TW202110478A

TW202110478A - Tau疫苗之異種投予

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Publication number: TW202110478A
Application number: TW109113654A
Authority: TW
Inventors: 伊麗莎白藍斯布格; 多娜塔德瑪爾科; 阿尼西查庫卡爾; 夏洛特沙達卡; 加波古德史密特; 安德列斯穆斯; 包區瑪麗亞菲爾格瑞; 馬里加武基契維奇凡希拉; 大衛希克曼; 尼可拉斯皮歐特; 沙羅吉米瑞
Original assignee: 美商健生醫藥公司; 瑞士商Ａｃ免疫學製藥股份有限公司
Priority date: 2019-04-24
Filing date: 2020-04-23
Publication date: 2021-03-16
Also published as: CN114173812A; US20200339643A1; MA55902A; JOP20210284A1; EP3965817A1; JP2022529529A; KR20220005033A; US20230257433A1; BR112021021213A2; MX2021012994A; EA202192891A1; US11591377B2; EP3965817A4; WO2020219646A1; AU2020262899A1; ZA202108168B; CA3137884A1; IL287486A; SG11202111770RA

Abstract

本發明說明一種在罹患神經退化性疾病、疾患或病症(如：阿茲海默症(Alzheimer’s disease))之個體中誘發對抗tau蛋白質之免疫反應之方法。該方法包括投予包含tau肽(較佳係磷酸化tau肽)之脂質體初免(priming)組成物，及包含已接合至免疫原性載劑之tau肽(較佳係磷酸化tau肽)之接合物追加(boosting)組成物。

Description

Tau　疫苗之異種投予

本發明係屬於醫學領域。本發明特定言之係有關一種使用包含tau肽之脂質體初免(priming)組成物及包含已接合至免疫原性載劑之tau肽之接合物追加(boosting)組成物，在罹患神經退化性疾病、疾患或病症之個體中誘發對抗tau蛋白質之免疫反應之方法。

阿茲海默症(Alzheimer’s disease) 為一種漸進性耗弱的神經退化性疾病，估計影響全世界約4400萬人(Alzheimers.net)。目前臨床上可採用的AD療法目的在於減緩臨床症狀的演進，但並未靶向構成疾病的致病過程。不幸地，此等療法的效力很低，因此需要發展及測試其他預防性及醫療性措施。

阿茲海默症的病理特徵為包含集結之類澱粉β蛋白質之細胞外斑塊累積及過度磷酸化tau蛋白質之細胞內「纏結」或集結。造成此等蛋白質累積之分子現象很難分析特徵。以類澱粉蛋白而言，其假說為類澱粉前驅蛋白質的異常裂解造成包含1至42個胺基酸的有集結傾向的片段累積。以tau而言，其假說為激酶、磷酸酶或此二者失調，導致tau之異常磷酸化。一旦tau變得過度磷酸化，不但會喪失有效結合及穩定微管的能力，反而會累積在受影響神經元的細胞質中。未結合及過度磷酸化的tau似乎會先形成寡聚物，然後形成較高級的集結物，其存在可能藉由中斷正常軸突運輸，推測會負面影響其所在的神經元功能。

已開發國家中，診斷患有阿茲海默症或其他失智性tau蛋白病變的個體通常接受膽鹼酯酶抑制劑(例如：Aricept®)或美金剛胺(memantine)(例如：Namenda™)治療。此等藥物儘管具有合理的良好耐受性，但效力仍非常弱。例如：Aricept®使約50%接受治療個體的症狀惡化延緩6-12個月。其餘治療則為非藥理性，且著重於讓患者隨著其認知能力下降，仍更有能力處理其日常生活。

數項已公開的研究(Asuni AA等人，J Neurosci. 2007 Aug 22；27(34):9115-29., Theunis C等人，PLoS One. 2013； 8(8): e72301., Kontsekova E等人，Alzheimers Res Ther. 2014 Aug 1；6(4):44)證實包含tau肽的活性疫苗可以在小鼠或大鼠中誘發抗-tau 免疫反應；減少囓齒類腦部的病理性tau 集結物的累積；及在阿茲海默症的動物模式中降低認知力下降的演進速度。對抗病理性tau蛋白質的活性疫苗已顯示在罹患阿茲海默症的人類患者中具有免疫原性(Novak P等人，Lancet Neurology 2017, 16:123-134)。WO2010/115843與WO2019/084118說明以擬似蛋白質tau之主要病理性磷酸-抗原表位之抗原性磷酸肽，及用於處理tau 蛋白病變(包括阿茲海默症)的治療及診斷用途之相關組成物。然而，目前市面上仍然沒有核准的有效疫苗可以防止tau介導的疾病發作。一旦疾病開始發作時，市面上也沒有有效的藥物可以截斷或減緩病程。因此極需要判別可以預防此等疾病的新穎預防性措施(例如：疫苗)。

本發明已驚人地發現，使用分別包含tau磷酸肽之脂質體組成物及接合物組成物進行異種疫苗接種，已提高tau磷酸肽-特異性抗體的抗原表位覆蓋度。此外，已發現使用脂質體初免組成物進行異種疫苗接種時，可比接合物初免組成物誘發更強的免疫反應。

一項一般態樣中，本發明係有關一種在有此需要之個體，較佳係罹患神經退化性疾患之個體中，誘發對抗tau蛋白質之免疫反應，較佳係誘發對抗磷酸化Tau與富集成對的螺旋狀纖維(ePHF)中至少一者之抗體的方法，該方法包括： (i) 對該個體投予包含免疫有效量脂質體之初免組成物，該脂質體包含： a. 第一tau磷酸肽； b. 輔助型T-細胞抗原表位； c. 脂質化CpG寡核苷酸；及 d. 包含toll-樣受體4配體之佐劑；其中tau磷酸肽係存在於脂質體表面上，及初免組成物進一步包含醫藥上可接受之載劑；及 (ii) 對該個體投予包含免疫有效量接合物之第一追加組成物，該接合物包含第二tau磷酸肽及利用連接子與其接合之免疫原性載劑，該接合物具有式(I)結構：

或具有式(II)結構：

其中 x為整數0至10，較佳係2至6，最佳係3； n為整數3至15，較佳係3至12； Tau肽代表第二tau磷酸肽；及載劑代表選自下列各物組成之群中之免疫原性載劑：鎖孔貝血藍蛋白(KLH)、破傷風類毒素、CRM197、及來自腦膜炎雙球菌(N. meningitidis )之外膜蛋白質混合物(OMP)，或其衍生物；及第一追加組成物進一步包含醫藥上可接受之載劑；其中第一tau磷酸肽及第二tau磷酸肽分別獨立包含選自下列所組成之群組中之胺基酸序列：SEQ ID NO：1至 SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：5至 SEQ ID NO：12。

某些實施例中，脂質體包含： a. 第一tau磷酸肽，其具有選自下列所組成之群組中之胺基酸序列：SEQ ID NO：27至 SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：31至 SEQ ID NO：38； b. 輔助型T細胞抗原表位，其具有選自下列所組成之群組中之胺基酸序列：SEQ ID NO：39至 SEQ ID NO：44，較佳係由選自：SEQ ID NO：13至SEQ ID NO：17所組成之群組中之胺基酸序列組成之輔助型T細胞抗原表位； c. 脂質化CpG寡核苷酸，其具有選自下列所組成之群組中之核苷酸序列：SEQ ID NO：18至 SEQ ID NO：22，其中該CpG寡核苷酸包含一個或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結，及該CpG寡核苷酸係利用連接子與至少一個膽固醇共價鍵結；及 d. 單磷醯基脂質 A (MPLA)；及該接合物包含第二tau磷酸肽，其具有選自下列所組成之群組中之胺基酸序列：SEQ ID NO：27至 SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：31至 SEQ ID NO：38，其利用連接子與CRM197接合。

某些實施例中，接合物具有如下結構：

, 其中n為整數3至7。

根據一項本發明實施例，一種在有此需要之個體中誘發對抗磷酸化Tau與富集成對的螺旋狀纖維(ePHF)中至少一者的抗體之方法包括： (i) 對該個體投予包含免疫有效量脂質體之初免組成物，該脂質體包含： a. 第一tau磷酸肽，其具有選自下列所組成之群組中之胺基酸序列：SEQ ID NO：27至 SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：31至 SEQ ID NO：38； b. 輔助型T細胞抗原表位，其具有選自下列所組成之群組中之胺基酸序列：SEQ ID NO：39至 SEQ ID NO：44，較佳係由選自：SEQ ID NO：13至SEQ ID NO：17所組成之群組中之胺基酸序列組成之輔助型T細胞抗原表位； c. 脂質化CpG寡核苷酸，其具有選自下列所組成之群組中之核苷酸序列：SEQ ID NO：18至 SEQ ID NO：22，其中該CpG寡核苷酸包含一個或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結，及該CpG寡核苷酸係利用連接子與至少一個膽固醇共價鍵結；及 d. 單磷醯基脂質 A (MPLA)；其中第一tau磷酸肽係存在於脂質體表面上，及初免組成物進一步包含醫藥上可接受之載劑；及 (ii) 對該個體投予包含免疫有效量接合物之第一追加組成物，該接合物包含第二tau磷酸肽及利用連接子與其接合之免疫原性載劑，該接合物具有如下結構：

，其中n為整數3至7，及第一追加組成物進一步包含醫藥上可接受之載劑。

根據本申請案之另一項實施例，一種在有此需要之個體中誘發對抗磷酸化Tau與富集成對的螺旋狀纖維(ePHF)中至少一者之抗體之方法包括： (i) 對該個體投予包含免疫有效量脂質體之初免組成物，該脂質體包含： (1) 第一tau磷酸肽，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：28； (2) toll-樣受體4促效劑，其包含單磷醯基六-醯基脂質 A，3-脫醯基； (3) 輔助型T-細胞抗原表位，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：39； (4) 脂質化CpG寡核苷酸，其包含核苷酸序列SEQ ID NO：18 ；及 (5) 至少一種選自下列組成之群組中之脂質：1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DMPC)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油基-3-磷醯基-3’-rac-甘油(DMPG)、及膽固醇，其中第一tau磷酸肽係存在於脂質體表面上，及初免組成物進一步包含醫藥上可接受之載劑；及 (ii) 對該個體投予包含免疫有效量之接合物之第一追加組成物，該接合物包含第二tau磷酸肽及利用連接子與其接合之免疫原性載劑，該接合物具有如下結構：

, 其中n為整數3至7，及第一追加組成物進一步包含醫藥上可接受之載劑。

某些實施例中，該方法進一步包括對個體初次投予第一追加組成物之後，至少投予一次第一追加組成物。

某些實施例中，該方法進一步包括對個體投予包含免疫有效量脂質體與醫藥上可接受之載劑之第二追加組成物。該第二追加組成物可以在初次投予第一追加組成物之前或之後投予。

某些實施例中，該方法進一步包括對個體初次投予第二追加組成物之後，至少投予一次第二追加組成物。

根據本申請案一項實施例，一種在有此需要之個體中誘發對抗磷酸化Tau與富集成對的螺旋狀纖維(ePHF)中至少一者之抗體之方法包括： (i) 對該個體投予包含免疫有效量脂質體之初免組成物，該脂質體包含： (1) 第一tau磷酸肽，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：28； (2) toll-樣受體4促效劑，其包含單磷醯基六-醯基脂質 A，3-脫醯基； (3) 輔助型T-細胞抗原表位，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：39； (4) 脂質化CpG寡核苷酸，其包含核苷酸序列SEQ ID NO：18 ；及 (5) 至少一種選自下列組成之群組中之脂質：1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DMPC)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油基-3-磷醯基-3’-rac-甘油(DMPG)、及膽固醇，其中第一tau磷酸肽係存在於脂質體表面上，及初免組成物進一步包含醫藥上可接受之載劑； (ii) 對該個體投予包含免疫有效量之接合物之第一追加組成物，該接合物包含第二tau磷酸肽及利用連接子與其接合之免疫原性載劑，該接合物具有如下結構：

，其中n為整數3至7，及第一追加組成物進一步包含醫藥上可接受之載劑；及 (iii) 對個體投予第一追加組成物或第二追加組成物，其包含免疫有效量之脂質體及醫藥上可接受之載劑。

某些實施例中，步驟(ii)係在步驟(iii)之前進行。

其他實施例中，步驟(ii)係在步驟(iii)之後進行。

某些實施例中，該方法包括對個體投予第一追加組成物至少兩次，以加強免疫反應。

某些實施例中，該方法包括對個體投予第二追加組成物至少一次，以加強免疫反應。

某些實施例中，第一追加組成物係在投予初免組成物之後約27-32天投予。較佳係該方法進一步包括在初次投予初免組成物之後約82-87天，再度投予第一追加組成物，及視需要進一步包括在投予初免組成物之後約167-172天，投予第二追加組成物。

某些實施例中，第一追加組成物係在投予初免組成物之後約82-87天投予。較佳係該方法進一步包括在投予初免組成物之後約27-32天投予第二追加組成物，及視需要進一步包括在投予初免組成物之後約167-172天，再度投予第一追加組成物。

某些實施例中，免疫有效量之脂質體包含每劑約25奈莫耳至約750奈莫耳之第一Tau磷酸肽，如：每劑約29.7奈莫耳至約742.5奈莫耳，較佳係約90奈莫耳至約715奈莫耳，如：每劑約89.1奈莫耳至約712.8奈莫耳，或每劑約90奈莫耳至約535奈莫耳，如：每劑約89.1奈莫耳至約534.6奈莫耳，或每劑約90奈莫耳至約275奈莫耳，如：每劑約89.1奈莫耳至約267.3奈莫耳之第一Tau磷酸肽，且第一Tau磷酸肽係存在於脂質體表面上。一項實施例中，有效量之脂質體包含每劑約265至約275奈莫耳之第一Tau磷酸肽，例如：每劑約265、約266、約267、約268、約269、約270、約271、約272、約273、約274或約275奈莫耳，或其等之間任何數值，如：每劑約267.3奈莫耳。另一項實施例中，免疫有效量之脂質體包含每劑約530至約540奈莫耳之第一Tau磷酸肽，如：每劑約530、約531、約532、約533、約534、約535、約536、約537、約538、約539或約540奈莫耳，或其等之間任何數值，如：每劑約534.6奈莫耳。另一項實施例中，有效量之脂質體包含每劑約710至約720奈莫耳之第一Tau磷酸肽，如：每劑約710、約711、約712、約713、約714、約715、約716、約717、約718、約719或約720奈莫耳，或其等之間任何數值，如：每劑約712.8奈莫耳。

某些實施例中，第一Tau磷酸肽係由選自下列所組成之群組中之胺基酸序列組成：SEQ ID NO：27至 SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：31至 SEQ ID NO：38，較佳係由胺基酸序列SEQ ID NO：28組成。一項實施例中，免疫有效量之脂質體包含由胺基酸序列SEQ ID NO：28組成之四棕櫚醯基化Tau磷酸肽，其中四棕櫚醯基化Tau磷酸肽存在於脂質體之表面上，且其投藥量為每劑約100 µg至約2500 µg，相當於每劑約29.7奈莫耳至約742.5奈莫耳，較佳係每劑約300 µg至約2400 µg，相當於每劑約89.1奈莫耳至約712.8奈莫耳，如：每劑約300 µg、約900 µg、約1800 µg或約2400 µg，相當於每劑約89.1奈莫耳、約267.3奈莫耳、約534.6奈莫耳或約712.8奈莫耳。

某些實施例中，免疫有效量之脂質體包含每劑約2奈莫耳至約110奈莫耳之輔助型T-細胞抗原表位，如：每劑約4.02奈莫耳至約100.44奈莫耳，或約4奈莫耳至約75奈莫耳，如：每劑約4.02奈莫耳至約72.32奈莫耳，或約10奈莫耳至約105奈莫耳，如：每劑約12.06奈莫耳至約100.44奈莫耳，或每劑約70至約105奈莫耳，如：每劑約72.32奈莫耳至約100.44奈莫耳。某些實施例中，有效量之脂質體包含約2奈莫耳至約110奈莫耳之輔助型T-細胞抗原表位(其較佳係由胺基酸序列SEQ ID NO：13組成之T50 輔助型T-細胞抗原表位組成)，如：約12.06奈莫耳至約100.44奈莫耳。

本發明亦有關一種本發明脂質體與接合物之疫苗組合，如：套組，用於為罹患神經退化性疾患之個體誘發對抗tau蛋白質之免疫反應，或用於為有此需要之個體治療或預防神經退化性疾病或疾患。

本發明亦有關一種以本發明脂質體與接合物之疫苗組合於製造醫藥上之用途，供於罹患神經退化性疾患之個體中誘發對抗tau蛋白質之免疫反應，或為有此需要之個體治療或預防神經退化性疾病或疾患。

藉由詳讀下文本發明詳細說明及申請專利範圍，將可更了解本發明其他態樣、特徵與優點。

本說明書之背景與全文已摘錄或說明各種不同公開文獻、文章與專利案；此等參考文獻之完整內容已分別以引用方式併入本文中。本說明書中已收納文獻、作用、材料、裝置、物品、或類似物的討論，目的在於提供本發明的內容。此等討論並不表示容許此等任何或所有內容形成本發明任何揭示內容或申請專利範圍的一部份。

除非另有其他定義，否則本文所採用所有技術與科學術語具有熟悉本發明相關技藝的人士習知的相同定義。否則本文所採用某些術語已如本說明書中之定義。

必需注意，本文及附錄之申請專利範圍所採用之單數形式「一種」、「一個」、及「該」包括相關之複數形式，除非本文中另有其他詳細說明。

除非另有其他定義，否則本文所說明任何數值，如：濃度或濃度範圍，咸了解在所有例子中均以名詞「約」修飾。因此，數值通常包括所示數值± 10%。例如：濃度1 mg/mL包括0.9 mg/mL至1.1 mg/mL。同樣地，濃度範圍1%至10% (w/v)包括0.9% (w/v)至11% (w/v)。本文所採用數字範圍的用法明確包括所有可能的子範圍、該範圍內的所有個別數值，包括此等範圍內的整數及數值的分數，除非本文中另有其他詳細說明。

除非本文中另有其他說明，否則在一系列元素之前的術語「至少」咸了解係指該系列中每一個元素。彼等熟習此相關技藝者僅需採用例行實驗即可了解或確定本文所說明本發明明確實施例的許多等效物。此等等效物均計畫包括在本發明內。

本文所採用術語「包含(comprise、comprising)」、「包括(include、including)」、「具有(has、having)」、「含有(contains或containing)」或其任何其他變化，咸了解係指涵括所陳述之整數或一組整數，但不排除任何其他整數或一組整數，且計畫為無排他性或為開放性。例如：包含一系列元素之組成物、混合物、製程、方法、物品或設備不一定僅侷限於彼等元素，反而可包括未明確列出的其他元素或此等組成物、混合物、製程、方法、物品或設備固有的元素。此外，除非另有相反的明確說明，否則「或」係指包括或且不排除「或」。例如：條件1或2係滿足下列任一項：1為真(或存在)及2為偽(或不存在)，1為偽(或不存在)及2為真(或存在)，及1與2二者均為真(或存在)。

應了解本文所採用術語「約」、「大約」、「一般」、「實質上」及類似術語當指較佳本發明組份之尺寸或特性時，係指所說明尺寸/特性沒有嚴格界限或參數，且如同習此相關技藝者咸了解，不排除會在相同或類似功能上有些微變異。在最低限度下，此等包括數目參數的提及內容將會包括變異，其等變異使用相關技藝可接受之數學與工業原則(例如：數值簡化、測量或其他系統誤差、製造公差，等等)，將不會改變最低有效數位。

根據本申請案之實施例，有效量之脂質體係每劑包含約25奈莫耳至約750奈莫耳之Tau磷酸肽，如：每劑約29.7奈莫耳至約742.5奈莫耳，較佳係約90奈莫耳至約715奈莫耳，如：每劑約89.1奈莫耳至約712.8奈莫耳，或每劑約90奈莫耳至約535奈莫耳，如：每劑約89.1奈莫耳至約534.6奈莫耳，或每劑約90奈莫耳至約275奈莫耳，如：每劑約89.1奈莫耳至約267.3奈莫耳之包含SEQ ID NO：1-3或5-12中一個胺基酸序列之Tau磷酸肽。較佳係該Tau磷酸肽係由SEQ ID NO：27至 SEQ ID NO：38中一個胺基酸序列組成。更佳係該Tau磷酸肽係由胺基酸序列SEQ ID NO：28組成。一項實施例中，有效量脂質體包含toll-樣受體4促效劑及由胺基酸序列SEQ ID NO：28組成之四棕櫚醯基化Tau磷酸肽，其含量為每劑約100 µg至約2500 µg，較佳係約300 µg至約2400 µg，相當於約29.7奈莫耳至約742.5奈莫耳，較佳係約89.1奈莫耳至約712.8奈莫耳。

根據本申請案之實施例，有效量之脂質體包含Tau磷酸肽，如：包含SEQ ID NO：1-3或5-12中一個胺基酸序列之Tau磷酸肽，較佳係由SEQ ID NO：27至 SEQ ID NO：38中一個胺基酸序列，更佳係由SEQ ID NO：28組成之Tau磷酸肽，其含量為每劑約100 µg至約2500 µg、約300 µg至約2400 µg、約300 µg至約1800 µg、或約300 µg至約900 µg，如：每劑約100 µg、約150 µg、約200 µg、約250 µg、約300 µg、約400 µg、約500 µg、約600 µg、約700 µg、約800 µg、約900 µg、約1000 µg、約1100 µg、約1200 µg、約1300 µg、約1400 µg、約1500 µg、約1600 µg、約1700 µg、約1800 µg、約1900 µg、約2000 µg、約2100 µg、約2200 µg、約2300 µg、約2400 µg、或約2500 µg，或其等之間任何數值。

某些實施例中，有效量之脂質體包含每劑約30 µg至約900 µg，較佳係約100 µg至約585 µg之toll-樣受體4促效劑。某些實施例中，有效量之脂質體包含每劑約30 µg、約50 µg、約100 µg、約150 µg、約200 µg、約250 µg、約300 µg、約330 µg、約360 µg、約390 µg、約420 µg、約450 µg、約480 µg、約500 µg、約520 µg、約540 µg、約560 µg、約580 µg、約600 µg、約700 µg、約800 µg或約900 µg之toll-樣受體促效劑單磷醯基六醯基脂質 A，3-脫醯基。

某些實施例中，有效量之脂質體包含每劑約50 µg至約1250 µg，較佳係約150 µg至約800 µg之脂質化CpG寡核苷酸。例如：有效量脂質體可以包含每劑約50 µg、約100 µg、約150 µg、約200 µg、約250 µg、約300 µg、約350 µg、約400 µg、約450 µg、約500 µg、約550 µg、約600 µg、約650 µg、約700 µg、約750 µg、約800 µg、約850 µg、約900 µg、約950 µg、約1000 µg、約1050 µg、約1100 µg、約1200 µg、或約1250 µg之脂質化CpG寡核苷酸。某些實施例中，有效量之脂質體包含每劑約50 µg至約1250 µg，較佳係約150 µg至約800 µg之由核苷酸序列SEQ ID NO：18組成之CpG寡核苷酸。

根據本申請案之實施例，Tau磷酸肽存在於脂質體之表面上。

本文所採用免疫有效量之接合物之定義為與第二Tau磷酸肽接合之免疫原性載劑在接合物中之含量。例如：15 µg 接合物係指包含15 µg與Tau磷酸肽接合之免疫原性載劑之接合物組成物。一個或多個Tau磷酸肽可以接合至一個免疫原性載劑。

根據本申請案之實施例，有效量之接合物可採用相關技藝已知之方法，如：臨床經驗，依據本揭示內容決定。

Tau磷酸肽包含SEQ ID NO：1-3或5-12中一個胺基酸序列。較佳係存在於脂質體上之Tau磷酸肽係由SEQ ID NO：27至 SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：31至 SEQ ID NO：38中一個胺基酸序列組成。更佳係存在於脂質體上之Tau磷酸肽係由胺基酸序列SEQ ID NO：28組成。較佳係存在於接合物中之Tau磷酸肽係由SEQ ID NO：1-3或5-12中一個胺基酸序列組成，較佳係由SEQ ID NO：2組成。

本文所採用術語「tau」或「tau蛋白質」亦稱為微管相關蛋白質tau、MAPT、神經纖維纏結蛋白質、成對的螺旋狀纖維-tau、PHF-tau、MAPTL、MTBT1，係指大量的具有多重同型的中樞與周邊神經系統蛋白質。人類中樞神經系統(CNS)中，因交替剪接而出現大小在長度為352至441個胺基酸的範圍內的六種主要tau同型(Hanger等人，Trends Mol Med. 15:112-9, 2009)。Tau之實例包括(但不限於)：CNS中之tau同型，如： 441個胺基酸之最長tau同型(4R2N)，其具有四個重複序列及兩個嵌入序列；及352個胺基酸之最短(胚胎)同型(3R0N)，其具有三個重複序列，且沒有嵌入序列。Tau之實例亦包括表現在周邊神經之「大tau」同型，其包含300個額外殘基(外顯子4a)。Friedhoff等人，Biochimica et Biophysica Acta 1502 (2000) 122-132。Tau之實例包括人類大tau，其係由長度6762個核苷酸之mRNA轉錄本 (NM_016835.4)編碼之長度758個胺基酸之蛋白質，或其同型。所例舉人類大tau之胺基酸序列由GenBank登錄號NP_058519.3代表。本文所採用術語「tau」包括來自人類以外其他物種之tau同系物，如：Macaca Fascicularis (食蟹獼猴)或Pan troglodytes(黑猩猩)。本文所採用術語「tau」包括包含全長度野生型tau之突變(例如：點突變)、切段、嵌入、缺失及剪切等變異之蛋白質。術語「tau」亦涵括 tau胺基酸序列之轉譯後修飾。轉譯後修飾包括(但不限於)：磷酸化。

本文所採用術語「磷酸化Tau」係指tau蛋白質，或其包含至少一個磷酸化殘基之片段或肽。

本文所採用術語「富集成對的螺旋狀纖維」或「ePHF」係指製劑中富集呈成對螺旋狀纖維之tau蛋白質。PHF為阿茲海默症神經纖維纏結的主要組份。

本文所採用術語「肽」或「多肽」係指由胺基酸殘基組成之聚合物、相關之天然結構變體、及利用肽鍵連接之其合成性非天然類似物。該術語係指任何大小、結構或功能之肽。通常，肽為至少三個胺基酸之長度。肽可為天然發生、重組、或合成，或其任何組合。合成性肽可以採用例如：自動化多肽合成儀合成。tau肽之實例包括長度約5至約30個胺基酸之tau蛋白質之任何肽，較佳係長度約10至約25個胺基酸，更佳係長度約16至約21個胺基酸。本揭示內容中，肽係從N至C 末端，採用標準三個或一個字母的胺基酸縮寫列出，其中磷酸殘基係以「p」表示。適用於本發明之tau肽實例包括(但不限於)：包含SEQ ID NO：1-12中任何胺基酸序列之tau肽，或具有與SEQ ID NO：1-12中任何胺基酸序列為至少 75%、80%、85%、90%或95%一致之胺基酸序列之tau肽。

本文所採用術語「磷酸肽」或「磷酸-抗原表位」係指肽在一個或多個胺基酸殘基上進行磷酸化。tau磷酸肽之實例包括包含一個或多個磷酸化胺基酸殘基之任何tau肽。適用於本發明之tau磷酸肽實例包括(但不限於)：包含SEQ ID NO：1-3或5-12中任何胺基酸序列之tau磷酸肽，或具有與SEQ ID NO：1-3或5-12中任何胺基酸序列為至少 75%、80%、85%、90%或95%一致之胺基酸序列之tau磷酸肽。

本發明tau肽可採用固相肽合成法或採用重組表現系統合成。自動化肽合成儀可自許多家供應商取得商品，如：Applied Biosystems (Foster City, Calif.)。重組表現系統可以包括細菌，如：大腸桿菌(E. coli)、酵母、昆蟲細胞、或哺乳動物細胞。重組表現的製程說明於Sambrook等人之Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY，第2版，1989)。

Tau為人類「自身」蛋白質。此意指原則上所有帶有tau之特異性受體之淋巴細胞已在發育期間消除(中樞耐受)或藉由周邊耐受機轉而沒有反應性。此問題已證實成為發展對抗自身或「改變的自身」蛋白質(例如：腫瘤抗原)的疫苗時的重要路障。

產生對抗(自身或感染)抗原之高品質抗體不僅需要會產生抗體的B淋巴細胞的作用，而且需要CD4+ T「輔助型」淋巴細胞。CD4+ T-細胞提供重要的存活及成熟訊號給B淋巴細胞，且CD4+ T-細胞缺陷動物的免疫力受到嚴重抑制。CD4+ T-細胞亦涉及耐受機轉，且另一個產生強力抗-自身(例如：抗-tau)抗體反應的路障亦為人類/動物組譜中似乎很難不存在tau-反應性CD4+ T-細胞。

在不希望受到理論限制下，咸信可在不以任何方式限制本發明範圍下，利用本發明疫苗組成物繞過此問題。

一項實施例中，所製成包含tau肽之脂質體亦包含T-細胞抗原表位，其可以結合大部份或所有HLA DR(人類白血球抗原 – 抗原 D相關)分子。T-細胞抗原表位隨後可以接著激活CD4+ T-細胞，並提供必要的成熟與存活訊號給tau-特異性B-細胞。另一項實施例中，製成tau肽與載劑蛋白質之接合物，其產生強力的輔助型T-細胞反應。本實施例中，採用「未連接之辨識」，其中載劑-特異性T-細胞提供存活與成熟訊號給自身-反應性B-細胞。因此，tau-特異性B-細胞接收關鍵的訊號，啟動親和性成熟、免疫球蛋白類型轉換、及建立長期記憶庫。tau 脂質體與tau 接合物可用於在同種或異種免疫接種流程中產生對抗tau 抗原之高品質抗體，其中使用脂質體或接合物進行初免及/或追加。

脂質體

本申請案在初免組成物中，及視需要在追加組成物中，使用脂質體。適用於本發明方法之脂質體包含： tau肽，較佳tau肽為tau磷酸肽；及輔助型T-細胞抗原表位，其中tau肽存在於脂質體之表面上。

根據本發明實施例之脂質體在本文中亦稱為「改良脂質體」、「改良脂質體疫苗」或「根據本發明實施例之脂質體疫苗」或「Tau 脂質體」或「第二代脂質體」之「優化脂質體疫苗」。

本文所採用術語「脂質體」一般指由具有高脂質含量材料製成之脂質囊泡，例如：磷脂、膽固醇。此等囊泡之脂質一般結構呈脂質雙層形式。脂質雙層一般囊封的體積在脂質雙層中穿插在多重洋蔥狀外殼之間，形成多疊層脂質囊泡(MLV)或在其中包含不定形之中心空洞。具有不定形中心空洞的脂質囊泡為單層脂質囊泡，亦即，彼等具有一個圍繞空洞的周圍雙層。大的單層囊泡(LUV)的一般直徑為100 nm至數微米，如：100-200 nm或更大，而小的單層脂質囊泡(SUV)的一般直徑為小於100 nm，如：20-100 nm，通常為15-30 mm。

根據特定實施例，脂質體包含一個或多個tau肽。根據特定實施例，脂質體上的tau肽可以相同或不同。

彼等習此相關技藝者已知之任何合適tau肽均可依據本揭示內容用於本發明。根據特定實施例，一個或多個tau肽包含SEQ ID NO：1-12中一個胺基酸序列。其他實施例中，一個或多個tau肽包含與SEQ ID NO：1-12中一個胺基酸序列為至少 75%、80%、85%、90%或95%一致之胺基酸序列，其中沒有任何胺基酸殘基為磷酸化，或有一個或多個胺基酸殘基為磷酸化。

根據特定實施例，一個或多個tau肽為tau磷酸肽。根據特定實施例，一個或多個tau磷酸肽包含SEQ ID NO：1-3或5-12中一個胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：1-3或5-12中一個胺基酸序列為至少 75%、80%、85%、90%或95%一致之胺基酸序列，其中一個或多個指定之胺基酸殘基為磷酸化。較佳係tau磷酸肽包含SEQ ID NO：1-3中一個胺基酸序列。tau肽可以具有C-末端醯胺化。

根據本申請案之實施例，tau肽存在於脂質體之表面上。tau肽，較佳係tau磷酸肽，可以採用相關技藝已知之方法，依據本揭示內容，呈現在脂質體表面上。參見例如：美國專利案案號8,647,631與9,687,447中之相關揭示內容，其內容已以引用方式併入本文中。根據特定實施例，一個或多個tau肽(包括磷酸肽)進一步包含一個或多個修飾，如：棕櫚醯基化或十二碳烷基修飾，讓tau肽存在於脂質體表面上。其他胺基酸殘基，如：Lys、Cys，或有時候指Ser或Thr，可以加至tau肽中，以促進修飾。有報告指出，脂質錨定的位置會誘發肽序列之不同構形(Hickman等人，J. Biol. Chem. vol. 286, NO. 16, pp. 13966–13976, April 22, 2011)。雖然不希望受到理論限制下，咸信在兩個末端添加疏水性部份體可能增加tau肽之病理性β-摺疊構形。因此，一個或多個tau肽進一步在兩個末端包含疏水性部份體。該已修飾之tau肽可以具有C-末端醯胺化。較佳係存在於脂質體表面上之tau肽係由SEQ ID NO：27至 SEQ ID NO：38中一個胺基酸序列組成。更佳係該肽為tau磷酸肽，其具有選自下列各物所組成群中之胺基酸序列：SEQ ID NO：27至 SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：31至 SEQ ID NO：38。

本文所採用術語「輔助型T-細胞抗原表位」係指包含可以讓輔助型T-細胞辨識之抗原表位的多肽。輔助型T-細胞抗原表位實例包括(但不限於)：破傷風類毒素(例如：P2與P30抗原表位，亦分別稱為T2與T30)、B型肝炎表面抗原、霍亂毒素B、類毒素、白喉類毒素、麻疹病毒F蛋白質、砂眼披衣菌(Chlamydia trachomatis)主要外膜蛋白質、惡性瘧原蟲環孢子小體T (Plasmodium falciparum circumsporozite T)、惡性瘧原蟲(P. falciparum)CS 抗原、曼森血吸蟲(Schistosoma mansoni)磷酸三碳糖異構酶、百日咳博德特氏桿菌(Bordetella pertussis)、破傷風梭菌(Clostridium tetani)、雞皮衣屬地衣(Pertusaria trachythallina)、大腸桿菌(Escherichia coli) TraT、及流感病毒(Influenza virus)血球凝集素(HA)。

彼等習此相關技藝者已知之任何合適之輔助型T-細胞抗原表位均可依據本揭示內容用於本發明。根據特定實施例，輔助型T-細胞抗原表位包含至少一個選自：SEQ ID NO：23至SEQ ID NO：2所組成群中之胺基酸序列。較佳係輔助型T-細胞抗原表位包含SEQ ID NO：23至SEQ ID NO：26中兩個或更多個胺基酸序列，利用連接子(如：包含一個或多個胺基酸，例如：Val (V)、Ala (A)、Arg (R)、Gly (G)、Ser (S)、Lys (K)之肽連接子)共同稠合。連接子之長度可以變化，較佳係1-5個胺基酸。較佳係該輔助型T-細胞抗原表位包含SEQ ID NO：23至SEQ ID NO：26中三個或更多個胺基酸序列，利用一個或多個選自：VVR、GS、RR、RK所組成群中之連接子共同稠合。輔助型T-細胞抗原表位可在其C-末端醯胺化。

根據本申請案之實施例，輔助型T-細胞抗原表位可以納入脂質體表面上，例如：被共價鍵結之疏水性部份體錨定，其中該疏水性部份體為烷基、脂肪酸、三酸甘油酯、二酸甘油酯、類固醇、鞘脂、糖脂或磷脂，特定言之烷基或脂肪酸，特定言之具有至少 3個碳原子，特定言之至少 4個碳原子，特定言之至少 6個碳原子，特定言之至少 8個碳原子，特定言之至少 12個碳原子，特定言之至少 16個碳原子之碳主幹。本發明一項實施例中，疏水性部份體為棕櫚酸。或者，輔助型T-細胞抗原表位可以囊封在脂質體內。根據特定實施例，輔助型T-細胞抗原表位係囊封在脂質體內。

輔助型T-細胞抗原表位可以採用相關技藝已知之方法，依據本揭示內容，在脂質體中所需位置進行修飾。根據特定實施例，適用於本發明之輔助型T-細胞抗原表位包含SEQ ID NO：39至SEQ ID NO：44中一個胺基酸序列。較佳係輔助型T細胞抗原表位係由選自：SEQ ID NO：13至SEQ ID NO：17所組成之群組中之胺基酸序列組成。

根據特定實施例，脂質體包含tau肽及輔助型T-細胞抗原表位，其重量比為1：1、2：1、3：1、4：1、5：1或6：1。

一項實施例中，脂質體進一步包括至少一個包含toll-樣受體之配體。因此在另一項一般態樣中，本發明係有關一種脂質體，其包含： tau肽，較佳係tau磷酸肽；輔助型T-細胞抗原表位；及 toll-樣受體9配體與toll-樣受體4配體中至少一者。

所採用術語「toll-樣受體」或「TLR」係指一種型態辨識受體(PRR)蛋白質類，其在先天免疫反應中扮演關鍵角色。TLR辨識來自微生物病原體(如：細菌、真菌、寄生蟲、與病毒)之病原體相關分子型態(PAMP)，其可以與宿主分子區分。TLR為跨膜蛋白質，其通常呈二聚體發揮功能，且係由涉及先天免疫反應之細胞表現，包括呈現抗原之樹狀細胞及吞噬性巨噬細胞。至少有十種人類 TLR家族成員：TLR1至TLR10，至少有十二種囓齒類TLR家族成員：TLR1至TLR9 及TLR11至TLR13，其等差異在於其等所辨識之抗原種類。例如：TLR4辨識脂多醣(LPS)(其係一種存在於許多種格蘭陰性(Gram-negative)細菌中之組份)，及病毒蛋白質、多醣、及內因性蛋白質，如：低密度脂蛋白、β-防禦素與熱休克蛋白質；及TLR9為核苷酸感測性TLR，其被未甲基化之胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CpG)單股或雙股二核苷酸激活，其等豐富存在於原核細胞生物基因體中，但罕見於脊椎動物基因體中。TLR激活後，造成一系列訊號傳導事件，導致產生I型干擾素(IFN)、發炎細胞素、及趨化素，並誘發免疫反應。最後此發炎亦激活後天免疫系統，進而清除入侵的病原體及感染的細胞。

本文所採用術語「配體」係指與生物分子(例如：受體)形成複合物之分子，以提供生物目的。根據特定實施例，toll-樣受體配體為toll-樣受體促效劑。

本文所採用術語「促效劑」係指會與一個或多個TLR結合並誘發受體所介導反應之分子。例如：促效劑可以誘發、刺激、提高、激活、促進、加強、或上調受體之活性。此等活性稱為「促效活性」。例如：TLR4或TLR9促效劑可以透過結合之受體來激活或提高細胞訊號傳導。促效劑包括(但不限於)：核酸、小分子、蛋白質、碳水化合物、脂質或任何可與受體結合或交互作用之其他分子。促效劑可以模擬天然受體配體之活性。促效劑可以在序列、構形、電荷或其他特性上與此等天然受體配體為同種，因此其等可以被受體辨識。此辨識結果造成細胞內的生理及/或生化變化，因此細胞會依如同存在之天然受體配體一般，與存在的促效劑反應。根據特定實施例，toll-樣受體促效劑為toll-樣受體4促效劑與toll-樣受體9促效劑中至少一者。

本文所採用術語「toll-樣受體4促效劑」係指其作用為TLR4之促效劑之任何化合物。彼等習此相關技藝者依據本揭示內容已知之任何合適toll-樣受體4促效劑均可用於本發明。適用於本發明之toll-樣受體4配體實例包括TLR4促效劑包括(但不限於)：單磷醯基脂質 A (MPLA)。本文所採用術語「單磷醯基脂質 A」或「MPLA」係指修飾型之脂質 A，其為格蘭陰性細菌脂多醣(LPS)內毒素之生物活性部份。MPLA的毒性低於LPS，但仍然維持免疫刺激活性。作為疫苗佐劑之MPLA可以同時刺激細胞及體液對疫苗抗原之反應。MPLA之實例包括(但不限於)：3-O-脫醯基-4′-單磷醯基脂質 A、單磷醯基六醯基脂質 A，3-脫醯基、單磷醯基 3-脫醯基脂質 A，及其結構上相關之變體。適用於本發明之MPLA可以採用相關技藝已知之方法得到，或從商業來源得到，如：來自Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama, USA)之3D-(6-醯基) PHAD®、PHAD®、PHAD®-504、3D-PHAD®，或來自各種不同商品來源的MPL™。根據特定實施例，toll-樣受體4促效劑為MPLA。

本文所採用術語「toll-樣受體9促效劑」係指其作用為TLR9之促效劑之任何化合物。彼等習此相關技藝者依據本揭示內容已知之任何合適toll-樣受體9促效劑均可用於本發明。適用於本發明之toll-樣受體9配體實例包括TLR9促效劑，包括(但不限於)：CpG寡核苷酸。

本文所採用術語「CpG寡核苷酸」、「CpG寡核苷酸寡去氧核苷酸」或「CpG ODN」係指包含至少一個 CpG基元之寡核苷酸。本文所採用「寡核苷酸」、「寡去氧核苷酸」或「ODN」係指由複數個連接之核苷酸單位形成之聚核苷酸。此等寡核苷酸可以從現有的核酸來源取得或可採用合成方法製得。本文所採用術語「CpG基元」係指核苷酸序列中包含利用磷酸酯鍵或磷酸二酯主幹或其他核苷酸間鍵結所連接之未甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CpG)二核苷酸(亦即胞嘧啶 (C)接著鳥嘌呤(G))。

根據特定實施例，CpG寡核苷酸係脂質化，亦即已接合(共價鍵結)脂質部份體。

本文所採用「脂質部份體」係指包含親脂性結構之部份體。脂質部份體，如：烷基、脂肪酸、三酸甘油酯、二酸甘油酯、類固醇、鞘脂、糖脂或磷脂，特定言之固醇，如：膽固醇，或脂肪酸，當附接高度親水性分子(如：核酸)時，可以實質上加強血漿蛋白質結合性，因此延長親水性分子之循環半衰期。此外，與某些血漿蛋白質(如：脂蛋白)結合，已顯示可以使表現對應脂蛋白受體(例如：LDL-受體、HDL-受體或清道夫受體SR-B1)之特異組織提高吸收性。特定言之，接合至磷酸肽及/或 CpG寡核苷酸之脂質部份體可以讓該肽及/或寡核苷酸利用疏水性部份體錨定在脂質體之膜內。

根據特定實施例，依據本揭示內容，CpG寡核苷酸可包含任何合適核苷酸間鍵結。

本文所採用術語「核苷酸間鍵結」係指兩個核苷酸透過其由磷原子組成的糖及相鄰核苷之間之帶電荷或中性基團連接之化學鍵結。核苷酸間鍵結包括磷酸二酯(po)、硫代磷酸酯(ps)、二硫代磷酸酯(ps2)、甲基膦酸酯(mp)、及甲基硫代磷酸酯(rp)。硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及甲基硫代磷酸酯為安定之核苷酸間鍵結，而磷酸二酯為天然存在的核苷酸間鍵結。寡核苷酸硫代磷酸酯通常合成為Rp與Sp硫代磷酸酯連接之隨機消旋性混合物。

彼等習此相關技藝者已知之任何合適CpG寡核苷酸均可依據本揭示內容用於本發明。此等CpG寡核苷酸實例(但不限於)：CpG2006 (亦稱為CpG 7909)、CpG 1018、CpG2395、CpG2216、CpG1826或CpG2336。

CpG寡核苷酸可以採用相關技藝已知之方法，依據本揭示內容進行脂質化。有些實施例中，CpG寡核苷酸之3’ 末端係利用磷酸酯鍵，視需要利用PEG 連接子，共價鍵結至膽固醇分子。其他親脂性部份體亦可共價鍵結至CpG寡核苷酸之3’ 末端。例如：CpG寡核苷酸可以視需要利用PEG 連接子，共價鍵結至與來自脂質體之磷脂相同長度之脂質錨：一個棕櫚酸鏈(使用Pal-OH或類似物，激活以供偶合)或兩個棕櫚酸(例如：使用1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(琥珀醯基)或類似物，激活以供偶合)。參見例如：美國專利案案號7,741,297之相關揭示內容，其內容已以引用方式併入本文中。PEG之長度可以在例如：1至5個PEG單位之間變化。

其他連接子亦可用於共價連結CpG寡核苷酸與親脂性部份體(如：膽固醇分子)，其實例包括(但不限於)：具有3至12個碳之烷基間隔基。需要符合寡核苷酸化學之短的連接子，如：胺基二醇。有些實施例中，不使用連接子進行共價鍵結。參見例如：Ries等人，「Convenient synthesis and application of versatile nucleic acid lipid membrane anchors in the assembly and fusion of liposomes, Org. Biomol. Chem., 2015, 13, 9673」，其相關內容已以引用方式併入本文中。

根據特定實施例，適用於本發明之脂質化CpG寡核苷酸包含選自：SEQ ID NO：18至 SEQ ID NO：22所組成群中之核苷酸序列，其中核苷酸序列包含一個或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結，及核苷酸序列係利用連接子，與至少一個膽固醇共價鍵結。任何合適連接子均可用於共價鍵結CpG寡核苷酸與膽固醇分子。較佳係連接子包含聚乙二醇(PEG)。

根據特定實施例，脂質體包含： tau磷酸肽；輔助型T-細胞抗原表位；脂質化CpG寡核苷酸；及 toll-樣受體4配體；其中tau磷酸肽係存在於脂質體表面上，及輔助型T-細胞抗原表位係囊封在脂質體中。

根據特定實施例，脂質體包含： tau肽，其具有選自下列所組成之群組中之胺基酸序列：SEQ ID NO：27至 SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：31至 SEQ ID NO：38；輔助型T細胞抗原表位，其具有選自下列所組成之群組中之胺基酸序列：SEQ ID NO：39至 SEQ ID NO：44，較佳係由選自：SEQ ID NO：13至SEQ ID NO：17所組成之群組中之胺基酸序列組成之輔助型T細胞抗原表位；脂質化CpG寡核苷酸，其具有選自下列所組成之群組中之核苷酸序列：SEQ ID NO：18至 SEQ ID NO：22，其中CpG寡核苷酸包含一個或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結，及CpG寡核苷酸係利用連接子與至少一個膽固醇共價鍵結；及單磷醯基脂質 A (MPLA)。

根據特定實施例，脂質體進一步包括一個或多個選自下列所組成之群組中之脂質：1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DMPC)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油基-3-磷醯基-3’-rac-甘油(DMPG)、及膽固醇。

根據特定實施例，脂質體進一步包含緩衝劑。彼等熟習此相關技藝者依據本揭示內容已知之任何合適緩衝劑均可用於本發明中。一項實施例中，脂質體包含磷酸鹽緩衝劑生理食鹽水。根據特定實施例，緩衝劑包含組胺酸與蔗糖。

根據特定實施例，脂質體包含DMPC、DMPG、膽固醇、tau磷酸肽與輔助型T-細胞抗原表位，其莫耳比例為9：1：7：0.07：0.04。

本發明脂質體可以採用相關技藝已知之方法，依據本揭示內容製成。

本申請案脂質體實例包含tau四棕櫚醯基化磷酸肽(pTau肽 T3，SEQ ID NO：28)，其利用tau肽每個末端的兩個棕櫚酸，存在於脂質體表面上；包含脂質化CpG (佐劑 CpG7909-Chol)的TLR-9配體，其利用共價鍵結之膽固醇納入脂質體膜中；納入膜中之TLR-4配體(佐劑 3D-(6-醯基) PHAD®)；及囊封之輔助型T-細胞抗原表位 (PAN-DR結合劑T50)。

接合物

接合物係用於本申請案之追加組成物。適用於本發明方法之接合物包含tau肽，較佳係tau磷酸肽，及與其接合之免疫原性載劑。

根據特定態樣，接合物具有下列結構式：

, 或式(II)結構：

其中 x為整數0至10； n為整數2至15，較佳係3-11；載劑代表免疫原性載劑；及 Tau肽代表tau磷酸肽。

根據特定實施例，x為整數1至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、或2至3。根據特定實施例，x為3。

根據特定實施例，n為2至15、3至11、3至9、3至8、或3至7。

根據特定實施例，接合物包含一個或多個tau肽。根據特定實施例，接合物之tau肽可以相同或不同。

根據特定實施例，依據本揭示內容，任何合適tau肽均可用於本發明。根據特定實施例，一個或多個tau肽包含SEQ ID NO：1-12中一個胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：1-12中一個胺基酸序列為至少 75%、80%、85%、90%或95%一致之胺基酸序列，其中沒有任何胺基酸殘基，或有一個或多個胺基酸殘基為磷酸化。

根據特定實施例，一個或多個tau肽為tau磷酸肽。根據特定實施例，一個或多個tau磷酸肽包含SEQ ID NO：1-3或5-12中一個胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：1-3或5-12中一個胺基酸序列為至少 75%、80%、85%、90%或95%一致之胺基酸序列，其中一個或多個所指之胺基酸殘基為磷酸化。

根據特定實施例，tau磷酸肽係由SEQ ID NO：1-3中一個胺基酸序列組成。

本文所採用術語「免疫原性載劑」係指可與tau肽偶合之免疫原性物質。與tau肽偶合之免疫原性部份體可誘發免疫反應，並引發產生可以特異性結合tau肽之抗體。免疫原性部份體為操作性部份體，其包括可被識為外來物的蛋白質、多肽、醣蛋白、複合多醣、粒子、核酸、聚核苷酸，及類似物，藉以引發宿主之免疫反應。彼等習此相關技藝者依據本揭示內容已知之任何合適免疫原性載劑均可用於本發明。根據特定實施例，免疫原性載劑為鎖孔貝血藍蛋白(KLH)、破傷風類毒素、CRM197(無毒型白喉毒素)、來自腦膜炎雙球菌(N. meningitidis )之外膜蛋白質混合物(OMP)，或其衍生物。根據特定實施例，免疫原性載劑為KLH或CRM197。

根據特定實施例，tau肽係利用連接子與載劑接合。本文所採用術語「連接子」係指連接免疫原性載劑與tau肽之化學部份體。彼等習此相關技藝者依據本揭示內容已知之任何合適連接子均可用於本發明。連接子可為例如：單一共價鍵、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之雜烷基部份體、聚乙二醇(PEG)連接子、肽連接子、基於糖之連接子、或可裂解之連接子(如：二硫醚連接或蛋白酶裂解位點)、或胺基酸、或其組合。連接子實例可包含一個或多個聚乙二醇(PEG)、3-(溴乙醯胺基)丙酸琥珀醯亞胺基酯(SBAP)、間馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)、或一個或多個胺基酸，如：Cys、Lys或有時候指Ser或Thr，或其組合。

根據特定實施例，連接子包含(C₂ H₄ O)x -半胱胺酸-乙醯胺基丙醯胺或間馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯– 半胱胺酸– (C₂ H₄ O)x，其中x為整數0至10，如：0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。

根據特定實施例，載劑係利用連接子共價鍵結至tau肽之N-末端。

根據其他特定實施例，載劑係利用連接子，共價鍵結至tau肽之C-末端。

根據特定實施例，接合物具有如下結構：

, 其中n為整數2至15，較佳為3-11，更佳為3-7。

本發明接合物可以採用相關技藝已知之方法依據本揭示內容製造。例如：上述接合物可以由琥珀醯亞胺基-3-(溴乙醯胺基)丙酸酯(SBAP)：

與CRM197之胺基反應，形成醯胺連接。此CRM197 前驅物隨後再與tau肽(例如：SEQ ID NO：2磷酸化tau肽)反應，在其N-末端或其C-末端接合具有一個游離親核性硫醇基之PEG-半胱胺酸連接子，形成tau磷酸肽接合物。

根據本申請案實施例之接合物實例包含多重tau磷酸肽(pTau肽 T3.76)共價鍵結至載劑蛋白質CRM197。

醫藥組成物

脂質體與接合物係呈醫藥組成物投予個體。醫藥組成物為包含醫療有效量之脂質體之組成物或包含醫療有效量之本發明接合物之組成物，其分別併用醫藥上可接受之載劑。醫藥上可接受之載劑包括相關技藝已知之賦形劑及/或載劑(參見Remington’s Pharmaceutical Science (第15版), Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1980)。醫藥組成物之較佳調配物係依計畫投藥模式及醫療用途而定。組成物可包括醫藥上可接受之無毒性載劑或稀釋劑，其定義為常用於調配供投予動物或人類之醫藥組成物之媒劑。所選擇之稀釋劑不會影響該組合之生物活性。此等稀釋劑實例為蒸餾水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、林格氏溶液(Ringer’s solution)、右旋糖溶液、與漢克氏溶液(Hank’s solution)。此外，醫藥組成物或調配物亦可包括其他載劑、佐劑、或無毒性、非醫療性、非免疫原性之安定劑，及類似物。咸了解，載劑、賦形劑或稀釋劑之特性將隨針對特定用途之投藥途徑而定，例如：肌內、皮下、經口、皮內、皮膚、黏膜內(例如：腸)、鼻內或腹膜內途徑。包括在醫藥組成物中之醫藥上可接受之載劑較佳係適合肌內投藥。

醫藥組成物可以依據相關技藝習知之方法調配成疫苗(亦稱為「免疫原性組成物」)，如：初免組成物或追加組成物。

醫藥組成物可以包含相同免疫原性tau肽之混合物。或者，醫藥組成物可以包含不同的本發明免疫原性tau肽之混合物。

另一個與對抗神經元性疾病之疫苗相關的問題為似乎需要特別高的抗體效價才可確保效力。此點係因為該疫苗的目標抗原位於腦內。腦部被一個稱為血腦障壁(BBB)的特異化細胞結構，與循環隔開。BBB阻擋來自循環的物質通過進入腦部。此舉防止毒素、微生物，等等入侵中樞神經系統。BBB亦具有防止免疫調控物(如：抗體)有效進入腦部周圍的間質與腦脊髓液的較不令人期待的潛在作用。

全身循環中有約0.1%抗體會通過BBB，進入腦部。此表示利用靶向CNS 抗原之疫苗所誘發之全身效價必需比最低有效效價高出至少 1000倍才可以在腦部產生效力。

根據特定實施例，本發明醫藥組成物因此進一步包含一或多種合適佐劑。因此，呈脂質體或接合物存在之本發明tau肽可以與合適佐劑組合投藥，以在個體中達成所需免疫反應。合適佐劑可以在使用本發明脂質體或接合物投藥之前、之後，或同時投予。較佳佐劑可加強對免疫原的內因性反應，不會引發可能影響反應品質之免疫原構形變化。佐劑實例為鋁鹽(alum)，如：氫氧化鋁、磷酸鋁、與硫酸鋁。其他佐劑實例包括CpG，如：CpG2006 (亦稱為CpG 7909)、CpG 1018、CpG2395、CpG2216、CpG1826或CpG2336。此等佐劑可以併用或不併用其他特異性免疫刺激劑，如：MPLA類(3 脫O-醯基化之單磷醯基脂質 A (MPL™)、單磷醯基六醯基脂質 A，3-脫醯基合成性(3D-(6-醯基) PHAD®)、PHAD™、PHAD®-504、3D-PHAD®)脂質 A、聚合或單體胺基酸，如：聚麩胺酸或聚離胺酸。此等佐劑可以併用或不併用其他特異性免疫刺激劑，如：胞壁醯基肽(例如：N-乙醯基胞壁醯基-L-蘇胺醯基-D-異麩醯胺(thr-MDP)、N-乙醯基-去甲基胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺(nor-MDP)、N-乙醯基胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺基-L-丙胺酸-2-(1′-2′ 二棕櫚醯基-sn-甘油基-3-羥基磷醯基氧)-乙基胺(MTP-PE)、N-乙醯基葡糖胺基-N-乙醯基胞壁醯基-L-Al-D-isoglu-L-Ala-二棕櫚醯基氧丙醯胺(DTP-DPP) Theramide™)、或其他細菌細胞壁組份。水包油型乳液包括MF59 (參見WO 90/14837)，包含5%鯊烯、0.5% Tween 80、與0.5% Span 85 (視需要包含各種不同含量之MTP-PE)，使用微射流器調配成小於微米的粒子；SAF，包含10%鯊烯、0.4% Tween 80、5% 泊洛沙姆(pluronic)-嵌段聚合物L121、及thr-MDP，其係經過微射流法調配成小於微米的乳液或渦轉產生較大粒度之乳液；及Ribi™佐劑系統 (RAS) (Ribi ImmunoChem, Hamilton, Mont.) 0.2% Tween 80，及選自下列所組成之群組中之一或多種細菌細胞壁組份：單磷醯基脂質 A (MPL™)、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)、及細胞壁骨架(CWS)，較佳係MPL™ +CWS (Detox™)。其他佐劑包括完全弗氏佐劑(Complete Freund’s Adjuvant)(CFA)，與細胞素，如：介白素(IL-1、IL-2、與IL-12)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、與腫瘤壞死因子(TNF)。

本文所採用術語「醫療有效量」係指可在個體中引發所需生物或醫學反應之活性成份或組份的量。醫療有效量可以依例行方式，以所述目的之相關實驗決定。例如：可視需要採用活體外分析法協助判斷最佳劑量範圍。彼等習此相關技藝者依據數項因素考量即可以(例如：透過臨床試驗)決定所選擇之特定有效劑量。此等因素包括所治療或預防之疾病、所涉及之症狀、患者體質量、患者之免疫狀態及習此相關技藝者已知之其他因素。調配物中採用之精確劑量亦依投藥途徑，及疾病嚴重性而定，且應根據操作者的判斷及每位患者的環境決定。可以從活體外或動物模式試驗系統推衍之劑量-效應曲線，外插得到有效劑量。

某些實施例中，「醫療有效量」為「免疫有效量」，其意指組成物在有此需要之個體中足以誘發所需免疫效應或免疫反應時之量。一項實施例中，免疫原性有效量意指足以在有此需要之個體中誘發免疫反應時之量。另一項實施例中，免疫原性有效量意指足以在有此需要之個體中產生免疫力時之量，例如：提供醫療效力來對抗神經退化性疾病、疾患或病症。免疫原性有效量可以隨不同因素變化，如：個體的身體條件、年齡、體重、健康，等等。免疫原性有效量很容易由習此相關技藝依據本揭示內容決定。

一項實施例中，免疫原性組成物為用於引發初次免疫反應之初免組成物，其係在投予追加組成物之前投予。根據本發明實施例，初免組成物包含免疫有效量之本文所說明脂質體。根據本發明實施例，免疫原性組成物為用於加強免疫反應之追加組成物，其係在投予追加組成物之後投予。根據本發明實施例，追加組成物包含免疫有效量之本文所說明接合物。根據本申請案之實施例，包含免疫有效量之本文所說明脂質體之免疫原性組成物可同時用為用於引發初次免疫反應之初免組成物及用於加強免疫反應之追加組成物。初免組成物可以與一或多個追加組成物組合使用。追加組成物可以投予超過一次。

本文在對個體投予兩種或更多種療法之內容中，所採用術語「組合」係指採用超過一種療法。所使用術語「組合」不限制投予個體之療法順序。例如：第一種療法(例如：本文所說明脂質體組成物)可以在投予第二種療法(例如：本文所說明接合物組成物)之前(例如：5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、16小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週、12週或更久之前)、同時、或之後(例如：5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、16小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週、12週或更久之後)投予個體。

本發明醫藥組成物可以根據相關技藝習知之方法調配。組成物中各組份之最佳比例可由彼等習此相關技藝者依據本揭示內容已知之技術決定。

某些實施例中，醫藥組成物包含本文所說明脂質體及緩衝劑，其包含一或多種胺基酸(如：組胺酸或甘胺酸)與/或一或多種碳水化合物(如：葡萄糖或蔗糖)。

其他實施例中，醫藥組成物包含本文所說明接合物及及緩衝劑，其包含一或多種胺基酸(如：組胺酸或甘胺酸)、一或多種碳水化合物(如：葡萄糖或蔗糖)、及/或界面活性劑(如：聚山梨酸酯80、聚山梨酸酯20，等等)。

使用方法

本發明提供一種使用包含tau肽之脂質體疫苗及包含接合至免疫原性載劑之tau肽之接合物疫苗，對罹患神經退化性疾患個體進行初免及加強對抗tau蛋白質之免疫反應之方法。

一項一般態樣中，一種為罹患神經退化性疾患之個體誘發對抗tau蛋白質之免疫反應之方法，其包括：對該個體投予包含免疫有效量的脂質體之初免組成物，該脂質體包含：第一tau磷酸肽；輔助型T-細胞抗原表位；脂質化CpG寡核苷酸；及包含toll-樣受體4配體之佐劑；其中tau磷酸肽存在於脂質體之表面上，及初免組成物進一步包含醫藥上可接受之載劑；及對該個體投予包含免疫有效量接合物之第一追加組成物，該接合物包含第二tau磷酸肽及利用連接子與其接合之免疫原性載劑，該接合物具有式(I)結構：

或具有式(II)結構：

其中 x為整數0至10，較佳係2至6，最佳係3； n為整數3至15，較佳係3至12；載劑代表選自下列各物組成之群中之免疫原性載劑：鎖孔貝血藍蛋白(KLH)、破傷風類毒素、CRM197及來自腦膜炎雙球菌(N. meningitidis )之外膜蛋白質混合物(OMP)，或其衍生物；及 Tau肽代表第二tau磷酸肽，及第一追加組成物進一步包含醫藥上可接受之載劑，其中第一tau磷酸肽與第二tau磷酸肽分別獨立具有選自下列各物所組成群中之胺基酸序列：SEQ ID NO：1至 SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：5至 SEQ ID NO：12。

某些實施例中，免疫有效量之接合物係與一或多種佐劑(如：本文所說明彼等佐劑)共同投予。一項實施例中，免疫有效量之接合物係與一或多種鋁鹽(alum)(如：氫氧化鋁、磷酸鋁、與硫酸鋁)、及/或一或多種CpG，如：CpG2006 (亦稱為CpG 7909)、CpG 1018、CpG2395、CpG2216、CpG1826或CpG2336投予。

某些實施例中，第一tau磷酸肽與第二tau磷酸肽相同。其他實施例中，第一tau磷酸肽與第二tau磷酸肽不同，較佳係其等共享至少一個共通抗原表位。

某些實施例中，該方法進一步包括對個體投予包含免疫原性有效量脂質體之第二追加組成物。

根據特定態樣，該免疫反應係誘發對抗磷酸化tau蛋白質，較佳係ePHF之抗體。

某些實施例中，第一追加組成物係在投予初免組成物之後約27-32天，如：約27、28、29、30、21或32天投予。某些實施例中，第一追加組成物係在投予初免組成物之後約82-87天，如：約82、83、84、85、86或87天再度投予。某些實施例中，包含免疫原性有效量脂質體之第二追加組成物係在投予初免組成物之後約167-172天，如：約167、168、169、170、171或172天投予。.

某些實施例中，第一追加組成物係在投予初免組成物之後約82-87天，如：約82、83、84、85、86或87天投予。某些實施例中，第二追加組成物係在投予初免組成物之後約27-32天，如：約27、28、29、30、21或32天投予。某些實施例中，第一追加組成物係在投予初免組成物之後約167-172天，如：約167、168、169、170、171或172天再度投予。

習此相關技藝者可以依據本文所教示及臨床經驗，改變初免及追加組成物之精確時程、其投藥頻率、其劑量，等等。

本文所說明任何初免與追加組成物均可用於罹患神經退化性疾患之個體中，誘發對抗tau蛋白質之免疫反應。本發明方法可使用之初免組成物；追加組成物；脂質體；及/或接合物，等等實施例已於上文及下文例示實例中詳細討論。

本文所採用術語「誘發」與「刺激」及其變化係指在細胞活性上任何可量測之升幅。誘發免疫反應可以包括例如：免疫細胞族群之激活、增殖、或成熟、增加產生細胞素及/或提高免疫功能之另一種指標物。某些實施例中，誘發免疫反應可以包括提高B細胞增殖、產生抗原-特異性抗體、提高抗原-特異性T細胞增殖、改善樹狀細胞抗原呈現及/或提高某些細胞素、趨化素及共同刺激性標記物之表現。

當投予動物或人類生物體時，可以採用相關技藝之各種不同標準分析法，於活體外或活體內評估誘發或刺激抗-tau 免疫反應之能力。可用於評估免疫反應之啟動及活化之一般技術說明參見例如：Coligan等人 (1992與1994, Current Protocols in Immunology；編輯J Wiley & Sons Inc, National Institute of Health)。可以採用相關技藝習知之方法測定細胞免疫力，例如：測定已激活之效應細胞(包括彼等衍生自CD4+與CD8+ T-細胞)所分泌細胞素型態(例如：採用ELISPOT 定量生產IL-4或IFNγ之細胞)、測定免疫效應細胞之活化狀態(例如：採用典型[3H]胸苷吸收法分析T-細胞增殖)、於敏化個體中分析抗原-特異性T淋巴細胞(例如：於細胞毒性分析法中之肽-特異性溶胞作用，等等)。

可以在來自個體之生物檢體(例如：血液、血漿、血清、PBMC、尿液、唾液、糞便、CSF或淋巴液)中測試所投予醫藥組成物中針對免疫原性tau肽(群)之抗體之存在，來測定刺激細胞及/或體液反應之能力 (參見例如： Harlow, 1989, Antibodies, Cold Spring Harbor Press)。例如：投予可提供免疫原之組成物時，所因映產生之抗體效價可以採用酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)、Meso scale Discovery (MSD)、墨點法、SDS-PAGE凝膠、ELISPOT或抗體依賴型細胞吞噬作用(Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis)(ADCP)分析法測定。

本發明提供一種為有此需要之個體治療或預防神經退化性疾病或疾患之方法，其係使用包含tau肽之脂質體疫苗及包含tau肽接合至免疫原性載劑之接合物疫苗。

習此相關技藝者可以依據本文之教示及臨床經驗，改變追加組成物、初免與追加組成物的精確時程、其投藥頻率、其劑量，等等。

本文所說明任何初免與追加組成物均可用於為有此需要之個體治療或預防神經退化性疾病或疾患之方法中。本發明方法可使用之初免組成物；追加組成物；脂質體；及/或接合物，等等實施例已於上文及下文例示實例中詳細討論。

本文所採用術語「個體」係指動物。根據特定實施例，個體為哺乳動物，包括非靈長類(例如：駱駝、驢、斑馬、乳牛、豬、馬、山羊、綿羊、貓、狗、大鼠、兔、天竺鼠或小鼠)或靈長類(例如：猴、黑猩猩或人類)。根據特定實施例，個體為人類。

本文所採用術語「處理」、「治療」(treat、treating與treatment)均意指減緩或逆轉與神經退化性疾病、疾患、或病症相關之至少一種不一定要在個體中分辨出，但可在個體中分辨出的可量測參數。術語「處理」、「治療」亦可指造成疾病、疾患、或病症消退、阻止其演進、或至少減慢其演進。特定實施例中，「處理」、「治療」係指緩和與神經退化性疾病、疾患、或病症相關之一或多種症狀、預防其發展或發作、或縮短其持續時間。特定實施例中，「處理」、「治療」係指預防疾病、疾患、或病症復發。特定實施例中，「處理」、「治療」係指提高罹患疾病、疾患、或病症之個體之存活。特定實施例中，「處理」、「治療」係指消除個體之疾病、疾患、或病症。

根據特定實施例，醫療有效量係指足以達成以下1、2、3、4項或更多項效應之醫療量：(i)減輕或緩解所治療疾病、疾患或病症、或其相關症狀之嚴重性；(ii)縮短所治療疾病、疾患或病症、或其相關症狀之持續時間；(iii)預防所治療疾病、疾患或病症、或其相關症狀演進；(iv)造成所治療疾病、疾患或病症、或其相關症狀消退；(v)預防所治療疾病、疾患或病症、或其相關症狀之發展或發作；(vi)預防所治療疾病、疾患或病症、或其相關症狀復發；(vii)減少罹患所治療疾病、疾患或病症、或其相關症狀之個體住院；(viii)縮短罹患所治療疾病、疾患或病症、或其相關症狀之個體的住院時間；(ix)延長罹患所治療疾病、疾患或病症、或其相關症狀之個體之存活；(xi)抑制或減輕個體中所治療疾病、疾患或病症、或其相關症狀；及/或(xii)加強或改善另一種療法之預防或醫療效力。

本文所採用「神經退化性疾病、疾患、或病症」包括彼等習此相關技藝者依據本揭示內容已知之任何神經退化性疾病、疾患、或病症。神經退化性疾病、疾患、或病症包括由形成神經纖維病灶所引起或與形成神經纖維病灶有關之神經退化性疾病或疾患，如：tau-相關疾病、疾患或病症，稱為tau蛋白病變。根據特定實施例，神經退化性疾病、疾患、或病症包括顯示共同存在tau與類澱粉病變之任何疾病或疾患，包括(但不限於)：阿茲海默症、帕金森氏症(Parkinson’s Disease)、庫賈氏症(Creutzfeldt-Jakob Disease)、拳擊手型失智症(Dementia pugilistica)、唐氏症候群(Down Syndrome)、吉斯曼-史特斯勤-先克症(Gerstmann-Sträussler-Scheinker Disease)、包涵體肌炎、普利昂蛋白(prion)腦部類澱粉血管病變、創傷性腦損傷、肌萎縮性側索硬化症、關島震顫麻痺失智綜合症(parkinsonism-dementia complex of Guam)、具有神經纖維纏結之非關島型運動神經元疾病(Non-Guamanian motor neuron disease with neurofibrillary tangles)、嗜銀顆粒性失智症、腦皮質基底核退化症、路易氏體失智型肌萎縮性側索硬化症、出現鈣化之瀰漫性神經纖維纏結、額顳型失智症，較佳係出現與染色體17相關之帕金森症候群(parkinsonism)之額顳型失智症(FTDP-17)、額顳葉失智症、哈雷狛登-斯巴茲症(Hallevorden-Spatz disease)、多重系統退化症、C型尼曼匹克症(Niemann-Pick disease)、匹克症(Pick’s disease)、進行性皮質下膠質增生、進行性核上眼神經麻痺症、亞急性硬化性全腦炎、僅有神經纏結之失智(Tangle only dementia)、腦炎後帕金森症候群、萎縮性肌強直、慢性創傷性腦病變(CTE)、腦血管病變或路易體失智症(Lewy body dementia)(LBD)。根據特定實施例，神經退化性疾病、疾患、或病症為阿茲海默症或另一種tau蛋白病變。

阿茲海默症之臨床過程可以依據認知力與功能損傷的演進型態分級。可以採用相關技藝已知之分級量表(包括例如：NIA-AA Research Framework)界定等級。參見例如：Dubois等人，Alzheimer’s & Dementia 12 (2016) 292-323, Dubois等人，Lancet Neurol 2014； 13: 614–29, Jack等人，Alzheimer’s & Dementia 14 (2018) 535-562 ，其完整內容已以引用方式併入本文中。

根據較佳實施例，神經退化性疾病、疾患、或病症為早發性阿茲海默症、因阿茲海默症造成之輕度認知力損傷(MCI)、輕度阿茲海默症、或輕度至中度阿茲海默症。

有些實施例中，需要治療之個體為腦中出現類澱粉陽性反應，但尚未出現顯著認知力損傷。腦中的類澱粉沉積可以採用相關技藝已知之方法檢測，如：PET掃瞄、免疫沉澱質譜儀或其他方法。

本發明亦提供一種促進個體腦部清除tau 集結物之方法，該方法包括在可以有效促進清除個體腦部tau 集結物之條件下，對該個體投予根據本發明實施例之醫藥組成物。根據特定實施例，tau 集結物為神經纖維纏結或其病理性tau 前驅物。

本發明亦提供一種減慢個體中與tau蛋白病變相關之行為表型演進之方法，該方法包括在可以有效減慢個體中與tau蛋白病變相關之行為表型演進之條件下，對該個體投予根據本發明實施例之醫藥組成物。

本發明較佳實施例中，藉由投予根據本發明一項實施例之醫藥組成物來投予tau肽，誘發個體對tau肽及對病理型tau之主動免疫反應，藉以促進清除相關tau 集結物，減慢tau蛋白病變相關行為的演進及/或治療原有的tau蛋白病變。依據本發明此態樣，免疫反應涉及發展出對抗tau肽之有利的體液性(humoral)(抗體介導)反應及對抗T-細胞抗原表位或免疫原性載劑之細胞(抗原-特異性T細胞或其分泌產物所介導)反應。

本文所採用tau蛋白病變相關行為表型包括(但不限於)：認知力損傷、早期人格改變及失控、冷漠、意志缺失、緘默、失用症、持續行為、刻板動作/行為、貪食、混亂、無能力計畫或組織循序作業、自私/麻木冷淡、反社會特質、缺乏移情、蹣跚、經常出現言語錯誤的語法錯亂但仍保有相當理解力、理解力受損及詞彙搜索困難、緩進型步態失穩、後退、僵住、經常跌倒、非左多巴反應性軀幹僵硬(non-levodopa responsive axial rigidity)、核上凝視麻痺、對稱性眼震、眼球垂直方向運動變慢、假性延髓性麻痺、四肢失用症、肌張力不全症、皮質功能損失、與震顫。

進行本發明方法時，較佳係選擇患有或有風險患有阿茲海默症或其他tau蛋白病變之個體、腦部具有tau 集結物之個體、或在接受投予本發明免疫原性肽或抗體之前即出現纏結相關行為表型之個體。可以接受治療之個體包括處於罹病風險但尚未出現症狀之個體，及目前已有症狀的患者。以阿茲海默症為例，實際上任何人均有罹患阿茲海默症之風險。因此，本方法可以預防性投藥給一般大眾，不需要任何評估患者個體之風險。本方法尤其適用於已知具有阿茲海默症遺傳風險之個體。此等個體包括彼等家屬已經歷該疾病者，及彼等藉由分析遺傳及生化標記物而判定有風險者。

無症狀之患者中，可在任何年齡開始治療(例如：10、20、30歲)。然而，通常不一定要患者達到40、50、60、或70歲才開始治療。通常在一段時間內需要多重劑量治療。可以藉由隨時間分析抗體、或活化之T-細胞或B-細胞對醫療劑之反應來追蹤治療。若反應下降，則表示需要追加劑量。

在預防性應用中，對容易罹患或有風險罹患阿茲海默症或其他tau蛋白病變之患者投予包含tau肽之醫藥組成物，其投藥量足以消除或降低疾病之風險、減輕嚴重性、或延緩發作，包括疾病之生化、組織及/或行為症狀、其併發症及疾病發展期間出現之中間病理表型。醫療應用中，包含tau肽之醫藥組成物係投予疑似或已罹患此等疾病之患者，其用量足以治癒或至少部份遏止疾病的症狀(生化、組織及/或行為)，包括其併發症及疾病發展期間之中間病理表型。

本發明醫藥組成物於預防及/或治療神經退化性疾病、疾患、或病症之有效劑量會隨許多不同因素變化，包括投藥模式、標靶部位、患者之生理狀態、其他投予藥物、及該治療為預防性或醫療性。醫藥組成物之用量會隨是否亦投予佐劑而定，在不使用佐劑下需要較高劑量。根據本發明方法中，對個體投予至少一次初免組成物及至少一次追加組成物。然而，當使用許多追加組成物時，各初免與追加組成物中之抗原不一定要相同，但應具有共通的抗原決定基或實質上彼此類似。

彼等習此相關技藝者咸了解，可以依據投藥後測定之免疫反應來調整初免及追加投藥的療程。例如：追加組成物通常在投予初免組成物後數週或數個月投予，例如：投予初免組成物後約2週、或約3週或約4週、或約8週、或約12週、或約16週、或約20週、或約24週、或約26週、或約28週、或約30週或約32週或約36週或約一至兩年。

醫藥組成物可依非經腸式、局部、靜脈內、經口、皮下、動脈內、顱內、腹膜內、皮內、鼻內、或肌內等方式進行預防及/或醫療性處理。免疫原劑之最常見投藥途徑為皮下或肌內注射。後者注射型態最常在手臂或大腿肌肉上執行。

若需要時，組成物可呈套組、包裝或配藥器，其包含一個或多個含有活性成份之單位劑型。套組可例如：包含金屬或塑膠箔，如：泡殼包。套組、包裝、或配藥器可附加投藥說明書。

根據特定實施例，套組包含含有根據本發明實施例之脂質體之醫藥組成物及含有根據本發明實施例之接合物之醫藥組成物。實施例

本發明亦提供下列無限制性實施例。

實施例1為一種在罹患神經退化性疾患之個體中誘發對抗tau蛋白質之免疫反應，較佳係誘發對抗tau磷酸肽及/或 ePHF之抗體之方法，該方法包括：對該個體投予包含免疫有效量的脂質體之初免組成物，該脂質體包含： a. 第一tau肽；及 b. 輔助型T細胞抗原表位；其中tau肽存在於脂質體之表面上，及醫藥上可接受之載劑；及對該個體投予包含免疫有效量接合物之第一追加組成物，該接合物包含第二tau磷酸肽及利用連接子與其接合之免疫原性載劑，該接合物具有式(I)結構：

或具有式(II)結構：

其中 x為整數0至10，較佳係2至6，最佳係3；及 n為整數3至15，較佳係3至12；載劑代表免疫原性載劑；較佳係選自下列所組成之群組中之免疫原性載劑：鎖孔貝血藍蛋白(KLH)、破傷風類毒素、CRM197及來自腦膜炎雙球菌(N. meningitidis )之外膜蛋白質混合物(OMP)，或其衍生物；及 Tau肽代表第二tau磷酸肽；及第一追加組成物進一步包含醫藥上可接受之載劑。

實施例2為實施例1之方法，其中脂質體之tau肽為tau磷酸肽。

實施例3為實施例1或2之方法，其中脂質體進一步包含toll-樣受體配體。

實施例4 為實施例3之方法，其中toll-樣受體配體包含toll-樣受體4配體與toll-樣受體9配體中至少一者。

實施例5為實施例3或4之方法，其中toll-樣受體配體為toll-樣受體4配體。

實施例6為實施例5之方法，其中toll-樣受體4配體包含單磷醯基脂質 A (MPLA)。

實施例7為實施例3或4之方法，其中toll-樣受體配體為toll-樣受體9配體。

實施例8為實施例7之方法，其中toll-樣受體9配體包含脂質化CpG寡核苷酸。

實施例9為實施例1之方法，其中初免組成物包含免疫有效量之脂質體，其包含： a. tau肽； b. 輔助型T細胞抗原表位；及 c. 以下至少一者 i. toll-樣受體9配體，及 ii. toll-樣受體4配體。

實施例10為實施例9之方法，其中tau肽為tau磷酸肽。

實施例11為實施例9或10之方法，其中toll-樣受體9配體為脂質化CpG寡核苷酸。

實施例12為實施例9至11中任一項之方法，其中脂質體包含 toll-樣受體4配體與toll-樣受體9配體。

實施例13為實施例12之方法，其中toll-樣受體4配體包含單磷醯基脂質 A (MPLA)。

實施例14為實施例1之方法，其中初免組成物包含免疫有效量之脂質體，其包含： tau磷酸肽；輔助型T-細胞抗原表位；脂質化CpG寡核苷酸；及包含toll-樣受體4配體之佐劑；其中tau磷酸肽存在於脂質體之表面上。

實施例15為實施例14之方法，其中toll-樣受體4配體包含單磷醯基脂質 A (MPLA)。

實施例16為實施例1至15中任一項之方法，其中輔助型 T細胞抗原表位係囊封在脂質體中。

實施例16a為實施例1至15中任一項之方法，其中輔助型 T細胞抗原表位係納入脂質體之膜中。

實施例16b為實施例1至15中任一項之方法，其中輔助型 T細胞抗原表位存在於脂質體之表面上。

實施例17為實施例1至16b中任一項之方法，其中初免組成物包含免疫有效量之脂質體組成物，其包含： tau磷酸肽；輔助型T細胞抗原表位；脂質化CpG寡核苷酸；及單磷醯基脂質 A (MPLA)；其中tau磷酸肽係存在於脂質體表面上，及 T-細胞抗原表位係囊封在脂質體中。

實施例17a為實施例17之方法，其中MPLA為3-O-脫醯基-4′-單磷醯基脂質 A，較佳係MPL™。

實施例17b為實施例17之方法，其中MPLA為單磷醯基六醯基脂質 A，3-脫醯基，較佳係3D-(6-醯基) PHAD®)。

實施例17c為實施例17之方法，其中MPLA為單磷醯基 3-脫醯基脂質 A，較佳係3D-PHAD®。

實施例18為實施例1至17c中任一項之方法，其中初免組成物之脂質體組成物進一步包括一或多種選自下列各物所組成群中之脂質：1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DMPC)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油基-3-磷醯基-3’-rac-甘油(DMPG)、與膽固醇。

實施例19為實施例1至18中任一項之方法，其中脂質體之tau肽具有選自：SEQ ID NO：1至 SEQ ID NO：12所組成群中之胺基酸序列，或具有與選自：SEQ ID NO：1至 SEQ ID NO：12所組成群中之胺基酸序列至少 85%、90%或95%一致之胺基酸序列。

實施例19-1為實施例19之方法，其中脂質體之tau肽為包含選自：SEQ ID NO：1-3與5-12所組成群中之胺基酸序列之磷酸肽。

實施例19-2為實施例19-1之方法，其中脂質體之tau磷酸肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：1。

實施例19-3為實施例19-1之方法，其中脂質體之tau磷酸肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：2。

實施例19-4為實施例19-1之方法，其中脂質體之tau磷酸肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：3。

實施例19a為實施例19、19-1、19-2、19-3與19-4中任一項之方法，其中該胺基酸序列進一步包含一個或多個修飾，讓tau肽存在於脂質體表面上。

實施例19b為實施例19a之方法，其中一個或多個修飾包含至少一個棕櫚醯基化與十二碳烷基修飾。

實施例19c為實施例19a或19b中任一項之方法，其中脂質體之tau肽係在其N-末端經過一或多個修飾。

實施例19d為實施例19a至19c中任一項之方法，其中脂質體之tau肽係在其C-末端經過一或多個修飾。

實施例19e為實施例19d之方法，其中脂質體之tau肽在其N-末端與C-末端兩端均經棕櫚醯基化。

實施例19f為實施例19a至19e中任一項之方法，其中脂質體之tau肽進一步包括一個或多個額外胺基酸，以促進一或多個修飾。

實施例19g為實施例19f之方法，其中一個或多個額外胺基酸係選自下列組成之群組中：Lys、Cys、Ser與Thr。

實施例19h為實施例19至19g中任一項之方法，其中脂質體之tau肽係在其C-末端進行醯胺化。

實施例19i為實施例19至19h中任一項之方法，其中脂質體之tau肽係由選自：SEQ ID NO：27至 SEQ ID NO：38所組成群中之胺基酸序列組成。

實施例19j為實施例19至19i中任一項之方法，其中脂質體之tau肽係由胺基酸序列SEQ ID NO：27組成。

實施例19k為實施例19至19i中任一項之方法，其中脂質體之tau肽係由胺基酸序列SEQ ID NO：28組成。

實施例19l為實施例19至19i中任一項之方法，其中脂質體之tau肽係由胺基酸序列SEQ ID NO：29組成。

實施例20為實施例1至19l中任一項之方法，其中脂質體之輔助型 T細胞抗原表位包含選自：SEQ ID NO：23至SEQ ID NO：26所組成群中之至少一個胺基酸序列。

實施例20a為實施例20之方法，其中輔助型 T細胞抗原表位包含選自：SEQ ID NO：23至SEQ ID NO：26所組成群中之至少兩個胺基酸序列。

實施例20b為實施例20之方法，其中輔助型 T細胞抗原表位包含選自：SEQ ID NO：23至SEQ ID NO：26所組成群中之至少三個胺基酸序列。

實施例20c為實施例20之方法，其中輔助型 T細胞抗原表位包含SEQ ID NO：23至SEQ ID NO：26中四個胺基酸序列。

實施例20d為實施例20a至20c中任一項之方法，其中選自：SEQ ID NO：23至SEQ ID NO：26所組成群中之兩個或更多個胺基酸序列係利用連接子共價鍵結。

實施例20e為實施例20d之方法，其中連接子包含一個或多個選自：Val (V)、Ala (A)、Arg (R)、Gly (G)、Ser (S)、Lys (K)所組成群中之胺基酸。

實施例20f為實施例20e之方法，其中連接子包含選自：VVR、GS、RR與RK所組成群中之胺基酸序列。

實施例20g為實施例20至20f中任一項之方法，其中輔助型 T細胞抗原表位係在其C-末端進行醯胺化。

實施例20h為實施例20至20g中任一項之方法，其中輔助型 T細胞抗原表位係經過修飾，以供嵌入脂質體之膜中、呈現於脂質體之表面上、或囊封在脂質體中，依輔助型T細胞抗原表位之預定位置而定。

實施例20i為實施例20至20h中任一項之方法，其中輔助型 T細胞抗原表位係由選自：SEQ ID NO：13至SEQ ID NO：17所組成之群組中之胺基酸序列組成。

實施例20j為實施例1至20i中任一項之方法，其中脂質體包含 tau肽與輔助型T細胞抗原表位，其重量比為6：1。

實施例20k為實施例1至20i中任一項之方法，其中脂質體包含 tau肽與輔助型T細胞抗原表位，其重量比為5：1。

實施例20l為實施例1至20i中任一項之方法，其中脂質體包含 tau肽與輔助型T細胞抗原表位，其重量比為4：1。

實施例20m為實施例1至20i中任一項之方法，其中脂質體包含 tau肽與輔助型T細胞抗原表位，其重量比為3：1。

實施例20n為實施例1至20i中任一項之方法，其中脂質體包含 tau肽與輔助型T細胞抗原表位，其重量比為2：1。

實施例20o為實施例1至20i中任一項之方法，其中脂質體包含 tau肽與輔助型T細胞抗原表位，其重量比為1：1。

實施例21為實施例1至20o中任一項之方法，其中脂質化CpG寡核苷酸包含選自：SEQ ID NO：18至 SEQ ID NO：22所組成之群組中之核苷酸序列。

實施例21a為實施例21之方法，其中CpG寡核苷酸具有一個或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結。

實施例21b為實施例21a之方法，其中CpG寡核苷酸均為硫代磷酸酯核苷酸間鍵結。

實施例21c為實施例21至21b中任一項之方法，其中脂質化CpG寡核苷酸包含CpG寡核苷酸，其利用連接子共價鍵結至至少一個親脂性基團。

實施例21d為實施例21c之方法，其中連接子包含(C₂ H₄ O)n，其中n為整數0至10。

實施例21e為實施例21c之方法，其中連接子包含具有3至12個碳之烷基間隔基。

實施例21f為實施例21至21e中任一項之方法，其中至少一個親脂性基團為膽固醇。

實施例21g為實施例21至21f中任一項之方法，其中脂質化CpG寡核苷酸包含核苷酸序列SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19，其利用包含(C₂ H₄ O)n之連接子共價鍵結至膽固醇分子，其中n為整數3至5。

實施例22為一種在罹患神經退化性疾患之個體中誘發對抗tau蛋白質之免疫反應之方法，該方法包括：對該個體投予包含免疫有效量的脂質體之初免組成物，該脂質體包含：第一tau磷酸肽，其具有選自下列所組成之群組中之胺基酸序列：SEQ ID NO：27至 SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：31至 SEQ ID NO：38；輔助型T細胞抗原表位，其具有選自下列所組成之群組中之胺基酸序列：SEQ ID NO：39至 SEQ ID NO：44，較佳係由選自：SEQ ID NO：13至SEQ ID NO：17所組成之群組中之胺基酸序列組成之輔助型T細胞抗原表位；脂質化CpG寡核苷酸，其具有選自下列所組成之群組中之核苷酸序列：SEQ ID NO：18至 SEQ ID NO：22，其中CpG寡核苷酸包含一個或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結，及CpG寡核苷酸係利用連接子與至少一個膽固醇共價鍵結；及單磷醯基脂質 A (MPLA)，及醫藥上可接受之載劑；及對該個體投予包含免疫有效量接合物之第一追加組成物，該接合物包含第二tau磷酸肽及利用連接子與其接合之免疫原性載劑，該接合物具有式(I)結構：

或具有式(II)結構：

其中 x為整數0至10，較佳係2至6，最佳係3；及 n為整數3至15，較佳係3至12；載劑代表免疫原性載劑； Tau肽代表第二tau磷酸肽；及醫藥上可接受之載劑。

實施例22a為實施例22之方法，其中脂質體包含： a. 第一tau磷酸肽，其係由胺基酸序列SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29組成； b. 輔助型T細胞抗原表位，其係由胺基酸序列SEQ ID NO：13組成； c. 脂質化CpG寡核苷酸，其係由利用包含(C₂ H₄ O)n之連接子共價鍵結至膽固醇之核苷酸序列SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19組成，其中n為整數3至7；及 d. 單磷醯基脂質 A (MPLA)。

實施例22b為實施例22或22a之方法，其中MPLA 為3-O-脫醯基-4′-單磷醯基脂質 A，較佳係MPL™。

實施例22c 為實施例22或22a之方法，其中MPLA為單磷醯基六醯基脂質 A，3-脫醯基，較佳係3D-(6-醯基) PHAD®)。

實施例22d為實施例22或22a之方法，其中MPLA為單磷醯基 3-脫醯基脂質 A，較佳係3D-PHAD®。

實施例23為實施例22至22d中任一項之方法，其中輔助型 T細胞抗原表位係囊封在脂質體中。

實施例24為實施例1至23中任一項之方法，其中x為整數2至6。

實施例25為實施例1至24中任一項之方法，其中x 為3。

實施例26為實施例1至25中任一項之方法，其中n為 3至7。

實施例27為實施例1至26中任一項之方法，其中載劑為選自下列所組成之群組中之免疫原性載劑：鎖孔貝血藍蛋白(KLH)、破傷風類毒素、CRM197、及來自腦膜炎雙球菌之外膜蛋白質混合物(OMP)，或其衍生物。

實施例28為實施例1至27中任一項之方法，其中接合物之第二tau磷酸肽係由選自：SEQ ID NO：1至 SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：5至 SEQ ID NO：12所組成之群組中之胺基酸序列組成。

實施例28a 為實施例28之方法，其中脂質體之第一tau磷酸肽與接合物之第二tau磷酸肽相同。

實施例28b為實施例28之方法，其中脂質體之第一tau磷酸肽與接合物之第二tau磷酸肽不同。

實施例28c為實施例28b之方法，其中脂質體之第一tau磷酸肽與接合物之第二tau磷酸肽共享至少一個共通抗原表位。

實施例29為實施例28至28c中任一項之方法，其中第二tau磷酸肽係由胺基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3組成。

實施例30為實施例1至29中任一項之方法，其中載劑為CRM197。

實施例31為實施例1至30中任一項之方法，其中接合物具有如下結構：

, 其中n為3-7。

實施例32為實施例1至29中任一項之接合物，其中接合物具有如下結構：

其中 Tau肽係由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3組成； x為整數0至10； n為整數2至15； Tau肽代表tau磷酸肽；及 KLH代表鎖孔貝血藍蛋白。

實施例33為實施例1至32中任一項之方法，其進一步包括對個體投予第二追加組成物，其包含免疫原性有效量之脂質體。

實施例33a為實施例33之方法，其中初免組成物、第一追加組成物及/或第二追加組成物進一步包含佐劑。

實施例33b為實施例33a之方法，其中佐劑包含TLR-4配體與TLR-9配體中至少一者。

實施例34為實施例1至33b中任一項之方法，其中第一追加組成物係在初次投予初免組成物之後約27-32天，較佳係約29天投予。

實施例35為實施例34之方法，其進一步包括在初次投予初免組成物之後約82-87天，較佳係約85天，再度投予第一追加組成物。

實施例36為實施例35之方法，其進一步包括在初次投予初免組成物之後約167-172天，較佳係約169天，投予第二追加組成物。

實施例37為實施例1至33b中任一項之方法，其中在初次投予初免組成物之後約82-87天，較佳係約85天，投予第一追加組成物。

實施例38為實施例37之方法，其進一步包括在初次投予初免組成物之後約27-32天，較佳係約29天，投予第二追加組成物。

實施例39為實施例35之方法，其進一步包括在初次投予初免組成物之後約167-172天，較佳係約169天，再度投予第一追加組成物。

實施例40為一種為有此需要之個體治療或預防神經退化性疾病或疾患之方法，其包括：對該個體投予包含免疫有效量脂質體之初免組成物，該脂質體包含：第一tau磷酸肽，其具有選自下列所組成之群組中之胺基酸序列：SEQ ID NO：27至 SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：31至 SEQ ID NO：38；輔助型T細胞抗原表位，其具有選自下列所組成之群組中之胺基酸序列：SEQ ID NO：39至 SEQ ID NO：44，較佳係由選自：SEQ ID NO：13至SEQ ID NO：17所組成之群組中之胺基酸序列組成之輔助型T細胞抗原表位；脂質化CpG寡核苷酸，其具有選自下列所組成之群組中之核苷酸序列：SEQ ID NO：18至 SEQ ID NO：22，其中CpG寡核苷酸包含一個或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結，及CpG寡核苷酸係利用連接子與至少一個膽固醇共價鍵結；及單磷醯基脂質 A (MPLA)；其中tau磷酸肽存在於脂質體之表面上，及醫藥上可接受之載劑；及對該個體投予包含免疫有效量接合物之第一追加組成物，該接合物包含 tau磷酸肽及利用連接子與其接合之免疫原性載劑，該接合物具有如下結構：

，其中n為整數3至7，及醫藥上可接受之載劑。

實施例41為實施例40之方法，其中第一追加組成物係在初次投予初免組成物之後約27-32天，較佳係約29天投予。

實施例42為實施例41之方法，其進一步包括在初次投予初免組成物之後約82-87天，較佳係約85天，再度投予第一追加組成物。

實施例43為實施例42之方法，其進一步包括在初次投予初免組成物之後約167-172天，較佳係約169天，投予包含免疫原性有效量脂質體之第二追加組成物。

實施例44為實施例40之方法，其中第一追加組成物係在初次投予初免組成物之後約82-87天，較佳係約85天投予。

實施例45為實施例44之方法，其進一步包括在初次投予初免組成物之後約27-32天，較佳係約29天，投予包含免疫原性有效量脂質體之第二追加組成物。

實施例46為實施例45之方法，其進一步包括在初次投予初免組成物之後約167-172天，較佳係約169天，再度投予第一追加組成物。

實施例46a為實施例1至46中任一項之方法，其中免疫有效量之接合物係與一或多種佐劑共同投予。

實施例46b為實施例46a之方法，其中佐劑包含鋁鹽，如：氫氧化鋁、磷酸鋁、與硫酸鋁。

實施例46c為實施例46a或46b之方法，其中佐劑包含CpG，如：CpG2006 (亦稱為CpG 7909)、CpG 1018、CpG2395、CpG2216、CpG1826或CpG2336。

實施例46d為實施例46c之方法，其中免疫有效量之接合物係與鋁鹽(如：氫氧化鋁、磷酸鋁、及硫酸鋁)、及CpG(如：CpG2006 (亦稱為CpG 7909)、CpG 1018、CpG2395、CpG2216、CpG1826或CpG2336)共同投予。

實施例46e為實施例46d之方法，其中免疫有效量之接合物係與磷酸鋁及CpG 1018共同投予。

實施例46f為實施例46d之方法，其中免疫有效量之接合物係與氫氧化鋁及CpG 7909共同投予。

實施例46g為實施例46d之方法，其中免疫有效量之接合物係與硫酸鋁及CpG 2395共同投予。

實施例46h為實施例46d之方法，其中免疫有效量之接合物係與氫氧化鋁及CpG1826共同投予。

實施例47為實施例1至46h中任一項之方法，其中神經退化性疾病或疾患係由形成神經纖維病灶引起或與形成神經纖維病灶有關。

實施例48為實施例1至47中任一項之方法，其中神經退化性疾病或疾患為阿茲海默症、帕金森氏症、庫賈氏症、拳擊手型失智症、唐氏症候群、吉斯曼-史特斯勤-先克症、包涵體肌炎、普利昂蛋白腦部類澱粉血管病變、創傷性腦損傷、肌萎縮性側索硬化症、關島震顫麻痺失智綜合症、具有神經纖維纏結之非關島型運動神經元疾病、嗜銀顆粒性失智症、腦皮質基底核退化症、路易氏體失智型肌萎縮性側索硬化症、出現鈣化之瀰漫性神經纖維纏結、額顳型失智症，較佳係出現與染色體17相關之帕金森症候群之額顳型失智症(FTDP-17)、額顳葉失智症、哈雷狛登-斯巴茲症、多重系統退化症、C型尼曼匹克症、匹克症、進行性皮質下膠質增生、進行性核上眼神經麻痺症、亞急性硬化性全腦炎、僅有神經纏結之失智、腦炎後帕金森症候群、萎縮性肌強直、慢性創傷性腦病變(CTE)、腦血管病變或路易體失智症(Lewy body dementia)(LBD)。

實施例49為實施例1至48中任一項之方法，其中神經退化性疾病或為阿茲海默症、帕金森氏症、唐氏症候群、進行性核上眼神經麻痺症 (PSP)、與染色體17相關之額顳型失智症與帕金森症候群(FTDP-17)、匹克症與PART(原發性老化相關之tau蛋白病變)、腦皮質基底核退化症、路易氏體失智型肌萎縮性側索硬化症、萎縮性肌強直、慢性創傷性腦病變(CTE)、腦血管病變、或路易體失智症 (LBD)。

實施例50為實施例1至49中任一項之方法，其中神經退化性疾病或疾患為阿茲海默症、進行性核上眼神經麻痺症(PSP)、與染色體17相關之額顳型失智症與帕金森症候群(FTDP-17)、或匹克症與PART(原發性老化相關之tau蛋白病變)。

實施例51為實施例1至50中任一項之方法，其中神經退化性疾病或疾患為阿茲海默症、帕金森氏症、唐氏症候群、與染色體17相關之額顳型失智症與帕金森症候群(FTDP-17)、腦皮質基底核退化症、路易氏體失智型肌萎縮性側索硬化症、萎縮性肌強直、慢性創傷性腦病變(CTE)、腦血管病變、或路易體失智症(LBD)。

實施例51a為實施例1至51中任一項之方法，其中神經退化性疾病或為早發性阿茲海默症、因阿茲海默症造成之輕度認知力損傷(MCI)、輕度阿茲海默症、或輕度至中度阿茲海默症。

實施例52為一種組合，如：套組，其包含實施例1至51a中任一項所使用之初免組成物及第一追加組成物。

實施例53為實施例1至51a中任一項之方法，或為實施例52之組合，其中免疫有效量之脂質體包含每劑約25奈莫耳至約750奈莫耳之第一tau磷酸肽，較佳係每劑約90奈莫耳至約715奈莫耳或每劑約90奈莫耳至約535奈莫耳，如：每劑約25奈莫耳、約30奈莫耳、約35奈莫耳、約40奈莫耳、約45奈莫耳、約50奈莫耳、約55奈莫耳、約60奈莫耳、約65奈莫耳、約70奈莫耳、約75奈莫耳、約80奈莫耳、約85奈莫耳、約90奈莫耳、約95奈莫耳、約100奈莫耳、約125奈莫耳、約150奈莫耳、約175奈莫耳、約200奈莫耳、約225奈莫耳、約250奈莫耳、約275奈莫耳、約300奈莫耳、約325奈莫耳、約350奈莫耳、約375奈莫耳、約400奈莫耳、約425奈莫耳、約450奈莫耳、約475奈莫耳、約500奈莫耳、約525奈莫耳、約550奈莫耳、約575奈莫耳、約600奈莫耳、約625奈莫耳、約650奈莫耳、約675奈莫耳、約700奈莫耳、約725奈莫耳、約750奈莫耳、或其等之間任何數值。

實施例53a為實施例1至51a中任一項之方法，或為實施例52之組合，其中免疫有效量之脂質體包含每劑約25奈莫耳至約750奈莫耳之第一tau磷酸肽，如：每劑約29.7奈莫耳至約742.5奈莫耳，較佳係每劑約90奈莫耳至約715奈莫耳，如：每劑約89.1奈莫耳至約712.8奈莫耳，或每劑約90奈莫耳至約535奈莫耳，如：每劑約89.1奈莫耳至約534.6奈莫耳，或每劑約90奈莫耳至約268奈莫耳，如：每劑約89.1奈莫耳至約267.3奈莫耳。

實施例53b為實施例53或53a之方法或組合，其中免疫有效量之脂質體包含每劑約100 µg至約2500 µg之第一tau磷酸肽，較佳係每劑約300 µg至約2400 µg，如：約100 µg、約150 µg、約200 µg、約250 µg、約300 µg、約400 µg、約500 µg、約600 µg、約700 µg、約800 µg、約900 µg、約1000 µg、約1100 µg、約1200 µg、約1300 µg、約1400 µg、約1500 µg、約1600 µg、約1700 µg、約1800 µg、約1900 µg、約2000 µg、約2100 µg、約2200 µg、約2300 µg、約2400 µg、約2500 µg、或其等之間任何數值。

實施例53c 為實施例53至53b中任一項之方法或組合，其中第一tau磷酸肽係由SEQ ID NO：27至 SEQ ID NO：38中一個胺基酸序列組成。

實施例53d為實施例53c之方法或組合，其中第一tau磷酸肽係由胺基酸序列SEQ ID NO：28組成。

實施例54為實施例53至53d中任一項之方法或組合，其中第二tau磷酸肽係由胺基酸序列SEQ ID NO：1-3或5-12組成。

實施例54a為實施例54之方法或組合，其中第二tau磷酸肽係由胺基酸序列SEQ ID NO：1、2、或3組成。實例實例1 脂質體疫苗製法

對照脂質體疫苗(乙醇注射技術)

對照脂質體疫苗係採用乙醇(EtOH)注射技術後，擠壓。首先，取DMPC (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Germany)、DMPG (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Germany)、膽固醇 (Dishman, Netherlands)與MPLA (Avanti Polar Lipids, AL, USA)依莫耳比例9：1：7：0.05溶解於60°C之20：1 (V/V)之EtOH與第三丁醇(t-BuOH)混合物中。脂質/乙醇溶液於60°C之pH 7.4磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)中稀釋，維持10% EtOH濃度，結果形成多疊層脂質體囊泡(MLV)。MLV隨後利用Emulsiflex-C5 (Avestin, Canada)，經過連續5次擠壓通過三個孔徑0.08 µm之聚碳酸酯濾器(Whatman)。所得脂質體於pH 7.4之PBS中稀釋，加熱至60°C，得到脂質體溶液後，添加tau肽。

取四棕櫚醯基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽乙酸鹽(Bachem AG, Switzerland)(相當於 SEQ ID NO：28，本文中稱為活性醫藥成份(API))，溶於pH 11.4之PBS中，其中2.0%辛基 β-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma-Aldrich, USA)濃度為1 mg/mL，肽溶液注射至60°C之脂質體溶液中後，於60°C下攪拌30分鐘。透過超離心法濃縮至目標最終體積，透析過濾期間，與pH 7.4 之PBS進行緩衝劑交換10次。所得脂質體(脂質體表面上有API 存在)隨後通過2個連續0.2 µm 聚碳酸酯針筒濾器進行無菌過濾，終產物存放在5°C下。

脂質體Z與Z+ 疫苗之製法

脂質體Z+ 疫苗(其中最終API濃度為1200µg/ml及最終T50濃度為1200 µg/ml)係採用乙醇注射技術，然後擠壓製成，及脂質體Z 疫苗(其中最終API濃度為400µg/ml及最終T50濃度為100 µg/ml)係經過薄脂質膜技術，然後均質化及擠壓後製成。

採用薄脂質膜技術製備脂質體Z 疫苗

脂質體Z 疫苗係採用薄脂質膜技術，然後均質化及擠壓後製成。首先，取DMPC (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Germany)、DMPG (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Germany)、膽固醇 (Dishman, Netherlands)與單磷醯基六醯基脂質 A 3-脫醯基合成性(3D-(6-醯基) PHAD®) (Avanti Polar Lipids, AL, USA)依莫耳比例9：1：7：0.05溶於60°C之EtOH中。於真空旋轉蒸發器中蒸發乙醇，得到薄脂質膜。.

脂質膜使用pH 7.4之PBS、5% DMSO (均來自Sigma-Aldrich)(含0.15 mg/mL T50肽)(Peptides & Elephants, Germany)再水合。溫和攪拌樣本15 min，然後再激烈渦轉，以溶解薄脂質膜。所得多疊層囊泡經過10次冷凍-解凍循環(液態N2及37°C水浴)後，經過均質化，接著連續擠壓通過孔徑0.08 µm之聚碳酸酯膜(Whatman, UK)。均質化及擠壓步驟均在EmulsiFlex-C5 (Avestin, Canada)上進行。所擠壓出含囊封T50肽之脂質體經過超過濾濃縮，藉由透析過濾法，交換緩衝劑成為pH 7.4之PBS。所得脂質體於pH 7.4之PBS中稀釋，加熱至60°C，得到脂質體溶液後，添加tau肽與佐劑。

CpG2006-膽固醇 (CpG2006-Chol) (Microsynth, Switzerland)為DNA寡核苷酸，其所有核苷酸間鍵結均為硫代磷酸酯，其5’末端經膽固醇分子利用PEG間隔基，透過磷酸酯鍵修飾。取CpG2006-膽固醇 (CpG2006-Chol) (Microsynth, Switzerland)溶於pH 7.4之PBS，1 mg/mL，並注射至脂質體溶液中，然後培養15分鐘後，嵌插API。

取API (Bachem AG, Switzerland)溶於pH 11.4之PBS，其中2% 辛基ß-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma-Aldrich, USA)之濃度為1 mg/mL，取肽溶液注射至60°C之脂質體溶液中後，於60°C下攪拌30 min。經過超過濾濃縮，得到目標值(針對脂質體Z之400µg/ml API與100 µg/ml T50)，透析過濾期間，與pH 7.4 之PBS進行緩衝劑交換10次。所得脂質體(脂質體表面上有API 存在)隨後通過0.2 µm 聚碳酸酯針筒濾器進行無菌過濾，終產物存放在5°C下。

採用乙醇注射法製備脂質體Z+ 疫苗

採用基於乙醇注射製程製備脂質體Z+ 疫苗。首先，取DMPC (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Germany)、DMPG (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Germany)、膽固醇 (Dishman, Netherlands)與3D-(6-醯基) PHAD® (Avanti Polar Lipids, AL, USA)依莫耳比約9：1：7：0.04溶於60°C之EtOH中。取T50肽 (Bachem AG, Switzerland)溶於10 mM His/270 mM 蔗糖 (pH 5.8-6.0)中。然後取脂質乙醇溶液注射至包含T50肽之溶液中，溫和攪拌15 min。產生多疊層囊泡(MLV)。取MLV經過均質化(脂質體Z+進行6次)，接著連續擠壓通過孔徑0.08 µm之聚碳酸酯膜(Whatman, UK) (脂質體Z+通過5次)。脂質體Z+之均質化與擠壓步驟均在EmulsiFlex-C5 (Avestin, Canada)中進行。擠壓出之脂質體經過超過濾法濃縮，採用透析過濾法交換緩衝劑成為20 mM His/145 mM NaCL，pH 7.4。所得含有囊封T50肽之脂質體於20 mM His/145 mM NaCL pH 7.4中稀釋，加熱至60°C，得到脂質體溶液後，添加API與佐劑。

取CpG2006-Chol (Microsynth, Switzerland，針對脂質體Z+)溶於20 mM His/145 mM NaCl pH 7.4，1 mg/mL，及注射至脂質體溶液中後，培養15分鐘後，嵌插API。

取API (Bachem AG, Switzerland)溶於pH 10.2碳酸鹽緩衝劑，其中1%辛基ß-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma-Aldrich, USA)之濃度為1 mg/mL，取肽溶液注射至60°C之脂質體Z+ 溶液中，然後於60°C下攪拌30 min。肽溶液使用T-Line Mixing，於60°C下混合至脂質體Z+溶液中，然後於60°C下攪拌30 min。經過超過濾濃縮，得到目標值(脂質體Z+之1200 µg/ml API與1200 µg/ml T50)，透析過濾期間，使用10 mM His/270 mM 蔗糖 pH 6.5 進行緩衝劑交換10次。所得Z+ 脂質體(脂質體表面上有API 存在)隨後通過0.2 µm 聚碳酸酯針筒/囊式濾器進行無菌過濾，及終產物存放在5°C下。實例2 接合物疫苗製法

肽與佐劑

本試驗中使用磷酸化tau肽(SEQ ID NO：2)進行合成製造，合成期間添加磷酸-殘基。包含胺基酸序列為SEQ ID NO：2之磷酸化tau肽利用連接子共價鍵結至CRM 載劑之接合物在本文稱為接合物X。

由疫苗肽利用聚乙二醇(PEG)-半胱胺酸-乙醯胺基丙醯胺連接子接合至載劑蛋白質CRM197。胺基酸序列為SEQ ID NO：2之磷酸化tau肽係合成製得(Polypeptide Laboratories SAS)，合成期間添加磷酸-殘基與PEG3 間隔基。接合物X製法為由載劑蛋白質CRM197利用3-(溴乙醯胺)丙酸琥珀醯亞胺基酯(SBAP)連接子，接合在肽N-末端之半胱胺酸上。SBAP經由NHS 酯反應化學，黏接至CRM197蛋白質一級胺(-NH2)。過量SBAP 連接子則使用超過濾法與透析過濾(UF/DF)排除。CRM197-SBAP中間物係接合至磷酸化tau肽，一旦反應完成時，即添加過量L-胱胺酸淬滅反應，結束該接合反應。粗製CRM197-肽接合產物使用Capto Q ImpRes (GE Healthcare)層析管柱純化，使用等濃度鹽方法溶離。純化之CRM197-肽產物再使用UF/DF，調配至含Tris與蔗糖(如：20 mM Tris、250 mM 蔗糖)之pH 8.1緩衝劑中。CRM197-tau肽藥物(DS)母液製法為添加聚山梨酸酯80 (PS80)母緩衝液，如：10% PS80母緩衝液，達成終濃度0.01% PS80。溶液先充份混合後才過濾。注射前，母液先使用PBS及CpG/Alum稀釋，例如：稀釋成第一濃度0.8 mg/mL CRM197-tau肽，然後再使用PBS與CpG/Alum稀釋成終濃度30 µg/mL之CRM197-tau肽，供注射用。實例3至7中，CRM197-tau肽母液係以含於10 mM PBS (pH 7.3)中之3.1 mg/mL濃度保存，再使用PBS稀釋至所需操作濃度。然後添加CpG寡核苷酸、alum與PBS至基於CRM197-tau肽之終濃度達成30 µg/mL，最終調配物充份混合後才注射。

使用活性疫苗靶向CNS 抗原的問題之一為無特異性或脫靶發炎，可能造成不要的神經病理性變化。為了探討此問題，從接種接合物組成物之免疫小鼠收集全腦，染色後，目視觀察血管周邊或其他細胞浸潤。已接種疫苗的動物均沒有任何神經發炎、細胞浸潤、或其他不期望的神經病理性變化等徵兆(未出示數據)。此表示，疫苗所誘發之抗體及對接種疫苗之先天免疫反應並未造成小鼠之神經病理性變化。

下列實例出示不同疫苗療程所誘發免疫反應之不同態樣。實例3 異種疫苗接種在恆河猴中提高Tau磷酸肽-特異性抗體之抗原表位覆蓋度

所有動物實驗均依據當地動物實驗法令核准及進行。恆河猴(Rhesus macaques)(普通獼猴(Macaca mulatta))係得自中國Kunming Biomed International Ltd, China, Yunnan Yinmore Bio-Tech Co. LTD, China and Yunnan Laboratory Primates Inc., China。動物開始接種疫苗時為2至5歲，其最低體重為2.5 kg。在開始處理之前及之後每週進行詳細的臨床檢查。此外，每天觀察猴子兩次，並記錄臨床徵兆。

脂質體疫苗，例如：脂質體Z或脂質體Z+ (二者均包含四棕櫚醯基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽、3D-(6-醯基) PHAD®、脂質化CpG寡核苷酸 CpG 2006及T-細胞肽 T50)在本申請案全文中稱為「A」，而接合物疫苗，例如：接合物X (SEQ ID NO：2磷酸化tau肽連接至CRM197)在本申請案全文中稱為「B」。

在一組恆河猴(每組n= 3隻公猴與3隻母猴)中，於第1天與第29天經皮下免疫接種：i) 每劑含1800 µg四棕櫚醯基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽乙酸鹽之脂質體Z疫苗 (療程A-A)； ii)每劑15 µg之接合物X 疫苗(療程B-B)；或iii) 於第1天接種每劑含1800 µg 四棕櫚醯基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽乙酸鹽之脂質體Z 疫苗，接著在第29天接種每劑15 µg接合物X 疫苗(療程A-B)。在第二次免疫接種之後三週(第50天)，由抗原表位圖譜分析ELISA，使用N-末端經生物素基化8聚體肽集合庫(其位移一個胺基酸且涵蓋SEQ ID NO：2之磷酸tau肽的整個序列)及SEQ ID NO：4序列(VYKSPVVSGDTSPRHL，SEQ ID NO：2之非磷酸化肽)，測定抗體之抗原表位辨識型態。

圖1A至1C出示接受脂質體疫苗(脂質體Z)免疫接種的猴子所產生IgG抗體大多數結合在肽之N-末端部份上 (A-A療程，圖1A)，而接受接合物疫苗(接合物X)免疫接種的猴子所產生IgG抗體大多數結合在肽之C-末端部份上(B-B療程，圖1B)，即使脂質體疫苗及接合物疫苗包含相同的SEQ ID NO：2磷酸化tau肽。異種療程誘發之抗體則與肽之N-及C-末端兩個部份均結合(A-B療程，圖1C)，因此提高了所誘發抗體之抗原表位覆蓋度。此外，接受脂質體疫苗(脂質體Z)免疫接種的猴子所誘發IgG抗體並未與非磷酸化集合庫結合，而接受接合物疫苗(接合物X)免疫接種的猴子所誘發IgG抗體則亦可辨識非磷酸化8-聚體肽。接受異種療程(A-B)免疫接種的猴子顯示與非磷酸化集合庫的中間結合性。實例4 在恆河猴中追加脂質體疫苗可以誘發傾向「脂質體樣」抗原表位型態(A-B-B-A療程)

恆河猴(每組n= 3隻公猴與3隻母猴)各組於第1天經皮下免疫接種每劑含1800 µg四棕櫚醯基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽乙酸鹽之脂質體Z疫苗，第 29天及第85天接種每劑15 µg接合物X 疫苗，及第169天再度接種每劑含1800 µg 四棕櫚醯基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽乙酸鹽之脂質體Z 疫苗(療程A-B-B-A)。在最後一次追加接種脂質體疫苗之前一週(第162天，A-B-B療程)及之後三週(第190天，A-B-B-A療程)，採用抗原表位圖譜分析ELISA，依實例6之說明測定所誘發抗體之抗原表位辨識型態。圖2出示使用脂質體進行初免及使用接合物疫苗追加，可以誘發N-與C-末端IgG抗體之組合(A-B-B療程)，而最後一次追加脂質體疫苗則在恆河猴中造成傾向「脂質體樣」抗原表位型態(A-B-B-A療程)。數據顯示使用本文所說明新穎抗-Tau疫苗之異種疫苗接種策略，在誘發抗-Tau抗體反應上具有高度彈性。

總言之，恆河猴之試驗顯示，使用脂質體Z與接合物X等疫苗進行連續免疫接種時程的異種疫苗接種法不僅誘發對抗pTau及從AD 患者腦部分離之病理性Tau之抗體效價，而且提高所誘發抗體在兩種第二代疫苗所使用之抗原性序列內之抗原表位覆蓋度。實例5 在恆河猴中使用脂質體及接合物疫苗之異種疫苗接種在血清中誘發 ePHF-特異性IgG效價及在腦脊髓液(CSF)中誘發特異性針對Tau磷酸肽之IgG抗體

成年恆河猴(每組n= 3隻公猴與3隻母猴)以下述經皮下或肌內免疫接種：i) 於第1、29、85與169天接種每劑含1800 µg 四棕櫚醯基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽乙酸鹽之脂質體Z疫苗(療程A-A-A-A)； ii) 於第1、29、85與169天接種每劑含1800 µg 四棕櫚醯基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽乙酸鹽之脂質體Z+疫苗(療程A-A-A-A)； iii)於第1天接種每劑含1800 µg 四棕櫚醯基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽乙酸鹽之脂質體Z疫苗，於第29及85天接種每劑15 µg接合物X 疫苗，並與alum及CpG寡核苷酸 CpG 2006共同注射，及於第169天接種每劑含1800 µg 四棕櫚醯基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽乙酸鹽之脂質體Z 疫苗(療程A-B-B-A)； iv)於第1與29天接種每劑含1800 µg 四棕櫚醯基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽乙酸鹽之脂質體Z+疫苗，及於第85與169天接種每劑15 µg接合物X 疫苗(療程A-A-B-B)；或v) 於第1與29天接種每劑15 µg接合物X 疫苗，及於第89與169天接種每劑含1800 µg 四棕櫚醯基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽乙酸鹽之脂質體Z+疫苗(療程B-B-A-A)。於第190天抽血，單離血清。

富集成對的螺旋狀纖維(ePHF)製劑係修改Greenberg與Davies之方法(Greenberg與Davies, 1991, Proc Natl Acad Sci U S A, 87(15):5827-31)，從經過組織學確認為AD 個體之死後屍檢腦組織，使用十二烷基肌胺酸鈉萃取(sarcosyl extraction)得到不可溶tau。採用Mesoscale Discovery (MSD)平台及以ePHF作為塗佈抗原，評估特異性針對ePHF之抗體效價。取來自免疫猴子的血清於分析緩衝劑(PBS、0.05% Tween20、1%脫脂奶)中連續稀釋，加至96-孔MSD分析盤中。培養2小時後，移除樣本，使用PBST (PBS、0.05% Tween20)洗滌分析盤。使用標記SulfoTag之抗-人類/猴IgG抗體檢測抗體，然後於1%多聚甲醛(PFA)中先進行固定步驟後，添加讀取緩衝劑 T。分析盤係使用Sector Imager (MSD)分析。所有樣本均以8個連續兩倍稀釋液進行，每個分析盤均包括陽性與陰性對照樣本。計算每隻個別猴子之抗體效價，以任意單位(AU)/mL表示。出示每隻猴子使用每種脂質體組成物分別得到之效價幾何平均值相對於A-A-A-A之倍數變化，並出示每組的幾何平均值。

採用MSD平台評估特異性針對SEQ ID NO：2磷酸化tau肽之抗體效價。在已先經過1%阻斷劑A之PBS溶液飽和之Gold 小孔鏈黴親和素(Gold small spot streptavidin) 96孔分析盤(MSD)上塗佈序列N-末端已經過生物素基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽。取免疫猴子的CSF，於分析緩衝劑(PBS、0.05% Tween 20、1%阻斷劑A)中連續稀釋，加至96孔MSD分析盤中。培養2小時後，移除樣本，使用PBST (PBS、0.05% Tween20)洗滌分析盤。使用標記SulfoTag之抗-人類/猴IgG抗體檢測抗體，然後添加讀取緩衝劑 T。分析盤係使用Sector Imager (MSD)分析。所有樣本均以8個連續兩倍稀釋液進行，每個分析盤均包括陽性與陰性對照樣本。計算每隻個別猴子之抗體效價，以AU/mL表示。出示每隻猴子使用每種脂質體組成物分別得到之效價幾何平均值相對於A-A-A-A之倍數變化，並出示每組的幾何平均值。分析中排除紅血球細胞數高的樣本，以避免因血液污染造成任何抗體效價偏差。

如圖3所示，猴子接受投予異種療程A-B-B-A與A-A-B-B (其中A為使用囊封T50、TLR4配體及脂質化CpG寡核苷酸之脂質體疫苗(使用四棕櫚醯基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽乙酸鹽)，及B為與alum及CpG寡核苷酸共同注射之接合物疫苗(磷酸肽 SEQ ID NO：2與CRM197連接))，於第190天(第四次注射後三週)顯示之ePHF-特異性效價係類似或高於彼等接受投予同種處理(A-A-A-A)的猴子(倍數變化≥1)。

然而，所有接受異種療程B-B-A-A注射的猴子所顯示之ePHF-特異性效價均低於彼等接受同種處理(A-A-A-A)的猴子(倍數變化≤1)。

圖6顯示，當於第183天(第四次注射後2週)追蹤此等猴子之腦脊髓液中IgG抗體反應時，顯示類似結論。接受投予異種療程A-B-B-A與A-A-B-B (其中A為使用四棕櫚醯基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽乙酸鹽、囊封T50(TLR4配體)及脂質化CpG寡核苷酸之脂質體疫苗，及B為與alum及CpG寡核苷酸共同注射之接合物疫苗(磷酸肽 SEQ ID NO：2與CRM197連接))的猴子所顯示特異性針對SEQ ID NO：2磷酸化tau肽之IgG效價均高於彼等接受投予同種處理(A-A-A-A)的猴子(倍數變化≥1)。然而，所有接受注射異種療程B-B-A-A的猴子所顯示特異性針對SEQ ID NO：2磷酸化tau肽之IgG效價均低於彼等接受投予同種處理(A-A-A-A)的猴子 (倍數變化≤1)。

總言之，此試驗結果顯示，在全身及局部(CSF中)抗體反應中，使用脂質體疫苗作為初免組成物之異種療程所誘發之ptau 特異性 IgG效價高於使用接合物疫苗作為初免組成物的療程。實例6 在恆河猴中使用初免脂質體疫苗進行異種疫苗接種所誘發特異性針對Tau磷酸肽與ePHF之IgG效價高於同種療程

成年恆河猴(每組n= 3隻公猴與3隻母猴)以下述經皮下或肌內免疫接種：i) 於第1、29、與85天接種每劑含1800 µg 四棕櫚醯基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽乙酸鹽之脂質體Z疫苗(療程A-A-A)； ii) 每劑含1800 µg 四棕櫚醯基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽乙酸鹽之脂質體Z+疫苗(療程A-A-A)； iii)於第1天接種每劑含1800 µg 四棕櫚醯基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽乙酸鹽之脂質體Z疫苗，及於第29與85天接種每劑15 µg接合物X 疫苗(療程A-B-B)；或iv) 於第1與29天接種每劑含1800 µg 四棕櫚醯基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽乙酸鹽之脂質體Z+疫苗，及於第85天接種每劑15 µg接合物X 疫苗(療程A-A-B)。於第106天抽血，及單離血清。

磷酸化tau肽-特異性IgG抗體效價係採用ELISA，使用SEQ ID NO：2磷酸化tau肽作為塗佈抗原測定。取來自免疫猴子的血清，於分析緩衝劑 (PBS、0.05% Tween 20、1% BSA)中連續稀釋，加至已先塗佈相關肽之96孔分析盤中。培養2小時後，移除樣本，使用PBST (PBS、0.05% Tween20)洗滌分析盤。抗體係使用HRP-接合抗-猴子IgG，然後使用ABTS受質(Roche)檢測。所有樣本均以8個連續兩倍稀釋液進行，每個分析盤均包括陽性與陰性對照樣本。數據係以個別終點效價(最後血清稀釋液所誘發之陽性反應)及每組之幾何平均值表示。採用單向ANOVA試驗法及特奇多重比較法(Tukey’s multiple comparison)進行統計分析。

採用MSD平台評估特異性針對ePHF之抗體效價。在已先經過1%BSA之PBS溶液飽和之Gold 小孔鏈黴親和素(Gold small spot streptavidin) 96孔分析盤(MSD)上塗佈生物素基化之抗-tau 捕捉抗體(HT7-生物素，ThermoScientific)，然後與從阿茲海默症患者腦部單離之ePHF培養。培養1小時後，使用PBST洗滌分析盤，添加血清之連續稀釋液，培養2小時。使用標記SulfoTag之抗-人類/猴IgG抗體檢測已結合之抗體，然後於1% PFA中先進行固定步驟後，添加讀取緩衝劑 T。分析盤係使用Sector Imager (MSD)分析。所有樣本均以8個連續兩倍稀釋液進行，每個分析盤均包括陽性與陰性對照樣本。每隻猴子的個別結果均AU/mL表示，並出示每組幾何平均值。出示第106天之特異性針對ePHF之抗體效價。採用單向ANOVA試驗法及特奇多重比較法進行統計分析。

圖4A出示異種療程A-A-B與A-B-B在恆河猴中所誘發特異性針對磷酸化tau肽之IgG抗體量在統計上顯著高於同種療程A-A-A。

圖4B出示異種療程A-A-B在恆河猴中所誘發ePHF-特異性IgG抗體量在統計上顯著高於同種療程A-A-A，而A-B-B在恆河猴中顯示ePHF-特異性IgG效價傾向高於同種療程A-A-A。

總言之，數據顯示使用脂質體疫苗(A)作為初免組成物之異種免疫接種療程所誘發對抗SEQ ID NO：2磷酸化tau肽與ePHF之抗體效價高於同種療程A-A-A。實例7 在恆河猴中之異種療程所誘發ePHF-特異性IgG抗體之品質類似或優於同種療程所誘發者

成年恆河猴(每組n= 3隻公猴與3隻母猴)以下述經皮下免疫接種：i) 於第1、29、85與169天接種每劑含1800 µg 四棕櫚醯基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽乙酸鹽之脂質體Z疫苗(療程A-A-A-A)；或 ii)於第1天接種每劑含1800 µg 四棕櫚醯基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽乙酸鹽之脂質體Z疫苗，於第29及85天接種每劑15 µg接合物X 疫苗，及於第169天接種每劑含1800 µg 四棕櫚醯基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽乙酸鹽之脂質體Z疫苗(療程A-B-B-A)，或經肌內：iii) 於第1、29、85與169天接種每劑含1800 µg 四棕櫚醯基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽乙酸鹽之脂質體Z+疫苗(療程A-A-A-A)；或 iv)於第1與29天接種每劑含1800 µg 四棕櫚醯基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽乙酸鹽之脂質體Z+疫苗，及於第85與169天接種每劑15 µg接合物X 疫苗(療程A-A-B-B)。於第190天抽血，及單離血清。

採用MSD平台，由與低塗佈濃度之ePHF 之結合性(本文中亦稱為在限制塗佈條件下)，評估特異性針對富集成對的螺旋狀纖維(ePHF)之抗體品質。取來自免疫猴子的血清於分析緩衝劑(PBS、0.05% Tween20、1%脫脂奶)中連續稀釋，加至96-孔MSD分析盤中。培養2小時後，移除樣本，使用PBST (PBS、0.05% Tween20)洗滌分析盤。使用標記SulfoTag之抗-人類/猴IgG抗體檢測抗體，然後於1%PFA中先進行固定步驟後，添加讀取緩衝劑 T。分析盤係使用Sector Imager (MSD)分析。所有樣本均以8個連續兩倍稀釋液進行，每個分析盤均包括陽性與陰性對照樣本。計算每隻個別猴子之抗體效價，以AU/mL表示。

採用ELISA，使用SEQ ID NO：2磷酸化tau肽作為塗佈抗原，測定磷酸化tau肽-特異性IgG抗體效價。取來自免疫猴子的血清，於分析緩衝劑 (PBS、0.05% Tween 20、1% BSA)中連續稀釋，加至已先塗佈相關肽之96孔分析盤中。培養2小時後，移除樣本，使用PBST (PBS、0.05% Tween20)洗滌分析盤。抗體係使用HRP-接合抗-猴子IgG，然後使用ABTS受質(Roche)檢測。所有樣本均以8個連續兩倍稀釋液進行，每個分析盤均包括陽性與陰性對照樣本。數據係以個別終點效價(最後血清稀釋液所誘發之陽性反應)及每組之幾何平均值表示。

採用ELISA，使用T50肽作為塗佈抗原，測定通用T-細胞抗原表位(T50)-特異性IgG抗體效價。取來自免疫猴子的血清，於分析緩衝劑 (PBS、0.05% Tween 20、1% 脫脂奶)中連續稀釋，加至已先塗佈相關肽之96孔分析盤中。培養2小時後，移除樣本，使用PBST (PBS、0.05% Tween20)洗滌分析盤。抗體係使用HRP-接合抗-猴子IgG，然後使用ABTS受質(Roche)檢測。所有樣本均以8個連續兩倍稀釋液進行，每個分析盤均包括陽性與陰性對照樣本。數據係以個別終點效價(最後血清稀釋液所誘發之陽性反應)及每組之幾何平均值表示。

出示每隻猴子的磷酸化tau肽-特異性IgG抗體效價與通用T-細胞抗原表位(T50)-特異性IgG抗體效價之間之倍數變化及每組之幾何平均值。採用曼-惠特尼試驗法(Mann-Whitney test)進行統計分析。

圖5A與5B出示在限制塗佈條件下之ePHF-特異性IgG效價，反映抗體之高結合容量。圖5A出示A-B-B-A 療程所誘發抗體效價稍高於A-A-A-A療程，而A-A-B-B則誘發類似之IgG效價。此外，如圖3所示，異種療程A-B-B-A及A-A-B-B 所誘發ePHF-特異性抗體效價均類似或高於僅使用脂質體疫苗之同種療程(A-A-A-A療程，倍數變化≥1)。總言之，數據顯示，由異種疫苗接種在恆河猴中所誘發ePHF-特異性抗體之品質類似或優於同種A-A-A-A疫苗接種療程所誘發抗體之品質。

不希望受到理論限制下，咸信根據本申請案之異種療程使CD4 T細胞反應多樣化。由於生長中心的空間有限，若維持使用相同的CD4 輔助型抗原表位/蛋白質(例如：破傷風)進行免疫接種，則破傷風特異性 B與T細胞將把tau-特異性B細胞擠出生長中心。另一方面。若改用CD4刺激，則tau 特異性 B細胞(其亦接受來自破傷風或白喉特異性 T細胞的輔助)更容易到達生長中心。在本發明中觀察到，當採用A-A-A-A 療程時，針對T50 輔助型肽的抗體效價大幅提高。當採用A與B之異種療程時，針對T50 輔助型肽之抗體效價則大幅下降。圖7出示異種療程(A-B-B-A與A-A-B-B)中，對抗SEQ ID NO：2磷酸化tau肽之IgG抗體效價與對抗T50肽之IgG抗體效價之間之比值高於其相對同種療程(A-A-A-A)。其反映CD4 T細胞反應的多樣性，亦證實T50-特異性B細胞反應不完全主導抗-pTau反應。

咸了解，本文說明之實例與實施例僅供例示說明目的，且可在不偏離本發明之廣義觀念下修改實施例。因此咸了解，本發明不受限於所揭示之特定實施例，但希望涵蓋在附錄之申請專利範圍所定義本發明本質與範圍內之修飾。序列表 SEQ ID NO：1 -磷酸-tau肽 (7.1) GDRSGYS[pS]PG[pS]PG[pT]PGSRSRT SEQ ID NO：2 -磷酸-tau肽 (T3.5) VYK[pS]PVVSGDT[pS]PRHL SEQ ID NO：3 -磷酸-tau肽 (22.1) SSTGSIDMVD[pS]PQLA[pT]LA SEQ ID NO：4 - tau肽 VYKSPVVSGDTSPRHL SEQ ID NO：5 -磷酸-tau肽 RENAKAKTDHGAEIVYK[pS]PVVSGDT[pS]PRHL SEQ ID NO：6 -磷酸-tau肽 RQEFEVMEDHAGT[pY]GL SEQ ID NO：7 -磷酸-tau肽 PGSRSR[pT]P[pS]LPTPPTR SEQ ID NO：8 -磷酸-tau肽 GYSSPG[pS]PG[pT]PGSRSR SEQ ID NO：9 -磷酸-tau肽 GDT[pS]PRHL[pS]NVSSTGSID SEQ ID NO：10 -磷酸-tau肽 PG[pS]PG[pT]PGSRSR[pT]P[pS]LP SEQ ID NO：11 -磷酸-tau肽 HL[pS]NVSSTGSID SEQ ID NO：12 -磷酸-tau肽 VSGDT[pS]PRHL SEQ ID NO：13 - T50 T細胞抗原表位 AKFVAAWTLKAAAVVRQYIKANSKFIGITELVVRFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-NH2 SEQ ID NO：14 - T46 T細胞抗原表位 AKFVAAWTLKAAAGSQYIKANSKFIGITELGSFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEK(Pal)K(Pal)-NH2 SEQ ID NO：15 - T48輔助型T細胞抗原表位 AKFVAAWTLKAAAGSQYIKANSKFIGITELGSFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSLINSTKIYSYFPSVISKVNQ-NH2 SEQ ID NO：16 - T51輔助型T細胞抗原表位 AKFVAAWTLKAAARRQYIKANSKFIGITELRRFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-NH2 SEQ ID NO：17 - T52輔助型T細胞抗原表位 AKFVAAWTLKAAARKQYIKANSKFIGITELRKFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-NH2 SEQ ID NO：18 - CpG 2006 (亦稱為CpG 7909) 5’-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3’ 其中小寫意指硫代磷酸酯(ps)核苷酸間鍵結 SEQ ID NO：19 - CpG 1018 5’-tgactgtgaacgttcgagatga-3’ 其中小寫意指硫代磷酸酯核苷酸間鍵結 SEQ ID NO：20 – CpG2395 5’-tcgtcgttttcggcgcgcgccg-3’ 其中小寫意指硫代磷酸酯核苷酸間鍵結 SEQ ID NO：21 – CpG2216 5’-ggGGGACGATCGTCgggggg-3’ 其中小寫意指硫代磷酸酯核苷酸間鍵結及大寫意指磷酸二酯(po)連接 SEQ ID NO：22 – CpG2336 5’- gggGACGACGTCGTGgggggg -3’, 其中小寫意指硫代磷酸酯核苷酸間鍵結及大寫意指磷酸二酯連接 SEQ ID NO：23 - Pan DR抗原表位 (PADRE)肽 AKFVAAWTLKAAA SEQ ID NO：24 – P2 QYIKANSKFIGITEL SEQ ID NO：25 – P30 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE SEQ ID NO：26 - TT586–605 LINSTKIYSYFPSVISKVNQ SEQ ID NO：27 – 棕櫚醯基化磷酸-tau肽 (棕櫚醯基化7.1) K(pal)K(pal)GDRSGYS[pS]PG[pS]PG[pT]PGSRSRTK(pal)K(pal) SEQ ID NO：28 - 棕櫚醯基化磷酸-tau肽 (T3，棕櫚醯基化T3.5，棕櫚醯基化SEQ ID NO：2) K(pal)K(pal)VYK[pS]PVVSGDT[pS]PRHLK(pal)K(pal) SEQ ID NO：29 - 棕櫚醯基化磷酸-tau肽 (棕櫚醯基化22.1) K(pal)K(pal)SSTGSIDMVD[pS]PQLA[pT]LAK(pal)K(pal) SEQ ID NO：30 - 棕櫚醯基化tau肽 K(pal)K(pal)VYKSPVVSGDTSPRHLK(pal)K(pal) SEQ ID NO：31 - 棕櫚醯基化磷酸-tau肽 K(pal)K(pal)RENAKAKTDHGAEIVYK[pS]PVVSGDT[pS]PRHLK(pal)K(pal) SEQ ID NO：32 - 棕櫚醯基化磷酸-tau肽 K(pal)K(pal)RQEFEVMEDHAGT[pY]GLK(pal)K(pal) SEQ ID NO：33 - 棕櫚醯基化磷酸-tau肽 K(pal)K(pal)PGSRSR[pT]P[pS]LPTPPTRK(pal)K(pal) SEQ ID NO：34 - 棕櫚醯基化磷酸-tau肽 K(pal)K(pal)GYSSPG[pS]PG[pT]PGSRSRK(pal)K(pal) SEQ ID NO：35 - 棕櫚醯基化磷酸-tau肽 K(pal)K(pal)GDT[pS]PRHL[pS]NVSSTGSIDK(pal)K(pal) SEQ ID NO：36 - 棕櫚醯基化磷酸-tau肽 K(pal)K(pal)PG[pS]PG[pT]PGSRSR[pT]P[pS]LPK(pal)K(pal) SEQ ID NO：37 - 棕櫚醯基化磷酸-tau肽 K(pal)K(pal)HL[pS]NVSSTGSIDK(pal)K(pal) SEQ ID NO：38 - 棕櫚醯基化磷酸-tau肽 K(pal)K(pal)VSGDT[pS]PRHLK(pal)K(pal) SEQ ID NO：39 - T50，沒有C-末端醯胺 AKFVAAWTLKAAAVVRQYIKANSKFIGITELVVRFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE SEQ ID NO：40 - T46，C-末端沒有-Lys(Pal)-Lys(Pal)-NH2 AKFVAAWTLKAAAGSQYIKANSKFIGITELGSFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE SEQ ID NO：41 - T48，沒有C-末端醯胺 AKFVAAWTLKAAAGSQYIKANSKFIGITELGSFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSLINSTKIYSYFPSVISKVNQ SEQ ID NO：42 - T51，沒有C-末端醯胺 AKFVAAWTLKAAARRQYIKANSKFIGITELRRFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE SEQ ID NO：43 - T52，沒有C-末端醯胺 AKFVAAWTLKAAARKQYIKANSKFIGITELRKFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE SEQ ID NO：44 - T57 (56, 57) AKFVAAWTLKAAAVVRQYIKANSKFIGITELVVRFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-K(Pal)K(Pal)-NH2 參考文獻 Asuni AA等人，J Neurosci. 2007 Aug 22；27(34):9115-29 Bentebibel等人，2013, Sci Transl Med., 5(176):176ra32 Crotty, 2011, Annual Reviews of Immunology. Vol 29:p621-663 Friedhoff等人，Biochimica et Biophysica Acta 1502 (2000) 122-132 Greenberg與Davies, 1991, Proc Natl Acad Sci U S A, 87(15):5827-31 Hanger等人，Trends Mol Med. 15:112-9, 2009 Hickman等人，J. Biol. Chem. vol. 286, NO. 16, pp. 13966–13976, April 22, 2011 Kontsekova E等人，Alzheimers Res Ther. 2014 Aug 1；6(4):44 Novak P等人，Lancet Neurology 2017, 16:123-134 Peeraer等人，2015, Neurobiol Dis., 73:83-95 Ries等人，2015, Org. Biomol. Chem., 13:9673 Spensieri等人，2013, Proc Natl Acad Sci U S A., 110(35):14330-5 Theunis C等人，PLoS One. 2013； 8(8): e72301 US7,741,297 US8,647,631 US9,687,447 WO90/14837 WO2010/115843

無

當配合附錄的圖示，將更了解本申請案之以上概述內容及以下較佳實施例之詳細說明。然而，應咸了解本申請案不受圖式中所示精確實施例之限制。

圖1A-1C出示藉由同種A-A (圖1A)或B-B (圖1B)疫苗接種或藉由異種 A-B (圖1C)疫苗接種所誘發抗體之抗原表位辨識型態，其係由短的8聚體重疊肽(涵蓋磷酸肽SEQ ID NO：2 與肽 SEQ ID NO：4)之抗原表位圖譜分析ELISA測定；

圖2出示在接種異種 A-B-B疫苗後(第162天)所誘發抗體相較於接種異種 A-B-B-A疫苗後(第190天)所誘發抗體之抗原表位辨識型態(其中A為脂質體疫苗，其包含TLR4配體及作為佐劑之脂質化CpG寡核苷酸、1800 µg/劑之四棕櫚醯基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽乙酸鹽(相當於 SEQ ID NO：28)、及囊封之T50輔助型T細胞抗原表位；及B為接合物疫苗，其包含15 µg/劑之CRM197，其利用連接子接合至SEQ ID NO：2磷酸化tau肽，且接合物疫苗係與鋁鹽(alum)及CpG寡核苷酸共同注射) ，其係由短的8聚體重疊肽(涵蓋磷酸肽SEQ ID NO：2 與肽 SEQ ID NO：4)之抗原表位圖譜分析ELISA測定；

圖3出示特異性針對富集成對的螺旋狀纖維(ePHF)之IgG效價，該富集成對的螺旋狀纖維係從阿茲海默症患者接受異種疫苗接種(A-B-B-A、A-A-B-B或B-B-A-A，其中A為脂質體疫苗，其包含TLR4配體及作為佐劑之脂質化CpG寡核苷酸、1800 µg/劑之四棕櫚醯基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽乙酸鹽、及囊封之T50輔助型T細胞抗原表位；及B為接合物疫苗，其包含15 µg/劑之CRM197，其利用連接子接合至SEQ ID NO：2磷酸化tau肽，且接合物疫苗係與alum及CpG寡核苷酸共同注射)或接受同種疫苗接種(A-A-A-A)後第190天之死後屍檢腦部所單離出，其中標繪相對於A-A-A-A之倍數變化。

圖4A出示在恆河猴(Rhesus monkey)接受同種(A-A-A)及異種 (A-A-B與A-B-B)免疫接種療程之後第106天，由ELISA測定特異性針對磷酸肽(其序列為SEQ ID NO：2) (T3.5)之IgG效價，所出示數據為終點效價(EPT)，及圖4B出示在恆河猴接受同種(A-A-A)及異種 (A-A-B與A-B-B)免疫接種療程之後第106天，特異性針對ePHF之IgG效價，其係以任意單位(AU)/mL表示；

圖5出示由異種療程A-B-B-A (圖5A)及A-A-B-B (圖5B)所誘發ePHF-特異性IgG抗體之品質與彼等由同種A-A-A-A療程所誘發品質之比較，其係在限制塗佈條件下測定與ePHF之結合性，其中標繪ePHF-特異性IgG效價，以AU/mL表示，其係由MSD在限制塗佈ePHF上測定；

圖6出示恆河猴在第一次接種異種疫苗(A-B-B-A、A-A-B-B或B-B-A-A，其中A為脂質體疫苗，其包含TLR4配體及作為佐劑之脂質化CpG寡核苷酸、1800 µg/劑之四棕櫚醯基化之SEQ ID NO：2磷酸化tau肽乙酸鹽、及囊封之T50輔助型T細胞抗原表位；及B為接合物疫苗，其包含15 µg/劑之CRM197，其利用連接子接合至SEQ ID NO：2磷酸化tau肽，且係與alum及CpG寡核苷酸共同注射)之後第183天之腦脊髓液(CSF)中，特異性針對N-末端已生物素基化之磷酸肽(其序列為SEQ ID NO：2)之IgG效價，其中標繪相對於接種同種疫苗A-A-A-A之倍數變化；及

圖7出示恆河猴在接受第一次免疫接種同種(A-A-A-A)及異種 (A-A-B-B與A-B-B-A)免疫接種之後第190天，由ELISA測定特異性針對磷酸肽(其序列為SEQ ID NO：2)(T3.5)之IgG效價與特異性針對 T50肽之IgG效價之比值。採用曼-惠特尼試驗法(Mann-Whitney test)進行統計分析(**p＜0.001)。

無

Claims

一種在有需要之個體中誘發對抗磷酸化Tau與富集成對的螺旋狀纖維(ePHF)中至少一者之抗體之方法，該方法包括： (i) 對該個體投予包含免疫有效量的脂質體之初免組成物，該脂質體包含： a. 第一tau磷酸肽； b. 輔助型T-細胞抗原表位； c. 脂質化CpG寡核苷酸；及 d. 包含toll-樣受體4配體之佐劑；其中tau磷酸肽係存在於脂質體表面上，及初免組成物進一步包含醫藥上可接受之載劑；及 (ii) 對該個體投予包含免疫有效量接合物之第一追加組成物，該接合物包含第二tau磷酸肽及利用連接子與其接合之免疫原性載劑，該接合物具有式(I)結構：
或具有式(II)結構：
其中 x為整數0至10，較佳係2至6，最佳係3； n為整數3至15，較佳係3至12； Tau肽代表第二tau磷酸肽；及載劑代表選自下列所組成之群組中之免疫原性載劑：鎖孔貝血藍蛋白(KLH)、破傷風類毒素、CRM197、及來自腦膜炎雙球菌(N. meningitidis )之外膜蛋白質混合物(OMP)，或其衍生物；及第一追加組成物進一步包含醫藥上可接受之載劑；其中第一tau磷酸肽與第二tau磷酸肽分別獨立包含選自下列所組成之群組中之胺基酸序列：SEQ ID NO：1至 SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：5至 SEQ ID NO：12。
如請求項1之方法，其中：該脂質體包含： a. 第一tau磷酸肽，其具有選自下列所組成之群組中之胺基酸序列：SEQ ID NO：27至 SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：31至 SEQ ID NO：38； b. 輔助型T細胞抗原表位，其具有選自下列所組成之群組中之胺基酸序列：SEQ ID NO：39至 SEQ ID NO：44，較佳係由選自：SEQ ID NO：13至SEQ ID NO：17所組成之群組中之胺基酸序列組成之輔助型T細胞抗原表位； c. 脂質化CpG寡核苷酸，其具有選自下列所組成之群組中之核苷酸序列：SEQ ID NO：18至 SEQ ID NO：22，其中CpG寡核苷酸包含一個或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結，及CpG寡核苷酸係利用連接子與至少一個膽固醇共價鍵結；及 d. 單磷醯基脂質 A (MPLA)；及該接合物包含第二tau磷酸肽，其具有選自下列所組成之群組中之胺基酸序列：SEQ ID NO：1至 SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5至 SEQ ID NO：12，其利用連接子與CRM197接合。
如請求項1或2之方法，其中該接合物具有如下結構：
，其中n為整數3至7。
一種在有需要之個體中誘發對抗磷酸化Tau與富集成對的螺旋狀纖維(ePHF)中至少一者之抗體之方法，該方法包括： (i) 對該個體投予包含免疫有效量的脂質體之初免組成物，該脂質體包含： a. 第一tau磷酸肽，其具有選自下列所組成之群組中之胺基酸序列：SEQ ID NO：27至 SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：31至 SEQ ID NO：38； b. 輔助型T細胞抗原表位，其具有選自下列所組成之群組中之胺基酸序列：SEQ ID NO：39至 SEQ ID NO：44，較佳係由選自：SEQ ID NO：13至SEQ ID NO：17所組成之群組中之胺基酸序列組成之輔助型T細胞抗原表位； c. 脂質化CpG寡核苷酸，其具有選自下列所組成之群組中之核苷酸序列：SEQ ID NO：18至 SEQ ID NO：22，其中CpG寡核苷酸包含一個或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結，及CpG寡核苷酸係利用連接子與至少一個膽固醇共價鍵結；及 d. 單磷醯基脂質 A (MPLA)；其中第一tau磷酸肽係存在於脂質體表面上，及初免組成物進一步包含醫藥上可接受之載劑；及 (ii) 對該個體投予包含免疫有效量的接合物之第一追加組成物，該接合物包含第二tau磷酸肽及利用連接子與其接合之免疫原性載劑，該接合物具有如下結構：
, 其中n為整數3至7，及第一追加組成物進一步包含醫藥上可接受之載劑。
一種在有需要之個體中誘發對抗磷酸化Tau與富集成對的螺旋狀纖維(ePHF)中至少一者之抗體之方法，該方法包括 (i) 對該個體投予包含免疫有效量的脂質體之初免組成物，該脂質體包含： (1) 第一tau磷酸肽，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：28； (2) toll-樣受體4促效劑，其包含單磷醯基六-醯基脂質 A，3-脫醯基； (3) 輔助型T-細胞抗原表位，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：39； (4) 脂質化CpG寡核苷酸，其包含核苷酸序列SEQ ID NO：18 ；及 (5) 至少一種選自下列所組成之群組中之脂質：1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DMPC)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油基-3-磷醯基-3’-rac-甘油(DMPG)、及膽固醇，其中第一tau磷酸肽係存在於脂質體表面上，及初免組成物進一步包含醫藥上可接受之載劑；及 (ii) 對該個體投予包含免疫有效量的接合物之第一追加組成物，該接合物包含第二tau磷酸肽及利用連接子與其接合之免疫原性載劑，該接合物具有如下結構：
, 其中n為整數3至7，及第一追加組成物進一步包含醫藥上可接受之載劑。
如請求項1至5中任一項之方法，其進一步包括在對個體初次投予第一追加組成物之後，投予至少一次第一追加組成物。
如請求項1至6中任一項之方法，其進一步包括對個體投予包含免疫有效量的脂質體及醫藥上可接受之載劑之第二追加組成物。
如請求項7之方法，其進一步包括在對個體初次投予第二追加組成物之後，投予至少一次第二追加組成物。
一種在有需要之個體中誘發對抗磷酸化Tau與富集成對的螺旋狀纖維(ePHF)中至少一者之抗體之方法，該方法包括 (i) 對該個體投予包含免疫有效量的脂質體之初免組成物，該脂質體包含： (1) 第一tau磷酸肽，其具有胺基酸序列SEQ ID NO：28； (2) toll-樣受體4促效劑，其包含單磷醯基六-醯基脂質 A，3-脫醯基； (3) 輔助型T-細胞抗原表位，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：39； (4) 脂質化CpG寡核苷酸，其包含核苷酸序列SEQ ID NO：18 ；及 (5) 至少一種選自下列所組成之群組中之脂質：1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DMPC)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油基-3-磷醯基-3’-rac-甘油(DMPG)、及膽固醇，其中第一tau磷酸肽係存在於脂質體表面上，及初免組成物進一步包含醫藥上可接受之載劑；及 (ii) 對該個體投予包含免疫有效量的接合物之第一追加組成物，該接合物包含第二tau磷酸肽及利用連接子與其接合之免疫原性載劑，該接合物具有如下結構：
, 其中n為整數3至7，及第一追加組成物進一步包含醫藥上可接受之載劑；及 (iii) 對個體投予包含免疫有效量的脂質體及醫藥上可接受之載劑之第一追加組成物或第二追加組成物。
如請求項9之方法，其中(ii)在(iii)之前進行。
如請求項9之方法，其中(ii)在(iii)之後進行。
如請求項9至11中任一項之方法，其進一步包括在對個體初次投予第一追加組成物之後，投予至少一次第一追加組成物。
如請求項9至12中任一項之方法，其包括對個體投予至少一次第二追加組成物。
如請求項1至13中任一項之方法，其中該個體需要治療由形成神經纖維病灶引起或與形成神經纖維病灶相關之神經退化性疾病或疾患。
如請求項14之方法，其中該神經退化性疾病或疾患為阿茲海默症(Alzheimer’s disease)、帕金森氏症(Parkinson’s Disease)、庫賈氏症(Creutzfeldt-Jakob Disease)、拳擊手型失智症(Dementia pugilistica)、唐氏症候群(Down Syndrome)、吉斯曼-史特斯勤-先克症(Gerstmann-Sträussler-Scheinker Disease)、包涵體肌炎、普利昂蛋白腦部類澱粉血管病變(prion protein cerebral amyloid angiopathy)、創傷性腦損傷、肌萎縮性側索硬化症、關島震顫麻痺失智綜合症(parkinsonism-dementia complex of Guam)、具有神經纖維纏結之非關島型運動神經元疾病(Non-Guamanian motor neuron disease with neurofibrillary tangles)、嗜銀顆粒性失智症、腦皮質基底核退化症、路易氏體失智型肌萎縮性側索硬化症(Dementia Lewy Amyotrophic Lateral sclerosis)、出現鈣化之瀰漫性神經纖維纏結、出現與染色體17相關之帕金森症候群之額顳型失智症(frontotemporal dementia with parkinsonism linked to chromosome 17)(FTDP-17)、哈雷狛登-斯巴茲症(Hallevorden-Spatz disease)、多重系統退化症、C型尼曼匹克症(Niemann-Pick disease)、匹克症(Pick’s disease)、進行性皮質下膠質增生、進行性核上眼神經麻痺症、亞急性硬化性全腦炎、僅有神經纏結之失智(Tangle only dementia)、腦炎後帕金森症候群(Postencephalitic Parkinsonism)、萎縮性肌強直、慢性創傷性腦病變(CTE)、腦血管病變或路易體失智症(Lewy body dementia)(LBD)。
如請求項15之方法，其中該個體需要治療阿茲海默症，較佳係早發性阿茲海默症、因阿茲海默症造成之輕度認知力損傷(MCI)、或輕度至中度阿茲海默症。
如請求項1至16中任一項之方法，其中該免疫有效量的脂質體包含第一tau磷酸肽，含量為每劑約25奈莫耳至約750奈莫耳，較佳係每劑約90奈莫耳至約715奈莫耳或每劑約90奈莫耳至約535奈莫耳。
如請求項1至17中任一項之方法，其中該免疫有效量的脂質體包含第一tau磷酸肽，含量為每劑約100 µg至約2500 µg，較佳係約300 µg至約2400 µg，如：約100 µg、約150 µg、約200 µg、約250 µg、約300 µg、約400 µg、約500 µg、約600 µg、約700 µg、約800 µg、約900 µg、約1000 µg、約1100 µg、約1200 µg、約1300 µg、約1400 µg、約1500 µg、約1600 µg、約1700 µg、約1800 µg、約1900 µg、約2000 µg、約2100 µg、約2200 µg、約2300 µg、約2400 µg、約2500 µg、或其等之間任何數值。