TW202100183A

TW202100183A - 雙配體藥物複合體及其用途

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Publication number: TW202100183A
Application number: TW109115998A
Authority: TW
Inventors: 黃保華; 譚巍; 戴建; 王中波; 劉小棟; 胡新禮; 謝雪原; 邵軍
Original assignee: 大陸商同宜醫藥（蘇州）有限公司
Priority date: 2019-01-30
Filing date: 2020-05-14
Publication date: 2021-01-01
Also published as: AU2020214507A1; SG11202108182RA; EP3903825A4; EP3903825A1; MX2021009199A; IL285148A; JP2022518924A; CN113453720A; KR20210119413A; US20220175761A1; BR112021015109A2; WO2020156513A1

Abstract

本申請涉及一種複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含有效負載和兩個靶向分子。本申請還涉及一種藥物組合物，所述藥物組合物包含本申請的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽。本申請另外涉及一種用於向有需要的對象遞送有效負載的方法以及一種治療疾病的方法，所述方法均包括向所述對象施用治療有效量的本申請的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，或者本申請的藥物組合物。

Description

雙配體藥物複合體及其用途

本申請關於生物醫藥化學領域。更具體地，本申請關於雙配體藥物複合體、包括所述雙配體藥物複合體的藥物組合物以及使用所述雙配體藥物複合體向有需要的對象遞送有效負載的方法和使用其治療疾病的方法。

通常，病變細胞的病理及生理特徵都與正常細胞有顯著不同，其中之一表現為病變細胞表面具有特異性或過度表現的物質（例如，抗原、化學信號、受體等），這些物質在正常細胞中無表現或低表現。基於這一原理，研發了抗體-藥物複合體（ADC，Antibody-drug conjugate）和多肽-藥物複合體（PDC）來治療疾病。目前，雖然已有一些ADC和PDC藥物上市或進入臨床研究，但由於這些藥物設計原理的原因，ADC和PDC在臨床應用中均具有很大的局限性。

由於ADC的複雜性和具有較大分子量，使其研發面臨著許多困難，包括缺乏適宜的靶點、生產困難和藥物穩定性較差。目前，ADC主要用於腫瘤治療領域。在一些情況下，靶向抗體對癌細胞表面抗原的親和性能夠高達10^-9 ~ 10^-12 （Kd，莫耳/升），因此在對靶細胞具有較高特異性的同時，ADC對與靶細胞具有相同靶向受體的正常細胞也具有較高的特異性。同時，由於ADC在體內的代謝時間較長（1至3周），在此期間其會不斷地殺傷正常細胞，因而極大地增加了ADC的毒副作用。因此，ADC更理想的適應症應當是其特徵為在腫瘤和正常細胞中的細胞表面抗原量相差非常懸殊的疾病。然而，目前所知滿足此嚴格要求的疾病非常少。

PDC在臨床或臨床前研究中用於治療多種疾病，但這些只是簡單的把化療藥物與多肽連接，或在包埋了化療藥物的奈米顆粒或高分子材料裡添加多肽，這樣會使得大部分多肽由於分子量較大以及帶有電荷導致其無法進入細胞，因此目前此類PDC大多數隻適用於胞外治療，嚴重限制了PDC的應用範圍和藥效。

藥物複合體化合物還可以是配體-藥物複合體（LDC），其中配體可以是肽或小分子。然而，從生物利用度、穩定性、療效到毒性等方面，LDC的應用存在很多問題。例如，很多配體由於其具有較大分子量、親脂性或其他屬性使其不能進入細胞，這限制了其治療應用。此外，如果配體與例行化療藥物（例如，多柔比星、紫杉醇等）複合，則療效通常較低，而如果其與高效藥物分子（例如，MMAE、DM1）複合，則毒性較大，甚至可能在達到腫瘤治療的治療有效量之前就導致動物中毒死亡。

因此領域內還迫切需要獲得改進的LDC，使其可以作用於病變細胞表面廣泛存在的較高表現受體、拓寬靶向範圍和治療窗以及增強藥效避免藥物副作用。

本申請的一個方面揭露了一種複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含有效負載和兩個靶向分子，其中所述兩個靶向分子分別為協同作用分子部分以及***特異性膜抗原配體部分。

本申請的另一方面揭露了一種複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含有效負載和兩個靶向分子，其中所述兩個靶向分子分別為協同作用分子部分以及具有式（I）所示的配體部分：

（I）。

本申請的另一方面揭露了一種複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含有效負載和兩個靶向分子，其中所述兩個靶向分子分別為協同作用分子部分以及P10，並且所述有效負載為喜樹鹼及其任何衍生物。

在一些實施方式中，複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含的***特異性膜抗原配體包括如下結構：

。

。

。

。

在一些實施方式中，複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含的兩個靶向分子是不同的。

在一些實施方式中，複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含的協同作用分子是細胞相互作用分子。

在一些實施方式中，複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含的兩個靶向分子與不同的細胞分子相互作用的細胞相互作用分子。

在一些實施方式中，複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含的協同作用分子是能夠介導內吞作用的內吞作用分子。

在一些實施方式中，複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含的協同作用分子與選自下組的分子結合：FOLR1、TRPV6、FOLH1(PMSA)、LHRH、Her2、Trop2、Her3、NECTIN4、LRP1、GLUT1、EGFR1、AXL、CA9、CD44、Claudin18.2、APN、DLL3、CEACAM5、FZD10、TFRC、MET、IGFR1、SSTR2、CCKBR、LFA1、ICAM、GPR87、GM-CSF、GM-CSFR、TIM3、TLR家族、CD40、CD40L、OX40、OX40L、GITRL、GITR、4-BBL、4-1BB、CD70、CD27、ICOSL、ICOS、HHLA2、CD28、CD86/80、CD28、MHCII抗原、TCR、CTLA-4、CD155、CD122、CD113、IGIT、PD-L1、PD1、Galectin-9、TIM-3、HVEM、BTLA、CD160、VISTA、B7-H4、B7-H3、磷脂醯絲胺酸、HHLA2、LAG3、Galectin-3、LILRB4、SIGLEC15、NKG2A、NKG2D、SLAMF7、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、FGFR1、FGFR2、FGFR4、NeuGcGM3和CXCR4。

在一些實施方式中，複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含***特異性膜抗原配體部分以及協同作用分子部分，所述協同作用分子部分與選自下組的分子結合：FOLR1、TRPV6、FOLH1(PMSA)、SSTR2和LHRH。

在一些實施方式中，複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含式（I）所示的配體部分以及協同作用分子部分，所述協同作用分子部分與選自下組的分子結合：FOLR1、TRPV6、SSTR2和LHRH。

在又一些實施方式中，複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含P10以及協同作用分子部分，所述協同作用分子與選自下組的分子結合：FOLR1、TRPV6、FOLH1(PMSA)和LHRH。

在一些實施方式中，複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含的協同作用分子是葉酸或其類似物。在一些實施方式中，葉酸類似物選自下組：5-甲基四氫葉酸、5-甲醯基四氫葉酸、甲氨蝶呤和5, 10-亞甲基四氫葉酸。

在一些實施方式中，複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含一個、兩個、三個、四個或更多個有效負載。在一些實施方式中，有效負載選自下組：小分子化合物、核苷酸、肽、和蛋白。在一些實施方式中，有效負載是小分子化合物。在一些實施方式中，小分子化合物選自下組：喜樹鹼及其任何衍生物、澳瑞他汀及其任何衍生物、美登素及其任何衍生物、放射性同位素錯合物、環氧化酶-2抑制劑、紫杉醇及其任何衍生物、埃博黴素及其任何衍生物、博來黴素及其任何衍生物、更生黴素及其任何衍生物、普卡黴素及其任何衍生物，以及絲裂黴素C。在一些實施方式中，小分子化合物是喜樹鹼及其任何衍生物、澳瑞他汀及其任何衍生物、美登素及其任何衍生物、放射性同位素錯合物或者環氧化酶-2抑制劑。

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含的有效負載通過連接子與至少一個所述靶向分子連接。

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含的連接子是肽類連接子、二硫化物連接子、pH依賴型連接子或者上述連接子的組合。

在一些實施方式中，肽類連接子可在特定的生理環境下通過蛋白酶裂解或還原裂解。在一些實施方式中，肽類連接子選自下組：半胱胺酸、賴胺酸、賴胺酸-賴胺酸、纈胺酸-瓜胺酸、***酸-賴胺酸、纈胺酸-賴胺酸、半胱胺酸-賴胺酸、半胱胺酸-穀胺酸、天冬胺酸-天冬胺酸和天冬胺酸-天冬胺酸-賴胺酸，可選的，上述胺基酸中的羧酸被醯胺化。

在一些實施方式中，二硫化物連接子選自下組：DMDS、MDS、DSDM和NDMDS。

在一些實施方式中，pH依賴型連接子是順烏頭酸酐。

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽的連接子包括如下結構：

、

、

、

、

、

、

、

、

、

、

及

，或者所述連接子是上述結構與肽類連接子的組合。

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含的兩個靶向分子通過間隔區連接。在一些實施方式中，本申請所述的間隔區包含選自下組的胺基酸序列：SEQ ID NO：1-14、Arg-Arg、Ala-Ser-Asn、Ala-Ala-Ala、Ser-Ser-Arg、Pro-Arg和Pro-Leu-Gly。

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物為CB-20B，其結構式如下：

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物為CB-20BK，其結構式如下：

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物為CB-60S，其結構式如下：

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物為CB-60SK，其結構式如下：

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物為CB-20C，其結構式如下：

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物為CB-1020，其結構式如下：

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物為CB-1320，其結構式如下：

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物為CB-1820，其結構式如下：

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物為CR19428，其結構式如下：

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物為20R-SM09，其結構式如下：

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物為CB-20R，其結構式如下：

，其中M為放射性同位素。

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物為CB-18G，其結構式如下：

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物為CR19426，其結構式如下：

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物為CB-10S，其結構式如下：

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物為CR19425，其結構式如下：

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物為CB-50S，其結構式如下：

本申請的另一方面揭露了一種藥物組合物，其包含本申請中的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的載體。

在一些實施方式中，所述組合物用於靜脈內、皮下、口服、肌內或心室內施用。

本申請的另一方面揭露了用於向有需要的對象遞送有效負載的方法，包括向所述對象施用治療有效量的本申請中所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽、或者本申請中所述的藥物組合物。

本申請的另一方面揭露了一種用於治療對象中的疾病的方法，包括向所述對象施用治療有效量的本申請中所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，或者本申請中所述的藥物組合物。

在一些實施方式中，本申請中用於治療對象中的疾病的方法還包括將一種或多種治療劑與所述複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，或者所述藥物組合物聯合施用。

本申請的又一方面揭露了一種本申請中所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，或者本申請中所述的藥物組合物在製備治療對象中疾病的藥物中的用途。

本申請的又一方面揭露了一種用於治療對象中疾病的本申請中所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，或者本申請中所述的藥物組合物。

在一些實施方式中，疾病選自下組：癌症、免疫性疾病、心血管疾病、代謝疾病和神經疾病。

在一些實施方式中，癌症選自下組：***癌、乳腺癌、肺癌、腎癌、白血病、卵巢癌、胃癌、子宮癌、子宮內膜癌、肝癌、結腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、結直腸癌、食道癌、皮膚癌、淋巴瘤和多發性骨髓瘤。

在一些實施方式中，免疫性疾病是自體免疫性疾病。在一些實施方式中，自體免疫性疾病選自下組：結締組織病、系統性硬化症、類風濕性關節炎和系統性紅斑狼瘡。

在一些實施方式中，心血管疾病選自下組：心絞痛、心肌梗死、中風、心臟病發作、高血壓性心臟病、風濕性心臟病、心肌病、心臟心律失常和先天性心臟病。

在一些實施方式中，代謝疾病選自下組：糖尿病、痛風、肥胖症、低血糖症、高血糖症和血脂異常。

在一些實施方式中，神經疾病選自下組：阿茲海默病、帕金森病、亨廷頓病、頭部損傷、多發性硬化症、眩暈、昏迷和癲癇。

儘管本申請將揭露各種方面和實施方式，但是顯而易見的是，在不偏離本申請的主旨和範圍的前提下，本領域通常知識者可以對這些方面和實施方式進行各種等同改變和修改。本申請揭露的各個方面和實施方式僅用於說明目的，並非旨在限制，真正的範圍由所附申請專利範圍表示。本申請引用的所有出版物、專利或專利申請通過引用整體併入本申請。除非另外說明，否則本申請中使用的所有科技術語具有的含義與本申請所屬領域通常知識者通常理解的含義相同。

如本文和所附申請專利範圍中所使用的，單數形式「一」、「一個」、「一種」和「所述」包括複數對象，除非上下文清楚地表示不是這樣。術語「一」（或「一個」）、「一個或多個」和「至少一個」在本申請中可以互換使用。還應當注意的是，術語「包含」、「包括」和「具有」可以互換使用。

如本文和所附申請專利範圍中所使用的，術語「類似物」包括結構類似物與功能類似物。其中結構類似物是指具有相似化學結構的一類化合物，它們之間可以存在一個或多個不同的原子、或一個或多個不同的官能基。功能類似物是指具有相同或相似的化學作用、生物作用或藥理學作用的一類化合物。例如，葉酸類似物包括了5-甲基四氫葉酸、5-甲醯基四氫葉酸、甲氨蝶呤和5, 10-亞甲基四氫葉酸。

如本文和所附申請專利範圍中所使用的，術語「衍生物」是指針對某一母體化合物分子，其一個或多個原子或原子團被其他原子或原子團取代而衍生出的一類較複雜的化合物。例如，喜樹鹼衍生物包括了伊立替康、SN-38、Dxd、拓撲替康、GI-147211C、托泊替康、9-氨基喜樹鹼、7-羥甲基喜樹鹼、7-氨基甲基喜樹鹼、10-羥基喜樹鹼、(20S)-喜樹鹼、9-硝基喜樹鹼、吉馬替康、karenitecin、silatecan、勒托替康、依沙替康、二氟替康、貝洛替康、勒托替康和S39625

（I）。

在本申請中使用的術語「有效負載」指的是擬遞送至靶細胞或組織的分子或物質。非限制性地，有效負載可以是旨在用於診斷、治療或預防對象中的疾病的任意分子或物質。在一些實施方案中，所述有效負載具有小於或等於約5kDa的分子量。在一些實施方案中，所述有效負載具有小於或等於約1.5kDa的分子量。在一些實施方案中，所述有效負載是已經被適當的藥物審核和註冊機構（例如，FDA，EMEA或NMPA）認為使用安全且有效的藥物或診斷試劑。

在一些實施方式中，本申請的有效負載是小分子化合物、核苷酸（例如，DNA、質粒DNA、RNA、siRNA、反義寡核苷酸或核酸適體等）、肽或蛋白（例如，酶）。在一些實施方式中，有效負載是小分子化合物。

在一些實施方式中，本申請的有效負載包括但不限於：抗癌藥、放射性物質、維生素、抗-AIDS藥物、抗生素、免疫抑制劑、抗病毒藥物、酶抑制劑、神經毒素、阿片樣藥物、細胞-胞外基質相互作用的調節劑、血管擴張劑、抗高血壓藥、***、抗組胺劑、抗驚厥藥、肌肉鬆弛藥、抗-帕金森物質、抗-痙攣藥和肌肉收縮藥、抗-寄生蟲及/或抗-原生動物藥、鎮痛藥、解熱劑、類固醇和非類固醇抗炎藥、抗-血管生成因子、抗分泌因子、抗凝血劑及/或抗血栓形成劑、局部***、***素、抗抑鬱劑、抗精神病藥物、止吐藥或成像劑。

在一些實施方式中，本申請的有效負載在連接至本申請的複合體化合物之前具有游離的氨基或者羧基，有效負載通過上述氨基或者羧基與複合體化合物的相應部分（例如，連接子）的基團發生醯化反應從而複合至複合體化合物。在一些實施方式中，對上述游離的氨基或者羧基的修飾（例如，通過複合至本申請的複合體化合物）會顯著降低有效負載的活性（例如，降低至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%）。

在本申請中使用的「小分子化合物」指的是具有小於或等於約2kDa分子量的化合物。在一些實施方式中，小分子化合物具有小於或等於約1.5kDa的分子量。在一些較佳的實施方式中，小分子化合物具有小於或等於約1kDa、800Da、700Da、600Da或500Da的分子量。在一些實施方式中，本申請的小分子化合物選自下組：喜樹鹼及其任何衍生物（例如，SN38或Dxd）、澳瑞他汀及其任何衍生物（例如，MMAE和MMAF）、美登素及其任何衍生物、環氧化酶-2抑制劑（例如，塞來昔布）、放射性同位素錯合物、紫杉醇及其任何衍生物、埃博黴素及其任何衍生物、博來黴素及其任何衍生物、更生黴素及其任何衍生物、普卡黴素及其任何衍生物，以及絲裂黴素C。在一些實施方式中，小分子化合物是喜樹鹼及其任何衍生物、澳瑞他汀及其任何衍生物、放射性同位素錯合物或者環氧化酶-2抑制劑。在一些實施方式中，本申請所述的小分子化合物是用於緩解或治療癌症的藥物。在一些實施方式中，本申請所述的小分子化合物是用於緩解或治療自體免疫性疾病的藥物。

本申請中使用的術語「喜樹鹼」是指一種細胞毒性生物鹼，主要來源於珙桐科植物喜樹，其顯示出較強的抗腫瘤活性。本申請的喜樹鹼及其衍生物包括目前已經存在的或者之後產生的喜樹鹼及其衍生物。本申請的喜樹鹼及其衍生物包括但不限於：喜樹鹼、伊立替康、SN-38、Dxd、拓撲替康、GI-147211C、托泊替康、9-氨基喜樹鹼、7-羥甲基喜樹鹼、7-氨基甲基喜樹鹼、10-羥基喜樹鹼、(20S)-喜樹鹼、9-硝基喜樹鹼、吉馬替康、karenitecin、silatecan、勒托替康、依沙替康、二氟替康、貝洛替康、勒托替康和S39625。

本申請中使用的術語「澳瑞他汀及其任何衍生物」是指天然抗腫瘤產品海兔毒素10以及其一系列衍生物，該類化合物通過干擾微觀自組裝使細胞停滯於有絲***期，對細胞具有很強的殺傷力。本申請的澳瑞他汀及其任何衍生物包括目前已經存在的或者之後產生的澳瑞他汀及其任何衍生物。本申請的奧瑞他汀及其衍生物包括但不限於澳瑞他汀、單甲基澳瑞他汀E（MMAE）、單甲基澳瑞他汀F（MMAF）、一甲基澳瑞他汀D（MMAD）、AFP和AFHPA。

本申請中使用的術語「環氧化酶-2抑制劑」是一類特異性的環氧化酶-2抑制劑。環氧化酶-2通過多種機制參與惡性腫瘤的發展和浸潤，環氧化酶-2抑制劑能抑制腫瘤細胞的遷移和黏附以及血管內浸潤，從而抑制惡性腫瘤的發生和發展。本申請的環氧化酶-2抑制劑包括目前已經存在的或者之後產生的環氧化酶-2抑制劑。環氧化酶-2抑制劑包括但不限於塞來昔布、羅非昔布、帕瑞昔布、瓦德昔布和依妥昔布。

本申請中使用的術語「放射性同位素錯合物」是指含有放射性同位素的一類特殊錯合物，錯合物中的螯合劑能夠與放射性同位素螯合，並提供更穩定地結合靶向物質的連接部分。本申請中使用的術語「放射性同位素」是指能自發地放出射線（例如α射線、β射線或γ射線等）的元素。本申請的放射性同位素包括目前已經存在的或者之後產生的所有能用於治療和診斷的放射性同位素。本申請的放射性同位素包括但不限於⁶⁷ Cu、⁶⁴ Cu、⁹⁰ Y、¹⁰⁹ Pd、¹¹¹ Ag、¹⁴⁹ Pm、¹⁵³ Sm、¹⁶⁵ Ho、¹⁶⁶ Ho、¹⁷⁷ Lu 、¹⁸⁶ Re、¹⁸⁸ Re、^99m Tc、⁶⁷ Ga、⁶⁸ Ga、¹¹¹ In、⁹⁰ Y、¹⁷⁷ Lu、¹⁸⁶ Re、¹⁸⁸ Re、¹⁹⁷ Au、¹⁹⁸ Au、¹⁹⁹ Au、¹⁰⁵ Rh、¹⁶¹ Tb、¹⁴⁹ Pm、⁴⁴ Sc、⁴⁷ Sc、⁷⁰ As、⁷¹ As、⁷² As、⁷³ As、⁷⁴ As、⁷⁶ As、⁷⁷ As、²¹² Pb、²¹² Bi、²¹³ Bi、²²⁵ Ac、^117m Sn、⁶⁷ Ga、²⁰¹ Tl、¹²³ I、¹³¹ I、¹⁶⁰ Gd、¹⁴⁸ Nd、⁸⁹ Sr和²¹¹ At。在一些實施方式中，螯合劑是大環螯合劑。本申請的螯合劑包括但不限於H2dedpa、H4octapa、H2azapa、DTPA、CHX-A’’-DTPA、DTPA-bis anhydride、Maleimide-DTPA、DTPA(tBu)4、DiamSar CB-TE2A、Cyclam、DO2A、DOTA、OTA-GA(tBu)₄ 、Maleimide-DOTA-GA、p-NCS-Bz-DOTA-GA、NH2-DOTA-GA、DOTA-GA anhydride、DOTA-tris(tBu) ester、Propargyl-DOTA-tris(tBu) ester、DO3AM-acetic acid、DO3AM-N-(2-aminoethyl)ethanamide、DO3AtBu-N-(2-aminoethyl)ethanamide、DOTA-di(tBu)ester、DOTA-tris(tBu)ester NHS ester、DOTA-NHS ester、Propargyl-DOTA-tris(tBu) ester、DOTADOTA-GA anhydride、DOTA-GA(tBu)₄ 、p-NCS-Bz-DOTA-GA、NH2-DOTA-GA、Maleimide-DOTA-GA、AGuIX、Gado-H、CYCLEN、DO2AtBu、DO3AtBu、DO3AEt、DO3AM、DOTAEt、DOTPrEt、cis-Glyoxal-Cyclen、Mono-N-Benzyl-Cyclen、trans-N-Dibenyl-Cyclen、TriBOC-Cyclen、Mono-N-Benzyl-TACN、DiBOC-TACN、Cross-bridge-Cyclam (CB-Cyclam)、 (13)aneN4、TACN、TACN·3HCl、TACD、Mono-N-benzyl-TACD、DiBOC-TACD、1,7-Dioxa-4,10-diazacyclododecane、C-Methyl-Ester-Cyclam、C-Carboxylic-Acid-Cyclam、trans-N-Dimethyl-Cyclam、TETRAM、TETAEt、TETAMEt2、TETAMMe2、TETAM、CPTA、CB-Cyclam derivatives、CB-TE2A、Methylamino-(13)aneN4、Bis-(13)aneN4、Oxo-(13)aneN4、Mono-N-Benzyl-(13)aneN4、TriBOC-(13)aneN4、TRITRAM、TRI3AEt、TRI3AtBu、TRITAM、TRITA、Mono-N-Benzyl-Cyclam、Formaldehyde-Cyclam、cis-Glyoxal-Cyclam、Dioxocyclam、Oxocyclam、trans-N-Dibenzyl-Cyclam、TriBOC-Cyclam、DOTP、DOTMA、TETA、DOTAM、DiAmSar、CB-Cyclam、CB-TE2A、NOTA、NOTAM、NH₂ -NODA-GA、Iodo-NODA-GA、NCS-MP-NODA、NH2-MPAA-NODA、NODA-GA(tBu)₃ 、NODA-GA-NHS ester、Maleimide-NODA-GA、NOTA-NHS ester、Maleimide-NOTA、Propargyl-NOTA(tBu)₂ 、p-NCS-benzyl-NODA-GA、NOTA(tBu)₂ 、NCS-MP-NODA、NH₂ -MPAA-NODA、NH₂ -NODA-GA、Iodo-NODA-GA和TACN。

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含一個有效負載。在一些實施方式中，本申請的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含兩個或兩個以上有效負載。例如，本申請的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個有效負載。在含有多個有效負載的複合體化合物中，每個有效負載彼此之間可以是相同的或不同的。在一些實施方式中，至少兩個有效負載彼此之間是不同的。

在本申請中使用的術語「靶向分子」指的是能夠將本申請的複合體化合物靶向至靶部位、靶組織、靶器官、靶細胞或靶細胞內區域的任意分子或部分。在一些實施方式中，靶向分子使得，相比於非靶部位、非靶組織、非靶器官、非靶細胞或非靶細胞內區域，靶向分子使得本申請的複合體化合物在靶部位、靶組織、靶器官、靶細胞或靶細胞內區域分配的更多，例如，多至少10%、20%、50%、80%、100%、150%、200%、300%、400%、500%或更高。在一些實施方式中，靶向分子使得，相比於不帶靶向分子，帶有靶向分子的複合體化合物在靶部位、靶組織、靶器官、靶細胞或靶細胞內區域分配的更多，例如，多至少10%、20%、50%、80%、100%、150%、200%、300%、400%、500%或更高。在一些實施方式中，靶向分子能夠觸發或促進含有此類靶向分子的複合體化合物與靶分子的特異性結合，觸發或促進靶細胞對複合體化合物的內吞作用，觸發或促進複合體化合物在靶細胞周圍富集及/或進入靶細胞。

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物包括至少兩個靶向分子。在一些實施方式中，本申請的複合體化合物包括的兩個或更多的靶向分子是相同的或不同的。在一些實施方式中，本申請的複合體化合物包括的兩個或更多的靶向分子中至少兩個靶向分子是不同的。在一些實施方式中，本申請的複合體化合物包括的兩個或更多的靶向分子彼此之間都是不同的。在一些實施方式中，本申請的複合體化合物包括的兩個或更多的靶向分子中至少兩個靶向分子是能夠與不同的細胞表面蛋白或標記物特異性結合。在一些實施方式中，本申請的複合體化合物包括的兩個或更多的靶向分子能夠與不同的細胞表面蛋白或標記物特異性結合。

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物包含至少兩個靶向分子，其中至少一個為協同作用分子。

在本申請中使用的術語「協同作用分子」是指能夠與本申請的複合體化合物包含的其它靶向分子協同作用，以更好的觸發或促進複合體化合物與靶分子的特異性結合，觸發或促進靶細胞對複合體化合物的內吞作用，觸發或促進複合體化合物在靶細胞周圍富集及/或進入靶細胞，及/或以其他形式引起複合體化合物與靶細胞特異性結合和保留的任意分子或部分。在一些實施方式中，協同作用分子使得，相比於非靶部位、非靶組織、非靶器官、非靶細胞或非靶細胞內區域，協同作用分子分子使得本申請的複合體化合物在靶部位、靶組織、靶器官、靶細胞或靶細胞內區域分配的更多，例如，多至少10%、20%、50%、80%、100%、150%、200%、300%、400%、500%或更高。在一些實施方式中，協同作用分子使得，相比於不帶協同作用分子，帶有協同作用分子的複合體化合物在靶部位、靶組織、靶器官、靶細胞或靶細胞內區域分配的更多，例如，多至少10%、20%、50%、80%、100%、150%、200%、300%、400%、500%或更高。在一些實施方式中，協同作用分子使得，相比於不帶協同作用分子，帶有協同作用分子的複合體化合物對靶細胞的作用活性更高，例如，高至少10%、20%、50%、80%、100%、150%、200%、300%、400%、500%或更多。

在一些實施方式中，本申請的協同作用分子是細胞相互作用分子。

在本申請中使用的術語「細胞相互作用分子」指的是能夠與靶細胞的細胞表面物質相互作用以觸發或促進含有此類細胞相互作用分子的複合體化合物與細胞的特異性結合，觸發或促進靶細胞對複合體化合物的內吞作用，及/或觸發或促進複合體化合物在靶細胞周圍富集及/或進入靶細胞。

細胞相互作用分子可以是小的化學分子或大的生物分子。在一些實施方式中，細胞相互作用分子是小分子化合物或者是多肽。在一些實施方式中，細胞相互作用分子是小分子化合物或者是包括2-50、2-40、2-30、2-25、2-22、2-20、2-18、2-15、2-12、2-10、2-8、4-50、5-50、5-40、5-30、5-25、5-22、5-20、5-18、5-15、5-12、5-10、6、7、8、9個胺基酸的多肽。

在一些實施方式中，靶向分子是能夠與細胞表面受體或其它分子結合的配體。在一些實施方式中，至少一個靶向分子是能夠與細胞表面受體或其它分子結合的配體。

本申請的配體可以包括各種各樣的化學或生物分子，其可以對所選定的靶點具有特異性的結合親和性，所選定的靶點可以是例如細胞表面受體、細胞表面抗原、細胞、組織、器官等。在一些實施方式中，配體可以與靶細胞表面上表現的蛋白或標記物特異性結合。在一些實施方式中，本申請的配體以10^-6 ~10^-11 M（K_d 值）的親和性與細胞表面蛋白或標記物結合。在一些實施方式中，本申請的配體以至少10^-7 、至少10^-8 、至少10^-9 M（K_d 值）的親和性與細胞表面蛋白或標記物結合。在一些實施方式中，本申請的配體以低於10^-6 、低於10^-7 、低於10^-8 M（K_d 值）的親和性與細胞表面蛋白或標記物結合。在一些實施方式中，本申請的配體以一定的親和性與細胞表面蛋白或標記物結合，所述一定的親和性是指與同非靶細胞表面蛋白或標記物的親和性相比，配體對靶細胞表面蛋白或標記物的親和性高至少兩倍、三倍、四倍、五倍、六倍、八倍、十倍、二十倍、五十倍、一百倍或更多倍。在一些實施方式中，本申請的細胞表面蛋白或標記物在靶細胞（例如，癌細胞）中的表現顯著高於在正常細胞中的表現。在本申請中使用的術語「顯著」指的是統計學上的顯著差異，或者可以由本領域通常知識者認識到的顯著性差異。

在一些實施方式中，本申請的細胞表面蛋白或標記物在靶細胞（例如，癌細胞）中的表現量是在正常細胞中的表現量的2倍至1,000,000倍，例如在靶細胞（例如，癌細胞）中的表現量比在正常細胞中的表現量高2倍至10倍、2倍至100倍、2倍至1,000倍、2倍至10,000倍、2倍至100,000倍、2倍至1,000,000倍（可以等於上述數值範圍內的任意值，包括該範圍的端點）。在一些實施方式中，細胞表面受體在靶細胞（例如，癌細胞）中的表現量比在正常細胞中的表現量高至少10倍、或者至少100倍、或者至少1,000倍、或者至少10,000倍、或者至少100,000倍。在一些實施方式中，當與靶細胞（例如，癌細胞）上的細胞表面蛋白或標記物的表現量比較時，正常細胞上的細胞表面受體的表現量降低至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。在一些實施方式中，本申請所述的細胞表面蛋白或標記物在正常細胞中是不能檢測到的。

在一些實施方式中，本申請的細胞表面蛋白或標記物是細胞表面受體。

在一些實施方式中，本申請的細胞表面受體選自下組：轉鐵蛋白受體（TFR）、低密度脂蛋白受體（LDLR）、葉酸受體（FR）、生長素抑制激素受體、尿酸激酶受體、腫瘤壞死因子受體（TNFR）、整合素受體（LFA-1）、SST-14受體（SSTR2）、GNRH受體（GNRHR）、TRPV6和整合素α受體。

在一些實施方式中，本申請的細胞表面蛋白或標記物是細胞表面抗原。

在一些實施方式中，本申請的細胞表面抗原選自下組：***特異性膜抗原、MUC1黏蛋白、急性淋巴母細胞共同抗原、Thy-1細胞表面抗原、Melan-A蛋白、鱗狀細胞癌抗原、半乳糖凝集素3和人類白細胞抗原。

在一些實施方式中，本申請的細胞相互作用分子能與選自下組的分子結合：FOLR1、TRPV6、FOLH1(PMSA)、LHRH、Her2、Trop2、Her3、NECTIN4、LRP1、GLUT1、EGFR1、AXL、CA9、CD44、Claudin18.2、APN、DLL3、CEACAM5、FZD10、TFRC、MET、IGFR1、SSTR2、CCKBR、LFA1、ICAM、GPR87、GM-CSF、GM-CSFR、TIM3、TLR家族、CD40、CD40L、OX40、OX40L、GITRL、GITR、4-BBL、4-1BB、CD70、CD27、ICOSL、ICOS、HHLA2、CD28、CD86/80、CD28、MHCII抗原、TCR、CTLA-4、CD155、CD122、CD113、IGIT、PD-L1、PD1、Galectin-9、TIM-3、HVEM、BTLA、CD160、VISTA、B7-H4、B7-H3、磷脂醯絲胺酸、HHLA2、LAG3、Galectin-3、LILRB4、SIGLEC15、NKG2A、NKG2D、SLAMF7、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、FGFR1、FGFR2、FGFR4、NeuGcGM3和CXCR4。

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含***特異性膜抗原配體部分以及協同作用分子部分，所述協同作用分子部分與選自下組的分子結合：FOLR1、TRPV6、FOLH1(PMSA)、SSTR2和LHRH。

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含式（I）所示的配體部分以及協同作用分子部分，所述協同作用分子部分與選自下組的分子結合：FOLR1、TRPV6、SSTR2和LHRH。

在又一些實施方式中，本申請的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含P10以及協同作用分子部分，所述協同作用分子與選自下組的分子結合：FOLR1、TRPV6、FOLH1(PMSA)和LHRH。

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽中的一個協同作用分子是能夠介導內吞作用的內吞作用分子部分。在本申請中使用的術語「內吞作用」指的是複合體化合物或其藥學上可接受的鹽與靶細胞相互作用後，能夠介導其自身被內吞、內化或攝取進入靶細胞。在本申請中使用的術語「內吞作用分子」指的是這樣的分子，即，其與靶細胞相互作用後，能夠介導本申請的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽內吞、內化或攝取進入靶細胞。

在一些實施方式中，內吞作用分子選自下組：葉酸及其類似物、能夠介導內吞作用的肽和穿膜肽。

在一些實施方式中，本申請的內吞作用分子是葉酸或其類似物。

葉酸由於其分子量小、無免疫原性和穩定性好，有利於與其他基團形成化學鍵。葉酸能夠以高親和性與細胞表面上表現的葉酸受體結合以介導細胞攝取葉酸。雖然葉酸受體在大部分正常細胞中的表現量非常低，但是在大量癌細胞中以高量表現以滿足在低葉酸條件下快速***細胞對葉酸的較高需求（參見Kelemen LE,Int J Cancer , 2006; 119: 243-50；Kane MA等，J Clin Invest. 1988; 81: 1398-406；Matsue H等，Proc Natl Acad Sci USA . 1992; 89: 6006-9；Zhao R等，Annu Rev Nutr. 2011; 31: 177-201）。葉酸能夠與細胞表面上的葉酸受體特異性結合，並且其還能介導複合體化合物或其藥學上可接受的鹽進入靶細胞的內吞作用。

在一些實施方式中，葉酸的類似物選自下組：5-甲基四氫葉酸、5-甲醯基四氫葉酸、甲氨蝶呤和5, 10-亞甲基四氫葉酸。

在一些實施方式中，內吞作用分子是能夠介導內吞作用的肽。

在一些實施方式中，能夠介導內吞作用的肽包含選自下組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、Arg-Gly-Asp（稱為RGD）、與SEQ ID NO：16-18中的任意一個具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的胺基酸序列同源性的同源肽，其中所述同源肽分別為SEQ ID NO：16-18所示的肽的功能性等價物。

在一些實施方式中，如本申請所述的能夠介導內吞作用的肽與SEQ ID NO: 16-20、RGD的序列相比，僅在一個胺基酸位點具有胺基酸的保守性取代。在一些實施方式中，如本申請所述的能夠介導內吞作用的肽與SEQ ID NO: 16-20的序列相比，在2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸位點具有胺基酸的保守性取代。

在不影響其生物活性的前提下，如本申請所述的能夠介導內吞作用的肽還可以含有非天然存在的胺基酸，包括例如β-氟丙胺酸、1-甲基-組胺酸、γ-亞甲基-穀胺酸、α-甲基-亮胺酸、4,5-脫氫-賴胺酸、羥脯胺酸、3-氟-***酸、3-氨基-酪胺酸、4-甲基-色胺酸等。

可以採用本領域熟知的多種方法確定同源性百分率。例如，可以通過下述可公開獲得的工具對序列進行比較：BLASTp軟體（可從國家生物技術信息中心（NCBI）的網站獲得：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，亦參見Altschul S.F.等，J. Mol. Biol. , 215:403–410 (1990)；Stephen F.等，Nucleic Acids Res. , 25:3389–3402 (1997)），ClustalW2（可從歐洲生物信息研究所的網站獲得：http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/，亦參見Higgins D.G.等，Methods in Enzymology , 266:383-402 (1996)；Larkin M.A.等，Bioinformatics (Oxford, England), 23(21): 2947-8 (2007)）以及Tcoffee（可從瑞典生物信息研究所的網站獲得，亦參見Poirot O.等，Nucleic Acids Res. , 31(13): 3503-6 (2003)；Notredame C.等，J. Mol. Boil. , 302(1): 205-17 (2000)）。如果使用軟體進行序列比對，則可以使用軟體中提供的默認參數，或者可以以其他方式對參數進行定制以適應比對目的。所有的這些均在本領域通常知識者的知識範圍內。

在本申請中使用的術語「功能性等價物」指的是保留了與衍生肽來源的原始肽序列的生物活性基本上類似的生物活性的衍生肽。功能性等價物可以是天然衍生物或合成製備的。示例性的功能性等價物包括具有一個或多個胺基酸取代、缺失或加入的胺基酸序列，條件是肽的生物活性得以保持。取代的胺基酸理想地具有與被取代的胺基酸類似的化學-物理性質。理想的類似的化學-物理性質包括電荷、蓬鬆性、疏水性、親水性等的相似性。

在一些實施方式中，功能性等價物包括胺基酸殘基的保守性取代。胺基酸殘基的保守性取代指的是具有相似性質的胺基酸之間的取代，例如極性胺基酸之間的取代（例如，穀氨醯胺和天冬醯胺之間的取代）、疏水性胺基酸之間的取代（例如，亮胺酸、異亮胺酸、甲硫胺酸和纈胺酸之間的取代）、以及具有相同電荷的胺基酸之間的取代（例如，精胺酸、賴胺酸和組胺酸之間的取代，或穀胺酸和天冬胺酸之間的取代）等等。

在一些實施方式中，內吞作用分子是穿膜肽。穿膜肽（C ell-P enetratingP eptides, CPP）也稱為蛋白轉導結構域（PTD），是短肽（通常少於40個胺基酸），能夠以不依賴於受體的方式進入細胞內部。穿膜肽與有效負載複合時能夠介導有效負載的跨膜轉運並且具有蛋白轉導活性。在一些實施方式中，本申請所述的穿膜肽選自下組：腫瘤歸巢肽、線粒體穿透肽、可活化細胞穿膜肽和抗菌肽。在一些實施方式中，穿膜肽包含選自下組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 19（RRRRRRRRR，稱為R9）和SEQ ID NO: 20（GRKKRRQRRRPPQ，其是Tat肽，即HIV轉錄蛋白反式激活因子的穿膜肽）。

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽中的一個靶向分子是***特異性膜抗原配體部分。

在本申請中使用的術語「***特異性膜抗原」，是指存在於***上皮細胞膜的一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，由750個胺基酸組成，其具有19個胞內區胺基酸、24個跨膜區胺基酸和707個胞外區胺基酸。***特異性膜抗原在正常***上皮細胞中表現，但其在***癌細胞中的表現量要高得多。相對於傳統用於臨床檢測的***特異抗原，***特異性膜抗原是一種更加敏感和特異的***癌腫瘤標記物，尤其是在激素難治性***癌及***癌轉移灶中均為高表現，在區分***癌和其他類型惡性腫瘤時具有高敏感度和特異性。同時，在多種非***來源的實體瘤（如肺癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、腎癌和結直腸癌等）中，***特異性膜抗原也高度特異地表現於腫瘤血管內皮細胞上。

在本申請中使用的術語「***特異性膜抗原配體」是指能特異性識別並結合***特異性膜抗原的抗體、核酸適配體和小分子等。本申請的***特異性膜抗原配體包括目前已經存在的或者之後產生的***特異性膜抗原配體，還包括前述配體的片段，只要這些片段還保留與***特異性膜抗原結合的能力。抗體類配體是最常見的***特異性膜抗原配體，其包括但不限於單克隆抗體J591、J533、J415和E99（例如，參見Liu H, Rajasekaran AK, Moy P等人Constitutive and antibody-induced internalization of prostate-specific memberane antigen [J]. Cancer Res, 1998, 58 (18): 4055-4060）。核酸適配體是經過指數富集配體系統進行技術篩選得到的能與***特異性膜抗原高親和性、高特異性結合的單鏈DNA或RNA，該類***特異性膜抗原配體包括但不限於xPSM-A10核酸適配體及其衍生物和xPSM-A9核酸適配體及其衍生物（例如，參見Lupoid SE等人，Identification and Characterization of nuclease-stabilized RNA molecules that bind human prostate cancer cells via the prostate-specific membrane antigen , Cncer Res, 2002, 62(14):4029-4033）。相比於抗體類和核酸適配體類配體，***特異性膜抗原小分子配體具有分子量小、高滲透性、低免疫原性、易於合成等優勢，其包括但不限於穀胺醯脲類小分子配體和氨基磷酸酯類小分子配體。

在一些實施方式中，本申請的***特異性膜抗原小分子配體可以選自由以下組成的組：2-[[甲基羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[乙基羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[丙基羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[丁基羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[環己基羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[苯基羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[2-(四氫呋喃基)羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[(2-四氫吡喃基)羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[((4-吡啶基)甲基)羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[((2-吡啶基)甲基)羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[(苯基甲基)羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[((2-苯基乙基)甲基)羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[((3-苯基丙基)甲基)羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[((3-苯基丁基)甲基)羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[((2-苯基丁基)甲基)羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[(4-苯基丁基)羥基氧膦基]甲基]戊二酸；和2-[[(氨甲基)羥基氧膦基]甲基]戊二酸；2-[[甲基羥基氧膦基]氧]戊二酸；2-[[乙基羥基氧膦基]氧]戊二酸；2-[[丙基羥基氧膦基]氧]戊二酸；2-[[丁基羥基氧膦基]氧]戊二酸；2-[[苯基羥基氧膦基]氧]戊二酸；2-[[((4-吡啶基)甲基)羥基氧膦基]氧]戊二酸；2-[[((2-吡啶基)甲基)羥基氧膦基]氧]戊二酸；2-[[(苯基甲基)羥基氧膦基]氧]戊二酸；和2[[((2-苯基乙基)甲基)羥基氧膦基]氧]戊二酸；2-[[(N-羥基)氨基甲醯]甲基]戊二酸；2-[[(N-羥基-N-甲基)氨基甲醯]甲基]戊二酸；2-[[(N-丁基-N-羥基)氨基甲醯]甲基]戊二酸；2-[[(N-苄基-N-羥基)氨基甲醯]甲基]戊二酸；2-[[(N-羥基-N-苯基)氨基甲醯]甲基]戊二酸；2-[[(N-羥基-N-2-苯基乙基)氨基甲醯]甲基]戊二酸；2-[[(N-乙基-N-羥基)氨基甲醯]甲基]戊二酸；2-[[(N-羥基-N-丙基)氨基甲醯]甲基]戊二酸；2-[[(N-羥基-N-3-苯基丙基)氨基甲醯]甲基]戊二酸；2-[[(N-羥基-N-4-吡啶基)氨基甲醯]甲基]戊二酸；2-[[(N-羥基)醯胺]甲基]戊二酸；2-[[N-羥基(甲基)醯胺]甲基]戊二酸；2-[[N-羥基(苄基)醯胺]甲基]戊二酸；2-[[N-羥基(苯基)醯胺]甲基]戊二酸；2-[[N-羥基(2-苯基乙基)醯胺]甲基]戊二酸；2-[[N-羥基(乙基)醯胺]甲基]戊二酸；2-[[N-羥基(丙基)醯胺]甲基]戊二酸；2-[[N-羥基(3-苯基丙基)醯胺]甲基]戊二酸；和2-[[N-羥基(4-吡啶基)醯胺]甲基]戊二酸；2-[(亞硫醯基)甲基]戊二酸；2-[(甲基亞硫醯基)甲基]戊二酸；2-[(乙基亞硫醯基)甲基]戊二酸；2-[(丙基亞硫醯基)甲基]戊二酸；2-[(丁基亞硫醯基)甲基]戊二酸；2-[(苯基亞硫醯基]甲基]戊二酸；2-[[(2-苯基乙基)亞硫醯基]甲基]戊二酸；2-[[(3-苯基丙基)亞硫醯基]甲基]戊二酸；2-[[(4-吡啶基)亞硫醯基]甲基]戊二酸；2-[(苄基亞硫醯基)甲基]戊二酸；2-[(磺醯基)甲基]戊二酸；2-[(甲磺醯基)甲基]戊二酸；2-[(乙磺醯基)甲基]戊二酸；2-[(丙磺醯基)甲基]戊二酸；2-[(丁磺醯基)甲基]戊二酸；2-[(苯基磺醯基]甲基]戊二酸；2-[[(2-苯基乙基)磺醯基]甲基]戊二酸；2-[[(3-苯基丙基)磺醯基]甲基]戊二酸；2-[[(4-吡啶基)磺醯基]甲基]戊二酸；2-[(苄基磺醯基)甲基]戊二酸；2-[(亞碸亞胺基(sulfoximinyl))甲基]戊二酸；2-[(甲基亞碸亞胺基)甲基]戊二酸；2-[(乙基亞碸亞胺基)甲基]戊二酸；2-[(丙基亞碸亞胺基)甲基]戊二酸；2-[(丁基亞碸亞胺基)甲基]戊二酸；2-[(苯基亞碸亞胺基]甲基]戊二酸；2-[[(2-苯基乙基)亞碸亞胺基]甲基]戊二酸；2-[[(3-苯基丙基)亞碸亞胺基]甲基]戊二酸；2-[[(4-吡啶基)亞碸亞胺基]甲基]戊二酸；和2-[(苄基亞碸亞胺基)甲基]戊二酸；N-[甲基羥基氧膦基]穀胺酸；N-[乙基羥基氧膦基]穀胺酸；N-[丙基羥基氧膦基]穀胺酸；N-[丁基羥基氧膦基]穀胺酸；N-[苯基羥基氧膦基]穀胺酸；N-[(苯基甲基)羥基氧膦基]穀胺酸；N-[((2-苯基乙基)甲基)羥基氧膦基]穀胺酸；和N-甲基-N-[苯基羥基氧膦基]穀胺酸。本申請的***特異性膜抗原配體還包括PCT申請WO2010/108125和WO2006/093991中揭露的所有***特異性膜抗原小分子配體，上述兩個專利申請以其全部內容併入本文。

在一些實施方式中，本申請的***特異性膜抗原小分子配體是戊二酸衍生物。在一些實施方式中，本申請的***特異性膜抗原小分子配體是戊二酸的氨羰基衍生物。

在一些實施方式中，本申請的***特異性膜抗原小分子配體包括如下結構：

。

。

在一些實施方式中，本申請的的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽中一個靶向分子是具有式（I）所示的配體部分：

（I），

或者與其具有至少70%、至少80%、至少85%或至少90%的胺基酸序列同源性的配體部分或者與其具有至多3個、2個或1個胺基酸替換（例如，保守性替換）。

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽中一個靶向分子是P10或者與其具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%或至少93%的胺基酸序列同源性的配體部分或者與其具有至多3個、2個或1個胺基酸替換（例如，保守性替換）。

在本申請中使用的術語「P10」指的是具有胺基酸序列Cys-Lys-Glu-Phe-Leu-His-Pro-Ser-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Arg的肽。

在一些實施方式中，本申請提供的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽的兩個靶向分子分別為協同作用分子部分以及***特異性膜抗原配體部分。在一些實施方式中，所述協同作用分子能夠介導內吞作用。在一些實施方式中，本申請提供的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽的兩個靶向分子分別為葉酸或其類似物以及***特異性膜抗原配體部分。

在一些實施方式中，本申請提供的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽的兩個靶向分子分別為協同作用分子部分以及具有式（I）所示的配體部分。在一些實施方式中，所述協同作用分子能夠介導內吞作用。在一些實施方式中，本申請提供的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽的兩個靶向分子分別為葉酸或其類似物以及具有式（I）所示的配體部分。

在一些實施方式中，本申請提供的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽的兩靶向分子分別為協同作用分子部分以及P10。在一些實施方式中，所述協同作用分子能夠介導內吞作用。在一些實施方式中，本申請提供的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽的兩個靶向分子分別為葉酸或其類似物以及P10。

在一些實施方式中，本申請提供的複合體化合物僅包含與兩個靶向分子偶聯的單一有效負載。在一些實施方式中，本申請提供的複合體化合物包含與兩個靶向分子偶聯的多個有效負載。

在本申請中使用的術語「複合的」指的是通過兩個化學基團共價鍵的連接，其可以是在兩個化學基團之間直接形成共價鍵，也可以是通過連接子將兩個化學基團間接連接。

在一些實施方式中，複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含有效負載（例如，1個）和兩個靶向分子，其中有效負載與至少一個靶向分子直接共價連接。在一些實施方式中，有效負載與兩個靶向分子均直接共價連接。

在一些實施方式中，複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含有效負載（例如，1個）和兩個靶向分子，其中有效負載與至少一個靶向分子通過連接子共價連接。在一些實施方式中，有效負載與兩靶向分子均通過連接子共價連接。

在本申請中使用的術語「連接子」指的是將有效負載與靶向分子共價連接的分子或部分。連接子包括用於將有效負載與至少一個靶向分子連接的官能基。在一些實施方式中，官能基可以含有兩個反應性部分，一個用於與有效負載連接，另一個用於與靶向分子連接。在一些實施方式中，官能基彼此之間是不同的。在一些實施方式中，官能基包含含有巰基反應性部分和胺反應性部分的基團。在一些實施方式中，官能基彼此之間是相同的。在一些實施方式中，官能基是馬來醯亞胺基團。在一些實施方式中，連接子含有胺基酸。在一些實施方案中，連接子含有的胺基酸中的羧酸被醯胺化。在一些實施方案中，連接子含有短鏈的聚乙二醇（例如，包括2-10、2-8、3-8、4-8、4-7、4-6或5個重複單元）。

在一些實施方式中，本申請的連接子是能夠結合至少一個（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個）有效負載和至少1個靶向分子的多價連接子。與多價連接子結合的有效負載可以是相同的或不同的，並且與多價連接子結合的靶向分子可以是相同的或不同的。

在一個方面中，連接子應足夠穩定以避免在血液循環過程中意外釋放有效負載，以增加有效負載到靶細胞或組織的有效量並避免毒性。在另一個方面，連接子應能夠在靶細胞周圍或內部釋放有效負載以有效殺死靶細胞或阻斷靶細胞的功能。在一些實施方式中，連接子包含至少一個可裂解官能基。較佳地，可裂解官能基在靶細胞外足夠穩定，但是其在進入靶細胞後裂解以釋放有效負載。在一些實施方式中，可裂解官能基在靶細胞中的裂解效率比在血液或血清中的裂解效率高至少10、20、30、50、100倍或更多倍。

可裂解連接子可以被水解、酶促反應、或還原反應、或通過pH改變所裂解。在一些實施方式中，連接子在特定生理環境下（例如，在適宜pH環境下）是可裂解的。在一些實施方式中，連接子可在pH約6.5或更低的酸性環境中裂解，或通過諸如酶等試劑裂解。在一些實施方式中，連接子對裂解劑敏感。例如，pH、氧化還原電位或存在降解分子。

在一些實施方式中，連接子是不可裂解的。在本申請中使用的不可裂解連接子指的是在細胞內代謝期間基本保持完整的連接子。

在一些實施方式中，連接子是肽類連接子，其由通過肽鍵連接的直鏈或支鏈胺基酸組成。在一些實施方式中，肽類連接子可被在靶細胞周圍或靶細胞中高度或特異性表現的蛋白酶裂解，例如在溶酶體或胞內體中的組織蛋白酶B。本申請所用的肽類連接子的長度可以有多種。通常地，本申請的肽類連接子的長度為1至50個胺基酸。在一些實施方式中，肽類連接子的長度為1至45、1至40、1至35、1至30、1至25、1至20、1至15、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3個、1至2個或1胺基酸。在一些實施方式中，肽類連接子的長度為2至45、2至40、2至35、2至30、2至25、2至20、2至15、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、2至3個或2個胺基酸。本申請所述的肽類連接子的胺基酸數量可以等於上述數值範圍內的任意整數值，包括該範圍的端點。在一些實施方式中，肽類連接子的長度較佳為1、2、3、4或5個胺基酸。在一些實施方式中，肽類連接子是半胱胺酸、賴胺酸、賴胺酸-賴胺酸、纈胺酸-瓜胺酸、***酸-賴胺酸、纈胺酸-賴胺酸、半胱胺酸-賴胺酸、半胱胺酸-穀胺酸天冬胺酸-天冬胺酸和天冬胺酸-天冬胺酸-賴胺酸，可選的，上述胺基酸中的羧酸被醯胺化。

在一些實施方式中，連接子是含有二硫鍵的二硫化物連接子。二硫鍵可以在細胞內的還原環境下裂解，而在循環系統中保持穩定。本申請的二硫化物連接子可以是DSDM、DMDS、MDS或NDMDS。這些二硫化物連接子的結構如下表1中所示。表1：DSDM、DMDS、MDS和NDMDS的結構

名稱	結構
DSDM
DMDS
MDS
NDMDS

在一些實施方式中，連接子是pH依賴型連接子。本申請所述的pH依賴型連接子可以在特定pH環境下裂解。在一些實施方式中，pH依賴型連接子可以在鹼性條件下穩定，但在酸性條件下（例如，在6.5或更低的pH值下）裂解。在一些實施方式中，pH依賴型連接子是順烏頭酸酐。

在一些實施方式中，複合體化合物或其藥學上可接受的鹽的連接子是

、

或者是上述結構與肽類連接子的組合（例如，通過含有1-3個胺基酸的肽類連接子與靶向分子連接）。

在一些實施方式中，複合體化合物或其藥學上可接受的鹽的連接子具有如下結構：

、

，

在一些實施方式中，本申請的連接子可以包含如上文所述的任意一個連接子或其組合。

在一些實施方式中，有效負載與第一靶向分子直接或間接複合，並且第一靶向分子與第二靶向分子直接或間接複合。在一些實施方式中，有效負載與第一靶向分子和第二靶向分子均是直接複合。在一些實施方式中，有效負載與第一靶向分子和第二靶向分子均是間接複合。在一些實施方式中，有效負載與第一靶向分子間接（例如，通過連接子）複合，並且第一靶向分子與第二靶向分子直接或間接複合。在一些實施方式中，有效負載與第一靶向分子通過第一連接子複合，並且有效負載與第二靶向分子通過第二連接子複合。在一些實施方式中，連接子是與至少一個（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個）有效負載和兩個靶向分子結合的多價連接子。

在一些實施方式中，兩個靶向分子彼此之間通過間隔區連接。在一些實施方式中，間隔區可以被由靶細胞特異性表現或將由靶細胞表現的蛋白酶裂解。此類蛋白酶包括例如在下表2中列出的蛋白酶。在一些實施方式中，間隔區包含選自在下表2中列出的胺基酸序列的任意一個的胺基酸序列。表2：酶促可裂解序列列表

蛋白酶	識別位點的胺基酸序列	SEQ ID NO.
組織蛋白酶B	RR	-
豆莢蛋白	ASN	-
Matripase	KSRAEDE	SEQ ID NO: 1
MMP-2	PLGLAG	SEQ ID NO: 2
***特異性抗原	SSLY	SEQ ID NO: 3
基質溶解素-3	AAA	-
TMPRSS2	LLRSLIG	SEQ ID NO: 4
尿激酶型纖溶酶原激活物	SSR	-
活化的蛋白C	LVKR	SEQ ID NO: 5
因子Ixa	LVVR	SEQ ID NO: 6
因子VIIa	QLTR	SEQ ID NO: 7
因子Xa	LEGR	SEQ ID NO: 8
凝血酶	PR	-
鈣蛋白酶-a	PLFAEP	SEQ ID NO: 9
鈣蛋白酶-2	GLGSEP	SEQ ID NO: 10
腸肽酶	DDDDK	SEQ ID NO: 11
MMP-8	GPSG	SEQ ID NO: 12
組織蛋白酶L	PLG	-
原蛋白轉化酶5	RSKR	SEQ ID NO: 13
鈣蛋白酶-3	VGVF	SEQ ID NO: 14

在本申請中使用的術語「可裂解」或「裂解的」指的是在本申請提供的複合體化合物上進行的代謝過程或反應過程，從而將有效負載與靶向分子之間的連接子，或靶向分子之間的間隔區破壞以釋放游離的有效負載或靶向分子。連接子或間隔區被蛋白酶裂解或在特定生理環境（例如，pH環境）下裂解。

在一些實施方式中，複合體化合物具有下述式I、II、III或IV所示的結構，其中n、m、p和q獨立地為0或1，其代表獨立地存在或不存在連接子或間隔區。下式中的「分子」為「靶向分子」的簡稱。

在一些實施方式中，本申請提供的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含如本申請所提供的至少一個（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個）有效負載、如本申請所提供的兩個靶向分子以及任選地如本申請所提供的連接子或間隔區。在一些實施方式中，本申請提供的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含如本申請所提供的一個有效負載、如本申請所提供的一個與細胞表面蛋白或標記物特異性結合的配體、如本申請所提供的一個協同作用分子、以及如本申請所提供的連接子或間隔區。

在一些實施方式中，複合體化合物具有如下所示的式V、VI、VII或VIII的結構，其中n、m、p、q和s獨立地為0或1，其獨立地表示存在或不存在連接子、多價連接子和間隔區。

在一些實施方式中，本申請提供的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含有效負載和兩個靶向分子，其中兩個靶向分子分別為協同作用分子部分以及***特異性膜抗原配體部分，例如CB-20B、CB-20BK、CB-60S、CB-60SK、CB-20C、CB-1020、CB-1320、CB-1820、CR19428、20R-SM09和CB-20R。

在一些實施方式中，本申請提供的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含一個或多個有效負載和兩個靶向分子，其中兩個靶向分子分別為協同作用分子部分以及具有式（I）所示的配體部分，例如CB-18G、CB-1820和CR19426。

在一些實施方式中，本申請提供的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含一個有效負載和兩個靶向分子，其中，兩個靶向分子分別為協同作用分子部分以及P10，有效負載為喜樹鹼及其任何衍生物，例如CB-10S、CR19425和CB-50S。

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物選自由下述化合物組成的組：CB-20B、CB-20BK、CB-60S、CB-60SK、CB-20C、CB-1020、CB-1320、CB-1820、CR19428、20R-SM09、CB-20R、CB-18G、CR19426、CB-10S、CR19425和CB-50S（各複合體化合物的具體結構如圖1所示）。在一些實施方式中，本申請的複合體化合物由連接子-藥物部分與配體部分通過共價鍵連接而成。本申請的連接子-藥物部分包括有效負載和連接子，並且本申請的配體部分包括兩個靶向分子以及可選的間隔區或連接子，兩部分通過反應形成共價鍵後形成本申請的複合體化合物，該共價鍵可以形成於連接子-藥物部分中的連接子與配體部分的配體分子之間，也可以形成於連接子-藥物部分中的連接子與配體部分的間隔區或連接子之間。

本申請的複合體化合物CB-20B由連接子-藥物部分LT1002與配體部分20B-SM09通過共價鍵連接而成。本申請的複合體化合物CB-20BK由連接子-藥物部分LT1002與配體部分20BK-SM09通過共價鍵連接而成。本申請的複合體化合物CB-60S由連接子-藥物部分LT2000C與配體部分60S-SM09通過共價鍵連接而成。本申請的複合體化合物CB-60SK由連接子-藥物部分LT2000C與配體部分60SK-SM09通過共價鍵連接而成。本申請的複合體化合物CB-20C由連接子-藥物部分LD1001與配體部分20BK-SM09通過共價鍵連接而成。本申請的複合體化合物CB-1020由連接子-藥物部分LT1002與配體部分1020BK-SM09通過共價鍵連接而成。本申請的複合體化合物CB-1320由連接子-藥物部分LT1002與配體部分1320BK-SM09通過共價鍵連接而成。本申請的複合體化合物CB-1820由連接子-藥物部分LT1002與配體部分1820BK-SM09通過共價鍵連接而成。本申請的複合體化合物CR19428由連接子-藥物部分CR19423與配體部分20BK-SM09通過共價鍵連接而成。本申請的複合體化合物CB-20R由20R-SM09與放射性同位素離子M絡合。本申請的複合體化合物CB-18G由連接子-藥物部分LT1002與配體部分18G-SM09通過共價鍵連接而成。本申請的複合體化合物CR19426由連接子-藥物部分CR19423與配體部分18G-SM09通過共價鍵連接而成。本申請的複合體化合物CB-10S由連接子-藥物部分LT1000與配體部分CBSM09通過共價鍵連接而成。本申請的複合體化合物CR19425由連接子-藥物部分CR19423與配體部分CBSM09通過共價鍵連接而成。本申請的複合體化合物CB-50S由連接子-藥物部分LT1000N3與配體部分50S-SM09通過共價鍵連接而成。各結構如下表3所示。表3：連接子-藥物部分和配體部分的結構

簡稱	結構
LD1001
LT1000
LT1000N3
LT1002
LT2000C
CBSM09
18G-SM09
20B-SM09
20BK-SM09
20R-SM09
50S-SM09
60S-SM09
60SK-SM09
1020BK-SM09
1320BK-SM09
1820BK-SM09
CR19423

在一些實施方式中，本申請提供的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽進入血液循環和細胞外部（胞間質），由於連接子在胞外環境非常穩定無法釋放藥物分子，則藥物分子的毒性被封閉。該複合體是一個無細胞毒性或低毒性的藥物，不會對正常細胞產生毒害作用。

在一些實施方式中，本申請提供的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽與病變細胞上同時有高表現的多個受體或抗原等作用分子結合，其協同效應大大增加了複合體化合物對靶細胞的親和性，降低了與正常細胞結合的可能。從而可以攜帶高效的毒素藥物如MMAE/Dxd/SN38/放射性同位素錯合物，增強藥效並拓寬治療窗避免藥物副作用。

在一些實施方式中，本申請提供的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽進入靶向細胞內部後，通過細胞內部環境的變化（特異性酶切、pH變化、二硫鍵還原等）連接子可以裂解釋放出藥物分子（相當於去除藥物分子的修飾基團），對腫瘤細胞產生治療作用。

在一些實施方式中，本申請的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽可用於將有效負載特異性地遞送至在靶組織環境中的靶細胞。在通常情況下，複合體化合物或其藥學上可接受的鹽的兩個靶向分子有三個優點。首先，兩個靶向分子能夠以多種方式起作用（通常是協同作用），從而提高治療效果，同時降低副作用。其次，兩個靶向分子結合增加了複合體化合物或其藥學上可接受的鹽對靶受體或靶細胞的親和性或親和力，從而增強其特異性，並且避免了脫靶毒性。最後，當設計合理時，兩個靶向分子的組合可以滿足藥物複合體通常所需的多功能要求。

本申請的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽取得了預料不到的技術效果，包括但不限於：（1）能夠與細胞表面受體結合的配體和能介導內吞作用的協同作用分子的組合使得複合體化合物能夠特異性地進入靶細胞；（2）複合體化合物或其藥學上可接受的鹽增強了藥物化合物的親和性和靶向特異性，從而向患者遞送高效的化療劑（如MMAE），拓寬了此類藥劑的治療窗並避免了副作用；（3）連接子能夠阻止有效負載在靶細胞外（例如，血液循環系統、細胞間質等）釋放，確保了複合體化合物在血液循環中的穩定性並降低了藥物的毒性，進入靶細胞後，連接子被裂解，釋放有效負載，從而發揮藥物的作用，同時，可以避免多重耐藥性（MDR）；（4）多種多樣的藥物可以以本申請的複合體化合物的形式遞送，因此擴大了相關藥物的應用範圍。因此，本申請的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽不僅拓寬了LDC藥物的目標範圍和治療窗，而且還降低了一些藥物的毒性和副作用。

在本申請中使用的術語「多肽」、「蛋白」和「肽」可以是單個胺基酸或者胺基酸的聚合物。如本申請所述的多肽、蛋白或肽可以含有天然存在的胺基酸，以及非天然存在的胺基酸，或者胺基酸的類似物和模擬物。可以通過本領域熟知的任何方法獲得多肽、蛋白或肽，例如但不限於從天然物質中分離和純化、重組表現、化學合成等。

本申請的另一個方面揭露了藥物組合物，所述藥物組合物含有本申請提供的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的載體。

在本申請中使用的術語「藥學上可接受的」指的是在合理的醫學判斷範圍內，其適用於與人和其他動物的細胞接觸而沒有不適當的毒性、刺激性、過敏反應等，並且與合理的效益/風險比是相稱的。

在本申請中使用的術語「藥學上可接受的鹽」指的是本申請的複合體化合物的相對無毒性的、無機和有機酸加成鹽和鹼加成鹽。代表性的酸加成鹽包括氫溴酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、硼酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、萘酸鹽、甲磺酸鹽、葡庚糖酸鹽、乳糖酸鹽、氨基磺酸鹽、丙二酸鹽、水楊酸鹽、丙酸鹽、亞甲基-雙-b -羥基萘甲酸鹽、龍膽酸鹽、羥乙基磺酸鹽、二對甲苯甲醯基酒石酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、環己基氨基磺酸鹽和奎尼酸月桂基磺酸鹽等。鹼加成鹽包括藥學上可接受的金屬和胺鹽。適宜的金屬鹽包括鈉、鉀、鈣、鋇、鋅、鎂和鋁鹽。在一些實施方式中，鈉鹽和鉀鹽是較佳的。適宜的無機鹼加成鹽由金屬鹼製備，所述金屬鹼包括例如氫化鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鋁、氫氧化鋰、氫氧化鎂和氫氧化鋅。適宜的胺鹼加成鹽由具有足夠鹼性的胺製備，以形成穩定的鹽，並且較佳包括以下常用於藥物化學的胺，因為其毒性較低並且是醫療用途可接受的：氨、乙二胺、N-甲基葡糖胺、賴胺酸、精胺酸、鳥胺酸、膽鹼、N, N'-二苄基乙二胺、氯普魯卡因、二乙醇胺、普魯卡因、N-苄基苯乙胺、二乙胺、呱嗪、三羥甲基氨基甲烷、四甲基氫氧化銨、三乙胺、二苄胺、二苯羥甲胺、脫氫樅胺、N-乙基呱啶、苄胺、四甲基銨、四乙基銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、鹼性胺基酸（例如，賴胺酸和精胺酸）以及二環己胺等。

在本申請中使用的術語「藥學上可接受的載體」指的是用於向對象遞送本申請提供的複合體化合物的藥學上可接受的溶劑、混懸劑或任意其他藥學上惰性的載劑，其不干擾複合體化合物的結構和性質。某些這樣的載體能夠將複合體化合物配製成例如片劑、丸劑、膠囊劑、液體、凝膠劑、糖漿劑、漿劑、混懸劑和軟錠劑，供對象口服攝入。某些這樣的載體能夠將複合體化合物製成注射、輸注或局部施用的製劑。

用於本申請提供的藥物組合物中的藥學上可接受的載體包括但不限於，例如藥學上可接受的液體、凝膠或固體載體、水性載劑（例如，氯化鈉注射液、林格氏注射液、等滲右旋糖注射液、無菌水注射液或者右旋糖和乳酸林格氏注射液）、非水性載劑（例如，植物來源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油）、抗微生物劑、等滲劑（例如，氯化鈉或右旋糖）、緩衝劑（例如，磷酸或檸檬酸緩衝劑）、抗氧劑（例如，硫酸氫鈉）、麻醉劑（例如，鹽酸普魯卡因）、混懸劑/分散劑（例如，羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素或聚乙烯吡咯烷酮）、螯合劑（例如，EDTA（乙二胺四乙酸）或EGTA（乙二醇四乙酸））、乳化劑（例如，聚山梨醇酯80（吐溫-80））、稀釋劑、佐劑、賦形劑、或無毒性輔助物質、本領域習知的其他成分或其各種組合。適宜的成分可以包括例如填充劑、黏合劑、緩衝劑、防腐劑、潤滑劑、調味劑、增稠劑、著色劑或乳化劑。

在一些實施方式中，藥物組合物是注射製劑。注射製劑包括無菌水溶液或分散劑、混懸劑或乳劑。在所有情況下，注射製劑應該是無菌的並且應該是流體以便於注射。注射製劑應在生產和儲存條件下保持穩定，並且必須防止細菌和真菌等微生物的污染。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等）及其適宜的混合物及/或植物油的溶劑或分散介質。注射製劑應保持適當的流動性。例如，可以通過使用諸如卵磷脂的包衣、通過使用表面活性劑等保持適當的流動性。可以通過各種抗細菌劑和抗真菌劑實現阻止微生物的作用，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。

在一些實施方式中，藥物組合物是口服製劑。口服製劑包括但不限於膠囊、扁膠囊、丸劑、片劑、錠劑（使用調味基質，通常為蔗糖和***膠或黃蓍膠）、粉劑、顆粒劑、或在水性或非水性液體中的溶液劑或混懸劑、或者作為水包油或油包水液體乳劑、或者作為酏劑或糖漿、或者作為軟錠劑（使用惰性基質，如明膠和甘油，或者蔗糖和***膠）及/或作為漱口劑等。

在用於口服施用的固體劑型（例如，膠囊、片劑、丸劑、糖衣丸、散劑、顆粒劑等）中，將複合體化合物與一種或多種藥學上可接受的載體混合，如檸檬酸鈉或磷酸氫二鈣，及/或下述中的任意一種：（1）填充劑或增量劑，例如，澱粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇及/或矽酸；（2）黏合劑，例如，羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖及/或***膠；（3）保濕劑，例如，甘油；（4）崩解劑，例如，瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯澱粉、海藻酸、某些矽酸鹽和碳酸鈉；（5）溶液阻滯劑，例如，石蠟；（6）吸收促進劑，例如，四級銨化合物；（7）潤濕劑，例如，乙醯基醇和單硬脂酸甘油酯；（8）吸收劑，例如，高嶺土和膨潤土；（9）潤滑劑，例如，滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉及其混合物；以及（10）著色劑。

在用於口服施用的液體劑型中，將複合體化合物與下述中的任意一種混合：藥學上可接受的乳劑、微乳、溶液、混懸劑、糖漿劑和酏劑。除了複合體化合物以外，液體劑型可以含有本領域常用的惰性稀釋劑，例如，水或其他溶劑、增溶劑和乳化劑，例如，乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、異丙醇、1,3-丁二醇、油（特別是，棉籽油、花生油、玉米油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油）、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和脫水山梨醇脂肪酸酯及其混合物。除了惰性稀釋劑以外，口服組合物還可以包含佐劑，例如，潤濕劑、乳化劑和混懸劑、甜味劑、調味劑、著色劑、增香劑和防腐劑。

在一些實施方式中，藥物組合物是口腔噴霧製劑或鼻噴霧製劑。噴霧製劑包括但不限於水性氣霧劑、非水性混懸劑、脂質體製劑或固體顆粒製劑等。水性氣霧劑通過將藥劑的水溶液或混懸液與例行藥學上可接受的載體和穩定劑混合製備。載體和穩定劑根據具體化合物的要求而改變，但是在通常情況下，其包括非離子表面活性劑（吐溫或聚乙二醇）、油酸、卵磷脂、胺基酸，例如，甘胺酸、緩衝溶液、鹽、糖或糖醇。氣霧劑通常由等滲溶液製備，並且能夠通過噴霧遞送。

在一些實施方式中，藥物組合物可以通過與一種或多種其他藥物混合使用。在一些實施方式中，藥物組合物包含至少一種其他藥物。在一些實施方式中，其他藥物是抗腫瘤藥、心血管藥、抗炎藥、抗病毒藥、消化系統藥、神經系統藥、呼吸系統藥、免疫系統藥、皮膚病藥、代謝藥等。

在一些實施方式中，可以通過適宜的途徑向有需要的對象施用藥物組合物，包括但不限於口服、注射（例如，靜脈內、肌內、皮下、皮內、心內、鞘內、胸膜內、腹膜內注射等）、黏膜（例如，鼻內、口內施用等）、舌下、直腸、經皮、眼內和肺部施用。在一些實施方式中，藥物組合物可以靜脈內、皮下、口服、肌內或心室內施用。

由於一些有效負載的性質，例如高毒性、高親水性，因而希望將有效負載更特異性地和更有效地向有需要的對象遞送。例如，在癌症治療中，希望將化療劑特異性地向癌細胞遞送，而不對正常細胞產生毒性。因而，本申請的另一個方面揭露了向有需要的對象遞送有效負載的方法，所述方法包括向對象施用治療有效量的本申請提供的複合體化合物，或其藥學上可接受的鹽，或者本申請提供的藥物組合物。本申請所述的有效負載可以是研究者、獸醫、醫生或其他醫師正在尋找的在組織、系統、動物個體或人中引發生物學或醫學反應以預防、抑制、改善或治療疾病的任何藥劑。

在本申請中使用的術語「對象」指的是人和非人動物。非人動物包括所有的脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物。對象也可以是家畜，例如，牛、豬、羊、家禽和馬，或家養動物，例如，狗和貓。對象可以是雄性（例如，男性）或雌性（例如，女性），可以是老年，成年、青少年、兒童或嬰兒。人可以是高加索人、非洲人、亞洲人、閃族人或其他種族背景人士，或者是這些種族背景的混合。

在本申請中使用的術語「治療有效量」指的是複合體化合物或其藥學上可接受的鹽或藥物組合物在一定程度上減輕對象中疾病或病症的一種或多種症狀的量；使與疾病或病症相關或導致疾病或病症的一個或多個生理或生化參數部分或完全恢復正常的量；及/或降低疾病或病症發病的可能性的量。這種量通常根據多種因素而改變，本領域的普通通常知識者根據本申請提供的說明書的範圍能夠對其進行確定和說明。這些包括但不限於：特定對象及其年齡、體重、身高、一般身體狀況和病史、所使用的特定化合物，以及其製劑的載體和所選擇的施用途徑；以及所治療病況的性質和嚴重程度。

在一些實施方式中，複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，或者藥物組合物的量足以在對象中抑制疾病或病症，或者預防性地抑制或阻止疾病或病症的發病。儘管治療有效量可以在不同對象中改變，但是其範圍通常為從0.01至100 mg/kg，例如0.01至90 mg/kg、0.01至80 mg/kg、0.01至70 mg/kg、0.01至60 mg/kg、0.01至50 mg/kg、0.01至40 mg/kg、0.01至30 mg/kg、0.01至20 mg/kg、0.01至10 mg/kg、0.01至5 mg/kg、0.01至4 mg/kg、0.01至3 mg/kg、0.01至2 mg/kg、0.01至1 mg/kg、0.01至0.1 mg/kg。本申請所述的治療有效量可以等於上述數值範圍內的任意值，包括該範圍的端點。

本申請的另一個方面揭露了一種向有需要的對象遞送有效負載的方法，所述方法包括向對象施用治療有效量的本申請提供的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，或者本申請提供的藥物組合物。

本申請的另一個方面揭露了用於治療對象中的疾病的方法，所述方法包括通過向對象施用治療有效量的本申請提供的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，或者本申請提供的藥物組合物。

在一些實施方式中，疾病是癌症，包括但不限於***癌、乳腺癌、肺癌、腎癌、白血病、卵巢癌、胃癌、子宮癌、子宮內膜癌、肝癌、甲狀腺癌、胰腺癌、結腸癌、結直腸癌、食道癌、皮膚癌、淋巴瘤和多發性骨髓瘤。

在一些實施方式中，癌症的癌症細胞具有本申請提及的細胞表面受體或抗原的表現。在一些實施方式中，癌症的癌症細胞具有本申請提及的細胞表面受體或抗原的高表現（例如，根據Depmap數據（參見https://depmap.org/portal/），相應的基因表現至少為0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10以上）。在一些實施方式中，癌症的癌症細胞具有FOLR1和FOLH1、TRPV6和FOLH1、GNRHR和FOLH1、SSTR2和FOLH1、FOLR1和SSTR2、或TRPV6和FOLR1的高表現。在一些實施方式中，疾病是免疫性疾病，例如，自體免疫性疾病，包括但不限於結締組織病、系統性硬化症、類風濕性關節炎和系統性紅斑狼瘡。

在一些實施方式中，疾病是心血管疾病，包括但不限於心絞痛、心肌梗死、中風、心臟病發作、高血壓性心臟病、風濕性心臟病、心肌病、心臟心律失常和先天性心臟病。

在一些實施方式中，疾病是代謝疾病，包括但不限於糖尿病、痛風、肥胖症、低血糖症、高血糖症和血脂異常。

在一些實施方式中，疾病是神經疾病，包括但不限於阿茲海默病、帕金森病、亨廷頓病、頭部損傷、多發性硬化症、眩暈、昏迷和癲癇。

在一些實施方式中，本申請提供的方法還包括將一種或多種治療劑與複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，或者藥物組合物聯合施用。在一些實施方式中，治療劑靶向抗癌治療靶點，誘導或增強針對癌症的免疫反應，或者是化療劑。

以下將通過具體實施例更詳細地描述本申請。提供以下實施例僅用於說明目的，並且不旨在以任何方式限制本發明。本領域通常知識者將容易地意識到可以對多種非關鍵參數進行改變或修改以產生基本上相同的結果。實施例

以下實施例旨在進一步說明本申請。通過描述，本申請的優點和特徵將變得清楚。然而，這些說明僅僅是示例性的，並且不應將其理解為對本申請的範圍的限制。

實施例 1 ：複合體化合物的製備

複合體化合物CB-20BK、CB-18G、CB-20B、CB-10S、CB-20C、FA-MMAE、CB-20AK、CB-1020、CB-1320和CB-1820的合成

1. 稱取取代度為0.45mmol/g的Rink amide-am 樹脂（下稱「Rink Resin」，西安藍曉科技新材料股份有限公司，貨號183599-10-2）10g，將其裝載於固相反應柱中，加入DCM，氮氣鼓泡至溶劑中，使樹脂溶脹30分鐘；抽掉溶劑，用DBLK脫除樹脂上的Fmoc保護基團，再用DMF洗滌5次。稱取Fmoc-Lys(Dde)-OH 4.79g（9mmol），HOBt 1.47g（10.8mmol），用DMF溶解，0℃冰水浴下向上述溶液中加入DIC1.67ml（10.8mmol），混合使其活化5分鐘，將該溶液加入上述反應柱中，反應3小時後，抽乾溶劑，洗滌反應柱中的樹脂3遍。然後用DBLK脫除Fmoc保護基團。

2. 重複上述操作，按照結構依次複合Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH以及中間體108。

（中間體108）

3. 用2%水合肼/DMF脫除Dde保護基兩遍，每次10分鐘，再用DMF洗滌樹脂5次。依次複合Fmoc-Glu-OtBu以及蝶酸。最後用甲醇收縮樹脂兩遍，抽乾溶劑，獲得保護肽樹脂17.4g。

4. 將上一步得到的肽樹脂17.4g加入到250ml單口燒瓶中，預先配置裂解液139ml，TFA:H₂ O:TIS=95:3:2（體積比），並稱量2.1g DTT加入裂解液中。將裂解液加入到上述燒瓶中，室溫反應2.5小時，過濾，樹脂繼續用30ml TFA洗滌，合併上述濾液，並加入到834ml無水***中，此時有黃色固體析出，離心得到固體，無水***洗滌固體，真空乾燥得到黃色固體6.4 g，粗產物產率93.4%。HPLC純度82.3%。經HPLC製備分離（製備條件：C18管柱，流動相A：0.1%三氟乙酸水溶液、B：乙腈，洗脫梯度(15-25)%B，時間60分鐘，收集餾分），將含有合格產品的餾分凍乾得到20BK-SM09 4.73g，純度為98.8%。

5. 稱取Mc-Val-Cit-PAB-MMAE（LT1002）4.09g（3.11mmol）加入到1000ml單口燒瓶中，並加入500ml磷酸緩衝液和100ml乙腈，攪拌，保持pH=7.2至澄清，加入中間體4.73g（3.11mmol）20BK-SM09，室溫反應2小時，期間HPLC監測反應。待反應完全後，過濾，濾液通過HPLC製備分離（製備條件：C18管柱，流動相A：碳酸氫銨溶液（pH=7.2）、B：乙腈，洗脫梯度(25-35)%B，時間60分鐘，收集餾分），將含有合格產品的餾分凍乾得到CB-20BK 6.96g產物，純度98.8%，產率為78.8%。

同理，通過與以上方法類似的步驟可獲得複合體化合物CB-18G、CB-20B、CB-10S、CB-20C、FA-MMAE（結構如下所示）、CB-20AK（結構如下所示）、CB-1020、CB-1320和CB-1820。

（FA-MMAE）

（CB-20AK）

複合體化合物CB-50S、CB-60S和CB-60SK的合成

1. 稱取取代度為1.1mmol/g的王樹脂（下稱「Wang Resin」，西安藍曉科技新材料股份有限公司，貨號1365700-43-1）10g，將其裝載於固相反應柱中，加入DMF，氮氣鼓泡至溶劑，溶脹30分鐘；稱取Fmoc-Arg(pbf)-OH 14.3g（22mmol），HOBt 3.56g（26.4mmol），DMAP 0.27g（2.2mmol），用DMF溶解，0℃冰水浴下加入4.1 ml DIC（26.4mmol），混合使其活化5分鐘，將該溶液加入反應柱，反應3小時後，抽乾溶劑，洗滌3遍。

2. 將10.4ml醋酸酐、8.9ml吡啶溶於50ml DMF中，混合加入以上洗滌後的樹脂，室溫封閉5小時，DMF洗滌三次，甲醇收縮後抽乾樹脂，得到Fmoc-Arg(pbf)-Wang Resin，檢測取代度為0.53mmol/g。

3. 稱取Fmoc-Arg(pbf)-Wang Resin（Sub=0.53mmol/g）3.8克（2mmol）於反應柱中，用DMF清洗3次，再加入DMF使樹脂溶脹30分鐘。然後用DBLK脫除Fmoc保護基團，再用DMF洗滌6次。稱取Fmoc-Pro-OH 2.0g（6mmol），HOBt 0.97g（7.2mmol），用DMF溶解，0℃冰水浴下加入1.1ml DIC（7.2mmol），混合使其活化5分鐘，加入反應柱，反應2小時，然後用DBLK脫除Fmoc保護基團。

4. 重複上述操作，按照結構依次複合Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-propargyl-Gly-OH、Fmoc-Glu-OtBu以及蝶酸。用甲醇收縮兩次，抽乾溶劑，獲得肽樹脂8.4g。

5. 將上一步得到的肽樹脂8.4g加入到250ml單口燒瓶中，預先配置裂解液67ml，TFA:H₂ O:TIS=95:3:2（體積比），並稱量0.92g DTT加入裂解液中。將裂解液加入到燒瓶中，室溫反應2.5小時，濾掉樹脂，樹脂用20ml TFA洗滌，合併濾液，加入到402ml無水***中析出黃色固體，離心得到固體，無水***洗滌固體，真空乾燥得到黃色固體4.06g，粗產物產率97.3%。HPLC純度84.6%。經HPLC製備分離（製備條件：C18管柱，流動相A：0.1%三氟乙酸水溶液、B：乙腈，洗脫梯度(20-29)%B，時間60分鐘，收集餾分），將含有合格產品的餾分凍乾得到50S-SM09 2.86g，純度為97.6%。

6. 稱取LT1000N3 1.29g（1.37mmol）加入到500ml單口燒瓶中，並加入270ml混合溶劑（ACN:H₂ O=1:4），CuBr 393mg（2.74mmol），攪拌。加入中間體2.86g（1.37mmol） 50S-SM09，室溫反應2-3小時，期間HPLC監測反應。反應完全後，過濾，通過HPLC製備分離（製備條件：C18管柱，流動相A：0.1%三氟乙酸水溶液、B：乙腈，洗脫梯度(22-40)%B，時間60分鐘，收集餾分），將含有合格產品的餾分凍乾得到CB-50S 3.17g，純度98.6%，產率為76.4%。

同理，通過與以上方法類似的步驟可獲得複合體化合物CB-60S和CB-60SK。

CB-20R的合成

1. 稱取取代度為0.45mmol/g的Rink Resin 5g，將其裝載於固相反應柱中，加入DCM，氮氣鼓泡至溶劑，使樹脂溶脹30分鐘；抽掉溶劑，用DBLK脫除樹脂上的Fmoc保護基團，再用DMF洗滌5次。稱取Fmoc-Lys(Dde)-OH 2.4g（4.5mmol），HOBt 0.74g（5.4mmol），用DMF溶解，0℃冰水浴下加入DIC 0.84ml（5.4mmol），混合使其活化5分鐘，加入反應柱，反應3小時後，抽乾，洗滌3遍。然後用DBLK脫除Fmoc保護基團。

3. 用2%水合肼/DMF脫除Dde保護基兩遍，每次10分鐘，再用DMF洗滌5次。複合DOTA-tris(tBu) ester。再用2%水合肼/DMF脫除Dde保護基兩遍，每次10分鐘，再用DMF洗滌5次。依次複合Fmoc-Glu-OtBu和蝶酸，最後用甲醇收縮兩遍，抽乾，獲得保護肽樹脂9.2g。

4. 將上一步得到的肽樹脂9.2g加入到250ml單口燒瓶中，預先配置裂解液74ml，TFA:H₂ O:TIS=95:3:2（體積比），並稱量1.05g DTT加入裂解液中。將裂解液加入到燒瓶中，室溫反應2.5小時，濾掉樹脂，樹脂用20ml TFA洗滌，合併濾液，加入到560ml無水***中析出黃色固體，離心，無水***洗滌固體，真空乾燥得到黃色固體3.8 g，粗產物產率87.4%。HPLC純度81.2%。經HPLC製備分離（製備條件：C18管柱，流動相A：0.1%三氟乙酸水溶液、B：乙腈，洗脫梯度(15-25)%B，時間60分鐘，收集餾分），將含有合成產品的餾分凍乾得到20R-SM09 2.9g，純度為97.8%。

5. 將20R-SM09與放射性同位素離子M絡合獲得CB-20R。具體的，將放射性標記物¹⁷⁷ Lu（約50MBq）與100μl 0.5M的乙酸鈉緩衝液（pH = 5）混合。將40μl溶於10％DMSO水溶液的1mM CB-20R溶液、2μl飽和抗壞血酸溶液和100μl含¹⁷⁷ Lu溶液進行混合，加熱至95℃並保持10分鐘。所述標記通過radio-HPLC檢驗（在5分鐘以內，0-100％ACN水溶液，C18柱）。

化合物CR19425的合成

1. N₂ 保護下，往反應瓶中加入441.4mg CR19420（結構如上反應步驟中所示）、8.0mL DMF，攪拌溶解，冰浴降溫，加入459.2mg HATU，加入380μL DIPEA，攪拌半小時；加入500.0mg CR19419（結構如上反應步驟中所示），加入190μL DIPEA，室溫反應直至完畢。反應完畢後，將反應液倒入醋酸水中，析出固體，過濾，濾餅用醋酸水洗滌，水洗，真空乾燥得到835.7mg CR19421（結構如上反應步驟中所示），棕色粉末，HPLC純度：90.0%，產率：90.6%。

2. N₂ 保護下，往反應瓶中加入835.7mg CR19421、16mL 10%呱啶DMF溶液，室溫下反應半小時。反應完畢後，將反應液倒入TFA/MTBE中，析出固體，過濾，濾餅用MTBE洗滌，真空乾燥得到599.7mg CR19422（結構如上反應步驟中所示），土灰色粉末，HPLC純度：84.7%，產率：83.0%。

3. N₂ 保護下，往反應瓶中加入599.7mg CR19422、586.7mg CR19424（結構如上反應步驟中所示）、15mL DMF，攪拌溶解，冰浴降溫，加入495.7mg HATU，加入410μL DIPEA，室溫反應。反應完畢後，將反應液製備純化，製備純品液減壓除去乙腈，二氯甲烷甲醇混合溶劑萃取，濃縮乾燥得674.9mg CR19423（結構如上反應步驟中所示），黃色粉末，HPLC純度：88.4%，產率：63.1%。

4. N₂ 保護下，往反應瓶中加入14.8mg CR19423，3.0mL pH=6.6的PBS緩衝液，3.0mL乙腈，攪拌溶解，加入32.9mg CBSM09，用Na₂ HPO₄ 調pH至6.6~6.8，反應半小時。反應完畢後，將反應液製備純化，製備純品冷凍乾燥得21.8mg CR19425，黃色粉末，HPLC純度：95.6%，產率：48.8%。

化合物CR19426的合成

1. N₂ 保護下，往反應瓶中加入25.2mg CR19423，3.0mL pH=6.6的PBS緩衝液，3.0mL乙腈，攪拌溶解，加入55.5mg 18G-SM09，用Na₂ HPO₄ 調pH至6.6~6.8，反應半小時。反應完畢後，將反應液製備純化，製備純品冷凍乾燥得44.6mg CR19426，黃色粉末，HPLC純度：95.4%，產率：55.2%。

化合物CR19428的合成

1. N₂ 保護下，往反應瓶中加入486mg CR19423，3.0mL pH=6.6的PBS緩衝液，3.0mL乙腈，攪拌溶解，加入712mg 20BK-SM09，用Na₂ HPO₄ 調pH至6.6~6.8，反應半小時。反應完畢後，將反應液製備純化，製備純品冷凍乾燥得508mg CR19428，黃色粉末，HPLC純度：96.7%，產率：42.3%。實施例 2 ：複合體化合物與靶蛋白的親和力測定

CB-20BK與蛋白FOLR1結合的親和力測定

實驗儀器、材料及試劑 BIAcore T200（GE） CM5晶片（GE，貨號：29104988）緩衝液：HBS-EP+緩衝液 10X（GE，貨號：BR100669），使用前用去離子水稀釋10倍。氨基複合試劑盒（GE，貨號：BR100050）再生試劑：10mM Glycine 2.0（GE，貨號：BR100355） 10mM Glycine 3.0（GE，貨號：BR100357）

實驗步驟

按照BIAcore T200（GE）使用手冊進行實驗，測定分析物Biotin-CB-20BK、葉酸（FA）和FA-MMAE與FOLR1的親和力。其中CM5晶片複合配體FOLR1（R&D System，貨號5646-FR）。實驗結果如表4所示。表4. CB-20BK和相關化合物與FOLR1結合的親和力

	ka	kd	KD
FA （葉酸）	3.335×10⁶ M^-1 s^-1	2.258×10^-4 s^-1	6.770×10^-11 M
FA-MMAE	1.789×10⁶ M^-1 s^-1	1.150×10^-4 s^-1	6.429×10^-11 M
CB-20BK	1.033×10⁶ M^-1 s^-1	1.312×10^-4 s^-1	1.269×10^-10 M

表4顯示，CB-20BK和FOLR1結合，並顯示出良好的親和力。

CB-20BK與蛋白FOLH1結合的親和力測定

和FOLH1結合，並顯示出良好的親和力。實施例 3 ：配體複合物與靶細胞的結合和內吞研究

複合體化合物CB-20BK的細胞結合和內吞實驗

標記樣品Cy5-pep-20BK、Cy5-FA(CONH₂ )和Cy5-pep-20AK的合成

1. 稱取取代度為0.45mmol/g的Rink Resin 2g，將其裝載於固相反應柱中，加入DCM，氮氣鼓泡至溶劑，使樹脂溶脹30分鐘；抽掉溶劑，用DBLK脫除Fmoc保護基團，再用DMF洗滌5次。稱取Fmoc-Lys(Dde)-OH 0.96g（1.8mmol），HOBt 0.3g（2.2mmol），用DMF溶解，0℃冰水浴下加入DIC 0.33ml（2.2mmol），混合使其活化5分鐘，加入反應柱，反應3小時後，抽乾，洗滌3遍。然後用DBLK脫除Fmoc保護基團。

2. 重複上述操作，按照結構依次複合Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH以及中間體108：

3. 用2%水合肼/DMF脫除Dde保護基兩遍，每次10分鐘，再用DMF洗滌5次。依次複合Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Glu-OtBu以及蝶酸。

4. 然後用2%水合肼/DMF脫除Dde保護基兩遍，每次10分鐘，再用DMF洗滌5次，複合Cy5-COOH後，用DMF洗滌2次，最後用甲醇收縮兩遍，抽乾，獲得保護肽樹脂3.6g。

5. 將上一步得到的肽樹脂3.6g加入到50ml單口燒瓶中，預先配置裂解液29ml，TFA:H₂ O:TIS=95:3:2（體積比），並稱量0.4g DTT加入裂解液中。將裂解液加入到燒瓶中，室溫反應2.5小時，濾掉樹脂，樹脂用8ml TFA洗滌，合併濾液，加入到173ml無水***中析出黃色固體，離心，無水***洗滌固體，真空乾燥得到藍色固體1.9g，粗產物產率89.6%。HPLC純度76.3%。經HPLC製備分離（製備條件：C18管柱，流動相A：0.1%三氟乙酸水溶液、B：乙腈，洗脫梯度(20-28)%B，時間50分鐘，收集餾分），將含有合格產品的餾分凍乾得到Cy5-pep-20BK 736mg，純度為93.4%。

同理，通過與以上方法類似的步驟可獲得化合物Cy5-FA(CONH₂ )和Cy5-pep-20AK。

（Cy5-pep-20BK）

（Cy5-pep-20AK）

（Cy5-FA(CONH₂ )）

細胞：NCI-H460人肺癌細胞、DU145人***癌細胞、LNcap人***癌細胞、KB人口腔表皮樣癌細胞

實驗方案/過程：

螢光標記的化合物與細胞在37度下，孵育15和30分鐘。細胞經過3次沖洗後，細胞的螢光強度採用流式細胞進行檢測。

結果與分析表5. FOLR1和FOLH1在不同細胞系中的表現量（參考Depmap的數據，來源：https://depmap.org/portal/）

細胞系	LNCap	DU145	NCI-H460	KB	Hela	SKOV-3	NCI-H460	A549
FOLR1	5+	-	-	+	8+	6+	+/-	+/-
FOLH1	10+	-	-	-	N/A	N/A	N/A	N/A

根據Depmap的數據，四捨五入表示表現情況，其中數據為0或者負數的表示為「-」，為0.001-0.499的表示為「+/-」，為0.500-1.499的表示為「+」，為1.500-2.499的表示為「2+」，以此類推，「N/A」表示未查詢到數據。

檢測細胞的螢光強度，將結果製圖示於圖2A和2B。可知樣品Cy5-pep-20BK在15分鐘和30分鐘與不同細胞的結合並內吞，在FOLR1相對高表現的細胞系LNCaP、KB細胞中，結合和內吞的CB-20BK的螢光強度明顯高於它在FOLR1和FOLH1相對低表現的DU145細胞系和NCI-H460細胞系中的螢光強度。Cy5-pep-20AK只有FOLH1配體，沒有FOLR1的配體FA，所以，Cy5-pep-20AK只在高表現FOLH1細胞系的LNCaP細胞中顯示高量的結合和內吞。配體複合物與細胞結合內化的程度與細胞相關受體表現量呈現正相關性。

單配體複合物Cy5-FA與細胞的結合和內吞實驗

標記樣品：Cy5-FA(CONH₂ )

細胞系：Hela子宮頸癌細胞、SKOV3人卵巢癌細胞和A549人肺癌細胞

實驗方案/過程：

根據圖3顯示可知，樣品Cy5-FA在15分鐘、30分鐘與細胞的結合及內吞，在FOLR1高表現的細胞系Hela和SKOV-3中的螢光強度明顯高於FOLR1相對低表現的細胞系A549中的螢光強度。配體複合物與細胞結合內化的程度與細胞相關受體表現量呈現正相關性。實施例 4 ：複合體化合物的細胞擴增抑制實驗

1. CB-20BK 腫瘤細胞擴增抑制實驗

樣品信息：CB-20BK

細胞系：KB人口腔表皮樣癌細胞、T-47D人乳腺癌細胞、NCI-H460人肺癌細胞、CALU-3人肺腺癌細胞、HuH-7人肝癌細胞和LNCaP人***癌細胞

主要試劑：IMDM培養基、胎牛血清、青黴素-鏈黴素溶液、L-穀氨醯胺、CCK8

實驗操作：

1）細胞鋪盤

提前準備好細胞，Trypsin消化、收集計數，使用完全細胞培養基將KB細胞稀釋成2.5×10⁴ 個細胞/ml，T-47D細胞稀釋成1.3×10⁴ 個細胞/ml，NCI-H460細胞稀釋成3.5×10⁴ 個細胞/ml，CALU-3細胞稀釋成4.0×10⁴ 個細胞/ml，HuH-7細胞稀釋成3.0×10⁴ 個細胞/ml，LNCaP細胞稀釋成8.0×10⁴ 個細胞/ml，鋪96孔盤，每個孔加入100μl稀釋的細胞溶液，每塊盤設置陰性及空白對照孔。將加好細胞的96孔盤置於37℃，5% CO₂ 培養箱培養過夜。

2）稀釋加樣

將樣品用培養基稀釋到所需濃度（參見表6）。按照每孔50μl加入到過夜培養後的96孔盤中，3個複孔，並設立陰性對照和空白對照，置於37℃，5% CO₂ 培養箱培養72小時。表6：樣品（CB-20BK）稀釋後濃度

管號	稀釋後濃度μmol/L
1	201
2	50
3	13
4	3.1
5	0.8
6	0.2
7	0.05
8	0.01
9	0.003
10	0.0008

3）顯色讀盤

取CCK-8顯色液，每孔加入15μl（孔內液體體積的10%），37℃孵育適宜時間（儘量使OD值在1.0-2.0範圍內），96孔盤去掉培養盤蓋，置於酶標儀（Molecular Devices Spectra MAX Plus），450nm讀數數值。

4）數據處理

用SoftMax Pro進行數據編輯，繪四參數擬合曲線。

5）實驗結果與分析

根據四參數擬合曲線圖（圖4A，其中C值對應於IC₅₀ ），CB-20BK對KB、T-47D、NCI-H460、CALU-3、HuH-7以及LNCaP腫瘤細胞系生長擴增都有抑制作用。由於細胞中複合體化合物相應的受體表現量有不同，所以抑制量有所差異。針對受體相對高表現的細胞株T-47D、KB、LNCaP、HuH-7和CALU-3的IC₅₀ 明顯低於受體相對低表現的細胞株NCI-H460。CB-20BK顯示出了抑瘤效果與細胞相關受體表現量的相關性。

2. 複合體化合物 CB-20BK 及相關化合物對腫瘤細胞系 LNCaP （人***癌細胞）和 22RV1 （人***癌細胞）擴增的抑制實驗

由於不同細胞對配體複合物中的有效負載的細胞增殖抑制毒性的敏感度不同，偶爾會干擾定量分析。我們挑選了一系列不同配體的受體表現量已知的細胞系，同時檢測它們對配體複合物和單獨有效負載細胞增殖抑制作用的反應。取單獨有效負載與配體複合物在一個細胞系中的IC₅₀ 的比值，從而去除這種干擾。

相關樣品：MMAE、CB-20BK、CB-20AK和FA-MMAE

實驗操作：將提前準備好的LNCaP和22RV1計數，分別以4×10⁴ 細胞/ml和2.0×10⁴ 細胞/ml的細胞密度鋪96孔細胞培養盤，100μl/孔，每塊盤設置相應的陰性及空白對照孔，貼壁過夜後，按50μl/孔加入稀釋好的待測樣品，放置於37℃，5% CO₂ 培養箱中，培養68-72小時，加入CCK8顯色液，每孔加入15μl（孔內液體體積的10%），37℃孵育45-70分鐘，置於酶標儀450nm讀取數值。用SoftMax Pro進行數據編輯，繪4-P擬合曲線。計算出的數據如表7所示。表7. FA-MMAE、CB-20BK和CB-20AK對細胞系增殖的抑制作用和細胞系中受體基因的表現量（參考Depmap數據）

細胞系	FOLR1_基因表現量	FOLH1_基因表現量	IC⁵⁰ (MMAE)	IC⁵⁰ (FA-MMAE)	IC⁵⁰ (CB-20AK)	IC⁵⁰ (CB-20BK)	IC₅₀ 比值 (MMAE/FA-MMAE)	IC₅₀ 比值 (MMAE/CB-20AK)	IC₅₀ 比值 (MMAE/CB-20BK)
LNCaP	+/-	10+	0.0026	0.264	0.102	0.0958	0.0098	0.025	0.0266
22RV1	+/-	6+	0.0065	1.01	1.05	0.502	0.0064	0.00617	0.0129

由上表可知，LNCaP和22RV1的FOLR1表現量差距不大，LNCaP的FOLH1表現量顯著高於22RV1的FOLH1表現量。CB-20BK（有FOLH1的配體和FOLR1配體）和CB-20AK（只有FOLH1的配體）對LNCaP和22RV1腫瘤細胞系擴增均有抑制作用。CB-20BK和CB-20AK對於受體FOLH1表現量有不同的細胞抑制程度有所差異，在受體FOLH1相對高表現細胞株LNCaP中，IC₅₀ 比值（MMAE/CB-20AK或MMAE/CB-20BK）高於受體相對低表現細胞株22RV1的IC₅₀ 比值2-4倍。FA-MMAE對LNCaP和22RV1腫瘤細胞系擴也有抑制作用。由於LNCaP和22RV1的FOLR1表現量很低，在LNCaP細胞中的表現（FOLR1基因表現量為0.3219，參考Depmap數據）略高於在22RV1中的表現（FOLR1基因表現量為0.0704，參考Depmap數據），FA-MMAE在LNCaP和22RV1的IC₅₀ 比值（MMAE/FA-MMAE）的差距只有1.5倍。上述數據表明細胞增殖抑制效果與細胞表現受體FOLH1和FOLR1表現量呈現正相關性。

3. 複合體化合物 CB-20BK 及相關化合物對腫瘤細胞系 PANC-1 （人胰腺癌細胞）和 CFPAC-1 （人胰腺癌細胞）擴增的抑制實驗

相關樣品：MMAE和CB-20BK

實驗操作：提前準備好細胞計數，PANC-1和CFPAC-1以4×10⁴ 細胞/ml的細胞密度鋪96孔盤，100 μl/孔，每塊培養盤設立相應的陰性及空白對照孔，貼壁過夜後，按50μl/孔加入稀釋好的待測樣品，放置於37℃，5% CO₂ 培養箱中，培養68-72小時，加入CCK8顯色液，每孔加入15μl（孔內液體體積的10%），37℃孵育45-70分鐘，置於酶標儀450nm讀取數值。用SoftMax Pro進行數據編輯，繪4-P擬合曲線。計算出的數據如下表所示：表8.CB-20BK對細胞系增殖的抑制作用和細胞系受體基因的表現量（參考Depmap數據）

細胞系	FOLR1基因表現量	FOLH1基因表現量	IC₅₀ (MMAE)	IC₅₀ (CB-20BK)	IC₅₀ (MMAE)/ IC₅₀ (CB-20BK)
CFPAC-1	4+	+/-	0.015	0.557	0.027
PANC-1	+/-	+/-	0.002	0.126	0.020

由表8可知，CFPAC-1的FOLH1表現量很低，CFPAC-1的FOLR1表現量顯著高於PANC1細胞系的表現量。CB-20BK對PANC-1和CFPAC-1腫瘤細胞系擴增均有抑制作用。對於受體FOLR1表現量有不同的細胞抑制程度有所差異，在受體FOLR1相對高表現細胞株CFPAC-1中，IC₅₀ 比值顯著高於受體FOLR1相對低表現PANC-1的IC₅₀ 比值，細胞增殖抑制效果與細胞相關受體FOLR1表現量呈現正相關性。

實驗2和3證明，在CB-20BK中兩個配體和表現在細胞表面的它們的受體（FOLR1和FOLH1）在該化合物抑制腫瘤細胞增殖的過程中起重要作用。

4. CB-20B 腫瘤細胞擴增抑制實驗

樣品信息：CB-20B

細胞系：A549人肺癌細胞、HuH-7人肝癌細胞、KB人口腔表皮樣癌細胞、LNCaP人***癌細胞、DU145人***癌細胞和T-47D人乳腺癌細胞

實驗操作：

1）細胞鋪盤

提前準備好細胞，Trypsin消化、收集計數，使用完全細胞培養基，按A549細胞、HuH-7細胞、KB細胞和DU145細胞以2×10⁴ 個細胞/ml密度鋪盤；T-47D細胞以1×10⁵ 個細胞/ml密度鋪盤；LNCaP細胞以6×10⁴ 個細胞/ml密度鋪96孔盤，每個孔加入100μl稀釋的細胞溶液，每塊盤設置陰性及空白對照孔。將加好細胞的96孔盤置於37℃，5% CO₂ 培養箱培養過夜。

2）稀釋加樣

將樣品用培養基稀釋到所需濃度（參見表9）。按照每孔50μl加入到過夜培養後的96孔盤中，3個複孔，並設立陰性對照和空白對照，置於37℃，5% CO₂ 培養箱培養72小時。表9：樣品（CB-20B）稀釋後濃度

管號	稀釋後濃度μmol/L
1	200
2	66.7
3	22.2
4	7.4
5	2.5
6	0.8
7	0.3
8	0.09
9	0.03
10	0.01

3）顯色讀盤

4）數據處理

用SoftMax Pro進行數據編輯，繪四參數擬合曲線。

5）實驗結果與分析

根據四參數擬合曲線圖（圖4B，其中C值對應於IC₅₀ ），CB-20B對A549、HuH-7、KB、LNcap、DU145和T-47D腫瘤細胞系生長擴增都有抑制作用。由於細胞中複合體化合物相應的受體表現量有不同，所以抑制量有所差異。針對受體相對高表現的細胞株T-47D、LNcap、KB、HuH-7和DU145的IC₅₀ 明顯低於受體相對低表現的細胞株A549。CB-20B顯示出了抑瘤效果與細胞相關受體表現量的相關性。

5. CB-10S 腫瘤細胞擴增抑制實驗

樣品信息：CB-10S

細胞系：KB人口腔表皮樣癌細胞、NCI-H460人肺癌細胞、RT4人膀胱癌細胞、T-47D人乳腺癌細胞和LNcap人***癌細胞

實驗操作：

1）細胞鋪盤

提前準備好細胞，Trypsin消化、收集計數，使用完全細胞培養基將KB細胞稀釋成3.5×10⁴ 個細胞/ml，LNCaP細胞稀釋成8.0×10⁴ 個細胞/ml，T-47D細胞稀釋成1.2×10⁴ 個細胞/ml，NCI-H460細胞稀釋成2.5×10⁴ 個細胞/ml，RT4細胞稀釋成1.2×10⁴ 個細胞/ml，取96孔盤，每個孔加入100μl稀釋的細胞溶液，每塊盤設置陰性及空白對照孔。將加好細胞的96孔盤置於37℃，5% CO₂ 培養箱培養過夜。

2）稀釋加樣

將樣品用培養基稀釋到所需濃度（參見表10）。按照每孔50μl加入到過夜培養後的96孔盤中，3個複孔，並設立陰性對照和空白對照，置於37℃，5% CO₂ 培養箱培養72小時。表10：樣品（CB-10S）稀釋後濃度

管號	稀釋後濃度μmol/L
1	302
2	43
3	6
4	0.9
5	0.1
6	0.02
7	0.003
8	0.0004
9	0.00005
10	0.000007

3）顯色讀盤

4）數據處理

用SoftMax Pro進行數據編輯，繪四參數擬合曲線。

5）實驗結果與分析

根據四參數擬合曲線圖（圖4C，其中C值對應於IC₅₀ ），CB-10S對KB、LNCaP、T-47D、RT4和NCI-H460腫瘤細胞系生長擴增都有抑制作用。由於細胞中複合體化合物相應的受體表現量有不同，所以抑制量有所差異。對於受體相對高表現的細胞株KB、LNcap、T-47D和RT4的IC₅₀ 明顯低於受體相對低表現細胞株NCI-H460。CB-10S顯示出了抑瘤效果與細胞相關受體表現量的相關性。

6. CB-60S 腫瘤細胞擴增抑制實驗

樣品信息：CB-60S

實驗操作：

1）細胞鋪盤

提前準備好細胞，Trypsin消化、收集計數，使用完全細胞培養基將KB細胞稀釋成2.0×10⁴ 個細胞/ml，T-47D細胞稀釋成1.5×10⁴ 個細胞/ml，NCI-H460細胞稀釋成2.0×10⁴ 個細胞/ml，CALU-3細胞稀釋成3.0×10⁴ 個細胞/ml，HuH-7細胞稀釋成4.0×10⁴ 個細胞/ml，LNCaP細胞稀釋成8.0×10⁴ 個細胞/ml，取96孔盤，每個孔加入100μl稀釋的細胞溶液，每塊盤設置陰性及空白對照孔。將加好細胞的96孔盤置於37℃，5% CO₂ 培養箱培養過夜。

2）稀釋加樣

將樣品用培養基稀釋到所需濃度（參見表11）。按照每孔50μl加入到過夜培養後的96孔盤中，3個複孔，並設立陰性對照和空白對照，置於37℃, 5% CO₂ 培養箱培養72小時。表11：樣品（CB-60S）稀釋後濃度

管號	稀釋後濃度μmol/L
1	320
2	80
3	20
4	5
5	1.3
6	0.3
7	0.08
8	0.02
9	0.005
10	0.001

3）顯色讀盤

4）數據處理

用SoftMax Pro進行數據編輯，繪四參數擬合曲線。

5）實驗結果與分析

四參數擬合曲線圖（圖4D，其中C值對應於IC₅₀ ），CB-60S對KB、T-47D、NCI-H460、CALU-3、HuH-7和LNCaP腫瘤細胞系生長擴增都有抑制作用。由於細胞中複合體化合物相應的受體表現量有不同，所以抑制量有所差異。對於受體相對高表現的細胞株LNCaP和HuH-7的IC₅₀ 值明顯低於受體相對低表現的細胞株NCI-H460、KB、T-47D和CALU-3。CB-60S顯示出了抑瘤效果與細胞相關受體表現量的相關性。

7. CB-60SK 腫瘤細胞擴增抑制實驗

樣品信息：CB-60SK

實驗操作：

1）細胞鋪盤

提前準備好細胞，Trypsin消化、收集計數，使用完全細胞培養基將KB細胞稀釋成2.5×10⁴ 個細胞/ml，T-47D細胞稀釋成1.3×10⁴ 個細胞/ml，NCI-H460細胞稀釋成3.5×10⁴ 個細胞/ml，CALU-3細胞稀釋成4.0×10⁴ 個細胞/ml，HuH-7細胞稀釋成3.0×10⁴ 個細胞/ml，LNCaP細胞稀釋成8.0×10⁴ 個細胞/ml，每個孔加入100μl稀釋的細胞溶液，每塊盤設置陰性及空白對照孔。將加好細胞的96孔盤置於37℃，5% CO₂ 培養箱培養過夜。

2）稀釋加樣

將樣品用培養基稀釋到所需濃度（參見表12）。按照每孔50μl加入到過夜培養後的96孔盤中，3個複孔，並設立陰性對照和空白對照，置於37℃，5% CO₂ 培養箱培養72小時。表12：樣品（CB-60SK）稀釋後濃度

管號	稀釋後濃度μmol/L
1	289
2	72
3	18
4	4.5
5	1.1
6	0.3
7	0.07
8	0.02
9	0.004
10	0.001

3）顯色讀盤

4）數據處理

用SoftMax Pro進行數據編輯，繪四參數擬合曲線。

5）實驗結果與分析

根據四參數擬合曲線圖（圖4E，其中C值對應於IC₅₀ ），CB-60SK對KB、T-47D、NCI-H460、CALU-3、HuH-7和LNCaP腫瘤細胞系生長擴增都有抑制作用。由於細胞中複合體化合物相應的受體表現量有不同，所以抑制量有所差異。對於受體相對高表現的細胞株LNCaP和HuH-7的IC₅₀ 值明顯低於受體相對低表現的細胞株T-47D、NCI-H460、CALU-3和KB。CB-60SK顯示出了抑瘤效果與細胞相關受體表現量的相關性。

8. CB-18G 腫瘤細胞擴增抑制實驗

樣品信息：CB-18G

細胞系：A549人肺癌細胞、Hela人宮頸癌細胞、SCLC-21H小細胞肺癌細胞、U-2 OS人骨肉瘤細胞、T-47D人乳腺癌細胞和NCI-H460人肺癌細胞

主要試劑：IMDM培養基、胎牛血清、P青黴素-鏈黴素溶液、L-穀氨醯胺、CCK8

實驗操作：

1）細胞鋪盤

提前準備好細胞，Trypsin消化、收集計數，使用完全細胞培養基，按A549細胞、Hela細胞、SCLC-21H細胞和U-2 OS細胞以2×10⁴ 個細胞/ml密度鋪板；T-47D細胞和NCI-H460細胞以3×10⁴ 個細胞/ml密度鋪96孔盤，取96孔盤，每個孔加入100μl稀釋的細胞溶液，每塊盤設置陰性及空白對照孔。將加好細胞的96孔盤置於37℃，5% CO₂ 培養箱培養過夜。

2）稀釋加樣

將樣品用培養基稀釋到所需濃度（參見表13）。按照每孔50μl加入到過夜培養後的96孔盤中，3個複孔，並設立陰性對照和空白對照，置於37℃，5% CO₂ 培養箱培養72小時。表13：樣品（CB-18G）稀釋後濃度

管號	稀釋後濃度μmol/L
1	100
2	25
3	6.25
4	1.56
5	0.39
6	0.10
7	0.02
8	0.006
9	0.002
10	0.0004

3）顯色讀盤

4）數據處理

用SoftMax Pro進行數據編輯，繪四參數擬合曲線。

5）實驗結果與分析

根據四參數擬合曲線圖（圖4F，其中C值對應於IC₅₀ ），CB-18G對A549、Hela、SCLC-21H、U-2 OS、T-47D和NCI-H460腫瘤細胞系生長擴增都有抑制作用。由於細胞中複合體化合物相應的受體表現量有不同，所以抑制量有所差異。對於受體相對高表現的細胞株Hela的IC₅₀ 低於受體相對低表現的細胞株NCI-H460。CB-18G顯示出了抑瘤效果與細胞相關受體表現量的相關性。

9. CB-50S 腫瘤細胞擴增抑制實驗

樣品信息：CB-50S

實驗操作：

1）細胞鋪盤

提前準備好細胞，Trypsin消化、收集計數，使用完全細胞培養基將KB細胞稀釋成3.5×10⁴ 個細胞/ml，LNCaP細胞稀釋成8.0×10⁴ 個細胞/ml，T-47D細胞稀釋成1.2×10⁴ 個細胞/ml，NCI-H460細胞稀釋成2.5×10⁴ 個細胞/ml，RT4細胞稀釋成1.2×10⁵ 個細胞/ml，取96孔盤，每個孔加入100μl稀釋的細胞溶液，每塊盤設置陰性及空白對照孔。將加好細胞的96孔盤置於37℃，5% CO₂ 培養箱培養過夜。

2）稀釋加樣

將樣品用培養基稀釋到所需濃度（參見表14）。按照每孔50μl加入到過夜培養後的96孔盤中，3個複孔，並設立陰性對照和空白對照，置於37℃，5% CO₂ 培養箱培養72小時。表14：樣品（CB-50S）稀釋後濃度

管號	稀釋後濃度μmol/L
1	314
2	45
3	6
4	0.9
5	0.1
6	0.02
7	0.003
8	0.0004
9	0.00005
10	0.000008

3）顯色讀盤

4）數據處理

用SoftMax Pro進行數據編輯，繪四參數擬合曲線。

5）實驗結果與分析

根據四參數擬合曲線圖（圖4G，其中C值對應於IC₅₀ ），CB-50S對KB、LNCaP、T-47D、RT4和NCI-H460腫瘤細胞系生長擴增都有抑制作用。由於細胞中複合體化合物相應的受體表現量有不同，所以抑制量有所差異。對於受體相對高表現的細胞株KB、LNcap、T-47D和RT4的IC₅₀ 明顯低於受體相對低表現的細胞株NCI-H460。CB-50S顯示出了抑瘤效果與細胞相關受體表現量的相關性。

10. 複合體化合物 CB-1020 腫瘤細胞擴增抑制實驗

實驗目的：測試CB-1020及相關化合物對腫瘤細胞系LNCaP（人***癌細胞）、SK-BR-3（人乳腺癌細胞）、NCI-H226（人肺癌細胞）、CFPAC-1（胰腺癌細胞）和PANC-1（胰腺癌細胞）擴增的抑制作用。

相關樣品：MMAE和CB-1020

實驗操作：將提前準備好的LNCaP、SK-BR-3、NCI-H226、CFPAC-1和PANC-1計數，用完全培養基（IMDM+10%FBS+1X L-Glutamine+1X P/S）將細胞LNCaP、SK-BR-3和CFPAC-1稀釋成4×10⁴ 細胞/ml，NCI-H226稀釋成2.0×10⁴ 細胞/ml，PANC-1稀釋成3.0×10⁴ 細胞/ml，100μl/孔鋪96孔盤，每盤設陰性及空白對照孔，貼壁過夜後，按50μl/孔加入稀釋好的待測樣品，放置於37℃，5% CO₂ 培養箱中，培養68-72小時，加入CCK8顯色液，每孔加入15μl（孔內液體體積的10%），37℃孵育45-70分鐘，置於酶標儀450nm讀取數值。用SoftMax Pro進行數據編輯，繪4-P擬合曲線。數據如下表所示：表15.CB-1020對細胞系增殖的抑制作用和細胞系受體基因的表現量（參考Depmap數據）

細胞系	TRPV6基因表現量	FOLH1基因表現量	IC₅₀ (MMAE)	IC₅₀ (CB-1020)	IC₅₀ (MMAE) /IC₅₀ (CB-1020)
LNCap	5+	10+	0.003	0.168	0.0179
SK-BR-3	4+	2+	0.002	0.287	0.0070
CFPAC-1	+	+/-	0.015	3.000	0.005
PANC-1	+/-	+/-	0.002	0.458	0.0044
NCI-H226	+/-	-	0.006	1.570	0.00384

由上表可知，LNCaP和SK-BR-3均表現TRPV6和FOLRH1，但LNCap兩個受體的表現量相對高一些。NCI-H226、CFPAC-1和PANC-1低表現或微弱表現兩個受體。CB-1020對LNCaP、SK-BR-3、NCI-H226、CFPAC-1和PANC-1腫瘤細胞系生長擴增均有抑制作用。CB-1020在受體相對雙高表現細胞系LNCaP的IC₅₀ 比值高於受體中度表現細胞系SK-BR-3的IC₅₀ 比值；SK-BR-3的IC₅₀ 比值有高於受體相對低的CFPAC-1和兩個受表現均為微弱表現的細胞株NCI-H226和PANC-1的IC₅₀ 比值。細胞增殖抑制效果與細胞中兩個受體表現量呈現正相關性。

11. 複合體化合物 CB-1320 腫瘤細胞擴增抑制實驗

實驗目的：測試CB-1320及相關化合物對腫瘤細胞系LNCaP（人***癌細胞）、SK-BR-3（人乳腺癌細胞）、MDA-MB-468（人乳腺癌細胞）和CFPAC-1（胰腺癌細胞）擴增的抑制作用。

相關樣品：MMAE和CB-1320

實驗操作：將提前準備好的LNCaP、SK-BR-3、MDA-MB-468和CFPAC-1計數，用完全培養基（IMDM+10%FBS+1X L-Glutamine+1X P/S）將細胞LNCaP、SK-BR-3、MDA-MB-468和CFPAC-1稀釋成4×10⁴ 細胞/ml，100μl/孔鋪96孔盤，每盤設立陰性及空白對照孔，貼壁過夜後，按50μl/孔加入稀釋好的待測樣品，放置於37℃，5% CO₂ 培養箱中，培養68-72小時，加入CCK8顯色液，每孔加入15μl（孔內液體體積的10%），37℃孵育45-70分鐘，置於酶標儀450nm讀取數值。用SoftMax Pro進行數據編輯，繪4-P擬合曲線。具體數據如下表所示：表16.CB-1320對細胞系增殖的抑制作用和細胞系受體基因的表現量（參考Depmap數據）

細胞系	GNRH1基因表現量	FOLH1基因表現量	IC50 (MMAE)	IC50 (CB-1320)	IC50(MMAE) /IC50(CB-1320)
LNCaP	+	10+	0.003	0.060	0.043
SK-BR-3	+	2+	0.002	0.093	0.016
CFPAC-1	2+	+/-	0.015	1.090	0.014
MDA-MB-468	+	+/-	0.002	0.212	0.011

由上表可知，LNCaP和SK-BR-3的GNRH1表現量大體相當，LNCap的FOLH1表現量顯著高於SK-BR3細胞系的表現量。CB-1320對LNCaP和SK-BR-3腫瘤細胞系擴增均有抑制作用。CB-1320對於受體FOLH1表現量有不同的細胞抑制程度有所差異，在受體FOLH1相對高表現細胞株LNCap中，IC₅₀ 比值顯著高於受體相對低表現低SK-BR-3細胞株的IC₅₀ 比值；細胞增殖抑制效果與細胞相關受體FOLH1表現量呈現正相關性。CFPAC-1和MDA-MB-468的GNRH1和FOLH1表現量都大體相當，CB-1320對MDA-MB-468和CFPAC-1腫瘤細胞系生長擴增均有抑制作用，兩個細胞系IC₅₀ 比值大體相當，細胞增殖抑制效果與細胞相關兩個受體表現量依然呈現相關性。

12 ．複合體化合物 CB-1820 腫瘤細胞擴增抑制實驗

實驗目的：測試CB-1820及相關化合物對腫瘤細胞系LNCaP（人***癌細胞）、MDA-MB-468（人乳腺癌細胞）、CFPAC-1（胰腺癌細胞）和PANC-1（胰腺癌細胞）擴增的抑制作用。

相關樣品：MMAE和CB-1820

實驗操作：將提前準備好的LNCaP、MDA-MB-468、CFPAC-1和PANC-1計數，用完全培養基（IMDM+10%FBS+1X L-Glutamine+1X P/S）將細胞LNCaP、MDA-MB-468和CFPAC-1稀釋成4×10⁴ 細胞/ml；PANC-1稀釋成3.0×10⁴ 細胞/ml，100μl/孔鋪96孔盤，每盤設立陰性及空白對照孔，貼壁過夜後，按50μl/孔加入稀釋好的待測樣品，放置於37℃，5% CO₂ 培養箱中，培養68-72小時，加入CCK8顯色液，每孔加入15μl（孔內液體體積的10%），37℃孵育45-70分鐘，置於酶標儀450nm讀取數值。用SoftMax Pro進行數據編輯，繪4-P擬合曲線。具體數值如下表所示：

表17.CB-1820對細胞系增殖的抑制作用和細胞系受體基因的表現量（參考Depmap數據）

細胞系	SSTR2基因表現量	FOLH1基因表現量	IC₅₀ (MMAE)	IC₅₀ (CB-1820)	IC₅₀ (MMAE) /IC₅₀ (CB-1820)
LNCap	+/-	10+	0.003	0.021	0.1429
MDA-MB-468	+/-	+/-	0.002	0.062	0.0323
CFPAC-1	+/-	+/-	0.015	0.356	0.0421
PANC-1	+/-	+/-	0.002	0.055	0.0364

由上表可知，LNCap、MDA-MB-468、CFPAC-1和PANC-1的SSTR2表現量大體相當，LNCaP的FOLH1表現量顯著高於其他細胞的FOLH1表現量。CB-1820對4株腫瘤細胞系擴增均有抑制作用。CB-1820對於受體FOLH1表現量有不同的細胞抑制程度有所差異，在受體相對高表現細胞株LNCaP中，IC₅₀ 比值顯著高於受體相對低表現細胞株其他細胞系的IC₅₀ 比值，細胞增殖抑制效果與細胞相關受體FOLH1表現量呈現正相關性。

13 ．複合體化合物 CR19425 、 CR19426 和 CR19428 腫瘤細胞擴增抑制實驗

實驗目的：測試CR19428、CR19425、CR19426及相關化合物對腫瘤細胞系NCI-H226（人肺癌細胞）、CFPAC-1（人胰腺癌細胞）和MDA-MB-468（人乳腺癌細胞）擴增的抑制作用。

相關樣品：SN-38、Dxd0017、CR19428、CR19425和CR19426

實驗操作：將提前準備好的NCI-H226、CFPAC-1和MDA-MB-468計數，細胞MDA-MB-468和CFPAC-1鋪板密度均為2×10⁴ 細胞/ml，NCI-H226鋪板密度均為1×10⁴ 細胞/ml，100μl/well鋪96孔盤，每塊培養盤設立陰性及空白對照孔，貼壁過夜後，按50μl/孔加入稀釋好的待測樣品，放置於37℃，5% CO₂ 培養箱中，培養68-72小時，加入CCK8顯色液，每孔加入15μl（孔內液體體積的10%），37℃孵育45-70m分鐘，置於酶標儀450nm讀取數值。用SoftMax Pro進行數據編輯，繪4-P擬合曲線。具體數據如下表所示：

表18. CR19428、CR19425和CR19426對細胞系增殖的抑制作用

細胞系	IC₅₀ (SN-38)	IC₅₀ (Dxd0017)	IC₅₀ (CR19428)	IC₅₀ (CR19425)	IC₅₀ (CR19426)
CFPAC-1	0.0055	0.0064	0.9060	0.6210	1.6600
MDA-MB-468	0.0136	0.0061	1.0700	0.9510	2.3000
NCI-H226	0.0173	0.0080	1.6200	1.0100	4.3900

實施例 5 ：複合體化合物在 CDX 模型中的藥效學研究

1. CB-20BK 在 CDX 模型中的藥效學研究 1

1）樣品準備：

稱取CB-20BK凍乾粉，用PBS溶解配成樣品母液，用注射用生理食鹽水稀釋母液到工作濃度樣品溶液，備用。

2）CDX模型構建

主要細胞系：KB人口腔表皮樣癌細胞、MIA paca-2人胰腺癌細胞、HCC1954人乳腺癌細胞、CALU-3人肺腺癌細胞和DU145人***癌細胞。

模型構建：復蘇、培養細胞，收集、計數注射於BALB/c-nude小鼠右肢皮下，等腫瘤生長擴增到80-160mm³ 時分組給藥或取快速擴增腫瘤塊轉接擴建小鼠腫瘤模型。

3）分組給藥觀察

分組：待腫瘤平均長至約80-160mm³ 進行分組，設置模型對照組和不同劑量給藥組。

給藥：尾靜脈注射。

實驗觀察與測量：腫瘤接種後，例行監測包括了腫瘤生長及治療對動物正常行為的影響。具體內容包括實驗動物的活動性，攝食和飲水情況，體重增減（體重每週測量2次）情況，眼睛、被毛及其它異常情況。

測量小鼠體重及瘤塊的長徑（a）和短徑（b），每週2次。腫瘤體積（tumor volume，TV）計算公式為：TV = 1/2×a×b² 。

4）實驗結果與分析

根據小鼠腫瘤體積的變化（圖5A-5E），可見CB-20BK對小鼠KB、MIA aca-2、HCC1954、CALU-3和DU145細胞系CDX腫瘤模型均有較好的抑制作用。

2. CB-20BK 在 CDX 模型中的藥效學研究 2

實驗目的：複合物化合物CB-20BK在人源LNCaP、DU145和NCI-H460細胞株皮下異體移植模型（CDX）中的藥效研究

主要CDX模型：LNCaP、DU145和NCI-H460

實驗方案：

將準備好的細胞或腫瘤組織塊，接種於BALB/c-nude小鼠右肢前部皮下，當腫瘤體積擴增到80-160 mm³ 時隨機分組，設置模型對照組和給藥組，在分組第1天開始給藥，根據小鼠最近一次的體重調整給藥量，尾靜脈注射，給藥體積為10μl/g。分組給藥後，監測包括了腫瘤生長及治療對動物正常行為的影響，具體內容有實驗動物的活動性，攝食和飲水情況，體重增加或降低情況，眼睛、被毛及其它異常情況。分組給藥後，每週測量2次小鼠體重，計算體重變化率；同時以遊標卡尺測量腫瘤長徑、短徑，並計算腫瘤體積、相對腫瘤增值率、腫瘤體積抑瘤率等指標。腫瘤體積公式為TV = 0.5 a × b² ，其中a是腫瘤的長徑，b是腫瘤的短徑。表19.CB-20BK對CDX模型的生長抑制作用和各個模型受體基因的表現量（參考中美冠科數據）

模型	FOLR1	FOLH1	抑瘤率（TGI）(%)	給藥劑量/時間
LNCaP	5+	10+	95.68	3mg/kg D1,8,15
DU145	-	-	52	5mg/kg D1,4,7
NCI-H460	-	-	32	10mg/kg D1,8,15

由上表可知，測試樣品CB-20BK的尾靜脈給藥方案下表現出不同程度的腫瘤生長抑制作用。對於LNCaP、DU145和NCI-H460人源細胞系CDX模型，與陰性對照組相比，都有一定抗腫瘤生長的作用。FOLR1和FOLH1雙表現模型LNCaP，以3mg/kg的劑量，在第1天、第8天和第15天（D1、D8和D15）給藥，TGI值為95.68%，有優異的抗腫瘤生長的作用，明顯優於FOLR1和FOLH1相對低表現的DU145和NCI-H460模型。抑瘤效果與細胞相關受體表現量呈現一定相關性。

3. 複合體化合物 CB-20BK 對 HuPrime^® 異體移植 PDX 模型的抑瘤實驗 1

實驗目的：複合體化合物CB-20BK在PDX模型上的藥效學研究

主要模型：LU1206、LU1380和LU0367

實驗方案：將準備好的腫瘤組織塊，接種於BALB/c-nude小鼠右肢前部皮下，當腫瘤體積擴增到80-160mm³ 時隨機分組，設置模型對照組和給藥組，在分組第1天開始給藥，根據小鼠最近一次的體重調整給藥量，尾靜脈注射，給藥體積為10μl/g，給藥劑量為3mg/kg。分組給藥後，監測包括了腫瘤生長及治療對動物正常行為的影響，具體內容有實驗動物的活動性，攝食和飲水情況，體重增加或降低情況，眼睛、被毛及其它異常情況。分組給藥後，每週測量2次小鼠體重，計算體重變化率；同時以遊標卡尺測量腫瘤長徑、短徑，並計算腫瘤體積、相對腫瘤增值率、腫瘤體積抑瘤率等指標。腫瘤體積公式為TV = 0.5 a × b² ，其中a是腫瘤的長徑，b是腫瘤的短徑。表20.CB-20BK對肺癌PDX模型生長的抑制作用和各個模型受體基因的表現量（參考中美冠科數據）

模型	FOLR1基因表現量	FOLH1基因表現量	TGI(%)	劑量
LU1206	4+	2+	90.89	3mg/kg
LU1380	-	4+	30.02	3mg/kg
LU0367	-	5+	71.34	3mg/kg

由表20數據可知，測試樣品CB-20BK（3mg/kg）對於LU1206、LU1380和LU0367人源肺癌PDX模型，均表現出一定的抗腫瘤效果。FOLR1和FOLH1雙表現模型LU1206的TGI值為90.89%，LU1380和LU0367單表現模型，TGI值分別為30.02%和71.34%，在抑瘤實驗中抑瘤效果與細胞相關受體表現量呈現一定相關性。

4. 複合體化合物 CB-20BK 對 HuPrime^® 異體移植 PDX 模型的抑瘤實驗 2

實驗目的：複合體化合物CB-20BK在PDX模型上的藥效學研究

主要模型：BR1283和BR0438

實驗方案：將準備好的腫瘤組織塊，接種於BALB/c-nude小鼠右肢前部皮下，當腫瘤體積擴增到80-160mm³ 時隨機分組，設置模型對照組和給藥組，在分組第1天開始給藥，根據小鼠最近一次的體重調整給藥量，尾靜脈注射，給藥體積為10μl/g，給藥劑量為3mg/kg。分組給藥後，監測包括了腫瘤生長及治療對動物正常行為的影響，具體內容有實驗動物的活動性，攝食和飲水情況，體重增加或降低情況，眼睛、被毛及其它異常情況。分組給藥後，每週測量2次小鼠體重，計算體重變化率；同時以遊標卡尺測量腫瘤長徑、短徑，並計算腫瘤體積、相對腫瘤增值率、腫瘤體積抑瘤率等指標。腫瘤體積公式為TV = 0.5 a × b² ，其中a是腫瘤的長徑，b是腫瘤的短徑。表21.CB-20BK對乳腺癌PDX模型生長的抑制作用和各個模型受體基因的表現量（參考中美冠科數據）

模型	FOLR1基因表現量	FOLH1基因表現量	TGI(%)	劑量
BR1283	7+	6+	96.49	3mg/kg
BR0438	5+	4+	70.74	3mg/kg

由上表可知，測試樣品CB-20BK以3mg/kg的劑量在FOLR1和FOLH1雙表現模型BR1283和BR0438中TGI值分別為96.49%、70.74%，顯現出優異的抗腫瘤生長的作用。而且，CB-20BK在FOLR1和FOLH1表現較高的表現BR1283中，TGI更優。

5. CB-20B 在 CDX 模型中的藥效學研究

1）樣品準備：

稱取CB-20B凍乾粉，用PBS溶解配成樣品母液，用注射用生理食鹽水稀釋母液到工作濃度樣品溶液，備用。

2）CDX模型構建

主要細胞系：KB人口腔表皮樣癌細胞、PC-9人肺癌細胞和DU145人***癌細胞。

3）分組給藥觀察

給藥：尾靜脈注射。

4）實驗結果與分析

根據小鼠腫瘤體積的變化（圖6A-6C），可見CB-20B對小鼠KB、PC-9和DU145細胞系CDX腫瘤模型均有較好的抑制作用。

6. CB-18G 在 CDX 模型中的藥效學研究

1）樣品準備：

稱取CB-18G凍乾粉，用PBS溶解配成樣品母液，用注射用生理食鹽水稀釋母液到工作濃度樣品溶液，備用。

2）CDX模型構建

主要細胞系：KB人口腔表皮樣癌細胞、PC-9人肺癌細胞、SPC-A1人肺腺癌細胞、CALU-3人肺腺癌細胞和DU145人***癌細胞

模型構建：復蘇、培養細胞，收集、進行細胞計數，將細胞液注射於BALB/c-nude小鼠右肢皮下，等腫瘤生長擴增到80-160mm³ 時分組給藥或取快速擴增腫瘤塊轉接擴建小鼠腫瘤模型。

3）分組給藥觀察

給藥：尾靜脈注射。

測量小鼠體重及瘤塊的長徑（a）和短徑（b），每週2次。腫瘤體積（TV）計算公式為：TV = 1/2×a×b² 。

4）實驗結果與分析

根據小鼠腫瘤體積的變化（圖7A-7E），可見CB-18G對小鼠KB、PC-9、SPC-A1、CALU-3和DU145細胞系CDX腫瘤模型均有較好的抑制作用。

7. 複合體化合物 CB-1020 、 CB-1320 和 CB-1820 對人源 HPAF-II 、 NCI-H226 和 SCLC-21H 細胞株皮下異體移植模型（ CDX ）的抑瘤實驗

實驗目的：配體複合物CB-1020、CB-1320和CB-1820在CDX模型上的藥效學研究

主要CDX模型：HPAF-II（人胰腺癌細胞）、NCI-H226（人肺癌細胞）和SCLC-21H（小細胞肺癌細胞）

實驗方案：

將準備好的細胞或腫瘤組織塊，接種於BALB/c-nude小鼠右肢前部皮下，當腫瘤體積擴增到80-160 mm³ 時隨機分組，設置模型對照組和給藥組，在分組第1天開始給藥，根據小鼠最近一次的體重調整給藥量，尾靜脈注射，給藥體積為10 μl/g。分組給藥後，監測包括了腫瘤生長及治療對動物正常行為的影響，具體內容有實驗動物的活動性，攝食和飲水情況，體重增加或降低情況，眼睛、被毛及其它異常情況。分組給藥後，每週測量2次小鼠體重，計算體重變化率；同時以遊標卡尺測量腫瘤長徑、短徑，並計算腫瘤體積、相對腫瘤增值率、腫瘤體積抑瘤率等指標。腫瘤體積公式為TV = 0.5 a × b² ，其中a是腫瘤的長徑，b是腫瘤的短徑。表22. CB-1020、CB-1320和CB-1820對CDX模型的抑制作用和各個模型受體基因的表現量（參考中美冠科數據）

模型	TRPV6基因表現量	GNRH1基因表現量	SSTR2基因表現量	FOLH1基因表現量	TGI(%) (CB-1020)	TGI(%) (CB-1320)	TGI(%) (CB-1820)	P值	劑量
HPAF-II	+	+	+/-	+/-	0.283			0.461	3mg/kg
0.445			0.153	5mg/kg
0.899			0.023	10mg/kg
NCIH226	+/-	+	+/-	-			0.823	0.011	3mg/kg
	0.962		0.006	3mg/kg
	0.992		0.005	10mg/kg
SCLC-21H	2+	3+	3+	-			0.995	0.131	3mg/kg
	0.361		0.610	3mg/kg
	0.985		0.134	10mg/kg

CB-1020對人源HPAF-II，CB-1320對NCI-H226和SCLC-21H，CB-1820對SCLC-21H細胞株皮下異體移植模型，都有較明顯的抗腫瘤生長作用。

8. 複合體化合物 CR19428 對人源 CALU-3 、 SCLC-21H 和 SPC-A1 細胞株皮下異體移植模型（ CDX ）的抑瘤實驗

實驗方案：將準備好的細胞，接種於BALB/c-nude小鼠右肢前部皮下，當腫瘤體積擴增到80-160mm³ 時隨機分組，設置模型對照組和給藥組，在分組第1天開始給藥，根據小鼠最近一次的體重調整給藥量，尾靜脈注射，給藥體積為10μl/g，每週給藥2次連續給藥3周。分組給藥後，監測包括了腫瘤生長及治療對動物正常行為的影響，具體內容有實驗動物的活動性，攝食和飲水情況，體重增加或降低情況，眼睛、被毛及其它異常情況。分組給藥後，每週測量2次小鼠體重，計算體重變化率；同時以遊標卡尺測量腫瘤長徑、短徑，並計算腫瘤體積、相對腫瘤增值率、腫瘤體積抑瘤率等指標。腫瘤體積公式為TV = 0.5 a × b² ，其中a是腫瘤的長徑，b是腫瘤的短徑。表23. CR19428對肺癌PDX模型的抑制作用

模型	TGI(%)	給藥劑量/時間
CALU-3	51	50mg/kg q2/w*3
SCLC-21H	66	50mg/kg q2/w*3
SPC-A1	75	50mg/kg q2/w*3
SPC-A1	91	100mg/kg q2/w*3

CR-19428為FOLR1和FOLH1的配體和有效負載Dxd的藥物複合體。由上表可知，它對人源CALU-3、SCLC-21H和SPC-A1細胞株皮下異體移植模型，都有較明顯的抗腫瘤生長作用。

9. 複合體化合物 CBP-1018 肺癌 LU2505 模型有效性研究（ PDX 模型）

本實驗為肺癌PDX模型LU2505（來自亞洲女性患者）第3代，屬快速生長的腫瘤模型。BALB/c裸小鼠皮下荷瘤，腫瘤體積約150mm³ 時進行分組：供試品低、中和高組，小分子MMAE和靶向多肽20BK-SM09對照組，以及空白製劑對照組，共6組，8只/組；分組後第1、8和15天給藥，末次藥後繼續觀察14天。供試品CBP-1018的活性物質為CB-20BK，通過將CB-20BK與輔料混合後凍乾獲得。表24. 注射用CBP-1018在肺癌LU2505模型的藥效學結果（首次試驗）

供試品 /對照品	劑量 (mg/kg)	體重（g）	瘤體積（mm³ ）	抑瘤率 TGI%	瘤重（mg）
空白製劑對照組	/	24.0	2219.62	/	2031.4（D22）
CBP-1018	4.5	22.5	0.00	100.00	0.0（D29）
1.5	22.1	386.16	82.60	400.7（D29）
0.5	23.6	1634.50	26.36	2084.7（D26）
20BK-SM09	10	23.8	2024.75	8.78	1811.5（D22）
MMAE	0.375	23.5	1132.61	48.97	1597.1（D29）

注：1）因動物福利要求，組內平均瘤體積達到2000mm³ ，動物需要進行安樂死，因此每組的處死時間不同。2）體重、瘤體積、抑瘤率的數據是第22天（D22）的數據。

如表24和圖8A所示：

所有組別動物給藥後未見異常臨床表現，未見死亡；各組動物體重緩慢增長。

空白製劑對照組、20BK-SM09組、CBP-1018低劑量組的動物因平均瘤體積超過2000mm³ 分別在第22天、第22天和第26天（D26）進行了安樂死。因此表24中體重、瘤體積、抑瘤率數據均是D22的數據。

注射用CBP-1018的有效性具有明顯的劑量相關性：低劑量組無效，中和高劑量組有效，高劑量組的腫瘤在第19天（D19）就已經被完全治癒，在第29天（D29）未見生長跡象。

多肽組20BK-SM09未見明顯的抑瘤作用；提示單獨的靶向性多肽不足以產生明確的抗腫瘤作用。

MMAE組具有明確的抑瘤作用，0.375mg/kg的劑量是CBP-1018在1.5mg/kg含有等莫耳的MMAE，對比發現，CBP-1018在1.5mg/kg明顯優於MMAE組，提示配體靶向的優勢（82.60% vs 48.97%）。

10. 複合體化合物 CBP-1018 肺癌 LU1206 模型有效性研究（ PDX 模型）

本實驗為肺癌PDX模型LU1206（來自亞洲女性患者）第5代，屬快速生長的腫瘤模型。BALB/c裸小鼠皮下荷瘤，腫瘤體積約150mm³ 時進行分組：供試品低、中和高組，小分子MMAE和靶向多肽20BK-SM09對照組，以及空白製劑對照組，共6組，8只/組；分組後第1、8和15天給藥，末次藥後繼續觀察14天。表25. 注射用CBP-1018在肺癌LU1206模型的藥效學結果（首次試驗）

組別	劑量（mg/kg）	體重（g）	腫瘤體積（mm³ ）	瘤體積抑瘤率（%）	腫瘤重量（mg）	瘤重抑制率（%）
空白製劑對照組	/	22.7	1216.67	/	856.14	/
CBP-1018	4.5	23.4	31.44	97.42	13.55	98.42
1.5	23.7	301.64	75.21	185.10	78.38
0.5	22.7	1118.30	8.08	852.19	0.46
20BK-SM09	10	23.3	1158.80	4.76	914.36	-6.80
MMAE	0.375	23.6	778.32	36.03	437.73	54.53

如表25和圖8B所示：

所有組別動物給藥後未見異常臨床表現，未見死亡，所有動物均在第29天進行安樂死。各組動物體重基本維持不變，均稍高於給藥的第一天。

注射用CBP-1018的有效性具有明顯的劑量相關性：低劑量組無效（抑瘤率8.08%），中和高劑量組有效，抑瘤率分別在75.21%和97.42%。低和中劑量的差距比較大。

多肽組20BK-SM09未見明顯的抑瘤作用，提示單獨的靶向性多肽在此模型也不足以產生明確的抗腫瘤作用。

MMAE組具有明確的抑瘤作用。0.375mg/kg的劑量是CBP-1018在1.5mg/kg含有等莫耳的MMAE；對比發現，CBP-1018在1.5mg/kg明顯優於MMAE組，提示配體靶向的優勢（瘤體積抑瘤率：75.21%vs 36.03%，瘤重抑瘤率：78.38% vs 54.53%）。

11. 荷瘤小鼠組織分佈（ PDX 模型 LU2505 ）

12只接種HuPrime^® 肺癌LU2505模型瘤塊的雌性荷瘤鼠和12只健康雄性BALB/c裸鼠，單次經尾靜脈注射給予1.5mg/140μCi/kg的[³ H]CBP-1018（同位素標記在MMAE上）。分別於0.5小時、2小時、6小時和24小時取3雄3雌，置於誘導盒內吸入適量二氧化碳麻醉後經心臟穿刺採集血液，然後立即實施安樂死取材。表26. 單次靜脈給予[³ H]CBP-1018後不同時間點各組織中的總放射性

組織	放射性濃度 (ng Eq./g)
0.5小時	2小時	6小時	24小時 (%C_max )
♂	♀	♂	♀	♂	♀	♂	♀
腫瘤	763	/	643	/	566	/	413	/
食管	915	784	628	508	521	172	286	91.7
體脂	341	479	288	276	231	177	67.2	43.7
骨骼肌	321	311	207	137	188	95.5	90.8	61.5
脾臟	744	693	701	524	671	421	253	163
胃壁	658	623	414	370	460	259	211	123
全腦	66.3	67.9	53.8	39.5	82.0	48.2	76.4	68.3
睾丸附睾	350	494	279	298	183	248	92.3	64.8
心臟	785	795	415	326	219	143	114	69.2
肺臟	1493	1807	997	920	416	392	109	93.7
腎臟	5682	6118	3300	4197	1227	1391	241	238
肝臟	1423	1306	1257	865	1138	599	712	518
小腸壁	726	778	641	816	490	334	210	90.9
大腸壁	550	520	672	823	1074	490	215	128
全血	2087	3194	684	691	211	132	86.5	64.6
血漿	7372	7610	1844	1760	495	306	214	140

由上表可知：動物組織分佈未見雌雄差異。給藥後，藥物主要分佈於腎臟、全血（主要分佈在血漿）、肝臟和肺臟。各組織0.5小時最高，隨後各組織藥物迅速消除，肝臟和腫瘤消除最慢。腫瘤內藥物的緩慢消除可以解釋CBP-1018在有效性方面的優勢。

12. 大鼠***試驗

6只正常SD大鼠，均雌雄各半，單次尾靜脈注射給予0.75mg/70μCi/kg的[³ H]CBP-1018。在指定時間間隔收集了整體大鼠給藥前和給藥後0~168小時的尿液、糞便、籠具沖洗/清洗液及屍體等樣品，以及BDC大鼠給藥前和給藥後0~72小時的膽汁、尿液、糞便及籠具沖洗/清洗液等樣品。上述樣品均在低溫冰箱（-10℃~-30℃）冷凍保存。

每份樣品加入適量閃爍液混勻後，使用液體閃爍計數儀測定放射性量。膽汁、尿液、糞便、籠具沖洗及清洗液、屍體等樣品中測定的放射性量用於計算占給藥量的百分比。血漿樣品中的放射性量用於計算每克樣品中的總放射性，應用WinNonLin軟體（7.0版，Pharsight）按照非房室模型計算血漿總放射性的主要藥代動力學參數。表27. 整體大鼠給藥後物料平衡研究結果

性別（只數）	尿液（%）	糞便（%）	籠具沖/清洗液（%）	屍體（%）	總回收率（%）
雌性（n=3）	50.26±6.11	23.93±0.98	5.70±2.63	4.51±1.19	84.40±4.02
雄性（n=3）	53.60±3.68	20.61±1.74	4.24±2.16	4.83±0.42	83.28±0.71
雌性和雄性（n=3雌3雄）	51.93±4.87	22.27±2.21	4.97±2.30	4.67±0.82	83.84±2.65

由上表可知，CBP-1018主要經過尿液排出，約占到總給藥量的約57%；經過糞便排出不足25%。主要經過腎臟從尿液排出的結果與裸鼠的組織分佈中在腎臟大量分佈是一致的。

圖1顯示了複合體化合物CB-20B、CB-20BK、CB-60S、CB-60SK、CB-20C、CB-1020、CB-1320、CB-1820、CR19428、20R-SM09、CB-20R、CB-18G、CR19426、CB-10S、CR19425和CB-50S的化學結構式。

圖2A顯示了Cy5-pep-20BK與不同細胞結合和內吞的隨時間變化的曲線（從上往下依次為LNCaP細胞、KB細胞、DU145細胞和NCI-H460細胞）。圖2B顯示了Cy5-pep-20AK與不同細胞結合和內吞的隨時間變化的曲線（從上往下依次為LNCaP細胞、DU145細胞、NCI-H460細胞和KB細胞）。

圖3顯示了Cy5-FA與不同細胞結合和內吞的隨時間變化的螢光照片。其中顯示完整的圓形的為細胞核的螢光，呈點狀分佈的為Cy5-FA的螢光。

圖4A顯示了複合體化合物CB-20BK對圖示的腫瘤細胞擴增的抑制活性。圖4B顯示了複合體化合物CB-20B對圖示的腫瘤細胞擴增的抑制活性。圖4C顯示了複合體化合物CB-10S對圖示的腫瘤細胞擴增的抑制活性。圖4D顯示了複合體化合物CB-60S對圖示的腫瘤細胞擴增的抑制活性。圖4E顯示了複合體化合物CB-60SK對圖示的腫瘤細胞擴增的抑制活性。圖4F顯示了複合體化合物CB-18G對圖示的腫瘤細胞擴增的抑制活性。圖4G顯示了複合體化合物CB-50S對圖示的腫瘤細胞擴增的抑制活性。

圖5A-5E顯示了複合體化合物CB-20BK在小鼠體內對腫瘤的抑制效果。

圖6A-6C顯示了複合體化合物CB-20B在小鼠體內對腫瘤的抑制效果。

圖7A-7E顯示了複合體化合物CB-18G在小鼠體內對腫瘤的抑制效果。

圖8A-8B顯示了注射用CBP-1018對肺癌LU2505模型和肺癌LU1206模型腫瘤體積的影響。

Claims

一種複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含有效負載和兩個靶向分子，其中所述兩個靶向分子分別為協同作用分子部分以及***特異性膜抗原配體部分。
根據請求項1所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述***特異性膜抗原配體包括如下結構：
。
根據請求項1所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述***特異性膜抗原配體包括如下結構：
。
根據請求項1所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述***特異性膜抗原配體包括如下結構：
。
根據請求項1所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述***特異性膜抗原配體包括如下結構：
。
一種複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含有效負載和兩個靶向分子，其中所述兩個靶向分子分別為協同作用分子部分以及具有式（I）所示的配體部分：
（I）。
一種複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含有效負載和兩個靶向分子，其中所述兩個靶向分子分別為協同作用分子部分以及P10，並且所述有效負載為喜樹鹼及其任何衍生物。
根據請求項1-7中任一項所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述兩個靶向分子是不同的。
根據請求項1-8中任一項所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述協同作用分子是細胞相互作用分子。
根據請求項1-9中任一項所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述兩個靶向分子是與不同的細胞分子相互作用的細胞相互作用分子。
根據請求項1-10中任一項所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述協同作用分子是能夠介導內吞作用的內吞作用分子。
根據請求項1-11中任一項所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述協同作用分子與選自下組的分子結合：FOLR1、TRPV6、FOLH1(PMSA)、GNRHR、Her2、Trop2、Her3、NECTIN4、LRP1、GLUT1、EGFR1、AXL、CA9、CD44、Claudin18.2、APN、DLL3、CEACAM5、FZD10、TFRC、MET、IGFR1、SSTR2、CCKBR、LFA1、ICAM、GPR87、GM-CSF、GM-CSFR、TIM3、TLR家族、CD40、CD40L、OX40、OX40L、GITRL、GITR、4-BBL、4-1BB、CD70、CD27、ICOSL、ICOS、HHLA2、CD28、CD86/80、CD28、MHCII抗原、TCR、CTLA-4、CD155、CD122、CD113、IGIT、PD-L1、PD1、Galectin-9、TIM-3、HVEM、BTLA、CD160、VISTA、B7-H4、B7-H3、磷脂醯絲胺酸、HHLA2、LAG3、Galectin-3、LILRB4、SIGLEC15、NKG2A、NKG2D、SLAMF7、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、FGFR1、FGFR2、FGFR4、NeuGcGM3和CXCR4。
根據請求項1-12中任一項所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述協同作用分子與選自下組的分子結合：FOLR1、TRPV6、FOLH1(PMSA)、SSTR2和GNRHR。
根據請求項1所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述協同作用分子與選自下組的分子結合：FOLR1、TRPV6、SSTR2和GNRHR。
根據請求項6所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述協同作用分子與選自下組的分子結合：FOLR1、TRPV6、FOLH1(PMSA)和GNRHR。
根據請求項1-15中任一項所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述協同作用分子是葉酸或其類似物。
根據請求項16所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述葉酸類似物選自下組：5-甲基四氫葉酸、5-甲醯基四氫葉酸、甲氨蝶呤和5, 10-亞甲基四氫葉酸。
根據請求項1或6中所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，所述複合體化合物或其藥學上可接受的鹽包含一個、兩個、三個、四個或更多個有效負載。
根據請求項1或6中所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述有效負載選自下組：小分子化合物、核苷酸、肽和蛋白。
根據請求項19所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述有效負載是小分子化合物。
根據請求項20所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述小分子化合物選自下組：喜樹鹼及其任何衍生物、澳瑞他汀及其任何衍生物、美登素及其任何衍生物、放射性同位素錯合物、環氧化酶-2抑制劑、紫杉醇及其任何衍生物、埃博黴素及其任何衍生物、博來黴素及其任何衍生物、更生黴素及其任何衍生物、普卡黴素及其任何衍生物，以及絲裂黴素C。
根據請求項21所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述小分子化合物是喜樹鹼及其任何衍生物、澳瑞他汀及其任何衍生物、放射性同位素錯合物或者環氧化酶-2抑制劑。
根據請求項1-22中任一項所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述有效負載通過連接子與至少一個所述靶向分子連接。
根據請求項23所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述連接子是肽類連接子、二硫化物連接子、pH依賴型連接子或者上述連接子的組合。
根據請求項24所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述肽類連接子可在特定的生理環境下通過蛋白酶裂解或還原裂解。
根據請求項24或25所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述肽類連接子選自下組：半胱胺酸、賴胺酸、賴胺酸-賴胺酸、纈胺酸-瓜胺酸、***酸-賴胺酸、纈胺酸-賴胺酸、半胱胺酸-賴胺酸、半胱胺酸-穀胺酸、天冬胺酸-天冬胺酸和天冬胺酸-天冬胺酸-賴胺酸，可選的，上述胺基酸中的羧酸被醯胺化。
根據請求項24所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述二硫化物連接子選自下組：DMDS、MDS、DSDM和NDMDS。
根據請求項24所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述pH依賴型連接子是順烏頭酸酐。
根據請求項23所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述連接子包括如下結構：
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
及
，或者所述連接子是上述結構與肽類連接子的組合。
根據請求項1-29中任一項所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述兩個靶向分子通過間隔區連接。
根據請求項30所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述間隔區包含選自下組的胺基酸序列：SEQ ID NO：1-14、Arg-Arg、Ala-Ser-Asn、Ala-Ala-Ala、Ser-Ser-Arg、Pro-Arg和Pro-Leu-Gly。
根據請求項1所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述複合體化合物選自由下述化合物組成的組：
（CB-20B）、
（CB-20BK）、
（CB-60S）、
（CB-60SK）、
（CB-20C）、
（CB-1020）、
（CB-1320）、
（CB-1820）、
（CR19428）、
和（20R-SM09）
（CB-20R），其中M為放射性同位素。
根據請求項6所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述複合體化合物為：
（CB-18G）、
（CB-1820）或
（CR19426）。
根據請求項7所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述複合體化合物為
（CB-10S）、
（CR19425）或
（CB-50S）。
一種藥物組合物，所述藥物組合物包含根據請求項1-34中任意一項所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的載體。
根據請求項35所述的藥物組合物，其中，所述組合物用於靜脈內、皮下、口服、肌內或心室內施用。
一種用於向有需要的對象遞送有效負載的方法，所述方法包括向所述對象施用治療有效量的根據請求項1-34中任意一項所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，或者根據請求項35或36所述的藥物組合物。
一種用於治療對象中的疾病的方法，所述方法包括向所述對象施用治療有效量的根據請求項1-34中任意一項所述的複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，或者根據請求項35或36所述的藥物組合物。
根據請求項38所述的方法，其中所述疾病選自下組：癌症、免疫性疾病、心血管疾病、代謝疾病和神經疾病。
根據請求項39所述的方法，其中所述癌症選自下組：***癌、乳腺癌、肺癌、腎癌、白血病、卵巢癌、胃癌、子宮癌、子宮內膜癌、肝癌、結腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、結直腸癌、食道癌、睾丸癌、皮膚癌、淋巴瘤和多發性骨髓瘤。
根據請求項39所述的方法，其中所述免疫性疾病是自體免疫性疾病。
根據請求項41所述的方法，其中所述自體免疫性疾病選自下組：結締組織病、系統性硬化症、類風濕性關節炎和系統性紅斑狼瘡。
根據請求項39所述的方法，其中所述心血管疾病選自下組：心絞痛、心肌梗死、中風、心臟病發作、高血壓性心臟病、風濕性心臟病、心肌病、心臟心律失常和先天性心臟病。
根據請求項39所述的方法，其中所述代謝疾病選自下組：糖尿病、痛風、肥胖症、低血糖症、高血糖症和血脂異常。
根據請求項39所述的方法，其中所述神經疾病選自下組：阿茲海默病、帕金森病、亨廷頓病、頭部損傷、多發性硬化症、眩暈、昏迷和癲癇。
根據請求項38-45中任意一項所述的方法，其中所述方法還包括將一種或多種治療劑與所述複合體化合物或其藥學上可接受的鹽，或者所述藥物組合物聯合施用。