TW202131935A - 用於肝臟再生的血漿組分 - Google Patents

Abstract

本發明描述了用於治療衰老相關性疾病以及肝臟再生、預防肝臟變性和維護肝臟的方法和組合物。該方法中使用的組合物包括血漿和源自血漿的血漿組分，其具有治療和/或預防疾病的功效。

Description

用於肝臟再生的血漿組分

本發明涉及疾病（包括衰老相關性疾病）的預防和治療。本發明還涉及利用血液製品（如血漿和血漿組分）治療和/或預防衰老相關病狀（與肝臟生長、維護和再生相關）。

肝衰竭治療市場巨大，目前可採用單一治療干預手段——肝移植來治療肝衰竭。十分之一的美國人（約 3500 萬人）患有某種形式的肝病。  由於在逐漸增多的肥胖人群中肝硬化性肝病的盛行，這一數字仍在持續攀升。  NAFLD（非酒精性脂肪性肝病）是引發肝硬化的主要危險因子，而肝硬化可能導致最終肝衰竭。由於普通人群的健康水準下降，可供移植的器官很少。因此，肝移植名單上僅有約 1/3 的患者接受了移植。  由於器官移植相關風險增加與年齡有關，因此該名單通常不包括 65 歲以上的患者。對於等待肝移植的肝硬化患者而言，統計值尤其可怕。在美國，有 300,000 例肝硬化住院患者，每年肝硬化死亡 36,000 例，其中半數以上的患者不適合移植。  替代治療方法的可用性可能會對大部分原本無可用治療方案的肝病患者造成嚴重影響。

肝衰竭可以是急性的，也可能是慢性的。  急性肝衰竭通常是由病毒感染（例如，B 型和 C 型肝炎）、藥物或毒素（例如，乙醯胺苯酚）的過度使用以及代謝或血管疾病（如自體免疫性肝炎和威爾遜病）所引起。  慢性肝衰竭通常被歸類為肝硬化，可能是由病毒感染、酗酒、NAFLD（由肥胖、高膽固醇和甘油三酸酯和高血壓引起）、自體免疫性疾病、管（如連接肝與腸的膽管）阻塞或損壞、暴露於毒素或某些藥物、寄生蟲、心臟衰竭導致肝內血液積聚所引起。

可以針對如上所述的肝衰竭進行肝切除和移植，而對於慢性肝衰竭，更為普遍的是進行移植。  另外，可以針對原發性和繼發性惡性腫瘤（即，癌症）進行這些手術。  肝切除和移植預後的改善與注意術前、圍手術期和術後護理有關。（Wrighton LJ 等人，胃腸腫瘤學雜誌 (J Gastrointest Oncol.)，3(1): 41-47, (2012)）。  這些包括提升手術和麻醉技術，增進對肝臟的生理作用、營養支援、血糖控制了解以及減少術後感染。  （同上）對於肝移植，最常用的藥物是免疫抑製劑。負責肝移植排斥反應控制和長期併發症（如高血壓和肥胖症）護理的主治醫師在改善相應預後方面一直發揮著重要作用。  （參見，Issa DH，克利夫蘭醫學雜誌 (Cleveland Clinic J of Med.)，82(6):361-72 (2015)）。

現仍然嚴重缺乏新的療法來改善肝衰竭和/或肝切除或移植患者的預後。  此外，即使在進行肝移植手術的情況下，也無足夠的供肝供所有患者使用。  （參見，例如，Helwick C，ASCO 郵報 (ASCO Post)，（2017 年 9 月 25 日）指出「移植問題是器官分配。」）

正處於研究階段的一種治療肝硬化的化合物是白蛋白。這是為了彌補由於肝硬化性肝臟本身產生的白蛋白減少而導致的白蛋白損失。  基本原理是白蛋白有助於提高滲透壓，結合有毒物質，調節體內平衡並起到消炎作用。  （Carvalho JR 等人，肝病學年鑑 (Annals of Hepatology)，17(4): 547-60 (2018)）。  因此，本領域的常規想法是，白蛋白越純，濃度越高，產生的功效越強。  治療性白蛋白通常透過血漿組分分離產生。  血漿組分分離可產生白蛋白溶液，只是含有不需要的蛋白質「污染物」或「雜質」。

本發明提供了使用血漿組分來改善和加速肝病患者的肝病、肝切除或肝移植（術後）恢復的新療法。  另外，由於肝臟是唯一能夠再生的內臟器官，因此本發明提供了刺激現有肝臟增殖和再生的方法，例如，在某些肝臟相關的適應證中，其可以促進術後恢復。  此外，本發明利用血漿組分分離產生的所謂的「污染物」或「雜質」來更有效地治療肝病。

[相關申請案的交叉引用]

根據《美國法典》第 35 章第 119 節 (e) 的規定，本申請案主張於 2019 年 11 月 20 日提交的序列號為 62/937,965 的美國臨時專利申請案以及於 2020 年 2 月 12 日提交的序列號為 62/975,637 的美國臨時專利申請案提交日期的優先權；這些申請案的公開內容以引用方式併入本文。 [援引併入]

在本說明書中引用的所有出版品和專利透過引用方式併入本文，如每一單獨出版品或專利被具體地和單獨地表明透過引用方式併入。

A.       引言

本發明涉及肝臟病症或疾病的治療。據證實，血漿組分（包括血漿組分分離產物）在肝切除術後誘導肝臟恢復方面具有顯著活性。此外，據證實，血漿組分可激活靜止、完整肝臟（肝切除術之前）中的細胞增殖。血漿組分相較於全血漿血清具有幾大優勢，因為血漿組分分離過程可以去除有問題的凝血因子，且無需進行血液交叉匹配。另外，在某些分析中，與年輕人血漿相比，血漿組分表現出的效力改善出乎意料（參見，例如，第 15/499,694 號美國專利申請案和第 16/432,114 號美國專利申請案；其公開內容以引用方式全部併入本文）。因此，利用全血漿血清對血漿組分分離產物的效力進行預測一事並無合理可預測性。

在詳細描述本發明之前，應當瞭解，本發明不僅限於文中所描述的特定方法和組合物，因為在實際實施中一定會存在差異。還應瞭解，本文中所使用的術語僅用於描述特定實施例，而無意限制本發明構思，本發明的範圍將僅由附屬申請專利範圍聲明限定。

提供本文所討論的出版品僅針對其在本申請案提交日期之前公開的內容。本文中的任何內容均不得解釋為承認由於之前的發明使得本發明無權早於此類出版品。此外，所提供的出版日期可能與實際出版日期不同，可能需要單獨確認。

在提供數值範圍的情況下，應當瞭解，本發明也特別公開了該範圍的上限與下限之間的各中間值，除非上下文另有明確規定，否則精確至下限單位的十分之一。介於該範圍內的任何規定值或中間值與該範圍內的任何其他規定值或中間值之間的各較小範圍都包含在本發明的範圍內。這些較小範圍的上限和下限可獨立地包括在該範圍內或排除在外，且上下限中任一項、兩項均未或兩項均包括在該較小範圍內的各範圍也都包含在本發明的範圍內，需遵守該範圍內任何特別排除的限值的要求。在該範圍包括一個或兩個限值的情況下，排除了所包括限值中的任一項或兩項的範圍也包括在本發明的範圍內。

應當注意，可以起草申請專利範圍以排除任何可選要素。因此，該陳述旨在作為使用諸如「單獨」、「僅」等與陳述申請專利範圍要素有關的專用術語或使用「否定」限制的前置基礎。 閱讀本發明後，以下內容對熟知本領域技術者應顯而易見的，本文所描述和列出的每個單獨的實施例都具有分層的組分和特徵，這些組分和特徵可在不脫離本發明的範圍和精神的情況下與其他實施例中任一實施例的特徵進行快速分解或合併。可按陳述的事件順序或邏輯上可能的任何其他順序對任何陳述的方法進行實施。

B.     定義

除非另有定義，否則本文所使用的所有技術和科學術語的含義與本發明所屬領域技術者所普遍理解的含義相同。儘管與本文所描述的方法和材料類似或等同的方法和材料亦可用於本發明的實踐或測試中，但下文描述了一些潛在優選的方法和材料。本文提及的所有出版品均以引用方式併入本文，以公開和描述與所引用的出版品有關的方法及/或材料。應當瞭解，除非存在矛盾，否則本發明公開內容取代所併入出版品的任何公開內容。

還應注意的是，本文和附屬申請專利範圍聲明中所使用的單數形式「一個」和「該」等也包含其複數指示物，除非上下文另外明確指明。因此，例如，提及「一個細胞」包括多個此等細胞，而且提及「該肽」包括提及一種或更多種肽以及本領域技術者已知的其等同物，例如多肽，等等。

在描述本發明中的方法時，術語「宿主」、「受試者」、「個體」和「患者」可互換使用，指的是需要根據本發明所揭示的方法接受這類給藥的任何哺乳動物。這些哺乳動物包括，例如人、羊、牛、馬、豬、犬、貓、非人靈長類動物、小鼠和大鼠。在某些實施例中，該受試者是非人哺乳動物。在一些實施例中，該受試者是家畜。在其他實施例中，該受試者是寵物。在一些實施例中，該受試者是哺乳動物。在某些情況下，該受試者是人類。其他受試者可包括家養寵物（例如，狗和貓）、家畜（例如，牛、豬、山羊、馬等）、齧齒動物（例如，小鼠、豚鼠和大鼠，可用於動物疾病模型的動物）以及非人靈長類動物（例如，黑猩猩和猴子）。因此，本發明的受試者包括但不限於人類和其他靈長類動物等哺乳動物，例如黑猩猩、其他猿類和猴類等等，在某些實施例中，該受試者是人類。術語「受試者」還包括任何年齡、體重或其他身體特徵的人或生物體，其中該受試者可以是成人、兒童、嬰兒或新生兒。

「年輕人」或「年輕個體」是指實際年齡為 40 歲或更年輕的個體，例如，35 歲或更年輕，包括 30 歲或更年輕，例如 25 歲或更年輕或 22 歲或更年輕。在一些情況下，充當含有年輕人血漿的血液製品來源的個體是年齡為 10 歲或更年輕的個體，例如，5 歲或更年輕，包括 1 歲或更年輕。在一些情況下，該受試者是新生兒，該血漿製品的來源是臍帶，其中該血漿製品獲取自新生兒的臍帶。因此，「年輕人」和「年輕個體」可以指年齡介於 0 至 40 歲之間的受試者，例如，0、1、5、10、15、20、25、30、35 或 40 歲。在其他情況下，「年輕人」和「年輕個體」可以指代生理年齡（與實際年齡相對照），例如，未表現出見於較年長個體中的血漿內炎性細胞因子水準的個體。相反地，這些「年輕人」和「年輕個體」可以指代生理年齡（與實際年齡相對照），例如，所表現出的血漿內抗炎性細胞因子水準相較於較年長個體更高的個體。舉例而言（而非限制），該炎性細胞因子是嗜酸性粒細胞趨化因子，且年輕受試者或年輕個體與年長個體之間的倍數差異為至少 1.5 倍。類似地，就其他炎性細胞因子而言，年長個體與年輕個體之間的倍數差異可用於指代生理年齡。（參見 第13/575,437 號美國專利申請案，該專利中的內容以引用方式併入本文）。通常情況下，該個體是健康的，例如，該個體在相應樣品採集時未患惡性血液病或自身免疫疾病。

本文所用的術語「治療」是指 (i) 預防疾病或病症，或 (ii) 緩解或消除疾病或病症症狀中的任一種。  可以預防性地（在肝臟疾病或肝衰竭發作之前）進行治療，並且該治療包括：(a) 防止受試者出現這種病狀；(b) 抑制這種病狀，即，防止其發作；或 (c) 緩解這種病狀，即，使病狀消退。治療可引起多種不同的身體表現，例如，基因表達調節、組織或器官恢復活力等。治療劑可在病狀發作之前、期間或之後施用。可在病狀的症狀期（以及在某些情況下，在病狀的症狀期之後）實施標的療法。  治療還可以透過在肝切除或移植之前、肝切除/移植期間和/或肝切除/移植之後施行諸如血漿、血漿組分或包含血漿成分的血液製品的干預措施來實現。

與肝臟功能、再生或恢復有關的「改善」是指使用本領域所熟知的標準方法測得的肝臟功能的任何明顯提升。舉例而言（而非限制），這可以包括測量某些蛋白質的血液水準，例如丙胺酸胺基轉移酶 (ALT)、天門冬胺酸轉胺酶 (AST)、鹼性磷酸酶 (ALP)、白蛋白和總蛋白、膽紅素、γ－麩胺醯轉化酶 (GGT)、L-乳酸鹽脫氫酶 (LD)、凝血酶原時間 (PT)。該蛋白質的正常水準的示例可以是：ALT（7 至 55 U/L）；AST（8 至 48 U/L）；ALP（40 至 129 U/L）；白蛋白（3.5 至 5.0 g/dL）；總蛋白（6.3 至 7.9 g/dL）；膽紅素（0.1 至 1.2 mg/dL）；GGT（8 至 61 U/L）；LD（122 至 222 U/L）；以及 PT（9.4 至 12.5 秒）。

包含血漿成分的血液製品 。          在實施本發明的方法時，將包含血漿成分的血液製品施用於有此需求的個體，例如，出現以下一種或更多種病狀的個體：肝臟疾病或肝衰竭。因此根據本發明的實施例所述的方法包括將包含血漿成分（源自於個體（「供體個體」或「供體」））的血液製品施用於出現以下一種或更多種病狀的個體：肝臟疾病或肝衰竭（「受體個體」或「受體」）。「包含血漿成分的血液製品」是指任何源自於血液的製品，其包含血漿（例如，全血、血漿或其組分）。依照常規含義，術語「血漿」是指血液中的稻草色/淡黃色液體成分，其由約 92% 的水、7% 的蛋白（例如白蛋白、γ 球蛋白、抗血友病因子和其他成分凝血因子）以及 1% 的礦物質鹽、糖類、脂肪、激素和維生素組成。適用於標的方法的包含血漿的血液製品的非限制性示例包括經抗凝劑（例如，EDTA、檸檬酸鹽、草酸鹽、肝素等）處理的全血、透過過濾全血以去除白血球（「白血球去除」）而產生的血液製品、由透過血漿去除法得到的或單採法得到的血漿組成的血液製品、新鮮冷凍血漿、主要由純化血漿組成的血液製品以及主要由血漿組分組成的血液製品。在一些情況下，所採用的血漿製品是非全血血漿製品，這意味著該製品不是全血，因此它缺乏在全血中發現的一種或更多種成分，例如紅細胞、白細胞等，至少在某種程度上這些成分存在於全血中。在一些情況下，血漿製品基本上是（如果並非完全是）無細胞的，其中在這種情況下，細胞含量（按體積計）可以是 5% 或更少，例如 1% 或更少，包括 0.5% 或更少；其中在一些情況下，無細胞血漿組分是指完全缺乏細胞的組合物，即其不包括細胞。

收集包含血漿成分的血液製品 。本文所述的方法的實施例包括施用包含血漿成分的血液製品，該血漿成分可源自於供體，包括人類志願者。  術語「人源的」可以指此類製品。  從供體中收集包含血漿的血液製品的方法是本領域眾所熟知的。  （例如，參見 AABB 技術手冊（Mark A. Fung 等人，編輯，第 18 版，2014），其以引用方式併入本文）。

在一個實施例中，透過靜脈穿刺獲得捐獻品。  在另一實施例中，該靜脈穿刺僅僅是單次靜脈穿刺。  在另一實施例中，不採用生理鹽水容量替代療法。  在優選實施例中，該血漿去除法相關流程用於獲得包含血漿的血液製品。  血漿去除法可包含去除重量調整後的血漿量，並使細胞成分返回至供體。  在優選實施例中，在血漿去除法實施期間使用檸檬酸鈉，防止細胞凝結。  在施用檸檬酸鹽後，從供體中收集的血漿量優選地介於 690 至 880 mL 之間，且優選地與供體體重協調。

C.     血漿組分

在第二次世界大戰期間，需要一種穩定的血漿擴容劑，以期用於戰場上，從而應對士兵失去大量血液的情況。因此，制定了製備凍乾血漿的方法。然而，由於重構需要無菌水，因此很難在作戰態勢中使用凍乾血漿。作為替代方案，E.J.Cohn 博士建議可以使用白蛋白，且準備了一種可立即引入以治療休克的即用型穩定溶液。（參見 Johan，目前用於製備血漿組分的方法（血液生物技術） 165 （Jack Goldstein 編，第 1 版，1991））。Cohn 博士在純化血漿組分的過程中利用了冷乙醇的變性作用，且透過 pH 和溫度變化來實現分離。

本文所述的方法的一實施例包括向受試者施用血漿組分。組分分離是將某些蛋白亞群與血漿分離的過程。組分分離技術在本領域中是已知的，且依賴於 Cohn 等人在 20 世紀 40 年代制定的步驟。（E.Cohn，血清和血漿蛋白的製備及其性質。IV。一種將生物組織和體液中的蛋白和脂蛋白成分分離成各組分的系統。68，美國化學會誌 (J Am Chem Soc) 459 (1946)，其以引用方式併入本文）。該過程涉及若干步驟，每個步驟均涉及特定的乙醇濃度以及使得蛋白選擇性沉澱的 pH、溫度和滲透壓濃度變化。  沉澱物也透過離心或沉澱分離。最初的「Cohn 組分分離過程」涉及透過沉澱將蛋白分離成五個組分，分別稱為組分 I、組分 II+III、組分 IV-1、組分 IV-4 和組分 V。白蛋白是此過程中最初確定的終點（組分 V）產物。根據本發明的實施例，每種組分（或來自先前分離步驟的流出物）含有或可能含有治療上有用的蛋白組分。（參見 Thierry Burnouf，現代血漿組分分離，21(2)，輸血醫學評論，101 (2007)；Adil Denizli，血漿組分分離：純化白蛋白的常規方法和色譜方法，4，生物化學雜誌 (J. Biol. & Chem)，315，(2011)；T. Brodniewicz-Proba，人血漿組分分離以及新技術對血漿源性製品的使用及品質的影響，5，血液學綜述，245 (1991)；以及第 3869431、5110907、5219995、7531513和 8772461 號美國專利，其以引用方式併入本文）。可以調整上述實驗參數以獲得特定的蛋白組分。

最近，組分分離變得更加複雜，因此，包含本發明的其他實施例。最近這種複雜性的增加是透過以下方式引起的：引入色譜法，可從現有組分（如冷凍沉澱物）、非冷凍血漿和 Cohn 組分中分離出新蛋白；透過整合色譜法和乙醇組分分離過程來提高 IgG 回收率；以及病毒減少/滅活/去除。（同上 ）為了在生理 pH 值和離子強度下捕獲蛋白，可以採用陰離子交換色譜法。這可以保留蛋白和/或蛋白組分的功能活性。肝素和單克隆抗體也用於親和色譜法。另外，可以透過凝膠過濾、鹽類和聚乙二醇進行組分分離。（Hosseini M，伊朗生物技術期刊 (Iran J Biotech) ，14(4):213-20 (2016)，其以引用方式併入本文）。熟知本領域技術者應認識到，可以調整上述參數和技術以獲得特別需要的含有血漿蛋白的組分。

血漿組分分離也可以基於硫酸銨進行。（例如，參見 Odunuga OO，生化化合物，1:3 (2013)；Wingfield PT，最新蛋白質科學實驗指南 (Curr Protoc Protein Sci)，附錄3 (2001)，其以引用方式併入本文）。除了獲得特定的血液組分外，還採用基於硫酸銨的組分分離法去除血漿中的大量蛋白。（Saha S等人 ，蛋白質組學與生物資訊學雜誌 (J.Proteomics Bioinform)，5(8) (2012)，其以引用方式併入本文）。

在本發明的一實施例中，血漿在工業環境中進行組分分離。  將冷凍血漿置於 1℃ 至 4℃ 下解凍。對解凍血漿進行連續冷凍離心，並分離出冷凍沉澱物。  將回收的冷凍沉澱物置於 -30℃ 或更低溫度下冷凍儲存。  立即處理非冷凍沉澱（「非冷凍」）血漿，以捕獲（例如，透過初級色譜法）不穩定的凝血因子，例如因子 IX 複合物及其成分以及蛋白酶抑制劑（例如抗凝血酶和 C1 酯酶抑制劑）。  可在後續步驟中進行連續離心和沉澱分離。  此類技術是熟知本領域技術者已知的技術，且在以下出版品中有相應介紹：例如，第  4624780、5219995 和 5288853 號美國專利以及第20140343255 和 20150343025 號美國專利申請案，其公開內容以引用方式全部併入本文。

在本發明的一實施例中，該血漿組分可以包含含有大量白蛋白的血漿組分。  在本發明的另一實施例中，該血漿組分可以包含含有大量 IgG 或靜脈注射免疫球蛋白 (IGIV)（例如 Gamunex-C®）的血漿組分。在本發明的另一實施例中，該血漿組分可以包含 IGIV 血漿組分，例如 Gamunex-C®，其透過熟知本領域技術者眾所周知的方法基本上耗竭了免疫球蛋白 (IgG)。例如，蛋白 A 介導的耗竭。（參見 Keshishian, H. 等人，用於發現血漿中敏感生物標記物的多重、定量工作流程產生了適用於早期心肌損傷的新型候選藥物，分子與細胞蛋白質組學，14，2375-93 (2015)）。在另一實施例中，該血漿組分可以是基本上所有凝血因子均已去除，以便保留組分效力並降低血栓形成風險的血漿組分。例如，血漿組分可以是於 2016 年 8 月 18 日提交的第 62/376,529 號美國專利中所述的血漿組分；其公開內容以引用方式全部併入本文。

D.     白蛋白製品

對於熟知本領域技術者而言，白蛋白血漿製品 (「APP」) 分為兩大類：血漿蛋白組分 (「PPF」) 和人白蛋白溶液 (「HAS」)。  PPF 源自相較於 HAS 產率更高但最低白蛋白純度更低（對於 PPF，＞ 83%；對於 HAS，＞ 95%）的工藝流程。（人白蛋白溶液的生產：一種不斷發展的膠體，P. Matejtschuk 等人，英國麻醉學雜誌 (British J. of Anaesthesia)，85(6): 887-95，888 (2000)）。在一些情況下，PPF 的白蛋白純度為 83% 至 95%，或者 83% 至 96%。該白蛋白純度可以透過電泳法或其他定量測定法（例如，透過質譜法）確定。另外，一些人注意到，PPF 由於存在蛋白「污染物」（例如 PKA）而具有缺陷。同上。因此，作為白蛋白血漿製品，PPF 製劑已不再普及，甚至已從某些國家的藥典中除名。同上。與這些問題相反，本發明有益地利用了這些「污染物」。除 α、β 和 γ 球蛋白以及上述 PKA 外，本發明的方法還利用「污染物」中促進諸如細胞增殖和組織再生等過程的其他蛋白或其他因子。

熟知本領域技術者應認識到，現有或已有若干 PPF 商業來源（「PPF 商用製劑」）。這些製劑包括 Plasma-Plex™ PPF（Armour Pharmaceutical Co.，紐約州塔里敦市）、Plasmanate™ PPF（Grifols，北卡羅來納州克萊頓市）、Plasmatein™（Alpha Therapeutics，加利福尼亞州洛杉磯市）以及 Protenate™ PPF（Baxter Labs, Inc.，伊利諾伊州迪爾菲爾德市）。

熟知本領域技術者還應認識到，現有或已有若干 HAS 商業來源（「HAS 商用製劑」）。這些製劑包括 Albuminar™ (CSL Behring)、AlbuRx™ (CSL Behring)、Albutein™（Grifols，北卡羅來納州克萊頓市）、Buminate™（Baxatla, Inc.，伊利諾伊州班諾克本市）、Flexbumin™（Baxatla, Inc.，伊利諾伊州班諾克本市）以及 Plasbumin™（Grifols，北卡羅來納州克萊頓市）。

1.        血漿蛋白組分（人）(PPF)

根據美國食品藥品監督管理局 (「FDA」) 規定，「血漿蛋白組分（人）」或 PPF 是定義為「由源自人血漿的白蛋白和球蛋白組成的無菌蛋白溶液」的製品的專有名稱  （《美國聯邦法規》「CFR」 21 CFR 640.90，其以引用方式併入本文）。  PPF 的源材料是從按照 21 CFR 640.1 – 640.5（以引用方式併入本文）規定製備的全血中回收的血漿或按照 21 CFR 640.60 – 640.76（以引用方式併入本文）規定製備的源血漿。

按照 21 CFR 640.92（以引用方式併入本文）對 PPF 進行測試，以確定其符合以下標準：

(a)      最終產物應為 5.0% +/- 0.30% 的蛋白溶液；以及

(b)   最終產物中的總蛋白應由至少 83% 的白蛋白和至多 17% 的球蛋白組成。γ 球蛋白在蛋白總量中的佔比不得超過 1%。蛋白組成透過食品藥品監督管理局生物製品評價和研究中心主任針對各製造商審批的方法確定。

本文使用的「血漿蛋白組分」或「PPF」是指由源自人血漿的白蛋白和球蛋白及其他血漿蛋白組成的無菌蛋白溶液，其中白蛋白含量為至少 83%，球蛋白含量不超過 17%（包括 α1、α2、β 和 γ 球蛋白），並且透過電泳法測定 γ 球蛋白含量不超過 1%。  （Hink, J.H., Jr. 等人，經熱處理的人血漿蛋白組分的製備和性質，血液之聲 (VOX SANGUINIS)，2(174) (1957)）。  PPF 也可指固體形式，其懸浮於溶劑中時具有類似組成。  總球蛋白組分可以透過減去總蛋白中的白蛋白來確定。  （Busher, J.，血清白蛋白和球蛋白，臨床方法：  歷史、物理和實驗室試驗，第 10 章，Walker HK，Hall WD，Hurst JD，編輯(1990)）。

2.        白蛋白（人） (HAS)

根據 FDA 規定，「白蛋白（人）」（在本文中也被稱為「HAS」）是被定義為「由源自人血漿的白蛋白組成的無菌溶液」的製品的專有名稱  （《美國聯邦法規》「CFR」 21 CFR 640.80，其以引用方式併入本文）。  用於白蛋白（人）的源材料是從按照 21 CFR 640.1 – 640.5（以引用方式併入本文）規定製備的全血中回收的血漿或按照 21 CFR 640.60 – 640.76（以引用方式併入本文）規定製備的源血漿。  有關白蛋白（人）的其他要求請見 21 CFR 640.80 – 640.84（以引用方式併入本文）。

按照 21 CFR 640.82 對白蛋白（人）進行測試，以確定其是否符合以下標準：

(a) 蛋白濃度。最終產物應滿足以下其中一個濃度要求：4.0% +/- 0.25%；5.0% +/- 0.30%；20.0% +/- 1.2%；以及 25.0% +/- 1.5% 的蛋白溶液。

(b) 蛋白組成。  在最終產物中，白蛋白在蛋白總量中的佔比至少應為 96%，這可以透過食品藥品監督管理局生物製品評價和研究中心主任針對各製造商審批的方法確定。

本文使用的「白蛋白（人）」或「HAS」是指由源自人血漿的白蛋白和球蛋白及其他血漿蛋白組成的無菌蛋白溶液，其中白蛋白含量為至少 95%，球蛋白含量不超過 5%（包括 α1、α2、β 和 γ 球蛋白）。HAS 也可指固體形式，其懸浮於溶劑中時具有類似組成。總球蛋白組分可以透過減去總蛋白中的白蛋白來確定。

熟知本領域技術者認識到，PPF 和 HAS 組分也可以採用凍乾形式或其他固體形式。例如，此類含有適當添加劑的製劑可用於製備片劑、粉劑、顆粒或膠囊。該固體形式可透過以下方式配製成注射用製劑：將其溶解、懸浮或乳化於水性或非水性溶劑中，例如植物油或其他類似油類、合成脂肪酸甘油酯、高級脂肪酸酯或丙二醇中；並且如有需要，可加入常規添加劑，例如增溶劑、等滲劑、助懸劑、乳化劑、穩定劑和防腐劑。

E.     凝血因子減少的組分

本發明的另一實施例採用所有凝血因子基本上均已去除，以便保留組分效力並降低血栓形成風險的血漿組分。為方便起見，該血液製品可以源自單個年輕供體或一群年輕供體，且可以使其不含任何 IgM，以提供與 ABO 相容的年輕血液製品。目前，輸注的血漿與 ABO 血型匹配，因為 A 和 B 抗原的天然抗體的存在可引起輸血反應。當患者接受與 ABO 不匹配的血漿時，IgM 似乎是造成輸血反應的原因。去除血液製品或組分中的 IgM 有助於消除接受本發明的血液製品和血漿組分給藥的受試者產生的輸血反應。

因此，在一實施例中，本發明涉及治療患有與以下肝臟疾病或肝衰竭中的任何一種有關的不利病狀的受試者的方法。該方法包含：向受試者施用源自單個個體或一群個體的全血的血液製品或血液組分，其中該血液製品或血液組分基本上不含 (a) 至少一種凝血因子和/或 (b) IgM。在一些實施例中，該血液製品或血液組分所源自的個體是年輕個體。在一些實施例中，該血液製品基本上不含至少一種凝血因子和 IgM。在某些實施例中，該血液製品基本上不含纖維蛋白原（因子 I）在其他實施例中，該血液製品基本上不含紅細胞和/或白細胞。在進一步實施例中，該血液製品基本上是無細胞的在其他實施例中，該血液製品源自於血漿。本發明的這些實施例受於 2016 年 8 月 18 日提交的第 62/376,529 號美國專利申請案的進一步支援，該專利以引用方式全部併入本文。

F.     富含蛋白的血漿蛋白製品給藥

本發明的其他實施例採用與 PPF 相比白蛋白濃度有所降低，但球蛋白和其他血漿蛋白（被某些人稱為「污染物」）的量有所增加的血漿組分。如同 PPF、HAS、流出物 I 和流出物 II/III 一般，這些實施例實際上不含任何凝血因子。下文將此類血漿組分稱之為「富含蛋白的血漿蛋白製品」。例如，本發明的一實施例可以使用由 82% 的白蛋白和 18% 的 α、β 和 γ 球蛋白及其他血漿蛋白組成的富含蛋白的血漿蛋白製品。本發明的另一實施例可以使用由 81% 的白蛋白和 19% 的 α、β 和 γ 球蛋白和/或其他血漿蛋白組成的富含蛋白的血漿蛋白製品本發明的另一實施例可以使用由 80% 的白蛋白和 20% 的 α、β 和 γ 球蛋白和/或其他血漿蛋白組成的富含蛋白的血漿蛋白製品。本發明的其他實施例可以使用由 70-79% 的白蛋白和相應 21-30% 的 α、β 和 γ 球蛋白和其他血漿蛋白組成的富含蛋白的血漿蛋白製品。本發明的其他實施例可以使用由 60-69% 的白蛋白和相應 31-40% 的 α、β 和 γ 球蛋白和其他血漿蛋白組成的富含蛋白的血漿蛋白製品。  本發明的其他實施例可以使用由 50-59% 的白蛋白和相應 41-50% 的 α、β 和 γ 球蛋白和其他血漿蛋白組成的富含蛋白的血漿蛋白製品。本發明的其他實施例可以使用由 40-49% 的白蛋白和相應 51-60% 的 α、β 和 γ 球蛋白和其他血漿蛋白組成的富含蛋白的血漿蛋白製品。本發明的其他實施例可以使用由 30-39% 的白蛋白和相應 61-70% 的 α、β 和 γ 球蛋白和其他血漿蛋白組成的富含蛋白的血漿蛋白製品。本發明的其他實施例可以使用由 20-29% 的白蛋白和相應 71-80% 的 α、β 和 γ 球蛋白和其他血漿蛋白組成的富含蛋白的血漿蛋白製品。本發明的其他實施例可以使用由 10-19% 的白蛋白和相應 81-90% 的 α、β 和 γ 球蛋白和其他血漿蛋白組成的富含蛋白的血漿蛋白製品。本發明的其他實施例可以使用由 1-9% 的白蛋白和相應 91-99% 的 α、β 和 γ 球蛋白和其他血漿蛋白組成的富含蛋白的血漿蛋白製品。本發明的進一步實施例可以使用由 0% 的白蛋白和 100% 的 α、β 和 γ 球蛋白和其他血漿蛋白組成的富含蛋白的血漿蛋白製品。

本發明的上述實施例還可以具有總濃度為 1-5% 的 γ 球蛋白。

血漿組分中蛋白的特定濃度可以採用熟知相關領域技術者眾所周知的技術確定。舉例而言（而非限制），此類技術包括電泳法、質譜法、ELISA 分析和蛋白質印跡分析。

G.     血漿組分的製備

PPF 和其他血漿組分的製備方法是熟知本領域技術者眾所周知的。  本發明的一實施例允許將用於製備人血漿蛋白組分的血液收集於裝有檸檬酸鹽或檸檬酸鹽抗凝劑右旋糖溶液（或其他抗凝劑）的燒瓶中，以抑制凝結，並根據 Hink 等人公開的方法進一步分離組分 I、II + III、IV 和 PPF。（參加 Hink, J.H., Jr. 等人，經熱處理的人血漿蛋白組分的製備和性質，血液之聲 (VOX SANGUINIS)，2(174) (1957)，其以引用方式併入本文。)  根據該方法，可收集混合物並將其置於 2-8℃ 環境中。隨後可以透過在 7℃ 下離心分離血漿，取出並儲存在 -20℃ 下。然後，可以將血漿在 37℃ 下解凍並進行組分分離，優選地在從 -20℃ 儲存環境中取出後 8 小時內進行組分分離。

可以在 -2 至 -2.5℃ 的溫度下，使用 pH 7.2 的 8% 乙醇將血漿與組分 I 分離，其中蛋白濃度為 5.1 至 5.6%。可以在將血漿溫度降至 -2℃ 期間，使用噴射器以諸如 450 毫升/分鐘的速率添加 53.3% 冷乙醇（176 mL/L 血漿）以及醋酸鹽緩衝液（200 mL 4M 醋酸鈉、230 mL 冰醋酸，加適量 H2O 至 1L）。可以透過超速離心將組分 I 與流出物（流出物 I）分離並去除。纖維蛋白原可以按照熟知本領域技術者眾所周知的方法從組分 I 中獲得。

在 pH 值為 6.8、溫度為 -6℃ 且蛋白濃度為 4.3% 的情況下，透過將流出物調節為 21% 乙醇，可以將組分 II + III 與流出物 I 分離。  可以在將流出物 I 的溫度降至 -6℃ 期間，使用噴射器以諸如 500 毫升/分鐘的速率添加 95% 冷乙醇（176 mL/L 流出物 I）以及用於調節 pH 值的 10 M 乙酸。可以透過在 -6℃ 下離心去除所得沉澱物（組分 II + III）。可以採用熟知本領域技術者眾所周知的方法從組分 II + III 中獲得 γ 球蛋白。

在 pH 值為 5.2、溫度為 -6℃ 且蛋白濃度為 3% 的情況下，透過將流出物調節為 19% 乙醇，可以將組分 IV-1 與流出物 II + III（「流出物 II/III」）分離。  可以使用噴射器添加用於調節 pH 值的 H2O 和 10 M 乙酸，同時將流出液 II/III 置於 -6℃ 環境下 6 小時。  沉澱組分 IV-1 可以在 -6℃ 下沉澱 6 小時，隨後透過在同一溫度下離心，從而與流出物分離。  在 pH 值為 4.65、溫度為 -7°C 且蛋白濃度為 2.5% 的情況下，透過將乙醇濃度調節為 30%，可以從流出物 IV-1 中回收穩定的血漿蛋白組分。  這可以透過用冷酸-乙醇（兩份 2 M 乙酸和一份 95% 乙醇）調節流出液 IV-1 的 pH 值來實現。  在溫度維持在 -7℃ 時，向每升經調節的流出物 IV-1 中添加 170 mL 冷乙醇 (95%)。  可使沉澱的蛋白質沉降 36 小時，隨後在 -7℃ 下透過離心去除。組分 IV-4 糊狀物也可以透過 Cohn 組分分離流程獲得。  實際上，組分 IV-4 及其生產過程如前所述（Schopfer LM 等人，PLoS ONE ，14(1):e0209795 (2018)，其以引用方式全部併入本文）（Schopfer LM 等人，PLoS ONE ，14(1):e0209795 (2018)；以及 Bertolini J, Goss N, Curlin J 編，用於治療用途的血漿蛋白的生產，16.4: 231:232 (2013) 其以引用方式全部併入本文）。

可對回收的蛋白（穩定的血漿蛋白組分）進行乾燥處理（例如，透過冷凍乾燥），以去除乙醇和 H2O。  可將所得乾燥粉末溶於無菌蒸餾水中，例如，使用15 升水/千克粉末，並用 1 M NaOH 將該溶液的 pH 值調節至 7.0。   透過添加含有乙醯色胺酸鈉、辛酸鈉和 NaCl 的無菌蒸餾水，將乙醯色胺酸鹽、辛酸鹽和鈉的最終濃度分別調節至 0.004 M、0.004 M 和 0.112 M，可使蛋白的最終濃度達到 5%。  最後，可在 10℃ 下過濾該溶液以獲得澄清溶液，隨後進行熱處理以使病原體在 60℃ 下滅活至少 10 小時。

熟知本領域技術者認識到，上述每種不同的組分、流出物或其糊狀物均可與本發明的方法結合用於治療諸如肝臟疾病或肝衰竭等病狀。例如（而非限制），流出物 I 或流出物 II/III 可用於治療諸如肝臟疾病或肝衰竭等病狀，並且是本發明的實施例。  另一示例是組分 I 糊狀物、組分 II + III 糊狀物、組分 IV-1 糊狀物、組分 IV-4 糊狀物和/或組分 V 糊狀物或其懸浮液可用於治療諸如肝臟疾病或肝衰竭等病狀，並且是本發明的實施例。

用於製備血漿組分和血漿蛋白組分 (PPF) 的前述方法僅為示例性方法，且僅涉及本發明的實施例。  熟知本領域技術者認識到，這些方法可以發生變化。  例如，在本發明的不同實施例和方法中，除其他方面外，可以調節 pH、溫度和乙醇濃度，以使血漿組分和血漿蛋白組分發生不同變化。  在另一示例中，本發明的其他實施例考慮了採用納濾法去除血漿組分和血漿蛋白組分中的病原體或使其滅活。

本發明的其他實施例考慮了使用和/或包含其他血漿組分的方法和組合物。  例如，除其他方面外，本發明考慮到，特定濃度的白蛋白對於與肝臟疾病或肝衰竭有關的病狀治療並不重要。因此，本發明考慮了白蛋白濃度有所降低的組分，例如白蛋白濃度低於 83% 的組分。

H.     治療

本文所述的本發明的方法的態樣包括用包含血漿的血液製品（例如，如上所述的血漿組分）治療受試者。一實施例包括用包含血漿的血液製品治療人類受試者。  本領域技術者應當認識到，用包含血漿的血液製品治療受試者的方法是本領域所熟知的。  舉例而言（而非限制），本文所述的本發明的方法的一個實施例包含向受試者施用血漿組分或新鮮冷凍血漿，以治療肝臟相關病症，如急性肝衰竭或慢性肝衰竭。  本發明的其他實施例包括其中該急性肝衰竭與傳染性疾病（如 B 型或 C 型肝炎）、藥物或毒素（例如，乙醯胺苯酚、異菸肼）的過度使用以及代謝或血管疾病（如自體免疫性肝炎和威爾遜病）有關。  本發明的其他實施例包括其中該慢性肝衰竭與病毒感染、酗酒、NAFLD（由肥胖、高膽固醇和甘油三酸酯和高血壓引起）、自體免疫性疾病、管（如連接肝與腸的膽管）阻塞或損壞、暴露於毒素或某些藥物、寄生蟲、心臟衰竭導致肝內血液積聚有關。

本發明的其他實施例包括與遺傳性疾病有關的肝臟疾病或肝衰竭，例如（而非限制）：α-1 抗胰蛋白酶缺乏症；膽酸合成障礙（威爾遜病、進行性家族性肝內膽汁淤積症 3 型）；碳水化合物代謝異常（遺傳性果糖不耐症、肝醣蓄積病 IV 型）；胺基酸代謝異常（酪氨酸血症 I 型）；尿素循環障礙（精胺基琥珀酸裂解酶缺乏症、希特林缺乏症——CTLN2、NICCD）；脂質代謝異常（膽固醇酯沉積病）；囊性纖維化；血色素沉著症；Alstrom 氏症候群和先天性肝纖維變性。  （Scorza M 等人，國際肝病雜誌 (Int ’l J Hepatology) ，2014，論文 ID 713754 (2014)）。

本發明的其他實施例包括與致病原有關的肝臟疾病或肝衰竭，例如（而非限制）：病毒（Epstein Barr 病毒、巨細胞病毒、單純疱疹病毒和其他疱疹病毒、黃熱病、登革熱、B 型和 C 型肝炎）；細菌（傷寒、結核分枝桿菌、布氏桿菌症、Q 熱、      鈎端螺旋體病、螺旋體——梅毒、疏螺旋體）；寄生蟲（血吸蟲病、瘧疾）；真菌（念珠菌）。（Talwani R 等人，臨床肝病 (Clin Liver Dis.) ，15(1):111-30 (2011)）。

本發明的其他實施例包括與藥物或有毒物質有關的肝臟疾病或肝衰竭，例如（而非限制）：乙醯胺苯酚、異菸肼以及由肝臟代謝的藥物。

本發明的其他實施例包括肝臟疾病，其中該肝臟部分或全部切除。其他實施例包括肝臟疾病，其中將供肝移植至肝臟疾病受試者中。其他實施例包括在術前、圍手術期和/或術後向該受試者施用治療劑，例如包含血漿的血液製品或血漿組分。

在一實施例中，該包含血漿的血液製品可以立即（例如，在從供體中收集後約 12-48 小時內）施用於出現與肝臟疾病或肝衰竭有關的病狀的個體。  在這種情況下，該製品可以在諸如 0-10℃ 的冷藏條件下儲存。在另一實施例中，新鮮冷凍血漿是已於 -18℃ 或更冷的環境中冷凍儲存（冷凍保存）的血漿。  在施用之前，將新鮮冷凍血漿解凍，並且一旦解凍，便在解凍過程開始後 60-75 分鐘將其施用於受試者。  每個受試者優選地接受單個單位的新鮮冷凍血漿 (200-250 mL)，該新鮮冷凍血漿優選地源自預定年齡範圍的供體。  在本發明的一個實施例中，該新鮮冷凍血漿由（源自）年輕個體捐獻。  在本發明的另一實施例中，該新鮮冷凍血漿由（源自）同一性別的供體捐獻。  在本發明的另一實施例中，該新鮮冷凍血漿由（源自）年齡介於 18-22 歲之間的供體捐獻。

在本發明的一實施例中，在捐獻後按照血型篩選包含血漿的血液製品。  在本發明的另一實施例中，根據 21 CFR 640.33 的要求和 FDA 指導檔中含有的建議，篩選適用於感染性疾病治療劑（例如 HIV I 和 II、HBV、HCV、HTLV I 和 II、抗 HBc）的包含血漿的血液製品。

在本發明的另一實施例中，用血漿組分治療受試者。  在本發明的一實施例中，該血漿組分是 PPF、HAS、組分 IV-1 或組分 IV-1 糊狀物、組分 IV-4 或組分 IV-4 糊狀物。  在本發明的進一步實施例中，該血漿組分是 HAS 商用製劑或 PPF 商用製劑中的一種。在本發明的另一實施例中，該血漿組分是源自一群特定年齡範圍的個體（例如，年輕個體）的 PPF、HAS、組分 IV-4 或組分 IV-4 糊狀物，或是經過額外組分分離或處理的改良 PPF、HAS、組分 IV-4 或組分 IV-4 糊狀物組分（例如，一種或更多種特定蛋白已部分或基本上去除的 PPF、HAS、組分 IV-1、組分 IV-1 糊狀物、組分 IV-4 或組分 IV-4 糊狀物）。  在本發明的另一實施例中，該血漿組分是免疫球蛋白 (IgG) 已基本上耗竭的 IGIV 血漿組分。  「基本上耗竭」或特定蛋白（例如 IgG）已「基本上去除」的血液組分是指含量少於參比製品或全血漿中存在的量的約 50%，例如少於 45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%、不可檢測水準或介於這些值之間的任意整數的血液組分，其含量採用本領域所熟知的標準測定法測定。

I.施用

本文所述的本發明的方法的態樣包括用包含血漿的血液製品（例如，如上所述的血漿或血漿組分）治療受試者。一實施例包括用包含血漿的血液製品治療人類受試者。本領域技術者應當認識到，用包含血漿的血液製品治療受試者的方法是本領域所熟知的。  舉例而言（而非限制），本文所述的本發明的方法的一個實施例包含向受試者施用新鮮冷凍血漿，以治療諸如肝臟疾病或肝衰竭等病狀。在一實施例中，該包含血漿的血液製品可以立即（例如，在從供體中收集後約 12-48 小時內）施用於出現與肝臟疾病或肝衰竭有關的不利病狀的個體。  在這種情況下，該製品可以在諸如 0-10℃ 的冷藏條件下儲存。在另一實施例中，新鮮冷凍血漿是已於 -18℃ 或更冷的環境中冷凍儲存（冷凍保存）的血漿。  在施用之前，將新鮮冷凍血漿解凍，並且一旦解凍，便在解凍過程開始後 60-75 分鐘將其施用於受試者。  每個受試者優選地接受單個單位的新鮮冷凍血漿 (200-250 mL)，該新鮮冷凍血漿優選地源自預定年齡範圍的供體。  在本發明的一個實施例中，該新鮮冷凍血漿由（源自）年輕個體捐獻。  在本發明的另一實施例中，該新鮮冷凍血漿由（源自）同一性別的供體捐獻。  在本發明的另一實施例中，該新鮮冷凍血漿由（源自）年齡介於 18-22 歲之間的供體捐獻。

在本發明的一實施例中，在捐獻後按照血型篩選包含血漿的血液製品。  在本發明的另一實施例中，根據 21 CFR 640.33 的要求和 FDA 指導檔中含有的建議，篩選適用於感染性疾病治療劑（例如 HIV I 和 II、HBV、HCV、HTLV I 和 II、抗 HBc）的包含血漿的血液製品。

在本發明的另一實施例中，用血漿組分治療受試者。  在本發明的一實施例中，該血漿組分是 PPF 或 HAS。  在本發明的進一步實施例中，該血漿組分是 HAS 商用製劑或 PPF 商用製劑中的一種。  在本發明的另一實施例中，該血漿組分是源自一群特定年齡範圍的個體（例如，年輕個體）的 PPF 或 HAS，或是經過額外組分分離或處理的改良 PPF 或 HAS（例如，一種或更多種特定蛋白已部分或基本上去除的 PPF 或 HAS）。  在本發明的另一實施例中，該血漿組分是免疫球蛋白 (IgG) 已基本上耗竭的 IGIV 血漿組分。  「基本上耗竭」或特定蛋白（例如 IgG）已「基本上去除」的血液組分是指含量少於參比製品或全血漿中存在的量的約 50%，例如少於 45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%、不可檢測水準或介於這些值之間的任意整數的血液組分，其含量採用本領域所熟知的標準測定法測定。

本發明的一實施例包括透過向受試者施用有效量的血漿或血漿組分來治療出現諸如肝臟疾病或肝衰竭等病狀的受試者。  本發明的另一實施例包括施用有效量的血漿或血漿組分，隨後監測受試者的肝功能改善、肝臟再生、標記物存在、疼痛減輕或炎症減少情況。  本發明的另一實施例包括透過向受試者施用有效量的血漿或血漿組分來治療出現諸如肝臟疾病或肝衰竭等病狀的受試者，其中該血漿或血漿組分的施用方式可在相對於最近施用的劑量（在本文中稱為「脈衝給藥」）達到血漿蛋白或血漿組分蛋白的平均半衰期或半衰期中值後，改善肝功能、促進肝臟再生、檢測到標記物的存在、減輕疼痛或減少炎症（參見第 15/499,697 和 62/701,411 號美國專利申請案，其以引用方式全部併入本文）。  本發明的另一實施例包括按照至少連續兩天的給藥方案來施用血漿或血漿組分，並且在最後一次施用日期後至少 3 天監測受試者的肝功能改善情況或 HSC 標記物水準。  本發明的進一步實施例包括按照至少連續 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 或 14 天的給藥方案來施用血漿或血漿組分，並且在最後一次施用日期後至少 3 天監測受試者的肝功能改善、肝臟再生、標記物存在、疼痛減輕或炎症減少情況。  本發明的另一實施例包括按照至少連續 2 天的給藥方案來施用血漿或血漿組分，並在最後一次施用日期後，監測達到血漿或血漿組分中蛋白的平均半衰期時受試者的肝功能改善、標記物存在、疼痛減輕或炎症減少情況。  本發明的另一實施例包括按照 2 至 14 天非連續給藥方案來施用血漿或血漿組分，其中各藥劑之間的每個間隔期均可為 0-3 天。

在一些情況下，根據本發明的脈衝給藥包括施用第一組藥劑（例如，如上所述），然後是一段停藥時期，例如「停藥期」，其後接著施用另一藥劑或另一組藥劑。該「停藥」期的持續時間可以發生變化，但是在一些實施例中，該持續時間為 7 天或更長，例如 10 天或更長，包括 14 天或更長，其中在某些情況下，該停藥期為 15 至 365 天，例如 30 至 90 天，包括 30 至 60 天。  因此，該方法的實施例包括非長期（即，非連續）給藥，例如血液製品的非長期施用。  在一些實施例中，脈衝給藥後接停藥期的模式根據需要重複多次，其中在一些情況下，該模式持續 1 年或更長，例如 2 年或更長，直至且包括受試者壽命終結。本發明的另一實施例包括按照先連續給藥 5 天，而後停藥 2-3 天，接著再連續給藥 2-14 天的給藥方案來施用血漿或血漿組分。

本發明的其他實施例包括肝臟疾病，其中該肝臟部分或全部切除。  其他實施例包括肝臟疾病，其中將供肝移植至肝臟疾病受試者中。  其他實施例包括在術前、圍手術期和/或術後向該受試者施用治療劑，例如包含血漿的血液製品或血漿組分。  切除和移植肝臟的方法是本領域所熟知的。

在生物化學上，活性劑的「有效量」或「有效劑量」是指抑制、拮抗、降低、減少或阻遏率約 20% 或更多的活性劑的量，例如 30% 或更多、40% 或更多或 50% 或更多，在一些情況下，為 60% 或更多、70% 或更多、80% 或更多或 90% 或更多，在一些情況下為約 100%，即可忽略的量，並且在一些情況下，可逆轉諸如肝臟疾病或肝衰竭病狀等不利病狀。

J.      血漿蛋白組分

在實施本發明的方法時，向受試者施用血漿組分。在一實施例中，該血漿組分是血漿蛋白組分 (PPF)。在其他實施例中，該 PPF 選自 PPF 商用製劑。

在另一實施例中，該 PPF 由 88% 的正常人白蛋白、12% 的 α 和 β 球蛋白以及不超過 1% 的 γ 球蛋白（透過電泳法測定）組成。  用於實施本發明的方法的該實施例的進一步實施例包括，例如，用碳酸鈉緩衝並用 0.004 M 辛酸鈉和 0.004 M 乙醯色胺酸穩定的 5% PPF 溶液的實施例。  其他製劑（包括改變 PPF 在溶液中的佔比（例如，由約 1% 改至約 10%、由約 10% 改至約 20%、由約 20% 改至 25%、由約 25% 改至 30%）以及溶劑濃度的製劑）和穩定劑可用於實施本發明的方法。

K.     特定年齡供體的血漿組分

本發明的其他實施例包括施用源自某些年齡範圍的個體的血漿的血漿蛋白組分。一實施例包括施用源自年輕個體的血漿的 PPF 或 HAS。在本發明的另一實施例中，該年輕個體具有單一特定年齡或特定年齡範圍。在另一實施例中，該供體的平均年齡小於受試者的平均年齡或小於接受治療的受試者的平均年齡。

本發明的某些實施例包括匯集源自特定年齡範圍的個體的血液或血漿，並如上所述對血漿進行組分分離，以獲得血漿蛋白組分產物，例如 PPF 或 HAS。在本發明的替代實施例中，該血漿蛋白組分或特定血漿蛋白組分獲取自落入特定年齡範圍內的特定個體。

L.       適應證

本發明的一實施例是向診斷出現可能從肝細胞增殖或肝臟再生的改善中受益的肝臟疾病或肝衰竭的受試者施用血漿組分或血漿組分分離產物。  本發明的另一實施例包括該疾病與以下各項有關的情況：急性肝衰竭、慢性肝衰竭或慢加急性肝衰竭。  慢加急性肝衰竭發生於患有相對穩定的慢性肝病但突然轉變為急性肝衰竭的患者中。  這通常會導致出現很高的死亡率。  本發明的另一實施例是其中該急性衰竭與傳染性疾病（如 B 型或 C 型肝炎）、藥物或毒素（例如，乙醯胺苯酚、異菸肼）的過度使用以及代謝或血管疾病（如自體免疫性肝炎和威爾遜病）有關。  本發明的其他實施例包括其中該慢性肝衰竭與病毒感染、酗酒、NAFLD（由肥胖、高膽固醇和甘油三酸酯和高血壓引起）、自體免疫性疾病、管（如連接肝與腸的膽管）阻塞或損壞、暴露於毒素或某些藥物、寄生蟲、心臟衰竭導致肝內血液積聚有關。

本發明的其他實施例包括與遺傳性疾病有關的肝臟疾病或肝衰竭，例如（而非限制）：α-1 抗胰蛋白酶缺乏症；膽酸合成障礙（威爾遜病、進行性家族性肝內膽汁淤積症 3 型）；碳水化合物代謝異常（遺傳性果糖不耐症、肝醣蓄積病 IV 型）；胺基酸代謝異常（酪氨酸血症 I 型）；尿素循環障礙（精胺基琥珀酸裂解酶缺乏症、希特林缺乏症——CTLN2、NICCD）；脂質代謝異常（膽固醇酯沉積病）；囊性纖維化；血色素沉著症；Alstrom 氏症候群和先天性肝纖維變性。（Scorza M 等人，國際肝病雜誌 (Int ’l J Hepatology) ，2014，論文 ID 713754 (2014)）。

本發明的其他實施例包括與致病原有關的肝臟疾病或肝衰竭，例如（而非限制）：病毒（Epstein Barr 病毒、巨細胞病毒、單純疱疹病毒和其他疱疹病毒、黃熱病、登革熱、B 型和 C 型肝炎）；細菌（傷寒、結核分枝桿菌、布氏桿菌症、Q 熱、      鈎端螺旋體病、螺旋體——梅毒、疏螺旋體）；寄生蟲（血吸蟲病、瘧疾）；真菌（念珠菌）。  （Talwani R 等人，臨床肝病 (Clin Liver Dis.) ，15(1):111-30 (2011)）。

本發明的其他實施例包括與藥物或有毒物質有關的肝臟疾病或肝衰竭，例如（而非限制）：乙醯胺苯酚、異菸肼以及由肝臟代謝的藥物。

本發明的其他實施例包括肝臟疾病，其中該肝臟部分切除。其他實施例包括肝臟疾病，其中將供肝移植至肝臟疾病受試者中。  其他實施例包括在術前、圍手術期和/或術後向該受試者施用治療劑，例如包含血漿的血液製品或血漿組分。

M.    試劑、設備和試劑盒

本發明還提供了用於實施一種或更多種上述方法的試劑、設備及其試劑盒。  標的試劑、設備及其試劑盒可以有很大變化。

關注的試劑和設備包括以上提及的關於製備包含血漿的血液製品以輸注至有此需求的受試者體內的方法的試劑和設備，例如，抗凝劑、冷凍保存劑、緩衝液、等滲溶液等。

試劑盒還可以包含採血袋、管、針、離心管等。在其他實施例中，本文所述的試劑盒包括兩個或更多個血漿製品（例如血漿蛋白組分）容器，例如，三個或更多個、四個或更多個、五個或更多個，包括六個或更多個血漿製品容器。在一些情況下，該試劑盒中的血漿製品容器數量可以有所不同，可以是 9 個或更多個、12 個或更多個、15 個或更多個、18 個或更多個、21 個或更多個、24 個或更多個、30 個或更多個，包括 36 個或更多個，例如 48 個或更多個。每個容器可以具有與之相關聯的識別資訊，包括關於其中所含血漿製品的各種資料，該識別資訊可以包括以下一項或多項：血漿製品供體的年齡、關於血漿製品的處理詳情，例如，是否處理血漿製品以去除高於平均分子量的蛋白（如上所述）、血型詳情等。在一些情況下，該試劑盒中的每個容器包括關於其中所含血漿的識別資訊，並且該識別資訊包括關於血漿製品供體年齡的資訊，例如，該識別資訊可確認血漿製品供體的年齡相關資料（其中此類識別資訊可以是採集時供體的年齡）。在一些情況下，該試劑盒的每個容器均含有源自年齡基本上相同的供體的血漿製品，即，所有容器均包括源自年齡如有不同也基本上相同的供體的製品。年齡基本上相同是指從中獲得試劑盒中所示的血漿製品的各供體年齡在一些情況下各自相差 5 歲或更少，諸如 4 歲或更少，例如 3 歲或更少，包括 2 歲或更少，諸如 1 歲或更少，例如 9 歲或更少、6 個月或更少、3 個月或更少，包括 1 個月或更少。識別資訊可以存在於容器的任何合適部件上，例如，標籤、RFID 晶片等。根據需要，該識別資訊可以是人類可讀的資訊、電腦可讀的資訊等。容器可以具有任何合適的配置。雖然容器的容積可以發生變化，但是在一些情況下，該容積的範圍為 10 ml 至 5000 mL，例如 25 mL 至 2500 mL、50 ml 至 1000 mL，包括 100 mL 至 500 mL。容器可以是剛性的或柔性的，並且可以用任何合適的材料製成，例如聚合材料，包括醫用級塑料。在一些情況下，容器具有包或小袋配置。除了容器之外，此類試劑盒可進一步包括諸如如上所述的給藥設備。此類試劑盒的組成部分可以裝於任何合適的包裝中，例如，盒或類似結構，被配置成容納容器和其他試劑盒組成部分。

除上述組成部分外，試劑盒還可有操作方法說明。這些說明可以多種形式呈現於試劑盒中。此等說明可存在的其中一種方式為列印在合適的介質或底物上的資訊，如試劑盒包裝中、包裝***物中印有訊息的一張或數張紙。另一種方式為將訊息錄於電腦可讀取的介質，如記憶碟、CD、便攜式快閃記憶體驅動器等。可存在的另一種方式為可經由網際網路用於存取已移除站點上的資訊的網站位址。試劑盒可能使用簡便表述。

N.     實驗示例

1.      示例 1

a)PPF1 誘導的 70% 部分肝切除術後 20 月齡 C57BL/6 小鼠肝臟功能恢復

使用 20 月齡雄性 C57BL/6J 小鼠（The Jackson Laboratory，加利福尼亞州薩克拉曼多）。將所有小鼠單獨飼養在無特定病原體的條件下，施以光照 12 小時、黑暗 12 小時的週期處理，並且所有動物的處理和使用均符合機構動物護理和使用委員會 (Institutional Animal Care and Use Committee) 批准的標準指南規定。用 60% 高脂飲食 (Bio-Serv F3282) 餵養動物 7-8 週，並根據其接受該飲食後的體重和 ALT 水準隨機分入溶媒給藥組和 PPF1 給藥組，以確保組間平均體重和血清 ALT 水準相同。如先前所述對手術進行細微修改（Nevzorova, Y. 等人，實驗動物 (Lab. Anim.) ，49 , 81–88 (2015)）。將已切除的肝臟（左葉和內葉）作為術前對照品，並在術後 48 小時時收穫殘餘肝臟（尾狀葉和右葉）。在術後二十四 (24) 小時時，以 30 mg/kg 體重的劑量經腹膜內註射 EdU（溶於生理鹽水中的 2.5 mg/mL 儲備液）。在術後四十六 (46) 小時時，以 30 mg/kg 體重的劑量經腹膜內註射 BrdU（溶於生理鹽水中的 10 mg/mL 儲備液）。在術後 48 小時時，對所有動物進行稱重，並收集殘餘肝臟（內葉和尾狀葉）和血清以便進行 ALT 分析。

將市售 PPF（「PPF1」）（如上述溶於 5% 溶液中的 PPF 商用製劑）置於 4℃ 下儲存。PPF1 是一種含有約 88% 的正常人白蛋白（相對於蛋白總量）、12% 的 α 和 β 球蛋白以及不超過 1% 的 γ 球蛋白（透過電泳法測定）的 PPF。  除另有說明的情況下，在本文的示例中，PPF1 透過 5% 溶液 (w/v, 50 g/L) 施用。

對於 qPCR 分析，從已切除的肝臟或殘餘肝臟中提取 RNA，然後用液氮和研缽/杵使其粉化。隨後用 Trizol (Ambion/Fisher 15-596-018) 和 RNeasy Mini Kit (Qiagen 74106) 提取。接著用 iScript 逆轉錄超級混合物 (Bio-Rad 1030) 擴增 cDNA。用 SsoAdvanced Universal SYBR 綠色主混合物 (Bio-Rad 1725272) 擴增 QPCR，並在 Quant Studio 6 Flex (Applied Biosystem) 上進行。基於 RPS18（核醣體蛋白 s18）對基因表達進行標準化處理。

對於免疫染色，將嵌入 OCT 化合物 (Sakura 4583) 中的 12 微米厚的冷凍肝臟切片用於免疫螢光染色。用檸檬酸鹽緩衝液 (Sigma C9999) 在 95°C 下進行抗原修復 30 分鐘。使用 Click-IT Plus EdU Alexa Fluor 555 (Fisher C10638) 進行 EdU 標記。以 1/100,000 的比例在 ddH2O 中使用 Hoechst 33342 3 分鐘以標記細胞核 (Fisher H3570)。進行油紅 O 染色以觀察肝臟中三酸甘油酯的積聚。簡而言之，將冷凍肝臟切片浸入溶於異丙醇的 0.375% 油紅 O 中 5 分鐘。將切片置於流動的自來水下沖洗 30 分鐘，並用 Prolong gold 防褪色試劑 (Invitrogen P36934) 固定。

圖 1 是接受高脂飲食（「HFD」）的 20 月齡 C57BL/6 小鼠的體重變化圖。接受 HFD 8.5 週後，小鼠體重明顯增加。平均值 ± SEM，****p＜0.0001 普通單因素方差分析。

圖 2 是圖 1 中所示的小鼠肝臟的油紅 o 染色圖像。  與接受正常飲食（「正常飼養」）的小鼠相比，接受 HFD 的小鼠發生脂肪肝。

圖 3 展示了評價 PPF1 對接受上述高脂飲食的 20 月齡 C57BL/6 小鼠的影響的實驗設計。

圖 4 標出了圖 3 中所示的接受給藥的小鼠行 70% 肝切除術後已切除的以及所殘餘的葉。

圖 5 展示了圖 3 中所示的來自接受給藥的小鼠的、接受溶媒和 PPF1 處理的經肝切除術切除的肝臟的肝臟重量與體重之比的測定結果。

圖 6 展示了圖 3 中所示的來自接受給藥的小鼠的、接受溶媒和 PPF1 處理的已切除的肝臟的肝臟重量。

圖 7 是展示行肝切除術前接受 HFD 且接受 PPF1 給藥的小鼠中血清 ALT 水準正常且未受影響的圖示。ALT 水準低於 50-60 個單位/升時被視為處於正常範圍。（參見，例如 ，Mazzaccara C 等人，PLoS ONE ，3(11):e3772 (2008)）。

圖 8 展示了圖 3 中所示的行肝切除術後 48 小時時接受溶媒和 PPF1 給藥的具有殘餘肝臟的小鼠的肝臟重量與體重之比的測定結果。與接受溶媒給藥的動物相比，接受 PPF1 給藥的動物在行肝切除術後 48 小時時肝臟重量顯著增加。平均值 ± SEM，**p＜0.001，非成對 T 檢定，Whitney 校正。

圖 9 展示了圖 3 中所示的行肝切除術後 48 小時時接受溶媒和 PPF1 給藥的具有殘餘肝臟的小鼠的肝臟重量。  與接受溶媒給藥的動物相比，接受 PPF1 給藥的動物在行肝切除術後 48 小時時肝臟重量顯著增加。  平均值 ± SEM，*p＜0.05，非成對 T 檢定，Whitney 校正。

圖 10 展示了圖 3 中所示的行肝切除術後 48 小時時接受溶媒和 PPF1 給藥的具有殘餘肝臟的小鼠中血清 ALT 水準的結果。與接受溶媒給藥的動物相比，接受 PPF1 給藥的動物在行肝切除術後 48 小時時血清 ALT 水準顯著降低，這表明接受 PPF1 給藥的動物的肝損傷程度顯著降低。平均值 ± SEM，**p＜0.001，非成對 T 檢定，Whitney 校正。

相反，接受溶媒給藥的動物和接受 PPF1 給藥的動物在已切除的肝臟重量、肝臟重量/體重比和 ALT 水準方面表現出的差異未能達到顯著水準。

圖 11 報告了行肝切除術後的細胞增殖率。  在行肝切除術後 24 小時時遞送 EdU，並透過用 Click-it 標記 EdU 陽性細胞來追蹤增殖率。  對於殘餘肝臟，與接受溶媒給藥的動物相比，PPF1 使得每個視野中的 EdU 陽性細胞數目顯著增加。

圖 12 報告了在行肝切除術後 48 小時時的細胞增殖情況，其透過每個視野中的 Ki67 陽性細胞數目來衡量。  對於殘餘肝臟，與接受溶媒給藥的動物相比，PPF1 使得每個視野中的 Ki67 陽性細胞數目顯著增加。

圖 13 報告了透過 qPCR 基因表達在殘餘肝臟中測得的細胞增殖率，  展示了細胞週期標記物 Cycle B1 的相對表達情況。  在殘餘肝臟切片中，與接受溶媒給藥的小鼠相比，細胞週期素 B1 表達在接受 PPF1 給藥的小鼠中明顯上調。平均值 ± SEM，*p＜0.05，非成對 T 檢定，Whitney 校正。

圖 14A 至圖 14D 報告了在已切除的肝臟中多種標記物的 qPCR 表達情況，  展示了細胞週期標記物 Cycle B1（圖 14A ）、細胞週期素 A2（圖 14B ）和 Ki67（圖 14C ）的相對表達情況。  對於所有三種細胞週期標記物而言，在已切除的肝臟切片（在肝切除術期間作為術前對照品取出）中，與溶媒對照品相比，令人驚訝的是，PPF1 組的細胞增殖顯著增加。圖 14D 報告了在已切除的肝臟切片中 TNFα 的相對表達水準。  已知 TNFα 可透過促進肝細胞增殖和肝臟再生而有助於功能性肝組織的恢復。  總而言之，與溶媒對照品相比，PPF1 給藥有助於激活靜止、完整肝臟（肝切除術之前）中的細胞增殖。平均值 ± SEM，*p＜0.05，非成對 T 檢定，Whitney 校正。

圖 15 展示了在圖 14C 中所報告的已切除的肝臟中的 Ki67 免疫染色情況，這證實了與溶媒對照品相比，接受 PPF1 處理的已切除的肝臟中 Ki67 陽性細胞數目明顯更多。

圖 16 報告了圖 15 中所示的免疫染色的量化情況，其表明在接受 PPF1 處理的已切除的肝臟中 Ki67 陽性細胞數目增加。  平均值 ± SEM，*p＜0.05，非成對 T 檢定，Whitney 校正。

圖 17 是列明行肝切除術的動物總數以及接受每種治療的動物的存活率的圖表。  與接受溶媒給藥的動物相比，接受 PPF1 給藥的動物表現出存活率增加趨勢。

圖 18 展示了在行肝切除術後 24 小時時，摻雜 EdU 的殘餘肝臟的兩個共聚焦顯微鏡視野（見圖 3 ）。組織切片用 GFAP 抗體（星狀細胞標記物）染色，並觀察 EdU 與 GFAP 的共定位水準。  基於 EdU 與 GFAP 之間缺乏共定位可以確定，星狀細胞中未發生與 PPF1 給藥相關的細胞增殖。

圖 19 展示了在行肝切除術後 24 小時時，摻雜 EdU 的殘餘肝臟的兩個共聚焦顯微鏡視野（見圖 3 ）。組織切片用 CD68 抗體（庫弗式細胞標記物）染色，並觀察 EdU 與 CD68 的共定位水準。  基於 EdU 與 CD68 之間缺乏共定位可以確定，庫弗式細胞中未發生與 PPF1 給藥相關的細胞增殖。

圖 20 展示了在行肝切除術後 24 小時時，摻雜 EdU 的殘餘肝臟的共聚焦顯微鏡視野（見圖 3 ）。組織切片用 HNF4a 抗體（肝細胞標記物）染色，並觀察 EdU 與 HNF4a 的共定位水準。  基於 EdU 與 HNF4a 之間缺乏共定位可以確定，肝細胞中未發生與 PPF1 給藥相關的細胞增殖。

圖 21 展示了在行肝切除術後 24 小時時，摻雜 EdU 的殘餘肝臟的共聚焦顯微鏡視野（見圖 3 ）。組織切片用 CD3 抗體（T 細胞標記物）染色，並觀察 EdU 與 CD3 的共定位水準。基於 EdU 與 CD3 之間缺乏共定位可以確定，T 細胞中未發生與 PPF1 給藥相關的細胞增殖。

圖 22 展示了在行肝切除術後 24 小時時，摻雜 EdU 的殘餘肝臟的兩個共聚焦顯微鏡視野（見圖 3 ）。組織切片用 CD31 抗體（竇內皮細胞標記物）染色，並觀察 EdU 與 CD31 的共定位水準。  基於 EdU 與 CD31 之間的陽性共定位可以確定，PPF1 給藥引起的細胞增殖與肝竇內皮細胞 (LSEC) 有關。  這些結果表明，PPF1 使得肝臟中的毛細血管細胞增殖增加，從而有更多的血液輸送至損傷部位，展示了在 PPF1 給藥後如何實現組織修復和再生的機制。（箭頭指示包括 EdU 陽性細胞的 LSEC）。

2.        示例 2

a)       PPF1、重組人白蛋白和 HAS1 對 70% 部分肝切除術後 20 月齡 C57BL/6 小鼠肝臟的影響重組人白蛋白

用如先前在上文示例 1 中所述的方式處理雄性 C57BL/6J，但是另一隊列用重組人白蛋白（「rhAlbumin」）處理。  在接受 PPF1 給藥組、接受 rhAlbumin 給藥組和接受溶媒給藥組之間進行了比較。

圖 23 展示了評價 PPF1（一種血漿組分「PF」類型）和重組人白蛋白 (rhAlbumin) 對接受高脂飲食的 20 月齡 C57BL/6 小鼠的影響的實驗設計。  先讓小鼠接受 60% 高脂飲食 8 週，然後連續 7 天用 PPF1、rhAlbumin 或溶媒進行治療。  在最後一劑 PPF1、rhAlbumin 或溶媒給藥後的第二天進行手術（70% 肝切除術），並且在肝切除術期間取出術前中葉和左葉（切除部分）。  肝切除術後 48 小時時收穫右葉和尾狀葉（殘餘部分）。

圖 24 報告了在行肝切除術後 48 小時時已切除的肝臟中的細胞增殖情況，其透過每個視野中的 Ki67 陽性細胞數目來衡量。  與接受溶媒給藥的動物相比，PPF1 使得每個視野中的 Ki67 陽性細胞數目顯著增加。  相反，接受 rhAlbumin 給藥的動物與接受溶媒給藥的動物之間無明顯差異。  平均值 ± SEM，***p＜0.0001，非成對 T 檢定，Whitney 校正，ns = 不顯著。

圖 25 報告了行肝切除術後已切除的肝臟中的細胞增殖率。在行肝切除術後 24 小時時遞送 EdU，並透過點擊化學法來追蹤增殖率。與接受溶媒給藥的動物相比，PPF1 使得每個視野中的 EdU 陽性細胞數目顯著增加。相反，與接受溶媒給藥的動物相比，接受 rhAlbumin 給藥的動物在增殖方面未達到顯著水準。

這些結果表明，白蛋白（PPF1 中的最主要成分）可能並非 PPF1 中實現其增殖、組織修復和再生活性的成分。  相反，它表明，PPF1 中的其他成分（通常被視為是血漿組分分離後留下的雜質）令人驚訝地驅動了 PPF1 的這些活性。人白蛋白溶液 (HAS)

還用如先前在上文示例 1 中所述的方式處理雄性 C57BL/6J，但是另一隊列用人白蛋白溶液（「HAS1」）處理。  在接受 PPF1 給藥組、接受 HAS1 給藥組和接受溶媒給藥組之間進行了比較。

圖 26 展示了評價 PPF1 和 HAS1 對接受高脂飲食的 20 月齡 C57BL/6 小鼠的影響的實驗設計。  先讓小鼠接受 60% 高脂飲食 8 週，然後連續 7 天用 PPF1、rhAlbumin 或溶媒進行治療。  在最後一劑 PPF1、HAS1 或溶媒給藥後的第二天進行手術（70% 肝切除術），並且在肝切除術期間取出術前中葉和左葉（切除部分）。  肝切除術後 48 小時時收穫右葉和尾狀葉（殘餘部分）。

圖 27 報告了在行肝切除術後 24 小時時的細胞增殖率。在行肝切除術後 24 小時時遞送 EdU。與溶媒組相比，PPF1 組和 HAS1 組殘餘肝臟中的 EdU 陽性細胞數目均顯著增加。*p＜0.05，Welch t 檢定。誤差槓 = S.E.M。  HAS1 是一市售 HAS，例如上述置於 5% 溶液中並在 4℃ 下儲存的 HAS 商用製劑。

圖 28 展示了在行肝切除術後 48 小時時的細胞增殖率。對在行肝切除術後 48 小時時取出的殘餘肝臟進行 Ki67 免疫染色。儘管與對照動物相比，PPF1 組和 HAS 組的細胞增殖均顯著增加，但與接受 HAS1 給藥的動物相比，PPF1 誘導的增殖明顯更高。*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.0005，Welch t 檢定。誤差槓 = S.E.M。

這些結果表明，在接受 HAS1 和 PPF1 處理的脂肪變性肝中均觀察到血漿組分誘導的肝細胞增殖。但是，儘管在 24 小時後，與溶媒組相比，兩種不同的血漿組分（HAS1 和 PPF1）均顯著誘導了增殖，但在 48 小時後，PPF1 的作用相較於 HAS1 更為顯著，甚至與溶媒組相比都更為顯著。  這再次表明，白蛋白（與 PPF1 相比，HAS1 中的純度更高且含量更高）並非實現血漿組分對增殖、組織修復和再生的影響的主要成分，這一點令人驚訝。  相反，它表明，血漿組分中的其他成分或血漿組分分離後留下的「雜質」能夠出人意料地驅動這些活性。

3.示例 3

a) 最後一次給藥後兩小時時，PPF1 對 20 月齡 C57BL/6 小鼠肝臟的影響

根據體重將 20 月齡雄性 C57BL/6 小鼠隨機分入溶媒給藥組和 PPF1 給藥組，以確保組間平均體重相同。正常飼養小鼠，而非施以高脂飲食。  經靜脈每天向動物給予 150 µL 溶媒或 PPF1，連續給予 7 天。在第 7 天，在給藥後 2 小時時取出肝臟。對於基因表達分析，提取 RNA 並進行逆轉錄，並對 TNFα 進行 SYBR qPCR。基於 RPS18 對基因表達進行標準化處理。對於免疫染色，用 Ki67 抗體標記所收穫的肝臟中的增殖細胞。

圖 29 展示了評價最後一劑給藥後 2 小時時 PPF1 對 20 月齡 C57BL/6 小鼠的影響的實驗設計。

圖 30 展示了對上文圖 29 中所示的接受給藥的小鼠進行的 TNFα 基因表達分析的結果。與接受溶媒給藥的動物相比，接受 PPF1 給藥的動物透過 QPCR 測定的 TNFα 基因表達顯著增加。**p＜0.005。Welch t 檢定，誤差槓=S.E.M。

圖 31 展示了對上文圖 29 中所示的接受給藥的小鼠進行的 Ki67 免疫染色分析的結果。與接受溶媒給藥的動物相比，接受 PPF1 給藥的動物在最後一劑給藥後 2 小時時 Ki67 陽性細胞顯著增加，表明 PPF1 可增加肝細胞增殖。*p＜0.05。Welch t 檢定，誤差槓=S.E.M。

這些結果表明，即使在健康的、非脂肪變性的老齡肝臟中，血漿組分（如 PPF1）也可以有效誘導增殖和再生。

4.        示例 4

a) 組分 IV-1 糊狀物對 70% 部分肝切除術後 20 月齡 C57BL/6 小鼠肝臟的影響

使用 20 月齡雄性 C57BL/6J 小鼠（The Jackson Laboratory，加利福尼亞州薩克拉曼多）。將所有小鼠單獨飼養在無特定病原體的條件下，施以光照 12 小時、黑暗 12 小時的週期處理，並且所有動物的處理和使用均符合機構動物護理和使用委員會 (Institutional Animal Care and Use Committee) 批准的標準指南規定。  用 60% 高脂飲食 (Bio-Serv F3282) 餵養動物 7-8 週，並根據其接受該飲食後的體重和 ALT 水準隨機分入溶媒給藥組和組分 IV-1 糊狀物懸浮液組，以確保組間平均體重和血清 ALT 水準相同。如先前所述對手術進行細微修改（Nevzorova, Y.等人 ，實驗動物 (Lab. Anim.) ， 49 , 81–88 (2015)）。將已切除的肝葉（左葉和內葉）作為術前對照品，並在術後 48 小時時收穫殘餘肝葉（尾狀葉和右葉）。在術後二十四 (24) 小時時，以 30 mg/kg 體重的劑量經腹膜內註射 EdU（溶於生理鹽水中的 2.5 mg/mL 儲備液）。在術後四十六 (46) 小時時，以 30 mg/kg 體重的劑量經腹膜內註射 BrdU（溶於生理鹽水中的 10 mg/mL 儲備液）。在術後 48 小時時，對所有動物進行稱重，並收集殘餘肝臟（內葉和尾狀葉）和血清以便進行 ALT 分析。比較組分 IV-1 糊狀物懸浮液與溶媒對這些實驗讀出值的影響。另外，比較組分 IV-1 糊狀物懸浮液與其他血漿組分對這些實驗讀出值的影響。

〔圖 1 〕 是接受高脂飲食（「HFD」）的 20 月齡 C57BL/6 小鼠的體重變化圖。  接受 HFD 8.5 週後，小鼠體重明顯增加。〔圖 2 〕 是圖 1 中所示的小鼠肝臟的油紅 o 染色圖像。  與接受正常飲食（「正常飼養」）的小鼠相比，接受 HFD 的小鼠發生脂肪肝。〔圖 3 〕 展示了評價 PPF1 對 20 月齡脂肪肝 C57BL/6 小鼠的影響的實驗設計。  先讓小鼠接受 60% 高脂飲食 7 週，然後連續 7 天用 PPF1 或溶媒進行治療。  在最後一劑 PPF1 或溶媒給藥後的第二天進行手術（70% 肝切除術），並且在肝切除術期間取出術前中葉和左葉（切除部分）。  肝切除術後 48 小時時收穫右葉和尾狀葉（殘餘部分）。〔圖 4 〕 標出了圖 3 中所示的接受給藥的小鼠行 70% 肝切除術後已切除的以及所殘餘的葉。〔圖 5 〕 展示了圖 3 中所示的接受溶媒給藥與接受 PPF1 給藥且行肝切除術的小鼠中肝臟切除部分的重量與體重之比的測定結果。〔圖 6 〕 展示了圖 3 中所示的接受溶媒給藥與接受 PPF1 給藥的小鼠中肝臟切除部分的重量。〔圖 7 〕 是展示行肝切除術前接受 HFD 且接受 PPF1 給藥的小鼠中血清 ALT 水準正常且未受影響的圖示。〔圖 8 〕 展示了圖 3 中所示的行肝切除術後 48 小時時接受溶媒和 PPF1 給藥的具有殘餘肝臟的小鼠的肝臟重量與體重之比的測定結果。〔圖 9 〕 展示了圖 3 中所示的行肝切除術後 48 小時時接受溶媒和 PPF1 給藥的具有殘餘肝臟的小鼠的肝臟重量。〔圖 10 〕 展示了圖 3 中所示的行肝切除術後 48 小時時接受溶媒和 PPF1 給藥的小鼠中血清 ALT 水準的結果。〔圖 11 〕 報告了行肝切除術後的細胞增殖率。  在行肝切除術後 24 小時時遞送 EdU，並透過用 Click-it 標記 EdU 陽性細胞來追蹤增殖率。  與接受溶媒給藥的動物相比，PPF1 使得每個視野中的 EdU 陽性細胞數目顯著增加。〔圖 12 〕 報告了在行肝切除術後 48 小時時的細胞增殖情況，其透過每個視野中的 Ki67 陽性細胞數目來衡量。  與接受溶媒給藥的動物相比，PPF1 使得每個視野中的 Ki67 陽性細胞數目顯著增加。〔圖 13 〕 報告了透過 qPCR 基因表達在殘餘肝臟中測得的細胞增殖率，  展示了細胞週期標記物 Cycle B1 的相對表達情況。  在殘餘肝臟切片中，與接受溶媒給藥的小鼠相比，細胞週期素 B1 表達在接受 PPF1 給藥的小鼠中明顯上調。〔圖 14A 〕 至〔圖 14 D 〕 報告了在已切除的肝臟中多種標記物的 qPCR 表達情況，  展示了細胞週期標記物 Cycle B1（圖 14A ）、細胞週期素 A2（圖 14B ）和 Ki67（圖 14C ）的相對表達情況。  對於所有三種細胞週期標記物而言，在已切除的肝臟切片（在肝切除術期間作為術前對照品取出）中，與溶媒對照品相比，令人驚訝的是，PPF1 組的細胞增殖顯著增加。圖 14D 報告了在已切除的肝臟切片中 TNFα 的相對表達水準。  已知 TNFα 可透過在肝臟再生期間促進肝細胞增殖而有助於功能性肝組織的恢復。〔圖 1 5 〕 展示了在圖 14C 中所報告的已切除的肝臟中 Ki67 免疫染色的代表性圖像，這證實了與溶媒對照品相比，接受 PPF1 處理的已切除的肝臟中 Ki67 陽性細胞數目明顯更多。〔圖 16 〕 報告了圖 15 中所示的免疫染色的量化情況，其表明在接受 PPF1 處理的已切除的肝臟中 Ki67 陽性細胞數目增加。〔圖 17 〕 是列明行肝切除術的動物總數以及每種治療下的存活率的圖表。〔圖 18 〕 展示了在行肝切除術後 24 小時時，摻雜 EdU 的殘餘肝臟的兩個代表性共聚焦顯微鏡視野（見圖 3 ）。組織切片用 GFAP 抗體（星狀細胞標記物）染色，並觀察 EdU 與 GFAP 的共定位水準。  基於 EdU 與 GFAP 之間缺乏共定位可以確定，星狀細胞中未發生與 PPF1 給藥相關的細胞增殖。〔圖 19 〕 展示了在行肝切除術後 24 小時時，摻雜 EdU 的殘餘肝臟的兩個代表性共聚焦顯微鏡視野（見圖 3 ）。組織切片用 CD68 抗體（庫弗式細胞標記物）染色，並觀察 EdU 與 CD68 的共定位水準。  基於 EdU 與 CD68 之間缺乏共定位可以確定，庫弗式細胞中未發生與 PPF1 給藥相關的細胞增殖。〔圖 20 〕 展示了在行肝切除術後 24 小時時，摻雜 EdU 的殘餘肝臟的代表性共聚焦顯微鏡視野（見圖 3 ）。組織切片用 HNF4a 抗體（肝細胞標記物）染色，並觀察 EdU 與 HNF4a 的共定位水準。  基於 EdU 與 HNF4a 之間缺乏共定位可以確定，肝細胞中未發生與 PPF1 給藥相關的細胞增殖。〔圖 21 〕 展示了在行肝切除術後 24 小時時，摻雜 EdU 的殘餘肝臟的代表性共聚焦顯微鏡視野（見圖 3 ）。組織切片用 CD3 抗體（T 細胞標記物）染色，並觀察 EdU 與 CD3 的共定位水準。  基於 EdU 與 CD3 之間缺乏共定位可以確定，T 細胞中未發生與 PPF1 給藥相關的細胞增殖。〔圖 22 〕 展示了在行肝切除術後 24 小時時，摻雜 EdU 的殘餘肝臟的兩個代表性共聚焦顯微鏡視野（見圖 3 ）。組織切片用 CD31 抗體（竇內皮細胞標記物）染色，並觀察 EdU 與 CD31 的共定位水準。  基於 EdU 與 CD31 之間的陽性共定位可以確定，PPF1 給藥引起的細胞增殖與肝竇內皮細胞 (LSEC) 有關。  箭頭指示包括 EdU 陽性細胞的 LSEC。〔圖 23 〕 展示了評價 PPF1（血漿組分「PF」）和重組人白蛋白 (rhAlbumin) 對 20 月齡 C57BL/6 小鼠的影響的實驗設計。  先讓小鼠接受 60% 高脂飲食 8 週，然後連續 7 天用 PPF1、rhAlbumin 或溶媒進行治療。  在最後一劑 PPF1、rhAlbumin 或溶媒給藥後的第二天進行手術（70% 肝切除術），並且在肝切除術期間取出術前中葉和左葉（切除部分）。  肝切除術後 48 小時時收穫右葉和尾狀葉（殘餘部分）。〔圖 24 〕 報告了在行肝切除術後 48 小時時已切除的肝臟中的細胞增殖情況，其透過每個視野中的 Ki67 陽性細胞數目來衡量。  與接受溶媒給藥的動物相比，PPF1 使得每個視野中的 Ki67 陽性細胞數目顯著增加。  相反，接受 rhAlbumin 給藥的動物與接受溶媒給藥的動物之間無明顯差異。〔圖 25 〕 報告了行肝切除術後已切除的肝臟中的細胞增殖率。  在行肝切除術後 24 小時時遞送 EdU，並透過點擊化學法來追蹤增殖率。  與接受溶媒給藥的動物相比，PPF1 使得每個視野中的 EdU 陽性細胞數目顯著增加。相反，與接受溶媒給藥的動物相比，接受 rhAlbumin 給藥的動物的增殖趨勢不明顯。〔圖 26 〕 展示了評價 PPF1 和 HAS1 對 20 月齡 C57BL/6 小鼠的影響的實驗設計。  先讓小鼠接受 60% 高脂飲食 8 週，然後連續 7 天用不同的血漿組分 (PF) PPF1 和 HAS1 或溶媒進行治療。  在最後一劑 PPF1、HAS1 或溶媒給藥後的第二天進行手術（70% 肝切除術），並且在肝切除術期間取出術前中葉和左葉（切除部分）。  肝切除術後 48 小時時收穫右葉和尾狀葉（殘餘部分）。〔圖 27 〕 報告了在行肝切除術後 24 小時時的細胞增殖率。在行肝切除術後 24 小時時遞送 EdU。與溶媒組相比，PPF1 組和 HAS1 組殘餘肝臟中的 EdU 陽性細胞數目均顯著增加。〔圖 28 〕 展示了在行肝切除術後 48 小時時的細胞增殖率。對在行肝切除術後 48 小時時取出的殘餘肝臟進行 Ki67 免疫染色。儘管與對照動物相比，PPF1 組和 HAS 組的細胞增殖均顯著增加，但與接受 HAS1 給藥的動物相比，PPF1 誘導的增殖明顯更高。〔圖 29 〕 展示了評價最後一劑給藥後 2 小時時 PPF1 對 20 月齡 C57BL/6 小鼠的影響的實驗設計。〔圖 30 〕 展示了對上文圖 29 中所示的接受給藥的小鼠進行的 TNFα 基因表達分析的結果。與接受溶媒給藥的動物相比，接受 PPF1 給藥的動物透過 QPCR 測定的 TNFα 基因表達顯著增加。〔圖 31 〕 展示了對上文圖 29 中所示的接受給藥的小鼠進行的 Ki67 免疫染色分析的結果。與接受溶媒給藥的動物相比，接受 PPF1 給藥的動物在最後一劑給藥後 2 小時時 Ki67 陽性細胞顯著增加，表明 PPF1 可增加肝細胞增殖。

Claims (12)

1. 一種治療被診斷患有肝臟疾病的受試者的方法，該方法包含向該受試者施用有效量的血漿組分。
2. 根據請求項 1 的方法，其中該血漿組分是血漿蛋白組分。
3. 根據請求項 2 的方法，其中該血漿蛋白組分包含 83% 至 95% 的白蛋白。
4. 根據前述請求項中任一項的方法，其中該施用是按照脈衝劑量給藥方案進行的。
5. 根據前述請求項中任一項的方法，其中該肝臟疾病是急性肝衰竭。
6. 根據請求項 1 至 5 的方法，其中該肝臟疾病是慢性肝衰竭。
7. 根據請求項 1 至 5 的方法，其中該肝臟疾病是慢加急性肝衰竭。
8. 一種改善受試者肝切除手術恢復的方法，該方法包含向該受試者施用有效量的血漿組分。
9. 根據請求項 8 的方法，進一步包含術後執行的給藥步驟。
10. 一種改善受試者肝移植手術恢復的方法，該方法包含向該受試者施用有效量的血漿組分。
11. 根據請求項 10 的方法，進一步包含術後執行的給藥步驟。
12. 根據請求項 1 的方法，其中該血漿組分由組分 IV-1 糊狀物組成。

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