TW202136294A - 多肽、蛋白質複合物及其製造方法 - Google Patents

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路易斯 達克魯斯
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Abstract

本發明大體上係關於多肽，該等多肽包含一或多個抗原結合域及允許將至少兩個多肽鏈組裝成多價及/或多特異性蛋白質複合物的二聚域。本發明之該等多肽及蛋白質複合物具有抗腫瘤活性。

Description

多肽、蛋白質複合物及其製造方法
本發明大體上係關於多肽，該等多肽包含一或多個抗原結合域及允許將至少兩個多肽鏈組裝成多價及/或多特異性蛋白質複合物的二聚域。本發明之該等多肽及蛋白質複合物具有抗腫瘤活性。
駱駝及軟骨魚天然產生由功能性同二聚重鏈抗體(HCAb)構成之抗體(Hamers-Casterman等人, 1993；Muyldermans及Smider, 2016)。HCAb之重鏈缺乏第一恆定域(CH1)且與經典抗體之不同之處僅在於輕鏈配對通常涉及之一些胺基酸取代(Muyldermans等人, 1994；Vu等人, 1997)。此等取代(Val37Phe/Tyr、Gly44Glu、Leu45Arg及Trp47Gly)存在於構架區2 (FR2)中。HCAb之抗原結合片段稱作單域抗體(sdAb)、VHH或nanobody®。VHH具有約15 kDa之分子量，使得其適於需要增強之組織滲透或快速清除的應用，諸如基於放射性同位素之成像。然而，對於治療性應用，通常需要增加VHH半衰期以便將腎清除率降至最低及最佳化治療功效(De Vlieger等人, Antibodies 8(1), 1-22, 2019)。儘管已採用增加VHH半衰期之方法，諸如聚乙二醇化、N-糖基化、HSA或其他載體蛋白融合，但此類構築體可引入免疫原性或成功率有限。
已將VHH用作構築嵌段來製得雙特異性及多特異性抗體。在一些研究中，已顯示二價構築體具有相較於單價形式增加之親合力或親和力(Conrath等人,2001；Coppieters等人, 2006；Hmila等人, 2008；Simmons等人, 2006及Hultberg等人, 2011、Jähnichen等人 (2010)、Fridy等人, 2014)。
多種基於VHH之治療劑目前正處於研究後期或已受FDA批准。此等治療劑包括針對抗原vWF的經批准用於血栓性血小板減少性紫癲(Thrombotic thrombocytopenic purpura)的二價單特異性抗體卡普拉珠單抗(Caplacizumab)(Duggan, 2018)。針對RSV之三價奈米抗體複合物ALX-0171處於針對呼吸道合胞病毒感染之研發後期(Detallea等人, 2015)。ALX-0061為針對抗原IL-6R但與HSA奈米抗體連接以延長半衰期的單價抗體，且處於針對RA及SLE適應症之臨床研發階段(Van Roy等人, 2015)。研究性藥物ALX-0761含有針對抗原IL-17A、IL-17F及HAS之三種奈米抗體且正研發用於牛皮癬(Svecova等人, 2019)。抗RANKL ALX-0141為針對抗原RANKL之二價抗體且連接於HSA以延長半衰期(Schoen等人, 2013)。奧利珠單抗(Ozoralizumab)為針對抗原TNFα之二價奈米抗體且連接於HSA以延長半衰期(Fleischmann等人, 2012)。
儘管有此等研發，仍需要結合多個目標且產生有效免疫反應之抗體樣分子。
本申請人已產生多肽，其包含抗原結合域及允許組裝兩個多肽鏈以形成多價及/或多特異性蛋白質複合物的二聚域。
本發明之多肽係由不同模組構成且包括針對其結合特異性目標之能力而選擇的抗原結合域。亦可針對其活體內及/或活體外功能特性或生物效應，包括例如其調節細胞過程(諸如基因表現、信號轉導、細胞生長、細胞活力及其類似者)的能力來選擇抗原結合域。
抗原結合域經工程改造成單一多肽鏈以便用單個部分靶向不同細胞組分或不同細胞類型。多肽鏈可組裝成蛋白質複合物，諸如二聚體，以強化其生物效應。因此可藉由投與單一多肽或蛋白質複合物物種來調節若干細胞過程。另外，同一分子內存在多個目標特異性抗原結合域可在由各抗原結合域定位之所有細胞聚集在一起時確保該等細胞最終經遞送至同一位置。額外益處為以及時方式或幾乎同時觸發各種生物效應。
此表示優於投與分開之抗體的顯著優勢，因為藉由單個部分考慮影響此類投與之結果的若干參數，包括劑量、投與時程、投與途徑、藥效學、藥物動力學，而非分開地考慮各部分。如此，投與分開之抗體未必總是達成所需生物效應。
此外，多肽鏈及蛋白質複合物適於與治療劑或可偵測部分結合。
本文揭示之多肽及蛋白質複合物之另一益處在於各種抗原結合域與其目標之結合可以協同方式發生。舉例而言，給定單域抗體與其目標之結合可有助於其他各者之結合。
基於本發明，本申請人已產生多肽及蛋白質複合物，其由靶向腫瘤及/或調節免疫檢查點及/或募集免疫細胞之各種單域抗體構成。舉例而言，在一些實施例中，該等多肽部分及蛋白質複合物係由靶向腫瘤之各種單域抗體構成。在一些實施例中，該等多肽部分及蛋白質複合物係由調節免疫檢查點之各種單域抗體構成。在一些實施例中，該等多肽部分及蛋白質複合物係由募集免疫細胞之各種單域抗體構成。在一些實施例中，該等多肽部分及蛋白質複合物係由靶向腫瘤、調節免疫檢查點及募集免疫細胞之各種單域抗體構成。
本申請人證實本發明之多肽鏈單獨或與化學療法組合促進活體內臨床前模型之腫瘤消退。
另一優勢在於本發明之多肽鏈有效地表現於細胞中。本文中所揭示之多肽鏈之型式允許達成公克/公升之範圍內的蛋白質複合物產量。
本申請人亦出人意料地發現一種製備具有優於單價多肽之各種有利特性的模組化、多功能、多特異性及/或多價多肽的方法，該等有利特性包括例如細胞靶向的增加之親合力及增加之特異性。
併入本發明之多肽中的VHH、單域Ab結合部分不需要用於抗原結合之輕鏈，相較於需要輕鏈之結合部分，其降低分子量、大小、複雜度及二硫鍵數目。此又具有各種優勢，例如簡化適合於抗癌療法之量的製造。併入本發明之多肽中的CH2-CH3域適用於標準抗體純化製程且賦予比VHH蛋白之半衰期長的全尺寸抗體半衰期。本發明之多肽之各鏈之不同大小簡化異二聚體與同二聚體之間的區別且有助於簡化此等抗體之製造。另一所需特性為在本發明之多肽之不同位置處使用的連接子。藉由選擇未特別設計以易於由蛋白酶裂解的連接子，本發明克服多特異性抗體被破壞成否則將缺乏多特異性益處的其組分部分。
本發明之多肽之另一優勢為多肽之結構。此優勢包括例如經由連接子及抗體最佳化克服當結合部分位於多肽之C端時的較低結合親和力限制。額外優勢包括例如CH2-CH3域與免疫系統之各種受體接合且強加結合部分之空間組織。空間組織克服端對端線性配置之結合部分之限制，在該限制下，隨著結合部分數目增加，中間之分子之特性的控制變得更加困難。
於多肽鏈內且甚至在將多肽鏈組裝成二聚體蛋白質複合物後仍保留單域抗體之功能特性。此外，即使在位於二聚域(例如Fc)之C端或如本文中所描述之其他模組之間時，仍保留單域抗體之功能特性。因此，在一些實施例中，當位於二聚域之C端時，本文中所描述之單域抗體保留功能。在一些實施例中，在位於模組之間時，本文中所描述之單域抗體保留功能。
二聚域係基於天然抗體之CH2-CH3域或含有有利於異二聚體形成的獨特CH3突變集合。
因此產生之蛋白質複合物可包含至少三個、四個、五個、六個及更多個各自具有所需特異性之抗原結合域。在一些實施例中，多肽或蛋白質複合物之各抗原結合域能夠呈單鏈結合其目標。
此外，本申請人能夠鑑別正面影響多肽或蛋白質複合物之活性的連接子及多肽構形。
本申請人亦提供一種用於製造本發明之多肽的模組化系統。
本文中所揭示之模組化系統係由各種DNA區段構成，該等DNA區段各自包含允許在獨特位置組裝至編碼多肽鏈之DNA構築體中的獨特突出端。此系統之獨特特徵允許使用者更換一或多個模組，以選擇最佳候選者。
因此，在一些態樣及實施例中，本發明係關於一種多肽，其以N端至C端方式包含具有式 Ia 中所闡述之構形的胺基酸序列： X-[(Aba )-(Lb )]m -(DD)-[(Lc )-(Abd )]n - Y 其中m可為0、1或大於1之整數； 其中n可為0、1或大於1之整數，其限制條件為m及n不同時為0； 其中Aba 、Abd 可各獨立地包含有包含抗體之一或多個互補決定區(CDR)的抗原結合域； 其中X或Y可獨立地存在或不存在且可包含胺基酸序列； 其中Lb 、Lc 可各獨立地包含一或多個連接子；且 其中DD包含二聚域。
在其他態樣及實施例中，本發明係關於一種多肽，其以N端至C端方式包含具有式 Ib 中所闡述之構形的胺基酸序列： X-[(Aba )-(Lb )] m-(DD)-[(Lc )-(Abd )]n - Y 其中m為0、1或大於1之整數； 其中n為2或大於2之整數； 其中Aba 、Abd 各獨立地包含有包含抗體之一或多個互補決定區(CDR)的抗原結合域； 其中X或Y獨立地存在或不存在且包含胺基酸序列； 其中Lb 、Lc 各獨立地包含一或多個連接子； 其中Lc 不包含可裂解連接子；且 其中DD包含二聚域。
在一些實施例中，該多肽之該二聚域包含CH2域、CH3域或其組合。
在一些實施例中，該二聚域包含天然IgG1 CH3域。
在其他實施例中，該二聚域包含天然IgG4 CH3域。
在其他實施例中，該二聚域包含相較於天然IgG之CH3域包含一或多個突變的CH3域。
在一些實施例中，該二聚域為突變IgG1 CH3域。
在其他實施例中，該二聚域為突變IgG4 CH3域。
在一些實施例中，該二聚域為如本文中所定義之第一二聚域(DD1 )。因此，在一些實施例中，該二聚域為具有本文中所揭示之胺基酸序列的第一二聚域(DD1 )。
在一些實施例中，該二聚域為如本文中所定義之第二二聚域(DD2 )。因此，在一些實施例中，該二聚域為具有本文中所揭示之胺基酸序列的第二二聚域(DD2 )。
在一些實施例中，該二聚域包含有包含一或多個根據EU編號在對應於399、356及/或370的位置處之突變的CH3域。在其他實施例中，該二聚域包含有包含一或多個根據EU編號在對應於399、357及/或439的位置處之突變的CH3域。
因此，在一些實施例中，該二聚域包含有包含一或多個根據EU編號在對應於D399、D/E356及/或K370的位置處之突變的CH3域。在其他實施例中，該二聚域包含有包含一或多個根據EU編號在對應於D399、E357及/或K439的位置處之突變的CH3域。
在一些實施例中，該CH3域可包含位置356處的胺基酸取代。
在一些實施例中，該CH3域可包含位置357處的胺基酸取代。
在一些實施例中，該CH3域可包含位置370處的胺基酸取代。
在一些實施例中，該CH3域可包含位置399處的胺基酸取代。
在一些實施例中，該CH3域可包含位置439處的胺基酸取代。
在一些實施例中，該二聚域包含具有位置399及356處之胺基酸取代的突變CH3域。在一些實施例中，該二聚域包含具有位置399及357處之胺基酸取代的突變CH3域。在一些實施例中，該二聚域包含具有位置399及370處之胺基酸取代的突變CH3域。在一些實施例中，該二聚域包含具有位置399及439處之胺基酸取代的突變CH3域。在一些實施例中，該二聚域包含具有位置356及370處之胺基酸取代的突變CH3域。在一些實施例中，該二聚域包含具有位置357及439處之胺基酸取代的突變CH3域。
在一些實施例中，該二聚域包含具有位置D399、D/E356及/或K370或D399、E357及/或K439處之胺基酸取代及一或多個其他胺基酸取代的突變CH3域。
在一些實施例中，根據EU編號，該突變CH3域中之該一或多個其他胺基酸取代可位於涵蓋胺基酸殘基349至355之區域中。
在一些實施例中，根據EU編號，該突變CH3域中之該一或多個其他胺基酸取代可位於涵蓋胺基酸殘基394至395之區域中。
在一些實施例中，根據EU編號，該突變CH3域中之該一或多個其他胺基酸取代可位於涵蓋胺基酸349至355之區域中及/或涵蓋胺基酸394至395之區域中。
在一些實施例中，根據EU編號，該突變CH3域中之該一或多個其他胺基酸取代可處於對應於349、350、351、352、354、355、394及/或395的位置。
在一些實施例中，根據EU編號，該突變CH3域中之該一或多個其他胺基酸取代可處於對應於Y349、T350、L351、P352、S354、R355或Q355、T394或P395之位置。
在一些實施例中，該其他胺基酸取代係處於位置Y349。
在一些實施例中，該其他胺基酸取代係處於位置T350。
在一些實施例中，該其他胺基酸取代係處於位置L351。
在一些實施例中，該其他胺基酸取代係處於位置P352。
在一些實施例中，該其他胺基酸取代係處於位置S354。
在一些實施例中，該其他胺基酸取代係處於位置R355。
在一些實施例中，該其他胺基酸取代係處於位置Q355。
在一些實施例中，該其他胺基酸取代係處於位置T394。
在一些實施例中，該其他胺基酸取代係處於位置P395。
在一些實施例中，該等其他胺基酸取代係處於位置Y349及S354。
在一些實施例中，該CH3域可包含位置D399、D/E356、K370及Y349處之胺基酸取代。
在一些實施例中，該CH3域可包含位置D399、D/E356、K370及T350處之胺基酸取代。
在一些實施例中，該CH3域可包含位置D399、D/E356、K370及L351處之胺基酸取代。
在一些實施例中，該CH3域可包含位置D399、D/E356、K370及P352處之胺基酸取代。
在一些實施例中，該CH3域可包含位置D399、D/E356、K370及S354處之胺基酸取代。
在一些實施例中，該CH3域可包含位置D399、D/E356、K370及R355處之胺基酸取代。
在一些實施例中，該CH3域可包含位置D399、D/E356、K370及Q355處之胺基酸取代。
在一些實施例中，該CH3域可包含位置D399、D/E356、K370及T394處之胺基酸取代。
在一些實施例中，該CH3域可包含位置D399、D/E356、K370、Y349及S354處之胺基酸取代。
在一些實施例中，該CH3域可包含位置D399、K439、E357及Y349處之胺基酸取代。
在一些實施例中，該CH3域包含位置D399、E357、K439及T350處之胺基酸取代。
在一些實施例中，該CH3域包含位置D399、E357、K439E及L351處之胺基酸取代。
在一些實施例中，該CH3域可包含位置D399、K439、E357及P352處之胺基酸取代。
在一些實施例中，該CH3域可包含位置D399、K439、E357及S354處之胺基酸取代。
在一些實施例中，該CH3域可包含位置D399、K439、E357及R355處之胺基酸取代。
在一些實施例中，該CH3域可包含位置D399、K439、E357及Q355處之突變。
在一些實施例中，該CH3域可包含位置D399、K439、E357及P395處之胺基酸取代。
在一些實施例中，該CH3域包含位置D399、E357、K439、Y349及S354處之胺基酸取代。
在一些實施例中，位置Y349處之該胺基酸取代係選自Y349K、Y349D或Y349R。更特定言之，在一些實施例中，位置Y349處之該胺基酸取代為Y349K。在其他實施例中，位置Y349處之該胺基酸取代為Y349D。
在一些實施例中，位置S354處之該胺基酸取代係選自S354K、S354D、S354W或S354M。更特定言之，在一些實施例中，位置S354處之該胺基酸取代為S354K。在其他實施例中，位置S354處之該胺基酸取代為S354D。在其他實施例中，位置S354處之該胺基酸取代為S354M。
在一些實施例中，位置L351處之該胺基酸取代為L351Y、L351W、L351H、L351R、L351D、L351A、L351T。更特定言之，在一些實施例中，位置L351處之該胺基酸取代為L351Y。在其他實施例中，位置L351之該胺基酸取代為L351W。在其他實施例中，位置L351處之該胺基酸取代為L351R。
在一些實施例中，位置T350處之該胺基酸取代為T350L、T350I或T350V。更特定言之，在一些實施例中，位置T350處之該胺基酸取代為T350I。在其他實施例中，位置T350處之該胺基酸取代為T350V。
在一些實施例中，位置P352處之該胺基酸取代為P352Y、P352V、P352R、P352T、P352L、P352G、P352E、P352C、P352K或P352D。更特定言之，在一些實施例中，位置P352處之該胺基酸取代為P352R。在其他實施例中，位置P352處之該胺基酸取代為P352E。
在一些實施例中，位置T394處之該胺基酸取代為T394N。
在一些實施例中，位置P395處之該胺基酸取代為P395I。在其他實施例中，位置P395處之該胺基酸取代為P395G。在其他實施例中，位置P395處之該胺基酸取代為P395E。
在一些實施例中，位置R355處之該胺基酸取代為R355K。在其他實施例中，位置R355處之該胺基酸取代為R355W。
在一些實施例中，位置Q355處之該胺基酸取代為Q355K。在其他實施例中，位置Q355處之該胺基酸取代為Q355W。
在其他態樣及實施例中，本發明係關於一種多肽，其以N端至C端方式包含具有式 Ic 中所闡述之構形的胺基酸序列： X-[(Aba )-(Lb )]m -(DD)-[(Lc )-(Abd )]n -Y 其中m為0、1或大於1之整數； 其中n為0、1或大於1之整數，其限制條件為m及n不同時為0； 其中Aba 、Abd 各獨立地包含有包含抗體之一或多個互補決定區(CDR)的抗原結合域； 其中X或Y獨立地存在或不存在且包含胺基酸序列； 其中Lb 、Lc 各獨立地包含一或多個連接子； 其中DD包含二聚域，該二聚域包含：a) 包含一或多個根據EU編號在對應於D399、D/E356及/或K370之位置處之突變的CH3域；或b) 包含一或多個根據EU編號在對應於D399、E357及/或K439之位置處之突變的CH3域。
在一些實施例中，該CH3域包含根據EU編號之突變D399N、E356Q及K370E。
在其他實施例中，該CH3域包含根據EU編號之突變D399N、E357Q及K439E。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399Q、D/E356Q、K370E、Y349K及S354K。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、D/E356Q、K370E及L351W。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、D/E356Q、K370E及S354M。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、D/E356Q、K370E及T350I。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、D/E356Q、K370E及T350V。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、D/E356Q、K370E及P352R。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、D/E356Q、K370E及P352E。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399Q、D/E356Q及K370E。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、D/E356Q、K370E及L351Y。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、D/E356Q、K370E及L351H。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、D/E356Q、K370E及R355K。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、D/E356Q、K370E及Q355K。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、D/E356Q、K370E及S354K。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、D/E356Q、K370E及T350L。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、D/E356Q、K370E及T394N。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、D/E356Q、K370E及P352Y。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、D/E356Q、K370E及P352V。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、D/E356Q、K370E及P352T。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、D/E356Q、K370E及P352L。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、D/E356Q、K370E及P352G。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、D/E356Q、K370E及P352C。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、D/E356Q、K370E及L351T。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、D/E356Q、K370E及L351A。
在一些實施例中，該CH3域包含突變D399Q、E357Q、K439E、Y349D及S354D。
在一些實施例中，該CH3域包含突變D399N、E357Q、K439E及L351R。
在一些實施例中，該CH3域包含突變D399N、E357Q、K439E及L351Y。
在一些實施例中，該CH3域包含突變D399N、E357Q、K439E及T350I。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、E357Q、K439E及T350V。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399Q、K439E、E357Q。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、K439E、E357Q、S354K。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、K439E、E357Q、S354W。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、K439E、E357Q、Y349R。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、K439E、E357Q、T350L。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、K439E、E357Q、R355W。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、K439E、E357Q、Q355W。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、K439E、E357Q、P395I。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、K439E、E357Q、P395G。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、K439E、E357Q、P395E。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、K439E、E357Q、P352K。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、K439E、E357Q、P352D。
在一些實施例中，該CH3域可包含突變D399N、K439E、E357Q、L351D。
在一些實施例中，該多肽包含至少兩個或至少三個抗原結合域及允許組裝兩個多肽鏈以形成多價及/或多特異性蛋白質複合物的二聚域。
在一些實施例中，Lc包含不可裂解連接子。在其他實施例中，Lc由不可裂解連接子組成。
在其中m為2或大於2之整數的一些實施例中，該等[(Aba )-(Lb )]單元相同。
在其中m為2或大於2之整數的其他實施例中，多肽或蛋白質複合物之該等[(Aba )-(Lb )]單元不同。
在其中m為大於2之整數的其他實施例中，多肽或蛋白質複合物之該等[(Aba )-(Lb )]單元可包含相同及不同單元。
在其中n為2或大於2之整數的一些實施例中，該等[(Lc )-(Abd )]單元相同。
在其中n為2或大於2之整數的其他實施例中，該等[(Lc )-(Abd )]單元不同。
在其中n為2或大於2之整數的其他實施例中，該等[(Lc )-(Abd )]單元包含相同及不同單元。
在實施例中，該一或多個連接子包含抗體或其抗原結合片段之鉸鏈區。
在一些實施例中，該鉸鏈區係來自IgG1。
在其他實施例中，該鉸鏈區係來自IgG2。
在其他實施例中，該鉸鏈區係來自IgG4。
在一些實施例中，該一或多個連接子中之每一者的長度獨立地為至少5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸殘基。
在一些實施例中，個一或多個連接子中之每一者獨立地為可撓性連接子、螺旋狀連接子或剛性連接子。
在一些實施例中，該連接子Lc為剛性連接子。
在一些實施例中，該一或多個連接子包含可撓性連接子及/或剛性連接子。
在一些實施例中，該可撓性連接子為GS連接子。
在一些實施例中，該可撓性連接子包含GGGGS之一或多個單元。
在一些實施例中，該可撓性連接子包含GGGGS之至少2、3、4、5或更多個單元。
在一些實施例中，該剛性連接子包含多個PA重複。
在一些實施例中，該剛性連接子係選自PAPAPKA (SEQ ID NO: 8)；APAPAPAPAPKA (SEQ ID NO: 9)；APAPAPAPAPAPA PAPAPAPKA (SEQ ID NO: 10)；或其組合。
在一些實施例中，該螺旋狀連接子包含EAAAK之一或多個單元。
在一些實施例中，該螺旋狀連接子係選自AEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO: 12)；AEAAAKEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO: 13)；AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO: 14)；或其組合。
在一些實施例中，該二聚域包含與SEQ ID NO : 27至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
在一些實施例中，該二聚域進一步包含與SEQ ID NO: 29至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
在一些實施例中，m為2。
在其他實施例中，m為3。
在其他實施例中，m為4。
在其他實施例中，m為5。
在其他實施例中，m為大於5之整數。
在一些實施例中，n為2。
在其他實施例中，n為3。
在額外實施例中，n為4。
在其他實施例中，n為5。
在其他實施例中，n為大於5之整數。
在一些實施例中，該多肽包含式II： X-(Aba1 )-(Lb1 )-(DD)-(Lc1 )-(Abd1 )-Y (式II)。
在一些實施例中，該多肽包含式III： X-(Aba1 )-(Lb1 )-(DD)-(Lc1 )-(Abd1 )-(Lc 2 )-(Abd 2 )-Y (式III)。
在一些實施例中，該多肽包含式IV： X-(Aba1 )-(Lb 2 )-(Aba 2 )-(Lb1 )-(DD)-(Lc1 )-(Abd1 )-Y (式IV)。
在一些實施例中，該多肽包含式V： X-(Aba1 )-(Lb 2 )-(Aba 2 )-(Lb1 )-(DD)-(Lc1 )-(Abd1 )-(Lc 2 )-(Abd 2 )-Y (式V)。
在一些實施例中，該多肽包含式VI： X-(Aba1 )-(Lb2 )-(Aba2 )-(Lb1 )-(DD)-(Lc1 )-(Abd1 )-(Lc2 )-(Abd2 )-(Lc3 )-(Abd3 )-Y (式VI)。
在一些實施例中，該多肽包含式VII： X-(Aba1 )-(Lb3 )-(Aba2 )-(Lb2 )-(Aba3 )-(Lb1 )-(DD)-(Lc1 )-(Abd1 )-(Lc2 )-(Abd2 )-Y (式VII)。
在一些實施例中，該多肽包含式VIII： X-(Aba1 )-(Lb3 )-(Aba2 )-(Lb2 )-(Aba3 )-(Lb1 )-(DD)-(Lc1 )-(Abd1 )-(Lc2 )-(Abd2 )-(Lc3 )-(Abd3 )-Y (式VIII)。
在一些實施例中，Lc1 為剛性連接子。
在一些實施例中，Lc2 為剛性連接子。
在一些實施例中，Lc3 為剛性連接子。
在一些實施例中，Lc1 及Lc2 為剛性連接子。
在一些實施例中，Lc1 、Lc2 及Lc3 為剛性連接子。
在實施例中，該抗原結合域為單域抗體(sdAb)。
在實施例中，該抗原結合域為重鏈可變區(VH或VHH)。
在一些實施例中，該VHH係來源於人類、小鼠、大鼠等。
在一些實施例中，該VHH係來自能夠表現駱駝化小鼠或大鼠VHH、來自其他物種(例如人類等)之VHH或來自其他物種之駱駝化VHH (例如駱駝化人類VHH等)的轉殖基因小鼠或大鼠。
在實施例中，該抗原結合域為輕鏈可變區(VL或VLL)。
在實施例中，該抗原結合域為單鏈可變片段(ScFv)。
在實施例中，該抗原結合域為VNAR 片段。
在其他實施例中，該多肽之該等抗原結合域包含單域抗體(sdAb)、重鏈可變區(VH或VHH)、輕鏈可變區(VL或VLL)、單鏈可變片段(ScFv)及/或VNAR 片段之任何組合。
在一些實施例中，該sdAb或VHH係來自駱駝科抗體。
在實施例中，該駱駝科抗體係來自單峰駝、駱駝、駱馬、羊駝等。
在其他實施例中，該sdAb或VHH係來自軟骨魚抗體。
在實施例中，該軟骨魚抗體為鯊魚抗體。
在一些實施例中，各個別抗原結合域特異性結合於不同抗原決定基。
在其他實施例中，各個別抗原結合域特異性結合於不同抗原。
在其他實施例中，各個別抗原結合域特異性結合於不同蛋白質。
在一些實施例中，該多肽包含至少一個結合於由腫瘤表現之蛋白質的抗原結合域。在其他實施例中，該多肽包含至少一個結合於由腫瘤表現且調節其活性之蛋白質的抗原結合域。
在一些實施例中，該多肽包含至少一個結合於免疫檢查點蛋白之抗原結合域。在其他實施例中，該多肽包含至少一個結合於免疫檢查點蛋白且調節其活性的抗原結合域。
在一些實施例中，該多肽包含至少一個結合於免疫細胞蛋白質之抗原結合域。在其他實施例中，該多肽包含至少一個結合於免疫細胞蛋白質且調節其活性的抗原結合域。在其他實施例中，該多肽包含至少一個結合於或接合且募集或重引導免疫細胞的抗原結合域。
在一些實施例中，該多肽包含至少一個結合於周邊血液單核細胞(PBMC)的抗原結合域。在其他實施例中，該多肽包含至少一個結合於PBMC且調節其活性的抗原結合域。在其他實施例中，該多肽包含至少一個結合於PBMC且募集或重引導PBMC的抗原結合域。
在一些實施例中，該多肽包含至少一個結合於T細胞蛋白質之抗原結合域。在其他實施例中，該多肽包含至少一個結合於T細胞蛋白質且調節其活性的抗原結合域。在其他實施例中，該多肽包含至少一個結合於T細胞蛋白質且募集或重引導T細胞的抗原結合域。
在一些實施例中，該多肽包含至少一個結合於由腫瘤表現之蛋白質的抗原結合域及至少一個結合且募集或重引導免疫細胞的抗原結合域。
在一些實施例中，該多肽包含至少一個結合於由腫瘤表現之蛋白質的抗原結合域、至少一個結合於免疫檢查點蛋白之抗原結合域及至少一個結合且募集或重引導免疫細胞的抗原結合域。
在一些實施例中，該多肽包含至少一個調節免疫檢查點抑制劑的抗原結合域。
在一些實施例中，該多肽包含至少一個結合於腫瘤抗原的抗原結合域、至少一個結合於免疫檢查點蛋白的抗原結合域及至少一個結合於T細胞的抗原結合域。
在一些實施例中，該多肽包含至少一個結合於腫瘤抗原的抗原結合域、至少一個結合於免疫檢查點蛋白的抗原結合域及至少一個結合於CD3的抗原結合域。
在一些實施例中，該多肽包含至少一個調節CD3功能的抗原結合域。
在一些實施例中，該多肽包含特異性結合於受體的抗原結合域。
在實施例中，該受體為G蛋白偶合受體。
在實施例中，該G蛋白偶合受體為多巴胺受體。
在一些實施例中，該多巴胺受體為多巴胺受體D1 (DRD1)、多巴胺受體D2 (DRD2)、多巴胺受體D3 (DRD3)、多巴胺受體D4 (DRD4)或多巴胺受體D5 (DRD5)。
在一些實施例中，該多肽包含特異性結合於腫瘤抗原的抗原結合域及特異性結合於免疫調節劑的抗原結合域。
在一些實施例中，特異性結合於腫瘤抗原之該抗原結合域在該二聚域之N端，且特異性結合於免疫調節劑之該抗原結合域在該二聚域之C端。
在一些實施例中，該免疫調節劑為免疫檢查點蛋白、細胞介素、趨化介素或免疫受體或輔助受體。
在一些實施例中，該多肽包含一或多個特異性結合於以下之抗原結合域：CD36、DRD1、DRD2、DRD3、DRD4、DRD5、PD-L1、TROP2、CD147、MCT1、IL1RAP、AMIGO2、PTK7、MCT2、MCT4、NHE1、H+/K+-ATP酶、LAP、HLA-I A2、CD73、CD98、CEACAM5/6、ICAM-1、MCSP、纖維結合蛋白、β1整合素、四跨膜蛋白8 (Tetraspanin 8)、CD164、CD59、CD63、CD44、CD166、cWF、TNF、IL-17A、IL17-F、IL-6R、BCMA、TNF、RANKL、ADAMTS5、VEGF、Ang2、CX3 CR1、CXCR4、TfR1 (CD71)、CXCR2、CD3、PD1、PDL-1、CTLA-4、CD8、LAG-3、OX40、CD27、CD122/IL2RB、TLR8/CD288、TIM-3、ICOS/CD278、NKG2A、A2AR、B7-H3、GITR/TNFRSF18、4-IBB/CD137、KIR2DL1、KIR3DL2、SIRPα、CD47、VISTA、CD40、CD112、CD96、TOGOT、BTLA、TIGIT、LAG-3、CD4、VEGFR2、CD19、IGFR1、EpCAM、EGFR、DLL3、CGRP、CD79b、CD28、CCR5、ErbB3、ErbB2、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβR1、TGFβR2、IDO1、IDO2、TLR-4、TLR-7、TLR-8、TLR-9、SARS-CoV-1刺突蛋白、SARS-CoV-2刺突蛋白或其組合。
在一些實施例中，該多肽包含一或多個在二聚域N端的抗原結合域，其特異性結合於CD36、DRD1、DRD2、DRD3、DRD4、DRD5、PD-L1、TROP2、CD147、MCT1、IL1RAP、AMIGO2、PTK7、MCT2、MCT4、NHE1、H+/K+-ATP酶、LAP、HLA-I A2、CD73、CD98、CEACAM5/6、ICAM-1、MCSP、纖維結合蛋白、β1整合素、四跨膜蛋白8、CD164、CD59、CD63、CD44、CD166、cWF、TNF、IL-17A、IL17-F、IL-6R、BCMA、TNF、RANKL、ADAMTS5、VEGF、Ang2、CX3 CR1、CXCR4、TfR1 (CD71)、CXCR2、VEGFR2、CD19、IGFR1、EpCAM、EGFR、DLL3、CGRP、CD79b、CD28、CCR5、ErbB3、ErbB2、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβR1-TGFβR2、IDO1、IDO2、TLR-4、TLR-7、TLR-8、TLR-9或其組合。
在一些實施例中，多肽包含一或多個在二聚域N端的抗原結合域，其特異性結合於CD36、DRD1、DRD2、PD-L1或TROP2。
在一些實施例中，該多肽包含一或多個在二聚域C端的抗原結合域，其特異性結合於CD3、PD1、PDL-1、CTLA-4、CD8、LAG-3、OX40、CD27、CD122/IL2RB、TLR8/CD288、TIM-3、ICOS/CD278、NKG2A、A2AR、B7-H3、GITR/TNFRSF18、4-IBB/CD137、KIR2DL1、KIR3DL2、SIRPα、CD47、VISTA、CD40、CD112、CD96、TOGOT、BTLA、TIGIT、LAG-3、CD4或其組合。
在一些實施例中，該多肽包含一或多個在二聚域C端的抗原結合域，其特異性結合於CD3、PD1、CTLA-4、CD8、LAG-3、OX40、CD27、CD122/IL2RB、TLR8/CD288、Tim3、ICOS/CD278、NKG2A、A2AR、B7-H3、GITR/TNFRSF18、4-IBB/CD137、KIR2DL1、KIR3DL2、SIRPα、CD47、VISTA、CD40、CD112、CD96、TOGOT、BTLA或CD4。
本文中應理解，給定抗原結合域可結合於存在於不同蛋白質中之抗原決定基。如此，在一些實施例中，抗原結合域或多肽或包含多肽之蛋白質複合物可結合於超過一種蛋白質。在一些實施例中，抗原結合域或多肽或包含多肽之蛋白質複合物可對超過一種蛋白質具有親和力。
在一些實施例中，多肽包含一或多個結合病毒抗原之抗原結合域。在一些實施例中，該病毒抗原包括來自包膜病毒之蛋白質。在一些實施例中，該病毒抗原包括病毒糖蛋白。在一些實施例中，該病毒抗原包括刺突蛋白。
在一些實施例中，該多肽包含一或多個結合SARS-CoV蛋白之抗原結合域。舉例而言，該多肽可包含一或多個結合於SARS-CoV-1刺突蛋白之抗原結合域。舉例而言，該多肽可包含一或多個結合於SARS-CoV-2刺突蛋白之抗原結合域。
在一些實施例中，該多肽包含至少兩個在二聚域C端的抗原結合域，其分別特異性結合於CD3及PD1。
在一些實施例中，該等抗原結合域中之一或多者經人類化。
在一些實施例中，X或Y係獨立地選自由以下組成之群：連接子、細胞介素、趨化介素、標籤、掩蔽域、噬菌體鞘蛋白(pIII、pVI、pV、pVII或pIX)、抗原結合域或其組合。
在一些實施例中，該多肽係與治療部分、可偵測部分或允許延長半衰期之蛋白質結合或係連接於奈米粒子。
本發明之其他態樣及實施例係關於一種醫藥組合物，其包含本文中所揭示之多肽及醫藥學上可接受之載劑。
本發明之其他態樣及實施例係關於一種核酸，其編碼本文中所揭示之多肽或多肽鏈。
在其他態樣及實施例中，本發明係關於一種核酸，其編碼包括本文中所揭示之抗原結合域、二聚域、連接子或其組合的個別模組。該核酸可呈如本文中所揭示之DNA區段形式。
本發明之額外態樣及實施例係關於一種載體，其包含本文中所揭示之核酸。
本發明之其他態樣及實施例係關於一種細胞，其表現本文中所揭示之多肽。
本發明之額外態樣及實施例係關於一種細胞，其包含本文中所揭示之核酸或載體。
本發明之其他態樣及實施例係關於一種套組，其包含本文中所揭示之多肽。
本發明之其他態樣及實施例係關於一種套組，其包含本文中所揭示之核酸、載體或細胞。
在其他態樣及實施例中，本發明係關於一種蛋白質複合物，其包含本文中所揭示之第一多肽鏈及第二多肽鏈。在一些實施例中，該第一及第二多肽相同或不同。在一些實施例中，該第一及第二多肽包含相同或不同胺基酸序列。
在一些實施例中，該蛋白質複合物係由多肽鏈製得，該等多肽鏈包括一個在二聚域之N端之抗原結合域及一個或兩個在C端之抗原結合域。
本發明之蛋白質複合物可包含兩個靶向不同免疫調節劑之抗原結合域。
在一些實施例中，該等多肽鏈包括一個腫瘤靶向抗原結合域及兩個結合不同免疫調節劑之抗原結合域，從而產生六價及三特異性蛋白質複合物。當兩個此類多肽鏈包含有助於異二聚體形成之CH3域時，可獲得六價及六特異性蛋白質複合物。
在其他態樣及實施例中，本發明係關於一種蛋白質複合物，其包含：a) 第一多肽，該第一多肽包含一或多個抗原結合域及第一二聚域(DD1 )，該第一二聚域包含有包含一或多個根據EU編號在對應於399、356及/或370之位置處之突變的CH3域；及b) 第二多肽，該第二多肽包含一或多個抗原結合域及第二二聚域(DD2 )，該第二二聚域包含有包含一或多個根據EU編號在對應於399、357及/或439之位置處之突變的CH3域，其中該第一及第二多肽形成二聚體。
在其他態樣及實施例中，本發明係關於一種蛋白質複合物，其包含：a) 第一多肽，該第一多肽包含一或多個抗原結合域及第一二聚域(DD1 )，該第一二聚域包含有包含一或多個根據EU編號在對應於D399、D/E356及/或K370之位置處之突變的CH3域，及b) 第二多肽，該第二多肽包含一或多個抗原結合域及第二二聚域(DD2 )，該第二二聚域包含有包含一或多個根據EU編號在對應於D399、E357及/或K439之位置處之突變的CH3域，其中該第一及第二多肽形成二聚體。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )及/或第二二聚域(DD2)包含有包含根據EU編號在對應於349、350、351、352、354、355、394及/或395之位置處之其他突變的CH3域。
在其他實施例中，該第一二聚域(DD1 )及/或第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號在對應於Y349、T350、L351、P352、S354、R355或Q355、T394及/或P395之位置處之其他突變的CH3域。
在一些實施例中，該其他突變係在第一二聚域中之位置Y349處。
在一些實施例中，該其他突變係在第一二聚域中之位置T350處。
在一些實施例中，該其他突變係在第一二聚域中之位置L351處。
在一些實施例中，該其他突變係在第一二聚域中之位置P352處。
在一些實施例中，該其他突變係在第一二聚域中之位置S354處。
在一些實施例中，該其他突變係在第一二聚域中之位置R355處。
在一些實施例中，該其他突變係在第一二聚域中之位置Q355處。
在一些實施例中，該等其他突變係在第一二聚域中之位置Y349及S354處。
在一些實施例中，該其他突變係在第二二聚域中之位置Y349處。
在一些實施例中，該其他突變係在第二二聚域中之位置T350處。
在一些實施例中，該其他突變係在第二二聚域中之位置L351處。
在一些實施例中，該其他突變係在第二二聚域中之位置P352處。
在一些實施例中，該其他突變係在第二二聚域中之位置S354處。
在一些實施例中，該其他突變係在第二二聚域中之位置R355處。
在一些實施例中，該其他突變係在第二二聚域中之位置Q355處。
在一些實施例中，該其他突變係在第二二聚域中之位置P395處。
在一些實施例中，該等其他突變係在第二二聚域中之位置Y349及S354處。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q及K370E的CH3域，且第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q及K439E的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q及K370E的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q及K439E的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399Q、D/E356Q、K370E、Y349K及S354K的CH3域，且該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399Q、E357Q、K439E、Y349D及S354D的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399Q、D/E356Q、K370E、Y349K及S354K的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399Q、E357Q、K439E、Y349D及S354D的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及L351W的CH3域，且第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及L351R的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及L351W的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及L351R的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及S354M的CH3域，且第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及L351Y的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及S354M的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及L351Y的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及T350I的CH3域，且第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及T350I的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及T350I的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及T350I的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及T350V的CH3域，且第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及T350V的CH3域。在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及T350V的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及T350V的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352R的CH3域，且第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及L351R的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352R的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及L351R的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352E的CH3域，且第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及L351R的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352E的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及L351R的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399Q、D/E356Q及K370E的CH3域，且第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399Q、E357Q及K439E的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399Q、D/E356Q及K370E的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399Q、E357Q及K439E的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及L351Y的CH3域，且第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及S354K的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及L351Y的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及S354K的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及L351H的CH3域，且該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及S354W的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及L351H的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及S354W的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及R355K的CH3域，且該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及Y349R的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及R355K的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及Y349R的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及Q355K的CH3域，且該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及Y349R的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及Q355K的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及Y349R的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及S354K的CH3域，且該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及T350L的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及S354K的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及T350L的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及T350L的CH3域，且該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及R355W的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及T350L的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及R355W的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及T350L的CH3域，且該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及Q355W的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及T350L的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及Q355W的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及T394N的CH3域，且該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及P395I的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及T394N的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及P395I的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及T394N的CH3域，且該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及P395G的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及T394N的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及P395G的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及T394N的CH3域，且該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及P395E的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及T394N的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及P395E的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352Y的CH3域，且該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及P352K的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352Y的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及P352K的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352V的CH3域，且該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及P352K的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352V的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及P352K的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352T的CH3域，且該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及P352K的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352T的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及P352K的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352R的CH3域，且該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及P352K的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352R的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及P352K的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352R的CH3域，且第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及P352D的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352R的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及P352D的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352L的CH3域，且該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及P352K的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352L的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及P352K的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352G的CH3域，且該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及P352K的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352G的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及P352K的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352C的CH3域，且該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及P352K的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352C的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及P352K的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352C的CH3域，且第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及P352D的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352C的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及P352D的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及L351T的CH3域，且該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及P352K的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及L351T的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及P352K的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及L351A的CH3域，且該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及L351R的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及L351A的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及L351R的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352Y的CH3域，且該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q及K439E的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352Y的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q及K439E的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399Q、D/E356Q、K370E、Y349K及S354K的CH3域，且該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q及K439E的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399Q、D/E356Q、K370E、Y349K及S354K的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q及K439E的CH3域。
在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399Q、D/E356Q、K370E、Y349K及S354K的CH3域，且該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399Q、E357Q、K439E及L351R的CH3域。因此，在一些實施例中，該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399Q、D/E356Q、K370E、Y349K及S354K的CH3域。在一些實施例中，該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及L351R的CH3域。
在一些實施例中，該蛋白質複合物可由第一多肽及第二多肽構成，該第一多肽包含具有本文中所揭示之任一胺基酸序列的第一二聚域(DD1 )，該第二多肽包含具有本文中所揭示之任一胺基酸序列的第二二聚域(DD2 )。
在一些實施例中，蛋白質複合物之第一及第二多肽各獨立地以N端至C端方式包含式Ia之胺基酸序列： X-[(Aba )-(Lb )]m -(DD)-[(Lc )-(Abd )]n -Y 其中m為0、1或大於1之整數； 其中n為0、1或大於1之整數，其限制條件為m及n不同時為0； 其中Aba 、Abd 各獨立地包含有包含抗體之一或多個互補決定區(CDR)的抗原結合域； 其中X或Y獨立地存在或不存在且包含胺基酸序列； 其中Lb 、Lc 各獨立地包含一或多個連接子；且 其中DD為該第一多肽中之該第一二聚域(DD1 )及該第二多肽中之該第二二聚域(DD2 )。
在一些實施例中，第一及第二多肽各獨立地為本文中所揭示之多肽。
在一些實施例中，第一及第二多肽各獨立地為具有式III之多肽，且二聚域為天然二聚域。
在一些實施例中，第一及第二多肽各獨立地為具有式III之多肽，且二聚域為突變二聚域。
在一些實施例中，第一多肽包含式II且第二多肽包含式III，且二聚域為天然二聚域。
在一些實施例中，第一多肽包含式II且第二多肽包含式III，且二聚域為突變二聚域。
在一些實施例中，蛋白質複合物為多特異性的。
在一些實施例中，蛋白質複合物為雙特異性、三特異性或四特異性的。
在一些實施例中，蛋白質複合物之第一及第二多肽具有相同價數及特異性。
在一些實施例中，蛋白質複合物之第一及第二多肽具有不同價數及特異性。
在一些實施例中，蛋白質複合物為雙特異性抗體，且視情況，第一及第二多肽各為抗體重鏈。
在一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含第一抗體輕鏈及第二抗體輕鏈。
在其他態樣及實施例中，本發明係關於一種組合物，其包含本文中所揭示之蛋白質複合物。
在其他態樣及實施例中，本發明係關於一種組合物，其包含單體、二聚體及其混合物。
在一些實施例中，超過70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%之第一及第二多肽以二聚體之形式存在於組合物中。
在一些實施例中，超過70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%之第一及第二多肽以同二聚體之形式存在於組合物中。
在一些實施例中，超過70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%之第一及第二多肽以異二聚體之形式存在於組合物中。
在額外態樣及實施例中，本發明係關於一種治療病症或疾病的方法，其包含投與本文中所揭示之多肽。
在其他態樣及實施例中，本發明係關於一種治療病症或疾病的方法，其包含投與本文中所揭示之蛋白質複合物。
在其他態樣及實施例中，本發明係關於一種治療病症或疾病的方法，其包含投與本文中所揭示之組合物。
在一些實施例中，該病症或疾病為癌症。
在一些實施例中，該病症或疾病為感染。
在一些實施例中，該病症或疾病為免疫失調。
在其他態樣及實施例中，本發明係關於一種製造蛋白質複合物的方法，該方法包含用一或多個包含本文中所揭示之核酸之載體轉化細胞。
在一些實施例中，該方法可進一步包含自雜質分離及/或純化多肽複合物。
在其他實施例中，該方法可進一步包含自單體及/或同二聚體分離及/或純化異二聚體。
在其他實施例中，該方法可進一步包含自單體及/或異二聚體分離及/或純化同二聚體。
在其他態樣及實施例中，本發明係關於一種套組，其在同一個或分開之小瓶中包含一或多種編碼本文中所揭示之二聚域的核酸、一或多種編碼抗原結合域之核酸及視情況存在之一或多種編碼連接子之核酸。在一些實施例中，該二聚域係來自人類抗體。
在一些實施例中，各核酸為載體。
在其他實施例中，各核酸為DNA區段，其包含允許在獨特位置組裝至用於編碼多肽鏈之DNA構築體中的獨特突出端。
在一些實施例中，一或多種編碼二聚域之核酸包含具有根據EU編號之位置356、357、370、399及/或439處之胺基酸取代的人類IgG1之突變CH3域。
在一些實施例中，二聚域包含具有位置356、357、370、399及/或439處之胺基酸取代及對應於349、350、351、352、354、355、394及/或395之位置處之其他胺基酸取代的人類IgG1之突變CH3域。
在一些實施例中，二聚域包含具有位置D/E356、E357、K370、D399及/或K439處之胺基酸取代及在對應於Y349、T350、L351、P352、S354、R355或Q355、T394及/或P395之位置處之其他胺基酸取代的人類IgG1之突變CH3域。
更特定言之，在一些例示性實施例中，二聚域包含具有位置D/E356、E357、K370、D399及/或K439處之胺基酸取代及在對應於Y349、T350、L351、P352及/或S354之位置處之其他胺基酸取代的人類IgG1之突變CH3域。
在一些實施例中，核酸各自為DNA區段，且套組在同一個或分開之小瓶中包含： a)     編碼二聚域之DNA區段，該二聚域包含具有根據EU編號之位置356、370及399處之胺基酸取代的人類IgG1之突變CH3域； b)     編碼二聚域之DNA區段，該二聚域包含具有位置357、399及439處之胺基酸取代的人類IgG1之突變CH3域； c)     一或多個編碼一或多個抗原結合域之DNA區段；及 d)     視情況存在之一或多個編碼一或多個連接子之DNA區段； 其中各核酸為DNA區段，其包含允許在獨特位置組裝至用於編碼多肽鏈之DNA構築體中的獨特突出端。
在一些實施例中，該套組係用於組裝編碼式Ia、式Ib或式Ic之多肽鏈的DNA構築體。
在其他實施例中，該套組係用於組裝編碼式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之多肽鏈的DNA構築體。
在其他態樣及實施例中，本發明係關於一種製造編碼本文中所揭示之多肽之核酸的方法，該方法包含共價組裝一或多個編碼人類抗體之二聚域的DNA區段及一或多個編碼抗原結合域之DNA區段以及視情況存在之一或多個編碼連接子之DNA區段，其中各DNA區段包含允許在獨特位置處組裝至用於編碼多肽鏈之DNA構築體中的獨特突出端。
在一些實施例中，至少一個DNA區段編碼天然抗體之二聚域。
在一些實施例中，至少一個DNA區段編碼包含CH3域之突變二聚域，該CH3域包含有助於異二聚體形成之胺基酸取代。
在一些實施例中，至少一個DNA區段編碼如本文中所描述之二聚域(DD)。
在一些實施例中，至少一個DNA區段編碼具有本文中所揭示之胺基酸序列的第一二聚域(DD1 )。
在一些實施例中，至少一個DNA區段編碼具有本文中所揭示之胺基酸序列的第二二聚域(DD2 )。
在一些實施例中，該胺基酸取代包含位置356、370及399處之胺基酸取代。
在一些實施例中，該胺基酸取代包含根據EU編號之位置357、399及439處的胺基酸取代。
在一些實施例中，該DNA區段編碼包含位置356、370及399處之胺基酸取代及視情況存在之選自349、350、351、352、354、355、394及/或395之位置處之其他突變的突變二聚域。因此，在一些實施例中，該DNA區段編碼包含位置356處之胺基酸取代的突變二聚域。在一些實施例中，該DNA區段編碼包含位置370處之胺基酸取代的突變二聚域。在一些實施例中，該DNA區段編碼包含位置399處之胺基酸取代的突變二聚域。在一些實施例中，該DNA區段編碼包含位置356、370及399處之胺基酸取代的突變二聚域。在一些實施例中，該DNA區段編碼進一步包含位置349處之突變的突變二聚域。在一些實施例中，該DNA區段編碼進一步包含位置350處之突變的突變二聚域。在一些實施例中，該DNA區段編碼進一步包含位置351處之突變的突變二聚域。在一些實施例中，該DNA區段編碼進一步包含位置352處之突變的突變二聚域。在一些實施例中，該DNA區段編碼進一步包含位置354處之突變的突變二聚域。在一些實施例中，該DNA區段編碼進一步包含位置355處之突變的突變二聚域。在一些實施例中，該DNA區段編碼進一步包含位置394處之突變的突變二聚域。在一些實施例中，該DNA區段編碼進一步包含位置395處之突變的突變二聚域。
在一些實施例中，該DNA區段編碼包含位置357、399及439處之胺基酸取代及視情況存在之選自349、350、351、352、354、355、394及/或395之位置處之其他突變的突變二聚域。
因此，在一些實施例中，該DNA區段編碼包含位置357處之胺基酸取代的突變二聚域。在一些實施例中，該DNA區段編碼包含位置399處之胺基酸取代的突變二聚域。在一些實施例中，該DNA區段編碼包含位置439處之胺基酸取代的突變二聚域。在一些實施例中，該DNA區段編碼包含位置357、399及439處之胺基酸取代的突變二聚域。在一些實施例中，該DNA區段編碼進一步包含位置349處之突變的突變二聚域。在一些實施例中，該DNA區段編碼進一步包含位置350處之突變的突變二聚域。在一些實施例中，該DNA區段編碼進一步包含位置351處之突變的突變二聚域。在一些實施例中，該DNA區段編碼進一步包含位置352處之突變的突變二聚域。在一些實施例中，該DNA區段編碼進一步包含位置354處之突變的突變二聚域。在一些實施例中，該DNA區段編碼進一步包含位置355處之突變的突變二聚域。在一些實施例中，該DNA區段編碼進一步包含位置394處之突變的突變二聚域。在一些實施例中，該DNA區段編碼進一步包含位置395處之突變的突變二聚域。在一些實施例中，該核酸包含至少兩個編碼抗原結合域之DNA區段。
在一些實施例中，該核酸包含至少三個編碼抗原結合域之DNA區段。
在一些實施例中，該核酸包含至少四個編碼抗原結合域之DNA區段。
在一些實施例中，該核酸包含至少一個在編碼二聚域之DNA區段之5'端及3'端中之每一者處編碼抗原結合域的DNA區段。
在其他態樣及實施例中，本發明係關於一種製造本文中所揭示之多肽或蛋白質複合物的方法，該方法包含用藉由包含以下之方法製得之核酸轉化細胞：共價組裝一或多個編碼人類抗體之二聚域的DNA區段及一或多個編碼抗原結合域之DNA區段以及視情況存在之一或多個編碼連接子之DNA區段，其中各DNA區段包含允許在獨特位置處組裝至用於編碼多肽鏈之DNA構築體中的獨特突出端。
在一些實施例中，DNA區段中之一或多者編碼二聚域，該二聚域包含a) 具有根據EU編號之位置356、370及399處之胺基酸取代的人類IgG1之突變CH3域或b) 具有位置357、399及439處之胺基酸取代的人類IgG1之突變CH3域。
在一些實施例中，一個DNA區段編碼包含具有根據EU編號之位置356、370及399處之胺基酸取代的人類IgG1之突變CH3域的二聚域，且另一DNA區段編碼具有位置357、399及439處之胺基酸取代的人類IgG1之突變CH3域。
在一些實施例中，突變CH3域包含一或多個選自349、350、351、352、354、355、394及/或395之位置處的其他胺基酸取代。因此，在一些實施例中，突變CH3域包含位置349處之其他胺基酸取代。在一些實施例中，突變CH3域包含位置350處之其他胺基酸取代。在一些實施例中，突變CH3域包含位置351處之其他胺基酸取代。在一些實施例中，突變CH3域包含位置352處之其他胺基酸取代。在一些實施例中，突變CH3域包含位置354處之其他胺基酸取代。在一些實施例中，該DNA區段編碼進一步包含位置355處之突變的突變二聚域。在一些實施例中，該DNA區段編碼進一步包含位置394處之突變的突變二聚域。在一些實施例中，該DNA區段編碼進一步包含位置395處之突變的突變二聚域。
本發明之其他範疇、可應用性及優勢將自在下文中給出之非限定性詳細描述顯而易見。然而，應理解，此詳細描述雖然指示本發明之例示性實施例，但僅參考隨附圖式以實例方式給出。
定義 除非另有指示，否則指示用於二聚域之胺基酸編號係根據EU編號系統。
除非本文另有指示或明顯與上下文相矛盾，否則在描述實施例之上下文中(尤其在申請專利範圍之上下文中)使用術語「一」及「該」及類似參照詞應理解為涵蓋單數及複數。
除非明確陳述或自上下文顯而易見，否則如本文所用之術語「或」應理解為包括性的且涵蓋「或」與「及」。
本文所使用之術語「及/或」應視為指定特徵或組分中之每一者具有或不具有另一者之特定揭示內容。
除非另外指出，否則術語「包含」、「具有」、「包括」及「含有」應理解為開放式術語(亦即，意謂「包括但不限於」)。術語「由...組成」被視為封閉式的。
術語「治療」出於本發明之目的係指治療性治療及防治性或預防性措施。需要治療者包括已患該病症者以及傾向於患該病症者；以及有待預防該病症者。
關於給定值之術語「約」或「大約」意謂該數值中的變化係經審慎考慮。在一些實施例中，術語「約」或「大約」一般意謂給定值或範圍之+/- 20%內、+/- 10%內、+/- 5%內、+/- 4%內、+/- 3%內、+/- 2%內或+/- 1%內的範圍。
提及抗原結合域之術語「功能活性」意謂該抗原結合域能夠結合於其目標且視情況，該抗原結合域具有一或多種生物活性。
如本文所用，術語「可撓性連接子」係指包含至少一個由允許鄰近模組相對於彼此移動之可撓性胺基酸殘基構成之部分的肽。
如本文所用，術語「剛性連接子」係指包含至少一個由展現剛性結構且保持兩個模組之間的距離之胺基酸構成之部分的肽。
如本文所用，術語「螺旋狀連接子」意謂由採用α-螺旋狀構形之胺基酸殘基構成的連接子。
如本文所用，術語「可裂解連接子」係指包含對選自由以下組成之群的蛋白酶敏感之酶裂解位點的肽：ADAMS、ADAMTS、天冬胺酸蛋白酶、凋亡蛋白酶、半胱胺酸組織蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、金屬蛋白酶、絲胺酸蛋白酶、凝血因子蛋白酶、II型跨膜絲胺酸蛋白酶(TTSP)及其組合。
在本文中應理解，以諸如「A至B」之格式提及值範圍的表述包括各個別值以及此類範圍所包含及包括之任何子範圍。舉例而言，表述「1至10」包括諸如而不限於「2至10」、「2至9」、「3至6」、「5至7」及包含於1與10之間且包括1及10的任何個別值，亦即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在本文中應理解，關於給定值之術語「至少」意欲包括該值及上位值。舉例而言，術語「至少80%」包括「至少81%」、「至少82%」、「至少83%」、「至少84%」、「至少85%」、「至少86%」、「至少87%」、「至少88%」、「至少89%」、「至少90%」、「至少91%」、「至少92%」、「至少93%」、「至少94%」、「至少95%」、「至少96%」、「至少97%」、「至少98%」、「至少99%」、「至少99.1%」、「至少99.2%」、「至少99.3%」、「至少99.4%」、「至少99.5%」、「至少99.6%」、「至少99.7%」、「至少99.8%」、「至少99.9%」及100%。
多肽 編碼所需多肽序列的DNA之區段係活體外合成。不同DNA模組以經組織且定向方式組裝成單一片段，隨後將該片段選殖至表現載體中。因此，所得多肽係由形成單鏈之不同模組構成。
本發明之多肽包括例如而不限於抗原結合域、連接子及促進至少兩個多肽鏈之組裝的二聚域。
在例示性構形中，一或多個抗原結合域可位於二聚域之N端、C端或每一側處。
在另一例示性構形中，多肽可包含至少一個在二聚域之N端的抗原結合域及至少一個在二聚域之C端的抗原結合域。
在另一例示性構形中，多肽可包含一個在二聚域之N端的抗原結合域及至少兩個在二聚域之C端的抗原結合域。
在又一例示性構形中，多肽可包含兩個在二聚域之N端的抗原結合域及兩個在二聚域之C端的抗原結合域。
在一些實施例中，多肽可以N端至C端方式包含具有式 Ia 中所闡述之構形的胺基酸序列： X-[(Aba )-(Lb )]m -(DD)-[(Lc )-(Abd )]n - Y 其中m可為0、1或大於1之整數； 其中n可為0、1或大於1之整數，其限制條件為m及n不同時為0； 其中Aba 、Abd 可各獨立地包含有包含抗體之一或多個互補決定區(CDR)的抗原結合域； 其中X或Y可獨立地存在或不存在且可包含胺基酸序列； 其中Lb 、Lc 可各獨立地包含一或多個連接子；且 其中DD包含二聚域。
在一些實施例中，多肽可以N端至C端方式包含具有式 Ib 中所闡述之構形的胺基酸序列： X-[(Aba )-(Lb )]m -(DD)-[(Lc )-(Abd )]n - Y 其中m可為0、1或大於1之整數； 其中n可為2或大於2之整數； 其中Aba 、Abd 可各獨立地包含有包含抗體之一或多個互補決定區(CDR)的抗原結合域； 其中X或Y可獨立地存在或不存在且可包含胺基酸序列； 其中Lb 、Lc 可各獨立地包含一或多個連接子； 其中Lc 不包含可裂解連接子；且 其中DD可包含二聚域。
在例示性實施例中，m可為2。在其他例示性實施例中，m可為3。在其他例示性實施例中，m可為4。在額外例示性實施例中，m可為5。在其他例示性實施例中，m可大於5。
在例示性實施例中，n可為2。在其他例示性實施例中，n可為3。在其他例示性實施例中，n可為4。在其他例示性實施例中，n可為5。在其他例示性實施例中，n可大於5。
在本文中應理解，在本文中所揭示之式 Ia 、式 Ib 或式 Ic 中，當m為2或大於2之整數時，Aba 、Lb 或由(Aba )-(Lb )定義之各單元中之每一者可相同或不同。
在本文中應理解，在本文中所揭示之式 Ia 、式 Ib 或式 Ic 中，當n為2或大於2之整數時，Abd 、Lc 或由(Lc )-(Abd )定義之各單元中之每一者可相同或不同。
多肽之實施例包括例如而不限於具有式 II 中所闡述之構形、式 III 中所闡述之構形、式 IV 中所闡述之構形、式 V 中所闡述之構形、式 VI 中所闡述之構形、式 VII 中所闡述之構形、式 VIII 中所闡述之構形的多肽。 X-(Aba1 )-(Lb1 )-(DD)-(Lc1 )-(Abd1 )-Y (式 II)； X-(Aba1 )-(Lb1 )-(DD)-(Lc1)-(Abd1 )-(Lc 2 )-(Abd 2 )-Y (式 III)； X-(Aba1 )-(Lb 2 )-(Aba 2 )-(Lb1 )-(DD)-(Lc1 )-(Abd1 )-Y (式 IV)； X-(Aba1 )-(Lb 2 )-(Aba 2 )-(Lb1 )-(DD)-(Lc1 )-(Abd1 )-(Lc 2 )-(Abd 2 )-Y (式 V) X-(Aba1 )-(Lb2 )-(Aba2 )-(Lb1 )-(DD)-(Lc1 )-(Abd1 )-(Lc2 )-(Abd2 )-(Lc3 )-(Abd3 )-Y (式 VI)； X-(Aba1 )-(Lb3 )-(Aba2 )-(Lb2 )-(Aba3 )-(Lb1 )-(DD)-(Lc1 )-(Abd1 )-(Lc2 )-(Abd2 )-Y (式 VII )； X-(Abal )-(Lb3 )-(Aba2 )-(Lb2 )-(Aba3 )-(Lbl )-(DD)-(Lcl )-(Abdl )-(Lc2 )-(Abd2 )-(Lc3 )-(Abd3 )-Y(式VIII )。 其中X、Y及DD如在式 Ia 、式 Ib 或式 Ic 中所定義； 其中Aba1 、Aba2 、Aba3 、Abd1 、Abd2 、Abd3 各獨立地包含有包含抗體之一或多個互補決定區(CDR)的抗原結合域； 其中Lb1 包含抗體或其抗原結合片段之一或多個連接子及/或鉸鏈區；且 其中Lb2 、Lb3 、Lc1 、Lc2 及Lc3 各獨立地包含一或多個連接子。
本發明之多肽包含呈單鏈形式或在作為本文中所揭示之蛋白質複合物之部分時具有功能活性的抗原結合域。
舉例而言，多肽之抗原結合域可結合於其目標且可具有生物活性。
在一些實施例中，抗原結合域之生物活性包括例如而不限於阻斷目標與其天然受體或配體之結合。或者，抗原結合域之生物活性包括其螯合目標之能力。此外，抗原結合域之生物活性包括其誘導信號傳導之能力。
包含超過一個抗原結合域之多肽表徵為多價的。
本發明之多肽可包含在其N端或C端或在兩端(在本文中所揭示之式中分別由X及Y定義)的額外胺基酸序列。
在一些實施例中，N端(由X定義)之胺基酸序列可包括信號肽，其例示性實施例提供於SEQ ID NO: 51中。
在一些實施例中，N端(由X定義)或C端(由Y定義)之胺基酸序列可獨立地包括連接子、細胞介素、趨化介素、標籤(例如His標籤(例如SEQ ID NO: 52))、掩蔽域、噬菌體鞘蛋白、抗原結合域或其組合。
抗原結合域 (Ab) 本發明之多肽包含一或多個各獨立地包含抗體之一或多個互補決定區(CDR)的抗原結合域。
因此，本發明之多肽之特異性可由其抗原結合域賦予。
在一些實施例中，給定多肽鏈之所有抗原結合域在呈單鏈形式與不同模組組合時均能夠結合於其目標。
本發明之多肽可包含來源於(人類或動物來源之)天然抗體或來源於合成抗體的抗原結合域。
在一些實施例中，天然抗體之抗原結合域經工程改造以便形成單鏈。
在一些實施例中，抗原結合域可獲自IgG，諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在特定實施例中，抗原結合域來源於人類IgG重鏈。
在一些實施例中，抗原結合域可獲自僅含重鏈之抗體(HCAb)。
抗原結合域之例示性實施例包括例如而不限於單域抗體(sdAb)、重鏈可變區(VH或VHH)、輕鏈可變區(VL或VLL)、單鏈可變片段(scFv)、VNAR 片段及其組合。
在一特定實施例中，本發明之多肽可包含IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c或IgG3或其組合的來源於人類或小鼠或大鼠或來源於轉殖基因小鼠或大鼠(其中小鼠或大鼠VHH已駱駝化)的抗原結合域VHH、人類VHH、已駱駝化之人類VHH。抗體可藉由用所關注之抗原使缺乏其重鏈、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c或IgG3或其組合中之任一者中之功能CH1域或上文所描述之VHH之組合的小鼠或大鼠或轉殖基因小鼠或大鼠免疫而獲得。
在一特定實施例中，本發明之多肽可包含駱駝科抗體之抗原結合域，諸如IgG2或IgG3之VHH。駱駝科抗體可藉由用所關注之抗原使單峰駝、駱駝、駱馬或羊駝免疫而獲得。
在一些實施例中，駱駝科抗體可來源於所謂的舊世界駱駝，諸如雙峰駱駝(Camelus bactrianus )、單峰駱駝(Camelus dromaderus )，或來自新世界駱駝，諸如小羊駝(Lama pacos )、大羊駝(Lama glama )及瘦駝(Lama vicugna )。
在另一特定實施例中，本發明之多肽可包含軟骨魚之抗原結合域，諸如IgNAR之VNAR 片段。VNAR 片段可來源於鯊魚抗體。
在需要時，非人類抗體之抗原結合域可經人類化。舉例而言，非人類VH、VHH或HCAb之構架區可經修飾以便使其更人類化。駱駝科抗體之人類化論述於例如Vincke C.等人 (J.Biol Chem. 2009, 284(5):3273-3284)中，其全部內容以引用之方式併入本文中。人類化駱駝科抗體可例如藉由通用人類化奈米抗體骨架上之CDR光柵獲得(例如揭示於Vincke C.等人中之h-NbBcII10 FGLA )。VNAR 抗體可藉由如Kovalenko OV等人(J Biol Chem. 2013, 288:17408-17419)中所論述將非CDR殘基轉化成人類生殖系Vκ1序列DPK9之殘基來人類化。本發明之多肽因此涵蓋人類化抗原結合域。
在又一特定實施例中，抗原結合域可包含人類VH (經修飾或未經修飾)。人類VH可例如自合成人類VH文庫獲得。經修飾人類VH包括其中一些胺基酸殘基已經修飾以使得其更加駱駝化(亦即藉由駱駝化)的VH。
在本發明之一些態樣中，多肽可由皆結合於同一目標及同一抗原決定基的抗原結合域構成。此類多肽可表徵為單特異性的。
單特異性多肽之例示性實施例包括包含具有一致CDR及構架區之抗原結合域的多肽。單特異性多肽之另一例示性實施例包括包含具有一致CDR及不同構架區之抗原結合域的多肽。單特異性多肽之另一例示性實施例包括包含其CDR中之一或多者之胺基酸序列不同(例如一或多個CDR中之保守取代)而不影響其結合於同一抗原決定基或抗原之能力的抗原結合域的多肽。
在本發明之其他態樣中，多肽之抗原結合域可結合於同一抗原之不同抗原決定基或結合於不同抗原。此類多肽可表徵為多特異性的且涵蓋例如雙特異性多肽、三特異性多肽、四特異性多肽、五特異性多肽、六特異性多肽、雙互補位多肽、多互補位多肽及其類似物。
多特異性多肽之例示性實施例包括包含至少兩個其CDR中之一或多者之胺基酸序列不同而使得結合特異性不同的抗原結合域的多肽。
更特定言之，當多肽結合於兩個不同抗原決定基或抗原時，多肽可表徵為雙特異性的。當多肽結合於三個不同抗原決定基或抗原時，其可表徵為三特異性的。當多肽結合於四個不同抗原決定基或抗原時，其可表徵為四特異性的。當多肽結合於五個不同抗原決定基或抗原時，其可表徵為五特異性的。當多肽結合於六個不同抗原決定基或抗原時，其可表徵為六特異性的。
包含兩個結合於同一目標上之兩個不重疊抗原決定基之抗原結合域的多肽表徵為雙互補位的。包含結合於同一目標上之三個、四個或更多個抗原決定基之抗原結合域的多肽表徵為多互補位的。
將基於諸如偵測、診斷及/或治療用途之預期用途來選擇給定多肽之抗原結合域。特定多肽之抗原結合域中之每一者可經選擇以便產生加成或協同效應。
在一些實施例中，抗原結合域可針對其特異性結合疾病或病況中所涉及之蛋白質的能力而進行選擇。
舉例而言，本發明之多肽可包含至少一個特異性結合於由腫瘤細胞或腫瘤細胞環境表現之抗原的抗原結合域(亦即腫瘤特異性抗原結合域)。
因此，本發明之多肽可包含一或多個特異性結合於以下之抗原結合域：CD36、DRD1、DRD2、DRD3、DRD4、DRD5、PD-L1、TROP2、CD147、MCT1、IL1RAP、AMIGO2、PTK7、MCT2、MCT4、NHE1、H+/K+-ATP酶、LAP、HLA-I A2、CD73、CD98、CEA、CEACAM5/6、ICAM-1、MCSP、纖維結合蛋白、β1整合素、四跨膜蛋白8、CD164、CD59、CD63、CD44、CD166、cWF、TNF、IL-17A、IL17-F、IL-6R、BCMA、TNF、RANKL、ADAMTS5、VEGF、Ang2、CX3 CR1、CXCR4、CXCR7、CXCL12、TfR1 (CD71)、CXCR2、VEGFR2、CD19、IGFR1、EpCAM、EGFR、DLL3、CGRP、CD79b、CD28、CCR5、ErbB3、ErbB2、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβR1、TGFβR2、IDO1、IDO2、TLR-4、TLR-7、TLR-8、TLR-9等。
在一些實施例中，抗原結合域可特異性結合於受體。
在一些實施例中，抗原結合域可特異性結合於G蛋白偶合受體，諸如而不限於多巴胺受體。
在一些例示性實施例中，多巴胺受體可為多巴胺受體D1 (DRD1)。
在一些例示性實施例中，多巴胺受體可為多巴胺受體D2 (DRD2)。
在一些例示性實施例中，多巴胺受體可為多巴胺受體D3 (DRD3)。
在一些例示性實施例中，多巴胺受體可為多巴胺受體D4 (DRD4)。
在一些例示性實施例中，多巴胺受體可為多巴胺受體D5 (DRD5)。
在本發明之其他態樣及實施例中，多肽可包含至少一個特異性結合於免疫調節劑的抗原結合域。
舉例而言，多肽可包含一或多個結合免疫檢查點蛋白、細胞介素、趨化介素或免疫受體或輔助受體等的抗原結合域(例如免疫特異性抗原結合域)。
因此，本發明之多肽可包含一或多個特異性結合於以下之抗原結合域：CD3、CD16、PD1、PDL-1、CTLA-4、CD8、LAG-3、OX40、CD27、CD122/IL2RB、TLR8/CD288、TIM-3、ICOS/CD278、NKG2A、A2AR、B7-H3、GITR/TNFRSF18、4-IBB/CD137、KIR2DL1、KIR3DL2、SIRPα、CD47、VISTA、CD40、CD112、CD96、TOGOT、BTLA、TIGIT、LAG-3、CD4等。
在一例示性實施例中，本發明之多肽可包含至少一個腫瘤特異性抗原結合域及至少一個免疫特異性抗原結合域。
文獻中已描述若干單域抗體。因此，本發明之多肽可包含有包含此類單域抗體之CDR、完全序列的抗原結合域。
此類單域抗體之例示性實施例包括但不限於靶向以下之單域抗體：CXCR2 (US 9328174 B2 (2016)、US9688763B2 (2017))、CXCR4 (US9212226 B2 (2015))、CXCR7 (US9212226 B2 (2015)、US8937164B2 (2015)、US9758584B2 (2017)、US999639B2 (2018))、C-MET (US8703135 B2 (2014)、US 9346884 B2 (2016)、US9683045B2 (2017))、KRAS (US9663570B2 (2017))、TNF-α(US 9546211B2 (2017)、US8703131B2 (2014)、US9067991B2 (2015)、US9371381B2 (2016)、US 9745372 B2 (2017))、血清白蛋白(US8217140B2 (2012)、US8188223 B2 (2012)、US9573992 B2 (2017))、溫韋伯氏因子(von Willebrand Factor)(US7807162 B2 (2010)、US8372398 B2 (2013)、US9028816B2 (2015)、US10112989B2 (2018))、RANK-L (US 8623361 B2 (2014)、US 9475877 B2 (2016)、US 9505840 B2 (2016)、US9534055 B2 (2017))、IL-6R (US8629244 B2 (2014)、US8748581 B2 (2014)、US 8962805B2 (2015)、US 9181350 B2 (2015)、US9273150 B2 (2016)、US 9605072 B2 (2017)、US 9611326 B2 (2017)、US 9617341 B2 (2017)、US10118967B2 (2018))、OX40L (US8962807B2 (2015)、US9834611B2 (2017))、HER2 (US8975382B2 (2015)、US 9969805B2 (2018))、HER3 (US9932403B2 (2018))、IL-17A及IL-17F (US10017568B2 (2018))、EGFR (US9243065 B2 (2016))、STAT3 (US9695234B2 (2017))、類澱粉蛋白β (US9211330B2 (2015))、假單胞菌(US10072098 B2 (2018))、P2X7受體(US9908935B2 (2018))、肝細胞生長因子(US9670275B2 (2017)、US10100110 B2 (2018))、Notch路徑成員(US 8557965 B2 (2013))、血管生成素/Tie (US8858940B2 (2014)、US9382333B2 (2016)、US9822175 B2 (2017))、趨化介素(US8906680 B2 (2014))、G偶合蛋白受體(US 9512236 B2 (2016)、清除劑受體(US9034325B2 (2015))、細胞內抗原(US9850321B2 (2017))、金屬蛋白酶(US9156914B2 (2015))等。
此類單域抗體之特定例示性實施例包括為以下之部分的單域抗體：卡普拉珠單抗(針對vWF之VHH)、奧利珠單抗(Ozoralizumab)(針對TNF之VHH)、ALX/0761/M1095 (針對IL-17A、I-17F雙特異性之VHH)、沃巴利單抗(Vobarilizumab)(針對IL-6R之VHH)、LCAR-B38M (針對BCMA之VHH)、V565 (針對TNF之VHH)、ALX-1141/M6495 (針對ADAMTS5之VHH)、BI 836880 (針對VEGF、Ang2雙特異性之VHH)、BI 655088 (針對CX3 CR1之VHH)、AD-214 (針對CXCR4之i-body)、TXB4 (TfR1之VNAR)、ALX-0141 (針對RANK-L之VHH)等。
在一些實施例中，本文中所揭示之多肽可包含一或多個在二聚域之N端的腫瘤特異性抗原結合域。
在一些實施例中，本文中所揭示之多肽可包含一或多個在二聚域之C端的腫瘤特異性抗原結合域。
在一些實施例中，本文中所揭示之多肽可包含一或多個在二聚域之N端及C端的腫瘤特異性抗原結合域。
在一些實施例中，本文中所揭示之多肽可包含一或多個在二聚域之N端的免疫特異性抗原結合域。
在一些實施例中，本文中所揭示之多肽可包含一或多個在二聚域之C端的免疫特異性抗原結合域。
在一些實施例中，本文中所揭示之多肽可包含一或多個在二聚域之N端及C端的免疫特異性抗原結合域。
在例示性及非限制性實施例中，多肽可包含兩個在二聚域之C端的免疫特異性抗原結合域。在一些實施例中，緊鄰二聚域之C端部分的免疫特異性抗原結合域可經由不可裂解連接子連接。
二聚域 (DD) 及蛋白質複合物 本發明之多肽包含二聚域。如此，兩個多肽(多肽鏈)可組裝形成蛋白質複合物。蛋白質複合物之例示性實施例包括同二聚體及異二聚體。
二聚域可包含例如而不限於免疫球蛋白之恆定區，包括例如重鏈免疫球蛋白之Fc、CH2及/或CH3域。
在本發明之某些實施例及態樣中，二聚域可具有與天然IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恆定區之序列或與其對應CH2及/或CH3域一致的序列。
本發明尤其涵蓋具有與天然人類抗體之序列一致的序列的二聚域。二聚域之例示性實施例包括例如天然人類重鏈之CH2-CH3域。
當表現於細胞或溶液中時，具有天然抗體之CH2-CH3域的多肽具有形成二聚體之傾向。當蛋白質複合物之兩個多肽鏈由相同胺基酸序列構成時，蛋白質複合物將形成同二聚體。然而，具有天然抗體之CH2-CH3域但胺基酸序列不同對多肽之共表現將產生同二聚體及異二聚體之混合物。存在於混合物中之不同蛋白質複合物可藉由此項技術中已知且包括例如尺寸排阻層析之方法分離。
因此，本發明之例示性異二聚體包括具有天然抗體之CH2-CH3域且由兩個具有不同序列或構形之多肽鏈形成的異二聚體。
然而，本發明亦係關於包含突變二聚域之多肽。
因此，此類多肽可包含相較於天然抗體之序列具有例如一或多個突變的突變二聚域。突變二聚域之例示性實施例包括具有天然CH2域及突變CH3域之二聚域。
在一些實施例中，Fc區可經修飾以便預防糖基化，以延長其半衰期，以調節受體結合或效應功能。例示性突變論述於Saunders K.O. (Front. Immunol. 10:1296, 2019，其全部內容以引用之方式併入本文中)中且包括例如天冬醯胺297 (例如N297)之突變。
二聚域之例示性實施例提供於SEQ ID NO: 16及SEQ ID NO: 17中。在SEQ ID NO: 16及SEQ ID NO: 17中，胺基酸殘基1-110對應於天然CH2，且胺基酸殘基111-217對應於天然CH3。SEQ ID NO: 16及SEQ ID NO: 17之第1號胺基酸殘基對應於根據EU編號系統之位置231。SEQ ID NO: 16及SEQ ID NO: 17之第111號胺基酸殘基對應於根據EU編號系統之位置341。
二聚域之其他例示性實施例提供於SEQ ID NO: 25及SEQ ID NO: 26中。二聚域之額外例示性實施例提供於SEQ ID NO: 48及SEQ ID NO: 50中。二聚域之額外例示性實施例提供於SEQ ID NO: 47及SEQ ID NO: 49中。二聚域之其他例示性實施例提供於表 5 中。本發明涵蓋包含SEQ ID NO: 53-91中所闡述之突變Fc域的二聚域。尤其考慮包含SEQ ID NO: 92至95中所闡述之突變CH3域的二聚域。
更特定言之，在一些實施例中，包含SEQ ID NO: 92中所闡述之突變CH3域的多肽可形成具有包含SEQ ID NO: 93中所闡述之突變CH3域之多肽的異二聚體。
更特定言之，在其他實施例中，包含SEQ ID NO: 94中所闡述之突變CH3域的多肽可形成具有包含SEQ ID NO: 95中所闡述之突變CH3域之多肽的異二聚體。
在一些實施例中，包含SEQ ID NO: 55中所闡述之突變Fc域的多肽可形成具有包含SEQ ID NO: 56中所闡述之突變Fc域之多肽的異二聚體。
在一些實施例中，包含SEQ ID NO: 61中所闡述之突變Fc域的多肽可形成具有包含SEQ ID NO: 62中所闡述之突變Fc域之多肽的異二聚體。
在一些實施例中，包含SEQ ID NO: 67中所闡述之突變Fc域的多肽可形成具有包含SEQ ID NO: 68中所闡述之突變Fc域之多肽的異二聚體。
在一些實施例中，包含SEQ ID NO: 71中所闡述之突變Fc域的多肽可形成具有包含SEQ ID NO: 72中所闡述之突變Fc域之多肽的異二聚體。
在一些實施例中，包含SEQ ID NO: 77中所闡述之突變Fc域的多肽可形成具有包含SEQ ID NO: 90中所闡述之突變Fc域之多肽的異二聚體。
在一些實施例中，包含SEQ ID NO: 80中所闡述之突變Fc域的多肽可形成具有包含SEQ ID NO: 90所闡述之突變Fc域之多肽的異二聚體。
在一些實施例中，包含SEQ ID NO: 82中所闡述之突變Fc域的多肽可形成具有包含SEQ ID NO: 90中所闡述之突變Fc域之多肽的異二聚體。
在一些實施例中，多肽可具有相較於天然或野生型序列包含例如1至30、1至20、1至15、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3個胺基酸取代的突變二聚域。
在例示性實施例中，突變二聚域可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代。胺基酸取代可如表A中所概述為保守的或非保守的。
在例示性實施例中，多肽可具有突變二聚域，該突變二聚域具有與天然IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恆定區之序列或與CH2及/或CH3域80%至99%一致的序列。本發明涵蓋之多肽包括包含突變二聚域之多肽，該突變二聚域與天然IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恆定區之序列或與CH2及/或CH3域85%至99%一致、90%至99%一致、95%至99%一致。
在一些實施例中，本發明之多肽可包含有包含有助於異二聚體形成之胺基酸取代的突變二聚域。因此，本發明之異二聚體可由包含此類突變之多肽形成。
在一些實施例中，突變二聚域可包括位置356、357、370、399及/或439處(根據EU編號系統)之胺基酸取代。
在例示性實施例中，給定異二聚體之一個多肽鏈可包括具有例如位置357、399及439處之胺基酸取代的突變CH3，而異二聚體之另一多肽鏈可包括具有例如位置356、370及399處之胺基酸取代的突變CH3(根據EU編號系統)。
在例示性實施例中，給定異二聚體之一個多肽鏈可包括具有例如位置357、399及439處之胺基酸取代的突變CH3，而異二聚體之另一多肽鏈可包括具有例如位置356、370及399處之胺基酸取代的突變CH3(根據EU編號系統)。給定異二聚體之一個或兩個多肽鏈可視情況進一步包含選自349、350、351、352、354、355、394及/或395之位置處的突變。給定異二聚體之一個多肽鏈因此可包含具有本文中所揭示之胺基酸序列的第一二聚域(DD1 )，且給定異二聚體之另一多肽鏈因此可包含具有本文中所揭示之胺基酸序列的第二二聚域(DD2 )。
在特定態樣及實施例中，本發明之多肽可以N端至C端方式包含具有式 Ic 中所闡述之構形的胺基酸序列： X-[(Aba )-(Lb )]m -(DD)-[(Lc )-(Abd )]n - Y 其中m可為0、1或大於1之整數； 其中n可為0、1或大於1之整數，其限制條件為m及n不同時為0； 其中Aba 、Abd 可各獨立地包含有包含抗體之一或多個互補決定區(CDR)的抗原結合域； 其中X或Y可獨立地存在或不存在且可包含胺基酸序列； 其中Lb 、Lc 可各獨立地包含一或多個連接子；且 其中DD可包含二聚域，該二聚域包含a)包含一或多個根據EU編號在對應於D399、D/E356及/或K370之位置處之突變的CH3域或b)包含一或多個根據EU編號在對應於D399、E357及/或K439之位置處之突變的CH3域。
在一些實施例中，位置356處之胺基酸可經中性胺基酸置換。在一些實施例中，位置370處之胺基酸可經帶正電胺基酸置換。在一些實施例中，位置399處之胺基酸可經中性胺基酸置換。在一些實施例中，位置357處之胺基酸可經中性胺基酸置換。在一些實施例中，位置439處之胺基酸可經帶負電胺基酸置換。
舉例而言，為了有助於異二聚體形成，可藉由a) 將位置356處之天冬胺酸(D)或麩胺酸(E)置換為中性胺基酸、b) 將位置370處之離胺酸(K)置換為帶正電胺基酸及c) 將位置399處之天冬胺酸(D)置換為中性胺基酸來使多肽鏈中之一者突變，同時可藉由a) 將位置357處之麩胺酸(E)置換為中性胺基酸、b) 將位置399處之天冬胺酸(D)置換為中性胺基酸及c) 將位置439處之離胺酸(K)置換為帶負電胺基酸來使另一多肽鏈突變。
本發明之多肽之例示性實施例可包含突變二聚域，該突變二聚域包含其中位置356處之天冬胺酸(D)或麩胺酸(E)可變成麩醯胺酸(Q)、位置370處之離胺酸(K)可變成麩胺酸(E)且位置399處之天冬胺酸(D)可變成天冬醯胺(N)的CH3域。
本發明之多肽之另一例示性實施例可包含突變二聚域，該突變二聚域包含其中位置357處之麩胺酸(E)可變成麩醯胺酸(Q)、位置399處之天冬胺酸(D)可變成天冬醯胺(N)且位置439處之離胺酸(K)可變成麩胺酸(E)的CH3域。
可藉由共表現多肽鏈(鏈A)及多肽鏈(鏈B)而製備異二聚體，該鏈A包含其中位置356處之天冬胺酸(D)或麩胺酸(E)變成麩醯胺酸(Q)、位置370處之離胺酸(K)變成麩胺酸(E)且位置399處之天冬胺酸(D)變成天冬醯胺(N)的CH3域，該鏈B包含其中位置357處之麩胺酸(E)變成麩醯胺酸(Q)、位置399處之天冬胺酸(D)變成天冬醯胺(N)且位置439處之離胺酸(K)變成麩胺酸(E)的CH3域。
視鏈A與鏈B之比而定，亦可在共表現兩種此類多肽時形成同二聚體。
因此，多肽鏈A與多肽鏈B之共表現可產生鏈A與鏈B之異二聚體、鏈A之同二聚體、鏈B之同二聚體及其混合物。亦可存在鏈A及/或鏈B之殘餘單體。由於單體、異二聚體及同二聚體各含有抗原結合域，混合物之各組分可具有一定水準之活性。
因此，本發明涵蓋包含本文中所揭示之CH3突變的單體、異二聚體及同二聚體以及此類單體、異二聚體及/或同二聚體之混合物。
在其他實施例中，本文中所揭示之多肽鏈及蛋白質複合物可包含有包含此項技術中已知有助於異二聚體形成之突變的突變二聚域。
舉例而言，本發明之多肽及蛋白質複合物可包含式 Ia 、式 Ib 、式 II 、式 III 、式 IV 、式 V 、式 VI 、式 VII 或式 VIII 中所闡述之構形及此項技術中已知有助於異二聚體形成之突變。
此類突變之例示性實施例揭示於例如Ha, J-H等人 (Front Immunol, 2016; 7:394)或Godar M等人 (Expert Opinion on Therapeutic patents, 2018; 28(3):251-276)中，該等文獻之全部內容以引用之方式併入；且包括例如臼包杵(第一CH3域突變T366Y及第二CH3域突變Y407T，第一CH3域突變T366W及第二CH3域突變T366S、L368A、Y407V，或第一CH3域突變S354C、T366W及第二CH3域突變Y349C、T366S、L368A、Y407V)、DD/KK突變(第一CH3域突變K409D、K392D，第二CH3域突變D399K、E356K)、不對稱再工程改造技術(第一CH3域突變E356K、E357K、D399K及第二CH3域突變K439E、K370E、K409D)、BiMAb突變(第一CH3域突變K249E、K288E，第二CH3域突變E236K、D278K)、XmAb突變(第一CH3域突變S364H、F405A，第二CH3域突變Y349T、T394F)、DuoBody突變(第一CH3域突變F405L，第二CH3域突變K409R)、Azymetric突變(第一CH3域突變T350V、L351Y、S400E、F405A、Y407V，第二CH3域突變T350V、T366L、N390R、K392M、T394W)、Biclonics突變(第一CH3域突變T366K (+L351K)，第二CH3域突變L351D或Y349、L368或Y349 +R355處之E或D)、ZW1突變(第一CH3域突變T350V、L351Y、F405A、Y407V，第二CH3域突變T350V、T366L、K392L、T394W)、7.8.60突變(第一CH3域突變K360D、D399M、Y407A，第二CH3域突變E345R、Q347R、T366V、K409V)、EW-RVT突變(第一CH3域突變K360E、K409W及第二CH3域突變Q347R、D399V、F405T)、EW-RVTs-s突變(第一CH3域突變K360E、K409W、Y349C及第二CH3域突變Q347R、D399V、F405T、S354C)、SEED突變(IgG1 CH3上之第一CH3域突變IgA源性之45個殘基，及IgA CH3上之第二CH3域突變IgG1源性之57個殘基)、A107突變(第一CH3域突變K370E、K409W，第二CH3域突變E357N、D399V、F405T)等。
本發明之蛋白質複合物可藉由組裝兩個具有相同構形(具有相同或不同胺基酸序列)或具有不同構形之多肽鏈形成，其中相同或不同之構形可選自式 Ia 、式 Ib 、 式 Ic 、 式 II 、式 III 、式 IV 、 式 V 、式 VI 、 式 VII 及/或式 VIII 中所闡述之構形。
在一些實施例中，蛋白質複合物之兩個多肽鏈皆可具有式 II 中所闡述之構形(具有相同或不同胺基酸序列)。
在一些實施例中，蛋白質複合物之兩個多肽鏈皆可具有式 III 中所闡述之構形(具有相同或不同胺基酸序列)。
在一些實施例中，多肽鏈中之一者可具有式 II 中所闡述之構形，而另一者可具有式 III 中所闡述之構形。
在一些實施例中，多肽鏈中之一者可具有式 II 中所闡述之構形，而另一者具有式 IV 中所闡述之構形。
在一些實施例中，多肽鏈中之一者可具有式 III 中所闡述之構形，而另一者具有式 IV 中所闡述之構形。
在一些實施例中，多肽鏈中之一者可具有式 IV 中所闡述之構形，而另一者具有式 IV 中所闡述之構形。
由多價多肽鏈構成之蛋白質複合物在本文中稱為多價蛋白質複合物。
由兩個多特異性多肽鏈構成之蛋白質複合物在本文中稱為多特異性蛋白質複合物。
術語「多特異性蛋白質複合物」涵蓋「雙特異性蛋白質複合物」、「三特異性蛋白質複合物」、「四特異性蛋白質複合物」、「五特異性蛋白質複合物」、「六特異性蛋白質複合物」及其類似物。
雙特異性蛋白質複合物之例示性實施例包括具有兩個多肽的蛋白質複合物，該等兩個多肽之各鏈包含不同腫瘤特異性抗原結合域，同時兩個多肽之其他抗原結合域一致或結合於相同抗原或抗原決定基。
其他類型之二聚體 本文中所揭示之突變二聚域可用於其他類型之多肽鏈之二聚化。
在一些實施例中，本文中所揭示之突變二聚域或CH3域可與結合域融合或引入抗體重鏈或Fc區內以產生雙特異性IgG或IgG樣分子。此類雙特異性分子之例示性實施例包括雙特異性抗體、單鏈Fv-CH3 (scFv-CH3)融合體、串聯scFv-CH3 (TaFv-CH3)融合體、雙功能抗體-CH3 (Db-CH3)融合體、串聯Db-CH3 (TaDb-CH3)融合體、單鏈Db-CH3融合體(scDb-CH3)、Fab-CH3融合體、單鏈Fab-CH3融合體、Fab-scFv-CH3融合體、雙重親和力再靶向(DART)-CH3融合體、Fab-DART-CH3融合體、單鏈Fv-Fc (scFv-Fc)融合體、串聯scFv-Fc (TaFv-Fc)融合體、雙功能抗體-Fc (Db-Fc)融合體、串聯Db-Fc (TaDb-Fc)融合體、單鏈Db-Fc融合體(scDb-Fc)、Fab-Fc融合體、單鏈Fab-Fc融合體、Fab-scFv-Fc融合體、雙重親和力再靶向(DART)-Fc融合體、Fab-DART-Fc融合體等。
在其他實施例中，本文中所揭示之突變二聚域可引入至可溶誘餌受體陷阱中。
因此，本發明係關於一種蛋白質複合物，其包含：a) 第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含有包含如下取代的Fc區、CH3或CH2/CH3域：中性胺基酸對位置356處之天冬胺酸(D)或麩胺酸(E)之取代、帶正電胺基酸對位置370處之離胺酸(K)之取代及中性胺基酸對位置399處之天冬胺酸(D)之取代；及b) 第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含有包含以下取代之Fc區、CH3或CH2/CH3域：中性胺基酸對位置357處之麩胺酸(E)之取代、中性胺基酸對位置399處之天冬胺酸(D)之取代及帶負電胺基酸對位置439處之離胺酸(K)之取代。
在一些實施例中，第一多肽鏈可包含其中位置356處之天冬胺酸(D)或麩胺酸(E)可變成麩醯胺酸(Q)、位置370處之離胺酸(K)可變成麩胺酸(E)且位置399處之天冬胺酸(D)可變成天冬醯胺(N)的CH3域，且第二多肽鏈可包含其中位置357處之麩胺酸(E)可變成麩醯胺酸(Q)、位置399處之天冬胺酸(D)可變成天冬醯胺(N)且位置439處之離胺酸(K)可變成麩胺酸(E)的CH3域。
在一些實施例中，第一多肽鏈及/或第二多肽鏈可包含有包含根據EU編號在對應於349、350、351、352、354、355、394及/或395之位置處的其他突變的CH3域。
在一些實施例中，第一多肽鏈可包含有包含根據EU編號之突變D399Q、D/E356Q、K370E、Y349K及S354K的CH3域，且第二多肽鏈可包含有包含根據EU編號之突變D399Q、E357Q、K439E、Y349D及S354D的CH3域。
在一些實施例中，第一多肽鏈可包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及L351W的CH3域，且第二多肽鏈可包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及L351R的CH3域。
在一些實施例中，第一多肽鏈可包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及S354M的CH3域，且第二多肽鏈可包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及L351Y的CH3域。
在一些實施例中，第一多肽鏈可包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及T350I的CH3域，且第二多肽鏈可包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及T350I的CH3域。
在一些實施例中，第一多肽鏈可包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及T350V的CH3域，且第二多肽鏈可包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及T350V的CH3域。
在一些實施例中，第一多肽鏈可包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352R的CH3域，且第二多肽鏈可包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及L351R的CH3域。
在一些實施例中，第一多肽鏈可包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352E的CH3域，且第二二聚多肽鏈可包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及L351R的CH3域。
亦考慮本文中所揭示之分別包含鏈A及鏈B CH3域的第一及第二多肽鏈之組合。
第一多肽及第二多肽鏈可為抗體重鏈。
因此，本發明尤其係關於一種抗體或其抗原結合片段，其包含：a) 包含其中位置356處之天冬胺酸(D)或麩胺酸(E)可變成麩醯胺酸(Q)、位置370處之離胺酸(K)可變成麩胺酸(E)且位置399處之天冬胺酸(D)可變成天冬醯胺(N)之CH3域的第一重鏈，b) 包含其中位置357處之麩胺酸(E)可變成麩醯胺酸(Q)、位置399處之天冬胺酸(D)可變成天冬醯胺(N)且位置439處之離胺酸(K)可變成麩胺酸(E)之CH3域的第二重鏈，及c) 輕鏈。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段可包含：a) 包含其中位置356處之天冬胺酸(D)或麩胺酸(E)可變成麩醯胺酸(Q)、位置370處之離胺酸(K)可變成麩胺酸(E)、位置399處之天冬胺酸(D)可變成麩醯胺酸(Q)、位置349處之酪胺酸(Y)可變成離胺酸(K)且位置354處之絲胺酸(S)可變成離胺酸(K)之CH3域的第一重鏈，b) 包含其中位置357處之麩胺酸(E)可變成麩醯胺酸(Q)、位置399處之天冬胺酸(D)可變成麩醯胺酸(Q)、位置439處之離胺酸(K)可變成麩胺酸(E)、位置349處之酪胺酸(Y)可變成天冬胺酸(D)且位置354處之絲胺酸(S)可變成天冬胺酸(D)之CH3域的第二重鏈，及c) 輕鏈。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段可包含：a) 包含其中位置356處之天冬胺酸(D)或麩胺酸(E)可變成麩醯胺酸(Q)、位置370處之離胺酸(K)可變成麩胺酸(E)、位置399處之天冬胺酸(D)可變成天冬醯胺(N)且位置351處之白胺酸(L)可變成色胺酸(W)之CH3域的第一重鏈，b) 包含其中位置357處之麩胺酸(E)可變成麩醯胺酸(Q)、位置399處之天冬胺酸(D)可變成天冬醯胺(N)、位置439處之離胺酸(K)可變成麩胺酸(E)且位置351處之白胺酸(L)可變成精胺酸(R)之CH3域的第二重鏈，及c) 輕鏈。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段可包含：a) 包含其中位置356處之天冬胺酸(D)或麩胺酸(E)可變成麩醯胺酸(Q)、位置370處之離胺酸(K)可變成麩胺酸(E)、位置399處之天冬胺酸(D)可變成天冬醯胺(N)且位置354處之絲胺酸(S)可變成甲硫胺酸(M)之CH3域的第一重鏈，b) 包含其中位置357處之麩胺酸(E)可變成麩醯胺酸(Q)、位置399處之天冬胺酸(D)可變成天冬醯胺(N)、位置439處之離胺酸(K)可變成麩胺酸(E)且位置351處之白胺酸(L)可變成酪胺酸(Y)之CH3域的第二重鏈，及c) 輕鏈。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段可包含：a) 包含其中位置356處之天冬胺酸(D)或麩胺酸(E)可變成麩醯胺酸(Q)、位置370處之離胺酸(K)可變成麩胺酸(E)、位置399處之天冬胺酸(D)可變成天冬醯胺(N)且位置350處之蘇胺酸(T)可變成異白胺酸(I)之CH3域的第一重鏈，b) 包含其中位置357處之麩胺酸(E)可變成麩醯胺酸(Q)、位置399處之天冬胺酸(D)可變成天冬醯胺(N)、位置439處之離胺酸(K)可變成麩胺酸(E)且位置350處之蘇胺酸(T)可變成異白胺酸(I)之CH3域的第二重鏈，及c) 輕鏈。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段可包含：a) 包含其中位置356處之天冬胺酸(D)或麩胺酸(E)可變成麩醯胺酸(Q)、位置370處之離胺酸(K)可變成麩胺酸(E)、位置399處之天冬胺酸(D)可變成天冬醯胺(N)且位置350處之蘇胺酸(T)可變成纈胺酸(V)之CH3域的第一重鏈，b) 包含其中位置357處之麩胺酸(E)可變成麩醯胺酸(Q)、位置399處之天冬胺酸(D)可變成天冬醯胺(N)、位置439處之離胺酸(K)可變成麩胺酸(E)且位置350處之蘇胺酸(T)可變成纈胺酸(V)之CH3域的第二重鏈，及c) 輕鏈。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段可包含：a) 包含其中位置356處之天冬胺酸(D)或麩胺酸(E)可變成麩醯胺酸(Q)、位置370處之離胺酸(K)可變成麩胺酸(E)、位置399處之天冬胺酸(D)可變成天冬醯胺(N)且位置352處之脯胺酸(P)可變成精胺酸(R)之CH3域的第一重鏈，b) 包含其中位置357處之麩胺酸(E)可變成麩醯胺酸(Q)、位置399處之天冬胺酸(D)可變成天冬醯胺(N)、位置439處之離胺酸(K)可變成麩胺酸(E)且位置351處之白胺酸(L)可變成精胺酸(R)之CH3域的第二重鏈，及c) 輕鏈。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段可包含：a) 包含其中位置356處之天冬胺酸(D)或麩胺酸(E)可變成麩醯胺酸(Q)、位置370處之離胺酸(K)可變成麩胺酸(E)、位置399處之天冬胺酸(D)可變成天冬醯胺(N)且位置352處之脯胺酸(P)可變成麩胺酸(E)之CH3域的第一重鏈，b) 包含其中位置357處之麩胺酸(E)可變成麩醯胺酸(Q)、位置399處之天冬胺酸(D)可變成天冬醯胺(N)、位置439處之離胺酸(K)可變成麩胺酸(E)且位置351處之白胺酸(L)可變成精胺酸(R)之CH3域的第二重鏈，及c) 輕鏈。
此類抗體或其抗原結合片段包括雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段。
連接子 (L) 本文中所揭示之多肽鏈之不同模組可經由連接子彼此連接。
在一些實施例中，用於連接多肽鏈之一或多個模組的連接子並非可裂解連接子。
在一例示性實施例中，緊鄰二聚域之C端定位的連接子(Lc)不包含可裂解連接子。
在另一例示性實施例中，位於兩個抗原結合域之間的連接子中之至少一者不包含可裂解連接子。
在其他實施例中，用於連接多肽鏈之一或多個模組的連接子可包括不可裂解連接子。
在一例示性實施例中，緊鄰二聚域之C端定位之連接子為不可裂解連接子。
在另一例示性實施例中，位於兩個抗原結合域之間的連接子中之至少一者為不可裂解連接子。
在另一例示性實施例中，緊鄰二聚域之C端定位的連接子及連接位於二聚域之C端之前兩個抗原結合域的連接子為不可裂解連接子。
在一些實施例中，緊鄰二聚域之N端的連接子可較佳地包含抗體之鉸鏈區。
在一些實施例中，多肽鏈之所有模組經由不可裂解連接子連接。
不可裂解連接子之例示性實施例包括在蛋白質表現期間或在製造製程期間保持實質上完整的連接子。如本文所用，「實質上完整」意謂以給定溶液或組合物之總多肽含量之20%或更少、15%或更少、10%或更少、7.5%或更少、5%或更少、4%或更少、3%或更少、2%或更少、1%或更少發生連接子裂解。
不可裂解連接子之其他例示性實施例亦包括不包含用於存在於人類或動物血液或血清中之一或多種蛋白酶的特定裂解位點的連接子。
不可裂解連接子之額外例示性實施例進一步包括在於個體中投與多肽或蛋白質複合物之後，在投與後至少一、二、三、四、五、六、十二、二十四、四十八小時或更長時間保持其完整性的連接子。
在其他例示性實施例中，連接子包含不可裂解連接子及可裂解連接子。
在一些實施例中，連接子不可裂解。
在一些情況下，可裂解連接子可用於活體內釋放藥物(例如細胞生長抑制分子、細胞毒性分子、化學治療劑等)或連接至本發明之多肽的標記。
可裂解連接子之例示性實施例提供於例如US2019/0010242中，且包括對於蛋白酶之裂解敏感的連接子，該蛋白酶通常為細胞外蛋白酶，諸如由腫瘤或活化免疫效應細胞產生之蛋白酶，且包括具有供選自以下之蛋白酶特異性裂解之位點的連接子：ADAMS、ADAMTS，例如ADAMS；ADAMS；ADAM10；ADAM12；ADAM15；ADAM17/TACE；ADAMDEC1；ADAMTS1；ADAMTS4；ADAMTS5；天冬胺酸蛋白酶，例如BACE或腎素；天冬胺酸組織蛋白酶，例如組織蛋白酶D或組織蛋白酶E；凋亡蛋白酶，例如凋亡蛋白酶1、凋亡蛋白酶2、凋亡蛋白酶3、凋亡蛋白酶4、凋亡蛋白酶5、凋亡蛋白酶6、凋亡蛋白酶7、凋亡蛋白酶8、凋亡蛋白酶9、凋亡蛋白酶10或凋亡蛋白酶14；半胱胺酸組織蛋白酶，例如組織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V/L2、組織蛋白酶X/Z/P；半胱胺酸蛋白酶，例如克魯茲蛋白酶(Cruzipain)；豆莢蛋白(Legumain)；泛素特異性蛋白酶-2 (Otubain-2)；KLK，例如KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13或KLK14；金屬蛋白酶，例如穿膜肽酶(Meprin)；腦啡肽酶(Neprilysin)；PSMA；BMP-1；MMP，例如MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP23、MMP24、MMP26或MMP27；絲胺酸蛋白酶，例如活化蛋白C；組織蛋白酶A；組織蛋白酶G；凝乳酶(Chymase)；凝血因子蛋白酶(例如FVIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa)；彈性蛋白酶(Elastase)；顆粒酶B；胍基苯甲酸蛋白酶(Guanidinobenzoatase)；HtrA1；人類嗜中性球彈性蛋白酶；乳鐵蛋白(Lactoferrin)；通道活化蛋白酶(Marapsin)；NS3/4A；PACE4；纖維蛋白溶酶(Plasmin)；PSA；tPA；凝血酶(Thrombin)；類胰蛋白酶(Tryptase)；uPA；II型跨膜絲胺酸蛋白酶(TTSP)，例如DESC1、DPP-4、FAP、第二型穿膜絲胺酸蛋白酶(Hepsin)、間質蛋白酶-2、間質蛋白酶(Matriptase)、TMPRSS2、TMPRSS3或TMPRSS4；及其任何組合。在一些實施例中，本發明之多肽不包括對應於Lc之位置處的此類連接子。
連接子之例示性實施例包括可撓性連接子、剛性連接子、螺旋狀連接子及其組合。連接子論述於例如Chen X等人 (Adv Drug Deliv Rev. 2013; 65(10):1357-1369)，其全部內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，抗體鉸鏈區或其部分可用於將模組連接至二聚域且在本文中被視為連接子。鉸鏈區可來源於(人類或動物來源之)天然抗體或來源於合成抗體。鉸鏈區可例如自諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之IgG獲得。鉸鏈區之例示性實施例提供於SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39及SEQ ID NO: 43中。
在一些情況下，鉸鏈區可具有與天然IgG1、IgG2、IgG3或IgG4鉸鏈區之序列80%至99%一致的序列。突變鉸鏈之例示性及非限制性實施例包括其中S228經置換為P (EU編號)的IgG4之鉸鏈區(Angal, S.等人, Mol Immunol 30, 105-108, 1993)。突變鉸鏈之其他例示性實施例提供於SEQ ID NO: 32-34、36-38、40-42及44-46中。
可撓性連接子通常由小極性胺基酸(諸如蘇胺酸或絲胺酸及甘胺酸)構成。可撓性連接子之例示性及非限制性實施例包括GS連接子(甘胺酸/絲胺酸重複)，諸如(GGGS)n(GGGGS)m、(GS)n、(G4 S)n、(GGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n、(GGSG)n、(GGGSS)n，其中n及m可為整數，諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大整數，諸如15、20或25。
可撓性連接子之特定例示性及非限制性實施例包括包含SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7中所闡述之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的連接子。
應理解，SEQ ID NO: 7可由式(GGGGS)n表示，其中n為選自1至10之整數；或替代地由式GGGGSX1 示，其中X1 不存在或若存在則為SEQ ID NO: 7之胺基酸殘基1至5之1至9個重複。
本發明之剛性連接子通常由富含脯胺酸之序列(XP)n構成，其中X表示任何胺基酸，較佳地Ala、Lys或Glu，且n為諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等之整數(Chen X等人, 2013)。
剛性連接子之特定例示性及非限制性實施例包括包含SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11中所闡述之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的連接子。
應理解，SEQ ID NO: 11可由式(X(PAPAP))n KA表示，其中n為選自1至10之整數，其中X存在抑或不存在，且若存在則為A，或替代地，SEQ ID NO: 11可由式(XPAPAP)X2 KA表示，其中X可存在或不存在，且若存在則為A；且其中X2 不存在或若存在則為SEQ ID NO: 11之胺基酸殘基1至6之1至9個重複。
螺旋狀連接子有時可表徵為剛性的，但在本文中分成相異連接子家族。螺旋狀連接子之例示性實施例論述於Chen X等人, 2013，且包含例如由帶正電及帶負電胺基酸殘基側接的丙胺酸殘基之重複。
螺旋狀連接子之特定例示性及非限制性實施例包括包含SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14及SEQ ID NO: 15中所闡述之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的連接子。
應理解，SEQ ID NO: 15可由式X(EAAAK)n X2 表示，其中n為選自1至10、更佳地2至5之整數，其中X及X2 獨立地存在或不存在且若存在則較佳地為A。或者，SEQ ID NO: 15可由式X(EAAAK)X3 X2 表示，其中X及X2 獨立地存在或不存在，且若存在則較佳地為A；且X3 不存在或若存在則為SEQ ID NO: 15之胺基酸殘基2至6之1至9次重複。
在一例示性實施例中，緊鄰二聚域之C端的連接子(鑑別為表 1 至表 4 中或在式 II 至式 VIII 中呈Lc1 形式之連接子2)可包含可撓性連接子、剛性連接子或螺旋狀連接子。可特定地經選擇以佔據此位置的連接子包括例如而不限於包含SEQ ID NO: 3-12、SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 15中所闡述之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的連接子，其中n為1。
在一例示性實施例中，連接位於二聚域之C端的前兩個抗原結合域的連接子(鑑別為表 1 至表 4 中或在式II 至式VIII 中呈L c2 形式之連接子3)可包含可撓性連接子、剛性連接子或螺旋狀連接子。可特定地經選擇以佔據此位置的連接子包括例如而不限於包含SEQ ID NO: 3-13或SEQ ID NO: 15中所闡述之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的連接子，其中n為1。
本發明亦提供在SEQ ID NO: 3至15中之任一者之N端或C端中之一者或兩者處添加1至10個胺基酸(及包含於1與10內之任何範圍或值，諸如1至5)的連接子。此等額外胺基酸殘基可各獨立地選自任何胺基酸殘基。此等額外胺基酸殘基較佳地形成不可裂解序列。
本發明亦提供在SEQ ID NO: 3至15中之任一者之N端或C端中之一者或兩者處缺失1、2、3、4或5個胺基酸(及包含於1與5內之任何值)的連接子。
適合之連接子可包含例如包含約3至約50、約3至約40、約3至約30、約3至約25、約3至約20、約3至約15、約3至約10個胺基酸殘基的胺基酸序列。
在例示性實施例中，各連接子之長度範圍可獨立地為約5至約50個胺基酸殘基，包括例如約5至約40個胺基酸殘基、約10至約40個胺基酸殘基、約20至約40個胺基酸殘基、約20至約35個胺基酸殘基、約25至約30個胺基酸殘基及此等範圍所包含及包括之任何子範圍。
在一些實施例中，包含SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 15中所闡述之胺基酸序列的連接子可具有較佳地1至10、更佳地2至5，包括2、3、4或5的「n」值。
變異體 本發明亦涵蓋本文中所揭示之序列之變異體。
本發明涵蓋之變異體包括可包含一或多個位置處之一或多個胺基酸殘基之***、一或多個位置處之一或多個胺基酸殘基之缺失或一或多個位置處之一或多個胺基酸殘基之取代(保守或非保守取代)的變異體。
舉例而言，基於共同側鏈特性將天然存在之殘基分組。可藉由將來自下列各組(第1組至第6組)中之一者的一胺基酸更換成同一組之另一胺基酸來進行保守取代。非保守取代將伴有將此等組中之一者之一成員換成另一成員。 (第1組)疏水性的：正白胺酸、甲硫胺酸(Met)、丙胺酸(Ala)、纈胺酸(Val)、白胺酸(Leu)、異白胺酸(Ile) (第2組)中性親水性的：半胱胺酸(Cys)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、天冬醯胺(Asn)、麩醯胺酸(Gln) (第3組)酸性：天冬胺酸(Asp)、麩胺酸(Glu) (第4組)鹼性：組胺酸(His)、離胺酸(Lys)、精胺酸(Arg) (第5組)影響鏈定向的殘基：甘胺酸(Gly)、脯胺酸(Pro)；及 (第6組)芳族：色胺酸(Trp)、酪胺酸(Tyr)、***酸(Phe)
保守取代之其他例示性實施例以標題「較佳取代」展示於表A中。若此類取代產生非所需特性，則可引入更顯著變化，在表A中稱為「例示性取代」或如下文關於胺基酸類別進一步描述，且篩選產物。
熟習此項技術者將認識到，相較於其他胺基酸，某些胺基酸帶較小正電、為中性、帶負電或具有降低之電荷。可如由胺基酸之等電點所指示基於淨電荷分類胺基酸。等電點為胺基酸分子之平均淨電荷為零時的pH。當pH＞pI時，胺基酸具有淨負電荷，且當pH＜pI時，胺基酸具有淨正電荷。在一些實施例中，抗體之經量測pI值介於約3與9之間(例如3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5及9)及之間的任何值。在一些實施例中，抗體之所量測pI值介於約4與7之間(例如4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)及之間的任何值。胺基酸之例示性等電點展示於下表A中。一般而言，具有帶正電側鏈之胺基酸包括例如精胺酸(R)、組胺酸(H)及離胺酸(K)。具有帶負電側鏈之胺基酸包括例如天冬胺酸(D)及麩胺酸(E)。具有極性特性之胺基酸包括例如絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)及半胱胺酸、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)。非極性胺基酸包括例如丙胺酸(A)、纈胺酸(V)、異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、***酸(F)、甘胺酸(G)及脯胺酸(P)。
在一些實施例中，抗體之等電點經由胺基酸取代進行修飾。參見例如US20110076275。在一些實施例中，修飾包含抗體之多肽之等電點使得抗體之半衰期改變。 表A：例示性胺基酸取代
初始殘基 例示性取代 保守取代 pI (等電點)
Ala (A) Val, Leu, Ile Val 6.0
Arg (R) Lys, Gln, Asn Lys 10.76
Asn (N) Gln, His, Lys, Arg, Asp Gln 5.41
Asp (D) Glu, Asn Glu 2.77
Cys (C) Ser, Ala Ser 5.07
Gln (Q) Asn; Glu Asn 5.65
Glu (E) Asp, Gln Asp 3.22
Gly (G) Ala Ala 5.97
His (H) Asn, Gln, Lys, Arg, Arg 7.59
Ile (I) Leu, Val, Met, Ala, Phe, 正白胺酸 Leu 6.02
Leu (L) 正白胺酸, Ile, Val, Met, Ala, Phe Ile 5.98
Lys (K) Arg, Gln, Asn Arg 9.74
Met (M) Leu, Phe, Ile Leu 5.74
Phe (F) Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Tyr 5.48
Pro (P) Ala Ala 6.30
Ser(S) Thr Thr 5.58
Thr (T) Ser Ser 5.60
Trp (W) Tyr, Phe Tyr 5.89
Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser Phe 5.66
Val (V) Ile, Leu, Met, Phe, Ala, 正白胺酸 Leu 5.96
一般而言，本文中使用Blast2序列程式(Tatiana A. Tatusova、Thomas L. Madden (1999), 「Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences」, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250)使用預設設定，亦即blastp程式、BLOSUM62矩陣(開放空位11及延伸空位罰分1；空位衰減50，預期10.0，字長3)及經啟動濾波器確定可變鏈之間的類似性及一致性程度。
因此，一致性百分比將指示相較於初始肽一致且可佔據相同或類似位置的胺基酸。
類似性百分比將指示一致之胺基酸及相較於初始肽在相同或類似位置經保守胺基酸取代置換的胺基酸。
本發明之變異體因此可包含與初始或參考序列或初始序列之一部分的序列至少70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，變異體可與本文中所揭示之序列具有至少80%序列一致性。在其他實施例中，變異體可與本文中所揭示之序列具有至少85%序列一致性。在其他實施例中，變異體可與本文中所揭示之序列具有至少90%序列一致性。在其他實施例中，變異體可與本文中所揭示之序列具有至少95%序列一致性。在其他實施例中，變異體可與本文中所揭示之序列具有至少99%序列一致性。
變異體之例示性實施例包括多肽或蛋白質複合物，其包含來源於天然抗體但包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個胺基酸差異的鉸鏈、Fc、CH3、CH2/CH3區。
在一些實施例中，本發明之多肽因此可包含與天然抗體之鉸鏈區至少80%一致、至少85%一致、至少90%一致、至少95%一致、至少99%一致的鉸鏈區。
在一些實施例中，本發明之多肽因此可包含與天然抗體之Fc至少80%一致的Fc部分。
在一些實施例中，本發明之多肽因此可包含與天然抗體之CH2域至少80%一致、至少85%一致、至少90%一致、至少95%一致、至少99%一致的CH2域。
在一些實施例中，本發明之多肽因此可包含與天然抗體之CH3域至少80%一致、至少85%一致、至少90%一致、至少95%一致、至少99%一致的CH3域。
在一些實施例中，本發明之多肽因此可包含與天然抗體之CH2/CH3域至少80%一致、至少85%一致、至少90%一致、至少95%一致、至少99%一致的CH2/CH3域。
核酸、載體、套組、細胞及製造多肽之方法 本發明之核酸分子可為單股或雙股。本文中所揭示之核酸分子可包含去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾去氧核糖核苷酸或經修飾核糖核苷酸。本發明之核酸分子可包含例如DNA。
尤其提供編碼一或多個模組或整個多肽鏈之DNA區段及載體。
DNA區段及/或載體可提供於分開之小瓶中且呈套組形式出售。
尤其考慮包含允許定向組裝併入DNA區段或整個多肽鏈之模組及選殖載體的序列的DNA區段之集合。
DNA區段及載體可提供為用於組裝能夠表現本文中所揭示之多肽或蛋白質複合物之DNA構築體的套組之部分。
套組可至少包含一或多個允許使用者產生包含如本文中所揭示之具有位置356、357、370、399及/或439處之胺基酸取代(根據EU編號系統)之突變二聚域的多肽鏈的DNA區段或載體。
歸因於遺傳密碼之固有簡併，可產生及使用編碼相同、實質上相同或功能上等效胺基酸序列的DNA序列。本發明之核苷酸序列可使用此項技術中通常已知之方法工程改造以便出於包括但不限於修飾基因產物之選殖、加工及/或表現的各種目的改變核苷酸序列。基因片段及合成寡核苷酸的藉由隨機片段化及PCR重組進行之DNA改組可用於對核苷酸序列進行工程改造。舉例而言，寡核苷酸介導之定點突變誘發可用於引入產生新限制位點、改變糖基化模式、改變密碼子偏好、產生剪接變異體等的突變。本發明涵蓋編碼本文中所描述之多肽鏈的經密碼子最佳化之核酸。
本文中所揭示之多肽及蛋白質複合物可藉由熟習此項技術者熟悉之各種方法製得，該等方法包括重組DNA方法或活體外轉錄/轉譯。
一般而言，本文中所描述之多肽鏈係由***至表現載體中之核酸序列表現，該表現載體亦即含有用於所***編碼序列在特定宿主中之轉錄及轉譯控制的元件的載體。此等元件可包括諸如強化子、組成型及誘導型啟動子之調控序列以及5'及3'非轉譯區。
熟習此項技術者已知之各種表現載體/宿主細胞系統可用於表現本文中所描述之多肽鏈。在蛋白質複合物由相異多肽鏈構成的情況下，此類多肽鏈中之每一者可由單獨表現載體或由唯一表現載體提供。根據本發明，蛋白質複合物之兩個鏈可由單一載體或由單獨載體(載體集合)編碼。
多肽通常表現於哺乳動物細胞中。為了長期產生重組蛋白，可使用穩定表現系統，其中DNA區段併入宿主細胞基因體中或藉由使用可選標記物而維持游離型形式。可針對宿主細胞類型調節所***序列之表現或以所需方式處理所表現多肽的能力來選擇該宿主細胞類型。具有針對轉譯後活性之特定細胞機制及特徵機制的不同宿主細胞(例如CHO、HeLa、MDCK、HEK293及W138)可商購及購自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection；ATCC)，且可經選擇以確保對所表現多肽之恰當修飾及處理。
可使用其他類型之表現系統。該等表現系統包括例如微生物，諸如經重組噬菌體、質體或黏質體DNA表現載體轉化之細菌；經酵母表現載體轉化之酵母；經桿狀病毒載體感染之昆蟲細胞系統；經病毒或細菌表現載體轉化之植物細胞系統；或動物細胞系統。
因此，本發明係關於經分離細胞，其經載體、核酸、載體集合、編碼本文中所描述之多肽鏈中之至少一者之核酸之集合轉化或轉染。因此，本發明亦係關於能夠表現或表現本文中所揭示之多肽或蛋白質複合物的經分離細胞。
本發明亦係關於一種製造蛋白質複合物的方法。該方法可包含提供細胞(例如哺乳動物細胞)與編碼本文中所揭示之多肽鏈中之一或多者的載體或載體集合，及允許表現。
在一些實施例中，藉由細胞產生之多肽及/或蛋白質複合物的效價可為0.1 g/L或更大。在一些情況下，藉由細胞產生之多肽及/或蛋白質複合物之效價可為0.5 g/L或更大。在一些情況下，藉由細胞產生之多肽及/或蛋白質複合物之效價可為1 g/L或更大。在一些情況下，藉由細胞產生之多肽及/或蛋白質複合物之效價可為2 g/L或更大。在一些情況下，藉由細胞產生之多肽及/或蛋白質複合物之效價可為3 g/L或更大。在一些情況下，藉由細胞產生之多肽及/或蛋白質複合物之效價可為4 g/L或更大。通常，藉由用包含編碼本文中所揭示之多肽鏈中之一者之核酸序列的載體轉染細胞來製得同二聚體。所收集上清液可含有同二聚體或單體及/或同二聚體之混合物。
一般而言，藉由用至少兩個類型之載體(載體集合)共轉染細胞來製得異二聚體，該等類型各自包含編碼兩個相異多肽鏈之核酸序列。鏈A與鏈B之適當比率一般視自各個別質體獲得之蛋白質表現量而定且可例如在約1:10至約10:1之間變化。大約1:1之DNA比率對於本文中所揭示之一些構築體尤佳。
亦可藉由用編碼兩個多肽鏈之單一載體轉染細胞來製得異二聚體。所收集上清液可含有異二聚體或單體異二聚體及/或同二聚體之混合物。
本發明之製造多肽之方法可進一步包含自包含單體、同二聚體及異二聚體之混合物分離該等單體、同二聚體及異二聚體的步驟。可藉由例如尺寸排阻層析或藉助於標籤或藉由熟習此項技術者已知之其他方法來純化及分離同二聚體或異二聚體。
方法亦可包含自雜質分離及/或純化蛋白質複合物的步驟。
因此，本發明之方法將產生包含同二聚體、異二聚體或單體、異二聚體及/或同二聚體之混合物的組合物。
在一些例示性實施例中，組合物可主要包含同二聚體。在一例示性實施例中，組合物可包含至少約80%、至少85%、至少90%、至少99%或100%之比例的同二聚體。
在其他例示性實施例中，組合物可主要包含異二聚體。在一例示性實施例中，組合物可包含至少約80%、至少85%、至少90%、至少99%或100%之比例的異二聚體。
結合物 本發明之多肽、多肽鏈或蛋白質複合物可與例如治療部分(用於治療目的)或可偵測部分(亦即用於偵測或診斷性目的)或與允許延長半衰期之蛋白質結合，或係連接至奈米粒子。在一些情況下，治療性或可偵測部分可連接至多肽之至少一個胺基酸殘基。
在一例示性實施例中，本發明之多肽、多肽鏈或蛋白質複合物與諸如但不限於化學治療劑、細胞介素、細胞毒性劑、抗癌藥(例如小分子)及其類似物之治療部分結合。
治療部分可包括例如而不限於釔-90、鈧-47、錸-186、碘-131、碘-125及許多熟習此項技術者公認之其他治療部分(例如鎦(例如Lu177 )、鉍(例如Bi213 )、銅(例如Cu67 ))、5-氟尿嘧啶、阿德力黴素(adriamycin)、伊立替康(irinotecan)、紫杉烷(taxane)、假單胞菌內毒素(pseudomonas endotoxin)、蓖麻毒素(ricin)、奧瑞他汀(auristatin)(例如單甲基奧瑞他汀E、單甲基奧瑞他汀F)、類美登素(maytansinoid)(例如美登素(mertansine))及其他毒素。
在另一例示性實施例中，本發明之多肽或蛋白質複合物與包括例如但不限於可藉由光譜、光化學、生物化學、免疫化學、化學及/或其他物理手段偵測之可偵測部分結合。可偵測部分可使用此項技術中熟知之方法直接及/或間接(例如經由鍵聯，諸如但不限於DOTA或NHS鍵聯)與多肽或蛋白質複合物偶合。可使用多種可偵測部分，選擇視所需敏感性、結合容易性、穩定性需求及可用儀器而定。適合之可偵測部分包括但不限於螢光標記、放射性標記(例如但不限於125 I、In111 、Tc99 、I131 且包括用於PET掃描器之正電子發射同位素等)、核磁共振活性標記、發光標記、化學發光標記、發色團標記、酶標記(例如但不限於辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶等)、量子點及/或奈米粒子。可偵測部分可引起及/或產生可偵測信號，從而允許偵測來自可偵測部分之信號。
醫藥組合物 本發明亦涵蓋包含本發明之多肽或蛋白質複合物之醫藥組合物。醫藥組合物亦可包含醫藥學上可接受之載劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含如本文中所揭示之結合多肽或結合蛋白質複合物。在一些實施例中，醫藥組合物包含與治療部分結合之多肽或蛋白質複合物。在一些實施例中，醫藥組合物包含與可偵測標記結合之多肽或蛋白質複合物。
除活性成分以外，醫藥組合物可含有醫藥學上可接受之載劑，包含水、PBS、鹽溶液、明膠、油、醇及有助於將活性化合物加工成可在醫藥學上使用之製劑的其他賦形劑及助劑。在其他情況下，可對此類製劑進行滅菌。
如本文所用，「醫藥組合物」意謂治療有效量之隨醫藥學上可接受之稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑及/或載劑一起的藥劑。如本文所用之「治療有效量」係指針對給定條件及投與方案提供治療作用的量。此類組合物為液體或經凍乾或以其他方式乾燥之調配物，且包括具有各種緩衝液含量(例如Tris-HCl.、乙酸鹽、磷酸鹽)、pH及離子強度之稀釋劑、用以預防被表面吸收之諸如白蛋白或明膠的添加劑、清潔劑(例如Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、膽酸鹽)、增溶劑(例如甘油、聚乙烯甘油)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉)、防腐劑(例如硫柳汞、苯甲醇、對羥基苯甲酸酯)、膨化物質或張力修飾劑(例如乳糖、甘露糖醇)、諸如聚乙二醇之聚合物與蛋白質之共價連接物、與金屬離子之錯合物或併入諸如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝膠等之聚合化合物之顆粒製劑中或上或併入脂質體、微乳液、微胞、單層或多層囊泡、紅血球影或球形質體上之物質。此等組合物將影響物理狀態、溶解度、穩定性、活體內釋放速率及活體內清除速率。控制或持續釋放組合物包括於親脂性儲存物(例如脂肪酸、蠟、油)中之調配物。本發明亦涵蓋包覆有聚合物(例如泊洛沙姆(poloxamer)或泊洛沙胺(poloxamine))的顆粒組合物。本發明之組合物之其他實施例併入顆粒形式之保護塗層、蛋白酶抑制劑或滲透強化子以用於各種投與途徑，包括非經腸、經肺、經鼻、經口、經***、經直腸途徑。在一個實施例中，醫藥組合物係非經腸、癌旁、經黏膜、經皮、肌肉內、靜脈內、皮內、皮下、腹膜內、腦室內、顱內及瘤內投與。
此外，如本文所用之「醫藥學上可接受之載劑」或「醫藥載劑」為此項技術中已知且包括但不限於0.01-0.1 M或0.05 M磷酸鹽緩衝液或0.8% 生理鹽水。另外，此類醫藥學上可接受之載劑可為水性或非水性溶液、懸浮液及乳液。非水性溶劑之實例為丙二醇、聚乙二醇、諸如橄欖油之植物油及諸如油酸乙酯之可注射有機酯。水性載劑包括水、醇溶液/水溶液、乳液或懸浮液，包括生理鹽水及緩衝介質。非經腸媒劑包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖及氯化鈉、乳酸化林格氏溶液或不揮發性油。靜脈內媒劑包括流體及營養補充劑、電解質補充劑(諸如基於林格氏右旋糖之彼等補充劑)及類似媒劑。亦可存在防腐劑及其他添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體及其類似物。
對於任何化合物，治療有效劑量最初可在細胞培養分析中或在諸如小鼠、大鼠、兔、狗或豬之動物模型中進行估計。動物模型亦可用於確定投與之濃度範圍及途徑。此類資訊隨後可用來確定用於在人類中投與的適用劑量及途徑。此等技術為熟習此項技術者所熟知，且治療有效劑量係指改善症狀或病況的活性成分之量。治療功效及毒性可藉由標準醫藥學程序在細胞培養物或實驗動物中測定，諸如藉由計算及對比ED50 (在50%群體中治療上有效之劑量)及LD50 (導致50%群體死亡之劑量)。上文所描述之醫藥組合物中之任一者可應用於任何需要療法之個體包括但不限於哺乳動物，諸如狗、貓、牛、馬、兔、猴及尤其人類。
本文中所描述之醫藥組合物可藉由多種途徑投與，包括但不限於經口、靜脈內、肌肉內、動脈內、髓內、鞘內、心室內、透皮、皮下、腹膜內、鼻內、經腸、體表、舌下或經直腸方式。
使用方法 本發明之多肽、多肽鏈及蛋白質複合物可用於治療病症或疾病。
在一些實施例中，多肽及蛋白質複合物可用於對目標細胞、循環蛋白質或組織之靶向治療及/或診斷。
在一些實施例中，多肽及蛋白質複合物可與治療部分結合且用於治療方法。
在一些實施例中，多肽及蛋白質複合物可與可偵測部分結合且用於偵測或診斷方法。
在一些實施例中，本發明之多肽、多肽鏈及蛋白質複合物可用於活體內靶向腫瘤。
在一些實施例中，多肽、多肽鏈及蛋白質複合物用於活體內促進腫瘤消退及/或減小腫瘤體積。
本發明之多肽、多肽鏈及蛋白質複合物因此可用於癌症治療。
本發明之方法可包含向有需要之個體投與本文中所揭示之多肽、蛋白質複合物或混合物或包含多肽、蛋白質複合物或混合物之醫藥組合物的步驟。
在一些實施例中，多肽、多肽鏈及蛋白質複合物係與化學治療劑組合投與。
根據本發明，有需要之個體可為人類。進一步根據本發明，有需要之個體可為動物。
在一些實施例中，尤其考慮由新抗原之表現引起或與其相關之病症或疾病的治療。
在一些實施例中，尤其考慮由抗原之表現過度表現引起或與其相關之病症或疾病的治療。
在一些實施例中，病症或疾病可為癌症。
在其他實施例中，病症或疾病可為感染。
在其他實施例中，病症或疾病可為免疫失調。
在其他實施例中，病症或疾病可為代謝失調。
本發明之多肽及蛋白質複合物可用於偵測目的。
可藉由使含有或疑似含有目標之樣本與包含針對特定目標之抗原結合域的多肽或蛋白質複合物接觸及使用偵測設備量化與陽性或陰性結合相關之信號來活體外進行此類目標之偵測。
樣本可來源於哺乳動物(例如人類)。樣本可為獲自哺乳動物之組織樣本或細胞培養物上清液。
在一些實施例中，樣本可為獲自哺乳動物之血清樣本、血漿樣本、血液樣本、***或腹水。
可藉由向個體投與包含針對特定目標之抗原結合域的多肽或蛋白質複合物及使用偵測設備量化與陽性或陰性結合相關之信號來活體內進行此類目標之偵測。
在偵測目標在樣本或個體中之存在後，可向個體投與藥物(例如本文中所揭示之抗體、小分子、多肽或蛋白質複合物)。
除本發明中所描述及提供之實施例以外，尤其考慮以下非限制性實施例。
實例 實例1.產生多肽之方法 選擇VHH 例如藉由駱駝或轉殖基因動物之免疫接種或自僅含重鏈之抗體之合成文庫產生此類抗體。選擇抗原結合域之序列，且例如以VHH-鉸鏈-Fc融合體形式或藉由噬菌體呈現來表現，且活體外及/或活體內測試其生物活性。基於本發明中概述之不同型式將抗原結合域組裝至單一多肽鏈中，且在細胞中產生多肽鏈或包括同二聚體及異二聚體之蛋白質複合物，且活體外及/或活體內測試其總體生物活性或不同模組之生物活性。
構築體之基因合成及組裝 使用GeneArt®系統(Thermo Fisher Scientific)合成對應於基因或基因片段(DNA模組)的DNA區段。將DNA模組設計成具有用於II型限制酶BsaI 之識別位點，其在用BsaI消化時產生獨特突出端。此等突出端之序列引導模組在DNA構築體中之位置。
使用II型限制酶選殖來組裝不同DNA模組。必要時，編碼最5'端DNA模組之質體亦可含有編碼信號肽之序列。此外，編碼肽標籤之序列可添加至DNA模組中之一或多者。各DNA模組通常由獨特質體提供以給予設計可撓性。圖 1 提供用於本文中所揭示之多肽的各種模組之例示性實施例。
表 1 、表 2 、表 3 及表 4 之多肽由47個DNA模組之組裝產生，該等模板各自由獨特質體編碼。
用NEB® Golden Gate Assembly Mix (NEB1600)進行金閘極反應。藉由使用100 ng之先前已選殖至缺乏BsaI限制位點之載體中的每一模組及100 ng之載體質體pNE-B340進行連接來組裝最終構築體。使用熱循環儀在同一試管中完成連接反應，其中在37℃下5分鐘及在16℃下5分鐘循環30次，隨後在55℃下培育一次，持續5 min。為減少不含有正確最終產物之背景群落，使用BsaI-HFv2 (NEBR3733L)限制酶對連接/消化產物再進行消化。
使用來自新英格蘭生物實驗室(NEB)之酶，使用製造商推薦方案進行所有限制酶消化。
轉化大腸桿菌 根據製造商之說明書使用連接反應混合物轉化大腸桿菌(NEB® 5-α勝任型大腸桿菌，高效)。簡言之，將50 μl大腸桿菌勝任細胞添加至連接/消化混合物中且在冰上培育5分鐘。藉由在42℃下熱衝擊30秒來處理細胞。藉由添加350 μl SOC來回收細胞，且在20分鐘之振盪下在37℃進行培育。將百分之十之轉化反應物塗鋪在含有安比西林(ampicillin)(100 μg/mL)之LB培養盤上。
篩選群落 篩選存在恰當組裝之DNA構築體的群落。簡言之，選取5至12個群落且用於接種含安比西林之2 ml LB。使培養物在振盪下在37℃下生長隔夜。根據製造商之說明書使用Qiagen小規模純化套組提取質體。用50 μl溶離緩衝液(10mM Tris)溶離質體。藉由用Hindlll 及EcoRI 限制消化來定量及分析質體。
在 ExpiCHO 或 Expi293 細胞中轉染及表現多肽 使用ExpiCHO™表現系統(Thermo Fisher，目錄號A29133)或Expi293™表現系統(Thermo Fisher，目錄號A14635)將蛋白質二聚體(例如同二聚體或異二聚體)表現於來自DNA構築體之2.5 mL或400 mL培養體積中。圖 2 示出本文中所揭示之蛋白質二聚體之例示性構形。
簡言之，在轉染之前，使新近解凍之CHO細胞在培養物中恢復以進行兩次或更多次繼代。隨後每3至4天使細胞繼代，直至其達至4×106 至6×106 個細胞/毫升為止，此時在預溫熱至37℃的ExpiCHO™表現培養基中將其稀釋至2×105 至3×105 個細胞/毫升。轉染前一天，將細胞稀釋至3×106 至4×106 個細胞/毫升，且在轉染當天，將細胞進一步稀釋至6×106 個細胞/毫升。用低溫OptiPRO™培養基(100 μL用於2.5 mL培養體積；16 mL用於400 mL培養體積)稀釋每毫升培養體積中之1 μg DNA。將ExpiFectamine™ CHO試劑(8 μL用於2.5 mL培養體積；1280 μL用於400 mL培養體積)添加至含有DNA之培養基中，且在室溫下與ExpiFectamine™/DNA複合物一起培育1至5 min。隨後在渦漩同時將DNA複合物轉移至培養物中(6×106 個細胞/毫升)。在振盪(INFORS HT振盪器，125 rpm)下，於8% CO2 及80%濕度下在37℃培育細胞。在轉染開始後18-22 h，將ExpiCHO™進料(0.6 mL用於2.5 mL培養體積；96 mL用於400 mL培養體積)及ExpiCHO™強化子(15 μL用於2.5 mL培養體積；2.4 mL用於400 mL培養體積)添加至細胞。將細胞返回至INFORS HT培育箱，該培育箱設定為37℃、8% CO2 及80%濕度，伴隨125 rpm之振盪(25 mm軌道)。轉染後8天，藉由以4000×g離心30 min使上清液澄清。使用Nalgene™ Rapid-Flow™無菌一次性過濾單元1000 mL過濾單元(Thermo Scientific，目錄號567-0020)將上清液過濾滅菌，且儲存於4℃或冷凍供稍後分析。
在轉染之前，使新近解凍之HEK293細胞在培養物中恢復以進行兩次或更多次繼代。隨後每3至4天使細胞繼代，直至其達至3×106 至5×106 個細胞/毫升為止，此時在經預熱至37℃之Expi293TM 表現培養基中將其稀釋至3×105 至5×105 個細胞/毫升。轉染前一天，將細胞稀釋至2.5×106 至3×106 ，且在轉染當天，將細胞進一步稀釋至3×106 個活細胞/毫升。用Opti-MEM™ I減血清培養基稀釋每毫升培養體積中之1 μg DNA，2.5 mL之培養體積得到150 μL之最終體積且400 mL之培養體積得到24 mL之最終體積。將ExpiFectamine™ 293試劑(8 μL用於2.5 mL培養體積；1.3 mL用於400 mL培養體積)添加至Opti-MEM™ I減血清培養基(140 μL用於2.5 mL培養體積；22.5 mL用於400 mL培養體積)中以在室溫下培育5分鐘。將經稀釋之ExpiFectamine™添加至經稀釋DNA中且在室溫下培育15分鐘。在渦漩同時將ExpiFectamine™/DNA溶液逐滴轉移至培養物中(3×106 個細胞/毫升)。在隔夜振盪(INFORS HT振盪器，125 rpm)下，於8% CO2 及80%濕度下在37℃培育細胞。在轉染開始後18-22 h，將ExpiFectamine™ 293轉染強化子1 (15 μL用於2.5 mL培養體積；2.4 mL用於400 mL培養體積)及ExpiFectamine™ 293轉染強化子2 (50 μL用於2.5 mL培養體積；24 mL用於400 mL培養體積)添加至細胞。將細胞返回至INFORS HT培育箱，該培育箱設定為37℃、8% CO2 及80%濕度，伴隨125 rpm之振盪(25 mm軌道)。轉染後5天，藉由以4000×g離心30 min使上清液澄清。使用Nalgene™ Rapid-Flow™無菌一次性過濾單元1000 mL過濾單元(Thermo Scientific，目錄號567-0020)將上清液過濾滅菌，且儲存於4℃或冷凍供稍後分析。
純化 視上清液體積而定使用3-mL MabSelect™ SuRe™樹脂及重力管柱(GE Healthcare，目錄號175438-02)或40-mL MabSelect™ SuRe™樹脂及AKTA PURE(GE Healthcare，Piscataway，NJ)純化蛋白質。在注入之前將樹脂與0.5 NaOH一起培育隔夜，且用基於Tris之緩衝液pH 7.4 (50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，pH 7.4)進行平衡。將上清液塗覆於重力管柱上或以5 mL/min塗覆於40-mL管柱上。用基於Tris之緩衝液pH 7.4以3 CV (管柱體積)以10 mL/min之流動速率洗滌樹脂管柱。用3 CV之0.1M檸檬酸pH 3以10 mL/min溶離蛋白質。將用蛋白質自色譜圖(280 nm之吸光度)之視覺輸出鑑別的溶離份彙集在一起。用1 M Tris-HCl pH 9中和彙集之溶離份以達成約5-6之pH，之後轉移至由PBS 10× pH 7.2 (15 mM磷酸二氫鉀、1552 mM氯化鈉、27 mM磷酸氫二鈉，ThermoFisher，目錄號70013073)製備之PBS (磷酸鹽緩衝生理鹽水) pH 6緩衝液中。
藉由用於自重力管柱純化之蛋白質的樣本濃縮器或藉由透析或藉由用於自AKTA PURE純化之蛋白質的去鹽管柱進行緩衝液更換。用樣本濃縮器VivaSpin 2，50 kDa MWCO (GE Healthcare，目錄號28932257)藉由以3,500至4,000×g在4℃下離心來濃縮自重力管柱純化之蛋白質，隨後用PBS pH 6稀釋以達至4倍，且重複稀釋直至樣本達至200倍為止。使用7 kDa分子量截斷透析管道(ThermoFisher，目錄號68799)在4℃下以4L PBS pH 6隔夜進行透析。另一方面，將去鹽管柱與0.5 NaOH一起培育隔夜且用PBS pH 6平衡。以0.5 mL/min將15 mL體積之經中和蛋白質樣本裝載至HiPrep 26/10去鹽管柱(GE Healthcare，目錄號17-5087-02)中，隨後用2 CV之PBS pH 6溶離蛋白質。重複裝載及溶離步驟直至沒有遺留來自親和管柱之溶離的經中和蛋白質樣本為止。將用蛋白質自色譜圖(280 nm之吸光度)之視覺輸出鑑別的溶離份彙集在一起。
使用Nalgene™ Rapid-Flow™無菌一次性過濾單元150 mL過濾單元(Thermo Scientific，目錄號565-0010)將樣本過濾滅菌。藉由Pierce™二喹啉甲酸蛋白質分析套組(ThermoFisher，目錄號23227)對最終蛋白質樣本進行定量，且用Endosafe® LAL試劑濾筒(Charles River，目錄號PTS2005)測試內毒素含量。在還原或非還原條件下在SDS-PAGE凝膠上分析最終蛋白質樣本(參見SDS PAGE及西方墨點法部分)。
SDS PAGE及西方墨點法 準備樣本以在具有NuPAGE™ LDS樣本緩衝液(賽默飛世爾，目錄號NP0007)及NuPAGE™樣本還原劑(ThermoFisher，目錄號NP0004)或不具有藥劑還原緩衝液之情況下藉由加熱在還原或非還原條件下進行SDS-PAGE分析。藉由在70℃下加熱10分鐘來使樣本變性。在BSA標準下，將樣本(16μL)裝載至3-8%Tris-Acetate微型凝膠(1.5 mm，15孔)上。使用X-Cell SureLock™微型凝膠裝置以125伏進行電泳約1小時。使用GelCode™染色試劑(Thermo Fisher，目錄號24594)將凝膠染色。
對於西方墨點分析，根據製造商之說明書使用iBlot™系統(Thermo Fisher，目錄號IB301031)將蛋白質轉移至硝化纖維素膜。
用抗Penta His-HRP抗體進行His抗原決定基標籤之偵測。簡言之，藉由在振盪下在室溫下於20 ml Qiagen阻斷緩衝液(Qiagen，目錄號1018862)中培育1小時，接著在振盪下在室溫下在20 ml起始Blocking™ T20 (PBS)阻斷緩衝液(Thermo Fisher，目錄號37528)中培育1小時來阻斷膜。將膜用1× TBS Tween™-20沖洗三次，持續10分鐘。在振盪下在室溫下將膜與先前在阻斷緩衝液中1:2000稀釋之抗Penta His-HRP (Qiagen，目錄號1014992)一起培育1小時。將膜用1× TBS Tween™-20沖洗三次，持續10分鐘。根據製造商之說明書使用Super Signal™ West Pico PLUS (Thermo Fisher，目錄號34080)觀測信號。使用Azure Biosystem成像系統記錄影像。
實例2：合成及產生多肽及多肽二聚體 藉由駱駝或駱馬之免疫接種來產生單域抗體或藉由活體外合成獲得單域抗體。
產生含有包括VHH之抗原結合域的各種DNA模組的DNA構築體，表現多肽，且使用本文所描述的方法分離及分析多肽或蛋白質二聚體。
表 1 、表 2 、表 3 及表 4 提供藉由組裝各種模組來產生之多肽之例示性實施例。
表 1 及表 2 之多肽含有允許多肽於經轉染細胞中之二聚化的天然二聚域(野生型CH2-CH3)。表 1 及表 2 之多肽鏈因此天然地形成包含兩個相同臂之同二聚體。
表 3 及表 4 之多肽含有有助於異二聚體之形成的突變二聚域(野生型CH2及突變CH3)。更特定言之，表3及表4之多肽具有在單獨表現時形成同二聚體或在用互補鏈表現時形成異二聚體的可能性。特定地藉由轉染表 3 或表 4 中所列之鏈集合(鏈A及鏈B)來製得異二聚體。
在一些實驗中，本申請人使用原理論證(POP)抗原結合域，包括抗CD3 (α-CD3：SEQ ID NO: 20)、抗PD1(α-PD1；SEQ ID NO: 21)、抗雞蛋白溶菌酶(α-HEWL：SEQ ID NO: 22)、抗4HEM (α-4HEM：SEQ ID NO: 23)或抗PDL1 (α-PDL1：SEQ ID NO: 24)之抗原結合域。在其他實驗中，申請人使用獲自針對腫瘤抗原產生之VHH的抗原結合域。
如本文中所證實，抗原結合域之序列可基於所需特異性及價數來選擇且其在多肽鏈內之位置可變化。舉例而言，抗原結合域中之每一者可由具有不同序列及/或特異性之另一者置換或替換。此外，可在多價蛋白質之N端或C端中之一者或兩者添加額外抗原結合域及連接子且延長。
本文所用之代號α-DRD2.1、α-DRD2.2、α-DRD2.3及α-DRD2.4、α-DRD1.1、α-DRD1.2、α-DRD1.3及α-DRD1.4或α-CD36.1、α-CD36.2、α-CD36.3及α-CD36.4表示具有不同互補決定區集合的VHH。
藉由用表現多肽之質體轉染細胞來產生原理論證同二聚體，該等多肽藉由代號KB015、KB016、KB017、KB018、KB019、KB020、KB021、KB022、KB023、KB024、KB025、KB026、KB027、KB028、KB029、KB030、KB031、KB032、KB033、KB034、KB035、KB036、KB037、KB038、KB039、KB040、KB041、KB042鑑別且包含表1中所指示之胺基酸序列。表 1 -含有天然抗體之CH2-CH3域的例示性POP多肽
   模組1 模組2 模組3 模組4 模組5 模組6 模組7
代號 特異性 VHH 1 連接子1 Fc 連接子2 VHH 2 連接子3 VHH 3
KB015 PDL1, CD3, PD1 α-PDL1 SEQ ID NO:24 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:2 α-CD3 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:4 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB070 PDL1, CD3, PD1 α-PDL1 SEQ ID NO:24 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:9 α-CD3 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:4 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB016 PDL1, CD3, PD1 α-PDL1 SEQ ID NO:24 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:2 α-PD1 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:4 α-CD3 SEQ ID NO:20
KB071 PDL1, CD3, PD1 α-PDL1 SEQ ID NO:24 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:9 α-PD1 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:4 α-CD3 SEQ ID NO:20
KB017 4HEM, 4HEM, 4HEM SEQ ID NO:23 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:23
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KB037 4HEM, 4HEM, PD1 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:13 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB038 4HEM, 4HEM, PD1 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:14 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB039 4HEM, 4HEM, PD1 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:9 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB040 4HEM, 4HEM, PD1 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:10 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB041 4HEM, 4HEM, PD1 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:7 (n=1) α-PD1 SEQ ID NO:21
KB042 4HEM, 4HEM, PD1 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:8 α-PD1 SEQ ID NO:21
藉由用針對多巴胺受體2 (DRD2)、多巴胺受體1 (DRD1)或CD36產生之VHH之抗原結合域置換表1之多肽(例如KB015或KB016)之VHH 1部分及/或藉由用IgG4之對應CH2-CH3域置換Fc部分來產生例示性腫瘤特異性多肽。在一些實驗中，IgG4之天然CH2CH3二聚域顯示亦充當IgG1天然CH2-CH3域。
藉由用表現多肽之質體轉染細胞來產生腫瘤特異性同二聚體，該等多肽藉由代號KB001、KB003、KB004、KB005、KB006、KB007、KB008、KB009、KB010、KB011、KB012、KB013、KB014鑑別且包含表2中所指示之胺基酸序列。表 2 -含有天然抗體之CH2-CH3域的例示性腫瘤特異性多肽
      模組1 模組2 模組3 模組4 模組5 模組6 模組7
代號 特異性 VHH 1 連接子1 Fc 連接子2 VHH 2 連接子3 VHH 3
KB001 DRD2, CD3, PD1 α- DRD2.1 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:2 α-CD3 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:4 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB059 DRD2, CD3, PD1 α- DRD2.1 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:9 α-CD3 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:4 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB060 DRD2, PD1, CD3 α- DRD2.1 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:2 α-PD1 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:4 α-CD3 SEQ ID NO:20
KB061 DRD2, PD1, CD3 α- DRD2.1 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:9 α-PD1 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:4 α-CD3 SEQ ID NO:20
KB003 DRD2, CD3, PD1 α- DRD2.2 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:2 α-CD3 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:4 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB004 DRD2, CD3, PD1 α- DRD2.3 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:2 α-CD3 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:4 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB005 DRD2, CD3, PD1 α- DRD2.4 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:2 α-CD3 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:4 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB044 DRD2, PD1, CD3 α- DRD2.1 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:2 a-PD1 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:4 a-CD3 SEQ ID NO:20
KB043 DRD2, PD1, CD3 α- DRD2.1 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:2 a-PD1 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:4 a-CD3 SEQ ID NO:20
KB006 PDL1, CD3, PD1 α- PDL1.1 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:2 α-CD3 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:4 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB035 DRD1, CD3, PD1 α- DRD1.1 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:2 α-CD3 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:4 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB062 DRD1, CD3, PD1 α- DRD1.1 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:9 α-CD3 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:4 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB063 DRD1, PD1, CD3 α- DRD1.1 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:2 α-PD1 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:4 α-CD3 SEQ ID NO:20
KB064 DRD1, PD1, CD3 α- DRD1.1 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:9 α-PD1 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:4 α-CD3 SEQ ID NO:20
KB007 DRD1, CD3, PD1 α- DRD1.1 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:4 α-CD3 SEQ ID NO:20
KB008 DRD1, CD3, PD1 α- DRD1.2 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:2 α-CD3 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:4 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB009 DRD1, CD3, PD1 α- DRD1.3 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:2 α-CD3 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:4 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB010 DRD1, CD3, PD1 α- DRD1.4 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:2 α-CD3 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:4 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB011 CD36, CD3, PD1 α- CD36.1 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:2 α-CD3 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:4 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB065 CD36, CD3, PD1 α- CD36.1 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:9 α-CD3 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:4 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB066 CD36, CD3, PD1 α- CD36.1 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:2 α-PD1 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:4 α-CD3 SEQ ID NO:20
KB067 CD36, CD3, PD1 α- CD36.1 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:9 α-PD1 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:4 α-CD3 SEQ ID NO:20
KB012 CD36, CD3, PD1 α- CD36.2 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:2 α-CD3 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:4 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB013 CD36, CD3, PD1 α- CD36.3 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:2 α-CD3 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:4 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB014 CD36, CD3, PD1 α- CD36.4 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:2 α-CD3 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:4 α-PD1 SEQ ID NO:21
如自圖 3 至圖 5 中呈現之SDS-PAGE分析可見，多肽KB001、KB003、KB004、KB005 (圖 3 )、KB007、KB008、KB009、KB010 (圖 4 )、KB012、KB013及KB011 (圖 5 )成功地表現於哺乳動物細胞中且具有預期分子量。
此外，圖 6A 、圖 6B 、圖 6D 及圖 6E 之結果顯示，由KB001、KB003、KB004、KB005、KB008、KB009及KB007製得之蛋白質二聚體可根據方法部分中所描述之純化製程純化。
實例3：活體外測試 活體外細胞毒性 在活體外實驗中評估本發明之多肽及蛋白質二聚體的細胞毒性。
簡言之，將腫瘤細胞再懸浮於細胞培養基中以得到5×106 個細胞/毫升。用CellTrace™ Violet溶液標記細胞，隨後在37℃下培育10分鐘。將CellTrace™ Violet標記之腫瘤細胞以1:10之比率與PBMC混合。用蛋白質二聚體或對照物以所指示濃度處理細胞。在冰上用染色死細胞之7-胺基-放線菌素D (7-AAD)溶液在4℃下培育細胞10分鐘。藉由流動式細胞測量術測定活細胞之數目以比較用7-AAD染色之細胞相對於用CellTrace™ Violet標記之細胞之總數目的百分比。結果係以死細胞的百分比呈現。
Jurkat 細胞上之 FACS 結合分析 藉由流動式細胞測量術評估蛋白質二聚體與Jurkat人類腫瘤細胞株之結合。簡言之，用抗CD3抗體(OKT3)預先刺激Jurkat細胞隔夜。藉由在4℃下在阻斷緩衝液中培育細胞10分鐘來阻斷非特異性結合。將含有蛋白質二聚體之溶液添加至細胞中且在4℃下培育20分鐘。在培育之後，用FACS染色緩衝液洗滌細胞三次。添加靶向多肽之Fc區的螢光標記抗體，且將細胞在暗處於冰上培育20分鐘。再次用FACS緩衝液洗滌細胞三次，再懸浮於100 ul FACS染色緩衝液中且使用BD FACSCanto™ II流式細胞儀(BD Bioscience)分析。
ELISA 結合分析 藉由蛋白脂質體-ELISA測定蛋白質二聚體之結合。簡言之，在96孔培養盤上塗佈含有目標蛋白或肽之蛋白脂質體或空白脂質體。覆蓋培養盤且保持在4℃下隔夜。次日，用PBS洗滌培養盤一次且用阻斷緩衝液在室溫下阻斷1小時。以所指示濃度測試蛋白質二聚體，稀釋於阻斷緩衝液中且在37℃下培育1小時。在培育之後，用PBS洗滌各孔三次。用以1:5000稀釋於阻斷緩衝液中之抗IgG1-HRP在室溫下培育各孔1小時，隨後用PBS洗滌三次。用SuperSignal™ ELISA Pico化學發光受質產生信號。在SpectraMax™ i3x多模式微量培養盤閱讀器(分子裝置)上讀取培養盤。
活體外活力分析 根據製造商之說明使用CellTiter-Fluor™細胞活力分析(Promega)活體外評估蛋白質二聚體降低細胞活力之能力，且與陰性對照物及經媒劑處理(PBS)之對照物之活力進行比較。
POP 多肽及蛋白質二聚體之結果 圖 7 至圖 12 呈現用POP多肽及同二聚體進行之實驗之例示性結果。
結合分析 如上文所指示藉由流動式細胞測量術評估由多肽KB017 (陰性對照)、KB019 (靶向CD3及PD1)或KB015 (靶向PDL1、CD3及PD1)製得之同二聚體與Jurkat人類腫瘤細胞株的結合。
圖7中呈現此實驗之結果，且結果顯示含有抗PDl、抗CD3及抗PDLl VHH之同二聚體具有比僅具有抗PDl、抗CD3 VHH之多價蛋白質二聚體顯著更高之結合。
活體外細胞毒性 使用上文所描述之細胞毒性分析，在腫瘤細胞株OCI-AML3上評估由多肽KB019或KB015製得之同二聚體之抗腫瘤作用。
在第一組實驗中，用由KB017多肽(陰性對照)製得之同二聚體或由KB019多肽(靶向CD3及PD1，圖 8A 及圖 8B )製得之同二聚體處理OCI-AML3細胞，最終濃度為0 nM、0.0667 nM、0.667 nM及6.67 nM。在培育之後，將細胞染色，且將死細胞之百分比與活細胞之百分比進行比較。
圖 8C 呈現此實驗之結果，且結果顯示由KB019多肽製得之同二聚體有效地靶向及殺死OCI-AML3細胞。因此，靶向CD3及PD1之VHH活體外賦予分子功能活性。
在第二組實驗中，將由三特異性KB015多肽(靶向PDL1、CD3及PD1：圖 8B )製得之同二聚體的抗腫瘤作用與由KB019多肽(圖 8A )製得之同二聚體的抗腫瘤作用進行比較。簡言之，用由KB017、KB019或KB015多肽製得之同二聚體處理OCI-AML3細胞，最終濃度為0 nM、0.0667 nM、0.667 nM及6.67 nM。在培育之後，將細胞染色，且將死細胞之百分比與活細胞之百分比進行比較。
圖 8C 及圖 8D 呈現此實驗之結果，且結果顯示，由KB017多肽製得之同二聚體有效地靶向及殺死OCI-AML3細胞且添加靶向PDL1之VHH可活體外增強多價蛋白質二聚體之功能活性。
在第三組實驗中，將由KB015多肽製得之同二聚體的抗腫瘤作用與由含有相同VHH但在不同位置之KB016多肽製得之同二聚體的抗腫瘤作用進行比較。簡言之，用每一同二聚體或用由KB018多肽(陰性對照)製得之同二聚體處理OCI-ML3細胞48小時，最終濃度為0 nM、0.007 nM、0.07 nM、0.7 nM及7 nM。在培育之後，將細胞染色，且將死細胞之百分比與活細胞之百分比進行比較。
圖9A 呈現此實驗之結果，且結果顯示抗PD-1及抗CD3 VHH之位置變化不影響蛋白質二聚體之細胞毒性。
在另一實驗中，產生且測試四特異性多肽。此等例示性四特異性多肽包含二聚域之N端處的兩個VHH域及二聚域之C端處的兩個VHH域。
簡言之，四特異性多肽經構築具有四個功能活性域(靶向CD36、PDL1、CD3及PD1：KB078)、三個功能活性域(靶向PDL1、CD3及PD1：KB075)或兩個功能活性域(靶向CD3及PD1：KB076)或不具有功能活性域之陰性對照蛋白質(KB077)。將此等分子與一組含有三個功能活性域(靶向PDL1、CD3及PD1)或兩個功能活性域(靶向CD3及PD1)之三特異性多肽或不具有功能活性域之陰性對照蛋白質進行比較。
簡言之，用Cell Trace Violet預先標記目標OCI-AML3腫瘤細胞，隨後在四特異性多肽、三特異性多肽存在下用人類PBMC效應細胞處理，最終濃度為0 nM、0.0667 nM、0.335 nM、0.667 nM及1.334 nM。在培育之後，將死細胞用7-AAD染色，且以與活OCI-AML3細胞百分比相比較的死細胞百分比來計算細胞毒性。
圖 9B 呈現此實驗之結果，且結果顯示由四特異性多肽製得之二聚體有效地靶向及殺死OCI-AML3細胞。
在另一實驗中，將由KB015多肽製得之同二聚體之抗腫瘤作用與由含有僅一個活性VHH之多肽(KB020、KB021或KB022)製得之同二聚體或與三個相應單域抗體-Fc蛋白質KB045 (抗PDL1 VHH-Fc)、KB046 (抗CD3 VHH-Fc)、KB033 (抗PD1 VHH-Fc)之組合的抗腫瘤作用進行比較。簡言之，用同二聚體或用三個VHH-Fc蛋白質之組合或用由KB023多肽製得之陰性對照同二聚體處理THP-1細胞，最終濃度為0 nM、0.007 nM、0.07 nM、0.7 nM及7 nM。在培育之後，將細胞染色，且將死細胞之百分比與活細胞之百分比進行比較。
圖10中呈現之結果顯示，由KB015多肽製得之同二聚體具有比含有僅一個針對PD-L1、CD3或PD-1之VHH的分子更大之細胞毒性。
連接子之分析 研究連接子之序列及在多肽中之位置的作用。
簡言之，測試含有相同VHH以及連接子序列之變化的三價多肽與重組蛋白PD-1的結合。將作為抗PDl VHH Fc蛋白質的構築體KB033用作陽性對照。以1 μg/ml將重組蛋白PD-1塗佈於96孔培養盤中隔夜。將培養盤洗滌3次，之後用1% BSA阻斷。將具有不同稀釋程度之多肽添加至培養盤中且在室溫下培育1小時。在洗滌3次之後，以0.2 μg/ml添加二級抗體抗人類IgG1-HRP。1小時後，添加supersignal ELISA Pico化學發光受質以進行偵測。
在第一組實驗中，在SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 14中所闡述之連接子序列當中選擇緊鄰Fc之C端部分的連接子(圖 11A )。
在第二組實驗中，在SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7 (n=1)、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 14中所闡述之連接子序列當中選擇兩個C端VHH之間的連接子(圖 12A )。
圖 11B 及圖 11C 以及圖 12B 及圖 12C 中呈現之實驗之此等結果顯示，抗PD-1 VHH與其目標之結合受蛋白質二聚體中之連接子類型及長度影響。在此情形下，看來剛性及可撓性連接子以類似於陽性對照之親和力的親和力進行結合。在緊鄰Fc之C端部分之位置處存在具有SEQ ID NO: 13中所闡述之序列的螺旋狀連接子對蛋白質二聚體之結合具有更大影響。兩個C端VHH之間存在具有SEQ ID NO: 14中所闡述之序列的螺旋狀連接子及在較低程度上具有SEQ ID NO: 13中所闡述之序列的連接子亦對蛋白質二聚體之結合具有不良影響。在此情形下，剛性連接子看來對於在二聚域之C端及在位於二聚域之C端的兩個VHH之間接合VHH而言更佳。
腫瘤特異性多肽及蛋白質二聚體之結果 圖 13至圖 20呈現關於腫瘤特異性多肽及相關蛋白質二聚體進行之實驗之例示性結果。
結合分析 藉由如本文中所描述之蛋白脂質體ELISA測定由含有相異抗DRD2 VHH部分之多肽製得的同二聚體之結合。將含有DRD2蛋白質之蛋白脂質體或空白脂質體用作目標，且以1 uM之濃度測試由KB001、KB003、KB004、KB005或KB017 (陰性對照)多肽製得之同二聚體。
圖 13A 中呈現之結果顯示，由KB001、KB003、KB004及KB005多肽製得之同二聚體選擇性結合於DRD2。
關於由含有相異抗DRDl VHH部分之多肽(KB035、KB008、KB009)製得的同二聚體進行類似實驗。圖 13B 呈現此實驗之結果，且結果顯示，至少由KB008及KB009多肽製得之同二聚體選擇性結合於DRD1。
關於含有抗CD36 VHH部分之同二聚體進行之ELISA實驗顯示，至少由KB014多肽製得之同二聚體有效地結合於重組人類CD36 (資料未展示)。
同二聚體與其目標之結合的可變性很可能歸因於腫瘤特異性VHH與其抗原決定基之結合親和力或親合力的變化。
活體外細胞活力及細胞毒性 根據製造商之說明書使用CellTiter-Fluor™細胞活力分析(Promega)測試由含有DRD2靶向部分之多肽製得的同二聚體活體外降低NCI-H510A或NCI-H69之活力的能力。簡言之，將與由KB001、KB003、KB004及KB005多肽製得之同二聚體(濃度1,000 ng/ml)一起培育的NCI-H510A或NCI-H69細胞之活力與由KB018多肽製得之陰性對照同二聚體或PBS媒劑對照進行比較。
圖 14A 及圖 14B 呈現結果，且結果顯示DRD2特異性同二聚體降低NCI-H510A (圖 14A )及NCI-H69 (圖 14B )肺癌細胞株之活力。
關於由含有相異DRD1靶向部分之多肽(KB035及KB008)製得之同二聚體進行類似實驗以測定NCI-H510A細胞之活力。圖 14C 呈現此實驗之結果，且結果顯示，由KB007及KB008多肽製得之同二聚體有效地降低NCI-H510A肺癌細胞之活力。
如上文所指示使用腫瘤細胞株OCI-AML3測試由含有CD36靶向部分之多肽製得之同二聚體的活體外細胞毒性。用由KB017、KB019、KB012或KB013多肽製得之同二聚體處理細胞，最終濃度為0 nM、0.0667 nM、0.667 nM及6.67 nM。將細胞在4℃下與7AAD染色溶液一起在冰上培育10分鐘。在培育之後，將細胞染色，且將死細胞之百分比與活細胞之百分比進行比較。
圖 15A 中呈現之結果顯示，添加靶向癌症特異性抗原CD36之VHH可增強同二聚體之功能性細胞毒性活性。
關於由KB014及KB011多肽製得之同二聚體進行的單獨實驗顯示，此等構築體亦有效地誘導OCI-AML細胞毒性(圖 15B )。
實例 4 ： 活體內測試 已建立的腫瘤模型 用2百萬個人類OCI-AML3白血病腫瘤細胞皮下注射年齡6至8週的四十隻雌性NOG小鼠(Taconics)，且用100 μL人類PBMC腹膜內注射。當腫瘤達至100至200 mm3 時再注射PBMC。在PBMC注射之後2至4天開始處理。將小鼠劃分成每組10個動物的4個處理組，具有相同平均腫瘤尺寸。治療由以下組成：約30 mg/kg之抗體劑量之多價蛋白質二聚體或媒劑(PBS)對照，每週兩次，持續時間3週。
腫瘤預防模型 用與7百萬人類PBMC混合(1:1)的2百萬個人類OCI-AML3白血病腫瘤細胞皮下注射年齡6至8週的四十隻雌性NOG小鼠(Taconics)。將小鼠劃分成每組10個動物的4個處理組。治療由以下組成：約30 mg/kg之抗體劑量之多價蛋白質二聚體或媒劑(PBS)對照，每週兩次，持續時間3週。
多肽及蛋白質二聚體之結果 在第一組實驗中，在預防性活體內腫瘤模型中使用人類人類OCI-AML3白血病腫瘤細胞比較由KB019或KB015多肽製得之同二聚體的抗腫瘤作用。簡言之，用與7百萬人類PBMC混合的2百萬個OCI-AML3腫瘤細胞皮下注射年齡6至8週的雌性NOG小鼠(Taconics)。將小鼠劃分成各由10個動物組成的處理組。治療由以下組成：28 mg/kg之劑量的同二聚體(由KB017、KB019、KB015多肽製得)或媒劑(PBS)對照，每週兩次，持續時間3週，在此期間量測腫瘤尺寸且計算腫瘤體積。
圖 16A 中呈現之結果顯示，靶向CD3及PD1之VHH向KB019多肽製得之同二聚體活體內賦予功能活性，且添加針對PDL1之靶向腫瘤之單域抗體增強分子之功能活性(參見關於由KB015多肽製得之同二聚體的結果)。亦在另一免疫缺陷小鼠模型中獲得類似結果(使用NCG小鼠(Charles River)，資料未顯示)。
腫瘤特異性多肽及蛋白質二聚體之結果 在預防性活體內腫瘤模型中使用人類OCI-AML3白血病腫瘤細胞將由KB011多肽製得之同二聚體之抗腫瘤作用與由KB017多肽製得之同二聚體之抗腫瘤作用及含有相同抗CD36 VHH但呈sdAb形式之構築體VHH-Fc (KB058)之抗腫瘤作用進行比較。簡言之，用與7百萬人類PBMC混合的2百萬個OCI-AML3腫瘤細胞皮下注射年齡4至6週的雌性NOG小鼠(Taconics)。將小鼠劃分成各由10個動物組成的處理組。治療由以下組成：28 mg/kg之劑量之同二聚體(由KB011、KB015、KB058多肽製得)或媒劑(PBS)對照，每週兩次，持續時間3週，其後量測腫瘤尺寸且計算腫瘤體積。
圖 16B 中呈現之結果顯示，由KB011多肽製得之同二聚體在活體內比VHH-Fc對應物(KB058)更有效。亦在NCG (Charles River)免疫缺陷小鼠模型中證實了同二聚體之效率(資料未展示)。
CB-17 Fox Chase SCID 小鼠中之腫瘤模型 將含腫瘤細胞(8百萬個細胞/小鼠，NCI-H510A)之DPBS皮下注射(s.c.)至小鼠之右側腹中。在細胞接種後一天，將接種各細胞株之小鼠隨機劃分成2個實驗組(10或5隻小鼠/組)，且每一組小鼠腹膜內接受16陰性對照或KB120，每週兩次，總共八週。使用游標卡尺來量測腫瘤體積，且每週為小鼠稱重一次或兩次。使用以下公式計算腫瘤體積：1 /2 (長度 ×寬度2 )。為了計算腫瘤生長抑制百分比(TGI)，將KB120處理組與其各別陰性對照進行比較。藉由以下公式計算TGI：
Figure 02_image002
TV第z天表示限定研究日(第z天)個別動物之腫瘤體積，且TV第x天表示分級日(第x天)個別動物之腫瘤體積。在癌症異種移植模型中測試DRD2三特異性蛋白質複合物KB073 (對DRD2、PD1及CD3具有特異性)。將NCG小鼠接種NCI-H82細胞，其中人類PBMC及NCI-H82細胞以1:5之比率共植入(圖 19 )。
藉由student t測試(雙尾)進行統計學測試。
圖 17 中呈現之結果顯示，抗DRD2 VHH充當sdAb (抗DRD2抗原結合域融合於人類鉸鏈之N端且Fc融合於C端)。在NCI-H510A模型以及其他模型中，相較於陰性對照，KB120構築體減小腫瘤體積。
如本文所概述測試由組裝包含對DRD2、PD 1及/或CD3具有特異性之VHH的多肽鏈形成之多肽複合物的活體外及活體內活性。圖 19 之結果顯示，例示性DRD2三特異性蛋白質複合物在NCI-H82 SCLC人類PBMC共植入模型中具有抗腫瘤作用。當與諸如順鉑之化學療法組合投與時，亦增加蛋白質複合物之抗腫瘤作用(資料未展示)。
PD-1/PD-L1 阻斷生物分析 在第一組實驗中，藉由ELISA評估包含抗PD-1 VHH之蛋白質複合物在重組人類PD-1上之結合。
簡言之，將重組蛋白塗佈於96孔培養盤上。覆蓋培養盤且保持在4℃下隔夜。次日，用PBS洗滌培養盤一次且用阻斷緩衝液在室溫下阻斷1小時。以所指示濃度測試抗體，稀釋於阻斷緩衝液中，且在37℃下培育1小時。在培育之後，用洗滌緩衝液洗滌培養盤三次。將培養盤與以1:5000稀釋之抗人類Fc-HRP在室溫下一起培育1小時，隨後用PBS-T洗滌緩衝液洗滌三次。用SuperSignal™ ELISA Pico化學發光受質產生信號。在SpectraMax™ i3x多模式微量培養盤閱讀器(分子裝置)上讀取培養盤。
此實驗之結果顯示，包含抗PD-1 VHH之KB072蛋白質複合物與陽性對照一樣有效地結合於重組人類PD-1 (圖 18A )。
使用PD-1/PD-L1阻斷分析在發光NFAT-RE報導系統內評估包含抗PD-1 VHH之蛋白質複合物之阻斷活性，且與陽性對照進行比較(圖 18B )。簡言之，解凍PD-L1 aAPC/CHO-K1 (目標)細胞且以推薦密度接種至96孔培養盤中，使其黏附於培養盤隔夜。第二天，將蛋白質複合物在分析緩衝液(含10%低IgG FBS之哈姆氏F12培養基)中稀釋至350 nM，且進行八次2.5×連續稀釋。傾析來自96孔培養盤之培養基，將40 μl經稀釋之多肽或蛋白質複合物及40 μl Jurkat (效應子)細胞添加至培養盤。將培養盤在37℃下培育6小時。合併Bio-Glo螢光素酶分析緩衝液及受質，且將80 μl溶液轉移至各孔。將培養盤在室溫下培育5分鐘，且使用培養盤讀取器來量測發光。
此實驗之結果指示，KB072蛋白質複合物之結合顯示與陽性對照類似之活性(圖 18B )。即使在位於「Fc-連接子」組分與「連接子-VHH」組分之間時，抗PD-1 VHH仍具功能性。因此，即使位於Fc之C端處，抗PD-1模組仍具功能性。亦藉由FACS分析觀測到蛋白質複合物與表現PD-1之細胞的結合(資料未展示)。包含抗PD-1 VHH之蛋白質複合物亦增加PBMC介導之細胞毒性(資料未展示)。
在人類小細胞肺癌之DRD2陽性NCI-H69及NCI-H82異種移植模型中觀測到放射性標記蛋白質複合物在腫瘤組織中之積聚(資料未展示)。
實例 5 ： 異二聚體 異二聚體設計 為了產生異二聚體，本申請人在Fc部分之CH3域中引入多個突變以便去除靜電相互作用或引入排斥電荷。
簡言之，產生含有位置356、370及399 (根據EU編號系統)處之突變的DNA構築體。在一些此等構築體(鏈A)中，位置356處之麩胺酸(E)變成麩醯胺酸(Q)，位置370處之離胺酸(K)變成麩胺酸(E)且位置399處之天冬胺酸(D)變成天冬醯胺(N)。此等構築體含有有助於偵測不為其功能所需之蛋白質的His標籤。產生含有位置357、399及439 (根據EU編號系統)處之突變的其他DNA構築體(鏈B)。更特定言之，在一些此等構築體中，位置357處之麩胺酸(E)變成麩醯胺酸(Q)，位置399處之天冬胺酸(D)變成天冬醯胺(N)，且位置439處之離胺酸(K)經修飾為麩胺酸(E)。
當在不存在另一鏈之情況下表現於細胞中時，包含鏈A或鏈B突變之多肽可組裝成同二聚體。表 3 含有突變二聚域之例示性POP多肽
      模組1 模組2 模組3 模組4 模組5 模組6 模組7
代號 特異性 VHH 1 連接子1 Fc 連接子2 VHH 2 連接子3 VHH 3
KB047 (鏈B) PDL1, CD3, PD1 α-PDL1, SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:2 α-CD3 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:4 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB068 (鏈B) PDL1, CD3, PD1 α-PDL1, SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:9 α-CD3 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:4 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB048 (鏈B) HEWL, HEWL, HEWL SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:22
KB050 (鏈A) 4HEM, 4HEM, 4HEM SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:23
KB049 (鏈B) 4HEM, 4HEM SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:23 - -
表 4- 含有突變二聚域之例示性腫瘤特異性多肽
   模組1 模組2 模組3 模組4 模組5 模組6 模組7
代號 特異性 VHH 1 連接子1 Fc 連接子2 VHH 2 連接子3 VHH 3
KB002 (鏈B) DRD2, PD1, CD3 α- DRD2.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:9 α-PD1 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:4 α-CD3 SEQ ID NO:20
KB069 (鏈B) DRD2, CD3, PD1 α- DRD2.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:9 α-CD3 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:4 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB051 (鏈A) DRD1, CD3 α- DRD1.4 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:14 α-CD3 SEQ ID NO:20 - -
KB051 (鏈B) DRD1, CD3, PD1 α- DRD1.3 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:2 α-CD3 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:4 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB052 (鏈A) DRD1, CD3 α- DRD1.3 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:14 α-CD3 SEQ ID NO:20 - -
KB052 (鏈B) DRD1, CD3, PD1 α- DRD1.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:2 α-CD3 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:4 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB053 (鏈A) DRD1, CD3 α- DRD1.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:14 α-CD3 SEQ ID NO:20 - -
KB053 (鏈B) DRD1, CD3, PD1 α- DRD1.3 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO19 SEQ ID NO:2 α-CD3 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:4 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB054 (鏈A) DRD2, CD3 α- DRD2.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:14 α-CD3 SEQ ID NO:20 - -
KB054 (鏈B) DRD2, CD3, PD1 α- DRD2.4 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO19 SEQ ID NO:2 α-CD3 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:4 α-PD1 SEQ ID NO:21
KB055 (鏈B) DRD2, HEWL, HEWL α- DRD2.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO19 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:22
KB056 (鏈B) DRD2, HEWL, CD3 α- DRD2.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO19 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:4 α-CD3 SEQ ID NO:20
為了測試CH3突變是否影響分子之細胞毒性，製備含有位置357、399及439處之突變的KB015多肽之變異體(亦即KB047多肽)，將其轉染至細胞中，且如上文所描述在活體外分析中測試因此產生之蛋白質二聚體的細胞毒性。
簡言之，用Cell Trace Violet預先標記目標OCI-AML3腫瘤細胞，隨後用人類PBMC效應細胞(效應物:目標比率5:1)在由KB015或KB047多肽製得之蛋白質二聚體存在下處理或用由KB018或KB048多肽製得之陰性對照二聚體處理，最終濃度為0 nM、0.007 nM、0.07 nM、0.7 nM及7 nM。在培育之後，將死細胞用7-AAD染色，且以死細胞與目標OCI-AML3腫瘤細胞之數目相比較的百分比來計算細胞毒性。
圖 20B 中呈現此實驗之結果，且結果顯示由KB047多肽製得之二聚體的細胞毒性作用類似於由KB015多肽製得之二聚體的細胞毒性作用。如此，此等突變看來並未對分子之細胞毒性產生負面影響。
形成異二聚體 產生包含三個抗4HEM VHH及含突變D399N、K439E、E357Q (根據EU編號系統)之Fc區的DNA構築體(KB049多肽)。
亦產生含有兩個抗4HEM VHH及含突變D399N、K370E及E356Q (根據EU編號系統)之Fc區的另一DNA構築體(KB050多肽)。
如上文所描述使用ExpiCHO™表現系統(Thermo Fisher，目錄號A29133)表現多肽。
簡言之，用編碼輕鏈(KB049多肽)、重鏈(KB050多肽)之質體轉染細胞或用兩種質體(在圖 21B 中鑑別為KB057)以1:1、3:1及1:3之比率共轉染。在轉染之後八天使上清液澄清，過濾滅菌且儲存於4℃或冷凍以供靠後分析。藉由西方墨點法分析異二聚體之產生且使用Penta.His抗體進行偵測。
僅含重鏈之KB050多肽之表現使得形成重同二聚體，而僅含輕鏈之KB049之表現使得僅產生輕同二聚體。圖 21 中(非還原條件)呈現此實驗之結果，且結果顯示有效地形成異二聚體，當DNA比率為1比1時發生最佳異二聚體形成。重鏈及輕鏈之共表現(KB057)使得成功產生異二聚體(圖 21 )。
進行類似實驗以檢驗VHH域變化之影響，其中藉由以1:1之DNA比率共表現KB051、KB052、KB053之鏈A及鏈B或以1:2之DNA比率共表現KB054之鏈A及鏈B來測試若干變異體，該等變異體具有替代抗原結合域(圖 22A )。圖 22 中呈現之此等實驗之結果顯示，異二聚體可有效地自用各種VHH域編碼蛋白質的此等構築體形成。(圖 22B -非還原條件，圖 22C -還原條件)。
產生額外突變CH3域，且測試突變多肽組裝成異二聚體的能力。表 5 中呈現例示性多肽鏈。
      模組1 模組2 模組3 模組4 模組5 模組6 模組7
CH3域ID 特異性 VHH 1 連接子1 Fc 連接子2 VHH 2 連接子3 VHH 3
KB079 (鏈A) HEWL, HEWL, SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:22      
KB080 (鏈B) HEWL, HEWL, HEWL SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:22
KB081 (鏈A) HEWL, HEWL SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:22      
KB082 (鏈B) HEWL, HEWL, HEWL SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:54 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:22
KB083 (鏈A) DRD2, PD1 α- DRD2.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:55 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:21      
KB084 (鏈B) DRD2, PD1, CD3 α- DRD2.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:56 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:20
KB085 (鏈B) HEWL, HEWL, HEWL SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:57 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:22
KB086 (鏈A) HEWL, HEWL SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:58 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:22      
KB087 (鏈B) HEWL, HEWL, HEWL SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:59 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:22
KB088 (鏈A) HEWL, HEWL SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:60 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:22      
KB089 (鏈B) HEWL, HEWL, HEWL SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:61 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:22
KB090 (鏈A) HEWL, HEWL SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:62 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:22      
KB091 (鏈B) HEWL, HEWL, HEWL SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:63 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:22
KB092 (鏈A) HEWL, HEWL SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:64 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:22      
KB093 (鏈B) HEWL, HEWL, HEWL SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:65 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:22
KB094 (鏈A) HEWL, HEWL SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:66 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:22      
KB095 (鏈B) HEWL, HEWL, HEWL SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:67 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:22
KB096 (鏈A) HEWL, HEWL SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:68 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:22      
KB097 (鏈B) HEWL, HEWL, HEWL SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:69 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:22
KB098 (鏈A) HEWL, HEWL SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:70 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:22      
KB099 (鏈B) HEWL, HEWL, HEWL SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:71 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:22
KB100 (鏈A) HEWL, HEWL SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:72 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:22      
KB101 (鏈A) DRD2, PD1 α- DRD2.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:73 SEQ ID NO:9 α-PD1      
KB102 (鏈A) DRD2, PD1 α- DRD2.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:74 SEQ ID NO:9 α-PD1      
KB103 (鏈A) DRD2, PD1 α- DRD2.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:9 α-PD1      
KB104 (鏈A) DRD2, PD1 α- DRD2.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:76 SEQ ID NO:9 α-PD1      
KB105 (鏈A) DRD2, PD1 α- DRD2.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:77 SEQ ID NO:9 α-PD1      
KB106 (鏈A) DRD2, PD1 α- DRD2.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:78 SEQ ID NO:9 α-PD1      
KB107 (鏈A) DRD2, PD1 α- DRD2.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:79 SEQ ID NO:9 α-PD1      
KB108 (鏈A) DRD2, PD1 α- DRD2.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:80 SEQ ID NO:9 α-PD1      
KB109 (鏈A) DRD2, PD1 α- DRD2.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:81 SEQ ID NO:9 α-PD1      
KB110 (鏈A) DRD2, PD1 α- DRD2.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:82 SEQ ID NO:9 α-PD1      
KB111 (鏈A) DRD2, PD1 α- DRD2.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:83 SEQ ID NO:9 α-PD1      
KB112 (鏈A) DRD2, PD1 α- DRD2.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:84 SEQ ID NO:9 α-PD1      
KB113 (鏈B) DRD2, PD1, CD3 α- DRD2.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:85 SEQ ID NO:9 α-PD1 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:20
KB114 (鏈B) DRD2, PD1, CD3 α- DRD2.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:86 SEQ ID NO:9 α-PD1 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:20
KB115 (鏈B) DRD2, PD1, CD3 α- DRD2.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:87 SEQ ID NO:9 α-PD1 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:20
KB116 (鏈B) DRD2, PD1, CD3 α- DRD2.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:88 SEQ ID NO:9 a-PD1 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:20
KB117 (鏈B) DRD2, PD1, CD3 α- DRD2.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:89 SEQ ID NO:9 α-PD1 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:20
KB118 (鏈B) DRD2, PD1, CD3 α- DRD2.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:90 SEQ ID NO:9 α-PD1 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:20
KB119 (鏈B) DRD2, PD1, CD3 α- DRD2.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:9 α-PD1 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:20
以不同比率共表現選自下表 5 之表現鏈A及鏈B對的載體，且如上文所描述評估異二聚體之形成。選擇不利於同二聚體形成及/或有利於異二聚體形成之突變以產生多價及/或多特異性蛋白質複合物。
尤其測試以下載體對。 -  將表現包含SEQ ID NO: 53中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 54中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 55中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 56中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 57中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 58中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 59中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 60中所闡述之突變CH3域的多肽共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 61中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 62中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 63中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 64中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 65中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 66中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 67中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 68中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 69中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 70中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 73中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 85中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 73中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 86中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 73中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 87中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 74中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 88中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 75中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 88中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 76中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 88中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 77中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 88中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 77中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 89中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 77中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 90中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 78中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 88中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 79中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 88中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 80中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 90中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 81中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 88中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 81中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 89中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 82中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 90中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 83中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 88中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 84中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 90中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 74中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 19中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 55中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 19中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。 -  將表現包含SEQ ID NO: 55中所闡述之突變CH3域之多肽的載體與表現包含SEQ ID NO: 90中所闡述之突變CH3域之多肽的載體共轉染。
此等實驗之結果指示，異二聚體主要在共表現選自以下之鏈A及鏈B對時形成：包含SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 20中所闡述、SEQ ID NO: 92及SEQ ID NO: 93中所闡述、SEQ ID NO: 94及SEQ ID NO: 95中、SEQ ID NO: 96及SEQ ID NO: 97中所闡述、SEQ ID NO: 98及SEQ ID NO: 99中所闡述、SEQ ID NO: 100及SEQ ID NO: 101中所闡述、SEQ ID NO: 102及SEQ ID NO: 95中所闡述或SEQ ID NO: 103及SEQ ID NO: 95中所闡述之突變CH3域的鏈A及鏈B對。
此等實驗之結果亦顯示，當多肽對包含SEQ ID NO: 92及SEQ ID NO: 93中所闡述之突變CH3域或SEQ ID NO: 94及SEQ ID NO: 95中所闡述之突變CH3域時，異二聚體形成之傾向增加。
本文中所描述之實施例及實例為說明性的且不意謂限制申請專利範圍之範疇。本發明人意欲將前述實施例之變化形式，包括替代方案、修改及等效物涵蓋於申請專利範圍中。在本申請案中列舉之引文以引用之方式併入本文中。
參考文獻 本申請案通篇提及之所有專利、專利申請案及公開案以引用之方式併入本文中。 Angal, S.等人, A Single Amino Acid Substitution Abolishes the Heterogeneity of Chimeric Mouse/human IgG4 Antibody, Mol Immunol 30, 105-108, 1993 Chen X等人, Fusion Protein Linkers: Properties, Design and Functionality, Adv Drug Deliv Rev. 2013; 65(10):1357-1369。 Conrath, K.E.等人, Camel Single-Domain Antibodies as Modular Building Units in Bispecific and Bivalent Antibody Constructs. J. Biol. Chem. 2001, 276, 7346-7350。 Coppieters, K.等人, Formatted Anti-Tumor Necrosis Factor alpha VHH Proteins Derived from Camelids Show Superior Potency and Targeting to Inflamed Joints in a Murine Model of Collagen-induced Arthritis. Arthritis Rheum. 2006, 54, 1856-1866。 Detallea L,等人, Generation and Characterisation of ALX-0171, a Potent Novel Therapeutic Nanobody for the Treatment of Respiratory Syncytial Virus infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 60(1) 2015 De Vlieger等人, Single-domain Antibodies and their Formatting to Combat Viral Infections, Antibodies 8(1), 1-22, 2019 Duggan S. Caplacizumab: First Global Approval. Drugs (2018) 78:1639-1642 Fleischmann R,等人, A Novel Individualized Treatment Approach in Open-Label Extension Study of Ozoralizumab (ATN-103) in Subjects with Rheumatoid Arthritis on a Background of Methotrexate. Abstract 1311, ACR/ARHP年度會議(2012)。 Fridy PC,等人, A Robust Pipeline for Rapid Production of Versatile Nanobody Repertoires. Nat Methods. 2014年12月; 11(12): 1253-1260。 Godar M等人. Therapeutic Bispecific Antibody Formats: a Patent Applications Review (19942017) Expert Opinion on Therapeutic patents, 2018; 28(3):251-276 Ha, J-H等人. Immunoglobulin Fc Heterodimer Platform Technology: From Design to Applications in Therapeutic Antibodies and Proteins, Front Immunol, 2016; 7:394。 Hamers-Casterman C,等人, Naturally-occurring Antibodies Devoid of Light-chains. Nature 1993, 363:446-448。 Hmila, I.等人, VHH, Bivalent Domains and Chimeric Heavy Chain-only Antibodies with High Neutralizing Efficacy for Scorpion Toxin AahI'. Mol. Immunol. 2008, 45, 3847-3856。 Hultberg, A等人, Llama-derived Single Domain Antibodies to Build Multivalent, Super Potent and Broadened Neutralizing Anti-viral Molecules. PLoS One 2011, 數位物件識別碼：10.1371/journal.pone.0017665。 Jähnichen S,等人, CXCR4 Nanobodies (VHH-based single variable domains) Potently Inhibit Chemotaxis and HIV-1 Replication and Mobilize Stem Cells. Proc Natl Acad Sci USA. (2010) 107:20565-20570。 Kovalenko OV等人 Atypical Antigen Recognition Mode of a Shark Immunoglobulin New Antigen Receptor (IgNAR) Variable Domain Characterized by Humanization and Structural Analysis, J Biol Chem. 2013, 288:17408-17419 Muyldermans,S及Smider, 2016. Distinct Antibody Species: Structural Differences Creating Therapeutic Opportunities. Current Opinion in Immunology 2016, 40:7-13 Muyldermans, S等人, 1994. Sequence and Structure of VH Domain From Naturally Occurring Camel Heavy Chain Immunoglobulins Lacking Light Chains. Protein Eng. 7: 1129-1135。 Saunders K.O., Conceptual Approach to Modulating Antibody Effector Functions and Circuation Half-Life, Front. Immunol. 10:1296, 2019。 Schoen P,等人, Anti-RANKL Nanobody® ALX-0141 Shows Sustained Biomarker Inhibition in a Phase I Study in Healthy Postmenopausal Women. 數位物件識別碼：10.1530/boneabs.1.PP135 (2013) Simmons, D.P等人, Dimerisation Strategies for Shark IgNAR Single Domain Antibody Fragments. J. Immunol. Methods 2006, 315, 171-184。 Svecova D,等人, A Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Phase 1 Study of Multiple Ascending Doses of Subcutaneous M1095, an Anti-Interleukin-17A/F Nanobody®, in Moderate- to-Severe Psoriasis. J Am Acad Dermatol. 2019年3月26日。 Tatusova, T. A,等人. (1999), BLAST 2 Sequences, a New Tool for Comparing Protein and Nucleotide Sequences, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) Van Roy M,等人, The Preclinical Pharmacology of the High Affinity Anti-IL-6R Nanobody® ALX-0061 Supports its Clinical Development in Rheumatoid Arthritis. Arthritis Research & Therapy (2015) 17:135 Vincke C.等人 General Strategy to Humanize a Camelid Single-Domain Antibody and Identification of a Universal Humanized Nanobody Scaffold, J.Biol Chem. 2009, 284(5):3273-3284 Vu, K. B.,等人, 1997. Comparison of Llama VH Sequences from Conventional and Heavy Chain Antibodies. Mol. Immunol. 34: 1121-1131.
序列表 SEQ ID NO:1 (人類IgG1鉸鏈)
Figure 02_image004
SEQ ID NO:2 (連接子-HL1)
Figure 02_image006
SEQ ID NO:3 (可撓性連接子-FL2)
Figure 02_image008
SEQ ID NO:4 (可撓性連接子-FL18)
Figure 02_image010
SEQ ID NO:5 (可撓性連接子-FL4)
Figure 02_image012
SEQ ID NO:6 (可撓性連接子- FL5)
Figure 02_image014
SEQ ID NO:7 (可撓性連接子) (GGGGS)n ，其中n為選自1至10之整數 SEQ ID NO:8 (剛性連接子-RL5)
Figure 02_image016
SEQ ID NO:9 (剛性連接子-RL7)
Figure 02_image018
SEQ ID NO:10 (剛性連接子-RL12)
Figure 02_image020
SEQ ID NO:11 (剛性連接子) (X(PAPAP))n KA其中n為選自1至10之整數，其中X存在抑或不存在且為A SEQ ID NO:12 (螺旋狀連接子-RLl)
Figure 02_image022
SEQ ID NO:13 (螺旋狀連接子-RL2)
Figure 02_image024
SEQ ID NO:14 (螺旋狀連接子-RL4)
Figure 02_image026
SEQ ID NO:15 (螺旋狀連接子X(EAAAK)n Y其中n為選自1至10、更佳2至5之整數，其中X及Y獨立地存在或不存在且較佳地為A SEQ ID NO:16 人類IgG1恆定區
Figure 02_image028
SEQ ID NO: 17 替代人類IgG1恆定區
Figure 02_image030
SEQ ID NO:18 突變人類IgG1恆定區(鏈A- 突變D399N; K370E; E356Q)
Figure 02_image032
SEQ ID NO:19 突變人類IgG1恆定區(鏈B-突變D399N; K439E; E357Q)
Figure 02_image034
SEQ ID NO:20 抗CD3 VHH
Figure 02_image036
SEQ ID NO:21 抗PDl VHH
Figure 02_image038
其中X為E或Q SEQ ID NO:22 抗HEWL VHH
Figure 02_image040
其中X為E或Q SEQ ID NO:23 抗4HEM VHH
Figure 02_image042
其中X為E或Q SEQ ID NO:24 抗PDL1 VHH
Figure 02_image044
SEQ ID NO:25 (CH2/CH3 IgG4-3)
Figure 02_image046
SEQ ID NO:26 (Fc區IgG4-1)
Figure 02_image048
SEQ ID NO:27 天然人類CH3
Figure 02_image050
SEQ ID NO: 28 替代天然人類CH3
Figure 02_image052
SEQ ID NO:29 天然人類CH2
Figure 02_image054
SEQ ID NO:30 突變CH3域(鏈A-突變D399N; K370E; E356Q)
Figure 02_image056
SEQ ID NO:31 突變CH3域(鏈B-突變D399N; K439E; E357Q)
Figure 02_image058
SEQ ID NO:32 人類IgG1鉸鏈變異體
Figure 02_image060
SEQ ID NO:33 人類IgG1鉸鏈變異體
Figure 02_image062
SEQ ID NO:34 人類IgG1鉸鏈變異體
Figure 02_image064
SEQ ID NO:35 人類IgG2鉸鏈
Figure 02_image066
SEQ ID NO:36 人類IgG2鉸鏈變異體
Figure 02_image068
SEQ ID NO:37 人類IgG2鉸鏈變異體
Figure 02_image070
SEQ ID NO:38 人類IgG2鉸鏈變異體
Figure 02_image072
SEQ ID NO:39 人類IgG3鉸鏈
Figure 02_image074
SEQ ID NO:40 人類IgG3鉸鏈變異體
Figure 02_image076
SEQ ID NO:41 人類IgG3鉸鏈變異體
Figure 02_image078
SEQ ID NO:42 人類IgG3鉸鏈變異體
Figure 02_image080
SEQ ID NO:43 人類IgG4鉸鏈
Figure 02_image082
SEQ ID NO:44 人類IgG4鉸鏈變異體
Figure 02_image084
SEQ ID NO:45 人類IgG4鉸鏈變異體
Figure 02_image086
SEQ ID NO:46 人類IgG4鉸鏈變異體
Figure 02_image088
SEQ ID NO:47 人類IgG1 Fc區變異體
Figure 02_image090
SEQ ID NO:48 人類IgG2 Fc區
Figure 02_image092
SEQ ID NO:49 人類IgG2變異體
Figure 02_image094
SEQ ID NO:50 人類IgG3 Fc區
Figure 02_image096
SEQ ID NO:51 單一肽
Figure 02_image098
SEQ ID NO:52 抗原決定基標籤 HHHHHHSEQ ID NO:53 突變Fc (KB081 Fc)
Figure 02_image100
SEQ ID NO:54 突變Fc (KB082 Fc)
Figure 02_image102
SEQ ID NO:55 突變Fc (KB083 Fc)
Figure 02_image104
SEQ ID NO:56 突變Fc (KB084 Fc)
Figure 02_image106
SEQ ID NO:57 突變Fc (KB085 Fc)
Figure 02_image108
SEQ ID NO:58 突變Fc (KB086 Fc)
Figure 02_image110
Figure 02_image112
SEQ ID NO:59 突變Fc (KB087 Fc)
Figure 02_image114
SEQ ID NO:60 突變Fc (KB088 Fc)
Figure 02_image116
SEQ ID NO:61 突變Fc (KB089 Fc)
Figure 02_image118
SEQ ID NO:62 突變Fc (KB090 Fc)
Figure 02_image120
SEQ ID NO:63 突變Fc (KB091 Fc)
Figure 02_image122
SEQ ID NO:64 突變Fc (KB092 Fc)
Figure 02_image124
SEQ ID NO:65 突變Fc (KB093 Fc)
Figure 02_image126
SEQ ID NO:66 突變Fc (CKB094 Fc)
Figure 02_image128
SEQ ID NO:67 突變Fc (KB095 Fc)
Figure 02_image130
SEQ ID NO:68 突變Fc (KB096 Fc)
Figure 02_image132
SEQ ID NO:69 突變Fc (KB097 Fc)
Figure 02_image134
Figure 02_image136
SEQ ID NO:70 突變Fc (KB098 Fc)
Figure 02_image138
SEQ ID NO:71 突變Fc (KB099 Fc)
Figure 02_image140
SEQ ID NO:72 突變Fc (KB100 Fc)
Figure 02_image142
SEQ ID NO:73 突變Fc (KB101 Fc)
Figure 02_image144
SEQ ID NO:74 突變Fc (KB102 Fc)
Figure 02_image146
SEQ ID NO:75 突變Fc (KB103 Fc)
Figure 02_image148
SEQ ID NO:76 突變Fc (KB104 Fc)
Figure 02_image150
SEQ ID NO:77 突變Fc (KB105 Fc)
Figure 02_image152
SEQ ID NO:78 突變Fc (KB106 Fc)
Figure 02_image154
SEQ ID NO:79 突變Fc (KB107 Fc)
Figure 02_image156
SEQ ID NO:80 突變Fc (KB108 Fc)
Figure 02_image158
Figure 02_image160
SEQ ID NO:81 突變Fc (KB109 Fc)
Figure 02_image162
SEQ ID NO:82 突變Fc (KB110 Fc)
Figure 02_image164
SEQ ID NO:83 突變Fc (KB111 Fc)
Figure 02_image166
SEQ ID NO:84 突變Fc (KB112 Fc)
Figure 02_image168
SEQ ID NO:85 突變Fc (KB113 Fc)
Figure 02_image170
SEQ ID NO:86 突變Fc (KB114 Fc)
Figure 02_image172
SEQ ID NO:87 突變Fc (KB115 Fc)
Figure 02_image174
SEQ ID NO:88 突變Fc (KB116 Fc)
Figure 02_image176
SEQ ID NO:89 突變Fc (KB117 Fc)
Figure 02_image178
SEQ ID NO:90 突變Fc (KB118 Fc)
Figure 02_image180
SEQ ID NO:91 突變Fc (KB119 Fc)
Figure 02_image182
Figure 02_image184
SEQ ID NO:92 KB083鏈A之突變CH3域(突變D399Q; K370E; E356Q, Y349K, S354K)
Figure 02_image186
SEQ ID NO:93 ) KB084鏈B之突變CH3域(突變D399Q; K439E; E357Q, Y349D, S354D)
Figure 02_image188
SEQ ID NO:94 (KB110鏈A之突變CH3域(突變D399N; K370E; E356Q; L351W)
Figure 02_image190
SEQ ID NO:95 KB118鏈B之突變CH3域(突變D399N; K439E; E357Q; L351R)
Figure 02_image192
SEQ ID NO:96 KB089鏈A之突變CH3域(突變D399N, K370E, E356Q, S354M)
Figure 02_image194
SEQ ID NO:97 KB090鏈B之突變CH3域(突變D399N, K439E, E357Q, L351Y)
Figure 02_image196
SEQ ID NO:98 KB095鏈A之突變CH3域(突變D399N, K370E, E356Q, T350I)
Figure 02_image198
SEQ ID NO:99 (KB096鏈B之突變CH3域(突變D399N, K439E, E357Q, T350I)
Figure 02_image200
SEQ ID NO:100 (KB099鏈A之突變CH3域(突變D399N, K370E, E356Q, T350V)
Figure 02_image202
SEQ ID NO:101 KB100鏈B之突變CH3域(突變D399N, K439E, E357Q, T350V)
Figure 02_image204
SEQ ID NO:102 KB105鏈A之突變CH3域(突變D399N, K370E, E356Q, P352R)
Figure 02_image206
SEQ ID NO:103 KB108鏈A之突變CH3域(突變D399N, K370E, E356Q, P352E)
Figure 02_image208
圖 1 ：表示本文中所揭示之例示性多價蛋白質之模組設計及組裝的示意圖。VHH可經選擇且與連接子及二聚域組合形成多價及/或多特異性多肽二聚體。圖 2A 至圖 2B ：表示本發明之包含三個VHH域的多肽之例示性構形的示意圖，該等多肽展示為單體(圖 2A )或呈對稱同二聚體形式或異二聚體形式之蛋白質二聚體(圖 2B )。圖 3A 至圖 3C ：裝載有含有多肽KB001 (圖 3A )、KB003及KB004 (圖 3B )或KB005 (圖 3C )之上清液的在還原條件下進行的4-12% Bis-Tris梯度SDS-PAGE凝膠的圖像。使用牛血清白蛋白(BSA)之連續稀釋液作為內參考物。使用GelCode™染色試劑將凝膠染色以使蛋白質可視化。圖 4A 至圖 4B ：裝載有含有表現於哺乳動物細胞中之多肽KB007及KB008 (圖 4A )或KB009及KB010 (圖 4B )之上清液的在還原條件下進行的4-12% Bis-Tris梯度SDS-PAGE凝膠的圖像。使用牛血清白蛋白(BSA)之連續稀釋液作為內參考物。使用GelCode™染色試劑將凝膠染色以使蛋白質可視化。圖 5A 及圖 5B ：使用4-12%Bis-Tris梯度SDS-PAGE凝膠的非還原條件下的裝載有含有多肽KB012、KB013及KB011之上清液的4-12% Bis-Tris梯度SDS-PAGE凝膠之圖像(圖 5A )。使用牛血清白蛋白(BSA)之連續稀釋液作為內參考物。在非還原及還原條件下運行的裝載有2 μg KB012、KB013及KB011的8% Tris-Glycine SDS-PAGE凝膠之圖像(圖 5B )。使用GelCode™染色試劑將凝膠染色以使蛋白質可視化。圖 6A 及圖 6B ：在非還原條件下(圖 6A )或在還原條件下(圖 6B )使用含有2 μg經純化多肽KB001、KB003、KB004或KB005之樣本進行的8% Tris-Glycine SDS-PAGE凝膠之圖像。使用GelCode™染色試劑將凝膠染色以使蛋白質可視化。圖 6C ：彙總多肽KB001、KB003、KB004或KB005之生產產量、等電點(pI)及分子量(MW)的表格。圖 6D 及圖 6E ：在非還原條件下(圖 6D )或在還原條件下(圖 6E )的裝載有2 μg經純化多肽KB008、KB009或KB007的8% Tris-Glycine SDS-PAGE凝膠之圖像。使用GelCode™染色試劑將凝膠染色以使蛋白質可視化。圖 6F ：彙總多肽KB008、KB009或KB007之生產產量、等電點(pI)及分子量(MW)的表格。圖 7 ：表示由KB017多肽(陰性對照)、KB019多肽或KB015多肽製得之二聚體與Jurkat細胞之流動式細胞測量術結合資料的直方圖。圖 8A 至圖 8B ：表示獲自KB019多肽(圖 8A )及KB015多肽(圖 8B )之同二聚體的示意圖。圖 8C 至圖 8D ：表示藉由將人類PBMC與OCI-AML3及由KB017及KB019多肽製得之二聚體(圖 8C )或與由KB017、KB019及KB015多肽製得之二聚體(圖 8D )一起培育48小時來進行的PBMC依賴性細胞毒性分析之資料的圖表。圖 9A ：表示在48小時時分析的在具有由KB015、KB016或KB018多肽製得之二聚體之情況下對OCI-AML3細胞進行之PBMC依賴性細胞毒性分析之資料的曲線圖。圖 9B ：表示藉由在由KB074、KB075、KB076及KB078多肽製得之二聚體存在下將人類PBMC與OCI-AML3細胞一起培育48小時而進行的細胞毒性分析之資料第曲線圖。圖 10 ：表示在具有由KB020、KB021、KB022、KB015、KB023多肽製得之二聚體或具有抗體Fc融合體KB045、KB046及KB033之組合的情況下對THP-1細胞進行的細胞毒性分析之資料的曲線圖。圖 11A ：展示經選擇用於連接子修飾之位置的示意圖。圖 11B 至圖 11C ：展示不同蛋白質二聚體與人類重組蛋白PD-1之結合曲線的直方圖及圖表。圖 12A ：展示經選擇用於連接子修飾之位置的示意圖。圖 12B 至圖 12C ：展示不同蛋白質二聚體與重組蛋白PD-1之結合的直方圖及圖表。圖 13A ：表示由KB001、KB003、KB004、KB005或KB017多肽製得之二聚體與DRD2蛋白脂質體或與空脂質體之結合的曲線圖。圖 13B ：表示由KB007、KB008、KB009或KB017多肽製得之二聚體與DRD1蛋白脂質體或與空脂質體之結合的曲線圖。圖 14A 至圖 14B ：展示以1:10之比率且在具有濃度為10 μg/mL的由KB015、KB018、KB001、KB003、KB004或KB005多肽製得之二聚體的情況下與人類PBMC一起培育的NCI-H510細胞(圖 14A )或NCI-H69細胞(圖 14B )之活力的直方圖。圖 14C ：展示以1:10之比率且在具有濃度為10 μg/mL的由KB015、KB018、KB007或KB008多肽製得之二聚體的情況下與人類PBMC一起培育之NCI-H510細胞之活力的直方圖。圖 15A 至圖 15B ：表示在具有由KB017、KB019、KB012或KB013多肽製得之二聚體(圖 15A )或具有由KB011、KB015、KB017、KB012、KB013或KB014多肽製得之二聚體(圖 15B )的情況下對OCI-AML3進行48小時的人類PBMC依賴性細胞毒性分析之資料的曲線圖。圖 16A ：表示皮下注射有OCI-AML3腫瘤及人類PBMC且用由KB015、KB017或KB019多肽製得之二聚體或用PBS以28 mg/kg藉由腹膜內(i.p.)一週處理一次的NOG小鼠隨時間推移之腫瘤體積的曲線圖。圖 16B ：表示皮下注射有OCI-AML3腫瘤及人類PBMC且用由KB017、KB011多肽製得之二聚體或用KB058或用PBS以28 mg/kg一週處理一次的NOG小鼠隨時間推移之腫瘤體積的曲線圖。圖 17 ：表示用KB120或陰性對照sdAb (NC)以16 mg/kg一週處理一次的小細胞肺癌NCI-H510A模型之SCID小鼠異種移植之腫瘤進展的曲線圖。圖 18A ：表示包含抗PD-1 VHH之蛋白質複合物相較於陽性對照或陰性對照抗體與人類PD-1 (KB072)之結合的曲線圖。圖 18B ：表示包含抗PD-1 VHH之蛋白質複合物相較於陽性對照或陰性對照抗體對於人類PD-1 (KB072)之CPI功能(免疫檢查點抑制)的曲線圖。圖 19 ：展示用包含靶向DRD2、PD1及T細胞之VHH的蛋白質複合物(KB073)或用陰性對照抗體以28 mg/kg之劑量每兩週處理一次(總共八個劑量)的NCI-H82 SCLC人類PBMC共植入模型之腫瘤進展的曲線圖。圖 20A ：表示由KB047多肽製得之同二聚體的示意圖。圖 20B ：表示在具有由KB047、KB015、KB018或KB048多肽製得之二聚體的情況下對OCI-AML3細胞進行之細胞毒性分析之資料的曲線圖。圖 21A ：在對二聚體進行SDS-PAGE分析之後進行的西方墨點法之圖像，該二聚體藉由與不同比率之編碼KB049多肽輕鏈(泳道1)、KB050多肽重鏈(泳道2)的DNA共轉染細胞或以1:1、3:1及1:3 (泳道3至5)之比率與兩種質體(鑑別為KB057)共轉染而製得。圖 21B ：彙總由KB050或KB049多肽製得之同二聚體或由KB049及KB050之KB057共轉染製得之異二聚體之分子量的表格。圖 22A ：彙總單體、同二聚體或異二聚體之分子量的表格，該等單體、同二聚體或異二聚體藉由用表現KB051、KB052、KB053或KB054多肽之鏈A及鏈B的DNA構築體以及用於鏈A及鏈B之共轉染之DNA比率來共轉染細胞而製得。圖 22B 至圖 22C ：在非還原(圖 22B )或還原(圖 22C )下進行且裝載有蛋白質二聚體之SDS-PAGE之後進行的西方墨點法之圖像，該等蛋白質二聚體藉由將細胞與表現KB051 (泳道1)、KB052 (泳道2)、KB053 (泳道3)之鏈A及鏈B的1:1比率DNA構築體或表現KB054 (泳道4)多肽之鏈A及鏈B的1:2比率DNA構築體一起共轉染而製得。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
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Claims (153)

  1. 一種多肽，其以N端至C端方式包含式Ib之胺基酸序列： X-[(Aba )-(Lb )]m -(DD)-[(Lc )-(Abd )]n -Y 其中m為0、1或大於1之整數； 其中n為2或大於2之整數； 其中Aba 、Abd 各獨立地包含抗原結合域，該抗原結合域包含抗體之一或多個互補決定區(complementarity determining region；CDR)； 其中X或Y獨立地存在或不存在且包含胺基酸序列； 其中Lb 、Lc 各獨立地包含一或多個連接子； 其中Lc 不包含可裂解連接子； 且其中DD包含二聚域。
  2. 如請求項1之多肽，其中該二聚域包含CH2域、CH3域或其組合。
  3. 如請求項1或2之多肽，其中該二聚域包含CH3域，該CH3域包含一或多個根據EU編號在對應於D399、D/E356及/或K370的位置處之突變。
  4. 如請求項3之多肽，其中該CH3域進一步包含一或多個根據EU編號在對應於Y349、T350、L351、P352、S354、R/Q355、T394及/或P395之位置處的突變。
  5. 如請求項3或4之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q及K370E。
  6. 如請求項4之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399Q、D/E356Q、K370E、Y349K及S354K。
  7. 如請求項4之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及L351W。
  8. 如請求項4之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及S354M。
  9. 如請求項4之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及T350I。
  10. 如請求項4之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及T350V。
  11. 如請求項4之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352R。
  12. 如請求項4之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352E。
  13. 如請求項1或2之多肽，其中該二聚域包含CH3域，該CH3域包含一或多個根據EU編號在對應於D399、E357及/或K439的位置處之突變。
  14. 如請求項13之多肽，其中該CH3域進一步包含一或多個根據EU編號在對應於Y349、T350、L351、P352、S354、R/Q355、T394及/或P395之位置處的突變。
  15. 如請求項13或14之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399N、E357Q及K439E。
  16. 如請求項14之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399Q、E357Q、K439E、Y349D及S354D。
  17. 如請求項14之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及L351R。
  18. 如請求項14之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及L351Y。
  19. 如請求項14之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及T350I。
  20. 如請求項14之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及T350V。
  21. 如請求項2之多肽，其中該CH3域為包含選自由以下組成之群之突變的CH3域： a. 突變D399N、D/E356Q、K370E； b. 突變D399N、K439E、E357Q； c. 突變D399Q、D/E356Q、K370E、Y349K及S354K； d. 突變D399N、D/E356Q、K370E及L351W； e. 突變D399N、D/E356Q、K370E及S354M； f.  突變D399N、D/E356Q、K370E及T350I； g. 突變D399N、D/E356Q、K370E及T350V； h. 突變D399N、D/E356Q、K370E及P352R； i.  突變D399N、D/E356Q、K370E及P352E； j.  突變D399Q、D/E356Q及K370E； k. 突變D399N、D/E356Q、K370E及L351Y； l.  突變D399N、D/E356Q、K370E及L351H； m.  突變D399N、D/E356Q、K370E及R355K； n. 突變D399N、D/E356Q、K370E及Q355K； o. 突變D399N、D/E356Q、K370E及S354K； p. 突變D399N、D/E356Q、K370E及T350L； q. 突變D399N、D/E356Q、K370E及T394N； r.  突變D399N、D/E356Q、K370E及P352Y； s. 突變D399N、D/E356Q、K370E及P352V； t.  突變D399N、D/E356Q、K370E及P352T； u. 突變D399N、D/E356Q、K370E及P352L； v. 突變D399N、D/E356Q、K370E及P352G； w. 突變D399N、D/E356Q、K370E及P352C； x. 突變D399N、D/E356Q、K370E及L351T； y. 突變D399N、D/E356Q、K370E及L351A； z.  突變D399Q、E357Q、K439E、Y349D及S354D； aa. 突變D399N、E357Q、K439E及L351R； bb.   突變D399N、E357Q、K439E及L351Y； cc.   突變D399N、E357Q、K439E及T350I； dd.   突變D399N、E357Q、K439E及T350V； ee.   突變D399Q、K439E、E357Q； ff.    突變D399N、K439E、E357Q、S354K； gg.   突變D399N、K439E、E357Q、S354W； hh.   突變D399N、K439E、E357Q、Y349R； ii.  突變D399N、K439E、E357Q、T350L； jj.    突變D399N、K439E、E357Q、R355W； kk.   突變D399N、K439E、E357Q、Q355W； ll. 突變D399N、K439E、E357Q、P395I； mm.     突變D399N、K439E、E357Q、P395G； nn.        突變D399N、K439E、E357Q、P395E； oo.        突變D399N、K439E、E357Q、P352K； pp.        突變D399N、K439E、E357Q、P352D；及 qq.        突變D399N、K439E、E357Q、L351D。
  22. 一種多肽，其以N端至C端方式包含式Ic之胺基酸序列： X-[(Aba )-(Lb )]m -(DD)-[(Lc )-(Abd )]n - Y 其中m為0、1或大於1之整數； 其中n為0、1或大於1之整數，其限制條件為m及n不同時為0； 其中Aba 、Abd 各獨立地包含抗原結合域，該抗原結合域包含抗體之一或多個互補決定區(CDR)； 其中X或Y獨立地存在或不存在且包含胺基酸序列； 其中Lb 、Lc 各獨立地包含一或多個連接子； 其中DD包含二聚域，該二聚域包含 包含一或多個根據EU編號在對應於D399、D/E356及/或K370的位置處之突變的CH3域； 或 包含一或多個根據EU編號在對應於D399、E357及/或K439的位置處之突變的CH3域。
  23. 如請求項22之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399N、E356Q及K370E。
  24. 如請求項22之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399N、E357Q及K439E。
  25. 如請求項22至24中任一項之多肽，其中該CH3域進一步包含一或多個根據EU編號在對應於Y349、T350、L351、P352、S354、R/Q355、T394及/或P395之位置處的突變。
  26. 如請求項25之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399Q、D/E356Q、K370E、Y349K及S354K。
  27. 如請求項25之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及L351W。
  28. 如請求項25之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及S354M。
  29. 如請求項25之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及T350I。
  30. 如請求項25之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及T350V。
  31. 如請求項25之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352R。
  32. 如請求項25之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352E。
  33. 如請求項25之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399Q、E357Q、K439E、Y349D及S354D。
  34. 如請求項25之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及L351R。
  35. 如請求項25之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及L351Y。
  36. 如請求項25之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及T350I。
  37. 如請求項25之多肽，其中該CH3域包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及T350V。
  38. 如前述請求項中任一項之多肽，其中當m為2或大於2之整數時，該等[(Aba )-(Lb )]單元相同。
  39. 如請求項1至37中任一項之多肽，其中當m為2或大於2之整數時，該等[(Aba )-(Lb )]單元不同。
  40. 如請求項1至37中任一項之多肽，其中當m為大於2之整數時，該等[(Aba )-(Lb )]單元包含相同及不同單元。
  41. 如前述請求項中任一項之多肽，其中當n為2或大於2之整數時，該等[(Lc )-(Abd )]單元相同。
  42. 如請求項1至40中任一項之多肽，其中當n為2或大於2之整數時，該等[(Lc )-(Abd )]單元不同。
  43. 如請求項1至40中任一項之多肽，其中當n為2或大於2之整數時，該等[(Lc )-(Abd )]單元包含相同及不同單元。
  44. 如前述請求項中任一項之多肽，其中該一或多個連接子包含抗體或其抗原結合片段之鉸鏈區。
  45. 如請求項44之多肽，其中該鉸鏈區係來自IgG1、IgG2或IgG4。
  46. 如前述請求項中任一項之多肽，其中該一或多個連接子中之每一者的長度獨立地為至少5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸殘基。
  47. 如請求項46之多肽，其中該一或多個連接子中之每一者獨立地為可撓性連接子、螺旋狀連接子或剛性連接子。
  48. 如請求項47之多肽，其中該一或多個連接子包含可撓性連接子及/或剛性連接子。
  49. 如前述請求項中任一項之多肽，其中Lc 為剛性連接子。
  50. 如請求項47至49中任一項之多肽，其中該可撓性連接子包含GS連接子。
  51. 如請求項47至50中任一項之多肽，其中該可撓性連接子包含SEQ ID NO: 7中所闡述之胺基酸。
  52. 如請求項51之多肽，其中該可撓性連接子包含SEQ ID NO: 7中所闡述之胺基酸序列，且其中n為2、3、4、5或大於5之整數。
  53. 如請求項47至52中任一項之多肽，其中該剛性連接子包含多個PA重複。
  54. 如請求項53之多肽，其中該剛性連接子係選自PAPAPKA (SEQ ID NO: 8)；APAPAPAPAPKA (SEQ ID NO: 9)；APAPAPAPAPAPAPAPAPAPKA (SEQ ID NO: 10)；或其組合。
  55. 如請求項47之多肽，其中該螺旋狀連接子包含SEQ ID NO: 15中所闡述之胺基酸序列。
  56. 如請求項55之多肽，其中該螺旋狀連接子係選自AEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO: 12)；AEAAAKEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO: 13)；AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO: 14)；或其組合。
  57. 如前述請求項中任一項之多肽，其中該二聚域包含與SEQ ID NO: 27至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
  58. 如前述請求項中任一項之多肽，其中該二聚域進一步包含與SEQ ID NO: 29至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
  59. 如前述請求項中任一項之多肽，其中m為2、3、4、5或大於5之整數。
  60. 如前述請求項中任一項之多肽，其中n為3、4、5或大於5之整數。
  61. 如前述請求項中任一項之多肽，其中該多肽係選自由以下組成之群： X-(Aba1 )-(Lb1 )-(DD)-(Lc1 )-(Abd1 )-Y (式II)； X-(Aba1 )-(Lb1 )-(DD)-(Lc1 )-(Abd1 )-(Lc 2 )-(Abd 2 )-Y (式III)； X-(Aba1 )-(Lb 2 )-(Aba 2 )-(Lb1 )-(DD)-(Lc1 )-(Abd1 )-Y (式IV)； X-(Aba1 )-(Lb 2 )-(Aba 2 )-(Lb1 )-(DD)-(Lc1 )-(Abd1 )-(Lc 2 )-(Abd 2 )-Y (式V) X-(Aba1 )-(Lb2 )-(Aba2 )-(Lb1 )-(DD)-(Lc1 )-(Abd1 )-(Lc2 )-(Abd2 )-(Lc3 )-(Abd3 )-Y (式VI)； X-(Aba1 )-(Lb3 )-(Aba2 )-(Lb2 )-(Aba3 )-(Lb1 )-(DD)-(Lc1 )-(Abd1 )-(Lc2 )-(Abd2 )-Y (式VII)； X-(Aba1 )-(Lb3 )-(Aba2 )-(Lb2 )-(Aba3 )-(Lb1 )-(DD)-(Lc1 )-(Abd1 )-(Lc2 )-(Abd2 )-(Lc3 )-(Abd3 )-Y (式VIII)。
  62. 如請求項61之多肽，其中Lc1 、Lc2 及/或Lc3 為剛性連接子。
  63. 如前述請求項中任一項之多肽，其中該抗原結合域係選自由以下組成之群：單域抗體(sdAb)、重鏈可變區(VH或VHH)、輕鏈可變區(VL或VLL)、單鏈可變片段(ScFv)、VNAR 片段及其組合。
  64. 如請求項63之多肽，其中該抗原結合域包含sdAb。
  65. 如請求項63之多肽，其中該抗原結合域包含VHH。
  66. 如請求項64或65之多肽，其中該sdAb或VHH係來自駱駝科抗體或軟骨魚抗體。
  67. 如請求項66之多肽，其中該駱駝科抗體係來自單峰駝、駱駝、駱馬或羊駝。
  68. 如請求項66之多肽，其中該軟骨魚抗體為鯊魚抗體。
  69. 如前述請求項中任一項之多肽，其中各個別抗原結合域結合於不同抗原決定基。
  70. 如前述請求項中任一項之多肽，其中各個別抗原結合域結合於不同抗原。
  71. 如前述請求項中任一項之多肽，其中各個別抗原結合域結合於不同蛋白質。
  72. 如前述請求項中任一項之多肽，其中該多肽包含一或多個結合於以下各者之抗原結合域：CD36、DRD1、DRD2、DRD3、DRD4、DRD5、PD- L1、TROP2、CD147、MCT1、IL1RAP、AMIGO2、PTK7、MCT2、MCT4、NHE1、H+/K+-ATP酶、LAP、HLA-I A2、CD73、CD98、CEACAM5/6、ICAM-1、MCSP、纖維結合蛋白、β1整合素、四跨膜蛋白8 (Tetraspanin 8)、CD164、CD59、CD63、CD44、CD166、cWF、TNF、IL-17A、IL17-F、IL-6R、BCMA、TNF、RANKL、ADAMTS5、VEGF、Ang2、CX3 CR1、CXCR4、TfR1 (CD71)、CXCR2、CD3、PD1、PDL-1、CTLA-4、CD8、LAG-3、OX40、CD27、CD122/IL2RB、TLR8/CD288、TIM-3、ICOS/CD278、NKG2A、A2AR、B7-H3、GITR/TNFRSF18、4-IBB/CD137、KIR2DL1、KIR3DL2、SIRPα、CD47、VISTA、CD40、CD112、CD96、TOGOT、BTLA、TIGIT、LAG-3、CD4、VEGFR2、CD19、IGFR1、EpCAM、EGFR、DLL3、CGRP、CD79b、CD28、CCR5、ErbB3、ErbB2、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβRl、TGFpR2、IDO1、IDO2、TLR-4、TLR-7、TLR-8、TLR-9、SARS-CoV-1刺突蛋白、SARS-CoV-2刺突蛋白或其組合。
  73. 如前述請求項中任一項之多肽，其中該多肽包含至少一個結合於由腫瘤表現之蛋白質的抗原結合域、至少一個結合且募集免疫細胞之抗原結合域。
  74. 如前述請求項中任一項之多肽，其中該多肽包含至少一個結合於由腫瘤表現之蛋白質的抗原結合域、至少一個結合於免疫檢查點蛋白之抗原結合域及至少一個結合且募集免疫細胞之抗原結合域。
  75. 如請求項73或74之多肽，其中該免疫細胞為T細胞。
  76. 如前述請求項中任一項之多肽，其中該多肽包含結合於受體之抗原結合域。
  77. 如請求項76之多肽，其中該受體為G蛋白偶合受體。
  78. 如請求項77之多肽，其中該G蛋白偶合受體為多巴胺受體。
  79. 如請求項78之多肽，其中該多巴胺受體為多巴胺受體D1 (DRD1)、多巴胺受體D2 (DRD2)、多巴胺受體D3 (DRD3)、多巴胺受體D4 (DRD4)或多巴胺受體D5 (DRD5)。
  80. 如前述請求項中任一項之多肽，其中該多肽包含結合於腫瘤抗原之抗原結合域及結合於免疫調節劑之抗原結合域。
  81. 如請求項80之多肽，其中該結合於腫瘤抗原之抗原結合域係在該二聚域之N端，且該結合於免疫調節劑之抗原結合域係在該二聚域之C端。
  82. 如請求項80或81之多肽，其中該免疫調節劑為免疫檢查點蛋白、細胞介素、趨化介素或免疫受體或輔助受體。
  83. 如前述請求項中任一項之多肽，其中該多肽包含一或多個在該二聚域之N端的抗原結合域，其結合於CD36、DRD1、DRD2、DRD3、DRD4、DRD5、PD-L1、TROP2、CD147、MCT1、IL1RAP、AMIGO2、PTK7、MCT2、MCT4、NHE1、H+/K+-ATP酶、LAP、HLA-I A2、CD73、CD98、CEACAM5/6、ICAM-1、MCSP、纖維結合蛋白、β1整合素、四跨膜蛋白8、CD164、CD59、CD63、CD44、CD166、cWF、TNF、IL-17A、IL17-F、IL-6R、BCMA、TNF、RANKL、ADAMTS5、VEGF、Ang2、CX3CR1、CXCR4、TfR1 (CD71)、CXCR2或其組合。
  84. 如請求項83之多肽，其中該多肽包含一或多個在該二聚域之N端的抗原結合域，其結合於CD36、DRD1、DRD2、PD-L1或TROP2。
  85. 如前述請求項中任一項之多肽，其中該多肽包含一或多個在該二聚域之C端的抗原結合域，其結合於CD3、PD1、PDL-1、CTLA-4、CD8、LAG-3、OX40、CD27、CD122/IL2RB、TLR8/CD288、TIM-3、ICOS/CD278、NKG2A、A2AR、B7-H3、GITR/TNFRSF18、4-IBB/CD137、KIR2DL1、KIR3DL2、SIRPα、CD47、VISTA、CD40、CD112、CD96、TOGOT、BTLA、TIGIT、LAG-3、CD4或其組合。
  86. 如請求項85之多肽，其中該多肽包含一或多個在該二聚域之C端的抗原結合域，其結合於CD3、PD1、CTLA-4、CD8、LAG-3、OX40、CD27、CD122/IL2RB、TLR8/CD288、Tim3、ICOS/CD278、NKG2A、A2AR、B7-H3、GITR/TNFRSF18、4-IBB/CD137、KIR2DL1、KIR3DL2、SIRPα、CD47、VISTA、CD40、CD112、CD96、TOGOT、BTLA或CD4。
  87. 如請求項86之多肽，其中該一或多個在該二聚域之C端的抗原結合域分別結合於CD3及PD1。
  88. 如前述請求項中任一項之多肽，其中一或多個抗原結合域經人類化。
  89. 如前述請求項中任一項之多肽，其中X或Y係獨立地選自由以下組成之群：連接子、細胞介素、趨化介素、標籤、掩蔽域、噬菌體鞘蛋白(pIII、pVI、pV、pVII或pIX)、抗原結合域或其組合。
  90. 如前述請求項中任一項之多肽，其中該多肽係與治療部分、可偵測部分或允許延長半衰期之蛋白質結合或係連接於奈米粒子。
  91. 一種醫藥組合物，其包含如前述請求項中任一項之多肽及醫藥學上可接受之載劑。
  92. 一種核酸，其編碼如前述請求項中任一項之多肽。
  93. 一種載體，其包含如請求項92之核酸。
  94. 一種細胞，其表現如請求項1至90中任一項之多肽。
  95. 一種細胞，其包含如請求項92之核酸或如請求項93之載體。
  96. 一種套組，其包含如請求項1至90中任一項之多肽。
  97. 一種套組，其包含如請求項92之核酸，或如請求項93之載體，或如請求項94或95之細胞。
  98. 一種蛋白質複合物，其包含如前述請求項中任一項之第一多肽及如前述請求項中任一項之第二多肽，其中該第一及第二多肽相同或不同。
  99. 一種蛋白質複合物，其包含 第一多肽，其包含一或多個抗原結合域及第一二聚域(DD1 )，該第一二聚域包含有包含一或多個根據EU編號在對應於D399、D/E356及/或K370的位置處之突變的CH3域； 及 第二多肽，其包含一或多個抗原結合域及第二二聚域(DD2 )，該第二二聚域包含有包含一或多個根據EU編號在對應於D399、E357及/或K439的位置處之突變的CH3域， 其中該第一及第二多肽形成二聚體。
  100. 如請求項99之蛋白質複合物，其中該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q及K370E的CH3域，且其中該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q及K439E的CH3域。
  101. 如請求項99或100之蛋白質複合物，其中該第一二聚域(DD1 )及/或第二二聚域(DD2 )包含進一步包含CH3域，該CH3域根據EU編號在對應於Y349、T350、L351、P352及/或S354的位置處之突變。
  102. 如請求項101之蛋白質複合物，其中該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399Q、D/E356Q、K370E、Y349K及S354K的CH3域，且其中該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399Q、E357Q、K439E、Y349D及S354D的CH3域。
  103. 如請求項101之蛋白質複合物，其中該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及L351W的CH3域，且其中該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及L351R的CH3域。
  104. 如請求項101之蛋白質複合物，其中該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及S354M的CH3域，且其中該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及L351Y的CH3域。
  105. 如請求項101之蛋白質複合物，其中該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及T350I的CH3域，且其中該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及T350I的CH3域。
  106. 如請求項101之蛋白質複合物，其中該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及T350V的CH3域，且其中該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及T350V的CH3域。
  107. 如請求項101之蛋白質複合物，其中該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352R的CH3域，且其中該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及L351R的CH3域。
  108. 如請求項101之蛋白質複合物，其中該第一二聚域(DD1 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、D/E356Q、K370E及P352E的CH3域，且其中該第二二聚域(DD2 )包含有包含根據EU編號之突變D399N、E357Q、K439E及L351R的CH3域。
  109. 如請求項98至108中任一項之蛋白質複合物，其中該第一及第二多肽各獨立地以N端至C端之方式包含式I之胺基酸序列： X-[(Aba )-(Lb )]m -(DD)-[(Lc )-(Abd )]n -Y 其中m為0、1或大於1之整數； 其中n為0、1或大於1之整數，其限制條件為m及n不同時為0； 其中Aba 、Abd 各獨立地包含有包含抗體之一或多個互補決定區(CDR)的抗原結合域； 其中X或Y獨立地存在或不存在且包含胺基酸序列； 其中Lb 、Lc 各獨立地包含一或多個連接子；且 其中DD為該第一多肽中之該第一二聚域(DD1 )及該第二多肽中之該第二二聚域(DD2 )。
  110. 如請求項109之蛋白質複合物，其中Lc 為剛性連接子。
  111. 如請求項98至110中任一項之蛋白質複合物，其中該第一及第二多肽各獨立地為如請求項1至83中任一項之多肽。
  112. 如請求項98至111中任一項之蛋白質複合物，其中該第一及第二多肽各獨立地為具有式III之多肽。
  113. 如請求項98至111中任一項之蛋白質複合物，其中該第一多肽具有式II且該第二多肽具有式III。
  114. 如請求項98至113中任一項之蛋白質複合物，其中該蛋白質複合物為多特異性的。
  115. 如請求項114之蛋白質複合物，其中該蛋白質複合物為雙特異性、三特異性或四特異性的。
  116. 如請求項115之蛋白質複合物，其中該第一及第二多肽具有相同價數及特異性。
  117. 如請求項115之蛋白質複合物，其中該第一及第二多肽具有不同價數及特異性。
  118. 如請求項115之蛋白質複合物，其中該蛋白質複合物為雙特異性抗體。
  119. 如請求項118之蛋白質複合物，其中該第一及第二多肽各為抗體重鏈。
  120. 如請求項119之蛋白質複合物，其中該雙特異性抗體進一步包含第一抗體輕鏈及第二抗體輕鏈。
  121. 一種組合物，其包含如請求項98至120中任一項之蛋白質複合物。
  122. 如請求項121之組合物，其中該組合物包含單體、二聚體及其混合物。
  123. 如請求項121之組合物，其中該第一及第二多肽超過70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%係以二聚體之形式存在。
  124. 如請求項121之組合物，其中該第一及第二多肽超過70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%係以同二聚體之形式存在。
  125. 如請求項121之組合物，其中該第一及第二多肽超過70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%係以異二聚體之形式存在。
  126. 一種治療病症或疾病之方法，其包含投與如請求項1至90中任一項之多肽或如請求項98至120中任一項之蛋白質複合物或如請求項121至125中任一項之組合物。
  127. 如請求項126之方法，其中該病症或疾病為癌症。
  128. 如請求項126之方法，其中該病症或疾病為感染。
  129. 如請求項126之方法，其中該病症或疾病為免疫失調。
  130. 一種製造如請求項98至120中任一項之蛋白質複合物的方法，該方法包含用一或多種包含如請求項92之核酸的載體轉化細胞。
  131. 一種套組，其在同一個或分開的小瓶中包含一或多個編碼人類抗體之二聚域之核酸、一或多個編碼抗原結合域之核酸及視情況存在之一或多個編碼連接子之核酸。
  132. 如請求項131之套組，其中各核酸為載體。
  133. 如請求項131之套組，其中各核酸為DNA區段，其包含允許在獨特位置組裝至用於編碼多肽鏈之DNA構築體中的獨特突出端。
  134. 一種套組，其包含一或多個編碼二聚域之核酸，該二聚域包含具有根據EU編號之位置D/E356、E357、K370、D399及/或K439處之胺基酸取代的人類IgG1之突變CH3域。
  135. 如請求項134之套組，其在同一個或分開之小瓶中包含： a.     編碼二聚域之DNA區段，該二聚域包含具有根據EU編號之位置D/E356、K370及D399處之胺基酸取代的人類IgG1之突變CH3域； b.     編碼二聚域之DNA區段，該二聚域包含具有位置E357、D399及K439處之胺基酸取代的人類IgG1之突變CH3域； c.     一或多個編碼一或多個抗原結合域之DNA區段；及/或 d.     視情況存在之一或多個編碼一或多個連接子之DNA區段； 其中各核酸為DNA區段，其包含允許在獨特位置組裝至用於編碼多肽鏈之DNA構築體中的獨特突出端。
  136. 如請求項134或135之套組，其中該二聚域進一步包含一或多個根據EU編號在對應於Y349、T350、L351、P352及/或S354之位置處的突變。
  137. 如請求項134至136中任一項之套組，其中該套組係用於組裝編碼式Ia、式Ib或式Ic之多肽鏈的DNA構築體。
  138. 如請求項134至136中任一項之套組，其中該套組係用於組裝編碼式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之多肽鏈的DNA構築體。
  139. 一種製備編碼如請求項1至88中任一項之多肽之核酸的方法，該方法包含共價組裝一或多個編碼人類抗體之二聚域的DNA區段及一或多個編碼抗原結合域之DNA區段以及視情況存在之一或多個編碼連接子之DNA區段，其中各DNA區段包含允許在獨特位置處組裝至用於編碼多肽鏈之DNA構築體中的獨特突出端。
  140. 如請求項139之方法，其中至少一個DNA區段編碼天然抗體之二聚域。
  141. 如請求項139之方法，其中至少一個DNA區段編碼包含CH3域之突變二聚域，該CH3域包含有利於異二聚體形成之胺基酸取代。
  142. 如請求項141之方法，其中根據EU編號，該等胺基酸取代包含位置D/E356、K370及D399處之胺基酸取代或位置E357、D399及K439處之胺基酸取代。
  143. 如請求項141或142之方法，其中該二聚域進一步包含一或多個根據EU編號在對應於Y349、T350、L351、P352及/或S354之位置處的突變。
  144. 如請求項139至143中任一項之方法，其中該核酸包含至少兩個編碼抗原結合域之DNA區段。
  145. 如請求項139至143中任一項之方法，其中該核酸包含至少三個編碼抗原結合域之DNA區段。
  146. 如請求項139至143中任一項之方法，其中該核酸包含至少四個編碼抗原結合域之DNA區段。
  147. 如請求項139至146中任一項之方法，其中該核酸包含至少一個在編碼二聚域之DNA區段之5'端及3'端中之每一者處編碼抗原結合域的DNA區段。
  148. 如請求項139至147中任一項之方法，其中該方法係用於組裝編碼式Ia、式Ib或式Ic之多肽鏈的核酸。
  149. 如請求項139至146中任一項之方法，其中該方法係用於組裝編碼式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII或式VIII之多肽鏈的核酸。
  150. 一種製造如請求項1至90中任一項之多肽或如請求項98至120中任一項之蛋白質複合物的方法，該方法包含用藉由包含以下之方法製得之核酸轉化細胞：共價組裝一或多個編碼人類抗體之二聚域的DNA區段及一或多個編碼抗原結合域之DNA區段以及視情況存在之一或多個編碼連接子之DNA區段，其中各DNA區段包含允許在獨特位置處組裝至用於編碼多肽鏈之DNA構築體中的獨特突出端。
  151. 如請求項150之方法，其中該DNA區段中之一或多者編碼二聚域，該二聚域包含a) 具有根據EU編號之位置D/E356、K370及D399處之胺基酸取代的人類IgG1之突變CH3域，或b) 具有位置E357、D399及K439處之胺基酸取代的人類IgG1之突變CH3域。
  152. 如請求項151之方法，其中一個DNA區段編碼包含具有根據EU編號之位置D/E356、K370及D399處之胺基酸取代的人類IgG1之突變CH3域的二聚域，且另一DNA區段編碼具有位置E357、D399及K439處之胺基酸取代的人類IgG1之突變CH3域。
  153. 如請求項151或152之方法，其中該二聚域進一步包含一或多個根據EU編號在對應於Y349、T350、L351、P352及/或S354之位置處的突變。
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