TW202132329A - Ｓｉｇｌｅｃ－９ ｅｃｄ融合分子及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本揭露大體上係關於Siglec-9 ECD及Siglec-9 ECD融合分子以及使用該等Siglec-9 ECD及Siglec-9 ECD融合分子進行治療之方法。

Description

SIGLEC-9　ECD融合分子及其使用方法
本揭露係關於Siglec-9 ECD融合分子及此類融合蛋白之治療用途。
唾液酸結合Ig樣凝集素-9 (Siglec-9)為1型免疫球蛋白樣跨膜蛋白，其在免疫及造血細胞上表現，包括未成熟及成熟髓樣細胞諸如單核球、巨噬細胞、樹突細胞、嗜中性球及微膠細胞以及淋巴樣細胞諸如自然殺手細胞及T細胞子集合(Crocker等人 (2007) Nat Rev Immunol. 7:255–266；O’Reilly及Paulson (2009) Trends in Pharm. Sci. 30:5:240-248；以及Macauley等人 (2014) Nat. Rev. Imm. 14: 653-666)。Siglec-9為結合醣蛋白及醣脂質之唾液酸殘基的凝集素之Siglec家族之成員。Siglec蛋白之潛在配體為神經節苷脂，其為包含與唾液酸化聚醣連接之神經醯胺的醣脂質。Siglec配體之多樣性係藉由在支鏈或末端之不同鍵聯中添加其他中性糖及唾液酸並修飾唾液酸本身所生成的。
在人類中已鑑定出了14種Siglec蛋白，且在小鼠中已鑑定出了9種Siglec蛋白，其包含2-17個細胞外Ig域，包括含有唾液酸結合位點的胺基末端 V-set Ig樣(IgV)域。IgV域在所有Siglec中高度保守的模體中均含有2個芳香族殘基及1個精胺酸(Crocker等人 (2007) Nat Rev Immunol. 7:255–266；McMillan及Crocker (2008) Carbohydr Res. 343:2050-2056；Von Gunten及Bochner (2008) Ann NY Acad Sci. 1143:61-82；May等人 (1998) Mol Cell. 1:719-728；Crocker等人 (1999) Biochem J. 341:355-361；以及Crocker及Varki (2001) Trends Immunol. 2:337-342)。配體結合位點已藉由具有及不具有結合配體之晶體結構來作圖(Attrill等人, (2006) J. Biol. Chem.281 32774-32783；Alphey等人 (2003) J. Biol. Chem. 278:5 3372-3377；Varki等人, Glycobiology, 16 第1R-27R頁；以及May等人 (1998) Mol. Cell 1:5:719-728)。因為細胞膜富含唾液酸，所以藉由Siglec之配體結合可以順式及反式之形式發生，從而影響其功能性質。各Siglec對於結合哺乳動物細胞表面上存在之不同類型的經唾液酸化之聚醣具有不同偏好(Crocker等人 (2007) Nat Rev Immunol. 7:255-266；以及Crocker等人 (2007) Nat Rev Immunol. 7:255-266)。
大多數Siglec蛋白，包括Siglec-9，為在其細胞質域中含有一或多個基於免疫受體酪胺酸之抑制模體(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif；ITIM)序列的抑制受體。抑制Siglec充當免疫功能之負調控子(Crocker等人 (2007) Nat Rev Immunol. 7:255-266；McMillan及Crocker (2008) Carbohydr Res. 343:2050-2056；以及Von Gunten及Bochner (2008) Ann NY Acad Sci. 1143:61-82)。其他Siglec為在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸活化模體(immunoreceptor tyrosine-based activating motif；ITAM)序列的活化受體。那些Siglec充當免疫功能之正調控子(Macauley SM.等人, (2014)Nature Reviews Immunology 14, 653-666)。
Siglec蛋白家族在腫瘤發病機制中起作用。許多人類腫瘤穩健上調結合Siglec-9之唾液酸，從而可能實現免疫逃脫及癌症進展(Jandus等人 (2014) J. Clinic. Invest. 124:1810-1820)。相比之下，缺少唾液酸生物合成之腫瘤在小鼠中生長減少(Stanczak等人 (2018) J Clin Invest.128:4912-4923)。Siglec-3、Siglec-7、Siglec-9中之某些SNP與結腸直腸癌及肺癌之風險降低有關(同上)。
本文中所引用之所有參考文獻，包括專利申請案及公開案，皆以引用之方式整體併入本文中。
本揭露大體上係關於Siglec-9細胞外域(ECD)融合蛋白及使用Siglec-9 ECD融合蛋白治療癌症及神經退化性疾病之方法。
在一些實施例中，一種經分離之多肽，其包含有包含選自SEQ ID NO: 109-137及214-226中任一者之胺基酸序列之Siglec-9 IgV域。在一些實施例中，該多肽包含有包含Siglec-9 IgV域、C2 1型(C2T1)域及C2 2型(C2T2)域之Siglec-9細胞外域(ECD)。在一些實施例中，該多肽包含選自SEQ ID NO: 79-107及194-206中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，該Siglec-9 IgV域多肽不包含Siglec-9之膜近側區，如SEQ ID NO: 147 (MPR)中所示。
在一些實施例中，該多肽進一步包含Fc域。在一些此類實施例中，該Fc域定位於該多肽之C末端。在一些實施例中，該Fc域具有IgG1同型。在一些實施例中，該Fc域包含選自SEQ ID NO: 142-144及234-239之胺基酸序列。在一些實施例中，該Fc域包含胺基酸序列SEQ ID NO: 142或143。在一些實施例中，該Fc域包含胺基酸序列SEQ ID NO: 142。在一些實施例中，經分離之多肽包含具有人類IgG1同型之Fc域，相對於IgG1多肽SEQ ID No: 142，其：(a)與FcγRIII之結合減少；(b)抗體依賴性細胞毒性(ADCC)降低及/或補體結合活性降低；(c)與FcγRIIa之結合增加；或a)、b)及/或c)之任何組合。在一些實施例中，該Fc域包含胺基酸序列SEQ ID NO: 143。在一些實施例中，該Fc域具有IgG4同型。在一些實施例中，該Fc域包含選自SEQ ID NO: 145-146之胺基酸序列。
在一些實施例中，該多肽包含選自SEQ ID NO: 11-39、148-160及168-170中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，該多肽包含選自SEQ ID NO: 49-77、171-183及191-193中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，該多肽包含選自SEQ ID NO: 49-77及171-193中任一者之胺基酸序列，缺少其訊息肽。
在一些實施例中，提供了一種包含Siglec-9 IgV域之經分離之多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 138。在一些實施例中，提供了一種包含Siglec-9 IgV域之經分離之多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 138，進一步包含視情況定位於該多肽之C末端的Fc域。視情況，該Fc域具有人類IgG1同型。在一些情況下，該多肽進一步包含連接子序列。在一些實施例中，該Fc域包含選自SEQ ID NO: 142-144之胺基酸序列。在一些實施例中，該Fc域包含胺基酸序列SEQ ID NO: 142或143。在一些實施例中，該多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO: 139。在一些實施例中，該Fc域具有IgG4同型。在一些實施例中，該Fc域包含選自SEQ ID NO: 145-146之胺基酸序列。
在一些實施例中，提供了一種包含Siglec-9 IgV域之經分離之多肽，其包含C末端連接至Fc域的胺基酸序列SEQ ID NO: 78。在一些實施例中，該多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:10。在一些實施例中，該多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:227。在一些實施例中，該Fc域具有IgG1同型。在一些實施例中，該Fc域包含選自SEQ ID NO: 142-144及234-239之胺基酸序列。在一些實施例中，該Fc域包含胺基酸序列SEQ ID NO: 142或143。在一些實施例中，該Fc域包含胺基酸序列SEQ ID NO: 142。在一些實施例中，經分離之多肽包含具有人類IgG1同型之Fc域，相對於IgG1多肽SEQ ID No: 142，其：(a)與FcγRIII之結合減少；(b)抗體依賴性細胞毒性(ADCC)降低及/或補體結合活性降低；(c)與FcγRIIa之結合增加；或a)、b)及/或c)之任何組合。在一些實施例中，該Fc域包含胺基酸序列SEQ ID NO: 143。在一些實施例中，該Fc域具有IgG4同型。在一些實施例中，該Fc域包含選自SEQ ID NO: 145-146之胺基酸序列。在一些實施例中，提供了一種包含Siglec-9 IgV域之經分離之多肽，其包含選自SEQ ID NO: 45-48及228-233中任一者之胺基酸序列，缺少其相關訊息肽。在一些實施例中，該多肽包含選自SEQ ID NO: 45-48及228-233中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，該多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO: 45，缺少其相關訊息肽。在一些實施例中，該多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO: 45。在一些實施例中，該多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO: 48，缺少其相關訊息肽。
在一些實施例中，提供了一種包含Siglec-9 IgV域之經分離之多肽，其包含SEQ ID No: 207-213中任一者之胺基酸序列以及定位於該多肽之C末端之Fc域。在一些實施例中，該Fc域具有IgG1同型。在一些實施例中，該Fc域包含選自SEQ ID NO: 142-144及234-239之胺基酸序列。在一些實施例中，該Fc域包含胺基酸序列SEQ ID NO: 142或143。在一些實施例中，該Fc域包含胺基酸序列SEQ ID NO: 142。在一些實施例中，經分離之多肽包含具有人類IgG1同型之Fc域，相對於IgG1多肽SEQ ID No: 142，其：(a)與FcγRIII之結合減少；(b)抗體依賴性細胞毒性(ADCC)降低及/或補體結合活性降低；(c)與FcγRIIa之結合增加；或a)、b)及/或c)之任何組合。在一些實施例中，該Fc域包含胺基酸序列SEQ ID NO: 143。在一些實施例中，該Fc域具有IgG4同型。在一些實施例中，該Fc域包含選自SEQ ID NO: 145-146之胺基酸序列。在一些實施例中，該多肽包含選自SEQ ID No: 161-167中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，該多肽包含選自SEQ ID No: 184-190中任一者之胺基酸序列，缺少訊息肽。在一些實施例中，該多肽包含選自SEQ ID No: 184-190中任一者之胺基酸序列。
在本文所提供之包含Siglec-9 IgV域之經分離之多肽之任一實施例中，該多肽可結合細胞表面上之唾液酸。在一些實施例中，細胞為腫瘤細胞。在一些實施例中，細胞表現FcR，例如FcRγIIA。在一些實施例中，細胞為髓樣細胞。在一些實施例中，該等髓樣細胞選自單核球、巨噬細胞、樹突細胞、微膠細胞及骨髓源性抑制細胞(MDSC)。
在本文所提供之包含Siglec-9 IgV域之經分離之多肽之任一實施例中，該多肽： a)          阻斷選自Siglec-3、Siglec-5、Siglec-7、Siglec-9、Siglec-10及Siglec-15之任何一或多個Siglec家族成員之結合； b)         減輕MDSC介導之T細胞抑制，視情況如藉由量測IFNγ表現之增加或T細胞增殖之增加所確定； c)          將MDSC再極化為促發炎表現型； d)         增加MDSC上CD86之表現，增加MDSC上CD11b之表現及/或減少MDSC上CD163之表現； e)          將腫瘤巨噬細胞再極化成遠離M2表現型； f)          減少CD163+及/或CD206+巨噬細胞； g)         誘導MDSC中選自CCL3、CCL4、CCL5、CCL17、CXCL1、CXCL9及IL-8之一或多種趨化介素之表現； h)         減少髓樣細胞向腫瘤微環境中之募集； i)          以小於100 nM、小於50 nM、小於25 nM、小於20 nM、小於10 nM、小於5 nM、小於2 nM、1-50 nM、1-25 nM、1-20 nM、1-10 nM、1-5 nM或1-2 nM之親和力與MDSC結合；或 j)          (a)至(i)中之任何一或多者。
在一些此類實施例中，MDSC為人類MDSC，及/或巨噬細胞為人類巨噬細胞。
在一些實施例中，提供了一種經分離之核酸，其包含編碼本文所提供之包含Siglec-9 IgV域之經分離之多肽的核酸序列。在一些實施例中，經分離之核酸編碼選自SEQ ID NO: 48-77、171-193及228-233中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，經分離之核酸編碼包含選自SEQ ID NO: 10-39、148-170及227中任一者之胺基酸序列的多肽。在一些實施例中，提供了一種表現載體，其包含經分離之核酸。
在一些實施例中，提供了一種宿主細胞，其包含本文所提供之經分離之核酸或表現載體。在一些實施例中，提供了一種宿主細胞，其表現本文所提供之包含Siglec-9 IgV域之經分離之多肽。在一些實施例中，提供了一種產生多肽之方法，其包含培養宿主細胞。在一些此類實施例中，該多肽經分離。
在各種實施例中，提供了一種醫藥組成物，其包含本文所提供之包含Siglec-9 IgV域之經分離之多肽及醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，該醫藥組成物可包含：(i)具有訊息肽之如本文所述之多肽；或(ii)缺少訊息肽之多肽；及醫藥學上可接受之載劑。
在一些實施例中，提供了一種治療癌症之方法，其包含向患有癌症之個體投與本文所提供之包含Siglec-9 IgV域之經分離之多肽或包含該多肽之醫藥組成物。在一些實施例中，癌症為與包含髓樣細胞之腫瘤微環境有關之實性瘤。在一些實施例中，癌症選自腎細胞上皮癌、肉瘤、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、結腸直腸癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、頭頸癌、乳癌及子宮癌。在一些實施例中，該方法進一步包含投與PD-1或PD-L1之拮抗劑，視情況其中該PD-1或PD-L1之拮抗劑分別為與PD-1或PD-L1結合之抗體。在一些實施例中，該方法進一步包含投與化學治療劑。
在一些實施例中，提供了一種治療神經性或神經退化性疾病之方法，其包含向患有神經性或神經退化性疾病之個體投與本文所提供之包含Siglec-9 IgV域之經分離之多肽或包含該多肽之醫藥組成物。在一些實施例中，神經性或神經退化性疾病之特徵在於微膠細胞功能不良或缺失。在一些實施例中，神經性或神經退化性疾病選自失智症、額顳葉失智症、阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)、血管型失智症、及輕度認知障礙、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、亨汀頓氏病(Huntington’s disease)、tau蛋白病(Taupathy disease)、多發性硬化症、免疫介導之神經病變(諸如神經病變痛)、那須-哈科拉病(Nasu-Hakola disease)、小兒發作腦白質病及成人發作腦白質病伴軸突小球及色素性神經膠(adult-onset leukoencephalopathy with axonal spheroids and pigmented glia；ALSP)。
在一些實施例中，提供了一種在個體中將骨髓源性抑制細胞(MDSC)再極化成促發炎表現型之方法，其包含向患有神經性或神經退化性疾病之個體投與本文所提供之包含Siglec-9 IgV域之經分離之多肽或包含該多肽之醫藥組成物。在一些此類實施例中，個體患有癌症。在一些實施例中，癌症為與包含髓樣細胞之腫瘤微環境有關之實性瘤。在一些實施例中，癌症選自腎細胞上皮癌、肉瘤、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、結腸直腸癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、頭頸癌、乳癌及子宮癌。在一些情況下，癌症為轉移性的。在一些實施例中，個體患有神經性或神經退化性疾病。在一些實施例中，神經性或神經退化性疾病之特徵在於微膠細胞功能不良或缺失。在一些實施例中，神經退化性疾病選自失智症、額顳葉失智症、阿茲海默氏病、血管型失智症、及輕度認知障礙、帕金森氏病、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、亨汀頓氏病、tau蛋白病、多發性硬化症、免疫介導之神經病變(諸如神經病變痛)、那須-哈科拉病、小兒發作腦白質病及成人發作腦白質病伴軸突小球及色素性神經膠(ALSP)。
在一些實施例中，提供了一種在個體中將腫瘤巨噬細胞再極化成遠離M2表現型的方法，該方法向該個體投與包含本文所提供之包含Siglec-9 IgV域之經分離之多肽或包含該多肽之醫藥組成物。在一些實施例中，癌症為與包含髓樣細胞之腫瘤微環境有關之實性瘤。在一些實施例中，癌症選自腎細胞上皮癌、肉瘤、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、結腸直腸癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、頭頸癌、乳癌及子宮癌。在一些情況下，癌症為轉移性的。
在一些實施例中，提供了一種在個體中活化髓樣細胞的方法，該方法向該個體投與包含本文所提供之包含Siglec-9 IgV域之經分離之多肽或包含該多肽之醫藥組成物。在一些情況下，髓樣細胞為微膠細胞。在一些實施例中，個體患有癌症。在一些實施例中，癌症為與包含髓樣細胞之腫瘤微環境有關之實性瘤。在一些實施例中，癌症選自腎細胞上皮癌、肉瘤、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、結腸直腸癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、頭頸癌、乳癌及子宮癌。在一些情況下，癌症為轉移性的。在一些實施例中，個體患有神經性或神經退化性疾病。在一些實施例中，神經性或神經退化性疾病之特徵在於微膠細胞功能不良或缺失。在一些實施例中，神經退化性疾病選自失智症、額顳葉失智症、阿茲海默氏病、血管型失智症、及輕度認知障礙、帕金森氏病、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、亨汀頓氏病、tau蛋白病、多發性硬化症、免疫介導之神經病變(諸如神經病變痛)、那須-哈科拉病、小兒發作腦白質病及成人發作腦白質病伴軸突小球及色素性神經膠(ALSP)。
本文提供了包含Siglec-9之細胞外域及融合搭配物(例如Fc域)之多肽。與針對Siglec-9或其他Siglec蛋白之抗體相比，Siglec-9 ECD-Fc融合分子意外地顯示出與髓樣細胞之協同結合，導致這些先天免疫細胞之有效活化。此類活化可用於例如治療癌症、神經退化性病症及免疫系統可能以其他方式受不適當抑制的其他疾病及病症。本文進一步提供了包含(且具體而言在IgV域中包含) Siglec-9細胞外域之變異體之多肽，其經工程改造以改良穩定性、溶解性、配體結合及/或其他性質。此類變異體可用於融合分子，以便如本文所述活化免疫反應。本文進一步描述了其他發明及實施例。 定義
術語「Siglec-9細胞外域」及「Siglec-9 ECD」係指Siglec-9之細胞外域多肽或其結合細胞表面上之唾液酸的片段。該術語包括其天然及經工程改造之變異體。在一些實施例中，Siglec-9 ECD包含Siglec-9之IgV域。在一些實施例中，Siglec-9 ECD包含Siglec-9之IgV域以及C2 1型(C2T1)域與C2 2型(C2T2)域。非限制示範性Siglec-9 ECD顯示於SEQ ID NO: 78-138。
術語「Siglec-9 ECD融合分子」係指包含Siglec-9 ECD及共價連接之融合搭配物(諸如Fc域、白蛋白或聚乙二醇(PEG))之分子。在一些實施例中，融合搭配物連接至Siglec-9 ECD之C末端。融合搭配物為Fc域的Siglec-9 ECD融合分子在本文中亦可稱為「Siglec-9 ECD-Fc融合分子」、「Siglec-9 ECD-Fc」或「Siglec-9-Fc」。非限制示範性Siglec-9 ECD-Fc融合分子顯示於胺基酸序列SEQ ID NO: 10-77及139，包括那些具有或不具有其相關訊息肽之序列。
術語「特異性結合(specific binding或specifically binds)」或「特異於」靶部分意謂可量測地不同於非特異性相互作用的結合。特異性結合可例如藉由相較於測試分子對於對照部分之結合而確定測試分子對於靶部分之結合來量測。若與對於對照部分之結合親和力相比，對於把部分之結合親和力強至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍，則測試分子特異性結合靶部分。為避免存疑，特異性結合不需要測試分子不結合任何其他部分。
例如本揭露之Siglec-9 ECD之指定位置處之「胺基酸修飾」係指指定殘基之取代或缺失，或者相鄰於指定殘基之至少一個胺基酸殘基之***。「相鄰於」指定殘基之***意謂在距其一至兩個殘基內的***。***可相對於指定殘基在N末端或C末端。本文中之較佳胺基酸修飾為取代。
術語「Fc區」在本文中用於意謂免疫球蛋白重鏈之C末端區，包括天然序列Fc區及變異體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈Fc區之邊界可能變化，但人類IgG重鏈Fc區通常定義為包括自位置Cys226處之胺基酸殘基或自Pro230至其羧基末端的多肽。可移除Fc區之C末端離胺酸(殘基447，根據EU編號系統)，例如，在含有Fc區之多肽之產生或純化期間進行，或藉由對編碼含有Fc區之多肽之核酸進行重組工程改造來進行。用於本揭露之合適的天然序列Fc區包括人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。
「天然序列Fc區」包含與自然界中所存在之Fc區之胺基酸序列相同的胺基酸序列。天然序列人類Fc區包括：天然序列人類IgG1 Fc區(非A及A異型)；天然序列人類IgG2 Fc區；天然序列人類IgG3 Fc區；及天然序列人類IgG4 Fc區以及其天然存在之變異體。
「變異體Fc區」包含由於至少一個胺基酸修飾、較佳一或多個胺基酸取代而與天然序列Fc區之胺基酸序列不同的胺基酸序列。較佳的是，變異體Fc區與天然序列Fc區相比在天然序列Fc區中具有至少一個胺基酸取代，例如，約1至約10個胺基酸取代，且較佳約1至約5個胺基酸取代。本文中之變異體Fc區較佳將與天然序列Fc區具有至少約80%同源性，且最佳與其具有至少約90%同源性，更佳與其具有至少約95%同源性。
「Fc受體」或「FcR」描述與Fc區結合之受體。較佳FcR為天然序列人類FcR。此外，較佳FcR為結合IgG Fc區之FcR (γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體，包括等位基因變異體及此等受體之交替剪接形式，FcγRII受體包括FcγRIIA (「活化受體」)及FcγRIIB (「抑制受體」)，其具有主要在其胞質域中不同的類似胺基酸序列。活化受體FcγRIIA在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化模體(「ITAM」)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制模體(「ITIM」)。本文中之術語「FcR」涵蓋其他FcR。FcR亦可增加包含Fc區的分子之血清半衰期。
可以在例如表現人類FcR之基因轉殖小鼠或經轉染之人類細胞株中或者在經投與具有變異體Fc區之多肽之靈長類動物中檢定體內FcR之結合以及人類FcR高親和力結合多肽之血清半衰期。WO 2004/42072 (Presta)描述了與FcR之結合改良或減少的Fc區變異體。亦參見例如Shields等人, J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)。
如本文中所使用，相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」及「同源性」係指在比對序列且在必要時引入空位以達成最大序列一致性百分比並不將任何保守取代視為序列一致性之一部分之後，查詢序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基相同的胺基酸殘基之百分比。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的而進行之比對可以熟習此項技術者能力範圍內的多種方式，例如使用公開可利用之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM (DNASTAR)軟體來達成。熟習此項技術者可確定適用於量測比對之參數，包括此項技術中已知的在所比較之序列的全長上達成最大程度之比對所需的任何演算法。
編碼多肽(諸如本揭露之包含Siglec-9 ECD之多肽)之「經分離之」核酸分子為自在其產生環境中一般與其締合之至少一種污染分子鑑定並分離之核酸分子。較佳的是，經分離之核酸不與產生環境相關之大部分或實質上所有組分締合。編碼本文中之多肽之經分離之核酸分子與細胞中天然存在之核酸分子不同。
如本文中所用之術語「載體」意欲指能夠運輸與之連接之核酸的核酸分子。一種類型的載體為「質體」，其係指可將額外DNA區段連接至其中的環狀雙股DNA。另一類型的載體為噬菌體載體。另一類型的載體為病毒載體，其中可將額外DNA區段連接至病毒基因體中。某些載體能夠在引入其之宿主細胞(例如，具有細菌複製起點之細菌載體及附加型哺乳動物載體)中自主複製。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)可在引入至宿主細胞中時整合至宿主細胞之基因體中，從而連同宿主基因體一起經複製。此外，某些載體能夠指導與其可操作地連接之基因的表現。此類載體在本文中稱為「重組表現載體」或簡稱為「表現載體」。一般而言，在重組DNA技術中具有實用性之表現載體通常呈質體形式。在本說明書中，「質體」及「載體」可互換使用，因為質體為最常用之載體形式。
如本文中可互換使用之「多肽」或「核酸」係指任何長度之核苷酸聚合物且包括DNA及RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或其類似物、或者可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應併入聚合物中之任何受質。
「宿主細胞」包括以下個別細胞或細胞培養物，其可含有或含有一或多種載體或併入一或多種多核苷酸***物的其他外源性核酸。在一些實施例中，將載體或其他外源性核酸併入宿主細胞之基因體中。宿主細胞包括單宿主細胞之子代，且該子代由於天然、偶然或人為突變而未必與原始母細胞完全相同(在形態方面或在基因體DNA補體方面)。宿主細胞包括包含本發明之一或多種多核苷酸(例如用其轉染)的細胞。
如本文中所用之「載劑」包括在所採用之劑量及濃度下對暴露於其之細胞或哺乳動物無毒的醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。生理學上可接受之載劑通常為pH緩沖水溶液。生理學上可接受之載劑之實例包括：緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他醣，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螫合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露醇或山梨醇；成鹽相對離子，諸如鈉；及/或非離子界面活性劑，諸如TWEEN™、聚乙二醇(PEG)及PLURONICS™。
如本文中所用，術語「預防」包括相對於個體中特定疾病、病症或疾患之發生或複發而提供預防。個體可能易患、易感特定疾病、病症或疾患，或者處於發展此種疾病、病症或疾患之風險，但尚未診斷出患有該疾病、病症或疾患。
如本文中所用，處於發展特定疾病、病症或疾患之「風險」的個體可能患有或可能不患有可偵測之疾病或疾病症狀，且在本文中所述之治療方法之前可能展示或可能未展示可偵測之疾病或疾病症狀。如此項技術中已知，「處於風險」表示個體具有一或多種風險因素，其為與發展特定疾病、病症或疾患相關之可量測參數。具有此等風險因素中之一或多者之個體發展特定疾病、病症或疾患的機率高於不具有此等風險因素中之一或多者之個體。
如本文中所用，術語「治療(treat/treatment/treating)」及其類似者係指經設計以在正治療之個體中改變臨床病理學之自然病程的臨床幹預。合意的治療效果包括針對特定疾病、病症或疾患：降低進展速率；改善或減輕病理狀態、好轉或預後改良；及/或緩解或減少症狀。例如，若與特定疾病、病症或疾患有關之一或多種症狀得以緩解或消除，則個體經成功「治療」。在某些實施例中，若患者顯示出以下中之一或多者，則根據本發明方法成功「治療」了患者之癌症：癌細胞數減少或完全不存在；腫瘤大小減小；癌細胞向周邊器官中之浸潤(包括例如癌症向軟組織及骨中之蔓延)之抑制或不存在；腫瘤轉移之抑制或不存在；腫瘤生長之抑制或不存在；與具體癌症有關之一或多種症狀之減輕；發病率及死亡率減小；生活品質改良；腫瘤之致腫瘤性、致腫瘤頻率或致腫瘤能力減小；腫瘤中癌症幹細胞之數目或頻率減小；致腫瘤細胞向非致腫瘤狀態分化；無進展存活率(PFS)、無疾病存活率(DFS)、總體存活率(OS)、完全反應(CR)、部分反應(PR)或穩定疾病(SD)增加；進行性疾病(PD)減少；進展時間(TTP)減少；或其任何組合。
術語「投與(administer/administering/administration)」及其類似者係指可用於實現治療劑諸如Siglec-9 ECD融合分子(例如，Siglec-9 ECD-Fc融合分子)之遞送的方法。可與本文所述之劑及方法一起採用之投與方法見於例如Goodman及Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, current edition, Pergamon；以及Remington’s, Pharmaceutical Sciences, current edition, Mack Publishing Co., Easton, Pa。
「有效量」係指在必需之劑量及時間段下對達成所要治療或預防結果有效的最少量。有效量可在一或多次投與中提供。本文中之有效量可根據諸如個體之疾病狀態、年齡、性別及體重以及治療在個體中引發所要反應之能力之因素而變化。有效量亦為治療有益作用勝過治療之任何毒性或不利效應的量。對於預防性用途，有益或所要結果包括以下結果，諸如消除或降低疾病(包括疾病之生物化學、組織學及/或行為學症狀、其並發症及疾病發展過程中呈現之中間病理學表現型)之風險、減輕其嚴重程度或延遲其發作。對於治療性用途，有益或所要結果包括以下臨床結果，諸如減輕由疾病引起之一或多種症狀、增加罹患疾病者之生活品質、降低治療疾病所需之其他藥劑之劑量、增強另一藥劑之效果(諸如經由靶向)、延遲疾病之進展及/或延長存活等。藥物、化合物或醫藥組成物之有效量為足以直接或間接地實現預防性或治療性治療的量。如在臨床情形下應理解，藥物、化合物或醫藥組成物之有效量可或可不聯合另一藥物、化合物或醫藥組成物來達成。因此，在投與一或多種治療劑之情形下可考慮「有效量」，且若聯合一或多種其他劑一起可達成或達成合意的結果，則可考慮給予有效量之單一劑。
出於治療、預防或降低風險之目的，「個體(individual/subject)」或「患者」係指歸類為哺乳動物之任何動物，包括人類、家畜及農場動物，以及動物園動物、競技動物或寵物，諸如狗、馬、兔、牛、豬、倉鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、貓及其類似動物。在一些實施例中，個體為人類。
術語「癌症」及「癌性」係指或描述細胞群之特徵在於細胞生長不受調控的哺乳動物中之生理狀況。癌症可為原發性腫瘤或可為晚期或轉移性癌症。「頑抗性」癌症為即使已向癌症患者投與了抗腫瘤治療仍進展的癌症。「復發性」癌症或已「復發」的癌症為在對初始治療產生反應之後在初始部位或遠側部位處再生長的癌症。「再發」患者係指好轉之後具有癌症體徵或症狀的患者。視情況，患者在輔助或新輔助療法之後再發。
如本文中所用，將劑或組成物與另一劑或組成物「聯合」或「組合」投與包括同時投與及/或在不同時間投與。聯合投與亦涵蓋呈共調配物形式投與或呈單獨組成物形式投與，包括以不同給藥頻率或間隔及使用相同的投與途徑或不同的投與途徑。在一些實施例中，聯合投與意謂呈同一治療方案之一部分的投與。在一些實施例中，將劑與另一劑組合投與導致「協同作用」或「協同效果」，亦即，一起使用各劑時所達成之效果大於單獨使用各劑所產生之效果之總和。在一些實施例中，將劑與另一劑組合投與導致「相加」效果，亦即，一起使用各劑時所達成之效果等於單獨使用各劑所產生之效果之總和。
如本文中所用之術語「約」係指此技術領域中之技術人員容易獲知之相應值之通常誤差範圍。本文中提及「約」某一值或參數包括(且描述)針對該值或參數本身之實施例。
如本文中及所附申請專利範圍中所用，除非上下文另外清楚指示，否則單數形式「一」及「該」包括複數個指示物。
應理解，本文中所述之本揭露之態樣及實施例包括「包含」態樣及實施例、「由其組成」及「基本上由其組成」。 包含 Siglec-9 細胞外域之多肽
在一些實施例中，根據本文任一實施例之Siglec-9 ECD或Siglec-9 ECD融合分子可單獨或以組合形式如本文所述併入任一特徵。
本文中提供了包含Siglec-9 IgV域之多肽。在某些實施例中，Siglec-9 IgV域包含人類Siglec-9 SEQ ID NO: 1之胺基酸20-140。參見圖2。如本文中之實例2中所示，Siglec-9之IgV域足以結合細胞表面上之唾液酸。在一些實施例中，本文提供了包含有包含IgV域、C2 1型(C2T1)域及C2 2型(C2T2)域之Siglec-9細胞外域(ECD)之多肽。Siglec-9 C2T1域包含人類Siglec-9 SEQ ID NO: 1之胺基酸146-229，且Siglec-9 C2T2域包含人類Siglec-9 SEQ ID NO: 1之胺基酸236-336。在一些實施例中，Siglec-9 ECD包含SEQ ID NO: 1之胺基酸20-336，視情況具有一或多個胺基酸修飾。在一些實施例中，Siglec-9 ECD包含SEQ ID NO: 1之胺基酸20-336，視情況具有一或多個胺基酸修飾，且視情況在N末端及/或C末端具有1至5個胺基酸缺失或添加。在一些實施例中，Siglec-9 ECD可包含IgV、C2T1及C2T2域，但可缺少例如ECD之至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個或12個C末端(膜近側)胺基酸。ECD之12個C端(膜近側)胺基酸顯示於SEQ ID NO: 147。實例為SEQ ID NO: 78，例如，其包含IgV、C2T1及C2T2域且其缺少C末端膜近側區。
在一些實施例中，多肽包含有包含一或多個胺基酸修飾之Siglec-9 IgV域，該一或多個胺基酸修飾改良多肽之穩定性，改良針對唾液酸之結合親和力，改良多肽之功能，改良多肽之藥物動力學性質(例如，半衰期、Cmax或AUC)或前述任一組合。在一些實施例中，多肽包含具有選自SEQ ID NO: 108-137及214-226中任一者之胺基酸序列的Siglec-9 IgV域。在一些實施例中，多肽包含具有選自SEQ ID NO: 109-137及214-226中任一者之胺基酸序列的Siglec-9 IgV域。在一些實施例中，多肽包含具有選自SEQ ID NO: 108-137及214-226中任一者之胺基酸序列的Siglec-9 IgV域，視情況在N末端及/或C末端具有1至5個胺基酸缺失或添加。在一些實施例中，多肽包含具有選自SEQ ID NO: 109-137及214-226中任一者之胺基酸序列的Siglec-9 IgV域，視情況在N末端及/或C末端具有1至5個胺基酸缺失或添加。在一些實施例中，多肽包含在IgV域之C末端具有一或多個取代之Siglec-9 ECD。例如，在一些實施例中，多肽包含SEQ ID No: 207-213中任一者之Siglec-9 ECD。以下序列表描繪了對應於本文所列出之SEQ ID No的序列。在許多情況下，胺基酸取代之定位顯示於表中，諸如藉由將經突變之殘基以下劃線表示或藉由將經突變之殘基以粗體及下劃線表示來顯示。
在一些實施例中，多肽包含有包含一或多個胺基酸修飾之Siglec-9 ECD，該一或多個胺基酸修飾改良多肽之穩定性，改良針對唾液酸之結合親和力，改良多肽之功能，改良多肽之藥物動力學性質或前述任一組合。在一些實施例中，多肽包含具有選自SEQ ID NO: 78-107、138及194-206中任一者之胺基酸序列之Siglec-9 ECD。在一些實施例中，多肽包含具有選自SEQ ID NO: 78-107、138、194-206中任一者之胺基酸序列的Siglec-9 ECD，視情況在N末端及/或C末端具有1至5個胺基酸缺失或添加。
在本文所提供之任何實施例中，多肽可進一步包含融合搭配物。非限制示範性融合搭配物包括Fc域、白蛋白及聚乙二醇(PEG)。在一些實施例中，融合搭配物共價連接至Siglec-9 ECD之C末端。在一些態樣中，融合搭配物包含Fc域。在一些實施例中，本文中提供了包含Siglec-9 ECD及Fc域之多肽，其中Fc域視情況在具有或不具有介入連接子序列之情況下與Siglec-9 ECD C末端融合。如本文中所用之「連接子序列」係指天然Siglec-9 ECD或其融合搭配物(例如，Fc域)中不存在之多肽序列，其中此類多肽序列設置於Siglec-9 ECD與其融合搭配物之間。在一些實施例中，連接子序列可為約4與25之間個胺基酸。在一些實施例中，Fc域與不具有連接子序列之C末端融合。在各種實施例中，多肽包含Siglec-9 ECD及IgG1 Fc域，例如SEQ ID NO: 142之IgG1 Fc域。在一些實施例中，包含Siglec-9 ECD之多肽包含有包含NSLF取代之IgG1 Fc域，例如SEQ ID NO: 143。在一些實施例中，包含Siglec-9 ECD之多肽包含有包含K322A取代之IgG1 Fc域，例如SEQ ID NO: 144。在一些實施例中，包含Siglec-9 ECD之多肽包含IgG4 Fc域或包含S228P取代之IgG4 Fc域，例如，分別如SEQ ID NO: 145或146中所示。
在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子包含選自SEQ ID NO: 10-39、148-160及168-170中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子包含選自SEQ ID NO: 40-77、171-183及191-193中任一者之胺基酸序列，視情況缺少訊息序列。
在一些實施例中，Siglec-9 ECD或Siglec-9 ECD融合分子之Siglec-9 ECD IgV域包含選自SEQ ID No: 109-137及214-226中任一者之胺基酸序列。在一些情況下，Siglec-9 ECD包含IgV、C2T1及C2T2域。在一些實施例中，Siglec-9 ECD缺少膜近側區序列SEQ ID NO: 147 (MPR)。在一些實施例中，Siglec-9 ECD包含IgV、C2T1及C2T2域且缺少MPR。在一些實施例中，Siglec-9 ECD包含選自SEQ ID No: 79-107及194-206中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，Siglec-9 ECD包含選自SEQ ID No: 79-107及194-206中任一者之胺基酸序列且缺少MPR SEQ ID NO: 147。在一些實施例中，Siglec-9 ECD由選自SEQ ID No: 79-107及194-206中任一者之胺基酸序列組成。在一些態樣中，Siglec-9 ECD為Siglec-9 ECD融合分子之一部分，其包含ECD及融合搭配物。在一些實施例中，融合搭配物為Fc、白蛋白或PEG。在一些實施例中，融合搭配物為Fc。在一些實施例中，融合搭配物為Fc且定位於分子之C末端(亦即，Fc直接或經由連接子連接至Siglec-9 ECD之C末端)。在一些實施例中，Fc為人類IgG1 (hIgG1)。在一些實施例中，Fc包含SEQ ID No: 142-144及234-239中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，Fc包含胺基酸序列SEQ ID No: 142。在一些實施例中，Fc域具有hIgG1同型，相對於IgG1多肽SEQ ID No: 142，其：a)與FcγRIII之結合減少；b)抗體依賴性細胞毒性(ATCC)降低及/或補體結合活性降低；c)與FcγRIIa之結合增加；或a)、b)及/或c)之任何組合。在一些情況下，Fc域包含具有N325S及L328F (NSLF)取代之人類IgG1同型。在一些實施例中，Fc包含胺基酸序列SEQ ID No: 143。在一些實施例中，Fc為具有或不具有S228P取代之人類IgG4。因此，在一些實施例中，Fc包含胺基酸序列SEQ ID NO: 145或146。
在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子包含選自SEQ ID No: 49-77及171-193中任一者之胺基酸序列，缺少訊息序列。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子包含選自SEQ ID No: 49-77及171-193中任一者之胺基酸序列，包括訊息序列。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子由選自SEQ ID No: 49-77及171-193中任一者之胺基酸序列組成，缺少訊息序列。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子由選自SEQ ID No: 49-77及171-193中任一者之胺基酸序列組成，包括訊息序列。
在一些實施例中，Siglec-9 ECD或Siglec-9 ECD融合分子包含胺基酸序列SEQ ID No: 138。在一些實施例中，Siglec-9 ECD缺少膜近側區(MPR)序列SEQ ID NO: 147。在一些情況下，Siglec-9 ECD由胺基酸序列SEQ ID NO: 138組成。在一些情況下，Siglec-9 ECD包含胺基酸序列SEQ ID NO: 138或由其組成，缺少訊息肽，但其中Siglec-9 ECD自編碼SEQ ID NO: 138之核酸表現，包括訊息序列。在一些情況下，Siglec-9 ECD為包含ECD及融合搭配物之Siglec-9 ECD融合分子。在一些此類實施例中，融合搭配物可為Fc、白蛋白或PEG。在一些實施例中，融合搭配物為Fc。在一些實施例中，融合搭配物為Fc且定位於分子之C末端(亦即，Fc直接或經由連接子連接至Siglec-9 ECD之C末端)。在一些實施例中，Fc為人類IgG1 (hIgG1)。在一些實施例中，Fc包含SEQ ID No: 142-144及234-239中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，Fc包含胺基酸序列SEQ ID NO: 142。在一些實施例中，Fc域具有hIgG1同型，相對於IgG1多肽SEQ ID No: 142，其：a)與FcγRIII之結合減少；b)抗體依賴性細胞毒性(ATCC)降低及/或補體結合活性降低；c)與FcγRIIa之結合增加；或a)、b)及/或c)之任何組合。在一些情況下，Fc域包含具有N325S及L328F (NSLF)取代之人類IgG1同型。在一些實施例中，Fc包含胺基酸序列SEQ ID NO: 143。在一些實施例中，Fc為具有或不具有S228P取代之人類IgG4。因此，在一些實施例中，Fc包含胺基酸序列SEQ ID NO: 145或146。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子包含胺基酸序列SEQ ID NO: 139。
在一些實施例中，Siglec-9 ECD或Siglec-9 ECD融合分子包含序列SEQ ID NO: 78。在一些實施例中，Siglec-9 ECD缺少膜近側區序列SEQ ID NO: 147 (MPR)。在一些情況下，Siglec-9 ECD由胺基酸序列SEQ ID NO: 78組成。在一些情況下，Siglec-9 ECD為包含ECD及融合搭配物之Siglec-9 ECD融合分子。在一些此類實施例中，融合搭配物可為Fc、白蛋白或PEG。在一些實施例中，融合搭配物為Fc。在一些實施例中，融合搭配物為Fc且定位於分子之C末端(亦即，Fc直接或經由連接子連接至Siglec-9 ECD之C末端)。在一些實施例中，Fc為人類IgG1 (hIgG1)。在一些實施例中，Fc包含SEQ ID No: 142-144及234-239中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，Fc包含胺基酸序列SEQ ID NO: 142。在一些實施例中，Fc域具有hIgG1同型，相對於IgG1多肽SEQ ID No: 142，其：a)與FcγRIII之結合減少；b)抗體依賴性細胞毒性(ATCC)降低及/或補體結合活性降低；c)與FcγRIIa之結合增加；或a)、b)及/或c)之任何組合。在一些情況下，Fc域包含具有N325S及L328F (NSLF)取代之人類IgG1同型。在一些實施例中，Fc包含胺基酸序列SEQ ID NO: 143。在一些實施例中，Fc為具有或不具有S228P取代之人類IgG4。因此，在一些實施例中，Fc包含胺基酸序列SEQ ID NO: 145或146。
在一些情況下，Siglec-9 ECD融合分子包含C末端視情況經由連接子或直接連接於Fc域或另一融合搭配物(諸如白蛋白或PEG)的Siglec-9 ECD SEQ ID NO: 78。在一些實施例中，SEQ ID NO: 78之C末端直接連接至Fc域。在一些實施例中，SEQ ID NO: 78之C末端經由連接子連接至Fc域。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子包含C末端連接至人類IgG1或IgG4同型Fc域(諸如包含SEQ ID No: 142-144及234-239中任一者之Fc)之序列SEQ ID NO: 78。在一些實施例中，Fc包含胺基酸序列SEQ ID NO: 142。在一些實施例中，Fc域具有hIgG1同型，相對於IgG1多肽SEQ ID No: 142，其：a)與FcγRIII之結合減少；b)抗體依賴性細胞毒性(ATCC)降低及/或補體結合活性降低；c)與FcγRIIa之結合增加；或a)、b)及/或c)之任何組合。在一些情況下，Fc域包含具有N325S及L328F (NSLF)取代之人類IgG1同型。在一些實施例中，Fc域包含SEQ ID NO: 143。在一些實施例中，Fc為具有或不具有S228P取代之人類IgG4。在一些實施例中，Fc域包含SEQ ID NO: 145。在一些實施例中，Fc域包含SEQ ID NO: 146。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子包含胺基酸序列SEQ ID NO: 10。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子由胺基酸序列SEQ ID NO: 10組成。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子包含胺基酸序列SEQ ID NO: 227。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子由胺基酸序列SEQ ID NO: 227組成。
在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子包含C末端連接於Fc域之胺基酸序列SEQ ID NO: 78，其中該分子包含選自SEQ ID No: 45-48及228-233中任一者之胺基酸序列，缺少其相關訊息肽。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子包含C末端連接於Fc域之胺基酸序列SEQ ID NO: 78，其中該分子包含選自SEQ ID No: 45-48及228-233中任一者之胺基酸序列，包括其相關訊息肽。在一些實施例中，該分子包含胺基酸序列SEQ ID NO: 45。在一些實施例中，該分子由胺基酸序列SEQ ID NO: 45組成。在一些實施例中，該分子包含胺基酸序列SEQ ID NO: 48。在一些實施例中，該分子由胺基酸序列SEQ ID NO: 48組成。在一些實施例中，該分子包含胺基酸序列SEQ ID NO: 228。在一些實施例中，該分子由胺基酸序列SEQ ID NO: 228組成。在一些實施例中，該分子包含胺基酸序列SEQ ID NO: 229。在一些實施例中，該分子由胺基酸序列SEQ ID NO: 229組成。在一些實施例中，該分子包含胺基酸序列SEQ ID NO: 230。在一些實施例中，該分子由胺基酸序列SEQ ID NO: 230組成。在一些實施例中，該分子包含胺基酸序列SEQ ID NO: 231。在一些實施例中，該分子由胺基酸序列SEQ ID NO: 231組成。在一些實施例中，該分子包含胺基酸序列SEQ ID NO: 232。在一些實施例中，該分子由胺基酸序列SEQ ID NO: 232組成。在一些實施例中，該分子包含胺基酸序列SEQ ID NO: 233。在一些實施例中，該分子由胺基酸序列SEQ ID NO: 233組成。
在一些實施例中，Siglec-9 ECD包含序列SEQ ID NO: 218。在一些實施例中，Siglec-9 ECD包含序列SEQ ID NO: 198。在一些實施例中，Siglec-9 ECD包含序列SEQ ID NO: 218或198，且缺少膜近側區(MPR)序列SEQ ID NO: 147。在一些情況下，Siglec-9 ECD由胺基酸序列SEQ ID NO: 198組成。在一些情況下，Siglec-9 ECD為包含ECD及融合搭配物之Siglec-9 ECD融合分子。在一些此類實施例中，融合搭配物可為Fc、白蛋白或PEG。在一些實施例中，融合搭配物為Fc。在一些實施例中，融合搭配物為Fc且定位於分子之C末端(亦即，Fc直接或經由連接子連接至Siglec-9 ECD之C末端)。在一些實施例中，Fc為人類IgG1 (hIgG1)。在一些實施例中，Fc包含SEQ ID No: 142-144及234-239中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，Fc包含胺基酸序列SEQ ID NO: 142。在一些實施例中，Fc域具有hIgG1同型，相對於IgG1多肽SEQ ID No: 142，其：a)與FcγRIII之結合減少；b)抗體依賴性細胞毒性(ATCC)降低及/或補體結合活性降低；c)與FcγRIIa之結合增加；或a)、b)及/或c)之任何組合。在一些情況下，Fc域包含具有N325S及L328F (NSLF)取代之人類IgG1同型。在一些實施例中，Fc包含胺基酸序列SEQ ID NO: 143。在一些實施例中，Fc為具有或不具有S228P取代之人類IgG4。因此，在一些實施例中，Fc包含胺基酸序列SEQ ID NO: 145或146。在一些實施例中，Siglec-9 ECD或Siglec-9 ECD融合分子包含訊息序列。在其他實施例中，其不包含訊息序列。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子包含胺基酸序列SEQ ID NO: 152。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子由胺基酸序列SEQ ID NO: 152組成。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子包含胺基酸序列SEQ ID NO: 168。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子由胺基酸序列SEQ ID NO: 168組成。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子包含胺基酸序列SEQ ID NO: 175。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子由胺基酸序列SEQ ID NO: 175組成。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子包含胺基酸序列SEQ ID NO: 191。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子由胺基酸序列SEQ ID NO: 191組成。
在一些實施例中，Siglec-9 ECD包含序列SEQ ID NO: 219。在一些實施例中，Siglec-9 ECD包含序列SEQ ID NO: 199。在一些實施例中，Siglec-9 ECD包含序列SEQ ID NO: 219或199，且缺少膜近側區(MPR)序列SEQ ID NO: 147。在一些情況下，Siglec-9 ECD由胺基酸序列SEQ ID NO: 199組成。在一些情況下，Siglec-9 ECD為包含ECD及融合搭配物之Siglec-9 ECD融合分子。在一些此類實施例中，融合搭配物可為Fc、白蛋白或PEG。在一些實施例中，融合搭配物為Fc。在一些實施例中，融合搭配物為Fc且定位於分子之C末端(亦即，Fc直接或經由連接子連接至Siglec-9 ECD之C末端)。在一些實施例中，Fc為人類IgG1 (hIgG1)。在一些實施例中，Fc包含SEQ ID No: 142-144及234-239中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，Fc包含胺基酸序列SEQ ID NO: 142。在一些實施例中，Fc域具有hIgG1同型，相對於IgG1多肽SEQ ID No: 142，其：a)與FcγRIII之結合減少；b)抗體依賴性細胞毒性(ATCC)降低及/或補體結合活性降低；c)與FcγRIIa之結合增加；或a)、b)及/或c)之任何組合。在一些情況下，Fc域包含具有N325S及L328F (NSLF)取代之人類IgG1同型。在一些實施例中，Fc包含胺基酸序列SEQ ID NO: 143。在一些實施例中，Fc為具有或不具有S228P取代之人類IgG4。因此，在一些實施例中，Fc包含胺基酸序列SEQ ID NO: 145或146。在一些實施例中，Siglec-9 ECD或Siglec-9 ECD融合分子包含訊息序列。在其他實施例中，其不包含訊息序列。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子包含胺基酸序列SEQ ID NO: 153。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子由胺基酸序列SEQ ID NO: 153組成。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子包含胺基酸序列SEQ ID NO: 169。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子由胺基酸序列SEQ ID NO: 169組成。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子包含胺基酸序列SEQ ID NO: 176。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子由胺基酸序列SEQ ID NO: 176組成。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子包含胺基酸序列SEQ ID NO: 192。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子由胺基酸序列SEQ ID NO: 192組成。
在一些實施例中，Siglec-9 ECD包含序列SEQ ID NO: 220。在一些實施例中，Siglec-9 ECD包含序列SEQ ID NO: 200。在一些實施例中，Siglec-9 ECD包含序列SEQ ID NO: 220或200，且缺少膜近側區(MPR)序列SEQ ID NO: 147。在一些情況下，Siglec-9 ECD由胺基酸序列SEQ ID NO: 200組成。在一些情況下，Siglec-9 ECD為包含ECD及融合搭配物之Siglec-9 ECD融合分子。在一些此類實施例中，融合搭配物可為Fc、白蛋白或PEG。在一些實施例中，融合搭配物為Fc。在一些實施例中，融合搭配物為Fc且定位於分子之C末端(亦即，Fc直接或經由連接子連接至Siglec-9 ECD之C末端)。在一些實施例中，Fc為人類IgG1 (hIgG1)。在一些實施例中，Fc包含SEQ ID No: 142-144及234-239中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，Fc包含胺基酸序列SEQ ID NO: 142。在一些實施例中，Fc域具有hIgG1同型，相對於IgG1多肽SEQ ID No: 142，其：a)與FcγRIII之結合減少；b)抗體依賴性細胞毒性(ATCC)降低及/或補體結合活性降低；c)與FcγRIIa之結合增加；或a)、b)及/或c)之任何組合。在一些情況下，Fc域包含具有N325S及L328F (NSLF)取代之人類IgG1同型。在一些實施例中，Fc包含胺基酸序列SEQ ID NO: 143。在一些實施例中，Fc為具有或不具有S228P取代之人類IgG4。因此，在一些實施例中，Fc包含胺基酸序列SEQ ID NO: 145或146。在一些實施例中，Siglec-9 ECD或Siglec-9 ECD融合分子包含訊息序列。在其他實施例中，其不包含訊息序列。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子包含胺基酸序列SEQ ID NO: 154。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子由胺基酸序列SEQ ID NO: 154組成。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子包含胺基酸序列SEQ ID NO: 170。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子由胺基酸序列SEQ ID NO: 170組成。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子包含胺基酸序列SEQ ID NO: 177。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子由胺基酸序列SEQ ID NO: 177組成。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子包含胺基酸序列SEQ ID NO: 193。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子由胺基酸序列SEQ ID NO: 193組成。
在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子包含C末端連接於Fc域之SEQ ID No: 207-213中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，連接係直接的。在其他情況下，其係通過連接子的。在一些實施例中，Fc為人類IgG1 (hIgG1)。在一些實施例中，Fc包含SEQ ID No: 142-144及234-239中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，Fc包含胺基酸序列SEQ ID NO: 142。在一些實施例中，Fc域具有hIgG1同型，相對於IgG1多肽SEQ ID No: 142，其：a)與FcγRIII之結合減少；b)抗體依賴性細胞毒性(ATCC)降低及/或補體結合活性降低；c)與FcγRIIa之結合增加；或a)、b)及/或c)之任何組合。在一些情況下，Fc域包含具有N325S及L328F (NSLF)取代之人類IgG1同型。在一些實施例中，Fc包含胺基酸序列SEQ ID NO: 143。在一些實施例中，Fc為具有或不具有S228P取代之人類IgG4。因此，在一些實施例中，Fc包含胺基酸序列SEQ ID NO: 145或146。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子包含選自SEQ ID No: 161-167中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子包含選自SEQ ID No: 184-190中任一者之胺基酸序列，缺少其相關訊息肽。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子包含選自SEQ ID No: 184-190中任一者之胺基酸序列，包括其相關訊息肽。 示範性 Fc 域
在本文所提供之Siglec-9 ECD融合分子中任一者之一些實施例中，融合分子可包含Fc域。在一些實施例中，Fc域為人類IgG1、IgG2、IgG3及/或 IgG4同型。
在本文所提供之Siglec-9 ECD融合分子中任一者之某些實施例中，Fc域具有IgG1同型。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子含有鼠IgG1 Fc域。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子含有人類IgG1 Fc域(hIgG1)，例如，如SEQ ID NO: 142中所提供。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子之人類IgG1 Fc域結合活化Fc受體。在某些實施例中，活化Fc受體選自FcγRI、FcγRIIa與IIc及FcγRIIIa與IIIb中之任何一或多者。
在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子之人類IgG1 Fc域不與FcγRIII (CD16)及/或C1q結合或與其結合降低。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子之人類IgG1 Fc域之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或補體結合活性降低，分別地，其在各情況下可減少Siglec-9 ECD融合分子所結合之細胞(例如，髓樣細胞)之非所要毒殺。上文效果可藉由某些胺基酸修飾(例如，「NSLF」突變)達成，在該等胺基酸修飾中IgG1 Fc域含有突變N325S及L328F (藉由IgG1 Fc域之EU編號)，如例如SEQ ID NO: 143中所示。在另一實施例中，人類IgG1 Fc域包含對應於K322A (EU編號)之突變，例如，如SEQ ID NO: 144中所提供。
對IgG1 Fc域之示範性修飾列出於以下表A中。表 A ：對 IgG1 Fc 域之示範性修飾
突變(EU 編號方案)
N325S及L328F (「NSLF」)
S267E及L328F (「SELF」)
P331S (「PS」)
P331S及E430G (「PSEG」)
K322A
L234A、L235A及P331S (「LALAPS」) (實質上取消了Fc與FcR之結合)
例如，在一些實施例中，Fc域具有人類IgG1同型，相對於IgG1多肽SEQ ID No: 142，其：a)與FcγRIII之結合減少；b)抗體依賴性細胞毒性(ATCC)降低及/或補體結合活性降低；c)與FcγRIIa之結合增加；或a)、b)及/或c)之任何組合。在一些情況下，Fc域包含SEQ ID NO: 143。在一些情況下，Fc域包含具有N325S及L328F (NSLF)取代之人類IgG1同型。
在一些實施例中，亦可在Siglec-9-hIgG1 NSLF (參見例如SEQ ID NO:45)之Fc區中進行取代及變異，例如以改良其在體外與FcRn之結合，且因此潛在地改良其在體內回收的能力。示範性取代及變異包括「YTE」及「LS」取代以及含有半胱胺酸之環圈***，如Dall’Acqua等人 (2002)J. Immunol. 169:5171-5180；Zalevsky等人 (2010)Nat. Biotechnol. 28:157-159；以及美國專利第9,688,756號中所述，其等均以引用之方式整體併入本文。在一些實施例中，Fc域可具有如SEQ ID No: 228-230中所示之序列(取代及變異藉由本文序列表中以雙下劃線表示之殘基指示)。可針對例如經由表面電漿子共振而在體外與FcRn之結合改善對經修飾之構築體進行測試，然後檢查其體內藥物動力學(PK)及藥效學(PD)。經修飾之Fc構築體亦可在Fc中含有「YTE」或「LS」取代或含有半胱胺酸之環圈***，但不含有NSLF取代。此類構築體顯示於SEQ ID No: 231-233。
在本文中所提供之任一Siglec-9 ECD融合分子之某些實施例中，Fc域具有IgG2同型。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子含有鼠IgG2 Fc域，例如鼠IgG2a (mIgG2a)。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子含有人類IgG2 Fc域(hIgG2)。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子之人類IgG2 Fc域結合活化Fc受體。在某些實施例中，活化Fc受體選自FcγRI、FcγRIIa與IIc及FcγRIIIa與IIIb中之任何一或多者。
在本文中所提供之任一Siglec-9 ECD融合分子之某些實施例中，Fc域具有IgG4同型。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子含有人類IgG1 Fc域(hIgG4)，例如，如SEQ ID NO: 145中所提供。在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子之人類IgG4 Fc區結合活化Fc受體。在某些實施例中，活化Fc受體選自FcγRI、FcγRIIa與IIc及FcγRIIIa與IIIb中之任何一或多者。在某些實施例中，人類IgG4 Fc區包含對應於S228P (藉由EU編號)之突變，例如，如SEQ ID NO: 146中所提供。 多肽變異體
在本文中所提供任一多肽之一些實施例中，涵蓋胺基酸序列變異體。例如，可能期望改良多肽之結合親和力及/或其他生物性質。 取代、***及缺失變異體
在本文中所提供之任一多肽之一些實施例中，提供了具有一或多個胺基酸取代之多肽變異體。多肽之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入至編碼多肽之核苷酸序列或藉由肽合成來製備。此類修飾包括例如多肽胺基酸序列內殘基之缺失、及/或***、及/或取代。表 B ： 胺基酸取代
原始殘基 示範性取代 較佳取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 Leu
藉由選擇在對維持以下之影響方面不同的取代來實現對多肽之生物性質之修改：(a)取代區域中之多肽主鏈結構，例如呈褶板狀或螺旋狀構型；(b)靶位點處之分子電荷或疏水性；或(c)側鏈堆積(bulk of the side chain)。基於常見側鏈性質將天然存在之殘基分成各群： (1) 疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3) 酸性：Asp、Glu； (4) 鹼性：His、Lys、Arg； (5) 影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；以及 (6) 芳族：Trp、Tyr、Phe。
例如，非保守性取代可涉及以此等類別之一的成員交換另一類別之成員。此類經取代之殘基可引入至例如與非人類多肽同源之人類多肽之區中或分子之非同源區中。
根據某些實施例，在對本文中所述之多肽進行改變時，可考慮胺基酸之親水性指數。已基於各胺基酸之疏水性及電荷特徵而為其分配親水性指數。其為：異白胺酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；白胺酸(+3.8)；***酸(+2.8)；半胱胺酸/胱胺酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(-0.4)；蘇胺酸(-0.7)；絲胺酸(-0.8)；色胺酸(-0.9)；酪胺酸(-1.3)；脯胺酸(-1.6)；組胺酸(-3.2)；麩胺酸(-3.5)；麩醯胺(-3.5)；天冬胺酸(-3.5)；天冬醯胺(-3.5)；離胺酸(-3.9)；及精胺酸(-4.5)。
此項技術中應理解親水性胺基酸指數在賦予蛋白相互作用生物功能中之重要性。Kyte等人J. Mol. Biol ., 157:105-131 (1982)。已知某些胺基酸可取代為具有類似親水性指數或評分之其他胺基酸且仍保留類似生物活性。在基於親水性指數進行改變時，在某些實施例中，包括親水性指數在±2內之胺基酸的取代。在某些實施例中，包括在±1內之彼等取代，且在某些實施例中，包括在±0.5內之彼等取代。
此項技術中亦應理解，可基於親水性有效地進行類似胺基酸之取代，尤其在由此產生之生物學功能蛋白或肽意欲用於免疫學實施例中時，如在本發明之情況下。在某些實施例中，蛋白之最大局部平均親水性(如藉由其相鄰胺基酸之親水性所決定)與其免疫原性及抗原性，亦即，與蛋白之生物性質相關。
以下親水性值已分配至此等胺基酸殘基：精胺酸(+3.0)；離胺酸(+3.0±1)；天冬胺酸(+3.0±1)；麩胺酸(+3.0±1)；絲胺酸(+0.3)；天冬醯胺(+0.2)；麩醯胺(+0.2)；甘胺酸(0)；蘇胺酸(-0.4)；脯胺酸(-0.5±1)；丙胺酸(-0.5)；組胺酸(-0.5)；半胱胺酸(-1.0)；甲硫胺酸(-1.3)；纈胺酸(-1.5)；白胺酸(-1.8)；異白胺酸(-1.8)；酪胺酸(-2.3)；***酸(-2.5)及色胺酸(-3.4)。在基於類似之親水性值進行改變時，在某些實施例中，包括親水性值在±2內之胺基酸之取代，在某些實施例中，包括在±1內之彼等取代，且在某些實施例中，包括在±0.5內之彼等取代。
胺基酸序列***包括長度為一個殘基至包含一百個或更多個殘基之多肽的胺基及/或羧基末端融合物，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內***。
一般亦可用絲胺酸取代任何不參與維持多肽之適當構型的半胱胺酸殘基，以改良分子之氧化穩定性及防止異常交聯。相比之下，可將一或多個半胱胺酸鍵添加至多肽以改良其穩定性。 其他多肽修飾
在任一多肽之一些實施例中，多肽為衍生物。術語「衍生物」係指包括除胺基酸(或核酸)之***、缺失或取代以外的化學修飾的分子。在某些實施例中，衍生物包含共價修飾，包括但不限於與聚合物、脂質或其他有機或無機部分之化學鍵結。在某些實施例中，經化學修飾之多肽之循環半衰期可比未經化學修飾之多肽長。在某些實施例中，經化學修飾之多肽對於所要細胞、組織及/或器官可具有改良之靶向能力。在一些實施例中，衍生多肽經共價修飾以包括一或多個水溶性聚合物連接，包括但不限於聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇。參見例如美國專利第4640835號、第4496689號、第4301144號、第4670417號、第4791192號及第4179337號。在某些實施例中，衍生多肽包含一或多種聚合物，包括但不限於單甲氧基-聚乙二醇、葡聚醣、纖維素、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1, 3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或隨機共聚物)、聚-(N-乙烯基吡咯啶酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化之多元醇(例如， 甘油)及聚乙烯醇以及此類聚合物之混合物。
在某些實施例中，衍生物經聚乙二醇(PEG)次單元共價修飾。在某些實施例中，一或多種水溶性聚合物鍵合於衍生物之一或多個具體位置，例如胺基酸末端。在某些實施例中，一或多種水溶性聚合物隨機連接至衍生物之一或多條側鏈。在某些實施例中，使用PEG以改良多肽之治療能力。某些此類方法討論於例如美國專利第6133426號中，其出於任一目的以引用之方式併入本文。 核酸、載體及宿主細胞
本揭露之Siglec-9 ECD融合分子可使用重組方法及組成物產生。在一些實施例中，提供了具有編碼本揭露之Siglec-9 ECD融合分子中任一者之核苷酸序列的經分離之核酸。例如，本文中之核酸可編碼SEQ ID No: 10-39、78、138、148-170及227中任一者之多肽。本文中之核酸可編碼選自SEQ ID No: 45-77、171-193及228-233中任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，核酸編碼包括訊息序列之Siglec-9 ECD融合分子。在一些實施例中，信息序列為天然訊息序列。天然人類Siglec-9訊息序列顯示於SEQ ID NO: 140。在一些實施例中，訊息序列為非天然訊息序列。熟習此項技術者應理解，可使用適當影響經編碼之多肽之細胞內運輸、訊息序列之裂解及經編碼之多肽自細胞分泌的任一訊息序列。在一些此類實施例中，核酸編碼包含訊息序列之Siglec-9 ECD融合分子，該訊息序列相對於天然人類Siglec-9訊息序列改良了經編碼之多肽之細胞內運輸、訊息序列裂解及/或經編碼之多肽之分泌(效率及/或產量)。在一些此類實施例中，核酸編碼包含訊息序列之Siglec-9 ECD融合分子，其中訊息序列包含胺基酸序列SEQ ID NO: 141。在一些實施例中，訊息序列SEQ ID NO: 141改良Siglec-9 ECD融合分子之產生。
在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 10。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 45。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 48。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 138。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 139。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 227。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 228。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 229。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 230。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 231。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 232。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 233。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 48。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 198。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 199。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 200。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 218。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 219。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 220。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 152。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 153。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 154。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 168。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 169。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 170。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 175。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 176。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 177。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 191。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 192。在一些實施例中，本文中之一或多種核酸可編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 193。
在一些實施例中，提供了一或多種包含上文核酸中任一者之載體(例如，表現載體)。在一些實施例中，亦提供了包含此種核酸之宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞包含有包含編碼Siglec-9 ECD融合分子之核酸的載體(例如，已用其轉導)。在一些實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴樣細胞(例如，Y0、NS0、Sp20細胞)。本揭露之宿主細胞亦包括但不限於經分離之細胞、活體外培養之細胞及離體培養之細胞。
提供了製備本揭露之Siglec-9 ECD融合細胞之方法。在一些實施例中，該方法包括在合適於Siglec-9 ECD融合分子表現之條件下，培養本揭露之包含編碼Siglec-9 ECD融合分子之核酸的宿主細胞。在一些實施例中，隨後自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收Siglec-9 ECD融合分子。
為了重組產生本揭露之Siglec-9 ECD融合分子，將編碼Siglec-9 ECD融合分子之核酸分離出並***至一或多種載體中，以用於宿主細胞中之進一步選殖及/或表現。此類核酸可使用習知程序容易地分離及定序。
包含編碼本揭露之任一Siglec-9 ECD融合分子之核酸序列的合適載體包括但不限於選殖載體及表現載體。合適的選殖載體可根據標準技術構築，或可選自此項技術中可利用之眾多選殖載體。儘管所選擇之選殖載體可根據意欲使用之宿主細胞而變化，但可用選殖載體一般具有自我複制能力，可能具有特定限制性核酸內切酶之單一靶標，及/或可能攜帶可用於選擇包含該載體之殖株的標記物的基因。合適之實例包括質體及細菌病毒， 例如pUC18、pUC19、Bluescript (例如pBS SK+)及其衍生物、mpl8、mpl9、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNA及穿梭載體諸如pSA3及pAT28。此等及許多其他選殖載體可獲自商業供應商，諸如BioRad、Strategene及Invitrogen。
適用於編碼Siglec-9 ECD融合分子之載體之選殖及表現的宿主細胞包括原核細胞或真核細胞。例如，本揭露之Siglec-9 ECD融合分子可在真核生物中產生，特別是當醣化及Fc效應子功能有助於分子之活性時。
除原核生物以外，真核微生物(諸如絲狀真菌或酵母)亦為編碼Siglec-9 ECD融合分子之載體之合適的選殖或表現宿主，包括醣化途徑已「人源化」，從而產生具有部分或完全人類醣化模式之Siglec-9 ECD融合分子的真菌及酵母菌株(例如，GerngrossNat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)；及Li等人Nat. Biotech. 24:210-215 (2006))。
亦可使用脊椎動物細胞作為宿主。例如，適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可能有用。可用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為藉由SV40轉型之猴腎CV1細胞株(COS-7)；人類胚腎細胞株(293或293細胞，例如，如Graham等人J. Gen Virol. 36:59 (1977)中所述)，其用於重組產生本文中之實例之Siglec-9 ECD融合分子；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠賽特利細胞(TM4細胞，例如，如Mather,Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)中所述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸上皮癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；布法羅大鼠肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠***瘤(MMT 060562)；TRI細胞，例如，如Mather等人Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)中所描述；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他可用哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR-CHO細胞(Urlaub等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如Y0、NS0及Sp2/0。 Siglec-9 ECD融合分子之示範性活性
本文提供了包含Siglec-9 ECD之多肽，其中該多肽結合細胞表面上之唾液酸。包含Siglec-9 ECD之多肽可為Siglec-9 ECD融合分子，諸如Siglec-9 ECD-Fc融合分子。包含Siglec-9 ECD之多肽可以小於100 nM、或小於90 nM、或小於80 nM、或小於70 nM、或小於60 nM、或小於50 nM、或小於40 nM、或小於30 nM之親和力(Kd)結合表面上包含唾液酸之細胞。在一些實施例中，該多肽以0.1-100 nM、或0.1-90 nM、或0.1-80 nM、或0.1-70 nM、或0.1-60 nM、或0.1-50 nM、或0.1-40 nM、或0.1-30 nM之親和力(Kd)結合表面上包含唾液酸之細胞。在一些實施例中，Siglec-9 ECD或Siglec-9 ECD融合分子可以例如小於100 nM、或小於90 nM、或小於80 nM、或小於70 nM、或小於60 nM、或小於50 nM、或小於40 nM、或小於30 nM、或小於25 nM、或小於20 nM、或小於10 nM、或小於5 nM、或小於2 nM、或0.1-50 nM、或1-50 nM、或1-25 nM、或1-20 nM、或1-10 nM、或1-5 nM、或1-2 nM之Kd與MDSC結合。在各種實施例中，細胞為骨髓源性抑制細胞(MDSC)。在一些情況下，MDSC為人類MDSC。
用於確定親和力之非限制示範性檢定如下。將MDSC (諸如人類MDSC)分離出並與滴定量包含Siglec-9 ECD-Fc融合分子之多肽孵育。將螢光標記之抗Fc域抗體(例如，結合IgG1 Fc域之抗體)用於偵測，且藉由流動式細胞測量術評估結合。在一些實施例中，將非人類Fc域(例如，小鼠IgG1 Fc域)用於融合分子，以降低螢光標記之抗Fc域抗體與MDSC之背景結合。示範性測定提供於實例7中。
在一些實施例中，包含Siglec-9 ECD之多肽使骨髓源性抑制細胞(MDSC)再極化。包含Siglec-9 ECD之多肽可為Siglec-9 ECD融合分子，諸如Siglec-9 ECD-Fc融合分子。MDSC之再極化可例如藉由量測與多肽孵育之MDSC之趨化介素表現增加來確定。指示MDSC之再極化的表現可能增加的非限制示範性細胞介素包括CCL3、CCL4、CCL5、CCL17、CXCL1、CXCL9及IL-8。確定再極化之檢定可量測1種、2種、3種、4種、5種或更多種細胞介素之表現。MDSC之再極化亦可藉由量測在存在包含Siglec-9 ECD之多肽之情況下培養之MDSC之CD86表現及/或CD163表現來確定。CD86為促發炎標記物，且CD86表現之增加與MDSC之再極化一致。CD163為M2巨噬細胞標記物，且CD163表現之降低與MDSC向促發炎噬菌體之再極化一致。示範性測定提供於實例8中。
在一些實施例中，包含Siglec-9 ECD之多肽減輕MDSC介導之T細胞抑制。包含Siglec-9 ECD之多肽可為Siglec-9 ECD融合分子，諸如Siglec-9 ECD-Fc融合分子。用於確定MDSC介導之T細胞抑制的非限制示範性檢定如下。將MDSC分離出並與多肽培養例如48小時。隨後將MDSC與經分離之T細胞(例如，CD8+ T細胞)及T細胞活化劑諸如Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28共培養。T細胞活化可藉由IFNγ表現來確定。在一些實施例中，與對照多肽相比，當將MDSC與包含Siglec-9 ECD之多肽孵育時，IFNγ表現增加，指示T細胞活化。示範性測定提供於實例9中。
在一些實施例中，包含Siglec-9 ECD之多肽阻斷其他Siglec與MDSC之結合。在一些此類實施例中，多肽阻斷Siglec-3、Siglec-5、Siglec-7、Siglec-9及/或Siglec-10與MDSC之結合。結合可例如使用本文所述之用於量測Kd之流動式細胞測量檢定來量測。示範性測定提供於實例19中。
在一些實施例中，Siglec-9 ECD融合分子可包含C末端直接或經由連接子分子連接至Fc域之胺基酸序列SEQ ID NO: 78，諸如胺基酸序列SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 227或者SEQ ID NO: 45-48及228-233中任一者之胺基酸序列，具有或不具有訊息肽。在一些情況下，該分子可以例如小於100 nM、或小於90 nM、或小於80 nM、或小於70 nM、或小於60 nM、或小於50 nM、或小於40 nM、或小於30 nM、或小於25 nM、或小於20 nM、或小於10 nM、或小於5 nM、或小於2 nM、或0.1-50 nM、或1-50 nM、或1-25 nM、或1-20 nM、或1-10 nM、或1-5 nM、或1-2 nM之Kd與MDSC (諸如人類MDSC)結合。
例如，在一些實施例中，Fc域具有人類IgG1同型，相對於IgG1多肽SEQ ID No: 142，其：a)與FcγRIII之結合減少；b)抗體依賴性細胞毒性(ATCC)降低及/或補體結合活性降低；c)與FcγRIIa之結合增加；或a)、b)及/或c)之任何組合。在一些情況下，Fc域包含SEQ ID NO: 143。在一些情況下，Fc域包含具有N325S及L328F (NSLF)取代之人類IgG1同型。在一些此類情況下，與具有相同胺基酸序列但C末端連接至hIgG1野生型Fc分子之Siglec-9 ECD相比，此種分子在存在MDSC之情況下誘導IFNγ產生之效力亦可增加。在一些實施例中，該分子可減輕MDSC介導之T細胞抑制，例如，如藉由量測IFNγ表現之增加或T細胞增殖之增加所確定。在一些情況下，此種分子可增加MDSC上CD86之表現及/或可降低MDSC上CD206之表現。在一些情況下，此種分子亦可與MDSC (諸如人類MDSC)結合，其中Kd低於包含相同胺基酸序列之Siglec-9 ECD但C末端結合至hIgG1野生型Fc之分子之Kd。 醫藥組成物/調配物
本文提供了醫藥組成物，其包含本揭露之Siglec-9 ECD融合分子(諸如Siglec-9 ECD-Fc融合分子)及醫藥學上可揭露之載劑。在一些實施例中，本文提供了醫藥組成物，其在醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑中包含具有所要純度的本揭露之Siglec-9 ECD融合分子(Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, Pa.)。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所採用之劑量及濃度下對接受者無毒。
在各種實施例中，在具有醫藥學上可接受之載劑之調配物中提供了包含Siglec-9 ECD融合分子之醫藥組成物(參見例如，Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 第20版(2003)；Ansel等人, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 第7版, Lippencott Williams and Wilkins (2004)；Kibbe等人, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 第3版, Pharmaceutical Press (2000))。適合非經腸投與之調配物包括水性及非水性等張無菌注射溶液，其可包含抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及致使調配物與預定接受者之血液等張的溶質；以及水性及非水性無菌懸浮液，其可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑及防腐劑。 治療用途
如本文所揭示，本揭露之Siglec-9 ECD融合分子(例如，Siglec-9 ECD-Fc融合分子)可用於預防疾病及病症、降低疾病及病症風險或治療疾病及病症。此外，本揭露之Siglec-9 ECD融合分子(例如，Siglec-9 ECD-Fc融合分子)可用於將骨髓源性抑制細胞(MDSC)再極化成促發炎表現型的方法，例如，在該等方法中個體患有癌症或神經性或神經退化性疾病，如下文所述。本揭露之Siglec-9 ECD融合分子(例如，Siglec-9 ECD-Fc融合分子)亦可用於活化髓樣細胞之方法，例如，在該等方法中個體患有癌症或神經性或神經退化性疾病，如下文所述。本揭露之Siglec-9 ECD融合分子(例如，Siglec-9 ECD-Fc融合分子)可進一步用於在患有癌症之個體中將腫瘤巨噬細胞再極化成遠離M2表現型之方法，如本文所述。
在本發明之一個態樣中，將Siglec-9 ECD融合分子(例如，Siglec-9 ECD-Fc融合分子)用作治療劑。藉由鑑定出罹患可受益於用Siglec-9 ECD融合分子治療的疾病或病症(或處於發展其之風險)之個體(例如，人類患者)進行治療方案。
如下文進一步詳述，Siglec-9 ECD融合分子(例如，Siglec-9 ECD-Fc融合分子)可與用於治療本文所提供之疾病或病理的額外治療劑組合使用。術語「組合」及「聯合」可在本揭露中互換使用。與Siglec-9 ECD融合分子組合投與之額外治療劑可在Siglec-9 ECD融合分子之前、之後或與其同時投與。
在一些實施例中，欲治療之疾病或病症為癌症。在某些實施例中，癌症為實性瘤。實性瘤可與腫瘤微環境有關，該腫瘤微環境包含髓樣細胞，例如，巨噬細胞、單核球、微膠細胞(在CNS中)、樹突細胞、嗜中性球及/或顆粒球。在某些實施例中，腫瘤微環境包含巨噬細胞及單核球。在某些實施例中，髓樣細胞產生腫瘤可逃避免疫系統的免疫抑制性腫瘤微環境。用本文中之Siglec-9 ECD融合分子進行治療可藉由活化髓樣細胞及促進抗腫瘤免疫反應來減輕此抑制。
在某些實施例中，欲藉由本揭露之方法預防或治療之癌症包括但不限於鱗狀細胞上皮癌(例如，上皮鱗狀細胞上皮癌)、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、鱗狀非小細胞肺癌、肺腺癌、鱗狀肺上皮癌、非鱗狀NSCLC、神經膠瘤、腹膜癌、肝細胞癌、包括胃腸癌及胃腸基質癌之胃癌(gastric cancer或stomach cancer)、腎癌(例如，明亮細胞癌)、卵巢癌、肝癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、肝上皮癌、 腎臟癌(例如，腎細胞上皮癌(RCC))、***癌(例如，激素頑抗性***癌)、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、肉瘤、胰臟癌、腦癌(例如，星細胞瘤諸如神經膠質母細胞瘤(多形性神經膠質母細胞瘤))、子宮頸癌、膀胱癌、肝腫瘤、乳癌(例如，三陰性乳癌)及頭頸癌(頭頸部鱗狀細胞上皮癌)、黑色素瘤(例如，轉移性惡性黑色素瘤，諸如皮膚或眼內惡性黑色素瘤)、甲狀腺癌、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門癌、睾丸癌、輸卵管上皮癌、陰門癌、膽管上皮癌及食道癌。在某些實施例中，癌症選自腎細胞上皮癌、肉瘤、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、結腸直腸癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、頭頸癌、乳癌及子宮癌。
在某些實施例中，欲藉由本揭露之方法預防或治療之癌症包括但不限於造血系統癌症，諸如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
在一些實施例中，癌症可為早期癌症或晚期癌症。在一些實施例中，癌症可為原發性腫瘤。在一些實施例中，癌症可為源自上文癌症類型中任一者的在第二部位處之轉移性腫瘤。
在一些實施例中，本揭露提供了治療患有癌症之個體之方法，其中該個體患有對檢查點抑制劑療法具有頑抗性的癌症，該等方法係藉由向該個體投與有效量本揭露之Siglec-9 ECD融合分子，例如Siglec-9 ECD-Fc融合分子來進行。在某些實施例中，個體患有對用PD-1或PD-L1拮抗劑(例如PD-1或PD-L1抗體，諸如下文提供的那些)之療法具有頑抗性的癌症。
在一些實施例中，本揭露提供了治療患有癌症之個體之方法，其中該個體患有在檢查點抑制劑療法之後復發的癌症，該等方法係藉由向該個體投與治療有效量本揭露之Siglec-9 ECD融合分子，例如Siglec-9 ECD-Fc融合分子來進行。在某些實施例中，個體患有在用PD-1或PD-L1拮抗劑(例如PD-1或PD-L1抗體，諸如下文提供的那些)之療法之後復發的癌症。
在一些實施例中，本揭露之Siglec-9 ECD融合分子(例如，Siglec-9 ECD-Fc融合分子)可聯合抑制免疫檢查點分子之拮抗劑投與。在一些實施例中，抑制檢查點分子為PD-1 (計畫性細胞死亡蛋白-1)或其配體PD-L1 (計劃性死亡配體-1)。在一些實施例中，PD-1之拮抗劑為針對PD-1之抗體。PD-1抗體包括例如OPDIVO (納武利尤單抗(nivolumab))、KEYTRUDA (帕博利珠單抗(pembrolizumab))、MEDI-0680 (AMP-514；WO2012/145493)、卡瑞利珠單抗(camrelizumab)(SHR-1210)、替雷利珠單抗(tislelizumab)(BGB-A317)或斯巴達珠單抗(spartalizumab)(NPVPDR001、NVS240118、PDR001)。由與IgGl之Fc部分融合之PD-L2細胞外域(B7-DC)組成之重組蛋白(稱為AMP-224)亦可用於拮抗PD-1受體。在一些實施例中，PD-L1之拮抗劑為針對PD-L1之抗體。PD-L1抗體包括例如TECENTRIQ (阿替珠單抗(atezolizumab))、伐利尤單抗(durvalumab)(MEDI4736)、BMS-936559 (W02007/005874)、MSB0010718C (WO2013/79174)或rHigM12B7。在一些實施例中，本發明之Siglec-9 ECD融合分子與放射療法及/或化學治療劑組合投與。
在一些實施例中，提供了用於藉由向有需要之患者投與Siglec-9 ECD融合分子(諸如Siglec-9 ECD-Fc融合分子)來治療神經性或神經退化性病症之方法。在一些實施例中，神經性或神經退化性病症之特徵在於微膠細胞功能不良(例如，活動不足)或缺失。微膠細胞為專門存在於腦中且起巨噬細胞的作用的先天性免疫細胞，其通過吞噬作用之過程清除碎屑及死亡神經元且提供其他支持功能以便維持腦部健康。不受理論的限制，藉由Siglec-9 ECD融合分子活化微膠細胞將治療神經性或神經退化性病症。在一些實施例中，患者具有神經性或神經退化性病症之症狀，且Siglec-9 ECD融合分子經投與以治療神經性或神經退化性病症。在一些實施例中，患者處於神經性或神經退化性病症之風險，且Siglec-9 ECD融合分子經投與以降低神經性或神經退化性病症之風險、減慢神經性或神經退化性病症之發作或預防神經性或神經退化性病症。在一些實施例中，神經性或神經退化性病症選自失智症包括失智症、額顳葉失智症、阿茲海默氏病、血管型失智症、及輕度認知障礙、帕金森氏病、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、亨汀頓氏病、tau蛋白病、多發性硬化症、免疫介導之神經病變(諸如神經病變痛)、那須-哈科拉病、小兒發作腦白質病及成人發作腦白質病伴軸突小球及色素性神經膠(ALSP)。失智症
失智症為呈現為先前未受損人士之整體認知能力嚴重喪失，超出可自正常老化預期之程度的非特定症候群(亦即，一組體徵及症狀)。由於獨特的整體腦損傷，失智症可為靜態的。替代地，失智症可為進行性的，由於身體損傷或疾病而導致長期衰退。儘管失智症在老年群體中更為常見，但其亦可在65歲之前發生。受失智症影響之認知區域包括但不限於記憶、注意力跨度、語言及問題解決。一般而言，截至個體經診斷為患有失智症之前，症狀必須存在至少六個月。
失智症之示範性形式包括但不限於額顳葉失智症、阿茲海默氏病、血管型失智症、語意型失智症及路易氏體型失智症(dementia with Lewy bodies)。
在一些實施例中，投與本揭露之Siglec-9 ECD融合分子可預防癡呆、降低癡呆之風險及/或治療癡呆。在一些實施例中，投與Siglec-9 ECD融合分子可在患有失智症之個體中調節一或多種Siglec-9活性。額顳葉失智症
額顳葉失智症(FTD)為由腦額葉之進行性惡化導致之疾患。隨時間流逝，變性可推進至顳葉。FTD在盛行率方面僅次於阿茲海默氏病(AD)，佔早老性失智症病例之20%。FTD之臨床特徵包括記憶減退、行為異常、人格改變及語言障礙(Cruts, M.及Van Broeckhoven, C., Trends Genet. 24:186-194 (2008)；Neary, D.等人, Neurology 51:1546-1554 (1998)；Ratnavalli, E., Brayne, C., Dawson, K.及Hodges, J. R., Neurology 58:1615-1621 (2002))。
很大一部分FTD病例以體染色體顯性方式遺傳，但即使在一個家族中，症狀亦可跨越自FTD伴隨行為失常至原發性進行性失語症至皮質-基底神經節變性之範圍。如同大部分神經退化性疾病，FTD之特徵可在於患病腦中之特定蛋白質聚集體之病理性存在。歷史上，對FTD之首次描述認識到神經原纖維纏結或匹克(Pick)體中存在高磷酸化tau蛋白之神經內積聚。對若干家族中編碼tau蛋白之基因中之突變的鑑定支持微管相關蛋白Tau之因果作用(Hutton, M.等人, Nature 393:702-705 (1998)。然而，大多數FTD腦未顯示高磷酸化Tau積聚，但確實展現對泛素(Ub)及TAR DNA結合蛋白(TDP43)之免疫反應性(Neumann, M. 等人, Arch. Neurol. 64:1388-1394(2007))。大多數涉及Ub之彼等FTD病例(FTD-U)顯示在前顆粒蛋白基因中帶有突變。
在一些實施例中，投與本揭露之Siglec-9 ECD融合分子可預防FTD、降低FTD之風險及/或治療FTD。在一些實施例中，投與Siglec-9 ECD融合分子可在患有FTD之個體中調節一或多種Siglec-9活性。阿茲海默氏病
阿茲海默氏病(AD)為失智症之最常見形式。該疾病不能治癒，隨其進展而惡化，且最終導致死亡。最通常在超過65歲之人士中診斷AD。然而，不太盛行之早發性阿茲海默氏病可能更早發生。阿茲海默氏病之常見症狀包括行為症狀，諸如難以記住最近之事件；認知症狀、混亂、煩躁及攻擊性、情緒波動、語言困難以及長期記憶喪失。隨著疾病進展，身體功能喪失，最終導致死亡。阿茲海默氏病在完全顯現之前會發展未知且可變量之時間，並且其可在多年未確診之情況下進展。
本文中亦報導以下發現，即rs2075803之次要對偶基因(在19號染色體上之Siglec-9基因座處之SNP)與血漿中之Siglec-9水準及阿茲海默氏病風險增加有關。此外，本文中報導了以下發現，及rs12983058之次要對偶基因(在19號染色體上Siglec-7基因座處之SNP)與血漿中Siglec-7水準及阿茲海默氏病風險增加有關。
據此，在一些實施例中，投與本揭露之Siglec-9 ECD融合分子可預防阿茲海默氏病、降低阿茲海默氏病之風險及/或治療阿茲海默氏病。在一些實施例中，投與Siglec-9 ECD融合分子可在患有阿茲海默氏病之個體中調節一或多種Siglec-9活性。帕金森氏病
帕金森氏病(可稱為特發性或原發性帕金森氏症、運動不足性僵硬症候群(HRS)或震顫麻痺症)為影響運動系統控制之神經退化性腦部病症。腦中產多巴胺細胞之進行性死亡導致帕金森氏症之主要症狀。最通常在超過50歲之人士中診斷帕金森氏病。在大部分人中，帕金森氏病為特發性的(無已知病因)。然而，遺傳因素亦在該疾病中起作用。
帕金森氏病之症狀包括但不限於手、臂、腿、下頜及面部震顫、四肢及軀幹肌強硬、運動緩慢(運動遲緩)、姿勢不穩、行走困難、神經精神病問題、語言或行為改變、抑鬱、焦慮、疼痛、精神病、失智症、幻覺及睡眠問題。
在一些實施例中，投與本揭露之Siglec-9 ECD融合分子可預防帕金森氏病、降低帕金森氏病之風險及/或治療帕金森氏病。在一些實施例中，投與Siglec-9 ECD融合分子可在患有帕金森氏病之個體中調節一或多種Siglec-9活性。肌萎縮性脊髓側索硬化症 (ALS)
如本文中所使用，肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)或運動神經元疾病或路格裡克氏病(Lou Gehrig's disease)可互換使用，並且係指不同病因之虛弱性疾病，其特徵為快速進行性虛弱、肌肉萎縮及束化、肌肉痙攣、難以說話(發音困難)、難以吞嚥(吞嚥困難)及難以呼吸(呼吸困難)。
已顯示，前顆粒蛋白在ALS方面起作用(Schymick, JC等人, (2007) J[0343] Neurol Neurosurg Psychiatry.;78:754-6)且保護免遭藉由造成ALS之蛋白諸如TDP-43所致之損傷(Laird, AS等人, (2010). PLoS ONE 5: e13368)。亦證明瞭，pro-NGF在脊髓損傷之後誘導p75介導之寡樹突膠細胞及皮質脊神經元死亡(Beatty等人, Neuron (2002),36, 第375-386頁；Giehl等人, Proc. Natl. Acad. Sci USA (2004), 101, 第6226-30頁)。
在一些實施例中，投與本揭露之Siglec-9 ECD融合分子可預防ALS、降低ALS之風險及/或治療ALS。在一些實施例中，投與Siglec-9 ECD融合分子可在患有肌萎縮性脊髓側索硬化症之個體中調節一或多種Siglec-9活性。亨汀頓氏病
亨汀頓氏病(HD)為由亨汀頓蛋白基因(HTT)中之體染色體顯性突變引起之遺傳性神經退化性疾病。亨汀頓蛋白基因內細胞介素-腺嘌呤-鳥嘌呤(CAG)三核苷酸重複序列之擴增導致該基因編碼之亨汀頓蛋白(Htt)之突變體形式之產生。此突變體亨汀頓蛋白(mHtt)有毒且導致神經元死亡。亨汀頓氏病之症狀最常出現在35與44歲之間，但其可出現在任何年齡。
亨汀頓氏病之症狀包括但不限於運動控制問題、運動不平穩且隨機(舞蹈症)、異常眼球運動、平衡能力受損、癲癇、咀嚼困難、吞嚥困難、認知問題、語言改變、記憶力減退、思考困難、失眠、疲勞、失智症、人格改變，抑鬱、焦慮及強迫行為。
在一些實施例中，投與本揭露之Siglec-9 ECD融合分子可預防亨汀頓氏病、降低亨汀頓氏病之風險及/或治療亨汀頓氏病。在一些實施例中，投與Siglec-9 ECD融合分子可在患有亨汀頓氏病之個體中調節一或多種Siglec-9活性。tau 蛋白病
tau蛋白病(Taupathy disease或Tauopathy)為一類由腦內微管相關蛋白tau之聚集引起之神經退化性疾病。阿茲海默氏病(AD)為最有名的tau蛋白病且涉及神經元內之tau蛋白以不溶性神經纖維纏結(NFT)之累積。其他tau蛋白病及病症包括進行性核上神經麻痺症、拳擊手型失智症(慢性創傷性腦病變)、與17號染色體連鎖之額顳葉失智症及帕金森氏症、Lytico-Bodig病(關島帕金森氏症-失智症複合症)、纏結為主型失智症(Tangle-predominant dementia)、神經節神經膠質瘤(Ganglioglioma)及神經節細胞瘤(gangliocytoma)、腦膜血管瘤病(Meningioangiomatosis)、亞急性硬化性泛腦炎、鉛毒腦病、結節性硬化症、哈雷狛登-斯巴茲病(Hallervorden-Spatz disease)、脂褐質症、匹克病(Pick’s disease)、皮質基底核退化、嗜銀顆粒病(Argyrophilic grain disease；AGD)、亨汀頓氏病及額顳葉退化症(frontotemporal lobar degeneration)。
在一些實施例中，投與本揭露之Siglec-9 ECD融合分子可預防tau蛋白病、降低tau蛋白病之風險及/或治療tau蛋白病。在一些實施例中，投與Siglec-9 ECD融合分子可在患有tau蛋白病之個體中調節一或多種Siglec-9活性。多發性硬化症
多發性硬化症(MS)亦可稱為瀰漫性硬化症或瀰漫性腦脊髓炎。MS為發炎疾病，其中腦及脊髓之軸突周圍之脂肪髓鞘被破壞，從而導致脫髓鞘及瘢痕形成以及諸多體徵及症狀。MS影響腦及脊髓中神經細胞彼此有效通訊的能力。神經細胞藉由將成為動作電位之電信號向下發送至稱為軸突之長纖維來通訊，該等長纖維包含於稱為髓磷脂之絕緣物質內。在MS中，人體自身的免疫系統攻擊並破壞髓磷脂。當髓磷脂喪失時，軸突不再有效傳導信號。MS發病通常發生在青年人中，且在女性中更為常見。
MS之症狀包括但不限於感覺改變，諸如靈敏性喪失或酸麻；刺痛或麻木，諸如感覺遲鈍及感覺異常；肌肉無力；陣攣；肌肉痙攣；移動困難；協調及平衡困難，諸如共濟失調；語言問題，諸如發音困難，或吞嚥問題(諸如吞嚥困難)；視覺問題，諸如眼球震顫、視神經炎(包括光幻視)及復視；疲勞；急性或慢性疼痛；以及膀胱及腸道困難；不同程度之認知障礙；抑鬱或情緒不穩之情緒症狀；烏特霍夫(Uhthoff)現象，其為由於暴露於比平常環境溫度高之溫度而使現存症狀惡化；以及萊爾米特(Lhermitte)體徵，其為當彎曲頸部時沿背部向下行進之電感覺。
在一些實施例中，投與本揭露之Siglec-9 ECD融合分子可預防MS、降低MS之風險及/或治療MS。在一些實施例中，投與Siglec-9 ECD融合分子可在患有MS之個體中調節一或多種Siglec-9活性。 投與
本文所提供之Siglec-9 ECD融合分子(諸如 Siglec-9 ECD-Fc融合分子)(及任何其他治療劑)可藉由任何適合之手段投與，包括非經腸、肺內、鼻內、腫瘤內、病灶內投與、腦脊髓內、顱內、脊髓內、滑膜內、鞘內、經口、局部或吸入途徑。非經腸輸注包括肌肉內、以彈丸形式或藉由在一段時間內連續輸注進行之靜脈內投與 、動脈內、關節內、腹膜內或皮下投與。在一些實施例中，投與為靜脈內投與。在一些實施例中，投與為皮下投與。給藥可藉由任何適合之途徑進行， 例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射，部分地視投與為短暫的抑或長期的而定。本文中預期各種給藥方案，包括但不限於在各個時間點單次或多次投與、彈丸投與及脈衝輸注。
就預防或治療疾病而言，本發明之Siglec-9 ECD融合分子(諸如Siglec-9 ECD-Fc融合分子)(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)之適當劑量將視欲治療之疾病之類型、融合分子之類型、疾病之嚴重程度及病程、抗體之投與係出於預防目的抑或治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷而定。融合分子一次性或在一系列治療中適當地向患者投與。 診斷用途
在一些實施例中，本文所提供之Siglec-9 ECD融合分子可用於偵測樣品或個體中Siglec配體(例如，唾液酸)之存在。如本文所用之術語「偵測」涵蓋定量或定性偵測。本文提供了使用本揭露之Siglec-9 ECD融合分子以實現診斷目的之方法，諸如個體或來源於個體之組織樣品中唾液酸之偵測。在一些實施例中，個體為人類。
偵測方法可涉及唾液酸結合之Siglec-9 ECD融合分子之定量。生物樣品中之此類偵測可用此項技術中已知的任何方法來進行，包括免疫螢光顯微鏡術、免疫細胞化學、免疫組織化學、ELISA、FACS分析、免疫沉澱或微正電子發射斷層攝影術。在某些實施例中，例如用18F對Siglec-9 ECD融合分子進行放射性標記，隨後利用微正電子發射斷層攝影術分析進行偵測。亦可藉由非侵入性技術，諸如正電子發射斷層攝影術(PET)、X射線電腦斷層攝影術、單光子發射電腦斷層攝影術(SPECT)、電腦斷層攝影術(CT)及電腦軸向斷層攝影術(CAT)對患者中之唾液酸結合進行定量。 製品
如本文所述，本文提供了包含Siglec-9 ECD融合分子(例如，Siglec-9 ECD-Fc融合分子)之製品(例如，套組)。製品可包括一或多個包含本文所述之Siglec-9 ECD融合分子之容器。容器可為任何適合之包裝，包括但不限於小瓶、瓶、廣口瓶、撓性包裝(例如密封麥拉(Mylar)或塑膠袋)及其類似物。容器可為單位劑量、大包裝(例如，多劑量包裝)或亞單位劑量。
在一些實施例中，套組可進一步包括第二劑。在一些實施例中，第二劑為醫藥學上可接受之緩沖劑或稀釋劑，包括但不限於諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液及右旋糖溶液。在一些實施例中，第二劑為如本文所述之醫藥活性劑。
在該等製品中任一者之一些實施例中，製品進一步包括根據本揭露方法之使用說明書。說明書一般包括預期治療之劑量、給藥方案及投與途徑的資訊。在一些實施例中，這些說明書包含根據本揭露之任何方法投與本揭露之Siglec-9 ECD融合分子以預防選自以下之疾病、病症或損傷、降低該疾病、病症或損傷之風險或治療患有該疾病、病症或損傷之個體：鱗狀細胞上皮癌(例如，上皮鱗狀細胞上皮癌)、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、鱗狀非小細胞肺癌、肺腺癌、鱗狀肺上皮癌、非鱗狀NSCLC、神經膠瘤、腹膜癌、肝細胞癌、包括胃腸癌及胃腸基質癌之胃癌(gastric cancer或stomach cancer)、腎癌(例如，明亮細胞癌)、卵巢癌、肝癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、肝上皮癌、 腎臟癌(例如，腎細胞上皮癌(RCC))、***癌(例如，激素頑抗性***癌)、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、胰臟癌、腦癌(例如，星細胞瘤諸如神經膠質母細胞瘤(多形性神經膠質母細胞瘤))、子宮頸癌、膀胱癌、肝腫瘤、乳癌(例如，三陰性乳癌)及頭頸癌(頭頸部鱗狀細胞上皮癌)、黑色素瘤(例如，轉移性惡性黑色素瘤，諸如皮膚或眼內惡性黑色素瘤)、甲狀腺癌、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門癌、睾丸癌、輸卵管上皮癌、陰門癌、膽管上皮癌、食道癌、失智症包括失智症、額顳葉失智症、阿茲海默氏病、血管型失智症、及輕度認知障礙、帕金森氏病、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、亨汀頓氏病、tau蛋白病、多發性硬化症、免疫介導之神經病變(諸如神經病變痛)、那須-哈科拉病、小兒發作腦白質病及成人發作腦白質病伴軸突小球及色素性神經膠(ALSP)。在一些實施例中，說明書包括Siglec-9 ECD融合分子及第二劑(例如，第二醫藥活性劑)之使用說明書。
藉由參考以下實例，將更充分地理解本揭露。然而，其不應被視為限制本揭露之範疇。本揭露通篇之所有引用文獻明確以引用之方式併入本文中。實例
下列實例僅作為說明而不是限制來提供。熟習此項技術者將容易認識到可改變或修改以產生基本上類似的結果的多種參數。 實例 1 ： Siglec-9 在人類腫瘤中之髓樣細胞表面上表現。
為了檢查Siglec-9在人類腫瘤中之免疫細胞上之表現，藉由酶消化處理了新切除的原發性人類腫瘤，接著進行流動式細胞測量分析。如圖1所示，在代表性肺腺癌樣品中，在腫瘤浸潤巨噬細胞及顆粒球表面上偵測出Siglec-9，但在T細胞上未偵測出。在來自結腸直腸癌、肝癌、卵巢癌及頭頸癌之樣品中觀察到類似的Siglec-9表現輪廓。Siglec-9髓樣細胞表現之進一步表徵顯示，在可表徵為骨髓源性抑制細胞(MDSC)的HLA-DRlo細胞上，Siglec-9表現最高。 實例 2 ： Siglec-9 ECD 域顯示結合及有效重組表現
評估了Siglec-9-hIgG1截短變異體之表現效率以及與A375黑色素瘤細胞之結合。Siglec-9之ECD由3個域組成：配體結合IgV域定位於N末端，接著為C2T1及C2T2域。在這三個域中，C2T2域最接近於質膜定位。如表 1 中所示，Expi293細胞中僅有效表現了含有所有3個域之Siglec-9 ECD-Fc變異體。為了偵測Siglec-9-hIgG1結合，將A375細胞與250 µg/ml Siglec-9 ECD-Fc變異體在黑暗中於冰上孵育2小時，接著與螢光綴合之抗人類IgG (Jackson Immunoresearch)孵育30分鐘。藉由用BD FACS Canto之流動式細胞測量術評估了結合，並使用FlowJo軟體進行分析。表 1 中之資料顯示，IgV域為與A375細胞結合所需的，這與IgV域在Siglec-9 ECD中充當主配體識別域一致。表 1 ：Siglec-9 ECD-Fc變異體之表現及細胞結合
變異體 每250 ml 之產量(mg) 細胞結合
IgV-C2T1-C2T2-Fc 37.6 +
IgV-Fc 0.2 +
IgV-C2T1-Fc 1.7 +
C2T1-C2T2-Fc 0.4 -
實例 3 ： Siglec9-Fc 融合蛋白工程改造：同源性建模
藉由創建Siglec9-IgV同源性模型對Siglec9-Fc融合蛋白進行工程改造，實現了改良溶解度並使電荷分佈重新平衡的突變之設計。使用基於結構之蛋白同源性建模及穩定性計算來設計溶解度改良且表面電荷重新分佈的Siglec-9變異體，利用了蛋白建模及MOE之蛋白設計模組(Molecular Operating Environment, Chemical Computing Group, Montreal, Canada)。
簡單地說，使用MOE 2019.01 (分子操作環境(Molecular Operating Environment ；MOE)中之Protein Modeler應用創建Siglec9 IgV域之同源性模型(「HM_S9」) (Montreal (QC, Canada): Chemical Computing Group ULC.; 2019年1月)。將Siglec9-IgV之一級胺基酸序列(SEQ ID NO: 7)用作查詢序列且描述於圖 2 中。進行了同源性搜索且將來自蛋白資料庫(www.rcsb.org/)之PDB_ID 1O7V (Siglec-7之高解析結構)用作查詢模板，其與模板具有大約73%的一致性。用MOE 2019.01中之Amber10: EHT力場進行整個蛋白同源性建模中之能量最小化，以便生成細化模型。
接著，使用細化HM_S9模型計算靜電及疏水表面區塊(patch)，以鑑別出與潛在有問題的蛋白-蛋白相互作用有關的殘基。此電腦模擬分析可用於預測可逆聚集，其通常由相對弱的非共價相互作用引起。疏水性相互作用可導致巨分子之間的高親和力非特異性相互作用(Wildman, S.A., Crippen, G.M.; Prediction of Physiochemical Parameters by Atomic Contributions; J. Chem. Inf. Comput. Sci. 39 (1999) 868–873)。此外，在包括抗體在內的許多蛋白中，靜電相互作用涉及到形成自身締合之聚集體(Sharp K., Honig B.; Electrostatic Interactions in Macromolecules: Theory and Applications. Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19 (1990) 301–332)。
鑑別了若干帶正電荷且疏水性的表面區塊。在IGV域中同時使用MOE中靶向疏水區塊、帶正電荷的區塊或疏水加帶正電荷的區塊的殘基掃描功能進行電腦模擬定點誘變。將單重、雙重、三重或四重突變引入至各變異體中。突變選自丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、麩醯胺、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、離胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸及纈胺酸。
取樣大約50,000個突變體並計算穩定性變化。基於穩定性改良、帶正電荷的區塊減少及疏水區塊減少選擇欲構築並測試功能、表現、溶解度及穩定性之突變體。親代Siglec-9-Fc顯示於SEQ ID NO: 10。在胺基酸50-53處之序列「WIYP」經S9.2-S9.7中指示之四個胺基酸置換(分別為SEQ ID NO: 11-16；DIEG，SEQ ID NO: 11；SIET，SEQ ID NO: 12；SIEP，SEQ ID NO: 13；DIEP，SEQ ID NO: 14；YQES，SEQ ID NO: 15；THET，SEQ ID NO: 16)。在S9.8-S9.22 (SEQ ID NO: 17-31)中，進行了指示之取代。參見某些序列之表。(由於藉由MOE進行分子建模，對經突變之殘基之編號進行了調整。成熟多肽序列之第一個胺基酸(SKLL…之S)為第8號殘基。) 實例 4 ： Siglec9-Fc 融合蛋白工程改造：置換環圈殘基
將Siglec-7之高解析晶體結構與Siglec-9模型相比較(Alpheny, M.S.等人; High Resolution Crystal Structures of Siglec-7, Insights into Ligand Specificity in the Siglec Family; J. Biol. Chem. 278 (2003) 3372-3377)。當與由VDSQTDSD (SEQ ID NO: 8)組成之帶負電荷的Siglec-7環圈相比，由SHGWIYPG (SEQ ID NO: 9)組成之電子等排(isosteric)的Siglec-9環圈產生較大疏水表面。因此，應用了系統性電腦模擬環圈調換蛋白工程改造；Siglec-7環圈之各胺基酸由Siglec-9殘基置換或與Siglec-7殘基一起保留至多8個殘基，得到總計256個變異體，包括255個突變體及1個野生型變異體。計算所有256個變異體之穩定性變化。基於穩定性改良、帶正電荷的區塊減少及疏水區塊減少選擇突變體以供進一步表徵。這些突變體之胺基酸序列S9.23-S9.39顯示於SEQ ID NO: 32-39。 實例 5 ：經工程改造之 Siglec9-IgV 變異體之改良之電腦模擬性質
在pH 7.4、100 mM濃度NaCl及298 K下計算電腦模擬生物物理性質，包括穩定性變化(負值越大，越穩定)、疏水蛋白區塊面積、帶正電荷的蛋白區塊面積、帶負電荷的蛋白區塊面積、等電點及淨電荷，並將其與親代構築體相比較。結果顯示於圖3。「穩定性變化」欄中之負值指示穩定性增加。穩定性變化之改良主要歸因於電荷重新分佈及暴露之疏水表面積減小。此類變化通常導致蛋白表現及產生增加。 實例 6 ： Siglec-9-Fc 以中等親和力與 FcR 陰性細胞株結合
使用S9.1-hIgG1變異體(SEQ ID NO: 10)來評估Siglec-9-Fc與一組癌細胞株之結合。S9.1-hIgG1含有天然序列Siglec-9 ECD，其缺失了存在於C2T2域之後且在跨膜域之前的胺基酸殘基LQSKATSGVTQG (SEQ ID NO: 147)，且其訊息序列在產生期間裂解。實質上如實例2中所述，將滴定量S9.1-hIgG1與表 2 中所列出之癌細胞株一起孵育。實質上如Drake及Klakamp,Journal of Immunological Methods , 2007中所述來計算FACS Kd。表 2 ：S9.1-hIgG1對於各種細胞株之親和力
細胞類型 組織來源 S9.1-hIgG1 Kd (nM)
A375 黑色素瘤 220
A549 肺腺癌 193
K562 白血病 12.9
293T 胚胎腎 175
如表 2 中所示，與其他癌細胞株相比，S9.1-hIgG1以較高親和力與K562白血病細胞結合。因為K562細胞來源於髓樣譜系，所以它們在表面上表現FcR，而其他癌細胞株不表現。因此，不受理論的束縛，與S9.1-hIgG1僅與不表現FcR之細胞株上之唾液酸之結合相比，S9.1-hIgG1與白血病細胞上之FcR及唾液酸之結合導致協同結果效果(參見表7)。這可部分解釋與測試之其他癌細胞相比，S9.1-hIgG1對於K562細胞之親和力增強。 實例 7 ： Siglec-9-Fc 以高親和力與骨髓來源之抑制細胞結合
為了檢查初級人類細胞上之Siglec-9-Fc結合，使用S9.A-mIgG1來評估Siglec-9-Fc與骨髓來源之抑制細胞(MDSC)之親和力。S9.A-mIgG1 (SEQ ID NO: 43)含有經由具有7個胺基酸之連接子與鼠IgG1 Fc域融合之全長Siglec-9 ECD (SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基1-348)，其訊息序列在產生期間裂解。MDSC實質上如下生成：使用RosetteSep人類單核球富集混合物套組(StemCell)自健康人類供體分離出CD14+單核球，且在37℃及5% CO2 下，於含有10 ng/ml hGM-CSF (R&D)及10 ng/ml hIL-6 (R&D)之RPMI培養基中分化7天。藉由將MDSC與滴定量S9.A-mIgG1在黑暗中於冰上孵育2小時，接著與螢光綴合之抗小鼠IgG (Jackson Immunoresearch)孵育30分鐘來評估細胞結合。藉由用BD FACS Canto之流動式細胞測量術評估了結合，並使用FlowJo軟體進行分析。使用具有鼠Fc之變異體S9.A-mIgG1，因為MDSC上抗人類偵測導致過高的背景結合。如表 3 中所示，對於3個獨立供體，S9.A-mIgG1在MDSC上之計算FACS Kd在低nM範圍內，且在作為肺上皮癌上皮細胞株之參考癌細胞株A549上弱約10-100倍。這些研究顯示，與癌細胞相比，Siglec-9-Fc以較高親和力與髓樣細胞(諸如MDSC)結合。據此，這些研究提供協同結合機制之進一步證據，其中與Siglec-9-Fc僅與不表現FcR之癌細胞上之唾液酸之結合相比，Siglec-9-Fc與髓樣細胞上之FcR及唾液酸結合。這解釋了，與不表現FcR之A549肺癌細胞株相比，S9.A-mIgG1對於MDSC之親和力增強。
圖15顯示Siglec-9-ECD-Fc融合分子(Siglec-9-Fc)之作用機制之示範性模型。Siglec-9-Fc通過其Siglec-9 ECD部分與癌細胞上之配體(唾液酸)結合(左圖)。基於本文中之研究，且不受理論束縛，據信，Siglec-9-Fc與髓樣細胞上表現之FcR及配體(唾液酸)結合(右圖)。結合經由協同結合(或順式)相互作用分別通過Siglec-9-Fc分子之Fc部分及Siglec-9 ECD部分而發生。因此，與不表現FcR之細胞相比，Siglec-9-Fc以較高親和力與髓樣細胞結合，導致體內優先靶向髓樣細胞。表 3 ：S9.A-mIgG1對於來自3個供體之MDSC及A549細胞之親和力
細胞類型 S9.A-mIgG1 Kd (nM)
1號MDSC供體 4.2
2號MDSC供體 19.4
3號MDSC供體 1.9
A549 228
實例 8 ： Siglec-9-Fc 有效地再極化 MDSC 。
評估了S9.A-hIgG1 (SEQ ID NO: 40)及S9.A-hIgG1 LALAPS (SEQ ID NO: 42)再極化MDSC之能力。S9.A-hIgG1 (SEQ ID NO: 40)及S9.A-hIgG1 LALAPS (SEQ ID NO: 42)含有經由具有7個胺基酸之連接子與人類IgG1 Fc域融合之全長Siglec-9 ECD (SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基1-348)，其訊息序列在產生期間裂解。對於S9.A-hIgG1，人類IgG1 Fc域為天然序列hIgG1，且對於S9.A-hIgG1 LALAPS，人類IgG1 Fc含有「LALAPS」取代。如先前所述，LALAPS實質上取消了Fc-FcR相互作用。
如實例7中所述，自CD14+單核球生成人類MDSC，然後將其與10 µg/ml S9.A-hIgG1或S9.A-hIgG1 LALAPS在37℃及5% CO2 下孵育48小時。收穫上清液，且使用LEGENDplex人類促發炎趨化介素組套組(Human Proinflammatory Chemokine Panel kit)(Biolegend)分析分泌之趨化介素。如表 4 中所示，S9.A-hIgG1有效地將MDSC再極化成促發炎表現型，而S9.A-hIgG1 LALAPS不太有效。這顯示，除配體(唾液酸)結合之外，FcR結合顯著增強Siglec-9-Fc再極化MDSC之能力。表 4 ：與S9.A-hIgG1或S9.A-hIgG1 LALAPS孵育之MDSC之趨化介素表現
分析物 S9.A-hIgG1 S9.A-hIgG1 LALAPS hIgG1
CCL3 68780 ± 25341 355 ± 295 207 ± 176
CCL4 16112 ± 4690 3505 ± 1371 792 ± 382
CCL5 1081 ± 294 23 ± 8 16 ± 4
CCL17 4585 ± 1429 401 ± 167 188 ± 41
CXCL1 11801 ± 1235 1135 ± 282 154 ± 77
CXCL9 306 ± 190 57 ± 26 68 ± 58
IL-8 280552 ± 18324 181326 ± 36223 11551 ± 5418
表4中之單位為pg/ml。結果表示為自4個供體匯集之平均值±SEM。斜體數字指示在雙邊t檢驗中將Siglec-9-Fc變異體與hIgG1同型對照相比較時p＜0.05。 實例 9 ： Siglec-9 減輕了 MDSC 介導之 T 細胞抑制
在人類MDSC-T細胞共同培養系統中評估了S9.1-hIgG1 (SEQ ID NO: 10)處理之作用。簡而言之，如實例7中所述生成了人類MDSC。使用RosetteSep™人類CD8+ T細胞富集混合物套組(StemCell)自血液分離出自體CD8+ T細胞。將MDSC用10 µg/ml S9.1-hIgG1或IgG對照在37℃及5% CO2 下處理48小時，接著與自體CD8+ T細胞在存在Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28之情況下以1:2:2 MDSC:T細胞:Dynabeads®之比率共同培養。在一些條件下，將僅與CD3/CD28 Dynabeads®孵育之CD8+ T細胞用S9.1-hIgG1處理。將所有細胞條件在37℃及5% CO2 下培養4天，接著藉由ELISA (Thermo Fisher)定量培養上清液中之IFNγ。
如圖 4 中所示，S9.1-hIgG1 (圖4中稱為「S9-hIgG1」)強減輕了MDSC介導之T細胞抑制。S9.1-hIgG1亦對在存在CD3/CD28 Dynabeads®但不存在MDSC之情況下培養之CD8+ T細胞有影響。單獨培養之用S9.1-hIgG1處理之MDSC產生＜20 pg/ml IFNγ (資料未顯示)。顯示了平均值±SEM。這些研究顯示，儘管Siglec-9-Fc可在不存在MDSC之情況下增強T細胞活化，但其可在存在MDSC之情況下藉由減少髓樣細胞免疫抑制信號(例如，藉由阻斷髓樣細胞上Siglec配體之連接)來更有效地增強T細胞活化。 實例 10 ： Siglec-9-Fc 而非 Siglec 抗體減輕了 MDSC 介導之 T 細胞抑制
將S9.A-hIgG1 (SEQ ID NO: 40)減輕MDSC介導之T細胞抑制之能力直接與一組功能性抗Siglec抗體相比較。如實例9中所述製備MDSC及自體CD8+ T細胞以用於共同培養。將MDSC用15 µg/ml S9.A-hIgG1或誘導靶受體下調或阻斷同源配體結合的針對Siglec-3、Siglec-7或Siglec-9之抗體處理48小時，接著與CD8+ T細胞及CD3/CD28 Dynabeads®共同培養4天。藉由ELISA評估培養上清液中之IFNγ。
如圖 5 中所示，單獨或以組合形式之抗Siglec抗體不能與S9.A-hIgG1一樣有效地減輕MDSC介導之T細胞抑制。顯示了平均值±SEM。aS9-1及aS9-2為兩種不同的Siglec-9抗體。藉由將S9.A-hIgG1與三抗體組合條件相比較來確定p值。此研究提供了圖15中所示之協同結合機制之進一步證據。Siglec-9-Fc能夠達成此機制，而包括抗Siglec-9抗體在內之抗Siglec抗體不能。此外，獲得了可商購獲得之人類Siglec-9-Fc融合蛋白(R&D Systems目錄號1139-SL-050，「Recombinant Human Siglec-9 Fc Chimera Protein, CF」，www.rndsystems.com)且在上文檢定中進行測試。其未顯示任何顯著活性(資料未顯示)。 實例 11 ：具有完整 FcR 結合之 Siglec-9-Fc 有效減輕 MDSC 介導之 T 細胞抑制
在人類MDSC-T細胞共同培養系統中，將S9.1-hIgG1 (SEQ ID NO: 10)之效力與S9.A-hIgG1 LALAPS (SEQ ID NO: 42)相比較。如實例9中所述製備了MDSC及自體CD8+ T細胞以用於共同培養。將MDSC用指示量S9.1-hIgG1、S9.A-hIgG1 LALAPS或同型對照處理48小時，接著與CD8+ T細胞及CD3/CD28 Dynabeads®共同培養4天。藉由ELISA評估培養上清液中之IFNγ。
如圖 6 中所示，與LALAPS變異體相比，具有完整FcR連接的S9.1-hIgG1在減輕MDSC介導之T細胞抑制方面有效得多。此檢定中S9.1-hIgG1之EC50經計算為17.5 nM，其在表 3 中所述之MDSC上FACS Kd之範圍內。此外，這些結果與表 4 中之資料一致，其顯示與具有LALAPS突變之Siglec-9-Fc變異體相比，具有完整FcR連接之Siglec-9-Fc在再極化MDSC方面更有效，如藉由趨化介素產生所量測。 實例 12 ： Siglec-9-hIgG1 及 Siglec-9-hIgG1 NSLF 等效地以劑量依賴性方式再極化 MDSC
評估了在融合蛋白之Fc部分中含有NSLF突變之Siglec-9-Fc之變異體再極化人類MDSC之能力。NSLF突變破壞了人類IgG1 Fc與人類C1q (補體組分1q)與人類CD16/FcRIII之間的相互作用，其誘導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。如先前所述，自CD14+單核球生成MDSC。在第7天，將MDSC用指示量S9.A-hIgG1 (SEQ ID NO: 40)或S9.A-hIgG1 NSLF (SEQ ID NO: 41)在37℃及5% CO2 下處理48小時。收穫上清液，且使用LEGENDplex™人類促發炎趨化介素組套組(Human Proinflammatory Chemokine Panel kit)(Biolegend)分析分泌之趨化介素。
圖 7 顯示S9.A-hIgG1及S9.A-hIgG1 NSLF等效地再極化MDSC，如藉由代表性趨化介素CCL5及CCL17之類似增加所證明。這些研究顯示，補體固定及ADCC不為Siglec-9-Fc活性所需的。此外，使用含有NSLF之hIgG1達成對髓樣細胞之所要作用的能力減少了可能以其他方式由補體活化及ADCC引起之有害作用的機會。 實例 13 ： Siglec-9-hIgG1 及 Siglec-9-hIgG1 NSLF 在 MDSC 中增加 CD86 表現且減少 CD163 表現。
如先前所述，自CD14+單核球生成人類MDSC。在第7天，將MDSC用指示量S9.A-hIgG1 (SEQ ID NO: 40)或S9.A-hIgG1 NSLF (SEQ ID NO: 41)在37℃及5% CO2 下處理48小時，之後使用抗CD86抗體(殖株IT2.2, Biolegend)及抗CD163抗體(殖株GHI/61, BD)定量促發炎標誌物CD86及M2巨噬細胞標誌物CD163之表現。
如圖 8 中所示，用S9.A-hIgG1或S9.A-hIgG1 NSLF進行之處理導致CD86之劑量依賴性增加及CD163之減少，這與MDSC向促發炎表現型(例如，M2免疫抑制表現型向M1活化表現型)之再極化一致。顯示了平均值±SEM。 實例 14 ： Siglec-9-hIgG1 及 Siglec-9-hIgG1 NSLF 在人源化小鼠中體內再極化腫瘤巨噬細胞。
使用人源化小鼠模型評估了體內Siglec-9-Fc治療之效果。將表現人類IL-3及GM-CSF轉殖基因的免疫缺陷HuNOG-EXL小鼠植入人類CD34+造血前驅細胞(Taconic)以有效重建人類免疫反應。將小鼠皮下植入3×106 個A375人類黑色素瘤細胞。16天之後，當腫瘤為大約300 mm3 時，將小鼠以10 mg/kg S9.1-hIgG1 (SEQ ID NO: 10)、S9.A-hIgG1 NSLF (SEQ ID NO: 41)或hIgG1同型對照之腹膜內(i.p.)注射治療兩次，間隔3天。第2劑之後24小時分析組織。
如圖 9A 至圖 9C 中所示，用S9.1-hIgG1或S9.A-hIgG1 NSLF進行之體內治療確認了以人類MDSC觀察之體外結果。與同型對照相比，在Siglec-9-Fc治療之小鼠之腫瘤中，M2樣CD14+CD163+巨噬細胞相對於人類CD45+細胞之百分比減小。參見 圖 9A 。(在圖 9A 中所示之實驗中，S9.1-hIgG1產生與S9.A-hIgG1 NSLF相比更穩健的體內作用；然而，在重複實驗(資料未顯示)中，S9.A-hIgG1 NSLF產生與S9.1-hIgG1相比更穩健的體內作用。)在用Siglec-9-Fc治療之小鼠之腫瘤中藉由表面標記物CD206鑑定之M2巨噬細胞亦減少。參見 圖9B。此外，腫瘤中CD14+巨噬細胞上CD206之表面表現減少。參見 圖9C。關於圖 9B 及圖 9C ，S9.1-hIgG1產生與S9.A-hIgG1 NSLF相比更穩健的體內作用。圖 9 之各圖中顯示平均值。 實例 15 ： Siglec-9-Fc 在人源化小鼠中不導致體內血細胞消耗
亦用標準全血計數評估了用S9.1-hIgG1或S9.A-hIgG1 NSLF治療之荷瘤HuNOG-EXL小鼠之血細胞消耗。在組織收穫當天(第二個10 mg/kg劑量之後24小時)，經由心臟穿刺收集血液且放置於含有肝素之採血管中。
圖 10 顯示與同型對照相比，S9.1-hIgG1及S9.A-hIgG1 NSLF均不導致血細胞組成之顯著變化。(顯示平均值。)儘管S9-hIgG1連接CD16/FcRIII且因此能夠誘導ADCC，但意外的是，未觀察到主要血細胞類型之消耗。 實例 16 ：在 MC38 腫瘤生長之情況下， Siglec-3/7/9 BAC 基因轉殖小鼠對抗 PD-L1 治療的反應較小。
創建了表現人類Siglec-3、Siglec-7及Siglec-9之細菌人工染色體(BAC)基因轉殖C57BL/6小鼠，且在這些小鼠中評估了MC38同基因腫瘤生長。將S3/7/9 BAC小鼠皮下植入MC38細胞(鼠結腸腺癌細胞株)，且一旦腫瘤達到平均100 mm3 ，每週用3 mg/kg抗PD-L1抗體(BM1) i.p.治療小鼠2次，達3週。
如圖 11 中所示，與WT對照相比，S3/7/9 BAC小鼠對抗PD-L1治療的反應較小。顯示了平均值±SEM。這些結果顯示，阻斷Siglec蛋白功能可改良對抑制PD-1或PD-L1之治療(諸如抗PD-1或抗PD-L1抗體療法)的反應。 實例 17 ： Siglec-9-Fc 單一療法延遲了 MC38 腫瘤生長。
產生了Siglec-9-mIgG2a (S9.B-mIgG2a；SEQ ID NO: 44)以分析具有可最大化Fc-FcR相互作用的Fc之小鼠同源腫瘤模型中Siglec-9-Fc之作用。將S3/7/9 BAC小鼠皮下植入MC38細胞。一旦腫瘤達到平均100 mm3 ，每週用10 mg/kg S9.B-mIgG2a i.p.治療小鼠2次，達3週。
如圖 12 中所示，與同型對照相比，S9.B-mIgG2a延遲了MC38腫瘤生長，在植入之後第22天，有20%腫瘤生長抑制。顯示了平均值±SEM。 實例 18 ： Siglec-9-Fc 與抗 PD-L1 組合以減少 MC38 腫瘤生長。
將S3/7/9 BAC小鼠皮下植入MC38細胞。一旦腫瘤達到平均100 mm3 ，每週用10 mg/kg S9.B-mIgG2a及3 mg/kg抗PD-L1抗體i.p.治療小鼠2次，達3週。
如圖 13 中所示，與單獨抗PD-L1 抗體治療相比，Siglec-9-Fc與抗PD-L1抗體之組合將MC38腫瘤生長減少至較大程度。在植入後第20天，與抗PD-L1抗體單一療法相比，達成了41%腫瘤生長抑制。顯示了平均值±SEM。這些研究顯示，Siglec-9-Fc與PD-1或PD-L1抑制劑(諸如抗PD-1或抗PD-L1抗體)組合可改良抗腫瘤反應。 實例 19 ： Siglec-9-Fc 可阻斷多個 Siglec 家族成員之細胞結合
如先前所述，自CD14+單核球生成人類MDSC。在第7天，首先將MDSC與滴定量S9.1-hIgG1在黑暗中於冰上孵育20分鐘，接著與指示為小鼠IgG1融合蛋白之Siglec家族成員在黑暗中於冰上再孵育2小時。用螢光綴合之抗小鼠IgG (Jackson Immunoresearch)偵測結合且藉由流動式細胞測量術進行分析。將各Siglec家族成員之細胞結合正規化至非阻斷對照(未添加S9.1-hIgG1)。
如圖 14 中所示，S9.1-hIgG1阻斷Siglec-3、Siglec-5、Siglec-7、Siglec-9及Siglec-10與MDSC表面之結合。這些研究顯示，Siglec-9-Fc在作為多種Siglec蛋白之活性之有效抑制劑方面為有利的。
使用S.9A-mIgG1及其他Siglec蛋白-mIgG1 Fc域融合物進行了與實例13及14中所述的實驗類似的再極化實驗。如圖 16A 及圖 16B 中所示，與其他Siglec-Fc融合物相比，Siglec-9-Fc獨特地再極化MDSC。CD40及CD86標誌物增加，且CD163及CD206減少，指示MDSC向促發炎性更強的表現型之再極化。 實例 20 ： Siglec-9-Fc 變異體之穩定性、結合親和力、功能及藥物動力學性質之分析。
用蛋白熱轉移檢定(protein thermal shift assay)及在40℃下的延長孵育評估了Siglec-9-Fc變異體之穩定性。對於熱轉移檢定，使用即時PCR儀確定熔解溫度。如實例2中所述，藉由流動式細胞測量術量測A375人類黑色素瘤細胞上Siglec-9-Fc變異體之結合親和力。如實例9中所述，在MDSC-T細胞共同培養檢定中將生物功能評估為減輕MDSC介導之抑制之能力。在體外使用具有Matrigel盤之細胞外基質結合檢定，或在體內以小鼠中之標準PK評估來評估藥物動力學(PK)性質。 實例 21 ：用 Siglec-9-Fc 治療之後人源化小鼠中藥效學標誌物之評估。
如實例14中所述生成人源化小鼠。將這些小鼠皮下植入3×106 個A375人類黑色素瘤細胞。2-3週之後，當腫瘤為大約300 mm3 時，將小鼠以10 mg/kg Siglec-9-Fc或hIgG1同型對照之i.p.注射治療兩次，間隔3天。第2劑之後24小時分析組織。使用LEGENDplex (Biolegend)細胞介素及趨化介素組套組或標準三明治ELISA評估血清中之藥效學(PD)效果。分別地，使用人類CD45 MicroBeads (Miltenyi)分離出脾及腫瘤中之人類CD45+細胞，且使用Nanostring髓樣先天免疫性組生成轉錄表現輪廓。 實例 22 ：同基因腫瘤模型研究中 Siglec-9-Fc 與抗 PD-L1 或抗 TRP1 之組協同用之分析。
將同基因腫瘤細胞株靜脈內注射或皮下植入S3/7/9 BAC小鼠中。在皮下情境中，一旦腫瘤達到平均100 mm3 ，每週用單獨或與3 mg/kg抗PD-L1抗體組合之10 mg/kg Siglec-9-Fc i.p.治療小鼠2次，達3週。用卡尺每週量測腫瘤生長2-3次。實驗終點為50天或當腫瘤達到2000 mm3 時。腫瘤生長減少、存活率增加、腫瘤中T細胞流入較大以及腫瘤巨噬細胞上CD163或CD206減少為Siglec-9-Fc之抗癌作用之一些指標。
在靜脈內情境中，經由尾部靜脈注射B16F10小鼠黑色素瘤細胞。植入之後24小時，用抗TRP1抗體治療小鼠，該抗體識別B16F10細胞上高表現之腫瘤抗原且經由抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)導致腫瘤細胞死亡。亦用單獨或與抗TRP1抗體組合之Siglec-9-Fc i.p.治療小鼠，每週兩次，直至研究結束。典型的研究持續時間大約為2週。在研究結束時，收穫小鼠之肺，且對腫瘤結節進行技術。腫瘤結節之減少將指示用Siglec-9-Fc治療之抗癌作用。 實例 23 ： Siglec-9-Fc 對巨噬細胞表面標誌物之作用
CNS中及周邊器官中之髓樣細胞之表現型及功能為固有可塑性的。這可藉由體外巨噬細胞來建模，該等巨噬細胞可分為M1及M2型巨噬細胞，顯示不同的吞噬及發炎潛能、表現型及活性。在周邊器官中，與M1表現型有關之巨噬細胞被認為更具有促發炎性及抗微生物性，而M2樣巨噬細胞更具有體內穩定性及抗發炎性。在CNS內，體內穩定狀況下的微膠細胞亦表現M2標誌物，諸如CD200R、CD163，表明此細胞型中之調控功能。
如下文檢查Siglec-9-Fc對各種M1及M2巨噬細胞表面標誌物之作用。在完整RPMI1640中用Siglec-9-Fc (例如，10 μg/ml)治療人類初級巨噬細胞達48小時。然後收穫細胞並使用特異於M1標誌物(諸如CD16、II類MHC、CD86)、M2標誌物(諸如CD200R、Dectin-1、CD163)及全巨噬細胞標記物包括CD14等進行流動式細胞測量術。 實例 24 ：腫瘤細胞上之唾液酸表現
藉由免疫組織化學評估各種腫瘤類型Fc上唾液酸之表現。用0.1 µg/ml S9.A-mIgG1對含有腎上腺癌、膀胱癌、乳癌、骨癌、腦癌、食道癌、胃癌、小腸癌、結腸癌、直腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰臟癌、***癌、皮膚癌、睪丸癌、甲狀腺癌及子宮癌之腫瘤多陣列(Pantomics)進行染色且藉由比色偵測來可視化。如圖 17 中所示，基於染色強度及盛行率對腫瘤樣品進行定性評分(1+低強度及/或盛行率，2+中等強度或盛行率且3+高強度或盛行率)。表5中概述了多種腫瘤類型中之評分。表 5 ：各種人類癌症中之唾液酸染色強度
器官部位 染色強度 器官部位 染色強度
腎上腺癌 3 肝癌 2+至3+
膀胱癌 2+至3+ 肺癌 2+至3+
乳癌 2+至3+ 淋巴瘤 2+至3+
骨癌 2+ 頭頸癌 1+至2+
腦癌 2+至3+ 卵巢癌 2+至3+
食道癌 2+ 胰臟癌 2+
胃癌 2+ ***癌 2+至3+
小腸癌 2+ 皮膚癌 2+
結腸癌 2+ 睾丸癌 1+至2+
直腸癌 2+ 甲狀腺癌 2+
腎癌 2+ 子宮癌 2+
在所有腫瘤類型中均觀察到Siglec-9-Fc之結合，指示腫瘤樣品中存在表現唾液酸之細胞。因此，這些腫瘤類型可藉由Siglec-9-Fc靶向。達成2+或更大染色強度的腫瘤類型可顯示Siglec-9-Fc之更有效靶向。 實例 25 ： Siglec-9-Fc 變異體與腫瘤細胞之結合
使用與實例6 (結合)及實例13 (MDSC活性/標誌物表現)中所述類似的方法，使S9.1 Fc之變異體表現並測試其與腫瘤細胞之結合及MDSC上之功能活性。亦使用粒徑篩析層析法測試變異體之單體含量，且用蛋白熱轉移檢定及在40℃下的延長孵育測試穩定性。對於熱轉移檢定，使用即時PCR確定熔解溫度。
資料概述於圖 18 中。如藉由CD86之誘導或CD163之下調所量測，S9.1 Fc之變異體顯示與A375腫瘤細胞之結合降低及MDSC上功能活性降低。相關分析顯示與腫瘤細胞之結合與CD86之誘導直接相關(圖 19A )。觀察到CD163之類似趨勢(資料未顯示)。S9.1 Fc之變異體通常對蛋白之生產產量及穩定性具有中性或積極影響。然後，產量或熱穩定性之增加與與腫瘤細胞之結合呈負相關(圖 19B 、圖 19C )。這些資料表明，某些S9.1 Fc變異體改良了表現或蛋白穩定性，但降低了藥理效力。 實例 26 ： Siglec-9-Fc 在靜脈內轉移性腫瘤模型中減少肺結節
為了分析靜脈內腫瘤情境中Siglec-9-mIgG2a之作用，經由尾部靜脈將B16F10小鼠黑色素瘤細胞注射至S3/7/9 BAC或WT小鼠中。植入之後24小時，用27 µg抗TRP1治療所有小鼠，該抗體識別B16F10細胞上高表現之腫瘤抗原且經由抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)導致腫瘤細胞死亡。此外，從植入之後24小時開始，用10 mg/kg S9.B-mIgG2a或mIgG2a同型對照i.p.治療小鼠，每3天一次，直至研究結束。植入之後15天，收穫小鼠肺並對腫瘤結節進行計數。
如圖 20 中所述，與用同型對照治療之S3/7/9 BAC小鼠相比，用S9.B-mIgG2a (S9-Fc)治療之S3/7/9 BAC小鼠之肺結節顯著減少。顯示了平均值。**p ＜0.01，雙邊t檢驗。這些結果表明，Siglec-9-Fc在治療轉移性愛中方面可為有效的。此外，結果亦表明Siglec-9-Fc增強抗TRP1之ADCC及/或ADCP活性。 實例 27 ： Siglec-9-Fc 單一療法顯著抑制 E0771 腫瘤生長。
在E0771同基因乳癌模型中測試了Siglec-9-Fc減少實性瘤生長之能力。此腫瘤模型之髓樣細胞含量相對豐富。將S3/7/9 BAC小鼠皮下植入E0771細胞。一旦腫瘤達到平均100 mm3 ，每週用20 mg/kg S9.B-mIgG2a或同型對照i.p.治療小鼠2次，達3週。
如圖 21 中所示，與同型對照相比，S9.B-mIgG2a單一療法抑制腫瘤生長。顯示了平均值±SEM。*p ＜0.05，在所示之所有時間點進行之雙邊t檢驗。這些資料指示，Siglec-9-Fc在治療存在髓樣細胞的腫瘤方面具有功效。 實例 28 ： Siglec-9-hIgG1 NSLF 展示唾液酸與 Fcγ 受體之間的協同結合
為了確定Fcγ受體連接對Siglec-9-Fc之結合之作用，測試了S9-hIgG1 NSLF (SEQ ID NO: 48，具有在產生期間裂解之訊息序列)及S9.A-hIgG1 LALAPS (SEQ ID NO: 42，具有在產生期間裂解之訊息序列)與MDSC之結合。如先前所述生成MDSC，且將其與滴定量S9-hIgG1 NSLF在黑暗中於冰上孵育2小時，接著與螢光綴合之抗小鼠IgG (Jackson Immunoresearch)孵育30分鐘。藉由用BD FACS Canto之流動式細胞測量術評估了結合，並使用FlowJo™軟體進行分析。如圖 22 中所示，S9-hIgG1 NSLF之MDSC上之計算FACS Kd在低nM範圍內(圖 22A )，且在S9.A-hIgG1 LALAPS之情況下，弱約75倍(圖 22B )。S9.A-hIgG1 LALAPS之計算FACS Kd更類似於先前針對不表現Fcγ受體之參考癌細胞株A549上之S9.A-hIgG1 (SEQ ID NO: 40)所計算之FACS Kd (圖 22C )。這些研究顯示當Fc-Fcγ受體結合完整時Siglec-9-Fc以較高親和力與人類初級髓樣細胞結合且提供了協同結合機制之額外證據。 實例 29 ： Siglec-9-Fc 顯示唾液酸部分之廣泛結合
為了評估若干Siglec與不同唾液酸聚醣之結合，用R&D systems之Siglec-3-Fc、Siglec-5-Fc、Siglec-7-Fc、Siglec-10-Fc及Siglec-15-Fc；Siglec-9-hIgG1 (SEQ ID NO:40，具有在產生期間裂解的訊息序列)；或同型對照染色包括含有唾液酸及不存在唾液酸之聚醣在內的由300種不同聚醣部分組成之聚醣陣列。使用螢光標記之抗人類抗體評估結合。資料未經正規化，且計算正規化之螢光值。含有唾液酸之聚醣亞組之染色顯示於圖 23 。Siglec-9-hIgG1顯示出與許多但非所有類型的唾液酸部分之穩健結合。Siglec-3-Fc、Siglec-5-Fc、Siglec-7-Fc、Siglec-10-Fc及Siglec-15-Fc之結合通常受到更多限制。Siglec-9-hIgG1與所有Siglec 10及15配體、大部分Siglec 3及7配體以及約一半Siglec 5配體結合。這些結果顯示，與其他Siglec-Fc構築體相比，Siglec-9-hIgG1為多種不同Siglec配體之有效阻斷劑，且因此可在治療情境中具有優勢。 實例 30 ：與人類血液中之 Siglec-9-hIgG1 相比， Siglec-9-hIgG1 NSLF 顯示與先天免疫細胞之結合增強。
為了進一證明Siglec-9-Fc之協同結合可在全血中發生，評估了健康人類供體血液中Siglec-9-Fc之結合。將100 µl全血與Alexa 647綴合之S9-hIgG1 (SEQ NO. 48，具有在產生期間裂解的訊息序列)或S9-hIgG1 NSLF (SEQ NO. 45，具有在產生期間裂解的訊息序列)之連續稀釋液一起孵育。將紅血球(RBC)溶解且在BD Fortessa™獲得所有樣品。計算平均螢光強度(MFI)及相對於IgG之結合%。與S9-hIgG1相比，S9-hIgG1 NSLF顯示與血液單核球之結合增強(圖 24A )。這與S9-hIgG1 NSLF與FcγRIIa之親和力相較於野生型hIgG1之所要增加一致。在單核球上觀察到最高的S9-hIgG1 NSLF結合，在顆粒球、NK細胞及B細胞上觀察到較低的結合度，且與T細胞及血小板之結合最小(圖 24B )。這些資料表明，在存在血清免疫球蛋白之情況下，Siglec-9-Fc與免疫細胞(具體而言，與單核球、顆粒球及NK細胞)結合。 實例 31 ： Siglec-9-hIgG1 NSLF 恢復 T 細胞增殖
使用與實例10及圖5中所述類似的方法確定Siglec-9-hIgG1 NSLF (SEQ ID NO:45，具有在產生期間裂解的訊息序列)之作用。藉由用GM-CSF及IL-6培養5-6天來自人類單核球生成MDSC。收穫MDSC，並在存在抗CD3及抗CD28抗體及Siglec-9-hIgG1 NSLF或對照IgG之情況下與自體CD8+ T細胞共同培養。3-5天之後評估T細胞增殖。如圖 25A 中所示，MDSC之存在抑制了T細胞增殖，其藉由Siglec-9-hIgG1 NSLF來恢復。如圖 25B 中所示，評估了劑量反應方面Siglec-9-hIgG1 NSLF之效力。在恢復T細胞增殖方面觀察到一位數nM EC50 (約1-2nM)。 實例 32 ：與 Siglec-9-hIgG1 相比， Siglec-9-hIgG1 NSLF 顯示效力增加
將Siglec-9-hIgG1 NSLF (SEQ ID NO:45，具有在產生期間裂解的訊息序列)直接與實例10中所述之MDSC T細胞檢定中之Siglec-9-hIgG1 (SEQ NO. 48，具有在產生期間裂解的訊息序列)相比較。如圖 26 中所示，與Siglec-9-hIgG1相比，Siglec-9-hIgG1 NSLF顯示效力增強，約10倍。合起來看，這些資料證明在減輕髓樣T細胞抑制方面Siglec-9-hIgG1 NSLF之有效作用。 實例 33 ： Siglec-9-hIgG1 NSLF 誘導與再極化一致的細胞介素表現
藉由RNAseq分析MDSC上不同細胞介素、趨化介素及共刺激分子藉由Siglec-9-hIgG1 NSLF (SEQ NO. 45，具有在產生期間裂解的訊息序列)之誘導。如圖 27 中所示，當與MDSC一起孵育時，Siglec-9-hIgG1 NSLF誘導穩健的基因表現輪廓，且此輪廓與再極化一致。以巨噬細胞及樹突細胞細胞亦觀察到類似輪廓(資料未顯示)。 實例 34 ：與其他檢查點途徑相比， Siglec-9-hIgG1 NSLF 更好地再極化抑制性髓樣細胞
針對再極化一致性髓樣細胞之能力，將Siglec-9-hIgG1 NSLF (SEQ NO. 45，具有在產生期間裂解的訊息序列)直接與靶向其他免疫檢查點途徑之抗體相比較。如圖 28 中所示，與那些抗體相比，Siglec-9-hIgG1 NSLF在再極化MDSC方面高度有效。抗Siglec-15、抗LILRB2及抗PD-L1不能誘導MDSC表面之CD86上調或CD206下調至Siglec-9-hIgG1 NSLF之程度。這些結果證明瞭Siglec-9-hIgG1 NSLF成為高效療法之潛力，可能比檢查點抑制劑更有效。 實例 35 ： Siglec-9-Fc 與抗 PD-L1 組合以減少 E0771 腫瘤生長
使用實例27中所述之方法，確定Siglec-9-Fc與抗PD-L1組合之作用。將S3/7/9 BAC小鼠皮下植入E0771細胞。一旦腫瘤達到平均100 mm3 ，每週用20 mg/kg S9.B-mIgG2a及10 mg/kg抗PD-L1抗體i.p.治療小鼠2次，達3週。如圖 29 中所示，與單獨Siglec-9-Fc或抗PD-L1治療相比，Siglec-9-Fc與抗PD-L1抗體之組合將E0771腫瘤生長減少至較大程度。在植入後第25天，與Siglec-9-Fc單一療法相比，達成了58%腫瘤生長抑制。顯示了平均值±SEM。這些研究顯示，Siglec-9-Fc與PD-1或PD-L1抑制劑(諸如抗PD-1或抗PD-L1抗體)組合可改良抗腫瘤反應。 實施例 36 ： Siglec-9-Fc 之潛在藥效學標誌物
為了說明作用機制並鑑定反應之藥效學(PD)標誌物，進行免疫監測研究。將小鼠與E0771腫瘤細胞一起孵育，以100 mm3 之平均體積隨機成2群且每3-4天用S9.B-mIgG2a (SEQ ID NO. 44，具有在產生期間裂解的訊息序列)或同型對照給藥3次。最後一劑之後24小時，對小鼠進行安樂死，且收穫脾及腫瘤以供流動式細胞測量分析。CD11b為髓樣細胞功能之多效性調控劑，包括調控黏附、遷移、吞噬作用及細胞活化。S9.B-mIgG2誘導脾髓樣細胞上CD11b及CD86表現之顯著增加(圖 30 )。脾髓樣細胞中之這些變化與在人類MDSC中觀察之變化一致，且表示Siglec-9-Fc之潛在藥效學標誌物。 實例 37 ： IgV 域之內及之外另外的 Siglec-9 變異體
製備了另外的Siglec-9-Fc變異體，其潛在地改良諸如穩定性及/或PK之性質。製成之某些變異體顯示於圖 31 中，且所有考慮之變異體均包括在以下序列表中。在命名為S9.32-S9.38之變異體中，IgV域中非所要疏水區塊中之單個色胺酸(W38)經疏水性較小的殘基取代。命名為S9.39及S9.41-S9.45之變異體在IgV域中含有額外取代，以潛在地進一步減小非所要疏水區塊之作用。命名為S9.47-S9.53之變異體在IgV域之外含有取代，以潛在地賦予穩定性。如圖 31 中所示，測試了某些變異體之某些性質。此外，在與實例13中所述之檢定類似的檢定中測試了某些變異體，以檢查對MDSC中再極化標誌物之作用。如圖 32 中所示，變異體S9.36、S9.37及S9.38表現得與Siglec-9-Fc-hIgG1相當，顯示CD163減少(圖 32A )及CD206減少(圖 32B )以及CD86增加(圖 32C )。 實例 38 ：改良 FcRn 結合及半衰期之 Fc 變異體
在Siglec-9-hIgG1 NSLF (SEQ ID NO:45)之Fc區中進行另外的取代及變異以潛在地改良其半衰期。預測，當Siglec-9-hIgG1 NSLF在體內由細胞吸收時，在胞內體之酸性環境中，Siglec-9-hIgG1 NSLF之Fc區由新生Fc受體(FcRn)結合。由於此結合，Siglec-9-hIgG1 NSLF被引導回細胞表面且在生理pH條件下釋放至細胞外環境中，而不是在酸性胞內體內降解。藉由內化之後將Siglec-9-hIgG1 NSLF「回收」至細胞外環境中，此過程可增加循環中Siglec-9-hIgG1 NSLF之量，從而導致半衰期改良。這繼而可實現較低劑量或較小給藥頻率。
據此，在Siglec-9-hIgG1 NSLF (SEQ ID NO:45)之Fc區中進行取代及變異，以改良其在體外與FcRn之結合，且因此潛在地改良其在體內回收的能力。那些取代及變異包括「YTE」及「LS」取代以及含有半胱胺酸之環圈***，如Dall’Acqua等人 (2002)J. Immunol. 169:5171-5180；Zalevsky等人 (2010)Nat. Biotechnol. 28:157-159；以及美國專利第9,688,756號中所述，其各自以引用之方式整體併入本文。所得經修飾之構築體之序列顯示於SEQ ID No: 228-230 (取代及變異藉由本文序列表中以雙下劃線表示之殘基指示)。針對例如經由表面電漿子共振而在體外與FcRn之結合改良對經修飾之構築體進行測試，然後檢查其體內PK及PD改良。亦考慮了以下經修飾之構築體，其在Fc中含有「YTE」或「LS」取代或含有半胱胺酸之環圈***，但不含有NSLF取代。這些構築體顯示於SEQ ID No: 231-233。 實例 39 ：與 Siglec-9-hIgG1 相比， Siglec-9-hIgG1 NSLF 之血清 PK 改良
比較了Siglec-9-hIgG1 NSLF (SEQ ID NO:45，具有在產生期間裂解的訊息序列) 及Siglec-9-hIgG1 (SEQ ID NO:48，具有在產生期間裂解的訊息序列)之藥物動力學性質。用單一劑80 mg/kg IV注射Siglec-9-hIgG1或Siglec-9-hIgG1 NSLF治療石蟹獼猴。確定石蟹獼猴血清中Siglec-9-hIgG1 及Siglec-9-hIgG1 NSLF之平均濃度-時間輪廓。圖 33 顯示Siglec-9-hIgG1 NSLF (方形)與Siglec-9-hIgG1  (圓形)相比PK改良。 實例 40 ： Siglec-9-Fc 變異體之藥物動力學性質
確定了如實例37中所述之某些Siglec-9-Fc變異體之藥物動力學性質。經由向Siglec 3/7/9 BAC基因轉殖小鼠IV彈丸注射，以單一投與之形式給予S9.1、S9.36、S9.37、S9.38及S9.45。如圖 34 中所示，S9.37顯示Cmax 及AUC0-inf 增加。儘管平均值T1/2 與其他變異體類似，但是與其他變異體相比，AUC之增加尤其可指示S9.37之暴露(生體利用率)改良。某些序列之表
在下表中，某些SEQ ID No中以粗體及下劃線表示之殘基顯示變異體Siglec-9 ECD序列表示與天然Siglec-9 ECD序列不同的殘基。SEQ ID No: 228-233中以雙下劃線表示之殘基顯示變異體Fc域殘基。在一些情況下，「描述」欄中具體Siglec-9變異體之名稱中所用之數字(例如S35X)可不與「序列」欄之SEQ ID No中殘基之編號匹配(例如，歸因於不存在或存在訊息序列)，如將以粗體及下劃線表示之經突變之殘基與其在以下SEQ ID NO內的位置相比較時可見。
SEQ ID NO 描述 序列
1 人類Siglec-9 (具有訊息序列)
Figure 02_image001
2 成熟人類Siglec-9
Figure 02_image003
3 連接子
Figure 02_image005
4 連接子
Figure 02_image007
5 ITIM模體
Figure 02_image009
6 SLAM樣模體
Figure 02_image011
7 人類Siglec-9 IgV域
Figure 02_image013
8 Siglec-7環圈
Figure 02_image015
9 Siglec-9環圈
Figure 02_image017
10 Siglec-9-Fc親代(WIYP)；S9.1-hIgG1(不具有訊息序列)
Figure 02_image019
Figure 02_image021
11 Siglec-9-Fc DIEG；S9.2-hIgG1
Figure 02_image023
12 Siglec-9-Fc SIET；S9.3-hIgG1
Figure 02_image025
13 Siglec-9-Fc SIEP；S9.4-hIgG1
Figure 02_image027
14 Siglec-9-Fc DIEP；S9.5-hIgG1
Figure 02_image029
Figure 02_image031
15 Siglec-9-Fc YQES；S9.6-hIgG1
Figure 02_image033
16 Siglec-9-Fc THET；S9.7-hIgG1
Figure 02_image035
17 Siglec-9-Fc L23T H26S H80Y L82E；S9.8-hIgG1   
Figure 02_image037
18 Siglec-9-Fc L23T H26T H80Y L82D；S9.9-hIgG1
Figure 02_image039
19 Siglec-9-Fc S35D W38T；S9.10-hIgG1
Figure 02_image041
20 Siglec-9-Fc S35D W38E；S9.11-hIgG1
Figure 02_image043
21 Siglec-9-Fc W38S I39H Y40H；S9.12-hIgG1   
Figure 02_image045
22 Siglec-9-Fc S35D W38Q I39H Y40E；S9.13-hIgG1   
Figure 02_image047
23 Siglec-9-Fc S35T W38Q I39H Y40E；S9.14-hIgG1   
Figure 02_image049
Figure 02_image051
24 Siglec-9-Fc S35D W38E I39T；S9.15-hIgG1   
Figure 02_image053
25 Siglec-9-Fc S35N W38E I39T；S9.16-hIgG1   
Figure 02_image055
26 Siglec-9-Fc S35H W38T I39T Y40T；S9.17-hIgG1   
Figure 02_image057
27 Siglec-9-Fc S35H W38S I39T Y40T；S9.18-hIgG1   
Figure 02_image059
Figure 02_image061
28 Siglec-9-Fc W38G I39T Y40E；S9.19-hIgG1   
Figure 02_image063
29 Siglec-9-Fc S8D K9Y L10T W116E；S9.20-hIgG1   
Figure 02_image065
30 Siglec-9-Fc S8D K9Y L10Q W116N；S9.21-hIgG1   
Figure 02_image067
31 Siglec-9-Fc S8E K9Y L10T W116E；S9.22-hIgG1   
Figure 02_image069
Figure 02_image071
32 Siglec-9-Fc WIYP至QTDS；S9.23-hIgG1   
Figure 02_image073
33 Siglec-9-Fc GWIYP至SQTDS；S9.24-hIgG1
Figure 02_image075
34 Siglec-9-Fc SHGWIYPG至VDSQTDSD；S9.25-hIgG1
Figure 02_image077
35 Siglec-9-Fc SHGWIYPG至VHGQIDSD；S9.26-hIgG1
Figure 02_image079
36 Siglec-9-Fc SHGWIYPG至VHSQIDSD；S9.27-hIgG1   
Figure 02_image081
37 Siglec-9-Fc SHGWIYPG至VDSQIDSD；S9.28-hIgG1   
Figure 02_image083
38 Siglec-9-Fc SHGWIYPG至SDSQIDSD；S9.29-hIgG1   
Figure 02_image085
39 Siglec-9-Fc SHGWIYPG至VDGQIDSD；S9.30-hIgG1
Figure 02_image087
40 S9.A-hIgG1 (訊息序列為胺基酸1-19；成熟序列為胺基酸20-586)
Figure 02_image089
Figure 02_image091
41 S9.A-hIgG1 NSLF (訊息序列為胺基酸1-19；成熟序列為胺基酸20-586)
Figure 02_image093
42 S9.A-hIgG1 LALAPS (訊息序列為胺基酸1-19；成熟序列為胺基酸20-586)
Figure 02_image095
43 S9.A-mIgG1 (訊息序列為胺基酸1-19；成熟序列為胺基酸20-576)
Figure 02_image097
44 S9.B-mIgG2a (訊息序列為胺基酸1-19；成熟序列為胺基酸20-587)
Figure 02_image099
Figure 02_image101
45 S9.1-hIgG1 NSLF
Figure 02_image103
46 S9.1-hIgG4 S228P
Figure 02_image105
47 S9.1-hIgG1 K322A
Figure 02_image107
48 訊息序列(SS)-Siglec-9-Fc親代(WIYP)；SS-S9.1-hIgG1
Figure 02_image109
Figure 02_image111
49 SS-Siglec-9-Fc DIEG；SS-S9.2-hIgG1
Figure 02_image113
50 SS-Siglec-9-Fc SIET；SS-S9.3-hIgG1
Figure 02_image115
51 SS-Siglec-9-Fc SIEP；SS-S9.4-hIgG1
Figure 02_image117
52 SS-Siglec-9-Fc DIEP；SS-S9.5-hIgG1
Figure 02_image119
Figure 02_image121
53 SS-Siglec-9-Fc YQES；SS-S9.6-hIgG1
Figure 02_image123
54 SS-Siglec-9-Fc THET；SS-S9.7-hIgG1
Figure 02_image125
55 SS-Siglec-9-Fc L23T H26S H80Y L82E；SS-S9.8-hIgG1   
Figure 02_image127
56 SS-Siglec-9-Fc L23T H26T H80Y L82D；SS-S9.9-hIgG1
Figure 02_image129
Figure 02_image131
57 SS-Siglec-9-Fc S35D W38T；SS-S9.10-hIgG1
Figure 02_image133
58 SS-Siglec-9-Fc S35D W38E；SS-S9.11-hIgG1
Figure 02_image135
59 SS-Siglec-9-Fc W38S I39H Y40H；SS-S9.12-hIgG1   
Figure 02_image137
60 SS-Siglec-9-Fc S35D W38Q I39H Y40E；SS-S9.13-hIgG1   
Figure 02_image139
Figure 02_image141
61 SS-Siglec-9-Fc S35T W38Q I39H Y40E；SS-S9.14-hIgG1   
Figure 02_image143
62 SS-Siglec-9-Fc S35D W38E I39T；SS-S9.15-hIgG1   
Figure 02_image145
63 SS-Siglec-9-Fc S35N W38E I39T；SS-S9.16-hIgG1   
Figure 02_image147
64 SS-Siglec-9-Fc S35H W38T I39T Y40T；SS-S9.17-hIgG1   
Figure 02_image149
Figure 02_image151
65 SS-Siglec-9-Fc S35H W38S I39T Y40T；SS-S9.18-hIgG1   
Figure 02_image153
66 SS-Siglec-9-Fc W38G I39T Y40E；SS-S9.19-hIgG1   
Figure 02_image155
67 SS-Siglec-9-Fc S8D K9Y L10T W116E；SS-S9.20-hIgG1   
Figure 02_image157
68 SS-Siglec-9-Fc S8D K9Y L10Q W116N；SS-S9.21-hIgG1   
Figure 02_image159
Figure 02_image161
69 SS-Siglec-9-Fc S8E K9Y L10T W116E；SS-S9.22-hIgG1   
Figure 02_image163
70 SS-Siglec-9-Fc WIYP至QTDS；SS-S9.23-hIgG1   
Figure 02_image165
71 SS-Siglec-9-Fc GWIYP至SQTDS；SS-S9.24-hIgG1   
Figure 02_image167
72 SS-Siglec-9-Fc SHGWIYPG至VDSQTDSD；SS-S9.25-hIgG1   
Figure 02_image169
Figure 02_image171
73 SS-Siglec-9-Fc SHGWIYPG至VHGQIDSD；SS-S9.26-hIgG1
Figure 02_image173
74 SS-Siglec-9-Fc SHGWIYPG至VHSQIDSD；SS-S9.27-hIgG1   
Figure 02_image175
75 SS-Siglec-9-Fc SHGWIYPG至VDSQIDSD；SS-S9.28-hIgG1   
Figure 02_image177
76 SS-Siglec-9-Fc SHGWIYPG至SDSQIDSD；SS-S9.29-hIgG1   
Figure 02_image179
Figure 02_image181
77 SS-Siglec-9-Fc SHGWIYPG至VDGQIDSD；SS-S9.30-hIgG1
Figure 02_image183
78 Siglec-9親代(WIYP)；S9.1(不具有訊息序列)
Figure 02_image185
79 Siglec-9 DIEG；S9.2
Figure 02_image187
80 Siglec-9 SIET；S9.3
Figure 02_image189
81 Siglec-9 SIEP；S9.4
Figure 02_image191
Figure 02_image193
82 Siglec-9 DIEP；S9.5
Figure 02_image195
83 Siglec-9 YQES；S9.6
Figure 02_image197
84 Siglec-9 THET；S9.7
Figure 02_image199
85 Siglec-9 L23T H26S H80Y L82E；S9.8   
Figure 02_image201
86 Siglec-9 L23T H26T H80Y L82D；S9.9
Figure 02_image203
87 Siglec-9 S35D W38T；S9.10
Figure 02_image205
88 Siglec-9 S35D W38E；S9.11
Figure 02_image207
Figure 02_image209
89 Siglec-9 W38S I39H Y40H；S9.12   
Figure 02_image211
90 Siglec-9 S35D W38Q I39H Y40E；S9.13   
Figure 02_image213
91 Siglec-9 S35T W38Q I39H Y40E；S9.14   
Figure 02_image215
92 Siglec-9 S35D W38E I39T；S9.15   
Figure 02_image217
93 Siglec-9 S35N W38E I39T；S9.16   
Figure 02_image219
94 Siglec-9 S35H W38T I39T Y40T；S9.17   
Figure 02_image221
95 Siglec-9 S35H W38S I39T Y40T；S9.18   
Figure 02_image223
96 Siglec-9 W38G I39T Y40E；S9.19   
Figure 02_image225
97 Siglec-9 S8D K9Y L10T W116E；S9.20   
Figure 02_image227
98 Siglec-9 S8D K9Y L10Q W116N；S9.21   
Figure 02_image229
99 Siglec-9 S8E K9Y L10T W116E；S9.22   
Figure 02_image231
100 Siglec-9 WIYP至QTDS；S9.23   
Figure 02_image233
101 Siglec-9 GWIYP至SQTDS；S9.24   
Figure 02_image235
Figure 02_image237
102 Siglec-9 SHGWIYPG至VDSQTDSD；S9.25   
Figure 02_image239
103 Siglec-9 SHGWIYPG至VHGQIDSD；S9.26
Figure 02_image241
104 Siglec-9 SHGWIYPG至VHSQIDSD；S9.27
Figure 02_image243
105 Siglec-9 SHGWIYPG至VDSQIDSD；S9.28
Figure 02_image245
106 Siglec-9 SHGWIYPG至SDSQIDSD；S9.29
Figure 02_image247
107 Siglec-9 SHGWIYPG至VDGQIDSD；S9.30
Figure 02_image249
108 Siglec-9親代(WIYP) IgV域；S9.1-IgV (不具有訊息序列)
Figure 02_image251
Figure 02_image253
109 Siglec-9 DIEG IgV域；S9.2-IgV
Figure 02_image255
110 Siglec-9 SIET IgV域；S9.3-IgV
Figure 02_image257
111 Siglec-9 SIEP IgV域；S9.4-IgV
Figure 02_image259
112 Siglec-9 DIEP IgV域；S9.5-IgV
Figure 02_image261
113 Siglec-9 YQES IgV域；S9.6-IgV
Figure 02_image263
114 Siglec-9 THET IgV域；S9.7-IgV
Figure 02_image265
115 Siglec-9 L23T H26S H80Y L82E IgV域；S9.8-IgV
Figure 02_image267
116 Siglec-9 L23T H26T H80Y L82D IgV域；S9.9-IgV
Figure 02_image269
117 Siglec-9 S35D W38T IgV域；S9.10-IgV
Figure 02_image271
118 Siglec-9 S35D W38E IgV域；S9.11-IgV
Figure 02_image273
119 Siglec-9 W38S I39H Y40H IgV域；S9.12-IgV
Figure 02_image275
120 Siglec-9 S35D W38Q I39H Y40E IgV域；S9.13-IgV
Figure 02_image277
121 Siglec-9 S35T W38Q I39H Y40E IgV域；S9.14-IgV
Figure 02_image279
122 Siglec-9 S35D W38E I39T IgV域；S9.15-IgV
Figure 02_image281
123 Siglec-9 S35N W38E I39T IgV域；S9.16-IgV
Figure 02_image283
124 Siglec-9 S35H W38T I39T Y40T IgV域；S9.17-IgV
Figure 02_image285
125 Siglec-9 S35H W38S I39T Y40T IgV域；S9.18-IgV
Figure 02_image287
126 Siglec-9 W38G I39T Y40E IgV域；S9.19-IgV
Figure 02_image289
127 Siglec-9 S8D K9Y L10T W116E IgV域；S9.20-IgV   
Figure 02_image291
128 Siglec-9 S8D K9Y L10Q W116N IgV域；S9.21-IgV
Figure 02_image293
129 Siglec-9 S8E K9Y L10T W116E IgV域；S9.22-IgV
Figure 02_image295
130 Siglec-9 WIYP至QTDS IgV域；S9.23-IgV
Figure 02_image297
131 Siglec-9 GWIYP至SQTDS IgV域；S9.24-IgV   
Figure 02_image299
132 Siglec-9 SHGWIYPG至VDSQTDSD IgV域；S9.25-IgV
Figure 02_image301
133 Siglec-9 SHGWIYPG至VHGQIDSD IgV域；S9.26-IgV
Figure 02_image303
134 Siglec-9 SHGWIYPG至VHSQIDSD IgV域；S9.27-IgV
Figure 02_image305
135 Siglec-9 SHGWIYPG至VDSQIDSD IgV域；S9.28-IgV
Figure 02_image307
136 Siglec-9 SHGWIYPG至SDSQIDSD IgV域；S9.29-IgV
Figure 02_image309
137 Siglec-9 SHGWIYPG至VDGQIDSD IgV域；S9.30-IgV
Figure 02_image311
Figure 02_image313
138 SSopt-S9.A ECD (具有最佳化之訊息序列)
Figure 02_image315
139 SSopt-S9.A ECD-hIgG1 (具有aa 1-19之最佳化之訊息序列及ECD與hIgG1 Fc域之間的連接子序列(加框) )
Figure 02_image317
140 天然訊息序列
Figure 02_image319
141 最佳化之訊息序列
Figure 02_image321
142 IgG1野生型
Figure 02_image323
143 IgG1 NSLF (N至S且L至F取代以下劃線表示)
Figure 02_image325
144 IgG1 K322A
Figure 02_image327
145 IgG4
Figure 02_image329
146 IgG4 S228P
Figure 02_image331
147 Siglec-9 ECD之膜近側區
Figure 02_image333
148 S9.32 - W38T - hIgGI
Figure 02_image335
149 S9.33 - W38E - hIgG1
Figure 02_image337
150 S9.34 - W38S - hIgG1
Figure 02_image339
151 S9.35 - W38A - hIgG1
Figure 02_image341
152 S9.36 - W38R - hIgG1
Figure 02_image343
Figure 02_image345
153 S9.37 - W38Q - hIgG1
Figure 02_image347
154 S9.38 - W38K - hIgG1
Figure 02_image349
155 S9.39 - W38S_Y40T - hIgG1
Figure 02_image351
156 S9.41 - L_ER_R - hIgG1
Figure 02_image353
157 S9.42 - D_SI_R - hIgG1
Figure 02_image355
158 S9.43 - L_KI_R - hIgG1
Figure 02_image357
159 S9.44 - T_EI_E - hIgG1
Figure 02_image359
160 S9.45 - S_QI_R - hIgG1
Figure 02_image361
161 S9.47 - R_SS_I_T - hIgG1
Figure 02_image363
Figure 02_image365
162 S9.48 - R_DS_I_T - hIgG1
Figure 02_image367
163 S9.49 - G_VT_Q_T - hIgG1
Figure 02_image369
164 S9.50 - N_TT_I_Q - hIgG1
Figure 02_image371
165 S9.51 - G_VK_I_E - hIgG1
Figure 02_image373
166 S9.52 - R_SS_Q_T - hIgG1
Figure 02_image375
Figure 02_image377
167 S9.53 - G_SK_Q_E - hIgG1
Figure 02_image379
168 S9.36 - W38R - hIgG1 NSLF
Figure 02_image381
169 S9.37 - W38Q - hIgG1 NSLF
Figure 02_image383
170 S9.38 - W38K - hIgG1 NSLF
Figure 02_image385
Figure 02_image387
171 S9.32 (SS) - W38T - hIgG1
Figure 02_image389
172 S9.33 (SS) - W38E - hIgG1
Figure 02_image391
173 S9.34 (SS) - W38S - hIgG1
Figure 02_image393
174 S9.35 (SS) - W38A - hIgG1
Figure 02_image395
175 S9.36 (SS) - W38R - hIgG1
Figure 02_image397
Figure 02_image399
176 S9.37 (SS) - W38Q - hIgG1
Figure 02_image401
177 S9.38 (SS) - W38K - hIgG1
Figure 02_image403
178 S9.39 (SS) - W38S_Y40T - hIgG1
Figure 02_image405
179 S9.41 (SS) - L_ER_R - hIgG1
Figure 02_image407
Figure 02_image409
180 S9.42 (SS) - D_SI_R - hIgG1
Figure 02_image411
181 S9.43 (SS) - L_KI_R - hIgG1
Figure 02_image413
182 S9.44 (SS) - T_EI_E - hIgG1
Figure 02_image415
183 S9.45 (SS) - S_QI_R - hIgG1
Figure 02_image417
Figure 02_image419
184 S9.47 (SS) - R_SS_I_T - hIgG1
Figure 02_image421
185 S9.48 (SS) - R_DS_I_T - hIgG1
Figure 02_image423
186 S9.49 (SS) - G_VT_Q_T - hIgG1
Figure 02_image425
187 S9.50 (SS) - N_TT_I_Q - hIgG1
Figure 02_image427
188 S9.51 (SS) - G_VK_I_E - hIgG1
Figure 02_image429
189 S9.52 (SS) - R_SS_Q_T - hIgG1
Figure 02_image431
190 S9.53 (SS) - G_SK_Q_E - hIgG1
Figure 02_image433
191 S9.36 (SS) - W38R - hIgG1 NSLF
Figure 02_image435
192 S9.37 (SS) - W38Q - hIgG1 NSLF
Figure 02_image437
Figure 02_image439
193 S9.38 (SS) - W38K - hIgG1 NSLF
Figure 02_image441
194 S9.32 (EC) - W38T
Figure 02_image443
195 S9.33 (EC) - W38E
Figure 02_image445
196 S9.34 (EC) - W38S
Figure 02_image447
197 S9.35 (EC) - W38A
Figure 02_image449
198 S9.36 (EC) - W38R
Figure 02_image451
Figure 02_image453
199 S9.37 (EC) - W38Q
Figure 02_image455
200 S9.38 (EC) - W38K
Figure 02_image457
201 S9.39 (EC) - W38S_Y40T
Figure 02_image459
202 S9.41 (EC) - L_ER_R
Figure 02_image461
203 S9.42 (EC) - D_SI_R
Figure 02_image463
204 S9.43 (EC) - L_KI_R
Figure 02_image465
205 S9.44 (EC) - T_EI_E
Figure 02_image467
206 S9.45 (EC) - S_QI_R
Figure 02_image469
207 S9.47 (EC) - R_SS_I_T
Figure 02_image471
208 S9.48 (EC) - R_DS_I_T
Figure 02_image473
209 S9.49 (EC) - G_VT_Q_T
Figure 02_image475
210 S9.50 (EC) - N_TT_I_Q
Figure 02_image477
211 S9.51 (EC) - G_VK_I_E
Figure 02_image479
212 S9.52 (EC) - R_SS_Q_T
Figure 02_image481
213 S9.53 (EC) - G_SK_Q_E
Figure 02_image483
Figure 02_image485
214 S9.32 (IgV) - W38T
Figure 02_image487
215 S9.33 (IgV) - W38E
Figure 02_image489
216 S9.34 (IgV) - W38S
Figure 02_image491
217 S9.35 (IgV) - W38A
Figure 02_image493
218 S9.36 (IgV) - W38R
Figure 02_image495
219 S9.37 (IgV) - W38Q
Figure 02_image497
220 S9.38 (IgV) - W38K
Figure 02_image499
221 S9.39 (IgV) - W38S_Y40T
Figure 02_image501
222 S9.41 (IgV) - L_ER_R
Figure 02_image503
223 S9.42 (IgV) - D_SI_R
Figure 02_image505
224 S9.43 (IgV) - L_KI_R
Figure 02_image507
225 S9.44 (IgV) - T_EI_E
Figure 02_image509
226 S9.45 (IgV) - S_QI_R   
Figure 02_image511
227 S9.1-hIgG1 NSLF (無SS)
Figure 02_image513
228 S9.1-hIgG1 NSLF YTE   
Figure 02_image515
Figure 02_image517
229 S9.1-hIgG1 NSLF LS   
Figure 02_image519
230 S9.1-hIgG1 NSLF LV5-112
Figure 02_image521
231 S9.1-hIgG1 YTE
Figure 02_image523
232 S9.1-hIgG1 LS
Figure 02_image525
Figure 02_image527
233 S9.1-hIgG1 LV5-112
Figure 02_image529
234 hIgG1 NSLF YTE
Figure 02_image531
235 hIgG1 NSLF LS
Figure 02_image533
236 hIgG1 NSLF LV5-112
Figure 02_image535
237 hIgG1 YTE
Figure 02_image537
238 hIgG1 LS
Figure 02_image539
239 hIgG1 LV5-112
Figure 02_image541
圖 1 顯示來自代表性非腺癌樣品之腫瘤浸潤T細胞、巨噬細胞及顆粒球上Siglec-9之表面表現。圖 2 顯示人類Siglec-9之胺基酸序列(SEQ ID NO: 1)。自N末端至C末端，訊息肽序列以粗體表示；IgV配體結合域以下劃線表示(其中保守之Arg以陰影粗體指示)；***序列以粗體且斜體表示(ALTHR；SEQ ID NO: 3)；C2 1型域以斜體表示；***序列以粗體且斜體表示(LNVSYP；SEQ ID NO: 4)且C2 2型域以下劃線且斜體表示。ITIM模體(LQYASL；SEQ ID NO: 5)及SLAM樣(TEYSEI；SEQ ID NO: 6)模體以下劃線且引用表示。預測跨膜域出現在SEQ ID NO: 1之胺基酸349-369。圖 3 顯示在pH 7.4、100 mM濃度NaCl及298 K下某些經工程改造之Siglec9-IgV變異體之電腦模擬計算性質，如實例5中所述。圖 4 顯示單獨或與接觸S9.1-hIgG1 (S9-hIgG1)之骨髓源性抑制細胞(MDSC)共同培養之T細胞之IFNγ表現，如實例9中所述。圖 5 顯示單獨或與接觸針對Siglec-3 (aS3)、Siglec-7 (aS7)、Siglec-9 (aS9-1及aS9-2)、aS3、aS7及aS9-2之組合或S9.1-hIgG1 (S9-hIgG1)之抗體之MDSC共同培養之T細胞之IFNγ表現，如實例10中所述。圖 6 顯示在存在遞增濃度S9.1-hIgG1 (S9-hIgG1)或S9.A-hIgG1 LALAPS (S9-hIgG1 LALAPS)之情況下與MDSC共同培養之T細胞之IFNγ表現，如實例11中所述。圖 7 顯示接觸S9.A-hIgG1 (S9-hIgG1)或S9.A-hIgG1 NSLF (S9-hIgG1 NSLF)之MDSC之CCL5 (頂部)及CCL17 (底部)表現，如實例12中所述。圖 8 顯示接觸S9.A-hIgG1 (S9-hIgG1)或S9.A-hIgG1 NSLF (S9-hIgG1 NSLF)之MDSC之CD86 (頂部)及CD163 (底部)表現，如實例13中所述。圖 9A 至圖 9C 顯示在用S9.1-hIgG1 (S9-IgG1)、S9.A-hIgG1 NSLF (S9-hIgG1 NSLF)或hIgG1同型對照處理之小鼠中，CD14+CD163+巨噬細胞相對於總CD45+細胞之百分比(9A)、CD14+CD206+巨噬細胞相對於總CD45+細胞之百分比(9B)以及CD14+巨噬細胞上CD206之表面表現(9C)，如實例14中所述。圖 10 顯示在用S9.1-hIgG1 (S9-hIgG1)、S9.A-hIgG1 NSLF (S9-hIgG1 NSLF)或hIgG1同型對照處理之小鼠中每微升血液之血小板、嗜中性球、淋巴球及單核球之數目，如實例15中所述。圖 11 顯示基因轉殖C57BL/6小鼠中之腫瘤生長，該小鼠表現人類Siglec-3、Siglec-7及Siglec-9 (S3/7/9 BAC)，植入了MC38細胞且用抗PD-L1抗體處理，如實例16中所述。圖 12 顯示基因轉殖C57BL/6小鼠中之腫瘤生長，該小鼠表現人類Siglec-3、Siglec-7及Siglec-9，植入了MC38細胞且用S9.B-mIgG2a (S9-mIgG2a)處理，如實例17中所述。圖 13 顯示基因轉殖C57BL/6小鼠中之腫瘤生長，該小鼠表現人類Siglec-3、Siglec-7及Siglec-9，植入了MC38細胞且用PD-L1抗體或S9.B-mIgG2a (S9-mIgG2a)與抗PD-L1抗體之組合處理，如實例18中所述。圖 14 顯示在存在遞增濃度S9.1-hIgG1之情況下包含Siglec-3 (S3-mIgG1)、Siglec-5 (S5-mIgG1)、Siglec-7 (S7-mIgG1)、Siglec-9 (S9-mIgG1)及Siglec-10 (S10-mIgG1)之細胞外域(ECD)之Fc融合物與MDSC表面之結合，如實例19中所述。圖 15 顯示Siglec-9-ECD-Fc融合分子(Siglec-9-Fc)之作用機制之示範性模型。Siglec-9-Fc通過其Siglec-9 ECD部分與癌細胞上之配體(唾液酸)結合(左圖)。基於本文中之研究，且不受理論束縛，據信，Siglec-9-Fc與髓樣細胞上表現之FcR (例如，FcγRIIA)及配體(唾液酸)結合(右圖)。結合經由協同結合(或順式)相互作用分別通過Siglec-9-Fc分子之Fc部分及Siglec-9 ECD部分而發生。因此，與不表現FcR之細胞相比，Siglec-9-Fc以較高親和力與髓樣細胞結合，導致體內優先靶向髓樣細胞以及髓樣細胞之活化。圖 16A 及圖 16B 顯示與其他Siglec-Fc融合物相比，S9.A-mIgG1 (S9-mIgG1)獨特地再極化MDSC，如實例19中所述。各組條形自坐至右為S3-mIgG1、S5-mIgG1、S7-mIgG1、S9-mIgG1、S10-mIgG1及mIgG1。圖 17 顯示藉由免疫組織化學(IHC)之腫瘤樣品上唾液酸表現之偵測。圖 18 顯示各種Siglec-9-Fc變異體與A375腫瘤細胞之結合及骨髓源性抑制細胞(MDSC)之再極化，如藉由CD86上調及CD163下調所量測。圖18亦顯示各變異體之生產產量及穩定性，如藉由熔解溫度及單體百分比所量測。圖 19A 至圖 19C 顯示針對各種Siglec-9-Fc變異體，MDSC檢定中CD86誘導相對於A375腫瘤細胞結合之間的相關性(19A)、生產產量與A375腫瘤細胞結合之間的相關性(19B)以及穩定性與A375腫瘤細胞結合之間的相關性(19C)。圖 20 顯示與靜脈內注射B16F10小鼠黑色素瘤細胞且用同型對照處理之S3/7/9 BAC小鼠相比，靜脈內注射B16F10小鼠黑色素瘤細胞且用S9.B-mIgG2a (S9-Fc)處理之S3/7/9 BAC小鼠中肺結節之減少。圖 21 顯示與同型對照相比，S9.B-mIgG2a單一療法抑制E0771同基因乳癌模型中之腫瘤生長。圖 22 顯示確定Fcγ受體連接對Siglec-9-Fc與骨髓源性抑制細胞(MDSC)之結合的作用的流動式細胞測量實驗之結果。圖 22A 顯示Siglec-9-hIgG1 (S9-hIgG1) NSLF (菱形)與MDSC之結合在低nM範圍內。圖 22B 顯示與Siglec-9-hIgG1 NSLF相比，Fc緘默的Siglec-9-hIgG1 LALAPS之結合弱約75倍。圖 22C 顯 示Siglec-9-hIgG1 (SEQ ID NO: 40)與不表現任何Fcγ受體之參考癌細胞株A549之結合。各圖中亦顯示同型對照之結合曲線(三角形)。圖 23 顯示含有唾液酸之聚醣暴露於各種Siglec Fc融合分子(包括Siglec-9-hIgG1)之結果。較深的陰影指示較大的結合度。如圖所示，Siglec-9-hIgG1分子與多種唾液酸分子結合，與其他Siglec融合分子相反。圖 24 比較了Siglec-9-hIgG1及Siglec-9-hIgG1 NSLF與血細胞之結合。圖 24A 基於平均螢光強度(MFI)比較了兩種分子與血液單核球之結合。圖 24B 顯示與若干血細胞型結合有關之MFI。圖 25 顯示了Siglec-9-hIgG1 NSLF對T細胞增殖之作用。圖 25A 顯示兩種供體樣品中抑制T細胞增殖之MDSC之存在，其在各樣品中藉由Siglec-9-hIgG1 NSLF而恢復。圖 25B 提供了在確定恢復T細胞增殖方面Siglec-9-hIgG1 NSLF之EC50之劑量反應曲線，其為約1-2 nM。圖 26 顯示當將Siglec-9-hIgG NSLF與MDSC及T細胞一起孵育時，在干擾素γ (IFN-g)之誘導方面，與Siglec-9-hIgG1相比，Siglec-9-hIgG1 NSLF像是效力增強，約10倍。圖 27 顯示，當與MDSC一起孵育時，Siglec-9-hIgG1 NSLF誘導穩健的基因表現輪廓，且此輪廓與噬菌體再極化一致。圖 28A 顯示與抗Siglec 15、抗PD-L1及抗LILRB2抗體相比，Siglec-9-hIgG1 NSLF導致M1極化之增加(CD86之上調)。圖 28B 顯示與抗Siglec 15、抗PD-L1及抗LILRB2抗體相比，Siglec-9-hIgG1 NSLF導致M2極化之降低(CD206之下調)。圖 29 顯示與同型對照或單獨Siglec-9-mIgG2a或抗PD-L1抗體相比，Siglec-9-mIgG2a與抗PD-L1抗體之組合使小鼠中植入之E0771乳腺腫瘤細胞生長降低至較大程度。圖 30 顯示Siglec-9-mIgG2a (向上的三角形)或同型對照(mIgG2a) (方形)對CD86 (圖 30A )或CD11b (圖 30B )自脾髓樣細胞表現的影響。圖 31 顯示某些額外Siglec-9-Fc變異體之性質。圖 32 顯示變異體S9.36、S9.37及S9.38表現得與Siglec-9-Fc-hIgG1 (黑色條，左起第二個)相當，顯示與同型對照(最左側的影線條)相比，CD163 (圖 32A )及CD206 (圖 32B )表現降低且CD86 (圖 32C )表現增加。圖 33 顯示石蟹獼猴血清中Sigled-9-hIgG1 (實心圓)及Siglec-9-hIgG1 NSLF (空心方形)之濃度-時間輪廓。圖 34 顯示向Siglec 3/7/9 BAC基因轉殖小鼠IV彈丸注射之後若干Siglec-9-Fc變異體之動力學輪廓。
應理解，本文所述之各種實施例之一種、一些或所有性質均可組合以形成本發明之其他實施例。本發明之這些及其他態樣對於熟習此項技術者將變得顯而易見。藉由以下實施方式進一步描述本發明之這些及其他實施例。
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Claims (97)

  1. 一種經分離之多肽，其包含有包含選自SEQ ID NO: 109-137及214-226中任一者之胺基酸序列之Siglec-9 IgV域。
  2. 如請求項1之經分離之多肽，其中該多肽包含有包含該Siglec-9 IgV域、C2 1型(C2T1)域及C2 2型(C2T2)域之Siglec-9細胞外域(ECD)。
  3. 如請求項1或請求項2之經分離之多肽，其中該多肽包含選自SEQ ID NO: 79-107及194-206中任一者之胺基酸序列。
  4. 如請求項1-3中任一項之經分離之多肽，其中該多肽進一步包含Fc域。
  5. 如請求項4之經分離之多肽，其中該Fc域定位於該多肽之C末端。
  6. 如請求項4或請求項5之經分離之多肽，其中該Fc域具有人類IgG1同型。
  7. 如請求項6之經分離之多肽，其中該Fc域具有人類IgG1同型，相對於IgG1多肽SEQ ID No: 142，其： a)      與FcγRIII之結合減少； b)      抗體依賴性細胞毒性(ADCC)降低及/或補體結合活性降低； c)      與FcγRIIa之結合增加；或 d)      a)、b)及/或c)之任何組合。
  8. 如請求項6或7之經分離之多肽，其中該Fc域包含選自SEQ ID NO: 142-144及234-239中任一者之胺基酸序列。
  9. 如請求項8之經分離之多肽，其中該Fc域包含胺基酸序列SEQ ID NO: 142或143。
  10. 如請求項6或7之經分離之多肽，其中該多肽包含選自SEQ ID NO: 11-39、148-160及168-170中任一者之胺基酸序列。
  11. 如請求項10之經分離之多肽，其中該多肽包含選自SEQ ID NO: 49-77、171-183及191-193中任一者之胺基酸序列。
  12. 一種多肽，其包含選自SEQ ID NO: 49-77及171-193中任一者之胺基酸序列，缺少其訊息肽。
  13. 如請求項4或請求項5之經分離之多肽，其中該Fc域具有人類IgG4同型。
  14. 如請求項13之經分離之多肽，其中該Fc域包含胺基酸序列SEQ ID NO: 145或146。
  15. 一種經分離之多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 138。
  16. 如請求項15之經分離之多肽，其中該多肽進一步包含Fc域。
  17. 如請求項16之經分離之多肽，其中該Fc域定位於該多肽之C末端。
  18. 如請求項17之經分離之多肽，其中該Fc域具有人類IgG1同型。
  19. 如請求項18之經分離之多肽，其包含連接子序列。
  20. 如請求項18或19之經分離之多肽，其中該Fc域包含選自SEQ ID NO: 142-144中任一者之胺基酸序列。
  21. 如請求項20之經分離之多肽，其中該Fc域包含胺基酸序列SEQ ID NO: 142或143。
  22. 如請求項19之經分離之多肽，其中該多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO: 139。
  23. 如請求項17之經分離之多肽，其中該Fc域具有人類IgG4同型。
  24. 如請求項23之經分離之多肽，其中該Fc域包含胺基酸序列SEQ ID NO: 145或146。
  25. 一種經分離之多肽SEQ ID NO: 78，其C末端連接至Fc域。
  26. 如請求項25之經分離之多肽，其中該Fc域具有人類IgG1或IgG4同型。
  27. 如請求項26之經分離之多肽，其中該Fc域具有人類IgG1同型，相對於IgG1多肽SEQ ID No: 142，其： a)      與FcγRIII之結合減少； b)      抗體依賴性細胞毒性(ADCC)降低及/或補體結合活性降低； c)      與FcγRIIa之結合增加；或 d)      a)、b)及/或c)之任何組合。
  28. 如請求項26或27之經分離之多肽，其中該Fc域具有人類IgG1同型且包含選自SEQ ID NO: 142-144及234-239中任一者之胺基酸序列。
  29. 如請求項26之經分離之多肽，其中該Fc域包含胺基酸序列SEQ ID NO: 142。
  30. 如請求項26之經分離之多肽，其中該多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO: 10。
  31. 如請求項26或27之經分離之多肽，其中該Fc域包含胺基酸序列SEQ ID NO: 143。
  32. 如請求項26之經分離之多肽，其中該多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO: 227。
  33. 如請求項26之經分離之多肽，其中該Fc域具有人類IgG4同型且包含胺基酸序列SEQ ID NO: 145或146。
  34. 如請求項25之經分離之多肽，其中該多肽包含選自SEQ ID NO: 45-48及228-233中任一者之胺基酸序列，缺少其相關訊息肽。
  35. 如請求項34之經分離之多肽，其中該多肽包含選自SEQ ID NO: 45-48及228-233中任一者之胺基酸序列。
  36. 如請求項34之經分離之多肽，其中該多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO: 45，缺少其相關訊息肽。
  37. 如請求項36之經分離之多肽，其中該多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO: 45。
  38. 如請求項34之經分離之多肽，其中該多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO: 48，缺少其相關訊息肽。
  39. 一種經分離之多肽，其包含選自SEQ ID NO: 207-213中任一者之胺基酸序列及定位於該多肽之C末端的Fc域。
  40. 如請求項39之經分離之多肽，其中該Fc域具有人類IgG1或IgG4同型。
  41. 如請求項40之經分離之多肽，其中該Fc域具有人類IgG1同型，相對於IgG1多肽SEQ ID No: 142，其： a)      與FcγRIII之結合減少； b)      抗體依賴性細胞毒性(ADCC)降低及/或補體結合活性降低； c)      與FcγRIIa之結合增加；或 d)      a)、b)及/或c)之任何組合。
  42. 如請求項40或41之經分離之多肽，其中該Fc域具有人類IgG1同型且包含選自SEQ ID NO: 142-144及234-239中任一者之胺基酸序列。
  43. 如請求項39之經分離之多肽，其包含選自SEQ ID NO: 161-167中任一者之胺基酸序列。
  44. 如請求項40之經分離之多肽，其包含選自SEQ ID NO: 184-190中任一者之胺基酸序列，缺少其相關訊息肽。
  45. 如請求項44之經分離之多肽，其包含選自SEQ ID NO: 184-190中任一者之胺基酸序列。
  46. 如請求項40之經分離之多肽，其中該Fc域具有人類IgG4同型且包含胺基酸序列SEQ ID NO: 145或146。
  47. 如請求項1-46中任一項之經分離之多肽，其中該多肽結合細胞表面上之唾液酸。
  48. 如請求項47之經分離之多肽，其中該等細胞為腫瘤細胞。
  49. 如請求項47之經分離之多肽，其中該等細胞表現FcR。
  50. 如請求項47之經分離之多肽，其中該等細胞為髓樣細胞。
  51. 如請求項50之經分離之多肽，其中該等髓樣細胞選自單核球、巨噬細胞、樹突細胞、微膠細胞及骨髓源性抑制細胞(MDSC)。
  52. 如請求項1-51中任一項之經分離之多肽，其中該多肽 a)      阻斷選自Siglec-3、Siglec-5、Siglec-7、Siglec-9、Siglec-10及Siglec-15之任何一或多個Siglec家族成員之細胞結合； b)      減輕MDSC介導之T細胞抑制，視情況如藉由量測IFNγ表現之增加或T細胞增殖之增加所確定； c)      將MDSC再極化為促發炎表現型； d)      增加MDSC上CD86之表現，增加MDSC上CD11b之表現及/或減少MDSC上CD163之表現； e)      將腫瘤巨噬細胞再極化成遠離M2表現型； f) 減少CD163+及/或CD206+巨噬細胞； g)      誘導MDSC中選自CCL3、CCL4、CCL5、CCL17、CXCL1、CXCL9及IL-8之一或多種趨化介素之表現； h)      減少髓樣細胞向腫瘤微環境中之募集；或 i) 以小於100 nM、小於50 nM、小於25 nM、小於20 nM、小於10 nM、小於5 nM、小於2 nM、1-50 nM、1-25 nM、1-20 nM、1-10 nM、1-5 nM或1-2 nM之親和力與MDSC結合； j) (a)至(i)中任何一或多者。
  53. 如請求項52之經分離之多肽，其中該等MDSC為人類MDSC及/或該等巨噬細胞為人類巨噬細胞。
  54. 一種經分離之核酸，其包含編碼如請求項1-53中任一項之經分離之多肽的核酸序列。
  55. 如請求項54之經分離之核酸，其中該經分離之核酸編碼選自SEQ ID NO: 45-77、171-193及228-233中任一者之胺基酸序列。
  56. 如請求項54之經分離之核酸，其中該經分離之核酸編碼包含選自SEQ ID NO: 10-39、148-170及227中任一者之胺基酸序列的多肽。
  57. 一種表現載體，其包含如請求項54-56中任一項之經分離之核酸。
  58. 一種宿主細胞，其包含如請求項54-56中任一項之經分離之核酸或如請求項57之表現載體。
  59. 一種宿主細胞，其表現如請求項1至53中任一項之經分離之多肽。
  60. 一種產生多肽之方法，其包含培養如請求項58或請求項59之宿主細胞。
  61. 如請求項60之方法，其包含分離出該多肽。
  62. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1-53中任一項之多肽及醫藥學上可接受之載劑。
  63. 一種醫藥組成物，其包含：(i)如請求項7、10、12、27、31、32、34、36、38、41、43及44中任一項之多肽；或(ii)如請求項22之多肽，缺少其訊息肽；及醫藥學上可接受之載劑。
  64. 一種治療癌症之方法，其包含向患有癌症之個體投與如請求項1-53中任一項之多肽或如請求項62或請求項63之醫藥組成物。
  65. 如請求項64之方法，其包含投與如請求項7、10、12、27、31、32、34、36、38、41、43及44中任一項之多肽。
  66. 如請求項64或請求項65之方法，其中該癌症為與包含髓樣細胞之腫瘤微環境有關之實性瘤。
  67. 如請求項64-66中任一項之方法，其中該癌症選自腎細胞上皮癌、肉瘤、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、結腸直腸癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、頭頸癌、乳癌及子宮癌。
  68. 如請求項64-67中任一項之方法，其中該癌症為轉移性的。
  69. 如請求項64-68中任一項之方法，其進一步包含投與PD-1或PD-L1之拮抗劑，視情況其中該PD-1或PD-L1之拮抗劑分別為與PD-1或PD-L1結合之抗體。
  70. 如請求項64-69中任一項之方法，其進一步包含投與化學治療劑。
  71. 一種治療神經性或神經退化性疾病之方法，其包含向患有神經性或神經退化性疾病之個體投與如請求項1-53中任一項之多肽或如請求項62或請求項63之醫藥組成物。
  72. 如請求項71之方法，其包含投與如請求項7、10、12、27、31、32、34、36、38、41、43及44中任一項之多肽。
  73. 如請求項71或請求項72之方法，其中該神經性或神經退化性疾病之特徵在於微膠細胞功能不良或缺失。
  74. 如請求項71-73中任一項之方法，其中該神經性或神經退化性疾病選自失智症、額顳葉失智症、阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)、血管型失智症、及輕度認知障礙、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、亨汀頓氏病(Huntington’s disease)、tau蛋白病(Taupathy disease)、多發性硬化症、免疫介導之神經病變(諸如神經病變痛)、那須-哈科拉病(Nasu-Hakola disease)、小兒發作腦白質病及成人發作腦白質病伴軸突小球及色素性神經膠(adult-onset leukoencephalopathy with axonal spheroids and pigmented glia；ALSP)。
  75. 一種在個體中將骨髓源性抑制細胞(MDSC)再極化成促發炎表現型之方法，其包含向該個體投與如請求項1-53中任一項之多肽或如請求項62或請求項63之醫藥組成物。
  76. 如請求項75之方法，其包含投與如請求項7、10、12、27、31、32、34、36、38、41、43及44中任一項之多肽。
  77. 如請求項75或請求項76之方法，其中該個體患有癌症。
  78. 如請求項77之方法，其中該癌症為與包含髓樣細胞之腫瘤微環境有關之實性瘤。
  79. 如請求項77或請求項78之方法，其中該癌症選自腎細胞上皮癌、肉瘤、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、結腸直腸癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、頭頸癌、乳癌及子宮癌。
  80. 如請求項77-79中任一項之方法，其中該癌症為轉移性的。
  81. 如請求項75或76之方法，其中該個體患有神經性或神經退化性疾病。
  82. 如請求項81之方法，其中該神經性或神經退化性疾病之特徵在於微膠細胞功能不良或缺失。
  83. 如請求項81或82之方法，其中該神經性或神經退化性疾病選自失智症、額顳葉失智症、阿茲海默氏病、血管型失智症、及輕度認知障礙、帕金森氏病、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、亨汀頓氏病、Tau蛋白病、多發性硬化症、免疫介導之神經病變(諸如神經病變痛)、那須-哈科拉病、小兒發作腦白質病及成人發作腦白質病伴軸突小球及色素性神經膠(ALSP)。
  84. 一種在患有癌症之個體中將腫瘤巨噬細胞再極化成遠離M2表現型之方法，該方法包含向該個體投與如請求項1-53中任一項之多肽或如請求項62或請求項63之醫藥組成物。
  85. 如請求項81之方法，其包含投與如請求項7、10、12、27、31、32、34、36、38、41、43及44中任一項之多肽。
  86. 如請求項84或請求項85之方法，其中該癌症為與包含髓樣細胞之腫瘤微環境有關之實性瘤。
  87. 如請求項84-86中任一項之方法，其中該癌症選自腎細胞上皮癌、肉瘤、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、結腸直腸癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、頭頸癌、乳癌及子宮癌。
  88. 如請求項84-87中任一項之方法，其中該癌症為轉移性的。
  89. 一種在個體中活化髓樣細胞之方法，該方法包含向該個體投與如請求項1-53中任一項之多肽或如請求項62或請求項63之醫藥組成物。
  90. 如請求項89之方法，其包含投與如請求項7、10、12、27、31、32、34、36、38、41、43及44中任一項之多肽。
  91. 如請求項89或90之方法，其中該等髓樣細胞為微膠細胞。
  92. 如請求項89-91中任一項之方法，其中該個體患有癌症。
  93. 如請求項92之方法，其中該癌症為與包含髓樣細胞之腫瘤微環境有關之實性瘤。
  94. 如請求項92或93之方法，其中該癌症選自腎細胞上皮癌、肉瘤、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、結腸直腸癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、頭頸癌、乳癌及子宮癌。
  95. 如請求項92-94中任一項之方法，其中該癌症為轉移性的。
  96. 如請求項89、90或91之方法，其中該個體患有神經退化性疾病。
  97. 如請求項96之方法，其中該神經性或神經退化性疾病選自失智症、額顳葉失智症、阿茲海默氏病、血管型失智症、及輕度認知障礙、帕金森氏病、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、亨汀頓氏病、tau蛋白病、多發性硬化症、免疫介導之神經病變(諸如神經病變痛)、那須-哈科拉病、小兒發作腦白質病及成人發作腦白質病伴軸突小球及色素性神經膠(ALSP)。
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