TW202120695A

TW202120695A - 用聚合酶將核苷酸接附至聚核苷酸

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Publication number: TW202120695A
Application number: TW109127579A
Authority: TW
Inventors: 趙燕楠; 凱特琳普格利斯; 艾琳加西亞; 盧達維克米森; 安密維派瑞湖; 希爾維亞格拉維納; 塞爾吉歐佩薩喬維奇; 張慇娜; 楊翔元; 傑佛瑞曼戴爾; 強納森斯圖奇曼
Original assignee: 美商伊路米納有限公司; 新加坡商伊路米納新加坡私人有限公司
Priority date: 2019-08-21
Filing date: 2020-08-13
Publication date: 2021-06-01
Also published as: KR20220047206A; BR112021013062A2; IL283917A; EP4018002A1; JP2022545308A; AU2020332798A1; US20220090193A1; MX2021006298A; CA3123158A1; CN113383088A; WO2021034853A1

Abstract

本發明提供一種方法，其包括將聚核苷酸與模板雜合，使5'鄰接於與該聚核苷酸互補之複數個核苷酸之5'最末端核苷酸之第一模板核苷酸與聚合酶及加電荷標籤的核苷酸接觸，其中該加電荷標籤的核苷酸與該第一模板核苷酸互補且包括接附至該加電荷標籤的核苷酸之5'聚磷酸的電荷標籤。

Description

用聚合酶將核苷酸接附至聚核苷酸

本申請案係關於用聚合酶將核苷酸接附至聚核苷酸之方法。相關申請案之交叉引用

本申請案主張2019年8月21日申請且標題為「用聚合酶將核苷酸接附至聚核苷酸（Attaching Nucleotides to a Polynucleotide with a Polymerase）」之美國臨時專利申請案第62/890,065號，其全部內容以引用之方式併入本文中。序列表

本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子方式提交且以全文引用的方式併入本文中。

目前許多定序平台使用「合成定序」（sequencing by synthesis，SBS）技術及基於螢光之偵測方法。允許更具成本效益、更快速且更方便定序及核酸偵測之替代定序方法作為SBS之補充為合乎需要的。基於電荷之定序為有吸引力之方法。

當前合成定序（SBS）技術使用在以下兩個位置處經修飾之核苷酸：1）去氧核苷之3'（或3-撇號）羥基（3'-OH），及2）嘧啶之5-位置或含氮鹼基（A、T、C、G）之嘌呤之7-位置。3'-OH基團用疊氮基甲基封端，產生可逆核苷酸終止子。此可在添加單核苷酸之後防止進一步延長。含氮鹼基中之每一者分別經螢光團修飾以提供鑑別單鹼基併入之螢光讀數。隨後，移除3'-OH封端基團及螢光團且重複循環。

經修飾之核苷酸之當前成本可能較高，此係由於修飾去氧核苷之3'-OH及含氮鹼基兩者之合成挑戰。有若干可能的方法來降低經修飾之核苷酸之成本。一種方法為將讀數標記物移動至5'-末端（或5-撇號-末端）磷酸而非含氮鹼基。在一個實例中，這種方式移除了對獨立裂解步驟之需求，且允許即時偵測引入核苷酸。在併入期間，將焦磷酸與標籤一起作為伸長過程之副產物釋放，因此不涉及可裂解鍵聯。

用於在與此類即時SBS系統相關或用於此類即時SBS系統而無需偵測標記之核苷酸本身之情形下評估聚合酶活性之方法可為有益的。舉例而言，可能有利的是，在獨立於或不同於裝置上之定序之情形及條件之不同測試條件下，能夠評估聚合酶添加標記之核苷酸之能力。因為藉由設計，核苷酸上之標籤可在併入至新生股中時自核苷酸釋放，所以量測此類標記之核苷酸之聚合酶介導之併入的時機及動力學具有挑戰性。在各種條件下確定聚合酶以高通量方式能夠在多大程度上或在任何情況下以多快之速度併入帶有此類可釋放標籤之核苷酸之能力，可有助於使用此類標記之核苷酸及聚合酶部署裝置級即時SBS系統。

在態樣中，提供一種方法，其包括將聚核苷酸與模板雜合，且使5'鄰接於與該聚核苷酸互補之複數個核苷酸之5'最末端核苷酸之第一模板核苷酸與聚合酶及加電荷標籤的核苷酸接觸，其中該加電荷標籤的核苷酸與該第一模板核苷酸互補且包括接附至該加電荷標籤的核苷酸之5'聚磷酸的電荷標籤。另一實例進一步包括用該聚合酶將該加電荷標籤的核苷酸接附至該聚核苷酸，其中接附包括將該電荷標籤與該加電荷標籤的核苷酸分離。

在實例中，模板結合至基底。在另一實例中，聚合酶結合至基底。在再一實例中，模板及聚合酶結合至基底。在另一實例中，該聚合酶係選自克列諾（Klenow）片段及Phi29聚合酶。

在另一實例中，模板接附至基底且包括連接核苷酸，且其中連接核苷酸在第二模板核苷酸與基底之間。在實例中，可以有超過20個連接核苷酸、或1至20個連接核苷酸、或10至20個連接核苷酸、或1至10個連接核苷酸、或1至5個連接核苷酸、或5至10個連接核苷酸、或10至15個連接核苷酸、或15至20個連接核苷酸。在再另一實例中，基底為固體載體導電通道，且該導電通道用於將在該第一模板核苷酸與該加電荷標籤的核苷酸接觸及將該加電荷標籤的核苷酸接附至該聚核苷酸期間偵測該加電荷標籤的核苷酸。在再一實例中，該方法包括在溶液中接附該加電荷標籤的核苷酸，其中該電荷標籤在該溶液中包括德拜長度（Debye length），且該德拜長度在約0.5 nm與約10 nm之間。

在實例中，加電荷標籤的核苷酸為式I之化合物

，其中n為3至10之整數，m為1至10之整數，t為0至50之整數，X₁ 為直接鍵、C₁ -C₁₀ 烷基、C₁ -C₁₀ 氧雜烷基、C₁ -C₁₀ 硫雜烷基或C₁ -C₁₀ 氮雜烷基，X₂ 為C₁ -C₂₀ 烷基，其中視需要一或多個CH₂ 殘基個別地經肽鍵或(-O-CH₂ -CH₂ -)_a 置換，其中a為1至24之整數，X₃ 為直接鍵或寡核苷酸，A為

、

、

、

或醯胺鍵，且Y係選自由以下者組成之群：

、

、

及

，q為1至100之整數，且B係選自由以下者組成之群：胺基酸；核苷酸；

；

，其中各R獨立地選自Y及氫；及樹突（dendron）；且其中當B為樹突時q等於1，且q數目個B具有電荷及電荷密度。

在另一實例中，電荷係在約-100e與約+100e之間。在另一實例中，電荷密度在約-100e/立方奈米與約+100e/立方奈米之間。在再一實例中，電荷在約-200e與約+200e之間。在再一實例中，電荷密度在約-200e/立方奈米與約+200e/立方奈米之間。

在另一實例中，B包括q數目個核苷酸且q大於1。在再一實例中，該聚核苷酸係選自分支聚核苷酸及一或多個髮夾環圈。在另一實例中，聚核苷酸包括兩個與五個之間的髮夾環圈。

在另一實例中，q數目個B包括多肽。在再一實例中，該多肽係選自分支多肽、捲曲（coiled）多肽及捲曲螺旋（coiled-coil）多肽。在另一實例中，B包括胺基酸，且該q數目個B中之一或多者包括甲基離胺酸、二甲基離胺酸或三甲基離胺酸。在另一實例中，B為包括一或多個組成重複單元及複數個末端單元之z代（generation）的樹突，其中z為1至6之整數，組成末端單元係選自：

及

，其中p1為1至3之整數，其中p1個-CH₂ -基團中之任何一或多者視需要經1至3個-O-CH₂ -CH₂ -基團置換，p2為1至3之整數，其中p2個-CH₂ -基團中之任何一或多者視需要經1至3個-O-CH₂ -CH₂ -基團置換，且末端基團係選自羧酸、磺酸、膦酸、精胺基（sperminyl）、胺基及四級銨基團。

在另一實例中，A係藉由包括連接反應之反應形成，且該連接反應係選自疊氮-炔銅輔助（azide-alkyne copper-assisted）之點擊反應（click reaction）、四

-反式環辛烯接合（ligation）、疊氮-二苯并環辛炔基無銅點擊反應及硫醇-順丁烯二醯亞胺共軛（conjugation）。在又一實例中，X₂ 為(-O-CH₂ -CH₂ -)_a ，其中a為1至24之整數，或其中a為24，或其中a為16，或其中a為12或其中a為8，或其中a為4。

在一實例中，該模板接附至基底且包括連接核苷酸，其中該等連接核苷酸在該第二模板核苷酸與該基底之間，且X₃ 包括寡核苷酸，其中該寡核苷酸在該電荷標籤接近該基底時與複數個連接核苷酸雜合。在另一實例中，加電荷標籤的核苷酸為式I之化合物

其中n為3至10之整數，m為1至10之整數，t為0至50之整數，X₁ 為直接鍵、C₁ -C₁₀ 烷基、C₁ -C₁₀ 氧雜烷基、C₁ -C₁₀ 硫雜烷基或C₁ -C₁₀ 氮雜烷基，X₂ 為C₁ -C₂₀ 烷基，其中視需要一或多個CH₂ 殘基個別地經肽鍵或(-O-CH₂ -CH₂ -)_a 置換，其中a為1至24之整數，X₃ 為直接鍵或寡核苷酸，A為

、

、

或醯胺鍵，且Y係選自由以下者組成之群：

、

、

及

，q為1至100之整數，B包括胺基酸，且q數目個B具有電荷及電荷密度。

在又一實例中，電荷係在約-100e與約+100e之間。在另一實例中，電荷密度在約-100e/立方奈米與約+100e/立方奈米之間。在再一實例中，電荷在約-200e與約+200e之間。在再一實例中，電荷密度在約-200e/立方奈米與約+200e/立方奈米之間。在再一實例中，q數目個B包括多肽。在另一實例中，該多肽係選自分支多肽、捲曲多肽及捲曲螺旋多肽。在另一實例中，該q數目個B中之一或多者包括甲基離胺酸、二甲基離胺酸或三甲基離胺酸。

在再一實例中，該多肽為包括一或多個叉之分支多肽，一或多個叉中之每一者包括複數個分支，且該複數個分支中之一或多者各自獨立地包括一定數目之胺基酸。在再一實例中，多肽包括三個或更多個叉且複數個分支中之一或多者之胺基酸數目為至少四個。在另一實例中，多肽包括七個或更多個叉。在再一實例中，複數個分支中之一或多者之胺基酸之數目為至少六個。

在另一實例中，A係藉由包括連接反應之反應形成，且該連接反應係選自疊氮-炔銅輔助之點擊反應、四

-反式環辛烯接合、疊氮-二苯并環辛炔基無銅點擊反應及硫醇-順丁烯二醯亞胺共軛。在另一實例中，X₂ 為(-O-CH₂ -CH₂ -)_a ，其中a為1至24之整數。在再一實例中，a為24，或a為16，或a為12，或a為8，或a為4。

在另一實例中，該模板接附至基底且包括連接核苷酸，其中該等連接核苷酸在該第二模板核苷酸與該基底之間，且X₃ 包括寡核苷酸，其中該寡核苷酸在該電荷標籤接近該基底時與複數個連接核苷酸雜合。

在另一實例中，加電荷標籤的核苷酸為式I之化合物

其中n為3至10之整數，m為1至10之整數，t為0至50之整數，X₁ 為直接鍵、C₁ -C₁₀ 烷基、C₁ -C₁₀ 氧雜烷基、C₁ -C₁₀ 硫雜烷基或C₁ -C₁₀ 氮雜烷基，X₂ 為C₁ -C₁₀ 烷基，其中視需要一或多個CH₂ 殘基個別地經肽鍵或(-O-CH₂ -CH₂ -)_a 置換，其中a為1至24之整數，X₃ 為直接鍵或寡核苷酸，A為

、

、

或醯胺鍵，且Y係選自由以下者組成之群：

、

、

及

，q為1至100之整數，且B係選自由以下者組成之群：核苷酸；

及

，其中各R獨立地選自Y及氫；且q數目個B具有電荷及電荷密度。

在再一實例中，電荷係在約-100e與約+100e之間。在另一實例中，電荷密度在約-100e/立方奈米與約+100e/立方奈米之間。在另一實例中，電荷在約-200e與約+200e之間。在再一實例中，電荷密度在約-200e/立方奈米與約+200e/立方奈米之間。

-反式環辛烯接合、疊氮-二苯并環辛炔基無銅點擊反應及硫醇-順丁烯二醯亞胺共軛。在再一實例中，X₂ 為(-O-CH₂ -CH₂ -)_a ，其中a為1至24之整數，或a為24，或a為16，或a為12或a為8，或a為4。

在另一實例中，加電荷標籤的核苷酸為式I之化合物

其中n為3至10之整數，m為1至10之整數，t為0至50之整數，X₁ 為直接鍵、C₁ -C₁₀ 烷基、C₁ -C₁₀ 氧雜烷基、C₁ -C₁₀ 硫雜烷基或C₁ -C₁₀ 氮雜烷基， X₂ 為C₁ -C₂₀ 烷基，其中視需要一或多個CH₂ 殘基個別地經肽鍵或(-O-CH₂ -CH₂ -)_a 置換，其中a為1至24之整數， X₃ 為直接鍵或寡核苷酸，A為

、

、

或醯胺鍵，且Y係選自由以下者組成之群：

、

、

及

，q為1，且B包括樹突，且B具有電荷及電荷密度。

在另一實例中，電荷係在約-100e與約+100e之間。在再一實例中，電荷密度在約-100e/立方奈米與約+100e/立方奈米之間。在另一實例中，電荷在約-200e與約+200e之間。在另一實例中，電荷密度在約-200e/立方奈米與約+200e/立方奈米之間。

在再一實例中，B為包括一或多個組成重複單元及複數個末端單元之z代的樹突，其中z為1至6之整數，組成末端單元係選自：

及

，其中p1為1至3之整數，其中p1個-CH₂ -基團中之任何一或多者視需要經1至3個-O-CH₂ -CH₂ -基團置換，p2為1至3之整數，其中p2個-CH₂ -基團中之任何一或多者視需要經1至3個-O-CH₂ -CH₂ -基團置換，且末端基團係選自羧酸、磺酸、膦酸、精胺基、胺基及四級銨基團。

-反式環辛烯接合、疊氮-二苯并環辛炔基無銅點擊反應及硫醇-順丁烯二醯亞胺共軛。在另一實例中，X₂ 為(-O-CH₂ -CH₂ -)_a ，其中a為1至24的整數或a為24，或a為16，或a為12，或a為8，或a為4。在再一實例中，該模板接附至基底且包括連接核苷酸，其中該等連接核苷酸在該第二模板核苷酸與該基底之間，且X₃ 包括寡核苷酸，其中該寡核苷酸在該電荷標籤接近該基底時與複數個連接核苷酸雜合。

在另一實例中，該模板進一步包括5'鄰接於該第一模板核苷酸之第二模板核苷酸，且該方法進一步包括使該第二模板核苷酸與加螢光標籤之核苷酸接觸，其中該加螢光標籤之核苷酸與該第二模板核苷酸但不與該第一模板核苷酸互補，且用聚合酶將加螢光標籤之核苷酸接附至聚核苷酸。在另一實例中，該方法進一步包括藉由量測自該聚核苷酸發出之螢光量測該加螢光標籤之核苷酸與該聚核苷酸之接附。在再一實例中，該方法進一步包括在量測之前自該模板溶析該聚核苷酸。

在另一態樣中，提供一種方法，其包括偵測藉由聚合酶將經標記之核苷酸併入至與模板聚核苷酸股互補之新生聚核苷酸股中，其中聚合酶藉由繫鏈（tether）繫栓至固體載體導電通道，經標記之核苷酸為式I之化合物

，其中n為3至10之整數，m為1至10之整數，t為0至50之整數，X₁ 為直接鍵、C₁ -C₁₀ 烷基、C₁ -C₁₀ 氧雜烷基、C₁ -C₁₀ 硫雜烷基或C₁ -C₁₀ 氮雜烷基，X₂ 為C₁ -C₂₀ 烷基，其中視需要一或多個CH₂ 殘基經肽鍵或(-O-CH₂ -CH₂ -)_a 置換，其中a為1至24之整數，X₃ 為直接鍵或寡核苷酸，其中當該標記物接近該導電通道時，該寡核苷酸與該繫鏈之受體區域雜合，F₁ 係選自螢光團及直接鍵，且F₂ 不存在或為螢光團， A為

、

、

，或醯胺鍵，且Y係選自由以下者組成之群：

、

、

及

，q為1至100之整數，且 B係選自由以下者組成之群：胺基酸；核苷酸；

；

，其中R獨立地選自Y及氫；及樹突；且其中當B為樹突時q等於1，且q數目個B具有電荷及電荷密度，且導電通道將在併入期間偵測經標記之核苷酸。

在一實例中，電荷係在約-100e與約+100e之間。在另一實例中，電荷密度在約-100e/立方奈米與約+100e/立方奈米之間。在另一實例中，電荷在約-200e與約+200e之間。在再一實例中，電荷密度在約-200e/立方奈米與約+200e/立方奈米之間。

在另一實例中，B包括q數目個核苷酸且q大於1。在又一實例中，該聚核苷酸係選自分支聚核苷酸及一或多個髮夾環圈。在再一實例中，聚核苷酸包括兩個與五個之間的髮夾環圈。

在另一實例中，q數目個B包括多肽。在另一實例中，該多肽係選自由以下者組成之群：分支多肽、捲曲多肽及捲曲螺旋多肽。在再一實例中，B包括胺基酸，且該q數目個B中之一或多者包括甲基離胺酸、二甲基離胺酸或三甲基離胺酸。

在另一實例中，B為包括一或多個組成重複單元及複數個末端單元之z代的樹突，其中z為1至6之整數，組成末端單元係選自：

及

，其中 p₁ 為1至3之整數，其中p₁ 個-CH₂ -基團中之任何一或多者視需要經1至3個-O-CH₂ -CH₂ -基團置換，p₂ 為1至3之整數，其中p₂ 個-CH₂ -基團中之任何一或多者視需要經1至3個-O-CH₂ -CH₂ -基團置換，且末端基團係選自羧酸、磺酸、膦酸、精胺基、胺基及四級銨基團。

-反式環辛烯接合、疊氮-二苯并環辛炔基無銅點擊反應及硫醇-順丁烯二醯亞胺共軛。

在再一實例中，該方法進一步包括連續併入複數個經標記之核苷酸，其中當複數個經標記之核苷酸中之每一者之Y與任何其他核苷酸之Y彼此不同時，該複數個經標記之核苷酸中之每一者之電荷不同於該複數個經標記之核苷酸中之任何其他之電荷。在另一實例中，該方法進一步包括基於藉由導電通道偵測之電荷鑑別併入至新生聚核苷酸股中之一或多種經標記聚核苷酸之Y。

在又一實例中，X₂ 為(-O-CH₂ -CH₂ -)_a ，其中a為1至24之整數。在一實例中，a為24。在另一實例中，a為12。在另一實例中，a為8。在再一實例中，a為4。

在另一態樣中，提供一種方法，其包括偵測藉由聚合酶將經標記之核苷酸併入至與模板聚核苷酸股互補之新生聚核苷酸股中，其中聚合酶藉由繫鏈繫栓至固體載體導電通道，經標記之核苷酸為式I之化合物

其中n為3至10之整數，m為1至10之整數，t為0至50之整數，X₁ 為直接鍵、C₁ -C₁₀ 烷基、C₁ -C₁₀ 氧雜烷基、C₁ -C₁₀ 硫雜烷基或C₁ -C₁₀ 氮雜烷基，X₂ 為C₁ -C₂₀ 烷基，其中視需要一或多個CH₂ 殘基個別地經肽鍵或(-O-CH₂ -CH₂ -)_a 置換，其中a為1至24之整數，X₃ 為直接鍵或寡核苷酸，其中當該標記物接近該導電通道時，該寡核苷酸與該繫鏈之受體區域雜合，F₁ 係選自螢光團及直接鍵，且F₂ 不存在或為螢光團， A為

、

、

，或醯胺鍵，且 Y係選自由以下者組成之群：

、

、

及

，q為1至100之整數，且 B包括胺基酸，且q數目個B具有電荷及電荷密度，且導電通道將在併入期間偵測經標記之核苷酸。

在再一實例中，該多肽為包括一或多個叉及複數個分支之分支多肽，且該複數個分支中之一或多者各自獨立地包括一定數目之胺基酸。在再一實例中，多肽包括三個或更多個叉且複數個分支中之一或多者之胺基酸數目為至少四個。在另一實例中，多肽包括七個或更多個叉。在再一實例中，複數個分支中之一或多者之胺基酸之數目為至少六個。

在又一實例中，A係藉由包括連接反應之反應形成，且該連接反應係選自疊氮-炔銅輔助之點擊反應、四

在再一態樣中，提供一種方法，其包括偵測藉由聚合酶將經標記之核苷酸併入至與模板聚核苷酸股互補之新生聚核苷酸股中，其中聚合酶藉由繫鏈繫栓至固體載體導電通道，經標記之核苷酸為式I之化合物

、

、

或醯胺鍵，且 Y係選自由以下者組成之群：

、

、

及

，q為1至100之整數，且 B係選自由以下者組成之群：核苷酸；

及

，其中R係選自Y及氫；且該導電通道將在併入期間偵測該經標記之核苷酸。

、

、

，或醯胺鍵，且 Y係選自由以下者組成之群：

、

、

及

，q為1，且B包括樹突，且B具有電荷及電荷密度，且導電通道將在併入期間偵測經標記之核苷酸。

及

應瞭解，預期前述概念及下文更詳細地論述之額外概念的所有組合（限制條件為此類概念並非彼此不相容）作為本文中所揭示之本發明主題的部分且促成如本文所描述之優點及益處。

本發明係關於一種用於測定在各種條件下藉由聚合酶之加電荷標籤的核苷酸併入之態樣的方法。用於SBS定序之即時方法或用於用導電通道偵測併入至新生核苷酸股中之核苷酸的其他方法，該方法包括使用核苷酸以藉由其5'磷酸基團併入接附至核苷酸之電荷標籤，可包括用於評估在併入之不同階段中之核苷酸併入速率的度量。可量測多個特徵之修飾對帶有電荷標籤之核苷酸併入根據模板之新生聚核苷酸股中之能力、速率、動力學或其他特徵的影響。有利地，且如本發明中所提供，諸如當在不包括導電通道之條件下評定或使用併入條件或其在偵測電荷標籤中之用途時，一種方法可包括獨立於在併入期間用導電通道偵測電荷標籤而評定此類影響。

當帶電標籤藉由核苷酸5'磷酸基團接附至核苷酸時，當核苷酸經由核苷酸5'磷酸接附至新生股之游離3'末端時，電荷標籤可與在核苷酸併入至新生寡核苷酸股中時之電荷標籤解離。舉例而言，如本文所揭示，核苷酸可藉由接附至核苷酸之糖部分之5'碳的聚磷酸而連接至電荷標籤。在自核苷酸移除一部分聚磷酸時，聚合酶可自核苷酸裂解電荷標籤，就像在將核苷酸接附至新生聚核苷酸股之3'氫氧化物時，聚合酶裂解併入核苷酸之5'焦磷酸基。如本文中所揭示，即時SBS類過程可包括併入接近於導電通道之加電荷標籤的核苷酸，使得導電通道可偵測與併入相關聯之電荷標籤，且藉此反映併入之鹼基。

但在一些實例中，在不用導電通道偵測帶電標籤之情況下，可能需要進行此類方法之態樣，同時保持量測併入之前包括電荷標籤之核苷酸是否添加至新生寡核苷酸股的能力。甚至在加電荷標籤的核苷酸的併入可由與其接近之導電通道偵測或可偵測到，或可接近於導電通道進行之狀況下，無論是否使用導電通道來偵測此併入，藉由獨立於使用導電通道檢測此類併入之另一方法來偵測電荷標籤可為有益的。

可藉由此類方法獲得關於使用加電荷標籤的核苷酸及導電通道的即時鹼基識別方法的特徵的量度。一種設備或表面之結構特徵及其對核苷酸併入之影響，不同聚合酶對核苷酸併入之能力及動力學，諸如包括不同電荷標籤或在電荷標籤與核苷酸之間具有不同連接之核苷酸之不同核苷酸的併入特徵，聚合酶在接近導電通道處繫栓之基底之不同表面化學物質，可藉由其將聚合酶接附至表面之不同繫鏈之不同特徵（包括接近於導電通道）或如本文所揭示之其他特徵可藉由如本文所揭示之方法詢問，獨立於藉由如本文所揭示之導電通道進行電荷偵測而偵測加電荷標籤的核苷酸。

圖1中描繪一實例。在此實例中，使模板寡核苷酸（朝上指向箭頭）與聚核苷酸（朝下指向箭頭）雜合。在此實例中，雜合後，可進行洗滌步驟，由此自反應移除未雜合之游離聚核苷酸。雜合模板及聚核苷酸可隨後與加電荷標籤的核苷酸（表示為圖1中之dN6P）及聚合酶一起進一步培育。模板及雜合聚核苷酸之序列可為已知的且設計成使得空模板核苷酸之5'緊鄰可已知與聚核苷酸雜合的5'最末端模板核苷酸。在一實例中，此類核苷酸可不同於模板之5'下一核苷酸。在此實例中，由於鹼基配對規則，有可能藉由在反應中僅包括已知與空模板核苷酸互補之一種核苷酸物種（C、G、A或T）來進行單鹼基併入步驟，該等物種帶有電荷標籤。

如本文中所揭示，模板、與其雜合之聚核苷酸或兩者可具有任何適合長度。在一些實例中，模板、與其雜合之聚核苷酸或兩者可為相對較短的聚核苷酸，長度為約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200個或更多個核苷酸。在一實例中，一者、另一者或兩者可為引子，即相對較短的聚核苷酸，其在與互補聚核苷酸雜合時可充當聚合酶之引子以藉由聚合酶藉由添加與其補體之下一個非雜合核苷酸互補之核苷酸。在一實例中，雜合至模板之聚核苷酸可為引子。引子可為任何適合之長度，此視互補聚核苷酸（諸如模板）之長度而定，其與聚合酶雜合且充當聚合酶之引子。在一實例中，引子之長度可為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75個核苷酸，或此等長度之間的任何中間長度。在一實例中，引子可長於此類長度。

在此實例中，一旦單一鹼基併入至雜合聚核苷酸中，另一第二核苷酸即可併入，因為反應中所包括之核苷酸之物種不與模板之第二、5'下一核苷酸互補。因此，聚合酶可不併入其。在其他實例中，帶有電荷標籤之核苷酸之單一物種亦可帶有化學修飾以在單一鹼基併入雜合聚核苷酸中之後減少、最小化或在一些情況下預防第二核苷酸之添加。舉例而言，加電荷標籤的核苷酸可帶有可逆封端部分，其可減少、最小化或在一些情況下防止後續核苷酸之添加（例如3'疊氮基甲基或其他可逆封端基團）。在此類實例中，可減少、最小化或在一些情況下防止其他核苷酸添加，直至且可能在併入有加電荷標籤的核苷酸之後對雜合聚核苷酸之游離3'碳末端進行化學修飾。

當電荷標籤經由連接至核苷酸之5'碳之聚磷酸接附至核苷酸時，如在本文所揭示之實例中，併入雜合聚核苷酸中之核苷酸可引起電荷標籤與模板及雜合聚核苷酸之解離。在此類情況下，可能難以判定併入之核苷酸是否已經加電荷標籤，尤其以可允許判定與如上文所描述之併入相關聯之其他度量的高通量方式。如本文中所揭示，第二核苷酸之併入可在第一加電荷標籤的核苷酸之合併之後，且第二核苷酸可具有准許藉由習知偵測方法偵測其之特徵。

繼續圖1中所描繪之實例，除使模板及雜合聚核苷酸與聚合酶及加電荷標籤的核苷酸接觸之外，其可進一步與全功能核苷酸接觸（在圖1中描繪為FFN）。FFN可與模板上之5'下一核苷酸互補，一個核苷酸在模板5'方向上鄰接於與如上所述併入之加電荷標籤核苷酸互補之模板核苷酸。

在此實例中，此類FFN可不同於模板之5'下一核苷酸。在此實例中，由於鹼基配對規則，有可能藉由在反應中僅包括已知與下一個空模板核苷酸互補之一種核苷酸物種（C、G、A或T）來進行另一種單鹼基併入步驟，之後用於併有如上文所揭示之加電荷標籤的核苷酸，該物種具有諸如螢光標籤之可偵測部分。

在此實例中，一旦FFN併入至雜合聚核苷酸中，另一第二核苷酸即可併入，因為反應中所包括之FFN之物種不與模板之5'下一核苷酸互補。因此，聚合酶可不併入其。在其他實例中，在FFN併入雜合聚核苷酸中之後，FFN之單一物種亦可帶有化學修飾以減少、最小化或在一些情況下防止另一核苷酸添加。舉例而言，FFN可帶有可逆封端部分，其可減少、最小化或在一些情況下防止後續核苷酸之添加（例如3'疊氮基甲基或其他可逆封端基團）。在此類實例中，可減少、最小化或在一些情況下防止其他核苷酸添加，直至且可能在併入有FFN之後對雜合聚核苷酸之游離3'碳末端進行化學修飾。在另一實例中，FFN可在其3'碳上缺乏羥基（例如，可為包括可偵測標記物，諸如螢光標籤之雙去氧核苷），從而可減少、最小化後續核苷酸之併入或在一些情況下防止後續核苷酸之併入。

在另一實例中，方法可包括併入除一或多個併入之FFN以外之超過一個FFN或一或多個未加螢光標籤之核苷酸符合本文中所揭示之方法。儘管本文中描述一個實例，其中FFN立即併入至先前併入之加電荷標籤的核苷酸之3'，且隨後可偵測此類FFN之存在，但在其他實例中，可在加電荷標籤的核苷酸併入之後及在併入FFN之前併入其他核苷酸，及/或可併入超過一個FFN，與其及/或與彼此相鄰或與其及/或與彼此隔開，且出於各種原因加以偵測。所有此類實例包括於本發明中且明確地視為與其變體可互換，如下文進一步所揭示。

在一實例中，模板及雜合聚核苷酸可依序與加電荷標籤的核苷酸及FFN一起培育，其中洗滌步驟在培育之間進行以移除未併入之核苷酸。舉例而言，在一實例中，用於併入至雜合聚核苷酸中之加電荷標籤的核苷酸及FFN可具有彼此相同之核苷酸物種（例如兩者皆有G、C、A或T），而可用於與該等核苷酸配對且併入至雜合聚核苷酸中之模板之核苷酸亦可彼此相同且與加電荷標籤的核苷酸及FFN互補。在此類實例中，可修飾加電荷標籤的核苷酸以便減少或在一些情況下最小化或甚至防止併入以下核苷酸（例如以降低、最小化或防止併入多個加電荷標籤的核苷酸），諸如上文所揭示（例如藉由包括3'疊氮基甲基或其他可逆嵌段）。此後可進行修飾以允許隨後在後續培育步驟期間併入FFN，其中在培育步驟之間洗滌出游離加電荷標籤的核苷酸。

在另一實例中，可同時培育加電荷標籤的核苷酸及FFN兩者。舉例而言，加電荷標籤的核苷酸可具有不同於FFN之物種（例如C、G、T或A）。儘管兩種核苷酸可同時與模板及雜合聚核苷酸及聚合酶一起培育，但其僅可串聯併入，因為其與相同模板核苷酸不互補。在一實例中，加電荷標籤的核苷酸中之一者或另一者可具有3'可逆嵌段（諸如疊氮基甲基或其他可逆嵌段）以減少、最小化或在一些情況下防止併入另一核苷酸，隨後不化學移除該嵌段。在另一實例中，FFN可缺乏3'碳（諸如二去氧核苷酸）上之羥基以減少、最小化或在一些情況下防止隨後核苷酸之進一步添加。在此類實施例中，可併入有加電荷標籤的核苷酸，隨後併入FFN，即使其在一或多種聚合反應期間可能同時存在。

在一實例中，模板可接附至基底。舉例而言，模板之3'末端可直接或間接結合至諸如固態載體之基底。在另一實例中，模板之5'末端可直接或間接結合至諸如固態載體之基底。在一實例中，模板可藉由一系列不意欲或選擇用於編碼核苷酸以供併入至雜合聚核苷酸之核苷酸直接或間接接附至基底。舉例而言，當雜合聚核苷酸可延伸以便併入將與將模板接附至表面之此類模板核苷酸互補或可雜合至將模板接附至表面之此類模板核苷酸時，與此類核苷酸互補之加電荷標籤的核苷酸或FFN根本不或至少不為每次都可與模板、雜合聚核苷酸及聚合酶一起培育。舉例而言，雜合聚核苷酸之3'末端可與模板核苷酸互補雜合，該模板核苷酸在5'端的方向遠離於所述模板之此類連接核苷酸，使得聚合酶無法使用此類接附核苷酸作為編碼基底以將其他核苷酸連接至所述雜合聚核苷酸，不管在加電荷標籤的核苷酸或FFN已併入至雜合聚核苷酸中之前或之後。模板亦可藉由其他化學連接而接附至基底，諸如惰性聚合物，諸如聚乙二醇或其他。

在一些實例中，可在存在用於併入根據模板之聚合酶的加電荷標籤的核苷酸的情況下，不存在另一加螢光標籤之核苷酸以供連續併入的情況下，進行聚合酶反應。洗滌步驟可在第一核苷酸存在下在聚合之後進行以便移除過量的未併入之核苷酸。隨後可在聚合酶存在下（與在電荷之核苷酸之聚合酶催化之併入期間存在之聚合酶是否相同或不同）添加加螢光標籤之核苷酸以用於第二聚合反應。

在其他實例中，聚合酶可直接或間接結合至諸如固體載體之基底。在另一實例中，模板可在溶液中且不結合至基底。在另一實例中，聚合酶可在溶液中不結合至基底。在再一實例中，雜合聚核苷酸可直接或間接結合至諸如固體載體之基底。在其他實例中，其可在溶液中且不結合至固體載體。固體載體可包括如本文進一步描述之導電通道。將聚合酶接附至基底之繫鏈可具有適合於既定目的之任何既定長度。下文進一步詳細解釋各種可用長度及化學組成物之繫鏈之實例。在一些實例中，聚合酶可藉由共價接附，諸如經由惰性聚合物（諸如聚乙二醇）或其他惰性聚合物接附至基底。在一些實例中，在與繫栓至固體載體之模板之聚合反應期間，第一聚合酶、第二聚合酶或兩個聚合酶可在溶液中。

在一實例中，可存在使模板引子直接或間接接附至基底之1與10個之間的連接核苷酸，或可存在使模板引子直接或間接接附至基底之1與5個之間的此類連接核苷酸，或可存在使模板引子直接或間接接附至基底之約5與10個之間的此類連接核苷酸，或可存在使模板引子直接或間接接附至基底之約10與15個之間的此類連接核苷酸，或可存在使模板引子直接或間接接附至基底之約15與20個之間的此類連接核苷酸，或可存在使模板引子直接或間接接附至基底之約1與20個之間的此類連接核苷酸，或可存在使模板引子直接或間接接附至基底之約20與30個之間的此類連接核苷酸，或可存在使模板引子直接或間接接附至基底之約20與25個之間的此類連接核苷酸，或可存在使模板引子直接或間接接附至基底之約25與30個之間的連接核苷酸，或可存在使模板引子直接或間接接附至基底之15與30個之間的此類連接核苷酸，或可存在使模板引子直接或間接接附至基底之約5、10、15、20、25、30或更多個此類連接核苷酸，其中約意謂在其後指示之數字之10%內。

適合之基底之非排他性實例包括環氧矽氧烷、玻璃及改質或官能化玻璃、多面體倍半矽氧烷及其衍生物、塑膠（包括丙烯酸聚合物、聚苯乙烯及苯乙烯及以下其他材料之共聚物：聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚胺脂、聚四氟乙烯（諸如來自Chemours之TEFLON®）、環狀烯烴/環烯烴聚合物（COP）（諸如來自Zeon之ZEONOR®）、聚醯亞胺等）、耐綸、陶瓷/陶瓷氧化物、二氧化矽、熔融二氧化矽或基於二氧化矽之材料、矽酸鋁、矽及改質矽（例如摻硼之p+矽）、氮化矽、氧化矽、五氧化鉭或其他氧化鉭、氧化鉿、碳、金屬、無機玻璃或其類似物。基底亦可為玻璃或矽或諸如多面體倍半矽氧烷材料之基於矽之聚合物，視需要在表面具有氧化鉭或另一陶瓷氧化物之塗層。基底亦可包括如下文更詳細地描述之導電通道。

在一實例中，固態載體可包括導電通道，如下文進一步解釋。在一實例中，根據下文進一步解釋之方法，導電通道可在將加電荷標籤的核苷酸併入至聚核苷酸股中期間偵測電荷標籤。在一實例中，將聚合酶連接至固態載體（諸如導電通道）之繫鏈可包括受體區域且電荷標籤與加電荷標籤的核苷酸之間的接附可包括特異性區域，使得受體區域及特異性區域可在併入加電荷標籤的核苷酸期間彼此鍵結，如下文進一步解釋。在一實例中，存在結合至其之受體區域及特異性區域可促進電荷標籤與導電通道在將電荷標籤併入至雜合聚核苷酸期間之結合，且藉此增強藉由導電通道進行之電荷標籤之偵測。

如下文亦進一步揭示，在給定溶液中，加電荷標籤的核苷酸之電荷標籤可具有給定德拜長度。德拜長度為對溶液中之電荷載體之淨靜電效應且其靜電效應持續多久之量測。可根據考慮電荷標籤及溶液之特徵的方程式計算加電荷標籤的核苷酸之電荷標籤之德拜長度的計算，如下文更充分地描述。德拜長度可測定電荷標籤可接近導電通道之程度，以便導電通道在將電荷標籤併入雜合聚核苷酸中期間偵測電荷標籤。在一實例中，德拜長度可為以下者：約0.5與約10 nm之間、約0.5與約1 nm之間、約1與約1.5 nm之間、約1.5與約2 nm之間、約2與約2.5 nm之間、約2.5與約3 nm之間、約3與約3.5 nm之間、約3.5與約4 nm之間、約4與約4.5 nm之間、約4.5與約5 nm之間、約5與約5.5 nm之間、約5.5與約6 nm之間、約6與約6.5 nm之間、約6.5與約7 nm之間、約7.5與約8 nm之間、約8與約8.5 nm之間、約8.5與約9 nm之間、約9與約9.5 nm之間、約9.5與約10 nm之間、約1與約2 nm之間、約2與約3 nm之間、約3與約4 nm之間、約4與約5 nm之間、約5與約6 nm之間、約6與約7 nm之間、約7與約8 nm之間、約8與約9 nm之間、約9與約10 nm之間、約0.5與約5 nm之間、約5與約10 nm之間、小於約0.5 nm或大於約10 nm，其中約意謂10%大於或小於以下數字。

在一實例中，第一聚合酶將加電荷標籤的核苷酸併入至雜合聚核苷酸中且第二聚合酶將FFN併入至聚合酶中。在一實例中，第一聚合酶及第二聚合酶彼此不同。在另一實例中，第一聚合酶及第二聚合酶可彼此相同。在一些實例中，第一聚合酶及第二聚合酶可均同時存在；而在其他實例中，藉由第一聚合酶併入加電荷標籤的核苷酸可在存在第一聚合酶且不存在第二聚合酶下進行，且FFN可隨後在存在第二聚合酶下併入，無論是否亦存在第一聚合酶。在一些實例中，在與FFN一起培育之前，在併入有加電荷標籤的核苷酸之後洗滌出第一聚合酶，其與第二聚合酶一起培育進行。在一實例中，第一聚合酶可併有具有給定動力學或在某些條件（諸如pH、張力或比第二聚合酶更佳之其他參數）下標記之加電荷標籤的核苷酸，及/或第二聚合酶可併有具有給定動力學或在某些條件（諸如pH、張力或比第一聚合酶更佳之其他參數）下之FFN。

多種適合之聚合酶中之任一者可用於本文所闡述之方法或組成物中，包括例如自生物系統分離之蛋白質類酶及其功能變體。除非另外指示，否則提及特定聚合酶（諸如下文所例示之聚合酶）應理解為包括其功能變體。一種特別有用的聚合酶功能係使用現存核酸作為模板催化核酸股之聚合。其他有用的功能在本文中別處描述。適用聚合酶之實例包括DNA聚合酶及RNA聚合酶、其功能片段及包括其之重組融合肽。實例DNA聚合酶包括藉由結構同源性分類成鑑別為A、B、C、D、X、Y及RT之家族的彼等。家族A中之DNA聚合酶包括例如T7 DNA聚合酶、真核粒線體DNA聚合酶γ、大腸桿菌DNA Pol I（包括克列諾片段）、水生棲熱菌Pol I及嗜熱脂肪芽孢桿菌Pol I。家族B中之DNA聚合酶包括例如真核DNA聚合酶a、6及E；DNA聚合酶C；T4 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、熱球菌屬9⁰ N-7古菌聚合酶（亦稱為9°N™）及其變體（諸如美國專利申請公開案第2016/0032377 A1號中所揭示之實例），及RB69噬菌體DNA聚合酶。家族C包括例如大腸桿菌DNA聚合酶III α次單元。家族D包括例如來源於古細菌（Archaea）之廣古菌門（Euryarchaeota）子域的聚合酶。家族X中之DNA聚合酶包括例如真核聚合酶Pol β、Pol σ、Pol λ及Pol μ以及釀酒酵母（S. cerevisiae）Pol4。家族Y中之DNA聚合酶包括例如Pol η、Pol ι、Pol κ、大腸桿菌Pol IV（DINB）及大腸桿菌Pol V（UmuD'2C）。DNA聚合酶之反轉錄酶（reverse transcriptase，RT）家族包括例如反轉錄病毒反轉錄酶及真核端粒酶。實例RNA聚合酶包括但不限於病毒RNA聚合酶，諸如T7核糖核酸聚合酶；真核RNA聚合酶，諸如RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III、RNA聚合酶IV及RNA聚合酶V；及古菌RNA聚合酶。任何其他適合之聚合酶，其包括但不限於例如美國專利第8,460,910號中所揭示之任何聚合酶，亦包括於如本文中所提及之聚合酶中，正如包括具有藉由與上文所提及之聚合酶中之任一者比較修飾之序列的任何其他功能聚合酶，其僅作為非限制性實例之清單提供。

返回至圖1，在併入FFN、加電荷標籤的核苷酸、FFN、聚合酶等之後，可自雜合聚核苷酸洗滌。在一實例中，蛋白質降解以便使任何未藉由習知洗滌步驟移除之殘餘聚合酶變性或以其他方式完全去活化。此後，FFN可藉由已知方法偵測。舉例而言，可使用已知光學螢光偵測方法在表面上偵測到FFN，其中螢光誘發於雜合聚核苷酸保持雜合至模板之表面上且自該表面偵測。因為FFN併入僅可在併入有加電荷標籤的核苷酸之後根據所揭示之方法發生，所以量測FFN併入可作為加電荷標籤的核苷酸併入之替代方式。在另一實施例中，雜合聚核苷酸可自模板去雜合且在溶液中溶析，其中螢光在該溶析溶液中而不在表面上偵測。可在表面上、在溶液中或以其他方式採用所揭示方法中所用之用於量測通常接附至核苷酸之螢光團的各種已知方法中之任一者。在一些實施例中，在聚合酶或聚核苷酸藉由連接子接附至表面之情況下，連接可為可裂解的，諸如蛋白酶裂解位點（若連接子為肽連接子）或必要時能夠經破壞以用於自表面釋放聚合酶或聚核苷酸之其他化學部分。

偵測可藉由任何適合之方法進行，包括螢光光譜分析或藉由其他光學手段。FFN標記物可為螢光團，其在吸收能量之後發射在所定義波長下之輻射。已知許多適合之螢光標記物。舉例而言，Welch等人（Chem. Eur: J. 5（3）: 951-960, 1999）揭示可用於本發明中之丹醯基官能化之螢光部分。Zhu等人（細胞量測術28：206-211，1997）描述螢光標記物Cy3及Cy5之用途，其亦可根據本發明之態樣使用。適合於使用之標記物亦揭示於Prober等人（Science 238：336-341，1987）；Connell等人（BioTechniques 5（4）：342-384，1987），Ansorge等人（Nucl.Acids Res. 15（11）：4593-4602，1987）及Smith等人（Nature 321：674, 1986）。其他可商購的螢光標記物包括但不限於螢光素、玫瑰紅（包括TMR、德克薩斯紅及Rox）、alexa、硼螢（bodipy）、吖啶、香豆素、芘、苯并蒽及花青苷。可採用前述任一者之任何適合的修改以用於如本文所揭示之方法中且根據如本文所揭示之方法使用。舉例而言，FFN可包括此類接附之標籤。可根據本發明使用商購之加螢光標籤之核苷酸。FFN之非限制性、廣泛性實例可描繪如下：

。

在此實例中，螢光團藉由連接子序列接附至核苷酸之鹼基。此類連接子可包括用於將螢光團接附至核苷酸之各種化學接附部分。在其他實例中，螢光團可接附至核苷酸之不同部分或核苷酸之不同鹼基。在所描繪之非限制性實例中，可逆阻斷劑經指示在3'碳上，但此類阻斷劑並非必需或存在於包括於本發明中之所有實例中。

在一實例中，可藉由修飾緩衝液或其他聚合酶反應條件（例如，螯合參與藉由第一聚合酶之核苷酸鹼基配對及/或聚合之溶液組分之金屬或其他離子）來停止將加電荷標籤的核苷酸併入雜合聚核苷酸中。在不同樣品中，併入加電荷標籤的核苷酸可在併入停止之後的各種時間停止，隨後在所有樣品之均勻條件下併入FFN。藉由比較併入至不同樣品中之聚核苷酸中之螢光量，可相對確定不同樣品中之加電荷標籤的核苷酸之併入。在其他實例中，不同於藉由第一聚合酶之聚合期間，不同第一聚合酶可彼此比較，不同基底；不同加電荷標籤的核苷酸；聚合酶、模板及/或雜合聚核苷酸接附至之表面之不同表面化學物質；聚合酶與基底之間的不同繫鏈；電荷標籤與核苷酸之間的不同附件；具有不同緩衝劑、pH及/或濃度之不同溶液；且因此，相比於比較樣本之間的FFN（例如，經由螢光）併入之量，用於給定電荷標籤之不同德拜長度或任何其他變數可在樣本及對電荷標籤併入之影響來改質。在一實例中，不進行或不需要藉由導電通道進行之電荷標籤偵測以便進行此類測定。

核苷酸、模板或雜合聚核苷酸無需為去氧核糖核苷酸。舉例而言，核苷酸、模板或雜合聚核苷酸可為核糖核苷酸。類似地，聚合酶無需為DNA聚合酶且可藉由RNA聚合酶取代。聚合酶亦可為逆轉錄酶。在此類實例中，可選擇加電荷標籤的核苷酸及FFN以便適當地補充模板核苷酸，以便藉由聚合酶將其併入至雜合聚合酶中。

在一實例中，雜合聚核苷酸可變為自模板去雜合且再雜合至模板。參看雜合聚核苷酸本身係關於在聚合酶聚合延長期間雜合，因為其併入有加電荷標籤的核苷酸或FFN。此類合併之間的雜合聚核苷酸之去雜合包括於如本文所揭示之方法之態樣內。

本發明之實例亦提供用於核酸定序程序中偵測之核苷酸併入事件的組成物及方法。存在對偵測系統之需求，該偵測系統基於電荷之差異提供核苷酸之差異性識別之益處，諸如以高通量方式准許長定序讀數。本文所闡述之實例可滿足此需要且亦提供其他優勢。包括如下文更詳細地描述之加電荷標籤的核苷酸作為組分且同樣適合且亦意欲用於所有前述實例中。

如本文中所揭示，在具有不同標記物之核苷酸上的昂貴且感光之螢光標記物供不同偵測系統使用。習知螢光標記物之偵測可涉及昂貴硬體，諸如增大偵測儀器之大小的雷射及偵測光學器件。另外，使用更強大之軟體來解碼產生之眾多資訊。重要的是，如本文所揭示，不需要昂貴螢光團。藉由用電荷標記物替換螢光標記物，可藉由監測系統中之電流的導電通道偵測電荷。此允許進行「即時」定序且具有藉由減少各核苷酸併入之循環時間實現更快的周轉時間的可能性。

藉由啟用「即時（real-time）」定序，在一個實例中不涉及3'-OH處之封端基團。此降低經修飾之核苷酸之成本，因為涉及較少合成步驟。另一益處為聚合酶更適合於併入具有3'OH之核苷酸，該等核苷酸與經化學修飾之大型3'保護基相比更接近於天然系統。

用於偵測包括電荷之經修飾核苷酸之導電通道可對周圍電場有反應。藉由定位具有極為貼近於導電通道之表面之電荷的經修飾核苷酸來調節此場。在一些情況下，諸如在溶液中之鹽或其他離子可篩檢電荷免於藉由導電通道偵測之情況下，電荷標籤與表面之緊密接近可為重要的。特徵屏蔽長度被稱作德拜長度（Debye length），超出該長度導電通道可能不能偵測電荷。

包括於經修飾之核苷酸中之電荷可為介於-200e至200e之間的任何位置，其在以線性方式經完全拉伸時可超過160埃，而導電通道周圍之德拜長度可為約1 nm。因此，可能需要建構核苷酸之帶電修飾以促進其藉由導電通道之偵測。

除非另外規定，否則本文所用之術語應理解為採用其普通含義。本文中所使用之若干術語及其定義之實例闡述於下文中。

如本文所使用，術語「陣列」係指接附至一或多個固相基底之導電通道或分子群，以使得導電通道或分子可根據其相對位置彼此區分開。陣列可包括各自位於固相基底上之不同可定址位置處（例如，不同導電通道處）的不同分子。或者，陣列可包括各自具有不同分子之分開的固相基底，其中不同探針分子可根據固相基底在固體相基底所接附之表面上的位置或根據固相基底在液體（諸如，流體流）中之位置來鑑別。陣列之分子可為核酸引子、核酸探針、核酸模板或核酸酶，諸如聚合酶及外切核酸酶。

如本文所用，術語「接附」係指兩個事物彼此接合、緊固、黏著、連接或結合之狀態。舉例而言，反應組分（諸如聚合酶）可藉由共價或非共價鍵接附至固相組分，諸如導電通道。共價鍵藉由原子之間電子對共用來特徵化。非共價鍵為不涉及電子對共用之化學鍵，且可包括例如氫鍵、離子鍵、凡得瓦力（van der Waals force）、親水相互作用及疏水相互作用。

如本文中所使用，術語「導電通道（electrically conductive channel）」欲意謂將其表面或其周圍電場中之擾動轉換成電信號的偵測裝置之一部分。導電通道可為電導性通道。舉例而言，如圖3中所繪示，導電通道5可將反應組分（例如經標記核苷酸）之到達或離開轉換成電信號。在本文所揭示之實例中，導電通道5亦可經由其與經標記核苷酸之氧化還原活性電荷標籤之相互作用，將兩種反應組分（模板核酸及經標記核苷酸之核苷酸）之間的相互作用轉換成可偵測信號。

導電通道5可為導電通道2之通道。導電通道2可包括源極及汲極端S、D以及連接端S、D之通道5。通道可具有任何適合之幾何形狀，例如管狀、線狀、板狀等。

如本文中所使用，術語「導電通道」欲意謂將其表面或其周圍電場中之擾動轉換成電信號的偵測裝置。舉例而言，導電通道可將反應組分之到達或離開轉換成電信號。導電通道亦可將兩種反應組分之間的相互作用或單一反應組分中之構形變化轉換成電信號。實例導電通道為場效應電晶體（FET），諸如碳奈米管（carbon nanotube；CNT）、基於單壁碳奈米管（single-walled carbon nanotube；SWNT）之FET、矽奈米線（silicon nanowire；SiNW）FET、石墨烯奈米帶FET（及由2D材料，諸如MoS₂ 、矽烯等製成之相關奈米帶FET）、隧穿FET（TFET）及陡次臨限斜率裝置（steep subthreshold slope device）（參見例如Swaminathan等人, Proceedings of the 51st Annual Design Automation Conference on Design Automation Conference, 第1-6頁, ISBN：ISBN: 978-1-4503-2730-5 （2014）及Ionescu等人,Nature 479, 329-337 （2011））。可用於本發明之方法及設備中之FET及SWNT導電通道之實例闡述於美國專利申請公開案第2013/0078622 A1號。

端S、D可為任何合適之導電材料，包括電導體或半導體。適合之源極及汲極材料之實例包括鈷、矽化鈷、鎳、矽化鎳、鋁、鎢、銅、鈦、鉬、氧化銦錫（indium tin oxide；ITO）、氧化銦鋅、金、鉑、碳等。

導電通道5可包括可氧化或還原氧化還原活性電荷標籤之任何導電材料或半導電材料。材料可包含有機材料、無機材料或兩者。適合之通道材料之一些實例包括矽、碳（例如玻璃態碳、石墨烯等）、聚合物（諸如導電聚合物（例如聚吡咯、聚苯胺、聚噻吩、摻雜有聚(4-苯乙烯磺酸鹽)之聚(3,4-伸乙基二氧噻吩)（PEDOT-PSS）等））、金屬、生物分子等。

在一些實例中，導電通道5亦可為在奈米尺度上具有至少一個尺寸（在1 nm至小於1 µm之範圍內）之奈米結構。在一個實例中，此尺寸指代最大尺寸。作為實例，導電通道5可為半導電奈米結構、石墨烯奈米結構、金屬奈米結構及導電聚合物奈米結構。奈米結構可為多壁或單壁之奈米管、奈米線、奈米帶等。

當關於核酸使用時，如本文所用之術語「不同」意謂核酸具有彼此不相同的核苷酸序列。兩個或更多個核酸可具有沿著其整個長度不同的核苷酸序列。或者，兩個或更多個核酸可具有沿著其長度之大部分不同的核苷酸序列。舉例而言，兩個或更多個不同核酸可具有對於兩個或更多個分子不同，同時亦具有在兩個或更多個分子上相同之通用序列部分的目標核苷酸序列部分。術語「不同」可類似地應用於其他分子，諸如聚合酶及核酸酶。

當關於項目集合使用時，如本文所使用之術語「各（each）」意欲鑑別該集合中之個別項目，但未必指該集合中之每一個項目。若清楚的揭示內容或上下文另外明確規定，則可存在例外狀況。

如本文中所使用，術語「標記物（label）」在關於反應組分使用時，欲意謂可偵測反應組分或反應組分之可偵測部分。有用標記物為可由導電通道偵測之電荷標記物（亦稱為電荷標籤）。標記物可為待偵測之反應組分固有的（例如聚合酶之帶電荷胺基酸）或標記物可為反應組分外在的（例如胺基酸之非天然存在之修飾）。在一些實例中，標記物可包括具有個別功能之多個部分。舉例而言，標記物可包括連接子組分（諸如核酸）及電荷標籤組分。

如本文所使用，術語「非天然（non-natural）」當用來指稱分子之一部分時，意欲指未在天然環境或在人類未干擾、技術未介入之生物系統中被發現接附至分子之部分。在一些實例中，非天然部分為使得分子在結構上或化學上不同於未經修飾分子或不同於具有天然修飾之分子的分子之合成修飾。如本文所使用，術語「非天然（non-natural）」當用於指稱方法之類似物時，意欲意謂在發生該方法之天然環境中未發現的類似物。在一些實例中，非天然類似物為結構上或化學上不同於類似物所屬類別中之其他類型之分子的合成類似物。

如本文所用之術語「核酸（nucleic acid）」意欲與其在此項技術中之用法一致且包括天然存在的核酸或其功能性類似物。尤其適用的功能性類似物能夠以序列特異性方式與核酸雜合或能夠用作特定核苷酸序列之複製模板。天然存在的核酸一般具有含有磷酸二酯鍵的主鏈。類似結構可具有替代主鏈鍵聯，包括各種此項技術中已知之彼等中之任一者，諸如肽核酸（peptide nucleic acid；PNA）或鎖核酸（locked nucleic acid；LNA）。天然存在之核酸通常具有去氧核糖（例如去氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid；DNA）中所發現的）或核糖（例如核糖核酸（ribonucleic acid；RNA）中所發現的）。

核酸可含有此項技術中已知之此等糖部分之各種類似物中之任一者。核酸可包括天然或非天然鹼基。就此而言，天然去氧核糖核酸可具有一或多個選自由以下者組成之群之鹼基：腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鳥嘌呤，且核糖核酸可具有一或多個選自由以下者組成之群之鹼基：尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鳥嘌呤。可包括在核酸中的適用的非天然鹼基為此項技術中已知的。

如本文中所使用，術語「核苷酸」意欲包括天然核苷酸、其類似物、核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、二去氧核糖核苷酸及已知為核苷酸之其他分子。術語可用於指存在於聚合物中之單體單元，例如鑑別存在於DNA或RNA股中之次單元。術語亦可用於指未必存在於聚合物中之分子，例如能夠藉由聚合酶以模板依賴性方式併入至聚核苷酸中之分子。術語可係指在5'碳上具有例如0、1、2、3或更多個磷酸根之核苷單元。舉例而言，四磷酸核苷酸、五磷酸核苷酸及六磷酸核苷酸可為尤其適用的，在5'碳上具有超過6個磷酸（諸如7、8、9、10或更多個磷酸）之核苷酸亦可如此。實例天然核苷酸包括但不限於ATP、UTP、CTP及GTP（統稱為NTP）；及ADP、UDP、CDP及GDP（統稱為NDP）；或AMP、UMP、CMP或GMP（統稱為NMP）；或dATP、dTTP、dCTP及dGTP（統稱為dNTP）；及dADP、dTDP、dCDP及dGDP（統稱為dNDP）；以及dAMP、dTMP、dCMP及dGMP（dNMP）。實例核苷酸可在無異常之情況下包括任何NMP、dNMP、NDP、dNDP、NTP、dNTP以及其中X表示2至10之數字的其他NXP及dNXP（統稱為NPP）。

本文中亦被稱作核苷酸類似物之非天然核苷酸包括不存在於天然生物學系統中或在其天然環境中（例如在表現聚合酶之非重組細胞中）並非實質上藉由聚合酶併入至聚核苷酸中的彼等核苷酸。尤其適用之非天然核苷酸包括藉由聚合酶以一定速率併入至聚核苷酸股中之彼等，該速率比另一核苷酸（諸如鹼基與其華生-克里克互補鹼基（Watson-Crick complementary base）配對的天然核苷酸）藉由聚合酶併入至股中之速率實質上更快或更慢。例如，當與天然核苷酸之併入速率相比，非天然核苷酸可以至少2倍不同的速率併入-例如，至少5倍不同、10倍不同、25倍不同、50倍不同、100倍不同、1000倍不同、10000倍不同或更多。非天然核苷酸可能夠在併入至聚核苷酸中之後經進一步延伸。實例包括具有3'羥基之核苷酸類似物或在3'位置具有可移除以允許進一步延伸已併入核苷酸類似物之聚核苷酸的可逆終止子部分之核苷酸類似物。可使用之可逆終止子部分之實例描述於例如美國專利第7,427,673號、第7,414,116號及第7,057,026號及PCT公開案WO 91/06678及WO 07/123744。應理解，在一些實例中，具有3'終止子部分或缺少3'羥基之核苷酸類似物（諸如雙去氧核苷酸類似物）可在已併入核苷酸類似物之聚核苷酸不經進一步延伸的條件下使用。在一些實例中，核苷酸可不包括可逆終止子部分，或核苷酸將不包括不可逆終止子部分或核苷酸將完全不包括任何終止子部分。在5'位置具有修飾之核苷酸類似物亦為適用的。

如本文所使用，術語「保護部分（protection moiety）」意欲意謂接附至反應組件以減少、最小化或在一些情況下防止反應組分經歷特定反應之化合物或其部分。舉例而言，核酸分子可與核酸酶結合，使得核酸分子降低、最小化或在一些情況下防止核酸酶藉由可以其他方式引起酶降解或修飾之處理而降解或修飾。抗體亦可用於結合反應組分以保護反應組分免於降解、不活化或其他反應。

如本文中所使用，術語「反應組分」意欲意謂參與反應之分子。實例包括反應中消耗之反應物、由反應產生之產物、有助於反應之催化劑（諸如酶）、溶劑、鹽、緩衝液及其他分子。

如本文所使用，術語「防護部分（repellant moiety）」意欲意謂將佔據空間以防止或抑制另一分子在該空間處之佔用或抑制另一分子在該空間附近之併接的分子或其部分。防護部分可經由立體排斥、電荷排斥、疏水性-親水性排斥或其他力起作用。

在關於核苷酸使用時，如本文中所使用，術語「終止子部分（terminator moiety）」意謂抑制或防止核苷酸與第二核苷酸形成共價鍵聯之核苷酸之一部分。舉例而言，在具有戊糖部分之核苷酸的情況下，終止子部分可減少、最小化或在一些情況下防止形成核苷酸之3'氧與第二核苷酸之5'磷酸之間的磷酸二酯鍵。終止子部分可為作為存在於核酸聚合物中之單體單元之核苷酸的一部分，或終止子部分可為游離核苷酸之一部分（例如核苷三磷酸（nucleotide triphosphate））。作為核苷酸之一部分的終止子部分可為可逆的，使得終止子部分可經修飾以致使核苷酸能夠與第二核苷酸形成共價鍵。在特定實例中，終止子部分（諸如可逆終止子部分）可接附至核苷酸類似物之戊糖部分之3'位置或2'位置。

下文所闡述及申請專利範圍中所敍述之實例可鑒於上文定義進行理解。

本發明提供尤其適用於在核酸定序程序中偵測之核苷酸併入事件之組成物、製造此類組成物之方法及在此類程序中使用其之方法。本文所闡述之組成物及方法尤其適用於例如單分子核酸定序反應，諸如藉由合成定序。然而，應瞭解，本文所闡述之組成物及方法可用於任何其他適合的偵測流程，包括但不限於單分子偵測。可使用如本文中所揭示之組成物的用於核酸定序之設備及方法揭示於例如美國專利申請案第14/798,762號中。

舉例而言，核酸定序之方法可包括以下之方法：（a）提供繫栓至固體載體導電通道之聚合酶；（b）提供一或多種經標記之核苷酸，其中當標記物接近於導電通道時可藉由導電通道偵測標記物之存在；及（c）偵測經標記之核苷酸併入至與模板核酸互補之新生股中。

在核酸定序方法之一些實例中，聚合酶保持與導電通道接近小於10、9、8、7、6、5、4、3、2或1 nm。

在一些實例中，標記物或其一部分（例如，電荷標籤）可在併入例如聚合酶之後自核苷酸裂解。

如本文所提供，一或多個經標記之核苷酸可包括複數個電荷標籤。舉例而言，一或多種經標記之核苷酸可包含各類型核苷酸之獨特電荷標籤。舉例而言，帶有電荷標籤之核苷酸可用於藉由聚合酶根據模板序列合成DNA之鏈，該模板序列可包括一串核苷酸，包括例如鹼基腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤及胞嘧啶。可藉由聚合酶將如本文所揭示之帶有電荷標籤之核苷酸併入至與模板序列互補之一串核苷酸中。如本文中所揭示，隨著帶電荷標籤之核苷酸如此併入，導電通道可偵測指定價之電荷（意謂正電或負電）及特定及差異地與各核苷酸物種相關聯的量值，允許記錄併入生長股中之連續核苷酸之一致性且藉此記錄生長股與生長股互補之模板股中存在的核苷酸序列。電荷標籤可為負電荷標籤或正電荷標籤，且可具有自-200e 至+200e （諸如自-175e 至+175e 、或自-150e 至+150e 、或自-125e 至+125e 、或自-100e 至+100e 、或自-75e 至+75e 、或自-50e 至+50e ）之任何位置的電荷。

用於核酸定序之方法中之導電通道可包括奈米線FET。視需要，導電通道可包括碳奈米管。導電通道可為導電通道陣列之部分。偵測過程可包括依次偵測複數個併入事件。

本文所闡述之組成物、設備及方法可提供長核酸定序讀數；快速讀數；用於定序之高通量能力；及用於定序之可擴充平台。在一些實例中，由於本文所闡述之方法及設備提供同時進行讀數數目之通量之能力，可藉由進行多個重疊讀數減緩單個讀數精確性之任何損害。

實例導電通道展示於圖3中。此處，聚合酶1產生反應位點，其中核苷酸可併入經激活之DNA模板4中。聚合酶1經由繫鏈3接附至奈米線FET 2。該設備提供單分子敏感度。反應位點之電荷分佈之變化（例如聚合酶構形變化、核苷酸併入、帶電標籤之出現或離開、聚合酶至導電通道之接近度之變化等）傳輸至閘極且可經偵測。

在特定實例中，本發明之設備或方法可使用深尺度之FinFET電晶體作為單分子導電通道。FinFET導電通道受益於前沿半導體製造商正研發之技術。此外，可使用預先公開之組分，包括但不限於（1）如Choi等人,Science , 335, 319 （2012）中所描述之用於將溶菌酶固定於CNT上以即時觀測酶持續合成能力（processivity）的彼等；（2）如Olsen等人,J. Amer. Chem. Soc. , 135, 7885 （2013）中所描述之用於將Pol 1克列諾片段固定於CNT上且即時觀測DNA持續合成能力的彼等；（3）如Chi等人,NanoLett 13, 625 （2013）中所描述之用於闡明由於蛋白質異位運動而移動帶電殘基之轉導機制的彼等。本方法亦可採用設備、設備組件及闡述於美國專利申請公開案第2013/0078622 A1號中之方法。

標記核苷酸之一些實例亦可包括特異性區域。因此，標記核苷酸可包括核苷酸、接附至核苷酸之磷酸基團之連接分子或連接子及接附至連接子之電荷標籤。連接分子或連接子可包含可與結合至導電通道之繫鏈上之受體區域雜合之特異性區域。作為實例，特異性區域可為能夠暫時接附或鍵結至繫鏈上之受體區域的任何核苷酸序列或肽。舉例而言，特異性區域可包括一連串核苷酸且受體區域可包括一連串核苷酸，使得在特異性區域與受體區域中之核苷酸之間形成成對鍵結形式。在此情況下，成對鍵結係指核苷酸之間，諸如G殘基與C殘基之間或A殘基與T殘基或U殘基之間的標準成對鍵結。

特異性區域可包括一連串核苷酸及受體區域，相應核苷酸互補序列。在一實例中，當聚合酶接受核苷酸以併入與模板聚核苷酸互補之生長之聚核苷酸股中時，特異性區域及受體區域可彼此足夠接近以在其間形成成對鍵結。特異性區域與受體區域之間的此類成對鍵結可促進帶電標籤與導電通道之間足夠接近，從而促進在核苷酸之併入期間導電通道對電荷標籤之偵測。

在一實例中，特異性區域可包括核苷酸序列，該核苷酸序列包括約一個核苷酸至約六個核苷酸。在另一實例中，特異性區域可進一步包括側接核苷酸序列之兩側的肌苷。在一些實例中，特異性區域包括於電荷標籤之部分中。舉例而言，特異性區域可由一系列核苷酸或胺基酸之片段或部分組成，該等核苷酸或胺基酸沿著線性序列彼此分離，諸如藉由電荷標籤之部分，其中鍵結至受體區域可誘導特異性區域之各別區域彼此接近，同時允許藉由電荷標籤採用給定三維結構。

在與繫鏈相關聯之標記核苷酸之一實例中，標記核苷酸與繫鏈之間的特異性結合親和力與藉由非特異性結合相互作用產生之弱親和力組合。標記核苷酸可包括與繫鏈之一部分互補的特異性區域。此等區域之間的特異性結合可由標準華生-克里克鹼基配對（Watson-Crick base pairing）或其他非共價鍵結產生。在此實例中，特異性區域亦可包括側接核苷酸序列之肌苷（I）。胞嘧啶為通用鹼基，且因此可與DNA之所有四個天然核苷酸配對。額外結合相互作用可由通用鹼基（例如肌苷I）與繫鏈上之天然核苷酸之相互作用產生。因此，當經標記之核苷酸在併入期間結合至聚合酶時，協同結合可發生於經標記之核苷酸之特異性區域與繫鏈之受體區域之間，此可極大增加經標記之核苷酸與繫鏈之間的相互作用之穩定性。

標記核苷酸與聚合酶或聚合酶與繫鏈之間的相互作用可使得電荷標籤出現在導電通道之感測區內。此類相互作用亦可幫助將感測區帶內之電荷標籤維持足夠用於高效及完整電荷偵測之時間。此類時間可為至多數十毫秒。此類相對較長相互作用不同於溶液中存在之其他經標記核苷酸，其理論上可擴散且短暫觸碰或接近導電通道。此類短暫相互作用可並不足夠長以用於進行足夠電荷偵測，且因此在此等情況下，未藉由導電通道偵測到電荷標籤。

如本文中所揭示，電荷標籤可包括多肽、寡核苷酸、寡聚肽核酸或前述中之兩者或更多者之任何組合。在一些實例中，電荷標籤可包括選自胺基酸、核苷酸及連接子之複數個元素。此類分子可採用三維結構以允許由電荷標籤之態樣攜載的電荷凝聚，使得總電荷可凝聚至較小區域。此類提高之電荷密度可增加在藉由聚合酶將核苷酸類似物併入生長股中期間由導電通道偵測之電荷，使得可測定此類合成中之既定核苷酸物種之存在。採用此類凝聚構形之電荷標籤可最小化其電荷遠離導電通道或在導電通道之大表面區域或兩者之分散。因此，導電通道可能更可能偵測較大量或比例之電荷標籤之電荷。

本文中所揭示之一些實例採用經標記核苷酸與聚合酶之協同結合（單獨或與繫鏈組合），以便在導電通道之感測區域附近引入及保持電荷標籤。用繫鏈形成之複合物之穩定性可相對較低，使得對於亦不結合至聚合酶之經標記核苷酸（亦即溶液中游離之經標記核苷酸可基本上不結合至繫鏈）不形成複合物。換言之，此類錯合物之解離速率可足夠高以使得壽命較短。然而，當經標記之核苷酸與聚合酶之間形成穩定結合時，連接分子之局部濃度可在繫鏈周圍提高，因此產生高締合速率。以此方式，與不相關狀態相比，在聚合酶相關狀態下之總體相關時間可極大地增加。單獨或與繫鏈組合之聚合酶之經標記核苷酸之親和力協同作用可合計以使得總體上結合親和力。在藉由聚合酶裂解之後，協同效應喪失且電荷標籤亦可自導電通道解離。

特定實例可採用γ-磷酸標記核苷酸與聚合酶及與繫鏈之協同結合。寡核苷酸部分之穩定性：繫鏈，或特異性區域：受體區域，複合物可相對較低，使得複合物不形成亦不結合至聚合酶之γ-磷酸標記之核苷酸，使得溶液中不含之γ-磷酸標記之核苷酸基本上不結合至繫鏈。然而，對繫鏈之受體區域的聚合酶之核苷酸部分及特異性區域（諸如寡核苷酸部分）之親和力協同作用可合計以允許實質上大體上結合親和力。在一些實例中，協同效應可利用核苷酸標記物與繫鏈之間的特異性結合親和力以及藉由非特異性結合相互作用產生之弱親和力之組合。舉例而言，如上文所陳述，在一些實例中，特異性結合可由標準華生-克里克鹼基配對產生，且非特異性結合相互作用可由混雜鹼基（例如肌苷）與天然核苷酸之相互作用產生。因此，當γ-磷酸標記之核苷酸在併入期間結合至聚合酶時，可發生協同結合，從而可極大地增加寡核苷酸部分與繫鏈之間的相互作用之穩定性。在γ磷酸藉由聚合酶裂解之後，協同效應可能消失且寡核苷酸部分將自繫鏈解離。其他類型之核苷酸部分：繫鏈鍵結，諸如經由DNA、RNA、PNA、胺基酸或其類似物或其組合之間的非共價相互作用，以促成此類協同效應。

如圖4中所示，聚合酶可固定至導電通道，諸如單壁碳奈米管、矽奈米線或FinFET。固定可經由包括DNA、RNA、PNA、胺基酸或其類似物或組合之繫鏈來進行。為證實之方便起見，圖4展示繫栓至導電通道之四個聚合酶，各聚合酶亦結合至不同的γ-磷酸標記之核苷酸類型。如所示，核苷酸可具有接附至γ-磷酸之寡核苷酸部分。與目標核酸之模板股適當匹配的β-磷酸或γ-磷酸標記之核苷酸可藉由聚合酶保持在適當位置，該聚合酶亦可與模板長時間結合以暫時使寡核苷酸部分或其他特異性區域與繫鏈之受體區域雜合（例如經由華生-克里克鹼基互補性或其他非共價鍵結）。雜合可使得電荷標籤干擾導電通道周圍之電場，該電場可歸因於經由導電通道之電晶體電流之變化而產生可偵測信號。該圖展示進入在導電通道之1-2 nm之內之場的電荷標籤。經適當匹配之β-磷酸或γ-磷酸磷酸標記之核苷酸可併入至雜合至模板核酸之新生股中。此可轉而破壞β磷酸與新併入之核苷酸之間的鍵。因此，電荷標籤（不論接附在核苷酸之或位置處）可自由地自繫鏈解離且分散遠離導電通道，由此將導電通道周圍之場返回至其未被擾動狀態。信號在導電通道周圍之區域經擾動且返回至未擾動狀態時之出現及消失可分別與核苷酸併入靶核酸之新生股中相關。

在模板股之各位置併入至新生股中之核苷酸類型可基於併入至各類型核苷酸中之標記物之獨特特性測定。舉例而言，四種類型dNTP可藉由以下者區分：特異性區域與繫鏈之結合區域雜合之位置、特異性區域之長度及/或標記物上之帶電部分之存在、電荷之價數及電荷之量值。舉例而言，給定核苷酸可具有給定價及量值之電荷，該電荷並非由具有不同價及/或量值之電荷的其他核苷酸共用。導電通道可能夠偵測電荷之價數及/或量值之差異。在藉由繫栓至導電通道之聚合酶將具有帶電標籤之核苷酸併入至新生聚核苷酸中期間，導電通道可偵測作為模板股之核苷酸之補充併入的核苷酸之標籤之價數及/或量值。當聚合酶移動以結合下一物種之核苷酸，轉而與模板之下一核苷酸互補時，併入至新生股中之此類下一物種之核苷酸的電荷之價數及/或量值亦可藉由導電通道偵測。且因此，將具有電荷標籤之連續核苷酸併入至新生股中。

由於連續電荷標籤由導電通道偵測，因此產生於電荷標籤差異之穿過導電通道之電流差異可記錄及儲存於諸如電腦可讀儲存媒體中，該電腦可讀儲存媒體可經程式化以便記錄對於隨著生長之新生股為由用於各此類併入之導電通道偵測之價數及/或電荷量值的基礎而合成，由聚合酶聚合之各併入的核苷酸之給定識別物種。

圖4提供使用2個電荷標籤及兩個繫鏈雜合位置實現鹼基G、A、C及T之間的四態區別之實例。特定言之，dCTP經帶負電之外部部分獨特地標記，dTTP經帶正電之外部部分獨特地標記，dATP及dGTP基於不存在任何外部電荷部分而與其他兩種核苷酸類型區分，且dATP與dGTP之區別在於，當寡核苷酸部分與繫鏈雜合時，寡核苷酸部分與導電通道之不同接近性。

應理解，不同核苷酸類型可基於正電荷部分、負電荷部分及/或繫鏈雜合位置之多種組合中之任一者區分。或者或另外，用於區分不同類型之核苷酸之電荷部分可在電荷之強度方面不同，即使電荷具有相同標識。圖5中展示之實例組態提供基於單一繫鏈雜合位置之鹼基G、A、C及T與四種不同電荷部分之間的四態區分。具體言之，在此非限制性實例中，dGTP及dCTP均含有帶負電部分，將其與dATP及dTTP區分開，且dGTP可歸因於可區別地高於dCTP上之電荷的電荷而區別於dCTP。類似地，dATP及dTTP可歸因於相較於dTTP部分，dATP部分上之較高正電荷而彼此區別開來。

如先前在本文中所指出，沿繫鏈之特定雜合位置處之標籤置放精確度可經由使用具有核糖核苷酸之繫鏈及具有2'-O-甲基（2'-O-Me）及2'-氟（2'F）修飾之RNA鹼基的核苷酸標記物來增強。替代性組態可使用具有標記物之含有2'-O-Me及2'F修飾之核糖核苷酸之繫鏈，該標記物具有核糖核苷酸，或繫鏈及標記物兩者可包括天然核糖核苷酸與2'-O-ME及2'F修飾之核糖核苷酸之混合物。儘管有可能使用主要由RNA構成之繫鏈及/或寡核苷酸部分，但可能需要使用基於DNA或基於PNA或基於胺基酸之繫鏈及/或寡核苷酸以避免與RNA相關之核酸酶敏感性。舉例而言，基於DNA或基於PNA或基於胺基酸之繫鏈及/或寡核苷酸可包括天然核糖核苷酸或非天然核糖核苷酸類似物以達成本文所闡述之結合優勢，同時降低不合需要之核酸酶消化之風險。在其他實例中，繫鏈可包括一或多個去氧核糖核苷酸，其與核苷酸標記物中之去氧核糖核苷酸互補，或者，繫鏈可包括與核苷酸標記物中之去氧核糖核苷酸互補之去氧核糖核苷酸。

將聚合酶接附至導電通道之繫鏈對於如本文所揭示之若干實例中所闡述之不同核苷酸序列可具有不同結合位置（例如受體區域）。兩個或更多個核苷酸序列之結合位置可重疊或其可離散，無重疊。出於說明之目的，繫鏈序列描繪於圖10中作為一系列通用「N」核苷酸。各種序列中之任一者可根據互補及所需雜合強度及特異性之法則使用。視繫鏈之長度、受體區域之長度及特異性區域之長度而定，繫鏈上之一些、全部或無結合位點可重疊。在一些態樣中，互補鹼基為標準DNA鹼基，但可使用任何核苷酸類似物（例如可使用去氧核糖核苷酸類似物）。

核苷酸類似物之特異性區域之繫鏈結合寡核苷酸部分可具有與繫鏈之受體區域上之互補序列特異性雜合的一連串核苷酸。在一些實例中，繫鏈結合寡核苷酸部分亦可包括非特異性結合至繫鏈之混雜核苷酸位置。此類位置可提供在繫鏈結合寡核苷酸部分與繫鏈之間之弱相互作用，從而促進形成特定混合結構。舉例而言，如圖11中所示，寡核苷酸部分可包括已知混雜地（儘管微弱地）與DNA之所有四種原生核苷酸結合之若干肌苷（I）。繫鏈結合寡核苷酸部分（例如特異性區域）及繫鏈（例如受體區域）可經由繫鏈結合寡核苷酸部分中之肌苷與繫鏈中之天然核苷酸之間的相互作用形成弱複合物。此可使序列之特定部分（例如，在圖中指示為ABC及其補體A'B'C'）比不存在弱複合物形成之情況更快速地結合。此外，一旦特定複合物已形成肌苷，則可提供其他穩定性。

非限制性實例，圖11中之繫鏈結合寡核苷酸部分包括側接特異性序列之兩側的混雜核苷酸位置。然而，應理解，一或多個混雜核苷酸位置可.定位於特異性序列之5'或3'側上。混雜核苷酸位置之其他實例包括藉由退化寡核苷酸合成形成之彼等或與此項技術中已知之其他核苷酸類似物形成之彼等核苷酸，以混雜地與2個或更多種類型之核苷酸雜合。

本文所闡述之若干實例已例示使用複數個具有不同長度之寡核苷酸特異性區域的不同核苷酸類似物。在此類實例中，不同核苷酸類似物類型可基於其特異性區域之不同長度而區分。或者，不同核苷酸類似物可具有相同或類似長度之繫鏈結合寡核苷酸部分，其可能不允許彼此區分開。然而，各核苷酸類似物可具有與受體區域或其他核苷酸類似物之特異性區結合之區域相比結合至繫鏈之不同受體區域的特異性序列。實例組態展示於圖12中，其中聚合酶與不同核苷酸類似物之結合將聚合酶置放於四個可區別的狀態中之一者中。在圖12中所展示之非限制性實例中，ATP類似物之繫鏈結合寡核苷酸部分結合至繫鏈上最接近繫鏈與聚合酶之接附點的位置，TTP類似物之繫鏈結合寡核苷酸部分結合至繫鏈上最遠離繫鏈與聚合酶之接附點的位置，且GTP及CTP類似物之繫鏈結合寡核苷酸部分分別結合至繫鏈上之不同位置，該等位置在其他兩個核苷酸類似物之繫鏈結合寡核苷酸部分之結合位點的中間距離。不同核苷酸類似物與聚合酶之結合可將聚合酶定位於距導電通道不同距離處（例如使得不同尺寸之環形成於繫鏈中，如圖中所示）。在核苷酸類似物中之一或多者包括電荷標籤或其他可偵測部分（例如自繫鏈結合寡核苷酸部分之末端延伸至自核苷酸延伸以待藉由聚合酶併入至核苷酸序列中之末端）的實例中，繫鏈結合寡核苷酸部分與繫鏈之間的結合可將電荷標籤部分定位於距導電通道不同的距離處。在此類情況下，可至少部分基於針對可偵測電荷標籤部分距導電通道之不同距離所產生之信號的差異區分不同類型之核苷酸類似物。對於此說明性實例，核苷酸類似物鑑別為ATP、GTP、CTP及TTP，但可使用任何核苷酸類似物（例如，可使用去氧核糖核苷酸類似物）。

在其他實例中，諸如圖15A及15B中所說明，如本文所揭示之標記核苷酸之特異性區域可包括各自雜合至繫鏈之受體區域之不同部分的聚核苷酸序列。此類序列之間之特異性區域可為不與受體區域之一部分雜合之一系列核苷酸序列。兩個序列可因此與繫鏈之受體區域之對應互補部分及特異性區域之介入部分雜合，其中中間序列在其他地方自由雜合（諸如特異性區域之此類中間序列之兩個互補部分彼此雜合以形成如圖15A中所示之髮夾結構）或自由雜合或保持其自身未特異性結合（諸如圖15B中所示）。在圖15A及15B中，「受體區域」指示繫鏈之受體部分，其與標記核苷酸之特異性區域雜合或以其他方式短暫結合。在一些實例中，此類鍵結可增加藉由導電通道對帶電標籤之偵測（在圖15A及15B中藉由接附至繫鏈/受體區域之導線表示）。

如藉由圖6中所圖解說明之實例所表明，將聚合酶接附至導電通道之繫鏈不必能夠與可存在於類似物核苷酸上之電荷標籤或特異性序列雜合。確切而言，導電通道可藉由與聚合酶之繫鏈分離之受體區域之接附而官能化，核苷酸類似物之特異性區域可結合至該聚合酶之繫鏈。不同核苷酸之區別可基於以下各者達成：電荷標籤之電荷之價數、電荷之強度、特異性區域之長度：受體區域結合複合物，或受體區域之鄰近度或位置：形成於導電通道或與導電通道相關之特異性區域複合物，或其組合，無論受體區域係以聚合酶繫鏈之一部分或以其他方式接附至導電通道。

在7圖中展示帶有根據本發明之電荷標籤的核苷酸類似物之說明性實例。此僅為如本文所描述及揭示之核苷酸類似物之許多實例中之一者，且不限制本發明之範疇。在此非限制性實例中，dT六磷酸經由包含特異性區域之連接區域連接至電荷標籤。在此非限制性實例中，連接子包括藉由疊氮炔烴點擊反應形成之共價鍵，但可替代地採用其他化學物質，如本文進一步揭示。為了易於參考，當描述本文中核苷酸類似物的部分時，如圖7中所示，根據指代核苷酸之去氧核苷上之游離3'羥基的定則，朝向分子右側之區域將稱作3'端。相應地，如圖7中所示，朝向分子左側之區域，其中電荷標籤位於此實例中，將稱作5'端，其作為鍵結至核苷酸之核糖之5'碳之磷酸基團的延伸部分。

可用於本文所闡述之設備及方法之電荷標籤之實例為磷酸部分，例如位於核酸部分之5'端處。含有磷酸二酯基團之此部分可在可獲得的寡核苷酸合成方案期間容易地添加，且可在寡核苷酸部分之末端產生兩個帶負電氧，如圖8中所示。聚核苷酸鏈或寡聚物之性質亦可具有與寡核苷酸鏈中之核苷酸數目大致成比例之負電荷，且可包括於電荷標籤中。寡核苷酸合成期間之化學磷酸化可藉由使用2-[2-(4,4'二甲氧基三苯甲基氧基)乙磺醯基]乙基-(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)-胺基磷酸酯（phosphoramidite）（購自Glen Research, Sterling VA,目錄號CPR 10-1900）將DMT保護基轉換為5'磷酸基團。具有不同數目個負電荷之一系列電荷標籤可使用以下者製得：參-2,2,2-[3-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)丙氧基甲基]乙基-[(2-氰基乙基)-(N, N-二異丙基)]-胺基磷酸酯（購自Glen Research, Sterling VA,目錄號10-1922-xx）、1,3-雙-[5-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)戊基醯胺基]丙基-2-[(2-氰基乙基)-(N, N-二異丙基)]-胺基磷酸酯（購自Glen Research,Sterling VA,目錄號10-1920-xx）、1-[5-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)戊基醯胺基]-3-[5-氟甲氧基羰基戊醯胺]-丙基-2-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-胺基磷酸酯（購自Glen Research,Sterling VA,目錄號10-1921-xx）或寡核苷酸樹突聚合物，其含有各種數目DMT（4,4'-二甲氧基三苯甲基）或Fmoc（茀基甲氧基羰基）部分，諸如購自Glen Research或諸如繪示於圖9A及圖9B中（針對倍增分支）或圖9C（針對三重分支）中之彼等。適用之帶正電標籤為2-[2-(4-單甲氧基三苯甲基)胺基乙氧基]乙基-(2-氰基乙基)-N,N-二異丙基）-胺基磷酸酯（購自Glen Research,Sterling VA,目錄號10-1905-xx）。另一適用之帶正電部分為5'一級胺，其可在適當pH下具有單一正電荷。

表1提供可用作本文所闡述之設備或方法中之標記物的一些有用修改及電荷之非限制性清單。表1

5'端	試劑	最終電荷狀態
5' OH	N/A	中性
5'磷酸	CPR 10-1900 （Glen Res.）	-2
5'磷酸（×2）	CPR 10-1900及對稱雙倍物（Glen Res.）	-4
5'磷酸（×3）	CPR 10-1900及對稱三倍物（Glen Res.）	-6
5'一級胺	5'胺基-改質劑5	+1

在一態樣中，本發明係關於一種經修飾之核苷酸，其包括：核苷酸；接附至核苷酸之磷酸基團之連接分子；及接附至連接分子之電荷標籤，其中電荷標籤包括選自由核苷酸及胺基酸組成之群的複數個元素及元素之間視需要存在之連接子，且其中該電荷標籤包含內部摺疊或二級結構。在一實例中，其中電荷標籤包含一或多個磷酸二酯基團及視需要存在之元素之間的連接子。在一些態樣中，核苷酸可為天然核苷酸或經修飾之核苷酸。經修飾之核苷酸結構為一般熟習此項技術者已知且可包括對鹼基或糖部分之結構修飾（例如烷基化、胺基或保護基）。在一些實例中，連接分子包含特異性區域。在一些實例中，特異性區域包含核苷酸序列，該核苷酸序列包括一至六個核苷酸。在一些實例中，該電荷標籤包括自約1電荷至約100或約200電荷。在一些實例中，連接分子包含如下文所示的自-X₂ 至(CH₂ )_m 基團之式I中之結構。在一個實例中，該電荷標籤並不結合至用於本文中之方法中的聚合酶（例如，Phi29）。在一些實例中，電荷標籤包含複數個核苷酸，該等核苷酸包含結合至聚合酶繫鏈中之受體區域的兩個非鄰接區域，由此在電荷標籤中形成髮夾結構。

核苷酸類似物或經標記核苷酸之實例由以下式I化合物表示：

，其中n為3至10之整數，m為1至10之整數，t為0至50之整數，X₁ 為直接鍵、C₁ -C₁₀ 烷基、C₁ -C₁₀ 氧雜烷基、C₁ -C₁₀ 硫雜烷基或C₁ -C₁₀ 氮雜烷基，X₂ 為C₁ -C₂₀ 烷基，其中視需要一或多個個別CH₂ 殘基經肽鍵及(-O-CH₂ -CH₂ -)_a 中之一或多者置換，其中a為1至24之整數，X₃ 為直接鍵或寡核苷酸，其中當該標記物接近該導電通道時，該寡核苷酸與該繫鏈之受體區域雜合，F₁ 係選自螢光團及直接鍵，且F₂ 不存在或為螢光團， A為

、

、

或醯胺鍵，且 Y係選自由以下者組成之群：

、

、

及

，q為1至100之整數， B係選自由以下者組成之群：胺基酸；核苷酸；

；

其中R選自Y及氫；及樹突；且其中當B為樹突時q等於1，且q數目個B具有電荷及電荷密度在一實例中，提供一種方法，其包括偵測經標記之核苷酸藉由聚合酶併入至與模板聚核苷酸股互補之新生聚核苷酸股中，其中聚合酶藉由繫鏈繫栓至固體載體導電通道，經標記之核苷酸為式I之化合物，且導電通道將在併入期間偵測經標記之核苷酸。

在一實例中，B包括電荷標籤，且該電荷標籤標記物包括核苷酸、寡核苷酸、胺基酸、肽核酸或其組合，其中該電荷標籤具有內部摺疊或二級結構。

如本文進一步闡述，製備式I化合物可包括藉由包括連接反應之反應形成A，且連接反應選自由以下者組成之群：疊氮-炔銅輔助點擊反應、四

-反式-環辛烯接合、氮雜-二苯并環辛炔基無銅點擊反應及硫醇-順丁烯二醯亞胺共軛。

亦提供一種藉由電荷偵測器偵測式I化合物之電荷標籤之方法，諸如在將式I化合物之核苷酸部分併入至聚核苷酸之新生鏈期間。在一非限制性實例中，偵測可在定序核酸期間進行，包括（a）提供繫栓至固體支撐導電通道之聚合酶；（b）提供一或多種式I化合物，其中當標記物接近導電通道時化合物之存在可藉由導電通道偵測；及（c）使用導電通道偵測化合物併入至與模板核酸互補之新生股中。

亦提供式I之化合物，其中B包括一或多種具有一或多個莖及環形狀、一或多個苜蓿葉形狀、一或多個管形狀、一或多個環形狀、一或多個立方形形狀、一或多個十字形形狀、一或多個球形形狀、一或多個矩形形狀、一或多個錐形形狀、一或多個菱形形狀、一或多個層形狀、一或多個柱形狀、一或多個波紋形狀或前述兩個或更多個之任何組合的寡核苷酸。在式I化合物之另一實例中，B包括一或多種具有一或多個捲曲形狀之多肽。亦提供式I之化合物，其中B包括一或多個形成十字形形狀之寡核苷酸、一或多個鍵結至該等寡核苷酸中之一或多者之肽核酸分子及一或多個鍵結至該一或多個肽核酸分子之多肽。

亦提供一種式I之化合物，其中B具有在-100e 與+100e 之間的電荷。亦提供式I之化合物，其中B具有在-100e 與+100e 之間的電荷及在-100e /立方奈米與+100e /立方奈米之間的電荷密度。亦提供一種式I之化合物，其中B具有在-200e 與+200e 之間的電荷。亦提供式I之化合物，其中B具有在-200e 與+200e 之間的電荷及在-200e /立方奈米與+200e /立方奈米之間的電荷密度。

在一些實例中，式I化合物可視需要包括螢光團，諸如由F₁ 、F₂ 或兩者表示。螢光團之一些非限制性實例包括花青染料（例如，Cy2、Cy3或Cy5）、異硫氰酸螢光素、羅丹明螢光團（rhodamine fluorophore）（例如，四甲基羅丹明）或其他。視需要存在之式I之化合物中之螢光團可提供額外用途，諸如用於偵測包括螢光團之標記核苷酸。舉例而言，可不僅經由偵測標籤所帶有之電荷之存在、價數及量值，而且藉由用於偵測螢光發射，諸如螢光共振能量轉移之方法來偵測含有螢光團之電荷標籤的存在。

亦提供標記之核苷酸，其中該電荷標籤包括一或多種肽核酸。在一些實例中，電荷標籤包括一或多個肽核酸，且肽核酸中之一或多者接附至一或多個帶電胺基酸。

亦提供一種形成式I之化合物之方法，其中該電荷標籤包括寡核苷酸且由DNA摺疊形成。DNA摺疊可涉及摺疊DNA，產生呈奈米級之非任意形狀。壓緊摺疊DNA結構可允許高電荷密度，允許不同式I化合物中之電荷密度變化。電荷標籤之不同電荷及電荷密度中之較高電荷、較高電荷密度及較大可撓性可增加導電通道對電荷標籤之偵測的機率，且亦准許區分藉由導電通道偵測之不同電荷標籤。可由電荷標籤攜帶之更大範圍之電荷允許由式I化合物之不同實例攜帶之電荷之間的更大差異。在一些實例中，不同核苷酸可藉由與其作為式I化合物連接之標籤攜帶的電荷而彼此區分。導電通道可由此能夠基於不同此類核苷酸攜帶之電荷之量值差異而不同地偵測構成式I化合物之一部分的不同核苷酸。

B可包括帶正電胺基酸，諸如精胺酸、組胺酸及離胺酸，產生具有正電荷之變化標籤。B可替代地包括天冬胺酸及麩胺酸，從而產生具有負電荷之電荷標籤。在一些實例中，B為分支多肽或線性多肽或環狀多肽。在一些實例中，B可為單個胺基酸或具有在任何位置處之2至10或11至20個之胺基酸的多肽。在一些實例中，B之胺基酸中之一些可不帶電且在其他實例中，B可含有一些自B之其他胺基酸帶相反電荷之胺基酸，然而B可保留總正電荷或負電荷。

在式I之此非限制性實例中，直接鍵結至n個磷酸基團之核苷酸可為可藉由聚合酶識別之核苷酸，且併入至由此與模板序列互補合成之核苷酸序列中。雖然核苷酸類似物在添加至生長合成聚核苷酸序列期間藉由聚合酶保持在原位，但類似物之其餘部分可自其延伸且如本文中所揭示，對於接近於導電通道之聚合酶，電荷標籤（諸如由式I中之B表示及與其直接鍵結之帶電肽中）可移動或與導電通道接近，以使得導電通道可感測電荷之價數及量值。不同核苷酸類似物可在類似物之3'端含有不同核苷酸，且相應地在類似物之5'端含有不同肽電荷標籤，使得繫栓至聚合酶之導電通道可在聚合酶與不同核苷酸類似物結合以併入所合成之核苷酸序列中之核苷酸時偵測電荷價數及量值之差異。在此等實例中，聚合酶可裂解除一個直接鍵結至核苷酸類似物之5'核苷酸之磷酸基團以外的所有磷酸基團，使得核苷酸類似物之dNMP部分保持在合成核苷酸序列中，其中5'磷酸基團不含鍵結至待併入之下一個核苷酸且核苷酸類似物之裂解剩餘物不含與複合物解離。

直接鍵結至3'鹼基核苷酸之磷酸或一系列磷酸基團可包括1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個磷酸基團。其他實例可包括超過10個磷酸基團。核苷酸類似物之此部分可隨後藉由包括1-10個-CH₂ -基團之烷基鍵連接。其他實例可包括在此位置處之11-20個此類基團。在其他實例中，此等1-10或11-20個-CH₂ -基團中之一或多者可經C₁ 至C₂₀ 烴取代。

核苷酸類似物之此部分可進一步藉由0至50個氧雜烷基，諸如-O-CH₂ -CH₂ -基團連接。在其他實例中，此等0-50個-O-CH₂ -CH₂ -基團中之一或多者可經C₁ 至C₁₅₀ 烴取代。

核苷酸類似物之此部分可進一步藉由包括如X₁ 所表示之0-10個-CH₂ -基團之烷基鍵連接。X₁ 之其他實例可包括來自此位置處之11-20個此類基團。在X₁ 之其他實例中，此等1-10個或11至20個-CH₂ 基團中之一或多者可經C₁ 至C₂₀ 烴取代。X₁ 亦可為直接鍵、C₁ -C₁₀ 烷基、C₁ -C₁₀ 氧雜烷基、C₁ -C₁₀ 硫雜烷基或C₁ -C₁₀ 氮雜烷基。

如下文更充分地描述，A表示可將核苷酸類似物之5'端連接至電荷標籤朝向核苷酸類似物之3'端的連接基團。舉例而言，聚磷酸核苷酸可具有最遠離去氧核糖（或核糖）之隨附至5'磷酸基團之官能基，其在該官能基之末端可為反應性基團。反應性基團為能夠與另一化學基團（一起為兩個反應性基團）反應以在受控條件下，諸如在特定試劑或試劑存在下或在預定pH值或溫度等下，在其之間形成共價鍵或鍵的化學基團。舉例而言，式I部分自3'核苷酸直至或一些數目個缺乏A之鍵的類似組成物或實例為可商購的或根據已知方法合成。可接著將反應性基團隨附至此類化合物之末端以使得與另一反應性基團之電荷標籤可一起反應，其中第一反應性基團可與另一反應性基團反應以形成共價鍵，由此將電荷標籤共價連接至3'核苷酸以形成式I化合物。

接附至A之可為X₂ 。X₂ 可為C₁ -C₂₀ 烷基，其中個別CH₂ 殘基可獨立地經肽鍵及(-O-CH₂ -CH₂ -)_a 中之一或多者置換，其中a為1至24之整數。在X₂ 之其他實例中，a可為6至20之整數。在另外其他實例中，X₂ 之1-20個烷基中之一或多者可經C₁ 至C₂₀ 烴取代。

在一實例中，B可表示藉由磷酸鍵聯連接至X₂ 之電荷標籤。B可包括含有磷酸二酯基之1至100個部分。在一實例中，B可包括含有磷酸二酯基之1至200個部分。此類磷酸二酯基中由氧原子攜帶之負電荷可賦予B電荷標籤負電荷，其中量值與部分之數目成比例。B之q部分中之每一者可為與B之其他部分中之任一者不同的部分，或其可皆彼此相同。B之任何一或多個部分可為具有例如腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鳥苷鹼基之dNMP。B之任何一或多個部分可為： C3間隔子

或dSpacer

其中R為氫。

在一些實例中，B之任何部分可包括任何NPP（聚磷酸核苷酸）。電荷價數、量值或兩者不同於結合有不同3'核苷酸之其他電荷標籤之彼等電荷標籤准許藉由導電通道區分對核苷酸類似物之鑑別，因為其藉由在聚核苷酸合成期間降聚合酶繫栓至其上而保持。在一些實例中，一些核苷酸類似物為如本文所揭示之式I之化合物或類似化合物。在一些實例中，用於合成定序反應之所有核苷酸含有包括如本文所揭示之一或多個磷酸二酯基團的帶電標籤，諸如式I化合物或相關化合物之實例。在其他實例中，用於合成定序反應之一些核苷酸含有包括如本文所揭示之一或多個磷酸二酯基團的帶電標籤，諸如式I化合物或相關化合物之實例，而用於合成定序反應之其他核苷酸含有不包括此類化合物之帶電標籤。

在其他實例中，各B可獨立地選自精胺酸、組胺酸及離胺酸，產生具有正電荷之變化標籤。在另一實例中，各B可獨立地選自天冬胺酸及麩胺酸，產生具有負電荷之電荷標籤。在一些實例中，q數目個B為分支多肽或線性多肽或環狀多肽。在一些實例中，q數目個B可為單個胺基酸或具有2至10或11至20個胺基酸之任何位置的多肽。在一些實例中，B之胺基酸中之一些可不帶電且在其他實例中，B可含有一些自B之其他胺基酸帶相反電荷之胺基酸，然而B可保留總正電荷或負電荷。在一些實例中，B可包括非天然胺基酸。

在又其他實例中，B可為包含一或多個組成重複單元及複數個末端單元之z代的樹突，其中z為1至6之整數，組成末端單元係選自由以下者組成之群：

及

其中p₁ 為1至3之整數，其中p₁ 個-CH₂ -基團中之任何一或多者視需要經1至3個-O-CH₂ -CH₂ -基團置換，p₂ 為1至3之整數，其中p₂ 個-CH₂ -基團中之任何一或多者視需要經1至3個-O-CH₂ -CH₂ -基團置換，且末端基團選自由以下者組成之群：羧酸、磺酸、膦酸、胺基或四級銨基團。

B可表示藉由其自由價端連接至X₂ 之樹突電荷標籤。在一些實例中，本文所揭示之樹突可不接附至核苷酸類似物，諸如在其已經化學鍵結至其上之前。B可包括具有2度分支之組成重複單元，諸如由以下者表示：

。

或者，B可包括具有3度分支之組成重複單元，諸如由以下者表示：

。

如本文進一步揭示，樹突電荷標籤之大小可為1至6代之任何位置處。末端組成重複單元上之末端基團可帶正電或帶負電。具有2度分支之樹突可因此產生具有2^z 之電荷的電荷標籤，且具有3度分支之樹突可產生具有3^z 之電荷的電荷標籤（其中每末端基團之電荷量值為1且z表示代數目）。

在B表示樹突之一實例中，末端基團可為多種帶電官能基中之任一者，諸如羧酸、磺酸、膦酸、胺基或四級銨基團，或任何其他帶電官能基。在一些實例中，樹突之組成重複單元可在原子上而非末端組成重複單元之末端基團上包括電荷，及末端組成重複單元之末端基團。舉例而言，作為一個非限制性實例，組成重複單元可在分支點含有四級銨基團，其可攜帶正電荷。不同於僅可存在於末端組成重複序列之帶電末端基團，直至此類內部電荷可存在於樹突中之組成重複單元之每一實例上。

可存在肽鍵，諸如視需要在式I中之X₂ 表示。在其他實例中，代替式I中所示之肽鍵，可存在C₁ 至C₂₀ 烴或直接鍵。

對於A，將核苷酸連接至電荷標籤之連接子可藉由反應性基團之間的連接反應形成。舉例而言，A可由具有疊氮（或炔烴）基團之核苷酸與具有炔烴（或疊氮）基團之電荷標籤之間的疊氮-炔烴銅輔助點擊反應形成，產生諸如以下者或其等效物之化學結構：

。

或者，A可藉由在具有四

（或反式環辛烯）基團之核苷酸與具有反式環辛烯（或四

）基團之電荷標籤之間接合之四

（TET）-反式-環辛烯（TCO）形成，從而產生諸如以下者或其等效物之化學結構：

。

或者A可由具有疊氮（或二苯并環辛炔）基團之核苷酸與具有二苯并環辛炔（或疊氮）基團之電荷標籤之間的不含銅之疊氮-二苯并環辛炔（DBCO）基團點擊反應形成，產生諸如以下者或其等效物之化學結構：

。

或者，A可藉由具有硫醇（或順丁烯二醯亞胺）基團之核苷酸與具有順丁烯二醯亞胺（或硫醇）基團之帶電標籤之間的硫醇-順丁烯二醯亞胺共軛而形成，產生諸如以下者或其等效物之化學結構：

。

或者，A可藉由具有胺（或N-羥基丁二醯亞胺酯）基團之核苷酸與具有N-羥基丁二醯亞胺酯（或胺）基團之帶電標籤之間的N-羥基丁二醯亞胺酯-胺鍵聯反應形成，得到醯胺鍵。

藉由適合反應性基團之間的其他接合化學反應形成之其他適合之鍵聯基團可併入至本發明中以形成用於A之其他結構，藉由該等其他結構，可將3'核苷酸連接至電荷標籤。

式I之B表示電荷標籤。如本文中所揭示，電荷標籤可包括多肽、寡核苷酸、寡聚肽核酸或樹突或前述中之至少兩者之組合。電荷標籤之電荷可藉由此類部分之帶電官能基攜帶，該等部分諸如磷酸二酯鍵、醯胺基、羧酸基或可添加至此類化合物之其他帶電官能基，該等化合物諸如一或多個磺酸基、膦酸基或四級銨基團。如本文中所揭示，電荷標籤可採用特定三維定向，使得由其元件攜載之電荷固持在一起且受到抑制，或在一些情況下防止傳播及遠離導電通道。電荷藉由提高電荷標籤之電荷密度之此類凝聚可增加由導電通道偵測之電荷。

可合成電荷標籤以便具有適用於根據前文形成點擊化學或接合反應之反應性基團。舉例而言，電荷標籤可具有疊氮或炔基（諸如用於藉由疊氮炔銅輔助點擊反應共價接附至及包括於核苷酸類似物中作為電荷標籤），或四

（TET）或反式環辛烯基（諸如用於藉由四

（TET）-反式環辛烯（TCO）接合共價接附至及包括於核苷酸類似物中作為電荷標籤），或疊氮基或DBCO基團（諸如藉由不含銅之疊氮-DBCO基團之點擊反應共價接附至及包括於核苷酸類似物中作為電荷標籤），或硫醇（例如半胱胺酸殘基）或順丁烯二醯亞胺基（諸如藉由硫醇-順丁烯二醯亞胺接合共價接附至及包括於核苷酸類似物中作為電荷標籤）。亦可採用其他已知接合、點擊化學或其他共價接附化學反應，其中對應反應性基團接附至電荷標籤，允許其共價接附至核苷酸類似物。

可存在肽鍵，諸如展示於式I中A與5'核苷酸之間。在其他實例中，代替式I中所示之肽鍵，可存在C₁ 至C₂₀ 烴或直接鍵。

一些適合實例包括對式I化合物之修飾或變化形式，其併有與繫鏈之受體區域（藉由其聚合酶繫栓至導電通道）可如何與核苷酸類似物之特異性區域雜合或以其他方式形成非共價鍵的上文所論述之特徵。舉例而言，在3'核苷酸與5'電荷標籤之間的類似物核苷酸之某一部分併入核苷酸、PNA殘基或胺基酸，該等核苷酸、PNA殘基或胺基酸能夠與繫鏈形成非共價鍵，聚合酶藉由該繫鏈連接至導電通道，或與自導電通道延伸且接附至導電通道之受體區域官能化之部分結合，該受體區域自身可不為此等繫鏈之一部分，且亦可包括核苷酸、PNA殘基或胺基酸或其組合。前述內容可經取代或添加至5'電荷標籤與3'核苷酸之間的如本文所揭示之式I化合物之區域中。此類取代或添加可有助於類似物核苷酸與聚合酶及與繫鏈（或出於結合至此類取代或添加之目的，除繫鏈以外之導電通道之官能化部分）之協同結合，以促進電荷標籤與電荷偵測器之偵測區的適合長持續時間之關聯，以允許偵測電荷標籤以登記且表明併入具有此類電荷之核苷酸類似物，如本文中所揭示。

在一些實例中，電荷標籤採用三維結構可藉由將特異性區域之空間上不同元件另外聚集在一起而使得特異性區域形成，從而允許將如此組合之限定區域鍵結至受體區域。此類特異性區域形成及受體區域結合可能不會出現或可能不太可能出現或在不採用電荷標籤之特定三維結構的情況下僅極短暫地出現。在其他實例中，在結合至受體區域時使特異性區域之另外不同元素聚集在一起可誘發或提昇給定三維構形之電荷標籤採用。在一些實例中，電荷標籤採用三維構形且在特異性區域之另外空間上遠端元件彙集在一起可為協同的，使得每一者促進另一者。在一些情況下，由電荷標籤如此採用之三維構形產生比原本可能出現之電荷密度更高的電荷密度，且可增加由導電通道進行之電荷標籤的偵測。

可使用肽電荷標籤之各種設計。使用固相肽合成，21個胺基酸中之任一者可包括於電荷標籤中。另外，經修飾之胺基酸亦可購得且可添加至肽電荷標籤中以進一步調節其特性。除使用具有帶電子電荷之側鏈的胺基酸，諸如精胺酸、組胺酸及離胺酸（正電），及天冬胺酸及麩胺酸（負電）以外，其他胺基酸可併入於肽電荷標籤中以調整其親水性、長度及大小。

如上文所揭示，在一個實例中，肽電荷標籤可以線性（參見圖14A）、分支（參見圖14B及14C）或環狀鏈（參見圖14D）形式呈現。

藉由使用不同長度之胺基酸，諸如KKKK（SEQ ID NO:8）或EEEEE（SEQ ID NO:9）（或具有或不具有其他不帶電胺基酸之帶電胺基酸之其他組合）之不同組合，可區分4種不同核苷酸類似物進行定序或各種核苷酸類似物可基於來自各肽電荷標籤之特徵電流特徵來區分。其他更複雜三維構形亦為可能的。舉例而言，肽電荷標籤可採用捲曲構形，諸如α-螺旋。此類結構可包括正胺基酸及負胺基酸，但可包括整體正電荷或負電荷。舉例而言，置放帶相反電荷之胺基酸可誘導其間之鍵結及採用α-螺旋或其他結構，其中過量正電荷或過量負電荷保持在一起接近，提高電荷密度。在其他實例中，類似鍵結可促進採用包括淨正電荷或負電荷之密度之捲曲螺旋結構。

電荷標籤亦可包括寡核苷酸。寡核苷酸電荷標籤可使用上文所述之點擊化學及接合化學反應接附至核苷酸類似物，從而將肽電荷標籤接附至核苷酸類似物。

寡核苷酸電荷標籤可採用各種三維取向，該等三維取向促進在較高電荷密度下壓縮其電荷。舉例而言，寡核苷酸之核苷酸之間的磷酸二酯鍵可具有負電荷。藉由採用縮合三維結構，可將寡核苷酸之負電荷保持接近彼此，從而增加為導電通道之此類電荷標籤之偵測。舉例而言，寡核苷酸可採用熟知結構，諸如逐步及環形結構、苜蓿葉結構或十字形結構（諸如霍利迪連結體（Holliday junction））。聚核苷酸摺疊技術亦可用於設計採用增加電荷密度之其他構形的聚核苷酸電荷標籤。聚核苷酸電荷標籤可採用管狀形狀、環狀形狀、立方形形狀或球形形狀。此類形狀可產生具有較高電荷密度之寡核苷酸電荷標籤：具有相同核苷酸組成物但不採用三維構形之寡核苷酸，諸如若將該寡核苷酸拉伸成線性構形，則將具有。

為方便及清楚起見，在本文中描述本說明書、實例及申請專利範圍中所採用之某些術語。

除非另外規定，否則烷基意欲包括直鏈或分支飽和烴結構及其組合。烷基係指具有1至20個碳原子，例如1至10個碳原子，諸如1至6個碳原子等之烷基。烷基之實例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、正丁基、第三丁基及其類似基團。

環烷基為烴之子集，且包括3至8個碳原子之環烴基。環烷基之實例包括c-丙基、c-丁基、c-戊基、降冰片烷基及其類似基團。

C₁ 至C₂₀ 烴包括烷基、環烷基、多環烷基、烯基、炔基、芳基及其組合。實例包括苯甲基、苯乙基、炔丙基、烯丙基、環己基甲基、金剛烷基、樟腦基及萘基乙基。烴係指由氫及碳作為唯一元素成分構成之任何取代基。

除非另外規定，否則術語「碳環（carbocycle）」意欲包括其中環原子全部為碳但具有任何氧化態之環系統。因此，(C₃ -C₁₂ )碳環係指非芳族及芳族系統，包括諸如環丙烷、苯及環己烯之系統。若沒有其他限制，則碳環係指單環、雙環及多環。(C₈ -C₁₂ )羰基多環係指諸如降冰片烷、十氫萘、茚滿及萘之此類系統。

烷氧基或烷氧基係指具有1至20個碳原子，例如1至10個碳原子，諸如1至6個碳原子等之經由氧接附至母結構之直鏈或分支組態之基團。實例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基及其類似基團。

氧雜烷基係指其中一或多個碳（及其相關氫）已經氧置換之烷基殘基。實例包括甲氧基丙氧基、3,6,9-三氧雜癸基及其類似基團。術語氧雜烷基意欲如此項技術中所理解[參見Naming and Indexing of Chemical Substances for Chemical Abstracts, 由American Chemical Society, 2002版本, ¶196,出版，但不具有127（a）之限制-參考文獻以全文引用之方式併入本文中]，其係指其中氧經由單鍵鍵結至其相鄰原子（形成醚鍵）之化合物；其不涉及如會在羰基中發現的雙重鍵結氧。類似地，硫雜烷基及氮雜烷基係指其中一或多個碳已分別經硫或氮置換之烷基殘基。氮烷基之實例包括乙胺基乙基及胺基己基。

雜環意謂環烷基或芳基碳環殘基，其中一至四個碳經一個選自由N、O及S組成之群的雜原子置換。雜芳基為雜環之子集，其中雜環為芳族。雜芳環之實例包括：呋喃、苯并呋喃、異苯并呋喃、吡咯、吲哚、異吲哚、噻吩、苯并噻吩、咪唑、苯并咪唑、嘌呤、吡唑、吲唑、㗁唑、苯并㗁唑、苯并異㗁唑、噻唑、苯并噻唑、***、四唑、吡啶、喹啉、異喹啉、吡

、喹喏啉、吖啶、嘧啶、喹唑啉、嗒

、

啉、酞

及三

。

如本文所用，術語「視需要經取代（optionally substituted）」可與「未經取代或經取代（unsubstituted or substituted）」互換使用。術語「經取代（substituted）」係指用特定基團置換特定基團中之一或多個氫原子。舉例而言，經取代之烷基、芳基、環烷基、雜環基等係指烷基、芳基、環烷基或雜環基，其中各殘基中之一或多個H原子經鹵素、鹵烷基、烷基、醯基、烷氧基烷基、羥基低碳烷基、羰基、苯基、雜芳基、苯磺醯基、羥基、低碳烷氧基、鹵烷氧基、氧雜烷基、羧基、烷氧基羰基[-C(=O)O-烷基]、烷氧基羰基胺基[HNC(=O)O-烷基]、甲醯胺基[-C(=O)NH₂ ]、烷胺基羰基[-C(=O)NH-烷基]、氰基、乙醯氧基、硝基、胺基、烷基胺基、二烷基胺基、(烷基)(芳基)胺基烷基、烷胺基烷基（包括環烷基胺基烷基）、二烷基胺基烷基、二烷基胺基烷氧基、雜環基烷氧基、巰基、烷硫基、亞碸、碸、磺醯基胺基、烷基亞磺醯基、烷基磺醯基、醯基胺基烷基、醯基胺基烷氧基、醯胺基、甲脒基、芳基、苯甲基、雜環基、雜環基烷基、苯氧基、苯甲氧基、雜芳氧基、羥亞胺基、烷氧基亞胺基、氧雜烷基、胺基磺醯基、三苯甲基、甲脒基、胍基、脲基、苯甲氧基苯基及苯甲氧基置換。「側氧基」亦包括在「視需要經取代」中提及之取代基中；所屬技術領域具有通常知識者應瞭解，因為側氧基為二價基團，所以存在其不適合作為取代基之情形（例如在苯基上）。在一個實例中，1、2或3個氫原子可經指定基團置換。在烷基及環烷基之情況下，多於三個氫原子可經氟置換；實際上，所有可用氫原子均可經氟置換。此類化合物（例如全氟烷基）屬於「氟代烴」之類別。為了清楚起見，通用術語可涵蓋超過一個取代基，亦即例如「鹵烷基」或「鹵苯基」係指其中至少一個但可能超過一個氫經鹵素置換之烷基或苯基。在一些實例中，取代基為鹵素、鹵烷基、烷基、醯基、羥基、烷氧基、鹵烷氧基、氧雜烷基、羧基、氰基、乙醯氧基、硝基、胺基、烷胺基、二烷胺基、烷硫基、烷基亞磺醯基、烷基磺醯基、烷磺醯胺基、芳基磺醯基、芳基磺醯胺基及苯甲氧基。

在描述本文中之化合物時，使用術語「經至少一個含氧取代基取代」。氧化取代基為除碳及氫以外亦含有氧之取代基；氧化取代基亦可包括其他雜原子，諸如氮（例如甲醯胺或甲烷磺醯基）。含氧取代基之典型實例包括烷氧基、羥基、氟烷氧基、甲醯基、乙醯基及其他C₁ 至C₆ 醯基鏈。非限制性實施例

以下實施例意欲說明本發明之特定實例，但不意欲限制其範疇之方式。

用於併入至根據本發明製得之核苷酸中之電荷標籤之一些實例包括以下者：

（聚-T或其他聚核苷酸或核苷酸之組合），

（聚dSpacer），及

（聚C間隔子）或前述中之任一者之組合。

用於此類電荷標籤之電荷可藉由改變含磷酸基部分之數目而改變，例如5、10、15、20、25、30、35、40或其間之任何數目或範圍。可包括多達40，或自1至40之任何數目。可包括多於40。根據本發明，可使用此等實施例中所展示之除反式環辛烯基以外的適合之反應性基團。

寡核苷酸序列可用作電荷標籤，其中各種長度之電荷由磷酸二酯鍵中之磷酸根賦予。另外，諸如dSpacer及C3間隔子核苷酸之經修飾寡核苷酸亦可用於產生具有不同親水性及大小之電荷標籤。寡核苷酸序列可使用不同鹼基及疏水性修飾來修飾以調節序列特異性、最小化對聚合酶之抑制及最佳化與表面及連接子之相互作用。

基於磷酸二酯之電荷標籤可接附至核苷酸之5'-末端磷酸。在合成模板股之互補序列期間，在藉由聚合酶將各核苷酸併入至生長股中時，可釋放電荷標記物作為焦磷酸副產物之一部分。標記物上之電荷藉由導電通道上之偵測系統偵測。基於來自每一標籤之特徵電流標誌（例如，電荷量值），可使用由標籤賦予之電荷之不同量值來區分併入至合成股中之鹼基。

根據本發明之類似物核苷酸之實例包括但不限於以下者：

、

、

、

、

、

、

、

及

。

基於磷酸二酯之電荷標籤使用胺基磷酸酯化學物質及自動化寡核苷酸合成來合成。在合成之後對其進行純化，且隨後經由正交化學方法接附至特異性核苷酸。正交化學方法包括但不限於銅催化之炔烴-疊氮、具有DBCO及疊氮之無銅點擊化學方法、TCO-四

接合或硫醇-順丁烯二醯亞胺接合。

以下非限制性實施例顯示用各種連接子修飾5'胺基核苷酸六磷酸以允許與磷酸二酯電荷標籤之正交接附化學作用。5'-胺去氧-胸腺嘧啶六磷酸（dT6P）（或其他NPP）（1）可用疊氮基-丁酸N-羥基丁二醯亞胺（NHS）酯（2a）或甲基四

NHS酯（2b）官能化分別形成疊氮基dT6P（3a）或甲基四

dT6P（3b）（流程1）。

流程1. 5'-胺dT6P之官能化。

疊氮基dT6P（3a）可經由銅（I）輔助之疊氮-炔烴環加成（CuAAC）在CuSO₄ 、參-羥丙基***基甲胺（THPTA）配位體及抗壞血酸鈉存在下與5'-己炔基共軛之聚T寡核苷酸（4）之線性股，以形成寡核苷酸共軛物（5a）。在C18逆相高效液相層析（HPLC）上進行純化且用50 mM TEAA（pH 7.5）及乙腈溶析。與聚T寡核苷酸之CuAAC反應之代表性實施例展示於流程2中。

流程2.代表性CuCCA反應。

將甲基四

dT6P（3b）與在50 mM磷酸鹽緩衝液（pH 7.4）中具有5'-反式環辛烯（TCO）基團之聚T寡核苷酸（6）之線性股共軛，以形成寡核苷酸共軛物（5b）。在C18逆相HPLC上進行純化且用50 mM TEAA（pH 7.5）及乙腈溶析。甲基四

-TCO接合之代表性實施例顯示於流程3中。

流程3.代表性甲基四

-TCO接合。

疊氮dT6P（3a）經由無銅張力促進含疊氮-炔烴環加成（SPAAC）在50 mM磷酸鹽緩衝液（pH 7.4）中與具有5'-二苯并環辛基（DBCO）基團之聚-T寡核苷酸（7）之線性股共軛，以形成寡核苷酸共軛物（5c）。在C18逆相HPLC上進行純化且用50 mM TEAA（pH 7.5）及乙腈溶析。與聚T寡核苷酸之SPAAC反應之代表性實施例展示於流程4中。

流程4.代表性DBCO-疊氮共軛。

在以下流程中，氮雜-炔烴點擊反應將聚磷酸核苷酸連接至電荷標籤：

流程5.藉由點擊化學之代表性共軛。

前述實施例可諸如藉由反轉接合反應或點擊化學反應之各反應性基團之置放來修飾，產生前述鍵聯，但相對於類似物核苷酸之5'及3'端沿相反方向定向。

反應性基團及連接子化學反應可根據本發明之各種適用化學反應隨附至核苷酸及電荷標籤。在一些非限制性實施例中，疊氮或甲基四

尾可藉由與適當NHS殘餘物反應添加至胺基化NPP中，該NHS殘餘物可包括各種長度之連接子部分，諸如PEG4連接子，或具有不同長度之PEG連接子。此類合成流程之非限制性實例包括以下者及其變化形式：

使用不同NHS部分添加疊氮基或甲基四

反應性基團且具有各種連接子長度。非限制性實施例包括：

、

及

。

各種NPP用不同反應性基團形成以用於點擊或接合化學反應以使其與電荷標籤共價連接。一些非限制性實施例包括：

與含炔烴電荷標籤反應以產生例如以下者：

。

或者，含有NPP之甲基四

，諸如

與含TCO電荷標籤反應以形成以下者：

。

在其他實施例中，使用NPP與電荷標籤之間的DBCO疊氮點擊化學方法形成諸如以下之化合物：

在其他實施例中，核苷酸或電荷標籤上之順丁烯二醯亞胺基可分別與電荷標籤或核苷酸上之硫醇基反應，以經由順丁烯二醯亞胺基硫醇反應連接兩者：

含有順丁烯二醯亞胺基團之NPP或電荷標籤

在存在諸如(參(2-羧基乙基)膦）之還原劑的情況下，分別與含有含硫醇基之電荷標籤或NPP反應，可產生兩者之間的共價鍵合，例如

。

如表2中所示，各種銅鹽、配位體、添加劑、溶劑、反應持續時間及反應溫度可用於不同銅輔助點擊化學。

表2：Cu輔助之點擊化學反應

Cu鹽	配位體	添加劑	溶劑	持續時間	T Deg. C	批註
CuBr （10）	TBTA （20）	-	DMSO/t-BuOH	隔夜	40	無產物，N₃ -dT6P回升
CuSO₄ （25）	THPTA （50）	Na Asc （50）	H₂ O	2h	RT	不完全反應，形成產物
CuSO₄ （500）	PMDETA （3500）	Na Asc （10000）	H₂ O	1h	RT	N₃ -dT6P回收
CuSO₄ （500）	THPTA （3500）	Na Asc （10000）	H₂ O	隔夜	RT	以低產量形成之Pdt
CuSO₄ （25）	THPTA （50）	Na Asc （eq）	H₂ O	隔夜	RT	形成產物，不完全反應
4	形成產物，不完全反應，系列最高產率
-20	形成產物，不完全反應，系列最低產率
CuSO₄ （10）	TBTA （20）	Na Asc （200）	DMSO/t-BuOH	隔夜	RT	無產物，兩個SM存在
CuSO₄ （10）	THPTA （20）	Na Asc （200）	H₂ O	隔夜	RT	形成產物，不完全反應
CuSO₄ （100）	THPTA （300）	Na Asc （1000）	H₂ O	24 h	RT	形成產物，完全反應

如可見，在一般術語中，在高Cu負載中，反應可進行至完成但具有低產率。對比而言，在低Cu負載之情況下，反應可能不會完全完成，但產率可能更高。在中間物Cu負載之情況下，反應可進行至完成且反應產物可藉由HPLC以86%產率分離。

已展示併入基於磷酸二酯之電荷標籤修飾之核苷酸。併入可藉由不同聚合酶，諸如phi29（及其變體）及克列諾片段或用於合成定序過程中之其他聚合酶進行。兩個聚合酶均可成功地併入電荷標籤。關於此實施例，藉由phi29併入展示於圖13中。在此實施例中，將單股DNA模板聚核苷酸序列在溶液中與含有與此類模板序列之一部分互補之100 nM 5'-Cy5-標記DNA引子（16聚體）的緩衝溶液（50 mM Tris pH 7.5，5 mM MnCl₂ ，4 mM DTT）、用於單核苷酸併入至基於模板之引子中之1 μM phi29及10 μM給定核苷酸一起培育。在30攝氏度下培育各種持續時間以允許併入加電荷標籤的胸苷之5'併入（與模板股上之腺苷殘基互補，緊接著與引子之部分5'互補）後，淬滅聚合酶反應物，在凝膠上去雜合及分離引子以用於偵測單核苷酸併入。去氧核苷-胸苷5'-六磷酸（dT6P）之間的鍵聯包括T5、T10及T15，具有指定的胸苷核苷酸重複序列作為電荷標籤；T5、T10及T15經由點擊化學接附，而T5-Tet經由四

-TCO接合接附。C3間隔子（C3）及dSpacer（d）寡核苷酸亦用作經由TCO-四

接合接附之帶電標籤。TMR為經四甲基羅丹明標記之dT6P，其具有下式：

且dTTP為無電荷或標記物之去氧-胸苷三磷酸以充當對照。

參考圖13、1310、1320及1330，各自個別地表示分別為dTTP、T10或T5之併入%（其曲線圖彼此重疊且因此在圖13中幾乎不可彼此區分），1340表示藉由T15併入，1350表示藉由T5-Tet併入，且1360、1370及1380各自個別地表示分別為TMR、d及C3之併入%（其曲線圖彼此重疊且因此在圖13中幾乎不可彼此區分）。所有實施例之併入在5秒內超過80%。

用於合成根據本發明之具有肽電荷標籤之核苷酸類似物之合成流程的非限制性實施例顯示如下：

（揭示為SEQ ID NO:10之「KKKKKC」）

在另一實施例中，類似流程用於合成具有帶負電胺基酸之電荷標籤，而非如上所說明之帶正電離胺酸殘基，諸如：

關於此流程之許多變化在保持本發明之教示內容內係可能的。舉例而言，可採用除離胺酸以外之胺基酸，包括上文所描述之帶電或不帶電胺基酸中之任一者，且其數目可大於或小於此實施例中所示之肽電荷標籤長度。因此可採用具有不同價數及量值之電荷的肽電荷標籤。

此外，不同反應性基團可添加至核苷酸類似物之5'端，且具有不同類型及長度之連接子部分，諸如用於其他非限制性實施例：

此等添加可得到具有各種反應性基團之核苷酸類似物，該等反應性基團包括疊氮或甲基四

反應性基團，其由各種類型及長度之連接子隨附，作為非限制性實施例包括：

在又其他實施例中，類似地添加炔烴、TCO或DBCO基團或硫醇基。可隨後將對應反應性基團添加至肽電荷標籤中以使得兩者可藉由以上揭示之點擊或接合化學反應或熟習此項技術者已知之其他反應接合。基於肽之電荷標籤可使用茀基甲氧羰基（Fmoc）及第三丁氧基羰基（Boc）保護基化學方法合成用於固相肽合成。正交「處理」反應性基團可在肽合成中在末端引入以允許與核苷酸或核酸結合。正交化學方法包括氮雜-炔銅輔助點擊反應、具有DBCO及疊氮的無銅點擊化學方法以及TCO-四

接合。胺基酸之反應性側鏈，諸如半胱胺酸硫醇亦可用於硫醇-順丁烯二醯亞胺化學反應中。

含有具有不同pKas之側鏈之胺基酸之可用性亦允許在不同pH下帶電之肽電荷標籤。舉例而言，組胺酸之pKa為6.04，而離胺酸具有pKa為10.54之側鏈。因此，在中性pH下，僅離胺酸為可帶電的。此亦允許藉由修改緩衝環境之pH來進一步調節電荷數目及電荷密度。

另外，肽電荷標籤可容易地隨附至肽核酸（PNA）寡聚物，因為用相同固相肽化學合成肽及PNA兩者。此可用於進一步修飾肽電荷標籤之特性或添加電荷標籤與連接子（諸如基於核酸之連接子）之相關特性。

用於合成樹突電荷標籤之化合物及每個末端組成重複單元之相應電荷之實例包括以下者：

在此等實施例中，不同反應性基團展示於樹突之自由價端處，以及個別組成重複單元之分支點與游離末端之間的不同電位莖長度，但此等僅為非限制性實例。

以下流程提供可能的樹突電荷標籤結構之說明性實施例：

所示為例如具有醯胺鍵及（A）末端羧酸或（B）胺基之樹突；具有聚(丙烯亞胺)（PPI）鍵聯及（C）末端羧酸或（D）胺基之樹突；及具有酯鍵及（E）末端羧酸或（F）胺基之樹突。

通常，樹突電荷標籤可根據發散或會聚合成方法根據以下代表性流程合成：

在發散合成（A）中，樹突藉由來自核心之一系列向外延伸之反應，通常藉由重複麥克爾加成（Michael addition）組合。在會聚合成（B）中，樹突藉由來自周邊之一系列內置建構反應建構且最終接附至核心。

根據本發明之此類發散合成流程之一些實例如下：

在此等實施例中，甲基丙烯酸脂基團藉由邁克爾加成添加至炔烴莖，隨後乙醯基脫除保護基以形成羧酸基，或添加乙二胺以形成胺基。麥克爾加成之重複週期使得連續產生樹突，其中末端官能基之數目為先前產生兩倍。可添加其他產生物，且不同反應性基團可用於莖/自由價端處。在一些實施例中，可根據前述合成流程反覆地添加其他產生物或更多其他產生物以增加由標籤攜載之電荷。電荷之價數（正或負）可藉由在末端基團處併入帶正電或帶負電胺基酸而變化。實施例展示於圖21A及21B中。在兩個非限制性實施例中，展示以半胱胺酸殘基封端之電荷標籤，其可連接至如本文中所揭示之用於充電核苷酸之連接子部分，但亦預期諸如本文中所揭示之其他化學反應作為實例。在圖21A中，對於在2、3或4個分支之後的末端基團之帶正電離胺酸殘基，產生不同末端電荷量值。替代地，如圖21B中所示，帶負電胺基酸（諸如麩胺酸）可在各種分支產生之後形成末端基團，同樣產生不同量值之末端電荷。

在另一實施例中，可甲基化（例如三甲基化）電荷標籤中之一或多個離胺酸殘基。不同於未甲基化離胺酸，三甲基化離胺酸之電荷不為pH依賴性的。

具有在自由價端之DBCO之另一實施例如下：

用於樹突電荷標籤及其合成之基於醯胺及PPI樹突設計之一些實例包括以下者：

包括於實施例C-1及C-2中之四級銨基團的一些優點為其可能不受pH影響，可能不與金屬配位，且在合成及處理期間可能不太可能附著至聚(乙烯基膦酸) （PVPA）。

在另一實施例中，可使用組成重複序列直至具有三個分支度。在另一實施例中，可使用會聚合成而非發散合成。與具有僅具有兩個分支度之單元的樹突相比，使用具有三個分支度之單元的益處在於可每產生物添加更多電荷，從而產生獲得給定較佳電荷所需之較少產生物。實施例如下：

在此實施例中，組成重複單元用第三丁氧基羰基（Boc）基團官能化。結果，

可添加DBCO基團，且在去除乙醯基之保護基時形成羧酸基。在此情況下，所得化合物具有-3電荷。在後續反應中，在第二代樹突中添加上文化合物A，得到-9之電荷，如下：

根據以下實施例，藉由反覆地組合前一步驟，可組合三個二次樹突，以經由會聚合成產生具有為-27之電荷的第三代樹突：

攜帶帶負電羧酸基團之樹突如下轉化成攜帶帶正電胺基之樹突：

在另一實施例中，根據以下流程將羧酸基轉化成胺基：

對於具有+9電荷之第二代，可使用以下流程：

且，第三代樹突可藉由會聚合成流程合成，以產生具有+27電荷之樹突，如下：

視根據本發明合成之樹突合成之自由價端處之反應性基團而定，其可包括但不限於上文所描述之實施例中之任一者，可將對應配對反應性基團隨附至核苷酸類似物以允許電荷標籤樹突接合至核苷酸類似物。根據前述內容，廣泛範圍之電荷可包括於核苷酸類似物中，包括-32、-27、-16、-9、-8、-4、-3、-2、+2、+3、+4、+8、+9、+16、+27及+32。亦可使用除前述非限制性實施例合成流程中所說明之彼等官能基之外的帶電官能基。

在一些實施例中，此類分支結構可用於將多種基於磷酸二酯之電荷添加至電荷標籤。舉例而言，諸如根據如此處所展示之樹突結構之分支結構可包括核苷酸或聚核苷酸作為末端基團，而非如本文所揭示之聚核苷酸或其他含磷酸二酯電荷之單個直鏈股。藉由根據如本文所揭示之樹突結構使連續產生物中之此類含磷酸二酯標籤之分支鹼化，可將多個聚核苷酸或其他基於磷酸二酯之電荷組合為單一電荷標籤。舉例而言，諸如圖19A及B中所展示之基於樹枝之結構。圖19A展示將三個聚T序列組合成單一標籤之標籤的實施例，該標籤可根據如本文所揭示之方法併入式I化合物中。在此實施例中，標籤攜帶-30之電荷。圖19B說明組合含磷酸二酯標籤以得到既定電荷之若干方式（在此實施例中，-30）：30個磷酸二酯電荷之線性序列、10個三個磷酸二酯序列終止的三次拉-分支結構，或五個二次分支三倍且終止於6個磷酸二酯序列之結構。相較於可遠離導電通道延伸之單個延伸序列，諸如在最後一個實施例中，相比於第一實施例，增大之分支的優點可為更高密度之電荷，其具有接近彼此之更高濃度之較短帶電序列。

在其他實施例中，基於胺基酸之分支叉形結構可包括於電荷標籤中。此類叉及分支之基於胺基酸之電荷標籤結構之合成流程的實施例描繪於圖22中。根據圖22之上圖，固相肽合成可在例如線性多肽鏈中共同用於胺基酸序列。藉由對游離胺基進行反覆保護，隨後移除其且添加活化胺基酸，可合成線性鏈多肽。帶電胺基酸之線性股（正或負）可由此產生為用於接附至核苷酸之電荷標籤或電荷標籤之一部分。在圖24A中描繪非限制性實施例，其展示16個帶負電麩胺酸殘基之股（SEQ ID NO:12）。其他實施例可包括其他帶電胺基酸且呈不同數目。

如在之圖22之底部面板中進一步所描繪，可使用會聚固相蛋白質合成方法，其中可在合成步驟期間添加獨立形成之多肽鏈之長度作為聚合物集合。在一些實施例中，圖22中未描繪，胺基酸或多肽可獨立地以分支形式添加至叉中，其中叉為含有兩個胺基之結構，而非自如圖22中所描繪之單個胺基線性地串接。舉例而言，如圖23A中之左結構中所示，具有兩個胺基之離胺酸胺基酸可充當與線性多肽之兩個分支可接附之分叉連接點，根據圖22中描繪之固相蛋白合成流程，一個連接至各胺基。

藉由添加兩股胺基酸，每個根據例如固相蛋白質合成流程根據圖22上圖合成，對於離胺酸殘基之兩個胺基，可合成包括具有兩個分支之叉的電荷標籤，其中各分支為多肽。分支可視構成其之胺基酸之電荷而帶正電或帶負電。圖23中描繪兩個非限制性實施例。在左側，戊離胺酸分支接附至離胺酸叉以形成帶正電電荷標籤，而在右側，兩個戊麩胺酸分支接附至離胺酸叉以形成帶負電電荷標籤。其他類似實施例可具有較長或較短分支，其中任何位置為1至20個胺基酸或更多胺基酸。在一個實施例中，各分支可具有不同於另一個分支中胺基酸之數目的一定數目之胺基酸。各分支中之胺基酸之物種亦可不同、在支鏈之間及/或在分支內。

在另外其他實施例中，多個叉可接附至中心叉以產生具有兩個以上分支之樹。舉例而言，兩個離胺酸可接附至單一離胺酸叉之彼胺基，產生具有四個可用胺基之中心結構以便後續添加帶電胺基酸。實施例描繪於圖23中所示之中心分子中。此處，離胺酸已藉由固相蛋白質合成添加至中心離胺酸之各胺基中，產生四個用於子序列添加帶電胺基酸或肽之反應性胺基。可隨後將包括帶電胺基酸股之多肽添加至此分子之胺基中之每一者中。圖24B中描繪非限制性實施例。在此實施例中，四麩胺酸股已添加至四分支分叉離胺酸結構之四個可用胺基中之每一者中，諸如圖23B之中心圖中所描繪。在其他實施例中，其他帶電胺基酸可以一或多個分支形式添加。分支亦可各自具有與圖24B中所描繪之實施例不同數目之胺基酸及/或可具有彼此不同數目之胺基酸。實施例包括各自獨立地具有1至20或更多個胺基酸之任何位置的一些或所有分支。分支中之胺基酸之物種亦可不同於分支內之其他胺基酸及/或不同於其他分支中發現之胺基酸。

繼續此會聚合成流程，兩個四分支離胺酸叉可接附至中心離胺酸叉之胺基以形成如圖23A右側組中所描繪之8-分支結構。如在先前實施例中，帶電胺基酸之股鏈可添加至8個游離胺基中之每一者以形成電荷標籤，再次具有彼此相同或不同的長度（每個分別具有1至20個或更多個胺基酸）之分支，及分支之間或在各分支中之相同帶電胺基酸，或在一或多個分支中之相同帶電胺基酸之物種。在再一實施例中，兩個8-分支叉可添加至離胺酸基團之兩個胺基中以形成16-分支結構。在圖24C中描繪非限制性實施例。在此實施例中，麩胺酸鹽殘基已添加至結構上之16個胺基中之每一者中。在其他實施例中，多肽可添加至胺基酸基團中之一些或更多中，再次在分支內及/或在分支之間具有彼此相同或不同的長度（每個分支獨立地具有1至20個或更多個胺基酸）或每個分支相同的胺基酸數目及相同或不同的帶電胺基酸物種。

應注意，圖24A-24C中所描繪之電荷標籤的非限制性實例各自具有相同淨電荷，其具有16個陰性胺基酸部分（在此實施例中為麩胺酸鹽）。然而，電荷標籤之結構不同，使得藉由三個實施例中之每一者以不同方式攜載由電荷標籤所承載之電荷載流子之密度及分佈。亦可在具有包括如本文中所揭示之帶電胺基酸之分支的分叉電荷標籤中採用所有先前提及之組合，提供彼此不同之電荷標籤之許多實例，不同之處在於其包括之電荷之價數（正或負），而且在於電荷之值及電荷標籤內之電荷之分佈或密度。

在另一實施例中，可藉由電荷標籤之基於精胺之成分組分提供電荷。舉例而言，可將基於精胺之寡聚陽離子電荷添加至核苷酸且提供正電荷作為根據本發明之電荷標籤。寡聚精胺共軛物在pH 7下具有約2.5質子化胺。此加電荷標籤的核苷酸之實施例展示於圖25A及25B中。圖25A展示根據本發明之一態樣之寡聚精胺共軛物之實施例，且圖25B展示具有精胺衍生之末端基團的樹突結構化標籤，用於放大可位於電荷標籤之末端處之電荷量。在兩個實施例中，本文中所揭示之用於將電荷標籤接附至核苷酸之化學物質可由熟習此項技術者調適，以根據本發明之態樣用於將此類精胺衍生電荷標籤接附至核苷酸。

以下非限制性實施例顯示用各種連接子修飾5'胺基核苷酸六磷酸，以允許與樹突電荷標籤之正交接附化學作用。5'-胺去氧-胸腺嘧啶六磷酸（dT6P）（或其他NPP）（1）可用疊氮基-丁酸N-羥基丁二醯亞胺（NHS）酯（2a）或甲基四

NHS酯（2b）官能化分別形成疊氮基dT6P（3a）或甲基四

dT6P（3b）（流程6）。

流程6. 5'-胺dT6P之官能化。

疊氮基dT6P（3a）可經由銅（I）輔助之疊氮-炔烴環加成（CuAAC）在CuSO₄ 、參-羥丙基***基甲胺（THPTA）配位體及抗壞血酸鈉存在下與5'-己炔基共軛之聚T寡核苷酸（4）之線性股，以形成寡核苷酸共軛物（5a）。在C18逆相HPLC上進行純化且用50 mM TEAA（pH 7.5）及乙腈溶析。接著可將甲基四

dT6P（3b）與在50 mM磷酸鹽緩衝液（pH 7.4）中具有反式環辛烯（TCO）基團之樹突共軛，以形成具有樹突電荷標籤之核苷酸類似物。

或者，疊氮dT6P（3a）經由無銅張力促進疊氮-炔烴環加成（SPAAC）在50 mM磷酸鹽緩衝液（pH 7.4）中與具有二苯并環辛基（DBCO）基團之樹突電荷標籤共軛，以形成具有樹突電荷標籤之核苷酸類似物。

在以下流程中，可進行疊氮-炔烴點擊反應以將聚磷酸核苷酸連接至電荷標籤，諸如在其自由價端具有炔基之樹突電荷標籤：

可使用不同NHS部分添加疊氮基或甲基四

反應性基團且具有各種連接子長度。非限制性實施例包括：

、

及

。

各種NPP可用不同反應性基團形成以用於點擊或接合化學反應以使其與電荷標籤共價連接。一些非限制性實施例包括：

其可與含炔烴電荷標籤，諸如與在其自由價端具有炔基之樹突電荷標籤反應。

或者，含有NPP之甲基四

，諸如

可與含TCO之電荷標籤，諸如在其自由價端具有TCO基團之樹突電荷標籤反應。

在其他實施例中，可使用NPP與樹突電荷標籤之間的DBCO-疊氮點擊化學。在其他實施例中，核苷酸或樹突電荷標籤上之順丁烯二醯亞胺基可分別與電荷標籤或核苷酸上之硫醇基反應，以經由順丁烯二醯亞胺基硫醇反應連接兩者：

含有順丁烯二醯亞胺基團之NPP或電荷標籤

在存在諸如(參(2-羧基乙基)膦)之還原劑的情況下，分別與含有含硫醇基之電荷標籤或NPP反應，產生兩者之間的共價鍵合，例如

。

圖15A-C、16A、16B、17及18展示可引起高電荷密度之具有三維構形之電荷標籤之一些非限制性說明性實例。圖15A-C展示具有寡核苷酸電荷標籤之核苷酸類似物之三個實例。舉例而言，寡核苷酸變化標籤可含有5、10、15、20、25、30、35、40個或更多個寡核苷酸。亦展示導電通道（在此情況下為奈米線）及對導電通道之官能化接附（特定言之，接受區域）。接受區域如所指示。寡核苷酸電荷標籤展示為自經修飾之核苷酸之5'端延伸之虛線。所示為三個不同構形，可採用電荷標籤。舉例而言，圖15A說明可辨識的莖及環結構。在此結構中，沿著莖部分鹼基對彼此之核苷酸，在其間留下環部分，在此實施例中說明為遠離受體區域定向。由此，寡核苷酸電荷標籤之核苷酸之間的磷酸二酯鍵之負電荷可維持彼此緊密接近，從而維持比在採用線性、伸展構形之情況下可獲得之電荷密度更高的電荷密度。

舉例而言，圖15B展示另一實施例，其不具有莖及環結構而具有電荷標籤之隆突區。在此情況下，如同圖15A，該電荷標籤包括特異性區域，展示為與受體區域結合。此處，特異性區域包括在以線性方式拉伸寡核苷酸之情況下在空間上彼此不同的寡核苷酸區段。但是，當藉由靜電吸引誘導與受體區域結合時，特異性區域之部分更近地拉伸在一起。此構形在兩種情況下符合採用莖及環構形（圖15A）或隆突構形（圖15B），使得該電荷標籤之電荷密度提高。

圖15C及20A-E展示帶有磷酸二酯標籤，其包括採用各種三維組態之聚核苷酸，諸如莖及環（例如，20A、20B）或苜蓿葉樣（例如，15C、20C、20D或20E）形狀。結構化寡核苷酸電荷標籤可藉由導電通道偵測（參見圖26中描繪之設備作為用於電荷標籤之導電通道偵測之結構，如下文所描述）。此等電荷標籤之序列如下：表3：實施例磷酸二酯電荷標籤

圖	SEQ ID NO.	序列	鹼基之編號
15C	1	CAGCGGAGCGGTATTTTTACCGCCAACGCTGTTTTCAGCGTAGCACCGTTTTCGGTGCGC	60
20A	2	CGAGACATCGTCGTGTCTCG	20
20B	3	CGAGACATCGTGCATATCGTACGATATGCACGATGTCTCG	40
20C	4	CGCCCGGGGATGAGTATCCCCGCGCTGAGTAGCGCGGGCG	40
20D	5	CGCCCGGGGATGAGTATCCCCGCGCATGAGTATGCGCT TGCTATGAGTATAGCAAGGGCG	60
20E	6	CGCCCTTGGGGATGAGTATCCCCAGCGCATGAGTATGCGCTTGCTATGAGTATAGCAAGTGCATGAGTATGCACAGGGCG	80

類似於莖及環構形，自中心軸延伸之莖可藉由核苷酸之股形成，該等核苷酸藉由華生-克里克對鍵結規則彼此吸引，藉由其間之環固持在一起。自中心軸輻射之莖可連接朝向中心軸或圍繞中心軸定向之寡核苷酸股。如同其他實施例，電荷標籤中之核苷酸之鹼基之成對鍵結誘發標籤採用使核苷酸之間的磷酸二酯鍵之負電荷聚集在一起，相比於若寡核苷酸以線性方式拉伸，則密度可為何，產生電荷密度之提高的構形。

寡核苷酸電荷標籤之其他三維構形為可能的。核苷酸之間的磷酸二酯鍵之負電荷可經誘導以由於華生-克里克鹼基配對而以高電荷密度一起出現。可採用各種三維形狀，使用例如DNA摺疊方法，在管狀、環狀、長方體、螺旋、凝聚螺旋、球形或球狀體或產生較高電荷密度之其他構形中產生寡核苷酸電荷標籤。

圖16顯示兩個電荷標籤之實施例，一個包括寡核苷酸序列（16A，在左側）且另一個包括除肽核酸序列及多肽以外的此類序列（16B，在右側）。未展示此等電荷標籤與核苷酸類似物之間的連接，但此類連接可藉由化學連接技術進行，諸如本文所揭示或以其他方式已知之技術。左側上之16A之構形為十字形形狀。四個寡核苷酸序列以類似於霍利迪結構之構形結合在一起（如可在DNA重組事件期間發生）。如16A中所示，四個聚核苷酸之部分根據華生-克里克鹼基配對彼此鍵結。各寡核苷酸亦自配對鍵結之中心部分延伸至單股突出物。配對鍵結保持彼此接近之寡核苷酸內磷酸二酯鍵之負電荷，從而提高電荷密度。

在右側，在16B中，將肽核酸及多肽序列添加至14A中所示之電荷標籤中，產生電荷標籤之另一非限制性實施例。在此實施例中，肽核酸之四個序列各自在其末端連接多肽序列。多肽序列由於多肽內之一些胺基酸之間的靜電引力而形成螺旋結構。然而，在此等實施例中，多肽具有淨正電荷（儘管在其中包括一些帶負電胺基酸，其幫助採用螺旋構形）。連接多肽對之肽核酸序列之部分亦與自鹼基配對的核心延伸之聚核苷酸之單股部分雜合。帶正電多肽之肽核酸與收緊螺旋構形之間的強鍵允許電荷標籤之淨正電荷且具有高電荷密度。採用類似架構之電荷標籤之其他實例可具有淨負電荷。

圖17展示多肽電荷標籤之一些實例，其中多肽採用產生較高電荷密度之不同三維架構。多肽之捲曲部分可藉由連接序列連接。當連接序列相當短時，捲曲結構可能夠在大致整體線性陣列中彼此結合。此類構形為可能的，因為多肽內帶正電與帶負電胺基酸之間的靜電引力。然而，總體而言，多肽電荷標籤可具有淨正電荷或淨負電荷。然而，在電荷標籤之多肽之捲曲部分之間較長的連接子之情況下，減少的硬脂酸阻礙允許在相鄰捲曲部分之間較大彎曲，允許採用更複雜的架構，諸如圖17之底部中所示。此等可能性可產生甚至更高電荷密度。如同圖16A及16B中所展示之實施例一樣，此等實施例電荷標籤可接附至核苷酸類似物（未展示）。

圖18A-18B展示採用捲曲螺旋架構之多肽電荷標籤之實施例之兩個視圖（分別為側視圖及縱向視圖），其中螺旋內之胺基酸之間及不同螺旋之胺基酸之間的靜電引力可誘導多肽形成縮合結構。結果可為捲曲螺旋可具有淨負電荷或淨負電荷，且淨電荷以高電荷密度結合在一起（相比於若多肽序列以線性方式拉伸，則電荷密度可為何）。

對於本文中所描述之每一實施例，藉由經描述用於將電荷標籤之實施例接附至核苷酸之實施例的一種類型之點擊化學或接合化學，各此類類型之點擊化學或接合化學亦可用於將電荷標籤之任何所描述實施例接附至核苷酸之任何所描述實施例。換言之，點擊化學或接合化學適用於無關於與其所接附之電荷標籤類型或核苷酸類型。

相較於以線性方式拉伸之線性電荷標籤，包括寡核苷酸、多肽或兩者具有或不具有肽核酸之電荷標籤可因此採用具有較高電荷密度之不同三維架構。電荷標籤可具有淨負電荷，諸如在其含有相對於正電荷之過量磷酸二酯或負胺基酸時，或具有淨正電荷，諸如在其具有比帶負電荷基多的帶正電荷胺基酸時。捲曲螺旋可基於胺基酸組分之間的充分表徵之分子相互作用計算上經設計以採用特異性緊湊結構。可使用之捲曲螺旋之實施例包括白胺酸拉鏈，其可呈（例如）具有受控長度及直徑之二聚或三聚形式。此外，因為控管捲曲螺旋緊密結構之相互作用定位於內部，所以表面可獨立地經工程改造以攜載廣泛範圍之電荷。

如本文中所揭示之電荷標籤可具有自介於-200e 與+200e 之間、或介於-100e 與+100e 之間、或介於-40e 與+40e 之間、或介於-20e 與+20e 之間、-40與+40之間，或其中之任何範圍的電荷。在一些實施例中，電荷標籤之淨電荷或部分淨電荷可封裝於約-200e 至+200e /立方奈米、或約-100e 至+100e /立方奈米、或約-40e 至+40e /立方奈米、或約-20e 至+20e /立方奈米或其中之任何範圍的密度中。

在一實施例中，測試設備用於藉由導電通道偵測電荷標籤。圖26中描繪此設備之示意圖。展示在接近矽奈米線（NW）場效電晶體時能夠偵測電荷的矽奈米線（NW）場效電晶體。視需要，如圖26中所描繪，表面改質劑可接附至NW，諸如可在流量槽中採用以用於SBS或其他相關方法。舉例而言，表面改質劑可為聚(N-(5-疊氮基乙醯胺基戊基)丙烯醯胺-共-丙烯醯胺)，亦稱為PAZAM，或另一相關表面改質劑聚合物。在此實施例中，寡核苷酸接枝至表面改質劑。向圍繞接枝寡核苷酸及NW之溶液中添加與嫁接劑寡核苷酸互補之另一寡核苷酸。根據標準華生-克里克鹼基配對規則測定接枝寡核苷酸及溶液中寡核苷酸之序列以便彼此結合。溶液中之寡核苷酸亦接附有電荷標籤。在圖26中描繪之實施例中，該電荷標籤為基於磷酸二酯之標籤。然而，本文中所揭示之電荷標籤之實例中之任一者可替代地用於此系統中。溶液內核苷酸與接枝核苷酸之結合使電荷標籤接近於NW，使得NW可偵測電荷標籤中之電荷之存在及量值。在一些對照條件（非互補（non-comp），相較於使用互補的溶液中寡核苷酸時之互補）中，使用與具有電荷標籤之接枝核苷酸不互補之溶液中寡核苷酸。本文中揭示使用用於測試導電通道之能力以偵測不同電荷標籤之此類設備及系統的實例。

使用如下圖26中所描繪之設備來進行對偵測電荷標籤之能力的導電通道之測試。對於基線，在1 mL 10 mM pH 5磷酸鹽緩衝液中流經NW，以電氣方式量測5分鐘。此後在空白PBS中沖洗兩次，且在10 mM磷酸鹽緩衝液（pH 5）中再進行5 min基線量測。接著藉由在1 mL 500 nM互補或非互補寡核苷酸之2×PBS中培育5分鐘，接著用1 mL 2×PBS沖洗，接著在1 mL 10 mM pH 5磷酸鹽緩衝液中沖洗來進行溶液中寡核苷酸中具有加電荷標籤的雜合。接著在10 mM pH 5磷酸鹽緩衝液中再進行5 min量測持續5 min。隨後用1 mL 100%甲醯胺溶析溶液中寡核苷酸且培育15分鐘，隨後在10 mM磷酸鹽緩衝液（pH 5）中沖洗1 mL 10 mM pH 5磷酸鹽緩衝液，隨後另外進行5 min基線量測值。隨後用含有貼附至溶液中寡核苷酸之不同電荷標籤的下一樣品重複該過程。

一些實施例之結果描繪於圖27中。藉由在與攜帶以下電荷標籤之溶液中寡核苷酸一起培育後之各NW傳導，如在多個奈米線上所偵測量測電流且標準化至電壓（mV）：C20（具有以下序列（SEQ ID NO:7）之磷酸二酯電荷標籤：GAACAATTCCAGCCTTGATATCAACACTATTGATA）、16個麩胺酸胺基酸（SEQ ID NO:12）之線性序列（「線性E16」）、具有如圖24B中所描繪之結構之16個麩胺酸胺基酸之分支電荷標籤（「分支E16」）、具有如圖24C中所描繪之結構之16個麩胺酸胺基酸之「樹突狀」電荷標籤（「樹突狀E16」）、五個三甲基化離胺酸殘基（SEQ ID NO:13）及同樣C20（「K5-Me3」）（以彼次序）之線性標籤。可以看出，導電通道能夠偵測具有在10-14 mV之間之反應的電荷。在非互補條件中未偵測到電流。

在另一實施例中，取得類似量測結果，但在此情況下用50 mM磷酸鹽緩衝劑（pH 5）。結果展示於圖28中。在此緩衝液中，由不同電荷標籤偵測到之mV之間的差異係明顯的（甚至在彼此具有相同總電荷量之電荷標籤之間），從而證實區分不同電荷標籤之能力。

電荷標籤之德拜長度可計算為緩衝溶液之函數，其中其由導電通道感測。離子溶液中之德拜長度（κ ⁻¹ ）可根據以下等式計算：

（等式1）其中T =約298K；k_B = 1.28e-23 J/K；e = 1.6e-19C；ε₀ = 8.85e-12 F/m；ε_r 對於水約78；N_A = 6.022e23；I =離子強度= Σc_i z_i ² 其中c為離子之濃度且z為電荷數目（視溶液而定）。在一實施例中，在Tris緩衝液（pH 7）中測試電荷標籤C20之不同德拜長度，其中c及z及德拜長度之值如下：表4

緩衝液	c1 （M）	z1	c2 （M）	z2	c3 （M）	z3	c4 （M）	z4	κ ⁻¹ nm
10 mM Tris7	1.00E-05	1	1.00E-05	1	1.00E-06	1	1.00E-06	1	2.71
5 mM Tris7	5.00E-06	1	5.00E-06	1	5.00E-07	1	5.00E-07	1	3.83
2 mM Tris 7	2.00E-06	1	2.00E-06	1	2.00E-07	1	2.00E-07	1	6.1
1 mM Tris 7	1.00E-06	1	1.00E-06	1	1.00E-07	1	1.00E-07	1	8.57

結果展示於圖29A中。

在另一實施例中，在具有或不具有KCl之檸檬酸鹽緩衝液中測試電荷標籤C20之不同德拜長度，其中c及z及德拜長度之值如下：表5

	c1 （M）	z1	c2 （M）	z2	c3 （M）	z3	c4 （M）	z4	κ ⁻¹ nm
10 mM檸檬酸鹽緩衝液	1.00E-05	2	2.00E-05	1					2.01
1 mM檸檬酸鹽緩衝液	1.00E-06	2	2.00E-06	1					6.35
5 mM檸檬酸鹽緩衝液	5.00E-06	2	1.00E-05	1					2.84
50 mM檸檬酸鹽緩衝液	5.00E-05	2	1.00E-04	1					0.90
10 mM檸檬酸鹽緩衝液+5 mM KCl	1.00E-05	2	2.00E-05	1	5.00E-06	1	5.00E-06	1	1.80
10 mM檸檬酸鹽緩衝液+10 mM KCl	1.00E-05	2	2.00E-05	1	1.00E-05	1	1.00E-05	1	1.64
10 mM檸檬酸鹽緩衝液+ 15 mM KCl	1.00E-05	2	2.00E-05	1	1.50E-05	1	1.50E-05	1	1.52
10 mM檸檬酸鹽緩衝液+50 mM KCl	1.00E-05	2	2.00E-05	1	5.00E-05	1	5.00E-05	1	1.07

結果展示於圖29B中。

因此，給定電荷標籤之德拜長度可藉由修改溶液之態樣來修改，其中電荷標籤係由導電通道偵測，使得電荷標籤與導電通道之接近足以准許在各種條件下偵測電荷標籤。在圖29A及29B中所描繪之實施例中，針對既定電荷標籤測試之德拜長度為0.9至8.57 nm，以使得可確定電荷標籤之接近度。在一實施例中，當電荷標籤在來自導電通道之德拜長度內時，出於准許導電通道對電荷標籤之電荷偵測的目的且以准許導電通道對電荷標籤之電荷偵測，電荷標籤可接近導電通道。

量測帶有電荷標籤之核苷酸之併入的非限制性實施例展示於圖2中。使用Phi29聚合酶將單獨5s、1m或10m的磷酸二酯加電荷標籤的胸苷核苷酸（TetTCO-dT6P）或隨後接著加螢光標籤之疊氮基甲基3'封端之腺苷核苷酸（ffA-AZM）併入至雜合至溶液中模板寡核苷酸之聚核苷酸中。在併入之後，將聚核苷酸自模板去雜合且藉由凝膠電泳分離且量測ffA-AZM之併入。如圖2中所示，與加電荷標籤的核苷酸一起培育，隨後與ffA-AZM一起培育，促成併入至聚核苷酸中之ffA-AZM之偵測，作為用於量測加電荷標籤的核苷酸之併入的替代方式。在無核苷酸（無nuc）存在下或當僅存在一者或另一者時（單獨TetTCO-dT6P，左側，單獨ffA-AZM，右側），未偵測到ffA-AZM併入。在其他實施例中，加螢光標籤之核苷酸之併入可藉由各種其他技術來偵測及量測，該等技術包括在聚核苷酸與模板去雜合之後的表面上螢光或溶液內螢光量測。

在其他實施例中，將加電荷標籤的核苷酸併入至與表面接附模板互補之聚核苷酸中，隨後併入加螢光標籤之核苷酸（未圖示）。在一個實施例中，使用一種聚合酶來併入加電荷標籤的核苷酸且使用不同聚合酶來併入加螢光標籤之核苷酸。舉例而言，將與第一加電荷標籤的T核苷酸及雜合至表面接附模板之聚核苷酸一起培育之克列諾片段用於併入加電荷標籤的核苷酸。在洗滌以移除聚合酶、過量核苷酸等之後，在Phi29中第二次培育且加螢光標籤之A核苷酸用於添加鄰接於首次併入之加電荷標籤的核苷酸的螢光核苷酸。設計模板及聚核苷酸序列，使得模板需要在聚合酶存在下將第一T隨後A添加至聚核苷酸之3'末端。隨後使延伸之聚核苷酸去雜合，隨後在電泳上操作以偵測核苷酸之併入。A之Phi29催化併入A表明克列諾片段亦併入有T（因為除非T首先添加至聚核苷酸之3'末端，否則Phi29不可能併有A）。在其他實施例中，Phi29用於併入T及A兩者，其中洗滌步驟在兩者之間，且確實如此。在另一實施例中，Phi29用於單個聚合酶反應，其中存在有加電荷標籤的T及螢光A，且同樣Phi 29能夠併入螢光A，指示其亦已併入加電荷標籤的T，指示Phi29可併入加電荷標籤及螢光核苷酸兩者。

在本文中所揭示之技術的一些實例中，一或多個電腦可讀儲存裝置或記憶體儲存電腦可讀指令，該等指令在由電腦執行時使得電腦執行本文中所揭示之方法中之至少任一者。本文中之「電腦」可指任何處理器或含處理器之裝置。在一些實例中，系統經組態以執行本文中所揭示之方法中任一者的至少一部分。在一些實例中，系統耦接至儲存電腦可讀指令之電腦可讀儲存裝置或記憶體，該等指令在執行時使得系統執行本文所揭示之方法中的至少任一者。

包括但不限於以下各者之在本申請案中所引用之所有文獻及類似材料以全文引用的方式明確地併入：專利、專利申請案、文章、書籍、論文及網頁，不管此等文獻及類似材料的格式。在所併入文獻及類似材料中之一或多者（包括但不限於定義之術語、術語用法、所描述之技術等）與本申請案不同或抵觸的情況下，以本申請案為準。

應瞭解，前述概念及下文更詳細地論述之額外概念的所有組合（限制條件為此等概念並不彼此不相容）經涵蓋作為本文中所揭示之發明主題的部分。詳言之，在本發明結尾處出現之所主張主題的全部組合預期為本文所揭示發明性主題的部分。亦應瞭解，本文明確採用之術語亦可出現在以引用的方式併入之任何揭示內容中，應符合與本文所揭示之特定概念最一致的含義。

貫穿說明書對「一個實例」、「另一實例」、「實例」等等之參考意謂，結合實例描述之特定元素（例如，特點、結構及/或特徵）包括於本文中所描述之至少一個實例中，且可能或可能不存在於其他實例中。此外應理解，除非上下文另外明確規定，否則關於任何實例所述之要素可在各種實例中以任何適合方式組合。

雖然已詳細描述了若干實例，但應理解，可修改所揭示實例。因此，前述描述應被視為非限制性的。儘管已在本文中詳細地描繪及描述一些實例，但所屬技術領域中具有通常知識者將顯而易見，可在不脫離本發明之精神的情況下進行各種修改、添加、取代及其類似者且因此此等被視為在如以下申請專利範圍中所界定之本發明的範圍內。

無

當參考隨附圖式閱讀以下詳細說明時，將更佳理解本發明之此等及其他特徵、態樣及優勢，其中：

[圖1]展示用於進行根據本發明之態樣的方法之流程圖。

[圖2]展示根據本發明之態樣將核苷酸併入至聚核苷酸中之實例。

[圖3]展示在一實例中，經由繫鏈將聚合酶接附至導電通道。

[圖4]展示在一實例中，經由核酸繫鏈將聚合酶接附至導電通道且結合至可基於電荷區分或接近電荷偵測器之核苷酸。

[圖5]展示在一個實例中，經由核酸繫鏈將聚合酶接附至導電通道且結合至可基於電荷區分之核苷酸。

[圖6]展示在一個實例中，將聚合酶繫栓至導電通道，其中該導電通道亦接附至受體區域，在此實例中包括複數個能夠結合（例如雜合）至核苷酸上之連接子內之特異性區域的寡核苷酸。

[圖7]展示根據本發明之帶有電荷標籤之核苷酸類似物之非限制性實例的說明。核苷酸類似物可包括聚磷酸核苷酸（諸如如所示之dT六磷酸）、視需要包含特異性區域之連接區域及電荷標籤。在此非限制性實例中，連接子包括藉由氮雜炔烴點擊化學形成之共價接附。如下文進一步描述，特異性區域可包括於連接子中且可在藉由聚合酶併入核苷酸期間輔助促進電荷標籤接近導電通道。

[圖8]展示在一個實例中，在標記物之寡核苷酸部分之磷酸二酯主鏈中具有帶負電之氧的核苷酸標記物。

[圖9]圖9A、圖9B及圖9C展示，作為實例，用以建構可使用導電通道偵測之分支電荷標籤之實例倍增單元。

[圖10]展示在一個實例中，經由具有核酸序列（一般性地表示為10 N之序列）之繫鏈接附至聚合酶（Pol）之導電通道。N個核苷酸係選自通用鹼基及與接附至電荷標籤之連接子（例如特異性區域）中之核苷酸互補之鹼基。

[圖11]展示在一個實例中，經由具有受體區域之繫鏈接附至聚合酶（Pol）之導電通道，在此實例中展示核酸序列（一般性地表示為具有ABC區域之7 N之序列；電荷標籤部分未展示）。聚合酶複合至目標核酸及經標記之CTP類似物。CTP類似物上之連接子包括具有肌苷（I）之核酸區域及與繫鏈上之受體區域（ABC）雜合之特異性區域（A'B'C'）。

[圖12]展示在一個實例中，相對於導電通道之四個不同位置狀態之繫栓之聚合酶，其歸因於經由各連接子中之特異性區域之四個不同核苷酸類似物中之每一者與繫鏈中之受體區域之結合。對於此說明性實例，核苷酸類似物鑑別為ATP、GTP、CTP及TTP，但可使用任何核苷酸類似物（例如，可使用去氧核糖核苷酸類似物）。核苷酸類似物中之每一者具有長度與其他3個核苷酸類似物相同之寡核苷酸部分，但各核苷酸類似物具有與其他核苷酸類似物連接子所結合之區域相比，結合至繫鏈中之受體區域之不同區域的特定結合序列。在此實例中為寡核苷酸或在其他實例中為其他含磷酸二酯之電荷標籤之電荷標籤在與核苷酸相對之連接子末端的雜合區域外部延伸。

[圖13]展示在一個實例中，藉由聚合酶phi29之基於磷酸二酯之電荷標籤的單核苷酸併入。

[圖14]圖14A、圖14B、圖14C及圖14D展示根據本發明之態樣的基於肽之電荷標籤之實例。

[圖15]圖15A、圖15B及圖15C展示在一實例中，具有結構化寡核苷酸作為電荷標籤的經修飾之核苷酸之若干結構。所示為具有自其延伸之電荷標籤的經修飾之核苷酸，其中電荷標籤包括鍵結至受體區域之特異性區域（指示為「膠」）。圖15A展示莖狀及環狀電荷標籤，且圖15C展示苜蓿葉狀電荷標籤（SEQ ID NO:1）。

[圖16]圖16A及圖16B展示十字形電荷標籤之實例。圖16A展示十字形電荷標籤，其包含以霍利迪結構樣組態（Holliday structure-like configuration）鍵結在一起之四個寡核苷酸及單股寡核苷酸突出物。圖16B展示來自圖16A之結構，其中肽核酸之序列結合至該寡核苷酸上旋體且捲曲多肽結構自該等肽核酸序列之末端延伸。在此實例中，多肽序列具有正電荷。

[圖17]展示包括捲曲多肽之多肽電荷標籤及其組件之若干實例。

[圖18]圖18A及圖18B展示包括以捲曲螺旋組態配置之多肽之電荷標籤之實例的兩個視圖。

[圖19]圖19A及圖19B展示具有分支結構之基於磷酸二酯之電荷標籤的實例。圖19A揭示「TTTTT TTTTT」作為SEQ ID NO:11。

[圖20]圖20A、圖20B、圖20C、圖20D及圖20E展示根據本發明之態樣的磷酸二酯電荷標籤之非限制性實例。圖按出現之次序分別揭示SEQ ID NO 2-6。

[圖21]圖21A及圖21B顯示基於分支肽之電荷標籤之實例。

[圖22]描繪根據本發明之態樣的用於合成電荷標籤之實例之合成方法。

[圖23]圖23A及圖23B描繪根據本發明之態樣之分支肽電荷標籤之實例。

[圖24]圖24A、圖24B及圖24C描繪根據本發明之態樣之線性肽電荷標籤（圖24A）及分支肽電荷標籤（圖24B及24C）之實例。

[圖25]圖25A及圖25B展示根據本發明之態樣的基於精胺之電荷標籤之實例。

[圖26]描繪根據本發明之態樣的具有用於偵測電荷標籤之導電通道的設備。

[圖27]為描繪根據本發明之態樣藉由導電通道進行之各種電荷標籤之電荷偵測的圖表。

[圖28]為描繪根據本發明之態樣藉由導電通道進行之各種電荷標籤之電荷偵測的圖表。

[圖29]圖29A及圖29B描繪不同緩衝液中根據各種德拜長度之實例電荷標籤之電荷偵測。

Claims

一種方法，其包含：使聚核苷酸與模板雜合，且使5'鄰接於與該聚核苷酸互補之複數個核苷酸之5'最末端核苷酸之第一模板核苷酸與聚合酶及加電荷標籤的核苷酸接觸，其中該加電荷標籤的核苷酸與該第一模板核苷酸互補且包含接附至該加電荷標籤的核苷酸之5'聚磷酸（polyphosphate）的電荷標籤。
如請求項1之方法，其進一步包含用該聚合酶將該加電荷標籤的核苷酸接附至該聚核苷酸，其中該接附包含將該電荷標籤與該加電荷標籤的核苷酸分離。
如請求項1或2之方法，其中該模板結合至基底。
如請求項1至3中任一項之方法，其中該聚合酶結合至基底。
如請求項1至4中任一項之方法，其中該模板及該聚合酶結合至基底。
如請求項1至5中任一項之方法，其中該聚合酶係選自克列諾（Klenow）片段及Phi29聚合酶。
如請求項1至6中任一項之方法，其中該模板接附至基底且包含連接核苷酸，且其中該等連接核苷酸在該第一模板核苷酸與該基底之間。
如請求項7之方法，其中有超過20個連接核苷酸。
如請求項7之方法，其中有1至20個連接核苷酸。
如請求項7之方法，其中有10至20個連接核苷酸。
如請求項7之方法，其中有1至10個連接核苷酸。
如請求項7之方法，其中有1至5個連接核苷酸。
如請求項7之方法，其中有5至10個連接核苷酸。
如請求項7之方法，其中有10至15個連接核苷酸。
如請求項7之方法，其中有15至20個連接核苷酸。
如請求項1至15中任一項之方法，其中該基底為固體載體導電通道，且該導電通道用於在使該第一模板核苷酸與該加電荷標籤的核苷酸接觸及使該加電荷標籤的核苷酸接附至該聚核苷酸期間偵測該加電荷標籤的核苷酸。
如請求項16之方法，其包含在溶液中接附該加電荷標籤的核苷酸，其中該電荷標籤在該溶液中包含德拜長度（Debye length），且該德拜長度在約0.5 nm與約10 nm之間。
如請求項1至17中任一項之方法，其中該加電荷標籤的核苷酸為式I之化合物
，其中n為3至10之整數， m為1至10之整數， t為0至50之整數， X₁ 為直接鍵、C₁ -C₁₀ 烷基、C₁ -C₁₀ 氧雜烷基、C₁ -C₁₀ 硫雜烷基或C₁ -C₁₀ 氮雜烷基， X₂ 為C₁ -C₂₀ 烷基，其中視需要一或多個CH₂ 殘基個別地經肽鍵或(-O-CH₂ -CH₂ -)_a 置換，其中a為1至24之整數， X₃ 為直接鍵或寡核苷酸， A為
、
、
、
或醯胺鍵，且 Y係選自由以下者組成之群：
、
、
、及
， q為1至100之整數，且 B係選自由以下者組成之群：胺基酸；核苷酸；
；
，其中各R獨立地選自Y及氫；及樹突（dendron）；且其中當B為樹突時q等於1，且q數目個B具有電荷及電荷密度。
如請求項18之方法，其中該電荷係在約-100e與約+100e之間。
如請求項19之方法，其中該電荷密度在約-100e/立方奈米與約+100e/立方奈米之間。
如請求項18之方法，其中該電荷係在約-200e與約+200e之間。
如請求項21之方法，其中該電荷密度在約-200e/立方奈米與約+200e/立方奈米之間。
如請求項18至22中任一項之方法，其中該B包含q數目個核苷酸且q大於1。
如請求項23之方法，其中該聚核苷酸係選自分支聚核苷酸及一或多個髮夾環圈。
如請求項18至22中任一項之方法，其中該q數目個B包含多肽。
如請求項24之方法，其中該多肽係選自分支多肽、捲曲（coiled）多肽及捲曲螺旋（coiled-coil）多肽。
如請求項18至22中任一項之方法，其中B包含胺基酸，且該q數目個B中之一或多者包含甲基離胺酸、二甲基離胺酸或三甲基離胺酸。
如請求項18至22中任一項之方法，其中B為包含一或多個組成重複單元及複數個末端單元之z代（generation）的樹突，其中z為1至6之整數，組成末端單元係選自：
及
，其中 p₁ 為1至3之整數，其中p₁ 個-CH₂ -基團中之任何一或多者視需要經1至3個-O-CH₂ -CH₂ -基團置換， p₂ 為1至3之整數，其中p₂ 個-CH₂ -基團中之任何一或多者視需要經1至3個-O-CH₂ -CH₂ -基團置換，且末端基團係選自羧酸、磺酸、膦酸、精胺基（sperminyl）、胺基及四級銨基團。
如請求項18至28中任一項之方法，其中A係藉由包含連接反應之反應形成，且該連接反應係選自疊氮-炔銅輔助之點擊反應、四
-反式環辛烯接合、疊氮-二苯并環辛炔基無銅點擊反應及硫醇-順丁烯二醯亞胺共軛。
如請求項18至28中任一項之方法，其中X₂ 為(-O-CH₂ -CH₂ -)_a ，其中a為1至24之整數。
如請求項30之方法，其中a為24。
如請求項30之方法，其中a為16。
如請求項30之方法，其中a為12。
如請求項30之方法，其中a為8。
如請求項30之方法，其中a為4。
如請求項18至35中任一項之方法，其中該模板接附至基底且包含連接核苷酸，其中該等連接核苷酸在該第二模板核苷酸與該基底之間，且X₃ 包含寡核苷酸，其中該寡核苷酸在該電荷標籤接近該基底時與複數個該等連接核苷酸雜合。
如請求項1至17中任一項之方法，其中該加電荷標籤的核苷酸為式I之化合物
其中n為3至10之整數， m為1至10之整數， t為0至50之整數， X₁ 為直接鍵、C₁ -C₁₀ 烷基、C₁ -C₁₀ 氧雜烷基、C₁ -C₁₀ 硫雜烷基或C₁ -C₁₀ 氮雜烷基， X₂ 為C₁ -C₂₀ 烷基，其中視需要一或多個CH₂ 殘基個別地經肽鍵或(-O-CH₂ -CH₂ -)_a 置換，其中a為1至24之整數， X₃ 為直接鍵或寡核苷酸， A為
、
、
、
或醯胺鍵，且 Y係選自由以下者組成之群：
、
、
及
， q為1至100之整數， B包含胺基酸，且 q數目個B具有電荷及電荷密度。
如請求項37之方法，其中該電荷係在約-100e與約+100e之間。
如請求項38之方法，其中該電荷密度在約-100e/立方奈米與約+100e/立方奈米之間。
如請求項37之方法，其中該電荷係在約-200e與約+200e之間。
如請求項40之方法，其中該電荷密度在約-200e/立方奈米與約+200e/立方奈米之間。
如請求項37至41中任一項之方法，其中該q數目個B包含多肽。
如請求項42之方法，其中該多肽係選自分支多肽、捲曲多肽及捲曲螺旋多肽。
如請求項42或43之方法，其中該q數目個B中之一或多者包含甲基離胺酸、二甲基離胺酸或三甲基離胺酸。
如請求項42至44中任一項之方法，其中該多肽為包含一或多個叉之分支多肽，該一或多個叉中之每一者包含複數個分支，且該複數個分支中之一或多者各自獨立地包含一定數目之胺基酸。
如請求項45之方法，其中該多肽包含三個或更多個叉且該複數個分支中之一或多者之胺基酸的數目為至少四個。
如請求項45或46之方法，其中該多肽包含七個或更多個叉。
如請求項45至47中任一項之方法，其中該複數個分支中之一或多者之胺基酸的數目為至少六個。
如請求項37至48中任一項之方法，其中A係藉由包含連接反應之反應形成，且該連接反應係選自疊氮-炔銅輔助之點擊反應、四
-反式環辛烯接合、疊氮-二苯并環辛炔基無銅點擊反應及硫醇-順丁烯二醯亞胺共軛。
如請求項37至49中任一項之方法，其中X₂ 為(-O-CH₂ -CH₂ -)_a ，其中a為1至24之整數。
如請求項50之方法，其中a為24。
如請求項50之方法，其中a為16。
如請求項50之方法，其中a為12。
如請求項50之方法，其中a為8。
如請求項50之方法，其中a為4。
如請求項37至62中任一項之方法，其中該模板接附至基底且包含連接核苷酸，其中該等連接核苷酸在該第二模板核苷酸與該基底之間，且X₃ 包含寡核苷酸，其中該寡核苷酸在該電荷標籤接近該基底時與複數個該等連接核苷酸雜合。
如請求項1至17中任一項之方法，其中該加電荷標籤的核苷酸為式I之化合物
其中n為3至10之整數， m為1至10之整數， t為0至50之整數， X₁ 為直接鍵、C₁ -C₁₀ 烷基、C₁ -C₁₀ 氧雜烷基、C₁ -C₁₀ 硫雜烷基或C₁ -C₁₀ 氮雜烷基， X₂ 為C₁ -C₂₀ 烷基，其中視需要一或多個CH₂ 殘基經肽鍵或(-O-CH₂ -CH₂ -)_a 置換，其中a為1至24之整數， X₃ 為直接鍵或寡核苷酸， A為
、
、
、
或醯胺鍵，且 Y係選自由以下者組成之群：
、
、
及
， q為1至100之整數，且 B係選自由以下者組成之群：核苷酸；
；及
，其中各R獨立地選自Y及氫；且 q數目個B具有電荷及電荷密度。
如請求項57之方法，其中該電荷係在約-100e與約+100e之間。
如請求項58之方法，其中該電荷密度在約-100e/立方奈米與約+100e/立方奈米之間。
如請求項57之方法，其中該電荷係在約-200e與約+200e之間。
如請求項60之方法，其中該電荷密度在約-200e/立方奈米與約+200e/立方奈米之間。
如請求項57至61中任一項之方法，其中B包含q數目個核苷酸且q大於1。
如請求項62之方法，其中該聚核苷酸係選自分支聚核苷酸及一或多個髮夾環圈。
如請求項62之方法，其中該聚核苷酸包含兩個與五個之間的髮夾環圈。
如請求項57至64中任一項之方法，其中A係藉由包含連接反應之反應形成，且該連接反應係選自疊氮-炔銅輔助之點擊反應、四
-反式環辛烯接合、疊氮-二苯并環辛炔基無銅點擊反應及硫醇-順丁烯二醯亞胺共軛。
如請求項57至65中任一項之方法，其中X₂ 為(-O-CH₂ -CH₂ -)_a ，其中a為1至24之整數。
如請求項66之方法，其中a為24。
如請求項66之方法，其中a為16。
如請求項66之方法，其中a為12。
如請求項66之方法，其中a為8。
如請求項66之方法，其中a為4。
如請求項57至71中任一項之方法，其中該模板接附至基底且包含連接核苷酸，其中該等連接核苷酸在該第二模板核苷酸與該基底之間，且X₃ 包含寡核苷酸，其中該寡核苷酸在該電荷標籤接近該基底時與複數個該等連接核苷酸雜合。
如請求項1至17中任一項之方法，其中該加電荷標籤的核苷酸為式I之化合物
其中n為3至10之整數， m為1至10之整數， t為0至50之整數， X₁ 為直接鍵、C₁ -C₁₀ 烷基、C₁ -C₁₀ 氧雜烷基、C₁ -C₁₀ 硫雜烷基或C₁ -C₁₀ 氮雜烷基， X₂ 為C₁ -C₂₀ 烷基，其中視需要一或多個CH₂ 殘基個別地經肽鍵或(-O-CH₂ -CH₂ -)_a 置換，其中a為1至24之整數， X₃ 為直接鍵或寡核苷酸， A為
、
、
、
或醯胺鍵，且 Y係選自由以下者組成之群：
、
、
及
， q為1，且 B包含樹突，且B具有電荷及電荷密度。
如請求項73之方法，其中該電荷係在約-100e與約+100e之間。
如請求項74之方法，其中該電荷密度在約-100e/立方奈米與約+100e/立方奈米之間。
如請求項73之方法，其中該電荷係在約-200e與約+200e之間。
如請求項76之方法，其中該電荷密度在約-200e/立方奈米與約+200e/立方奈米之間。
如請求項73至77中任一項之方法，其中B為包含一或多個組成重複單元及複數個末端單元之z代的樹突，其中z為1至6之整數，組成末端單元係選自：
及
，其中 p₁ 為1至3之整數，其中p₁ 個-CH₂ -基團中之任何一或多者視需要經1至3個-O-CH₂ -CH₂ -基團置換， p₂ 為1至3之整數，其中p₂ 個-CH₂ -基團中之任何一或多者視需要經1至3個-O-CH₂ -CH₂ -基團置換，且末端基團係選自羧酸、磺酸、膦酸、精胺基、胺基及四級銨基團。
如請求項73至78中任一項之方法，其中A係藉由包含連接反應之反應形成，且該連接反應係選自疊氮-炔銅輔助之點擊反應、四
-反式環辛烯接合、疊氮-二苯并環辛炔基無銅點擊反應及硫醇-順丁烯二醯亞胺共軛。
如請求項73至7879中任一項之方法，其中X₂ 為(-O-CH₂ -CH₂ -)_a ，其中a為1至24之整數。
如請求項80之方法，其中a為24。
如請求項80之方法，其中a為16。
如請求項80之方法，其中a為12。
如請求項80之方法，其中a為8。
如請求項80之方法，其中a為4。
如請求項73至85中任一項之方法，其中該模板接附至基底且包含連接核苷酸，其中該等連接核苷酸在該第二模板核苷酸與該基底之間，且X₃ 包含寡核苷酸，其中該寡核苷酸在該電荷標籤接近該基底時與複數個該等連接核苷酸雜合。
如請求項1至86中任一項之方法，其中該模板進一步包含5'鄰接於該第一模板核苷酸之第二模板核苷酸，該方法進一步包含使該第二模板核苷酸與加螢光標籤之核苷酸接觸，其中該加螢光標籤之核苷酸與該第二模板核苷酸互補但不與該第一模板核苷酸互補，且用聚合酶將該加螢光標籤之核苷酸接附至該聚核苷酸。
如請求項87之方法，其進一步包含藉由量測自該聚核苷酸發出之螢光量測該加螢光標籤之核苷酸與該聚核苷酸之接附。
如請求項88之方法，其進一步包含在量測之前自該模板溶析該聚核苷酸。