模式。
在一些實施例中，當以相反方向讀取時，髮夾區具有核酸序列互補之核苷酸。在一些實施例中，當以相反方向讀取時，髮夾區彼此可不完全互補(例如髮夾之頂部或環包含不成對核苷酸)。
在一些實施例中，sgRNA包含經核苷酸「n」置換髮夾1區，其中「n」為介於1與50、40、30、20、15、10、5、4、3及2之間的整數。在一些實施例中，sgRNA之髮夾1區經2個核苷酸置換。 3'末端
sgRNA具有3'端，其為sgRNA之最後一個核苷酸。3'末端區包括3'端的最後1至7個核苷酸。在一些實施例中，3'端為髮夾2之末端。在一些實施例中，sgRNA包含髮夾區之後的核苷酸。在一些實施例中，sgRNA包括3'尾區域，在此情況下，3'尾之最後一個核苷酸為3'末端。在一些實施例中，3'尾包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個或更多個核苷酸，例如與髮夾之二級結構不締合的核苷酸。在一些實施例中，3'尾區包含1、2、3或4個與髮夾之二級結構不締合之核苷酸。在一些實施例中，3'尾區包含4個與髮夾之二級結構不締合之核苷酸。在一些實施例中，3'尾區包含1、2或3個與髮夾之二級結構不締合之核苷酸。表 2 (spyCas9 sgRNA 之保守部分； SEQ ID NO: 400)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
G U U U U A G A G C U A G A A A U A G C A A G U U A A A A U
LS1-LS6 B1-B2 US1-US12 B2-B6 LS7-LS12
31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
A A G G C U A G U C C G U U A U C A A C U U G A A A A A G U
   H1-1至H1-12
61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76
G G C A C C G A G U C G G U G C
N H2-1至H2-15
表 3 (sgRNA 之區 ( 線性視圖 ， 5' 至 3')
   LS1-6    B1 -2    US1-12    B3-6   
5' 末端 (n) 下莖 n 隆突 n 上莖 n 隆突 n
LS7-12    N1-18    H1-1至H1-12    H2-1至H2-15   
下莖 n    n 髮夾1 n 髮夾2 3'末端
組合物及套組
涵蓋包含本文所述之任一種gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)及載劑、賦形劑、稀釋劑或其類似物的組合物。在一些情況下，賦形劑或稀釋劑呈惰性。在一些情況下，賦形劑或稀釋劑不呈惰性。在一些實施例中，提供一種醫藥調配物，其包含本文所述之任一種gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑或其類似物。在一些實施例中，醫藥調配物進一步包含LNP。在一些實施例中，醫藥調配物進一步包含Cas9蛋白或編碼Cas9蛋白的mRNA。在一些實施例中，醫藥調配物包含gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)、LNP及Cas9蛋白或編碼Cas9蛋白之mRNA中之任一者或多者。
亦提供包含本文所述之一或多種gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)、組合物或醫藥調配物的套組。在一些實施例中，套組進一步包含溶劑、溶液、緩衝液(各自與組合物或醫藥調配物分開)、說明書或乾燥劑中之一或多者。 包含經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之mRNA的組合物
在一些實施例中，提供組合物或醫藥調配物，其包含至少一種本文所述之gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)及經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸(例如mRNA)。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為Cas蛋白。在一些實施例中，gRNA連同Cas蛋白或編碼Cas蛋白之核酸(例如mRNA)被稱為Cas RNP。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為與gRNA起作用以將經RNA引導之DNA結合劑導引至目標核酸序列之結合劑。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為來自II型CRISPR/Cas系統的Cas蛋白。在一些實施例中，Cas蛋白為Cas9。在一些實施例中，Cas9蛋白為野生型Cas9。在一些實施例中，Cas9蛋白來源於釀膿鏈球菌Cas9蛋白，例如釀膿鏈球菌Cas9 (sypCas9)。在一些實施例中，提供包含至少一種gRNA及核酸酶或編碼spyCas9之mRNA的組合物。在一些實施例中，Cas9蛋白不來源於釀膿鏈球菌，但以與釀膿鏈球菌Cas9相同的方式發揮功能，以便對釀膿鏈球菌Cas9具有特異性的gRNA將非釀膿鏈球菌Cas9導引至其目標位點。在一些實施例中，Cas9蛋白來源於金黃色葡萄球菌Cas9蛋白，例如SaCas9。在一些實施例中，提供包含至少一種gRNA及核酸酶或編碼saCas9之mRNA的組合物。在一些實施例中，Cas誘導目標DNA發生雙股斷裂。本文所述之實施例涵蓋spyCas9及saCas9蛋白之等效物。
經RNA引導之DNA結合劑(包括Cas9)涵蓋經修飾者及其變異體。具有一個非活性催化域(RuvC或HNH)之經修飾形式稱為「切口酶」。切口酶僅切割目標DNA上之一個股，因此產生單股斷裂。單股斷裂亦可稱為「鏈裂」。在一些實施例中，組合物及方法包含切口酶。在一些實施例中，組合物及方法包含經切口酶RNA引導之DNA結合劑，諸如切口酶Cas9，其誘導目標DNA出現切口，而非雙股斷裂。
在一些實施例中，核酸酶(例如經RNA引導之DNA結合劑)可經修飾而僅含有一個功能核酸酶域。舉例而言，經RNA引導之DNA結合劑可經修飾以使得一個核酸酶域發生突變或完全或部分缺失以降低其核酸裂解活性。在一些實施例中，使用具有活性降低之RuvC域之切口酶Cas。在一些實施例中，使用具有非活性RuvC域之切口酶Cas。在一些實施例中，使用具有活性降低之HNH域之切口酶Cas。在一些實施例中，使用具有非活性HNH域之切口酶Cas。
在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑核酸酶域內之保守胺基酸經取代以減少或改變核酸酶活性。在一些實施例中，Cas蛋白可在RuvC或RuvC樣核酸酶域中包含胺基酸取代。RuvC或RuvC樣核酸酶域中之例示性胺基酸取代包括D10A (基於釀膿鏈球菌Cas9蛋白)。在一些實施例中，Cas蛋白可包含HNH或HNH樣核酸酶域中之胺基酸取代。HNH或HNH樣核酸酶域中之例示性胺基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A及D986A (基於spyCas9蛋白)。
在一些實施例中，本文所述之RNP複合物包含切口酶或編碼切口酶之mRNA及與目標序列之有義股及反義股分別互補的一對gRNA (其中之一或兩者可為sgRNA)。在此實施例中，gRNA (例如sgRNA)將切口酶導引至目標序列且藉由在目標序列之對置股上產生切口(亦即，雙重切口)來引入雙股斷裂(DSB)。在一些實施例中，使用雙重切口可改良特異性且減少脫靶效應。在一些實施例中，經切口酶RNA引導之DNA結合劑連同兩種單獨gRNA (例如sgRNA)一起使用，該等gRNA經選擇以緊密接近，從而在目標DNA中產生雙重切口。
在一些實施例中，使用嵌合Cas蛋白，其中該蛋白質之一個域或區經不同蛋白質之一部分替代。在一些實施例中，Cas核酸酶域可經來自諸如Fok1之不同核酸酶的域置換。在一些實施例中，Cas蛋白可為經修飾之核酸酶。
在一些實施例中，Cas蛋白包含融合蛋白，其包含連接至異源功能域之無催化活性Cas9 (例如Cas9)(參見例如WO2014152432)。在一些實施例中，無催化活性Cas9來自釀膿鏈球菌。在一些實施例中，無催化活性Cas包含使Cas不活化的突變。在一些實施例中，異源功能域為調節基因表現、組蛋白或DNA的域。在一些實施例中，異源功能域為轉錄活化域或轉錄抑制因子域。在一些實施例中，核酸酶為無催化活性Cas核酸酶，諸如dCas9。
在一些實施例中，目標序列可鄰近於PAM。在一些實施例中，PAM可鄰近於或位於目標序列之3'端之1、2、3或4個核苷酸內。PAM之長度及序列可視所用Cas蛋白而定。舉例而言，PAM可選自特定Cas9蛋白或Cas9直系同源物之共有或特定PAM序列，包括Ran等人, Nature 520:186-191 (2015)之圖1中所揭示的彼等物。在一些實施例中，PAM可包含2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸長度。非限制性例示性PAM序列包括NGG、NAG、NGA、NGAG、NGCG、NNGRRT、TTN、NGGNG、NG、NAAAAN、NNAAAAW、NNNNACA、GNNNCNNA及NNNNGATT (其中N經定義為任何核苷酸，且W經定義為A或T，且R經定義為A或G)。在一些實施例中，PAM序列可為NGG。在一些實施例中，PAM序列可為NGGNG。在一些實施例中，PAM序列可為NNAAAAW。
在一些實施例中，異源功能域可促進將經RNA引導之DNA結合劑輸送至細胞核中。舉例而言，異源功能域可為核定位信號(NLS)。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可與1至10個NLS融合。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可與1至5個NLS融合。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可與一個NLS融合。在使用一個NLS之情況下，NLS可在經RNA引導之DNA結合劑序列之N端或C端處融合。其亦可***經RNA引導之DNA結合劑序列內。在其他實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可與多於一個NLS融合。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可與2、3、4或5個NLS融合。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可與兩個NLS融合。在某些情況下，兩個NLS可相同(例如兩個SV40 NLS)或不同。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑與羧基端處之兩個NLS序列(例如SV40)融合。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可與兩個NLS融合，一個NLS在N端處且一個在C端處。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可與3個NLS融合。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑可不與NLS融合。在一些實施例中，NLS可為單聯(monopartite)序列，諸如SV40 NLS、PKKKRKV (SEQ ID NO: 1001)或PKKKRRV (SEQ ID NO: 1002)。在一些實施例中，NLS可為諸如核質蛋白之NLS、KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 1003)之雙聯(bipartite)序列。在特定實施例中，單一PKKKRKV (SEQ ID NO: 1001) NLS可在經RNA引導之DNA結合劑之C端處融合。一或多個連接子視情況包括在融合位點處。
在一些實施例中，使用包含編碼經RNA引導之DNA結合劑之ORF的核酸(例如mRNA)，其具有以下特徵中之一或多者。在一些實施例中，編碼經RNA引導之DNA結合劑(例如Cas9核酸酶，諸如釀膿鏈球菌Cas9)之ORF的腺嘌呤含量的範圍為其最小腺嘌呤含量至其最小腺嘌呤含量之約150%範圍內。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤含量小於或等於其最小腺嘌呤含量之約145%、140%、135%、130%、125%、120%、115%、110%、105%、104%、103%、102%或101%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤含量等於其最小腺嘌呤含量。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤含量小於或等於其最小腺嘌呤含量之約150%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤含量小於或等於其最小腺嘌呤含量之約145%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤含量小於或等於其最小腺嘌呤含量之約140%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤含量小於或等於其最小腺嘌呤含量之約135%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤含量小於或等於其最小腺嘌呤含量之約130%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤含量小於或等於其最小腺嘌呤含量之約125%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤含量小於或等於其最小腺嘌呤含量之約120%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤含量小於或等於其最小腺嘌呤含量之約115%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤含量小於或等於其最小腺嘌呤含量之約110%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤含量小於或等於其最小腺嘌呤含量之約105%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤含量小於或等於其最小腺嘌呤含量之約104%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤含量小於或等於其最小腺嘌呤含量之約103%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤含量小於或等於其最小腺嘌呤含量之約102%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤含量小於或等於其最小腺嘌呤含量之約101%。
在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量的範圍為其最小腺嘌呤二核苷酸含量至其最小腺嘌呤二核苷酸含量之200%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量小於或等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量之約195%、190%、185%、180%、175%、170%、165%、160%、155%、150%、145%、140%、135%、130%、125%、120%、115%、110%、105%、104%、103%、102%或101%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量小於或等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量之約200%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量小於或等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量之約195%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量小於或等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量之約190%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量小於或等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量之約185%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量小於或等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量之約180%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量小於或等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量之約175%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量小於或等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量之約170%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量小於或等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量之約165%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量小於或等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量之約160%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量小於或等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量之約155%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量小於或等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量之約150%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量小於或等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量之約145%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量小於或等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量之約140%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量小於或等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量之約135%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量小於或等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量之約130%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量小於或等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量之約125%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量小於或等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量之約120%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量小於或等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量之約115%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量小於或等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量之約110%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量小於或等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量之約105%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量小於或等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量之約104%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量小於或等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量之約103%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量小於或等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量之約102%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量小於或等於其最小腺嘌呤二核苷酸含量之約101%。
在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量的範圍為其最小腺嘌呤二核苷酸含量至編碼與討論中的mRNA相同之蛋白質的參考序列之最大腺嘌呤二核苷酸含量之90%或更低之腺嘌呤二核苷酸含量。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤二核苷酸含量小於或等於編碼與討論中的mRNA相同之蛋白質的參考序列之最大腺嘌呤二核苷酸含量約85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%。
在一些實施例中，ORF之腺嘌呤三核苷酸含量的範圍為0個腺嘌呤三核苷酸至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50個腺嘌呤三核苷酸(其中更長串腺嘌呤以其內之獨特三腺嘌呤區段之數目計數，例如腺嘌呤四核苷酸含有兩個腺嘌呤三核苷酸，腺嘌呤五核苷酸含有三個腺嘌呤三核苷酸等)。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤三核苷酸含量的範圍為0%腺嘌呤三核苷酸至0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.5%或2%腺嘌呤三核苷酸，其中腺嘌呤三核苷酸百分比含量係以形成腺嘌呤三核苷酸(或更長串腺嘌呤)之一部分之腺嘌呤所佔之序列中之位置百分比計算，使得序列UUUAAA及UUUUAAAA各自具有50%之腺嘌呤三核苷酸含量。舉例而言，在一些實施例中，ORF之腺嘌呤三核苷酸含量小於或等於2%。舉例而言，在一些實施例中，ORF之腺嘌呤三核苷酸含量小於或等於1.5%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤三核苷酸含量小於或等於1%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤三核苷酸含量小於或等於0.9%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤三核苷酸含量小於或等於0.8%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤三核苷酸含量小於或等於0.7%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤三核苷酸含量小於或等於0.6%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤三核苷酸含量小於或等於0.5%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤三核苷酸含量小於或等於0.4%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤三核苷酸含量小於或等於0.3%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤三核苷酸含量小於或等於0.2%。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤三核苷酸含量小於或等於0.1%。在一些實施例中，提供一種核酸，其編碼包含不含腺嘌呤三核苷酸之ORF的經RNA引導之DNA結合劑。
在一些實施例中，ORF之腺嘌呤三核苷酸含量的範圍為其最小腺嘌呤三核苷酸含量至編碼與討論中之mRNA相同的蛋白質的參考序列之最大腺嘌呤三核苷酸含量之90%或更低之腺嘌呤三核苷酸含量。在一些實施例中，ORF之腺嘌呤三核苷酸含量小於或等於編碼與討論中的mRNA相同之蛋白質的參考序列之最大腺嘌呤三核苷酸含量的約85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%。
可以降低所給定ORF中之腺嘌呤含量或腺嘌呤二核苷酸含量或腺嘌呤三核苷酸含量，例如藉由在大部分ORF中使用最少腺嘌呤密碼子。舉例而言，可藉由將胺基酸轉化成密碼子而將經RNA引導之DNA結合劑的胺基酸序列轉譯回ORF序列，其中ORF中之一些或全部使用以下所示的例示性最少腺嘌呤密碼子。在一些實施例中，ORF中至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%之密碼子為表4中所列之密碼子。表 4. 例示性最少腺嘌呤密碼子
   胺基酸 最少腺嘌呤密碼子
A 丙胺酸 GCU或GCC或GCG
G 甘胺酸 GGU或GGC或GGG
V 纈胺酸 GUC或GUU或GUG
D 天冬胺酸 GAC或GAU
E 麩胺酸 GAG
I 異白胺酸 AUC或AUU
T 蘇胺酸 ACU或ACC或ACG
N 天冬醯胺 AAC或AAU
K 離胺酸 AAG
S 絲胺酸 UCU或UCC或UCG
R 精胺酸 CGU或CGC或CGG
L 白胺酸 CUG或CUC或CUU
P 脯胺酸 CCG或CCU或CCC
H 組胺酸 CAC或CAU
Q 麩醯胺酸 CAG
F ***酸 UUC或UUU
Y 酪胺酸 UAC或UAU
C 半胱胺酸 UGC或UGU
W 色胺酸 UGG
M 甲硫胺酸 AUG
在一些實施例中，提供一種核酸，其編碼經RNA引導之DNA結合劑，例如Cas9核酸酶，諸如釀膿鏈球菌Cas9，其包含ORF，該ORF由至少約75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%密碼子為表4中所列之密碼子的一組密碼子組成。在一些實施例中，ORF具有最少核苷酸均聚物，例如相同核苷酸之重複串。舉例而言，在一些實施例中，當自表4中所列之密碼子中選擇最少尿苷密碼子時，藉由選擇最少腺嘌呤密碼子以減少核苷酸均聚物之數目及長度(例如丙胺酸選擇GCG代替GCC或甘胺酸選擇GGC代替GGG)來構築核酸。
在任一前述實施例中，核酸可為mRNA。
在一些實施例中，ORF中至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之密碼子為來自表5中所示之密碼子組(例如低U、低A或低A/U密碼子組)的密碼子。低U、低A及低A/U組中之密碼子使用將所指定之核苷酸減至最少之密碼子，同時在超過一個選項可利用的情況下，亦使用對應於高度表現之tRNA的密碼子。在一些實施例中，ORF中至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之密碼子為來自表5中所示之低U密碼子組的密碼子。在一些實施例中，ORF中至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之密碼子為來自表5中所示之低A密碼子組的密碼子。在一些實施例中，ORF中至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之密碼子為來自表5中所示之低A/U密碼子組的密碼子。表 5. 例示性密碼子組
胺基酸 低U 低A 低A/U 長半衰期
Gly GGC GGC GGC GGT
Glu GAG GAG GAG GAA
Asp GAC GAC GAC GAC
Val GTG GTG GTG GTC
Ala GCC GCC GCC GCC
Arg AGA CGG CGG AGA
Ser AGC TCC AGC TCT
Lys AAG AAG AAG AAG
Asn AAC AAC AAC AAC
Met ATG ATG ATG ATG
Ile ATC ATC ATC ATC
Thr ACC ACC ACC ACC
Trp TGG TGG TGG TGG
Cys TGC TGC TGC TGC
Tyr TAC TAC TAC TAC
Leu CTG CTG CTG TTG
Phe TTC TTC TTC TTC
Gln CAG CAG CAG CAA
His CAC CAC CAC CAC
例示性序列
在一些實施例中，編碼經RNA引導之DNA結合劑之ORF包含與SEQ ID NO: 1102-1122、1125、1126或1129-1146中之任一者至少90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的序列；及/或該ORF與SEQ ID NO: 1102-1122、1125、1126或1129-1146中之任一者在至少其前50、200、250或300個核苷酸上至少90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致，或與SEQ ID NO: 1102-1122、1125、1126或1129-1146中之任一者在至少其前30、50、70、100、150、200、250或300個核苷酸上至少95%一致；及/或該ORF由至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%密碼子為表4或5中所列之密碼子的一組密碼子組成；及/或該ORF的腺嘌呤含量在其最小腺嘌呤含量至最小腺嘌呤含量之123%的範圍內；及/或該ORF的腺嘌呤二核苷酸含量在其最小腺嘌呤二核苷酸含量至最小腺嘌呤二核苷酸含量之150%的範圍內。在一些實施例中，編碼經RNA引導之DNA結合劑的聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 1102-1122、1125、1126或1129-1146中之任一者至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的序列。
在一些實施例中，mRNA包含與SEQ ID NO: 1101、1123、1124或1127中之任一者至少90%一致的序列，其中該序列包含編碼經RNA引導之DNA結合劑的ORF。在一些實施例中，mRNA包含與SEQ ID NO: 1101、1123、1124或1127中之任一者至少90%一致的序列，其中該序列包含編碼經RNA引導之DNA結合劑的ORF，其中省去SEQ ID NO: 1101、1123、1124或1127中前三個核苷酸。在一些實施例中，mRNA包含與SEQ ID NO: 1101、1123、1124或1127中之任一者至少90%一致的序列，其中該序列包含編碼經RNA引導之DNA結合劑的ORF，其中省去SEQ ID NO: 1101、1123、1124或1127中前三個核苷酸，及/或SEQ ID NO: 1101、1123、1124或1127內所包含之ORF編碼序列經SEQ ID NO: 1102-1122、1125、1126或1129-1146中之任一者的編碼序列取代。在一些實施例中，前述一致性水準中之任一者為至少95%、至少98%、至少99%或100%。 基因調節方法
在一些實施例中，本文所述之gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)、組合物或醫藥調配物中之任一者或多者係用於製備供治療或預防個體之疾病或病症用的藥劑。
在一些實施例中，本發明包含一種治療或預防個體之疾病或病症的方法，其包含投與本文所述之gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)、組合物或醫藥調配物中之任一者或多者。
在一些實施例中，本發明包含一種修飾目標DNA的方法或用途，其包含投與或遞送本文所述之gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)、組合物或醫藥調配物中之任一者或多者。
在一些實施例中，本發明包含一種調節目標基因的方法或用途，其包含投與或遞送本文所述之gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)、組合物或醫藥調配物中之任一者或多者。在一些實施例中，調節為目標基因編輯。在一些實施例中，調節為改變目標基因所編碼之蛋白質的表現。
在一些實施例中，該方法或用途引起基因編輯。在一些實施例中，該方法或用途引起目標基因內之雙股斷裂。在一些實施例中，該方法或用途引起在DSB之非同源端連接期間形成***缺失突變。在一些實施例中，該方法或用途引起目標基因中之核苷酸***或缺失。在一些實施例中，目標基因中之核苷酸***或缺失引起讀框轉移突變或過早終止密碼子產生非功能蛋白質。在一些實施例中，目標基因中之核苷酸***或缺失引起目標基因表現之阻斷或消除。在一些實施例中，該方法或用途包含DSB之同源定向修復。在一些實施例中，該方法或用途進一步包含將模板遞送至細胞，其中將模板之至少一部分在核酸酶誘導之雙股斷裂位點處或附近併入至目標DNA中。
在一些實施例中，該方法或用途引起基因調節。在一些實施例中，基因調節為基因表現之增加或減少、DNA之甲基化狀態之變化或組蛋白亞單位之修飾。在一些實施例中，該方法或用途引起目標基因所編碼之蛋白質之表現增加或減少。
可以測試gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)在活體外及活體內的功效。在一些實施例中，本發明包含本文所述之gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)、組合物或醫藥調配物中之一或多者，其中gRNA在連同Cas9或編碼Cas9之mRNA一起提供至細胞時會引起基因調節。在一些實施例中，gRNA之功效可在活體外或活體內量測。
在一些實施例中，將包含gRNA之Cas RNP的活性與包含未經修飾之sgRNA或參考sgRNA之Cas RNP的活性進行比較，該參考sgRNA缺乏存在於sgRNA中的修飾，諸如一或多個縮短區及/或YA位點取代。
在一些實施例中，gRNA增加或減少目標蛋白表現之效率係藉由量測目標蛋白之量來測定。
在一些實施例中，遞送Cas9及gRNA之後，藉由存在於基因組中之目標位置之編輯來測定利用特定gRNA進行編輯之效率。在一些實施例中，藉由下一代定序來量測利用特定gRNA進行編輯之效率。在一些實施例中，測定所關注之目標區域之編輯百分比。在一些實施例中，遞送gRNA及Cas9之後，量測所關注之目標區域中存在核苷酸***或缺失之序列讀段之總數目相對於序列讀段總數目。
在一些實施例中，使用特定gRNA進行編輯之效率係根據成功基因編輯所引入之核苷酸***或缺失的存在來量測。在一些實施例中，在生物化學分析中測試Cas9及gRNA之活性。在一些實施例中，在無細胞裂解分析中測試Cas9及gRNA之活性。在一些實施例中，測試Cas9及gRNA在Neuro2A細胞中之活性。
在一些實施例中，在活體內投配包含經修飾之gRNA及Cas蛋白或編碼Cas蛋白之mRNA的LNP之後量測經修飾之gRNA之活性。
在一些實施例中，本文提供之gRNA或組合物之活體內功效係在投與gRNA及Cas9之後根據在自組織(例如肝臟組織)提取之DNA中量測之編輯功效來測定。
在一些實施例中，將sgRNA連同Cas9 mRNA或蛋白質一起(例如調配於LNP中)在活體內給與之後，根據細胞介素之血清濃度來量測個體免疫反應之活化。在一些實施例中，細胞介素為干擾素-α (IFN-α)、介白素6 (IL-6)、單核球趨化蛋白1 (MCP-1)及/或腫瘤壞死因子α (TNF-α)。
在一些實施例中，相較於投與未經修飾之sgRNA，將Cas RNP或Cas9 mRNA與經修飾之gRNA (例如sgRNA或dgRNA)一起投與會引起免疫細胞介素之血清濃度較低。在一些實施例中，本發明包含一種降低個體之免疫細胞介素之血清濃度的方法，其包含投與本文所揭示之任一種gRNA，其中相較於未經類似修飾之對照gRNA，gRNA引起個體血清中之免疫細胞介素濃度較低。 LNP遞送gRNA
脂質奈米粒子(LNP)為遞送核苷酸及蛋白質負荷之熟知方式，且可用於遞送本文所揭示之gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)、組合物或醫藥調配物。在一些實施例中，LNP遞送核酸、蛋白質，或將核酸連同蛋白質一起遞送。
在一些實施例中，本發明包含一種向個體遞送本文所揭示之任一種gRNA (例如sgRNA、dgRNA或crRNA)的方法，其中gRNA與LNP締合。在一些實施例中，gRNA/LNP亦與Cas9或編碼Cas9之mRNA締合。
在一些實施例中，本發明包含一種包含所揭示之任一種gRNA及LNP的組合物。在一些實施例中，組合物進一步包含Cas9或編碼Cas9之mRNA。
在一些實施例中，LNP包含陽離子脂質。在一些實施例中，LNP包含十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，亦稱作(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯。在一些實施例中，LNP包含約4.5之陽離子脂質胺與RNA磷酸酯之莫耳比(N:P)。
在一些實施例中，與本文所揭示之gRNA締合之LNP用於製備供治療疾病或病症用之藥劑。
電穿孔為遞送負荷之熟知手段，且任何電穿孔方法可用於遞送本文所揭示之gRNA中之任一者。在一些實施例中，電穿孔可用於遞送本文所揭示之任一種gRNA及Cas9或編碼Cas9之mRNA。
在一些實施例中，本發明包含一種向細胞離體遞送本文所揭示之gRNA中之任一者之方法，其中該gRNA與LNP締合或不與LNP締合。在一些實施例中，gRNA/LNP或gRNA亦與Cas9或編碼Cas9之mRNA締合。 ***
本說明書及例示性實施例不應視為限制性的。出於本說明書及所附申請專利範圍之目的，除非另外說明，否則表示數量、百分比或比例的所有數字，及說明書及申請專利範圍中所用之其他數值均應理解為在所有情況下藉由術語「約」修飾至其尚未如此修飾的程度。「約」表示實質上不影響所描述主題之特性的變異程度，例如在10%、5%、2%或1%內。因此，除非有相反指示，否則以下說明書及所附申請專利範圍中所闡述之數值參數為可視設法獲得之所需特性而變化的近似值。至少，且不試圖將均等論之應用限於申請專利範圍之範疇，各數值參數至少應根據所報導之有效數位的數目且藉由應用普通捨位技術來解釋。
應注意，如本說明書及申請專利範圍中所用，除非明確地且肯定地限於一個指示物，否則單數形式「一(a/an)」與「該」及任何字語之任何單數使用形式包括複數個指示物。如本文所用，術語「包括」及其文法變化形式意欲具有非限制性，因此清單中之各項的敍述不排除可以取代或添加至所列項中的其他類似項。 實例
提供以下實例以說明某些所揭示實施例且不應視為以任何方式限制本發明之範疇。實例 1 - 初級小鼠肝細胞 (PMH) 中之活體外編輯
如表1A中所示設計靶向小鼠及獼猴TTR基因之短sgRNA，且如下文所提供將其脂質體轉染至初級小鼠肝細胞(PMH)中。解凍PMH (Gibco, 批號793)且再懸浮於具有補充劑(Gibco，目錄號CM7500)之肝細胞解凍培養基中，隨後加以離心。丟棄上清液且將集結之細胞再懸浮於肝細胞平板接種培養基加補充包(Invitrogen，目錄號A1217601及CM3000)中。對細胞進行計數，且將其對於PMH以15,000個細胞/孔之密度平板接種於經Bio-coat膠原蛋白I塗佈之96孔盤(ThermoFisher，目錄號877272)上。使平板接種之細胞在處於37℃及5% CO2 氛圍下之組織培養恆溫箱中靜置且黏附持續5小時。在培育之後，檢查細胞的單層形成且用肝細胞培養基(Takara，目錄號Y20020及/或Invitrogen，目錄號A1217601及CM4000)洗滌一次。使用預混合脂質調配物進行Cas9 mRNA及gRNA之脂質體轉染。脂質體轉染試劑含有莫耳比分別為50:38:9:3之可離子化脂質(十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，亦稱作(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG。將此混合物在100%乙醇中復原，隨後以約6.0之脂質胺與RNA磷酸酯之莫耳比(N:P)與RNA負荷(例如Cas9 mRNA及gRNA)混合。藉由供應商或使用標準活體外合成技術與經修飾之核苷酸化學合成引導RNA。表1B之Cas9 ORF係藉由如WO2019/067910中所描述之活體外轉錄(IVT)產生，參見例如¶ 354，使用2小時IVT反應時間及藉由LiCl沈澱，隨後切向流過濾來純化mRNA。
用6%食蟹獼猴血清及按重量計1:1之gRNA與mRNA之比進行脂質體轉染。
基因組 DNA 分離
在72小時轉染後收集PMH細胞。根據製造商方案，使用50 µL/孔QuickExtract DNA提取溶液(Epicentre，目錄號QE09050)自96孔盤之各孔中提取gDNA。
用於編輯效率之下一代定序 ( 「 NGS 」 ) 及分析
為了定量地測定基因組中之目標位置處之編輯效率，使用定序來鑑別藉由基因編輯引入之***及缺失的存在。圍繞所關注基因(例如TTR)內之目標位點設計PCR引子，且擴增所關注基因組區域。進行引子序列設計作為本領域中之標準。
根據製造商之方案(Illumina)進行其他PCR以添加化學物質來進行定序。擴增子經Illumina MiSeq儀器定序。在消除具有低品質評分之讀段之後，將讀段與參考基因組(例如hg38)比對。將含有該等讀段之所得檔案映射至參考基因組(BAM檔案)，其中選擇重疊所關注之目標區之讀段，且計算野生型讀段之數目相對於含有***或缺失(「***缺失(indel)」)之讀段之數目。
編輯百分比(例如「編輯效率」或「編輯%」)經定義為具有***或缺失(「***缺失」)之序列讀段之總數目除以包括野生型之序列讀段之總數目。
在一式兩份樣本中進行編輯效率對引導物濃度之劑量反應。表6展示在各引導物濃度及所計算之EC50 值下之平均及標準差(SD)編輯。
表6 - 初級小鼠肝細胞中之編輯
引導物 EC50 (nM) SEM 引導物濃度(nM) 平均編輯% SD
G013772 38.0 n/d 150 3% 0%
75 5% 2%
38 2% 1%
19 1% 0%
9 0% 0%
5 0% 0%
2 0% 0%
G013773 12.7 1.4 150 96% 2%
75 96% 4%
38 90% 1%
19 72% 5%
9 42% 7%
5 28% 7%
2 20% 10%
G013774 n/d n/d 150 2% 0%
75 3% 0%
38 1% 0%
19 1% 0%
9 0% 0%
5 0% 0%
2 0% 0%
G013775 n/d n/d 150 0% 0%
75 0% 0%
38 0% 0%
19 0% 0%
9 0% 0%
5 0% 0%
2 0% 0%
G013776 10.1 1.9 150 96% 0%
75 94% 0%
38 89% 6%
19 71% 11%
9 52% 16%
5 25% 9%
2 15% 11%
G010039 13.4 2.0 150 83% 0%
75 81% 3%
38 72% 0%
19 53% 22%
9 32% 10%
5 12% 6%
2 6% 1%
G012402 7.9 0.8 150 86% 0%
75 86% 1%
38 81% 7%
19 73% 6%
9 60% 6%
5 33% 6%
2 23% 4%
G012401 8.5 1.1 150 97% 0%
75 94% 1%
38 89% 2%
19 82% 2%
9 61% 14%
5 33% 12%
2 23% 7%
實例2 - 初級食蟹獼猴肝細胞(PCH)中缺失系列之活體外編輯
如表1A中所示設計靶向小鼠及食蟹獼猴TTR基因之其他sgRNA且將其脂質體轉染至初級食蟹獼猴肝細胞(PCH)中。除非另外指出，否則如上文所描述製備、處理及分析細胞。具體而言，使用來自Vitro ADMET Laboratories, Inc. 批號10281011之PCH細胞且將其以50,000個細胞/孔之密度平板接種。除了單獨分析之G015651以外，分析中包括重複樣本。具有標準差之平均編輯結果展示於表7及圖2中。 表7 - PCH中之活體外編輯
引導物 平均編輯% SD 引導物 平均編輯% SD 引導物 平均編輯% SD
G015631 38.3% 14.9% G015656 31.1% 11.2% G015680 1.9% 0.4%
G015632 41.4% 14.5% G015656 25.6% 8.3% G015681 1.5% 0.1%
G015633 41.5% 2.8% G015657 12.0% 6.7% G015682 1.2% 0.1%
G015634 5.4% 3.6% G015658 13.2% 10.4% G015683 1.0% 0.1%
G015635 57.0% 7.8% G015659 6.5% 6.4% G015684 1.1% 0.4%
G015636 57.3% 8.8% G015660 10.3% 6.4% G015685 37.5% 8.9%
G015637 67.1% 8.7% G015661 15.4% 13.4% G015686 42.7% 10.3%
G015638 60.5% 1.3% G015662 8.0% 4.2% G015687 38.8% 21.6%
G015639 65.0% 4.8% G015663 17.5% 9.8% G015688 40.5% 12.0%
G015640 62.5% 2.0% G015664 22.8% 17.7% G015689 25.7% 17.5%
G015641 64.5% 2.1% G015665 36.4% 19.5% G015690 8.2% 6.8%
G015642 69.1% 2.5% G015666 15.9% 14.6% G015691 16.9% 12.9%
G015643 49.0% 5.0% G015667 1.1% 0.4% G015692 50.7% 17.9%
G015644 32.6% 8.8% G015668 1.1% 0.1% G015693 41.9% 8.0%
G015645 3.5% 0.4% G015669 1.5% 0.4% G015694 32.6% 17.2%
G015646 38.4% 17.1% G015670 0.9% 0.1% G015695 43.6% 7.6%
G015647 51.4% 7.4% G015671 14.2% 4.1% G015696 38.7% 12.0%
G015648 55.3% 19.6% G015672 1.7% 0.1% G015697 23.3% 15.8%
G015649 52.5% 2.8% G015673 18.7% 11.2% G015698 44.0% 13.7%
G015650 45.3% 12.3% G015674 4.9% 2.4% G015699 38.4% 19.4%
G015651 44.9% n/a G015675 2.2% 0.1% G015700 0.8% 0.1%
G015652 58.3% 16.3% G015676 3.3% 3.4% G015701 40.0% 21.2%
G015653 53.1% 15.3% G015677 1.4% 0.8% G015702 0.8% 0.1%
G015654 43.2% 16.8% G015678 48.8% 6.5% G000502 47.3% 10.1%
G015655 47.0% 6.3% G015679 5.8% 1.3% G012401 51.4% 13.1%
實例3 - 使用脂質體轉染對PCH中之其他引導物進行活體外編輯
如表1A中所示設計靶向食蟹獼猴TTR基因之sgRNA，其在sgRNA恆定區之不同區中組合缺失或化學修飾。將引導物及Cas9 mRNA經脂質體轉染至初級食蟹獼猴肝細胞(PCH)中。除非另外指出，否則如上文所描述製備、處理及分析細胞。依以50 nM引導物濃度起始的7點2倍劑量反應曲線分析引導物，如表8至9中所示。除了一式四份地分析之G000502以外，分析中包括重複樣本。EC50 值及平均編輯結果展示於表8至表9中。劑量反應曲線繪製於圖3A及圖3B中。
表8 - 使用脂質體轉染在PCH 中之編輯效率
引導物 EC50 EC50 SEM 引導物濃度(nM) 平均編輯% SD
G000502 5.3 0.2 100 87.6 2.1
50 85.1 2.4
25 81.1 1.9
12.5 72.4 1.0
6.25 51.8 2.7
3.125 24.8 2.1
1.563 11.5 3.1
0.781 5 0.4
G012401 6.8 0.4 100 86.9 2.7
50 84.1 2.9
25 77.4 0.2
12.5 61.7 3.8
6.25 45.1 0.7
3.125 17.8 1.5
1.563 10.8 2.4
0.781 4.2 1.4
G009978 12.5 0.6 100 87.2 3.4
50 82.3 3.8
25 66.5 3.6
12.5 47.0 0.4
6.25 24.7 2.6
3.125 12.4 0.4
1.563 4.6 0
0.781 2.3 0.2
G017275 7.0 0.3 100 82.2 7.3
50 84.2 n/a
25 78.1 3.2
12.5 64.8 1.7
6.25 39.5 2.3
3.125 18.0 2.4
1.563 9.6 0.6
0.781 5.6 0.4
G015642 12.5 0.8 100 87.6 0.9
50 83.2 0.4
25 66.5 1.9
12.5 45.3 0.2
6.25 29.9 0.1
3.125 11.6 4.0
1.563 5.2 0.4
0.781 2.5 0.7
G015648 16.5 0.7 100 87.8 3.1
50 78.6 1.2
25 60.8 2.9
12.5 37.6 1.6
6.25 18.3 2.6
3.125 6.6 1.6
1.563 3.2 1.0
0.781 2.2 0.7
G015652 10.7 0.5 100 85.9 3.3
50 86 2.5
25 73.1 0.9
12.5 49.5 2.6
6.25 29.5 0.2
3.125 10.5 0.4
1.563 5.6 0.5
0.781 3.4 1.5
G015653 20.2 0.4 100 80.7 0.7
50 72.6 0.1
25 50.7 1.4
12.5 26.3 0.7
6.25 11.0 1.0
3.125 3.7 0.1
1.563 2.1 0.6
0.781 1.2 0
G015655 30.0 0.8 100 71.6 1.4
50 59.2 1.9
25 30.7 1.3
12.5 10.5 0.3
6.25 5.2 0.2
3.125 2.3 0.1
1.563 1.0 0.3
0.781 0.7 0.2
表9 - 使用脂質體轉染在PCH 中之編輯效率
引導物 EC50 EC50 SEM 引導物濃度 (nM) 平均編輯% SD
G000502 5.9 0.5 50 75.2 4.4
25 71.5 3.7
12.5 61.4 6.6
6.25 40.6 10.6
3.125 19 2.9
1.563 7.6 0.3
0.781 3 0.6
G017276 6.2 1.0 50 73.9 12.4
25 68.6 2.3
12.5 55.7 2.0
6.25 42.0 2.2
3.125 24.1 0.7
1.563 12.3 0.7
0.781 7.5 2.3
G017277 5.9 1.2 50 69.7 0.7
25 70.5 14.0
12.5 52.2 0.1
6.25 39.9 6.1
3.125 23.7 4.3
1.563 9.5 1.7
0.781 4.6 1.8
G017278 6.5 0.8 50 71.8 8.9
25 70.8 4.5
12.5 61.9 11.8
6.25 38.8 5.9
3.125 17.3 1.8
1.563 11.9 4.4
0.781 6.6 3.7
G017279 7.0 1.5 50 69.8 1.9
25 67.0 16.1
12.5 53.4 0.2
6.25 35.4 1.9
3.125 24.0 3.7
1.563 11.9 5.9
0.781 7.9 0.5
G017280 11.8 2.9 50 79.7 5.0
25 67.3 13.3
12.5 47.4 3.2
6.25 29.2 0.8
3.125 15.7 2.2
1.563 6.1 1.1
0.781 2.3 0.9
G017281 18.1 8.6 50 74.4 3.6
25 57.9 6.8
12.5 41.0 3.9
6.25 23.9 4.6
3.125 14.7 6.3
1.563 5.1 1.6
0.781 3.3 1.8
G017282 10.3 1.9 50 57.9 2.5
25 71.1 1.6
12.5 36.0 5.6
6.25 21.0 11.5
3.125 10.8 0.5
1.563 3.1 1.7
0.781 1.9 0.9
G017283 15.6 1.4 50 56.1 5.2
25 44.5 0.1
12.5 24.9 4.3
6.25 9.9 0.3
3.125 3.2 0.0
1.563 1.3 0.5
0.781 0.8 0.2
實例4 - 使用脂質奈米粒子對PMH及PCH中之其他引導物進行活體外編輯
如表1A中所示設計靶向小鼠及食蟹獼猴TTR基因之sgRNA，其在sgRNA恆定區之不同區中組合缺失或化學修飾。使用脂質奈米粒子測試此等引導物在初級小鼠及初級食蟹獼猴肝細胞中遞送Cas9 mRNA及sgRNA的功效。
大體而言，以各種莫耳比將脂質奈米粒子組分溶解於100%乙醇中。將RNA負荷(例如Cas9 mRNA及gRNA)溶解於25 mM檸檬酸鹽、100 mM NaCl (pH 5.0)中，產生大致0.45 mg/mL之RNA負荷濃度。用於實例5至6中之LNP含有莫耳比分別為50:38:9:3之可離子化脂質(十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，亦稱作(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG。以約6之脂質胺與RNA磷酸酯之莫耳比(N:P)及按重量計1:2之gRNA與mRNA之比調配LNP。
使用交叉流技術，利用將含有脂質之乙醇與兩個體積之RNA溶液及一個體積之水進行衝擊射流混合來製備LNP。經由混合十字管使脂質於乙醇中之混合物與兩個體積之RNA溶液混合。經由線內T形件使第四水流與十字管之輸出流混合(參見WO2016010840圖2)。將所得LNP在室溫下保持1小時且進一步用水(大約1:1 v/v)稀釋。使用PD-10脫鹽管柱(GE)將經稀釋之LNP緩衝交換至50 mM Tris、45 mM NaCl、5% (w/v)蔗糖(pH 7.5) (TSS)中。所得混合物接著使用0.2 μm無菌過濾器過濾且視情況進一步稀釋。最終LNP在4℃或-80℃下儲存直至進一步使用。
在劑量反應分析中，在PMH及PCH上測試sgRNA之脂質奈米粒子(LNP)調配物。分別如實例1及實例2中製備PMH及PCH。另外，在37℃，5% CO2 下培育細胞24小時，隨後用LNP處理。在37℃下在含有6%胎牛血清(FBS)之培養基中培育LNP 10分鐘。培育後，依以300 ng Cas9 mRNA起始的8點3倍劑量反應曲線，將LNP添加至小鼠或食蟹獼猴肝細胞中。處理後96小時溶解細胞以進行NGS分析，如實例1中所述。分析中包括重複樣本。PMH之EC50 值及平均編輯結果展示於表10中且繪製為圖4A及圖4B中之劑量反應曲線。PCH之EC50 值及平均編輯結果展示於表11A中且繪製為圖5A及圖5B中之劑量反應曲線。
相較於使用基於轉染之遞送方法(稱為脂質體轉染)的以上實驗，LNP中之引導物的精確調配達成較低EC50 及較高編輯%。 表10
表10 - 使用脂質奈米粒子在PMH 中之活體外編輯
引導物 EC50 EC50 SEM 引導物濃度(nM) 平均編輯% SD
G000502 1.54 0.03 46.56 97.0 0.1
23.28 97.7 1.0
11.64 97.8 0.1
5.82 96.2 0.1
2.91 82.7 1.8
1.46 45.6 4.8
0.73 10.5 1.8
0.36 2.1 0.2
G017275 1.61 0.02 46.56 98.1 0.2
23.28 98.1 0.1
11.64 98.3 0.6
5.82 95.3 0.3
2.91 82.1 2.1
1.46 42.7 0.7
0.73 12.6 0.7
0.36 2.1 0.6
G015648 1.38 0.02 46.56 97.8 0.1
23.28 98.1 0.1
11.64 97.9 0.3
5.82 96.4 0.4
2.91 88.1 1.2
1.46 52.7 0.5
0.73 18.2 0.4
0.36 4.1 0.3
G015652 2.17 0.03 46.56 97.9 0.3
23.28 98.4 0.0
11.64 98.0 0.4
5.82 92.4 1.5
2.91 66.4 0.6
1.46 26.8 0.1
0.73 5.1 1.2
0.36 1.1 0.1
G015653 2.31 0.04 46.56 97.7 0.0
23.28 98.0 0.6
11.64 96.9 1.2
5.82 91.3 2.0
2.91 62.1 0.4
1.46 23.8 1.9
0.73 3.8 0.1
0.36 0.8 0.1
G015655 4.09 0.03 46.56 97.7 1.0
23.28 97.9 0.6
11.64 95.2 0.1
5.82 72.8 0.5
2.91 26.6 1.3
1.46 4.6 0.4
0.73 0.9 0.1
0.36 0.4 0.1
G017281 1.32 0.02 46.56 98.1 0.4
23.28 98.4 0.2
11.64 98.4 0.9
5.82 96.4 0.2
2.91 87.9 2.8
1.46 56.3 0.2
0.73 17.6 1.8
0.36 4.7 1.1
G017282 2.00 0.03 46.56 97.9 0.4
23.28 98.2 0.2
11.64 97.4 0.6
5.82 93.3 0.0
2.91 70.7 2.3
1.46 30.5 1.8
0.73 6.8 1.1
0.36 1.4 0.2
G017283 3.63 0.03 46.56 97.7 0.4
23.28 97.6 0.4
11.64 95.4 0.8
5.82 78.1 1.8
2.91 34.0 1.1
1.46 7.1 0.8
0.73 1.2 0.1
0.36 0.4 0.2
G000502 1.56 0.02 46.56 97.2 0.1
23.28 97.5 0.7
11.64 97.8 0.3
5.82 96.0 0.0
2.91 81.7 2.3
1.46 44.7 1.4
0.73 13.2 1.7
0.36 2.6 0.2
G012401 1.14 0.02 46.56 98.1 0.2
23.28 98.7 0.2
11.64 98.6 0.1
5.82 97.1 0.4
2.91 90.3 1.4
1.46 64.5 1.9
0.73 25.3 0.8
0.36 6.7 0.0
G009978 1.68 0.02 46.56 97.9 0.5
23.28 98.6 0.1
11.64 97.6 0.4
5.82 93.5 0.4
2.91 75.8 1.2
1.46 41.4 1.3
0.73 11.3 0.4
0.36 2.5 0.1
G015642 1.24 0.03 46.56 98.2 0.2
23.28 98.3 0.4
11.64 97.8 0.5
5.82 96.0 0.3
2.91 88.4 0.1
1.46 57.4 0.5
0.73 24.5 2.8
0.36 6.2 0.8
G017276 1.09 0.02 46.56 97.7 0.9
23.28 98.7 0.4
11.64 98.5 0.1
5.82 96.8 1.2
2.91 89.0 0.6
1.46 65.8 1.9
0.73 28.5 1.1
0.36 8.2 1.0
G017277 1.12 0.03 46.56 98.5 0.3
23.28 98.4 0.0
11.64 98.2 0.6
5.82 96.9 0.1
2.91 90.7 0.6
1.46 63.1 0.6
0.73 29.6 3.2
0.36 8.4 1.3
G017278 1.22 0.02 46.56 97.8 0.8
23.28 98.7 0.2
11.64 97.7 0.1
5.82 96.8 0.1
2.91 88.6 0.3
1.46 59.8 2.8
0.73 23.8 0.7
0.36 6.6 0.7
G017280 1.27 0.03 46.56 98.6 0.0
23.28 98.6 0.1
11.64 98.3 0.5
5.82 96.4 0.6
2.91 89.8 0.8
1.46 56.8 1.3
0.73 24.5 0.6
0.36 6.6 0.8
表11A - 使用脂質奈米粒子在PCH 中之活體外編輯
引導物 EC50 (nM) EC50 SEM 引導物濃度(nM) 平均編輯% SD
G000502 2.70 0.17 46.56 80.8 0.84853
23.28 83.475 5.48008
11.64 80.3 4.59619
5.82 73.825 2.22739
2.91 43.75 7.99031
1.46 18.65 5.44472
0.73 4.8 1.48492
0.36 1.525 0.45962
G017275 2.09 0.11 46.56 78.6 4.52548
23.28 82.55 3.74767
11.64 n/d n/d
5.82 76.1 1.69706
2.91 56.3 3.25269
1.46 24.45 5.44472
0.73 7.8 1.13137
0.36 2.1 0.70711
G015648 1.80 0.15 46.56 80.85 10.2531
23.28 83.85 8.27315
11.64 79.7 0.42426
5.82 75.45 2.19203
2.91 60.95 1.62635
1.46 32.2 3.25269
0.73 11.05 2.47487
0.36 3.4 1.41421
G015652 3.30 0.19 46.56 86.3 1.69706
23.28 79.05 4.17193
11.64 77.6 6.78823
5.82 62.6 0
2.91 37.35 0.91924
1.46 13.9 1.69706
0.73 3.5 1.41421
0.36 1.45 0.3535
G015653 3.11 0.18 46.56 72.05 3.04056
23.28 71.6 9.05097
11.64 76.35 3.88909
5.82 62.55 0.91924
2.91 34.2 2.96985
1.46 9.85 1.62635
0.73 3.55 0.49498
0.36 1.1 0.56569
G015655 5.59 0.24 46.56 74.45 6.15183
23.28 77.85 2.33345
11.64 67.35 1.3435
5.82 41.2 5.9397
2.91 11.45 0.07071
1.46 3.15 0.3535
0.73 1.55 1.06066
0.36 0.7 0.28284
G017281 1.64 0.11 46.56 75.05 5.58614
23.28 76.35 5.02046
11.64 72.3 6.78823
5.82 76.2 5.79828
2.91 64 5.09117
1.46 32.3 5.79828
0.73 9.05 0.49498
0.36 2.85 0.49498
G017282 3.18 0.24 46.56 82.2 n/a
23.28 85.2 n/a
11.64 78.6 4.66691
5.82 61.95 1.06066
2.91 37.95 0.6364
1.46 19.4 8.34386
0.73 3.4 0.42426
0.36 1.4 0.14142
G017283 5.16 0.23 46.56 74.8 5.79828
23.28 75.75 6.15183
11.64 66.9 3.67696
5.82 45 1.41421
2.91 14.05 1.76777
1.46 3.3 0.42426
0.73 2 0.56569
0.36 1.3 0.56569
G000502 2.44 0.14 46.56 79.1 3.53553
23.28 86.725 0.67175
11.64 83.7 3.67696
5.82 74.225 4.77297
2.91 50.975 3.14663
1.46 19.775 5.05581
0.73 5.875 1.6617
0.36 1.6 0.49498
G012401 1.53 0.08 46.56 83.25 1.90919
23.28 84.8 0.70711
11.64 85.05 6.01041
5.82 78.4 6.6468
2.91 77.2 3.53553
1.46 40 1.13137
0.73 15.9 1.55564
0.36 5.05 0.6364
G009978 2.15 0.08 46.56 81.25 1.3435
23.28 83.85 0.77782
11.64 81.85 2.47487
5.82 74.55 4.59619
2.91 53.9 1.83848
1.46 26.25 0.07071
0.73 7 0.84853
0.36 2.35 0.07071
G015642 1.77 0.07 46.56 84.1 1.69706
23.28 82.6 2.68701
11.64 83.35 3.18198
5.82 76.2 3.81838
2.91 63.2 0.98995
1.46 33.8 1.55564
0.73 12.1 0.98995
0.36 4.2 0
G017276 1.37 0.11 46.56 77.9 3.67696
23.28 83.1 1.69706
11.64 80.1 5.37401
5.82 75.4 3.67696
2.91 65.6 6.92965
1.46 44.8 0.98995
0.73 13.7 1.13137
0.36 4.45 0.91924
G017277 1.50 0.09 46.56 84.1 3.9598
23.28 83.2 2.96985
11.64 81.8 5.09117
5.82 78.6 2.40416
2.91 65.45 1.20208
1.46 40.8 2.68701
0.73 15.1 1.69706
0.36 4.45 0.07071
G017278 1.50 0.08 46.56 85.35 0.21213
23.28 83.65 1.06066
11.64 83.15 0.21213
5.82 78.05 2.33345
2.91 67.7 0.70711
1.46 41.35 7.42462
0.73 12.65 2.33345
0.36 3.95 0.91924
G017280 1.60 0.07 46.56 81.85 0.07071
23.28 86.15 2.6163
11.64 83.75 1.20208
5.82 78.7 3.39411
2.91 66.65 0.6364
1.46 38.65 2.33345
0.73 16.45 1.20208
0.36 5.6 0.14142
如實例1及實例2中所述，利用一些方案修改在劑量反應分析中在PMH及PCH上測試sgRNA之脂質奈米粒子(LNP)調配物。具體而言，使用分別具有補充劑(Invitrogen, William's E (Gibco, 目錄號A1217601))、平板接種補充劑(混合物A及***(Dexamethasone)) (Gibco, 目錄號A15563)、平板接種補充劑(FBS) (Gibco, 目錄號A13450)、保養補充劑(Gibco, 目錄號A15564)之肝細胞培養基來製備PMH (Gibco, 批號839)及PCH (InVitro ADMET Laboratories，批號10361011)。對PCH計數且以30,000個細胞/孔之密度平板接種。在37℃，5% CO2 下培育PMH及PCH 24小時，隨後用LNP處理。使用如上文所述之製程，用替代性混合技術來製備LNP。培育後，依以300 ng Cas9 mRNA起始的8點3倍劑量反應曲線，將LNP添加至小鼠或食蟹獼猴肝細胞中。處理後72小時溶解細胞以進行NGS分析，如實例1中所述。一式兩份或一式三份地對分析中所包括之樣本進行操作且對照重複6次。G000502用作此研究中之基準。PMH之EC50 值及平均編輯結果展示於表11B中且繪製為圖5C及圖5D中之劑量反應曲線。PCH之EC50 值及平均編輯結果展示於表11C中且繪製為圖5E及圖5F中之劑量反應曲線。
表11B - 使用脂質奈米粒子在PMH 中之活體外編輯
引導物 EC50 EC50 SEM 引導物濃度(nM) 平均編輯% SD
G012401 0.18 0.01 46.56 97.5 1.1
15.52 98.3 0.5
5.17 98.0 1.0
1.72 96.1 0.2
0.57 83.4 1.4
0.19 51.5 3.8
0.06 17.6 3.1
0.02 5.1 1.7
G019877 0.638 0.012 46.56 97.2 0.2
15.52 98.2 0.3
5.17 97.1 0.5
1.72 85.2 2.4
0.57 44.6 0.5
0.19 11.5 2.5
0.06 2.9 1.0
0.02 0.5 0.1
G020350 0.225 0.006 46.56 94.3 0.6
15.52 96.6 0.4
5.17 96.7 1.1
1.72 94.9 0.4
0.57 79.7 1.3
0.19 42.3 1.2
0.06 13.3 0.9
0.02 2.8 0.3
G020024 0.158 0.006 46.56 96.0 2.0
15.52 96.6 0.1
5.17 97.1 0.7
1.72 95.7 2.5
0.57 87.2 0.4
0.19 56.6 2.3
0.06 19.3 3.5
0.02 4.8 0.9
G020025 0.278 0.009 46.56 95.4 0.4
15.52 96.8 1.1
5.17 95.0 0.3
1.72 94.7 2.2
0.57 76.4 1.0
0.19 33.9 1.8
0.06 10.9 1.6
0.02 2.4 0.7
G017276 0.297 0.011 46.56 96.9 0.9
15.52 98.1 0.6
5.17 97.2 0.7
1.72 91.9 1.4
0.57 70.5 3.3
0.19 34.1 3.8
0.06 8.1 1.2
0.02 2.1 1.3
G020353 0.322 0.008 46.56 96.9 0.9
15.52 98.1 0.3
5.17 97.8 0.4
1.72 93.6 1.6
0.57 72.0 1.6
0.19 28.7 3.9
0.06 6.8 0.3
0.02 1.4 0.0
G020027 0.338 0.009 46.56 94.5 2.5
15.52 96.1 0.6
5.17 95.7 1.3
1.72 92.2 1.8
0.57 69.3 0.5
0.19 26.7 0.8
0.06 6.0 1.8
0.02 2.0 0.7
G000502 0.448 0.013 46.56 97.0 1.1
15.52 96.9 2.7
5.17 95.7 1.2
1.72 92.6 1.9
0.57 66.0 2.5
0.19 27.2 4.2
0.06 7.4 1.7
0.02 1.9 1.0
G020028 0.394 0.025 46.56 88.4 0.4
15.52 88.3 0.4
5.17 89.8 1.7
1.72 84.6 5.1
0.57 55.4 3.0
0.19 24.4 1.2
0.06 6.1 1.3
0.02 0.7 0.1
G020349 0.449 0.015 46.56 91.4 0.3
15.52 94.3 0.8
5.17 93.8 0.3
1.72 83.8 2.6
0.57 55.7 3.1
0.19 20.3 1.2
0.06 4.7 0.4
0.02 1.0 0.3
G020022 0.497 0.011 46.56 97.4 0.4
15.52 97.9 0.5
5.17 97.0 1.1
1.72 88.3 1.1
0.57 55.3 3.3
0.19 16.9 1.3
0.06 4.5 1.2
0.02 0.7 0.3
G020352 0.596 0.014 46.56 93.0 0.9
15.52 96.2 0.6
5.17 95.9 0.9
1.72 84.5 1.1
0.57 46.2 1.6
0.19 12.3 1.3
0.06 2.8 1.0
0.02 0.5 0.2
G020029 0.597 0.023 46.56 88.1 4.9
15.52 91.6 2.1
5.17 91.7 1.6
1.72 83.2 1.3
0.57 44.0 0.5
0.19 10.6 1.4
0.06 2.6 0.1
0.02 1.2 0.4
G020351 0.619 0.026 46.56 87.9 1.4
15.52 95.0 0.4
5.17 95.7 1.3
1.72 84.6 1.8
0.57 42.7 1.3
0.19 12.1 1.7
0.06 2.0 0.4
0.02 0.5 0.4
G020023 0.652 0.027 46.56 97.0 0.6
15.52 98.4 0.5
5.17 97.1 0.8
1.72 83.8 2.8
0.57 43.5 5.8
0.19 12.0 5.4
0.06 1.8 0.6
0.02 0.6 0.5
G020026 0.669 0.019 46.56 89.0 1.3
15.52 91.9 2.2
5.17 89.8 0.1
1.72 78.3 0.4
0.57 39.3 2.2
0.19 10.7 0.1
0.06 2.4 0.1
0.02 1.0 0.4
G020030 3.359 0.27 46.56 68.4 1.1
15.52 79.9 4.1
5.17 54.9 2.1
1.72 12.7 1.8
0.57 1.2 0.1
0.19 0.4 0.1
0.06 0.4 0.1
0.02 0.3 n/d
表11C - 使用脂質奈米粒子在PCH 中之活體外編輯
引導物 EC50 EC50 SEM 引導物濃度(nM) 平均編輯% SD
G012401 0.1 0.02 46.6 90.0 3.7
15.5 84.5 7.3
5.2 90.4 3.0
1.7 86.7 6.7
0.6 78.9 2.4
0.2 53.4 2.4
0.1 22.7 0.6
0.0 4.9 0.2
G019877 0.4 0.05 46.6 80.0 12.9
15.5 85.7 3.0
5.2 87.9 4.0
1.7 78.4 8.2
0.6 56.8 10.4
0.2 23.4 5.2
0.1 5.6 0.7
0.0 1.0 0.2
G020350 0.2 0.03 46.6 79.5 3.0
15.5 82.5 2.3
5.2 80.3 16.1
1.7 81.4 12.2
0.6 73.7 6.2
0.2 47.0 7.8
0.1 19.6 3.1
0.0 4.1 1.7
G020024 0.1 0.01 46.6 91.3 0.3
15.5 88.4 0.2
5.2 90.7 1.6
1.7 87.1 0.6
0.6 77.6 1.9
0.2 54.9 1.9
0.1 27.8 0.4
0.0 8.9 0.5
G020025 0.2 0.01 46.6 89.9 0.1
15.5 89.2 3.5
5.2 87.4 0.6
1.7 86.0 3.5
0.6 70.5 1.6
0.2 39.9 1.8
0.1 14.3 1.6
0.0 3.3 0.8
G017276 0.3 0.01 46.6 89.3 1.9
15.5 90.5 1.5
5.2 88.9 1.0
1.7 84.8 1.3
0.6 62.1 0.3
0.2 31.5 0.6
0.1 2.4 2.0
0.0 1.9 0.4
G020353 0.2 0.05 46.6 83.2 5.7
15.5 83.1 10.7
5.2 87.6 6.2
1.7 83.1 8.3
0.6 68.6 13.9
0.2 36.3 16.5
0.1 10.3 n/d
0.0 2.6 0.4
G020027 0.2 0.02 46.6 92.3 2.1
15.5 89.3 2.1
5.2 91.4 1.2
1.7 84.9 0.9
0.6 68.2 4.3
0.2 39.5 1.6
0.1 14.4 0.3
0.0 3.8 0.1
G000502 0.3 0.03 46.6 84.8 8.3
15.5 83.7 8.4
5.2 84.5 7.1
1.7 75.5 6.2
0.6 57.5 6.3
0.2 26.7 4.7
0.1 8.0 1.7
0.0 2.0 0.5
G020028 0.4 0.02 46.6 87.5 1.5
15.5 88.2 3.6
5.2 85.8 3.4
1.7 78.2 0.9
0.6 56.8 0.1
0.2 27.8 1.8
0.1 7.8 0.1
0.0 1.9 0.1
G020349 0.4 0.16 46.6 85.3 8.6
15.5 84.8 7.7
5.2 91.1 2.1
1.7 70.5 20.5
0.6 50.4 22.8
0.2 30.3 12.4
0.1 8.5 2.2
0.0 2.0 1.1
G020022 0.3 0.05 46.6 77.9 9.1
15.5 91.3 1.0
5.2 81.9 10.6
1.7 79.3 9.1
0.6 62.4 8.6
0.2 29.2 8.5
0.1 7.0 2.1
0.0 1.7 1.0
G020352 0.3 0.05 46.6 74.7 3.9
15.5 78.2 3.8
5.2 81.9 12.9
1.7 82.7 5.1
0.6 57.1 9.3
0.2 24.7 4.5
0.1 9.6 1.8
0.0 1.7 0.2
G020029 0.5 0.05 46.6 88.3 4.1
15.5 84.0 7.1
5.2 84.9 0.6
1.7 70.9 5.9
0.6 44.8 3.2
0.2 18.5 0.2
0.1 4.6 0.7
0.0 1.4 0.8
G020351 0.4 0.07 46.6 71.9 8.2
15.5 78.6 10.4
5.2 89.0 4.2
1.7 77.8 6.4
0.6 51.8 10.3
0.2 21.3 6.5
0.1 4.1 1.8
0.0 1.3 0.0
G020023 0.4 0.08 46.6 81.8 11.8
15.5 82.3 14.1
5.2 86.6 8.7
1.7 72.2 11.1
0.6 53.4 11.9
0.2 20.5 6.7
0.1 5.2 0.1
0.0 1.1 0.6
G020026 0.5 0.02 46.6 84.5 1.9
15.5 86.3 1.1
5.2 84.7 1.1
1.7 74.6 2.5
0.6 47.1 2.7
0.2 17.8 0.8
0.1 4.6 0.5
0.0 0.9 0.1
G020030 2.8 0.52 46.6 62.1 7.8
15.5 81.6 1.8
5.2 52.2 5.7
1.7 22.1 2.3
0.6 8.9 4.3
0.2 2.4 1.8
0.1 0.5 0.3
0.0 0.3 0.0
實例5 - 小鼠肝臟中之活體內編輯
測試所選引導物設計之活體內編輯效率。在涉及小鼠之各研究中使用6至10週齡範圍內的CD-1雌性小鼠。在給藥前為動物稱重以用於給藥計算。經由側尾靜脈以每隻動物0.2 Ml (每公斤體重大致10 mL)之體積投配LNP。給藥後約6小時，觀測到動物出現副作用。在投與後二十四小時處量測體重，且藉由在異氟醚麻醉下放血而在各個時間點將動物安樂死。經驗心臟穿刺將血液收集至血清分離管中或含有緩衝檸檬酸鈉的管中以得到血漿，如本文所述。對於涉及活體內編輯之研究而言，自各動物之左中葉收集肝臟組織以用於DNA提取及分析。
對於活體內研究而言，使用基於珠粒之提取套組，例如Zymo Quick- DNA 96套組(Zymo Research，目錄號D3010)，根據製造商方案，自10 mg組織中提取基因組DNA，包括使組織在溶解緩衝液中均質化(約400 μL/10 mg組織)。將所有DNA樣本標準化至100 ng/μL濃度以用於PCR及後續NGS分析，如實例1中所述。
如實例4中所述產生所有用於小鼠研究中之LNP。在各別實例中注意到與方案之偏差。 動物研究中所用的轉甲狀腺素蛋白(TTR) ELISA分析
收集血液且如所指示分離血清。使用小鼠前白蛋白(轉甲狀腺素蛋白) ELISA套組(Aviva Systems Biology，目錄號OKIA00111)測定總TTR血清含量；使用大鼠特異性ELISA套組(Aviva Systems Biology，目錄號OKIA00159)量測大鼠TTR血清含量。根據製造商方案製備套組試劑及標準品。用1×分析稀釋劑將小鼠或大鼠血清稀釋至10,000倍之最終稀釋度。此如下進行：進行兩個連續50倍稀釋，產生2500倍稀釋。進行最終4倍稀釋步驟以使得總樣本稀釋度為10,000倍。將標準曲線稀釋液(各100 μL)與稀釋之血清樣本均添加至預塗有捕捉抗體之ELISA培養盤之各孔中。將培養盤在室溫下培育30分鐘，隨後洗滌。添加酶-抗體結合物(每孔100 μL)，培育20分鐘。移除非結合之抗體結合物且再次洗滌培養盤，隨後添加顯色受質溶液。將培養盤培育10分鐘，隨後添加100 μL終止溶液，例如硫酸(約0.3 M)。在SpectraMax M5或Clariostar盤式讀取器上以450 nm之吸光度讀取培養盤。使用脫離標準曲線之四參數邏輯曲線擬合，藉由SoftMax Pro軟體版本6.4.2或Mars軟體版本3.31計算血清TTR含量。根據分析稀釋度調整最終血清值。相對於對照，測定基因表現阻斷百分比(KD%)值，除非另外指明，否則對照通常為經媒劑(輸送及儲存溶液或TSS)假處理的動物。
表12分別展示LNP之編輯效率及TTR蛋白含量，該等LNP含有皆靶向TTR基因中之相同序列的指定sgRNA (關於sgRNA核苷酸序列，參見表1A)。舉例而言，引導物G000502及引導物G012401充當對照。LNP係如實例4中所述製得。圖6A-B及表12中所示之資料來自投與0.1 mg/kg及0.3 mg/kg總RNA之雌性CD-1小鼠(n=3、4或5)。
表12.肝臟編輯及血清TTR
引導物 劑量(mg/kg) 編輯% SD n 血清TTR (µg/ml) SD n
媒劑 TSS 0.1 0.0 4 713 282.8 5
G000502 0.3 65.8 2.5 5 141 99.3 5
G000502 0.1 47.6 1.3 5 236 83.2 5
G012401 0.3 60.3 7.3 5 319 193.1 4
G012401 0.1 41.8 16.7 5 330 119.3 5
G017275 0.3 47.6 5.6 5 304 87.9 5
G017275 0.1 27.9 8.0 5 394 165.7 5
G015642 0.3 62.3 4.0 5 138 40.4 5
G015642 0.1 37.5 14.8 5 367 181.2 5
G015648 0.3 62.3 4.0 5 183 121.2 3
G015648 0.1 28.5 9.8 5 534 55.5 5
G015652 0.3 37.9 7.8 5 383 58.3 5
G015652 0.1 21.9 10.9 5 456 79.0 5
G015653 0.3 19.0 3.3 5 586 90.1 5
G015653 0.1 9.1 4.3 5 507 139.4 5
G017280 0.1 43.1 3.9 5 339 83.8 4
表13分別展示LNP之編輯效率及TTR蛋白含量，該等LNP含有皆靶向TTR基因中之相同序列的指定sgRNA (關於sgRNA核苷酸序列，參見表1A)。舉例而言，引導物G000502及引導物G012401充當對照。LNP係如實例4中所述製得。圖7A-B及表13中所示之資料來自投與0.1 mg/kg及0.3 mg/kg總RNA之CD-1雌性小鼠(n=5)。
表13.肝臟編輯及血清TTR
引導物 劑量(mpk) 編輯% SD n 血清TTR µg/ml SD n
TSS TSS 0.1 0.1 5 908 231.6 5
G000502 0.3 71.1 2.5 5 29 18.6 5
G000502 0.1 49.2 8.4 5 303 112.9 5
G012401 0.3 66.7 2.9 5 68 17.3 5
G012401 0.1 34.7 4.7 5 461 122.3 5
G017281 0.3 56.9 9.8 5 165 112.4 5
G017281 0.1 24.4 6.0 5 570 172.6 5
G017282 0.3 55.7 8.8 5 175 100.2 5
G017282 0.1 22.7 4.4 5 566 131.2 5
G017276 0.3 71.3 3.1 5 26 25.8 5
G017276 0.1 61.1 6.1 5 130 52.0 4
G017277 0.3 67.8 4.3 5 38 15.2 5
G017277 0.1 53.0 7.4 5 264 112.3 5
G017278 0.3 70.6 1.7 5 41 26.7 5
G017278 0.1 38.7 5.3 5 372 106.7 5
G017279 0.3 68.6 1.4 5 45 14.6 5
G017279 0.1 44.8 2.6 5 238 45.1 5
表14分別展示LNP之編輯效率及TTR蛋白含量，該等LNP含有皆靶向TTR基因中之相同序列的指定sgRNA (關於sgRNA核苷酸序列，參見表1A)。實驗中包括無引導物(標註為TSS)之LNP作為相對對照。圖8A-B及表14中所示之資料來自投與0.03 mg/kg、0.1 mg/kg及0.3 mg/kg總RNA之CD-1雌性小鼠(n=5)。如上文所描述在小鼠中量測肝臟編輯及血清蛋白含量。 表14.肝臟編輯及血清TTR
引導物 劑量(mpk) 編輯% SD n 血清TTR (ug/ml) SD n
TSS TSS 0.2 0.1 5 1106.4 17.5 5
G000502 0.03 12.0 4.1 5 851.1 10.4 5
G012401 0.03 9.1 2.5 5 913.5 6.5 5
G017276 0.03 22.1 1.7 5 632.0 1.7 5
G017279 0.03 11.0 3.4 5 711.5 11.6 5
G017280 0.03 16.9 2.9 5 667.3 16.3 5
G000502 0.1 38.6 1.1 5 478.9 3.0 5
G012401 0.1 27.4 4.4 5 697.7 3.9 5
G017276 0.1 50.4 11.3 5 233.9 10.9 5
G017279 0.1 42.9 1.0 5 294.4 0.7 5
G017280 0.1 32.3 1.8 5 427.0 12.2 5
G000502 0.3 65.3 3.6 5 51.7 4.2 5
G012401 0.3 56.9 2.8 5 143.8 2.8 5
G017276 0.3 67.1 5.9 5 40.1 7.5 5
G017279 0.3 63.1 6.6 5 77.3 7.5 5
G017280 0.3 60.8 3.2 5 98.4 5.8 5
表15分別展示LNP之編輯效率及TTR蛋白含量，該等LNP含有皆靶向TTR基因中之相同序列的指定sgRNA (關於sgRNA核苷酸序列，參見表1A)。實驗中包括無引導物(標註為TSS)之LNP作為相對對照。表15及圖9A-B中所示之資料來自投與0.03 mg/kg總RNA之CD-1雌性小鼠(n=5)。如上文所描述在小鼠中量測肝臟編輯及血清蛋白含量，不同之處在於給藥後24小時觀測動物。 表15.肝臟編輯及血清TTR
引導物 編輯% SD n 血清TTR (µg/ml) SD n
TSS 0.1 0.0 5 1050.1 192.5 5
G012401 4.7 1.3 5 1201.4 180.2 5
G017276 5.7 1.3 5 1267.2 110.3 5
G020349 11.4 6.4 5 1616.9 398.1 5
G020350 19.0 3.4 5 1333.5 422.7 5
G020351 1.0 0.5 5 1475.8 230.7 5
G020352 1.6 0.9 5 1324.0 422.0 5
G020353 5.1 1.6 5 990.9 153.1 5
G019877 1.9 1.0 5 1168.1 236.7 5
G020022 3.0 1.0 5 1147.2 304.4 5
G020023 1.8 0.8 5 1021.9 139.7 5
G020024 12.1 9.9 5 947.5 177.5 5
G020025 3.1 2.3 5 998.4 247.0 5
G020027 4.1 2.0 5 1193.2 226.6 5
表16分別展示LNP之編輯效率及TTR蛋白含量，該等LNP含有皆靶向TTR基因中之相同序列的指定sgRNA (關於sgRNA核苷酸序列，參見表1A)。實驗中包括無引導物(標註為TSS)之LNP作為相對對照且包括G000502作為此研究中之基準。圖10A-B及表16中所示之資料來自投與0.03 mg/kg及0.1 mg/kg總RNA之CD-1雌性小鼠(n=3、4或5)。如上文所描述在小鼠中量測肝臟編輯及血清蛋白含量，不同之處在於給藥後24小時觀測動物。 表16.肝臟編輯及血清TTR
引導物ID 劑量(mpk) 編輯% SD n 血清TTR (µg/ml) SD n
TSS N/A 0.1 0.04 5 667.5 115.6 5
G017276 0.03 26.6 6.2 5 468.1 69.3 5
G017276 0.03 26.0 6.3 5 544.8 52.4 5
G012401 0.03 11.4 4.5 5 574.9 72.2 5
G020349 0.03 23.5 12.3 5 552.11 205.3 5
G020350 0.03 26.6 8.0 5 482.4 89.8 5
G020024 0.03 11.4 7.7 5 633.3 99.4 5
G020025 0.03 9.7 3.5 5 616.9 99.4 5
G020028 0.03 6.5 1.6 5 651.1 49.8 5
G017276 0.1 53.4 7.1 5 199.4 74.4 5
G017276 0.1 59.1 7.1 5 123.6 29.2 5
G012401 0.1 32.3 3.0 5 429.8 93.5 5
G020349 0.1 58.2 6.6 4 159.2 38.8 3
G020350 0.1 57.6 5.9 5 147.0 54.0 5
G020024 0.1 38.8 10.4 4 382.0 165.8 4
G020025 0.1 39.7 7 4 474.8 167.3 4
G020028 0.1 31.1 5.3 5 465.9 37.5 5
實例6.大鼠肝臟中之活體內編輯
在大鼠中進一步測試所選引導物設計。在涉及大鼠之各研究中使用來自Charles River之6至8週齡範圍內的史泊格多利(Sprague Dawley)雌性大鼠。經由側尾靜脈以每隻動物0.3至0.4 mL (每公斤體重大致10 mL)或每隻動物0.35 mL之體積投配LNP。在給藥後觀測到動物出現副作用。在投與後二十四小時量測體重，且在給藥後在異氟醚麻醉或CO2 窒息下經由放血將動物安樂死。經由心臟穿刺將血液收集至血清分離管中(Geriner Bio One，目錄號#450472)。對於涉及活體內編輯之研究而言，自各動物之左外葉收集肝臟組織。如實例5中所述分離及處理基因組DNA。製備DNA樣本以用於PCR及後續NGS分析，如實例1中所述。
評估各大鼠樣本之肝臟及蛋白質血清TTR含量之編輯效率，如實例6中所述。以下研究表中之每一者中所示之結果表示各LNP內所含有之sgRNA (關於sgRNA核苷酸序列，參見表1A)，其皆靶向TTR基因中之相同序列。LNP係如實例5中所述製得。在以下各別實例中注意到與方案之偏差。
圖11A至圖11B及表17中所示之資料來自投與0.1 mg/kg總RNA且在給藥後7天安樂死之史泊格多利雌性大鼠(每組n=5)。如上文所描述處理樣本。 表17.肝臟編輯及血清TTR
引導物 編輯% SD n 血清TTR (µg/ml) SD N TTR%
TSS 0.1 0 5 1553.3 259.4 5 100
G000534 43.1 6.8 5 493.4 191.9 5 31.7
G000694 30.9 5.4 5 867.8 190.2 5 55.9
G018631 56.8 7.4 5 212.4 80.7 5 13.7
G018632 46.5 5.2 5 406.6 104.8 5 26.2
G018633 37.9 6.9 5 593 170.3 5 38.2
G018634 27.9 11.8 5 693.2 194.5 5 44.6
圖12A至圖12B及表18中所示之資料來自投與0.03 mg/kg及0.1 mg/kg總RNA且在給藥後7天安樂死之史泊格多利雌性大鼠(每組n=5)。如上文所描述處理樣本。 表18. 肝臟編輯及血清TTR
引導物 劑量(mpk) 編輯% SD n 血清TTR (µg/ml) SD n
TSS NA 0.1 0 5 2764.5 420.1 5
G000390 0.03 8.3 3.8 5 2027.3 238.1 5
G000532 0.03 3.9 4.9 5 1909.8 405.1 5
G018635 0.03 18.44 5.0 5 1575 272.8 5
G018639 0.03 4.4 1.7 5 2216.4 386.8 5
G018643 0.03 5.1 2.3 5 1929.3 136.1 5
G018644 0.03 0.4 3.9 5 1836.1 542.2 5
G000390 0.1 49.4 4.1 5 698.6 182.0 5
G000532 0.1 18.5 1.4 5 1644.1 324.4 5
G018635 0.1 54.2 5.8 5 403.4 297.6 5
G018639 0.1 23.3 1.2 5 1359.9 400.7 5
G018643 0.1 23.3 1.2 5 1508.1 297.0 5
G018644 0.1 3.4 0.2 5 1657.5 464.7 5
圖1A展示呈可能二級結構之例示性sgRNA (SEQ ID NO: 801，甲基化未示出)，其中標記標識sgRNA之保守區的個別核苷酸，包括下莖、隆突、上莖、(其核苷酸依5'至3'方向分別可稱作N1至N18)，及髮夾區，該髮夾區包括髮夾1區及髮夾2區。髮夾1與髮夾2之間的核苷酸標記為n。引導區可以存在於sgRNA上且在此圖中表示為位於sgRNA保守區之前的「(N)x 」。
圖1B展示例示性sgRNA恆定區序列(SEQ ID NO: 802)，其呈可能的二級結構且包括表示為N20 之20-核苷酸引導序列。
圖1C在例示性sgRNA序列(SEQ ID NO: 801，甲基化未示出)中以1至10標記10個保守區YA位點。編號25、45、50、56、64、67及83指示YA位點1、5、6、7、8、9及10之嘧啶在sgRNA中的位置，其中引導區表示為(N)x ，例如其中x視情況為20。
圖2展示初級獼猴肝細胞(PCH)中之指定引導物之缺失系列之編輯頻率。
圖3A及圖3B展示實驗之編輯%結果的劑量反應曲線，其中使用脂質體轉染將短引導物活體外傳遞至初級獼猴肝細胞(PCH)。
圖4A及圖4B展示實驗之編輯%結果的劑量反應曲線，其中使用LNP將短引導物活體外遞送至初級小鼠肝細胞(PMH)。
圖5A及圖5B展示實驗之編輯%結果的劑量反應曲線，其中使用LNP將短引導物活體外遞送至初級獼猴肝細胞(PCH)。
圖5C及圖5D展示實驗之編輯%結果的劑量反應曲線，其中使用LNP將短引導物活體外遞送至初級小鼠肝細胞(PMH)。
圖5E及圖5F展示實驗之編輯%結果的劑量反應曲線，其中使用LNP將短引導物活體外遞送至初級獼猴肝細胞(PCH)。
圖6A及圖6B針對指定的引導物分別展示活體內編輯%及血清TTR結果。
圖7A及圖7B針對指定的引導物分別展示活體內編輯%及血清TTR結果。
圖8A及圖8B針對指定的引導物分別展示活體內編輯%及血清TTR結果。
圖9A及圖9B針對指定的引導物分別展示活體內編輯%及血清TTR結果。
圖10A及圖10B針對指定的引導物分別展示活體內編輯%及血清TTR結果。
圖11A及圖11B針對指定的引導物分別展示活體內編輯%及血清TTR結果。
圖12A及圖12B針對指定的引導物分別展示活體內編輯%及血清TTR結果。
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Claims (85)

  1. 一種引導RNA (gRNA)，其包含5'端修飾或3'端修飾及gRNA之保守部分，該保守部分包含以下中之一或多者： (a)經縮短髮夾1區或經取代且視情況經縮短髮夾1區，其中 (i)以下核苷酸對中之至少一者在經取代及視情況經縮短髮夾1中經華特生-克里克配對核苷酸取代：H1-1及H1-12、H1-2及H1-11、H1-3及H1-10、及/或H1-4及H1-9，且該髮夾1區視情況缺乏 (aa)H1-5至H1-8中之任一者或兩者， (bb)以下核苷酸對中之一者、兩者或三者：H1-1及H1-12、H1-2及H1-11、H1-3及H1-10、及/或H1-4及H1-9，及/或 (cc)該髮夾1區之1至8個核苷酸；或 (ii)該經縮短髮夾1區缺乏6至8個核苷酸，較佳6個核苷酸；及 (A)位置H1-1、H1-2或H1-3中之一或多者相對於SEQ ID NO: 400缺失或經取代，及/或 (B)位置H1-6至H1-10中之一或多者相對於SEQ ID NO: 400經取代；或 (iii)該經縮短髮夾1區缺乏5至10個核苷酸，較佳地5至6個核苷酸，且位置N18、H1-12或n中之一或多者相對於SEQ ID NO: 400經取代；及/或 (b)縮短上莖區，其中該經縮短上莖區缺乏1至6個核苷酸，且其中該經縮短上莖區之6、7、8、9、10或11個核苷酸包括相對於SEQ ID NO: 400少於或等於4個取代；及/或 (c)在LS6、LS7、US3、US10、B3、N7、N15、N17、H2-2及H2-14中之任一者或多者處相對於SEQ ID NO: 400的取代，其中取代基核苷酸既不為隨後為腺嘌呤之嘧啶，亦不為在嘧啶之前的腺嘌呤；及/或 (d)上莖區，其中該上莖修飾包含對該上莖區中之US1至US12中之任一者或多者的修飾。
  2. 如請求項1之gRNA，其中位置H1-1缺失。
  3. 如請求項1之gRNA，其中位置H1-1經取代。
  4. 如請求項1至3中任一項之gRNA，其中位置H1-2缺失。
  5. 如請求項1至3中任一項之gRNA，其中位置H1-2經取代。
  6. 如請求項1至5中任一項之gRNA，其中位置H1-3缺失。
  7. 如請求項1至5中任一項之gRNA，其中位置H1-3經取代。
  8. 如請求項1至7中任一項之gRNA，其中位置H1-4缺失。
  9. 如請求項1至7中任一項之gRNA，其中位置H1-5缺失。
  10. 如請求項1至9中任一項之gRNA，其中位置H1-6缺失。
  11. 如請求項1至9中任一項之gRNA，其中位置H1-6經取代。
  12. 如請求項1至11中任一項之gRNA，其中位置H1-7缺失。
  13. 如請求項1至11中任一項之gRNA，其中位置H1-7經取代。
  14. 如請求項1至13中任一項之gRNA，其中位置H1-8缺失。
  15. 如請求項1至13中任一項之gRNA，其中位置H1-8經取代。
  16. 如請求項1至15中任一項之gRNA，其中位置H1-9缺失。
  17. 如請求項1至15中任一項之gRNA，其中位置H1-9經取代。
  18. 如請求項1至17中任一項之gRNA，其中位置H1-10缺失。
  19. 如請求項1至17中任一項之gRNA，其中位置H1-10經取代。
  20. 如請求項1至19中任一項之gRNA，其中位置H1-11缺失。
  21. 如請求項1至20中任一項之gRNA，其中位置H1-12缺失。
  22. 如請求項1至21中任一項之gRNA，其中位置H1-11及H1-12缺失。
  23. 如請求項1至22中任一項之gRNA，其中位置H1-7經G取代及/或H1-8經C取代。
  24. 如請求項1至23中任一項之gRNA，其中位置H1-6及/或H1-7經取代。
  25. 如請求項1至24中任一項之gRNA，其中位置H1-6經C取代及/或位置H1-7經U取代。
  26. 如請求項1至25中任一項之gRNA，其中位置H1-1及/或H1-12經取代。
  27. 如請求項1至26中任一項之gRNA，其中位置H1-1經C取代及/或位置H1-12經G取代。
  28. 如請求項1至27中任一項之gRNA，其中位置N18經取代。
  29. 如請求項28之gRNA，其中位置N18經C取代。
  30. 如請求項1至29中任一項之gRNA，其中位置H1-12經取代。
  31. 如請求項30之gRNA，其中位置H1-12經C或A取代。
  32. 如請求項1至31中任一項之gRNA，其中位置n經取代。
  33. 如請求項32之gRNA，其中位置n經A取代。
  34. 如請求項1至33中任一項之gRNA，其包含縮短上莖區，其中該經縮短上莖區缺乏1至6個核苷酸。
  35. 如請求項1至34中任一項之gRNA，其中該gRNA為sgRNA。
  36. 如請求項1至35中任一項之gRNA，其中該gRNA包含5'端修飾。
  37. 如請求項1至36中任一項之gRNA，其中該gRNA包含3'端修飾。
  38. 如請求項1至37中任一項之gRNA，其中該gRNA包含5'端修飾及3'端修飾。
  39. 如請求項1至38中任一項之gRNA，其中該gRNA包含3'尾。
  40. 如請求項39之gRNA，其中該3'尾包含1至2個、1至3個、1至4個、1至5個、1至7個、1至10個核苷酸或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。
  41. 如請求項1至38中任一項之gRNA，其中該gRNA不包含3'尾。
  42. 如請求項1至41中任一項之gRNA，其包含在該髮夾區中之修飾。
  43. 如請求項42之gRNA，其進一步包含3'端修飾。
  44. 如請求項42之gRNA，其進一步包含3'端修飾及5'端修飾。
  45. 如請求項42之gRNA，其進一步包含5'端修飾。
  46. 如請求項1至45中任一項之gRNA，其進一步包含引導區。
  47. 如請求項46之gRNA，其中該引導區之長度為17、18、19或20個核苷酸。
  48. 如請求項1至47中任一項之gRNA，其中該3'及/或5'端修飾包含保護端修飾，視情況為選自以下之經修飾核苷酸：2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯、反向無鹼基修飾之核苷酸，或其組合。
  49. 如請求項1至48中任一項之gRNA，其包含該髮夾區中之修飾，其中該髮夾區中之該修飾包含經修飾之核苷酸，其選自2'-O-甲基(2'-Ome)修飾之核苷酸、2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯或其組合。
  50. 如請求項1至49中任一項之gRNA，其中該3'及/或5'端飾包含或進一步包含2'-O-甲基(2'-Ome)修飾之核苷酸。
  51. 如請求項1至50中任一項之gRNA，其中該3'及/或5'端修飾包含或進一步包含2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。
  52. 如請求項1至51中任一項之gRNA，其中該3'及/或5'端修飾包含或進一步包含核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵聯。
  53. 如請求項1至52中任一項之gRNA，其中該3'及/或5'端修飾包含或進一步包含反向無鹼基修飾之核苷酸。
  54. 如請求項1至53中任一項之gRNA，其包含該髮夾區中之修飾，其中該髮夾區中之該修飾包含或進一步包含2'-O-甲基(2'-Ome)修飾之核苷酸。
  55. 如請求項1至54中任一項之gRNA，其包含該髮夾區中之修飾，其中該髮夾區中之該修飾包含或進一步包含2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。
  56. 如請求項1至55中任一項之gRNA，其中該sgRNA包含3'尾，其中該3'尾包含存在於該3'尾中之任一個或多個核苷酸的修飾。
  57. 如請求項56之gRNA，其中該3'尾完全被修飾。
  58. 如請求項1至57中任一項之gRNA，其中該上莖區包含至少一個修飾。
  59. 如請求項58之gRNA，其中該上莖修飾包含以下中之任一者或多者： i.   該上莖區中之US1至US12中之任一者或多者的修飾；及 ii.  該上莖區中之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或所有12個核苷酸的修飾。
  60. 如請求項59之gRNA，其中該上莖修飾包含以下中之一或多者： i.   2'-OMe修飾之核苷酸； ii.  2'-O-moe修飾之核苷酸； iii. 2'-F修飾之核苷酸；及 iv. (i.)至(iii.)中之一或多者之組合。
  61. 如請求項1至60中任一項之gRNA，其包含與SEQ ID NO: 1-98、201-294、401-494、601-698或801-875中之任一者之核苷酸序列具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70%一致性之核苷酸序列。
  62. 如請求項1至61中任一項之gRNA，其包含與SEQ ID No: 101-198、301-394、501-594、701-798或901-975中之任一者之核苷酸序列具有至少99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75或70%一致性之核苷酸序列，其中在對應於表1A中之參考序列識別符之核苷酸的該gRNA之各核苷酸處的修飾等同於或等效於表1A中之參考序列識別符中所示的修飾。
  63. 一種引導RNA，其包含SEQ ID NO: 1-98、201-294、401-494、601-698或801-875中之任一者。
  64. 一種引導RNA，其包含SEQ ID NO: 101-198、301-394、501-594、701-798或901-975中之任一者，包括表1A之修飾。
  65. 如請求項1至64中任一項之gRNA，其包含一或多個引導區YA位點之YA修飾。
  66. 如請求項1至65中任一項之gRNA，其包含YA修飾，其中該修飾包含2'-氟、2'-H、2'-OMe、ENA、UNA、肌苷或PS修飾。
  67. 如請求項1至66中任一項之gRNA，其包含一或多個保守區YA位點之YA修飾。
  68. 如請求項1至67中任一項之gRNA，其中至少一個經修飾之YA位點包含 (i) 2'-OMe修飾，視情況屬於該YA位點之嘧啶； (ii) 2'-氟修飾，視情況屬於該YA位點之嘧啶；及/或 (iii) PS修飾，視情況屬於該YA位點之嘧啶。
  69. 一種LNP組合物，其包含如請求項1至68中任一項之gRNA。
  70. 一種組合物，其包含與脂質奈米顆粒(LNP)締合之如請求項1至68中任一項之gRNA。
  71. 一種組合物，其包含如請求項1至68中任一項之gRNA或如請求項69或70之組合物，其進一步包含核酸酶或編碼該核酸酶之mRNA。
  72. 如請求項71之組合物，其中該核酸酶為Cas蛋白。
  73. 如請求項72之組合物，其中該Cas蛋白為Cas9。
  74. 如請求項73之組合物，其中該Cas9為釀膿鏈球菌(S. pyogenes ) Cas9或金黃色葡萄球菌(S. aureus ) Cas9。
  75. 如請求項71至74中任一項之組合物，其中該核酸酶為切口酶或dCas。
  76. 如請求項71至75中任一項之組合物，其中該核酸酶經修飾。
  77. 如請求項76之組合物，其中該經修飾之核酸酶包含核定位信號(NLS)。
  78. 如請求項71至77中任一項之組合物，其包含編碼該核酸酶之mRNA。
  79. 如請求項78之組合物，其中該mRNA包含SEQ ID NO: 1099-1127或1129-1146中之任一者的序列。
  80. 一種醫藥調配物，其包含如請求項1至68中任一項之gRNA或如請求項69至79中任一項之組合物及醫藥學上可接受之載劑。
  81. 一種修飾目標DNA的方法，其包含將Cas蛋白或編碼Cas蛋白的核酸及以下中之任一者或多者遞送至細胞： i.如請求項1至68中任一項之gRNA； ii.如請求項69至79中任一項之組合物；及 iii.如請求項80之醫藥調配物。
  82. 如請求項81之方法，其中該方法引起基因***或缺失。
  83. 如請求項81或82之方法，其進一步包含向細胞遞送模板，其中該模板之至少一部分併入至藉由該Cas蛋白誘發之雙股斷裂位點處或附近之目標DNA中。
  84. 如請求項1至68中任一項之gRNA，如請求項69至79之組合物，或如請求項80之醫藥調配物，其用於製備供治療疾病或病症用之藥劑。
  85. 一種如請求項1至68中任一項之gRNA、如請求項69至79之組合物或如請求項80之醫藥調配物之用途，其用於製造供治療疾病或病症用之藥劑。
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