TW202122093A

TW202122093A - 化合物、藥物綴合物、試劑盒及其用途

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Publication number: TW202122093A
Application number: TW109129461A
Authority: TW
Inventors: 鴻雁張; 志偉楊; 高山; 曹力強; 劉國成
Original assignee: 大陸商蘇州瑞博生物技術股份有限公司
Priority date: 2019-08-29
Filing date: 2020-08-28
Publication date: 2021-06-16
Also published as: CN113891892B; WO2021037205A1; EP4023659A1; EP4023659A4; JP2022546055A; CN113891892A; US20230076803A1

Abstract

一種具有如式（101）所示的結構的化合物及相應的藥物綴合物，該藥物綴合物能夠特異性地靶向細胞，毒性低，並具有優異的遞送效率。

Description

化合物、藥物綴合物、試劑盒及其用途

本發明關於一種用於與活性藥物綴合的化合物、相應的藥物綴合物及其製備方法以及用途。本發明還關於使用該藥物綴合物預防和/或治療病理狀況或疾病的方法。

遞送系統是小核酸藥物開發中的核心關鍵技術之一，目前全球範圍內對小核酸遞送系統研究最廣泛的一類遞送系統是靶向綴合遞送技術。開發一種新的具有較高活性藥物體內遞送效率、較低的毒性、較高活性的藥物綴合物，在本領域中仍存在迫切需求。

針對上述需求，發明人發明了一種具有較高體內遞送效率、較低的毒性和/或較好的穩定性的用於與活性藥物綴合的化合物、相應的活性藥物綴合物、其製備方法及應用。

在一些實施方式中，本發明提供了一種化合物，該化合物具有式（101）所示的結構：

式（101）其中，A₀ 具有如式（312）所示的結構：

式（312）式中，n₁ 為1-4的整數，n₂ 為0-3的整數；每個L₁ 是長度為1-70個碳原子的直鏈亞烷基，其中一個或多個碳原子任選地被選自於以下基團所組成的組中的任何一個或多個所替換：C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)₂ 、C₂ -C₁₀ 亞烯基、C₂ -C₁₀ 亞炔基、C₆ -C₁₀ 亞芳基、C₃ -C₁₈ 亞雜環基和C₅ -C₁₀ 亞雜芳基；並且其中，L₁ 任選地具有由以下基團所組成的組中的任何一個或多個的取代基：C₁ -C₁₀ 烷基、C₆ -C₁₀ 芳基、C₅ -C₁₀ 雜芳基、C₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-OC₁ -C₁₀ 烷基、OC₁ -C₁₀ 烷基苯基、-C₁ -C₁₀ 烷基-OH、-OC₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-SC₁ -C₁₀ 烷基、-SC₁ -C₁₀ 烷基苯基、-C₁ -C₁₀ 烷基-SH、-SC₁ -C₁₀ 鹵代烷基、鹵素取代基、-OH、-SH、-NH₂ 、-C₁ -C₁₀ 烷基-NH₂ 、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-NH(C₁ -C₁₀ 烷基)、N(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基苯基)、NH(C₁ -C₁₀ 烷基苯基)、氰基、硝基、-CO₂ H、-C(O)O(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CON(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CONH(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CONH₂ ，-NHC(O)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)C(O)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)C(O)(苯基)、C(O)C₁ -C₁₀ 烷基、C(O)C₁ -C₁₀ 烷基苯基、C(O)C₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-OC(O)C₁ -C₁₀ 烷基、-SO₂ (C₁ -C₁₀ 烷基)、-SO₂ (苯基)、-SO₂ (C₁ -C₁₀ 鹵代烷基)、-SO₂ NH₂ 、-SO₂ NH(C₁ -C₁₀ 烷基)、-SO₂ NH(苯基)、-NHSO₂ (C₁ -C₁₀ 烷基)、-NHSO₂ (苯基)和-NHSO₂ (C₁ -C₁₀ 鹵代烷基)。

每個S₁ 獨立地為M₁ ，其中任何活性羥基和/或氨基，如果有的話，都被保護基團保護；每個M₁ 獨立地選自能夠和細胞表面受體結合的配體；每個R₁ 各自獨立地選自H、取代或未取代的C₁ -C₄ 烴基或鹵素； R_j 為連接基團； R₇ 是任何能經過反應與羥基形成磷酸酯連接、硫代磷酸酯連接、硼代磷酸酯連接或羧酸酯連接、或者任何能經過反應與氨基形成醯胺鍵連接的官能團； R₈ 是羥基保護基團。

在一些實施方式中，本發明提供了一種化合物，該化合物具有式（111）所示的結構：

式（111）其中，每個A₀ 、每個R_j 和R₈ 各自的定義與選擇範圍與上述相同；W₀ 為連接基團；X選自O或NH；SPS表示固相載體；n為0-7的整數。

在一些實施方式中，X是O，W₀ 與X共同形成磷酸酯連接、硫代磷酸酯連接或硼代磷酸酯連接。

在一些實施方式中，本發明提供了一種藥物綴合物，該綴合物具有式（301）所示的結構：

式（301）其中，A具有如式（302）所示的結構，式中，Rj、R₁ 、L₁ 、M₁ 、n、n₁ 和n₂ 各自的定義和可選擇的範圍如前所述。

式（302） R₁₆ 和R₁₅ 各自為H或活性藥物基團，並且R₁₆ 和R₁₅ 中的至少一個為活性藥物基團。在一些實施方式中，所述活性藥物基團具有式A60所示的結構。W為連接基團。在一些實施方式中，W具有如式（A61）或式(C1’)所示的結構。

式（A60）式（A61）式(C1’)；其中，E₁ 為OH、SH或BH₂ ，n4選自1-4的整數。

表示基團連接的位點，Nu為功能性寡核苷酸。

在一些實施方式中，本發明提供了本發明的藥物綴合物在製備用於治療和/或預防由靶細胞中基因的表達而引起的病理狀況或疾病的藥物中的用途。

在一些實施方式中，本發明提供了一種治療由靶細胞中基因的表達而引起的病理狀況或疾病的方法，所述方法包括向患有該疾病的患者給予本發明的藥物綴合物。

在一些實施方式中，本發明提供了一種調控細胞中基因表達的方法，所述調控包括抑制或增強所述基因的表達，該方法包括將本發明的藥物綴合物與所述細胞接觸。

在一些實施方式中，本發明提供了一種試劑盒，所述試劑盒包含本發明的藥物綴合物。 [有益效果]

本發明提供的式（101）所示化合物或式（111）所示化合物可以和各種活性藥物基團，例如小分子藥物、單抗或功能性寡核苷酸綴合，得到本發明的藥物酸綴合物。該藥物綴合物可以特異性地將上述活性藥物遞送至目標器官或組織，與特定的靶點結合，調控蛋白質的的體內含量或功能，或者抑制或者加強需要抑制或加強的基因對應的mRNA的表達，對細胞相關基因的表達進行調節，從而對相關病理狀況或疾病進行預防和/或治療。在一些實施方式中，本發明提供的藥物綴合物中活性藥物為寡核苷酸，該藥物綴合物為寡核苷酸綴合物，該藥物綴合物具有較高的體內遞送效率、較低的毒性、較好的穩定性和/或較高的活性。

根據本發明的一些實施方式，當所述活性藥物為一種抑制B型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）基因表達的siRNA時，本發明提供的藥物綴合物能夠有效地靶向肝臟，在1 mg/kg的劑量下，抑制乙肝模型小鼠肝臟中至少65.77%的HBV基因表達；1mg/kg劑量下，HBV基因表達量抑制率可高達91.96%；同時，本發明的藥物綴合物還能夠有效地降低乙肝模型小鼠中的HBV表面抗原表達，在3 mg/kg的劑量下最高可以達到97.80%的HBV表面抗原表達抑制率和85.7%的HBV DNA抑制率。並且，在給藥劑量為3 mg/kg的劑量下，在高達140天的實驗時間內持續顯示出優異的HBV表達抑制作用。

根據本發明的一些實施方式，當所述活性藥物為一種抑制B型肝炎病毒基因表達的siRNA時，本發明提供的藥物綴合物能夠有效地將siRNA遞送到肝臟，並表現出優異的抑制HBV基因表達的特性。能夠在1mg/kg的劑量下抑制乙肝模型小鼠肝臟中至少68.3%、甚至78.7-88.5%的HBV基因表達。同時，本發明的藥物綴合物還能夠有效地降低乙肝模型小鼠中的HBV表面抗原表達，在3mg/kg的劑量下可以達到98.1%的HBV表面抗原表達抑制率和93.5%的HBV DNA抑制率，並且，在給藥劑量為3 mg/kg的劑量下，在高達84天的實驗時間內持續顯示出優異的HBV表達抑制作用。

根據本發明的一些實施方式，當所述活性藥物為一種抑制B型肝炎病毒基因表達的siRNA時，本發明提供的藥物綴合物能夠有效地將siRNA遞送到肝臟，並表現出優異的抑制HBV基因表達的特性。能夠在1mg/kg的劑量下抑制乙肝模型小鼠肝臟中至少50.4%、在一些實施方式中為76.2-84.6%的HBV基因表達。同時，本發明的藥物綴合物還能夠有效地降低乙肝模型小鼠中的HBV表面抗原表達，甚至在3mg/kg的劑量下可以達到82.5%的HBV表面抗原表達抑制率和83.9%的HBV DNA抑制率，並且，在給藥劑量為3 mg/kg的劑量下，在21天的實驗時間內持續顯示出較高的HBV表達抑制作用。

根據本發明的一些實施方式，當所述活性藥物為一種抑制B型肝炎病毒基因表達的siRNA時，本發明提供的藥物綴合物能夠有效地將siRNA遞送到肝臟，並表現出優異的抑制HBV基因表達的特性。能夠在1 mg/kg的劑量下抑制乙肝模型小鼠肝臟中至少65.8%、甚至76.3-84.1%的HBV基因表達。同時，本發明的藥物綴合物還能夠有效地降低乙肝模型小鼠中的HBV表面抗原表達，甚至在3 mg/kg的劑量下可以達到95.6%的HBV表面抗原表達抑制率和93.1%的HBV DNA抑制率，並且，在給藥劑量為3 mg/kg的劑量下，在長達56天的實驗時間內持續顯示出優異的HBV表達抑制效果。

根據本發明的一些實施方式，當所述活性藥物為一種抑制B型肝炎病毒基因表達的siRNA時，本發明提供的藥物綴合物能夠有效地將siRNA遞送到肝臟，並表現出優異的抑制HBV基因表達的特性。能夠在1 mg/kg的劑量下抑制乙肝模型小鼠肝臟中80%以上的HBV基因表達。同時，本發明的藥物綴合物還能夠有效地降低乙肝模型小鼠中的HBV表面抗原表達，甚至在3 mg/kg的劑量下可以達到最高99%以上的HBV表面抗原表達抑制率和90%以上的HBV DNA抑制率，並且，在給藥劑量為3 mg/kg的劑量下，在長達112天的實驗時間內持續顯示出優異的HBV表達抑制效果。

根據本發明的一些實施方式，當所述活性藥物為一種抑制血管生成素樣蛋白3（ANGPTL3）基因表達的siRNA時，本發明提供的藥物綴合物能夠有效地將siRNA遞送到肝臟，並表現出優異的抑制ANGPTL3基因表達的特性。在1mg/kg的劑量下抑制高脂模型小鼠肝臟中至少53.2%的ANGPTL3基因表達；3 mg/kg劑量下，ANGPTL3的mRNA抑制率高達86.4%，並且，在給藥劑量為3 mg/kg的劑量下、單次給藥的情況下，在長達49天的實驗時間內持續顯示出優異的ANGPTL3表達抑制及降血脂作用。

根據本發明的一些實施方式，當所述活性藥物為一種抑制載脂蛋白C3（ApoC3）基因表達的siRNA時，本發明提供的藥物綴合物能夠有效地將siRNA遞送到肝臟，並表現出優異的抑制APOC3基因表達的特性。在3 mg/kg的劑量下抑制高脂模型小鼠肝臟中至少71.4%的APOC3基因表達，並且，在給藥劑量為3 mg/kg的劑量下、單次給藥的情況下，在長達65天的實驗時間內持續顯示出優異的血脂抑制作用。

在某些實施方式中，本發明所述的藥物綴合物還表現出低的動物水平毒性和良好的安全性，例如，在一些實施方式中，對於本發明的綴合物，即使在C57BL/6J小鼠中給予高達起效濃度的100倍（按起效濃度3 mg/kg計），也未觀察到明顯的毒性反應。

上述實例說明，本發明提供的藥物綴合物能夠有效地將功能性活性藥物遞送到目標器官或組織並在體內長時間保持活性，從而可有效治療和/或預防由細胞中基因的表達而引起的病理狀況和疾病。

本發明的其他特徵和優點將在隨後的具體實施方式部分予以詳細說明。

以引用的方式併入本說明書中提及的所有出版物、專利以及專利申請均以引用的方式併入本文，其程度與每一單獨的出版物、專利以及專利申請均專門並且單獨地以引用的方式併入本文的程度相同。

以下對本發明的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用於說明和解釋本發明，並不用於限制本發明。

在上文及下文中，如無特別說明，大寫字母C、G、U、A或T表示核苷酸的鹼基組成；小寫字母d表示該字母d右側相鄰的一個核苷酸為去氧核糖核苷酸；小寫字母m表示該字母m左側相鄰的一個核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸；小寫字母f表示該字母f左側相鄰的一個核苷酸為氟代修飾的核苷酸；小寫字母s表示與該字母s左右相鄰的兩個核苷酸之間為硫代磷酸酯基連接；P1表示該P1右側相鄰的一個核苷酸為5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸類似物修飾的核苷酸，尤指乙烯基磷酸酯修飾的核苷酸（以下實施例中以VP表示）、5'-磷酸核苷酸（以下實施例中以P表示）或5'-硫代磷酸酯修飾的核苷酸（以下實施例中以Ps表示）。

在上文及下文中，“氟代修飾的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羥基被氟取代形成的核苷酸，“非氟代修飾的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羥基被非氟基團取代形成的核苷酸或核苷酸類似物，“核苷酸類似物”指能夠在核酸中代替核苷酸，但結構不同於腺嘌呤核糖核苷酸、鳥嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、脲嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶去氧核糖核苷酸的基團。如異核苷酸、橋聯的核苷酸（bridged nucleic acid，簡稱BNA）或無環核苷酸。所述甲氧基修飾的核苷酸指核糖基的2'-羥基被甲氧基取代而形成的核苷酸。

在本文的上下文中，“互補”或“反向互補”一詞可互相替代使用，並具有所屬技術領域具有通常知識者周知的含義，即，在雙鏈核酸分子中，一條鏈的鹼基與另一條鏈上的鹼基以互補的方式相配對。在DNA中，嘌呤鹼基腺嘌呤（A）始終與嘧啶鹼基胸腺嘧啶（T）（或者在RNA中為脲嘧啶（U））相配對；嘌呤鹼基鳥嘌呤（C）始終與嘧啶鹼基胞嘧啶（G）相配對。每個鹼基對都包括一個嘌呤和一個嘧啶。當一條鏈上的腺嘌呤始終與另一條鏈上的胸腺嘧啶（或脲嘧啶）配對，以及鳥嘌呤始終與胞嘧啶配對時，兩條鏈被認為是彼此相互補的，以及從其互補鏈的序列中可以推斷出鏈的序列。與此相應地，“錯配”在本領域中意指在雙鏈核酸中，對應位置上的鹼基並未以互補的形式配對存在。

在上文及下文中，如無特別說明，“基本上反向互補”是指所關於的兩段核苷酸序列之間存在不多於3個的鹼基錯配；“基本上完全反向互補”或者“實質上反向互補”是指兩段核苷酸序列之間存在不多於1個的鹼基錯配；“完全互補”指兩段核苷酸序列之間不存在鹼基錯配。

在上文及下文中，一個核苷酸序列與另外一個核苷酸序列存在核苷酸差異，指前者與後者相比，相同位置的核苷酸的鹼基種類發生了改變，例如，在後者中一個核苷酸鹼基為A時，在前者的相同位置處的對應核苷酸鹼基為U、C、G或者T的情況下，認定為兩個核苷酸序列之間在該位置處存在核苷酸差異。在一些實施方式中，以無鹼基核苷酸或其均等物代替原位置的核苷酸時，也可認為在該位置處產生了核苷酸差異。

在上文及下文中，特別是在描述本發明的式（101）所示的化合物、式（111）所示的化合物或式（301）所示的藥物綴合物的製備方法或用途時，有時會關於核苷單體（nucleoside monomer）的使用。除非特別說明，所述核苷單體指，根據欲製備的功能性寡核苷酸或藥物綴合物中核苷酸的種類和順序，亞磷醯胺固相合成中使用的修飾或未修飾的核苷亞磷醯胺單體（unmodified or modified RNA phosphoramidites，有時RNA phosphoramidites也稱為Nucleoside phosphoramidites）。亞磷醯胺固相合成為所屬技術領域具有通常知識者所習知的RNA合成中所用的方法。本發明所用的核苷單體均可商購得到。

在本發明的上下文中，除非另有說明，“綴合”是指兩個或多個各自具有特定功能的化學部分之間以共價連接的方式彼此連接；相應地，“綴合物”是指該各個化學部分之間通過共價連接而形成的化合物。進一步地，“藥物綴合物”表示一個或多個具有特定功能的化學部分共價連接至活性藥物上而形成的化合物。在下文中，有時，特別是在實施例中，也將本發明的藥物綴合物簡稱為“綴合物”。藥物綴合物應根據上下文，理解為藥物綴合物的總稱或由特定結構式表示的具體藥物綴合物。

如本文所使用的，不介於兩個字母之間或兩個符號之間的短橫（“-”）是用於指示取代基連接點的位置。例如：-C₁ -C₁₀ 烷基-NH₂ 通過C₁ -C₁₀ 烷基而連接。

如本文所使用的，“任選的”或“任選地”是指其後描述的事件或狀況可以發生或不發生，並且所述描述包括事件或狀況發生的情況和其中不發生的情況。例如，“任選地取代”的“烷基”包括下面定義的“烷基”和“取代烷基”。所屬技術領域具有通常知識者將理解的是，對於包含一個或多個取代基的任何基團，這些基團不打算引入空間上不切實際、合成上不可行和/或本身不穩定的任何取代或取代模式。

如本文所使用的，“烷基”是指具有指定數量的碳原子的直鏈和支鏈，所述數量通常為1到20個碳原子，例如1至10個碳原子，如1至8個或1至6個碳原子。例如，C₁ -C₆ 烷基包含1至6個碳原子的直鏈和支鏈烷基。當對具有特定數量的碳的烷基殘基進行命名時，旨在涵蓋所有具有該數量的碳的支鏈和直鏈形式；因此，例如，“丁基”意味著包括正丁基、仲丁基、異丁基和叔丁基；“丙基”包括正丙基和異丙基。亞烷基是烷基的子集，指與烷基相同、但具有兩個附著點的殘基。

如本文所使用的，“烯基”是指具有至少一個碳-碳雙鍵的不飽和支鏈或直鏈烷基，所述碳-碳雙鍵是通過從母體烷基的相鄰碳原子中除去一分子氫而獲得的。該基團可以處於雙鍵的順式或反式構型。典型的烯基基團包括但不限於：乙烯基；丙烯基，如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基（烯丙基）、丙-2-烯-2-基；丁烯基，例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基等等。在某些實施方式中，烯基基團具有2到20個碳原子，而在其他實施方式中，具有2至10個、2至8個或2至6個碳原子。亞烯基是烯基的一個子集，指與烯基相同、但具有兩個連接點的殘基。

如本文所使用的，“炔基”是指具有至少一個碳-碳三鍵的不飽和支鏈或直鏈烷基，所述碳-碳三鍵是通過從母體烷基的相鄰碳原子中除去兩個氫分子而獲得的。典型的炔基基團包括但不限於：乙炔基；丙炔基，如丙-1-炔-1-基，丙-2-炔-1-基；丁炔基，例如丁-1-炔-1-基，丁-1-炔-3-基，丁-3-炔-1-基等。在某些實施方式中，炔基具有2到20個碳原子，而在其他實施方式中，具有2至10、2至8或2至6個碳原子。亞炔基是炔基的子集，指的是與炔基相同、但具有兩個連接點的殘基。

如本文所使用的，“烷氧基”是指通過氧橋連接的指定數量碳原子的烷基，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、2-戊氧基、異戊氧基、新戊氧基、己氧基、2-己氧基、3-己氧基、3-甲基戊氧基等。烷氧基通常具有1至10個、1至8個、1至6個，或1至4個通過氧橋連接的碳原子。

如本文所使用的，“芳基”是指通過從環碳原子中除去氫原子而衍生自芳香族單環或多環烴環系統的基團。所述芳香族單環或多環烴環系統僅含有氫和6至18個碳原子的碳，其中所述環系統中的至少一個環是完全不飽和的，即，包含根據Hückel理論的環狀、離域的(4n+2)π-電子系統。芳基包括但不限於苯基、芴基和萘基等基團。亞芳基是芳基的子集，指與芳基相同、但具有兩個連接點的殘基。

如本文所使用的，“環烷基”是指非芳香族碳環，通常具有3至7個環碳原子。環可以是飽和的，或具有一個或多個碳-碳雙鍵。環烷基的實例包括環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基和環己烯基，以及橋聯和籠狀環基團，如降冰片烷（norbornane）。

如本文所使用的，“鹵素取代基”或“鹵代”指氟代、氯代、溴代和碘代，術語“鹵素”包括氟、氯、溴和碘。

如本文所使用的，“鹵代烷基”是指指定數量的碳原子被一個或多個、直至最大允許數量的鹵素原子取代的如上述所定義的烷基。鹵代烷基的實例包括但不限於三氟甲基、二氟甲基、2-氟乙基和五氟乙基。

“雜環基”是指穩定的3至18員非芳香族環基，包含2-12個碳原子和選自氮、氧和硫的1-6個雜原子。除非說明書中另有說明，否則雜環基是單環、雙環、三環或四環系統，可包括稠環或橋環系統。雜環基中的雜原子可以任選地被氧化。一個或多個氮原子（如果存在的話）任選地被季銨化。雜環基是部分飽和或完全飽和的。雜環基可以通過任何環原子連接至分子的其餘部分。此類雜環基的實例包括但不限於：二噁烷基、噻吩基[1,3]二硫醯基(thienyl[1,3]dithianyl)、十氫異喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、異噻唑烷基、異噁唑烷基、嗎啉基、八氫吲哚基、八氫異吲哚基、2-氧雜呱嗪基、2-氧雜呱啶基、2-氧雜吡咯烷基、噁唑烷基、呱啶基、呱嗪基、4-呱啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎寧環基、噻唑烷基、四氫呋喃基、三硫醯基(trithianyl)、四氫吡喃基、硫代嗎啉基（thiomorpholinyl）、硫雜嗎啉基（thiamorpholinyl）、1-氧代硫嗎啉基（1-oxo-thiomorpholinyl）和1,1-二氧代硫嗎啉基（1,1-dioxo-thiomorpholinyl）。

“雜芳基”指由3至18員芳香族環自由基衍生的基團，包含2個至17個碳原子和選自氮、氧和硫的1至6個雜原子。如本文所使用的，雜芳基可以是單環、雙環、三環或四環系統，其中環系統中的至少一個環是完全不飽和的，即，所述環包含根據Hückel理論的環狀離域(4n+2)π-電子體系。雜芳基包括稠環或橋環系統。雜芳基中的雜原子被任選地氧化。一個或多個氮原子（如果存在的話）任選地被季銨化。雜芳基通過任何環原子連接至分子的其餘部分。雜芳基的實例包括但不限於：氮雜環庚三烯基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并吲哚基、1,3-苯并二噁唑基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并[d]噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二噁庚英基(benzo[b ][1,4]dioxepinyl)、苯并[b][1,4]噁嗪基（benzo[b][1,4]oxazinyl）、1,4-苯并二噁烷基（1,4-benzodioxanyl）、苯并萘並呋喃基、苯并噁唑基、苯并間二氧雜環戊烯基(benzodioxolyl)、苯并二噁英基(benzodioxinyl)、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基、苯并噻吩并[3,2-d]嘧啶基、苯并***基、苯并[4,6]咪唑並[1,2-a]吡啶基、哢唑基、噌啉基（cinnolinyl）、環戊烷并[d]嘧啶基、6,7-二氫-5H-環戊烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6-二氫苯并[h]喹唑啉基（5,6-dihydrobenzo[h]quinazolinyl）、5,6-二氫苯并[h]噌啉基（5,6 dihydrobenzo[h]cinnolinyl）、6,7-二氫-5H-苯并[6,7]環庚烷并[1,2-c]噠嗪基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、呋喃並[3,2-c]吡啶基、5,6,7,8,9,10-六氫環辛烷并[d]嘧啶基、5,6,7,8,9,10-六氫環辛烷并[d]噠嗪基、5,6,7,8,9,10-六氫環辛烷并[d]吡啶基、異噻唑基、咪唑基、吲唑基（indazolyl）、吲哚基、異吲哚基、二氫吲哚基、異二氫吲哚基、異喹啉基、吲哚嗪基（indolizinyl）、異噁唑基、5,8-甲醇-5,6,7,8-四氫喹唑啉基（5,8-methano-5,6,7,8-tetrahydroquinazolinyl）、萘啶基（naphthyridinyl）、1,6-萘啶酮基（1,6-naphthyridinonyl）、噁二唑基、2-氧雜吖庚因基（2-oxoazepinyl）、噁唑基、氧雜環丙烷基（oxiranyl）、5,6,6a,7,8,9,10,10a-八氫苯并[H]喹唑啉基、1-苯基-1H -吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基（phthalazinyl）、蝶啶基（pteridinyl）、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡唑並[3,4-d]嘧啶基、吡啶基、吡啶并[3,2-d]嘧啶基、吡啶并[3,4-d]嘧啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基、吡咯基、喹唑啉基、喹喔啉基（quinoxalinyl）、喹啉基、四氫喹啉基、5,6,7,8-四氫喹唑啉基、5,6,7,8-四氫苯并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、6,7,8,9-四氫-5H-環庚烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6,7,8-四氫吡啶并[4,5-c]噠嗪基、噻唑基、噻二唑基、***基、四唑基、三嗪基、噻吩并[2,3-d]嘧啶基、噻吩并[3,2-d]嘧啶基、噻吩并[2,3-c]吡啶基（thieno[2,3-c]pridinyl）和噻吩基（thiophenyl/thienyl）。

在本發明中可以使用各種保護基團。一般來說，保護基團使化學官能團對特定的反應條件不敏感，並且可以在分子中的該官能團上附加以及去除，而實質上不損害分子的其餘部分。在一些實施方式中，本發明中使用的保護基團包括但不限於羥基保護基團和/或氨基保護基團。代表性的羥基保護基團公開於Beaucage等人，Tetrahedron 1992, 48, 2223-2311，以及Greeneand Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，Chapter 2, 2d ed，John Wiley & Sons，New York，1991中，以引用的方式將上述文獻整體併入本文。在一些實施方式中，羥基保護基團在鹼性條件下穩定，但可以在酸性條件下脫除。在一些實施方式中，本文可使用的羥基保護基的非排他性實例包括二甲氧基三苯甲基（DMT）、單甲氧基三苯甲基、9-苯基黃嘌呤-9-基（Pixyl）和9-(對甲氧基苯基)黃嘌呤-9-基（Mox）。在一些實施方式中，本文可使用的羥基保護基的非排他性實例包括Tr（三苯甲基）、MMTr（4-甲氧基三苯甲基）、DMTr（4,4’-二甲氧基三苯甲基）和TMTr（4,4’,4’’-三甲氧基三苯甲基）。在一些實施方式中，本文可使用的氨基保護基的非排他性實例包括苄氧羰基（Cbz）、叔丁氧羰基（Boc）、芴甲氧羰基（Fmoc）、烯丙氧羰基（Alloc）、三甲基矽乙氧羰基（Teoc）、任選取代的鹵代醯基（如乙醯基或三氟乙醯基）和苄基（Bn）。

“受試者”一詞，如本文所使用的，指任何動物，例如哺乳動物或有袋動物。本發明的受試者包括但不限於人類、非人靈長類（例如，恆河猴或其他類型的獼猴）、小鼠、豬、馬、驢、牛、綿羊、大鼠和任何種類的家禽。

如本文所使用的，“治療”、“減輕”、或“改善”可在此處互換使用。這些術語指的是獲得有益的或期望的結果的方法，包括但不限於治療益處。“治療益處”意味著根除或改善被治療的潛在障礙。此外，治療益處通過根除或改善與潛在障礙相關的一個或多個生理症狀，從而在受試者中觀察到改善而獲得，儘管受試者可能仍然受到潛在障礙的折磨。

如本文所使用的，“防止”和“預防”可互換使用。這些術語指獲得有益或期望的結果的方法，包括但不限於預防性益處。為了獲得“預防性益處”，可將綴合物或組合物給予有罹患特定疾病風險的受試者，或給予報告疾病的一種或多種生理症狀的受試者，即便可能該疾病的診斷尚未作出。

[第一種化合物]

在一個方面，本發明提供了一種化合物，該化合物具有式（101）所示的結構：

式（101）其中，R_j 為連接基團； R₇ 是任何能經過反應與羥基形成磷酸酯連接、硫代磷酸酯連接、硼代磷酸酯連接或羧酸酯連接、或者能經過反應與氨基形成醯胺鍵連接的官能團； R₈ 是羥基保護基團； A₀ 具有如式（312）所示的結構：

式（312）式（312）中，n₁ 為1-4的整數，n₂ 為0-3的整數；每個L₁ 是長度為1-70個碳原子的直鏈亞烷基，其中一個或多個碳原子任選地被選自於以下基團所組成的組中的一個或多個所替換：C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)₂ 、C₂ -C₁₀ 亞烯基、C₂ -C₁₀ 亞炔基、C₆ -C₁₀ 亞芳基、C₃ -C₁₈ 亞雜環基和C₅ -C₁₀ 亞雜芳基，並且其中，L₁ 可任選地具有由以下基團所組成的組中的任何一個或多個的取代基：C₁ -C₁₀ 烷基、C₆ -C₁₀ 芳基、C₅ -C₁₀ 雜芳基、C₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-OC₁ -C₁₀ 烷基、OC₁ -C₁₀ 烷基苯基、-C₁ -C₁₀ 烷基-OH、-OC₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-SC₁ -C₁₀ 烷基、-SC₁ -C₁₀ 烷基苯基、-C₁ -C₁₀ 烷基-SH、-SC₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-鹵素取代基、-OH、-SH、-NH₂ 、-C₁ -C₁₀ 烷基-NH₂ 、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-NH(C₁ -C₁₀ 烷基)、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基苯基)、-NH(C₁ -C₁₀ 烷基苯基)、氰基、硝基、-CO₂ H、-C(O)O(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CON(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CONH(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CONH₂ ，-NHC(O)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)C(O)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)C(O)(苯基)、C(O)C₁ -C₁₀ 烷基、C(O)C₁ -C₁₀ 烷基苯基、C(O)C₁ -C₁₀ 鹵烷基、-OC(O)C₁ -C₁₀ 烷基、-SO₂ (C₁ -C₁₀ 烷基)、-SO₂ (苯基)、-SO₂ (C₁ -C₁₀ 鹵代烷基)、-SO₂ NH₂ 、-SO₂ NH(C₁ -C₁₀ 烷基)、-SO₂ NH(苯基)、-NHSO₂ (C₁ -C₁₀ 烷基)、-NHSO₂ (苯基)和-NHSO₂ (C₁ -C₁₀ 鹵代烷基)。

在一些實施方式中，L₁ 可選自於由A1-A26基團或其任意組合所組成的組：

、

、

、

、（A1）（A2）（A3）（A4）

、

、

、

、（A5）（A6）（A7）（A8）

、

、

、（A9）（A10）（A11）

、

、

、（A12）（A13）（A14）

、

、

、（A15）（A16）（A17）

、

、

、

、（A18）（A19）（A20）（A21）

、

、

、（A22）（A23）（A24）

、

；（A25）（A26）其中，j1為1-20的整數；j2為1-20的整數；R’為C₁ -C₁₀ 烷基；Ra選自式A27-A45基團中的一種：

、

、

、

、

、

、（A27）（A28）（A29）（A30）（A31）（A32）

、

、

、

、

、（A33）（A34）（A35）（A36）（A37）

、

、

、

、

、（A38）（A39）（A40）（A41）（A42）

、

或

；（A43）（A44）（A45） Rb為C₁ -C₁₀ 烷基；

表示基團共價連接的位點。

具有通常知識者會理解的是，儘管為了方便起見，L₁ 被定義為線性烷基，但是它可能不是線性基團或者名稱不同，例如由於上述置換和/或置換而產生的氨或烯基。為了本發明內容的目的，L₁ 的長度是連接兩個附著點的鏈中的原子數。為此目的，將替換所述直鏈亞烷基的碳原子而得到的環（如亞雜環基或亞雜芳基）計為一個原子。

在一些實施方式中，式（312）中，每個S₁ 獨立地為M₁ ，其中任何活性羥基和/或氨基，如果有的話，都被保護基團保護；每個M₁ 獨立地選自能夠和細胞表面受體結合的配體。在一些實施方式中，式（312）中，每個R₁ 各自獨立地選自H、取代或未取代的C₁ -C₄ 烴基或鹵素；n₁ 可以為1-4的整數，n₂ 可以為0-3的整數；在一些實施方式中，n₁ 為1-2的整數，n₂ 為1-2的整數，這樣可以使得藥物綴合物結構更加穩定。從合成容易程度、結構/製程成本和遞送效率等多方面考慮，在一些實施方式中，n₁ 為2，n₂ 為1，此時，A₀ 具有如式（120）所示的結構：

式（120）。

所屬技術領域具有通常知識者可以理解，當每個R₁ 各自獨立地選自H、取代或未取代的C₁ -C₄ 烴基或鹵素中的一種時，不會改變式（101）所示的化合物的性質，均可以實現本發明的目的。但是，為了簡化本發明提供的化合物，並且為了合成方便，在一些實施方式中，每個R₁ 均為H。

R_j 為含有三個共價連接位點的連接基團，起到在式（101）所示的化合物中連接式A₀ 、提供適當的空間位置的作用。在一些實施方式中，R_j 為能夠實現與A₀ 、OR₇ 和OR₈ 的連接的任意基團。基於便於合成的考慮，在一些實施方式中，R_j 中可具有醯胺鍵結構或者酯鍵結構。在一些實施方式中，R_j 選自式A62-A67基團中的一種：

、

、

、

式（A62）式（A63）式（A64）式（A65）

、

式（A66）式（A67）。其中，R_j 可以任意地與A₀ 、OR₇ 以及OR₈ 連接，在一些實施方式中，式A62-A67中的每個“*”表示連接到A₀ 的位點，式A62-A67中的每個“**”或“#”各自獨立地表示連接到OR₇ 或OR₈ 的位點。在一些實施方式中，R_j 具有手性。在一些實施方式中，R_j 是外消旋的。在一些實施方式中，R_j 是手性純的。

在一些實施方式中，期望與式（101）所示的化合物綴合的活性藥物是功能性寡核苷酸。在一些實施方式中，R₇ 是任何能經過反應與羥基形成磷酸酯連接、硫代磷酸酯連接、硼代磷酸酯連接或羧酸酯連接、或者能經過反應與氨基形成醯胺鍵連接的官能團。從而，經上述磷酸酯連接、硫代磷酸酯連接、羧酸酯連接或者醯胺鍵連接，可將式（101）所示的化合物連接至具有羥基的固相載體，從而為後續與核苷單體的連接提供合適的反應環境；或者，可通過上述磷酸酯連接、硫代磷酸酯連接、羧酸酯連接或者醯胺鍵連接將式（101）所示的化合物與連接至固相載體的核苷酸序列上的羥基相連接，從而將式（101）所示的化合物綴合至活性藥物、特別是功能性寡核苷酸。

在一些實施方式中，R₇ 為具有式（A46）所示結構的含亞磷醯胺官能團的基團：

式（A46）其中，B₁ 選自取代或未取代的C₁ -C₅ 烴基；B₂ 選自C₁ -C₅ 烷基、乙氰基、丙氰基和丁氰基中的一種。在一些實施方式中，所述含亞磷醯胺官能團的基團具有式（C3）所示的結構：

。（C3）

在一些實施方式中，R₇ 為具有式（C1）或式（C2）所示結構的包含羧基或羧酸鹽官能團的基團。其中，n4為1-4的整數，M⁺ 為陽離子，

表示基團連接的位點。

（C1）（C2）羥基保護基團R₈ 的選擇是為了取代羥基上的氫，形成不具有反應活性的基團，該保護基團R₈ 可在後續反應過程中脫除，從而重新釋放出活性羥基參與後續反應。所述羥基保護基團的種類為所屬技術領域具有通常知識者所習知，例如，可以是Tr（三苯甲基）、MMTr（4-甲氧基三苯甲基）、DMTr（4,4’-雙甲氧基三苯甲基）或TMTr（4,4’,4’’-三甲氧基苯甲基）。在一些實施方式中，R₈ 可以是DMTr，即4,4’-雙甲氧基三苯甲基（4,4’-dimethoxytrityl）。

根據上述描述，所屬技術領域具有通常知識者容易理解的是，相較於本領域習知的亞磷醯胺固相合成方法而言，可通過上述R₇ 以及R₈ ，將式（101）所示的化合物連接至核苷酸序列的任意可能的位置，例如，式（101）所示的化合物連接至核苷酸序列的端部，式（101）所示的化合物連接至核苷酸序列的末端。相應地，除非另有說明，以下關於式（101）所示的化合物的反應的描述中，當提及“脫保護”、“偶聯”、“蓋帽”、“氧化”、“硫化”等反應時，應當理解為本領域習知的亞磷醯胺核酸固相合成方法中所關於的反應條件和試劑也同樣適用於這些反應。示例性的反應條件和試劑將在後文詳細描述。

L₁ 的作用是將能夠與細胞表面受體結合的M₁ 配體或M₁ 配體經保護後得到的S₁ 基團與式（312）中雜環結構上的N原子連接，從而為本發明的藥物綴合物提供靶向功能。在一些實施方式中，選自式A1-A26基團中的一種或多種的連接組合均能夠實現上述目的。為了使藥物綴合物中，M₁ 配體之間的空間位置更適合M₁ 配體與細胞表面受體結合，並節省成本，在一些實施方式中，L₁ 選自A1、A2、A4、A5、A6、A8、A10、A11和A13中的一種或多種的連接組合，在一些實施方式中，L₁ 選自A1、A2、A4、A8、A10和A11中至少2個的連接組合，在一些實施方式中，L₁ 選自A1、A2、A8、A10中至少2個的連接組合。

為了實現L₁ 的上述功能，在一些實施方式中，L₁ 的長度可以為3-25個原子，3-20個原子、4-15個原子或5-12個原子。除非另有說明，在本文的上文及下文中，所述L₁ 的長度是指與式（302）中雜環結構上的N原子連接的原子到與S₁ （或在後文所述綴合物中的M₁ ）連接的原子形成的最長的原子鏈上的成鏈原子的個數。

式A1-A26中，j1、j2、R’、Ra、Rb各自選擇的範圍，也是為了實現藥物綴合物中，M₁ 配體與A上的N原子連接，並使M₁ 配體之間的空間位置更適合M₁ 配體與細胞表面受體結合。因此，在一些實施方式中，j1為2-10的整數，在一些實施方式中，j1為3-5的整數。在一些實施方式中，j2為2-10的整數，在一些實施方式中，j2為3-5的整數。在一些實施方式中，R’為C₁ -C₄ 烷基，在一些實施方式中，R’為甲基、乙基和異丙基中的一種。在一些實施方式中，Ra為A27、A28、A29、A30和A30中的一種，在一些實施方式中，Ra為A27或A28。Rb為C₁ -C₅ 烷基，在一些實施方式中，Rb為甲基、乙基、異丙基和丁基中的一種。

在一些實施方式中，所述藥學上可接受的靶向基團可以選自以下靶向分子或其衍生物形成的配體中的一種或多種：親脂類分子，例如膽固醇、膽汁酸、維生素（例如維生素E）、不同鏈長的脂質分子；聚合物，例如聚乙二醇；多肽，例如透膜肽；適配體；抗體；量子點；糖類，例如乳糖、聚乳糖、甘露糖、半乳糖、N-乙醯半乳糖胺（GalNAc）；內涵體裂解物質（endosomolytic component）；葉酸（folate）；肝實質細胞表達的受體配體，例如去唾液酸糖蛋白、去唾液酸糖殘基、脂蛋白（如高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等）、胰高血糖素、神經遞質（如腎上腺素）、生長因數、轉鐵蛋白等。

在一些實施方式中，所述的每個配體獨立地選自一個能夠與細胞表面受體結合的配體。在一些實施方式中，至少一個配體是能夠與肝細胞表面受體結合的配體。在一些實施方式中，至少一個配體是能夠與哺乳動物肝細胞表面受體結合的配體。在一些實施方式中，至少一個配體是能夠與人肝細胞表面受體結合的配體。在一些實施方式中，至少一個配體是能夠與肝表面去唾液酸糖蛋白受體（ASGPR）結合的配體。至少一個配體是能夠與肺部細胞表面受體結合的配體。在一些實施方式中，至少一個配體是能夠與腫瘤細胞表面受體結合的配體。這些配體的種類為所屬技術領域具有通常知識者所習知，其作用一般是與細胞表面的特異性受體相結合，介導與配體連接的雙鏈寡核苷酸遞送至細胞。

在一些實施方式中，所述藥學上可接受的靶向基團可以是與哺乳動物肝細胞表面上的去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)結合的任意一種配體。在一些實施方式中，每個配體獨立地為去唾液酸糖蛋白，例如去唾液酸血清類黏蛋白（asialoorosomucoid，ASOR）或去唾液酸胎球蛋白（asialofetuin，ASF）。在一些實施方式所述配體為糖或糖的衍生物。在一些實施方式中，所述藥學上可接受的靶向基團可以是腫瘤細胞表面受體結合的任意一種配體。在一些實施方式中，所述配體為葉酸或葉酸的衍生物。

在一些實施方式中，至少一個配體是糖。在一些實施方式中，每個配體均是糖。在一些實施方式中，至少一個配體是單糖、多糖、修飾的單糖、修飾的多糖或糖衍生物。在一些實施方式中，至少一個所述配體可以是單糖，雙糖或三糖。在一些實施方式中，至少有一個配體是修飾的糖。在一些實施方式中，每一個配體均為修飾的糖。在一些實施方式中，每個配體均獨立地選自多糖、修飾的多糖、單糖、修飾的單糖、多糖衍生物或單糖衍生物。在一些實施方式中，每一個或至少一個配體選自由葡萄糖及其衍生物組、甘露聚糖及其衍生物、半乳糖及其衍生物、木糖及其衍生物、核糖及其衍生物、岩藻糖及其衍生物、乳糖及其衍生物、麥芽糖及其衍生物，***糖及其衍生物、果糖及其衍生物和唾液酸組成的組。在一些實施方式中，每個M₁ 可以獨立地選自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-***糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺、N-三氟乙醯基半乳糖胺、N-丙醯基半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺、N-異丁醯基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-去氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-去氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二去氧-4-甲醯胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-去氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇醯基-α-神經氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙醯基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙醯基-2-去氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脫水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖或L-4-硫代核糖。在一些實施方式中，每個M₁ 均為N-乙醯基半乳糖胺（GalNAc）。配體的另外的選擇可參見例如CN105378082A的記載，以引用的方式將其全部公開內容併入本文。

在一些實施方式中，每個S₁ 獨立地是M₁ 中全部活性羥基被羥基保護基團保護而形成的基團，所述羥基保護基團在後續步驟中脫除，獲得M₁ 配體。在一些實施方式中，所述羥基保護基團為具有YCO-結構的醯基基團。

在一些實施方式中，每個S₁ 各自獨立地選自式A51-A59基團中的一種：

、

、

、（A51）（A52）（A53）

、

、

、（A54）（A55）（A56）

、

、

。（A57）（A58）（A59）

在一些實施方式中，S₁ 為式A54或A55。

每個Y獨立地選自甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、異丙基、苯基、鹵代苯基以及烷基苯基中的一種；出於簡化本發明的式（101）所示的化合物的目的，在一些實施方式中，Y為甲基。

在一些實施方式中，每個M₁ 獨立地選自親脂類分子、糖類、維生素、多肽、內涵體裂解物質、類固醇化合物、萜烯化合物、整合素受體抑制劑和陽離子脂質分子中的分子或衍生物形成的配體中的一種。在一些實施方式中，每個M₁ 獨立地選自膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睾酮、1,3-雙-O（十六烷基）甘油（1,3,-Bis-O(hexadecyl)glycerol）、六甘油、薄荷醇、薄荷腦、1,3-丙二醇、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-（油醯基）石膽酸、苯噁嗪、葉酸、葉酸的衍生物、維生素A、維生素B7（biotin）、吡哆醛、熊果醇、三萜烯、軟木三萜酮、表木栓醇衍生石膽酸中的一種化合物所形成的配基。在一些實施方式中，每個M₁ 獨立地選自香葉基氧基己基、十七烷基、二甲氧基三苯甲基、龍舌蘭皂苷配基、薯蕷皂苷元、菝葜皂苷元中的一種。在一些實施方式中，每個M₁ 均獨立地為葉酸及其衍生物所形成的配基。葉酸的衍生物例如可以是葉酸類似物或葉酸模擬物。在一些實施方式中，每個M₁ 均獨立地為由以下化合物中的一種形成的配基：葉酸、葉酸類似物或葉酸類比物。在一些實施方式中，葉酸類似物為與主鏈結構與葉酸相似、並且葉酸在同一受體結合位點上具有類似官能團的基團。在一些實施方式中，葉酸類比物為與葉酸具有相同的主要官能團、並且這些主要官能團與葉酸的對應官能團在空間構型方面也相似的基團。

在一些實施方式中，每個M₁ 各自獨立地選自式H1-H5基團中的一種：

式（H1）式（H2）

，

式（H3）式（H4）

式（H5）其中，n3選自1-5的整數。在一些實施方式中，M₁ 為式（H1）所示的基團。

在一些實施方式中，每個S₁ 獨立地選自式A71-A75基團中的一種：

式（A71）式（A72）

式（A73）式（A74）

式（A75）其中，n3選自1-5的整數，Fm是指9-芴甲基。在一些實施方式中，S₁ 為式（A71）所示的基團。

根據本發明的一些實施方式，式（101）所示化合物具有式（403）、（404）、（405）、（406）、（407）或（408）所示的結構：

式（403）

式（404）

式（405）

式（406）

式（407）

式（408）。

[式（101）所示化合物的製備]

可以採用任意合理的合成路線製備本發明的式（101）所示化合物。

在一些實施方式中，式（101）所示化合物可以採用如下方法製備，該製備方法包括：在有機溶劑中，在取代反應條件下，以及在活化劑和催化劑存在下，將式（102）所示化合物與式（103）所示的亞磷醯二胺接觸，分離出式（101）所示化合物：

式（102）

式（103） A₀ 、R_j 、R₈ 各自的定義和可選擇的範圍如前所述，每個B₁ 獨立地為C₁ -C₅ 烷基；B₂ 選自C₁ -C₅ 烷基、乙氰基、丙氰基和丁氰基中的一種。此時，所獲得的式（101）化合物中，R₇ 為式（C3）所示的含亞磷醯胺官能團的基團。

式（103）所示化合物可通過商購得到，或可由所屬技術領域具有通常知識者通過習知的方法合成獲得。在一些實施方式中，式（103）化合物為可通過商購得到的雙(二異丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦。

所述取代反應條件包括反應溫度為0-100^o C，反應時間為1-20小時，在一些實施方式中，所述取代反應條件包括反應溫度為10-40^o C，反應時間為2-8小時。

所述有機溶劑可以是環氧類溶劑、醚類溶劑、鹵代烷類溶劑、二甲基亞碸、N,N-二甲基甲醯胺和N,N-二異丙基乙胺中的一種或多種。所述環氧類溶劑例如可以為二氧六環和/或四氫呋喃，所述醚類溶劑例如可以為***和/或甲基叔丁基醚，所述鹵代烷類溶劑例如可以為二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一種或多種，在一些實施方式中，所述有機溶劑為二氯甲烷。相對於所述式（102）所示化合物，所述有機溶劑的用量可以是3-50L/mol，例如可以為5-20L/mol。

所述活化劑可以是三氟乙酸吡啶鹽。相對於所述式（102）所示化合物，所述活化劑的用量可以是0.1:1-5:1，例如可以為0.5:1-3:1。

所述催化劑可以是N-甲基咪唑或N-甲基咪唑，例如可以為N-甲基咪唑。相對於所述式（102）所示化合物，所述催化劑的用量可以是0.1:1-5:1，例如可以為0.5:1-3:1。

所述式（103）所示化合物與式（102）所示化合物的莫耳比可以是0.5:1-5:1，例如可以為0.5:1-3:1。

可使用任何合適的分離方法從反應混合物中分離式（101）化合物。在一些實施方式中，可通過蒸發除去溶劑、隨後通過色譜方法分離式（101）化合物，例如，可使用如下色譜條件進行分離：正相純化矽膠：200-300目矽膠填料，使用石油醚:乙酸乙酯=2:1-1:2梯度沖提；反相純化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈=0.1:1-1:0.1梯度沖提。在一些實施方式中，可以直接除去溶劑得到式（101）化合物粗產品，該粗產品可以直接用於後續反應。

在一些實施方式中，式（102）所示化合物可以通過以下製備方法得到：該方法包括在有機溶劑中，在醯胺化反應條件下，以及活化劑和三級胺類有機鹼存在下，將式（104）所示化合物與式（105）所示化合物接觸，分離出式（102）所示化合物：

式（104）

式（105）其中，n₁ 、n₂ 、R₁ 、R₈ 、R_j 各自的定義和可選擇的範圍如前所述。

式（105）化合物可通過商購得到，或可由所屬技術領域具有通常知識者通過各種方法製備，例如，可參照US8106022B2實施例1中所公開的方法製備某些式（105）化合物，以引用的方式將其全部內容整體併入本文。

所述醯胺化反應條件包括：反應溫度為0-100^o C，反應時間為8-48小時，在一些實施方式中，所述醯胺化反應條件為反應溫度10-40^o C，反應時間為8-20小時。

所述有機溶劑可以是環氧類溶劑、醚類溶劑、鹵代烷類溶劑、二甲基亞碸、N,N-二甲基甲醯胺和N,N-二異丙基乙胺中的一種或多種。所述環氧類溶劑例如可以為二氧六環和/或四氫呋喃，所述醚類溶劑例如可以為***和/或甲基叔丁基醚，所述鹵代烷類溶劑例如可以為二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一種或多種，在一些實施方式中，所述有機溶劑為二氯甲烷。相對於式（104）化合物，有機溶劑用量可以為3-50L/mol，例如可以為5-20L/mol。

所述活化劑可以為3-二乙氧基磷醯氧基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、二環己基碳二亞胺中的一種。例如可以為3-二乙氧基磷醯氧基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮（DEPBT）。相對於所述式（104）所示化合物，所述活化劑的用量可以為0.1:1-10:1，例如可以為1:1-5:1。

所述三級胺類有機鹼可以為三乙胺、三丙胺、三丁胺、二異丙基乙胺中的一種，例如可以為二異丙基乙胺。相對於所述式（104）所示化合物，所述三級胺類有機鹼的用量可以為0.5:1-20:1，例如可以為1:1-10:1。

所述式（105）所示化合物與所述式（104）所示化合物的莫耳比可以為0.5:1-100:1，例如可以為2:1-10:1。

與上述類似地，可使用任何合適的分離方法從反應混合物中分離式（102）化合物。在一些實施方式中，可通過蒸發除去溶劑、隨後通過色譜方法分離式（102）化合物，例如，可使用如下色譜條件進行分離：正相純化矽膠：200-300目矽膠填料，使用石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇=1:1:1:0.05~1:1:1:0.2梯度沖提；反相純化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈=0.1:1-1:0.1梯度沖提。在一些實施方式中，可以直接除去溶劑得到式（102）化合物粗產品，該粗產品可以直接用於後續反應。

在一些實施方式中，式（104）所示化合物可以通過以下製備方法得到：該方法包括在有機溶劑中，在取代反應條件下，將式（106）所示化合物與鹼性試劑接觸反應，分離出式（104）所示化合物：

式（106）其中，n₁ 、n₂ 、R₁ 、R₈ 、R_j 各自的定義和可選擇的範圍如前所述。

R₉ 為氨基保護基團，可以選自式A69或A70：

、

（A69）（A70）其中，式A70中的K表示鹵素，每個K選自F、Cl、Br、I中的一種；在一些實施方式中，K為F或Cl。

所述取代反應條件包括：反應溫度為0-100^o C，反應時間為5分鐘-5小時，在一些實施方式中，所述取代反應條件為反應溫度為10-40^o C，反應時間為0.3-3小時。

所述有機溶劑可以為環氧類溶劑、醚類溶劑、鹵代烷類溶劑、二甲基亞碸、N,N-二甲基甲醯胺和N,N-二異丙基乙胺中的一種或多種。所述環氧類溶劑例如可以為二氧六環和/或四氫呋喃，所述醚類溶劑例如可以為***和/或甲基叔丁基醚，所述鹵代烷類溶劑例如可以為二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一種或多種，在一些實施方式中，所述有機溶劑為N,N-二甲基甲醯胺。相對於式（106）化合物，有機溶劑用量可以為1-50L/mol，例如可以為1-20L/mol。

所述鹼性試劑可以為呱啶、氨或甲胺中的一種或多種。在一些實施方式中，所述氨以25-28wt%水溶液的形式提供，所述甲胺以30-40wt%水溶液的形式提供，在一些實施方式中，所述鹼性試劑為呱啶，所述鹼性試劑與式（106）所示化合物的莫耳比可以為1:1-100:1，例如可以為10:1-50:1。

與上述類似地，可使用任何合適的分離方法從反應混合物中分離式（104）化合物。在一些實施方式中，可通過蒸發除去溶劑、隨後通過色譜方法分離式（104）化合物，例如，可使用如下色譜條件進行分離：正相純化矽膠：200-300目矽膠填料，使用乙酸乙酯:甲醇=1:1-1:10梯度沖提；反相純化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈=0.1:1-1:0.1梯度沖提。在一些實施方式中，可以直接除去溶劑得到式（104）化合物粗產品，該粗產品可以直接用於後續反應。

在一些實施方式中，式（106）所示化合物可以通過以下製備方法得到：該方法包括在有機溶劑中，在取代反應條件下，將式（107）所示化合物與羥基保護試劑接觸，分離出式（106）所示化合物：

式（107）其中，n₁ 、n₂ 、R₁ 、R_j 、R₉ 各自的定義和可選擇的範圍如前所述。

所述取代反應條件包括：反應溫度為0-100^o C，反應時間為8-48小時，在一些實施方式中，所述取代反應條件為反應溫度為10-40^o C，反應時間為8-24小時。所述有機溶劑可以為吡啶，相對於式（107）化合物，有機溶劑用量可以為1-50L/mol，例如可以為1-20L/mol。

所述羥基保護試劑可以是任何可以起到羥基保護作用的試劑，有些羥基保護試劑為所屬技術領域具有通常知識者所習知。在一些實施方式中，與Rj連接的兩個羥基具有相同的化學環境，此時，通過控制所述羥基保護劑與式（107）所示化合物的莫耳比，來控制反應程度，使得主要反應產物為僅有一個羥基被保護的產物；在一些實施方式中，與Rj連接的兩個羥基中僅有一個為伯醇羥基，此時，通過對羥基保護試劑進行選擇，使得主要反應產物為僅有一個羥基被保護的產物。在一些實施方式中，所述羥基保護試劑為三苯甲基氯、4-甲氧基三苯甲基氯、4,4'-雙甲氧基三苯甲基氯和4,4',4’’-三甲氧基三苯甲基氯中的一種。在一些實施方式中，所述羥基保護試劑為4,4'-雙甲氧基三苯甲基氯（DMTrCl）。所述羥基保護劑與式（107）所示化合物的莫耳比可以為1:1-50:1，在一些實施方式中，為1.2:1-2:1。與上述類似地，可使用任何合適的分離方法從反應混合物中分離式（106）化合物。在一些實施方式中，可通過蒸發除去溶劑、隨後通過色譜方法分離式（106）化合物，例如，可使用如下色譜條件進行分離：正相純化矽膠：200-300目矽膠填料，使用石油醚:乙酸乙酯=1:1混合液沖提；反相純化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈=0.1:1-1:0.1梯度沖提。在一些實施方式中，可以直接除去溶劑得到式（106）化合物粗產品，該粗產品可以直接用於後續反應。

在一些實施方式中，式（107）所示化合物可以通過以下製備方法得到：該方法包括在有機溶劑中，在醯胺化反應條件下，將式（108）所示化合物與選自式B62-B67化合物中的一種的氨基二醇以及醯胺化活化劑接觸，分離出式（107）所示化合物：

式（108）

、

、

、

、

、式（B62）式（B63）式（B64）式（B65）式（B66）

式（B67），其中，n₁ 、n₂ 、R₁ 、R₉ 各自的定義和可選擇的範圍如前所述。此時，所獲得的式（107）化合物中，R_j 選自式A62-A67基團中的一種。

所述氨基二醇可通過商購獲得，或者由所屬技術領域具有通常知識者通過習知的方法合成獲得。在一個具體的實施方式中，所述氨基二醇為式（B62）所示的3-氨基-1,2-丙二醇。

所述醯胺化反應條件包括反應溫度為0-100^o C，反應時間為8-48小時，在一些實施方式中，所述醯胺化反應條件包括：反應溫度為40-80^o C，反應時間為10-30小時。

所述有機溶劑可以是醯胺類溶劑、醇類溶劑或醚類溶劑。在一些實施方式中，所述醯胺類溶劑為例如二甲基甲醯胺，所述醇類溶劑為甲醇和/或乙醇。相對於式（108）所示化合物，所述有機溶劑的用量可以為1-50L/mol，例如1-20L/mol。

式B62-B67中的一種與式（108）所示化合物的莫耳比可以為0.1:1-20:1，例如可以為0.5:1-5:1。

在一些實施方式中，所述醯胺化活化劑可以為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、2-乙氧基-1-乙氧碳醯基-1,2-二氫喹啉或4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽，例如可以為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDCl）或2-乙氧基-1-乙氧碳醯基-1,2-二氫喹啉（EEDQ）。所述醯胺化活化劑與式（108）所示化合物的莫耳比可以為0.1:1-20:1，例如可以為0.5:1-5:1。

與上述類似地，可使用任何合適的分離方法從反應混合物中分離式（107）化合物。在一些實施方式中，可通過蒸發除去溶劑、隨後通過色譜方法分離式（107）化合物，例如，可使用如下色譜條件進行分離：正相純化矽膠：200-300目矽膠填料，使用石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇=1:1:1:0.05-1:1:1:0.15梯度沖提；反相純化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈=0.1:1-1:0.1梯度沖提。在一些實施方式中，可以直接除去溶劑得到式（107）化合物粗產品，該粗產品可以直接用於後續反應。

在一些實施方式中，式（108）所示化合物可以通過以下製備方法得到：該方法包括有機溶劑存在下，在取代反應條件下，將式（109）所示化合物與氨基保護劑接觸，分離出式（108）所示化合物：

式（109）其中，n₁ 、n₂ 、R₁ 各自的定義和可選擇的範圍如前所述。

所述取代反應條件包括反應溫度為0-100^o C，反應時間為4-48小時，在一些實施方式中，所述取代反應條件為反應溫度為10-40^o C，反應時間為8-30小時。

所述氨基保護劑可以為芴甲氧羰醯氯、三氟乙醯氯或三氯乙醯氯。在一些實施方式中，所述氨基保護劑為芴甲氧羰醯氯（Fmoc-Cl）。氨基保護劑與式（109）所示化合物的物質的量的比例可以為0.1:1-20:1，例如可以為1:1-10:1。

所述有機溶劑可以為環氧類溶劑、醚類溶劑、鹵代烷類溶劑、二甲基亞碸、N,N-二甲基甲醯胺和N,N-二異丙基乙胺中的一種或多種。所述環氧類溶劑例如可以為二氧六環和/或四氫呋喃，所述醚類溶劑例如可以為***和/或甲基叔丁基醚，所述鹵代烷類溶劑例如可以為二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一種或多種，在一些實施方式中，所述有機溶劑為二氧六環。在一些實施方式中，所述有機溶劑為水和二氧六環的混合物。在一些實施方式中，所述水和二氧六環的體積比可以為5:1-1:5、在一些實施方式中為3:1-1:3。相對於式（109）化合物，有機溶劑的總用量可以為0.1-50L/mol，例如0.5-10L/mol。

與上述類似地，可使用任何合適的分離方法從反應混合物中分離式（108）化合物。在一些實施方式中，可通過蒸發除去溶劑、隨後通過色譜方法分離式（108）化合物，例如，可使用如下色譜條件進行分離：正相純化矽膠：200-300目矽膠填料，使用石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷=1:1:1混合液沖提；反相純化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈=0.1:1-1:0.1梯度沖提。在一些實施方式中，可以直接除去溶劑得到式（108）化合物粗產品，該粗產品可以直接用於後續反應。

在一些實施方式中，式（109）所示化合物可通過各種方法製備得到，或者通過商購獲得。在一些實施方式中，全部R₁ 為氫、n₁ 為2、n₂ 為1，此時，式（109）所示的化合物是容易商購獲得的呱嗪-2-羧酸二鹽酸鹽。

[第二種化合物]

在一些實施方式中，本發明提供了一種化合物及其製備方法，該化合物具有式（111）所示的結構（111）所示化合物。

式（111）式中，每個A₀ 、每個R_j 、R₈ 各自的定義和可選擇的範圍如前所述，W₀ 為連接基團；X選自O或NH；SPS表示固相載體，n為0-7的整數。

W₀ 的作用是為式（111）所示化合物與固相載體之間、以及多個R_j 基團之間提供共價連接，W₀ 可以是任意的連接結構。在一些實施方式中，W₀ 具有如式（C1’）或式（A81）所示的結構：

,

式(C1') 式(A81) 其中，n4為1-4的整數，每個E₀ 獨立地為O、S或BH，每個B₂ 獨立地選自C₁ -C₅ 烷基、乙氰基、丙氰基和丁氰基，

表示基團連接的位點。

式（111）所示化合物中的固相載體SPS可以基於本領域中習知的可用於核酸固相合成的固相載體，例如，可以是以W₀ 基團取代市售的通用固相載體（NittoPhase®HL UnyLinker™ 300 Oligonucleotide Synthesis Support，Kinovate Life Sciences公司，結構如式B80所示）中的DMTr而獲得的固相載體部分：

（B80）。

在一些實施方式中，W₀ 是式（101）化合物中的R₇ 與固相載體上的羥基或其它式（101）化合物脫保護後產生的羥基反應形成亞磷醯胺連接，該亞磷醯胺連接再經過氧化、硫化或硼氫化反應後得到的連接基團。因此，B₂ 的選擇與式（101）中的對應基團相同，而E₀ 則可以是O、S或BH。在後續反應中，B₂ 基團可水解脫除形成羥基，形成的羥基隨後與E₀ 經構型互變形成磷醯氧基和式（A60）和式（A61）中的E₁ ，對應的E₁ 則分別為OH、SH或BH₂ 。綜合考慮成本與反應簡便的需要，在一些實施方式中，B₂ 為氰乙基，而E₀ 是O。

在一些實施方式中，W₀ 是式（101）化合物中的R₇ 與固相載體上的羥基或氨基、或者其它式（101）化合物脫保護後產生的羥基或氨基反應形成酯鍵或醯胺鍵而得到的連接基團。

根據本發明，n可以是0-7的整數，從而保證式（111）所示化合物中S₁ 基團的個數至少為2；在一些實施方式中，M₁ 配體是獨立地選自對哺乳動物肝臟細胞表面上的去唾液酸糖蛋白受體具有親合力的配體中的一種，並且n≥1，這樣可以使得藥物綴合物中，M₁ 配體的個數至少為4，從而使得M₁ 配體與肝表面去唾液酸糖蛋白受體更容易結合，進而促進藥物綴合物通過內吞作用進入細胞。實驗表示，當M₁ 配體的個數大於4個時，M₁ 配體與肝表面去唾液酸糖蛋白受體結合的容易程度增加並不明顯，因此，從合成容易程度、結構/製程成本和遞送效率等多方面綜合考慮，在一些實施方式中，n為1-4的整數。在一些實施方式中，n為1-2的整數。

在一些實施方式中，M₁ 配體是葉酸或其衍生物形成的配基，並且n=0。

參見後述，當活性藥物為功能性寡核苷酸時，式（111）所示化合物可用於代替常規亞磷醯胺核酸固相合成方法所使用的固相載體作為起始，按照亞磷醯胺固相合成方法依次連接核苷單體，從而將式（111）所示化合物綴合至核苷酸序列。在連接結束後，可將綴合至核苷酸序列的式（101）所示化合物從固相載體上切割下來，並隨後經分離純化等步驟，並且根據目標功能性寡核苷酸的結構，進行可選的退火步驟，最終獲得本發明的藥物綴合物。

根據本發明的一些具體實施方式，式（111）所示化合物具有式（503）、（504）、（505）、（506）、（507）、（508）、（509）或（510）所示的結構：

式（503）

式（504）

式（505）

式（506）

式（507）

式（508）

式（509）

式（510），其中，n4為選自1-4的整數。在一些實施方式中，上述式（503）-（510）化合物中的R₈ 為羥基保護基團為三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4’-雙甲氧基三苯甲基和4,4’,4’’-三甲氧基苯甲基中的一種，每個B₂ 均為乙氰基，每個E₀ 均為O。

在一種實施方式中，在一些實施方式中，X是O，W₀ 與X共同形成磷酸酯連接、硫代磷酸酯連接或硼代磷酸酯連接，式（111）所示化合物可以採用如下方法製備，該方法包括：

（Ia）脫除帶有經保護的羥基的固相載體上的保護基團，在偶聯反應條件和偶聯試劑存在下，將式（101）所示的化合物與固相載體接觸，隨後，進行蓋帽反應，再進行氧化、硫化或硼氫化反應。

式（111）所示化合物的製備方法還可以包括：（IIa）按照（Ia）的方法再進行n次（n的定義與式（111）中相同）與式（101）所示的化合物的接觸，每次均是對前一步驟得到的產物進行脫保護，隨後與式（101）所示的化合物相接觸，進行蓋帽反應，並進行氧化、硫化或硼氫化反應。

所述脫保護、偶聯、蓋帽、氧化、硫化或硼氫化反應可使用與常規亞磷醯胺固相合成方法中相同的條件與試劑，部分典型的反應條件和試劑將在後文詳細描述。

在一些實施方式中，X是O或者N，W₀ 與X共同形成羧酸酯連接或者醯胺鍵連接，式（111）所示化合物可以採用如下方法製備，該方法包括：（Ib）脫除帶有經保護的羥基或氨基的固相載體上的保護基團，在有機溶劑中，在縮合反應條件和縮合試劑存在下，使式（101）所示的化合物與該固相載體接觸，分離獲得含有經羧酸酯鍵或醯胺鍵式（111）所示化合物。

在一些實施方式中，由式A₀ 表示的基團中，每個S₁ 獨立地選自式A71-A75所示基團中的一種，並且每個S₁ 經由羧酸酯鍵或醯胺鍵連接至L₁ 基團，式（111）所示化合物可以採用如下方法製備，該方法包括：（Ic）在有機溶劑中，在縮合反應條件下，以及在胺基鹽酸鹽、縮合劑和雜環有機鹼的存在下，使式（121）所示的化合物和式（401）所示的化合物接觸，分離獲得式（111）所示化合物。

式（121） S₁ -X₄₀₁ 式（401）其中，A₁₀₀ 具有如式（402）所示的結構：

式（402）其中，X₄₀₁ 為羥基、氨基、鹵素或O^- M⁺ ，其中M⁺ 為陽離子；X₄₀₂ 為O或NH，並且L₂ 與X₄₀₂ 基團共同形成L₁ 連接基團；即L₂ 是L₁ 去掉X₄₀₂ 基團的部分。

SPS、X、W₀ 、R_j 、n₁ 、n₂ 、R₈ 和每個R₁ 的各自的定義與選擇範圍與上述相同。

式（401）所示化合物與式（121）所示化合物的用量比（莫耳比）可以是1:1-5:1，例如可以為2:1-3:1。所述有機溶劑可以為鹵代烷類溶劑或有機腈化合物中的一種或多種。鹵代烷類溶劑例如可以為二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷，有機腈化合物例如可以為乙腈。在一些實施方式中，所述有機溶劑為二氯甲烷。相對於所述式（121）所示化合物，所述有機溶劑的用量可以為3-100L/mol，例如可以為5-80L/mol。

所述胺基鹽酸鹽例如可以為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（EDCl）。相對於所述式（121）所示化合物，所述胺基鹽酸鹽的用量（莫耳比）可以為1:1-5:1，例如可以為2:1-4:1。

所述縮合劑例如可以為1-羥基苯并***（HOBt）、4-二甲氨基吡啶、二環己基碳二亞胺，在一些實施方式中，所述縮合劑為1-羥基苯并***（HOBt）。相對於所述式（121）所示化合物，所述縮合劑的用量（莫耳比）可以為3:1-10:1，例如可以為4:1-7:1。

所述雜環有機鹼例如可以為N-甲基嗎啉，相對於所述式（121）所示化合物，所述雜環有機鹼的用量（莫耳比）可以為1:1-5:1，例如可以為2:1-4:1。

所述縮合反應條件包括反應溫度為0-100^o C，反應時間為10-30小時，在一些實施方式中，所述縮合反應條件為反應溫度為10-40^o C，反應時間為15-20小時。

可使用任何合適的分離方法從反應混合物中分離式（111）所示化合物。在一些實施方式中，可通過抽濾除去試劑得到式（111）所示化合物粗產品，該粗產品可以直接用於後續反應。

在一些實施方式中，式（401）所示的化合物可由所屬技術領域具有通常知識者商購獲得，或通過已知方法容易地製備獲得。例如，在一些實施方式中，S₁ 為式（A71）所示的基團，X₄₀₁ 為羥基，此時，式（401）所示的化合物可參照WO2009082607說明書實施例2中，化合物152的製備方法製備獲得。

在一些實施方式中，式（121）所示的化合物可通過商購獲得，或者由所屬技術領域具有通常知識者通過習知的方法合成獲得。在一些實施方式中，式（121）所示的化合物可通過以下方法製備獲得：該方法包括在有機溶劑中，在脫保護反應條件下，以及雜環有機鹼存在下，使式（122）所示的化合物進行脫保護反應，分離出式（121）所示化合物：

式（122）其中，A₁₀₁ 具有如式（403）所示的結構：

式（403）其中，Y₄₀₂ 是保護基團，在一些實施方式中，X₄₀₂ 是氨基，Y₄₀₂ 是氨基保護基團。在一些實施方式中，Y₄₀₂ 是苄氧羰基（Cbz）、叔丁氧羰基（Boc）、芴甲氧羰基（Fmoc）、烯丙氧羰基（Alloc）、三甲基矽乙氧羰基（Teoc）和苄基（Bn）中的一種。在一些實施方式中，Y₄₀₂ 是Fmoc保護基。

X₄₀₂ 、L₂ 、SPS、X、W₀ 、R_j 、R₈ 、n₁ 、n₂ 和每個R₁ 的各自的定義與選擇範圍與上述相同。

所述有機溶劑可以為鹵代烷類溶劑。鹵代烷類溶劑例如可以為二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷。在一些實施方式中，所述有機溶劑為二氯甲烷。相對於所述式（122）所示化合物，所述有機溶劑的用量可以為10-80 L/mol，例如可以為20-40 L/mol。

所述雜環有機鹼例如可以為吡啶或呱啶。在一些實施方式中，所述雜環有機鹼可以為呱啶。相對於所述式（122）化合物，所述雜環有機鹼的用量可以為2-20 L/mol，例如可以為5-10 L/mol。

所述脫保護反應條件包括：反應溫度為0-100^o C，反應時間為2-20小時，在一些實施方式中，所述脫保護反應條件為反應溫度10-40^o C，反應時間為3-10小時。

可使用任何合適的分離方法從反應混合物中分離式（121）化合物。在一些實施方式中，可通過抽濾除去溶劑得到式（121）化合物粗產品，該粗產品可以直接用於後續反應。

在一些實施方式中，式（122）所示的化合物可通過以下方法製備獲得：該方法包括在有機溶劑中，在縮合反應條件下，以及縮合劑和三級胺的存在下，使式（123）所示的化合物和帶有羥基或氨基的固相載體接觸，分離出式（122）所示化合物：

式（123）其中，A₁₀₁ 、R_j 、R₈ 、W₀ 各自的定義和可選擇的範圍如前所述。

所述固相載體可以為固相合成siRNA中所用的載體中的一種，這固相載體為所屬技術領域具有通常知識者所習知。例如，所述固相載體可以選自含有活性羥基或氨基官能團的固相載體，在一些實施方式中，所述固相載體為氨基樹脂或羥基樹脂。在一些實施方式中，所述氨基或羥基樹脂具有如下參數：粒徑100-400目（mesh），表面氨基或羥基載量可以為0.2-0.5mmol/g。所述式（123）所示化合物與固相載體的用量比可以為10-800 μmol化合物/每克固相載體（μmol/g）。在一些實施方式中，所述式（321）所示化合物與固相載體的用量比可以為100-600 μmol/g。

所述有機溶劑可以是所屬技術領域具有通常知識者已知的任何合適的溶劑。在一些實施方式中，所述有機溶劑為鹵代烷類溶劑或有機腈化合物中的一種或多種。鹵代烷類溶劑例如可以為二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷，有機腈化合物例如可以為乙腈。在一些實施方式中，所述有機溶劑為乙腈。相對於所述式（123）所示化合物，所述有機溶劑的用量可以為3-50 L/mol，例如可以為5-30 L/mol。

在一些實施方式中，所述縮合劑例如可以為苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽（benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidino phosphonium hexafluorophosphate，PyBop）、3-二乙氧基磷醯基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮（3-(Diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-one，DEPBT）和/或O-苯并***-四甲基脲六氟磷酸鹽（O-benzotriazol-1-yl-tetramethyluronium hexafluorophosphate，HBTU），在一些實施方式中，所述縮合劑為O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽鹽。相對於所述式（123）化合物，所述縮合劑的用量（莫耳比）可以為1:1-20:1，例如可以為1:1-5:1。

所述三級胺例如可以為三乙胺和/或N,N-二異丙基乙胺(DIEA)，在一些實施方式中，為N,N-二異丙基乙胺。相對於所述式（123）化合物，所述三級胺的用量（莫耳比）可以為1:1-20:1，例如可以為1:1-5:1。

所述縮合反應條件包括反應溫度為0-100^o C，反應時間為10-30小時，在一些實施方式中，所述縮合反應條件為反應溫度為10-40^o C，反應時間為15-30小時。

可使用任何合適的分離方法從反應混合物中分離式（122）化合物。在一些實施方式中，可通過抽濾除去試劑得到式（122）化合物粗產品，該粗產品可以直接用於後續反應。

在一些實施方式中，式（122）化合物的製備方法還可以包括在蓋帽反應條件下，在有機溶劑中，將得到的縮合產物與蓋帽試劑和醯化催化劑接觸，分離得到式（122）所示化合物。所述蓋帽反應的作用在於除去任何尚未反應完全的活性反應官能團，以避免在後續反應中產生不必要的副產物。所述蓋帽反應的條件包括反應溫度為0-50^o C，在一些實施方式中為15-35^o C，反應的時間為1-10h，在一些實施方式中為3-6h。蓋帽試劑可以使用siRNA固相合成中所使用的蓋帽試劑，siRNA固相合成中所使用的蓋帽試劑為所屬技術領域具有通常知識者所習知。

在一些實施方式中，所述蓋帽試劑由蓋帽試劑A（capA）和蓋帽試劑B（capB）組成，其中，蓋帽試劑A為N-甲基咪唑，在一些實施方式中以N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液形式提供，其中，吡啶與乙腈的體積比可以為1:10-1:1，在一些實施方式中為1:3-1:1，吡啶與乙腈的總體積與N-甲基咪唑的體積比可以為1:1-10:1，在一些實施方式中為3:1-7:1。所述蓋帽試劑B為乙酸酐。在一些實施方式中，所述蓋帽試劑B以乙酸酐的乙腈溶液形式提供，其中，乙酸酐和乙腈的體積比可以為1:1-1:10，在進一步的實施方式中為1:2-1:6。

在一些實施方式中，所述N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液的體積與式（122）化合物的品質之比可以為5ml/g-50ml/g，在一些實施方式中為15ml/g-30ml/g。所述乙酸酐的乙腈溶液的體積與式（122）化合物的品質之比可以為0.5ml/g-10ml/g，在一些實施方式中為1ml/g-5ml/g。

在一些實施方式中，蓋帽試劑使用等莫耳量的乙酸酐與N-甲基咪唑。在一些實施方式中，所述有機溶劑可以為乙腈、環氧類溶劑、醚類溶劑、鹵代烷類溶劑、二甲基亞碸、N,N-二甲基甲醯胺和N,N-二異丙基乙胺中的一種或多種。在一些實施方式中，所述有機溶劑為乙腈。相對於式（122）化合物，所述有機溶劑的用量可以為10-50L/mol，在一些實施方式中為5-30L/mol。

在一些實施方式中，所述醯化催化劑可以選自任何可用於酯化縮合或醯胺化縮合的催化劑，例如鹼性雜環化合物。在一些實施方式中，所述醯化催化劑為4-二甲氨基吡啶。所述催化劑與式（122）所示化合物的品質之比可以為0.001:1-1:1，在一些實施方式中為0.01:1-0.1:1。

在一些實施方式中，可使用任何合適的分離方法從反應混合物中分離式（122）化合物。在一些實施方式中，可通過以有機溶劑充分洗滌，並過濾，去除未反應的反應物、過量的蓋帽試劑及其它雜質，得到式（122）化合物，所述有機溶劑選自乙腈、二氯甲烷、甲醇中的一種或多種。在一些實施方式中為乙腈。在一些實施方式中，W₀ 包含二醯基結構，式（123）所示的化合物可通過以下方法製備獲得：該方法包括在有機溶劑中，在酯化反應條件下，以及在鹼和酯化催化劑存在下，使式（125）所示的化合物與環狀酸酐接觸，分離得到式（123）所示化合物：

式（125）其中，A₁₀₁ 、R_j 、R₈ 各自的定義和可選擇的範圍如前所述。

在一些實施方式中，所述有機溶劑包含環氧類溶劑、醚類溶劑、鹵代烷類溶劑、二甲基亞碸、N,N-二甲基甲醯胺和N,N-二異丙基乙胺中的一種或多種。在一些實施方式中，所述環氧類溶劑可以為二氧六環和/或四氫呋喃，所述醚類溶劑可以為***和/或甲基叔丁基醚，所述鹵代烷類溶劑可以為二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一種或多種。在一些實施方式中，所述有機溶劑為二氯甲烷。相對於所述式（125）所示化合物，所述有機溶劑的用量可以為3-50L/mol，例如可以為5-20L/mol。

在一些實施方式中，所述環狀酸酐可以為丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐或庚二酸酐中的一種，在一些實施方式中為丁二酸酐。相對於所述式（125）化合物，所述酸酐類化合物的用量（莫耳比）可以為1:1-10:1，例如可以為2:1-5:1。

所述酯化催化劑可以是任何對該酯化反應起到催化作用的催化劑，例如該催化劑可以是例如可以為1-羥基苯并***（HOBt）、4-二甲氨基吡啶、二環己基碳二亞胺。在一些實施方式中，所述縮合劑可以為4-二甲氨基吡啶。相對於所述式（125）所示化合物，所述縮合劑的用量（莫耳比）可以為1:1-10:1，例如可以為2:1-5:1。

在一些實施方式中，所述鹼可以是任意的無機鹼，有機鹼或者它們的結合。考慮溶解性和產物穩定性，所述鹼可以是例如三級胺。在一些實施方式中，所述三級胺可以為三乙胺或N,N-二異丙基乙胺。所述三級胺與式（125）所示化合物的莫耳比可以為1:1-20:1，例如可以為3:1-10:1。

所述酯化反應條件包括反應溫度為0-100^o C，反應時間為8-48小時，在一些實施方式中，所述酯化反應條件為反應溫度為10-40^o C，反應時間為20-30小時。在上述反應完成後，還可根據需要，使所得到的式（123）所示的化合物進行任選的離子交換反應。所述離子交換作用是將式（123）所示的化合物轉化為期望的羧酸或羧酸鹽的形式，離子交換的方法為所屬技術領域具有通常知識者所習知，可以使用合適的離子交換溶液和交換條件，得到具有M⁺ 陽離子的式（101）所示的化合物，在此不做詳述。在一些實施方式中，所述離子交換反應使用三乙胺磷酸鹽溶液進行，所述三乙胺磷酸鹽溶液的濃度可以為0.2-0.8M，在一些實施方式中，所述三乙胺磷酸鹽溶液的濃度為0.4-0.6M，相對於式（123）所示的化合物，所述三乙胺磷酸鹽溶液的用量可以為3-6L/mol，在進一步的實施方式中為4-5L/mol。

可使用任何合適的分離方法從反應混合物中分離式（123）所示的化合物。在一些實施方式中，可通過蒸發除去溶劑、隨後通過色譜方法分離式（123）所示的化合物，例如，可使用如下色譜條件進行分離：正相純化矽膠：200-300目矽膠填料，先以含0.1%三乙胺（v/v）的石油醚平衡管柱，隨後以二氯甲烷:甲醇=20:1-10:1梯度沖提；反相純化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈=0.1:1-1:0.1梯度沖提。在一些實施方式中，可以直接除去溶劑得到式（123）化合物粗產品，該粗產品可以直接用於後續反應。

在一些實施方式中，式（125）所示的化合物可通過以下方法製備獲得：該方法包括在有機溶劑中，在羥基保護反應條件下，以及縮合劑存在下，使式（126）所示的化合物與羥基保護劑接觸，分離出式（125）所示的化合物：

式（126）其中，A₁₀₁ 、R_j 各自的定義和可選擇的範圍如前所述。

所述縮合劑例如可以為1-羥基苯并***（HOBt）、4-二甲氨基吡啶和/或二環己基碳二亞胺，在一些實施方式中，所述縮合劑為4-二甲氨基吡啶。相對於所述式（126）所示化合物，所述縮合劑的用量可以為0.01:1-1:1，例如可以為0.1:1-0.5:1。

所述有機溶劑例如可以是有機鹼溶劑。在一些實施方式中，所述有機鹼溶劑可以為吡啶。相對於所述式（126）所示化合物，所述有機溶劑的用量可以為2-20 L/mol，例如可以為3-10 L/mol。

與前述類似地，所述羥基保護劑可以是所屬技術領域具有通常知識者已知的各種羥基保護劑。在一些實施方式中，所述羥基保護試劑為三苯甲基氯、4-甲氧基三苯甲基氯、4,4'-双甲氧基三苯甲基氯和4,4',4’’-三甲氧基三苯甲基氯中的一種。在一些實施方式中，所述羥基保護劑例如可以為4,4’-二甲氧基三苯甲基氯（DMTrCl）。相對於所述式（126）化合物，所述羥基保護劑的用量（莫耳比）可以為1:1-1.5:1，例如可以為1.1:1-1.3:1。

所述羥基保護反應條件包括反應溫度為0-100^o C，反應時間為5-30小時，在一些實施方式中，所述羥基保護反應條件為反應溫度為0-40^o C，反應時間為8-20小時。

與上述類似地，可使用任何合適的分離方法從反應混合物中分離式（125）所示的化合物。在一些實施方式中，可通過蒸發除去溶劑、隨後通過色譜方法分離式（125）所示的化合物，例如，可使用如下色譜條件進行分離：正相純化矽膠：200-300目矽膠填料，先以含0.1%三乙胺（v/v）的石油醚平衡管柱，隨後以石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇=1:1:1:0.1-1:1:1:0.3梯度沖提；反相純化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈=0.1:1-1:0.1梯度沖提。在一些實施方式中，可以直接除去溶劑得到式（125）所示的化合物粗產品，該粗產品可以直接用於後續反應。

在一些實施方式中，式（126）所示的化合物可以通過以下製備方法得到：該方法包括在有機溶劑中，在活化劑和三級胺存在下，在縮合反應條件下，將式（104）所示的化合物與式（127）所示的化合物接觸，隨後進行分離：

式（104）

式（127）其中，R_j 、R₈ 、R₁ 、n₁ 、n₂ 、Y₄₀₂ 、X₄₀₂ 、L₂ 各自的定義和可選擇的範圍如前所述。

所述有機溶劑可以為環氧類溶劑、醚類溶劑、鹵代烷類溶劑、二甲基亞碸、N,N-二甲基甲醯胺和N,N-二異丙基乙胺中的一種或多種。所述環氧類溶劑例如可以為二氧六環和/或四氫呋喃，所述醚類溶劑例如可以為***和/或甲基叔丁基醚，所述鹵代烷類溶劑例如可以為二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一種或多種，在一些實施方式中，所述有機溶劑為二氯甲烷。相對於式（104）所示的化合物，有機溶劑用量可以為3-50L/mol，例如可以為5-20L/mol。

在一些實施方式中，L₂ 連接基團通過醯基與羥基相連接，此時，所述縮合反應為醯胺化反應，所述醯胺化反應條件包括：反應溫度為0-100^o C，反應時間為8-48小時，在一些實施方式中，所述醯胺化反應條件為反應溫度10-40^o C，反應時間為8-20小時。

在一些實施方式中，所述活化劑可以為3-二乙氧基磷醯氧基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、二環己基碳二亞胺中的一種。例如可以為3-二乙氧基磷醯氧基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮（DEPBT）。所述活化劑與式（104）所示化合物的莫耳比可以可以為2:1-5:1，在一些實施方式中為2.1:1-3.5:1。

所述三級胺可以為N-甲基嗎啉、三乙胺或N,N-二異丙基乙胺，在一些實施方式中為N,N-二異丙基乙胺（DIEA）；所述三級胺與式（104）所示化合物的莫耳比可以為2:1-10:1，在一些實施方式中為4:1-8:1。

所屬技術領域具有通常知識者可通過已知的方法容易地製備獲得式（127）所示的化合物，或者可商購獲得特定結構的式（127）所示化合物。例如，當Y₄₀₂ 為Fmoc保護基、X₄₀₂ 為NH、L₂ 為亞己醯基時，式（127）所示的化合物可以為可商購（例如購自北京偶合科技公司）獲得的6-（（（9H-芴-9-基）甲氧基）羰基）氨基）己酸。式（127）所示的化合物與式（104）所示的化合物的用量比可以為2:1-5:1，在一些實施方式中為2:1-3:1。獲得式（104）化合物的方法與前述相同。

與上述類似地，可使用任何合適的分離方法從反應混合物中分離式（126）所示的化合物。在一些實施方式中，可通過蒸發除去溶劑、隨後通過色譜方法分離式（126）所示的化合物。例如，可使用如下兩種色譜條件進行分離：（1）正相純化矽膠：200-300目矽膠填料，使用乙酸乙酯:石油醚:二氯甲烷:甲醇=1:1:1:0.2至1:1:1:0.4梯度沖提；以及（2）反相純化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈=0.1:1-1:0.1梯度沖提。在一些實施方式中，可以直接除去溶劑得到式（126）所示的化合物粗產品，該粗產品可以直接用於後續反應。

[藥物綴合物]

式（301）其中，式（301）中的A具有如式（302）所示的結構：

式（302）式中，R_j 、R₁ 、L₁ 、M₁ 、n、n₁ 和n₂ 各自的定義和可選擇的範圍如前所述，W為連接基團。R₁₆ 和R₁₅ 各自為H或活性藥物基團，並且R₁₆ 和R₁₅ 中的至少一個為活性藥物基團。

所述“活性藥物基團”是指能夠通過本文公開的化合物遞送的活性藥物分子形成的基團。在一些實施方式中，活性藥物為期望遞送到肝細胞的藥物試劑或期望遞送至腫瘤的藥物試劑。

這些活性藥物或者藥物試劑可以是小分子藥物、單抗類藥物、核酸類藥物。在一些實施方式中，所述活性藥物為功能性寡核苷酸，特別是本文公開的那些，例如siRNA。雖然，在本發明中活性藥物大量使用了功能性寡核苷酸，如siRNA，但是，所屬技術領域具有通常知識者預知，其它活性藥物，如小分子藥物或者單抗藥物也可以用與本發明提供的藥物綴合物中作為藥物活性成分。

所述活性藥物可以是治療和/或預防各種疾病的藥物，例如，治療和/或預防病毒感染引發的症狀或疾病的藥物，如治療和/或預防病毒性肝炎如乙肝或丙肝的藥物、治療和/或預防埃博拉出血熱的藥物、治療和/或預防冠狀病毒病、特別是嚴重急性呼吸綜合征（SARS）或2019冠狀病毒病（COVID-19）的藥物；治療和/或預防代謝類疾病的藥物，例如治療和/或預防血脂代謝異常相關疾病的藥物、治療和/或預防非酒精性脂肪性肝炎的藥物、治療和/或預防激素代謝異常相關疾病的藥物、治療和/或預防糖代謝異常相關疾病的藥物、治療和/或預防尿酸代謝異常相關疾病的藥物等；治療和/或預防血液疾病的藥物，例如治療和/或預防凝血功能異常相關疾病的藥物或治療和/或預防血液組成異常相關疾病的藥物；治療和/或預防癌症或腫瘤的藥物，例如治療和/或預防上皮細胞癌（carcinoma）的藥物、治療和/或預防實體瘤（sarcoma）的藥物、治療和/或預防白血病的藥物、治療和/或預防淋巴瘤的藥物、治療和/或預防骨髓瘤的藥物等；治療和/或預防中樞神經系統相關疾病的藥物，例如治療和/或預防脊髓相關疾病的藥物、治療和/或預防腦相關疾病的藥物等。

在一些實施方式中，R₁₆ 和R₁₅ 中的至少一個具有式A60所示的結構。

式（A60）其中，E₁ 為OH、SH或BH₂ ，Nu為功能性寡核苷酸。

式（301）中，W可以是任意的連接基團，只要能夠起到連接作用。在一些實施方式中，W可以是W₀ ，例如，式（C1'）所示的基團。在一些實施方式中，W可以是W₀ 水解得到的產物，如式（A61）所示的基團。

式（A61）其中，E₁ 為OH、SH或BH₂ ，基於製備原料易獲取性的考慮，可以為OH或SH。

根據本發明的一些具體實施方式，式（101）所示的化合物具有式（303）、（304）、（305）、（306）、（307）、（308）、（309）、（310）或（311）所示的結構：

式（303）

式（304）

式（305）

式（306）

式（307）

式（308）

式（309）

式（310）

式（311）

在一些實施方式中，本發明的藥物綴合物中的活性藥物是功能性寡核苷酸。功能性寡核苷酸是指這樣的寡核苷酸：所述寡核苷酸能夠通過與靶序列之間產生穩定且特異性的雜交，利用RNA啟動（RNA activation，RNAa）、RNA干擾（RNA interference，RNAi）、反義核酸技術、外顯子跳躍（exon skipping）技術等原理，上調或下調靶基因的表達，或導致mRNA可變剪接。在一些方面，功能性寡核苷酸還可以是與靶蛋白之間產生穩定且特異性地結合的核酸結構。此外，所屬技術領域具有通常知識者容易理解的是，多核苷酸（例如mRNA本身或其片段）也同樣適用於與本發明提供的藥物綴合物，實現肝靶向遞送，從而調節mRNA轉錄出的蛋白質的表達。因此，在上下文中，“功能性寡核苷酸”的概念也可涵蓋mRNA或其片段。

在一些實施方式中，所述功能性寡核苷酸能夠與靶序列發生相互作用，從而影響靶序列分子的正常功能，如導致發生mRNA斷裂或翻譯阻遏或外顯子跳躍引發mRNA可變剪接等。為了實現上述相互作用，所述功能性寡核苷酸可以大體上與靶序列的鹼基互補。在一些實施方式中，所述功能性寡核苷酸可以與靶序列80%以上的鹼基互補，或者與靶序列90%以上的鹼基互補，也可以二者完全互補。在一些實施方式中，所述功能性寡核苷酸可以含有1個、2個或3個不與靶序列互補的鹼基。在一些實施方式中，所述功能性寡核苷酸包括去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、以及具有修飾的核苷酸。在一些實施方式中，所述功能性寡核苷酸可以是單鏈的DNA、RNA或DNA-RNA嵌合體（chimera），或者是雙鏈的DNA、RNA或DNA-RNA雜交體（hybrids）。

由此，適合的功能性寡核苷酸可以是小干擾RNA（siRNA）、微小RNA（microRNA）、抗微小RNA（antimiR）、微小RNA拮抗劑（antagomir）、微小RNA模擬物（microRNA mimics）、誘餌寡核苷酸（decoy）、免疫刺激物（immune stimulatory）、G-四極子（G-quadruplex）、可變剪接體（splice altering）、單鏈RNA（ssRNA）、反義核酸（antisense）、核酸適配體（Nucleic Acid Aptamer）、小啟動RNA（small activating RNA，saRNA）、莖環RNA（stem-loop RNA）或DNA中的一種。在進一步的實施方式中，適合的功能性寡核苷酸可以是WO2009082607A2、WO2009073809A2或WO2015006740A2中公開的寡核苷酸，以引用的方式將其整體內容併入本文。

在一些實施方式中，所述活性藥物為功能性寡核苷酸。本發明的藥物綴合物可通過提高所述功能性寡核苷酸的靶向遞送，進而通過所述功能性寡核苷酸在細胞中與靶序列發生相互作用，從而對細胞中基因的異常表達進行調控。在細胞中異常表達的基因可以是例如ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV、HCV等基因。在一些實施方式中，所述在肝細胞異常表達的基因是HBV基因、ANGPTL3基因或APOC3基因。在本發明的上下文中，HBV基因是指序列如Genbank註冊號NC_003977.1所示的基因；ANGPTL3基因是指mRNA序列如Genbank註冊號NM_014495.3所示的基因；APOC3基因是指mRNA序列如Genbank註冊號NM_000040.1所示的基因。

在一些實施方式中，“靶序列”是靶mRNA。在本發明的上下文中，“靶mRNA”是指在細胞中異常表達的基因對應的mRNA，它既可以是過量表達的基因對應的mRNA，也可以是表達不足的基因對應的mRNA，或者是外源性基因（如病毒基因）對應的mRNA。由於大部分疾病源於mRNA的過量表達，因此，在本發明中，靶mRNA尤其指過量表達的基因對應的mRNA。在一些實施方式中，靶mRNA也可以是自身雖然以正常水平表達，但需要調控其表達水平、以獲得期望的其它治療和/或預防效果的mRNA。在本發明的一些實施方式中，相應於上述異常表達的基因，所述靶mRNA可以是ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV、HCV、FXI、FXII、KNG、PNP、XO、PKK、PLG、C9、SARS、SARS-Cov-2、ACE-2等基因對應的mRNA。在一些實施方式中，所述靶mRNA可以是由對應HBV基因轉錄而得的mRNA、或者ANGPTL3基因所對應的mRNA、或者APOC3基因所對應的mRNA。

式A60中的P原子可以通過磷酸酯鍵連接到寡核苷酸序列中任何可能的位置，例如，可以連接到寡核苷酸的任何一個核苷酸上。在一些實施方式中，本發明的藥物綴合物中的功能性寡核苷酸是單鏈寡核苷酸（例如，單鏈RNA或者適配體），此時，式A60中的P原子可以連接到所述單鏈寡核苷酸的端部，所述單鏈寡核苷酸的端部指所述單鏈寡核苷酸中從一端起算的前4個核苷酸。在一些實施方式中，式A60中的P原子連接到所述單鏈寡核苷酸的末端。

在一些實施方式中，本發明的藥物綴合物中的功能性寡核苷酸是雙鏈寡核苷酸（例如，siRNA、microRNA或者DNA），所述雙鏈寡核苷酸包含正義鏈和反義鏈，所述式A59中的P原子連接到所述雙鏈寡核苷酸中正義鏈或反義鏈的端部，所述端部指所述正義鏈或所述反義鏈中從一端起算的前4個核苷酸，在一些實施方式中，式A60中的P原子連接到所述正義鏈或所述反義鏈的末端；更在一些實施方式中，式A60中的P原子連接到所述正義鏈的3'末端。在式A60中的P原子連接至雙鏈寡核苷酸的正義鏈的上述位置的情況下，本發明提供的藥物綴合物進入細胞後，在解旋時，可以釋放出單獨的雙鏈寡核苷酸反義鏈，以阻斷靶mRNA翻譯蛋白質的過程，抑制基因的表達。

式A60中的P原子可以連接到寡核苷酸序列中的核苷酸上任何可能的位置，例如，核苷酸的5'位、核苷酸的2'位、核苷酸的3'位或核苷酸的鹼基上。在一些實施方式中，式A60中的P原子可通過形成磷酸酯鍵而連接至所述寡核苷酸序列中的核苷酸的2'位、3'位或5'位。在一些具體實施方式中，式A60中的P原子連接在雙鏈寡核苷酸序列中正義鏈3'末端核苷酸的3'羥基脫氫後形成的氧原子上（此時，可將該P原子及相應的磷酸酯基團視為歸屬於雙鏈寡核苷酸中的P原子和磷酸酯基團），或者式A60中的P原子通過取代雙鏈寡核苷酸序列中正義鏈中的一個核苷酸的2'-羥基中的氫與核苷酸連接，或者式A60中的P原子通過取代雙鏈寡核苷酸序列中正義鏈5'末端核苷酸的5'羥基中的氫與核苷酸連接。

下面的實施方式和實施例中，詳細描述了本發明的藥物綴合物中的活性藥物為小干擾RNA（siRNA）的情況。此時，本發明的藥物綴合物為藥物綴合物。在本文的上下文中，也將這些實施方式中的藥物綴合物稱為本發明的藥物綴合物。但這僅是為了描述方便，本發明僅是以具體實施方式或實施例的形式說明本發明，而並不代表本發明的藥物綴合物中的活性藥物僅可以是寡核苷酸或者siRNA。根據靶向位置和實際效果需要，用其它活性藥物，例如，小分子藥物，單抗或其它功能性寡核苷酸代替siRNA對於所屬技術領域具有通常知識者而言是可以預知的。

所屬技術領域具有通常知識者習知，siRNA含有核苷酸基團作為基本結構單元，所述核苷酸基團具有磷酸基團、核糖基團和鹼基，在此不再贅述。通常具有活性的，即功能性的siRNA的長度約為12-40個核苷酸，在一些實施方式中約為15-30個核苷酸，所述siRNA中的每個核苷酸可以獨立地是修飾或未修飾的核苷酸，為了增加穩定性，所述siRNA中至少部分核苷酸是修飾的核苷酸。

本發明的發明人發現，下面的實施方式中所述的siRNA具有較高的活性和/或穩定性，因而可以作為本發明一些具體實施方式中的siRNA。

按照本發明一些實施方式，本發明的藥物綴合物中的siRNA（以下，也稱為本發明的siRNA）中的每個核苷酸各自獨立地為修飾或未修飾的核苷酸，該siRNA含有正義鏈和反義鏈，其中，所述正義鏈包含核苷酸序列1，所述反義鏈包含核苷酸序列2，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2的長度均為19個核苷酸，並且至少部分地反向互補形成互補雙鏈區，所述核苷酸序列2的至少一部分與第一段核苷酸序列互補，所述第一段核苷酸序列為靶mRNA中的一段核苷酸序列。

在一些實施方式中，本發明的siRNA是指在3mg/kg的濃度下，能夠抑制至少50%B型肝炎病毒基因表達、至少50%血管生成素樣蛋白3基因表達或者至少50%載脂蛋白C3基因表達的siRNA。

在一些實施方式中，所述核苷酸序列1與所述第一段核苷酸序列長度相等，且不超過3個核苷酸差異；所述核苷酸序列2與核苷酸序列B長度相等，且不超過3個核苷酸差異；所述核苷酸序列B為與所述第一段核苷酸序列完全反向互補的核苷酸序列。這些特定的核苷酸差異並不會顯著降低藥物綴合物的靶基因抑制能力，而這些包含特定核苷酸差異的藥物綴合物也在本發明的保護範圍之內。

在一些實施方式中，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2基本上反向互補、基本上完全反向互補或完全反向互補。

在本發明的一些實施方式中，所述核苷酸序列1與所述第一段核苷酸序列不多於1個核苷酸差異，和/或所述核苷酸序列2與所述核苷酸序列B不多於1個核苷酸差異。在一些實施方式中，所述核苷酸序列2與所述核苷酸序列B之間的核苷酸差異包括按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列2上的第一個核苷酸Z'位置上的差異。在一些實施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列1上的最後一個核苷酸Z是與Z'互補的核苷酸。

在一些實施方式中，所述正義鏈還含有核苷酸序列3，所述反義鏈還含有核苷酸序列4，所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4的長度各自獨立地為1-4個核苷酸，並且所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4的位置相對應。在一些實施方式中，核苷酸序列4與靶mRNA相應位置的核苷酸至少部分互補，在一些實施方式中，核苷酸序列4與靶mRNA相應位置的核苷酸完全互補。

在一些實施方式中，所述核苷酸序列3連接在所述核苷酸序列1的5'末端，並且所述核苷酸序列4連接在所述核苷酸序列2的3'末端。在一些實施方式中，所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4長度相等並且反向互補。因此，所述正義鏈和反義鏈的長度可以是19-23個核苷酸。在一個一些實施方式中，本發明的siRNA還含有核苷酸序列5，所述核苷酸序列5的長度為1至3個核苷酸，連接在所述反義鏈的3'末端，從而構成所述反義鏈的3'突出端；在一些實施方式中，所述核苷酸序列5的長度為1或2個核苷酸。這樣，本發明的siRNA的正義鏈和反義鏈的長度之比可以是19/20、19/21、20/21、20/22、21/22、21/23、22/23、22/24、23/24或23/25。

在一些實施方式中，所述核苷酸序列5的長度為2個核苷酸，並且按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列5為連續的2個去氧胸腺嘧啶核苷酸、連續的2個脲嘧啶核苷酸、或者與第三段核苷酸序列互補，所述第三段序列是指靶mRNA中與所述第一段核苷酸序列相鄰、或者和所述第二段核苷酸序列相鄰，並且長度與所述核苷酸序列5相等的核苷酸序列。在一些實施方式中，本發明的siRNA的正義鏈和反義鏈的長度之比為19/21或21/23，此時，本發明的siRNA具有更好的細胞mRNA沉默活性。

在一些實施方式中，本發明的siRNA中的核苷酸各自獨立地為修飾或未修飾的核苷酸。在一些實施方式中，本發明的siRNA不含修飾的核苷酸；在一些實施方式中，本發明的siRNA具有修飾的核苷酸，含有這些修飾的核苷酸的siRNA具有較高的穩定性和靶mRNA沉默活性。

在一些實施方式中，綴合物中的siRNA至少含有1個修飾的核苷酸。在本發明的上下文中，所使用的術語“修飾的核苷酸”是指核苷酸的核糖基2'位羥基被其他基團取代形成的核苷酸或核苷酸類似物，或者核苷酸上的鹼基是經修飾的鹼基的核苷酸。含有這些修飾的核苷酸的藥物綴合物具有較高的穩定性和靶mRNA沉默活性例如，可以選擇J.K. Watts, G.F. Deleavey, and M.J. Damha, Chemically modified siRNA: tools and applications. Drug Discov Today, 2008, 13(19-20): 842-55中公開的修飾的核苷酸。在本發明的一些實施方式中，所述正義鏈或所述反義鏈中的至少一個核苷酸為修飾的核苷酸，和/或至少一個磷酸酯基為具有修飾基團的磷酸酯基。換句話說，所述正義鏈和所述反義鏈中至少一條單鏈的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基和/或核糖基的至少一部分為具有修飾基團的磷酸酯基和/或具有修飾基團的核糖基。在本發明的一些實施方式中，所述正義鏈和/或所述反義鏈中的全部核苷酸均為修飾的核苷酸。

在一些實施方式中，正義鏈和反義鏈中的每一個核苷酸獨立地為氟代修飾的核苷酸或非氟代修飾的核苷酸。

在一些實施方式中，所述核苷酸序列1中氟代修飾的核苷酸不多於5個；在一些實施方式中，所述核苷酸序列2中氟代修飾的核苷酸不多於7個。

在一些實施方式中，所述氟代修飾的核苷酸位於核苷酸序列1和核苷酸序列2中，所述核苷酸序列1中氟代修飾的核苷酸不多於5個，並且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列1的第7、8、9位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸；所述核苷酸序列2中氟代修飾的核苷酸不多於7個，並且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸。

在一些具體的實施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，在所述正義鏈中，所述核苷酸序列1的第7、8、9位或者第5、7、8、9位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，所述正義鏈中其餘位置的核苷酸為非氟代修飾的核苷酸；在所述反義鏈中，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位或者第2、6、8、9、14、16位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，所述反義鏈中其餘位置的核苷酸為非氟代修飾的核苷酸。

氟代修飾的核苷酸指核苷酸的核糖基2'位的羥基被氟取代形成的核苷酸，其具有以式（207）所示的結構。非氟代修飾的核苷酸指核苷酸的核糖基2'位的羥基被非氟基團取代形成的核苷酸或核苷酸類似物。在一些實施方式中，每一個非氟代修飾的核苷酸獨立地選自核苷酸的核糖基2'位的羥基被非氟基團取代形成的核苷酸或核苷酸類似物中的一種。核糖基2'位的羥基被非氟基團取代形成的核苷酸是所屬技術領域具有通常知識者所習知的，這些核苷酸可以選自2'-烷氧基修飾的核苷酸、2'-經取代的烷氧基修飾的核苷酸、2'-烷基修飾的核苷酸、2'-經取代的烷基修飾的核苷酸、2'-氨基修飾的核苷酸、2'-經取代的氨基修飾的核苷酸、2'-去氧核苷酸中的一種。

在一些實施方式中，2'-烷氧基修飾的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸（2'-OMe），如式（208）所示。2'-經取代的烷氧基修飾的核苷酸，例如可以是2'-O-甲氧基乙基修飾的核苷酸（2'-MOE），如式（209）所示。2'-氨基修飾的核苷酸（2'-NH₂ ）如式（210）所示。2'-去氧核苷酸（DNA）如式（211）所示。

式（207）式（208）式（209）式（210）式（211）

核苷酸類似物指能夠在核酸中代替核苷酸，但結構不同於腺嘌呤核糖核苷酸、鳥嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、脲嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶去氧核糖核苷酸的基團，如異核苷酸、橋聯的核苷酸（bridged nucleic acid，簡稱BNA）或無環核苷酸。

BNA是指受約束的或不能接近的核苷酸。BNA可以具有五員環、六員環、或七員環的具有“固定的”C3'-內切糖縮攏的橋聯結構。通常將該橋摻入到該核糖的2'-、4'-位處以提供一個2', 4'-BNA核苷酸，如LNA、ENA、cET BNA等，其中，LNA如式（212）所示，ENA如式（213）所示，cET BNA如式（214）所示。

，

，

式（212）式（213）式（214）

無環核苷酸是核苷酸的糖環被打開形成的一類核苷酸，如解鎖核酸（UNA）或甘油核酸（GNA），其中，UNA如式（215）所示，GNA如式（216）所示。

式（215）式（216）

上述式（215）和式（216）中，R選自H、OH或烷氧基（O-烷基）。

異核苷酸是指核苷酸中鹼基在核糖環上的位置發生改變而形成的化合物，例如，鹼基從核糖環的1'-位移動至2'-位或3'-位而形成的化合物，如式（217）或（218）所示。

，

式（217）式（218）

上述式（217）-式（218）化合物中，Base表示鹼基，例如A、U、G、C或T；R選自H、OH、F或者如上所述的非氟基團。

在一些實施方式中，核苷酸類似物選自異核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA和GNA中的一種。在一些實施方式中，每一個非氟代修飾的核苷酸均為甲氧基修飾的核苷酸，在上文和下文中，所述甲氧基修飾的核苷酸指核糖基的2'-羥基被甲氧基取代而形成的核苷酸。

在上文及下文中，“氟代修飾的核苷酸”、“2'-氟修飾的核苷酸”、“核糖基團的2'-羥基被氟取代的核苷酸”和“包含2'-氟代核糖基的核苷酸”意義相同，均指核苷酸的2'-羥基被氟取代而形成的具有如式（207）所示結構的化合物；“甲氧基修飾的核苷酸”、“2'-甲氧基修飾的核苷酸”、“核糖基團的2'-羥基被甲氧基取代的核苷酸”和“包含2'-甲氧基核糖基的核苷酸”意義相同，均指核苷酸核糖基團的2'-羥基被甲氧基取代而形成的具有如式（208）所示結構的化合物。

在一些實施方式中，本發明的藥物綴合物中的siRNA是具有以下修飾的siRNA：按照5'末端到3'末端的方向，在所述正義鏈中，所述核苷酸序列1的第7、8、9位或者第5、7、8、9位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，所述正義鏈中其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸；在所述反義鏈中，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位或者第2、6、8、9、14、16位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，所述反義鏈中其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸。

在一些具體的實施方式中，本發明的siRNA是具有以下修飾的siRNA：按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正義鏈中，所述核苷酸序列1的第7、8、9位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，所述正義鏈中其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸；在所述反義鏈中，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，所述反義鏈中其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸；或者按照5'末端到3'末端的方向，在所述正義鏈中，所述核苷酸序列1的第5、7、8、9位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，所述正義鏈中其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸；在所述反義鏈中，所述核苷酸序列2的第2、6、8、9、14、16位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，所述反義鏈中其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸；或者按照5'末端到3'末端的方向，在所述正義鏈中，所述核苷酸序列1的第5、7、8、9位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，所述正義鏈中其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸；在所述反義鏈中，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，所述反義鏈中其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸。

具有上述修飾的siRNA不僅成本低，而且可使血液中的核糖核酸酶不易切割核酸，由此增加核酸的穩定性，使核酸具有更強的抵抗核酸酶水解的性能。

在一些實施方式中，所述核苷酸具有磷酸基團修飾。在本發明的上下文中，磷酸基團修飾可以是如式（201）所示的硫代磷酸（phosphorthioate）修飾，即，用一個硫原子取代作為相鄰核苷酸間的鍵聯的磷酸二酯鍵中的非橋接氧原子，從而以硫代磷酸二酯鍵替換磷酸二酯鍵。該修飾能穩定siRNA的結構，保持鹼基配對的高特異性和高親和力。

式（201）

在一些實施方式中，所述siRNA中，由以下核苷酸之間的連接所組成的組中的至少一個為硫代磷酸酯基連接：所述正義鏈的5'末端端部第1個核苷酸和第2個核苷酸之間的連接；所述正義鏈的5'末端端部第2個核苷酸和第3個核苷酸之間的連接；所述正義鏈的3'末端端部第1個核苷酸和第2個核苷酸之間的連接；所述正義鏈的3'末端端部第2個核苷酸和第3個核苷酸之間的連接；所述反義鏈的5'末端端部第1個核苷酸和第2個核苷酸之間的連接；所述反義鏈的5'末端端部第2個核苷酸和第3個核苷酸之間的連接；所述反義鏈的3'末端端部第1個核苷酸和第2個核苷酸之間的連接；以及所述反義鏈的3'末端端部第2個核苷酸和第3個核苷酸之間的連接。

在一些實施方式中，所述siRNA分子的反義鏈序列5'末端核苷酸為5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸類似物修飾的核苷酸。

如所屬技術領域具有通常知識者所熟知的，5'-磷酸核苷酸可具有以式（202）所示的結構：

式（202）；同時，常用的所述5'-磷酸類似物修飾的核苷酸的種類是所屬技術領域具有通常知識者習知的，例如，Anastasia Khvorova and Jonathan K. Watts, The chemical evolution of oligonucleotide therapies of clinical utility. Nature Biotechnology, 2017, 35(3): 238-48中公開的如式（203）-（206）所示的4種核苷酸：

式（203）式（204）式（205）式（206），其中，R表示選自於由H、OH、F和甲氧基所組成的組的基團； Base表示選自A、U、C、G或T的鹼基。

在一些具體的實施方式中，5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸類似物修飾的核苷酸為式（203）所示的具有乙烯基磷酸酯（E-vinylphosphonate，E-VP）的核苷酸、式（202）所示的具有5'-磷酸的核苷酸或式（205）所示的具有5'-硫代磷酸修飾的核苷酸。

本發明的發明人意外發現，本發明所述藥物綴合物在具有顯著提高的血漿中穩定性的同時，還表現出並未明顯降低的靶mRNA沉默活性以及優異的基因表達抑制效果。從而顯示出，本發明的藥物綴合物具有較高的體內遞送效率。按照本發明的一些實施方式，本發明的藥物綴合物為包含以下siRNA的藥物綴合物，所述siRNA例如為表1A-1H中示出的siRNA：

表1 一些實施方式中的siRNA序列

表1A

編號	序列方向5' - 3'	SEQ ID NO
siHBa1	S	CCUUGAGGCAUACUUCAAA	1
AS	UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU	2
siHBa2	S	GACCUUGAGGCAUACUUCAAA	3
AS	UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUCGG	4
siHBa1M1	S	CmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	5
AS	UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm	6
siHBa1M2	S	CmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	7
AS	UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm	8
siHBa2M1	S	GmAmCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	9
AS	UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm	10
siHBa2M2	S	GmAmCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	11
AS	UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm	12
siHBa1M1S	S	CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	13
AS	UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm	14
siHBa1M2S	S	CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	15
AS	UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm	16
siHBa2M1S	S	GmsAmsCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	17
AS	UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm	18
siHBa2M2S	S	GmsAmsCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	19
AS	UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm	20
siHBa1M1P1	S	CmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	21
AS	P1-UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm	22
siHBa1M2P1	S	CmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	23
AS	P1-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm	24
siHBa2M1P1	S	GmAmCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	25
AS	P1-UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm	26
siHBa2M2P1	S	GmAmCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	27
AS	P1-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm	28
siHBa1M1SP1	S	CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	29
AS	P1-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm	30
siHBa1M2SP1	S	CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	31
AS	P1-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm	32
siHBa2M1SP1	S	GmsAmsCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	33
AS	P1-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm	34
siHBa2M2SP1	S	GmsAmsCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	35
AS	P1-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm	36

表1B

編號	序列方向5' - 3'	SEQ ID NO
siHBb1	S	UGCUAUGCCUCAUCUUCUA	37
AS	UAGAAGAUGAGGCAUAGCAGC	38
siHBb2	S	UGCUAUGCCUCAUCUUCUA	39
AS	UAGAAGAUGAGGCAUAGCAUU	40
siHBb1M1	S	UmGmCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	41
AS	UmAfGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmGmCm	42
siHBb2M1	S	UmGmCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	43
AS	UmAfGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmUmUm	44
siHBb1M2	S	UmGmCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	45
AS	UmAfGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmGmCm	46
siHBb2M2	S	UmGmCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	47
AS	UmAfGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmUmUm	48
siHBb1M1S	S	UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	49
AS	UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm	50
siHBb2M1S	S	UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	51
AS	UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm	52
siHBb1M2S	S	UmsGmsCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	53
AS	UmsAfsGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm	54
siHBb2M2S	S	UmsGmsCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	55
AS	UmsAfsGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm	56
siHBb1M1P1	S	UmGmCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	57
AS	P1-UmAfGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmGmCm	58
siHBb2M1P1	S	UmGmCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	59
AS	P1-UmAfGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmUmUm	60
siHBb1M2P1	S	UmGmCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	61
AS	P1-UmAfGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmGmCm	62
siHBb2M2P1	S	UmGmCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	63
AS	P1-UmAfGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmUmUm	64
siHBb1M1SP1	S	UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	65
AS	P1-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm	66
siHBb2M1SP1	S	UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	67
AS	P1-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm	68
siHBb1M2SP1	S	UmsGmsCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	69
AS	P1-UmsAfsGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm	70
siHBb2M2SP1	S	UmsGmsCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	71
AS	P1-UmsAfsGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm	72

表1C

編號	序列方向5' - 3'	SEQ ID NO
siHBc1	S	UCUGUGCCUUCUCAUCUGA	73
AS	UCAGAUGAGAAGGCACAGACG	74
siHBc1M1	S	UmCmUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm	75
AS	UmCfAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmCmGm	76
siHBc1M2	S	UmCmUmGmUfGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm	77
AS	UmCfAmGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmCmGm	78
siHBc1M1S	S	UmsCmsUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm	79
AS	UmsCfsAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm	80
siHBc1M2S	S	UmsCmsUmGmUfGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm	81
AS	UmsCfsAmGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm	82
siHBc1M1P1	S	UmCmUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm	83
AS	P1-UmCfAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmCmGm	84
siHBc1M2P1	S	UmCmUmGmUfGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm	85
AS	P1-UmCfAmGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmCmGm	86
siHBc1M1SP1	S	UmsCmsUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm	87
AS	P1-UmsCfsAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm	88
siHBc1M2SP1	S	UmsCmsUmGmUfGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm	89
AS	P1-UmsCfsAmGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm	90

表1D

編號	序列方向5' - 3'	SEQ ID NO
siHBd1	S	CGUGUGCACUUCGCUUCAA	91
AS	UUGAAGCGAAGUGCACACGGU	92
siHBd1M1	S	CmGmUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm	93
AS	UmUfGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmGmUm	94
siHBd1M2	S	CmGmUmGmUfGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm	95
AS	UmUfGmAmAmGfCmGfAfAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmGmUm	96
siHBd1M1S	S	CmsGmsUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm	97
AS	UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm	98
siHBd1M2S	S	CmsGmsUmGmUfGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm	99
AS	UmsUfsGmAmAmGfCmGfAfAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm	100
siHBd1M1P1	S	CmGmUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm	101
AS	P1-UmUfGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmGmUm	102
siHBd1M2P1	S	CmGmUmGmUfGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm	103
AS	P1-UmUfGmAmAmGfCmGfAfAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmGmUm	104
siHBd1M1SP1	S	CmsGmsUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm	105
AS	P1-UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm	106
siHBd1M2SP1	S	CmsGmsUmGmUfGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm	107
AS	P1-UmsUfsGmAmAmGfCmGfAfAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm	108

表1E

編號	序列方向5' - 3'	SEQ ID NO
siHBe1	S	GAAAGUAUGUCAACGAAUU	109
AS	AAUUCGUUGACAUACUUUCUU	110
siHBe2	S	GAAAGUAUGUCAACGAAUU	111
AS	AAUUCGUUGACAUACUUUCCA	112
siHBe3	S	GAAAGUAUGUCAACGAAUA	113
AS	UAUUCGUUGACAUACUUUCUU	114
siHBe4	S	GAAAGUAUGUCAACGAAUA	115
AS	UAUUCGUUGACAUACUUUCCA	116
siHBe5	S	UGGAAAGUAUGUCAACGAAUA	117
AS	UAUUCGUUGACAUACUUUCCAUU	118
siHBe6	S	UGGAAAGUAUGUCAACGAAUA	119
AS	UAUUCGUUGACAUACUUUCCAAU	120
siHBe7	S	UGGAAAGUAUGUCAACGAAUU	121
AS	AAUUCGUUGACAUACUUUCCAUU	122
siHBe1M1	S	GmAmAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	123
AS	AmAfUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmUmUm	124
siHBe2M1	S	GmAmAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	125
AS	AmAfUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmCmAm	126
siHBe3M1	S	GmAmAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	127
AS	UmAfUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmUmUm	128
siHBe4M1	S	GmAmAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	129
AS	UmAfUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmCmAm	130
siHBe1M2	S	GmAmAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	131
AS	AmAfUmUmCmGfUmUfGfAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmUmUm	132
siHBe2M2	S	GmAmAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	133
AS	AmAfUmUmCmGfUmUfGfAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmCmAm	134
siHBe3M2	S	GmAmAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	135
AS	UmAfUmUmCmGfUmUfGfAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmUmUm	136
siHBe4M2	S	GmAmAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	137
AS	UmAfUmUmCmGfUmUfGfAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmCmAm	138
siHBe1M3	S	GmAmAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	139
AS	AmAfUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmUmUm	140
siHBe2M3	S	GmAmAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	141
AS	AmAfUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmCmAm	142
siHBe3M3	S	GmAmAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	143
AS	UmAfUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmUmUm	144
siHBe4M3	S	GmAmAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	145
AS	UmAfUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmCmAm	146
siHBe5M1	S	UmGmGmAmAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	147
AS	UmAfUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmCmAmUmUm	148
siHBe6M2	S	UmGmGmAmAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	149
AS	UmAfUmUmCmGfUmUfGfAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmCmAmAmUm	150
SiHBe7M3	S	UmGmGmAmAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	151
AS	AmAfUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmCmAmUmUm	152
siHBe1M1S	S	GmsAmsAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	153
AS	AmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm	154
siHBe2M1S	S	GmsAmsAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	155
AS	AmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsCmsAm	156
siHBe3M1S	S	GmsAmsAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	157
AS	UmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm	158
siHBe4M1S	S	GmsAmsAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	159
AS	UmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsCmsAm	160
siHBe1M2S	S	GmsAmsAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	161
AS	AmsAfsUmUmCmGfUmUfGfAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm	162
siHBe2M2S	S	GmsAmsAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	163
AS	AmsAfsUmUmCmGfUmUfGfAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsCmsAm	164
siHBe3M2S	S	GmsAmsAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	165
AS	UmsAfsUmUmCmGfUmUfGfAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm	166
siHBe4M2S	S	GmsAmsAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	167
AS	UmsAfsUmUmCmGfUmUfGfAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsCmsAm	168
siHBe1M3S	S	GmsAmsAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	169
AS	AmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm	170
siHBe2M3S	S	GmsAmsAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	171
AS	AmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsCmsAm	172
siHBe3M3S	S	GmsAmsAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	173
AS	UmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm	174
siHBe4M3S	S	GmsAmsAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	175
AS	UmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsCmsAm	176
siHBe5M1S	S	UmsGmsGmAmAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	177
AS	UmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmCmAmUsmsUm	178
siHBe6M2S	S	UmsGmsGmAmAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	179
AS	UmsAfsUmUmCmGfUmUfGfAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmCmAmsAmsUm	180
SiHBe7M3S	S	UmsGmsGmAmAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	181
AS	AmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmCmAmsUmsUm	182
siHBe1M1P1	S	GmAmAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	183
AS	P1-AmAfUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmUmUm	184
siHBe2M1P1	S	GmAmAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	185
AS	P1-AmAfUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmCmAm	186
siHBe3M1P1	S	GmAmAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	187
AS	P1-UmAfUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmUmUm	188
siHBe4M1P1	S	GmAmAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	189
AS	P1-UmAfUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmCmAm	190
siHBe1M2P1	S	GmAmAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	191
AS	P1-AmAfUmUmCmGfUmUfGfAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmUmUm	192
siHBe2M2P1	S	GmAmAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	193
AS	P1-AmAfUmUmCmGfUmUfGfAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmCmAm	194
siHBe3M2P1	S	GmAmAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	195
AS	P1-UmAfUmUmCmGfUmUfGfAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmUmUm	196
siHBe4M2P1	S	GmAmAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	197
AS	P1-UmAfUmUmCmGfUmUfGfAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmCmAm	198
siHBe1M3P1	S	GmAmAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	199
AS	P1-AmAfUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmUmUm	200
siHBe2M3P1	S	GmAmAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	201
AS	P1-AmAfUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmCmAm	202
siHBe3M3P1	S	GmAmAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	203
AS	P1-UmAfUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmUmUm	204
siHBe4M3P1	S	GmAmAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	205
AS	P1-UmAfUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmCmAm	206
siHBe5M1P1	S	UmGmGmAmAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	207
AS	P1-UmAfUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmCmAmUmUm	208
siHBe6M2P1	S	UmGmGmAmAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	209
AS	P1-UmAfUmUmCmGfUmUfGfAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmCmAmAmUm	210
SiHBe7M3P1	S	UmGmGmAmAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	211
AS	P1-AmAfUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmCmAmUmUm	212
siHBe1M1SP1	S	GmsAmsAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	213
AS	P1-AmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm	214
siHBe2M1SP1	S	GmsAmsAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	215
AS	P1-AmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsCmsAm	216
siHBe3M1SP1	S	GmsAmsAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	217
AS	P1-UmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm	218
siHBe4M1SP1	S	GmsAmsAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	219
AS	P1-UmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsCmsAm	220
siHBe1M2SP1	S	GmsAmsAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	221
AS	P1-AmsAfsUmUmCmGfUmUfGfAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm	222
siHBe2M2SP1	S	GmsAmsAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	223
AS	P1-AmsAfsUmUmCmGfUmUfGfAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsCmsAm	224
siHBe3M2SP1	S	GmsAmsAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	225
AS	P1-UmsAfsUmUmCmGfUmUfGfAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm	226
siHBe4M2SP1	S	GmsAmsAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	227
AS	P1-UmsAfsUmUmCmGfUmUfGfAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsCmsAm	228
siHBe1M3SP1	S	GmsAmsAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	229
AS	P1-AmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm	230
siHBe2M3SP1	S	GmsAmsAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	231
AS	P1-AmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsCmsAm	232
siHBe3M3SP1	S	GmsAmsAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	233
AS	P1-UmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm	234
siHBe4M3SP1	S	GmsAmsAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	235
AS	P1-UmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsCmsAm	236
siHBe5M1SP1	S	UmsGmsGmAmAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	237
AS	P1-UmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmCmAmsUmsUm	238
siHBe6M2SP1	S	UmsGmsGmAmAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	239
AS	P1-UmsAfsUmUmCmGfUmUfGfAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmCmAmsAmsUm	240
siHBe7M3SP1	S	UmsGmsGmAmAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	241
AS	P1-AmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmCmAmsUmsUm	242

表1F

編號	序列方向5’ - 3’	SEQ ID NO
siAN1	S	CCAAGAGCACCAAGAACUA	243
AS	UAGUUCUUGGUGCUCUUGGCU	244
siAN2	S	AGCCAAGAGCACCAAGAACUA	245
AS	UAGUUCUUGGUGCUCUUGGCUUG	246
siAN1M1	S	CmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	247
AS	UmAfGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm	248
siAN2M1	S	AmGmCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	249
AS	UmAfGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm	250
siAN1M2	S	CmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	251
AS	UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm	252
siAN2M2	S	AmGmCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	253
AS	UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm	254
siAN1M3	S	CmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	255
AS	UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm	256
siAN2M3	S	AmGmCmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	257
AS	UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm	258
siAN1M1S	S	CmsCmsAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	259
AS	UmsAfsGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm	260
siAN2M1S	S	AmsGmsCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	261
AS	UmsAfsGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm	262
siAN1M2S	S	CmsCmsAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	263
AS	UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm	264
siAN2M2S	S	AmsGmsCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	265
AS	UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm	266
siAN1M3S	S	CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	267
AS	UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm	268
siAN2M3S	S	AmsGmsCmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	269
AS	UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm	270
siAN1M1P1	S	CmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	271
AS	P1-UmAfGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm	272
siAN2M1P1	S	AmGmCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	273
AS	P1-UmAfGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm	274
siAN1M2P1	S	CmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	275
AS	P1-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm	276
siAN2M2P1	S	AmGmCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	277
AS	P1-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm	278
siAN1M3P1	S	CmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	279
AS	P1-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm	280
siAN2M3P1	S	AmGmCmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	281
AS	P1-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm	282
siAN1M1SP1	S	CmsCmsAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	283
AS	P1-UmsAfsGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm	284
siAN2M1SP1	S	AmsGmsCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	285
AS	P1-UmsAfsGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm	286
siAN1M2SP1	S	CmsCmsAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	287
AS	P1-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm	288
siAN2M2SP1	S	AmsGmsCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	289
AS	P1-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm	290
siAN1M3SP1	S	CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	291
AS	P1-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm	292
siAN2M3SP1	S	AmsGmsCmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	293
AS	P1-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm	294

表1G

編號	序列方向5' - 3'	SEQ ID NO
siAP1	S	CAAUAAAGCUGGACAAGAA	295
AS	UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGG	296
siAP2	S	CCCAAUAAAGCUGGACAAGAA	297
AS	UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGGAG	298
siAP1M1	S	CmAmAmUmAfAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	299
AS	UmUfCmUmUmGfUmCfCfAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGm	300
siAP2M1	S	CmCmCmAmAmUmAfAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	301
AS	UmUfCmUmUmGfUmCfCfAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGmAmGm	302
siAP1M2	S	CmAmAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	303
AS	UmUfCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGm	304
siAP2M2	S	CmCmCmAmAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	305
AS	UmUfCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGmAmGm	306
siAP1M1S	S	CmsAmsAmUmAfAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	307
AS	UmsUfsCmUmUmGfUmCfCfAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm	308
siAP2M1S	S	CmsCmsCmAmAmUmAfAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	309
AS	UmsUfsCmUmUmGfUmCfCfAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGmsAmsGm	310
siAP1M2S	S	CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	311
AS	UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm	312
siAP2M2S	S	CmsCmsCmAmAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	313
AS	UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGmsAmsGm	314
siAP1M1P1	S	CmAmAmUmAfAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	315
AS	P1-UmUfCmUmUmGfUmCfCfAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGm	316
siAP2M1P1	S	CmCmCmAmAmUmAfAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	317
AS	P1-UmUfCmUmUmGfUmCfCfAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGmAmGm	318
siAP1M2P1	S	CmAmAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	319
AS	P1-UmUfCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGm	320
siAP2M2P1	S	CmCmCmAmAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	321
AS	P1-UmUfCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGmAmGm	322
siAP1M1SP1	S	CmsAmsAmUmAfAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	323
AS	P1-UmsUfsCmUmUmGfUmCfCfAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm	324
siAP2M1SP1	S	CmsCmsCmAmAmUmAfAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	325
AS	P1-UmsUfsCmUmUmGfUmCfCfAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGmsAmsGm	326
siAP1M2SP1	S	CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	327
AS	P1-UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm	328
siAP2M2SP1	S	CmsCmsCmAmAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	329
AS	P1-UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGmsAmsGm	330

表1H

編號	序列方向5' - 3'	SEQ ID NO
FC-siSTAT1	S	CmsUmsAmGmAmAmAfAfCfUmGmGmAmUmAmAmCmGmUm	719
AS	AmsCfsGmUmUmAfUmCmCmAmGmUmUmUfUmCfUmAmGmsCmsCm	720

其中，S表示正義鏈，AS表示反義鏈；大寫字母C、G、U、A表示核苷酸的鹼基組成；小寫字母m表示該字母m左側相鄰的一個核苷酸為2'-甲氧基修飾的核苷酸；小寫字母f表示該字母f左側相鄰的一個核苷酸為2'-氟修飾的核苷酸；小寫字母s表示與該字母s左右相鄰的兩個核苷酸之間的連接為硫代磷酸酯基連接；P1表示該P1右側相鄰的一個核苷酸為5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸類似物修飾的核苷酸，在一些實施方式中為乙烯基磷酸酯修飾的核苷酸（以下實施例中以VP表示）、5'-磷酸修飾的核苷酸（以下實施例中以P表示）或硫代磷酸酯修飾的核苷酸（以下實施例中以Ps表示）。

所屬技術領域具有通常知識者清楚知曉的是，可以通過使用具有相應修飾的核苷單體來將修飾的核苷酸基團引入本發明所述的siRNA中，製備具有相應修飾的核苷單體的方法及將修飾的核苷酸基團引入siRNA的方法也是所屬技術領域具有通常知識者所熟知的。所有修飾的核苷單體均可以商購得到或者採用已知方法製備得到。

[藥物綴合物的製備]

可以採用任意合理的合成路線製備本發明的藥物綴合物。下面以活性藥物為寡核苷酸為例，說明瞭本發明提供的藥物綴合物的製備方法，所屬技術領域具有通常知識者可以預知，其它活性藥物也可以參照下述方法製備，只不過省去了核苷酸序列的製備過程，或者，可以根據具體的活性藥物的結構特點，在下述方法的基礎之上進行相應的改變。

在一些實施方式中，所述藥物綴合物的製備方法包括：在亞磷醯胺固相合成的條件下，分別按照所述功能性寡核苷酸的核苷酸種類和順序，按照3'到5'的方向將核苷單體依次連接，每個核苷單體的連接包括脫保護、偶聯、蓋帽、氧化或硫化四步反應；所述方法還包括用式（111）所示化合物代替固相載體，將第一個核苷酸與式（111）所示化合物連接。或者，所述方法還包括形成連接在固相載體上的核苷酸序列後，在偶聯反應條件和偶聯試劑存在下，將式（101）所示的化合物與該連接在固相載體上的核苷酸序列接觸，並進行蓋帽反應，再進行氧化、硫化或硼氫化反應。可選地，再進行n次（n的定義與式（301）中相同）與式（101）化合物的接觸，每次均是對前一步驟得到的產物進行脫保護，隨後與式（101）化合物相接觸，進行蓋帽反應，並進行氧化、硫化或硼氫化反應。

在一些實施方式中，該方法還包含脫除保護基並與固相載體切割的步驟、分離純化步驟。

在一些實施方式中，所述寡核苷酸為雙鏈寡核苷酸，所述藥物綴合物的製備方法包括在偶聯反應條件和偶聯試劑存在下，將式（111）所示的化合物與正義鏈或反義鏈的3'端的第一個核苷單體接觸，使式（111）所示的化合物連接上序列中第一個核苷酸，在亞磷醯胺固相合成的條件下，按照期望的正義鏈或反義鏈核苷酸種類和順序，按照3'到5'的方向將核苷單體依次連接，合成寡核苷酸的正義鏈或反義鏈；其中，與第一個核苷單體連接前，式（111）所示化合物經過脫保護；每個核苷單體的連接包括脫保護、偶聯、蓋帽、氧化或硫化四步反應，得到核酸的正義鏈或反義鏈；在亞磷醯胺固相合成的條件下，按照反義鏈或正義鏈核苷酸種類和順序，按照3'到5'的方向將核苷單體依次連接，合成核酸的反義鏈或正義鏈；每個核苷單體的連接包括脫保護、偶聯、蓋帽、氧化或硫化四步反應；脫除保護基並與固相載體切割，分離純化獲得核酸的正義鏈和反義鏈，退火。

在一些實施方式中，所述寡核苷酸為雙鏈寡核苷酸，所述藥物綴合物的製備方法包括按照該雙鏈寡核苷酸中正義鏈或反義鏈的核苷酸種類和順序，按照3'到5'的方向將核苷單體依次連接，合成正義鏈和反義鏈，每個核苷單體的連接包括脫保護、偶聯、蓋帽、氧化或硫化四步反應，得到連接在固相載體上的正義鏈和連接在固相載體上的反義鏈；脫除連接在固相載體上的正義鏈和連接在固相載體上的反義鏈上末端核苷的羥基保護基團，在偶聯反應條件和偶聯試劑存在下，將式（101）所示的化合物與連接在固相載體上的正義鏈或連接在固相載體上的反義鏈接觸，從而將式（101）化合物連接至正義鏈或反義鏈；脫除保護基並與固相載體切割，分別分離純化，獲得寡核苷酸的反義鏈或正義鏈，退火。

在一個具體實施方式中，式A59中的P原子連接至siRNA中的正義鏈的3'末端，本發明的藥物綴合物的製備方法包括：（1）脫除式（111）所示化合物中的羥基保護基團R₈ ；在偶聯反應條件和偶聯試劑存在下，將該化合物與核苷單體接觸，得到通過本發明的化合物連接至固相載體的核苷單體；（2）以該通過本發明的化合物連接至固相載體的核苷單體起始，按照3'-5'的方向通過亞磷醯胺固相合成方法合成siRNA的正義鏈；（3）通過亞磷醯胺固相合成方法，合成siRNA的反義鏈；（4）分離出siRNA的正義鏈和反義鏈並退火，獲得本發明的藥物綴合物。

其中，在步驟（1）中，脫除式（111）所示的化合物中的保護基團R₈ 的方法包括在脫保護條件下，將式（111）所示化合物與脫保護試劑接觸。脫保護條件包括溫度為0-50^o C，在一些實施方式中為15-35^o C，反應時間為30-300秒，在一些實施方式中為50-150秒，脫保護試劑可以選自三氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸中的一種或多種，在一些實施方式中為二氯乙酸。脫保護試劑與式（111）所示化合物的莫耳比可以為10:1-1000:1，在一些實施方式中為50:1-500:1。

所述偶聯反應條件和偶聯試劑可使用任何能夠實現上述偶聯反應的條件和試劑。出於簡化製程的考慮，可在一些實施方式中使用與所採用的固相合成方法中的偶聯反應相同的條件與試劑。

一般來說，所述偶聯反應的條件包括反應溫度為0-50^o C，在一些實施方式中為15-35^o C。式（321）化合物與核苷單體的莫耳比可以為1:1-1:50，在一些實施方式中為1:2-1:5；式（321）化合物和偶聯試劑的莫耳比為1:1-1:50，在一些實施方式中為1:3-1:10。反應時間可以為200-3000秒，在一些實施方式中為500-1500秒。偶聯試劑選自1H-四氮唑、5-乙硫基1H-四氮唑、5-苄硫基1H-四氮唑中的一種或多種，在一些實施方式中為5-乙硫基1H-四氮唑。所述偶聯反應可在有機溶劑中進行，所述有機溶劑選自無水乙腈、無水DMF、無水二氯甲烷中的一種或多種，在一些實施方式中為無水乙腈。相對於式（321）化合物，所述有機溶劑的用量可以為3-50L/mol，在一些實施方式中為5-20L/mol。

在步驟（2）中，通過亞磷醯胺核酸固相合成的方法，利用上述步驟製備的通過本發明的化合物連接至固相載體的核苷單體起始，按照3'-5'的方向合成藥物綴合物的正義鏈S。此時，式（101）所示的化合物連接至所得到的正義鏈的3'末端。

步驟（2）和（3）中所述固相合成的其它條件，包括核苷單體脫保護條件，脫保護試劑種類和用量，偶聯反應條件，偶聯試劑的種類和用量，蓋帽反應的條件，蓋帽試劑的種類和用量，氧化反應條件，氧化試劑種類和用量，硫化反應條件，硫化試劑和用量採用本領域中常規使用的各種試劑、用量和條件。

所屬技術領域具有通常知識者容易理解的是，由於與亞磷醯胺固相合成方法中所使用的核苷單體類似地，由式（101）所示的化合物同樣具有亞磷醯胺基團和羥基保護基團，因此可將式（101）化合物視為一個核苷單體，應用本領域習知的亞磷醯胺固相合成方法，通過脫保護、偶聯、蓋帽、氧化或硫化反應，將其連接至固定相，並可隨後繼續連接另一式（101）化合物或者另一核苷單體，直至獲得目標產物的核苷酸序列。相應地，以下關於式（101）所示的化合物的反應的描述中，當提及“脫保護”、“偶聯”、“蓋帽”、“氧化”、“硫化”等反應時，應當理解為本領域習知的亞磷醯胺核酸固相合成方法中所關於的反應條件和試劑也同樣適用於這些反應。示例性的反應條件和試劑如下所述。

上述方法中，固相載體可以是本領域中習知的可用於核酸固相合成的固相載體，例如，可以是市售的通用固相載體（NittoPhase®HL UnyLinker™ 300 Oligonucleotide Synthesis Support，Kinovate Life Sciences公司，結構如式B80所示）：

（B80）。

在一些實施方式中，上述方法中所述固相合成可使用如下條件：

脫保護條件包括溫度為0-50^o C，例如為15-35^o C；反應時間為30-300秒，例如為50-150秒。脫保護試劑可以選自三氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸中的一種或多種，在一些實施方式中，脫保護試劑為二氯乙酸。脫保護試劑與固定相上的4,4'-二甲氧基三苯甲基保護基的的莫耳比可以為2:1-100:1，例如為3:1-50:1。通過進行所述脫保護，在所述固相載體表面上、連接在固相載體上的式（101）所示的化合物上或通過式（101）所示的化合物與固相載體連接的核酸序列的末端核苷上獲得具有反應活性的遊離羥基，從而便於進行下一步的偶聯反應。

偶聯反應條件包括溫度為0-50^o C，例如為15-35^o C。固相載體上連接的核酸序列（在固相合成初期，列入計算的是上述脫保護步驟中形成的具有反應活性的遊離羥基）與核苷單體或者式（101）化合物的莫耳比可以為1:1-1:50，例如為1:5-1:15。固相載體上連接的核酸序列和偶聯試劑的莫耳比可以為1:1-1:100，例如為1:50-1:80。反應時間可以為200-3000秒，例如為500-1500秒。偶聯試劑選自1H-四氮唑、5-乙硫基1H-四氮唑、5-苄硫基1H-四氮唑中的一種或多種，例如為5-乙硫基1H-四氮唑。所述偶聯反應可在有機溶劑中進行，所述有機溶劑選自無水乙腈、無水DMF、無水二氯甲烷中的一種或多種，例如為無水乙腈。相對於式（101）化合物，所述有機溶劑的用量可以為3-50L/mol，例如可以為5-20L/mol。通過進行該偶聯反應，脫保護反應中形成的遊離羥基與核苷單體或式（101）化合物上的亞磷醯胺基團反應形成亞磷酸酯連接。

蓋帽反應的作用在於，通過過量蓋帽試劑將前述偶聯反應中尚未反應完全的活性反應官能團鈍化，以避免在後續反應中產生不必要的副產物。蓋帽反應條件包括溫度可以為0-50^o C，例如為15-35^o C，反應時間可以為5-500秒，例如為10-100秒，所述蓋帽反應在蓋帽試劑存在下進行。蓋帽試劑可以使用siRNA固相合成中所使用的蓋帽試劑，siRNA固相合成中所使用的蓋帽試劑為所屬技術領域具有通常知識者所習知。在一些實施方式中，所述蓋帽試劑例如可以為蓋帽試劑A（capA）和蓋帽試劑B（capB），其中，蓋帽試劑A為N-基甲基咪唑，在一些實施方式中，N-基甲基咪唑以N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液形式提供，其中，吡啶與乙腈的體積比為1:10-1:1，例如為1:3-1:1，吡啶與乙腈的總體積與N-甲基咪唑的體積為1:1-10:1，例如為3:1-7:1。所述蓋帽試劑B為乙酸酐，在一些實施方式中，乙酸酐以乙酸酐的乙腈溶液形式提供，其中，乙酸酐和乙腈的體積為1:1-1:10，例如為1:2-1:6。在所述步驟（i）和（ii）中，所述N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液的體積與式（101）化合物和固相載體的品質和之比可以為5ml/g-50ml/g，例如為15ml/g-30ml/g。所述乙酸酐的乙腈溶液的體積與式（101）化合物和固相載體的品質和之比可以為0.5ml/g-10ml/g，例如為1ml/g-5ml/g。在一些實施方式中，蓋帽試劑使用等莫耳量的乙酸酐與N-甲基咪唑。在所述步驟（iii）和（iv）中，蓋帽試劑的總量與固相載體上連接的核酸序列的莫耳比為1:100-100:1，例如為1:10-10:1。在蓋帽試劑使用等莫耳量的乙酸酐與N-甲基咪唑的情況下，乙酸酐、N-甲基咪唑以及固相載體上連接的核酸序列的莫耳比可以為1:1:10-10:10:1，例如為1:1:2-2:2:1。

當序列中目標位置處的相鄰核苷之間為磷酸酯鍵連接時，經偶聯反應，連接上較後一個核苷單體之後，在氧化反應條件、氧化試劑存在下進行氧化反應。氧化反應條件包括溫度為0-50^o C，例如可以為15-35^o C，反應時間可以為1-100秒，例如可以為5-50秒，氧化試劑例如可以為碘（在一些實施方式中，以碘水的形式提供）。氧化試劑與偶聯步驟中固相載體上連接的核酸序列的莫耳比可以為1:1-100:1，例如可以為5:1-50:1。在一些具體的實施方式中，所述氧化反應在四氫呋喃:水:吡啶=3:1:1-1:1:3的混合溶劑中進行。

當序列中目標位置處的相鄰核苷之間為硫代磷酸酯鍵連接時，經偶聯反應，連接上較後一個核苷單體之後，在硫化反應條件、硫化試劑存在下進行硫化反應。硫化反應條件包括溫度為0-50^o C，例如可以為15-35^o C，反應時間可以為50-2000秒，例如可以為100-1000秒，硫化試劑例如可以為氫化黃原素。硫化試劑與偶聯步驟中固相載體上連接的核酸序列的莫耳比可以為10:1–1000:1，例如可以為10:1-500:1。在一些具體的實施方式中，所述硫化反應在乙腈:吡啶=1:3-3:1的混合溶劑中進行。通過所述氧化/硫化反應，將前述獲得的亞磷酸酯連接氧化為穩定的磷酸酯或硫代磷酸酯連接，完成本次亞磷醯胺固相合成循環。

按照本發明提供的方法，在將所有核苷單體連接之後，退火之前，該方法還包括分離出siRNA的正義鏈和反義鏈。分離的方法為所屬技術領域具有通常知識者所習知，一般包括將合成得到的核苷酸序列從固相載體上切割下來，脫除鹼基上、磷酸基上和配體上的保護基團，純化和脫鹽。

將合成得到的核苷酸序列從固相載體上切割下來，並脫除鹼基上、磷酸基上和配體上的保護基團可按照siRNA合成中常規的切割和脫保護方法進行。例如，將得到的連接有固相載體的核苷酸序列與濃氨水接觸；在脫保護的過程中，A51-A59基團中的保護基團被脫除，A₀ 轉化為A，同時連接本發明化合物的核苷酸序列從固相載體上切割下來。其中，所述濃氨水是指25-30重量%的氨水，濃氨水的用量與目標siRNA序列相比為0.2ml/μmol-0.8ml/μmol。

在所合成的核苷酸序列上存在至少一個2'-O-TBDMS保護時，所述方法還包括將脫除了固相載體的核苷酸序列與三乙胺三氫氟酸鹽接觸，以脫除該2'-O-TBDMS保護。此時，所得到的目標siRNA序列中具有遊離的2'-羥基的相應核苷。三乙胺三氫氟酸鹽純品的用量與目標siRNA序列相比可以為0.4ml/μmol-1.0ml/μmol。

純化和脫鹽的方法是所屬技術領域具有通常知識者熟知的。例如，可利用製備型離子色譜純化柱，通過NaBr或NaCl的梯度沖提，完成核酸的純化；產品收集合併後，可採用反相色譜純化柱進行脫鹽。

在合成過程中，可隨時對核酸序列的純度和分子量進行檢測，從而更好地控制合成品質，檢測的方法為所屬技術領域具有通常知識者所習知。例如，可通過離子交換色譜檢測核酸純度，並通過液質聯用色譜測定分子量。

退火的方法也是所屬技術領域具有通常知識者熟知的。例如，可將所合成的正義鏈（S鏈）與反義鏈（AS鏈）以等莫耳比混合在注射用水中加熱至70-95^o C，隨後室溫冷卻，使其通過氫鍵形成雙鏈結構。這樣即可得到本發明的藥物綴合物。

在獲得本發明的藥物綴合物後，在一些實施方式中，還可利用例如液質聯用色譜等方法，通過分子量檢測等方式對所合成的藥物綴合物進行表徵，確定所合成的藥物綴合物為目標設計的藥物綴合物，且所合成的寡核苷酸的序列與欲合成的寡核苷酸的序列相符，例如與上述表1中所列的序列相符。

在一些實施方式中，本發明的藥物綴合物中的siRNA可以是以下第一種siRNA。

所述第一種siRNA中的每個核苷酸各自獨立地為修飾或未修飾的核苷酸，該siRNA含有正義鏈和反義鏈，其中，所述正義鏈包含核苷酸序列1，所述反義鏈包含核苷酸序列2，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2至少部分地反向互補形成雙鏈區，所述核苷酸序列1與SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且所述核苷酸序列2與SEQ ID NO ： 2所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- CCUUGAGGCAUACUUCAAZ -3'（SEQ ID NO: 717）； 5'- Z'UUGAAGUAUGCCUCAAGG -3'（SEQ ID NO: 718）；其中，Z為A，Z'為U，所述核苷酸序列1中包含位置對應於Z的核苷酸Z_A ，所述核苷酸序列2中，包含位置對應於Z'的核苷酸Z'_B ，所述Z'_B 是所述反義鏈5'末端的第一個核苷酸。

在一些實施方式中，所述核苷酸序列1與SEQ ID NO： 717所示的核苷酸序列不多於1個核苷酸差異，和/或所述核苷酸序列2與SEQ ID NO： 2所示的核苷酸序列不多於1個核苷酸差異。

在一些實施方式中，所述核苷酸序列2與SEQ ID NO： 718所示的核苷酸序列之間的核苷酸差異包括Z'_B 位置處的差異，且Z'_B 選自A、C或G；在一些實施方式中，所述核苷酸差異為Z'_B 位置處的差異，Z'_B 選自A、C或G，並且Z_A 是與Z'_B 互補的核苷酸。這些核苷酸差異並不會顯著降低藥物綴合物的靶基因抑制能力，而這些包含特定核苷酸差異的藥物綴合物也在本發明的保護範圍之內。

在一些實施方式中，所述核苷酸序列3連接在所述核苷酸序列1的5'末端，並且所述核苷酸序列4連接在所述核苷酸序列2的3'末端。在一些實施方式中，所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4長度相等並且反向互補。因此，所述正義鏈和反義鏈的長度可以是19-23個核苷酸。

在一些實施方式中，所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4的長度均為1個核苷酸，所述核苷酸序列3的鹼基為A，此時，所述雙鏈區的長度可以是20個核苷酸，即本發明的siRNA正義鏈和反義鏈的長度之比可以是20/20；或者，所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4的長度均為2個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列3的鹼基依次為G和A，此時，所述雙鏈區的長度可以是21個核苷酸，即本發明的siRNA正義鏈和反義鏈的長度之比可以是21/21；或者，所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4的長度均為3個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列3的鹼基依次為C、G和A，此時，所述雙鏈區的長度可以是22個核苷酸，即本發明的siRNA正義鏈和反義鏈的長度之比可以是22/22；或者，所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4的長度均為4個核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列3的鹼基依次為C、C、G和A，此時，所述雙鏈區的長度可以是23個核苷酸，即本發明的siRNA正義鏈和反義鏈的長度之比可以是23/23。

在一些具體的實施方式中，所述核苷酸序列3的長度為2個核苷酸，並且按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列3的鹼基依次為G和A。

在一些具體的實施方式中，上述各組中，核苷酸序列3和所述核苷酸序列4的長度相同，並且完全反向互補，因此，給出了核苷酸序列3的鹼基，核苷酸序列4的鹼基也就確定了。

在一些實施方式中，本發明的siRNA還含有核苷酸序列5，所述核苷酸序列5的長度為1至3個核苷酸，連接在所述反義鏈的3'末端，從而構成所述反義鏈的3'突出端。在一些實施方式中，所述核苷酸序列5的長度為1或2個核苷酸。這樣，本發明的siRNA的正義鏈和反義鏈的長度之比可以是19/20、19/21、20/21、20/22、21/22、21/23、22/23、22/24、23/24或23/25。

在一些實施方式中，所述核苷酸序列5的長度為2個核苷酸，並且按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列5為連續的2個胸腺嘧啶去氧核糖核苷酸、連續的2個脲嘧啶核糖核苷酸、或者與靶mRNA互補的兩個核苷酸。因此，在一些實施方式中，本發明的siRNA的正義鏈和反義鏈的長度之比為19/21或21/23，此時，本發明的siRNA具有更好的HBV mRNA沉默活性和/或有效地降低表面抗原HBsAg表達的活性。

在一些實施方式中，所述核苷酸序列1含有如SEQ ID NO： 1所示的核苷酸序列，且所述核苷酸序列2含有如SEQ ID NO： 3所示的核苷酸序列： 5'- CCUUGAGGCAUACUUCAAZ -3'（SEQ ID NO： 1）， 5'- Z'UUGAAGUAUGCCUCAAGGUU -3'（SEQ ID NO： 2）；

在一些實施方式中，本發明的siRNA為siHBa1或siHBa2： siHBa1 正義鏈：5'- CCUUGAGGCAUACUUCAAZ -3'（SEQ ID NO： 1），反義鏈：5'- Z'UUGAAGUAUGCCUCAAGGUU -3'（SEQ ID NO： 2）， siHBa2 正義鏈：5'- GACCUUGAGGCAUACUUCAAZ -3'（SEQ ID NO： 3），反義鏈：5'- Z'UUGAAGUAUGCCUCAAGGUCGG -3'（SEQ ID NO： 4），其中，Z為A，Z'為U。

如前所述，所述第一種siRNA中的核苷酸各自獨立地為修飾或未修飾的核苷酸。在一些實施方式中，所述第一種siRNA中的核苷酸為未經修飾的核苷酸；在一些實施方式中，所述第一種siRNA中的部分或全部核苷酸為修飾的核苷酸，核苷酸基團上的這些修飾不會導致本發明的藥物綴合物抑制HBV基因表達的功能明顯削弱或喪失。在一些實施方式中，如前所述地對所述第一種siRNA中的核苷酸進行修飾。在一些實施方式中，所述第一種siRNA可以是表1A中列出的任何一種siRNA。

本發明的藥物綴合物的應用

本發明的藥物綴合物具有優異的靶向特異性，因此能夠高效地將所綴合的功能性寡核苷酸遞送至目標器官或組織，從而有效地對細胞內基因表達進行調控。從而，本發明的藥物綴合物具有廣泛的應用前景。

按照本發明一種實施方式，本發明提供了本發明的藥物綴合物在製備用於治療和/或預防由細胞中基因的表達引起的病理狀況或疾病的藥物中的用途。所述基因可以是細胞中表達的內源性基因，也可以是在細胞中繁殖的病原體基因。在一些實施方式中，所述基因選自ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV、HCV等基因。在一些實施方式中，所述基因選自B型肝炎病毒基因、血管生成素樣蛋白3基因或者載脂蛋白C3基因。相應地，所述疾病選自慢性肝病、肝炎、肝纖維化疾病、肝增生性疾病和血脂異常。在一些實施方式中，所述血脂異常為高膽固醇血症、高甘油三酯血症或動脈粥樣硬化。在一些實施方式中，所述基因選自訊號轉導及轉錄啟動蛋白3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3, STAT3）。

按照本發明的一種實施方式，本發明提供了一種治療由細胞中基因的表達而引起的病理狀況或疾病的方法，該方法包括向患者給予本發明的藥物綴合物。在一些實施方式中，所述基因選自ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV、HCV等基因。在一些實施方式中，所述基因選自B型肝炎病毒基因、血管生成素樣蛋白3基因、載脂蛋白C3基因或者訊號轉導及轉錄啟動蛋白3（STAT3）。相應地，所述疾病選自慢性肝病、肝炎、肝纖維化疾病、肝增生性疾病、血脂異常和腫瘤。在一些實施方式中，所述血脂異常為高膽固醇血症、高甘油三酯血症或動脈粥樣硬化。

按照本發明另外一種實施方式，本發明提供了一種調控細胞中基因表達的方法，所述調控包括抑制或增強所述基因的表達，該方法包括將本發明的藥物綴合物與所述細胞接觸。

通過將本發明的藥物綴合物給予有需要的患者，可以通過對基因表達進行調控的機制達到預防和/或治療由細胞中基因的表達而引起的病理狀況或疾病的目的。因此，本發明的藥物綴合物可用於預防和/或治療所述病理狀況或疾病、或用於製備用於預防和/或治療所述病理狀況或疾病的藥物。

本文所使用的術語“給藥/給予”是指通過使得至少部分地將藥物綴合物定位於期望的位點以產生期望效果的方法或途徑，將藥物綴合物放置入患者體內。適於本發明方法的給藥途徑包括局部給藥和全身給藥。一般而言，局部給藥導致與患者整個身體相比將更多藥物綴合物遞送至特定位點；而全身給藥導致將所述藥物綴合物遞送至患者的基本整個身體。一些實施方式

可通過本領域已知的任何合適途徑向患者給藥，所述途徑包括但不僅限於：口服或胃腸外途徑，包括靜脈內給藥、肌肉內給藥、皮下給藥、經皮給藥、氣道給藥（氣霧劑）、肺部給藥、鼻部給藥、直腸給藥和局部給藥（包括口腔含化給藥和舌下給藥）。給藥頻率可以是每天、每週、每個月或每年1次或多次。

本發明所述的藥物綴合物的使用劑量可為本領域常規的劑量，所述劑量可以根據各種參數、尤其是患者的年齡、體重和性別來確定。可在細胞培養或實驗動物中通過標準藥學程式測定毒性和療效，例如測定LD50（使50%的群體致死的劑量）和ED50（在量反應中指能引起50%最大反應強度的劑量，在質反應中，指引起50%實驗物件出現陽性反應時的劑量）。可基於由細胞培養分析和動物研究得到的資料得出人用劑量的範圍。

在給予本發明所述的藥物綴合物時，例如，對於雄性或雌性、6-12周齡、體重18-25g的C57BL/6J或C3H/HeNCrlVr小鼠，以所述藥物綴合物中的寡核苷酸的量計：對於功能性寡核苷酸與藥學上可接受的式（101）所示的化合物形成的藥物綴合物，其寡核苷酸用量可以為0.001-100mg/kg體重，在一些實施方式中為0.01-50mg/kg體重，在一些實施方式中為0.05-20mg/kg體重，在一個具體的實施方式中為0.1-10mg/kg體重。在給予本發明所述的藥物綴合物時，可參考上述用量。

另外，通過將本發明的藥物綴合物導入基因異常表達的細胞，還可以通過基因表達調控的機制達到調控細胞中該基因的表達這一目的。在一個一些實施方式中，所述細胞為肝炎細胞，在一些實施方式中為HepG2.2.15細胞。在一些實施方式中，所述細胞可以選自Hep3B、HepG2、Huh7等肝癌細胞系或分離的肝原代細胞，在一些實施方式中為Huh7肝癌細胞。

採用本發明提供的方法抑制基因在細胞中表達，所提供的藥物綴合物中的功能性寡核苷酸的用量是所屬技術領域具有通常知識者根據期望獲得的效果容易確定的。例如，在一些實施方式中，所述藥物綴合物是藥物綴合物，所提供的藥物綴合物中的siRNA用量是這樣的量：其足以減少靶基因的表達，並導致在細胞表面處1pM至1μM、或0.01nM至100nM、或0.05nM至50nM或至約5nM的細胞外濃度。達到該局部濃度所需的量將隨各種因素而變化，所述因素包括遞送方法、遞送部位、在遞送部位和細胞或組織之間的細胞層的數目、遞送是局部還是全身等。在遞送部位處的濃度可以顯著高於在細胞或組織的表面處的濃度。

[試劑盒]

本發明提供了一種試劑盒，所述試劑盒包含如前所述的藥物綴合物。

在本發明的試劑盒的一些實施方式中，可將藥物綴合物保存於一個容器中；可以有或沒有至少另一個容器，用於提供或不提供藥學上可接受的輔料。除了藥物綴合物和任選的藥學上可接受的輔料外，所述試劑盒中還可包含其它成分，如穩定劑或防腐劑等。所述其它成分可包含於所述試劑盒中，但存在於與提供藥物綴合物和任選的藥學上可接受的輔料的容器均不同的容器中。在這些實施方式中，所述試劑盒可包含用於將藥物綴合物與藥學上可接受的輔料(對於有輔料而言)或其它成分進行混合的說明書。

在本發明的試劑盒中，所述藥物綴合物和任選的藥學上可接受的輔料可以任何形式提供，例如液體形式、乾燥形式或凍乾形式。在一些實施方式中，所述藥物綴合物和任選的藥學上可接受的輔料基本上純淨和/或無菌。可任選地在本發明的試劑盒中提供無菌水。

在一些實施方式中，本發明提供的藥物綴合物可在體內具有更高的穩定性、更低的毒性和/或更高的活性。在一些實施方式中，本發明提供的siRNA、siRNA組合物或藥物綴合物在體內顯示出至少20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或95%的靶基因表達抑制率。在一些實施方式中，本發明提供的siRNA、siRNA組合物或藥物綴合物在體內顯示出至少20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或95%的肝內靶基因表達抑制率。在一些實施方式中，本發明提供的siRNA、siRNA組合物或藥物綴合物在體內顯示出至少20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或95%的動物模型中肝內靶基因表達抑制率。在一些實施方式中，本發明提供的siRNA、siRNA組合物或藥物綴合物在體內顯示出至少20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或95%的靶表面抗原表達抑制率。在一些實施方式中，本發明提供的siRNA、組合物或藥物綴合物未顯示出明顯脫靶效應。脫靶效應可以是例如抑制非靶基因的基因正常表達。據認為，如果脫靶基因表達的結合/抑制與在靶基因效果相比低於50%、40%、30%、20%或10%時，該脫靶效應就是不顯著的。

在一些實施方式中，本發明提供的藥物綴合物具有較低的動物水平毒性。

在一些實施方式中，本發明提供的藥物綴合物在人血漿中直至72h時仍未降解，顯示出優異的在人血漿中的穩定性。

在一些實施方式中，本發明提供的藥物綴合物在食蟹猴血漿中直至72h仍未降解，顯示出優異的在猴血漿中的穩定性。

在一些實施方式中，本發明提供的藥物綴合物無論在人源溶酶體裂解液還是在鼠源溶酶體裂解液中，都表現出令人滿意的穩定性，至少能夠維持24小時不降解。

在一些實施方式中，本發明提供的藥物綴合物能夠特異性地在肝臟中顯著富集並保持穩定，具有高度的靶向性。

在一些實施方式中，本發明提供的藥物綴合物在測試時間點不同的多次試驗中，均顯示出了高的小鼠體內靶mRNA抑制活性。

在一些實施方式中，本發明提供的藥物綴合物在不同動物模型中均顯示出持久高效的靶mRNA抑制效率，並呈現出較規律的劑量依賴性。

在一些實施方式中，本發明提供的藥物綴合物在體外具有較高活性的同時，還具有低脫靶效應。

下面通過製備例和實施例來進一步說明本發明，但是本發明並不因此而受任何限制。

實施例

以下通過實施例對本發明進行詳細描述。除非特別說明，以下實施例中所用到的試劑、培養基均為市售商品，所用到的核酸電泳、real-time PCR等操作均按所屬技術領域具有通常知識者熟知的方案進行。例如，可按Molecular Cloning （Cold Spring Harbor LBboratory Press(1989)）所記載的方法進行。

HepG2.2.15細胞購自ATCC，用含有10%的胎牛血清（FBS，Gibco）、2mM L-穀氨醯胺（Gibco）和380μg/ml G418的DMEM完全培養基（Gibco）培養細胞，於37°C在含5% CO₂ /95%空氣的培養箱中培養。

Huh7細胞購自ATCC，用含有10%的胎牛血清（FBS，Gibco）、2mM L-穀氨醯胺（Gibco）和380μg/ml G418的DMEM完全培養基（Gibco）培養細胞，於37^o C在含5% CO2/95%空氣的培養箱中培養。

HBV轉基因小鼠C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J：購自北京大學醫學部實驗動物科學部。於實驗前選擇S/COV＞10的小鼠，以下有時也簡稱為44Bri模型小鼠；

HBV轉基因小鼠：命名為M-Tg HBV，購自上海市公共衛生中心動物部，轉基因小鼠的製備方法如Ren J.等，J. Medical Virology. 2006, 78: 551-560所述，以下有時也簡稱為M-Tg模型；

AAV-HBV轉基因小鼠：按照文獻方法（董小岩等，Chin J Biotech 2010, May 25; 26(5): 679-686）製備AAV-HBV模型小鼠。將rAAV8-1.3HBV，D型（ayw）病毒（購於北京五加和分子醫學研究所有限公司，1×10¹² viral genome （v.g.）/mL，批號2016123011）用無菌PBS稀釋至5×10¹¹ v.g./mL，每隻小鼠注射200 μL稀釋後的rAAV8-1.3HBV，（即每隻小鼠注射1×10¹⁰ v.g.）。病毒注射後第28天，所有小鼠通過眼眶採血（約100 µL）用於收集血清檢測HBsAg和HBV DNA，以下有時也簡稱為AAV-HBV模型小鼠；

低濃度AAV-HBV轉基因小鼠：採用與上述基本相同的造模方法，區別之處在於，病毒在實驗前用無菌PBS稀釋至1×10¹¹ （v.g.）/mL，每隻小鼠注射100 μL病毒，即每隻小鼠注射1×10¹⁰ v.g.，以下有時也簡稱為AAV-HBV低濃度小鼠模型；

HBV轉基因小鼠C57BL/6-HBV：品系名：B6-Tg HBV/Vst (1.28 copy, genotype A)，購自北京維通達生物技術有限公司。於實驗前選擇COI＞10⁴ 的小鼠，以下有時也簡稱為1.28copy模型。

用以下製備例7-製備例8中合成的藥物綴合物轉染細胞時，使用Lipofectamine^TM 2000（Invitrogen）作為轉染試劑，具體操作參照製造商提供的說明書。

若無其它說明，以下提供的試劑比例均按體積比（v/v）計算。

[製備例1 N-6所示的化合物的合成]

本製備例中，按照以下方法，合成了式（N-6）所示的化合物：

（1-1）綴合末端段GAL-5的合成

（1-1a）GAL-2的合成

將20.0g GAL-1（N-乙醯-D-半乳糖胺鹽酸鹽，CAS號：1772-03-8，購自寧波弘翔生化公司，92.8 mmol）溶於200ml無水吡啶，冰水浴下加入108ml乙酸酐（購自Enox公司，1113mmol），室溫攪拌反應24小時。將反應液倒入2L冰水中，減壓抽濾，濾餅用500ml冰水洗滌後，加乙腈/甲苯混合溶劑（體積比乙腈:甲苯=1:1）至完全溶解，蒸乾溶劑，得到白色固體產品GAL-2 30.6g。¹ H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 5.72 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.40 (m, 2H), 5.11 (dd, J = 11.3, 3.3 Hz, 1H), 4.47 (q, J = 10.7, 10.0 Hz, 1H), 4.24 – 4.10 (m, 2H), 4.04 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 2.20 (s, 3H), 2.16 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 1.97 (s, 3H).

（1-1b）GAL-3的合成

將步驟（1-1a）中獲得的GAL-2（11.5g，29.5mmol）溶解於70ml無水1,2-二氯乙烷中，在冰水浴且氮氣保護條件下，加入6.4ml 三氟甲基磺酸三甲基矽酯（TMSOTf，CAS號：27607-77-8，購自麥克林公司，35.5mmol），室溫反應過夜。

在反應液中加入100ml飽和碳酸氫鈉水溶液，攪拌10分鐘，分出有機相，水相用二氯乙烷萃取兩次，每次100ml，合併有機相，分別用100ml飽和碳酸氫鈉水溶液和100ml飽和食鹽水洗滌，分出有機相，無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸乾溶劑，得到淺黃色黏稠糖稀狀產品GAL-3 10.2g。¹ H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 5.99 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 5.46 (t, J = 3.0 Hz, 1H), 4.90 (dd, J = 7.5, 3.3 Hz, 1H), 4.30 – 4.15 (m, 2H), 4.10 (m, 1H), 4.02 – 3.94 (m, 1H), 2.12 (s, 3H), 2.07 (d, J = 0.9 Hz, 6H), 2.05 (d, J = 1.2 Hz, 3H).

（1-1c）GAL-4的合成

將步驟（1-1b）中獲得的GAL-3（9.5g，28.8mmol）溶於50ml無水1,2-二氯乙烷中，加入乾燥的4Å分子篩粉末10g，再加入3.2g 5-己烯-1-醇（CAS號：821-41-0，購自Adamas-beta公司，31.7mmol），室溫下攪拌30分鐘，冰浴和氮氣保護下加入2.9ml TMSOTf（14.4mmol），室溫下攪拌反應過夜。過濾除去4 Å分子篩粉末，濾液中加入100ml飽和碳酸氫鈉水溶液攪拌10分鐘，分出有機相，水相用100ml二氯乙烷萃取一次，合併有機相並分別用100ml飽和碳酸氫鈉水溶液和100ml飽和食鹽水洗滌，分出有機相，無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸乾溶劑，得到黃色糖稀狀產品GAL-4 13.3g，不進行純化直接進行下一步氧化反應。

（1-1d）GAL-5的合成

將按照步驟（1-1c）中描述的方法得到的GAL-4（17.5g，40.7mmol，由兩批次產物合併而得）溶於80ml二氯甲烷和80ml乙腈的混合溶劑中，分別加入130ml去離子水和34.8g高碘酸鈉（CAS號：7790-28-5，購自阿拉丁公司，163mmol），冰水浴下攪拌10分鐘，加入三氯化釕（CAS號：14898-67-0，購自安耐吉公司，278mg，1.34mmol），控制體系溫度不超過30^o C，室溫反應過夜。反應液加入300ml水稀釋攪拌，加飽和碳酸氫鈉調pH約為7.5，分出並棄去有機相，水相用二氯甲烷萃取三次，每次200ml，棄去有機相。水相用檸檬酸固體調節pH約為3，用二氯甲烷萃取三次，每次200ml，合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸乾溶劑，得到白色泡沫狀固體產品GAL-5 6.5g。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.01 (s, 1H), 7.82 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.21 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 4.95 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz, 1H), 4.48 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.02 (s, 3H), 3.87 (dt, J = 11.3, 8.9 Hz, 1H), 3.75 – 3.66 (m, 1H), 3.46 – 3.36 (m, 1H), 2.19 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.10 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.89 (s, 3H), 1.77 (s, 3H), 1.55 – 1.43 (m, 4H).

以下，使用按照上述方法得到的GAL-5化合物，通過以下製程路線合成了式（N-6）所示的化合物：

（1-2）N-1的合成

將呱嗪-2-羧酸（33.2g，163.3mmol，購自阿法埃莎（中國）化學有限公司，CAS號：2762-32-5）溶於200ml二氧六環和50ml 10%碳酸鈉水溶液中，冰水浴下加入用50ml二氧六環溶解的芴甲氧羰醯氯（100.0g，391.9mmol），室溫攪拌反應24小時。將反應液倒入水中，減壓抽濾，濾餅用酸性水溶液酸化後用二氯甲烷提取一次。有機相用飽和食鹽水水洗一次後乾燥並蒸發溶劑至乾。柱層析（200~300目正相矽膠，石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷=1:1:1混合液沖提）純化收集目標產物濃縮，用二氯甲烷溶解後用酸性水溶液水洗至水相pH=5，再用飽和食鹽水水洗一次後乾燥並蒸發溶劑至乾（水相pH=6）。得產品N-1計83.0g。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.85 – 7.72 (m, 6H), 7.60 – 7.39 (m, 10H), 5.09 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 4.70 (d, J = 5.7 Hz, 4H), 4.23 (td, J = 12.1, 11.5, 6.3 Hz, 3H), 4.16 – 4.04 (m, 1H), 4.04 – 3.95 (m, 1H), 3.82 (dd, J = 12.4, 7.0 Hz, 1H), 3.58 (dt, J = 12.0, 6.8 Hz, 1H), 3.48 (dt, J = 12.1, 6.8 Hz, 1H). MS m/z：C₃₅ H₂₉ N₂ O₆ ，[M-H]-，理論：573.20，實測：573.32。

（1-3）N-2的合成

將步驟（1-2）得到的N-1（13.9g，24.28mmol），3-氨基-1,2-丙二醇（2.5g，27.4mmol）和2-乙氧基-1-乙氧碳醯基-1,2-二氫喹啉（7.3g，29.6mmol）加入到120ml乙醇中，室溫攪拌反應5分鐘。再轉油浴60oC攪拌反應18小時。蒸發溶劑至乾，柱層析（200~300目正相矽膠，石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇=1:1:1:0.05-1:1:1:0.15梯度沖提）純化收集目標產物濃縮，得到產品N-2 9.4g。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.15 (s, 2H), 7.87 – 7.76 (m, 7H), 7.75 (dd, J = 7.5, 1.6 Hz, 3H), 7.66 (ddd, J = 24.6, 7.4, 1.7 Hz, 4H), 7.59 (d, J = 1.8 Hz, 0H), 7.55 (tdd, J = 7.5, 5.4, 1.6 Hz, 10H), 7.46 (dddd, J = 9.2, 7.6, 4.8, 2.0 Hz, 8H), 5.35 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 5.16 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 5.07 (d, J = 5.0 Hz, 2H), 4.70 (dd, J = 3.7, 1.9 Hz, 8H), 4.46 (t, J = 1.9 Hz, 2H), 4.26 – 4.14 (m, 4H), 3.95 (dt, J = 12.3, 7.0 Hz, 2H), 3.84 – 3.61 (m, 6H), 3.53 (dd, J = 12.4, 7.0 Hz, 2H), 3.47 – 3.20 (m, 10H). MS m/z：C₃₈ H₃₈ N₃ O₇ ，[M+H]+，理論：648.27，實測：648.35。

（1-4）N-3的合成

將步驟（1-3）得到的N-2（8.27g，12.8mmol）用60ml無水吡啶溶解，再加入4,4'-雙甲氧基三苯甲基氯（5.2g，15.4mmol）室溫下攪拌反應18小時。加50ml甲醇淬滅，蒸發溶劑至乾。柱層析（200~300目正相矽膠，石油醚:乙酸乙酯=1:1混合液沖提）純化收集目標產物濃縮，得到產物N-3 12.7g。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.95 (dd, J = 7.3, 1.6 Hz, 1H), 7.87 – 7.71 (m, 5H), 7.67 – 7.41 (m, 12H), 7.36 – 7.25 (m, 7H), 6.89 – 6.81 (m, 4H), 5.16 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 4.70 (dd, J = 5.1, 1.1 Hz, 4H), 4.41 (pd, J = 7.0, 5.0 Hz, 1H), 4.27 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 4.13 – 3.93 (m, 3H), 3.89 – 3.72 (m, 2H), 3.79 (s, 7H), 3.67 – 3.36 (m, 6H), 3.21 (dd, J = 12.4, 7.0 Hz, 1H). MS m/z：C₅₉ H₅₆ N₃ O₉ ，[M+H]+，理論：950.40，實測：950.32。

（1-5）N-4的合成

用70ml二甲基甲醯胺溶解步驟（1-4）得到的N-3（12.7g，13.4mmol）後加入呱啶（34.2g，401.5mmol），向反應液中加入500ml水稀釋攪拌，乙酸乙酯提取三次，合併有機相，飽和食鹽水水洗一次後乾燥並蒸發溶劑至乾。柱層析（200~300目正相矽膠，乙酸乙酯:甲醇=1:1-1:10梯度沖提）純化收集目標產物濃縮，得目標產物N-4 5.77g。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.15 (s, 1H), 7.50 – 7.42 (m, 2H), 7.36 – 7.25 (m, 7H), 6.89 – 6.81 (m, 4H), 4.68 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.41 (pd, J = 7.0, 5.0 Hz, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.62 (ddd, J = 10.1, 7.0, 2.8 Hz, 2H), 3.50 (dd, J = 12.3, 7.0 Hz, 1H), 3.28 (dd, J = 12.4, 7.0 Hz, 1H), 3.06 (dd, J = 12.4, 7.0 Hz, 1H), 2.92 – 2.81 (m, 2H), 2.85 – 2.74 (m, 2H), 2.78 – 2.68 (m, 2H), 2.09 (s, 1H), 1.83 (s, 1H). MS m/z：C₂₉ H₃₆ N₃ O₅ ，[M+H]+，理論：506.27，實測：506.35。

（1-6）N-5的合成

向10ml二氯甲烷中加入GAL-5（1.074g，2.4mmol）、3-二乙氧基磷醯氧基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮（0.897g，3.0mmol）、二異丙基乙胺（0.775g，6.0mmol），室溫反應1小時。再加入N-4（0.505g，1.0mmol）25oC攪拌反應18小時。蒸發溶劑至乾，柱層析（200~300目正相矽膠，石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇=1:1:1:0.05~1:1:1:0.2梯度沖提）純化收集目標產物濃縮，得目標產物N-5 1.2g。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.15 (s, 1H), 7.85 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.46 (s, 3H), 7.50 – 7.41 (m, 1H), 7.36 – 7.25 (m, 7H), 6.89 – 6.81 (m, 4H), 6.05 – 5.94 (m, 4H), 5.16 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 4.98 (dt, J = 9.4, 6.8 Hz, 2H), 4.65 – 4.34 (m, 7H), 4.02 – 3.88 (m, 3H), 3.79 (s, 6H), 3.75 – 3.31 (m, 7H), 3.22 – 2.92 (m, 5H), 2.13 – 1.87 (m, 28H), 1.63 – 1.51 (m, 2H), 1.55 – 1.39 (m, 2H). MS m/z：C₆₇ H₉₀ N₅ O₂₅ ，[M+H]+，理論：1364.59，實測：1364.52。

（1-7）N-6的合成

在氬氣保護條件下向10ml無水二氯甲烷中加入按照步驟（1-6）合成的N-5（1.365g，1.0mmol，由兩批次產物合併而得）、三氟乙酸吡啶鹽（0.232g，1.2mmol）、N-甲基咪唑（0.099g，1.2mmol），雙(二異丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦（0.452g，1.5mmol，購自ACROS試劑，CAS號：102691-36-1），室溫攪拌反應5小時。蒸發溶劑至乾，柱層析（200~300目正相矽膠，石油醚:乙酸乙酯=2:1-1:2梯度沖提）純化收集目標產物濃縮，得目標產物N-6 1.346g。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.46 (s, 1H), 7.36 – 7.25 (m, 3H), 6.88 – 6.82 (m, 2H), 6.05 – 5.94 (m, 1H), 5.20 – 4.98 (m, 2H), 4.49 – 3.91 (m, 5H), 3.79 (s, 3H), 3.94 – 3.67 (m, 2H), 3.67 – 3.27 (m, 3H), 3.26 – 2.88 (m, 2H), 2.91 – 2.75 (m, 1H), 2.29 – 2.16 (m, 1H), 2.15 – 1.95 (m, 11H), 1.76 – 1.49 (m, 1H), 1.36 – 1.11 (m, 1H), 1.11 – 0.99 (m, 4H), 0.61 (d, J = 6.9 Hz, 1H). 31P NMR (161 MHz, DMSO-d6) δ 149.23-148.06. MS m/z：C₇₆ H₁₀₇ N₇ O₂₆ P，[M+H]+，理論：1564.70，實測：1564.62。所得到的式（N-6）化合物具有符合式（403）所示的結構。

[製備例2式（X-2）所示的化合物的合成]

本製備例中，按照以下方法，合成了式（X-2）所示的化合物：

（2-1）GAL-C7-2的合成

（2-1a）GAL-C7-1的合成

將GAL-3（9.5g，28.8mmol）溶於50ml無水1，2-二氯乙烷中，加入活化的4 Å分子篩粉末10g，再加入7-辛烯-1-醇（4.1g，31.7mmol），室溫下攪拌反應30分鐘，在冰浴和氮氣保護下加入三氟甲基磺酸三甲基矽酯（TMSOTf，2.9ml，14.4mmol），在室溫下攪拌反應16小時。通過矽藻土過濾除掉4 Å分子篩粉末，在濾液中加入100ml飽和碳酸氫鈉水溶液攪拌反應10分鐘，分出有機相，水相用100ml二氯乙烷萃取一次，合併有機相並分別用飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和食鹽水洗滌一次，分出有機相，用無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸出溶劑並用油泵抽乾得到GAL-C7-1 13.1g，不進行純化直接進行下一步氧化反應。

（2-1b）GAL-C7-2合成

將按照步驟（2-1a）合成的GAL-C7-1（18.6g，40.7mmol，由兩批次產物合併而得）溶於80ml二氯甲烷和80ml乙腈的混合溶劑中，分別加入130ml水和高碘酸鈉固體（34.8g，163mmol），冰水浴下攪拌反應10分鐘，再加入催化劑三氯化釕（278mg，1.34mmol），室溫下攪拌反應16小時。向反應液中加入300ml水，再加入飽和碳酸氫鈉調節pH為7.5，分掉有機相，水相再用二氯甲烷萃取三次，棄去有機相，水相用檸檬酸固體調節pH為3，用200ml二氯甲烷萃取三次，合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸出溶劑後柱層析（200~300目正相矽膠，二氯甲烷:甲醇=10:1-3:1梯度沖提）純化得到產品GAL-C7-2 14.2g。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.46 (s, 1H), 6.05 – 5.94 (m, 2H), 5.18 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 4.52 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 4.30 (dd, J = 12.4, 7.0 Hz, 1H), 3.98 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 3.85 (dd, J = 12.4, 6.9 Hz, 1H), 3.35 – 3.23 (m, 1H), 2.88 (td, J = 12.3, 3.1 Hz, 1H), 2.69 – 2.58 (m, 1H), 2.30 – 2.14 (m, 2H), 2.13 – 1.95 (m, 13H), 1.80 (dddt, J = 13.7, 12.5, 9.5, 1.2 Hz, 1H), 1.52 (dt, J = 12.2, 9.2 Hz, 1H), 1.41 – 1.24 (m, 1H), 1.28 – 1.14 (m, 1H). MS m/z：C₂₁ H₃₂ NO₁₁ ，[M-H]-，理論：474.20，實測：474.31。

（2-2）X-1的合成

向10ml二氯甲烷中加入GAL-C7-2（1.141g，2.4mmol）、3-二乙氧基磷醯氧基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮（0.897g，3.0mmol）、二異丙基乙胺（0.775g，6.0mmol），室溫下反應1小時。再加入N-4（0.505g，1.0mmol）在25^o C攪拌反應18小時。蒸發溶劑至乾，柱層析（200~300目正相矽膠，石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇=1:1:1:0.05-1:1:1:0.2梯度沖提）純化收集目標產物濃縮，得目標產物X-1 1.196g。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.15 (s, 1H), 7.46 (s, 3H), 7.35 – 7.29 (m, 4H), 7.33 – 7.20 (m, 4H), 6.89 – 6.82 (m, 4H), 6.05 – 5.94 (m, 4H), 5.12 (dt, J = 31.6, 7.0 Hz, 2H), 4.58 – 4.27 (m, 7H), 4.18 – 3.99 (m, 2H), 4.01 – 3.88 (m, 2H), 3.79 (s, 6H), 3.81 – 3.64 (m, 2H), 3.59 – 3.30 (m, 4H), 3.19 – 3.00 (m, 2H), 2.96 – 2.81 (m, 2H), 2.09 – 1.92 (m, 24H), 1.62 – 1.16 (m, 8H), 1.18 – 0.99 (m, 2H), 1.03 – 0.87 (m, 2H). MS m/z：C₇₁ H₉₈ N₅ O₂₅ ，[M+H]+，理論：1420.66，實測：1420.74。

（2-3）X-2的合成

在氬氣保護條件下向10ml無水二氯甲烷中加入按照步驟（2-2）合成的X-1（1.421g，1.0mmol，由兩批次產物合併而得）、三氟乙酸吡啶鹽（0.232g，1.2mmol）、N-甲基咪唑（0.099g，1.2mmol），雙(二異丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦（0.452g，1.5mmol），室溫攪拌反應5小時。蒸發溶劑至乾，柱層析（200~300目正相矽膠，石油醚:乙酸乙酯=2:1-1:2梯度沖提）純化收集目標產物濃縮，得目標產物X-2 1.446g。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.46 (s, 1H), 7.36 – 7.25 (m, 3H), 6.89 – 6.82 (m, 2H), 6.05 – 5.94 (m, 1H), 5.12 (dt, J = 30.4, 7.0 Hz, 1H), 4.77 (dq, J = 27.5, 7.0 Hz, 1H), 4.52 – 4.35 (m, 1H), 4.35 – 4.15 (m, 1H), 3.96 – 3.78 (m, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.74 – 3.56 (m, 2H), 3.55 – 3.03 (m, 3H), 2.90 – 2.75 (m, 1H), 2.74 – 2.34 (m, 2H), 2.23 – 1.95 (m, 11H), 1.85 – 1.17 (m, 4H), 1.11 – 0.90 (m, 6H), 0.66 – 0.45 (m, 1H). 31P NMR (161 MHz, DMSO-d6) δ 148.83-147.65. MS m/z：C₈₀ H₁₁₅ N₇ O₂₆ P，[M+H]+，理論：1620.76，實測：1620.82。所得到的式（X-2）化合物具有符合式（404）所示的結構。

[製備例3式（W-2）所示的化合物的製備]

本製備例中，按照以下方法，合成了式（W-2）所示的化合物：

（3-1）GAL5-C2-2的合成

（3-1a）GAL-C2-1的合成

向40ml N,N-二甲基甲醯胺中加入GAL-5（4.5g，10.0mmol）、甘氨酸叔丁酯鹽酸鹽（2.0g，12.0mmol）、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽（5.7g，15.0mmol）、二異丙基乙胺（3.9g，30.0mmol），室溫攪拌反應4小時。向反應液中加入100ml飽和碳酸氫鈉水溶液，用100ml乙酸乙酯萃取3次，合併有機相，用100ml飽和食鹽水洗滌一次，分出有機相，無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸出溶劑並用油泵抽乾得到10.1g GAL-C2-1粗品直接進行下一步反應。

（3-1b）GAL-C2-2的合成

將GAL-C2-1粗品（10.1g，10mmol）溶於60ml甲酸中，室溫攪拌反應16小時。蒸發溶劑至乾，柱層析（200~300目正相矽膠，二氯甲烷:甲醇=10:1-3:1梯度沖提）純化收集目標產物濃縮，得目標產物GAL-C2-2 5.0g。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.49 (s, 1H), 7.46 (s, 1H), 6.05 – 5.94 (m, 2H), 5.01 – 4.90 (m, 1H), 4.52 – 4.33 (m, 3H), 3.79 – 3.61 (m, 3H), 3.14 (td, J = 12.2, 3.2 Hz, 1H), 2.68 (td, J = 12.2, 3.3 Hz, 1H), 2.27 (td, J = 12.6, 2.8 Hz, 1H), 2.15 (td, J = 12.6, 2.9 Hz, 1H), 2.07 – 1.95 (m, 12H), 1.82 (qt, J = 12.9, 2.8 Hz, 1H), 1.54 (qt, J = 12.6, 2.6 Hz, 1H), 1.15 – 0.99 (m, 1H), 0.97 – 0.81 (m, 1H). MS m/z：C₂₁ H₃₁ N₂ O₁₂ ，[M-H]-，理論：503.19，實測：503.26。

（3-2）W-1的合成

向10ml二氯甲烷中加入GAL5-C2-2（1.211g，2.4mmol）、3 -二乙氧基磷醯氧基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮（0.897g，3.0mmol）、二異丙基乙胺（0.775g，6.0mmol），室溫下反應1小時。再加入N-4（0.505g，1.0mmol）25^o C攪拌反應18小時。蒸發溶劑至乾，柱層析（200~300目正相矽膠，石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇=1:1:1:0.1-1:1:1:0.4梯度沖提）純化收集目標產物濃縮，得目標產物W-1 1.291g。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.49 (s, 1H), 7.46 (s, 2H), 7.36 – 7.25 (m, 4H), 6.88 – 6.82 (m, 2H), 6.05 – 5.94 (m, 1H), 5.60 – 5.38 (m, 2H), 5.14 (dt, J = 13.7, 6.9 Hz, 1H), 4.83 – 4.67 (m, 1H), 4.53 – 4.09 (m, 4H), 3.79 (s, 3H), 3.75 – 3.24 (m, 6H), 3.22 – 3.09 (m, 1H), 3.09 – 2.76 (m, 2H), 2.28 – 2.07 (m, 2H), 2.09 – 1.95 (m, 13H), 1.80 – 1.44 (m, 2H), 1.43 – 1.31 (m, 1H). MS m/z：C₇₁ H₉₆ N₇ O₂₇ ，[M+H]+，理論：1478.64，實測：1478.56。

（3-3）W-2的合成

在氬氣保護條件下向10ml無水二氯甲烷中加入按照步驟（3-2）合成的W-1（1.479g，1.0mmol，由兩批次產物合併而得）、三氟乙酸吡啶鹽（0.232g，1.2mmol）、N-甲基咪唑（0.099g，1.2mmol），雙(二異丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦（0.452g，1.5mmol），室溫下攪拌反應5小時。蒸發溶劑至乾，柱層析（200~300目正相矽膠，石油醚:乙酸乙酯=3:1-1:3梯度沖提）純化收集目標產物濃縮，得目標產物W-2 1.534g。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.49 (s, 1H), 7.46 (s, 1H), 7.36 – 7.25 (m, 3H), 6.89 – 6.82 (m, 2H), 6.05 – 5.94 (m, 1H), 5.20 – 5.05 (m, 1H), 4.81 – 4.57 (m, 2H), 4.47 – 4.24 (m, 2H), 4.05 – 3.66 (m, 4H), 3.79 (s, 3H), 3.67 – 3.45 (m, 2H), 3.40 – 3.26 (m, 1H), 3.16 – 2.93 (m, 2H), 2.92 – 2.66 (m, 3H), 2.39 – 2.22 (m, 1H), 2.10 – 1.93 (m, 11H), 1.77 – 1.53 (m, 1H), 1.56 – 1.32 (m, 1H), 1.09 – 1.01 (m, 4H), 0.97 (d, J = 6.7 Hz, 1H). 31P NMR (161 MHz, DMSO-d6) δ 149.15-147.72. MS m/z：C₈₀ H₁₁₃ N₉ O₂₈ P，[M+H]+，理論：1678.74，實測：1678.66。所得到的式（W-2）化合物具有符合式（405）所示的結構。

[製備例4 式（V-2）所示的化合物的製備]

本製備例中，按照以下方法，合成了式（V-2）所示的化合物：

（4-1）GAL5-C4-2的合成

（4-1a）GAL-C4-1的合成

向40ml N,N-二甲基甲醯胺中加入GAL-5（4.5g，10.0mmol）、4-氨基酸叔丁酯鹽酸鹽（1.9g，12.0mmol）、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽（5.7g，15.0mmol）、二異丙基乙胺（3.9g，30.0mmol），溶解均一後室溫攪拌4小時反應完全。反應液中緩慢加入100ml飽和碳酸氫鈉水溶液，100ml×3乙酸乙酯萃取，合併有機相，100ml飽和食鹽水洗滌一次，分出有機相，無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸出溶劑並用油泵抽乾得到10.3g GAL-C4-1粗品直接進行下一步反應。

（4-1b）GAL-C4-2合成

將GAL-C4-1粗品（10.3g，10mmol）溶於60ml甲酸中，室溫攪拌反應16小時。蒸發溶劑至乾，柱層析（200~300目正相矽膠，二氯甲烷:甲醇=10:1-2:1梯度沖提）純化收集目標產物濃縮，得目標產物5.1g。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.89 (s, 1H), 7.46 (s, 1H), 6.05 – 5.94 (m, 2H), 5.25 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 4.53 – 4.35 (m, 2H), 4.14 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 3.81 (dd, J = 12.1, 6.8 Hz, 1H), 3.46 (td, J = 12.1, 3.3 Hz, 1H), 3.30 (td, J = 12.4, 3.0 Hz, 1H), 3.01 (td, J = 12.1, 2.8 Hz, 1H), 2.75 (td, J = 12.4, 3.0 Hz, 1H), 2.45 – 2.08 (m, 6H), 2.07 – 1.95 (m, 12H), 1.81 – 1.49 (m, 3H), 1.35 – 1.20 (m, 1H). MS m/z：C₂₃ H₃₅ N₂ O₁₂ ，[M-H]-，理論：531.22，實測：531.15。

（4-2）V-1的合成

向10ml二氯甲烷中加入GAL5-C4-2（1.278g，2.4mmol）、3 -二乙氧基磷醯氧基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮（0.897g，3.0mmol）、二異丙基乙胺（0.775g，6.0mmol），室溫下反應1小時。再加入N-4（0.505g，1.0mmol），在25^o C攪拌反應18小時。蒸發溶劑至乾，柱層析（200~300目正相矽膠，石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇=1:1:1:0.1-1:1:1:0.5梯度沖提）純化收集目標產物濃縮，得目標產物V-1 1.315g。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.83 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.46 (s, 3H), 7.50 – 7.41 (m, 1H), 7.36 – 7.25 (m, 7H), 6.89 – 6.81 (m, 4H), 6.08 – 5.94 (m, 3H), 5.60 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 5.18 (dt, J = 19.2, 7.0 Hz, 2H), 4.64 – 4.47 (m, 2H), 4.46 – 4.27 (m, 2H), 4.29 – 4.07 (m, 4H), 3.98 – 3.73 (m, 3H), 3.79 (s, 6H), 3.67 – 3.50 (m, 2H), 3.54 – 3.45 (m, 2H), 3.37 (ddd, J = 25.2, 12.5, 7.0 Hz, 2H), 3.32 – 3.15 (m, 2H), 3.20 – 3.11 (m, 2H), 3.03 – 2.83 (m, 3H), 2.80 – 2.48 (m, 5H), 2.42 – 2.25 (m, 3H), 2.15 – 1.89 (m, 28H), 1.86 – 1.68 (m, 2H), 1.70 – 1.48 (m, 2H). MS m/z：C₇₅ H₁₀₄ N₇ O₂₇ ，[M+H]+，理論：1534.70，實測：1534.63。

（4-3）V-2的合成

在氬氣保護條件下向10ml無水二氯甲烷中加入按照步驟（4-2）合成的多批產物合併得到的V-1（1.535g，1.0mmol）、三氟乙酸吡啶鹽（0.232g，1.2mmol）、N-甲基咪唑（0.099g，1.2mmol），雙(二異丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦（0.452g，1.5mmol），室溫攪拌反應5小時。蒸發溶劑至乾，柱層析（200~300目正相矽膠，石油醚:乙酸乙酯=2:1-1:3梯度沖提）純化收集目標產物濃縮，得目標產物1.490g。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.15 (s, 0H), 8.07 (s, 0H), 7.86 (s, 0H), 7.46 (s, 0H), 7.50 – 7.41 (m, 0H), 7.36 – 7.25 (m, 0H), 6.89 – 6.81 (m, 0H), 5.55 (dd, J = 22.4, 7.0 Hz, 0H), 4.49 – 4.35 (m, 0H), 4.31 – 4.19 (m, 0H), 4.23 – 4.09 (m, 0H), 4.13 – 3.99 (m, 0H), 4.01 – 3.88 (m, 0H), 3.79 (s, 0H), 3.82 – 3.21 (m, 1H), 3.10 (ddd, J = 12.5, 6.1, 3.2 Hz, 0H), 2.98 – 2.75 (m, 0H), 2.74 – 2.52 (m, 0H), 2.54 – 2.38 (m, 0H), 2.41 – 2.25 (m, 0H), 2.29 – 2.21 (m, 0H), 2.20 – 1.93 (m, 1H), 1.83 – 1.66 (m, 0H), 1.70 – 1.50 (m, 0H), 1.39 – 1.21 (m, 0H), 1.18 – 1.02 (m, 0H), 0.95 – 0.79 (m, 0H), 0.70 (d, J = 6.8 Hz, 0H).³¹ P NMR (161 MHz, DMSO-d6) δ 148.79-147.75. MS m/z：C₈₄ H₁₂₁ N₉ O₂₈ P，[M+H]+，理論：1734.81，實測：1734.89。所得到的式（V-2）化合物具有符合式（406）所示的結構。

[製備例5式（O-2）所示的化合物的合成]

本製備例中，按照以下方法，合成了式（O-2）所示的化合物：

（5-1）GAL5-C6-2的合成

（5-1a）GAL-C6-1的合成

向40ml N,N-二甲基甲醯胺中加入GAL-5（4.5g，10.0mmol）、6-氨基己酸叔丁酯鹽酸鹽（2.2g，12.0mmol）、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽（5.7g，15.0mmol）、二異丙基乙胺（3.9g，30.0mmol），室溫攪拌反應4小時。向反應液中加入100ml飽和碳酸氫鈉水溶液，用100ml乙酸乙酯萃取3次，合併有機相，100ml飽和食鹽水洗滌一次，分出有機相，無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸出溶劑並用油泵抽乾得到10.5g GAL-C6-1粗品直接進行下一步反應。

（5-1b）GAL-C6-2的合成

將GAL-C6-1粗品（10.5g，10mmol）溶於60ml甲酸中，室溫攪拌反應16小時。蒸發溶劑至乾，柱層析（200~300目正相矽膠，二氯甲烷:甲醇=10:1-3:1梯度沖提）純化收集目標產物濃縮，得目標產物5.2g。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.87 (s, 0H), 7.46 (s, 0H), 6.05 – 5.94 (m, 0H), 5.17 (t, J = 7.0 Hz, 0H), 4.54 (dd, J = 12.4, 6.9 Hz, 0H), 4.33 (q, J = 7.0 Hz, 0H), 3.88 (t, J = 7.0 Hz, 0H), 3.75 – 3.58 (m, 0H), 3.38 (td, J = 12.3, 2.1 Hz, 0H), 3.17 – 3.07 (m, 0H), 2.57 – 2.46 (m, 0H), 2.50 – 2.35 (m, 0H), 2.28 (ddd, J = 12.3, 4.5, 2.1 Hz, 0H), 2.27 – 2.08 (m, 0H), 2.09 – 1.90 (m, 1H), 1.76 – 1.63 (m, 0H), 1.62 – 1.37 (m, 0H), 1.05 – 0.92 (m, 0H). MS m/z：C₂₅ H₃₉ N₂ O₁₂ ，[M-H]-，理論：559.25，實測：559.32。

（5-2）O-1的合成

向10ml二氯甲烷中加入GAL5-C6-2（1.345g，2.4mmol）、3 -二乙氧基磷醯氧基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮（0.897g，3.0mmol）、二異丙基乙胺（0.775g，6.0mmol），室溫反應1小時。再加入N-4（0.505g，1.0mmol），在25^o C攪拌反應18小時。蒸發溶劑至乾，柱層析（200~300目正相矽膠，石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇=1:1:1:0.1-1:1:1:0.3梯度沖提）純化收集目標產物濃縮，得目標產物1.298g。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.46 (s, 3H), 7.50 – 7.41 (m, 1H), 7.36 – 7.25 (m, 7H), 6.89 – 6.81 (m, 4H), 6.05 – 5.94 (m, 2H), 5.39 – 5.28 (m, 2H), 5.16 (td, J = 7.0, 2.9 Hz, 2H), 4.57 (ddd, J = 32.7, 12.3, 6.9 Hz, 2H), 4.46 – 4.25 (m, 2H), 4.29 – 4.16 (m, 2H), 4.10 – 3.83 (m, 3H), 3.82 – 3.66 (m, 8H), 3.71 – 3.57 (m, 2H), 3.55 – 3.34 (m, 3H), 3.33 – 2.80 (m, 13H), 2.28 – 2.07 (m, 4H), 2.03 (d, J = 12.0 Hz, 19H), 1.97 (s, 6H), 1.98 – 1.72 (m, 3H), 1.73 – 1.57 (m, 1H), 1.44 – 0.84 (m, 8H). MS m/z：C₇₉ H₁₁₂ N₇ O₂₇ ，[M+H]+，理論：1590.76，實測：1590.83。

（5-3）O-2的合成

在氬氣保護條件下向10ml無水二氯甲烷中加入按照步驟（5-2）合成的O-1（1.591g，1.0mmol，由兩批次產物合併而得）、三氟乙酸吡啶鹽（0.232g，1.2mmol）、N-甲基咪唑（0.099g，1.2mmol），雙(二異丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦（0.452g，1.5mmol），室溫攪拌反應5小時。蒸發溶劑至乾，柱層析（200~300目正相矽膠，石油醚:乙酸乙酯=2:1-1:2梯度沖提）純化收集目標產物濃縮，得目標產物1.501g。¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.70 (s, 1H), 7.46 (s, 1H), 7.36 – 7.25 (m, 3H), 6.89 – 6.81 (m, 2H), 6.05 – 5.94 (m, 2H), 4.53 – 4.35 (m, 3H), 4.18 (ddd, J = 12.0, 9.2, 7.0 Hz, 1H), 3.97 – 3.78 (m, 2H), 3.79 (s, 3H), 3.67 – 3.45 (m, 1H), 3.45 – 3.22 (m, 2H), 3.15 (dt, J = 12.3, 7.1 Hz, 1H), 3.00 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.83 (hept, J = 6.8 Hz, 1H), 2.27 (td, J = 7.1, 3.1 Hz, 1H), 2.17 – 2.09 (m, 2H), 2.14 – 1.95 (m, 12H), 1.63 – 1.45 (m, 5H), 1.34 (dtd, J = 9.0, 7.0, 2.4 Hz, 4H), 1.05 (dd, J = 20.0, 6.8 Hz, 5H).³¹ P NMR (161 MHz, DMSO-d6) δ 148.66-147.93. MS m/z：C₈₈ H₁₂₉ N₉ O₂₈ P，[M+H]+，理論：1790.87，實測：1790.81。所合成的式（O-2）化合物具有符合式（407）所示的結構。

[製備例6 連接至固相載體的式（101）所示的化合物的製備]

本製備例中，以式（N-6）、（W-2）、（V-2）、（X-2）、（O-2）所示的化合物出發，按照以下方法製備了連接至固相載體的的化合物。

（6-1）連接至固相載體的N-6₂ 化合物的合成

此步驟中，通過將兩個式（N-6）所示的化合物依次連接至固相載體，製備了N-6₂ 化合物。

由通用固相載體（NittoPhase®HL UnyLinker™ 300 Oligonucleotide Synthesis Support，Kinovate Life Sciences公司，結構如式（B80）所示，載量300μmol/g）起始，脫除固相載體上的保護基團，在偶聯反應條件和偶聯試劑存在下，將製備例1獲得的式（N-6）所示的化合物與該固相載體接觸，隨後，進行蓋帽反應，再進行氧化反應。隨後，對得到的產物進行脫保護，隨後與式（N-6）所示的化合物再接觸一次，進行蓋帽反應，並進行氧化反應，得到兩個式（N-6）所示的化合物依次連接至固相載體的化合物，即，連接至固相載體的N-6₂ 化合物。該化合物具有式（503）所示的結構。

（6-2）連接至固相載體的化合物的合成

採用與（6-1）相同的方法製備了本發明的連接至固相載體的化合物，不同之處在於，分別以兩個式（W-2）、（V-2）、（X-2）或（O-2）所示的化合物代替（6-1）中的式（N-6）所示的化合物依次連接至固相載體。所得到的連接至固相載體的X-2₂ 化合物、連接至固相載體的W-2₂ 化合物、連接至固相載體的V-2₂ 化合物、連接至固相載體的O-2₂ 化合物依次具有式（504）、（505）、（506）或（507）所示的結構。

（6-3）連接至固相載體的化合物的合成

採用與（6-1）相同的方法製備了連接至固相載體的化合物，不同的是：由通用固相載體起始，僅進行一次與式（N-6）所示的化合物的接觸，隨後進行蓋帽反應和氧化反應，得到僅有一個式（N-6）所示的化合物連接至固相載體的N-6₁ 化合物；或者，脫除連接至固相載體的N-6₂ 化合物上的羥基保護基團，隨後再接觸一次式（N-6）所示的化合物，隨後進行蓋帽和氧化反應，得到三個式（N-6）所示的化合物依次連接至固相載體的N-6₃ 化合物。上述連接至固相載體的N-6₁ 化合物和連接至固相載體的N-6₃ 化合物依次具有式（508）或（509）所示的結構。

[製備例7 N6-siHBa1綴合物（綴合物13）的合成]

本製備例中，以上述製備的連接至固相載體的N-6₂ 化合物出發，按照以下方法製備了N6-siHBa1綴合物（綴合物13）：

本步驟中，藥物綴合物的siRNA為編號為siHBa1的序列：正義鏈：5'- CCUUGAGGCAUACUUCAAA-3'（SEQ ID NO: 331），反義鏈：5'- UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU -3'（SEQ ID NO: 332）；

（7-1）合成正義鏈

通過亞磷醯胺核酸固相合成的方法，利用上述製備的連接至固相載體的N-6₂ 化合物起始循環，按照上述序列順序按照3'-5'的方向逐一連接核苷單體。每連接一個核苷單體都包括脫保護、偶聯、蓋帽、氧化四步反應。合成條件給定如下：

核苷單體以0.1M濃度的乙腈溶液提供，每一步的脫保護反應的條件相同，即溫度為25^o C，反應時間為70秒，脫保護試劑為二氯乙酸的二氯甲烷溶液（3%v/v），二氯乙酸與固相載體上4,4'-二甲氧基三苯甲基保護基的莫耳比為5:1。

每一步偶聯反應條件均相同，包括溫度為25^o C，固相載體上連接的核酸序列與核苷單體的莫耳比為1:10，固相載體上連接的核酸序列和偶聯試劑的莫耳比為1:65，反應時間為600秒，偶聯試劑為5-乙硫基-1H-四氮唑的0.5M乙腈溶液。

每一步蓋帽條件均相同，包括溫度為25^o C，反應時間為15秒。蓋帽試劑溶液為莫耳比為1:1的CapA和CapB的混合溶液，CapA為20體積%N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液，吡啶與乙腈的體積比為3:5；CapB為20體積%乙酸酐的乙腈溶液；蓋帽試劑與固相載體上連接的核酸序列的莫耳比為乙酸酐:N-甲基咪唑:固相載體上連接的核酸序列=1:1:1。

每一步氧化反應條件相同，包括溫度為25^o C，反應時間為15秒，氧化試劑為濃度為0.05M的碘水。碘與偶聯步驟中固相載體上連接的核酸序列的莫耳比為30:1。反應在四氫呋喃:水:吡啶=3:1:1的混合溶劑中進行。

切割和脫保護條件如下：將合成的連接有載體的核苷酸序列加入濃度為25wt%的氨水中，氨水用量為0.5ml/μmol，在55°C反應16h，除去液體，真空濃縮至乾。在氨水處理後，相對於單鏈核酸的量，用0.4ml/μmol N-甲基吡咯烷酮溶解產品，隨後加入0.3ml/μmol三乙胺和0.6ml/μmol三乙胺三氫氟酸鹽，脫除核糖上的2'-O-TBDMS保護。純化與脫鹽：利用製備型離子色譜純化柱（Source 15Q），通過NaCl的梯度沖提，完成核酸的純化。具體而言為：沖提劑A：20mM磷酸鈉（pH 8.1），溶劑為水/乙腈=9:1（體積比）；沖提劑B：1.5M氯化鈉，20mM磷酸鈉（pH 8.1），溶劑為水/乙腈=9:1（體積比）；沖提梯度：沖提劑A:沖提劑B=100:0-50:50梯度沖提。收集產品沖提液後合併，採用反相色譜純化柱進行脫鹽，具體條件包括採用葡聚糖凝膠柱進行脫鹽，填料為葡聚糖凝膠G25，以去離子水沖提。

檢測：使用離子交換色譜（IEX-HPLC）進行檢測，純度為92.4%；採用液質聯用（LC-MS）分析分子量，理論值7748.37，實測值7747.50。

從而，該步驟中將N-6₂ 化合物連接至所得到的正義鏈的3'末端，得到N-6₂ 化合物綴合在siRNA 3'末端的siRNA正義鏈S。

（7-2）合成反義鏈

本步驟中，利用通用固相載體（UnyLinker™ loaded NittoPhase®HL Solid Supports，Kinovate Life Sciences公司），合成了N6-siHBa1綴合物的反義鏈AS。固相合成方法中的脫保護、偶聯、蓋帽、氧化反應條件，脫保護和切割，分離條件與合成正義鏈相同，得到反義鏈AS。

檢測：純度採用離子交換色譜（IEX-HPLC）進行檢測，其結果，純度93.2%；分子量採用液質聯用（LC-MS）進行分析。理論值6675.04，實測值：6674.18。

（7-3）合成N6-siHBa1綴合物

將步驟（7-1）中合成的正義鏈與（7-2）中合成的反義鏈以等莫耳比混合，溶於注射用水中並加熱至95°C，室溫冷卻後，使它們通過氫鍵形成雙鏈結構。

在上述合成完成後，利用液質聯用儀（LC-MS，Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，購於Waters公司，型號：LCT Premier）進行分子量檢測。其結果，理論值S：7748.37，AS：6675.04，實測值S：7747.82，AS：6674.43，實測值與理論值一致，從而確定所合成的藥物綴合物是目標設計的綴合有連續兩個式（N-6）所示的化合物的雙鏈核酸序列。N6-siHBa1綴合物（綴合物13）的結構如式（303）所示。

[製備例8 綴合物14-184以及對比綴合物1的製備]

採用與製備例7相同的方法製備題述各藥物綴合物，不同的是：1）綴合的siRNA具有表2A-表2G中所示的對應於綴合物14-184以及對比綴合物1的序列；2）對於綴合物38-42、60-64、77-81、94-98、116-120、154-158以及179-184，分別以上述製備例6獲得的連接至固相載體的X-2₂ 化合物、連接至固相載體的W-2₂ 化合物、連接至固相載體的V-2₂ 化合物或連接至固相載體的O-2₂ 化合物代替連接至固相載體的N-6₂ 化合物6（例如，以連接至固相載體的X-2₂ 化合物代替連接至固相載體的N-6₂ 化合物時，獲得的是綴合物38、60、77、94、116和154，以連接至固相載體的W-2₂ 化合物代替連接至固相載體的N-6₂ 化合物時，獲得的是綴合物39、61、78、95、117和155，以此類推）；3）當目標序列中兩個核苷酸之間為硫代磷酸酯連接時，用以下硫化反應步驟代替該兩個核苷酸中後一個核苷酸的連接中的氧化反應步驟；每一步硫化反應的條件相同，包括溫度為25^o C，反應時間為300秒，硫化試劑為氫化黃原素。硫化試劑與偶聯步驟中固相載體上連接的核酸序列的莫耳比為120:1。反應在乙腈:吡啶=1:1的混合溶劑中進行；並且4）當目標序列中的全部核苷酸的2'-位均為修飾的羥基基團時，切割與脫保護條件中，不包括脫除核糖上的2'-O-TBDMS保護的步驟。從而，製備得到本發明的藥物綴合物14-183以及對比綴合物1，按照表2A-2G對其分別進行編號。通過液質聯用儀檢測分子量，確認上述綴合物分別具有如式（303）、（304）、（305）、（306）、（307）或（308）所示的結構。

[製備例1B（FC-10化合物的合成）]

本製備例中，按照以下方法，合成了FC-10化合物：

（1B-1）綴合末端段F-e的合成

（1B-1-1a）F-a的合成

將式F-SM所示的化合物（購自北京偶合科技有限公司，CAS號：5793-73-8，5.0 g）、(9H-芴-9-基)甲醇（購自北京偶合科技有限公司，CAS號24324-17-2，3.2 g）和4-二甲氨基吡啶（DMAP， CAS號1122-58-3，購自北京偶合科技有限公司，0.4 g）溶於80 mL無水二氯甲烷中，在0°C且氮氣保護條件下，加入二環己基碳二亞胺（DCC，3.7 g，購自北京偶合科技有限公司，CAS號538-75-0）。加入後，將混合物加熱至室溫並攪拌4小時。過濾除去形成的固體，並在減壓條件下濃縮濾液。柱層析（200~300目正相矽膠，乙酸乙酯：石油醚=1:10-1:6梯度沖提）純化收集目標產物濃縮，得到無色油狀產物F-a 4.6g。MS m/z:[M+H]+ 理論：516.2，實際：[M+H-Boc]：515.9。

（1B-1-1b）F-b的合成

將步驟（1B-1-1a）得到的化合物F-a（4.6 g）溶解於40 ml 4 mol/L 氯化氫的二氧六環溶液中。將混合物在室溫下攪拌2小時。減壓條件下濃縮混合物，得到白色膠狀產物F-b 4.3g。理論分子量：MS m/z:[M+H]+：451.2，實測分子量：[M-HCl+H]+：415.9。

（1B-1-1c）F-d的合成

其中，式F-b中Fm表示9-芴甲基。

將步驟（1B-1-1b）中得到的F-b（3.8 g）、化合物F-c（4.0 g，CAS號252847-30-6，參照WO2009082607中第113頁中化合物151至化合物152記載的製備方法製備）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDCl，CAS號25952-53-8，購自北京偶合科技有限公司，1.9 g）和1-羥基苯并***（HOBt，CAS號2592-95-2，購自北京偶合科技有限公司，1.4 g）溶於40 ml無水二甲基甲醯胺（DMF）中，在0^o C且氮氣保護條件下，向混合液中加入N,N-二異丙基乙胺（DIEA，4.3 g）。添加完畢，將混合物加熱至室溫並攪拌2小時，然後用100 ml飽和食鹽水淬火，用乙酸乙酯萃取2次，每次100ml。將合併的有機層用飽和食鹽水洗滌2次，每次100ml，後用無水硫酸鈉乾燥，過濾獲得有機層並減壓濃縮。殘餘物經矽膠層析（乙酸乙酯：石油醚=1:1至1:0梯度沖提）純化，得到淺白色固體產物F-d 1.0g。¹ H NMR（300MHz，DMSO，P P m）12.26（s，1H），11.95（s，1H），9.04–8.76（m，2H），7.99–7.87（m，3H），7.82（dd，J=7.5，4.1Hz，2H），7.72（d，J=8.2Hz，2H），7.66–7.57（m，2H），7.58–7.29（m，8H），7.14（d d，J=8.4，6.1H z，2H），5.25（s，2H），5.07（d，J=5.1hz，2H），4.41（d t，J=16.1，11.6hz，3H），4.23（t，J=6.7hz，1H），2.89（s，2H），2.83-2.74（m，1H），2.73（s，2H），1.13（d，J=6.8hz，6H），MS m/z: [M+H]+ 理論：876.3，實測：875.7。

（1B-1-1d）F-e的合成

將步驟（1B-1-1c）中得到的F-d（1.0g）溶於30 ml乙醇和10 ml乙酸乙酯中，然後向混合液中加入Pd/C（200 mg，10 %w/w）。將混合物在氫氣保護條件下室溫攪拌4小時，然後再在開放空氣中於室溫下攪拌8小時。過濾混合物並在減壓條件下濃縮濾液。殘餘物經反相C18柱純化（水:乙腈=0:1-4:6的梯度沖提），冷凍蒸發除去溶劑，得到黃色固體產物F-e 400 mg。1H NMR（300 MHz，DMSO）δ12.15（d，J=124.0 Hz，5H），9.02~8.95（m，1H），8.90（d，J=6.1 Hz，1H），8.01~7.55（m，10H），7.45~7.51（m，3H），7.25~7.12（m，2H），5.29–5.20（s，2H），4.60–4.45（m，1H），4.42–4.31（m，2H），4.29–4.20（m，1H），2.84–2.73（m，1H），2.40–2.25（m，3H），2.15–2.00（m，2H），2.00–1.85（m，1H），1.13（d，J=6.8Hz，6H），MS m/z: [M+H]+ 理論：786.2，實測：785.7。

以下，使用按照上述方法得到的F-e化合物，通過以下製程路線合成了FC-10化合物：

（1B-2）FC-1的合成

在0^o C-5^o C的溫度下，將氫氧化鈉（15.76 g）溶於300 ml水中，再向溶液中添加呱嗪-2-羧酸二鹽酸鹽（CAS號3022-15-9，購自北京偶合科技有限公司，20.00 g），得到反應混合物。將二碳酸二叔丁基甲酯（(Boc)₂ O，CAS號24424-99-5，購自北京偶合科技有限公司，47.30g）溶解在200ml二氧六環溶液中，再加入至反應混合物。將混合物在室溫下攪拌15小時。減壓去除有機溶劑，將剩餘水相冷卻至0^o C-5^o C，使用3N鹽酸酸化至pH=3，用乙酸乙酯萃取2次，每次300ml。將合併的有機層用300 ml水洗滌1次，使用無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮。得到白色固體狀產物FC-1 29.0 g。1H NMR（300 MHz，DMSO）δ12.88（s，1H），4.54–4.16（m，2H），3.79（d，J=10.3 Hz，1H），3.62（d，J=12.7 Hz，1H），3.16–2.87（m，2H），2.85–2.65（m，1H），1.38–1.28（m，18H）， MS m/z: [M+H]+ 理論：330.2，實測：[2M+H⁺ +Na⁺ ]=682.9。

（1B-3）FC-2的合成

將步驟（1B-2）中得到的FC-1（27.70 g）、1-羥基苯并***（HOBt，13.60 g）和三乙胺（TEA，34.00 g，北京偶合科技有限公司，CAS號121-44-8）溶於150 ml無水二甲基甲醯胺中，持續攪拌，在溫度為0°C時，向攪拌的混合液中分部分加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDCl, 19.30 g），然後加入3-氨基丙烷-1,2-二醇（8.40 g，北京偶合科技有限公司，Cas號616-30-8）。加入後，將混合物在室溫下攪拌5小時。加入150 ml飽和食鹽水冷卻反應，用乙酸乙酯萃取2次，每次150ml。將合併的有機層用飽和食鹽水洗滌2次，每次150ml，後用無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮。濃縮物經矽膠層析（乙酸乙酯:石油醚:二氯甲烷:甲醇=1:1:1:0至1:1:1:0.2梯度沖提）純化，得到白色固體狀產物FC-2 21.0g。

¹ HNMR（300 MHz，CDCl3）δ6.67–6.51（m，1H），4.56（s，1H），4.44（d，J=13.3 Hz，1H），3.95–3.66（m，J=43.2，7.2 Hz，3H），3.65–2.81（m，9H），1.43（d，J=5.5 Hz，18H），MS m/z: [M+H]+ 理論：404.2，實測：404.0。

（1B-4）FC-3的合成

將步驟（1B-3）中得到的FC-2（17.00 g）溶解在100 ml 4mol/L氯化氫的二氧六環溶液中。在室溫下攪拌1小時。在減壓條件下濃縮混合物，得到白色固體狀產物FC-3 12.0 g。MS m/z: [M+H]+ 理論：204.1，實測：204.1。

（1B-5）FC-4的合成

在室溫下向250 ml無水二氯甲烷中加入3-二乙氧基磷醯氧基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮（DEPBT, 25.40 g，購自北京偶合科技有限公司，CAS號165534-43-0），持續攪拌，然後將6-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)己酸（6-((((9H-fluoren-9-yl)methoxy)carbo nyl)amino)hexanoic acid，CAS號88574-06-5，購自北京偶合科技有限公司，24.00 g）和N,N-二異丙基乙胺（DIEA, 22.00 g）加入至混合液中，將混合物在室溫下攪拌30分鐘。在溫度為0^o C時，加入步驟（1B-4）獲得的的FC-3（7.80 g）。添加完畢後，將混合物在室溫下攪拌18小時。用150 ml飽和食鹽水淬火，用二氯甲烷萃取2次，每次150 ml。將合併的有機層用飽和食鹽水洗滌2次，每次150 ml，使用無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮。柱層析（200~300目正相矽膠，乙酸乙酯:石油醚:二氯甲烷:甲醇=1:1:1:0.2至1:1:1:0.4梯度沖提）純化，得到淡黃色固體狀產物FC-4 14.7g。MS m/z:[M+H]+ 理論：874.4，實測：873.8。

（1B-6）FC-5的合成

在0^o C時持續攪拌下向40 ml無水吡啶中加入4,4’-雙甲氧基三苯甲基氯（DMTrCl, 3.70 g），然後將1B-5中所得產物FC-4 （8.00 g）和4-二甲氨基吡啶（0.22 g）加入至混合液中，然後在室溫且氮氣保護條件下將混合物攪拌過夜。減壓條件下濃縮混合物，柱層析（200~300目正相矽膠，先以含0.1%三乙胺（v/v）的石油醚平衡管柱，隨後以乙酸乙酯:石油醚:二氯甲烷:甲醇=1:1:1:0.1至1:1:1:0.3梯度沖提）純化，得到白色固體狀產物FC-5 7.5g。MS m/z:[m+Na]+ 理論：1198.6，實測：1198.6。

（1B-7）FC-6的合成

在室溫下，向60 ml無水二氯甲烷中加入丁二酸酐（CAS號108-30-5，購自北京偶合科技有限公司，0.43 g），將步驟（1B-6）得到的FC-5（3.60 g）、N,N-二異丙基乙胺（DIEA, 1.97 g）和4-二甲氨基吡啶（DMAP, 37.30 mg）加入至混合液中，然後在室溫下在氮氣保護條件下將混合物攪拌過夜。然後用矽膠層析法（先以含0.1%三乙胺（v/v）的石油醚平衡管柱，隨後以二氯甲烷:甲醇=20:1至10:1梯度沖提）純化，得到白色固體狀產物FC-6 4.0g。MS m/z:[m+Na]+ 理論：1399.7，實測：[m-Et3N+Na]:1298.6。

（1B-8）FC-7的合成

在室溫下向40 ml無水乙腈中加入苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽（HBTU，CAS號94790-37-1，購自北京偶合科技有限公司，0.83 g），持續攪拌，加入步驟（1B-7）得到的FC-6（2.0 g）和N,N-二異丙基乙胺（DIEA， 0.40 g）。然後在氮氣保護條件下在室溫下將混合物攪拌30分鐘。然後將氨基樹脂（4.1g，400 μmol/g，購自天津南開和成科技有限公司，產品型號：HC4025）加入混合物中，通過震盪反應器將混合物旋轉反應21小時。過濾混合物，用50 ml二氯甲烷、50 ml乙腈各洗滌1次，減壓條件下乾燥濾餅，得到黃色固體狀產物FC-7 5.4 g，載樣量：269μmol/g。

（1B-9）FC-8的合成

將蓋帽試劑A（CapA，121.5 ml，22.5 ml/g）和蓋帽試劑B（CapB，13.5 ml，2.5 ml/g）均勻混合，CapA為20體積%N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液，吡啶與乙腈的體積比為3:5；CapB為20體積%乙酸酐的乙腈溶液；然後將其添加到4-二甲氨基吡啶（DMAP，67.5 mg，0.0125 g/g）和乙腈（13.5 ml，2.5 ml/g）的混合物中。將上述混合物充分混合，然後添加步驟（1B-8）中所得的FC-7（5.4 g，1.0 g/g）。在室溫下通過震盪反應器將得到的混合物旋轉反應5小時。過濾分離反應混合物，用50 ml乙腈洗滌濾餅一次，減壓條件下乾燥濾餅，得到淡黃色固體狀產物FC-8 5.6g。

（1B-10）FC-9的合成

將步驟（1B-9）中所得的5.6g FC-8加入44 ml呱啶的二氯甲烷溶液（20% v/v）中，通過震盪反應器將所得混合物旋轉反應5小時。過濾混合物，用150 ml乙腈洗滌1次，減壓條件下乾燥濾餅，得到黃色固體狀產物FC-9 5.0g。

（1B-11）FC-10的合成

將步驟（1B-10）所得的FC-9（0.86 g）、步驟（1B-1-1d）獲得的化合物F-e（400 mg）、1-羥基苯并***（HOBt，78 mg）、N-甲基嗎啉（151 mg）和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽（EDCl，112 mg）溶解於12 ml無水1,2-二氯乙烷中。在室溫下，通過震盪反應器將得到的混合物旋轉18小時。過濾混合物，用30 ml乙腈、30 ml二氯甲烷洗滌，減壓條件下乾燥濾餅，得到黃色固體狀產物FC-10 800mg，載樣量：269μmol/g。

[製備例2B 綴合物185的合成]

（2B-1）合成FC-siSTAT1綴合物正義鏈

本步驟中，藥物綴合物的siRNA為編號為siSTAT1的序列： siSTAT1 正義鏈： 5'- CmsUmsAmGmAmAmAfAfCfUmGmGmAmUmAmAmCmGmUm -3'（SEQ ID NO: 723），反義鏈： 5'- AmsCfsGmUmUmAfUmCmCmAmGmUmUmUfUmCfUmAmGmsCmsCm -3'（SEQ ID NO: 724）；其中，正義鏈3'末端綴合有FC-10化合物，反義鏈5'末端連接有Cy5螢光基團。

通過亞磷醯胺固相合成的方法，由上述步驟製備的FC-10化合物代替固相合成方法中的固相載體起始，按照上述序列順序按照3'-5'的方向逐一連接核苷單體。每連接一個核苷單體都包括脫保護、偶聯、蓋帽、和氧化四步反應。其中，兩個核苷酸之間採用磷酸酯連接時，連接後一個核苷單體時，包括脫保護、偶聯、蓋帽、氧化四步反應。兩個核苷酸之間採用硫代磷酸酯連接時，連接後一個核苷單體時，包括保護、偶聯、蓋帽、硫化四步反應。合成條件給定如下：

每一步偶聯反應條件均相同，包括溫度為25^o C，固相載體上連接的核酸序列與核苷單體的莫耳比為1:10，固相載體上連接的核酸序列和偶聯試劑的莫耳比為1:65，反應時間為600秒，偶聯試劑為5-乙硫基-1H-四氮唑（5-(Ethylthio)-1H-tetrazole，ETT）的0.5M乙腈溶液。

每一步硫化反應的條件相同，包括溫度為25^o C，反應時間為300秒，硫化試劑為氫化黃原素。硫化試劑與偶聯步驟中固相載體上連接的核酸序列的莫耳比為120:1。反應在乙腈:吡啶=1:1的混合溶劑中進行。

待最後一個核苷單體連接完成後，依次對固相載體上連接的核酸序列進行切割、脫保護、純化、脫鹽，隨後凍乾獲得正義鏈，其中，切割和脫保護條件如下：將合成的連接有載體的核苷酸序列加入濃度為25wt%的氨水中，氨水用量為0.5ml/μmol，在55°C反應16h，過濾去除剩餘載體，將上清液真空濃縮至乾，隨後加入至過量的20%呱啶的二氯甲烷溶液，室溫培養4h脫除Fm基團後，真空濃縮至乾。

純化與脫鹽條件如下：利用製備型離子色譜純化柱（Source 15Q），通過NaCl的梯度沖提，實現核酸的純化。具體而言為：沖提劑A：20mM磷酸鈉（pH 8.1），溶劑為水/乙腈=9:1（體積比）；沖提劑B：1.5M氯化鈉，20mM磷酸鈉（pH 8.1），溶劑為水/乙腈=9:1（體積比）；沖提梯度：沖提劑A:沖提劑B=100:0-50:50梯度沖提。收集產品沖提液後合併，採用反相色譜純化柱進行脫鹽，具體條件包括採用葡聚糖凝膠柱進行脫鹽，填料為葡聚糖凝膠G25（Sephadex G25），以去離子水沖提。

檢測：使用離子交換色譜（IEX-HPLC）檢測的純度為92.4%；採用液質聯用儀（LC-MS）分析分子量，理論值7253.96，實測值7253.12。

從而，該步驟中將FC-10化合物連接至所得到的正義鏈的3'末端，得到FC-10化合物綴合在siRNA 3'末端的siRNA正義鏈S。

（2B-2）合成FC-siSTAT1綴合物的反義鏈

採用與綴合物29中製備反義鏈相同方法製備FC-siSTAT1綴合物的反義鏈，不同的是：（1）在連接反義鏈最後一個核苷單體後，再額外將Cy5螢光基團連接到反義鏈上；（2）反義鏈的切割與脫保護條件不同。

具體來說：在（1）中，在按照製備例1中步驟（7-2）中所描述的固相亞磷醯胺法製備反義鏈過程中，連接反義鏈最後一個核苷單體後，再經脫保護、偶聯、蓋帽、氧化四步反應將式（901）所示的Cy5亞磷醯胺單體（購自上海兆維科技發展有限公司，貨號為OP-057）連接至反義鏈5'末端。其中，使用的脫保護、偶聯、蓋帽、氧化反應條件與步驟（7-2）合成反義鏈相同，不同在於：1）脫保護反應時間延長至300秒；2）Cy5偶聯反應時間延長至900秒。

式（901）

在（2）中，切割和脫保護條件如下：將合成的連接有載體的核苷酸序列加入AMA溶液（40wt%甲胺水溶液與25wt%氨水體積比為1 : 1的混合溶液）中，AMA溶液用量為0.5ml/μmol，在25°C水浴條件下反應2h，過濾去除剩餘載體，將上清液真空濃縮至乾。反義鏈的純化和脫鹽條件與步驟（7-2）中合成反義鏈時的純化和脫鹽相同。隨後凍乾，得到FC-siSTAT1綴合物的反義鏈AS。

從而，得到藥物綴合物FC-siSTAT1綴合物，該藥物綴合物的siRNA反義鏈的5'末端共價連接有Cy5螢光基團，具有表2H所示的對應於藥物綴合物FC-siSTAT1綴合物的正義鏈和反義鏈序列。

檢測：採用離子交換色譜（IEX-HPLC）進行檢測的純度為93.2%；分子量採用液質聯用儀（LC-MS）進行分析。理論值6675.04，實測值6674.50。

（2B-3）合成FC-siSTAT1綴合物

將步驟（2B-1）中獲得的正義鏈和（2B-2）中獲得的反義鏈分別溶於注射用水溶液中，得到40 mg/ml的溶液。將它們以等莫耳比混合，在50^o C下加熱15分鐘，冷卻至室溫以使其通過氫鍵形成雙鏈結構。

在上述合成完成後，用超純水(Milli-Q超純水儀自製，電阻率18.2MΩ*cm(25°C))將綴合物稀釋至0.2mg/mL的濃度。利用液質聯用儀（LC-MS，Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，購於Waters公司，型號：LCT Premier）進行分子量檢測。其結果，分子量理論值S：7253.96，AS：6675.04；分子量實測值S：7253.24，AS：6674.61，實測值與理論值一致，從而確定所合成的綴合物是目標設計的帶有FC-10化合物的雙鏈核酸序列。FC-siSTAT1綴合物（綴合物185）的結構如式（311）所示。

表2 藥物綴合物

表2A

綴合物序號	綴合物編號	序列方向5' - 3'	SEQ ID NO
綴合物14	N6-siHBa1	S	CCUUGAGGCAUACUUCAAA	331
AS	UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU	332
綴合物15	N6-siHBa2	S	GACCUUGAGGCAUACUUCAAA	333
AS	UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUCGG	334
綴合物16	N6-siHBa1M1	S	CmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	335
AS	UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm	336
綴合物17	N6-siHBa2M2	S	CmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	337
AS	UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm	338
綴合物18	N6-siHBa2M1	S	GmAmCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	339
AS	UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm	340
綴合物19	N6-siHBa2M2	S	GmAmCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	341
AS	UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm	342
綴合物20	N6-siHBa1M1S	S	CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	343
AS	UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm	344
綴合物21	N6-siHBa1M2S	S	CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	345
AS	UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm	346
綴合物22	N6-siHBa2M1S	S	GmsAmsCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	347
AS	UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm	348
綴合物23	N6-siHBa2M2S	S	GmsAmsCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	349
AS	UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm	350
綴合物24	N6-siHBa1M1VP	S	CmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	351
AS	VP-UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm	352
綴合物25	N6-siHBa1M2VP	S	CmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	353
AS	VP-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmUm	354
綴合物26	N6-siHBa2M1VP	S	GmAmCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	355
AS	VP-UmUfUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm	356
綴合物27	N6-siHBa2M2VP	S	GmAmCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	357
AS	VP-UmUfUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmGmGm	358
綴合物28	N6-siHBa1M1SVP	S	CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	359
AS	VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm	360
綴合物29	N6-siHBa1M1SP	S	CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	361
AS	P-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm	362
綴合物30	N6-siHBa1M1SPs	S	CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	363
AS	Ps-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm	364
綴合物31	N6-siHBa3M1S	S	CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmUm	365
AS	AmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm	366
綴合物32	N6-siHBa1M2SVP	S	CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	367
AS	VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm	368
綴合物33	N6-siHBa2M1SVP	S	GmsAmsCmCmUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	369
AS	VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm	370
綴合物34	N6-siHBa2M2SVP	S	GmsAmsCmCmUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	371
AS	VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmUmCmsGmsGm	372
綴合物35	N6-siHBa1M5SVP	S	CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	373
AS	VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm	374
綴合物36	N6-siHBa1M3SVP	S	CmsCmsUmUmGmAmGfGmCfAmUfAmCmUmUmCmAmAmAm	375
AS	VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm	376
綴合物37	N6-siHBa1M4SVP	S	CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	377
AS	VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm	378
綴合物38	X2-siHBa1M2SVP	S	CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	379
AS	VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm	380
綴合物39	W2-siHBa1M2SVP	S	CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	381
AS	VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm	382
綴合物40	V2-siHBa1M2SVP	S	CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	383
AS	VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm	384
綴合物41	O2-siHBa1M1SVP	S	CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	385
AS	VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm	386
綴合物42	P2-siHBa1M1SVP	S	CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm	387
AS	VP-UmsUfsUmGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm	388
對比綴合物1	N6-NC	S	UUCUCCGAACGUGUCACGU	389
AS	ACGUGACACGUUCGGAGAAUU	390

表2B

綴合物序號	綴合物編號	序列方向5‘-3’	SEQ ID NO
綴合物43	N6-siHBb1M1S	S	UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	391
AS	UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm	392
綴合物44	N6-siHBb2M1S	S	UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	393
AS	UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm	394
綴合物45	N6-siHBb1M2	S	UmGmCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	395
AS	UmAfGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmGmCm	396
綴合物46	N6-siHBb2M2	S	UmGmCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	397
AS	UmAfGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmUmUm	398
綴合物47	N6-siHBb1M1SVP	S	UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	399
AS	VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm	400
綴合物48	N6-siHBb2M1SP	S	UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	401
AS	P-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm	402
綴合物49	N6-siHBb2M1SPs	S	UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	403
AS	Ps-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm	404
綴合物50	N6-siHBb3M1S	S	UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmUm	405
AS	AmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm	406
綴合物51	N6-siHBb2M1SVP	S	UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	407
AS	VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm	408
綴合物52	N6-siHBb1M2SVP	S	UmsGmsCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	409
AS	VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm	410
綴合物53	N6-siHBb2M2SVP	S	UmsGmsCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	411
AS	VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUfGfAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm	412
綴合物54	N6-siHBb1M5SVP	S	UmsGmsCmUmAfUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	413
AS	VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm	414
綴合物55	N6-siHBb1M3SVP	S	UmsGmsCmUmAfUmGfCmCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	415
AS	VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm	416
綴合物56	N6-siHBb1M4SVP	S	UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	417
AS	VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUfGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsGmsCm	418
綴合物57	N6-siHBb4M1SVP	S	GmsCmsUmGmCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	419
AS	VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmGmCmsGmsCm	420
綴合物58	N6-siHBb1	S	UGCUAUGCCUCAUCUUCUA	421
AS	UAGAAGAUGAGGCAUAGCAGC	422
綴合物59	N6-siHBb2	S	UGCUAUGCCUCAUCUUCUA	423
AS	UAGAAGAUGAGGCAUAGCAUU	424
綴合物60	X2-siHBb2M1SVP	S	UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	425
AS	VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm	426
綴合物61	W2-siHBb2M1SVP	S	UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	427
AS	VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm	428
綴合物62	V2-siHBb2M1SVP	S	UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	429
AS	VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm	430
綴合物63	O2-siHBb2M1SVP	S	UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	431
AS	VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm	432
綴合物64	P2-siHBb2M1SVP	S	UmsGmsCmUmAmUmGfCfCfUmCmAmUmCmUmUmCmUmAm	433
AS	VP-UmsAfsGmAmAmGfAmUmGmAmGmGmCmAfUmAfGmCmAmsUmsUm	434

表2C

綴合物序號	綴合物編號	序列方向5' - 3'	SEQ ID NO
綴合物65	N6-siHBc1	S	UCUGUGCCUUCUCAUCUGA	435
AS	UCAGAUGAGAAGGCACAGACG	436
綴合物66	N6-siHBc1M1	S	UmCmUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm	437
AS	UmCfAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmCmGm	438
綴合物67	N6-siHBc1M2	S	UmCmUmGmUfGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm	439
AS	UmCfAmGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmCmGm	440
綴合物68	N6-siHBc1M1SVP	S	UmsCmsUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm	441
AS	VP-UmsCfsAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm	442
綴合物69	N6-siHBc1M2SVP	S	UmsCmsUmGmUfGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm	443
AS	VP-UmsCfsAmGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm	444
綴合物70	N6-siHBc1M3SVP	S	UmsCmsUmGmUfGmCfCmUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm	445
AS	VP-UmsCfsAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm	446
綴合物71	N6-siHBc1M4SVP	S	UmsCmsUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm	447
AS	VP-UmsCfsAmGmAmUfGmAfGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm	448
綴合物72	N6-siHBc1M5SVP	S	UmsCmsUmGmUfGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm	449
AS	VP-UmsCfsAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm	450
綴合物73	N6-siHBc2M1SVP	S	CmsGmsUmCmUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm	451
AS	VP-UmsCfsAmGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGmGmGm	452
綴合物74	N6-siHBc1M1SP	S	UmsCmsUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm	453
AS	P-UmsCfsAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm	454
綴合物75	N6-siHBc1M1SPs	S	UmsCmsUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm	455
AS	Ps-UmsCfsAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm	456
綴合物76	N6-siHBc4M1S	S	UmsCmsUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmUm	457
AS	AmsCfsAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm	458
綴合物77	X2-siHBc1M1SVP	S	UmsCmsUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm	459
AS	VP-UmsCfsAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm	460
綴合物78	W2-siHBc1M1SVP	S	UmsCmsUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm	461
AS	VP-UmsCfsAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm	462
綴合物79	V2-siHBc1M1SVP	S	UmsCmsUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm	463
AS	VP-UmsCfsAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm	464
綴合物80	O2-siHBc1M1SVP	S	UmsCmsUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm	465
AS	VP-UmsCfsAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm	466
綴合物81	P2-siHBc1M1SVP	S	UmsCmsUmGmUmGmCfCfUfUmCmUmCmAmUmCmUmGmAm	467
AS	VP-UmsCfsAmGmAmUfGmAmGmAmAmGmGmCfAmCfAmGmAmsCmsGm	468

表2D

綴合物序號	綴合物編號	序列方向5' - 3'	SEQ ID NO
綴合物82	N6-siHBd1	S	CGUGUGCACUUCGCUUCAA	469
AS	UUGAAGCGAAGUGCACACGGU	470
綴合物83	N6-siHBd1M1	S	CmGmUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm	471
AS	UmUfGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmGmUm	472
綴合物84	N6-siHBd1M2	S	CmGmUmGmUfGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm	473
AS	UmUfGmAmAmGfCmGfAfAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmGmUm	474
綴合物85	N6-siHBd1M1SVP	S	CmsGmsUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm	475
AS	VP-UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm	476
綴合物86	N6-siHBd1M2SVP	S	CmsGmsUmGmUfGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm	477
AS	VP-UmsUfsGmAmAmGfCmGfAfAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm	478
綴合物87	N6-siHBd1M3SVP	S	CmsGmsUmGmUfGmCfAmCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm	479
AS	VP-UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm	480
綴合物88	N6-siHBd1M4SVP	S	CmsGmsUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm	481
AS	VP-UmsUfsGmAmAmGfCmGfAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm	482
綴合物89	N6-siHBd1M5SVP	S	CmsGmsUmGmUfGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm	483
AS	VP-UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm	484
綴合物90	N6-siHBd2M1SVP	S	AmsCmsCmGmUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm	485
AS	VP-UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmGmUmsCmsCm	486
綴合物91	N6-siHBd1M1SP	S	CmsGmsUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm	487
AS	P-UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm	488
綴合物92	N6-siHBd1M1SPs	S	CmsGmsUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm	489
AS	Ps-UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm	490
綴合物93	N6-siHBd4M1S	S	CmsGmsUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmUm	491
AS	AmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm	492
綴合物94	X2-siHBd1M1SVP	S	CmsGmsUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm	493
AS	VP-UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm	494
綴合物95	W2-siHBd1M1SVP	S	CmsGmsUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm	495
AS	VP-UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm	496
綴合物96	V2-siHBd1M1SVP	S	CmsGmsUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm	497
AS	VP-UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm	498
綴合物97	O2-siHBd1M1SVP	S	CmsGmsUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm	499
AS	VP-UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm	500
綴合物98	P2-siHBd1M1SVP	S	CmsGmsUmGmUmGmCfAfCfUmUmCmGmCmUmUmCmAmAm	501
AS	VP-UmsUfsGmAmAmGfCmGmAmAmGmUmGmCfAmCfAmCmGmsGmsUm	502

表2E

綴合物序號	綴合物編號	序列方向5' - 3'	SEQ ID NO
綴合物99	N6-siHBe3M1S	S	GmsAmsAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	503
AS	UmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm	504
綴合物100	N6-siHBe4M1S	S	GmsAmsAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	505
AS	UmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsCmsAm	506
綴合物101	N6-siHBe3M1	S	GmAmAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	507
AS	UmAfUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmUmUm	508
綴合物102	N6-siHBe4M1	S	GmAmAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	509
AS	UmAfUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmCmAm	510
綴合物103	N6-siHBe3M1SVP	S	GmsAmsAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	511
AS	VP-UmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm	512
綴合物104	N6-siHBe3M1SPs	S	GmsAmsAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	513
AS	Ps-UmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm	514
綴合物105	N6-siHBe3M1SP	S	GmsAmsAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	515
AS	P-UmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm	516
綴合物106	N6-siHBe3M1VP	S	GmAmAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	517
AS	VP-UmAfUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmUmUm	518
綴合物107	N6-siHBe3M2	S	GmAmAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	519
AS	UmAfUmUmCmGfUmUfGfAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmUmUm	520
綴合物108	N6-siHBe3M2SVP	S	GmsAmsAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	521
AS	VP-UmsAfsUmUmCmGfUmUfGfAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm	522
綴合物109	N6-siHBe3M3SVP	S	GmsAmsAmAmGfUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	523
AS	VP-UmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm	524
綴合物110	N6-siHBe3M4SVP	S	GmsAmsAmAmGfUmAfUmGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	525
AS	VP-UmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm	526
綴合物111	N6-siHBe3M5SVP	S	GmsAmsAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	527
AS	VP-UmsAfsUmUmCmGfUmUfGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm	528
綴合物112	N6-siHBe1M1S	S	GmsAmsAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	529
AS	AmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm	530
綴合物113	N6-siHBe5M1SVP	S	UmsGmsGmAmAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	531
AS	VP-UmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmCmAmsUmsUm	532
綴合物114	N6-siHBe0M1	S	GmAmAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmUm	533
AS	AmAfUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCm	534
綴合物115	N6-siHBe2	S	GAAAGUAUGUCAACGAAUU	535
AS	AAUUCGUUGACAUACUUUCCA	536
綴合物116	X2-siHBe3M1SVP	S	GmsAmsAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	537
AS	VP-UmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm	538
綴合物117	W2-siHBe3M1SVP	S	GmsAmsAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	539
AS	VP-UmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm	540
綴合物118	V2-siHBe3M1SVP	S	GmsAmsAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	541
AS	VP-UmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm	542
綴合物119	O2-siHBe3M1SVP	S	GmsAmsAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	543
AS	VP-UmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm	544
綴合物120	P2-siHBe3M1SVP	S	GmsAmsAmAmGmUmAfUfGfUmCmAmAmCmGmAmAmUmAm	545
AS	VP-UmsAfsUmUmCmGfUmUmGmAmCmAmUmAfCmUfUmUmCmsUmsUm	546

表2F

綴合物序號	綴合物編號	序列方向5' - 3'	SEQ ID NO
綴合物121	N6-siAN1	S	CCAAGAGCACCAAGAACUA	547
AS	UAGUUCUUGGUGCUCUUGGCU	548
綴合物122	N6-siAN2	S	AGCCAAGAGCACCAAGAACUA	549
AS	UAGUUCUUGGUGCUCUUGGCUUG	550
綴合物123	N6-siAN1-M1	S	CmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	551
AS	UmAfGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm	552
綴合物124	N6-siAN2-M1	S	AmGmCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	553
AS	UmAfGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm	554
綴合物125	N6-siAN1-M2	S	CmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	555
AS	UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm	556
綴合物126	N6-siAN2-M2	S	AmGmCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	557
AS	UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm	558
綴合物127	N6-siAN1-M3	S	CmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	559
AS	UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm	560
綴合物128	N6-siAN2-M3	S	AmGmCmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	561
AS	UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm	562
綴合物129	N6-siAN1-M1VP	S	CmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	563
AS	VP-UmAfGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm	564
綴合物130	N6-siAN2-M1VP	S	AmGmCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	565
AS	VP-UmAfGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm	566
綴合物131	N6-siAN1-M2VP	S	CmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	567
AS	VP-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm	568
綴合物132	N6-siAN2-M2VP	S	AmGmCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	569
AS	VP-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm	570
綴合物133	N6-siAN1-M3VP	S	CmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	571
AS	VP-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm	572
綴合物134	N6-siAN2-M3VP	S	AmGmCmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	573
AS	VP-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm	574
綴合物135	N6-siAN1-M1S	S	CmsCmsAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	575
AS	UmsAfsGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm	576
綴合物136	N6-siAN2-M1S	S	AmsGmsCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	577
AS	UmsAfsGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm	578
綴合物137	N6-siAN1-M2S	S	CmsCmsAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	579
AS	UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm	580
綴合物138	N6-siAN2-M2S	S	AmsGmsCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	581
AS	UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm	582
綴合物139	N6-siAN1-M3S	S	CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	583
AS	UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm	584
綴合物140	N6-siAN2-M3S	S	AmsGmsCmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	585
AS	UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm	586
綴合物141	N6-siAN1-M1SVP	S	CmsCmsAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	587
AS	VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm	588
綴合物142	N6-siAN2-M1SVP	S	AmsGmsCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	589
AS	VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm	590
綴合物143	N6-siAN1-M2SVP	S	CmsCmsAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	591
AS	VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm	592
綴合物144	N6-siAN2-M2SVP	S	AmsGmsCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	593
AS	VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm	594
綴合物145	N6-siAN1-M3SVP	S	CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	595
AS	VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm	596
綴合物146	N6-siAN1-M3SP	S	CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	597
AS	P-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm	598
綴合物147	N6-siAN1-M3SPs	S	CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	599
AS	Ps-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm	600
綴合物148	N6-siAN4-M3S	S	CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmUm	601
AS	AmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm	602
綴合物149	N6-siAN2-M3SVP	S	AmsGmsCmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	603
AS	VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm	604
綴合物150	N6-siAN1-M4S	S	CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	605
AS	UmsAfsGmUmUmCfUmUfGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm	606
綴合物151	N6-siAN1-M4SVP	S	CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	607
AS	VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUfGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm	608
綴合物152	N6-siAN1-M5S	S	CmsCmsAmAmGfAmGfCmAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	609
AS	UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm	610
綴合物153	N6-siAN1-M5SVP	S	CmsCmsAmAmGfAmGfCmAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	611
AS	VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm	612
綴合物154	X2-siAN1-M3SVP	S	CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	613
AS	VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm	614
綴合物155	W2-siAN1-M3SVP	S	CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	615
AS	VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm	616
綴合物156	V2-siAN1-M3SVP	S	CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	617
AS	VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm	618
綴合物157	O2-siAN1-M3SVP	S	CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	619
AS	VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm	620
綴合物158	P2-siAN1-M3SVP	S	CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm	621
AS	VP-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm	622

表2G

綴合物序號	綴合物編號	序列方向5' - 3'	SEQ ID NO
綴合物159	N6-siAP1	S	CAAUAAAGCUGGACAAGAA	623
AS	UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGG	624
綴合物160	N6-siAP2	S	CCCAAUAAAGCUGGACAAGAA	625
AS	UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGGAG	626
綴合物161	N6-siAP1-M1	S	CmAmAmUmAfAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	627
AS	UmUfCmUmUmGfUmCfCfAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGm	628
綴合物162	N6-siAP2-M1	S	CmCmCmAmAmUmAfAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	629
AS	UmUfCmUmUmGfUmCfCfAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGmAmGm	630
綴合物163	N6-siAP1-M2	S	CmAmAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	631
AS	UmUfCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGm	632
綴合物164	N6-siAP2-M2	S	CmCmCmAmAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	633
AS	UmUfCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGmAmGm	634
綴合物165	N6-siAP1-M1VP	S	CmAmAmUmAfAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	635
AS	VP-UmUfCmUmUmGfUmCfCfAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGm	636
綴合物166	N6-siAP2-M1VP	S	CmCmCmAmAmUmAfAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	637
AS	VP-UmUfCmUmUmGfUmCfCfAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGmAmGm	638
綴合物167	N6-siAP1-M2VP	S	CmAmAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	639
AS	VP-UmUfCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGm	640
綴合物168	N6-siAP2-M2VP	S	CmCmCmAmAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	641
AS	VP-UmUfCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGmAmGm	642
綴合物169	N6-siAP1-M1S	S	CmsAmsAmUmAfAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	643
AS	UmsUfsCmUmUmGfUmCfCfAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm	644
綴合物170	N6-siAP2-M1S	S	CmsCmsCmAmAmUmAfAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	645
AS	UmsUfsCmUmUmGfUmCfCfAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGmsAmsGm	646
綴合物171	N6-siAP1-M2S	S	CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	647
AS	UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm	648
綴合物172	N6-siAP2-M2S	S	CmsCmsCmAmAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	649
AS	UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGmsAmsGm	650
綴合物173	N6-siAP1-M1SVP	S	CmsAmsAmUmAfAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	651
AS	VP-UmsUfsCmUmUmGfUmCfCfAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm	652
綴合物174	N6-siAP2-M1SVP	S	CmsCmsCmAmAmUmAfAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	653
AS	VP-UmsUfsCmUmUmGfUmCfCfAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGmsAmsGm	654
綴合物175	N6-siAP1-M2SVP	S	CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	655
AS	VP-UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm	656
綴合物176	N6-siAP1-M2SP	S	CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	657
AS	P-UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm	658
綴合物177	N6-siAP1-M2SPs	S	CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	659
AS	Ps-UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm	660
綴合物178	N6-siAP4-M2S	S	CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmUm	661
AS	AmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm	662
綴合物179	X2-siAP1-M2SVP	S	CmsCmsCmAmAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	663
AS	VP-UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmGmGmsAmsGm	664
綴合物180	W2-siAP1-M2SVP	S	CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	665
AS	VP-UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm	666
綴合物181	V2-siAP1-M2SVP	S	CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	667
AS	VP-UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm	668
綴合物182	O2-siAP1-M2SVP	S	CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	669
AS	VP-UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm	670
綴合物183	P2-siAP1-M2SVP	S	CmsAmsAmUmAmAmAfGfCfUmGmGmAmCmAmAmGmAmAm	671
AS	VP-UmsUfsCmUmUmGfUmCmCmAmGmCmUmUfUmAfUmUmGmsGmsGm	672
綴合物184	N6-siTTR-M2SVP	S	AfsAmsCfAmGfUmGfUmUfCfUfUmGfCmUfCmUfAmUfAmAf	673
AS	VP-UmsUfsAmUfAmGfAmGfCmAfAmGmAmAfCmAfCmUfGmUfUmsUmsUm	674

表2H

綴合物序號	綴合物編號	序列方向5' - 3'	SEQ ID NO
綴合物185	FC-siSTAT1	S	CmsUmsAmGmAmAmAfAfCfUmGmGmAmUmAmAmCmGmUm	675
AS	AmsCfsGmUmUmAfUmCmCmAmGmUmUmUfUmCfUmAmGmsCmsCm	676

其中，S表示正義鏈，AS表示反義鏈；大寫字母C、G、U、A表示核苷酸的鹼基組成；小寫字母m表示該字母m左側相鄰的一個核苷酸為2'-甲氧基修飾的核苷酸；小寫字母f表示該字母f左側相鄰的一個核苷酸為2'-氟修飾的核苷酸；小寫字母s表示與該字母s左右相鄰的兩個核苷酸之間的連接為硫代磷酸酯基連接；VP表示該VP右側的一個核苷酸為乙烯基磷酸酯修飾的核苷酸；P表示該字母P右側的一個核苷酸為磷酸酯修飾的核苷酸；Ps表示該Ps右側的一個核苷酸為硫代磷酸酯修飾的核苷酸。

上述製備例7和8中，當AS鏈5'位末端為VP-Um表示的乙烯基磷酸酯修飾的2'-甲氧基修飾脲嘧啶核苷酸時，對應的乙烯基磷酸酯修飾的2'-甲氧基修飾脲嘧啶核苷單體（VP-U-6化合物）按照以下方法合成：

（13-1）VP-U-2的合成

按照以下方法，合成了VP-U-2分子：

將2'-甲氧基修飾的脲嘧啶核苷酸（2'-OMe-U，51.30g，91.6mmol），叔丁基二苯基氯矽烷（TBDPSCl，50.35g，183.2mmol），咪唑（12.47g，183.2mmol）混合溶於450ml N,N-二甲基甲醯胺（DMF），室溫下攪拌反應20h。蒸除DMF，用600ml二氯甲烷溶解後加300ml飽和碳酸氫鈉洗滌，水相再用二氯甲烷（DCM）萃取3次，每次300ml，合併有機相，用5%草酸洗滌至水相pH＜5，蒸發溶劑至乾後獲得VP-U-1粗品直接用於隨後VP-U-2的合成。

將VP-U-1粗品用100ml二氯甲烷溶解後，外加冰浴攪拌10分鐘，再加入預先在4^o C冰箱冷藏好的450ml 2%對甲苯磺酸溶液（溶劑為體積比3:7的甲醇-二氯甲烷混合溶劑），反應10分鐘。再加入200ml飽和碳酸氫鈉淬滅反應，有機相加入飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌至pH=8。合併水相，用二氯甲烷萃取2次，每次200ml，合併有機相，再用200ml飽和食鹽水洗滌一次，蒸發溶劑至乾。200-300目正相矽膠柱純化，石油醚裝柱，以石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇=1:1:1:0.05-1:1:1:0.25梯度沖提，收集產物沖提液，減壓蒸乾溶劑，真空油泵發泡乾燥得到純品VP-U-2共40.00g。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.96 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.64 (dtd, J = 5.1, 4.0, 2.2 Hz, 4H), 7.41–7.30 (m, 6H), 6.79 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 5.73 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.94 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 4.12 (td, J = 4.6, 3.9 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 4.8, 4.0 Hz, 1H), 3.96 (t, J = 4.7 Hz, 1H), 3.68 (ddd, J = 11.8, 7.0, 4.6 Hz, 1H), 3.57 – 3.46 (m, 1H), 3.39 (s, 3H), 1.05 (s, 8H). MS m/z：C₂₆ H₃₃ N₂ O₆ Si，[M+H]+，理論：497.21，實測：497.45。

（13-2）VP-U-4的合成：

將VP-U-2（19.84g，40.0mmol），二環己基碳二亞胺（DCC，16.48g，80.0mmol），吡啶（4.20g，53.2mmol），三氟乙酸（6.61g，53.2mmol）混合溶於200ml二甲基亞碸（DMSO），室溫下攪拌反應20h。另取亞甲基二磷酸四乙酯（21.44g，74.4mmol）溶於120ml THF，冰浴降溫，在冰浴溫度下加入t-BuOK（11.36g，101.2mmol），先在冰浴溫度下反應10min，再升至室溫反應0.5h，然後加入至前述反應液中，約1h加完，冰浴溫度下反應1h，再升至室溫反應18h。加水淬滅反應，水相以二氯甲烷提取3次，每次200ml。合併有機相，用200ml飽和食鹽水水洗一次後蒸發溶劑至乾。用200-300目正相矽膠柱純化，石油醚裝柱，以石油醚:乙酸乙酯=1:1-1:4梯度沖提，收集產物沖提液，減壓蒸乾溶劑，真空油泵發泡乾燥得到純品VP-U-4共14.00g。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.96 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.64 (dtd, J = 5.1, 4.0, 2.2 Hz, 4H), 7.41 – 7.30 (m, 6H), 6.82 – 6.71 (m, 2H), 5.90 (ddd, J = 25.9, 15.0, 1.0 Hz, 1H), 5.73 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.36 – 4.21 (m, 3H), 4.18 (t, J = 4.9 Hz, 1H), 4.05 (ddq, J = 9.7, 8.5, 6.9 Hz, 2H), 3.87 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 3.39 (s, 3H), 1.32 (td, J = 6.9, 0.7 Hz, 6H), 1.05 (s, 8H). MS m/z：C₃₁ H₄₂ N₂ O₈ PSi，[M+H]+，理論：629.24，實測：629.51。

（13-3）VP-U-5的合成：

將VP-U-4（14.00g，22.29mmol）溶於100ml四氫呋喃，加入三乙胺三氫氟酸（17.96g，111.45mmol），室溫攪拌20h反應完全。直接蒸發溶劑至乾，再用二氯甲烷溶解隨後蒸乾2次，每次使用50ml二氯甲烷，得到粗品。用200-300目正相矽膠柱純化，石油醚裝柱，以石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇=1:1:1:0.05-1:1:1:0.25梯度沖提，收集產物沖提液，減壓蒸乾溶劑，真空油泵發泡乾燥得到純品VP-U-5共6.70g。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.96 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 6.77 (dd, J = 15.0, 6.2 Hz, 1H), 5.99 – 5.82 (m, 2H), 5.73 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.27 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 5.10 (dd, J = 5.3, 4.7 Hz, 1H), 4.29 (ddq, J = 9.8, 8.6, 7.0 Hz, 2H), 4.17 (ddd, J = 6.2, 5.2, 1.0 Hz, 1H), 4.12 – 3.98 (m, 3H), 3.39 (s, 2H), 1.32 (td, J = 6.9, 0.6 Hz, 6H). MS m/z：C₁₅ H₂₄ N₂ O₈ P，[M+H]+，理論：391.13，實測：391.38。

（13-4）VP-U-6的合成：

在氬氣保護條件下向10ml無水二氯甲烷中加入VP-U-5（391mg，1.0mmol）、三氟乙酸吡啶鹽（0.232g，1.2mmol）、N-甲基咪唑（0.099g，1.2mmol），雙(二異丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦（0.452g，1.5mmol），室溫攪拌反應5小時。蒸除溶劑至乾，柱層析純化（200-300目正相矽膠，二氯甲烷:乙腈（含0.5wt%三乙胺）=3:1-1:3梯度沖提），收集產物沖提液，濃縮除去溶劑，得到目標產物VP-U-6共508mg。31P NMR (161 MHz, DMSO-d6) δ 150.34, 150.29, 17.07, 15.50. MS m/z：C₂₄ H₄₁ N₄ O₉ P₂ ，[M+H]+，理論：591.23，實測：591.55。表示VP-U-6是目標產物VP-Um，作為核苷單體參與RNA鏈合成。

使用如下方法將5'-磷酸酯修飾連接至反義鏈5'端：

原料為具有如式CPR-I結構的磷酸化結構單體，由蘇州吉瑪提供，貨號Cat#13-2601-XX：

（CPR-I）

在反義鏈全部核苷單體連接完畢後，按照亞磷醯胺核酸固相合成的方法，經脫保護、偶聯、蓋帽、氧化四步反應將CPR-I單體連接至反義鏈5'末端。隨後按照如下條件進行切割與脫保護，獲得反義鏈：

將合成的連接有載體的核苷酸序列加入濃度為25wt%的氨水中，氨水用量為0.5ml/μmol，在55°C反應16h，除去液體，真空濃縮至乾。在氨水處理後，相對於單鏈核酸的量，用0.4ml/μmol N-甲基吡咯烷酮溶解產品，隨後加入0.3ml/μmol三乙胺和0.6ml/μmol三乙胺三氫氟酸鹽，脫除核糖上的2'-O-TBDMS保護。純化與脫鹽：利用製備型離子色譜純化柱（Source 15Q），通過NaCl的梯度沖提，完成核酸的純化。具體而言為：沖提劑A：20mM磷酸鈉（pH 8.1），溶劑為水/乙腈=9:1（體積比）；沖提劑B：1.5M氯化鈉，20mM磷酸鈉（pH 8.1），溶劑為水/乙腈=9:1（體積比）；沖提梯度：沖提劑A:沖提劑B=100:0-50:50梯度沖提。收集產品沖提液後合併，採用反相色譜純化柱進行脫鹽，具體條件包括採用葡聚糖凝膠柱進行脫鹽，填料為葡聚糖凝膠G25，以去離子水沖提。

對於目標產物具有5'-硫代磷酸酯修飾的情況，使用與上述同樣的步驟，區別在於在連接時，以硫化反應條件代替上述氧化反應條件，進行硫化反應。

對於上述合成的正義鏈和反義鏈，使用離子交換色譜（IEX-HPLC）檢測純度，並以液質聯用色譜（LC-MS）分析分子量，確認所合成的核酸序列是對應於表2中各綴合物與對比綴合物的siRNA。

實驗例1 本實驗說明本發明的藥物綴合物的動物水平毒性。

在C57BL/6J小鼠（購自北京維通利華實驗動物技術有限公司）上，分別向每隻小鼠皮下單次給予300mg/kg（以siRNA計）的綴合物28-30、38-42、47-49、68-70、90-92、145-147和175-177，連續觀察14天，未出現動物死亡，也未觀察到與藥物不良反應相關的臨床症狀，在觀察結束後，對各小鼠進行大體解剖，也均未發現異常。從而，上述結果表示本發明的藥物綴合物具有較低的動物水平毒性。

以下實驗例2-實驗例8中，按照siRNA靶點位置和序列關聯性，對表2A-表2G的藥物綴合物的性質和效果分別進行實驗驗證。

[實驗例2 表2A的藥物綴合物的效果實驗]

實驗例2-1 本發明綴合物在人血漿中的體外穩定性

將綴合物32（以siRNA濃度為20μΜ的0.9%氯化鈉水溶液形式提供，每組12μl）與108 μL 90%人血漿（Human plasma，購自江蘇省血液研究所，以1×PBS（pH7.4）稀釋）混勻，獲得混合液，並在37^o C恆溫培養。在培養過程中，分別在0、2、4、6、8、24、48、72小時中的每個時間點取出10 μL混合液，立即進行液氮速凍，於-80^o C冰箱中凍存。其中，0小時是指綴合物溶液與90%人血漿混勻後，立即取出10μL混合液的時刻。待各時間點取樣完畢後，用1×PBS（pH7.4）將各混合液稀釋5倍後，取每一稀釋混合液10 μL準備電泳。同時，取等莫耳量的藥物綴合物32溶液（siRNA濃度為2μM）2μl，與8μl 1×PBS（pH7.4）混勻，製備成10μL未經人血漿處理的樣品（記為Con）。

配製20重量%的非變性聚丙烯醯胺凝膠，將每一組的準備電泳的樣品分別與4 μL上樣緩衝液（20mM EDTA，36重量%甘油，0.06重量%溴酚藍的水溶液）混合，然後上樣至各凝膠孔，在80mA恒流條件下電泳60分鐘。電泳結束後，取出凝膠，用1×Sybr Gold染料（Invitrogen，Cat.11494）染色15分鐘後成相，結果如圖1所示。所述對比序列1 如下：

正義鏈：5'- CCUUGAGGCAUACUUCAAA - 3'（SEQ ID NO: 1）

反義鏈：5'- UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU -3'（SEQ ID NO: 2）

由圖1顯示了測試的藥物綴合物在體外人血漿中的穩定性半定量檢測結果。結果顯示，本發明的綴合物在人血漿中最高72h時仍未降解，顯示出優異的在人血漿中的穩定性。

實驗例2-2 本發明綴合物在猴血漿中的體外穩定性

將綴合物32和對比序列1（分別以siRNA濃度為20μM的0.9wt%氯化鈉水溶液形式提供，每組12μL）分別與108 μL 90%食蟹猴血漿（Monkey plasma，購自鴻泉生物，HQ70082，以1×PBS稀釋）混勻，獲得混合液並在37^o C恆溫培養。在培養過程中，分別在0、2、4、6、8、24、48、72小時中的每個時間點取出10 μL樣本，立即進行液氮速凍於-80^o C冰箱中凍存。其中，0小時是指綴合物溶液與90%食蟹猴血漿混勻後，立即取出10μL混合液的時刻。待各時間點取樣完畢後，用1×PBS（pH7.4）將各混合液稀釋5倍後，取每一稀釋混合液10 μL準備電泳。同時，取等莫耳量的綴合物32（以siRNA計的濃度為2μM）2μl與8μl 1×PBS（pH7.4）混勻獲得10μL未經猴血漿處理的樣品(記為Con)。

配製20重量%的非變性聚丙烯醯胺凝膠，將上述稀釋後的樣品中每一組的準備電泳樣品與4 μL上樣緩衝液（20mM EDTA，36重量%甘油，0.06重量%溴酚藍的水溶液）混合，然後上樣至各凝膠孔，在80mA恒流條件下電泳60分鐘。電泳結束後，凝膠用1×Sybr Gold染料（Invitrogen，Cat.11494）染色15分鐘後成相，結果如圖2所示。

圖2示出了所測試藥物綴合物在體外猴血漿中的穩定性半定量檢測結果。可以看出，本發明的綴合物32在食蟹獼猴血漿中最高為72h仍未降解，顯示出優異的在猴血漿中的穩定性。

實驗例2-3 本實驗說明綴合物32在大鼠體內的藥代動力學

在本實驗例中，分別向各實驗組的大鼠（每組10隻大鼠，雌雄各半）皮下注射給予綴合物32，單次給藥劑量按照1mg/kg和0.5mg/kg大鼠體重實施。隨後檢測各時間點的大鼠血漿藥物濃度和肝臟組織藥物濃度。

首先，將SD大鼠採用PRISTIMA 7.2.0版資料系統根據大鼠體重分性別隨機分組，隨後按照設計的劑量分別給予綴合物。所有動物根據體重計算藥量，皮下單次給藥，劑量為1mg/kg和0.5mg/kg，以1mg/ml和5mg/ml的0.9%氯化鈉水溶液的形式，體積為10ml/kg。給藥前及給藥後5分鐘（±30秒）、30分鐘（±1分鐘）、1小時（±2分鐘）、2小時（±2分鐘）、6小時（±5分鐘）、24小時（±10分鐘）、48小時（±20分鐘）、72小時（±20分鐘）、120小時（±30分鐘）、168小時（±30分鐘）分別從頸靜脈採集大鼠全血。之後全血樣品於2~8^o C在離心力1800×g下離心10分鐘分離血漿，血漿樣品在一管中放置約70 μL，剩餘的同一樣品放置於另一管中，二者均在-70~-86^o C凍存待檢。分別在給藥後約24、48、72、120、168小時採集大鼠肝臟組織，採集方法包括根據大鼠體重以戊巴比妥鈉麻醉（腹腔注射60 mg/kg），腹主動脈採血使大鼠安樂死，對其進行大體解剖。對各大鼠肝臟取樣，並保存在1mL凍存管中，-68^o C以下保存至檢測分析。

採用HPLC-FLD（高效液相螢光色譜法）定量檢測大鼠血漿及肝臟組織中的綴合物32的濃度，具體依據以下步驟：（1）研磨組織至組織塊不大於80mg，隨後加入組織和細胞裂解液（Tissue and Cell Lysis Solution, 供應商：Epicentre，貨號：MTC096H）配製成66.7 mg/mL的組織勻漿；（2）對組織勻漿進行超聲（150W，30s）以破碎細胞；（3）對於每組組織樣品，各取75μL組織樣品加至96孔PCR板的不同培養孔中，向每一培養孔中加入5 μL蛋白酶K（供應商：Invitrogen，貨號：25530-015）和10 μL的10wt%乙腈和0.01wt%吐溫20混合水溶液；對於每組血漿樣品，各取20 μL血漿加至96孔PCR板的不同培養孔中，向每一培養孔中加入45 μL組織和細胞裂解液，5 μL蛋白酶K和20 μL的10wt%乙腈和0.01wt%吐溫20混合液；（4）封板，置於PCR儀（供應商：Applied Biosystems，型號：GeneAmp® PCR system 9700）中，在65^o C下培養45分鐘；（5）培養結束後，向每一培養孔中加入10μL 3M KCl水溶液（供應商：Sigma-aldrich，貨號：60135-250ML），搖勻，在4℃，3200 rcf離心15分鐘，將上清液保存備用；（6）對於每組組織樣品，取80 μL前述上清液加入到120 μL雜交混合物中（配方：0.5 mL 6 μM PNA探針（供應商：杭州泰禾生物科技有限公司），1 mL 200 mM的Trizma/pH=8，5mL 8 M 脲素水溶液，3.5 mL H₂ O，2 mL乙腈）；對於每組血漿樣品，取40 μL上清液加入到160 μL雜交混合物中（配方：0.5 mL 6 μM PNA探針，1 mL 200 mM的Trizma/pH=8，5mL 8 M 脲素水溶液，7.5 mL H₂ O，2 mL乙腈）；（7）封板，置於PCR儀中，95℃培養15 分鐘；立即置於冰上5分鐘，獲得培養樣品；（8）將各培養樣品轉移至新的錐形底96孔板的不同培養孔中，搖勻，以3200 rcf離心1分鐘；（9）進樣檢測，使用HPLC-FLD定量分析（液相系統供應商：Thermo Fisher，色譜儀型號：ultimate 3000）。

分析結果參見圖3和圖4。圖3和圖4分別示出了綴合物32在大鼠血漿中PK/TK血漿濃度的經時代謝曲線以及在大鼠肝臟中PK/TK組織濃度的經時代謝曲線。

具體而言，圖3是給藥量為1mg/kg和0.5mg/kg時，綴合物32在大鼠血漿中PK/TK血漿濃度的經時代謝曲線。

圖4是給藥量為1mg/kg和0.5mg/kg時，綴合物32在大鼠肝臟中PK/TK組織濃度的經時代謝曲線。

由圖3和圖4的結果可以看出，無論是在低劑量（0.5mg/kg）還是在相對更高劑量（1mg/kg）下，綴合物32在大鼠血漿中的濃度均迅速在數小時內降低至檢測限以下；而在肝臟組織中則均在至少150h維持了較高穩定水平的濃度。由此表示，通過綴合N-6₂ 化合物，所得到的藥物綴合物能夠特異性地在肝臟中顯著富集並保持穩定，具有高度的靶向性。

實驗例2-4 本實驗說明本發明的藥物綴合物在體內（in vivo ）對HBV mRNA表達量的抑制效率

在本實驗例中，對綴合物32在HBV轉基因小鼠C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J中對HBV mRNA表達量的抑制效率進行了考察。

本實驗例中所使用的HBV轉基因小鼠C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J購自北京大學醫學部實驗動物科學部。

首先，將C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J小鼠（以下也簡稱為44Bri小鼠）按血清HBsAg含量隨機分組（均為雌性），每組4隻小鼠，給予不同劑量的綴合物32並增加PBS對照組。所有動物根據體重計算藥量，採用皮下注射方式單次給藥，各綴合物以2 mg/ml 或0.2 mg/ml（均以siRNA計）的0.9%氯化鈉水溶液形式給予，給藥體積為5 ml/kg小鼠體重，即，每一綴合物的給藥劑量（以siRNA計）為1mg/kg和0.1mg/kg。給藥後第14天將動物處死，分別收集每隻小鼠的肝臟組織，用RNA later（Sigma Aldrich公司）保存；用組織勻漿儀勻漿肝組織，再用Trizol根據總RNA提取的標準操作步驟提取得到總RNA。

對於每隻小鼠，分別取1μg總RNA，使用ImProm-IITM反轉錄試劑盒（Promega公司）按其說明書將提取的總RNA逆轉錄為cDNA，得到含cDNA的溶液，接著用螢光定量PCR試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）檢測肝組織中的HBV mRNA的表達量。在該螢光定量PCR法中，以β-肌動蛋白（β-actin）基因作為內參基因，使用針對HBV的引子（primer）和針對β-肌動蛋白的引子分別對HBV和β-肌動蛋白進行檢測。檢測引子的序列參見表3A。

表3A 檢測引子的序列

基因	上游引子	下游引子
HBV	5'- CCGTCTGTGCCTTCTCATCT -3' （SEQ ID NO：677）	5'- TAATCTCCTCCCCCAACTCC -3' （SEQ ID NO：678）
β-肌動蛋白	5'-AGCTTCTTTGCAGCTCCTTCGTTG -3' （SEQ ID NO：679）	5'-TTCTGACCCATTCCCACCATCACA -3' （SEQ ID NO：680）

採用比較Ct（ΔΔCt）法，對各測試組中目標基因的表達水平和抑制率進行相對定量計算，計算方法如下： ΔCt(測試組) = Ct(測試組目標基因) – Ct(測試組內參基因) ΔCt(對照組) = Ct(對照組目標基因) – Ct(對照組內參基因) ΔΔCt(測試組) = ΔCt(測試組) - ΔCt(對照組平均) ΔΔCt(對照組) = ΔCt(對照組) - ΔCt(對照組平均) 其中，ΔCt(對照組平均)是對照組4隻小鼠各自的ΔCt(對照組)的算術平均值。從而，測試組和對照組的每隻小鼠均對應一個ΔΔCt值。

以對照組為基準，對測試組HBV mRNA的表達水平進行歸一化，定義空白對照組HBV mRNA表達水平為100%，測試組HBV mRNA相對表達水平 = 2^-ΔΔCt (測試組) × 100% 測試組HBV mRNA抑制率 = (1-測試組HBV mRNA相對表達水平) × 100%

圖5為對照組和分別給予1mg/kg和0.1mg/kg的藥物綴合物32後，小鼠肝組織中HBV mRNA表達水平的散點圖。由圖5結果可見，綴合物32在體內實驗中顯示出優異的的對44Bri小鼠肝組織中HBV基因mRNA的抑制率，該抑制率顯示出明顯的劑量依賴性，並且在給藥後第14天時，在1mg/kg的劑量下抑制率可高達89.86%。

實驗例2-5 本實驗說明本發明的藥物綴合物在HBV轉基因小鼠中siRNA對血清HBsAg表達量以及HBV DNA表達量的抑制效率的時間相關性測試

使用M-Tg HBV小鼠，購自上海市公共衛生中心動物部，轉基因小鼠的製備方法如Ren J.等，J. Medical Virology. 2006, 78: 551-560所述；所使用的AAV病毒為rAAV8-1.3HBV，D型（ayw），購於北京五加和分子醫學研究所有限公司，1×10¹² viral genome （v.g.）/mL，批號2016123011。實驗前將AAV病毒用無菌PBS稀釋至5×10¹¹ v.g./mL。每隻小鼠注射200 μL，即每隻小鼠注射1×10¹¹ v.g.。病毒注射後第28天，所有小鼠通過眼眶採血（約100 µL）用於收集血清檢測HBsAg。動物造模成功後，按血清HBsAg含量隨機分組（每組5隻），給予綴合物32以及PBS空白對照。所有動物根據體重計算藥量，採用皮下注射方式單次給藥，各綴合物以0.2 mg/ml 或0.6 mg/ml（均以siRNA計）的0.9%氯化鈉水溶液形式給予，給藥體積為5 ml/kg小鼠體重，即，每一綴合物的給藥劑量（以siRNA計）為1mg/kg和3mg/kg。空白對照組給予5 ml/kg的1×PBS。在給藥前與給藥後第7、14、21、28、35、42、49、63、70天對小鼠眼眶靜脈叢取血，在各時間點檢測血清HBsAg水平。

眼眶取血每次約0.1ml，離心後血清不少於20μl。利用HBsAg CLIA試劑盒（安圖生物，CL0310）按照製造商提供的說明書檢測血清中HBsAg的表達水平； HBsAg抑制率按如下等式計算： HBsAg抑制率＝(1-給藥後HBsAg含量/給藥前HBsAg含量)×100%。其中，HBsAg含量用每毫升（ml）血清含多少當量（UI）HBsAg表示。

圖6是給藥後不同時間點，給予了不同劑量的綴合物32的轉基因小鼠和空白對照組的轉基因小鼠中血清中HbsAg水平的經時曲線圖。由圖6可以看出，在給藥後不同時間點，PBS陰性對照組未顯示出任何抑制作用；與之相比，不同劑量（3mg/kg、1mg/kg）的綴合物32對HBsAg均體現出了優秀的HBsAg抑制效果。特別是3mg/kg劑量下，在長達70天的時間內均顯示出高的血清HBsAg抑制率，最高可達97.80%，表示其能夠在長時間內穩定高效地抑制HBV轉基因小鼠體內HBV基因的表達。

實驗例2-6 本實驗說明本發明的綴合物在小鼠體內對HBV mRNA表達的抑制效果

在本實驗例中，關於不同濃度的綴合物32在HBV轉基因小鼠C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J中對HBV mRNA表達的抑制效率進行了考察。

首先，將C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J小鼠按血清HbsAg含量隨機分組（均為雌性，每組5隻小鼠），分別進行編號，並增加NS組作為對照組。所有動物根據體重計算藥量。分別以1mg/kg以及0.1ml/kg的劑量皮下給予綴合物32，以0.2mg/ml以及0.02mg/ml（濃度均以siRNA計）的綴合物的0.9%氯化鈉水溶液的形式給藥，給藥體積為5ml/kg。給藥後第7天將動物處死，分別收集每隻小鼠的肝臟組織，用RNA Later（Sigma Aldrich）保存；用組織勻漿儀勻漿肝組織。然後用Trizol根據總RNA提取的標準操作步驟提取得到總RNA。

採用即時螢光定量PCR檢測每隻小鼠肝組織中HBV mRNA的表達水平，具體地：使用ImProm-II^TM 反轉錄試劑盒（Promega）按其說明書將由每隻小鼠肝臟組織中提取的總RNA逆轉錄為cDNA，接著用螢光定量PCR試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）檢測肝組織中的HBV mRNA表達量並計算抑制效率。在該螢光定量PCR法中，以GAPDH基因作為內參基因，使用針對HBV的引子和針對GAPDH的引子分別對HBV和GAPDH進行檢測。

檢測引子的序列參見表4A。

採用比較Ct（ΔΔCt）法，對各測試組和對照組中目標基因HBV的表達量進行相對定量計算，計算方法如下： ΔCt(測試組) = Ct(測試組目標基因) – Ct(測試組內參基因) ΔCt(對照組) = Ct(對照組目標基因) – Ct(對照組內參基因) ΔΔCt(測試組) = ΔCt(測試組) - ΔCt(對照組平均) ΔΔCt(對照組) = ΔCt(對照組) - ΔCt(對照組平均) 其中，ΔCt(對照組平均)是對照組5隻小鼠各自的ΔCt(對照組)的算術平均值。從而，測試組和對照組的每隻小鼠均對應一個ΔΔCt值。

以對照組為基準，對測試組HBV mRNA的表達水平進行歸一化，定義對照組HBV mRNA表達水平為100%，測試組HBV mRNA相對表達水平 = 2^-ΔΔCt( ^測試組 ⁾ × 100%。

對於同一測試組siRNA，每一濃度下的測試組HBV mRNA相對表達水平平均值為該濃度三個培養孔的相對表達水平的算術平均值。

其中，對照組為本實驗中施以PBS的對照組小鼠，各測試組為分別施以不同藥物綴合物的給藥組小鼠。結果示於圖7A中：

表4A 檢測引子的序列

基因	上游引子	下游引子
HBV	5’- CGTTTCTCCTGGCTCAGTTTA -3’ （SEQ ID NO: 729）	5’- CAGCGGTAAAAAGGGACTCAA -3’ （SEQ ID NO: 730）
GAPDH	5'- AGAAGGCTGGGGCTCATTTG- 3' （SEQ ID NO: 731）	5'- AGGGGCCATCCACAGTCTTC -3' （SEQ ID NO: 1732）

圖7A為給予空白對照和不同劑量的綴合物32後，第7天時小鼠肝組織中HBV mRNA的相對表達水平的散點圖。由圖7A的結果可見，綴合物32在體內實驗中顯示出優異的的對44Bri小鼠肝組織中HBV基因mRNA的抑制率，在給藥第7天時，在1mg/kg的劑量下抑制率可高達91.96%；並且，濃度相對較高的綴合物32在體內實驗中顯示出與低濃度綴合物劑量相比明顯更高的對44Bri乙肝小鼠肝組織中HBV基因mRNA的抑制率。

使用同樣的步驟，對劑量為1mg/kg和0.1mg/kg的綴合物38、39和40（X2-siHBa1M2SVP、W2-siHBa1M2SVP和V2-siHBa1M2SVP）進行了測試，區別僅在於，所使用的綴合物分別為綴合物38、39和40。結果示於圖7B中。

圖7B為給予空白對照和不同劑量的綴合物38、39和40後，第7天時小鼠肝組織中HBV mRNA的相對表達水平的散點圖。由圖7B的結果可見，本發明的不同綴合物在體內實驗中均顯示出優異的的對44Bri小鼠肝組織中HBV基因mRNA的抑制率，在給藥第7天時，在1mg/kg的劑量下抑制率可高達90.37-95.03%。

實驗例2-7 本實驗說明綴合物32在HBV轉基因小鼠血清中對HBsAg表達和HBV DNA的抑制效率的時間相關性測試

使用AAV-HBV低濃度模型小鼠。成功建立動物模型之後，按血清HBsAg含量隨機分組（每組5隻小鼠）。每組分別給予兩組不同劑量的綴合物32，PBS用作空白對照。所有動物根據體重計算藥量。採用皮下注射的方式單次給藥，給藥劑量為3mg/kg或1mg/kg兩個組別，使用濃度分別為0.6mg/ml或0.2mg/ml的綴合物的0.9%氯化鈉水溶液，給藥體積為5ml/kg。空白組僅給予5ml/kg的1×PBS。在給藥前與給藥後第14、28、42、56、70、84、98、112、126、140、154、168、182、196天對小鼠眼眶靜脈叢取血，在各時間點檢測血清HBsAg水平。

眼眶取血每次約100μl，離心後血清不少於20μl。利用HBsAg CLIA試劑盒（安圖生物，CL0310）按照製造商提供的說明書檢測血清中HBsAg的含量；參照QIAamp 96 DNA Blood Kit說明書提取血清中DNA，進行定量PCR，檢測HBV DNA的表達水平。

標準化的HBsAg的表達水平=（給藥後HBsAg含量/給藥前HBsAg含量）×100%。

HBsAg抑制率＝(1-給藥後HBsAg含量/給藥前HBsAg含量)×100%。其中，HBsAg含量用每毫升（ml）血清含多少當量（UI）HBsAg表示。

標準化的HBV DNA的表達水平=(給藥後HBV DNA含量/給藥前HBV DNA含量)×100%。

HBV DNA抑制率＝(1-給藥後HBV DNA含量/給藥前HBV DNA含量)×100%。

其中，HBV DNA含量用每毫升（ml）血清含多少拷貝HBV DNA表示。

圖 8A和圖8B分別是示出了給予不同劑量的綴合物32或PBS後，HBV轉基因小鼠體內HBsAg和HBV DNA相對水平的曲線圖。由圖8A和圖8B的結果可以看出，在給藥後不同時間點，NS陰性對照組未顯示出抑制作用；與之相比，濃度為3mg/kg綴合物32在給藥後長達100天的期間內，在不同時間點均體現出了高的HBsAg抑制率和優異的HBV DNA抑制效果，給藥劑量為3mg/kg的綴合物32對血清HBsAg的抑制率最高可達90.9%、HBV DNA抑制率最高可達85.7%，且其抑制效果在不同時間點均高於較低濃度1mg/kg的綴合物32的抑制效果，表示其能夠在較長時間內穩定高效地抑制HBV基因的表達。

在進一步的實驗中，按照上述實施例6的檢測方法，對第70天時的HBV mRNA抑制效果進行了檢驗，結果示於圖9中。

由圖9可知，在給藥後第70天，不同濃度的綴合物32仍然能夠在一定程度上抑制HBV mRNA的表達量，因此顯示出在長期起效方面的特殊應用前景。

[實驗例3 表2B的藥物綴合物的效果實驗]

實驗例3-1 本實驗說明表2B的藥物綴合物在HepG2.2.15細胞中對HBV mRNA表達量的抑制效率。

用H-DMEM完全培養基將HepG2.2.15細胞以7 × 10⁴ 細胞/孔接種於24孔板中，16h後細胞生長密度達到70-80%時，吸盡培養孔中H-DMEM完全培養基，每孔加入500μl Opti-MEM培養基（GIBCO公司）繼續培養1.5h。

用DEPC化水將綴合物43-64和對比綴合物1中的每一個分別配製成50 μM、5 μM和0.5 μM（濃度均以siRNA計算）的共3種不同濃度的藥物綴合物工作液。對於每一個藥物綴合物，分別配製3A1-3A3溶液，每份3A1-3A3溶液依次含有上述3個濃度的藥物綴合物工作液0.6 μl和Opti-MEM培養基50 μl。

配製3B溶液，每份3B溶液含有1 μl Lipofectamine™ 2000和50 μl Opti-MEM培養基。

分別將一份3B溶液與得到的每個藥物綴合物的3A1、3A2或3A3溶液混合，分別室溫下培養20min，得到每個siRNA的轉染複合物3X1、3X2或3X3。

將一份3B溶液與Opti-MEM培養基50 μl混合，室溫下培養20min，得到轉染複合物3X4。

在培養孔中，分別加入每一個藥物綴合物的轉染複合物3X1、3X2或3X3，均勻混合，加入量為100 μl/孔，得到每個siRNA終濃度分別約為50 nM、5 nM或0.5 nM的轉染複合物，每個轉染複合物分別轉染3個培養孔，得到含藥物綴合物的轉染混合物，記為測試組。

在另外3個培養孔中，分別加入轉染複合物3X4，加入量為100 μl/孔，得到不含siRNA的轉染混合物，記為空白對照組。

將含藥物綴合物的轉染混合物和不含藥物綴合物的轉染混合物在培養孔中培養4h後，每孔補加1ml 含20% FBS的H-DMEM完全培養基。將24孔板置於CO₂ 培養箱繼續培養24h。

隨後，使用RNeasy Mini Kit（QIAGEN公司，貨號Cat.74106）試劑盒，根據說明書描述的詳細步驟提取各孔細胞中的總RNA。

對於每孔細胞，分別取1 μg總RNA，使用反轉錄試劑盒GoldenstarTM RT6 cDNA Synthesis Kit（購自北京擎科新業生物技術有限公司，貨號TSK301M）提供的試劑，其中選取GoldenstarTM Oligo (dT)17作為引子，按試劑盒說明書中反轉錄操作步驟配置反轉錄反應體系20 μl，對細胞的總RNA進行反轉錄。反轉錄的條件為：將反轉錄反應體系置於50^o C培養50min，然後85^o C培養5min，最後4^o C培養30s，反應結束後，向反轉錄反應體系中加入DEPC水80 μl，得到含cDNA的溶液。

對於每一反轉錄反應體系，分別取上述含cDNA的溶液5μl做範本，使用NovoStart^® SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒（購自近岸蛋白質科技有限公司，貨號E096-01B）提供的試劑配置qPCR反應體系20μl，其中，用於擴增目標基因HBV和內參基因GAPDH的PCR引子序列如表3B所示，每條引子的終濃度為0.25μM。將各qPCR反應體系置於ABI StepOnePlus Real-Time PCR儀上，使用三步法進行擴增，擴增程式為95^o C預變性10min，然後95^o C變性30s，60^o C退火30s，72^o C延伸30s，重複上述變性、退火、延伸的過程共40次後，得到含有擴增了目標基因HBV和內參基因GAPDH的產物W1。產物W1隨即依次經過95^o C 15s，60^o C 1min，95^o C 15s的培養，即時螢光定量PCR儀分別收集產物W1中目標基因HBV和內參基因GAPDH的溶解曲線，得到目標基因HBV和內參基因GAPDH的Ct值。

表3B 檢測引子的序列

基因	上游引子	下游引子
HBV	5'- CGTTTCTCCTGGCTCAGTTTA - 3' （SEQ ID NO: 681）	5'- CAGCGGTAAAAAGGGACTCAA -3' （SEQ ID NO: 682）
GAPDH	5'- AGAAGGCTGGGGCTCATTTG- 3' （SEQ ID NO: 683）	5'- AGGGGCCATCCACAGTCTTC -3' （SEQ ID NO: 684）

採用比較Ct（ΔΔCt）法，對各測試組和對照組中目標基因HBV的表達量進行相對定量計算，計算方法如下： ΔCt(測試組) = Ct(測試組目標基因) – Ct(測試組內參基因) ΔCt(對照組) = Ct(對照組目標基因) – Ct(對照組內參基因) ΔΔCt(測試組) = ΔCt(測試組) - ΔCt(對照組平均) ΔΔCt(對照組) = ΔCt(對照組) - ΔCt(對照組平均) 其中，ΔCt(對照組平均)是對照組三個培養孔各自的ΔCt(對照組)的算術平均值。從而，測試組和對照組的每一培養孔均對應一個ΔΔCt值。

其中，各測試組為分別經表2B中所列的藥物綴合物處理的HepG2.2.15細胞，所述藥物綴合物包括綴合物43-64的藥物綴合物和對比綴合物1的對照藥物綴合物。

以下表4B示出了表2B中所列的測試藥物綴合物與對照藥物綴合物在HepG2.2.15細胞中對HBV mRNA表達抑制活性的檢測結果。

表4B 不同濃度藥物綴合物的體外HBV mRNA抑制率

綴合物序號	綴合物編號	mRNA抑制率（%）
50nM	10nM	1nM
綴合物43	N6-siHBb1M1S	54.1	40.2	24.9
綴合物44	N6-siHBb2M1S	53.9	37.5	29.2
綴合物45	N6-siHBb1M2	54.3	35.5	26.5
綴合物46	N6-siHBb2M2	52.2	38.5	27.1
綴合物47	N6-siHBb1M1SVP	55.2	48.2	28.7
綴合物48	N6-siHBb2M1SP	55.0	48.0	28.6
綴合物49	N6-siHBb2M1SPs	54.9	47.8	28.4
綴合物50	N6-siHBb3M1S	54.0	47.5	28.0
綴合物51	N6-siHBb2M1SVP	54.1	48.3	30.8
綴合物52	N6-siHBb1M2SVP	52.0	38.2	29.2
綴合物53	N6-siHBb2M2SVP	53.2	37.3	27.2
綴合物54	N6-siHBb1M5SVP	52.2	36.4	25.6
綴合物55	N6-siHBb1M3SVP	43.0	28.4	21.1
綴合物56	N6-siHBb1M4SVP	39.4	25.2	17.1
綴合物57	N6-siHBb4M1SVP	53.5	36.4	24.2
綴合物58	N6-siHBb1	57.4	45.1	32.3
綴合物59	N6-siHBb2	56.5	49.9	29.3
綴合物60	X2-siHBb2M1SVP	54.5	49.2	30.6
綴合物61	W2-siHBb2M1SVP	54.4	48.6	30.4
綴合物62	V2-siHBb2M1SVP	54.2	48.5	30.2
綴合物63	O2-siHBb2M1SVP	54.2	48.8	30.4
綴合物64	P2-siHBb2M1SVP	54.1	48.5	30.2
對比綴合物1	N6-NC	2.1	1.5	-2.8

從表4B的結果可以看出，表2B中的各個藥物綴合物在體外HepG2.2.15細胞中具有很高的HBV mRNA抑制活性，在siRNA濃度為50 nM時最高可達到57.4%的HBV mRNA抑制率。

實驗例3-2 本實驗說明表2B的藥物綴合物在體外人血漿中的穩定性

將綴合物43-57、60-64的藥物綴合物（以siRNA濃度為20 μM的0.9 wt%氯化鈉水溶液形式提供，每組12μl）分別與108 μL 90%人血漿（Human plasma，購自江蘇省血液研究所，以1×PBS（pH7.4）稀釋）混勻，獲得混合液，在37^o C恆溫培養。分別在0、8、24、48小時取出10 μL混合液，立即進行液氮速凍於-80^o C冰箱中凍存。其中，0小時是指綴合物溶液與90%人血漿混勻後，立即取出10μL混合液的時刻。待各時間點取樣完畢後，用1×PBS（pH7.4）將各混合液稀釋5倍後，取每一稀釋混合液10 μL準備電泳。同時，分別將等莫耳量的上述綴合物溶液（以siRNA計的濃度為2 μM）2 μl與8 μl 1×PBS（pH7.4）混勻，製備成10 μL未經人血漿處理的樣品，記為未處理，準備電泳。

配製20重量%的非變性聚丙烯醯胺凝膠，將每一組的上述準備電泳的樣品分別與4 μL上樣緩衝液（20mM EDTA，36重量%甘油，0.06重量%溴酚藍）混合，然後上樣至各凝膠孔，在80mA恒流條件下電泳60分鐘左右。電泳結束後，取出凝膠，用1×Sybr Gold染料（Invitrogen，Cat.11494）染色15分鐘後成像並計算穩定性結果，結果如表5B所示。

表5B示出了表2B中所列的藥物綴合物在體外人血漿中的穩定性半定量檢測結果。該結果以藥物綴合物與人血漿培養後殘留的最長片段與未經處理的siRNA最長片段的比例（RL）表示。

表5B 不同藥物綴合物隨時間的血漿穩定性

綴合物序號	綴合物編號	RL（%）
未處理	0h	8h	24h	48h
綴合物43	N6-siHBb1M1S	100	100	99.6	96.0	94.7
綴合物44	N6-siHBb2M1S	100	100	99.7	96.2	94.7
綴合物45	N6-siHBb1M2	100	100	99.6	96.1	94.8
綴合物46	N6-siHBb2M2	100	100	99.4	96.7	95.3
綴合物47	N6-siHBb1M1SVP	100	100	99.3	96.5	95.5
綴合物48	N6-siHBb2M1SP	100	100	99.2	96.2	95.1
綴合物49	N6-siHBb2M1SPs	100	100	99.5	96.1	95.2
綴合物50	N6-siHBb3M1S	100	100	99.2	96.0	94.9
綴合物51	N6-siHBb2M1SVP	100	100	99.7	96.7	95.8
綴合物52	N6-siHBb1M2SVP	100	100	99.7	97.1	95.1
綴合物53	N6-siHBb2M2SVP	100	100	99.4	96.4	95.5
綴合物54	N6-siHBb1M5SVP	100	100	99.7	95.5	94.6
綴合物55	N6-siHBb1M3SVP	100	100	99.7	96.4	96.3
綴合物56	N6-siHBb1M4SVP	100	100	99.5	97.3	94.4
綴合物57	N6-siHBb4M1SVP	100	100	99.6	97.1	94.3
綴合物60	X2-siHBb2M1SVP	100	100	99.8	96.3	94.4
綴合物61	W2-siHBb2M1SVP	100	100	99.5	96.6	94.5
綴合物62	V2-siHBb2M1SVP	100	100	99.4	97.1	94.8
綴合物63	O2-siHBb2M1SVP	100	100	99.6	96.1	95.2
綴合物64	P2-siHBb2M1SVP	100	100	99.7	95.7	95.0

由表5B的結果可以看出，各個藥物綴合物在人血漿中均顯示出優異的穩定性。

實驗例3-3 本實驗說明表2B的藥物綴合物在體內（in vivo）對HBV mRNA表達量的抑制效率

在本實驗例中，對綴合物43-57和60-64的藥物綴合物在HBV轉基因小鼠C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J中對HBV mRNA表達量的抑制效率進行了考察。

首先，將C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J小鼠按血清HbsAg含量隨機分組（均為雌性），每組5隻小鼠，按照表2B中的藥物綴合物進行編號，並增加PBS對照組。所有動物根據體重計算藥量，採用皮下注射方式單次給藥，各綴合物以0.2 mg/ml（均以siRNA計）的0.9%氯化鈉水溶液形式給予，給藥體積為5 ml/kg小鼠體重，即，每一綴合物的給藥劑量（以siRNA計）為1mg/kg。對於對照組的每隻小鼠，僅給予5 ml/kg的1×PBS。給藥後第14天將動物處死，分別收集每隻小鼠的肝臟組織，用RNA later（Sigma Aldrich公司）保存；用組織勻漿儀勻漿肝組織，再用Trizol根據總RNA提取的標準操作步驟提取得到總RNA。

對於每隻小鼠的肝臟組織，分別取1μg總RNA，使用ImProm-IITM反轉錄試劑盒（Promega公司）按其說明書將提取的總RNA逆轉錄為cDNA，得到含cDNA的溶液，接著用螢光定量PCR試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）檢測肝組織中的HBV mRNA的表達量。在該螢光定量PCR法中，以β-肌動蛋白（β-actin）基因作為內參基因，使用針對HBV的引子和針對β-肌動蛋白的引子分別對HBV和β-肌動蛋白進行檢測。檢測引子的序列參見表6B。

表6B 檢測引子的序列

基因	上游引子	下游引子
HBV	5’- CGTTTCTCCTGGCTCAGTTTA -3’ （SEQ ID NO: 685）	5’- CAGCGGTAAAAAGGGACTCAA -3’ （SEQ ID NO: 686）
β-actin	5'- AGCTTCTTTGCAGCTCCTTCGTTG -3' （SEQ ID NO: 687）	5'- TTCTGACCCATTCCCACCATCACA-3' （SEQ ID NO: 688）

以對照組為基準，對測試組HBV mRNA的表達水平進行歸一化，定義空白對照組HBV mRNA表達水平為100%，測試組HBV mRNA相對表達水平 = 2^-ΔΔCt( ^測試組 ⁾ × 100% 測試組HBV mRNA抑制率 = (1-測試組HBV mRNA相對表達水平) × 100%

表7B示出了對照組和分別給予1mg/kg的藥物綴合物43-64後，小鼠肝組織中HBV mRNA的抑制率。

表7B 藥物綴合物在小鼠肝臟中HBV mRNA表達的抑制

綴合物序號	綴合物編號	給藥劑量（mg/kg）	肝臟HBV mRNA抑制率（%）
綴合物43	N6-siHBb1M1S	1	79.4
綴合物44	N6-siHBb2M1S	1	84.2
綴合物45	N6-siHBb1M2	1	80.0
綴合物46	N6-siHBb2M2	1	84.5
綴合物47	N6-siHBb1M1SVP	1	82.2
綴合物48	N6-siHBb2M1SP	1	88.5
綴合物49	N6-siHBb2M1SPs	1	82.0
綴合物50	N6-siHBb3M1S	1	79.0
綴合物51	N6-siHBb2M1SVP	1	88.2
綴合物52	N6-siHBb1M2SVP	1	78.7
綴合物53	N6-siHBb2M2SVP	1	85.4
綴合物54	N6-siHBb1M5SVP	1	76.1
綴合物55	N6-siHBb1M3SVP	1	68.3
綴合物56	N6-siHBb1M4SVP	1	68.6
綴合物57	N6-siHBb4M1SVP	1	86.0
綴合物60	X2-siHBb2M1SVP	1	86.1
綴合物61	W2-siHBb2M1SVP	1	86.4
綴合物62	V2-siHBb2M1SVP	1	86.5
綴合物63	O2-siHBb2M1SVP	1	86.8
綴合物64	P2-siHBb2M1SVP	1	86.2
PBS	-	NA	NA

由上述結果可見，本發明各個實施例的綴合物均顯示出了高的小鼠體內HBV mRNA抑制活性，在1 mg/kg的劑量下， HBV mRNA抑制率最高可達88.5%。

實驗例3-4 本實驗說明表2B的藥物綴合物在HBV轉基因小鼠中siRNA對血清HBsAg表達量和HBV DNA的抑制效率的時間相關性測試

按照文獻方法（董小岩等，Chin J Biotech 2010, May 25; 26(5): 679-686）製備AAV-HBV模型，rAAV8-1.3HBV，D型（ayw），購於北京五加和分子醫學研究所有限公司，1×10¹² viral genome （v.g.）/mL，批號2016123011。實驗前將AAV病毒用無菌PBS稀釋至5×10¹¹ v.g./mL。每隻小鼠注射200 μL，即每隻小鼠注射1×10¹¹ v.g.。病毒注射後第28天，所有小鼠通過眼眶採血（約100 µL）用於收集血清檢測HBsAg和HBV DNA。動物造模成功後，按血清HBsAg含量隨機分組（每組5隻），分別給予綴合物43-49、52-53、57和60-64的藥物綴合物，以及PBS空白對照。所有動物根據體重計算藥量，採用皮下注射方式單次給藥，各綴合物以0.6 mg/ml（均以siRNA計）的0.9%氯化鈉水溶液形式給予，給藥體積為5 ml/kg小鼠體重，即，每一綴合物的給藥劑量（以siRNA計）為3mg/kg。空白對照組的每隻小鼠僅給予5 ml/kg小鼠體重的1×PBS。在給藥前與給藥後第7、14、21、28、56、84天對小鼠眼眶靜脈叢取血，在各時間點檢測血清HBsAg水平。

眼眶取血每次約100 μl，離心後血清不少於20μl。利用HBsAg CLIA試劑盒（安圖生物，CL0310）按照製造商提供的說明書檢測血清中HBsAg的表達水平；參照QIAamp 96 DNA Blood Kit說明書提取血清中DNA，進行定量PCR，檢測HBV DNA的表達水平。

HBsAg抑制率按如下等式計算： HBsAg抑制率＝(1-給藥後HBsAg含量/給藥前HBsAg含量)×100%。其中，HBsAg含量用每毫升（ml）血清含多少當量（UI）HBsAg表示。

HBV DNA抑制率按如下等式計算： HBV DNA抑制率＝(1-給藥後HBV DNA含量/給藥前HBV DNA含量)×100%。其中，HBV DNA含量用每毫升（ml）血清含多少拷貝HBV DNA表示。

表8B和9B分別示出了給予不同劑量的各藥物綴合物或PBS後，HBV轉基因小鼠體內HBsAg和HBV DNA抑制率。表8B 藥物綴合物在小鼠血清中HBsAg表達的抑制

綴合物序號	綴合物編號	血清HBsAg抑制率（%）
D7	D14	D21	D28	D56	D84
綴合物43	N6-siHBb1M1S	93.1	93.2	92.6	88.3	81.4	73.4
綴合物44	N6-siHBb2M1S	93.8	94.6	93.6	90.1	82.6	79.4
綴合物45	N6-siHBb1M2	93.5	94.3	93.1	85.7	78.8	71.7
綴合物46	N6-siHBb2M2	94.4	94.9	94.2	87.6	79.2	76.1
綴合物47	N6-siHBb1M1SVP	95.3	95.6	95.1	94.8	91.9	85.6
綴合物48	N6-siHBb2M1SP	95.3	96.8	98.1	96.3	94.7	89.2
綴合物49	N6-siHBb2M1SPs	95.4	95.6	95.2	94.9	89.6	82.5
綴合物52	N6-siHBb1M2SVP	94.5	95.8	94.9	93.6	89.2	83.5
綴合物53	N6-siHBb2M2SVP	95.7	96.5	96.8	95.3	91.4	84.8
綴合物57	N6-siHBb4M1SVP	94.7	95.0	94.2	93.1	90.3	84.2
綴合物60	X2-siHBb2M1SVP	93.2	94.0	93.4	92.9	87.5	80.1
綴合物61	W2-siHBb2M1SVP	93.7	94.1	93.3	91.9	86.4	79.8
綴合物62	V2-siHBb2M1SVP	93.6	94.3	93.5	91.7	86.8	80.6
綴合物63	O2-siHBb2M1SVP	93.8	94.8	93.1	92.1	87.1	79.8
綴合物64	P2-siHBb2M1SVP	93.6	94.5	93.0	91.8	86.2	79.9
-	PBS	1.8	-9.3	-11.5	-8.9	-42.1	-103.5

由表8B的結果可以看出，在給藥後不同時間點，PBS陰性對照組未顯示出任何抑制作用；與之相比，各藥物綴合物在給藥後不同時間點對HBsAg均體現出了優異的HBsAg抑制效果。特別是綴合物47-53和57的藥物綴合物在長達84天的時間內持續顯示出高的血清HBsAg抑制率，抑制率最高可達98.1%，表示其能夠在較長時間內穩定高效地抑制HBV基因的表達。

表9B 藥物綴合物在小鼠血清中HBV DNA表達的抑制

綴合物序號	綴合物編號	血清HBV DNA抑制率（%）
D7	D14	D21	D28	D56	D84
綴合物43	N6-siHBb1M1S	74.3	91.2	90.2	82.4	75.2	67.2
綴合物44	N6-siHBb2M1S	74.2	90.8	90.4	83.5	73.2	67.3.3
綴合物45	N6-siHBb1M2	75.5	91.3	90.5	79.4	72.5	63.8
綴合物46	N6-siHBb2M2	74.6	91.4	90.6	81.6	73.8	65.4
綴合物47	N6-siHBb1M1SVP	76.2	92.6	90.8	85.6	78.4	70.1
綴合物48	N6-siHBb2M1SP	76.6	92.1	90.1	86.4	82.1	75.3
綴合物49	N6-siHBb2M1SPs	76.0	92.3	90.3	82.5	78.6	69.1
綴合物52	N6-siHBb1M2SVP	75.7	91.9	89.9	82.1	79.5	69.4
綴合物53	N6-siHBb2M2SVP	76.2	93.2	90.1	82.6	79.8	70.2
綴合物57	N6-siHBb4M1SVP	76.4	93.5	90.3	81.8	81.2	73.1
綴合物60	X2-siHBb2M1SVP	76.5	92.4	90.1	82.5	79.4	69.5
綴合物61	W2-siHBb2M1SVP	76.3	92.4	90.6	85.1	82.1	73.4
綴合物62	V2-siHBb2M1SVP	76.2	91.8	90.1	85.3	81.6	73.4
綴合物63	O2-siHBb2M1SVP	76.1	92.1	90.2	84.2	81.7	73.9
綴合物64	P2-siHBb2M1SVP	76.8	91.0	89.7	83.4	81.9	72.1
-	PBS	1.7	-8.5	-11.4	-18.4	-42.1	-80.5

由表9B可以看出，與HBsAg抑制效果類似地，各實施例的藥物綴合物同樣顯示出高效的HBV DNA表達抑制，抑制率最高可達93.5%，並且在長達84天的時間內抑制率保持基本穩定。

[實驗例4 表2C的藥物綴合物的效果試驗]

實驗例4-1 本發明提供的藥物綴合物在HepG2.2.15細胞中對HBV mRNA表達量的抑制效率檢測。

用DEPC化水將下面的藥物綴合物中的每一個藥物綴合物分別配製成50 μM、5 μM和0.5 μM的共3種不同濃度的藥物綴合物工作液，所用藥物綴合物分別為表4C中列出的各綴合物。

對於每一個siRNA,分別配製4A1、4A2和4A3溶液，每份4A1-4A3溶液依次含有上述3個濃度的siRNA工作液0.6 μl和Opti-MEM培養基50 μl。

配製4B溶液，每份4B溶液含有1 μl Lipofectamine™ 2000和50μl Opti-MEM培養基。

分別將一份4B溶液與得到的一份每個siRNA的4A1、4A2或4A3溶液混合，分別在室溫下培養20min，得到每個siRNA的轉染複合物4X1、4X2和4X3。

將一份4B溶液與Opti-MEM培養基50μl混合，室溫下培養20min，得到轉染複合物4X4。

在培養孔中，分別加入每一個藥物綴合物的轉染複合物4X1、4X2或4X3，均勻混合，加入量為100 μl/孔，得到每個藥物綴合物終濃度分別約為50 nM、5 nM和0.5 nM的轉染化混合物，每個轉染複合物分別轉染3個培養孔，得到含藥物綴合物的轉染混合物，記為測試組。

在另外3個培養孔中，分別加入轉染複合物4X4，加入量為100 μl/孔，得到不含藥物綴合物的轉染混合物，記為對照組。

對於每孔細胞，分別取1μg總RNA，使用反轉錄試劑盒Goldenstar^TM RT6 cDNA Synthesis Kit（購自北京擎科新業生物技術有限公司，貨號TSK301M）提供的試劑，其中選取Goldenstar^TM Oligo (dT)₁₇ 作為引子，按試劑盒說明書中反轉錄操作步驟配置反轉錄反應體系20μl，對細胞的總RNA進行反轉錄。反轉錄的條件為：將反轉錄反應體系置於50^o C培養50min，然後85^o C培養5min，最後4^o C培養30s，反應結束後，向反轉錄反應體系中加入DEPC水80μl，得到含cDNA的溶液。

對於每一反轉錄反應體系，分別取上述含cDNA的溶液5μl做範本，使用NovoStart^® SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒（購自近岸蛋白質科技有限公司，貨號E096-01B）提供的試劑配置qPCR反應體系20μl，其中，用於擴增目標基因HBV和內參基因GAPDH的PCR引子序列如表3A所示，每條引子的終濃度為0.25μM。將各qPCR反應體系置於ABI StepOnePlus Real-Time PCR儀上，使用三步法進行擴增，擴增程式為95^o C預變性10min，然後95^o C變性30s，60^o C退火30s，72^o C延伸30s，重複上述變性、退火、延伸的過程共40次後，得到含有擴增了目標基因HBV和內參基因GAPDH的產物W1。產物W1隨即依次經過95^o C 15s，60^o C 1min，95^o C 15s的培養，即時螢光定量PCR儀分別收集產物W1中目標基因HBV和內參基因GAPDH的溶解曲線，得到目標基因HBV和內參基因GAPDH的Ct值。

其中，各測試組為分別經表2C中所列的藥物綴合物處理的HepG2.2.15細胞，所述藥物綴合物包括綴合物65-81和對比綴合物1。

以下表4C示出了表2C中所列的綴合物藥物綴合物與對比綴合物1在HepG2.2.15細胞中對HBV mRNA表達抑制活性的檢測結果。

表4C 不同濃度藥物綴合物的體外HBV mRNA抑制率

綴合物序號	綴合物編號	mRNA抑制率（%）
50nM	10nM	1nM
綴合物65	N6-siHBc1	53.5	39.2	22.3
綴合物66	N6-siHBc1M1	53.3	38.1	27.5
綴合物67	N6-siHBc1M2	53.8	36.2	24.6
綴合物68	N6-siHBc1M1SVP	53.1	37.6	25.8
綴合物69	N6-siHBc1M2SVP	54.2	47.1	27.1
綴合物70	N6-siHBc1M3SVP	54.6	26.5	18.3
綴合物71	N6-siHBc1M4SVP	55.2	25.8	18.0
綴合物72	N6-siHBc1M5SVP	54.3	42.1	26.2
綴合物73	N6-siHBc2M1SVP	53.6	43.2	27.1
綴合物74	N6-siHBc1M1SP	52.8	44.1	28.0
綴合物75	N6-siHBc1M1SPs	53.3	44.6	26.6
綴合物76	N6-siHBc4M1S	52.9	44.2	26.9
綴合物77	X2-siHBc1M1SVP	55.2	42.6	27.3
綴合物78	W2-siHBc1M1SVP	54.9	41.2	28.3
綴合物79	V2-siHBc1M1SVP	54.9	41.6	26.4
綴合物80	O2-siHBc1M1SVP	54.1	45.2	25.9
綴合物81	P2-siHBc1M1SVP	53.8	46.3	28.1
對比綴合物1	N6-NC	2.0	1.7	-2.6

從表4C的結果可見，本發明提供的藥物綴合物在體外HepG2.2.15細胞中具有很高的HBV mRNA抑制活性，在siRNA濃度為50 nM時可達到55.2%的HBV mRNA抑制率。

實驗例4-2 本發明提供的藥物綴合物在體外人血漿中的穩定性

將藥物綴合物中的每一個藥物綴合物（以siRNA計算的濃度均為20μM的0.9 wt%氯化鈉水溶液提供，每組12μl）分別與108 μL 90%人血漿（Human plasma，購自江蘇省血液研究所，以1×PBS（pH7.4）稀釋）混勻，獲得混合液，所用藥物綴合物分別為表5C中列出的各綴合物。在37^o C恆溫培養。分別在0、8、24、48小時取出10 μL樣本，立即進行液氮速凍於-80^o C冰箱中凍存。其中，0小時是指綴合物溶液與90%人血漿混勻後，立即取出10μL混合液的時刻。待各時間點取樣完畢後，用1×PBS（pH7.4）將各混合液稀釋5倍後，每一混合液各取10 μL準備電泳。分別將等莫耳量的上述綴合物溶液（以siRNA計的濃度為2 μM）2 μl與8 μl 1×PBS（pH7.4）混勻，製備成10 μL未經人血漿處理的樣品，記為未處理，準備電泳。

配製20重量%的非變性聚丙烯醯胺凝膠，將每一組的上述準備電泳的樣品分別與4 μL上樣緩衝液（20mM EDTA，36重量%甘油，0.06重量%溴酚藍）混合，然後上樣至各凝膠孔，在80mA恒流條件下電泳60分鐘左右。電泳結束後，取出凝膠，用1×Sybr Gold染料（Invitrogen，Cat.11494）染色15分鐘後成像並計算穩定性結果，結果如表5C所示。

表5C示出了表2C中所列的藥物綴合物在體外人血漿中的穩定性半定量檢測結果。該結果以藥物綴合物與人血漿培養後殘留的最長片段與未經處理的siRNA最長片段的比例（RL）表示。

表5C 不同藥物綴合物隨時間的血漿穩定性

綴合物序號	綴合物編號	RL（%）
未處理	0h	8h	24h	48h
綴合物66	N6-siHBc1M1	100	100	99.5	96.2	94.2
綴合物67	N6-siHBc1M2	100	100	99.5	96.4	94.1
綴合物68	N6-siHBc1M1SVP	100	100	99.2	96.0	94.0
綴合物69	N6-siHBc1M2SVP	100	100	99.1	96.2	95.0
綴合物70	N6-siHBc1M3SVP	100	100	99.5	96.7	95.2
綴合物71	N6-siHBc1M4SVP	100	100	99.4	96.0	94.8
綴合物72	N6-siHBc1M5SVP	100	100	99.2	95.8	95.1
綴合物73	N6-siHBc2M1SVP	100	100	99.0	96.3	94.5
綴合物74	N6-siHBc1M1SP	100	100	99.6	96.2	95.2
綴合物75	N6-siHBc1M1SPs	100	100	99.5	96.1	94.6
綴合物76	N6-siHBc4M1S	100	100	99.1	95.4	95.1
綴合物77	X2-siHBc1M1SVP	100	100	99.5	95.3	94.2
綴合物78	W2-siHBc1M1SVP	100	100	99.4	96.0	94.1
綴合物79	V2-siHBc1M1SVP	100	100	99.1	96.1	94.2
綴合物80	O2-siHBc1M1SVP	100	100	99.2	95.1	95.0
綴合物81	P2-siHBc1M1SVP	100	100	99.5	95.2	94.5

由表5C的結果可見，本發明提供的藥物綴合物在血漿中均顯示出優異的穩定性，在48h仍均具有高於94%的siRNA片段長度比例。

實驗例4-3 本發明提供的藥物綴合物在體內（in vivo）中對HBV mRNA表達量的抑制效率檢測。

本實驗例中所使用的HBV轉基因小鼠C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J購自北京大學醫學部實驗動物科學部，將C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J小鼠按血清HbsAg含量隨機分組（均為雌性），每組5隻小鼠，按照表2C中的藥物綴合物對每組小鼠進行編號，然後分別向每組小鼠給予表7C中的各待測綴合物。所有動物根據體重計算藥量，採用皮下注射方式單次給藥，各綴合物以0.2 mg/ml的0.9%氯化鈉水溶液形式給予，給藥體積為5 ml/kg小鼠體重，即，每一綴合物的給藥劑量為1 mg/kg。

對另外一組小鼠中的每隻給予1×PBS，給藥體積均為5ml/kg，作為對照組。

給藥後第14天處死動物，分別收集每隻小鼠的肝臟組織，用RNA later（Sigma Aldrich公司）保存；用組織勻漿儀勻漿肝組織，再用Trizol（Thermo Fisher公司）根據說明書描述的操作步驟提取得到總RNA。

對於每隻小鼠的肝臟組織，分別取1μg總RNA，使用ImProm-IITM反轉錄試劑盒（Promega公司）按其說明書將提取的總RNA逆轉錄為cDNA，得到含cDNA的溶液，接著用螢光定量PCR試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）檢測肝組織中的HBV mRNA的表達量。在該螢光定量PCR法中，以β-肌動蛋白（β-actin）基因作為內參基因，使用針對HBV的引子和針對β-肌動蛋白的引子分別對HBV和β-肌動蛋白進行檢測。檢測引子的序列參見表6A所示。

採用比較Ct（ΔΔCt）法，對各測試組和對照組中目標基因HBV的表達量進行相對定量計算，計算方法如下： ΔCt(測試組) = Ct(測試組目標基因) – Ct(測試組內參基因) ΔCt(對照組) = Ct(對照組目標基因) – Ct(對照組內參基因) ΔΔCt(測試組) = ΔCt(測試組) - ΔCt(對照組平均) ΔΔCt(對照組) = ΔCt(對照組) - ΔCt(對照組平均) 其中，ΔCt(對照組平均)是對照組三個培養孔各自的ΔCt(對照組)的算術平均值。從而，測試組和對照組的每隻小鼠均對應一個ΔΔCt值。

對於同一測試組siRNA，每一濃度下的測試組HBV mRNA相對表達水平平均值為該濃度5隻小鼠的相對表達水平的算術平均值。

其中，對照組為本實驗中施以PBS的對照組小鼠，各測試組為分別施以不同藥物綴合物的給藥組小鼠。結果示於以下表7C中。

表7C 不同藥物綴合物在小鼠肝臟中的HBV mRNA抑制率

綴合物序號	綴合物編號	給藥劑量（mg/kg）	肝臟HBV mRNA抑制率（%）
綴合物66	N6-siHBc1M1	1	78.2
綴合物67	N6-siHBc1M2	1	82.3
綴合物68	N6-siHBc1M1SVP	1	79.6
綴合物69	N6-siHBc1M2SVP	1	82.1
綴合物70	N6-siHBc1M3SVP	1	58.2
綴合物71	N6-siHBc1M4SVP	1	50.4
綴合物72	N6-siHBc1M5SVP	1	81.3
綴合物73	N6-siHBc2M1SVP	1	77.9
綴合物74	N6-siHBc1M1SP	1	82.1
綴合物75	N6-siHBc1M1SPs	1	83.5
綴合物76	N6-siHBc4M1S	1	76.2
綴合物77	X2-siHBc1M1SVP	1	83.2
綴合物78	W2-siHBc1M1SVP	1	84.2
綴合物79	V2-siHBc1M1SVP	1	83.6
綴合物80	O2-siHBc1M1SVP	1	82.9
綴合物81	P2-siHBc1M1SVP	1	84.6
PBS	-	-	NA

由表7C的結果可見，本發明提供的藥物綴合物在1 mg/kg的siRNA給藥劑量下，在C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J小鼠體內對肝臟HBV mRNA顯示出了很高的抑制活性，在1 mg/kg的劑量下，最高可達到84.6%的HBV mRNA抑制率。

實驗例4-4本實驗提供的藥物綴合物在HBV轉基因小鼠中siRNA對血清HBsAg表達量和HBV DNA的抑制效率的時間相關性測試

按照文獻方法（董小岩等，Chin J Biotech 2010, May 25; 26(5): 679-686）製備AAV-HBV模型，rAAV8-1.3HBV，D型（ayw），購於北京五加和分子醫學研究所有限公司，1×10¹² viral genome （v.g.）/mL，批號2016123011。實驗前將AAV病毒用無菌PBS稀釋至5×10¹¹ v.g./mL。每隻小鼠注射200 μL，即每隻小鼠注射1×10¹¹ v.g.。病毒注射後第28天，所有小鼠通過眼眶採血（約100 µL）用於收集血清檢測HBsAg和HBV DNA。

動物造模成功後，按血清HBsAg含量隨機分組（每組5隻），分別進行編號，然後分別向每組小鼠給予表8C中的各待測綴合物，所有動物根據體重計算藥量，採用皮下注射方式單次給藥，各綴合物以0.6 mg/ml的0.9%氯化鈉水溶液形式給予，給藥體積為5 ml/kg小鼠體重，即，每一綴合物的給藥劑量為3 mg/kg。對另外一組小鼠中的每一隻給予1×PBS，給藥體積均為5ml/kg，作為對照組。在給藥前與給藥後第7、14、21天對小鼠眼眶靜脈叢取血，在各時間點檢測血清HBsAg水平。

眼眶取血每次約100 μl，離心後取血清不少於20μl。使用HBsAg CLIA試劑盒（安圖生物，CL0310），按照試劑盒中提供的說明書檢測血清中HBsAg的表達水平；參照QIAamp 96 DNA Blood Kit說明書提取血清中DNA，對其進行定量PCR，檢測HBV DNA的表達水平。

表8C和9C分別示出了給予不同劑量的藥物綴合物或PBS後，HBV轉基因小鼠體內HBsAg和HBV DNA抑制率。

表8C 不同藥物綴合物在小鼠血清中HBsAg抑制率

綴合物序號	綴合物編號	血清HBsAg抑制率（%）
D7	D14	D21
綴合物68	N6-siHBc1M1SVP	81.2	82.3	74.8
綴合物69	N6-siHBc1M2SVP	81.5	82.5	73.8
綴合物73	N6-siHBc2M1SVP	80.1	82.1	74.6
綴合物74	N6-siHBc1M1SP	79.8	81.8	74.1
綴合物75	N6-siHBc1M1SPs	78.2	81.6	73.5
綴合物77	X2-siHBc1M1SVP	80.3	81.3	72.0
綴合物78	W2-siHBc1M1SVP	81.6	81.2	71.5
綴合物79	V2-siHBc1M1SVP	81.0	80.1	71.6
綴合物80	O2-siHBc1M1SVP	81.3	79.2	71.4
綴合物81	P2-siHBc1M1SVP	81.2	81.3	71.5
-	PBS	2.2	-19.3	-31.8

由表8C的結果可見，在給藥後不同時間點，PBS陰性對照組未顯示出任何抑制作用；與之相比，本發明提供的藥物綴合物在給藥後不同時間點對HBsAg均體現出了優異的HBsAg抑制效果。特別是在21天的時間內持續顯示出高的血清HBsAg抑制率，抑制率最高可達81.8%，表示其能夠在較長時間內穩定高效地抑制HBV mRNA的表達。

表9C 不同藥物綴合物在小鼠血清中HBV DNA抑制率

綴合物序號	綴合物編號	血清HBV DNA抑制率（%）
D7	D14	D21
綴合物68	N6-siHBc1M1SVP	75.2	82.3	71.3
綴合物69	N6-siHBc1M2SVP	74.3	82.4	70.2
綴合物73	N6-siHBc2M1SVP	76.1	81.9	73.2
綴合物74	N6-siHBc1M1SP	75.3	82.6	71.2
綴合物75	N6-siHBc1M1SPs	74.2	83.2	70.8
綴合物77	X2-siHBc1M1SVP	75.3	82.7	73.2
綴合物78	W2-siHBc1M1SVP	76.4	82.1	72.4
綴合物79	V2-siHBc1M1SVP	75.1	80.9	72.1
綴合物80	O2-siHBc1M1SVP	74.6	83.9	71.9
綴合物81	P2-siHBc1M1SVP	75.0	82.1	71.6
-	PBS	1.2	3.5	-3.8

由表9C的結果可見，本發明提供的藥物綴合物同樣顯示出優秀的HBV DNA的抑制效果，並且在21天的時間內均保持了較高的抑制率，最高可達到83.9%。

[實驗例5 本發明提供的藥物綴合物的效果試驗]

實驗例5-1 本發明提供的藥物綴合物在HepG2.2.15細胞中對HBV mRNA表達量的抑制效率檢測。

用DEPC化水將下面的藥物綴合物中的每一個藥物綴合物分別配製成50 μM、5 μM和0.5 μM的共3種不同濃度的藥物綴合物工作液，所用藥物綴合物分別為表4D中的各待測綴合物。

對於每一個siRNA,分別配製5A1、5A2和5A3溶液，每份53A1-3A3溶液依次含有上述3個濃度的siRNA工作液0.6 μl和Opti-MEM培養基50 μl。

配製5B溶液，每份5B溶液含有1 μl Lipofectamine™ 2000和50 μl Opti-MEM培養基。

分別將一份5B溶液與得到的一份每個siRNA的5A1、5A2或5A3溶液混合，分別在室溫下培養20min，得到每個siRNA的轉染複合物5X1、5X2和5X3。

將一份5B溶液與Opti-MEM培養基50μl混合，室溫下培養20min，得到轉染複合物5X4。

在培養孔中，分別加入每一個藥物綴合物的轉染複合物5X1-5X3，均勻混合，加入量為100μl/孔，得到每個藥物綴合物終濃度分別約為50 nM、5 nM和0.5 nM的轉染混合物，每個轉染複合物分別轉染3個培養孔，得到含藥物綴合物的轉染混合物，記為測試組。

在另外3個培養孔中，分別加入轉染複合物5X4，加入量為100 μl/孔，得到不含siRNA的轉染混合物，記為對照組。

將含藥物綴合物的轉染混合物和不含藥物綴合物的轉染混合物在培養孔中培養4h後，每孔補加1ml 添加了20% FBS的H-DMEM完全培養基。將24孔板置於CO₂ 培養箱繼續培養24h。

對於每一反轉錄反應體系，分別取上述含cDNA的溶液5μl做範本，使用NovoStart^® SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒（購自近岸蛋白質科技有限公司，貨號E096-01B）提供的試劑配置qPCR反應體系20μl，其中，用於擴增目標基因HBV和內參基因GAPDH的PCR引子序列如表3A所示，每條引子的終濃度為0.25μM。將各qPCR反應體系置於ABI StepOnePlus Real-Time PCR儀上，使用三步法進行擴增，擴增程式為95^o C預變性10min，然後95^o C變性30s，60^o C退火30s，72^o C延伸30s，重複上述變性、退火、延伸的過程共40次後，得到含有擴增了目標基因HBV和內參基因GAPDH的產物W2。產物W2隨即依次經過95^o C 15s，60^o C 1min，95^o C 15s的培養，即時螢光定量PCR儀分別收集產物W2中目標基因HBV和內參基因GAPDH的溶解曲線，得到目標基因HBV和內參基因GAPDH的Ct值。

其中，各測試組為分別經表2D中所列的藥物綴合物處理的HepG2.2.15細胞，所述藥物綴合物包括綴合物82-98對比綴合物1。

以下表4D示出了表2D中所列的綴合物藥物綴合物與對比綴合物在HepG2.2.15細胞中對HBV mRNA表達抑制活性的檢測結果。

表4D 不同濃度藥物綴合物的體外HBV mRNA抑制率

綴合物序號	綴合物編號	HBV mRNA抑制率（%）
50nM	10nM	1nM
綴合物82	N6-siHBd1	53.2	39.6	22.6
綴合物83	N6-siHBd1M1	52.8	38.8	26.8
綴合物84	N6-siHBd1M2	52.7	36.5	23.9
綴合物85	N6-siHBd1M1SVP	52.7	36.9	24.9
綴合物86	N6-siHBd1M2SVP	53.8	45.2	26.5
綴合物87	N6-siHBd1M3SVP	53.9	24.5	17.8
綴合物88	N6-siHBd1M4SVP	53.9	23.6	17.5
綴合物89	N6-siHBd1M5SVP	52.7	41.6	25.9
綴合物90	N6-siHBd2M1SVP	51.9	43.1	26.5
綴合物91	N6-siHBd1M1SP	52.6	43.5	27.6
綴合物92	N6-siHBd1M1SPs	53.1	43.8	26.9
綴合物93	N6-siHBd4M1S	52.1	53.2	25.8
綴合物94	X2-siHBd1M1SVP	53.8	41.8	26.7
綴合物95	W2-siHBd1M1SVP	53.2	41.6	27.4
綴合物96	V2-siHBd1M1SVP	52.9	41.2	25.9
綴合物97	O2-siHBd1M1SVP	52.4	44.2	25.7
綴合物98	P2-siHBd1M1SVP	52.9	45.3	27.5
對比綴合物1	N6-NC	1.3	1.3	-2.3

從表4D的結果可見，本發明提供的藥物綴合物在體外HepG2.2.15細胞中具有很高的HBV mRNA抑制活性，在siRNA濃度為50nM時可達到53.9%的HBV mRNA抑制率。

實驗例5-2 本發明提供的藥物綴合物在體外人血漿中的穩定性

將藥物綴合物中的每一個藥物綴合物（以siRNA計算的濃度均為20μM的0.9 wt%氯化鈉水溶液提供，每組12μl）分別與108 μL 90%人血漿（Human plasma，購自江蘇省血液研究所，以1×PBS（pH7.4）稀釋）混勻，獲得混合液，所用藥物綴合物分別為表5D中的各待測綴合物。在37^o C恆溫培養。分別在0、8、24、48小時取出10 μL樣本，立即進行液氮速凍於-80^o C冰箱中凍存。其中，0小時是指綴合物溶液與90%人血漿混勻後，立即取出10μL混合液的時刻。待各時間點取樣完畢後，用1×PBS（pH7.4）將各混合液稀釋5倍後，每一混合液各取10 μL準備電泳。分別將等莫耳量的上述綴合物溶液（以siRNA計的濃度為2μM）2 μl與8 μl 1×PBS（pH7.4）混勻，製備成10 μL未經人血漿處理的樣品，記為未處理，準備電泳。

配製20重量%的非變性聚丙烯醯胺凝膠，將每一組的上述準備電泳的樣品分別與4 μL上樣緩衝液（20mM EDTA，36重量%甘油，0.06重量%溴酚藍）混合，然後上樣至各凝膠孔，在80mA恒流條件下電泳60分鐘左右。電泳結束後，取出凝膠，用1×Sybr Gold染料（Invitrogen，Cat.11494）染色15分鐘後成像並計算穩定性結果，結果如表5D所示。

表5D示出了表2D中所列的藥物綴合物在體外人血漿中的穩定性半定量檢測結果。該結果以藥物綴合物與人血漿培養後殘留的最長片段與未經處理的siRNA最長片段的比例（RL）表示。

表5D 不同藥物綴合物隨時間的血漿穩定性

綴合物序號	綴合物編號	RL（%）
未處理	0h	8h	24h	48h
綴合物83	N6-siHBd1M1	100	100	99.2	96.3	94.2
綴合物84	N6-siHBd1M2	100	100	99.8	96.0	94.1
綴合物85	N6-siHBd1M1SVP	100	100	99.5	96.0	94.0
綴合物86	N6-siHBd1M2SVP	100	100	99.1	96.2	95.0
綴合物87	N6-siHBd1M3SVP	100	100	99.3	96.1	95.2
綴合物88	N6-siHBd1M4SVP	100	100	99.6	96.0	95.0
綴合物89	N6-siHBd1M5SVP	100	100	99.2	96.0	95.1
綴合物90	N6-siHBd2M1SVP	100	100	99.1	96.3	94.5
綴合物91	N6-siHBd1M1SP	100	100	99.5	96.5	95.2
綴合物92	N6-siHBd1M1SPs	100	100	99.4	97.3	94.5
綴合物93	N6-siHBd4M1S	100	100	99.2	96.2	94.1
綴合物94	X2-siHBd1M1SVP	100	100	99.1	95.1	94.0
綴合物95	W2-siHBd1M1SVP	100	100	99.5	96.0	94.3
綴合物96	V2-siHBd1M1SVP	100	100	99.6	97.0	94.2
綴合物97	O2-siHBd1M1SVP	100	100	99.4	96.8	94.0
綴合物98	P2-siHBd1M1SVP	100	100	99.2	96.1	94.1

由表5D的結果可見，本發明提供的藥物綴合物在血漿中均顯示出優異的穩定性，在48h仍均具有高於94%的siRNA片段長度比例。

實驗例5-3 本發明提供的藥物綴合物在HBV轉基因小鼠C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J中對HBV mRNA表達量的抑制效率檢測。

首先，將C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J小鼠按血清HbsAg含量隨機分組（均為雌性），每組5隻小鼠，按照表2D中的藥物綴合物對每組小鼠進行編號，然後分別向每組小鼠給予表7D中的各待測綴合物。所有動物根據體重計算藥量，採用皮下注射方式單次給藥，各藥物綴合物以0.2 mg/ml的0.9%氯化鈉水溶液形式給予，給藥體積為5 ml/kg小鼠體重，即，每一綴合物的給藥劑量為1 mg/kg。

對於每隻小鼠的肝臟組織，分別取1 μg總RNA，使用ImProm-IITM反轉錄試劑盒（Promega公司）按其說明書將提取的總RNA逆轉錄為cDNA，得到含cDNA的溶液，接著用螢光定量PCR試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）檢測肝組織中的HBV mRNA的表達量。在該螢光定量PCR法中，以β-肌動蛋白（β-actin）基因作為內參基因，使用針對HBV的引子和針對β-肌動蛋白的引子分別對HBV和β-肌動蛋白進行檢測。檢測引子的序列參見表6A所示。

對於同一測試組siRNA，每一濃度下的測試組HBV mRNA相對表達水平平均值為該濃度5隻小鼠的相對表達水平的算術平均值。其中，對照組為本實驗中施以PBS的對照組小鼠，各測試組為分別施以不同藥物綴合物的給藥組小鼠。結果示於以下表7D中。

表7D 不同藥物綴合物在小鼠肝臟中的HBV mRNA抑制率

綴合物序號	綴合物編號	給藥劑量（mg/kg）	肝臟HBV mRNA抑制率（%）
綴合物83	N6-siHBd1M1	1	76.3
綴合物84	N6-siHBd1M2	1	82.1
綴合物85	N6-siHBd1M1SVP	1	79.8
綴合物86	N6-siHBd1M2SVP	1	83.2
綴合物87	N6-siHBd1M3SVP	1	66.3
綴合物88	N6-siHBd1M4SVP	1	65.8
綴合物89	N6-siHBd1M5SVP	1	81.0
綴合物90	N6-siHBd2M1SVP	1	77.9
綴合物91	N6-siHBd1M1SP	1	79.6
綴合物92	N6-siHBd1M1SPs	1	79.2
綴合物93	N6-siHBd4M1S	1	83.1
綴合物94	X2-siHBd1M1SVP	1	81.6
綴合物95	W2-siHBd1M1SVP	1	80.8
綴合物96	V2-siHBd1M1SVP	1	84.1
綴合物97	O2-siHBd1M1SVP	1	83.4
綴合物98	P2-siHBd1M1SVP	1	82.9
PBS	-	-	NA

由表7D的結果可見，本發明提供的藥物綴合物在1 mg/kg的siRNA給藥劑量下，在C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J小鼠體內對肝臟HBV mRNA顯示出了很高的抑制活性，在1 mg/kg的劑量下，最高可達到83.4%的HBV mRNA抑制率。

實驗例5-4 本發明提供的藥物綴合物在HBV轉基因小鼠中siRNA對血清HBsAg表達量和HBV DNA的抑制效率的時間相關性測試

動物造模成功後，按血清HBsAg含量隨機分組（每組5隻），分別進行編號，然後分別向每組小鼠給予表8D中的各待測綴合物，所有動物根據體重計算藥量，皮下單次給藥，給藥劑量為3mg/kg，體積為5ml/kg。對另外一組小鼠中的每隻給予1×PBS，給藥體積均為5ml/kg，作為對照組。在給藥前與給藥後第7、14、21、28、56天對小鼠眼眶靜脈叢取血，在各時間點檢測血清HBsAg水平。

表8D和9D分別示出了給予不同劑量的藥物綴合物或PBS後，HBV轉基因小鼠體內HBsAg和HBV DNA抑制率。

表8D 不同藥物綴合物在小鼠血清中HBsAg抑制率

綴合物序號	綴合物編號	血清HBsAg抑制率（%）
D7	D14	D21	D28	D56
綴合物85	N6-siHBd1M1SVP	91.8	91.2	91.2	86.1	79.2
綴合物86	N6-siHBd1M2SVP	91.2	92.8	91.3	88.2	79.1
綴合物90	N6-siHBd2M1SVP	91.6	92.9	91.6	86.1	77.6
綴合物91	N6-siHBd1M1SP	92.4	92.9	92.8	86.2	77.2
綴合物92	N6-siHBd1M1SPs	93.8	93.4	93.4	93.1	85.3
綴合物94	X2-siHBd1M1SVP	93.7	93.1	94.2	92.4	83.4
綴合物95	W2-siHBd1M1SVP	95.1	95.2	95.6	94.8	84.2
綴合物96	V2-siHBd1M1SVP	94.2	94.2	94.0	92.6	83.8
綴合物97	O2-siHBd1M1SVP	92.1	92.9	93.8	92.2	84.1
綴合物98	P2-siHBd1M1SVP	91.8	92.8	93.5	91.1	82.1
-	PBS	1.8	-9.3	-12.4	-8.8	-44.2

由表8D的結果可見，在給藥後不同時間點，PBS陰性對照組未顯示出任何抑制作用；與之相比，本發明提供的藥物綴合物在給藥後不同時間點對HBsAg均體現出了優異的HBsAg抑制效果。特別是在21天的時間內持續顯示出高的血清HBsAg抑制率，抑制率最高可達95.6%，表示其能夠在較長時間內穩定高效地抑制HBV mRNA的表達。

表9D 不同藥物綴合物在小鼠血清中的HBV DNA抑制率

綴合物序號	綴合物編號	血清HBV DNA抑制率（%）
D7	D14	D21	D28	D56
綴合物85	N6-siHBd1M1SVP	76.5	91.3	90.2	87.3	85.6
綴合物86	N6-siHBd1M2SVP	75.2	90.5	89.5	84.8	82.1
綴合物90	N6-siHBd2M1SVP	75.8	91.6	90.2	85.3	80.3
綴合物91	N6-siHBd1M1SP	76.3	92.2	91.1	86.2	83.5
綴合物92	N6-siHBd1M1SPs	76.5	91.6	90.3	85.4	83.2
綴合物94	X2-siHBd1M1SVP	75.8	92.6	91.2	83.2	81.6
綴合物95	W2-siHBd1M1SVP	76.4	93.1	91.3	82.9	80.2
綴合物96	V2-siHBd1M1SVP	76.6	92.4	91.5	84.3	82.1
綴合物97	O2-siHBd1M1SVP	75.2	92.6	91.6	84.2	82.1
綴合物98	P2-siHBd1M1SVP	75.1	91.8	90.0	83.8	83.1
-	PBS	0.4	3.5	-1.8	-1.8	-8

由表9D的結果可見，本發明提供的藥物綴合物同樣顯示出優秀的HBV DNA的抑制效果，並且在長達56天的時間內均保持了較高的抑制率，最高可達到93.1%。

[實驗例6 本發明提供的藥物綴合物的效果實驗]

實驗例6-1 本發明提供的藥物綴合物在HepG2.2.15細胞中對HBV mRNA表達量的抑制效率檢測。

用H-DMEM完全培養基將HepG2.2.15細胞以7 × 10⁴ 細胞/孔接種於24孔板中，16h後細胞生長密度達到70-80%時，吸盡培養孔中H-DMEM完全培養基，每孔加入500 μl Opti-MEM培養基（GIBCO公司）繼續培養1.5h。

用DEPC化水將下面的藥物綴合物中的每一個藥物綴合物分別配製成50 μM、5 μM和0.5 μM的共3種不同濃度的藥物綴合物工作液，所用藥物綴合物分別為表4E中的各待測綴合物。

對於每一個siRNA,分別配製6A1、6A2和6A3溶液，每份6A1、6A2和6A3溶液依次含有上述3個濃度的siRNA工作液0.6 μl和Opti-MEM培養基50μl。

配製6B溶液，每份6B溶液含有1 μl Lipofectamine™ 2000和50μl Opti-MEM培養基。

分別將一份6B溶液與得到的一份每個siRNA的6A1、6A2或6A3的溶液混合，分別在室溫下培養20min，得到每個siRNA的轉染複合物6X1、6X2和6X3。

將一份6B溶液與Opti-MEM培養基50μl混合，室溫下培養20min，得到轉染複合物6X4。

在培養孔中，分別加入每一個藥物綴合物的轉染複合物6X1、6X2或6X3，均勻混合，加入量為100μl/孔，得到每個藥物綴合物終濃度分別約為50 nM、5 nM和0.5 nM的轉染混合物，每個轉染複合物分別轉染3個培養孔，得到含藥物綴合物的轉染混合物，記為測試組。

在另外3個培養孔中，分別加入轉染複合物6X4，加入量為100 μl/孔，得到不含siRNA的轉染混合物，記為對照組。

對於每一反轉錄反應體系，分別取上述含cDNA的溶液5μl做範本，使用NovoStart^® SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒（購自近岸蛋白質科技有限公司，貨號E096-01B）提供的試劑配置qPCR反應體系20μl，其中，用於擴增目標基因HBV和內參基因GAPDH的PCR引子序列如表3E所示，每條引子的終濃度為0.25μM。將各qPCR反應體系置於ABI StepOnePlus Real-Time PCR儀上，使用三步法進行擴增，擴增程式為95^o C預變性10min，然後95^o C變性30s，60^o C退火30s，72^o C延伸30s，重複上述變性、退火、延伸的過程共40次後，得到含有擴增了目標基因HBV和內參基因GAPDH的產物W。產物W隨即依次經過95^o C 15s，60^o C 1min，95^o C 15s的培養，即時螢光定量PCR儀分別收集產物W中目標基因HBV和內參基因GAPDH的溶解曲線，得到目標基因HBV和內參基因GAPDH的Ct值。

表3E 檢測引子的序列

基因	上游引子	下游引子
HBV	5'-GTCTTTTGGGTTTTGCTGCC -3' （SEQ ID NO: 689）	5'- GCAACGGGGTAAAGGTTCAG -3' （SEQ ID NO: 690）
GAPDH	5'- GGTCGGAGTCAACGGATTT - 3' （SEQ ID NO: 691）	5'- CCAGCATCGCCCCACTTGA -3' （SEQ ID NO: 692）

以下表4E示出了表2E中所列的藥物綴合物與對比綴合物1的藥物綴合物在HepG2.2.15細胞中對HBV mRNA表達抑制活性的檢測結果。

表4E 不同濃度藥物綴合物HBV mRNA抑制率

綴合物序號	綴合物編號	HBV mRNA抑制率（%）
50nM	10nM	1nM
綴合物99	N6-siHBe3M1S	78.1	44.4	28.9
綴合物100	N6-siHBe4M1S	78.9	49.5	29.2
綴合物101	N6-siHBe3M1	78.8	47.5	26.5
綴合物102	N6-siHBe4M1	79.9	45.5	27.1
綴合物103	N6-siHBe3M1SVP	79.9	50.4	28.7
綴合物104	N6-siHBe3M1SPs	79.0	50.0	28.6
綴合物105	N6-siHBe3M1SP	78.9	49.8	28.3
綴合物106	N6-siHBe3M1VP	78.2	49.5	28.0
綴合物107	N6-siHBe3M2	78.1	48.4	30.8
綴合物108	N6-siHBe3M2SVP	79.0	49.4	29.2
綴合物109	N6-siHBe3M3SVP	78.9	49.4	27.2
綴合物110	N6-siHBe3M4SVP	52.9	35.4	15.6
綴合物111	N6-siHBe3M5SVP	55.2	30.4	11.1
綴合物112	N6-siHBe1M1S	79.8	47.4	27.1
綴合物113	N6-siHBe5M1SVP	70.7	45.4	23.2
綴合物114	N6-siHBe0M1	65.8	42.1	23.3
綴合物115	N6-siHBe2	68.7	45.9	25.3
綴合物116	X2-siHBe3M1SVP	78.7	51.3	30.6
綴合物117	W2-siHBe3M1SVP	75.8	50.6	30.3
綴合物118	V2-siHBe3M1SVP	78.9	50.5	30.2
綴合物119	O2-siHBe3M1SVP	73.9	50.8	30.3
綴合物120	P2-siHBe3M1SVP	78.1	50.5	30.2
對比綴合物1	N6-NC	3.1	1.8	-4.8

從表4E的結果可見，本發明提供的藥物綴合物在體外HepG2.2.15細胞中具有很高HBV mRNA的抑制活性，在siRNA濃度為50Nm時可達到79.9%的HBV mRNA抑制率。

實驗例6-2 本發明提供的藥物綴合物在體外人血漿中的穩定性

將藥物綴合物中的每一個藥物綴合物以及對比綴合物1的藥物綴合物（以siRNA計的濃度均為20μM的0.9 wt%氯化鈉水溶液提供，每組12μl）分別與108 μL 90%人血漿（Human plasma，購自江蘇省血液研究所，以1×PBS（pH7.4）稀釋）混勻，獲得混合液，所用藥物綴合物分別為表5E中的各待測綴合物。在37^o C恆溫培養。分別在0、8、24、48小時取出10 μL樣本，立即進行液氮速凍於-80^o C冰箱中凍存。其中，0小時是指綴合物溶液與90%人血漿混勻後，立即取出10μL混合液的時刻。待各時間點取樣完畢後，用1×PBS（pH7.4）將各混合液稀釋5倍後，每一混合液各取10 μL準備電泳。

配製20重量%的非變性聚丙烯醯胺凝膠，將每一組的上述準備電泳的樣品分別與4 μL上樣緩衝液（20mM EDTA，36重量%甘油，0.06重量%溴酚藍）混合，然後上樣至各凝膠孔，在80mA恒流條件下電泳60分鐘左右。電泳結束後，取出凝膠，用1×Sybr Gold染料（Invitrogen，Cat.11494）染色15分鐘後成像並計算穩定性結果，結果如表5E所示。

表5E示出了表2E中所列的測試藥物綴合物在體外人血漿中的穩定性半定量檢測結果。該結果以測試藥物綴合物與人血漿培養後殘留的最長片段與未經處理的siRNA最長片段的比例（RL）表示。

表5E 不同藥物綴合物隨時間的血漿穩定性

綴合物序號	綴合物編號	RL（%）
未處理	0h	8h	24h	48h
綴合物99	N6-siHBe3M1S	100	100	99.6	96.0	94.7
綴合物100	N6-siHBe4M1S	100	100	99.7	96.4	94.7
綴合物101	N6-siHBe3M1	100	100	99.6	96.1	94.8
綴合物102	N6-siHBe4M1	100	100	99.4	96.7	95.4
綴合物103	N6-siHBe3M1SVP	100	100	99.4	96.5	95.5
綴合物104	N6-siHBe3M1SPs	100	100	99.4	96.4	95.1
綴合物105	N6-siHBe3M1SP	100	100	99.5	96.1	95.4
綴合物106	N6-siHBe3M1VP	100	100	99.4	96.0	94.9
綴合物107	N6-siHBe3M2	100	100	99.6	96.7	95.8
綴合物108	N6-siHBe3M2SVP	100	100	99.1	97.1	95.1
綴合物109	N6-siHBe3M3SVP	100	100	99.4	96.4	95.5
綴合物110	N6-siHBe3M4SVP	100	100	99.6	95.5	94.6
綴合物111	N6-siHBe3M5SVP	100	100	99.7	96.4	96.4
綴合物112	N6-siHBe1M1S	100	100	99.5	97.4	94.4
綴合物113	N6-siHBe5M1SVP	100	100	99.6	97.1	94.4
綴合物114	N6-siHBe0M1	100	100	99.8	94.4	93.4
綴合物115	N6-siHBe2	100	100	95.5	93.6	92.5
綴合物116	X2-siHBe3M1SVP	100	100	99.4	97.1	94.8
綴合物117	W2-siHBe3M1SVP	100	100	99.6	96.1	95.4
綴合物118	V2-siHBe3M1SVP	100	100	99.3	95.7	95.0
綴合物119	O2-siHBe3M1SVP	100	100	99.6	96.4	96.4
綴合物120	P2-siHBe3M1SVP	100	100	99.2	96.0	94.7
對比綴合物1	N6-NC	100	0	0	0	0

由表5E的結果可見，本發明提供的藥物綴合物在血漿中均顯示出優異的穩定性，在48h仍均具有高於92.5%的siRNA片段長度比例。

實驗例6-3 本發明提供的藥物綴合物在HBV轉基因小鼠C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J中對HBV mRNA表達量的抑制效率檢測。

本實驗例中所使用的HBV轉基因小鼠C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J購自北京大學醫學部實驗動物科學部，將C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J小鼠按血清HbsAg含量隨機分組（均為雌性），每組5隻小鼠，按照表2C中的藥物綴合物對每組小鼠進行編號，然後分別向每組小鼠給予表7E中所列的各待測綴合物。所有動物根據體重計算藥量，採用皮下注射方式單次給藥，各綴合物以0.2 mg/ml的0.9%氯化鈉水溶液形式給予，給藥體積為5 ml/kg小鼠體重，即，每一綴合物的給藥劑量為1 mg/kg。

對於每隻小鼠的肝臟組織，分別取1μg總RNA，使用ImProm-IITM反轉錄試劑盒（Promega公司）按其說明書將提取的總RNA逆轉錄為cDNA，得到含cDNA的溶液，接著用螢光定量PCR試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）檢測肝組織中的HBV mRNA的表達量。在該螢光定量PCR法中，以β-肌動蛋白（β-actin）基因作為內參基因，使用針對HBV的引子和針對β-肌動蛋白的引子分別對HBV和β-肌動蛋白進行檢測。檢測引子的序列參見下表6E所示。

表6E 檢測引子的序列

基因	上游引子	下游引子
HBV	5’-GTCTTTTGGGTTTTGCTGCC -3’ （SEQ ID NO: 693）	5’- GCAACGGGGTAAAGGTTCAG-3’ （SEQ ID NO: 694）
β-actin	5’-AGCTTCTTTGCAGCTCCTTCGTTG -3’ （SEQ ID NO: 695）	5’-TTCTGACCCATTCCCACCATCACA -3’ （SEQ ID NO: 696）

以對照組為基準，對測試組HBV mRNA的表達水平進行歸一化，定義對照組HBV mRNA表達水平為100%，

測試組HBV mRNA相對表達水平 = 2^-ΔΔCt( ^測試組 ⁾ × 100%。

其中，對照組為本實驗中施以PBS的對照組小鼠，各測試組為分別施以不同藥物綴合物的給藥組小鼠。結果示於以下表7E中。

表7E 不同藥物綴合物在小鼠肝臟中HBV mRNA抑制率

綴合物序號	綴合物編號	給藥劑量（mg/kg）	肝臟HBV mRNA抑制率（%）
綴合物99	N6-siHBe3M1S	1	86.4
綴合物100	N6-siHBe4M1S	1	84.2
綴合物101	N6-siHBe3M1	1	84.0
綴合物102	N6-siHBe4M1	1	82.5
綴合物103	N6-siHBe3M1SVP	1	88.5
綴合物104	N6-siHBe3M1SPs	1	88.2
綴合物105	N6-siHBe3M1SP	1	88.0
綴合物106	N6-siHBe3M1VP	1	84.0
綴合物107	N6-siHBe3M2	1	84.2
綴合物108	N6-siHBe3M2SVP	1	88.7
綴合物109	N6-siHBe3M3SVP	1	88.6
綴合物112	N6-siHBe1M1S	1	85.3
綴合物113	N6-siHBe5M1SVP	1	80.5
綴合物116	X2-siHBe3M1SVP	1	88.1
綴合物117	W2-siHBe3M1SVP	1	88.4
綴合物118	V2-siHBe3M1SVP	1	88.5
綴合物119	O2-siHBe3M1SVP	1	88.6
綴合物120	P2-siHBe3M1SVP	1	88.3
PBS	-	NA	2.0

由上述結果可見，本發明提供的藥物綴合物在1 mg/kg的siRNA給藥劑量下，在C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J小鼠體內對肝臟HBV mRNA顯示出了很高的抑制活性。尤其是綴合物103-106、108-109以及116-120，這些藥物綴合物C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J小鼠體內實驗中顯示出很高的乙肝小鼠肝組織HBV mRNA的抑制活性，在1 mg/kg的劑量下最高可達到88.6%的HBV mRNA抑制率。

實驗例6-4 本發明提供的藥物綴合物在HBV轉基因小鼠中siRNA對血清HBsAg表達量和HBV DNA的抑制效率的時間相關性測試

動物造模成功後，按血清HBsAg含量隨機分組（每組5隻），分別向每組小鼠給予表8E中所列的各待測藥物綴合物。所有動物根據體重計算藥量，皮下單次給藥，給藥劑量為3mg/kg，體積為5ml/kg。對另外一組小鼠中的每隻給予1×PBS，給藥體積均為5ml/kg，作為對照組。在給藥前與給藥後第7、14、21、28、56、84、98、112天對小鼠眼眶靜脈叢取血，在各時間點檢測血清HBsAg水平和DNA水平。

眼眶取血每次約100 μl，離心後血清不少於20μl。利用HBsAg CLIA試劑盒（安圖生物，CL0310），按照試劑盒中提供的說明書檢測血清中HBsAg的表達水平；參照QIAamp 96 DNA Blood Kit說明書提取血清中DNA，進行定量PCR，檢測HBV DNA的表達水平。

HBsAg抑制率按如下等式計算：

表8E和9E分別示出了給予不同劑量的藥物綴合物或PBS後，HBV轉基因小鼠體內HBsAg和HBV DNA抑制率。

表8E 不同藥物綴合物在不同時間點在小鼠血清中HBsAg表達的抑制

綴合物序號	綴合物編號	血清HBsAg抑制率（%）
D7	D14	D21	D28	D40	D56	D70	D84	D98	D112
綴合物99	N6-siHBe3M1S	99.6	99.5	99.6	99.4	98.8	96.5	95.6	93.1	84.2	80.9
綴合物112	N6-siHBe1M1S	99.5	99.4	99.7	99.2	98.8	96.4	94.5	92.0	85.6	80.8
綴合物101	N6-siHBe3M1	99.4	99.1	99.1	99.0	98.6	96.9	94.7	92.8	84.9	78.2
綴合物103	N6-siHBe3M1SVP	99.5	99.8	99.7	99.5	99.0	97.4	95.5	93.2	87.0	82.5
綴合物104	N6-siHBe3M1SPs	99.6	99.6	99.6	99.4	99.0	96.0	94.0	91.6	80.0	75.6
綴合物105	N6-siHBe3M1SP	99.3	99.7	99.6	99.4	98.8	97.5	95.0	92.6	84.8	78.6
綴合物108	N6-siHBe3M2SVP	99.4	99.4	99.3	99.3	99.3	97.5	95.4	92.8	85.0	82.2
綴合物109	N6-siHBe3M3SVP	99.0	99.6	99.2	99.2	99.4	97.6	94.9	93.8	81.6	79.0
綴合物116	X2-siHBe3M1SVP	99.4	99.6	99.3	99.5	99.0	97.2	95.8	93.1	86.5	82.3
綴合物117	W2-siHBe3M1SVP	99.5	99.7	99.7	99.4	99.1	97.8	95.1	93.2	86.7	82.4
綴合物118	V2-siHBe3M1SVP	99.4	99.7	99.6	99.3	99.2	97.7	95.3	92.9	87.2	84.4
綴合物119	O2-siHBe3M1SVP	99.0	99.8	99.5	99.5	99.2	97.7	95.3	92.8	87.2	82.0
綴合物120	P2-siHBe3M1SVP	99.7	99.9	99.8	99.6	99.3	97.6	95.2	93.0	86.9	81.9
-	PBS	1.9	2.4	-10.5	-6.5	-2.8	5.6	3.6	9.0	-1.0	-5.9

由表8E的結果可見，在給藥後不同時間點，PBS陰性對照組未顯示出任何抑制作用；與之相比，本發明提供的藥物綴合物在給藥後不同時間點對HBsAg均體現出了優異的HBsAg抑制效果。特別是在長達140天的時間內持續顯示出高的血清HBsAg抑制效果，抑制率最高可達99.9%，表示其能夠在較長時間內穩定高效地抑制HBV mRNA的表達。

表9E 不同藥物綴合物在小鼠血清中在不同時間點HBV DNA抑制率

siRNA 綴合物	編號	血清HBsAg抑制率（%）
D7	D14	D21	D28	D40	D56	D70	D84	D98	D112
綴合物99	N6-siHBe3M1S	97.6	99.0	98.0	96.6	96.3	93.2	90.0	88.7	80.1	78.3
綴合物112	N6-siHBe1M1S	96.9	99.0	98.9	96.8	96.2	92.2	91.0	89.6	80.5	76.5
綴合物101	N6-siHBe3M1	97.0	99.1	97.7	95.8	96.0	90.1	90.5	88.6	82.0	77.6
綴合物103	N6-siHBe3M1SVP	97.6	99.2	98.3	97.0	96.6	93.8	92.6	90.1	84.2	79.8
綴合物104	N6-siHBe3M1SPs	97.6	99.4	98.6	96.4	96.1	93.7	92.2	90.0	78.9	73.2
綴合物105	N6-siHBe3M1SP	97.5	99.3	98.1	96.4	96.4	93.9	92.1	89.8	80.6	76.9
綴合物108	N6-siHBe3M2SVP	96.8	99.0	98.0	96.2	96.0	92.7	91.9	88.7	78.9	75.4
綴合物109	N6-siHBe3M3SVP	96.9	99.1	97.9	96.6	95.9	92.5	91.0	88.9	78.3	76.2
綴合物116	X2-siHBe3M1SVP	97.8	99.1	98.5	96.1	96.2	93.6	92.5	90.1	80.2	80.9
綴合物117	W2-siHBe3M1SVP	97.5	99.2	98.6	96.4	96.1	93.7	92.7	90.0	82.9	78.5
綴合物118	V2-siHBe3M1SVP	97.6	99.2	98.9	96.7	96.3	93.2	92.2	90.8	80.9	77.7
綴合物119	O2-siHBe3M1SVP	87.2	99.3	97.6	96.7	96.5	93.6	92.0	89.9	81.6	76.6
綴合物120	P2-siHBe3M1SVP	97.1	99.6	97.4	97.2	96.7	93.1	92.7	89.8	83.3	79.9
-	PBS	2.6	2.9	-0.5	-5.6	-12.8	-8.7	-3.8	6.0	-1.0	-4.9

由表9E的結果可見，本發明提供的藥物綴合物同樣顯示出優秀的HBV DNA的抑制效果，並且在長達112天的時間內均保持了較高的抑制率，最高可達到99.6%。

[實驗例7 表2F的藥物綴合物的效果試驗]

實驗例7-1 本實驗說明表2F的藥物綴合物在Huh7細胞中對ANGPTL3 mRNA表達量的抑制效率檢測。

用H-DMEM完全培養基將Huh7細胞以7.5 × 10⁴ 細胞/孔接種於24孔板中，16h後細胞生長密度達到70-80%時，吸盡培養孔中H-DMEM完全培養基，每孔加入500 μl Opti-MEM培養基（GIBCO公司）繼續培養1.5h。

用DEPC化水將下麵的藥物綴合物分別配製成5 μM、0.5 μM和0.05 μM的共3種不同濃度的藥物綴合物工作液（以siRNA計），所述藥物綴合物為表2F中的綴合物121-158和表2A中的對比綴合物1，對比綴合物1為陰性對照。

對於每一個藥物綴合物，分別配製7A1、7A2和7A3溶液，每份7A1-7A3溶液依次含有上述3個濃度的藥物綴合物工作液0.6 μl和Opti-MEM培養基50 μl。

配製7B溶液，每份7B溶液含有1 μl Lipofectamine™ 2000和50 μl Opti-MEM培養基。

分別將一份7B溶液與得到的每個藥物綴合物的7A1、7A2或7A3溶液混合，分別室溫下培養20min，得到每個siRNAUI合物的轉染複合物7X1-7X3。

將一份7B溶液與Opti-MEM培養基50 μl混合，室溫下培養20min，得到轉染複合物7X4。

在培養孔中，分別加入每一個藥物綴合物的轉染複合物7X1-7X3，均勻混合，加入量為100 μl/孔，得到每個藥物綴合物的終濃度分別約為5 nM、0.5 nM和0.05 nM的轉染複合物，每個藥物綴合物的轉染複合物7X1-7X3分別轉染3個培養孔，得到含藥物綴合物的轉染混合物，記為測試組。

在另外3個培養孔中，分別加入轉染複合物7X4，加入量為100μl/孔，得到不含siRNA的轉染混合物，記為空白對照組。

將含藥物綴合物的轉染混合物和不含藥物綴合物的轉染混合物在培養孔中培養4h後，每孔補加1ml 含20% FBS的H-DMEM完全培養基。將24孔板置於CO₂ 培養箱中繼續培養24h。

隨後，使用RNAVzol（購自威格拉斯生物技術（北京）有限公司，貨號N002）根據說明書記載的方法提取各孔細胞中的總RNA。

對於每孔細胞，分別取1μg總RNA，使用反轉錄試劑盒Goldenstar^TM RT6 cDNA Synthesis Kit（購自北京擎科新業生物技術有限公司，貨號TSK301M）提供的試劑，其中選取Goldenstar^TM Oligo (dT)₁₇ 作為引子，按試劑盒說明書中反轉錄操作步驟配置反轉錄反應體系20μl，對各孔細胞的總RNA進行反轉錄。反轉錄的條件為：對於每一反轉錄反應體系，將反轉錄反應體系置於50^o C培養50min，然後85^o C培養5min，最後4^o C培養30s，反應結束後，向反轉錄反應體系中加入DEPC水80μl，得到含cDNA的溶液。

對於每一反轉錄反應體系，分別取上述含cDNA的溶液5μl做範本，使用NovoStart^® SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒（購自近岸蛋白質科技有限公司，貨號E096-01B）提供的試劑配置qPCR反應體系20μl，其中，用於擴增目標基因ANGPTL3和內參基因β-actin的PCR引子序列如表3F所示，每條引子的終濃度為0.25μM。將各qPCR反應體系置於ABI StepOnePlus Real-Time PCR儀上，使用三步法進行擴增，擴增程式為95^o C預變性10min，然後95^o C變性30s，60^o C退火30s，72^o C延伸30s，重複上述變性、退火、延伸的過程共40次後，得到含有擴增了目標基因ANGPTL3和內參基因β-actin的產物W。產物W隨即依次經過95^o C 15s，60^o C 1min，95^o C 15s的培養，即時螢光定量PCR儀分別收集產物W中目標基因ANGPTL3和內參基因β-actin的溶解曲線，得到目標基因ANGPTL3和內參基因β-actin的Ct值。

表3F 引子信息

基因	上游引子	下游引子
人ANGPTL3	5'- ACCAACTATACGCTACAT -3' （SEQ ID NO: 697）	5'- CCTCCTGAATAACCCTCT -3' （SEQ ID NO: 698）
人β-actin	5'- CCAACCGCGAGAAGATGA - 3' （SEQ ID NO: 699）	5'- CCAGAGGCGTACAGGGATAG -3' （SEQ ID NO: 700）

採用比較Ct（ΔΔCt）法，對各測試組中目標基因ANGPTL3進行相對定量計算，計算方法如下： ΔCt(測試組) = Ct(測試組目標基因) – Ct(測試組內參基因) ΔCt(對照組) = Ct(對照組目標基因) – Ct(對照組內參基因) ΔΔCt(測試組) = ΔCt(測試組) - ΔCt(對照組平均) ΔΔCt(對照組) = ΔCt(對照組) - ΔCt(對照組平均) 其中，ΔCt(對照組平均)是對照組3個培養孔各自的ΔCt(對照組)的算術平均值。從而，測試組和對照組的每一培養孔均對應一個ΔΔCt值。

以對照組為基準，對測試組ANGPTL3 mRNA的表達水平進行歸一化，定義空白對照組ANGPTL3 mRNA表達水平為100%，測試組ANGPTL3 mRNA相對表達水平 = 2^-ΔΔCt( ^測試組 ⁾ × 100% 測試組ANGPTL3 mRNA抑制率 = (1-測試組ANGPTL3 mRNA相對表達水平) × 100%

各siRNA對ANGPTL3 mRNA的抑制率總結於表4F中。對於同一測試組siRNA，mRNA抑制率是3個培養孔測定的測試組ANGPTL3 mRNA抑制率的算術平均值。

表4F 不同濃度藥物綴合物在Huh7細胞中對ANGPTL3 mRNA的抑制率

綴合物序號	綴合物編號	mRNA抑制率（%）
0.05nM	0.5nM	5nM
綴合物121	N6-siAN1	42.4	64.5	73.8
綴合物122	N6-siAN2	39.8	64.2	70.1
綴合物123	N6-siAN1-M1	42.1	62.6	75.4
綴合物124	N6-siAN2-M1	42.3	64.1	71.4
綴合物125	N6-siAN1-M2	44.5	60.3	75.6
綴合物126	N6-siAN2-M2	49.2	60.5	74.2
綴合物127	N6-siAN1-M3	51.3	57.3	78.1
綴合物128	N6-siAN2-M3	52.5	65.9	72.5
綴合物129	N6-siAN1-M1VP	43.8	59.8	72.3
綴合物130	N6-siAN2-M1VP	49.4	57.5	76.2
綴合物131	N6-siAN1-M2VP	45.3	66.6	76.3
綴合物132	N6-siAN2-M2VP	42.9	72.6	81.4
綴合物133	N6-siAN1-M3VP	47.4	65.9	76.4
綴合物134	N6-siAN2-M3VP	50.2	62.4	82.1
綴合物135	N6-siAN1-M1S	42.9	62.1	71.5
綴合物136	N6-siAN2-M1S	43.1	61.3	71.3
綴合物137	N6-siAN1-M2S	45.8	70.1	67.2
綴合物138	N6-siAN2-M2S	44.9	62.4	75.8
綴合物139	N6-siAN1-M3S	48.4	71.0	78.3
綴合物140	N6-siAN2-M3S	41.2	65.8	75.2
綴合物141	N6-siAN1-M1SVP	52.5	68.8	80.1
綴合物142	N6-siAN2-M1SVP	55.3	68.1	74.2
綴合物143	N6-siAN1-M2SVP	52.3	67.5	76.4
綴合物144	N6-siAN2-M2SVP	49.6	72.3	80.2
綴合物145	N6-siAN1-M3SVP	49.3	72.4	76.4
綴合物146	N6-siAN1-M3SP	48.8	70.3	76.5
綴合物147	N6-siAN1-M3SPs	48.2	69.8	76.8
綴合物148	N6-siAN4-M3S	42.5	67.4	75.4
綴合物149	N6-siAN2-M3SVP	50.8	78.1	80.8
綴合物150	N6-siAN1-M4S	35.1	48.5	62.3
綴合物151	N6-siAN1-M4SVP	32.4	47.6	62.1
綴合物152	N6-siAN1-M5S	33.1	52.3	60.8
綴合物153	N6-siAN1-M5SVP	32.5	51.8	63.4
綴合物154	X2-siAN1-M3SVP	49.6	67.4	75.6
綴合物155	W2-siAN1-M3SVP	48.6	68.2	74.8
綴合物156	V2-siAN1-M3SVP	50.2	70.1	74.9
綴合物157	O2-siAN1-M3SVP	53.6	67.2	75.2
綴合物158	P2-siAN1-M3SVP	54.1	69.3	76.2
對比綴合物1	N6-NC	3.6	8.2	17.1

從表4F的結果可以看出，在各個濃度下，本發明提供的藥物綴合物在細胞水平上均顯示出了優異的ANGPTL3 mRNA表達抑制活性，5nM濃度下，藥物綴合物抑制率達到60%以上，有些綴合物可達到80%以上的抑制率。

實驗例7-2 本實驗說明表2F的藥物綴合物在人血漿中的穩定性檢測

用DEPC化水將綴合物123-158和對比綴合物1分別配製成20μM（以siRNA計）的溶液。分別取上述濃度為20μM的綴合物123-158、對比綴合物1中的每一個，每組12μl溶液分別與108 μL 90%人血漿（來自江蘇省血液研究所，用1×PBS（pH7.4）稀釋）快速混合均勻，獲得混合液，在37^o C恆溫培養。在培養過程中，分別在0、8、24、48小時取出10 μL混合液，立即進行液氮速凍，於-80^o C冰箱中凍存。其中，0小時是指綴合物溶液與90%人血漿混勻後，立即取出10μL混合液的時刻。待各時間點取樣完畢後，用1×PBS（pH7.4）將各混合液稀釋5倍後，每一稀釋混合液各取10 μL準備電泳。分別將等莫耳量的綴合物123-158溶液（以siRNA計的濃度為2 μM）2 μl與8 μl 1×PBS（pH7.4）混勻，製備成10 μL未經人血漿處理的樣品，記為未處理，準備電泳。

配製20重量%的非變性聚丙烯醯胺凝膠，將每一組的上述準備電泳的樣品分別與4 μl上樣緩衝液（20mM EDTA，36重量%甘油，0.06重量%溴酚藍）混勻，依次上樣至各凝膠孔，在80mA恒流條件下電泳60分鐘。電泳結束後，取出凝膠，用1×Sybr Gold染料（Invitrogen，Cat.11494）染色15分鐘，成像並計算穩定性結果。

表5F示出了表2F中所列的藥物綴合物與對比綴合物在體外人血漿中的穩定性半定量檢測結果。該結果以藥物綴合物和對比綴合物與人血漿培養後殘留的最長片段與未經處理的siRNA最長片段的比例（RL）表示。

表5F 不同藥物綴合物隨時間的血漿穩定性

綴合物序號	綴合物編號	RL（%）
未處理	0h	8h	24h	48h
綴合物123	N6-siAN1-M1	100	100	97.1	95.4	95.1
綴合物124	N6-siAN2-M1	100	100	97.3	95.2	96.3
綴合物125	N6-siAN1-M2	100	100	97.4	95.3	95.2
綴合物126	N6-siAN2-M2	100	100	97.6	96.4	95.1
綴合物127	N6-siAN1-M3	100	100	95.1	94.3	95.3
綴合物128	N6-siAN2-M3	100	100	96.3	98.0	95.3
綴合物129	N6-siAN1-M1VP	100	100	95.2	96.1	94.8
綴合物130	N6-siAN2-M1VP	100	100	96.3	95.2	95.9
綴合物131	N6-siAN1-M2VP	100	100	95.8	95.3	95.2
綴合物132	N6-siAN2-M2VP	100	100	97.4	95.1	95.1
綴合物133	N6-siAN1-M3VP	100	100	95.5	95.1	96.2
綴合物134	N6-siAN2-M3VP	100	100	95.6	95.2	95.6
綴合物135	N6-siAN1-M1S	100	100	97.1	94.3	95.1
綴合物136	N6-siAN2-M1S	100	100	98.2	95.2	96.1
綴合物137	N6-siAN1-M2S	100	100	98.1	98.4	95.0
綴合物138	N6-siAN2-M2S	100	100	997.3	95.1	95.1
綴合物139	N6-siAN1-M3S	100	100	95.4	94.2	95.3
綴合物140	N6-siAN2-M3S	100	100	94.5	96.3	95.4
綴合物141	N6-siAN1-M1SVP	100	100	98.1	96.1	97.2
綴合物142	N6-siAN2-M1SVP	100	100	98.3	96.2	98.1
綴合物143	N6-siAN1-M2SVP	100	100	98.4	96.4	97.1
綴合物144	N6-siAN2-M2SVP	100	100	97.8	95.5	98.1
綴合物145	N6-siAN1-M3SVP	100	100	97.1	96.5	97.4
綴合物146	N6-siAN1-M3SP	100	100	96.5	96.2	98.3
綴合物147	N6-siAN1-M3SPs	100	100	97.2	97.3	98.5
綴合物148	N6-siAN4-M3S	100	100	97.5	95.8	99.1
綴合物149	N6-siAN2-M3SVP	100	100	98.7	97.2	99.1
綴合物150	N6-siAN1-M4S	100	100	98.4	98.3	99.2
綴合物151	N6-siAN1-M4SVP	100	100	98.3	98.2	98.5
綴合物152	N6-siAN1-M5S	100	100	99.1	98.1	98.1
綴合物153	N6-siAN1-M5SVP	100	100	98.6	98.2	94.1
綴合物154	X2-siAN1-M3SVP	100	100	95.9	98.2	98.2
綴合物155	W2-siAN1-M3SVP	100	100	98.2	97.6	95.3
綴合物156	V2-siAN1-M3SVP	100	100	97.9	94.4	95.2
綴合物157	O2-siAN1-M3SVP	100	100	98.3	95.4	95.6
綴合物158	P2-siAN1-M3SVP	100	100	98.5	95.2	96.8
對比綴合物1	N6-NC	100	0	0	0	0

由表5F的結果可以看出，本發明提供的藥物綴合物在血漿中均顯示出優異的穩定性，在48小時仍均具有高於94%的siRNA片段長度比例。

實驗例7-3 本實驗說明表2F的藥物綴合物在體內（in vivo ）對ANGPTL3 mRNA表達量的抑制效

在本實驗例中，考察綴合物141、144、145-147及154-158在BALB/c小鼠體內對肝臟組織中ANGPTL3表達水平的抑制。

將6-8周齡BALB/c小鼠（購於北京維通利華實驗動物技術有限公司）按照體重隨機分組，每組6隻，雌雄各半，按照表2F中的藥物綴合物對每組小鼠編號，然後分別向每組小鼠給予待測綴合物141、144、145-147和154-158。所有動物根據體重計算藥量，採用皮下注射方式單次給藥，各綴合物以0.3 mg/ml的0.9%氯化鈉水溶液形式給予，給藥體積為10 ml/kg小鼠體重，即，每一綴合物的給藥劑量為3 mg/kg。

對另外一組小鼠中的每隻給予1×PBS，給藥體積均為10 ml/kg，作為對照組。

給藥後14天處死動物，分別收集每隻小鼠的肝臟組織，用RNA later（Sigma Aldrich公司）保存；用組織勻漿儀勻漿肝組織，再用Trizol（Thermo Fisher公司）根據說明書描述的操作步驟提取得到總RNA。

對於每隻小鼠的肝臟組織，分別取1 μg總RNA，使用ImProm-IITM反轉錄試劑盒（Promega公司）按其說明書將提取的總RNA逆轉錄為cDNA，得到含cDNA的溶液，接著用螢光定量PCR試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）檢測肝組織中的ANGPTL3 mRNA的表達量。在該螢光定量PCR法中，以β-肌動蛋白（β-actin）基因作為內參基因，使用針對ANGPTL3的引子和針對β-肌動蛋白的引子分別對ANGPTL3和β-肌動蛋白進行檢測。檢測引子的序列參見表6F所示。

採用比較Ct（ΔΔCt）法，對各測試組和對照組中目標基因ANGPTL3的表達量進行相對定量計算，計算方法如下： ΔCt(測試組) = Ct(測試組目標基因) – Ct(測試組內參基因) ΔCt(對照組) = Ct(對照組目標基因) – Ct(對照組內參基因) ΔΔCt(測試組) = ΔCt(測試組) - ΔCt(對照組平均) ΔΔCt(對照組) = ΔCt(對照組) - ΔCt(對照組平均) 其中，ΔCt(對照組平均)是對照組6隻小鼠各自的ΔCt(對照組)的算術平均值。從而，測試組和對照組的每隻小鼠均對應一個ΔΔCt值。

以對照組為基準，對測試組ANGPTL3 mRNA的表達水平進行歸一化，定義對照組ANGPTL3 mRNA表達水平為100%，測試組ANGPTL3 mRNA相對表達水平 = 2^-ΔΔCt( ^測試組 ⁾ × 100%。

對於同一測試組siRNA，每一濃度下的測試組ANGPTL3 mRNA相對表達水平平均值為該濃度6隻小鼠的相對表達水平的算術平均值。

其中，對照組為本實驗中施以PBS的對照組小鼠，各測試組為分別施以不同藥物綴合物的給藥組小鼠。結果示於以下表7F中。

表6F 引子的序列

基因	上游引子	下游引子
小鼠ANGPTL3	5’-GAGGAGCAGCTAACCAACTTAAT-3’ （SEQ ID NO: 701）	5’-TCTGCATGTGCTGTTGACTTAAT-3’ （SEQ ID NO: 702）
小鼠β-actin	5’-AGCTTCTTTGCAGCTCCTTCGTTG-3’ （SEQ ID NO: 703）	5’-TTCTGACCCATTCCCACCATCACA-3’ （SEQ ID NO: 704）

表7F 藥物綴合物在小鼠肝臟中的ANGPTL3 mRNA表達抑制率

綴合物序號	綴合物編號	肝臟ANGPTL3 mRNA抑制率（%）
--	PBS	0
綴合物141	N6-siAN1-M1SVP	93.4
綴合物144	N6-siAN2-M2SVP	93.1
綴合物145	N6-siAN1-M3SVP	92.5
綴合物146	N6-siAN1-M3SP	92.9
綴合物147	N6-siAN1-M3SPs	93.6
綴合物154	X2-siAN1-M3SVP	92.1
綴合物155	W2-siAN1-M3SVP	92.7
綴合物156	V2-siAN1-M3SVP	93.3
綴合物157	O2-siAN1-M3SVP	91.8
綴合物158	P2-siAN1-M3SVP	92.5

由表7F的結果可見，與PBS相比，本發明提供的藥物綴合物均顯示出較高的ANGPTL3 mRNA的抑制活性，可達到至少91.8%、最高93.6%的ANGPTL3 mRNA抑制率。

實驗例7-4 本實驗說明表2F的藥物綴合物在體內（in vivo ）對ANGPTL3 mRNA表達量的抑制效率及對血脂的影響

在本實驗例中，考察綴合物141（N6-siAN1M1SVP）及綴合物145-147（N6-siAN1-M3SVP、N6-siAN1-M3SP、N6-siAN1-M3SPs）的藥物綴合物在ob/ob模型小鼠體內對肝臟組織中ANGPTL3表達水平的抑制率和對血清中總膽固醇（CHO）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL-c）含量的影響。

將6-8周齡ob/ob雌性小鼠（購於常州卡文斯實驗動物有限公司）隨機分成9組，每組5隻，分組如下：（1）PBS對照組；（2）N6-siAN1-M1SVP 3mg/kg組；（3）N6-siAN1-M3SVP 3mg/kg組；（4）N6-siAN1-M3SP 3mg/kg組；（5）N6-siAN1-M3SPs 3mg/kg組；（6）N6-siAN1-M1SVP 1mg/kg組；（7）N6-siAN1-M3SVP 1mg/kg組；（8）N6-siAN1-M3SP 1mg/kg組；（9）N6-siAN1-M3SPs 1mg/kg組。所有動物根據體重計算藥量，採用皮下注射方式單次給藥，給藥體積均為10mL/kg。

分別於給藥前2天（記為-2天），及給藥後第7、14、21、28、35、42、49天眼眶採血（約100 µL）用於檢測血脂水平。

第49天處死小鼠，收集肝臟，用RNA later（Sigma Aldrich公司）保存；用組織勻漿儀勻漿肝組織，再用Trizol（Thermo Fisher公司）根據總RNA提取的標準操作步驟提取得到總RNA。

採用與實驗例7-3相同的方法，進行即時螢光定量PCR檢測肝組織中ANGPTL3 mRNA的表達水平。結果示於以下表8F中。

表8F 藥物綴合物對小鼠肝臟中ANGPTL3 mRNA的表達抑制率

綴合物序號	綴合物編號	給藥劑量（mg/kg）	肝臟ANGPTL3 mRNA抑制率（%）
--	PBS	--	0
綴合物141	N6-siAN1-M1SVP	3	86.4
綴合物145	N6-siAN1-M3SVP	3	77.6
綴合物146	N6-siAN1-M3SP	3	76.9
綴合物147	N6-siAN1-M3SPs	3	77.2
綴合物141	N6-siAN1-M1SVP	1	53.2
綴合物145	N6-siAN1-M3SVP	1	56.4
綴合物146	N6-siAN1-M3SP	1	56.2
綴合物147	N6-siAN1-M3SPs	1	56.0

將眼眶採集的血液進行離心得到血清，進一步使用PM1P000/3全自動血清生化儀（SABA，義大利）檢測血清中總膽固醇（CHO）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL-c）的含量，血脂結果進行標準化處理，血脂水平的抑制率按如下等式計算：抑制率＝（1-給藥後測試組血脂含量/給藥前測試組血脂含量）×100%。血脂指總膽固醇、甘油三酯或低密度脂蛋白。檢測結果示於以下表9F、10F和11F中。

表9F 藥物綴合物對小鼠血清中總膽固醇表達水平的影響

綴合物序號	綴合物編號	給藥劑量（mg/kg）	CHO （標準化，以-2天數據為1）
-2天	7天	14天	21天	28天	35天	42天	49天
--	PBS	--	1.00	1.07	1.41	1.06	0.97	0.97	1.07	1.05
綴合物141	N6-siAN1-M1SVP	3	1.00	0.22	0.24	0.22	0.28	0.33	0.41	0.49
綴合物145	N6-siAN1-M3SVP	3	1.00	0.21	0.23	0.24	0.30	0.36	0.42	0.50
綴合物146	N6-siAN1-M3SP	3	1.00	0.22	0.22	0.23	0.31	0.37	0.43	0.49
綴合物147	N6-siAN1-M3SPs	3	1.00	0.21	0.22	0.24	0.31	0.36	0.43	0.50
綴合物141	N6-siAN1-M1SVP	1	1.00	0.27	0.33	0.32	0.38	0.42	0.52	0.58
綴合物145	N6-siAN1-M3SVP	1	1.00	0.31	0.35	0.36	0.42	0.44	0.54	0.52
綴合物146	N6-siAN1-M3SP	1	1.00	0.30	0.36	0.35	0.41	0.43	0.53	0.53
綴合物147	N6-siAN1-M3SPs	1	1.00	0.31	0.35	0.35	0.42	0.43	0.52	0.51

表10F 藥物綴合物對小鼠血清中甘油三酯表達水平的影響

綴合物序號	綴合物編號	給藥劑量（mg/kg）	TG （標準化，以-2天數據為1）
-2天	7天	14天	21天	28天	35天	42天	49天
--	PBS	--	1.00	1.04	1.23	0.94	0.95	1.04	0.98	1.01
綴合物141	N6-siAN1-M1SVP	3	1.00	0.17	0.21	0.19	0.26	0.25	0.28	0.38
綴合物145	N6-siAN1-M3SVP	3	1.00	0.20	0.18	0.23	0.24	0.28	0.31	0.37
綴合物146	N6-siAN1-M3SP	3	1.00	0.21	0.17	0.24	0.23	0.27	0.30	0.38
綴合物147	N6-siAN1-M3SPs	3	1.00	0.20	0.18	0.25	0.24	0.28	0.29	0.37
綴合物141	N6-siAN1-M1SVP	1	1.00	0.25	0.26	0.28	0.33	0.31	0.45	0.47
綴合物145	N6-siAN1-M3SVP	1	1.00	0.25	0.27	0.32	0.39	0.40	0.41	0.49
綴合物146	N6-siAN1-M3SP	1	1.00	0.26	0.28	0.33	0.40	0.41	0.40	0.50
綴合物147	N6-siAN1-M3SPs	1	1.00	0.24	0.29	0.34	0.39	0.42	0.40	0.49

表11F 藥物綴合物對小鼠血清中低密度脂蛋白表達水平的影響

綴合物序號	綴合物編號	給藥劑量（mg/kg）	LDL-c （標準化，以-2天數據為1）
-2天	7天	14天	21天	28天	35天	42天	49天
--	PBS	--	1.00	1.04	1.02	0.97	1.08	1.04	1.02	1.03
綴合物141	N6-siAN1-M1SVP	3	1.00	0.24	0.26	0.24	0.33	0.35	0.34	0.44
綴合物145	N6-siAN1-M3SVP	3	1.00	0.25	0.27	0.28	0.31	0.35	0.36	0.44
綴合物146	N6-siAN1-M3SP	3	1.00	0.24	0.27	0.29	0.32	0.35	0.36	0.45
綴合物147	N6-siAN1-M3SPs	3	1.00	0.25	0.25	0.29	0.31	0.36	0.36	0.46
綴合物141	N6-siAN1-M1SVP	1	1.00	0.34	0.36	0.34	0.44	0.48	0.48	0.54
綴合物145	N6-siAN1-M3SVP	1	1.00	0.37	0.37	0.38	0.41	0.47	0.46	0.56
綴合物146	N6-siAN1-M3SP	1	1.00	0.38	0.38	0.36	0.42	0.48	0.47	0.55
綴合物147	N6-siAN1-M3SPs	1	1.00	0.37	0.37	0.37	0.43	0.48	0.46	0.55

由上述表9F、表10F和表11F的結果可見，不同劑量下的綴合物141、綴合物145、綴合物146或綴合物147的藥物綴合物均能顯著抑制小鼠肝臟組織中ANGPTL3的表達，且存在明顯的劑量依賴響應；綴合物141的藥物綴合物（N6-siAN1-M1SP）在1mg/kg的低劑量下，對ANGPTL3基因表達的抑制率為53.2%；在3mg/kg的高劑量下，對ANGPTL3基因表達的抑制率高達86.4%；同時對小鼠血清中CHO、TG和LDL-c的含量進行了監測，結果顯示經綴合物141或145-147的藥物綴合物治療後的小鼠血清中的CHO、TG和LDL-c的含量明顯下降，並且至少在49天時仍顯示出較高的血脂降低效果。

[實驗例8 表2G的藥物綴合物的效果試驗]

實驗例8-1 本實驗說明表2G的藥物綴合物在Huh7細胞中對APOC3 mRNA表達量的抑制效率檢測。

用DEPC化水將下麵的藥物綴合物分別配製成5 μM、0.5 μM和0.05 μM的共3種不同濃度的藥物綴合物工作液（以siRNA計），所述藥物綴合物為表2G中的綴合物159-183和表2A中的對比綴合物1，對比綴合物1為陰性對照。

配製8A1-8A3溶液，對於每一個藥物綴合物，分別配製8A1、8A2和8A3溶液，每份8A1-8A3溶液依次含有上述3個濃度的藥物綴合物工作液0.6 μl和Opti-MEM培養基50μl。

配製8B溶液，每份8B溶液含有1 μl Lipofectamine™ 2000和50μl Opti-MEM培養基。

分別將一份8B溶液與得到的每個藥物綴合物的8A1-8A3溶液混合，分別室溫下培養20min，得到每個藥物綴合物的轉染複合物8X1-8X3。

將一份8B溶液與Opti-MEM培養基50μl混合，室溫下培養20min，得到轉染複合物8X4。

在培養孔中，分別加入每一個藥物綴合物的轉染複合物8X1-8X3，均勻混合，加入量為100μl/孔，得到每個藥物綴合物的終濃度（以siRNA計）分別約為5 nM、0.5 nM和0.05 nM的轉染複合物，每個藥物綴合物的轉染複合物8X1-8X3分別轉染3個培養孔，得到含siRNA的轉染混合物，記為測試組。

在另外三個培養孔中，分別加入轉染複合物8X4，加入量為100μl/孔，得到不含藥物綴合物的轉染混合物，記為空白對照組。

將含藥物綴合物的轉染混合物和不含藥物綴合物的轉染混合物在培養孔中轉染4 h後，每孔補加1 ml 含20% FBS的H-DMEM完全培養基。將24孔板置於CO₂ 培養箱繼續培養24h。

對於每一反轉錄反應體系，分別取上述含cDNA的溶液5μl做範本，使用NovoStart^® SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒（購自近岸蛋白質科技有限公司，貨號E096-01B）提供的試劑配置qPCR反應體系20μl，其中，用於擴增目標基因APOC3和內參基因β-actin的PCR引子序列如表3G所示，每條引子的終濃度為0.25μM。將各qPCR反應體系置於ABI StepOnePlus Real-Time PCR儀上，使用三步法進行擴增，擴增程式為95^o C預變性10min，然後95^o C變性30s，60^o C退火30s，72^o C延伸30s，重複上述變性、退火、延伸的過程共40次後，得到含有擴增了目標基因APOC3和內參基因β-actin的產物W。產物W隨即依次經過95^o C 15s，60^o C 1min，95^o C 15s的培養，即時螢光定量PCR儀分別收集產物W中目標基因APOC3和內參基因β-actin的溶解曲線，得到目標基因APOC3和內參基因β-actin的Ct值。

表3G 引子信息

基因	上游引子	下游引子
人APOC3	5'- GTGACCGATGGCTTCAGTTC -3' （SEQ ID NO: 705）	5'- ATGGATAGGCAGGTGGACTT -3' （SEQ ID NO: 706）
人β-actin	5'- CCAACCGCGAGAAGATGA - 3' （SEQ ID NO: 707）	5'- CCAGAGGCGTACAGGGATAG -3' （SEQ ID NO: 708）

採用比較Ct（ΔΔCt）法，對各測試組中目標基因APOC3進行相對定量計算，計算方法如下： ΔCt(測試組) = Ct(測試組目標基因) – Ct(測試組內參基因) ΔCt(對照組) = Ct(對照組目標基因) – Ct(對照組內參基因) ΔΔCt(測試組) = ΔCt(測試組) - ΔCt(對照組平均) ΔΔCt(對照組) = ΔCt(對照組) - ΔCt(對照組平均) 其中，ΔCt(對照組平均)是對照組三個培養孔各自的ΔCt(對照組)的算術平均值。從而，測試組和對照組的每一培養孔均對應一個ΔΔCt值。

以對照組為基準，對測試組APOC3 mRNA的表達水平進行歸一化，定義空白對照組APOC3 mRNA表達水平為100%，測試組APOC3 mRNA相對表達水平 = 2^-ΔΔCt( ^測試組 ⁾ × 100% 測試組APOC3 mRNA抑制率 = (1-測試組APOC3 mRNA相對表達水平) × 100% 各藥物綴合物對APOC3 mRNA的抑制率總結於表4G中。對於同一測試組的藥物綴合物，mRNA抑制率是兩個培養孔測定的測試組APOC3 mRNA抑制率的算術平均值。

表4G 不同濃度藥物綴合物在Huh7細胞中對APOC3 mRNA的抑制率

綴合物序號	綴合物編號	mRNA抑制率（%）
5nM	0.5nM	0.05nM
綴合物159	N6-siAP1	53.3	33.3	12.5
綴合物160	N6-siAP2	54.1	35.4	13.6
綴合物161	N6-siAP1-M1	53.5	35.2	13.7
綴合物162	N6-siAP2-M1	55.2	33.1	12.8
綴合物163	N6-siAP1-M2	55.1	34.5	14.4
綴合物164	N6-siAP2-M2	57.6	34.2	15.1
綴合物165	N6-siAP1-M1VP	53.2	34.3	15.0
綴合物166	N6-siAP2-M1VP	57.4	32.8	14.6
綴合物167	N6-siAP1-M2VP	56.2	33.4	16.3
綴合物168	N6-siAP2-M2VP	58.3	32.7	13.4
綴合物169	N6-siAP1-M1S	57.1	41.2	16.8
綴合物170	N6-siAP2-M1S	57.3	38.7	16.1
綴合物171	N6-siAP1-M2S	60.2	43.1	17.4
綴合物172	N6-siAP2-M2S	57.5	37.6	15.4
綴合物173	N6-siAP1-M1SVP	57.8	41.2	15.2
綴合物174	N6-siAP2-M1SVP	58.2	42.6	17.3
綴合物175	N6-siAP1-M2SVP	59.5	43.2	20.1
綴合物176	N6-siAP1-M2SP	59.1	42.2	20.5
綴合物177	N6-siAP1-M2SPs	57.4	41.3	20.8
綴合物178	N6-siAP4-M2S	57.1	38.5	21.9
綴合物179	X2-siAP1-M2SVP	57.8	39.8	18.3
綴合物180	W2-siAP1-M2SVP	56.4	40.2	21.1
綴合物181	V2-siAP1-M2SVP	61.3	41.5	18.9
綴合物182	O2-siAP1-M2SVP	59.4	40.3	18.4
綴合物183	P2-siAP1-M2SVP	57.7	44.1	19.6
對比綴合物1	N6-NC	7.8	3.1	0.2

從表4G的結果可以看出，在各個濃度下，本發明提供的藥物綴合物在細胞水平上均顯示出了優異的APOC3 mRNA表達抑制活性，5nM濃度下，藥物綴合物抑制率達到53.2%以上，有些綴合物可達到61%以上的抑制率。

實驗例8-2 本實驗說明表2G的藥物綴合物在體外人血漿中的穩定性

用DEPC化水將綴合物161-183和對比綴合物1分別配製成20μM（以siRNA計）的溶液。

分別取上述濃度為20μM的綴合物161-183、對比綴合物1中的每一個，每組12μl溶液，分別與108 μL 90%人血漿（來自江蘇省血液研究所，用1×PBS（pH7.4）稀釋）快速混合均勻，獲得混合液，在37^o C恆溫培養。在培養過程中，分別在0、8、24、48小時取出10 μL混合液，立即進行液氮速凍，於-80^o C冰箱中凍存。其中，0小時是指綴合物溶液與90%人血漿混勻後，立即取出10μL混合液的時刻。待各時間點取樣完畢後，用1×PBS（pH7.4）將各混合液稀釋5倍後，每一稀釋混合液10 μL準備電泳。分別將等莫耳量的綴合物161-183溶液（2μM，2μl）與8μl 1×PBS（pH7.4）混勻，製備成10μL未經人血漿處理的樣品，記為未處理，準備電泳。

配製20重量%的非變性聚丙烯醯胺凝膠，將每一組的上述準備電泳的樣品與4μl上樣緩衝液（20mM EDTA，36重量%甘油，0.06重量%溴酚藍）混勻，依次上樣至各凝膠孔，在80mA恒流條件下電泳60分鐘。電泳結束後，取出凝膠，用1×Sybr Gold染料（Invitrogen，Cat.11494）染色15分鐘，成像並計算穩定性結果。

表5G示出了表2G中所列的藥物綴合物與對比綴合物在體外人血漿中的穩定性半定量檢測結果。該結果以藥物綴合物和對比綴合物與人血漿培養後殘留的最長片段與未經處理的siRNA最長片段的比例（RL）表示。

表5G 不同藥物綴合物隨時間的血漿穩定性

綴合物序號	綴合物編號	RL（%）
未處理	0h	8h	24h	48h
綴合物161	N6-siAP1-M1	100	100	99.4	98.0	95.1
綴合物162	N6-siAP2-M1	100	100	99.4	96.2	96.2
綴合物163	N6-siAP1-M2	100	100	99.6	96.1	98.3
綴合物164	N6-siAP2-M2	100	100	99.7	96.2	98.4
綴合物165	N6-siAP1-M1VP	100	100	99.6	98.3	93.1
綴合物166	N6-siAP2-M1VP	100	100	99.5	95.1	95.2
綴合物167	N6-siAP1-M2VP	100	100	99.5	96.2	96.7
綴合物168	N6-siAP2-M2VP	100	100	99.1	97.0	98.4
綴合物169	N6-siAP1-M1S	100	100	99.4	93.1	98.8
綴合物170	N6-siAP2-M1S	100	100	99.3	95.4	94.4
綴合物171	N6-siAP1-M2S	100	100	98.5	98.3	98.2
綴合物172	N6-siAP2-M2S	100	100	99.2	96.1	99.3
綴合物173	N6-siAP1-M1SVP	100	100	99.1	98.4	99.1
綴合物174	N6-siAP2-M1SVP	100	100	99.1	96.5	96.9
綴合物175	N6-siAP1-M2SVP	100	100	99.1	98.3	98.2
綴合物176	N6-siAP1-M2SP	100	100	99.3	95.8	94.4
綴合物177	N6-siAP1-M2SPs	100	100	99.2	98.1	95.1
綴合物178	N6-siAP4-M2S	100	100	99.1	96.1	98.2
綴合物179	X2-siAP1-M2SVP	100	100	99.0	97.2	99.0
綴合物180	W2-siAP1-M2SVP	100	100	99.1	98.0	95.1
綴合物181	V2-siAP1-M2SVP	100	100	99.1	95.4	94.2
綴合物182	O2-siAP1-M2SVP	100	100	99.2	96.2	95.3
實施例183	P2-siAP1-M2SVP	100	100	99.3	98.1	96.2
對比綴合物1	N6-NC	100	100	99.1	98.3	98.2

由表5G的結果可以看出，本發明提供的藥物綴合物在血漿中均顯示出優異的穩定性，在48小時仍具有高於93%的siRNA片段長度比例。

實驗例8-3 本實驗說明表2G的藥物綴合物在體內（in vivo ）對APOC3 mRNA表達量的抑制效率

在本實驗例中，考察綴合物172、173、175-177和179-183在人APOC3轉基因小鼠（B6；CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J，購於Jackson Lab）體內對肝臟組織中APOC3表達水平的抑制。

將6-8周齡人APOC3轉基因小鼠隨機分組，每組6隻，雌雄各半，按照表2G中的藥物綴合物對每組小鼠編號，然後分別向每組小鼠給予綴合物172、173、175-177和179-183的藥物綴合物。所有動物根據體重計算藥量，採用皮下注射方式單次給藥，各綴合物以0.3 mg/ml的0.9%氯化鈉水溶液形式給予，給藥體積為10 ml/kg小鼠體重，即，每一綴合物的給藥劑量為3 mg/kg。對另外一組小鼠中的每隻給予1×PBS，給藥體積均為10ml/kg，作為對照組。

給藥後28天處死小鼠，分別收集每隻小鼠的肝臟組織，用RNA later（Sigma Aldrich公司）保存；用組織勻漿儀勻漿肝組織，再用Trizol（Thermo Fisher公司）根據總RNA提取的標準操作步驟提取得到總RNA。

對於每隻小鼠的肝臟組織，分別取1 μg總RNA，使用ImProm-IITM反轉錄試劑盒（Promega公司）按其說明書將提取的總RNA逆轉錄為cDNA，得到含cDNA的溶液，接著用螢光定量PCR試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）檢測肝組織中的APOC3 mRNA的表達量。在該螢光定量PCR法中，以β-肌動蛋白（β-actin）基因作為內參基因，使用針對APOC3的引子和針對β-肌動蛋白的引子分別對APOC3和β-肌動蛋白進行檢測。檢測引子的序列參見表6G所示。

採用比較Ct（ΔΔCt）法，對各測試組和對照組中目標基因APOC3的表達量進行相對定量計算，計算方法如下： ΔCt(測試組) = Ct(測試組目標基因) – Ct(測試組內參基因) ΔCt(對照組) = Ct(對照組目標基因) – Ct(對照組內參基因) ΔΔCt(測試組) = ΔCt(測試組) - ΔCt(對照組平均) ΔΔCt(對照組) = ΔCt(對照組) - ΔCt(對照組平均) 其中，ΔCt(對照組平均)是對照組6隻小鼠各自的ΔCt(對照組)的算術平均值。從而，測試組和對照組的每隻小鼠均對應一個ΔΔCt值。

以對照組為基準，對測試組APOC3 mRNA的表達水平進行歸一化，定義對照組APOC3 mRNA表達水平為100%，測試組APOC3 mRNA相對表達水平 = 2^-ΔΔCt( ^測試組 ⁾ × 100%。

對於同一測試組siRNA，每一濃度下的測試組APOC3 mRNA相對表達水平平均值為該濃度6隻小鼠的相對表達水平的算術平均值。

其中，對照組為本實驗中施以PBS的對照組小鼠，各測試組為分別施以不同藥物綴合物的給藥組小鼠。結果示於以下表7G中。

表6G 引子的序列

基因	上游引子	下游引子
人APOC3	5'- GTGACCGATGGCTTCAGTTC -3' （SEQ ID NO: 709）	5'- ATGGATAGGCAGGTGGACTT -3' （SEQ ID NO: 710）
小鼠β-actin	5’-AGCTTCTTTGCAGCTCCTTCGTTG-3’ （SEQ ID NO: 711）	5’-TTCTGACCCATTCCCACCATCACA-3’ （SEQ ID NO: 712）

表7G 藥物綴合物在小鼠肝臟中的APOC3 mRNA的表達抑制率

綴合物序號	綴合物編號	劑量 mg/kg	肝臟APOC3 mRNA抑制率（%）
--	PBS	--	0
綴合物172	N6-siAP2-M2S	3	71.4
綴合物173	N6-siAP1-M1SVP	3	81.2
綴合物175	N6-siAP1-M2SVP	3	82.5
綴合物176	N6-siAP1-M2SP	3	81.5
綴合物177	N6-siAP1-M2SPs	3	81.9
綴合物179	X2-siAP1-M2SVP	3	80.6
綴合物180	W2-siAP1-M2SVP	3	78.2
綴合物181	V2-siAP1-M2SVP	3	79.4
綴合物182	O2-siAP1-M2SVP	3	80.8
綴合物183	P2-siAP1-M2SVP	3	77.5

由表7G的結果可見，與PBS相比，本發明的藥物綴合物均顯示出優異的APOC3 mRNA的抑制活性，可達到至少71.4%、最高82.5%的APOC3 mRNA抑制率。

實驗例8-4 本實驗說明綴合物175-177的藥物綴合物在體內（in vivo ）對血脂含量的影響

在本實驗例中，考察綴合物175-177的藥物綴合物（N6-siAP1-M2SVP、N6-siAP1-M2SP和N6-siAP1-M2SPs）在人APOC3轉基因小鼠（B6；CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J，購於Jackson Lab）體內對血清中總膽固醇（CHO）和甘油三酯（TG）含量的影響。

將6-8周齡人APOC3轉基因小鼠隨機分為3組，每組6隻（雌雄各半），分組如下：（1）PBS對照組；（（2）綴合物175 3mg/kg組；（3）綴合物175 1mg/kg組；（4）綴合物176 3mg/kg組；（5）綴合物176 1mg/kg組；（6）綴合物177 3mg/kg組；（7）綴合物177 1mg/kg組。所有動物根據體重計算藥量，採用皮下注射方式單次給藥，藥物綴合物給藥體積為10mL/kg。

分別於給藥前1天（記為-1天），及給藥後第7、14、21、28、35、42、49、65天進行眼眶採血（約100 µL），離心得到血清，進一步使用PM1P000/3全自動血清生化儀（SABA，義大利）檢測血清中總膽固醇（CHO）和甘油三酯（TG）的含量，血脂結果進行標準化處理，血脂水平的抑制率按如下等式計算：抑制率＝（1-給藥後測試組血脂含量/給藥前測試組血脂含量）×100%。血脂指總膽固醇或甘油三酯。檢測結果示於以下表8G中。

表8G 藥物綴合物對小鼠血清中總膽固醇和甘油三酯表達水平的影響

檢測點	抑制率%
綴合物175 3mg/kg	綴合物175 1mg/kg	綴合物176 3mg/kg	綴合物176 1mg/kg	綴合物177 3mg/kg	綴合物177 1mg/kg
CHO	TG	CHO	TG	CHO	TG	CHO	TG	CHO	TG	CHO	TG
7天	54.2	84.3	57.3	85.1	53.8	83.9	56.8	85.3	53.7	83.8	57.0	84.7
14天	53.1	82.6	51.2	80.0	53.2	82.4	51.0	79.6	52.9	81.9	50.8	80.2
21天	46.5	83.6	44.5	83.2	46.1	83.2	44.3	82.8	46.4	83.2	44.6	83.1
28天	55.1	88.1	53.5	82.5	54.8	87.5	53.4	82.1	54.5	87.2	53.2	82.7
35天	53.6	85.3	50.1	79.6	53.2	85.1	49.5	79.8	53.8	84.6	50.5	79.1
42天	55.2	85.1	55.2	77.4	54.8	85.0	55.1	77.6	54.9	84.8	54.2	77.1
49天	52.9	79.3	40.5	71.4	52.5	78.8	40.2	72.1	52.8	79.8	41.3	71.2
65天	58.4	75.2	49.3	66.7	57.5	75.0	75.3	66.5	56.9	75.4	48.8	66.2

由表8G可見，綴合物175-177所示的藥物綴合物對小鼠血清中總膽固醇和甘油三酯的含量有明顯下調作用，並且至少在65天時仍顯示出較高的血脂降低效果。

實驗例8-5本實驗說明藥物綴合物在C57BL/6J小鼠中的靶mRNA抑制效率。

在本實驗例中，考察綴合物184在C57BL/6J小鼠體內對肝臟組織中APOC3表達水平的抑制。

將6-8周齡C57BL/6J小鼠（購於購自北京大學醫學部實驗動物科學部）按照體重隨機分組，每組5隻，均為雌性，以綴合物184對每組小鼠編號，然後分別向每組小鼠給予待測綴合物184。所有動物根據體重計算藥量，採用皮下注射方式單次給藥，各綴合物分別以0.2 mg/ml和0.02mg/ml的0.9%氯化鈉水溶液形式給予，給藥體積為5 ml/kg小鼠體重，即，每一綴合物的給藥劑量分別為1 mg/kg和0.1mg/kg。

對其中一組小鼠給予1×PBS，給藥體積均為5ml/kg，作為對照組。

給藥後72h處死動物，分別收集每隻小鼠的肝臟組織，用RNA later（Sigma Aldrich公司）保存；用組織勻漿儀勻漿肝組織，再用Trizol（Thermo Fisher公司）根據說明書描述的操作步驟提取得到總RNA。

對於每隻小鼠的肝臟組織，分別取1μg總RNA，使用ImProm-IITM反轉錄試劑盒（Promega公司）按其說明書將提取的總RNA逆轉錄為cDNA，得到含cDNA的溶液，接著用螢光定量PCR試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）檢測肝組織中的TTr mRNA的表達量。在該螢光定量PCR法中，以GAPDH基因作為內參基因，使用針對TTr的引子和針對β-肌動蛋白的引子分別對TTr和GAPDH進行檢測。檢測引子的序列參見表9G所示。

採用比較Ct（ΔΔCt）法，對各測試組和對照組中目標基因TTr的表達量進行相對定量計算，計算方法如下： ΔCt(測試組) = Ct(測試組目標基因) – Ct(測試組內參基因) ΔCt(對照組) = Ct(對照組目標基因) – Ct(對照組內參基因) ΔΔCt(測試組) = ΔCt(測試組) - ΔCt(對照組平均) ΔΔCt(對照組) = ΔCt(對照組) - ΔCt(對照組平均) 其中，ΔCt(對照組平均)是對照組5隻小鼠各自的ΔCt(對照組)的算術平均值。從而，測試組和對照組的每隻小鼠均對應一個ΔΔCt值。

以對照組為基準，對測試組TTr mRNA的表達水平進行歸一化，定義對照組TTr mRNA表達水平為100%，測試組TTr mRNA相對表達水平 = 2^-ΔΔCt( ^測試組 ⁾ × 100%。

對於同一測試組siRNA，每一濃度下的測試組TTr mRNA相對表達水平平均值為該濃度5隻小鼠的相對表達水平的算術平均值。

其中，對照組為本實驗中施以PBS的對照組小鼠，各測試組為分別施以不同藥物綴合物的給藥組小鼠。結果示於以下表10G中。

表9G 引子的序列

基因	上游引子	下游引子
mTTR	5'- CCGTCTGTGCCTTCTCATCT -3' （SEQ ID NO: 715）	5'- TAATCTCCTCCCCCAACTCC -3' （SEQ ID NO: 716）
GAPDH	5'- AGAAGGCTGGGGCTCATTTG- 3' （SEQ ID NO: 717）	5'- AGGGGCCATCCACAGTCTTC -3' （SEQ ID NO: 718）

表10G 小鼠中mTTR mRNA抑制效果

綴合物序號	綴合物編號	mRNA抑制率（%）
1mg/kg	0.1mg/kg
綴合物184	N6-siTTR-M2SVP	90	38

根據結果可見，綴合物184對小鼠體內靶mRNA（TTR mRNA）具有優異的抑制效果，最高可達90%。

以上詳細描述了本發明的具體實施方式，但是，本發明並不限於上述實施方式中的具體細節，在本發明的技術構思範圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬於本發明的保護範圍。

另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特徵，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重複，本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。

此外，本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發明的思想，其同樣應當視為本發明所公開的內容。

無。

圖1是藥物綴合物在體外人血漿中的穩定性半定量檢測結果。

圖2是藥物綴合物在體外猴血漿中的穩定性半定量檢測結果。

圖3是給予1mg/kg和0.5mg/kg的藥物綴合物後，在大鼠血漿中PK/TK濃度的經時代謝曲線。

圖4是給予1mg/kg和0.5mg/kg的藥物綴合物後，在大鼠肝臟中PK/TK濃度的經時代謝曲線。

圖5是給予C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J小鼠1mg/kg和0.1mg/kg的藥物綴合物後，在小鼠體內（in vivo ）中HBV mRNA的抑制率。

圖6是給予3mg/kg和1mg/kg的藥物綴合物後，在M-Tg HBV轉基因小鼠體內（in vivo ）對血清HbsAg水平影響的時間相關性曲線。

圖7A是給予1mg/kg和0.1mg/kg的藥物綴合物後，在C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J小鼠體內（in vivo ）中HBV mRNA的抑制率。

圖7B是給予1mg/kg和0.1mg/kg的不同的藥物綴合物後，在C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J小鼠體內（in vivo ）中HBV mRNA的抑制率。

圖8A是給予3mg/kg和1mg/kg的藥物綴合物後，在M-Tg HBV轉基因小鼠體內（in vivo ）對血清HBsAg水平影響的時間相關性曲線。

圖8B是給予3mg/kg和1mg/kg的藥物綴合物後，在M-Tg HBV轉基因小鼠體內（in vivo ）對血清HBV DNA水平影響的時間相關性曲線。

圖9是給予1mg/kg和3mg/kg的藥物綴合物後第70天時，在M-Tg HBV轉基因小鼠中HBV mRNA的抑制率。

Claims

一種化合物，所述化合物具有式（101）所示的結構：
式（101）其中，A₀ 具有式（312）所示的結構，
式（312）其中，n₁ 為1-4的整數，n₂ 為0-3的整數；每個R₁ 各自獨立地選自H、取代或未取代的C₁ -C₄ 烴基和鹵素中的一種；每個L₁ 是長度為1-70個碳原子的直鏈亞烷基，其中一個或多個碳原子任選地被選自於以下基團所組成的組中的任何一個或多個所替換：C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)₂ 、C₂ -C₁₀ 亞烯基、C₂ -C₁₀ 亞炔基、C₆ -C₁₀ 亞芳基、C₃ -C₁₈ 亞雜環基和C₅ -C₁₀ 亞雜芳基；並且其中，L₁ 任選地具有由以下基團所組成的組中的任何一個或多個的取代基：C₁ -C₁₀ 烷基、C₆ -C₁₀ 芳基、C₅ -C₁₀ 雜芳基、C₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-OC₁ -C₁₀ 烷基、OC₁ -C₁₀ 烷基苯基、-C₁ -C₁₀ 烷基-OH、-OC₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-SC₁ -C₁₀ 烷基、-SC₁ -C₁₀ 烷基苯基、-C₁ -C₁₀ 烷基-SH、-SC₁ -C₁₀ 鹵代烷基、鹵素取代基、-OH、-SH、-NH₂ 、-C₁ -C₁₀ 烷基-NH₂ 、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-NH(C₁ -C₁₀ 烷基)、N(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基苯基)、NH(C₁ -C₁₀ 烷基苯基)、氰基、硝基、-CO₂ H、-C(O)O(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CON(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CONH(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CONH₂ ，-NHC(O)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)C(O)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)C(O)(苯基)、C(O)C₁ -C₁₀ 烷基、C(O)C₁ -C₁₀ 烷基苯基、C(O)C₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-OC(O)C₁ -C₁₀ 烷基、-SO₂ (C₁ -C₁₀ 烷基)、-SO₂ (苯基)、-SO₂ (C₁ -C₁₀ 鹵代烷基)、-SO₂ NH₂ 、-SO₂ NH(C₁ -C₁₀ 烷基)、-SO₂ NH(苯基)、-NHSO₂ (C₁ -C₁₀ 烷基)、-NHSO₂ (苯基)和-NHSO₂ (C₁ -C₁₀ 鹵代烷基)；
表示基團共價連接的位點；每個S₁ 獨立地為M₁ ，其中任何活性羥基和/或氨基，如果有的話，都被保護基團保護；每個M₁ 獨立地選自能夠和細胞表面受體結合的配體；R_j 為連接基團；R₇ 是任何能經過反應與羥基形成磷酸酯連接、硫代磷酸酯連接、硼代磷酸酯連接或羧酸酯連接、或者能經過反應與氨基形成醯胺鍵連接的官能團；R₈ 是羥基保護基團。
如請求項1所述之化合物，其中，每個L₁ 獨立地選自式A1-A26基團中的一種或多種的連接組合；
、
、
、
、（A1）             （A2）             （A3）             （A4）
、
、
、
、（A5）             （A6）                （A7）              （A8）
、
、
、（A9）                （A10）                        （A11）
、
、
、（A12）                    （A13）                         （A14）
、
、
、（A15）                    （A16）                            （A17）
、
、
、
、（A18）            （A19）            （A20）           （A21）
、
、
、（A22）                         （A23）                      （A24）
、
；（A25）                     （A26）其中，j1為1-20的整數；j2為1-20的整數；R’為C₁ -C₁₀ 烷基；Ra選自式A27-A45所示基團中的一種；Rb為C₁ -C₁₀ 烷基；
、
、
、
、
、
、（A27）（A28）（A29）             （A30）          （A31）（A32）
、
、
、
、
、（A33）       （A34）      （A35）     （A36）（A37）
、
、
、
、
、（A38）         （A39）   （A40）      （A41）        （A42）
、
或
（A43）   （A44）      （A45）   。
如請求項2所述之化合物，其中，L₁ 選自式A1、A2、A4、A5、A6、A8、A10、A11、A13中的一種或多種的連接組合。
2或3所述之化合物，其中，L₁ 的長度為3-25個原子，所述L₁ 的長度是指與A₀ 中的N原子連接的原子到與S₁ 連接的原子形成的最長的原子鏈上的成鏈原子的個數。
如請求項1或2所述之化合物，其中，n₁ 為1或2，n₂ 為1或2。
如請求項1或2所述之化合物，其中，A₀ 具有如式（120）所示的結構：
式（120）。
如請求項1或2所述之化合物，其中，每個M₁ 獨立地選自親脂類分子、糖類、維生素、多肽、內涵體裂解物質、類固醇化合物、萜烯化合物、整合素受體抑制劑和陽離子脂質分子及它們的衍生物形成的配體中的一種。
如請求項7所述之化合物，其中，每個M₁ 獨立地選自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-***糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺、N-三氟乙醯基半乳糖胺、N-丙醯基半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺、N-異丁醯基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-去氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-去氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二去氧-4-甲醯胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-去氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇醯基-α-神經氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙醯基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙醯基-2-去氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脫水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖中的一種。
如請求項1或2所述之化合物，其中，每個S₁ 獨立地選自式A51-A59基團中的一種：
、
、
、（A51）                              （A52）                           （A53）
、
、
、（A54）                      （A55）                  （A56）
、
、
（A57）                   （A58）                             （A59）其中，每個Y獨立地選自甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、異丙基、苯基、鹵代苯基以及烷基苯基中的一種。
如請求項1或2所述之化合物，其中，每個M₁ 獨立地選自以下基團中的一種：膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睾酮、1,3-雙-O（十六烷基）甘油、六甘油、薄荷醇、薄荷腦、1,3-丙二醇、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-（油醯基）石膽酸、苯噁嗪、葉酸、葉酸的衍生物、維生素A、維生素B7（biotin）、吡哆醛、熊果醇、三萜烯、軟木三萜酮、表木栓醇衍生石膽酸中的一種化合物所形成的配基，或者香葉基氧基己基、十七烷基、二甲氧基三苯甲基、龍舌蘭皂苷配基、薯蕷皂苷元或菝葜皂苷元。
如請求項1或2所述之化合物，其中，每個S₁ 獨立地選自式A71-A75基團中的一種，其中，n3選自1-5的整數，

式（A71）                                式（A72）

式（A73）                                     式（A74）
式（A75）                            。
如請求項1或2所述之化合物，其中，R_j 選自式A62-A67所示基團中的一種：
、
、
、
式（A62）式（A63）式（A64）式（A65）
、
式（A66）式（A67）。
如請求項1或2所述之化合物，其中，R₇ 為包含亞磷醯胺、羧基或羧酸鹽官能團的基團。
如請求項13所述之化合物，其中，R₇ 具有式（A46）、式（C1）或式（C2）所示的結構，
式（A46）

（C1）（C2）其中，每個B₁ 相同或不同，選自取代或未取代的C₁ -C₅ 烴基；B₂ 選自C₁ -C₅ 烷基、乙氰基、丙氰基和丁氰基中的一種；n4為1-4的整數，M⁺ 為陽離子，
表示基團共價連接的位點。
2、13或14所述之化合物，其中，所述化合物具有式（403）-（408）中任意一個所示的結構：
式（403）
式（404）
式（405）
式（406）
式（407），
式（408）。
一種化合物，所述化合物具有式（111）所示的結構：
式（111）其中，A₀ 具有如式（312）所示的結構：
式（312）式中，n₁ 為1-4的整數，n₂ 為0-3的整數；每個R₁ 各自獨立地選自H、取代或未取代的C₁ -C₄ 烴基或鹵素；每個L₁ 是長度為1-70個碳原子的直鏈亞烷基，其中一個或多個碳原子任選地被選自於以下基團所組成的組中的任何一個或多個所替換：C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)₂ 、C₂ -C₁₀ 亞烯基、C₂ -C₁₀ 亞炔基、C₆ -C₁₀ 亞芳基、C₃ -C₁₈ 亞雜環基和C₅ -C₁₀ 亞雜芳基；並且其中，L₁ 任選地具有由以下基團所組成的組中的任何一個或多個的取代基：C₁ -C₁₀ 烷基、C₆ -C₁₀ 芳基、C₅ -C₁₀ 雜芳基、C₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-OC₁ -C₁₀ 烷基、OC₁ -C₁₀ 烷基苯基、-C₁ -C₁₀ 烷基-OH、-OC₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-SC₁ -C₁₀ 烷基、-SC₁ -C₁₀ 烷基苯基、-C₁ -C₁₀ 烷基-SH、-SC₁ -C₁₀ 鹵代烷基、鹵素取代基、-OH、-SH、-NH₂ 、-C₁ -C₁₀ 烷基-NH₂ 、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-NH(C₁ -C₁₀ 烷基)、N(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基苯基)、NH(C₁ -C₁₀ 烷基苯基)、氰基、硝基、-CO₂ H、-C(O)O(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CON(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CONH(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CONH₂ ，-NHC(O)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)C(O)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)C(O)(苯基)、C(O)C₁ -C₁₀ 烷基、C(O)C₁ -C₁₀ 烷基苯基、C(O)C₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-OC(O)C₁ -C₁₀ 烷基、-SO₂ (C₁ -C₁₀ 烷基)、-SO₂ (苯基)、-SO₂ (C₁ -C₁₀ 鹵代烷基)、-SO₂ NH₂ 、-SO₂ NH(C₁ -C₁₀ 烷基)、-SO₂ NH(苯基)、-NHSO₂ (C₁ -C₁₀ 烷基)、-NHSO₂ (苯基)和-NHSO₂ (C₁ -C₁₀ 鹵代烷基)；每個S₁ 獨立地為M₁ ，其中任何活性羥基和/或氨基，如果有的話，都被保護基團保護；每個M₁ 獨立地選自能夠和細胞表面受體結合的配體； W₀ 為連接基團； X選自O或NH； R_j 為連接基團；SPS表示固相載體；R₈ 是羥基保護基團；n為0-7的整數。
如請求項16所述之化合物，其中，每個L₁ 獨立地選自式A1-A26基團中的一種或多種的連接組合；
、
、
、
、（A1）             （A2）                （A3）          （A4）
、
、
、
、（A5）           （A6）              （A7）               （A8）
、
、
、（A9）                       （A10）                      （A11）
、
、
、（A12）                         （A13）                        （A14）
、
、
、（A15）                 （A16）                              （A17）
、
、
、
、（A18）           （A19）            （A20）              （A21）
、
、
、（A22）                         （A23）                      （A24）
、
；（A25）                          （A26）其中，j1為1-20的整數；j2為1-20的整數；R’為C₁ -C₁₀ 烷基；Ra選自式A27-A45基團中的一種；Rb為C₁ -C₁₀ 烷基；
表示基團共價連接的位點；
、
、
、
、
、
、（A27）（A28）   （A29）               （A30）              （A31）（A32）
、
、
、
、
、（A33）      （A34）     （A35）       （A36）   （A37）
、
、
、
、
、（A38）      （A39）    （A40）      （A41）          （A42）
、
或
（A43）（A44）      （A45）         。
如請求項16或17所述之化合物，其中，L₁ 選自式A1、A2、A4、A5、A6、A8、A10、A11、A13中的一種或多種的連接組合。
如請求項16或17所述之化合物，其中，L₁ 的長度為3-25個原子，所述L₁ 的長度是指與A₀ 中的N原子連接的原子到與M₁ 連接的原子形成的最長的原子鏈上的成鏈原子的個數。
如請求項16或17所述之化合物，其中，n₁ 為1或2，n₂ 為1或2。
如請求項20所述之化合物，其中，A₀ 具有如式（120）所示的結構：
式（120）。
如請求項16或17所述之化合物，其中，每個M₁ 獨立地選自親脂類分子、糖類、維生素、多肽、內吞體裂解物質、類固醇化合物、萜烯化合物、整合素受體抑制劑和陽離子脂質分子中的分子或衍生物形成的配基中的一種。
如請求項22所述之化合物，其中，每個M₁ 獨立地選自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-***糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺、N-三氟乙醯基半乳糖胺、N-丙醯基半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺、N-異丁醯基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-去氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-去氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二去氧-4-甲醯胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-去氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇醯基-α-神經氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙醯基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙醯基-2-去氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脫水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖中的一種。
如請求項16或17所述之化合物，其中，每個S₁ 獨立地選自式A51-A59基團中的一種：
、
、
、（A51）                               （A52）                        （A53）
、
、
、（A54）                      （A55）                   （A56）
、
、
（A57）                    （A58）                          （A59）其中，每個Y獨立地選自甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、異丙基、苯基、鹵代苯基以及烷基苯基中的一種。
如請求項16或17所述之化合物，其中，每個M₁ 獨立地選自以下基團中的一種：膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睾酮、1,3-雙-O（十六烷基）甘油、香葉基氧基己基、六甘油、薄荷醇、薄荷腦、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-（油醯基）石膽酸、二甲氧基三苯甲基、苯噁嗪、葉酸、葉酸的衍生物、維生素A、維生素B7（biotin）生物素、吡哆醛、熊果醇、龍舌蘭皂苷配基、薯蕷皂苷元、三萜烯、薩灑皂草配基、軟木三萜酮、表木栓醇衍生石膽酸中的一種化合物所形成的的配基，或者香葉基氧基己基、十七烷基、二甲氧基三苯甲基、龍舌蘭皂苷配基、薯蕷皂苷元或菝葜皂苷元。
如請求項16或17所述之化合物，其中，每個S₁ 獨立地選自式A71-A75所示基團中的一種：

式（A71）式（A72）

式（A73）式（A74）
式（A75）其中，n3選自1-5的整數，
表示基團共價連接的位點。
如請求項31所述之化合物，其中，R_j 選自式A62-A67所示基團中的一種：
、
、
、
式（A62）式（A63）式（A64）式（A65）
、
式（A66）式（A67）。
如請求項16或17所述之化合物，其中，每個W₀ 獨立地具有如式（C1’）或式（A81）所示的結構：
,
式(C1’) 式(A81) 其中，n4為1-4的整數，每個E₀ 獨立地為O、S或BH，每個B₂ 獨立地選自C₁ -C₅ 烷基、乙氰基、丙氰基和丁氰基，
表示基團連接的位點。
如請求項16或17所述之化合物，其中，n為1-4的整數。
如請求項16或17所述之化合物，其中，所述化合物具有式（503）-（510）中任意一個所示的結構：
式（503）
式（504）
式（505）
式（506）
式（507）
式（508）
式（509）
式（510）其中，n4為1-4的整數，每個B₂ 獨立地選自C₁ -C₅ 烷基、乙氰基、丙氰基和丁氰基中的一種，每個E₀ 獨立地為O、S或BH，SPS表示固相載體。
一種藥物綴合物，所述藥物綴合物具有式（301）所示的結構：
式（301）其中，A具有如式（302）所示的結構：
式（302） n₁ 為1-4的整數，n₂ 為0-3的整數，n為0-7的整數；每個R₁ 各自獨立地選自H、取代或未取代的C₁ -C₄ 烴基或鹵素；每個L₁ 是長度為1-70個碳原子的直鏈亞烷基，其中一個或多個碳原子任選地被選自於以下基團所組成的組中的任何一個或多個所替換：C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)₂ 、C₂ -C₁₀ 亞烯基、C₂ -C₁₀ 亞炔基、C₆ -C₁₀ 亞芳基、C₃ -C₁₈ 亞雜環基和C₅ -C₁₀ 亞雜芳基；並且其中，L₁ 任選地具有由以下基團所組成的組中的任何一個或多個的取代基：C₁ -C₁₀ 烷基、C₆ -C₁₀ 芳基、C₅ -C₁₀ 雜芳基、C₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-OC₁ -C₁₀ 烷基、OC₁ -C₁₀ 烷基苯基、-C₁ -C₁₀ 烷基-OH、-OC₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-SC₁ -C₁₀ 烷基、-SC₁ -C₁₀ 烷基苯基、-C₁ -C₁₀ 烷基-SH、-SC₁ -C₁₀ 鹵代烷基、鹵素取代基、-OH、-SH、-NH₂ 、-C₁ -C₁₀ 烷基-NH₂ 、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-NH(C₁ -C₁₀ 烷基)、N(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基苯基)、NH(C₁ -C₁₀ 烷基苯基)、氰基、硝基、-CO₂ H、-C(O)O(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CON(C₁ -C₁₀ 烷基)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CONH(C₁ -C₁₀ 烷基)、-CONH₂ ，-NHC(O)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)C(O)(C₁ -C₁₀ 烷基)、-N(C₁ -C₁₀ 烷基)C(O)(苯基)、C(O)C₁ -C₁₀ 烷基、C(O)C₁ -C₁₀ 烷基苯基、C(O)C₁ -C₁₀ 鹵代烷基、-OC(O)C₁ -C₁₀ 烷基、-SO₂ (C₁ -C₁₀ 烷基)、-SO₂ (苯基)、-SO₂ (C₁ -C₁₀ 鹵代烷基)、-SO₂ NH₂ 、-SO₂ NH(C₁ -C₁₀ 烷基)、-SO₂ NH(苯基)、-NHSO₂ (C₁ -C₁₀ 烷基)、-NHSO₂ (苯基)和-NHSO₂ (C₁ -C₁₀ 鹵代烷基)；
表示基團共價連接的位點；每個M₁ 獨立地選自能夠和細胞表面受體結合的配體；R_j 為連接基團；R₁₆ 和R₁₅ 各自為H或活性藥物基團，並且R₁₆ 和R₁₅ 中的至少一個為活性藥物基團；W為連接基團。
如請求項31所述之藥物綴合物，其中，每個L₁ 獨立地選自式A1-A26基團中的一種或多種的連接組合；其中，Rb為C₁ -C₁₀ 烷基；j1為1-20的整數；j2為1-20的整數；R’為C₁ -C₁₀ 烷基；Ra選自式A27-A45基團中的一種；
、
、
、
、（A1）             （A2）             （A3）             （A4）
、
、
、
、（A5）             （A6）                （A7）                 （A8）
、
、
、（A9）                    （A10）                         （A11）
、
、
、（A12）                          （A13）                   （A14）
、
、
、（A15）                  （A16）                           （A17）
、
、
、
、（A18）             （A19）             （A20）            （A21）
、
、
、（A22）                    （A23）                      （A24）
、
；（A25）            （A26）
、
、
、
、
、
、（A27）（A28）    （A29）         （A30）            （A31）（A32）
、
、
、
、
、（A33）        （A34）   （A35）        （A36）（A37）
、
、
、
、
、（A38）         （A39）     （A40）      （A41）     （A42）
、
或
（A43）   （A44）      （A45）   。
如請求項32所述之藥物綴合物，其中，L₁ 選自式A1、A2、A4、A5、A6、A8、A10、A11、A13中的一種或多種的連接組合。
如請求項31或32所述之藥物綴合物，其中，L₁ 的長度為3-25個原子，所述L₁ 的長度是指與A中的N原子連接的原子到與M₁ 連接的原子形成的最長的原子鏈上的成鏈原子的個數。
如請求項31或32所述之藥物綴合物，其中，n₁ 為1或2，n₂ 為1或2。
如請求項35所述之藥物綴合物，其中，A的結構如式（320）所示：
式（320）。
如請求項31或32所述之藥物綴合物，其中，所述藥物綴合物為寡核苷酸綴合物，其中，所述活性藥物基團具有式A60所示的結構；其中，E₁ 為OH、SH或BH₂ ，
表示基團連接的位點，Nu為功能性寡核苷酸，
式（A60）。
如請求項31或32所述之藥物綴合物，其中，每個M₁ 獨立地選自親脂類分子、糖類、維生素、多肽、內涵體裂解物質、類固醇化合物、萜烯化合物、整合素受體抑制劑和陽離子脂質分子中的分子或衍生物形成的配體中的一種。
如請求項38所述之藥物綴合物，其中，每個M₁ 獨立地選自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-***糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺、N-三氟乙醯基半乳糖胺、N-丙醯基半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺、N-異丁醯基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-去氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-去氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二去氧-4-甲醯胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-去氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇醯基-α-神經氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙醯基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙醯基-2-去氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脫水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖中的一種。
如請求項31或32所述之藥物綴合物，其中，每個M₁ 獨立地選自以下基團中的一種：由膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睾酮、1,3-雙-O（十六烷基）甘油、六甘油、薄荷醇、薄荷腦、1,3-丙二醇、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-（油醯基）石膽酸、苯噁嗪、葉酸、葉酸的衍生物、維生素A、維生素B7（biotin）、吡哆醛、熊果醇、三萜烯、軟木三萜酮或表木栓醇衍生石膽酸形成的配基；或者香葉基氧基己基、十七烷基、二甲氧基三苯甲基、龍舌蘭皂苷配基、薯蕷皂苷元或菝葜皂苷元。
如請求項40所述之藥物綴合物，其中，每個M₁ 均獨立地為由以下化合物中的一種形成的配基：葉酸、葉酸類似物或葉酸類比物。
如請求項41所述之藥物綴合物，其中，每個M₁ 獨立地選自式H1-H5基團中的一種：

式（H1）式（H2）

式（H3）式（H4）
式（H5）其中，n3選自1-5的整數，
表示基團共價連接的位點。
如請求項31或32所述之藥物綴合物，其中，n為0-4的整數。
如請求項31或32所述之藥物綴合物，其中，R_j 選自式A62-A67所示基團中的一種：
、
、
、
式（A62）式（A63）式（A64）式（A65）
、
式（A66）式（A67）。
如請求項31或32所述之藥物綴合物，其中，W為式（A61）或式（C1’）所示的基團：
，
式（A61）式（C1’) 其中，E₁ 為OH、SH或BH₂ ，n4選自1-4的整數。
如請求項31或32所述之藥物綴合物，其中，所述藥物綴合物具有式（303）、（304）、（305）、（306）、（307）、（308）、（309）、式（310）或式（311）所示的結構：
式（303）
式（304）
式（305）
式（306）
式（307）
式（308）
式（309）
式（310）
式（311）式中，Nu表示功能性寡核苷酸。
如請求項37或46所述之藥物綴合物，其中，所述功能性寡核苷酸選自小干擾RNA、微小RNA、抗微小RNA、微小RNA拮抗劑、微小RNA模擬物、誘餌寡核苷酸、免疫刺激物、G-四極子、可變剪接體、單鏈RNA、反義核酸、核酸適配體、莖環RNA、mRNA片段、啟動RNA或DNA中的一種。
如請求項47所述之藥物綴合物，其中，所述功能性寡核苷酸為單鏈寡核苷酸或者雙鏈寡核苷酸。
如請求項48所述之藥物綴合物，其中，所述功能性寡核苷酸為siRNA。
如請求項49所述之藥物綴合物，其中，所述siRNA中的每個核苷酸各自獨立地為修飾或未修飾的核苷酸，所述siRNA含有正義鏈和反義鏈，其中，所述正義鏈包含核苷酸序列1，所述反義鏈包含核苷酸序列2，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2的長度均為19個核苷酸，並且至少部分地反向互補形成雙鏈區，所述核苷酸序列2與第一段核苷酸序列至少部分互補，所述第一段核苷酸序列為靶mRNA中的一段核苷酸序列，所述靶mRNA是指在細胞中異常表達的基因對應的mRNA。
如請求項50所述之藥物綴合物，其中，所述細胞為肝細胞、肺部細胞或腫瘤細胞。
如請求項50所述之藥物綴合物，其中，所述靶mRNA選自以下基因對應的mRNA中的一種：ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV、HCV。
一種如請求項31至52中任一項所述之藥物綴合物在製備用於治療和/或預防由細胞中基因的表達而引起的病理狀況或疾病的藥物中的用途。
如請求項53所述之用途，其中，所述基因選自B型肝炎病毒基因、血管生成素樣蛋白3基因、載脂蛋白C3基因或者訊號轉導及轉錄啟動蛋白3基因。
如請求項53所述之用途，其中，所述疾病選自慢性肝病、肝炎、肝纖維化疾病、肝增生性疾病、血脂異常或腫瘤導致的疾病。
一種治療由細胞中基因的表達而引起的病理狀況或疾病的方法，所述方法包括向患有所述疾病的患者給予請求項31至52中任一項所述之藥物綴合物。
如請求項56所述之方法，其中，所述基因選自B型肝炎病毒基因、血管生成素樣蛋白3基因、載脂蛋白C3基因或者訊號轉導及轉錄啟動蛋白3基因。
如請求項56所述之方法，其中，所述疾病選自慢性肝病、肝炎、肝纖維化疾病、肝增生性疾病、血脂異常導致的疾病或腫瘤。
一種調控細胞中基因表達的方法，其中，所述調控包括抑制所述基因表達或者增強所述基因表達，所述方法包括將請求項31至52中任一項所述的藥物綴合物與所述細胞接觸。
如請求項59所述之方法，其中，所述基因選自以下基因中的一種：ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV、HCV。
一種試劑盒，所述試劑盒包含請求項31至52中任一項所述的藥物綴合物。