TW202037608A - 人源化抗人類-pd-1抗體 - Google Patents
人源化抗人類-pd-1抗體 Download PDFInfo
- Publication number
- TW202037608A TW202037608A TW108146725A TW108146725A TW202037608A TW 202037608 A TW202037608 A TW 202037608A TW 108146725 A TW108146725 A TW 108146725A TW 108146725 A TW108146725 A TW 108146725A TW 202037608 A TW202037608 A TW 202037608A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- antibody
- inhibitors
- antigen
- human
- cells
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/567—Framework region [FR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
Abstract
本文描述人源化抗PD-1抗體、編碼此類抗體之核酸及其藉由活化T細胞而增強免疫反應且治療諸如癌症及感染性疾病之疾病的用途。
Description
本發明係關於免疫學及免疫療法之領域,尤其治療人類疾病。更確切言之,本發明係關於一種人源化抗人類PD-1抗體或其抗原結合片段,其可用於治療人類疾病。
計劃性細胞死亡蛋白1 (PD-1,亦稱為CD279)係一種屬於免疫球蛋白超家族之細胞表面蛋白分子。PD-1在T淋巴細胞及B淋巴細胞以及巨噬細胞上表現,且在細胞命運及分化中發揮作用。詳言之,PD-1充當免疫檢查點,其藉由預防T細胞活化,隨後降低自身免疫性及促進自身耐受性而在下調免疫系統中發揮重要作用。已確定PD-1之兩種配位體,PD-L1與PD-L2,已顯示該兩種配位體在結合於PD-1時下調T細胞活化,誘發T細胞中之共抑制信號,且促進其細胞凋亡、失能及功能耗竭(Freeman等人(2000) J Exp Med 192: 1027-34;Latchman等人(2001) Nat Immunol 2:261-8;Carter等人(2002) Eur J Immunol 32:634-43)。配位體PD-L1及PD-L2在正常人類細胞中不表現,但在多種人類癌症中可大量存在(Dong等人 (2002) Nat Med 8:787-9;Brahmer等人, N Eng J Med, 366(26), 2012;Topalian等人, N Eng J Med, 366(26), 2012;Wolchok等人, N Engl J Med. 2013年7月11日; 369(2): 122-133)。PD-L1比PD-L2更廣泛地表現,且由多種造血細胞及非造血細胞表現。
腫瘤、微生物及病毒採用諸如PD-L1/PD-1之共抑制途徑,藉由建立免疫抑制微環境來避開免疫防禦及免疫監視。詳言之,由腫瘤、微生物或病毒引起之PD-L1/PD-1路徑可經由多種機制來逃避宿主之免疫監視,該等機制包括:促進T細胞失活、疲勞、無反應及細胞凋亡;誘發T-reg細胞擴增;以及增強腫瘤抵抗殺死及細胞凋亡之內在能力。由癌細胞介導之PD-1與PD-L1之相互作用亦藉由減少TCR下游之信號而減少腫瘤浸潤性淋巴細胞及抑制T細胞受體介導之T細胞增殖,從而減少活化及細胞介素產生(Dong等人 J. Mol. Med. 2003, 81: 281-7;Blank等人 Cancer Immunol. Immunother. 2005, 54: 307-314;Konishi等人 Clin. Cancer Res. 2004, 10: 5094-100)。已在大量原發性腫瘤生檢中發現PD-1在腫瘤浸潤性淋巴細胞或腫瘤細胞上表現(Ribas A. Cancer Discov. 2015, 5(9):915-9)。
考慮到PD-1之免疫抑制作用,已研發出PD-1抑制劑來抵消此對人類免疫系統之不利影響。咸信此類PD-1抑制劑使免疫系統活化以侵襲腫瘤或感染細胞,因此可用於治療癌症及疾病。實際上,使用PD-1或PD-L1之抑制劑破壞其相互作用的策略已顯示改善癌症免疫療法之潛能(Brahmer等人, N Eng J Med, 366(26), 2012;Powles等人, Nature, 515(7528), 2014;Topalian等人, N Eng J Med, 366(26), 2012;Ansell, Curr Opin Hematol, 22(4), 2015)。詳言之,阻斷PD-1與其配位體之間的相互作用可增強能夠消除腫瘤細胞之腫瘤特異性CD8 T細胞免疫性(Topalian S.等人 Curr Opin Immunol. 2012, 24(2):207-12)。PD-1之抑制作用亦經由促進淋巴結中抗原特異性T細胞之細胞凋亡同時減少調節T細胞之細胞凋亡的雙重機制實現。
對PD-1/PD-L1阻斷具有特異性之單株抗體(「mAb」)之使用係此項技術中已知的,其抵消PD-1/PD-L1信號傳導路徑之免疫抑制作用。然而,顯著實際問題已阻礙其在活體內廣泛用於人類中。一個主要問題係,非人類來源之單株抗體常常具有免疫原性,藉此限制其效力,且在一些情況下,引起危險的過敏反應。針對此類外源性mAb之免疫反應包括產生特定的高親和力抗體,該等抗體結合於mAb且消除mAb,因此,藉由促進mAb自體內清除且抑制其結合於所靶向抗原之能力,實質上降低mAb之效力。為克服此問題,可將所關注之非人類抗體人源化,以降低對人類之免疫原性,同時保留親本非人類抗體(通常為鼠類抗體)之特異性及親和力。此類人源化抗體通常包含一或多個可變域,其中抗原結合域來源於非人類抗體,且構架區來源於人類或人源化抗體序列。
因此,需要研發出靶向人類PD-1之人源化抗體,以提供用於安全免疫療法、尤其針對癌症之改良藥劑。
本發明係基於特異性靶向人類PD-1之人源化抗體之研發,該抗體展示對PD-1之高結合親和力及與其配位體PDL-1及/或PDL-2之強烈競爭。此人源化抗體經工程改造,在基於哺乳動物細胞之生產系統中呈現高的可製造性及產量。此人源化抗體在本文中特別稱為「HKLD」。
此外,本申請人已觀測到該抗體之顯著及意外之作用,其引起巨噬細胞對不表現PD-L1之腫瘤細胞的吞噬作用,其中此抗體尤其用於治療PD-L1陰性腫瘤及/或患有T細胞免疫反應缺乏症之患者的功效係有希望的。
特別在實施方式開始時及實例中展示及解釋強烈之有益及意外作用。
在第一態樣中,人源化單株抗人類-PD-1抗體或其抗原結合片段包含:
(i) 重鏈可變域,該重鏈可變域包括包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列或由其組成之HCDR1、包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列或由其組成之HCDR2及包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列或由其組成之HCDR3,及
(ii) 輕鏈可變域,該輕鏈可變域包括包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列或由其組成之LCDR1、包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列或由其組成之LCDR2及包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列或由其組成之LCDR3,
其中該抗體或其抗原結合片段為人類PD-L1及/或PD-L2與人類PD-1之結合的拮抗劑。
在第二態樣中,人源化單株抗人類-PD-1抗體或其抗原結合片段包含(a)包含選自由SEQ ID NO: 21組成之群之胺基酸序列或由其組成之VH;及(b)包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列或由其組成之VL。
較佳地,抗體或其抗原結合片段為人類PD-L1及/或PD-L2與人類PD-1之結合的拮抗劑。
在一特定態樣中,抗體或其抗原結合片段包含:(a)重鏈,該重鏈包含選自由SEQ ID NO: 31組成之群之胺基酸序列或由其組成,視情況在SEQ ID NO: 31之除位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106及112以外之任何位置處具有一個、兩個或三個選自取代、添加、刪除及其任何組合之修飾;及(b)輕鏈,該輕鏈包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列或由其組成,視情況在SEQ ID NO: 34之除位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99及105以外之任何位置處具有一個、兩個或三個選自取代、添加、刪除及其任何組合之修飾。
在一特定態樣中,抗體或其抗原結合片段包含來源於人類κ輕鏈恆定域之輕鏈恆定域及來源於人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定域之重鏈恆定域。
在一更特定態樣中,抗體或其抗原結合片段包含來源於人類κ輕鏈恆定域之輕鏈恆定域及來源於人類IgG1重鏈恆定域之重鏈恆定域,視情況具有選自由以下各者組成之群的取代或取代組合:T250Q/M428L;M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F;E233P/L234V/L235A/G236A + A327G/A330S/P331S;E333A;S239D/A330L/I332E;P257I/Q311;K326W/E333S;S239D/I332E/G236A;N297A;L234A/L235A;N297A + M252Y/S254T/T256E;K322A及K444A,較佳選自由以下各者組成之群:N297A,視情況與M252Y/S254T/T256E組合,及L234A/L235A。
在另一更特定態樣中,抗體或其抗原結合片段包含來源於人類κ輕鏈恆定域之輕鏈恆定域及來源於人類IgG4重鏈恆定域之重鏈恆定域,視情況具有選自由以下各者組成之群的取代或取代組合:S228P;L234A/L235A、S228P+M252Y/S254T/T256E及K444A。
較佳地,抗體或其抗原結合片段以等於或低於10-7
M之對人類PD-1之結合親和力常數(KD)特異性結合於人類PD-1,該親和力較佳藉由生物感測器分析來確定。
詳言之,抗體或其抗原結合片段具有等於或大於85%、較佳等於或大於88%之人源化(T20)及/或在哺乳動物細胞中具有高產量。
在一第二態樣中,本發明係關於一種經分離之核酸分子或經分離之核酸分子組,其編碼如本文所揭示之抗體或其抗原結合片段。
在一第三態樣中,本發明係關於一種載體,其包含如本文所揭示之經分離之核酸分子或經分離之核酸分子組。
本發明亦關於一種宿主細胞,其包含根據本發明之經分離之核酸分子及/或經分離之核酸分子組及/或載體。
在另一態樣中,本發明係關於一種用於產生抗體或其抗原結合片段之方法,該方法包含培養如本文所揭示之宿主細胞之步驟且視情況包含分離該抗體或抗原結合片段之步驟。
在另一態樣中,本發明係關於一種醫藥組合物,其包含如本文所揭示之抗體或其抗原結合片段及/或經分離之核酸分子及/或經分離之核酸分子組及/或載體及/或宿主細胞及醫藥學上可接受之載劑。
視情況,醫藥組合物進一步包含另一種治療劑,該另一種治療劑較佳選自由以下各者組成之群:烷基化劑、血管生成抑制劑、抗體、尤其抗腫瘤靶向抗體、抗代謝物、抗有絲***劑、抗增生劑、抗病毒劑、極光激酶抑制劑、細胞凋亡促進劑(例如Bcl-2家族抑制劑)、死亡受體路徑活化劑、Bcr-Abl激酶抑制劑、BiTE (雙特異性T細胞接合分子)抗體、抗體藥物結合物、生物反應調節劑、布魯頓氏酪胺酸激酶(Bruton's tyrosine kinase,BTK)抑制劑、週期蛋白依賴型激酶抑制劑、細胞週期抑制劑、環加氧酶-2抑制劑、DVD、白血病病毒致癌基因同源物(ErbB2)受體抑制劑、生長因子抑制劑、熱休克蛋白(HSP)-90抑制劑、組蛋白去乙醯基酶(HDAC)抑制劑、激素療法、免疫藥物、細胞凋亡蛋白抑制劑(IAP)、嵌入型抗生素、激酶抑制劑、驅動蛋白抑制劑、Jak2抑制劑、哺乳動物雷帕黴素靶蛋白抑制劑(mammalian target of rapamycin inhibitor)、微RNA、有絲***原活化胞外信號調節激酶抑制劑、多價結合蛋白、非類固醇消炎藥(NSAID)、聚ADP (二磷酸腺苷)-核糖聚合酶(PARP)抑制劑、鉑化學治療劑、polo樣激酶(Plk)抑制劑、磷酸肌醇-3激酶(PI3K)抑制劑、蛋白酶體抑制劑、嘌呤類似物、嘧啶類似物、受體酪胺酸激酶抑制劑、類視黃素/類維生素D植物鹼、小抑制核糖核酸(siRNA)、拓樸異構酶抑制劑、泛蛋白連接酶抑制劑、低甲基化劑、檢查點抑制劑、肽疫苗及其類似物、來自腫瘤抗原之抗原決定基或新抗原決定基以及此等藥劑中之一或多者的組合。
特定而言,抗體或其抗原結合片段、醫藥組合物、經分離之核酸分子或經分離之核酸分子組、載體或宿主細胞適用作藥劑。
視情況,抗體或其抗原結合片段、醫藥組合物、經分離之核酸分子或經分離之核酸分子組、載體或宿主細胞與放射線療法或另一種治療劑組合使用,該另一種治療劑較佳選自由以下各者組成之群:烷基化劑、血管生成抑制劑、抗體、尤其抗腫瘤靶向抗體、抗代謝物、抗有絲***劑、抗增生劑、抗病毒劑、極光激酶抑制劑、細胞凋亡促進劑(例如Bcl-2家族抑制劑)、死亡受體路徑活化劑、Bcr-Abl激酶抑制劑、BiTE (雙特異性T細胞接合分子)抗體、抗體藥物結合物、生物反應調節劑、布魯頓氏酪胺酸激酶(BTK)抑制劑、週期蛋白依賴型激酶抑制劑、細胞週期抑制劑、環加氧酶-2抑制劑、DVD、白血病病毒致癌基因同源物(ErbB2)受體抑制劑、生長因子抑制劑、熱休克蛋白(HSP)-90抑制劑、組蛋白去乙醯基酶(HDAC)抑制劑、激素療法、免疫藥物、細胞凋亡蛋白抑制劑(IAP)、嵌入型抗生素、激酶抑制劑、驅動蛋白抑制劑、Jak2抑制劑、哺乳動物雷帕黴素靶蛋白抑制劑、微RNA、有絲***原活化胞外信號調節激酶抑制劑、多價結合蛋白、非類固醇消炎藥(NSAID)、聚ADP (二磷酸腺苷)-核糖聚合酶(PARP)抑制劑、鉑化學治療劑、polo樣激酶(Plk)抑制劑、磷酸肌醇-3激酶(PI3K)抑制劑、蛋白酶體抑制劑、嘌呤類似物、嘧啶類似物、受體酪胺酸激酶抑制劑、類視黃素/類維生素D植物鹼、小抑制核糖核酸(siRNA)、拓樸異構酶抑制劑、泛蛋白連接酶抑制劑、低甲基化劑、檢查點抑制劑、肽疫苗及其類似物、來自腫瘤抗原之抗原決定基或新抗原決定基以及此等藥劑中之一或多者的組合。
在一態樣中,適用作藥劑之抗體或其抗原結合片段、醫藥組合物、經分離之核酸分子或經分離之核酸分子組、載體或宿主細胞用於預防或治療癌症。較佳地,癌症係選自由以下各者組成之群:表現PD-1及/或PD-L1之惡性血液病或實體腫瘤,諸如選自由淋巴造血腫瘤、血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤、骨髓增生異常症候群及急性骨髓性白血病組成之群的癌症;由病毒誘發或與免疫缺乏相關聯之癌症,諸如選自由以下各者組成之群的癌症:卡波西氏肉瘤(Kaposi sarcoma)(例如與卡波西氏肉瘤疱疹病毒相關聯);子宮頸、肛門、陰莖及外陰鱗狀細胞癌及口咽癌(例如與人類乳頭狀瘤病毒相關聯);B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL),包括彌漫性大B細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、漿母細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、HHV-8原發性滲出性淋巴瘤、經典霍奇金氏淋巴瘤(classic Hodgkin lymphoma)及淋巴增生病症(例如與艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus,EBV)及/或卡波西氏肉瘤疱疹病毒相關聯);肝細胞癌(例如與B型及/或C型肝炎病毒相關聯);梅克爾細胞癌(Merkel cell carcinoma)(例如與梅克爾細胞多瘤病毒(MPV)相關聯);以及與人類免疫缺乏病毒感染(HIV)相關聯之癌症;及選自由轉移性或非轉移性黑色素瘤、惡性間皮瘤、非小細胞肺癌、腎細胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、頭頸癌、尿道上皮癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、小細胞肺癌、轉移性梅克爾細胞癌、胃癌或胃食道癌及子宮頸癌組成之群的癌症。
在一特定態樣中,抗體或其抗原結合片段、醫藥組合物、經分離之核酸分子或經分離之核酸分子組、載體或宿主細胞係用於治療腫瘤細胞為PD-L1陰性之癌症。較佳地,適用作藥劑之抗體或其抗原結合片段、醫藥組合物、經分離之核酸分子或經分離之核酸分子組、載體或宿主細胞用於預防或治療感染性疾病,較佳慢性感染性疾病,甚至更佳由選自由以下各者組成之群之病毒引起的感染性疾病:HIV、肝炎病毒、疱疹病毒、腺病毒、流感病毒、黃病毒、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒、科沙奇病毒(coxsackie virus)、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、細小病毒、痘瘡病毒、HTLV病毒、登革熱病毒(dengue virus)、乳頭狀瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰白質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒及蟲媒病毒性腦炎病毒。
在一特定態樣中,抗體或其抗原結合片段、醫藥組合物、經分離之核酸分子或經分離之核酸分子組、載體或宿主細胞係用於治療患有淋巴球減少症之患者。
在一特定態樣中,抗體或其抗原結合片段、醫藥組合物、經分離之核酸分子或經分離之核酸分子組、載體或宿主細胞用作用於治療免疫抑制、免疫功能不全或免疫功能低下之個體的藥物。在另一特定態樣中,個體具有高的突變負荷及新抗原密度。
引言
本發明之人源化抗hPD1抗體(HKLD)具有以下所有優點:
-其具有高百分比之人源化,詳言之,重鏈91.07%且輕鏈88.7%之T20人源化評分。相比之下,作為臨床批准之抗體及標準之稱為Keytruda的抗PD1抗體具有重鏈75.7%且輕鏈82.7%之T20人源化評分(參見表9)。T20人源化評分為抗體人源化領域常用之參數,由Gao等人(BMC Biotechnol, 2013, 13, 55)首次揭示。T20人源化評分通常用於專利申請案中,用於定義人源化抗體(例如WO15161311、WO17127664、WO18136626、WO18190719、WO19060750或WO19170677)。
-意外地,當在哺乳動物細胞(例如COS、CHO)中產生時,與嵌合抗體相比,其呈現高的可製造性及高產量。實際上,在CHO細胞及COS細胞中,與嵌合抗體相比,其產量增加3-4倍(參見表11),且與Keytruda相比,產量增加2倍(參見圖6)。
-其呈現小於10-8 M之對人類PD-1之結合親和力(KD)。如藉由不同方法所評估,本發明之人源化抗體展示與嵌合抗體相比改善之與PD-1之結合。人源化抗體HKLD之親和力與稱為Keytruda之抗PD1抗體中之一者相當(參見表7)。
-其具有拮抗劑活性且抑制人類PD-L1及/或PD-L2與人類PD-1之結合(參見表13)。更特定言之,與嵌合抗體相比,本發明之人源化抗體展示改善之與PD1表現細胞之結合(圖1C)及拮抗劑能力(參見表14及15)。
-其高度穩定(參見表12)。
-其阻斷PD-1信號傳導(SHP-1磷酸化及募集,參見表15及圖7)且促進T細胞活化(NFAT介導之活化,參見表16及圖8)。
-其刺激人類T細胞之效應細胞介素之分泌,更特定言之IFNg細胞介素之分泌(圖9)。
-因此,其能夠恢復T細胞活化。
-其促進活體內抗腫瘤免疫反應。實際上,本發明之人源化抗體能夠在若干腫瘤類型中減小腫瘤尺寸且提高存活率(圖10-12)。
-其具有一出人意料之額外益處,因為其藉由阻斷巨噬細胞上PDL1/PD-1結合,能夠增強PD-L1陰性腫瘤細胞之吞噬(圖14)。此作用係本發明之人源化抗PD-1抗體所特有的,尚未在其他抗PD-1抗體、尤其派姆單抗及納武單抗下觀測到(圖14C)。因此,本發明之人源化抗PD-1抗體經由此吞噬作用誘發針對不表現PD-L1之腫瘤細胞之免疫反應。對於免疫抑制或免疫功能低下患者,及/或對於治療包含不表現PD-L1之腫瘤細胞之腫瘤,此特性尤其受關注。更特定言之,其適用於治療可能具有少量T細胞、尤其腫瘤浸潤T細胞及/或具有大量耗竭性T細胞之患者。實際上,抗體經由活化巨噬細胞之吞噬作用可具有額外抗腫瘤作用。不受理論束縛,本發明者咸信本發明之抗體對巨噬細胞之特定作用可歸因於其能夠結合相同細胞,亦即相同巨噬細胞上之PD-1及PD-L1。
-最終,本發明之人源化抗體呈現良好藥物動力學(圖13)。
總而言之,本發明之人源化抗PD1抗體呈現極高人源化,甚至與Keytruda (臨床上已批准之抗PD1)相比。與該嵌合抗體相比,其意外地呈現更佳產量、與PD-1更佳之結合及更佳拮抗劑能力。其穩定且具有良好藥物動力學。其增強T細胞活化,活化巨噬細胞之吞噬作用且促進活體內抗腫瘤免疫反應。
定義
為使本發明更易於理解,下文對某些術語進行定義。在通篇[實施方式]中,闡述其他定義。
除非另外定義,否則本文所使用之所有技術術語、符號以及其他科學術語意欲具有本發明相關領域之熟練技術人員通常理解的含義。在一些情況下,為求清楚及/或方便參考,在本文中定義具有通常所理解含義之術語,且本文中包括此類定義不一定解釋為表示與此項技術中通常所理解存在實質性差異。熟習此項技術者通常很好理解且通常使用習知方法來使用本文中描述或參考之許多技術及程序。
如本文所用,術語「計劃性死亡1」、「計劃性細胞死亡1」、「PD1」、「PD-1」、「PDCD1」、「PD-1抗原」、「人類PD-1」、「hPD-1」及「hPD1」可互換使用且係指計劃性死亡-1受體,亦稱為CD279,且包括人類PD-1之變異體及同功異型物,及具有至少一個與PD-1共同之抗原決定基的類似物。PD-1為免疫反應極限及周邊免疫耐受性之關鍵調節劑。其在活化T細胞、B細胞、單核球及樹突狀細胞上表現且結合於其配位體PD-L1及PD-L2。人類PD-1由PDCD1基因編碼。舉例而言,人類PD-1之胺基酸序列揭示於GenBank寄存編號NP_005009。PD1具有四種在人類周邊血單核細胞(PBMC)上表現之剪接變異體。因此,PD-1蛋白質包括全長PD-1,以及PD-1之交替剪接變異體,諸如PD-1Aex2、PD-1Aex3、PD-1Aex2,3及PD-1Aex2,3,4。除非另外規定,否則術語包括天然由PBMC表現或由經PD-1基因轉染之細胞表現的人類PD-1之任何變異體及同功異型物。
如本文所用,術語「抗體」描述一種免疫球蛋白分子類型且以其最廣泛之意義使用。詳言之,抗體包括免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性片段,亦即含有抗原結合位點之分子。免疫球蛋白分子可具有任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類。對應於不同類別免疫球蛋白之重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ及μ。除非特定地指出,否則術語「抗體」包括完整免疫球蛋白及「抗體片段」或「抗原結合片段」(諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈(scFv)、其突變體、包含抗體部分之分子、雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體及包含具有所需特異性之抗原識別位點的免疫球蛋白分子之任何其他經修飾組態,包括抗體之糖基化變異體、抗體之胺基酸序列變異體。較佳地,術語「抗體」係指人源化抗體。
如本文所用,抗體之「抗原結合片段」意謂展現對PD-1之抗原結合能力的抗體之一部分,亦即與本發明之抗體之結構的一部分對應的分子,可能呈其原生形式;與對應四鏈抗體之抗原結合特異性相比,此類片段尤其展現相同或基本上相同之對該抗原之抗原結合特異性。有利地,抗原結合片段具有與對應4鏈抗體類似之結合親和力。然而,相對於對應4鏈抗體,抗原結合親和力降低之抗原結合片段亦涵蓋於本發明內。抗原結合能力可藉由量測抗體與目標片段之間的親和力來確定。此等抗原結合片段亦可表示為抗體之「功能片段」。抗體之抗原結合片段為包含其稱為CDR (互補決定區)之高變域之片段,或其涵蓋抗原識別位點,亦即PD1之細胞外域,藉此界定抗原識別特異性之部分。
「Fab」片段含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域(CH1)。Fab'片段與Fab片段之不同之處在於幾個殘基添加在重鏈CH1域之羧基端處,包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸。F(ab')片段藉由F(ab')2胃蛋白酶消化產物之鉸鏈半胱胺酸處之二硫鍵裂解產生。所屬領域的一般技術人員已知抗體片段之其他化學偶合。Fab及F(ab')2片段缺乏完整抗體之Fc片段,更迅速地自動物循環中清除,且可具有比完整抗體更少之非特異性組織結合(參見例如Wahl等人, 1983, J. Nucl. Med. 24:316)。
「Fv」片段為含有完整目標識別及結合位點之抗體最小片段。此區域由緊密非共價締合之一個重鏈可變域及一個輕鏈可變域之二聚體組成(VH-VL二聚體)。在此組態中各可變域之三個CDR相互作用,從而在VH-VL二聚體之表面上界定目標結合位點。常常六個CDR賦予抗體以目標結合特異性。然而,在一些情況下,甚至單一可變域(或僅僅包含三個CDR之Fv一半,其對目標具有特異性)亦可具有識別及結合目標之能力,不過親和力低於完整結合位點。
「單鏈Fv」或「scFv」抗體結合片段包含抗體之VH結構域及VL結構域,其中此等結構域存在於單個多肽鏈中。一般而言,Fv多肽在VH結構域與VL結構域之間進一步包含使scFv能夠形成抗原結合所需之結構的多肽連接子。
「單域抗體」由單一VH結構域或VL結構域構成,其展現足夠之對PD-1之親和力。在一特定實施例中,單域抗體為駱駝化抗體{參見例如Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38)。
就結構而言,抗體可具有由二硫鍵互連之重(H)鏈及輕(L)鏈。存在兩種輕鏈類型,λ (λ)及κ (κ)。各重鏈及輕鏈含有恆定區及可變區(或「域」)。輕鏈及重鏈可變區含有「構架」區,該「構架」區間雜有亦稱為「互補決定區」或「CDR」之三個高變區。已界定構架區及CDR之範圍(參見Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest;及U.S. Department of Health and Human Services, 1991,以引用之方式併入本文中)。較佳地,CDR根據Kabat方法界定。構架區用於形成骨架,該骨架藉由鏈間非共價相互作用使CDR以正確定向定位。CDR主要負責結合於抗原之抗原決定基。各鏈之CDR通常稱為「互補決定區1」或「CDR1」、「CDR2」及「CDR3」,依次自N端開始編號。根據本發明之抗體之VL結構域及VH結構域可包含四個構架區或「FR」,其在所屬領域中及本文中分別稱為「構架區1」或「FR1」、「FR2」、「FR3」及「FR4」。此等構架區及互補決定區較佳按以下次序可操作地連接:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (自胺基端至羧基端)。
如本文所用,「抗體重鏈」係指抗體構形中所存在之兩種多肽鏈類型中的較大者。抗體重鏈之CDR通常稱為「HCDR1」、「HCDR2」及「HCDR3」。抗體重鏈之構架區通常稱為「HFR1」、「HFR2」、「HFR3」及「HFR4」。
如本文所用,「抗體輕鏈」係指抗體構形中所存在之兩種多肽鏈類型中的較小者,κ及λ輕鏈係指兩種主要抗體輕鏈同型。抗體輕鏈之CDR通常稱為「LCDR1」、「LCDR2」及「LCDR3」。抗體輕鏈之構架區通常稱為「LFR1」、「LFR2」、「LFR3」及「LFR4」。
關於抗體與目標分子之結合,術語「結合(bind)」或「結合(binding)」係指識別及接觸抗原之肽、多肽、蛋白質、融合蛋白及抗體(包括抗體片段)。較佳地,其係指抗原-抗體類型相互作用。術語「特異性結合」、「特異性結合於」、「對……具有特異性」、「選擇性結合」及對特定抗原(例如PD-1)或特定抗原(例如PD-1)上之抗原決定基具有「選擇性」意謂抗體識別及結合特定抗原,但基本上不識別或結合樣品中之其他分子。舉例而言,特異性(或優先)結合於PD-1或PD-1抗原決定基之抗體為與該抗體與其他PD-1抗原決定基或非PD-1抗原決定基之結合相比,以更大親和力、親合力、更容易及/或以更長持續時間與此PD-1抗原決定基結合的抗體。較佳地,術語「特異性結合」意謂抗體與抗原之間以等於或低於10-7
M之結合親和力接觸。在某些態樣中,抗體以等於或低於10-8
M、10-9
M或10-10
M之親和力結合。
如本文所用,「PD-1抗體」、「抗PD-1抗體」、「PD-1 Ab」、「PD-1特異性抗體」或「抗PD-1 Ab」或「人源化抗PD-1抗體」可互換使用且係指特異性結合於PD-1、較佳人類PD-1之如本文所述之抗體。在一些實施例中,抗體結合於PD-1之細胞外域。詳言之,抗PD-1抗體為能夠結合於PD-1抗原且抑制PD-1介導之信號傳導路徑,藉此增強諸如T細胞活化之免疫反應的抗體。
如本文所用,術語「人源化抗體」意欲指其中來源於另一哺乳動物物種、諸如小鼠之生殖系的CDR序列已移植至人類構架序列上的抗體(例如含有來源於非人類抗體之最小序列的嵌合抗體)。抗體(例如非人類抗體)之「人源化形式」亦指已經歷人源化之抗體。人源化抗體通常為其中來自一或多個CDR之殘基經來自非人類抗體(供體抗體)之至少一個CDR之殘基置換,同時維持原始抗體之所需特異性、親和力及能力的人類免疫球蛋白(接受體抗體)。供體抗體可為任何適合之非人類抗體,諸如具有所需特異性、親和力或生物效應之小鼠、大鼠、兔、雞或非人類靈長類動物抗體。在一些情況下,接受體抗體之所選構架區殘基經來自供體抗體之構架區殘基置換。可替代地,供體抗體之所選構架區殘基經來自人類或人源化抗體之構架區殘基置換。在人類構架序列中可進行其他構架區修飾。因此,人源化抗體亦可包含在接受體抗體或供體抗體中未發現之殘基。可進行此類胺基酸修飾,以進一步優化抗體功能及/或增加人源化過程。本文中「胺基酸變化」或「胺基酸修飾」意謂多肽之胺基酸序列的變化。「胺基酸修飾」包括多肽序列之取代、***及/或刪除。本文中之「胺基酸取代」或「取代」意謂親本多肽序列中之特定位置處之胺基酸經另一胺基酸置換。「胺基酸***」或「***」意謂親本多肽序列中之特定位置處添加胺基酸。「胺基酸刪除」或「刪除」意謂移除親本多肽序列中之特定位置處的胺基酸。胺基酸取代可為保守的。保守取代為所給定之胺基酸殘基經具有具類似化學特性(例如電荷、體積及/或疏水性)之側鏈(「R-基團」)的另一殘基置換。如本文所用,「胺基酸位置」或「胺基酸位置編號」可互換使用且係指特定胺基酸在胺基酸序列中之位置,通常用胺基酸之單字母代碼指定。胺基酸序列中之第一胺基酸(亦即,自N端開始)應視為具有位置1。
保守取代為所給定之胺基酸殘基經具有具類似化學特性(例如電荷、體積及/或疏水性)之側鏈(「R-基團」)的另一殘基置換。一般而言,保守胺基酸取代不會實質上改變蛋白之功能特性。保守取代及對應規則在目前先進技術下充分描述。舉例而言,保守取代可藉由下表中反映之胺基酸組內的取代界定:表 A- 胺基酸殘基
表 B- 替代保守胺基酸殘基取代組
表 C- 胺基酸殘基之其他替代物理及功能分類
胺基酸組 | 胺基酸殘基 |
酸性殘基 | ASP及GLU |
鹼性殘基 | LYS、ARG及HIS |
親水性不帶電殘基 | SER、THR、ASN及GLN |
脂族不帶電殘基 | GLY、ALA、VAL、LEU及ILE |
非極性不帶電殘基 | CYS、MET及PRO |
芳族殘基 | PHE、TYR及TRP |
1 | 丙胺酸(A) | 絲胺酸(S) | 蘇胺酸(T) |
2 | 天冬胺酸(D) | 麩胺酸(E) | |
3 | 天冬醯胺(N) | 麩醯胺酸(Q) | |
4 | 精胺酸(R) | 離胺酸(K) | |
5 | 異白胺酸(I) | 白胺酸(L) | 甲硫胺酸(M) |
6 | ***酸(F) | 酪胺酸(Y) | 色胺酸(W) |
含醇基之殘基 | S及T |
脂族殘基 | I、L、V及M |
環烯基相關殘基 | F、H、W及Y |
疏水性殘基 | A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W及Y |
帶負電殘基 | D及E |
極性殘基 | C、D、E、H、K、N、Q、R、S及T |
小殘基 | A、C、D、G、N、P、S、T及V |
極小殘基 | A、G及S |
與轉角形成有關之殘基 | A、C、D、E、G、H、K、N、Q、R、S、P及T |
可撓性殘基 | E、Q、T、K、S、G、P、D、E及R |
如本文所用,「經分離之抗體」為自其天然環境之至少一種組分分離及/或回收的抗體。經分離之抗體包括重組細胞內之原位抗體,此係因為抗體之天然環境之至少一種組分將不存在。在一些實施例中,如藉由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細電泳法)或層析(例如離子交換或逆相HPLC)在還原或非還原條件下所測定,抗體純化至均質及/或超過90%、95%或99%純度。
如本文所用,術語「來源於(derive from)」及「來源於(derived from)」係指結構來源於母體化合物或蛋白質之結構,且結構與本文所揭示之結構足夠相似,且基於該相似性,所屬領域的技術人員預期,展現與所主張化合物相同或相似特性、活性及效用的化合物。舉例而言,來源於鼠類抗體之人源化抗體係指與該鼠類抗體共享相似特性,例如識別相同抗原決定基、共享具有參與及/或增加抗體人源化之經修飾殘基的相似VH及VL的抗體或抗體片段。
術語「治療」係指意欲改善患者之健康狀況之任何行為,諸如疾病或疾病症狀之療法、預防、防治及延遲。其表示疾病之治癒性治療及/或防治性治療。治癒性治療定義為治癒疾病或疾病症狀或其直接或間接引起之痛苦的治療,或緩解、改善及/或消除、減少及/或穩定化疾病或疾病症狀或其直接或間接引起之痛苦的治療。防治性治療包含預防疾病之治療及減少疾病或其發生風險及/或延遲其進展及/或發生的治療。在某些實施例中,此類術語係指疾病、病症、感染或與其相關聯之症狀的改善或根除。在其他實施例中,此術語係指使癌症最低程度地擴散或惡化。根據本發明之治療不一定意味100%或完全治療。實際上,存在不同程度之治療,所屬領域的一般技術人員認可該等程度之治療具有潛在益處或治療作用。較佳地,術語「治療」係指向患有例如與PD-1介導之信號傳導路徑相關聯之病症/疾病的個體施加或投與包括一或多種活性劑之組合物。
如本文所用,術語「病症」或「疾病」係指由基因或發育錯誤、感染、毒物、營養缺乏或不均衡、毒性或不利環境因素之作用引起的功能不正確之身體器官、部分、結構或系統。較佳地,此等術語係指健康病症或疾病,例如破壞正常身體或精神功能之病。更佳地,術語病症係指影響動物及/或人類之免疫及/或炎性疾病,諸如癌症。
如本文所用,術語「免疫疾病」係指個體中特徵在於由個體對其自身細胞、組織及/或器官之免疫反應所引起之細胞、組織及/或器官損傷的病況。術語「炎性疾病」係指個體中特徵在於炎症,例如慢性炎症之病況。自體免疫性病症可與或不與炎症相關聯。此外,炎症可由或不由自體免疫性病症引起。
如本文所用,術語「癌症」定義為特徵在於異常細胞快速且不受控制之生長的疾病。癌細胞可局部擴散或經由血流及淋巴系統擴散至身體其他部分。
如本文所用,術語「與PD-1相關聯或相關之疾病」、「PD-1陽性癌症」或「PD-1陽性感染性疾病」意欲指由PD-1表現引起或具有PD-1表現之症狀/特徵的癌症或感染性疾病(例如由病毒及/或細菌引起),亦即由PD-1表現或活性增加或減少引起、因其加重或與其相關之任何病況。
如本文所用,術語「個體(subject)」、「宿主」、「個體(individual)」或「患者」係指人類,包括成人及兒童。
如本文所用,「醫藥組合物」係指一或多種活性劑之製劑,諸如包含根據本發明之人源化抗PD1抗體與視情況選用之其他化學組分,諸如生理學上合適之載劑及賦形劑。醫藥組合物之目的為促進活性劑投與生物體。本發明之組合物可呈適合於任何習知投與或使用途徑之形式。在一個實施例中,「組合物」通常意欲活性劑、例如化合物或組合物與天然存在或非天然存在之載劑、惰性劑(例如可偵測劑或標記)或活性劑、諸如佐劑、稀釋劑、黏合劑、穩定劑、緩衝劑、鹽、親脂性溶劑、防腐劑、佐劑或其類似物之組合,且包括醫藥學上可接受之載劑。如本文中所提及之「可接受之媒劑」或「可接受之載劑」為熟習此項技術者已知的可用於調配醫藥組合物之任何已知化合物或已知化合物之組合。
如本文所用,「有效量」或「治療有效量」係指單獨或與一或多種其他活性劑組合,賦予個體治療作用所需之活性劑之量,例如治療目標疾病或病症或產生期望作用所需要的活性劑之量。「有效量」將視以下而變:藥劑、疾病及其嚴重程度、待治療個體之特性(包括年齡、身體狀況、體型、性別及體重)、治療持續時間、並行療法(若存在)之性質、特定投藥途徑及健康從業者之知識及專長範圍內的類似因素。此等因素為所屬領域的一般技術者熟知且可僅用常規實驗便可解決。通常較佳使用個別組分或其組合之最大劑量,亦即根據合理醫學判斷之最高安全劑量。
如本文所用,術語「藥劑」係指具有治癒或預防病症或疾病之特性的任何物質或組合物。
如本文所用,術語「組合」係指使用超過一種療法(例如防治劑及/或治療劑)。術語「組合」之使用不限制向患有疾病或病症之個體投與療法(例如防治劑及/或治療劑)的次序。
術語「多核苷酸」、「核酸」及「核酸序列」係同等的,且係指具有任何長度之核苷酸之聚合形式,例如RNA或DNA或其類似物。本發明之核酸(例如核酸之組分或部分)可為天然存在的、經修飾或經工程改造。經工程改造之核酸包括重組核酸及合成核酸。「編碼抗PD1抗體之經分離之核酸」係指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之一或多種核酸分子,包括單一載體或分開載體中之此類核酸分子及存在於宿主細胞中之一或多個位置處之此類核酸分子。如本文所用,術語「核酸構築體」、「質體」及「載體」係同等的,且係指用以將諸如DNA或RNA之過客核酸序列轉移至宿主細胞中的核酸分子。
如本文所用,術語「宿主細胞」意欲包括可為或曾為編碼本發明抗體構築體之載體、外源性核酸分子及多核苷酸之接受體,及/或抗體構築體本身之接受體的任何個別細胞或細胞培養物。將各別物質引入細胞中可藉助於轉型、轉染及其類似方法進行。術語「宿主細胞」亦意欲包括單個細胞之後代或可能後代。宿主細胞包括細菌細胞、微生物細胞、植物細胞及動物細胞。
如本文所用,「免疫細胞」係指與先天性免疫及適應性免疫有關之細胞,例如來源於骨髓中產生之造血幹細胞(HSC)的白血球(白細胞)、淋巴細胞(T細胞、B細胞、自然殺手(NK)細胞及自然殺手T細胞(NKT))及骨髓來源細胞(嗜中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球、單核球、巨噬細胞、樹突狀細胞)。詳言之,免疫細胞可在包含B細胞、T細胞、尤其CD4+
T細胞及CD8+
T細胞、NK細胞、NKT細胞、APC細胞、樹突狀細胞及單核球之非詳盡性清單中選擇。如本文所用,「T細胞」包括例如CD4 + T細胞、CD8 + T細胞、T輔助1型T細胞、T輔助2型T細胞、T輔助17型T細胞及抑制T細胞。
術語「免疫反應」係指例如淋巴細胞、抗原呈遞細胞、吞噬細胞、粒細胞及由以上細胞或肝臟產生之可溶性大分子(包括抗體、細胞介素及補體)對侵入病原體、感染病原體之細胞或組織、癌細胞或在自體免疫性或病理性炎症之情況下正常人類細胞或組織進行選擇性損壞、破壞或使其自人體消除之作用。
如本文所用,術語「拮抗劑」係指阻斷或降低另一物質之活性或功能性的物質。詳言之,此術語係指如參考物質(例如PD-L1及/或PD-L2)般結合於細胞受體(例如PD-1),防止其產生其全部或部分常用生物效應(例如創造免疫抑制微環境)的抗體。根據本發明之人源化抗體的拮抗劑活性可藉由競爭性ELISA評估。
如本文所用,術語「分離」指示所述材料(例如抗體、多肽、核酸等)基本上與其天然一起存在之其他物質分離或相對於該等其他物質富集。詳言之,「分離之」抗體係已自其天然環境之組分鑑別出且分離及/或回收之抗體。舉例而言,如藉由勞里法(Lowry method)所測定,經分離之抗體純化(1)至超過75重量%抗體,或(2)藉由SDS-PAGE,在還原或非還原條件下純化至均質。經分離之抗體包括重組細胞內之原位抗體,此係因為抗體之天然環境之至少一種組分將不存在。然而,通常,經分離之抗體將藉由至少一個純化步驟來製備。
如本文所用,術語「及/或」應視為特定揭示兩種指定特徵或組分中之每一者,有或無另一者。舉例而言,「A及/或B」欲視為特定揭示(i) A、(ii) B及(iii) A及B中之每一者,正如個別地陳述每一者一般。
除非上下文明確描述一種要素或超過一種要素,否則術語「一種(a或an)」可指其修飾之要素中之一個或複數個要素(例如「一種試劑」可意謂一或多種試劑)。
如本文所用,聯合任何及所有值(包括數值範圍之下限及上限)之術語「約」意謂具有高達+/-10%偏差之可接受範圍的任何值(例如+/- 0.5%、+/- 1%、+/- 1.5%、+/- 2%、+/- 2.5%、+/- 3%、+/- 3.5%、+/- 4%、+/- 4.5%、+/- 5%、+/- 5.5%、+/- 6%、+/- 6.5%、+/- 7%、+/- 7.5%、+/- 8%、+/- 8.5%、+/- 9%、+/-9.5%)。在一串值開頭之術語「約」的使用修飾該等值中之每一者(亦即,「約1、2及3」係指約1、約2及約3)。此外,當本文中描述值之清單(例如約50%、60%、70%、80%、85%或86%)時,該清單包括其所有中間值及分數值(例如54%、85.4%)。
針對人類
PD-1
之人源化抗體
本文提供一種結合於人類PD-1之人源化抗體。在一些態樣中,人源化抗體特異性結合於人類PD-1,較佳結合於人類PD-1之細胞外域。在一些態樣中,人源化抗體選擇性結合於全長人類PD-1、PD-1Aex2、PD-1Aex3、PD-1Aex2,3及PD-1Aex2,3,4中之一或多種。
在一些態樣中,人源化抗PD1抗體為經分離之抗體,尤其非天然之經分離之抗體。此類經分離之人源化抗PD1抗體可藉由至少一個純化步驟來製備。在一些實施例中,經分離之抗體純化至至少80重量%、85重量%、90重量%、95重量%或99重量%。在一些實施例中,經分離之抗體呈包含至少85重量%、90重量%、95重量%、98重量%、99重量%至100重量%抗體之溶液提供,該重量之其餘部分包含溶解於溶劑中之其他溶質之重量。
根據本發明之抗PD1抗體之人源化形式可包含任何類別之免疫球蛋白,諸如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM (或其子類)、含有來源於靶向人類PD-1之非人類(例如鼠類)免疫球蛋白之最小序列的免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv或抗體之其他抗原結合子序列)。較佳地,根據本發明之人源化抗hPD-1抗體來源於IgG1、IgG2、IgG3或IgG4,較佳來源於IgG4。
較佳地,針對人類PD-1之人源化抗體為單株抗體。
較佳地,此類抗體能夠阻斷或抑制PD-1與至少一種其配位體(例如PD-L1及/或PD-L2)之間的相互作用。如本文所用,能夠「阻斷結合」或「阻斷相互作用」或「抑制相互作用」係指抗體或抗原結合片段能夠預防兩個分子(例如PD-1及其配位體PD-L1及/或PD-L2)之間的結合相互作用至任何可偵測程度。
較佳地,抗體或其抗原結合片段為人類PD-L1及/或PD-L2與人類PD-1、更佳人類PD-L1及PD-L2與人類PD-1之結合的拮抗劑。
在某些實施例中,抗hPD1抗體或抗原結合片段抑制PD-1與至少一種其配位體(例如PD-L1及/或PD-L2,較佳PD-L1及PD-L2)之間的結合相互作用達至少50%。在某些實施例中,此抑制程度可超過60%、超過70%、超過80%或超過90%。
「互補決定區」或「CDR」係所屬領域中已知的,係指抗體可變區內胺基酸之非鄰接序列,其賦予抗原特異性及結合親和力。所給定CDR之確切胺基酸序列邊界容易使用多種熟知方案中之任一者確定,包括以下文獻中所述之方案:Kabat等人, (Sequences of Proteins of Immunological Interest 第5版 (1991) 「Kabat」編號方案);Al-Lazikani等人, 1997, J. Mol. Biol, 273:927-948 (「Chothia」編號方案);MacCallum等人, 1996, J. Mol. Biol. 262:732-745 (「接觸」編號方案);Lefranc等人, Dev. Comp. Immunol., 2003, 27:55-77 (「IMGT」編號方案);以及Honegge及Pluckthun, J. Mol. Biol, 2001, 309:657-70 (「AHo」編號方案)。除非另外說明,否則用於鑑別本文中之特定CDR的編號方案為Kabat編號方案。
人源化抗體之CDR區來源於鼠類抗體且經優化以i)提供具有極高程度人源化之安全人源化抗體;以及ii)提高抗體特性,更特定言之較高產量。
在一個實施例中,人源化抗人類-PD-1抗體或其抗原結合片段包含:
(i) 重鏈可變域,該重鏈可變域包括包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列或由其組成之HCDR1、包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列或由其組成之HCDR2及包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列或由其組成之HCDR3,及
(ii) 輕鏈可變域,該輕鏈可變域包括包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列或由其組成之LCDR1、包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列或由其組成之LCDR2及包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列或由其組成之LCDR3。
在一個實施例中,根據本發明之抗PD1抗體或抗原結合片段包含構架區,詳言之,重鏈可變區構架區(HFR) HFR1、HFR2、HFR3及HFR4以及輕鏈可變區構架區(LFR) LFR1、LFR2、LFR3及LFR4。
較佳地,根據本發明之抗PD1抗體或抗原結合片段包含人類或人源化構架區。出於本文之目的,「人類接受體構架」為包含來源於如以下所定義之人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之輕鏈可變域(VL)構架或重鏈可變域(VH)構架的胺基酸序列的構架。來源於人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之人類接受體構架可包含相同胺基酸序列,或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中,胺基酸變化之數目為10個或更少、9個或更少、8個或更少、7個或更少、6個或更少、5個或更少、4個或更少、3個或更少、或2個或更少。在一些實施例中,VL接受體人類構架與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架序列在序列上一致。「人類共同構架」為表示一系列人類免疫球蛋白VL或VH構架序列中最常出現之胺基酸殘基的構架。
詳言之,抗PD1抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區構架區(HFR) HFR1、HFR2、HFR3及HFR4,該等重鏈可變區構架區分別包含SEQ ID NO: 37、38、39及40之胺基酸序列,視情況在HFR3、亦即SEQ ID NO: 40之除位置27、29及32外之任何位置處具有一個、兩個或三個選自取代、添加、刪除及其任何組合之修飾。較佳地,抗PD1抗體或抗原結合片段包含SEQ ID NO: 37之HFR1、SEQ ID NO: 38之HFR2、SEQ ID NO: 39之HFR3及SEQ ID NO: 40之HFR4。
可替代地或另外,抗PD1抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區構架區(LFR) LFR1、LFR2、LFR3及LFR4,該等輕鏈可變區構架區分別包含SEQ ID NO: 41、42、43及44之胺基酸序列,視情況具有一個、兩個或三個選自取代、添加、刪除及其任何組合之修飾。較佳地,人源化抗PD1抗體或抗原結合片段包含SEQ ID NO: 41之LFR1、SEQ ID NO: 42之LFR2、SEQ ID NO: 43之LFR3及SEQ ID NO: 44之LFR4。
根據本發明之抗體之VL及VH結構域可包含間雜有三個互補決定區之四個構架區,此等構架區及互補決定區較佳按以下次序可操作地連接:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (自胺基端至羧基端)。
在第一實施例中,抗人類-PD-1人源化抗體或其抗原結合片段包含:
(a)重鏈可變區(VH),該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列或由其組成,視情況在SEQ ID NO: 21之除位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106及112以外之任何位置處具有一個、兩個或三個選自取代、添加、刪除及其任何組合之修飾;
(b)輕鏈可變區(VL),該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列或由其組成,視情況在SEQ ID NO: 24之除位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99及105以外之任何位置處具有一個、兩個或三個選自取代、添加、刪除及其任何組合之修飾。
較佳地,修飾為取代、尤其保守取代。
較佳地,抗人類-PD-1人源化抗體或其抗原結合片段包含:(a)包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列或由其組成的重鏈可變區(VH);及(b)包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列或由其組成之輕鏈可變區(VL)。
在一個實施例中,重鏈(CH)及輕鏈(CL)包含如上文所描述之VL及VH序列。
在一特定實施例中,抗人類-PD-1抗體或其抗原結合片段包含:(a)重鏈,該重鏈包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列或由其組成,視情況在SEQ ID NO: 31之除位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106及112以外之任何位置處具有一個、兩個或三個選自取代、添加、刪除及其任何組合之修飾;及(b)輕鏈,該輕鏈包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列或由其組成,視情況在SEQ ID NO: 34之除位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99及105以外之任何位置處具有一個、兩個或三個選自取代、添加、刪除及其任何組合之修飾。
較佳地,修飾為取代、尤其保守取代。
較佳地,抗人類-PD-1抗體或其抗原結合片段包含:(a)包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列或由其組成的重鏈;及(b)包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列或由其組成之輕鏈。
Fc
及鉸鏈區
若干研發治療性抗體之研究對Fc區進行工程改造,以優化抗體特性,允許產生更適合於所需之藥理學活性之分子。抗體之Fc區介導其血清半衰期及效應功能,諸如補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及抗體依賴性吞噬作用(ADCP)。位於CH2與CH3結構域之間的界面上的若干突變,諸如T250Q/M428L及M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F,已顯示增加與FcRn結合之親和力且增加IgG1在活體內之半衰期。然而,增加FcRn結合與改善半衰期之間未必總是直接關係。一種提高治療性抗體之功效的方法為增加其血清持久性,藉此允許較高循環水準、較低投與頻率及劑量減少。可期望Fc區工程改造減少或增加抗體之效應功能。對於靶向細胞表面分子,尤其免疫細胞上之彼等細胞表面分子之抗體,需要消除效應功能。相反,對於意欲用於腫瘤學用途之抗體,增加效應功能可提高治療活性。四種人類IgG同型以不同親和力結合活化Fcγ受體(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa)、抑制FcγRIIb受體及補體第一組分(C1q),產生極為不同之效應功能。IgG與FcγR或C1q之結合視位於鉸鏈區及CH2結構域中之殘基而定。CH2結構域之兩個區對於FcγR及C1q結合而言係關鍵的,且在IgG2及IgG4中具有獨特序列。
根據本發明之人源化抗體視情況包含免疫球蛋白恆定區(Fc)、通常人類或人源化免疫球蛋白之免疫球蛋白恆定區之至少一部分。較佳地,Fc區為本文所述之人源化抗hPD-1抗體之一部分。所屬領域的技術人員亦熟知,對重鏈恆定域之IgG同型之選擇集中在是否需要特定功能及對合適活體內半衰期之需求上。舉例而言,經設計用於選擇性根除癌細胞之抗體通常需要允許補體活化及藉由抗體依賴性細胞介導之細胞毒性進行效應子介導之細胞殺死的活性同型。人類IgG1與IgG3 (半衰期更短)同型符合此等標準,尤其人類IgG1同型(野生型及變異體)。詳言之,視重鏈恆定域之IgG同型(尤其人類野生型及變異IgG1同型)而定,本發明之人源化抗hPD1抗體可經由CDC、ADCC及/或ADCP機制對表現PD-1之細胞具有細胞毒性。實際上,可結晶片段(Fc)區與多種輔助分子相互作用,以介導間接效應功能,諸如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)及補體依賴性細胞毒性(CDC)。
在較佳實施例中,恆定區來源於人類免疫球蛋白重鏈,例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他類別。在另一態樣中,人類恆定區係選自由IgG1、IgG2、IgG2、IgG3、IgG4組成之群。較佳地,人源化抗PD1抗體包含IgG1或IgG4 Fc區。甚至更佳地,人源化抗hPD1抗體包含具有使IgG4穩定之S228P的IgG4 Fc區。
在一個實施例中,抗PD1抗體包含截短之Fc區或Fc區之片段。在一個實施例中,恆定區包括CH2結構域。在另一實施例中,恆定區包括CH2及CH3結構域或包括鉸鏈-CH2-CH3。可替代地,恆定區可包括鉸鏈區、CH2結構域及/或CH3結構域之全部或一部分。在一較佳實施例中,恆定區含有來源於人類IgG4重鏈之CH2及/或CH3結構域。
在另一實施例中,恆定區包括CH2結構域及至少一部分鉸鏈區。鉸鏈區可來源於免疫球蛋白重鏈,例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他類別。較佳地,鉸鏈區來源於人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其它合適類別,突變或未突變。更佳地,鉸鏈區來源於人類IgG1重鏈。在一個實施例中,恆定區包括來源於第一抗體同型之CH2結構域及來源於第二抗體同型之鉸鏈區。在一特定實施例中,CH2結構域來源於人類IgG2或IgG4重鏈,而鉸鏈區來源於改變之人類IgG1重鏈。
在一個實施例中,恆定區含有降低對Fc受體之親和力或減少Fc效應功能之突變。舉例而言,恆定區可含有消除IgG重鏈恆定區內之糖基化位點的突變。
在另一實施例中,恆定區包括CH2結構域及至少一部分鉸鏈區。鉸鏈區可來源於免疫球蛋白重鏈,例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他類別。較佳地,鉸鏈區來源於人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他適合類別。IgG1鉸鏈區具有三個半胱胺酸,其中兩個參與免疫球蛋白之兩個重鏈之間的二硫鍵。此等半胱胺酸允許在Fc部分之間形成高效且一致之二硫鍵。因此,本發明之較佳鉸鏈區來源於IgG1,更佳來源於人類IgG1。在一些實施例中,人類IgG1鉸鏈區內之第一半胱胺酸突變成另一胺基酸,較佳絲胺酸。IgG2同型鉸鏈區具有四個二硫鍵,在重組系統中分泌期間,該等二硫鍵往往促進寡聚及可能不正確之二硫鍵鍵結。適合鉸鏈區可來源於IgG2鉸鏈;頭兩個半胱胺酸各較佳突變成另一胺基酸。已知IgG4之鉸鏈區低效地形成鏈間二硫鍵。然而,適用於本發明之鉸鏈區可來源於IgG4鉸鏈區,較佳含有增強來源於重鏈之部分之間的二硫鍵正確形成的突變(Angal S等人, (1993) Mol. Immunol., 30:105-8)。鉸鏈區更佳來源於人類IgG4重鏈。
在一個實施例中,恆定區包括來源於第一抗體同型之CH2結構域及來源於第二抗體同型之鉸鏈區。在一特定實施例中,CH2結構域來源於人類IgG4重鏈,而鉸鏈區來源於改變之人類IgG1重鏈。
根據本發明,恆定區可含有來源於不同抗體同型之CH2及/或CH3結構域及鉸鏈區,亦即混雜恆定區。舉例而言,在一個實施例中,恆定區含有來源於IgG2或IgG4之CH2及/或CH3結構域及來源於IgG1之突變鉸鏈區。可替代地,來自另一IgG子類之突變鉸鏈區用於混雜恆定區。舉例而言,可使用允許兩個重鏈之間有效二硫鍵鍵結之IgG4鉸鏈的突變形式。突變鉸鏈亦可來源於IgG2鉸鏈,其中頭兩個半胱胺酸各突變成另一胺基酸。此類混雜恆定區之組裝已描述於美國專利公開案第20030044423號中,其揭示內容以引用的方式併入本文中。
在一個實施例中,根據本發明,恆定區可含有具有以下表D中所述之突變之一或其任何組合的CH2及/或CH3。表 D :抗體之合適人類工程改造 Fc 結構域
工程改造 Fc | 同型 | 突變 | FcR/C1q 結合 | 效應功能 |
hIgG1e1-Fc | IgG1 | T250Q/M428L | 增加之與FcRn之結合 | 增加之半衰期 |
hIgG1e2-Fc | IgG1 | M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F | 增加之與FcRn之結合 | 增加之半衰期 |
hIgG1e3-Fc | IgG1 | E233P/L234V/ L235A/G236A + A327G/A330S/P331S | 減少之與FcγRI之結合 | 減少之ADCC及CDC |
hIgG1e4-Fc | IgG1 | E333A | 增加之與FcγRIIIa之結合 | 增加之ADCC及CDC |
hIgG1e5-Fc | IgG1 | S239D/A330L/I332E | 增加之與FcγRIIIa之結合 | 增加之ADCC |
hIgG1e6-Fc | IgG1 | P257I/Q311 | 增加之與FcRn之結合 | 未改變之半衰期 |
hIgG1e7-Fc | IgG1 | K326W/E333S | 增加之與C1q之結合 | 增加之CDC |
hIgG1e9-Fc | IgG1 | S239D/I332E/G236A | 增加之FcγRIIa/FcγRIIb比率 | 增加之巨噬細胞吞噬作用 |
hIgG1e9-Fc | IgG1 | N297A | 減少之與FcγRI之結合 | 減少之ADCC及CDC |
hIgG1e9-Fc | IgG1 | LALA (L234A/L235A) | 減少之與FcγRI之結合 | 減少之ADCC及CDC |
hIgG1e10-Fc | IgG1 | N297A + YTE (N298A + M252Y/S254T/T256E) | 減少之與FcγRI之結合 增加之與FcRn之結合 | 減少之ADCC及CDC 增加之半衰期 |
hIgG1e11-Fc | IgG1 | K322A | 減少之與C1q之結合 | 減少之CDC |
hIgG2e1-Fc | IgG4 | S228P | - | 減少之Fab臂交換 |
hIgG4e1-Fc | IgG4 | LALA (L234A/L235A) | 增加之與FcRn之結合 | 增加之半衰期 |
hIgG4e2-Fc | IgG4 | S228P+ YTE (S228P + M252Y/S254T/T256E) | - 增加之與FcRn之結合 | 減少之Fab臂交換 增加之半衰期 |
hIgG4e3-Fc | IgG4 | K444A | 消除抗體中心處之裂解基元 | |
hIgG1e3-Fc | IgG1 | K444A | 消除抗體中心處之裂解基元 |
重鏈恆定區中殘基之編號係根據EU編號(Edelman, G.M.等人, Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969);www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html#refs)
在一特定態樣中,抗體或其抗原結合片段包含來源於人類κ輕鏈恆定域之輕鏈恆定域及來源於人類IgG1重鏈恆定域之重鏈恆定域,視情況具有選自由以下各者組成之群的取代或取代組合:T250Q/M428L;M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F;E233P/L234V/L235A/G236A + A327G/A330S/P331S;E333A;S239D/A330L/I332E;P257I/Q311;K326W/E333S;S239D/I332E/G236A;N297A;L234A/L235A;N297A + M252Y/S254T/T256E;K444A及K322A,較佳選自由以下各者組成之群:N297A,視情況與M252Y/S254T/T256E組合,及L234A/L235A。
在另一特定態樣中,抗體或其抗原結合片段包含來源於人類κ輕鏈恆定域之輕鏈恆定域及來源於人類IgG4重鏈恆定域之重鏈恆定域,視情況具有選自由以下各者組成之群的取代或取代組合:S228P;L234A/L235A、S228P + M252Y/S254T/T256E及K444A。
在某些實施例中,胺基酸修飾可引入到本文所提供之抗體之Fc區中,以產生Fc區變異體。在某些實施例中,Fc區變異體具有一些但非所有的效應功能。此類抗體可用於例如抗體在活體內之半衰期重要但某些效應功能不必要或有害的應用中。效應功能之實例包括補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體引導之補體介導之細胞毒性(ADCC)。改變效應功能之大量取代或取代或刪除係所屬領域中已知的。
在一個實施例中,恆定區含有降低對Fc受體之親和力或降低Fc效應功能之突變。舉例而言,恆定區可含有消除IgG重鏈恆定區內之糖基化位點的突變。較佳地,CH2結構域含有消除CH2結構域內之糖基化位點的突變。
在一個實施例中,根據本發明之抗hPD1具有SEQ ID NO: 39之重鏈恆定域及/或SEQ ID NO: 40之輕鏈恆定域,尤其SEQ ID NO: 39之重鏈恆定域及SEQ ID NO: 40之輕鏈恆定域。
在一個實施例中,根據本發明之抗hPD1具有SEQ ID NO: 47之重鏈恆定域及/或SEQ ID NO: 40之輕鏈恆定域,尤其SEQ ID NO: 47之重鏈恆定域及SEQ ID NO: 40之輕鏈恆定域。
表 E.
適合於根據本發明之人源化抗體的重鏈恆定域及輕鏈恆定域之實例
重鏈恆定域(IgG4m-S228P) SEQ ID NO: 39 | ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
輕鏈恆定域(CLκ) SEQ ID NO: 40 | RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
重鏈恆定域(IgG1m-N298A) SEQ ID NO:47 | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
靠近Fc部分與非Fc部分之接合處的胺基酸之改變可顯著增加Fc融合蛋白之血清半衰期(PCT公開案WO 01/58957)。因此,本發明之蛋白質或多肽之接合區可含有相對於免疫球蛋白重鏈及紅血球生成素之天然存在之序列,較佳處於接合點之約10個胺基酸內的改變。此等胺基酸變化會使疏水性增加。在一個實施例中,恆定區來源於C端離胺酸殘基經置換之IgG序列。較佳地,IgG序列之C端離胺酸經非離胺酸胺基酸,諸如丙胺酸或白胺酸置換,以進一步增加血清半衰期。
詳言之,IgG1或IgG4結構域中之K444胺基酸可經丙胺酸取代以減少蛋白水解裂解。接著,在一個實施例中,抗PD1抗體包含至少一個由K444A組成之其他胺基酸取代。
在一個實施例中,抗PD1抗體在IgG之C端結構域包含額外半胱胺酸殘基以產生額外二硫鍵。
在某些實施例中,抗體可經改變以增加、降低或消除糖基化程度。多肽之糖基化通常為「N連接」或「O連接」的。
「N連接」之糖基化係指碳水化合物部分附接至天冬醯胺殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X係除脯胺酸外之任何胺基酸)係用於將碳水化合物部分在酶催化下附接於天冬醯胺側鏈之識別序列。因此,在多肽中此等三肽序列中之任一者的存在產生潛在糖基化位點。
「O-連接」之糖基化係指糖N-乙醯基半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者附接至羥基胺基酸,最常見為絲胺酸或蘇胺酸,儘管亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。將N連接之糖基化位點添加至抗體或使抗體刪除N連接之糖基化位點可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除上述三肽序列中之一或多個來實現。O連接之糖基化位點之添加或刪除可藉由一或多種絲胺酸或蘇胺酸殘基添加、刪除或取代在抗體序列中或至抗體序列(視具體情況)來實現。
本發明亦關於一種人源化抗PD-1抗體或其抗原結合片段:
-其具有超過85%之T20人源化評分;
-當在哺乳動物細胞中產生時其呈現高的可製造性;
-其在哺乳動物細胞中呈現高產量;
-其具有等於或低於10-7
M之對人類PD-1之結合親和力(KD);
-其具有拮抗劑活性且抑制人類PD-L1及/或PD-L2與人類PD-1、較佳PD-L1及PD-L2之結合;
-其阻斷或抑制PD-1信號傳導(SHP-1磷酸化及募集);
-其增強T細胞活化,尤其(抑制pSHP-1及TCR介導之NFAT活化、IFNγ及IL-2分泌;及/或
-其促進抗腫瘤免疫反應。
-其證明在活體內良好之藥物動力學及藥效學。
出於本發明之目的,「人源化」係使用T20評分分析儀定量單株抗體可變區之人源化來量測,如Gao S H, Huang K, Tu H, Adler A S. BMC Biotechnology. 2013: 13:55中所述。
提供基於網路之工具,使用T20截止值人類資料庫http://abAnalyzer.lakepharma.com計算抗體序列之T20評分。在計算T20評分之過程中,首先給輸入VH、VK或VL可變區蛋白質序列分配Kabat編號,且確定CDR殘基。使用blastp蛋白質-蛋白質BLAST演算法比較全長序列或僅構架序列(已移除CDR殘基)與相應抗體資料庫中之每一個序列。分離各成對比較之間的序列一致性,且在分析完資料庫中之每一個序列之後,基於與輸入序列之序列一致性將序列自高至低排序。對前20個匹配序列之一致性百分比取平均,獲得T20評分。
關於「所有人類資料庫(All Human Databases)」中之各鏈類型(VH、VK、VL)及序列長度(全長或僅構架),使用T20評分分析儀用各抗體序列之相應資料庫對其進行評分。在排除輸入序列本身之後獲得前20個匹配序列之T20評分(因為序列1始終是輸入抗體本身,所以對序列2至21之一致性百分比取平均)。將各組之T20評分自高至低排序。對於大部分序列而言,評分之減小大致上係線性的;然而,對於抗體之後約15%而言,T20評分開始急劇減小。因此,移除序列之後15%且剩餘序列形成T20截止值人類資料庫,其中T20評分截止值指示新資料庫中序列之最低T20評分。
如本文所用,「人源化抗體」為具有至少80%或至少85%、更佳至少88%、甚至更佳至少90%之T20人源化評分,最佳介於85%與95%之間、較佳88%與92%之間的T20人源化評分的人源化抗體。
因此,根據本發明之人源化抗PD1抗體具有至少80%或至少85%、更佳至少88%、甚至更佳至少90%之T20人源化評分,最佳介於85%與95%之間、較佳88%與92%之間的T20人源化評分。
在一個實施例中,如本文所揭示之人源化抗hPD1抗體或其抗原結合片段較佳與對應嵌合抗體相比產量得到提高。特定言之,此類人源化抗hPD1抗體在CHO細胞中具有超過5 mg/L、6 mg/L、7 mg/L、8 mg/L或9 mg/L,較佳超過1 g/L或2 g/L之產量。可替代地或另外,此類人源化抗hPD1抗體在CHO細胞中具有超過2 mg/L、3 mg/L或4 mg/L,較佳超過4 mg/L之產量。
在另一實施例中,此類人源化抗hPD1抗體之產量至少為對應嵌合抗體之產量的兩倍。
抗體之親和力可為其與特定抗原在單個抗原-抗體位點之結合的量度,且本質上為抗體之抗原結合位點與特定抗原決定基之間的相互作用中所存在之吸引力與排斥力之總和。抗體與特定抗原(例如PD-1)之親和力可由平衡解離常數K表示,該常數由等式Kd =[Ag][Ab]/[Ag Ab]定義,其表示抗體組合位點之親和力;其中[Ag]為游離抗原之濃度(M),[Ab]為游離抗體之濃度(M)且[Ag Ab]為抗原-抗體複合物之濃度(M)。在抗原及抗體一起強烈反應之情況下,幾乎不存在游離抗原或游離抗體,因此抗體之平衡常數或親和力將為低的。抗體之平均親和力等於或低於10-7
M。在某些態樣中,人源化抗PD-1抗體以等於或低於10-8
M、較佳等於或低於10-9
M之親和力結合人類PD-1。在一個態樣中,親和力等於或低於1.5×10-9
M。親和力可藉由所屬領域的技術人員可利用之任何方法,例如藉由生物感測器分析,諸如表面電漿子共振(SPR) Biacore分析、Blitz分析及史卡查圖(Scatchard plot)量測。更特定言之,結合親和力藉由Biacore量測,如實例2中所詳述。本發明之人源化抗體具有比嵌合抗體更佳之親和力。
結合親和力可由KD
或解離常數表示,且結合親和力增加與KD
減少相對應。一種測定抗體對PD-1之結合親和力的方式為量測抗體之Fab片段之結合親和力。為獲得Fab片段,抗體可用木瓜蛋白酶裂解或重組表現。抗體之抗PD-1Fab片段之親和力可藉由表面電漿子共振(BIAcore3000TM
表面電漿子共振(SPR)系統, BIAcore, INC, Piscaway N.J.)確定。獲得動力學締合速率(kon
)及解離速率(koff
)(通常在25℃下量測);且平衡解離常數(KD
)值計算為koff
/kon
。
特定言之,如可藉由Blitz分析測定,本文所提供之抗體以等於或低於0.75至1.34 nM、較佳等於或低於0.75至1 nM、更佳等於或低於0.75至0.8 nM之親和力常數(KD)結合於人類PD-1。此系統允許量測結合相互作用之速率及親和力常數(k a
、k d
、K D
)。
在一實施例中,本發明係關於如上所定義之人源化抗hPD-1抗體或其抗原結合片段,其部分或完全、尤其完全抑制PDL-1及/或PDL-2與人類PD-1之結合。
本發明之此類人源化抗體特異性結合hPD-1且拮抗PD-1與PD-L1及/或PD-L2之間的相互作用。特定言之,如上所定義之人源化抗hPD-1抗體或其抗原結合片段為人類PD-L1及/或PD-L2與人類PD-1之結合、較佳人類PD-L1及PD-L2與人類PD-1之結合的拮抗劑。
在一些實例中,本文所述之抗PD-1抗體抑制PD-1信號傳導路徑至少20%、至少40%、至少50%、至少75%、至少90%、至少100%,或至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。詳言之,在諸如競爭ELISA分析之結合分析中,與陰性對照分子相比,人源化抗hPD-1抗體或其抗原結合片段能夠減少或抑制PD-L1及/或PD-L2與PD-1之結合至少50%、60%、70%、較佳80%、更佳90%或最佳100%。此類分析揭示於Sebaugh JL. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharm. Stat. 2011; 10: 128-134及實例3中。如藉由此分析所量測,本發明之人源化抗體具有小於50 ng/ml、尤其小於40 ng/ml及視情況小於20 ng/ml之IC50。相比之下,嵌合抗體具有超過50 ng/ml、亦即約60 ng/ml之IC50。可替代地,本發明之人源化抗體拮抗PD-L1對PD-1之結合之能力亦可藉由Blitz及Biacore對與PD-L1對PD-1之競爭進行分析來量測,如實例4中所詳述。
用於藉由競爭性抑制,確定抗體特異性及親和力之方法係所屬領域中已知的(參見例如Harlow等人, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998);Colligan等人, Current Protocols in Immunology, Green Publishing Assoc., NY (1992; 1993);Muller, Meth. Enzym. 92:589-601 (1983))且在以下實例中予以描述。
用於確定抗體之拮抗劑活性之方法係所屬領域中已知的,且例如為ELISA、生物感測器分析,諸如Biacore及Blitz。
編碼抗
PD1
抗體之核酸分子、重組表現載體及宿主細胞
本文亦揭示編碼本文所述之人源化抗PD-1抗體或其抗原結合片段之核酸、其任何輕鏈或重鏈、載體(諸如包含此等核酸之表現載體或重組病毒)及包含該等核酸及/或載體之宿主細胞。
核酸序列
本發明亦關於一種核酸分子或核酸分子組,其編碼如上所定義之人源化抗hPD-1抗體或其抗原結合片段或其任何輕鏈或重鏈。
抗體DNA序列可例如自合成免疫球蛋白之細胞之RNA擴增,使用PCR利用經選殖之免疫球蛋白合成,或經由編碼已知之信號肽胺基酸序列之寡核苷酸合成。較佳地,對於VH及/或CH,肽信號包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列或由其組成;及/或對於VL及/或CL,肽信號包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列或由其組成。特定言之,肽信號在CH、VH、CL及/或VL之N端。
此類核酸可編碼構成抗體之VL之胺基酸序列及/或構成抗體之VH之胺基酸序列(例如抗體之輕鏈及/或重鏈)。此類核酸容易使用習知程序分離及測序。
在一個實施例中,編碼人源化抗人類PD-1抗體之核酸分子包含:
-編碼SEQ ID NO: 21之可變重鏈域之第一核酸分子,其視情況具有SEQ ID NO. 45之肽信號,及
-編碼SEQ ID NO: 24之可變輕鏈域之第二核酸分子,其視情況具有SEQ ID NO: 46之肽信號。
在一個實施例中,編碼人源化抗人類PD-1抗體之核酸分子包含:
- SEQ ID NO: 48之編碼可變重鏈域之第一核酸分子,其視情況具有編碼SEQ ID NO. 45之肽信號之核酸序列,及
- SEQ ID NO: 49之編碼可變輕鏈域之第二核酸分子,其視情況具有編碼SEQ ID NO: 46之肽信號之核酸序列。
在一個特定實施例中,編碼人源化抗人類PD-1抗體之核酸分子包含:
- SEQ ID NO: 50之編碼重鏈之第一核酸分子,及
- SEQ ID NO: 51之編碼輕鏈之第二核酸分子。
在一個實施例中,核酸分子為經分離、尤其非天然之核酸分子。
編碼根據本發明之人源化抗PD1抗體之核酸分子或核酸分子組較佳包含於載體或一組載體中。
載體
在另一態樣中,本發明係關於一種載體,其包含如上所定義之核酸分子或核酸分子組。
如本文所用,「載體」為用作媒劑,將遺傳物質轉移至細胞中之核酸分子。術語「載體」涵蓋質體、病毒、黏質體及人造染色體。一般而言,經工程改造之載體包含複製起點、多選殖位點及可選標記物。載體本身一般為核苷酸序列,通常為DNA序列,其包含***序列(轉殖基因)及充當載體「主鏈」之較大序列。現今載體可涵蓋除轉殖基因***序列及主鏈以外之其他特徵:啟動子、遺傳標記物、抗生素抗性序列、報導基因、靶向序列、蛋白質純化標籤。稱為表現載體(表現構築體)之載體特定用於在目標細胞中表現轉殖基因,且一般具有控制序列。
在一個實施例中,人源化抗PD1抗體之重鏈與輕鏈編碼序列及/或恆定區包括在一個表現載體中。重鏈編碼序列及輕鏈編碼序列中之每一者可操作地連接於合適啟動子。可替代地,重鏈與輕鏈兩者之表現可由相同啟動子驅動。在另一實施例中,抗體之重鏈及輕鏈中之每一者選殖至個別載體中。在後一種情況下,編碼重鏈及輕鏈之表現載體可共轉染至一個宿主細胞中來表現兩條鏈,該兩條鏈可在活體內或活體外進行組裝以形成完整抗體。可替代地,編碼重鏈及編碼輕鏈之表現載體可引入到不同宿主細胞中來表現重鏈及輕鏈中之每一者,接著重鏈及輕鏈可在活體外純化且進行組裝以形成完整抗體。
編碼人源化抗PD-1抗體或其抗體片段之核酸分子可藉由所屬領域的技術人員選殖至載體中,且接著轉型至宿主細胞中。因此,本發明亦提供一種重組載體,其包含編碼本發明之抗PD-1抗體或其片段之核酸分子。在一個較佳實施例中,表現載體進一步包含啟動子及編碼分泌信號肽之核酸序列,且視情況包含至少一種用於篩選之抗藥基因。
合適表現載體通常含有(1)原核DNA元件,其編碼細菌複製起點及抗生素抗性標記物以使得表現載體可在細菌宿主中生長及進行選擇;(2)真核DNA元件,其控制轉錄之開始,諸如啟動子;以及(3)控制轉錄物加工之DNA元件,諸如轉錄終止/多腺苷酸化序列。
業內人士已知之方法可用於構築含有本文所述之抗PD1抗體之核酸序列及轉錄/轉譯之適當調節組件的表現載體。此等方法包括活體外重組DNA技術、DNA合成技術、活體內重組技術等。DNA序列有效連接至表現載體中之適當啟動子,從而引導mRNA之合成。表現載體可進一步包含用於起始轉譯之核糖體結合位點、轉錄終止子及其類似物。
表現載體可使用多種技術引入到宿主細胞中,該等技術包括磷酸鈣轉染、脂質體介導之轉染、電穿孔及其類似方法。較佳地,經轉染之細胞經選擇且進行繁殖,其中表現載體穩定地整合於宿主細胞基因組中以產生穩定轉型體。用於將載體引入到真核細胞中之技術及使用顯性可選標記物選擇穩定轉型體之技術描述於以下中:Sambrook, Ausubel, Bebbington, 「Expression of Antibody Genes in Nonlymphoid Mammalian Cells」, 2 METHODS: A companion to methods in enzymology 136 (1991)及Murray (編輯), Gene transfer and expression protocols (Humana Press 1991)。合適選殖載體描述於以下中:Sambrook等人 (編輯), MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第二版 (Cold Spring Harbor Press 1989) (下文為「Sambrook」);Ausubel等人 (編輯), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Wiley Interscience 1987) (下文為「Ausubel」);及Brown (編輯), MOLECULAR BIOLOGY LABFAX (Academic Press 1991)。
宿主細胞
本發明之核酸分子、核酸分子組及/或載體可包含於宿主細胞中,尤其出於產生人源化抗人類PD-1抗體之目的。因此,本發明提供包含至少上文所述之核酸分子及/或核酸分子組及/或載體的宿主細胞。
如本文所用,術語「宿主細胞」意欲包括可為或曾為編碼本發明抗體之載體、外源性核酸分子及多核苷酸之接受體,及/或抗體本身之接受體的任何個別細胞或細胞培養物。將各別物質引入細胞中可藉助於轉型、轉染及其類似方法進行。術語「宿主細胞」亦意欲包括單個細胞之後代或可能後代。合適宿主細胞包括原核或真核細胞,且亦包括(但不限於)細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞及動物細胞,諸如昆蟲細胞及哺乳動物細胞,例如鼠類、大鼠、獼猴或人類。
在一個實施例中,宿主細胞包含(例如經轉型具有):(1)包含編碼構成抗體VL之胺基酸序列及/或構成抗體VH之胺基酸序列及/或抗體恆定區之核酸的載體;或(2)包含編碼構成抗體之VL之胺基酸序列之核酸的第一載體及包含編碼構成抗體VH之胺基酸序列之核酸的第二載體。
本文亦提供一種產生人源化抗PD1抗體之方法。該方法包含在適合於表現抗體之條件下培養如以上所提供之包含編碼抗體之核酸的宿主細胞,且視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。詳言之,為重組產生人源化抗PD1抗體,將例如如上所述之編碼抗體之核酸分離且***至一或多種載體中以在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。
適用於產生人源化抗PD-1抗體之宿主細胞包括(但不限於)真核細胞,諸如哺乳動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞或酵母細胞。哺乳動物細胞為尤其較佳之真核宿主,因為哺乳動物細胞提供合適之轉譯後修飾,諸如糖基化。較佳地,此類合適真核宿主細胞可為真菌,諸如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris
)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae
)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe
);昆蟲細胞,諸如東方黏蟲(Mythimna separate
);植物細胞,諸如菸草;及哺乳動物細胞,諸如BHK細胞、293細胞、CHO細胞、NSO細胞及COS細胞。適用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為具有SV40基因之CV-1來源細胞(COS細胞)、經SV40轉型之猴腎CV1細胞株(COS-7);人類胚腎細胞株(293或293細胞,如例如Graham, F.L.等人, J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74中所描述);幼倉鼠腎細胞(BHK);小鼠塞特利氏細胞(mouse Sertoli cell)(TM4細胞,如例如Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252中所描述);人類腎上皮細胞(HEK細胞);猴腎細胞(CV1);非洲綠猴腎細胞(VERO-76);人類子宮頸癌細胞(HELA);犬科動物腎細胞(MDCK;水牛鼠肝細胞(BRL 3 A);人類肺細胞(W138);人類肝細胞(Hep G2);小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562);TRI細胞,如例如Mather, J.P.等人, Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68中所描述;MRC 5細胞;以及FS4細胞。其他適用哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞,包括DHFR" CHO細胞(Urlaub, G.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220);以及骨髓瘤細胞株,諸如Y0、NSO及Sp2/0。關於適合於產生抗體之某些哺乳動物宿主細胞株之評述,參見例如Yazaki, P.及Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, 第248卷, Lo, B.K.C. (編), Humana Press, Totowa, NJ (2004), 第255-268頁。舉例而言,適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為適用的。
特定言之,本發明之宿主細胞係選自由以下各者組成之群:CHO細胞、COS細胞、NSO細胞及HEK細胞。
對於哺乳動物宿主,表現載體之轉錄及轉譯調節信號可來源於病毒來源,諸如腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒、猿病毒或其類似物,其中調控信號與具有高表現水準之特定基因關聯。合適轉錄及轉譯調控序列亦可自哺乳動物基因獲得,諸如肌蛋白、膠原蛋白、肌球蛋白及金屬硫蛋白基因。
產生根據本發明之人源化抗體的穩定轉型體可使用多種方法確定。在鑑別產生分子之細胞之後,宿主細胞在適合於其生長及表現人源化抗體之條件下培養(例如溫度、培養基)。接著人源化抗體藉由所屬領域中已知之任何方法分離及/或純化。此等方法包括(但不限於)習知複性處理、藉由蛋白質沈澱劑處理(諸如鹽沈澱)、離心、藉由滲透溶解細胞、音波處理、超速離心、分子篩層析法或凝膠層析法、吸附層析法、離子交換層析法、HPLC、任何其他液相層析法及其組合。如例如Coligan所描述,人源化抗體分離技術可尤其包括利用蛋白-A瓊脂糖凝膠之親和層析法、尺寸排阻層析法及離子交換層析法。較佳使用蛋白A分離本發明之抗體。
抗體結合物
本發明亦提供一種「抗體結合物」,亦稱為「免疫結合物」,其包含本文所述之人源化抗PD-1抗體或其抗體片段及第二合適試劑,該第二試劑可為治療劑或診斷劑。本發明亦提供包含結合於一或多種細胞毒性劑之人源化抗PD1抗體或其抗體片段的免疫結合物,該一或多種細胞毒性劑諸如化學治療劑或藥物(例如免疫抑制劑)、生長抑制劑、毒素(例如蛋白毒素、免疫毒素、細胞毒素、細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活性毒素或其片段)、放射性毒素、放射性同位素、非蛋白質聚合物,例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。本發明之抗體結合物亦可用於修改指定之生物反應,且藥物部分不應理解為侷限於經典的化學治療劑。舉例而言,藥物部分可為具有所需生物活性之蛋白質或多肽。術語「免疫結合」在本文中係指另一分子/部分藉由重組方法化學交聯或共價附接至根據本發明之人源化抗PD1抗體。用於製備免疫結合物之方法係所屬領域中熟知的(參見例如WO 2014/160160、美國專利第5,208,020號及第5,416,064號;以及Chari等人, 1992 Cancer Res. 52:127-131)。
醫藥組合物
本發明亦關於一種醫藥組合物,其包含人源化抗人類PD1抗體或其抗體片段、如上文所揭示之抗體結合物、如上文所描述之核酸分子、核酸分子組、載體及/或宿主細胞,較佳作為活性成分或化合物。調配物可經殺菌,且必要時與諸如醫藥學上可接受之載劑及賦形劑之輔助劑混合,該等輔助劑不與本發明之人源化抗人類PD-1抗體或其抗體片段、抗體結合物、核酸、載體及/或宿主細胞有害地相互作用。視情況,醫藥組合物可進一步包含如下詳述之另一種治療劑。
較佳地,本發明之醫藥組合物可包含如本文所述之人源化抗人類PD-1抗體或其抗體片段、核酸分子、核酸分子組、載體及/或宿主細胞,與一或多種如下文所描述之醫藥學上或生理學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑、鹽及抗氧化劑組合。理想地,採用不會不利地影響根據本發明之人源化抗PD1抗體之期望免疫增強作用的醫藥學上可接受之形式。為促進投與,如本文所述之人源化抗人類PD-1抗體或其抗體片段可製成醫藥組合物供活體內投與。製作此類組合物之方式已描述於所屬領域中(參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins, 第21版 (2005)。
根據本發明之醫藥組合物可經調配用於任何習知投與途徑,包括局部、經腸、經口、非經腸、鼻內、靜脈內、動脈內、肌肉內、腫瘤內、皮下或眼內投與及其類似途徑。較佳地,根據本發明之醫藥組合物經調配用於經腸或非經腸投與途徑。用於非經腸投與之組合物及調配物可包括無菌水溶液,無菌水溶液亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他合適添加劑,諸如(但不限於)穿透增強劑、梳理化合物(carder compound)及其他醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
醫藥組合物可藉由混合具有所需純度之藥劑與視情況存在之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版, Osol, A.編輯(1980))來製備,呈凍乾調配物或水溶液形式。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所採用之劑量及濃度下對接受者而言無毒性,且包括緩衝劑,諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸;抗氧化劑,包括抗壞血酸及甲硫胺酸;防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨;氯化六羥季銨、苄索氯銨;苯酚、丁醇或苯甲醇;對羥苯甲酸烷酯,諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯;兒茶酚;間苯二酚;環己醇;3-戊醇;以及間甲酚);低分子量(小於約10個殘基)多肽;蛋白質,諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白;親水性聚合物,諸如聚乙烯吡咯啶酮;胺基酸,諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸;單醣、雙醣及其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合劑,諸如EDTA;糖,諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇;成鹽相對離子,諸如鈉;金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物);及/或非離子界面活性劑,諸如TWEENTM
、PLURONICSTM
或聚乙二醇(PEG)。
固體醫藥學上可接受之媒劑可包括一或多種物質,其亦可充當調味劑、潤滑劑、增溶劑、懸浮劑、染料、填充劑、滑動劑、壓縮助劑、惰性黏合劑、甜味劑、防腐劑、染料、塗料或錠劑崩解劑。合適固體媒劑包括例如磷酸鈣、硬脂酸鎂、滑石、糖、乳糖、糊精、澱粉、明膠、纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、低熔點蠟及離子交換樹脂。醫藥學上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌散劑。除非任何習知介質或試劑與活性化合物不相容,否則考慮將其用於本發明之醫藥組合物中。
根據本發明之人源化抗PD1抗體可溶解或懸浮於醫藥學上可接受之液體媒劑中,諸如水、有機溶劑、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇)及其類似物、兩者之混合物或醫藥學上可接受之油或脂肪及其合適混合物。液體媒劑可含有其他合適之醫藥添加劑,諸如增溶劑、乳化劑、緩衝劑、防腐劑、甜味劑、調味劑、懸浮劑、潤濕劑、增稠劑、顏料、黏度調節劑、穩定劑或滲透調節劑。適用於經口及經腸投與之液體媒劑之實例包括水(部分含有如上文之添加劑,例如纖維素衍生物,較佳羧甲基纖維素鈉溶液)、醇(包括一元醇及多元醇,例如二醇)及其衍生物以及油(例如分餾椰子油及花生油)。對於非經腸投與而言,媒劑亦可為油性酯,諸如油酸乙酯及十四烷酸異丙酯。無菌液體媒劑可用於無菌液體形式之組合物以供經腸投與。用於加壓組合物之液體媒劑可為鹵化烴或其他醫藥學上可接受之推進劑。
本發明之醫藥組合物可進一步包含一或多種醫藥學上可接受之鹽。「醫藥學上可接受之鹽」係指保留母體化合物之所需生物活性且不賦予任何非所需之毒理學作用的鹽。該等鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包括來源於無毒無機酸之酸加成鹽,諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸及其類似物;以及來源於無毒有機酸之酸加成鹽,諸如脂族單羧酸及脂族二羧酸、經苯基取代之烷酸、羥基烷酸、芳族酸、脂族及芳族磺酸及其類似物。鹼加成鹽包括來源於鹼金屬或鹼土金屬(諸如鈉、鉀、鎂、鈣及其類似物)以及來源於無毒有機胺(諸如N,N'-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因及其類似物)之鹽。
本發明之醫藥組合物亦可包括醫藥學上可接受之抗氧化劑。醫藥學上可接受之抗氧化劑之實例包括:水溶性抗氧化劑,諸如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉及其類似物;油溶性抗氧化劑,諸如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基大茴香醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚及其類似物;以及金屬螯合劑,諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸及其類似物。
為促進遞送,抗PD-1抗體或其編碼核酸可與伴隨劑(chaperon agent)結合。伴隨劑可為天然存在之物質,諸如蛋白質(例如人類血清白蛋白、低密度脂蛋白或球蛋白);碳水化合物(例如聚葡萄糖、普魯蘭(pullulan)、幾丁質、聚葡萄胺糖、菊糖、環糊精或玻尿酸);或脂質。其亦可為重組或合成分子,諸如合成聚合物,例如合成聚胺基酸。聚胺基酸之實例包括聚離胺酸(PLL)、聚L-天冬胺酸、聚L-麩胺酸、苯乙烯-順丁烯二酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯醚-順丁烯二酸酐共聚物、N-(2-羥基丙基)甲基丙烯醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚胺基甲酸酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物及聚磷嗪。在一個實例中,伴隨劑為囊封寡核苷酸/干擾RNA之膠束、脂質體、奈米粒子或微球體。用於製備此類膠束、脂質體、奈米粒子或微球體之方法係所屬領域中熟知的。參見例如美國專利5,108,921;5,354,844;5,416,016;以及5,527,5285。
醫藥組合物通常必須在製造及儲存條件下無菌且穩定。醫藥組合物可調配為溶液、微乳液、脂質體或適合於高藥物濃度及/或適合於注射之其他有序結構。適當流動性可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持。
在一個實施例中,醫藥組合物為可含有多種載劑之可注射組合物,該等載劑諸如植物油、二甲基乙醯胺、二甲基甲醯胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、十四烷酸異丙酯、乙醇及多元醇(甘油、丙二醇、液體聚乙二醇及其類似物)。對於靜脈內注射而言,可藉由滴注方法投與水溶性抗體,藉此輸注含有抗體及生理學上可接受之賦形劑的醫藥調配物。生理學上可接受之賦形劑可包括例如5%右旋糖、0.9%生理鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)或其他合適賦形劑。肌肉內製劑(例如抗體之合適可溶性鹽形式之無菌調配物)可溶解於醫藥賦形劑(諸如注射用水、0.9%生理鹽水或5%葡萄糖溶液)中且投與。
無菌可注射溶液可藉由視需要將活性化合物以所需量與上文所列舉之一種成分或成分組合一起併入適當溶劑中,繼而滅菌微過濾來製備。一般而言,分散液藉由將活性化合物併入含有基礎分散介質及來自以上所列舉之彼等成分之所需其他成分的無菌媒劑中來製備。在無菌粉末用於製備無菌可注射溶液之情況下,較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾),其自其預先無菌過濾之溶液產生活性成分加任何額外所需成分之粉末。藉由在組合物中包括延遲吸收之試劑(例如單硬脂酸鹽及明膠),可使可注射組合物之吸收延長。
可藉由殺菌程序以及藉由包括各種抗菌劑及抗真菌劑,例如氯丁醇、苯酚山梨酸及其類似物來確保對微生物存在之預防。亦可能需要在組合物中包括等張劑,諸如糖、氯化鈉及其類似物。另外,可藉由包括延遲吸收之試劑(諸如單硬脂酸鋁及明膠)使可注射醫藥形式之吸收延長。
所屬領域的技術人員應瞭解,本發明之調配物可與人類血液等張,亦即本發明之調配物具有基本上與人類血液相同之滲透壓。此類等張調配物通常具有約250 mOSm至約350 mOSm之滲透壓。等張性可藉由例如使用蒸氣壓或冰凍型滲透壓計量測。調配物之張力藉由使用張力調節劑來調節。「張力調節劑」為可添加至調配物中以提供調配物之等張性的彼等醫藥學上可接受之惰性物質。適合於本發明之張力調節劑包括(但不限於)醣類、鹽類及胺基酸。
根據本發明之醫藥組合物可經調配以在投與後基本上立即或在投與之後的任何預定時間或時間段釋放活性成分(例如本發明之人源化抗hPD1抗體)。在一些態樣中,醫藥組合物可採用定時釋放型、延遲釋放型及持續釋放型遞送系統,使得組合物之遞送在所治療之位點敏感化之前發生且其時間足以引起所治療之部位的敏感化。所屬領域中已知之方式可用於預防組合物之釋放及吸收或將釋放及吸收減至最少,直至其達到目標組織或器官,或確保組合物之定時釋放。此類系統可避免重複投與組合物,從而增加個體及醫師之便利。
可與載劑物質組合以產生單一劑型的活性成分之量將視所治療之個體及特定投藥模式而變化。可與載劑材料組合以產生單一劑型之活性成分之量大體上為產生治療效果之組合物之量。
個體、方案及投藥
本發明係關於本發明之人源化抗PD1抗體或其片段、醫藥組合物、核酸分子、核酸分子組、載體或宿主細胞,其適用作藥劑,尤其用於預防或治療個體之疾病或病症。治療之實例在下文「方法與用途」部分更明確地描述。其亦關於本發明之醫藥組合物、核酸、載體或宿主細胞或人源化抗PD1抗體或其抗體片段的用途,其用於製造供治療個體之疾病用之藥劑。最終,其係關於一種用於治療個體之疾病或病症之方法,該方法包含向個體投與治療有效量之醫藥組合物或人源化抗PD1抗體或其抗體片段。治療之實例在下文「方法與用途」部分更明確地描述。
治療個體可為人類,尤其處於產前階段之人類、新生兒、兒童、嬰兒、青少年或成年人,尤其至少30歲、40歲之成年人,較佳至少50歲之成年人,更佳至少60歲之成年人,甚至更佳至少70歲之成年人。
在一特定實施例中,個體為免疫抑制或免疫功能低下的。此類受試者可例如因諸如HIV之病毒感染、癌症、糖尿病、營養不良及某些遺傳病症、用免疫抑制藥物治療或先前用免疫療法、化學療法或放射線療法治療而為免疫抑制、免疫功能不全或免疫功能低下的。本發明之個體可為免疫功能低下的。如本文所用,術語「免疫功能低下」及「免疫缺陷」係同等的且可互換使用。如本發明中使用,術語「免疫功能低下」或「免疫功能不全」係指個體之免疫防禦減弱的狀態。免疫功能低下之個體不能正確地管理在正常條件下不存在危險之微生物。本發明之個體可為免疫抑制的。如本文所用,術語「免疫抑制」係指個體不再具有免疫防禦之狀態。
因此,根據本發明之抗體或其抗原結合片段、醫藥組合物、經分離之核酸分子或經分離之核酸分子組、載體或宿主細胞可進一步用於預防或治療患有淋巴球減少症之患者。
特定言之,個體罹患可涉及PD-1/PDL-1路徑,尤其其中表現、尤其過度表現PD-1配位體(例如PDL-1及/或PDL-2)或PD-1中之至少一種的疾病。較佳地,個體罹患癌症、甚至更佳罹患PD1、PD-L1及/或PD-L2陽性癌症或PD-1陽性癌症。疾病及癌症之實例在下文「方法與用途」部分更明確地描述。
在一特定實施例中,在投與根據本發明之人源化抗PD1抗體或根據本發明之醫藥組合物之前,個體已接受至少一條線之治療,較佳若干條線之治療。
醫學領域的一般技術人員已知之習知方法可用於向個體投與本文所揭示之人源化抗PD1抗體或其抗體片段或醫藥組合物,視待治療之疾病類型或疾病部位而定。此組合物可經由習知途徑投與,例如經口、非經腸、藉由吸入噴霧、局部、經直腸、經鼻、頰內、經***或經由植入式儲集器投與。如本文所用,術語「非經腸」包括皮下、皮內、靜脈內、肌肉內、關節內、動脈內、滑膜內、胸骨內、鞘內、病灶內、腫瘤內及顱內注射或輸注技術。當非經腸投與時,根據本發明之醫藥組合物較佳藉由靜脈內投與途徑投與。當經腸投與時,根據本發明之醫藥組合物較佳藉由經口投與途徑投與。此組合物亦可局部投與。
醫藥組合物之形式、根據本發明之醫藥組合物或人源化抗PD1抗體或其片段之投與途徑及投與劑量可藉由所屬領域的技術人員根據感染類型及嚴重程度及患者、尤其其年齡、體重、性別及整體身體狀況進行調整。本發明之組合物可以多種方式投與,視所需局部還是全身治療而定。
較佳地,用人源化抗PD-1抗體或其片段或用根據本發明之醫藥組合物進行之治療定期投與,較佳每天、每週或每個月、更佳介於每天與每一週、每兩週、每三週或每四週之間。在一特定實施例中,治療一天投與若干次,較佳一天2次或3次。
用根據本發明之人源化抗PD-1抗體或其片段或根據本發明之醫藥組合物進行之治療的持續時間較佳介於1天與20週之間,更佳介於1天與10週之間,更佳介於1天與4週之間,甚至更佳介於1天與2週之間。可替代地,治療可持續至與疾病持續一樣長。
本文所揭示之人源化抗hPD1抗體可以在約1 ng/kg體重至約30 mg/kg體重、1 μg/kg至約20 mg/kg、10 μg/kg至約10 mg/kg或100 μg/kg至5 mg/kg之範圍內的有效劑量,視情況每一週、兩週、三週或四週,較佳藉由非經腸或經口投與,尤其藉由靜脈內或皮下投與來提供。
特定言之,根據本發明之人源化抗hPD1抗體可以低於治療劑量投與。如本文所用,術語「低於治療劑量」係指低於治療疾病常用之有效單一療法劑量水準的劑量,或抗hPD1抗體之有效單一療法當前通常不使用之劑量。
方法與用途
治療疾病之用途
本發明之人源化抗PD-1抗體或其抗原結合片段、核酸、載體、宿主細胞、組合物及方法具有大量活體外及活體內效用及應用。舉例而言,本文所述之人源化抗PD-1抗體或其抗體片段(呈游離形式或免疫結合物)、核酸、載體、宿主細胞及/或醫藥組合物可用作治療劑、診斷劑及醫學研究。特定言之,本文提供之人源化抗PD1抗體、核酸、載體、宿主細胞或醫藥組合物中之任一者可用於治療方法及/或用於達成治療目的。特定言之,本文提供之人源化抗PD-1抗體或其抗體片段可用於治療涉及PD-1之任何疾病或病狀,諸如癌症及感染,或與免疫缺乏相關聯之其他疾病,諸如T細胞功能異常。
在一個態樣中,本發明係關於一種治療可藉由抑制PD-L1及/或PD-L2與PD-1之結合而預防或得到治療之病變、疾病及/或病症的方法。
甚至更佳地,本發明係關於一種治療有需要之個體中選自由癌症及感染性疾病、較佳慢性感染組成之群之疾病及/或病症的方法,該方法包含向該個體投與有效量之如上所定義之抗PD1抗體或醫藥組合物。此類疾病之實例在下文更明確地描述。
本發明亦關於人源化抗hPD1抗體或其抗原結合片段、核酸、核酸組或編碼其之載體或包含其之醫藥組合物,用於治療個體之病症及/或疾病及/或適用作藥劑或疫苗。其亦關於人源化抗hPD1抗體或其抗原結合片段、核酸或編碼其之載體或包含其之醫藥組合物,用於製造供治療個體之疾病及/或病症用之藥劑。最終,其係關於一種用於治療個體之疾病或病症之方法,該方法包含向個體投與治療有效量之醫藥組合物或人源化抗PD1抗體或其抗體片段。
在一特定態樣中,本發明特別關於如本文所揭示之人源化抗hPD1抗體或其抗原結合片段、核酸、核酸組或編碼其之載體或包含其之醫藥組合物,用於治療可藉由抑制PD-L1及/或PD-L2與PD-1之結合而預防或得到治療的病變、疾病及/或病症。
因此,本文揭示用於治療與PD-1及/或PD-1/PD-L1及/或PD-1/PD-L2信號傳導路徑相關聯之疾病的方法,該方法包含向需要治療之個體投與有效量的本文所述之抗PD-1抗體或醫藥組合物。亦考慮患者之生理資料(例如年齡、體型及體重)及投與途徑以確定適當劑量,以便向患者投與治療有效量。
本文揭示治療患有疾病及/或病症之患者之方法,該方法包含:(a)鑑別需要治療之患者;以及(b)向該患者投與治療有效量之本文所述之抗體、核酸、載體或醫藥組合物。
在一個特定態樣中,需要治療之個體可為患有與由PD-1介導之信號傳導路徑相關聯之疾病、處於患病風險下或懷疑患病的人類。此類患者可藉由常規醫學檢查來鑑別。舉例而言,適合於治療之個體可藉由檢查此類個體是否攜帶PD-1、PD-L1及/或PD-L2陽性細胞來鑑別。在一個實施例中,需要治療之個體為患有疾病、較佳PD-1、PDL1及/或PDL2陽性疾病、甚至更佳PD-1及/或PD-1之至少一種配位體過度表現之疾病、懷疑患病或處於患病風險下之患者。在此類個體中,PD-1/PD-L1及/或PD-1/PD-L2相互作用之破壞歸功於根據本發明之抗體或醫藥組成物的投與,可增強個體之免疫反應。在一些實施例中,本文所述之人源化抗PD-1抗體或醫藥組合物可用於治療PD-1陽性細胞。
可替代地,歸因於對不特異性針對表現PD-L1或PD-L2之目標細胞的巨噬細胞之吞噬作用的作用,適合於治療之個體亦可具有PD-L1及/或PD-L2陰性目標細胞。在一個實施例中,需要治療之個體為患有PDL1及/或PDL2陰性疾病、懷疑患病或處於患病風險下之患者。
在另一態樣中,本文所述之人源化抗PD-1抗體或醫藥組合物可投與個體,例如在活體內,以增強免疫性,較佳治療病症及/或疾病。因此,在一個態樣中,本發明提供一種改善個體之免疫反應的方法,該方法包含向個體投與本發明之人源化抗PD-1抗體或其抗原結合片段、核酸、載體或醫藥組合物,從而改善個體之免疫反應。較佳地,免疫反應得到增強、增加、受到刺激或上調。人源化抗hPD-1抗體或醫藥組合物可用於增強需要治療之個體之免疫反應,諸如T細胞活化。免疫反應增強可抑制PD-L1及/或PD-L2與PD-1之結合,藉此減少免疫抑制環境、刺激人類T細胞之增殖及/或活化及/或人類PBMC之IFNγ分泌。
可替代地或另外,免疫反應增強可由巨噬細胞對細胞之吞噬作用的活化引起。此吞噬作用不限於表現PD-L1之細胞。實際上,本發明之人源化抗hPD-1抗體可活化此等巨噬細胞對任何細胞、尤其癌細胞或感染細胞之吞噬作用。
本發明特別提供一種增強個體之免疫反應的方法,該方法包含向個體投與治療有效量之本文所述之人源化抗PD-1抗體或其抗原結合片段、核酸、載體或包含其之醫藥組合物中的任一者,從而增強個體之免疫反應。
在一些實施例中,本文所述之人源化抗hPD-1抗體之量有效抑制PD-1信號傳導(例如與對照相比,使PD-1信號傳導減少至少20%、30%、50%、80%、100%、200%、400%或500%)。在其他實施例中,本文所述之抗PD-1抗體之量有效活化免疫反應(例如與對照相比,活化至少20%、30%、50%、80%、100%、200%、400%或500%)。
在一些實施例中,本文所述之人源化抗hPD-1抗體之量有效抑制人類PD-L1及/或PD-L2與人類PD-1之結合,例如與對照相比,抑制結合至少20%、30%、50%、80%、100%、200%、400%或500%)。
在一些實施例中,本文所述之人源化抗hPD-1抗體之量足夠具有對人類PD-L1及/或PD-L2與人類PD-1之結合的拮抗劑活性,例如與對照相比,抑制結合至少20%、30%、50%、80%、100%、200%、400%或500%)。
癌症
所屬領域中已知,抗體對PD-L1之阻斷可增強患者中針對癌細胞之免疫反應。因此,在一個態樣中,本發明提供用於治療患有癌症之個體之抗PD1抗體或醫藥組合物,治療包含向個體投與有效量之抗PD1抗體或醫藥組合物,較佳地,以破壞或抑制PD1/PD-L1及/或PD1/PD-L2相互作用。因此,在一個態樣中,本發明提供用於治療患有癌症之個體之抗PD-1抗體或醫藥組合物,其中該抗PD-1抗體較佳藉由破壞或抑制PD1/PD-L1及/或PD1/PD-L2相互作用而能夠活化耗竭性T細胞。在一個態樣中,本發明提供用於治療患有癌症之個體之抗PD-1抗體或醫藥組合物,其中該抗PD-1抗體較佳藉由破壞或抑制PD1/PD-L1及/或PD1/PD-L2相互作用而能夠活化巨噬細胞。
在一個實施例中,需要治療之個體為患有疾病、較佳PD-1或PD-L1陽性癌症、甚至更佳表現或過度表現PD-1或PD-L1之癌症、懷疑患病或處於患病風險下的患者。舉例而言,適合於治療之患者可藉由檢查此類患者是否攜帶PD-L1陽性腫瘤細胞來鑑別。另外或可替代地,適合於治療之個體為具有表現或過度表現PD-1之腫瘤浸潤性T細胞的個體。
在另一實施例中,個體為顯現癌症、較佳PD-L1及/或PD-L2陽性癌症、懷疑患癌或處於患癌風險下之患者。在一些實施例中,本文所述之人源化抗PD-1抗體或醫藥組合物可用於治療PD-L1及/或PD-L2陽性腫瘤。舉例而言,適合於治療之人類患者可藉由檢查此類患者是否攜帶PD-L1及/或PD-L2陽性腫瘤細胞來鑑別。
在其他態樣中,提供用於治療癌症、較佳PD-L1及/或PD-L2陽性癌症、甚至更佳過度表現PD-L1及/或PD-L2之癌症的人源化抗hPD1抗體或其抗體片段。
在另一實施例中,本發明提供如本文所揭示之人源化抗hPD-1抗體或其抗原結合部分或醫藥組合物的用途,其用於製造用以治療較佳具有PD-L1、PD-L2陽性腫瘤細胞之個體之癌症、例如用於抑制腫瘤細胞之生長的藥劑。
因此,在一個實施例中,本發明提供一種治療個體之癌症、例如抑制腫瘤細胞生長之方法,該方法包含向個體投與治療有效量之根據本發明之人源化抗PD-1抗體或其抗原結合部分或醫藥組合物。特定言之,本發明係關於使用人源化抗PD-1抗體治療個體,以使得癌細胞之生長得到抑制。
在本發明之一個態樣中,待治療之癌症與耗竭性T細胞相關聯。
較佳地,「PD-L1陽性腫瘤細胞」或「PD-L2陽性腫瘤細胞」意欲分別指PD-L1或PD-L2在至少10%腫瘤細胞、較佳至少20%、30%、40%或50%腫瘤細胞中表現之腫瘤細胞群體。
可替代地或另外,本發明之人源化抗hPD-1抗體亦可用於治療可能與低表現程度PD-1及/或PD-L1及/或少量T細胞、尤其腫瘤浸潤性T細胞及/或大量耗竭性T細胞相關聯之癌症。實際上,本發明之人源化抗hPD-1抗體意外地可活化此等巨噬細胞對任何細胞(表現或不表現PD-1及/或PD-L1之細胞)之吞噬作用。在此背景下,患者可因諸如HIV之病毒感染、癌症、糖尿病、營養不良及某些遺傳病症、用免疫抑制藥物治療或先前用免疫療法、化學療法或放射線療法治療而為免疫抑制、免疫功能不全或免疫功能低下的。
因此,本發明之人源化抗hPD-1抗體亦可用於治療具有PD-L1陰性腫瘤細胞之癌症。
較佳地,「PD-L1陰性腫瘤細胞」或「PD-L2陰性腫瘤細胞」意欲分別指PD-L1或PD-L2在少於10%腫瘤細胞、較佳少於5%腫瘤細胞、較佳少於1%腫瘤細胞中表現之腫瘤細胞群體。
可用本文提供之抗體治療的任何合適癌症可為造血癌症或實體癌症。此類癌症包括癌瘤、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、胃腸癌、頭頸癌、腎癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、神經膠質瘤、間皮瘤、黑色素瘤、胃癌、尿道癌、環境誘發之癌症及該等癌症之任何組合。本發明亦適用於治療轉移性癌症,尤其表現PD-L1之轉移性癌症(Iwai等人 (2005) Int. Immunol. 17: 133-144)。另外,本發明包括難治性或復發性惡性病。
在一特定態樣中,癌症為高度表現PD-1及/或PD-L1之惡性血液病或實體腫瘤。此類癌症可選自由以下各者組成之群:淋巴造血腫瘤、血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤、骨髓增生異常症候群、急性骨髓性白血病。
在一特定態樣中,癌症為病毒誘發或與免疫缺乏相關聯之癌症。此類癌症可選自由以下各者組成之群:卡波西氏肉瘤(例如與卡波西氏肉瘤疱疹病毒相關聯);子宮頸、肛門、陰莖及外陰鱗狀細胞癌及口咽癌(例如與人類乳頭狀瘤病毒相關聯);B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL),包括彌漫性大B細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、HHV-8原發性滲出性淋巴瘤、經典霍奇金氏淋巴瘤及淋巴增生病症(例如與艾伯斯坦-巴爾病毒(EBV)及/或卡波西氏肉瘤疱疹病毒相關聯);肝細胞癌(例如與B型及/或C型肝炎病毒相關聯);梅克爾細胞癌(例如與梅克爾細胞多瘤病毒(MPV)相關聯);以及與人類免疫缺乏病毒感染(HIV)相關聯之癌症。
較佳地,待治療或預防之癌症係選自由以下各者組成之群:轉移性或非轉移性黑色素瘤、惡性間皮瘤、非小細胞肺癌、腎細胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、頭頸癌、尿道上皮癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、小細胞肺癌、轉移性梅克爾細胞癌、胃癌或胃食道癌及子宮頸癌。
治療之較佳癌症包括通常對免疫療法起反應之癌症。
舉例而言且不希望受理論束縛,用抗癌抗體或抗癌免疫結合物或引起癌細胞死亡之其他當前抗癌療法進行之治療將增強PD-1介導之免疫反應。因此,過度增生性疾病(例如癌症腫瘤)之治療可包括人源化抗PD-1抗體或其片段與抗癌療法組合,同時或依次或其任何組合,此可增強宿主之抗腫瘤免疫反應。較佳地,抗PD-1抗體可與其他免疫原性劑(例如ADC)、標準癌症治療或如下所述之其他抗體組合使用。
感染性疾病
本發明之人源化抗PD1抗體或其片段或醫藥組合物用於治療已暴露於特定毒素或病原體之患者。因此,本發明之一態樣提供一種治療個體之感染性疾病的方法,該方法包含向個體投與人源化抗PD-1抗體或其抗原結合片段或包含其之醫藥組合物,較佳使得個體之感染性疾病得到治療。
任何合適感染可用本文提供之人源化抗PD1抗體或抗體片段治療。
引起可由本發明方法治療之感染之病原性病毒的一些實例包括HIV、肝炎(A、B或C)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II及CMV、埃-巴二氏病毒)、腺病毒、流感病毒、黃病毒、埃可病毒、鼻病毒、科沙奇病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、細小病毒、痘瘡病毒、HTLV病毒、登革熱病毒、乳頭狀瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰白質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒及蟲媒病毒性腦炎病毒。
特定言之,本發明之抗PD1抗體或醫藥組合物用於治療具有慢性病毒感染之患者,此類感染由選自由以下各者組成之群的病毒引起:反轉錄病毒、指環病毒、環狀病毒、疱疹病毒、水痘帶狀疱疹病毒(VZV)、細胞巨大病毒(CMV)、艾伯斯坦-巴爾病毒(EBV)、多瘤病毒BK、多瘤病毒、腺相關病毒(AAV)、1型單純疱疹(HSV-1)、腺病毒、2型單純疱疹(HSV-2)、卡波西氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)、B型肝炎病毒(HBV)、GB病毒C、乳頭狀瘤病毒、C型肝炎病毒(HCV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)、D型肝炎病毒(HDV)、人類T細胞白血病病毒1型(HTLV1)、異嗜性鼠類白血病病毒相關病毒(XMLV)、風疹病毒、德國麻疹、細小病毒B19、麻疹病毒、科沙奇病毒。
引起可藉由本發明方法治療之感染之病原菌的一些實例包括衣原體(chlamydia)、立克次體細菌(rickettsial bacteria)、分枝桿菌(mycobacteria)、葡萄狀球菌(staphylococci)、鏈球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、腦膜炎球菌(meningococci)及***(conococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、變形桿菌(proteus)、沙雷菌屬(serratia)、假單胞菌(pseudomonas)、軍團菌屬(legionella)、白喉(diphtheria)、沙門氏菌(salmonella)、桿菌(bacilli)、霍亂(cholera)、破傷風(tetanus)、肉毒中毒(botulism)、炭疽病(anthrax)、瘟疫(plague)、鉤端螺旋體病(leptospirosis)及萊姆病細菌(Lymes disease bacteria)。
引起可藉由本發明方法治療之感染之病原性真菌的一些實例包括念珠菌屬(Candida) (白色念珠菌(albicans Candida)、克魯斯氏念珠菌(krusei Candida)、光滑念珠菌(glabrata Candida)、熱帶念珠菌(tropicalis Candida)等)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、麴菌屬(Aspergillus) (煙麯黴(fumigatus)、黑麴菌(niger)等)、毛黴目(Mucorales)屬(毛黴菌屬(mucor)、犁頭黴屬(absidia)、根黴屬(rhizophus))、申克氏胞絲菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)及莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)。
引起可由本發明方法治療之感染之病原性寄生蟲的一些實例包括溶組織內阿米巴(Entamoeba histolytica)、大腸纖毛蟲(Balantidium coli)、福氏耐格里阿米巴原蟲(Naegleriafowleri)、棘阿米巴蟲屬(Acanthamoeba sp.)、蘭比亞梨形鞭毛蟲(Giardia lambia)、隱孢子蟲屬(Cryptosporidium sp.)、肺炎肺囊蟲(Pneumocystis carinii)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、微小巴倍蟲(Babesia microti)、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondi)及巴西日圓線蟲(Nippostrongylus brasiliensis)。
在所有上述方法中,PD-1阻斷可與諸如細胞介素治療(例如干擾素、GM-CSF、G-CSF、IL-2)之其他形式免疫療法或增強腫瘤抗原呈遞之任何療法組合。
組合療法
詳言之,根據本發明之人源化抗PD-1抗體或其抗原結合片段可與一些利用處於臨床研發中或已經上市之藥劑克服免疫逃避機制之其他潛在策略組合(參見Antonia等人 Immuno-oncology combinations: a review of clinical experience and future prospects. Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc. Cancer Res.20
, 6258-6268, 2014之表1)。此類與根據本發明之人源化抗PD-1抗體或其抗原結合片段的組合可能特別適用於:
1-例如藉由使用抗CTLA4分子,逆轉適應性免疫之抑制(阻斷T細胞檢查點路徑);
2-開啟適應性免疫(使用促效劑分子、尤其抗體促進T細胞共刺激受體信號傳導);
3-改善先天性免疫細胞之功能;
4-例如經由基於疫苗之策略,活化免疫系統(增強免疫細胞效應功能)。
因此,本文亦提供用於如本文所述之疾病中之任一者的組合療法,其利用如本文所述之人源化抗PD-1抗體或其抗體片段或包含其之醫藥組合物及另一種治療劑。在一態樣中,人源化抗PD-1抗體及另一種治療劑可存在於如上所述之醫藥組合物中。可替代地,如本文所用,術語「組合療法(combination therapy)」或「組合療法(combined therapy)」涵蓋以依次方式投與此等藥劑(例如如本文所述之抗PD-1抗體及第二或另一種合適治療劑),亦即,其中各治療劑在不同時間投與;以及以基本上同時之方式投與此等治療劑或該等藥劑中之至少兩種。依次或基本上同時投與各藥劑可藉由任何適當途徑實現。藥劑可藉由相同途徑或藉由不同途徑投與。舉例而言,第一藥劑(例如抗PD-1抗體)可經口投與,且另一種治療劑(例如抗癌劑、抗感染劑;或免疫調節劑)可靜脈內投與。可替代地,所選組合之藥劑可藉由靜脈內注射投與,而組合之其他藥劑可經口投與。
在另一態樣中,本發明係關於一種治療手段、尤其組合產品手段,其包含以下作為活性成分:如上所定義之人源化抗hPD-1抗體或抗原結合片段及另一種治療劑,其中該等活性成分經調配用於單獨、依次或組合療法,尤其組合或依次使用。
除非另外說明,否則如本文所用,術語「依次」意謂特徵在於有規則之順序或次序,例如若給藥方案包括投與人源化抗hPD-1抗體及另一種或第二藥劑,則依次給藥方案可包括在投與第二藥劑之前、與其同時、基本上同時或在其之後投與人源化抗hPD-1抗體,但兩種藥劑以有規則之順序或次序投與。除非另外說明,否則術語「單獨」意謂彼此分開。除非另外說明,否則術語「同時」意謂同時發生或進行,亦即本發明之藥劑同時投與。術語「基本上同時」意謂該等藥劑彼此相隔數分鐘內投與(例如彼此相隔15分鐘內),且意欲涵蓋共同投與以及連續投與,但若投與為連續的,則其僅僅相隔很短時間(例如開業醫師分開投與兩種化合物所耗費之時間)。
應瞭解如本文所述之任何組合可以任何順序使用,以用於治療本文所述之病症或疾病。本文所述之組合可基於大量因素選擇,該等因素包括(但不限於)抑制或預防目標疾病進展之效力、減輕組合之另一藥劑之副作用的效力或減輕與目標疾病相關之症狀的效力。舉例而言,本文所述之組合療法可減少與組合之各個別成員相關聯之副作用中的任一者。
本發明亦關於一種用於治療個體之疾病的方法,其包含向該個體投與治療有效量之本文所述之人源化抗hPD-1抗體或醫藥組合物及治療有效量之另一種治療劑。
當本文所述之人源化抗hPD-1抗體或醫藥組合物與另一種治療劑共同使用時,低於治療劑量之組合物或第二藥劑或低於治療劑量之兩種藥劑可用於治療個體,較佳患有與PD-1介導之細胞信號傳導相關聯之疾病或病症或處於顯現該疾病或病症之風險下的個體。在一態樣中,另一種治療劑可在包含以下之非詳盡性清單中選擇:烷基化劑、血管生成抑制劑、抗體、尤其抗腫瘤靶向抗體、抗代謝物、抗有絲***劑、抗增生劑、抗病毒劑、極光激酶抑制劑、細胞凋亡促進劑(例如Bcl-2家族抑制劑)、死亡受體路徑活化劑、Bcr-Abl激酶抑制劑、BiTE (雙特異性T細胞接合分子)抗體、抗體藥物結合物、生物反應調節劑、布魯頓氏酪胺酸激酶(BTK)抑制劑、週期蛋白依賴型激酶抑制劑、細胞週期抑制劑、環加氧酶-2抑制劑、DVD、白血病病毒致癌基因同源物(ErbB2)受體抑制劑、生長因子抑制劑、熱休克蛋白(HSP)-90抑制劑、組蛋白去乙醯基酶(HDAC)抑制劑、激素療法、免疫藥物、細胞凋亡蛋白抑制劑(IAP)、嵌入型抗生素、激酶抑制劑、驅動蛋白抑制劑、Jak2抑制劑、哺乳動物雷帕黴素靶蛋白抑制劑、微RNA、有絲***原活化胞外信號調節激酶抑制劑、多價結合蛋白、非類固醇消炎藥(NSAID)、聚ADP (二磷酸腺苷)-核糖聚合酶(PARP)抑制劑、鉑化學治療劑、polo樣激酶(Plk)抑制劑、磷酸肌醇-3激酶(PI3K)抑制劑、蛋白酶體抑制劑、嘌呤類似物、嘧啶類似物、受體酪胺酸激酶抑制劑、類視黃素/類維生素D植物鹼、小抑制核糖核酸(siRNA)、拓樸異構酶抑制劑、泛蛋白連接酶抑制劑、低甲基化劑、檢查點抑制劑、肽疫苗及其類似物、來自腫瘤抗原之抗原決定基或新抗原決定基以及此等藥劑中之一或多者的組合。
舉例而言,另一種治療劑可選自由以下各者組成之群:化學療法、放射線療法、靶向療法、抗腫瘤靶向抗體、抗血管生成劑、低甲基化劑、癌症疫苗、來自腫瘤抗原之抗原決定基或新抗原決定基、骨髓檢查點抑制劑、其他免疫療法及HDAC抑制劑。
在一較佳實施例中,另一種治療劑係選自由以下各者組成之群:化學治療劑、放射治療劑、免疫治療劑、細胞治療劑(諸如CAR T細胞)、抗生素及益生菌。
該免疫治療劑亦可為靶向腫瘤抗原之抗體,尤其選自由抗Her2、抗EGFR、抗CD20、抗CD19及抗CD52組成之群。該等抗體可為靶向腫瘤細胞之細胞毒性抗體或誘發免疫細胞(諸如NK細胞、T細胞或巨噬細胞)針對腫瘤細胞之細胞溶解活性的抗體。此類抗體之非詳盡性清單包括利妥昔單抗(rituximab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、阿特珠單抗(atezolizumab)、貝伐單抗(bevacizumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、赫賽汀(herceptin)、帕尼單抗(panitumumab)、萊西單抗(necitumumab)、迪奴圖單抗(dinutuximab)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、奧拉單抗(olaratumab)、伊派利單抗(ipilimumab)、賽咪單抗(cemiplimab)、曲美木單抗(tremelimumab)、CS1001、瑞拉單抗(relatlimab)、納昔單抗(naxitamab)、馬戈妥昔單抗(margetuximab)、BAT8001、KN035、伊薩妥昔單抗(isatuximab)、安德西昔單抗(andecaliximab)、貝馬妥昔單抗(bemarituzumab)、曲妥珠單抗、抗PD1抗體、抗PDL-1、抗CD47抗體及抗SIRPa抗體。在一極特定態樣中,本發明之抗PD-1抗體與利妥昔單抗組合使用。
在一實施例中,本發明係關於如上所定義之組合療法,其中另一種治療劑尤其選自由以下各者組成之群:治療性疫苗、免疫檢查點阻斷劑或活化劑、尤其適應性免疫細胞(T及B淋巴細胞)及抗體-藥物結合物。較佳地,與人源化抗hPD-1抗體或其片段或與根據本發明之醫藥組合物共同使用的合適藥劑包括結合於共刺激受體(例如OX40、CD40、ICOS、CD27、HVEM或GITR)之抗體、誘發免疫原性細胞死亡之藥劑(例如化學治療劑、放射性治療劑、抗血管生成劑或用於靶向療法之藥劑)、抑制檢查點分子(例如CTLA4、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、BTLA或TIGIT)之藥劑、癌症疫苗、調節免疫抑制酶(例如IDO1或iNOS)之藥劑、靶向Treg細胞之藥劑、用於過繼性細胞療法之藥劑或調節骨髓細胞之藥劑。
在一實施例中,本發明係關於如上所定義之組合療法,其中第二治療劑為選自由以下各者組成之群的適應性免疫細胞(T及B淋巴細胞)之免疫檢查點阻斷劑或活化劑:抗CTLA4、抗CD2、抗CD28、抗CD40、抗HVEM、抗BTLA、抗CD160、抗TIGIT、抗TIM-1/3、抗LAG-3、抗2B4及抗OX40、抗CD40促效劑、CD40-L、TLR促效劑、抗ICOS、ICOS-L及B細胞受體促效劑。
在一個實施例中,另一種或第二治療劑為靶向腫瘤抗原之抗體,尤其選自由抗Her2、抗EGFR、抗CD20、抗CD19及抗CD52組成之群。
第二治療劑之特定實例提供於WO 2018/053106第36-43頁,其揭示內容以引用的方式併入本文中。
組合療法亦依賴於投與人源化抗PD1抗體或其抗體片段與手術、化學療法(例如多烯紫杉醇(docetaxel)或達卡巴嗪(decarbazine))、放射線療法、免疫療法(例如諸如靶向CD40、CTLA-4之抗體)、基因靶向及調節及/或其他藥劑(諸如免疫調節劑、血管生成抑制劑及其任何組合)的組合。
在診斷中之用途
在某些實施例中,本文所提供之抗PD1抗體可用於偵測生物樣品中PD1之存在。如本文所用,術語「偵測」涵蓋定量或定性偵測。在某些實施例中,生物樣品包含細胞或組織,諸如免疫細胞或T細胞浸潤物。
在一態樣中,本發明亦關於一種活體外或離體診斷方法、尤其適用於個體化用藥、更尤其伴隨診斷之診斷方法,其中人源化抗PD-1抗體或其抗原結合片段用於偵測較佳先前自個體獲得之樣品中的PD-1陽性細胞且視情況用於定量PD-1之表現。
本發明進一步提供用於偵測樣品中人類PD-1抗原之存在或量測人類PD-1抗原之量的方法,該方法包含使樣品及對照樣品與根據本發明之人源化抗PD1抗體在允許抗體或其部分與人類PD-1之間形成複合物之條件下接觸。接著偵測複合物之形成,其中樣品與對照樣品相比的複合物形成差異指示樣品中存在人類PD-1抗原。此類方法可為活體外或活體內方法。抗體可為包含如上所述之合適可偵測部分的免疫結合物。此等分析可用於例如評估諸如癌症之疾病的存在及/或進展。
在另一態樣中,本發明亦關於本發明之人源化抗人類PD-1抗體或其抗原結合片段之尤其活體外或離體用途,其用於其中PD-1用作預測個體、尤其癌症個體對治療之反應之生物標記物的方法中。
在一態樣中,本發明亦關於一種尤其用本發明之人源化抗人類PD-1抗體或其抗原結合片段活體外或離體預測癌症個體對治療之反應的方法,該方法包含:
-較佳用連接至可偵測部分的本發明之人源化抗人類PD-1抗體或其抗原結合片段確定較佳先前自個體獲得之腫瘤樣品中的PD-1之表現水準;及
- 將PD-1之表現水準與代表無反應個體群體中之PD-1之表現水準的值比較,
其中個體之腫瘤樣品中之PD-1表現水準較高指示將對治療、較佳使用人源化抗PD1抗體或其抗原結合片段或包含其之醫藥組合物的抗癌療法起反應的個體。
本發明亦提供診斷方法,其中人源化抗PD1抗體或其片段用於選擇適合用人源化抗PD1抗體治療之個體,例如其中PD-1為用於選擇患者之生物標記物或其中PD-1過度表現。
套組
本文所述之抗體或組合物中之任一者可包括在本發明提供之套組中。本發明亦提供用於增強免疫反應及/或治療與PD-1信號傳導相關聯之疾病(例如癌症及病毒性疾病)的套組。
特定言之,根據本發明之套組可包含:
-如本文所述之抗hPD1抗體或其抗原結合片段,
-編碼該抗體之核酸分子或核酸分子組,
-包含該核酸分子或核酸分子組之載體,及/或
-包含該載體、核酸分子或核酸分子組之細胞。
在本發明之上下文中,術語「套組」意謂包裝在容器(container/recipient)或其他中之兩種或更多種組分(其中之一與本發明之人源化抗hPD-1抗體分子、核酸分子、載體或細胞對應)。因此,套組可在合適容器構件中包括本發明之人源化抗PD1抗體及/或宿主細胞,及/或編碼本發明之核酸分子或核酸分子組之載體,及/或本發明之核酸分子或核酸分子組或相關試劑。因此,套組可描述為足以達成某一目標之一組產品及/或用具,其可作為單個單元出售。
在一些實施例中,可提供自個體獲取樣品及/或分析樣品之構件。在某些實施例中,套組包括細胞、緩衝液、細胞培養基、載體、引子、限制酶、鹽等等。該等套組亦可包含用於容納無菌、醫藥學上可接受之緩衝液及/或其他稀釋劑的構件。
容器可為單位劑量、散裝(例如多劑量包裝)或次單位劑量。在一實施例中,本發明係關於如上文關於單劑量投藥單元所定義之套組。本發明之套組亦可含有包含經乾燥/凍乾之抗體的第一容器及包含水性調配物之第二容器。在本發明之某些實施例中,提供含有單室及多室預填充注射器(例如液體注射器及凍乾物注射器)的套組。
本發明之套組呈合適包裝形式。合適包裝包括(但不限於)小瓶、瓶子、罐、可撓性包裝(例如密封Mylar或塑膠袋)及其類似物。亦涵蓋用於與特定裝置,諸如吸入器、經鼻投與裝置(例如霧化器)或輸注裝置(諸如小型泵)組合之包裝。套組可具有無菌進入孔(例如容器可為靜脈內溶液袋或具有皮下注射針可刺穿之塞子的小瓶)。容器亦可具有無菌進入孔(例如容器可為靜脈內溶液袋或具有皮下注射針可刺穿之塞子的小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為如本文所述之人源化抗PD-1抗體或其抗原結合片段。
根據本發明之套組中包含之組合物亦可調配成注射器相容性組合物。在此情況下,容器構件本身可為注射器、滴管及/或其他此類設備,調配物可自其施用於身體之受感染區域,及/或甚至施用於套組之其他組分及/或與套組之其他組分混合。可替代地,套組之組分可呈一或多種乾粉形式提供。當試劑及/或組分係呈乾粉形式提供時,可藉由添加合適溶劑來使粉末復原。設想亦可在另一容器構件中提供該溶劑且適合於投與。
在一些實施例中,套組進一步包括用於治療癌症或感染性疾病之另一種藥劑,且該另一種藥劑可與人源化抗PD1抗體或本發明之套組之其他組分組合,或可分開提供在套組中。特定言之,本文所述之套組可包括一或多種額外治療劑,諸如上文描述之「組合療法」中所述之治療劑。套組可針對個體之特定癌症定製且包含如上所述用於該個體之相應第二癌症療法。
與本文所述之抗體分子或醫藥組合物之使用相關的說明書通常包括關於劑量、給藥時程、預期治療投與途徑、抗體復原方式及/或本發明抗體之稀釋方式的資訊。本發明之套組中供應之說明書通常為在標籤或藥品說明書上之書面說明書(例如套組中所包括之呈小冊子或指導手冊形式的紙張)。在一些實施例中,套組可包含根據本文所述之任一方法的使用說明書。所包括之說明書可包含關於投與包含抗體之醫藥組合物以增強免疫反應及/或治療如本文所述之疾病的描述。套組可進一步包含關於基於確定個體是否患有與PD-1信號傳導相關聯之疾病,例如本文所述之彼等疾病來選擇適合於治療之個體的描述。
實例
提出以下圖及實例以便向所屬領域的一般技術人員提供對如何製備及使用本發明之完整揭示及描述,且不意欲限制本發明者認為係其發明之範疇,亦不意欲表示下文實驗係所進行之所有或唯一實驗。雖然本發明已參考其特定實施例加以描述,但所屬領域的技術人員應瞭解,在不脫離本發明之真實精神及範疇之情況下,可進行各種改變且可用同等物替代。另外,可進行許多修改以使特定情形、材料、物質組合物、製程、一或多個製程步驟適合於本發明之目標、精神及範疇。所有此類修改意欲在此隨附之申請專利範圍之範疇內。
實例
1
:
人類生殖系之
CDR
移植
(
人類構架
)
抗體人源化之第一步為將小鼠抗PD-1 CDR區移植至人類生殖系中。測試三種重鏈人類生殖系(IGHV7-4-1*02、IGHV1-46*01、IGHV3-20*01)及兩種輕鏈生殖系(IGKV2-30*02、IGKV3-11*01)。如表1中所示,生殖系IGHV7-4-1*02重鏈及IGKV2-30*02具有最高人源化%,優於將抗體認定為人源化所需之85%。
表 1 :
T20人源化評分使用截止值人類資料庫確定。http://abAnalyzer.lakepharma.com:一般而言,評分超過85截止值之全長序列視為人類樣。
CDR移植 | IMGT人類生殖系 | 可變區人源化% |
重鏈 | IGHV7-4-1 | 89.8 |
IGHV1-46*01 | 79.6 | |
IGHV3-20*01 | 82.7 | |
輕鏈 | IGKV2-30*02 | 89 |
IGKV3-11*01 | 80 |
重鏈及輕鏈短暫共轉染至黏附COS細胞中。使用夾心ELISA評估COS細胞之上清液中之抗體濃度(使用小鼠抗人類κ+過氧化酶結合之山羊抗小鼠抗體評估固定之驢抗人類Fc抗體,用於偵測及揭露)。使用人類IvIgG標準(ng/ml)計算濃度。如表2中所示,對於生殖系IGHV7-4-1及IGKV2-30*02 (具有最高人源化%之組合),在COS細胞中獲得良好產率,而與生殖系IGHV3-20*01及IGKV3-11*01之組合顯著降低人源化抗PD-1抗體之產率。另外,可注意到其他組合亦展示良好產率。
表 2 :
COS哺乳動物細胞上清液中產生之抗PD1抗體之濃度
(ng/ml) | VH 嵌合 wt | VH IGHV7-4-1 | VH IGHV1-46*01 | VH IGHV3-20*01 |
VL 嵌合 wt | 3459.4 | 1377.2 | 1400.9 | 586.7 |
VL IGKV2-30*02 | 2459.4 | 1959.0 | 2743.2 | 1888.7 |
VL IGKV3-11*01 | 3166.0 | 1713.4 | 2368.7 | 735.0 |
藉由ELISA,對人源化抗PD1變異抗體對人類PD1蛋白之結合進行分析。將重組hPD1 (Sino Biologicals, Beijing, China;參考10377-H08H)於碳酸鹽緩衝液(pH 9.2)中以0.5 µg/ml固定在塑膠上,且添加多種濃度之COS細胞之上清液以量測結合功效。在培育及洗滌之後,添加經過氧化酶標記之驢抗人類IgG (Jackson Immunoresearch;USA;參考709-035-149)且藉由習知方法揭露。
表 3
:ED50測定係指各人源化抗PD1變異抗體在此分析中達到信號50%所需之濃度。由COS細胞產生之未純化之抗PD-1抗體用於此實驗。
ED50 (ng/ml) | VH 嵌合 wt | VH IGHV7-4-1 | VH IGHV1-46*01 | VH IGHV3-20*01 |
VL 嵌合 wt | 6.9 | 7.9 | 6.3 | 9.0 |
VL IGKV2-30*02 | 8.5 | 8.2 | 6.7 | 7.0 |
VL IGKV3-11*01 | 7.4 | 6.4 | 5.1 | 5.7 |
與嵌合抗體(VHwt+VLwt)相比,所有移植CDR之生殖系具有類似之與PD-1之結合,證實PD-1抗體之生物特性(表3)。總而言之,選擇IGHV7-4-1構架及VL-CDR與IGKV2-30*02構架,因為(1)其人源化百分比高,分別為89.8%及89%;(2)與抗體原始序列相比互補序列較高;(3)保留活體外生物活性;及(4)在哺乳動物細胞中產率良好。
人源化之第二步由以下組成:使小鼠來源之CDR序列突變以提高人源化百分比;及移除重鏈及輕鏈中使抗體在製造過程中不穩定之去胺基或糖基化位點。已產生表4中列出之多種突變序列且測試其產生及生物活性。輕鏈序列亦在CDR1中呈現糖基化位點(「NG」序列),其可能在製造過程中損害產物穩定性。為移除此糖基化位點,G29胺基酸代入T胺基酸,產生「LD」鏈(胺基酸位置由Kabat編號確定,與SEQ ID NO: 37中之G34對應)。HCLD抗體雖然為良好候選抗體,但在重鏈之CDR3區中呈現去胺基位點(DS序列)。此序列可在製造過程中損害產物穩定性。為移除此DS序列,藉由取代D105或S106胺基酸,本發明者產生替代序列HE、HG、HH、HI、HJ、HK、HL。
表 4 :
以下實例中使用之人源化抗PD1變異體的胺基酸序列
Seq ID | 名稱 | 胺基酸序列 |
29 | HC | QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTHYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGEPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREREPGM DS WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
30 | HE | QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTHYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGEPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREREPGM DT WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
31 | HG | QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTHYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGEPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREREPGM ES WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
32 | HH | QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTHYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGEPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREREPGM DH WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
33 | HI | QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTHYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGEPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREREPGM DA WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
34 | HJ | QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTHYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGEPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREREPGM DY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
35 | HK | QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTHYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGEPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREREPGM DN WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
36 | HL | QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTHYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGEPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREREPGM DE WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
37 | LC | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHA NG NTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGTHVPNTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
38 | LD | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHA NT NTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGTHVPNTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
實例
2
:
藉由
Blitz
、
ELISA
及流動式細胞測量術對人源化抗
PD1
變異抗體對人類
PD1
蛋白之結合的分析
將重組hPD1 (Sino Biologicals, Beijing, China;參考10377-H08H)於碳酸鹽緩衝液(pH 9.2)中以0.5 µg/ml固定在塑膠上,且添加純化抗體以量測結合。在培育及洗滌之後,添加經過氧化酶標記之驢抗人類IgG (Jackson Immunoresearch;USA;參考709-035-149)且藉由習知方法揭露。
表 5 :
來自圖1A之ED50測定係指各人源化抗PD1變異抗體在此分析中達到信號50%所需之濃度。由HEK細胞產生之未純化之抗PD-1抗體用於此實驗。
表 6
:藉由Blitz量測之抗PD1抗體對人類PD1重組蛋白之親合力分析
表 7
:藉由Biacore量測之抗PD1抗體對人類PD1重組蛋白之親合力分析
表 8 :
來自圖1C之ED50測定係指各人源化抗PD1變異抗體在此分析中達到信號50%所需之濃度。
表 9 : T20 人源化百分比使用截止值人類資料庫確定 :
http://abAnalyzer.lakepharma.com:一般而言,評分超過85之全長序列視為人類樣抗體。
表 10 : T20 人源化百分比使用截止值人類資料庫確定 :
http://abAnalyzer.lakepharma.com:一般而言,評分超過85之全長序列視為人類樣。
ED50 ng/ml | |
嵌合 | 16.79 |
HCLD | 12.66 |
HELD | 19.23 |
HGLD | 14.75 |
HHLD | 16.39 |
HILD | 11.55 |
HJLD | 13.44 |
HKLD | 11.42 |
HLLD | 16.58 |
KD (nM) | Ka (1/Ms) | Kd (1/s) | |
嵌合 | 1.29 | 2.26e5 | 2.91e-4 |
HCLD | 1.34 | 3.19e5 | 4.29e-4 |
HELD | 1.14 | 4.43e5 | 5.07e-4 |
HGLD | 1.28 | 2.74e5 | 3.52e-4 |
HHLD | 0.84 | 4.05e5 | 3.43e-4 |
HILD | 0.93 | 4.58e5 | 4.27e-4 |
HJLD | 1.05 | 4.1e5 | 4.32e-4 |
HKLD | 0.75 | 3.51e5 | 2.62e-4 |
HLLD | 1.25 | 4.41e5 | 5.54e-4 |
Ab | KD (M) | Ka (1/Ms) | Kd (1/s) |
嵌合 | 1.01E -9 | 2.43E 5 | 2.45E -4 |
HKLD | 4.1E -9 | 3.24E 5 | 0.05137 |
KEYTRUDA臨床 | 4.42e -9 | 4.5e 5 | 0.00428 |
pM | |
HGLD | 1543.68523 |
HHLD | 133.273506 |
HILD | 118.262072 |
HJLD | 241.404054 |
HKLD | 187.312713 |
HLLD | 223.473437 |
HELD | 401.699408 |
HCLD | 278.261503 |
嵌合 | 611.914193 |
名稱 | Seq ID | T20 |
VH_ 共同 | 17 | 90.86 |
HC | 18 | 91.28 |
HE | 19 | 91.06 |
HG | 20 | 90.3 |
HH | 21 | 90.94 |
HI | 22 | 91.06 |
HJ | 23 | 91.2 |
HK | 24 | 91.07 |
HL | 25 | 91.28 |
VL_ 共同 | 26 | 89.5 |
LC | 27 | 89.55 |
LD | 28 | 88.7 |
評分T20 | VH | VL |
Keytruda | 75.7 | 82.7 |
HKLD | 91.07 | 88.7 |
結果
:在小鼠抗人類PD1抗體(本文中稱為嵌合抗體)之人源化階段後,與嵌合抗體相比,針對良好的與人類PD1 (重組蛋白以及細胞表面表現之PD1)結合之能力,選擇若干人源化抗PD1變異抗體。圖1(A)及表5展示藉由不同方法,在變異抗體中抗體HKLD具有最佳結合活性,且與嵌合抗體相比,結合得到改善。圖1B證實當抗體與LC輕鏈變異體組合時在人類細胞上此類似之結合能力。表6呈現之親合力量測結果指示在變異抗體中HKLD呈現最佳KD且與嵌合抗體相比,KD得到改善。表7比較嵌合抗體、HKLD及其他PD1抗體(如Keytruda,一種臨床上批准之抗PD-1抗體)之對PD1之親和力量測結果,且展示變異HKLD與Keytruda相比親和力類似。在此實驗中,藉由固定抗Fc抗體來量測抗體之親和力,與使用固定之PD-1及可溶性抗體的Blitz實驗對比,此實驗允許對一價PD-1抗體進行親和力量測。雖然在基於細胞之系統中抗PD-1變異抗體之親和力描繪類似之對PD-1蛋白之親和力/親合力,但本發明者意外地觀測到與抗體之嵌合形式相比,HKLD結合更佳PD-1+ T細胞,如圖1C及表8所示。另一方面,與抗PD-1嵌合形式相比,HGLD變異體失去結合能力。除HGLD之外,本發明者亦展示在人源化過程期間,一些突變誘發PD1結合能力之喪失。圖2 (A至E)展示重鏈可變域上藉由Kabat方法編號為96及97之胺基酸及輕鏈可變域上Kabat編號為28、34、94之胺基酸對於PD1結合能力而言至關重要且因此不應突變。表9呈現重鏈及輕鏈之各選定可變域之人源化程度(T20人源化評分)。T20測定指示選定變異抗體之各可變區的極強人源化評分,尤其88%至91.28%。表10展示人源化抗PD-1 (HKLD變異體)之T20評分優於標準Keytruda,先前所描述且臨床上批准之抗PD-1序列(重鏈75.7%對比91.07%及輕鏈82.7%對比88.7%)。
實例
3
:在哺乳動物
COS
及
CHO
細胞中進行短暫轉染之後的抗體產率
將重鏈及輕鏈短暫共轉染至黏附COS細胞或CHO細胞中。使用夾心ELISA評估COS細胞及CHO細胞之上清液中之抗體濃度(固定之驢抗人類Fc抗體與小鼠抗人類κ+過氧化酶結合之山羊抗小鼠抗體一起用於偵測及揭露)。濃度用人類IvIgG標準確定。產率計算為每公升所收集之培養上清液的純化抗體量。
表 11 :
在哺乳動物細胞(COS及CHO)中產生時之高產量。抗體之人源化形式與嵌合抗體相比產率更高。
表 12 : 在 37 ℃ 下培育 7 天之後抗 PD-1 抗體的穩定性。
抗體在4℃或37℃下培育7天。藉由排除擴散層析法,評估單體形式及聚集體之百分比。第0天用作此等實驗中之陽性對照。
CHO產量(mg/L) | COS產量(mg/L) | |
嵌合 | 4.6 | 1.67 |
HCLD | 9.58 | 7.21 |
HELD | 11.71 | 4.03 |
HGLD | 12.15 | 6.91 |
HHLD | 12.80 | 4.48 |
HILD | 11.41 | 5.81 |
HJLD | 12.67 | 5.80 |
HKLD | 14.08 | 6.35 |
HLLD | 14.35 | 4.85 |
第 0 天 | 在 37 ℃下培育後第 7 天 | |||
單體形式% | 聚集體% | 單體形式% | 聚集體% | |
HCLC | 94.8 | 2.5 | 96.1 | 1.1 |
HCLD | 91.4 | 6.6 | 90.5 | 7 |
HELC | 98.7 | 1.3 | 98.8 | 1.2 |
HELD | 97.2 | 2.1 | 96.4 | 2.4 |
HGLD | 97.45 | 2.55 | 96.57 | 3.43 |
HHLD | 97.32 | 2.68 | 97.82 | 2.18 |
HILD | 96.16 | 3.84 | 96.14 | 3.86 |
HJLD | 97.74 | 2.26 | 98.28 | 1.72 |
HKLD | 96.9 | 3.1 | 97.12 | 2.88 |
HLLD | 96.98 | 3.02 | 96.73 | 3.27 |
結果:
在諸如CHO或COS之哺乳動物細胞中產生不同變異體,且表11中呈現之結果出人意料地顯示在兩種細胞類型中人源化抗PD1變異抗體之產量(mg/L)比嵌合抗體更佳。HKLD呈現最佳產量。在CHO細胞中,此抗體之產量增加3倍,且在COS細胞中,增加幾乎4倍。同時,在活體外評估該等分子之穩定性,如表12中所示,所有變異體在4℃及37℃下均呈現良好穩定性且聚集程度低。彼等結果表明本發明之人源化抗PD1抗體呈現極佳可製造性,此對於臨床研發及治療應用之後續步驟而言係非常重要的。
在使用CHO細胞產生方法之第二實驗中,將HKLD變異體之產率與Keytruda及嵌合抗PD-1抗體之產率相比較。如圖6中所示,本發明者觀測到與嵌合及Keytruda主鏈相比,HKLD變異體之產率增加。在此測試中,以小規模(12孔盤,短暫轉染在黏附細胞上)及在生物反應器(未最佳化之分批補料CHO細胞產生)中測試產率。得到HKLD變異體2 g/L之高產量,證實該抗體在大規模生產製程中具有高產率。
實例 4 : 量測人源化抗 PD1 變異抗體對 PD-PDL1 及 PD1-PDL2 相互作用之拮抗劑活性的競爭分析 :
表 13
:在不同人源化抗PD1變異抗體存在下PD1-PDL1之相互作用之抑制的Blitz測定:量測ka (1/Ms)、kd (1/s)及KD (nM)。
表 14 :
PD-1抗體阻斷PD-L1結合之拮抗劑能力。用不同人源化抗PD1變異抗體測定IC50 (ng/ml),結果由圖4C示出。
KD (nM) | Ka (1/Ms) | Kd (1/s) | |
無抗體 | 1.83 e-7 | 3.68 E4 | 6.71 E-3 |
HCLD | 7.15 E-3 | 10.1 | 7.2 E-2 |
HELD | 5.91 E-3 | 14.9 | 1.04 E4 |
HGLD | 9.8 E-3 | 28.3 | 5.34 E-2 |
HHLD | 8.54 E-3 | 112.2 | 1.04E-1 |
HILD | 1.12 E-3 | 790 | 88.8E-1 |
HJLD | 2.79 E-3 | 65.4 | 5.67 E4 |
HKLD | 4.59 E-3 | 18.8 | 8.62 E-2 |
HLLD | 2.15 E-3 | 99.6 | 2.14 E-1 |
IC50 ng/mL | |
嵌合 | 253.15 |
HCLD | 196.11 |
HELD | 196.43 |
HGLD | 177.57 |
HHLD | 201.4 |
HILD | 175.4 |
HJLD | 193.95 |
HKLD | 205.32 |
HLLD | 155.72 |
使用
DiscoverX
基於細胞之生物分析進行
PD-1
信號傳導分析
利用DiscoverX PathHunter®
Jurkat PD-1 (SHP1)信號傳導分析(參考93-1104C19)評估抗PD-1抗體阻斷PD-1/pSHP-1信號傳導之能力。在此分析中,Jurkat T細胞穩定地表現與β-gal片段融合之嵌合PD-1受體(ED)及與互補β-gal片段融合之經工程改造之SHP1 (EA)。Jurkat細胞與PD-L1呈遞細胞之共培養引起PD-1磷酸化、經工程改造之SHP-1之募集以及ED及EA片段之互補,從而在添加受質之後建立活性β-gal酶及生物發光信號。化學發光與PD-1信號傳導活化成比例。按照製造商建議進行實驗。簡言之,將PD-1+ Jurkat細胞與不同濃度之抗PD-1抗體一起培育1小時,接著與PD-L1+細胞一起再共培養一小時。添加偵測試劑,在使用TecanTM盤式讀取器之後180分鐘讀取發光信號。測試不同濃度下之人源化抗PD1變異抗體。資料以RLU (相對發光信號)表示。IC50 (ng/mL)係指信號抑制達到50%所需之濃度。
表 15 :
PD-1抗體阻斷PD-1介導之抑制信號傳導的拮抗劑能力:測定IC50 (ng/mL),其係指信號抑制達到50%所需之濃度,圖7A。
IC50 ng/mL | |
嵌合 | 16.79 |
HCLD | 12.66 |
HELD | 19.23 |
HGLD | 14.75 |
HHLD | 16.92 |
HILD | 11.55 |
HJLD | 13.44 |
HKLD | 11.42 |
HLLD | 16.58 |
實例
5
:
使用
Promega
基於細胞之生物分析進行細胞活化分析
使用Promega PD-1/PD-L1套組(參考J1250)測試抗PD-1抗體恢復T細胞活化之能力。使用兩種細胞株:(1)效應T細胞(Jurkat,其穩定表現PD-1、NFAT誘發之螢光素酶)及(2)活化目標細胞(CHO K1細胞,其穩定表現PDL1及經設計以按非抗原依賴性方式刺激同源TCR之表面蛋白。當細胞共培養時,PD-L1/PD-1相互作用抑制TCR介導之活化,藉此阻斷NFAT活化及螢光素酶活性。添加抗PD-1抗體可阻斷PD-1介導之抑制信號,引起NFAT活化及螢光素酶合成以及生物發光信號之發射。按照製造商建議進行實驗。測試PD-1抗體之連續稀釋液。在PD-L1+目標細胞、PD-1效應細胞及抗PD-1抗體共培養之後四小時,將BioGloTM螢光素受質添加至孔中且使用TecanTM光度計讀取盤。使用光度計定量之發光反映T細胞活化。測試人源化抗PD1變異抗體之連續稀釋液。EC50 (µg/mL)係指達到最大發光之50%所需之抗體濃度。
表 16 :
抗PD-1抗體在活體外加強T細胞活化:測定EC50 (µg/mL),其係指達到最大發光之50%所需之抗體濃度,圖8。
ED50 ug/mL | |
嵌合 | 0.29 |
HCLD | 0.41 |
HELD | 0.46 |
HGLD | 1.16 |
HHLD | 0.54 |
HILD | 0.40 |
HJLD | 0.90 |
HKLD | 0.69 |
HLLD | 0.89 |
結果:
在量測不同人源化抗PD1變異抗體結合PD1之能力之後,使用不同方法(Biacore、Blitz及ELISA)評估各變異抗體阻斷PD1-PDL1相互作用之抑制能力。圖4A呈現與嵌合抗體對PD1-PDL1相互作用之抑制相比變異體HCLC、HCLD及HELC、HELD抗體之抑制反應。圖4B呈現變異體HCLD、HELD、HGLD、HILD、HJLD、HKLD及HLLD抗體對PDL1與PD1結合之抑制反應。表13展示所有變異抗體之存在均抑制PDL1與PD1之結合。用HCLC及HELC獲得之結果類似於表13中呈現之結果(資料未示出)。圖4C展示不同濃度下人源化抗PD1抗體之競爭功效,從而確定各變異體之IC50 (圖4C及表14)。PD1能夠結合於在細胞表面上表現之另一配位體:PDL2。圖5A及B展示如藉由Biacore分析及拮抗劑PD-L2/PD-1 ELISA所量測,抗PD-1變異抗體HELC、HELD及HKLD亦阻斷PD1-PDL2相互作用。
為證實彼等結果,進行評估SHP1 (來自PD-1路徑之信號傳導蛋白)磷酸化之生物分析。圖7A及B呈現用不同人源化抗PD1變異抗體獲得之關於SHP1磷酸化之抑制劑量反應。表15呈現各變異抗體之IC50,其顯示所有變異體對PD1活化之抑制功效類似。然而,與例如HELD變異體相比,稱為HCLD及HKLD變異體之兩種變異體抑制信號P-SHP1更有效。抑制曲線顯示用接近嵌合主鏈之HCLD及HKLD抑制更佳,而HLLD或HJLD人源化變異體喪失一些拮抗劑能力。同時,使用NFAT生物發光生物分析評估T細胞活化,以比較所有選定人源化抗PD1變異抗體抑制PD1-PDL1相互作用,引起T細胞活化之抑制功效(抑制檢查點相互作用之抑制)。圖8展示所有測試變異體均能夠活化TCR介導之NFAT信號傳導,但效能及功效不同。在平台期獲得之最大RLU信號反映該效能。本發明者觀測到,與例如HELD或HLLD變異體相比,HCLD、HKLD變異體具有更佳效能。此功效係藉由EC50來測定(表16)。嵌合抗體及所有變異體均有效活化NFAT,且HCLD、HILD、HKLD、HHLD、HELD及HKLD變異體最有效活化T細胞。
實例
6
:
人類
T
細胞之
IFNg
分泌
為證實HKLD變異體刺激人類T細胞分泌效應細胞介素之功效,本發明者藉由將樹突狀細胞及同種異體T細胞共培養來進行混合白血球反應分析。如圖9所示,HKLD變異體以劑量依賴型方式增加IFNg細胞介素之分泌。
所有選定人源化抗PD1變異抗體均能夠以至少與嵌合抗體一樣優良之方式抑制PD1與PDL1及PDL2之結合。所有變異體均能夠活化T細胞。在生物分析中,像經由PD1信號傳導之P-SHP1抑制或NFAT活化一般,本發明者觀測到,三種變異體比其他更有效,亦即HCLD、HKLD及HILD。其展現與嵌合結果類似之信號及與其他變異體相比改善之PD1阻斷。與其他變異體相比,HILD及HKLD變異體證明最佳特性,以及在基於哺乳動物細胞之生產系統中高的可製造性及高產量,同時保持其生物活性:對PD-1之高親和力、對PD-L1及PD-L2之拮抗劑能力及恢復T細胞活化之能力(pSH-P-1之抑制、活化NFAT、促進IFNg效應細胞介素分泌)。
實例
7
:
人源化抗
PD1
抗體之活體內功效
在經基因修飾以表現人類PD-1 (外顯子2)之免疫活性小鼠中在多種活體內模型中評估人類抗PD-1抗體之功效。對於間皮瘤模型,胸膜內注射AK7間皮細胞(3e6個細胞/小鼠),接著在第5天/第8天/第12天/第15天用抗PD-1對照或抗PD1人源化抗體(HKLD變異體)以1 mg/kg處理。注射之AK7細胞穩定表現螢光素酶,允許在腹膜內注射D-螢光素(3 µg/小鼠;GoldBio, Saint Louis MO, USA;參考115144-35-9)之後產生活體內生物發光信號。在注射螢光素之後十分鐘,藉由Biospace成像器在小鼠之背側及腹側上量測生物發光信號1分鐘。資料以光子/秒/平方公分/立體角來分析且表示背部及腹部信號之平均值。各組表示每組5至7隻小鼠之平均值+/-SEM。對於MC38模型,將MC38結腸癌細胞以5e5個細胞皮下注射在腰窩中,且用式0.52×(長度×寬度)計算腫瘤體積。當腫瘤達到40-80 mm3
時,用10 mg/kg抗PD1人源化抗體(HKLD變異體)一週處理小鼠3次,歷時3週。對於肝癌原位模型,將2.5e6個Hepa1.6細胞注射至門靜脈中。在腫瘤注射之後第4天/第7天/第11天/第14天/第18天/第21天用3 mg/kg IgG4同型對照或抗PD1人源化抗體(HKLD變異體)處理小鼠。
結果:
圖10展示在用作為陽性對照之對照抗PD1抗體或用人源化抗PD1變異抗體(HKLD)之一處理之後的間皮瘤腫瘤生長,陰性對照藉由用PBS處理動物展示。本發明之人源化抗PD1展示控制腫瘤生長之極佳效能。人源化抗PD1變異抗體(HKLD)可根除AK7間皮瘤腫瘤,如圖10A上所描繪,其中1 mg/kg或3 mg/kg抗體分別為77% (13隻小鼠中之10隻)或100% (7隻小鼠)完全反應(圖10B)。在2種其他小鼠模型中證實活體內功效。在異位MC38結腸癌中,人源化抗PD1變異抗體(HKLD)顯著提高中值存活率且促進50%之完全反應(10隻小鼠中之5隻)(圖11A及B)。類似地,在原位HCC模型中,人源化抗PD1變異抗體(HKLD)提高小鼠存活率及42%完全反應(10隻小鼠中之3隻)(圖12)。
實例
8
:
人源化抗
PD1
抗體在活體內之藥物動力學及藥效學
在食蟹獼猴及小鼠中在單次注射後評估產品之藥物動力學及藥效學。為評估小鼠中之藥物動力學,向BalbcRJ (雌性6-9週齡)經眼眶內或皮下注射單次劑量(5 mg/kg)嵌合形式、人源化抗PD-1抗體(HKLD變異體)或Keytruda抗體。藉由ELISA,使用固定之抗人類輕鏈抗體(純系NaM76-5F3)確定血漿藥物濃度,添加含抗PD-1抗體之稀釋血清。添加經過氧化酶標記之驢抗人類IgG (Jackson Immunoresearch;USA;參考709-035-149),進行偵測,且藉由習知方法揭露。
經靜脈內以1 mg/kg或5 mg/kg向食蟹獼猴注射人源化抗PD1抗體(HKLD變異體)。在多個時間點收集全血及血清,以藉由ELISA定量血清中之抗PD1抗體。猴血清中之抗PD-1抗體,固定PD-1重組蛋白且添加含抗PD-1抗體之稀釋血清。用磺酸基標記之抗人類κ抗體進行偵測,且使用MSD技術揭露。
結果:
圖13A、B及C展示人源化抗PD-1抗體在小鼠及猴中在活體內具有良好藥物動力學概況及線性動力學曲線。在小鼠中,具有IgG1 N298A及IgG4 S228P同型之抗PD-1人源化形式(HKLD)具有與Keytruda (臨床上使用及商業化之抗PD-1抗體)類似的概況。在食蟹獼猴中,觀測到劑量對比暴露之良好相關性,因為與1 mg/kg相比,在5 mg/kg下偵測到血清中較高量之人源化抗PD-1抗體。總而言之,此資料顯示人源化抗PD-1在活體內具有良好藥物動力學概況。
實例
9
:
人源化抗
PD-1
抗體經由阻斷相同細胞上之
PD-1/PD-L1
相互作用而增強巨噬細胞介導之腫瘤細胞吞噬作用
PD-1表現不限於T細胞,例如PD-1亦可在腫瘤相關巨噬細胞上表現。腫瘤細胞上之PD-L1表現可觸發反向抑制信號至巨噬細胞中,阻斷其吞噬細胞效力(Gordon等人, Nature. 2017年5月25;545(7655):495-499)。然而,其未描述PD-1/PD-L1阻斷療法是否可增強PD-L1陰性腫瘤細胞之吞噬作用。因為M1巨噬細胞在其表面上表現兩種受體,所以PD-1及PD-L1可能結合在相同細胞上且觸發陰性調節信號傳導至巨噬細胞中。此處,本發明者證明人源化抗PD-1抗體可經由阻斷相同細胞上PD-1/PD-L1相互作用而恢復巨噬細胞針對PD-L1陰性腫瘤細胞之吞噬細胞功能。
結果:
圖14A展示PD-1及PD-L1在M0、M1巨噬細胞及raji細胞上之表現。僅僅M1巨噬細胞表現PD-1及PD-L1兩種受體,且M0巨噬細胞高度表現PD-1但不表現PD-L1,Raji細胞不表現PD-L1。圖14B展示人源化抗PD-1抗體意外地增強M1-巨噬細胞對PD-L1陰性腫瘤之吞噬作用。與其他抗PD-1抗體(派姆單抗及納武單抗)相比,人源化抗PD-1抗體更有效地促進腫瘤細胞之吞噬(圖14C)。因為在此分析中腫瘤細胞不表現PD-L1且M1巨噬細胞表現PD1及PDL1兩種受體,所以此實驗提出抗人源化抗體可阻斷相同細胞上PD-L1與PD-1之間的相互作用(相互作用引起腫瘤細胞吞噬作用之抑制)。實際上,用不表現PD-L1但表現PD-1受體之M0巨噬細胞進行相同實驗(圖14A)。如圖14D所示,抗PD-1人源化抗體增強M1巨噬細胞之吞噬作用,而其對M0巨噬細胞無作用,此證明人源化抗PD1抗體介導之作用增強需要兩種受體PD-1/PD-L1。此等資料表明抗PD-1人源化抗體中和M1巨噬細胞上之PD-1/PD-L1相互作用,使得腫瘤細胞吞噬作用再活化。
Raji細胞既未表現PD-L2,亦未表現PD-1之其他配位體,如其他地方所描述(Andorsky等人, 2011, DOI: 10.1158/1078-0432),此證實抗人源化抗PD-1抗體可增強PD-L1以及PD-L2陰性腫瘤細胞之吞噬。
雖然公認PD-1-PD-L1阻斷使T細胞再活化,但在此處,本發明者展示抗PD-1抗體經由直接復興巨噬細胞之新特性。其證明人源化抗PD-1抗體可阻斷相同巨噬細胞上PD-1/PD-L1之相互作用,促進PD-L1陰性腫瘤細胞之吞噬。此態樣在臨床中受到特別關注,因為在腫瘤細胞之表面上表現PD-L1之患者可用PD-1/PD-L1療法治療。此處呈現之資料展示甚至PD-L1陰性腫瘤亦可藉由再活化巨噬細胞之吞噬作用而得益於人源化抗PD-1抗體。
材料與方法
結合
PD1
之
ELISA
對於活性ELISA分析,將重組hPD1 (Sino Biologicals, Beijing, China;參考10377-H08H)於碳酸鹽緩衝液(pH 9.2)中以0.5 µg/ml固定在塑膠上,且添加純化抗體以量測結合。在培育及洗滌之後,添加經過氧化酶標記之驢抗人類IgG (Jackson Immunoresearch;USA;參考709-035-149)且藉由習知方法揭露。
藉由細胞螢光測定法對人類刺激
T
細胞上
PD1
結合之分析
藉由抗CD3/CD28刺激活化來自健康志願者之PBMC以刺激T細胞。為量測抗PD1在人類刺激T細胞上之結合,將抗體在4℃下培育30分鐘且洗滌,接著在4℃下用PE標記之抗人類IgG Fc (Biolegend;USA;參考409303)染色30分鐘。在BD LSRII或Canto II細胞螢光測定法上關於CD3+細胞(T細胞)之圈選分析樣品。
藉由
Blitz
方法量測對
PD1
之親合力
使用Blitz方法(Forté Bio;USA;參考C22-2編號61010-1)來量測結合親和力/親合力。將重組hPD1-His (Sino Biologicals, Beijing, China;參考10377-H08H)藉由組胺酸尾以10 µg/ml固定至Ni-NTA生物感測器(Forté Bio;USA;參考18-0029)中,歷時30秒。接著,使抗PD1抗體以20 µg/mL締合120秒。抗PD1抗體在動力學緩衝液中解離120秒。分析資料用Blitz pro 1.2軟體製成,該軟體計算締合常數(ka)及解離常數(kd)且確定親和力常數KD (ka/kd)。
藉由
Biacore
方法量測對
PD1
之親和力
在PP2I平台(Inserm U1194, Université de Montpellier)中藉由Biacore量測親和力。將抗人類Fc抗體(GEHelthcare)以25 µg/ml固定在pH 5乙酸鹽緩衝液中。添加1.25 nM之抗人類PD1抗體(Keytruda、Opdivo、HKLD變異體、嵌合)且重組hPD1-His (Sino Biologicals, Beijing, China;參考10377-H08H)以不同劑量(6.25 nm至 200 nM)締合以計算締合常數(ka)及解離常數(kd)且確定親和力常數KD (ka/kd)。
ELISA
拮抗劑
:
PDL1
或
PDL2
與人源化抗
PD1
之間的競爭
藉由PD-1:PD-L1抑制劑篩選ELISA分析對(AcroBiosystems;USA;參考EP-101)進行競爭ELISA分析。在此分析中,將重組hPDL1於PBS pH 7.4緩衝液中以2 µg/ml固定在塑膠上。在37℃下將純化抗體(不同濃度)與0.66 µg/ml最終(固定濃度)生物素化人類PD1 (AcroBiosystems;USA;參考EP-101)混合2小時以量測競爭性結合。在培育及洗滌之後,添加經過氧化酶標記之抗生蛋白鏈菌素(Vector laboratoring;USA;參考SA-5004)以偵測生物素-PD-1Fc結合且藉由習知方法揭露。對於競爭性ELISA分析PDL-2/PD-1,除PD-L2 (Sinobiological,10292-H02H)代替PD-L1於PBS pH 7.4緩衝液中以2 µg/mL固定在塑膠上外,進行類似方案。
關於與
PDL1
之競爭之
Blitz
方法
:
PD1 + acs + PDL1
此方法係用Blitz (Forté Bio;USA;參考C22-2編號61010-1)進行。將重組hPD1-His (Sino Biologicals, Beijing, China;參考10377-H08H)藉由組胺酸尾以10 µg/ml固定至Ni-NTA生物感測器(Forté Bio;USA;參考18-0029)中,歷時30秒。在第二步中,抗PD1抗體以20 µg/mL (飽和濃度)添加120秒。接著,人類PDL1 (Sino Biologicals, Beijing, China;參考10084-H02H)以100 µg/mL締合,與抗PD1抗體競爭,歷時120秒。PDL1在動力學緩衝液中解離120秒。分析資料用Blitz pro 1.2軟體製成,該軟體計算締合常數(ka)及解離常數(kd)且確定親和力常數KD (ka/kd)。
藉由
Biacore
量測
PDL2
與組合人源化抗
PD1
變異抗體之
PD1
之間的親和力的競爭分析
藉由Biacore評估與抗PD1抗體一起預培育之PD-1重組蛋白(Sino Biologicals, Beijing, China;參考10377-H08H)對人類PD-L2重組蛋白(Sinobiological,10292-H08H-B)的親和力。人類重組PD-L2以200 µg/mL之濃度固定在生物感測器晶片上。接著用1M PH 8.4乙醇胺處理生物感測器晶片10分鐘以使游離位點不活化。添加複合物抗體(200 nM) + 重組人類PD-1 (100 nM)且藉由Biacore量測相對反應。資料計算為相互作用之相對反應之%:100% = PD-1相對反應。
藉由
Blitz
方法對
PDL1
與人源化抗
PD1
變異抗體之間對
PD1
之競爭分析
此方法用Blitz (Forté Bio;USA;參考C22-2編號61010-1)進行。將重組hPD1-His (Sino Biologicals, Beijing, China;參考10377-H08H)藉由組胺酸尾以10 µg/ml固定至Ni-NTA生物感測器(Forté Bio;USA;參考18-0029)中,歷時30秒。在第二步中,PD1與20 µg/mL (飽和濃度)人源化抗PD1變異抗體一起培育120秒。接著,與人源化抗PD1抗體競爭,人類PDL1 (Sino Biologicals, Beijing, China;參考10084-H02H)以100 µg/mL締合,歷時120秒。PDL1在動力學緩衝液中解離120秒。分析資料用Blitz pro 1.2軟體製成,該軟體計算締合常數(ka)及解離常數(kd)且確定親和力常數KD (ka/kd)。
藉由
ELISA
對與不同濃度人源化抗
PD1
變異抗體組合之
PD1
與
PDL1
或
PD-L2
之間的競爭分析
藉由PD-1:PD-L1抑制劑篩選ELISA分析對(AcroBiosystems;USA;參考EP-101)進行競爭ELISA分析。在此分析中,將重組hPDL1於PBS pH 7.4緩衝液中以2 µg/ml固定在塑膠上。在37℃下將純化抗體(不同濃度)與0.66 µg/ml最終(固定濃度)生物素化人類PD1 (AcroBiosystems;USA;參考EP-101)混合2小時以量測競爭性結合。在培育及洗滌之後,添加經過氧化酶標記之抗生蛋白鏈菌素(Vector laboratoring;USA;參考SA-5004)以偵測生物素-PD-1Fc結合且藉由習知方法揭露。
藉由排除擴散層析法進行之穩定性研究
藉由排除擴散層析法進行之穩定性研究用尺寸排阻管柱(GE healthcare;Sweden, Superdex 200 10/300 GL;參考17-5175-01)在AkTA Prime純化系統(GE healthcare;Sweden)上進行。在37℃下或在4℃下培育7天之抗PD1抗體注射在此管柱(體積100 µl)中且用30 ml PBS緩衝液溶離。用PrimeView評估軟體(GE healthcare;Sweden)進行分析以分析聚集體及單體之百分比(單體之滯留時間Tm=11.7-12ml)。
使用
DiscoverX
基於細胞之生物分析進行
PD-1
信號傳導分析
利用DiscoverX PathHunter®
Jurkat PD-1 (SHP1)信號傳導分析(參考93-1104C19)評估抗PD-1抗體阻斷PD-1/pSHP-1信號傳導之能力。在此分析中,Jurkat T細胞穩定地表現與β-gal片段融合之嵌合PD-1受體(ED)及與互補β-gal片段融合之經工程改造之SHP1 (EA)。Jurkat細胞與PD-L1呈遞細胞之共培養引起PD-1磷酸化、經工程改造之SHP-1之募集及ED及EA片段之互補,從而在添加受質之後建立活性β-gal酶及生物發光信號。化學發光與PD-1信號傳導活化成比例。按照製造商建議進行實驗。簡言之,PD-1+ Jurkat細胞與不同濃度之抗PD-1抗體一起培育1小時,接著與PD-L1+細胞一起再共培養一小時。添加偵測試劑,在使用TecanTM
盤式讀取器之後180分鐘讀取發光信號。
使用
Promega
基於細胞之生物分析進行
T
細胞活化分析
使用Promega PD-1/PD-L1套組(參考J1250)測試抗PD-1抗體恢復T細胞活化之能力。使用兩種細胞株:(1)效應T細胞(Jurkat,其穩定表現PD-1、NFAT誘發之螢光素酶)及(2)活化目標細胞(CHO K1細胞,其穩定表現PDL1及經設計以按非抗原依賴性方式刺激同源TCR之表面蛋白。當細胞共培養時,PD-L1/PD-1相互作用抑制TCR介導之活化,藉此阻斷NFAT活化及螢光素酶活性。添加抗PD-1抗體可阻斷PD-1介導之抑制信號,引起NFAT活化及螢光素酶合成以及生物發光信號之發射。按照製造商建議進行實驗。測試PD-1抗體之連續稀釋液。在PD-L1+目標細胞、PD-1效應細胞及抗PD-1抗體共培養之後四小時,將BioGloTM
螢光素受質添加至孔中且使用TecanTM
光度計讀取盤。
活體外混合白細胞反應分析
藉由與20 ng/ml顆粒球-巨噬細胞-群落刺激因子及20 ng/ml IL-4一起培養6天,使樹突狀細胞自分離自人類PBMC (Miltenyi單核球未接觸經典套組分離# 130-117-337)之CD14+單核球分化,且接著以1:10比率與自健康血液供體分離(Miltenyi分離套組,#130-096-533)之同種異體CD4+ T細胞混合。在共培養5天之後,收穫上清液;藉由ELISA定量IFN-γ水準。
活體內人源化
PD1
基因嵌入小鼠模型
在經基因修飾以表現人類PD-1 (外顯子2)之免疫活性小鼠中在原位間皮瘤小鼠模型中活體內評估人類抗PD-1抗體之功效。胸膜內注射AK7間皮細胞(3e6個細胞/小鼠),接著在第5天/第8天/第12天/第15天用抗PD-1對照或抗PD1人源化抗體(HKLD變異體)以1 mg/kg處理。注射之AK7細胞穩定表現螢光素酶,允許在腹膜內注射D-螢光素(3 µg/小鼠;GoldBio, Saint Louis MO, USA;參考115144-35-9)之後產生活體內生物發光信號。在注射螢光素之後十分鐘,藉由Biospace成像器在小鼠之背側及腹側上量測生物發光信號1分鐘。資料以光子/秒/平方公分/立體角來分析且表示背部及腹部信號之平均值。各組表示每組5至7隻小鼠之平均值+/-SEM。對於MC38模型,MC38結腸癌細胞以5e5個細胞皮下注射在左腰窩中。腫瘤體積用式0.52×(長度×寬度)1.5
計算。當腫瘤達到80-100 mm3
時,用10 mg/kg 抗PD1人源化抗體(HKLD變異體)一週處理小鼠3次,歷時3週。對於Hepa1.6肝癌,將2.5e6個Hepa1.6肝癌細胞注射至門靜脈中。在注射腫瘤之後第4天/第7天/第11天/第14天/第18天/第21天用3 mg/kg IgG4同型對照或抗PD1人源化抗體(HKLD變異體)處理小鼠。
人源化抗
PD1
抗體在小鼠及猴中之藥物動力學及藥效學
經靜脈內以1或5 mg/kg向食蟹獼猴注射單劑人源化抗PD1抗體(HKLD變異體)。在多個時間點收集全血及血清,以評估受體佔有率及定量血清中之抗PD1抗體。為評估猴血清中人源化抗PD-1抗體之藥物動力學,將PD-1重組蛋白(人類PD-1-his標籤重組蛋白(Sino Biological,#10377-H08H)固定且稀釋,添加含抗PD-1抗體之血清。添加磺酸基標記之小鼠抗人類κ抗體(純系NaM76-5F3,sulfloTag染色)進行偵測,且藉由MSD Gold讀取緩衝液(MSD # R92TG-2及MESO QUICKPLEX SQ 120讀取器揭露。
為評估小鼠中之藥物動力學,向BalbcRJ (雌性6-9週齡)經眼眶內或皮下注射單次劑量(5 mg/kg)嵌合形式、人源化抗PD-1抗體(HKLD變異體)或Keytruda抗體。藉由ELISA,使用固定之抗人類輕鏈抗體(純系NaM76-5F3)確定血漿藥物濃度,添加含抗PD-1抗體之稀釋血清。添加經過氧化酶標記之驢抗人類IgG (Jackson Immunoresearch;USA;參考709-035-149),進行偵測,且藉由習知方法揭露。
吞噬作用分析
來自健康志願者之人類單核球在活體外在完全RPMI培養基中用M-CSF (100 ng/mL)分化成M0-巨噬細胞,歷時5天。接著M0巨噬細胞與人類IFNg (70 ng/mL)一起培養2天以產生M1-巨噬細胞。將M0/M1-巨噬細胞及Raji細胞株分別用細胞增殖染料eFluor450 (Invitrogen)及細胞增殖染料eFluor670 (Invitrogen)染色。使用超低附著(ULA) 96孔底部圓形盤,將Raji CPDe670+與抗體及利妥昔單抗一起預培育1小時,且以2:1之效應物:目標比率添加M0或M1-巨噬細胞CPDe450+。細胞均培育1或2小時。藉由流動式細胞測量術進行吞噬作用分析,且藉由總CPDe450+細胞中CPDe670+細胞之百分比計算吞噬作用百分比(亦即,雙重陽性細胞(CPDe670+/ CPDe450+)之百分比)。
藉由流動式細胞螢光測定法對人類刺激之
CD3+PBMC
之離體結合之分析
為量測人類周邊T細胞上抗PD1之結合,將抗體在4℃下培育30分鐘,且洗滌,接著在4℃下用PE標記之抗人類IgG Fc (Biolegend;USA;參考409303) + Pacific Blue標記之抗人類CD3 (BD Biosciences純系SP34-2 # 558124)染色30分鐘。在Cytoflex (Beckman Coulter)細胞螢光測定儀上關於CD3+T細胞圈選來分析樣品。
人類
T
細胞之
IFNg
分泌
在混合同種異體白細胞反應中評估人源化抗PD-1刺激IFNg效應細胞介素分泌之能力。單核球來源之樹突狀細胞自CD14+分離之人類周邊血液單核球+GM-CSF及IL-4產生,且與CD4+分離之同種異體人類T細胞(1:10比率)及不同劑量之HKLD變異體或同型對照共培養5天。收穫含有IFNg細胞介素之上清液且藉由ELISA (BD Bioscience,參考555142及555190)給藥。
無
圖 1 : 藉由 ELISA 及 FACS , 不同人源化抗 PD1 變異抗體對人類 PD1 之結合 : A :
不同濃度(ng/ml)抗體之結合的ELISA分析:嵌合抗體(●)及HC (■)、HE (▲)、HG (▼)、HH (◆)、HJ (o)、HI (□)、HK(Δ)至HL (⊕)重鏈變異體與LD輕鏈變異體組合之人源化抗PD1變異抗體。用與過氧化酶偶合之驢抗人類抗體進行偵測且使用TMB受質在450 nm下藉由比色法來揭露。ED50係指在此分析中達到信號之50%所需之濃度。B :
藉由細胞螢光測定法評估CD3/CD28刺激之人類PBMC上的抗體結合。添加HELC (■)、HELD (▼)之連續稀釋液(µg/ml)且使用PE標記之小鼠抗人類Fc mAb及Canto II細胞計數器揭露。資料由PD1+陽性CD3+ T細胞群體中之平均螢光強度(Mean Fluorescence Intensity,MFI)染色表示。C :
藉由細胞螢光測定法評估CD3/CD28刺激之T細胞上的抗體結合。添加人源化抗體之連續稀釋液(µg/ml)且使用PE標記之小鼠抗人類Fc mAb及Canto II細胞計數器揭露。資料由PD1+陽性CD3+ T細胞群體中之平均螢光強度(MFI)染色表示。圖 2 :在人源化過程期間在胺基酸突變之後一些人源化抗 PD1 抗體與人類 PD1 之結合喪失:
在可變重鏈上之如下位置處突變之後人源化抗PD1變異體之ELISA結合:Kabat位置97 (亦即,習知胺基酸位置101),(A) :
其中HC(E97)LB2 (●)及HC(D97)LB2 (□)與嵌合(Δ)相比;Kabat位置R96處,(B) :
其中HELD(●)及HE(K96)LD (□)與嵌合(Δ)相比。(C) 、 (D) 及 (E) :
在可變輕鏈上以下位置處突變之後人源化抗PD1變異體之ELISA結合:Kabat位置N28,(C) :
其中HCLw(N28) (□)及HCLw(Q28) (●)與嵌合(Δ)相比;Kabat位置V94,(D) :
其中Hwt-LA(E34) (■)及HwtLA(N34) (◊)與嵌合(Δ)相比;Kabat位置E34,(E) :
其中HELD(V94)及HELD(L94)與嵌合(Δ)相比。對於重鏈,Kabat位置96與序列位置100相對應且Kabat位置97與序列位置101相對應。對於輕鏈,Kabat位置28與序列位置33相對應,Kabat位置34與序列位置39相對應且Kabat位置94與序列位置99相對應。圖 3 :藉由 ELISA 量測人源化抗 PD1 變異抗體在 4 ℃或 37 ℃下 7 天之後關於結合 PD1 的穩定性。
第0天(●)、在4℃下第7天(◼)及在37℃下第7天(▲)圖 4 :人源化抗 PD1 變異抗體對 PD1-PDL1 相互作用之拮抗劑活性: A :
藉由Biacore量測PDL1與人源化抗PD1變異抗體之間對結合於PD1之競爭。B :
藉由Blitz量測人源化抗體與PDL1之間對PD1之競爭。資料以結合反應百分比表示,其中100%表示在無抗體下PD1/PD-L1相互作用之Ka (相對反應)。C :
藉由ELISA量測各變異抗體之IC50值,研究在遞增濃度之人源化抗PD1變異抗體存在下PD1與PDL1之結合。圖 5 :人源化抗 PD1 變異抗體對 PD1-PDL2 之拮抗劑活性 A.
藉由Biacore量測PDL2與人源化抗PD1變異抗體之間對結合於PD1之競爭;B.
藉由ELISA研究在遞增濃度之人源化抗PD1變異(HKLD)抗體存在下PD1與PDL2之結合。圖 6 :在哺乳動物細胞中與嵌合變異體及 Keytruda 相比人源化抗 PD1 變異抗體之產率較高。
在12孔盤中黏附CHO-K1細胞經編碼Keytruda、HKLD或嵌合抗PD-1抗體之DNA短暫轉染。藉由ELISA,使用(固定之驢抗人類Fc抗體與小鼠抗人類κ+結合過氧化酶之山羊抗小鼠抗體用於偵測及揭露)得到產率。濃度用人類IvIgG標準確定。資料相對於嵌合抗PD-1抗體之產率標準化。圖 7 :關於 SHP1- 磷酸化之生物分析,量測人源化抗 PD1 變異抗體阻斷 PD1 信號傳導之拮抗劑活性:
使用Discoverx生物分析測試PD-1信號傳導。量測之化學發光(RLU:(相對發光信號)與PD-1信號傳導活化成比例。A :
表示比較不同濃度(µg/ml)人源化抗PD1變異抗體與輕鏈之LD變異體的結果。B :
表示比較與重鏈之HE變異體組合的輕鏈之LD及LC變異體(HELC或HELD抗體)的結果。IC50 (ng/mL)係指達到信號抑制之50%所需之濃度。圖 8 :量測在人源化抗 PD1 變異抗體存在下之 T 細胞活化的生物分析。
使用NFAT螢光素酶報導體系統進行Promega PD-1/PD-L1生物分析。測試各人源化抗PD1變異抗體之連續稀釋液。x軸表示抗體濃度,以µg/mL為單位。EC50 (µg/mL)係指達到最大發光之50%所需之抗體濃度。圖 9 :在混合白血球反應分析中在用人源化 PD-1 抗體處理後 T 細胞之 IFNγ 分泌。
在5天期間將單核球衍生之樹突狀細胞與同種異體CD4 T細胞共培養。A.
藉由ELISA定量上清液中之IFNg水準。測試HKLD (黑色■)或IgG4同型對照(灰色●)抗體之劑量反應曲線。資料表示4次獨立實驗。用學生t檢驗計算統計顯著性*p>0.05。圖 10 :在表現 PD-1 之人類形式之間皮瘤小鼠模型中人源化抗 PD-1 變異體之活體內功效。
小鼠經基因修飾以表現人類PD-1之胞外部分,其中PDCD1基因之外顯子2經人類對應物置換(Oxford University Innovation特許)。間皮瘤AK7細胞原位注射至胸腔中且藉由生物發光(光子/秒/平方公分/立體角)量測腫瘤生長(A)
且評估總存活率(B)
。將小鼠用PBS(●)(陰性對照)或抗PD-1人源化形式(HKLD變異體)(▲)或抗PD-1對照(■)處理。圖 11 :在表現 PD-1 之人類形式之異位 MC38 結腸癌小鼠模型中人源化抗 PD-1 變異體之活體內功效。
將MC38皮下注射且小鼠用PBS (灰色●)(陰性對照)或抗PD-1人源化形式(HKLD變異體)(黑色▲)處理且評估腫瘤體積(A)
及總存活率(B)
。圖 12 :肝癌小鼠模型中人源化抗 PD-1 變異體之活體內功效。
Hepa1.6細胞接種至小鼠門靜脈中形成肝癌模型。將小鼠用同型對照IgG4 (灰色●)(陰性對照)或抗PD-1人源化形式(HKLD變異體)(黑色●)處理。評估總存活率。圖 13 :食蟹獼猴及小鼠中在單次注射後人源化 PD-1 抗體之藥物動力學。 A :
Balb/C小鼠靜脈內注射HKLD變異體IgG4 S228P同型(●)或HKLD變異體IgG1 N298A同型(■)或Keytruda (1劑,5 mg/kg)(灰色▲)。B :
Balb/C小鼠靜脈內(■)或皮下(●)注射HKLD變異體IgG4 S228P同型(1劑,5 mg/kg)。C :
食蟹獼猴靜脈內注射1 mg/kg (●)或5 mg/kg (■) HKLD變異體。藉由自製ELISA或使用MSD技術定量血清中之抗PD-1抗體。圖 14 :藉由阻斷 PD-L1/PD-1 在巨噬細胞上負相互作用,人源化抗 PD-1 促進 PD-L1 陰性腫瘤細胞之吞噬。 A.
用於吞噬作用分析之Raji細胞、M0、M1及巨噬細胞之PD-1/PD-L1流動式細胞測量術染色;B.
人源化抗PD-1抗體之活體外吞噬作用分析。將人類M1-巨噬細胞用細胞增殖染料eFluor450染色且在利妥昔單抗(Rituximab)(10 ng/mL)及同型對照或人源化抗PD-1 (HKLD,10 μg/mL)存在下與CPDeFluor670標記之Raji細胞一起培育1小時。資料表示3次獨立實驗之吞噬作用且相對於最大吞噬作用標準化。C.
利用M1巨噬細胞及Raji細胞,在同型對照、人源化抗PD-1、派姆單抗(pembrolizumab)或納武單抗(nivolumab)抗體(10 μg/mL)存在下進行相同吞噬作用分析。D.
在Raji細胞與同型對照、人源化抗PD-1一起培育下M0對比M1巨噬細胞之吞噬作用分析。資料以與同型對照相比吞噬作用之變化倍數表示。
Claims (24)
- 一種人源化單株抗人類-PD-1抗體或其抗原結合片段,其包含: (i) 重鏈可變域,該重鏈可變域包括包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列或由其組成之HCDR1、包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列或由其組成之HCDR2及包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列或由其組成之HCDR3;及 (ii)輕鏈可變域,該輕鏈可變域包括包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列或由其組成之LCDR1、包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列或由其組成之LCDR2及包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列或由其組成之LCDR3, 其中該抗體或其抗原結合片段為人類PD-L1及/或PD-L2與人類PD-1之結合的拮抗劑。
- 如請求項1之人源化單株抗人類-PD-1抗體或其抗原結合片段,其包含:(a)包含選自由SEQ ID NO: 21組成之群之胺基酸序列或由其組成的VH;及(b)包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列或由其組成之VL, 其中該抗體或其抗原結合片段為人類PD-L1及/或PD-L2與人類PD-1之結合的拮抗劑。
- 如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段,其中其包含: (a)重鏈,該重鏈包含選自由SEQ ID NO: 31組成之群之胺基酸序列或由其組成,視情況在SEQ ID NO: 31之除位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106及112以外之任何位置處具有一個、兩個或三個選自取代、添加、刪除及其任何組合之修飾;及 (b)輕鏈,該輕鏈包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列或由其組成,視情況在SEQ ID NO: 34之除位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99及105以外之任何位置處具有一個、兩個或三個選自取代、添加、刪除及其任何組合之修飾。
- 如請求項1至3中任一項之抗體或其抗原結合片段,其中其包含:(a)包含選自由SEQ ID NO: 31組成之群之胺基酸序列或由其組成的重鏈;及(b)包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列或由其組成之輕鏈。
- 如請求項1至3中任一項之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段包含來源於人類κ輕鏈恆定域之輕鏈恆定域及來源於人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定域之重鏈恆定域。
- 如請求項1至3及5中任一項之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段包含來源於人類κ輕鏈恆定域之輕鏈恆定域及來源於人類IgG1重鏈恆定域之重鏈恆定域,視情況具有選自由以下各者組成之群的取代或取代組合:T250Q/M428L;M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F;E233P/L234V/L235A/G236A + A327G/A330S/P331S;E333A;S239D/A330L/I332E;P257I/Q311;K326W/E333S;S239D/I332E/G236A;N297A;L234A/L235A;N297A + M252Y/S254T/T256E;K322A及K444A,較佳選自由以下各者組成之群:N297A,視情況與M252Y/S254T/T256E組合,及L234A/L235A。
- 如請求項1至3及5中任一項之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段包含來源於人類κ輕鏈恆定域之輕鏈恆定域及來源於人類IgG4重鏈恆定域之重鏈恆定域,視情況具有選自由以下各者組成之群的取代或取代組合:S228P;L234A/L235A、S228P+M252Y/S254T/T256E及K444A。
- 如請求項1至7中任一項之抗體或其抗原結合片段,其以等於或低於10-7 M之對人類PD-1之結合親和力常數(KD)特異性結合於人類PD-1,該親和力較佳藉由生物感測器分析來確定。
- 如請求項1至7中任一項之抗體或其抗原結合片段,其具有等於或大於85%、較佳等於或大於88%之人源化(T20)及/或在哺乳動物細胞中具有高產量。
- 一種經分離之核酸分子或經分離之核酸分子組,其編碼如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合片段。
- 一種載體,其包含如請求項10之經分離之核酸分子或經分離之核酸分子組。
- 一種宿主細胞,其包含如請求項9之經分離之核酸分子或經分離之核酸分子組及/或如請求項11之載體。
- 一種用於產生如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合片段之方法,該方法包含培養如請求項12之宿主細胞之步驟且視情況包含分離該抗體或抗原結合片段之步驟。
- 一種醫藥組合物,其包含如請求項1至9中任一項之抗體或其抗原結合片段及/或如請求項10之經分離之核酸分子及/或經分離之核酸分子組及/或如請求項11之載體及/或如請求項12之宿主細胞及醫藥學上可接受之載劑。
- 如請求項14之醫藥組合物,其中其進一步包含另一種治療劑,該另一種治療劑較佳選自由以下各者組成之群:烷基化劑、血管生成抑制劑、抗體、尤其抗腫瘤靶向抗體、抗代謝物、抗有絲***劑、抗增生劑、抗病毒劑、極光激酶抑制劑、細胞凋亡促進劑(例如Bcl-2家族抑制劑)、死亡受體路徑活化劑、Bcr-Abl激酶抑制劑、BiTE (雙特異性T細胞接合分子)抗體、抗體藥物結合物、生物反應調節劑、布魯頓氏酪胺酸激酶(Bruton's tyrosine kinase,BTK)抑制劑、週期蛋白依賴型激酶抑制劑、細胞週期抑制劑、環加氧酶-2抑制劑、DVD、白血病病毒致癌基因同源物(ErbB2)受體抑制劑、生長因子抑制劑、熱休克蛋白(HSP)-90抑制劑、組蛋白去乙醯基酶(HDAC)抑制劑、激素療法、免疫藥物、細胞凋亡蛋白抑制劑(IAP)、嵌入型抗生素、激酶抑制劑、驅動蛋白抑制劑、Jak2抑制劑、哺乳動物雷帕黴素靶蛋白抑制劑、微RNA、有絲***原活化胞外信號調節激酶抑制劑、多價結合蛋白、非類固醇消炎藥(NSAID)、聚ADP (二磷酸腺苷)-核糖聚合酶(PARP)抑制劑、鉑化學治療劑、polo樣激酶(Plk)抑制劑、磷酸肌醇-3激酶(PI3K)抑制劑、蛋白酶體抑制劑、嘌呤類似物、嘧啶類似物、受體酪胺酸激酶抑制劑、類視黃素/類維生素D植物鹼、小抑制核糖核酸(siRNA)、拓樸異構酶抑制劑、泛蛋白連接酶抑制劑、低甲基化劑、檢查點抑制劑、肽疫苗及其類似物、來自腫瘤抗原之抗原決定基或新抗原決定基以及此等藥劑中之一或多者的組合。
- 如請求項1至10中任一項之抗體或其抗原結合片段、如請求項14或15之醫藥組合物、如請求項10之經分離之核酸分子或經分離之核酸分子組、如請求項11之載體或如請求項12之宿主細胞,其用作藥劑。
- 如請求項16之使用之抗體或其抗原結合片段、醫藥組合物、經分離之核酸分子或經分離之核酸分子組、載體或宿主細胞,其用於預防或治療癌症。
- 如請求項17之使用之抗體或其抗原結合片段、醫藥組合物、經分離之核酸分子或經分離之核酸分子組、載體或宿主細胞,其中該癌症係選自由以下各者組成之群:表現PD-1及/或PD-L1之惡性血液病或實體腫瘤,諸如選自由淋巴造血腫瘤、血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤、骨髓增生異常症候群及急性骨髓性白血病組成之群的癌症;由病毒誘發或與免疫缺乏相關聯之癌症,諸如選自由以下各者組成之群的癌症:卡波西氏肉瘤(Kaposi sarcoma)(例如與卡波西氏肉瘤疱疹病毒相關聯);子宮頸、肛門、陰莖及外陰鱗狀細胞癌及口咽癌(例如與人類乳頭狀瘤病毒相關聯);B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL),包括彌漫性大B細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、漿母細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、HHV-8原發性滲出性淋巴瘤、經典霍奇金氏淋巴瘤(classic Hodgkin lymphoma)及淋巴增生病症(例如與艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus,EBV)及/或卡波西氏肉瘤疱疹病毒相關聯);肝細胞癌(例如與B型及/或C型肝炎病毒相關聯);梅克爾細胞癌(Merkel cell carcinoma)(例如與梅克爾細胞多瘤病毒(MPV)相關聯);以及與人類免疫缺乏病毒感染(HIV)相關聯之癌症;及選自由轉移性或非轉移性黑色素瘤、惡性間皮瘤、非小細胞肺癌、腎細胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、頭頸癌、尿道上皮癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、小細胞肺癌、轉移性梅克爾細胞癌、胃癌或胃食道癌及子宮頸癌組成之群的癌症。
- 如請求項17之使用之抗體或其抗原結合片段、醫藥組合物、經分離之核酸分子或經分離之核酸分子組、載體或宿主細胞,其中該癌症具有PD-L1陰性腫瘤細胞。
- 如請求項16至19中任一項之使用之抗體或其抗原結合片段、醫藥組合物、經分離之核酸分子或經分離之核酸分子組、載體或宿主細胞,其與放射線療法或另一種治療劑組合使用,該另一種治療劑較佳選自由以下各者組成之群:烷基化劑、血管生成抑制劑、抗體、尤其抗腫瘤靶向抗體、抗代謝物、抗有絲***劑、抗增生劑、抗病毒劑、極光激酶抑制劑、細胞凋亡促進劑(例如Bcl-2家族抑制劑)、死亡受體路徑活化劑、Bcr-Abl激酶抑制劑、BiTE (雙特異性T細胞接合分子)抗體、抗體藥物結合物、生物反應調節劑、布魯頓氏酪胺酸激酶(BTK)抑制劑、週期蛋白依賴型激酶抑制劑、細胞週期抑制劑、環加氧酶-2抑制劑、DVD、白血病病毒致癌基因同源物(ErbB2)受體抑制劑、生長因子抑制劑、熱休克蛋白(HSP)-90抑制劑、組蛋白去乙醯基酶(HDAC)抑制劑、激素療法、免疫藥物、細胞凋亡蛋白抑制劑(IAP)、嵌入型抗生素、激酶抑制劑、驅動蛋白抑制劑、Jak2抑制劑、哺乳動物雷帕黴素靶蛋白抑制劑、微RNA、有絲***原活化胞外信號調節激酶抑制劑、多價結合蛋白、非類固醇消炎藥(NSAID)、聚ADP (二磷酸腺苷)-核糖聚合酶(PARP)抑制劑、鉑化學治療劑、polo樣激酶(Plk)抑制劑、磷酸肌醇-3激酶(PI3K)抑制劑、蛋白酶體抑制劑、嘌呤類似物、嘧啶類似物、受體酪胺酸激酶抑制劑、類視黃素/類維生素D植物鹼、小抑制核糖核酸(siRNA)、拓樸異構酶抑制劑、泛蛋白連接酶抑制劑、低甲基化劑、檢查點抑制劑、肽疫苗及其類似物、來自腫瘤抗原之抗原決定基或新抗原決定基以及此等藥劑中之一或多者的組合。
- 如請求項16之使用之抗體或其抗原結合片段、醫藥組合物、經分離之核酸分子或經分離之核酸分子組、載體或宿主細胞,其用於預防或治療感染性疾病,較佳慢性感染性疾病,甚至更佳由選自由以下各者組成之群之病毒引起的感染性疾病:HIV、肝炎病毒、疱疹病毒、腺病毒、流感病毒、黃病毒、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒、科沙奇病毒(coxsackie virus)、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、細小病毒、痘瘡病毒、HTLV病毒、登革熱病毒(dengue virus)、乳頭狀瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰白質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒及蟲媒病毒性腦炎病毒。
- 如請求項16之使用之抗體或其抗原結合片段、醫藥組合物、經分離之核酸分子或經分離之核酸分子組、載體或宿主細胞,其用於預防或治療患有淋巴球減少症之患者。
- 如請求項16至22中任一項之使用之抗體或其抗原結合片段、醫藥組合物、經分離之核酸分子或經分離之核酸分子組、載體或宿主細胞,其中該待治療之個體係免疫抑制、免疫功能不全或免疫功能低下的。
- 如請求項16至22中任一項之使用之抗體或其抗原結合片段、醫藥組合物、經分離之核酸分子或經分離之核酸分子組、載體或宿主細胞,其中該個體具有高的突變負荷及新抗原密度。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP18306801 | 2018-12-21 | ||
EPEP18306801.4 | 2018-12-21 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW202037608A true TW202037608A (zh) | 2020-10-16 |
Family
ID=65628503
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW108146725A TW202037608A (zh) | 2018-12-21 | 2019-12-19 | 人源化抗人類-pd-1抗體 |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11352430B2 (zh) |
EP (2) | EP4257199A3 (zh) |
JP (2) | JP7043685B2 (zh) |
KR (2) | KR20220032646A (zh) |
CN (2) | CN116063513A (zh) |
AR (1) | AR117465A1 (zh) |
AU (1) | AU2019406452B2 (zh) |
BR (1) | BR112021011982A2 (zh) |
CA (1) | CA3122526C (zh) |
CL (1) | CL2021001628A1 (zh) |
CO (1) | CO2021007956A2 (zh) |
DK (1) | DK3883966T3 (zh) |
EA (1) | EA202191751A1 (zh) |
ES (1) | ES2963700T3 (zh) |
IL (2) | IL296038A (zh) |
MX (1) | MX2021007290A (zh) |
SG (1) | SG11202106347PA (zh) |
TW (1) | TW202037608A (zh) |
WO (2) | WO2020127366A1 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI833242B (zh) * | 2021-06-11 | 2024-02-21 | 大陸商廣東菲鵬製藥股份有限公司 | 抗pd-1人源化抗體或其抗原結合片段、編碼其的核酸、包含其的載體、細胞和藥物組合物及其用途 |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2022514702A (ja) * | 2018-12-21 | 2022-02-14 | オーエスイー・イミュノセラピューティクス | 二機能性抗pd-1/il-7分子 |
AU2020406083A1 (en) | 2019-12-17 | 2022-06-16 | Ose Immunotherapeutics | Bifunctional molecules comprising an IL-7 variant |
KR20230129441A (ko) | 2020-12-17 | 2023-09-08 | 오제 이뮈노테라프틱스 | 이기능성 항-pd1/il-7 분자 |
CN114763384B (zh) * | 2021-01-14 | 2023-03-17 | 立凌生物制药(苏州)有限公司 | 靶向pd-1的单域抗体及其衍生物和用途 |
IL307419A (en) | 2021-04-09 | 2023-12-01 | Ose Immunotherapeutics | A new scaffold for bifunctional molecules with improved properties |
EP4320156A1 (en) | 2021-04-09 | 2024-02-14 | Ose Immunotherapeutics | Scaffold for bifunctioanl molecules comprising pd-1 or cd28 and sirp binding domains |
CN115521379B (zh) * | 2021-07-16 | 2023-12-22 | 南京吉盛澳玛生物医药有限公司 | Pd-1抗体及其用途 |
CN115521378B (zh) * | 2021-07-23 | 2023-12-22 | 南京吉盛澳玛生物医药有限公司 | Pd-l1抗体及其用途 |
WO2024028386A1 (en) | 2022-08-02 | 2024-02-08 | Ose Immunotherapeutics | Multifunctional molecule directed against cd28 |
WO2024077069A1 (en) * | 2022-10-05 | 2024-04-11 | Chulalongkorn University | Monoclonal antibodies against human programmed cell death protein 1 (pd-1) |
Family Cites Families (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5354844A (en) | 1989-03-16 | 1994-10-11 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Protein-polycation conjugates |
US5108921A (en) | 1989-04-03 | 1992-04-28 | Purdue Research Foundation | Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules |
US5208020A (en) | 1989-10-25 | 1993-05-04 | Immunogen Inc. | Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use |
US5275285A (en) | 1992-12-30 | 1994-01-04 | Clegg Industries | Business card holder with sound generating microchip |
EP1252192B1 (en) | 2000-02-11 | 2006-08-16 | MERCK PATENT GmbH | Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins |
DK1366067T3 (da) | 2001-03-07 | 2012-10-22 | Merck Patent Gmbh | Ekspressionsteknologi for proteiner indeholdende en hybrid isotype-antistof-enhed |
US9498532B2 (en) | 2013-03-13 | 2016-11-22 | Novartis Ag | Antibody drug conjugates |
EP2992017B1 (en) * | 2013-05-02 | 2020-11-18 | AnaptysBio, Inc. | Antibodies directed against programmed death-1 (pd-1) |
WO2015161311A2 (en) | 2014-04-18 | 2015-10-22 | The Research Foundation For The State University Of New York | Humanized anti-tf-antigen antibodies |
CN105330740B (zh) * | 2014-07-30 | 2018-08-17 | 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 | 抗pd-1抗体及其应用 |
SI3368572T1 (sl) | 2015-10-02 | 2022-10-28 | Symphogen A/S | Protitelesa proti PD-1 in sestavki |
WO2017127664A1 (en) | 2016-01-20 | 2017-07-27 | The Scripps Research Institute | Ror1 antibody compositions and related methods |
MX2019002946A (es) | 2016-09-14 | 2019-09-26 | Abbvie Biotherapeutics Inc | Anticuerpos anti-pd-1 y sus usos. |
US11890319B2 (en) | 2017-01-18 | 2024-02-06 | Visterra, Inc. | Antibody molecule-drug conjugates and uses thereof |
US10851164B2 (en) | 2017-04-13 | 2020-12-01 | Aduro Biotech Holdings, Europe B.V. | Anti-SIRPα antibodies |
WO2019060750A2 (en) | 2017-09-23 | 2019-03-28 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | A33 ANTIBODY COMPOSITIONS AND METHODS OF USE IN RADIOIMMUNOTHERAPY |
CN111902426A (zh) | 2018-03-05 | 2020-11-06 | 法国血液机构 | 重组单链免疫球蛋白 |
BR112021012027A2 (pt) | 2018-12-21 | 2021-11-03 | Ose Immunotherapeutics | Molécula bifuncional direcionada contra pd-1 humano |
JP2022514702A (ja) | 2018-12-21 | 2022-02-14 | オーエスイー・イミュノセラピューティクス | 二機能性抗pd-1/il-7分子 |
WO2020127373A1 (en) | 2018-12-21 | 2020-06-25 | Ose Immunotherapeutics | Bifunctional anti-pd-1/sirpa molecule |
-
2019
- 2019-12-17 US US17/414,967 patent/US11352430B2/en active Active
- 2019-12-17 SG SG11202106347PA patent/SG11202106347PA/en unknown
- 2019-12-17 WO PCT/EP2019/085776 patent/WO2020127366A1/en active Search and Examination
- 2019-12-17 KR KR1020227007041A patent/KR20220032646A/ko active Application Filing
- 2019-12-17 ES ES19829506T patent/ES2963700T3/es active Active
- 2019-12-17 EA EA202191751A patent/EA202191751A1/ru unknown
- 2019-12-17 BR BR112021011982-5A patent/BR112021011982A2/pt unknown
- 2019-12-17 JP JP2021536204A patent/JP7043685B2/ja active Active
- 2019-12-17 CN CN202211259346.4A patent/CN116063513A/zh active Pending
- 2019-12-17 EP EP23184389.7A patent/EP4257199A3/en active Pending
- 2019-12-17 DK DK19829506.5T patent/DK3883966T3/da active
- 2019-12-17 CA CA3122526A patent/CA3122526C/en active Active
- 2019-12-17 KR KR1020217022357A patent/KR102371173B1/ko active IP Right Grant
- 2019-12-17 AU AU2019406452A patent/AU2019406452B2/en active Active
- 2019-12-17 EP EP19829506.5A patent/EP3883966B1/en active Active
- 2019-12-17 MX MX2021007290A patent/MX2021007290A/es unknown
- 2019-12-17 IL IL296038A patent/IL296038A/en unknown
- 2019-12-17 WO PCT/EP2019/085779 patent/WO2020127367A1/en active Application Filing
- 2019-12-17 CN CN201980092699.XA patent/CN113557245B/zh active Active
- 2019-12-19 AR ARP190103789A patent/AR117465A1/es unknown
- 2019-12-19 TW TW108146725A patent/TW202037608A/zh unknown
-
2021
- 2021-06-08 IL IL283812A patent/IL283812B2/en unknown
- 2021-06-17 CL CL2021001628A patent/CL2021001628A1/es unknown
- 2021-06-17 CO CONC2021/0007956A patent/CO2021007956A2/es unknown
-
2022
- 2022-03-15 JP JP2022040264A patent/JP7404423B2/ja active Active
- 2022-06-02 US US17/830,381 patent/US20220332826A1/en active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI833242B (zh) * | 2021-06-11 | 2024-02-21 | 大陸商廣東菲鵬製藥股份有限公司 | 抗pd-1人源化抗體或其抗原結合片段、編碼其的核酸、包含其的載體、細胞和藥物組合物及其用途 |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7404423B2 (ja) | ヒト化抗ヒトpd-1抗体 | |
CN113573782A (zh) | 针对人pd-1的双功能分子 | |
US20230071889A1 (en) | Bifunctional anti-pd-1/il-7 molecule | |
US20220056135A1 (en) | Bifunctional anti-pd-1/sirpa molecule | |
RU2779489C2 (ru) | Антитела, связывающие cd3 | |
RU2790288C2 (ru) | Антитела, связывающие cd3 | |
WO2022214652A1 (en) | Scaffold for bifunctioanl molecules comprising pd-1 or cd28 and sirp binding domains |