TW202045135A

TW202045135A - 具有促進傷口癒合功效的酵素水解滑菇多醣體及其用途

Info

Publication number: TW202045135A
Application number: TW108119819A
Authority: TW
Inventors: 謝昌衛; 周俊旭; 周旻昇; 張兆凱; 宋子榕
Original assignee: 森田藥粧股份有限公司
Priority date: 2019-06-06
Filing date: 2019-06-06
Publication date: 2020-12-16
Also published as: TWI734121B

Abstract

本發明係關於一種具有促進傷口癒合功效的酵素水解滑菇多醣體，其製備方法及其用途。本發明之酵素水解滑菇多醣體主要含有平均分子量為3-4.5kDa之小分子滑菇多醣體，具有更佳的皮膚滲透力之潛力，且經實驗證明可效抵抗皮膚細胞受到氧化損傷，抑制發炎反應，且具有促進傷口癒合的功效。

Description

具有促進傷口癒合功效的酵素水解滑菇多醣體及其用途

本發明係關於一種滑菇多醣體萃取物及其製備方法。更特別地，本發明係關於含有小分子量之酵素水解滑菇多醣體用於製備促進傷口癒合的組成物之用途。

滑菇(Pholiota nameko)別名珍珠菇，中文學名又叫光帽鱗傘，光滑銹傘、珍珠菇等，屬於擔子菌綱，傘菌目，絲膜菌科，鱗傘屬，於初冬群簇腐生於闊葉朽木上，菌傘為金褐色，成熟平展時可達3-10公分，菌傘表面具有黏液，菌柄圓柱狀且柄上具黃褐色之菌環(韓誠武等人，豆渣深層培養滑菇產胞外纖維素酶最佳培養基的優化，2011)。在中國和日本被廣泛種植用作食品和傳統醫藥(Rodrigues,D.等人，Food chemistry, 216：176-185,2017)，富含多種營養，蛋白質含量33~35%、醣類38%以上及多種礦物質和維生素B1、B2。

滑菇已知具有一般菇菌的保健功效如抗氧化、抗發炎、免疫調節以及抗癌(Moradali,M.-F.等人，International immunopharmacology, 7(6)：701-724,2007)，然而其菇傘表面含有一層其他菇種沒有的黏性物質(Zhang,Y.等人，Biochimie, 99：28-37,2014。滑菇的黏性物質僅出現於子實體，而現今是利用溫度來進行滑菇的生長調控，產菇(子實體)的溫度界於6-20℃，若溫度高於15℃則產出的子實體的菇傘小、菌柄細長，若溫度低於8℃則生長緩慢，但菇傘較大。

傳統藥用真菌多醣體的萃取方法，大多將菇蕈類之菌絲體進行液態發酵培養或直接採用子實體，以熱水萃取、酶萃取或酸鹼萃取法等進行萃取，再進一步藉由高濃度有機溶劑，如酒精等，進行沈澱純化以得到多醣體。但是，此傳統方式所萃取出來之多醣體分子品質較大(約為100k道耳頓(Dalton,Da)至1000k道耳頓之間)，人體皮膚較無法輕易吸收，若應用於添加在化妝品配方中，可能無法使所製得之化妝品達到所期望的較佳促進傷口癒合和抗皺之功效。

另已有研究指出，玻尿酸滲透隨著其分子量的降低而增加，且不同分子量有不同的人體皮膚的滲透和空間分佈，多醣體可透過皮膚保護和促進皮膚形成水合作用，有文獻已證實玻尿酸於皮膚之可滲透性(20-300kDa)(Essendoubi，等人，Skin Research and Technology, 22(1)：55-62,2016)。因此，本發明致力於開發一種簡化、快速且成本花費較低的小分子多醣體萃取製程。

基於以上之目的，並有效解決上述習知技藝之問題，本發明遂提出一種具有較低分子量以及促進傷口癒合功效之滑菇多醣體之製造方法，其包含下列步驟：將一滑菇進行萃取使得到一粗萃物；利用一澱析法使粗萃物析出多醣體；以及添加水解酵素於多醣體中以形成混合物，並將混合物於預定溫度下進行水解程序，以得到小分子量(低於4.5kDa)的滑菇多醣體。

於是，本發明之一方面係關於一種具有促進傷口癒合作用的滑菇多醣體組合物，包含平均分子量為3-4.5kDa的酵素水解滑菇多醣體，特徵在於係由下列方法製備得：取滑菇子實體以95-98℃之熱水萃取120-150分鐘；將所得之水萃取液以乙醇進行沉澱得粗滑菇多醣體；及將得之粗滑菇多醣體以水解酵素於20~40℃處理而得分子量低於4.5kDa的滑菇多醣體。

於本發明之一些具體實施態樣，所述之酵素水解步驟較佳係於pH 6.5-7.5、20~40℃之條件下作用1-3小時。於本發明之一具體實施例，所述酵素水解步驟較佳係於pH.7.0、溫度30℃之條件下作用1-3小時。

用於本發明之水解酵素可為任一種用於將蕈菇多醣體水解，而得到較小分子量多醣體分子之酵素，例如(但不限定於)β-1,3-D-葡聚糖酶(β-1,3-D-glucanase)，該類酵素可專一性水解β-1,3-糖苷鍵。於天然物中，蕈菇類多醣體的主要結構就是β-1,3-糖苷(β-1,3-D-glucan)，因此這類酵素尤其可用於本發明，於水解反應中"切割"滑菇粗多醣體之分子/結構，而得到本發明具有分子量小於4.5kDa的酵素水解滑菇粗多醣體。

本發明之另一方面係關於一種酵素水解滑菇多醣體用於製備促進傷口癒合之醫藥組合物的用途。於本發明之一些具體實施態樣，所述之醫藥組合物可經調製成為一創傷敷料、一貼皮墊片、一面膜、一乳霜或一洗劑。

圖1係顯示酵素水解滑菇多醣體(EH)、滑菇粗多醣體(CRUDE)及維生素C(作為陽性對照組)之體外抗氧化ABTS之實驗結果。結果以清除率平均值±標準偏差表示。(p<0.05)

圖2為酵素水解滑菇多醣體(EH)與滑菇粗多醣體(CRUDE)的Fe2+離子螯合活性測試結果。

圖3為酵素水解滑菇多醣體(EH)與滑菇粗多醣體(CRUDE)對於H₂O₂處理L929細胞之存活率試驗結果。

圖4係顯示不同濃度之酵素水解滑菇多醣體(EH)與滑菇粗多醣體(CRUDE)促進L929細胞增生的功效。

圖5為不同濃度之酵素水解滑菇多醣體(EH)與滑菇粗多醣體(CRUDE)對於抑制NO生成的試驗結果。

圖6係顯示不同濃度之酵素水解滑菇多醣體(EH)與滑菇粗多醣體(CRUDE)對L929細胞的傷口癒合效果。

本發明之其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明，而該實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明之範圍。

實施例一、滑菇子實體多醣體組合物之製備

本實例列舉一種用以製備本發明滑菇子實體多醣體的較佳製程，主要包含將滑菇子實體利用熱水萃取，再藉由酒精沉澱原理澱析得到滑菇粗多醣體，之後再以水解酵素處理滑菇粗多醣體，而得到具有分子量小於4.5kDa的功效性小分子酵素水解滑菇多醣體。

製備方法簡要敘述如下：取滑菇子實體以95℃熱水萃取150分鐘，得到水萃液；利用95%乙醇將前述之水萃液進行萃取、沉澱而得滑菇粗多醣體(CRUDE)；再將前述之滑菇粗多醣體(CRUDE)以酵素水解處理，而得到酵素水解滑菇多醣體(EH)。所得酵素水解滑菇多醣體的平均分子量，經測定為3.0kDa(如表1所示)。

前述之酵素水解處理程序可於pH6.5-7.5，較佳為pH7.0之適當酸鹼值環境，於溫度20~40℃，較佳可為30℃的條件下作用1-3小時，之後可以95℃之高溫將酵素滅活以終止酵素反應。水解酵素一般可用之多醣類水解酵素，於本實施例較佳使用β-1,3-D-葡聚糖酶(β-1,3-D-glucanase)，該酵素可專一性裂解存在天然蕈菇類多醣體主要結構β-1,3-糖苷(β-1,3-D-glucan)中的β-1,3-糖苷鍵，而得到所希望分子量大小之滑菇多醣體。所使用的粗多醣體與水解酵素之重量百分比，較佳地可分別為90~99.8wt%及0.2~1wt%。

滑菇子實體的菇傘表面含有一層其他菇種不常見的黏液，且滑菇中胺基酸及多醣體組成與其他菇菌類有所差異，根據本發明酵素水解滑菇多醣體體與金針菇多醣體及銀耳多醣體之比較實驗數據顯示，蛋白質-多醣複合物中之蛋白質含量，係以滑菇多醣體中所含為最多，即滑菇多醣體>金針菇多醣體及銀耳多醣體，且以本發明的酵素水解製備多醣體之方法，可分離得到具有較小分子量之抗氧化功效性的多醣(數據如下表一所示)。

實施例二、酵素水解滑菇子實體多醣體組合物之抗氧化功效

ABTS自由基清除力

ABTS(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)為一種相當穩定的自由基，當ABTS經由抗氧化劑所提供的氫質子將其還原後，其吸光值會降低。因此，在評估抗氧化能力的實驗中，常使用ABTS自由基來測試檢品藉由氫質子的提供而達到清除自由基之效力。樣品對ABTS自由基的清除率越高，即表示其清除自由基的能力越好。

秤取ABTS(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)粉末，以及過硫酸鉀加入反應12-16小時，為ABTS溶液。配置不同濃度之樣品溶液(酵素水解滑菇多醣體(EH)溶液，及滑菇粗多醣體(CRUDE)溶液)，在96孔盤中加入20μl樣品溶液後，加入180μl ABTS溶液，經均勻混合後，進行避光反應6分鐘，最後以分光光度計波長734nm中檢測吸光值。精密秤量0.1g L-維生素C溶解於10ml ddH₂O，依序稀釋成0,0.625,1.25,2.5mg/ml濃度之維生素C溶液並以上述方法進行，為陽性對照。

清除率%=[(A_對照組-A_樣品)/A_對照組]×100

其中A_對照組=對照的吸光度，包含除測試化合物外的所有試劑；A_樣品=樣品的吸光度，包含所有試劑，包括測試化合物，維生素C用作陽性對照。

由圖1之結果顯示，對於ABTS自由基，本發明酵素水解滑菇多醣體(EH)之IC₅₀約為2.85mg/mL，明顯優於滑菇粗多醣體(CRUDE)之IC₅₀(>5mg/mL)。表示，經進一步酵素水解得到的小分子滑菇多醣體，其ABTS自由基清除能力顯著提高。

亞鐵離子(Fe²⁺)螯合能力

在多種金屬離子中，Fe²⁺經常是最具影響力的助氧化劑，其會促進脂質氧化作用的進行。當Fe²⁺與ferrozine螯合會產生鮮紅色的Ferrozine-Fe²⁺錯化合物，在562nm具有呈色反應。而當樣品螯合Fe²⁺離子時，會減少Ferrozine-Fe²⁺的生成，而造成562nm吸光值的降低，所以所測得的吸收度越低，就表示螯合能力越高，可藉此而測得樣品對Fe²⁺離子的螯合能力。

將等體積之不同濃度樣品(酵素水解滑菇多醣體(EH)、滑菇粗多醣體(CRUDE)、EDTA-2Na)與2mM FeCl₂．4H₂O混合，加入5mM ferrozine，晃動混合物，反應10分鐘後，用分光光度法在562nm處測量所得溶液的吸光度。使用下式計算ferrozine-Fe⁺²複合物形成的抑制百分比：螯合效應%=[(A_對照組-A_樣品)/A_對照組]×100

其中A_對照組=對照的吸光度(包含除測試化合物外的所有試劑)和A_樣品=樣品的吸光度(包含所有試劑，包括測試化合物)，EDTA-2Na用作陽性對照。

參見圖2之實驗結果得知，酵素水解滑菇多醣體(EH)樣品之Fe²⁺離子螯合能力(IC₅₀約為0.48mg/mL)，明顯高於滑菇粗多醣體(CRUDE)(IC₅₀約為2.29mg/mL)。以上之結果顯示，

抵抗L929細胞受到氧化損傷

進一步於MTT細胞存活試驗，評估本發明酵素水解滑菇多醣體對於保護細胞抗氧化傷害的能力。MTT(溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑)為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用於活細胞粒線體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶 (SDH)和細胞色素C的作用下四氮唑環會開裂，生成紫色的甲

(formazan)結晶，利用DMSO將甲

溶解出來之後，再利用吸光度的測定去評估有多少細胞存活，甲

結晶的生成量與活細胞數目成正比，因為死細胞中的琥珀酸脫氫酶會消失，而不能將MTT還原。

將L929細胞接種於96-well plate，於37℃培養箱進行隔夜培養。之後，以不同濃度的樣品處理細胞24小時，未處理組作為對照組。處理後，加入100μL 0.5mg/ml MTT培養2小時。移除培養上清液，再加入200μL DMSO溶出甲

結晶。使用ELISA計讀機偵測於波長570nm的吸光值。從上述方法得到滑菇黏質醣蛋白處理L929細胞的最適處理濃度。依據上述培養條件，於24小時培養後，再以1.0mmol/L H₂O₂處理24小時，並以MTT測試法分析細胞存活率。

由圖3之結果顯示，未給予滑菇多醣體防護的L929細胞其存活率明顯下降，而在給予不同濃度滑菇多醣體溶液之培養條件下，其保護L929細胞抵抗氧化物H₂O₂傷害的存活率效果明顯提高，且隨滑菇多醣體組合物的濃度增加，保護細胞抗氧化的效果越好。

綜合以上結果表示，本發明之酵素水解滑菇多醣體(EH)為一種有效清除自由基，並能抵抗L929細胞受到氧化損傷的機能性活性物質。而且，本發明以酵素水解獲得的小分子滑菇多醣體，並不會對細胞造成毒害，反而具有保護細胞抵抗H₂O₂自由基攻擊之功效，顯示其對於化妝品保養品之應用開發應無安全上之疑慮。

已有研究指出，食用和藥用真菌菇類多醣體生物活性與其蛋白含量相關，與抗氧化功效性等有相當關連性，故參照表1之蛋白質含量與本實例之細胞抗氧化保護結果，可符合本發明酵素水解滑菇多醣體(EH)具有較高蛋白質含量，而能產生最佳的抗氧化活性及細胞保護效果。

實施例三、酵素水解滑菇子實體多醣體組合物促進傷口癒合

由前述之實施例已證明，本發明之酵素水解滑菇多醣體(EH)具有清除自由基、抑制氧化損傷的活性，於本實例遂進一步評估酵素水解滑菇多醣體(EH)在促使細胞增生，進而達到傷口癒合的功效。

L929(小鼠成纖維細胞)細胞增殖試驗

將L929(小鼠成纖維細胞)細胞接種於96-well培養平盤，經隔夜培養後，以不同濃度的樣品處理48小時，未處理組當作對照組。之後，加入100μL 0.5mg/ml MTT培養2小時，移除培養上清液，再加入200μL DMSO溶出formazan結晶。使用ELISA計讀機，於波長570nm下偵測吸光值。

由圖4之結果顯示，隨著酵素水解滑菇多醣體樣品濃度增加，L929增生效果越佳，顯示本樣品可促進纖維細胞增生，達到促進傷口癒合之效果。

抑制NO生成試驗

NO為細胞發炎時的產物，會造成組織細胞損傷，進而延緩傷口癒合的速度。故本實例亦進一步評估酵素水解滑菇多醣體在抑制發炎物質NO生成之能力。將RAW264.7細胞接種在96孔培養平盤中，並加入不同濃度樣品，於LPS(誘導劑)存在下於37℃進行溫育。於18小時後，使用Griess反應測量細胞中NO之產生量。

由圖5之結果顯示，滑菇粗多糖體都有抑制NO濃度增加的效果，但本發明之經過酵素水解的滑菇多醣體的NO生成抑制效果，顯然比粗萃取多醣體更佳。

傷口癒合試驗

將L929細胞(密度為1x10⁵細胞/ml)接種到24培養平板的每個孔中，並在37℃和5% CO₂下進行培育。在形成匯合的單層L929細胞後，用無菌移液管尖端，在每個孔中產生平行劃痕。通過用PBS緩衝液沖洗，洗滌除去細胞碎片，並加入樣品(40~80%滑菇多醣體)。在第0天使用顯微照片拍攝照片，然後將板在37℃下與5% CO₂之培養箱中培養24h，並測量癒合區域的百分比。

結果圖6所示。表示，80%分級滑菇多醣體萃取液可有效抵抗L929細胞受到氧化損傷，促使細胞增生，進而達到促進傷口癒合的功效。

比較酵素水解滑菇多醣體(EH)與滑菇粗多醣體(CRUDE)對細胞的傷口癒合率。參見圖6之結果，經24小時後，酵素水解滑菇多醣具細胞癒合的情形，且促進細胞增生效果也較滑菇粗多醣體更為顯著。此結果顯示，以酵素水解滑菇多醣體(EH)培養之L929細胞，其細胞增生及移行能力都有增加，和滑菇粗多醣體處理組細胞相較，細胞癒合的情形也較明顯。

綜合上述，本發明之滑菇多醣體萃取物可效藉由消除細胞自由基所受到之氧化損傷，促使細胞增生進而達到傷口癒合。於是，本發明之滑菇萃取物具體可與習知醫藥載劑或化妝品基底物質調配，而製成敷料、面膜、化妝水、精華液、修復霜等具有促損傷口癒合的醫藥產品或化妝品。

Claims

一種具有促進傷口癒合作用的滑菇多醣體組合物，包含平均分子量為3.0-4.5kDa的酵素水解滑菇多醣體，特徵在於該酵素水解滑菇多醣體係由下列方法製備得：(1)取滑菇子實體以95-98℃之熱水萃取120-150分鐘；(2)將所得之水萃取液以乙醇進行沉澱得粗滑菇多醣體；及(3)將所得之粗滑菇多醣體以β-1,3-D-葡聚糖酶(β-1,3-D-glucanase)水解酵素於20~40℃處理而得分子量低於4.5kDa的酵素水解滑菇多醣體。
如請求項1所述之滑菇多醣體組合物，其中該酵素水解步驟係於pH 6.5-7.5、溫度20~40℃之條件下作用1-3小時。
如請求項2所述之滑菇多醣體組合物，其中該酵素水解步驟係於pH.7.0、溫度30℃之條件下作用1-3小時。
如請求項1所述之滑菇多醣體組合物，其中該酵素水解步驟包含將90~99.8wt%之粗多醣體與0.2~1wt%之水解酵素進行水解反應。
如請求項1所述之滑菇多醣體組合物用於製備促進傷口癒合之醫藥組合物的用途。
如請求項5所述之用途，其中該醫藥組合物為一創傷敷料、一貼皮墊片、一面膜、一乳霜或一洗劑。