TW202033538A

TW202033538A - 非洲豬瘟病毒疫苗

Info

Publication number: TW202033538A
Application number: TW108133648A
Authority: TW
Inventors: 佩卓斯ＴＪ威廉辛; 伯納德斯ＰＨ皮特斯
Original assignee: 瓦赫寧恩研究基金會
Priority date: 2018-09-18
Filing date: 2019-09-18
Publication date: 2020-09-16
Also published as: EP3852798A2; CO2021004188A2; PH12021550580A1; ZA202101615B; TWI777093B; MX2021003175A; JP2022500050A; CN110904127A; CA3112800A1; KR20210065128A; WO2020060403A3; BR112021005079A2; US20220047694A1; WO2020060403A2; CL2021000636A1; AU2019345214A1

Abstract

本發明涉及非洲豬瘟病毒疫苗。具體而言，本發明涉及一種重組核酸分子，其包含編碼包含來自非洲豬瘟病毒蛋白的T細胞抗原的多表位的表達盒。本發明進一步涉及包含所述重組核酸分子的病毒顆粒，並涉及包含非洲豬瘟病毒的B細胞抗原的病毒顆粒。本發明進一步涉及刺激豬的免疫反應的方法，包括向所述豬以有效誘導免疫反應的量給予本發明的重組分子和/或本發明的病毒顆粒。

Description

非洲豬瘟病毒疫苗

發明領域本發明涉及病毒領域，更具體而言，涉及非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）領域。本發明涉及產生免受ASFV感染的疫苗的方法，並涉及這種疫苗在豬中預防或改善（減輕，ameliorate）非洲豬瘟病毒感染和/或傳播的用途。

發明背景非洲豬瘟（ASF）是一種只有豬和野豬易感的病毒性疾病。初次感染後，症狀可能需要2至10天才會出現。根據病毒的致病性，30%至100%的受感染動物都會死亡。常見症狀包括：食欲不振、虛弱、皮膚發紅、眼黏膜發炎、嘔吐、出血性腹瀉和發燒。此外，皮膚可能會變成藍色，一些區域的皮膚可能會死亡（黑色斑點（black stains））並且可能會出現出血。此外，疾病能夠導致懷孕母豬自發流產。也可能發生突然死亡，沒有任何先兆性明顯症狀。ASF的症狀類似於經典的豬瘟。

豬能夠在急性期存活並且看上去已經恢復正常，然而卻轉變成病毒的長期攜帶者（從幾個月到整個生命週期），由此再次***病毒並感染其他動物。

病毒直接地由動物向動物以及間接地通過諸如糞便、豬肉和其他豬產品的污染物質，蒼蠅和蜱蟲叮咬（特別是經由一種繁殖病毒的軟蜱—非洲鈍緣蜱（Ornithodoros moubata））進行傳播。來自受感染豬的廚餘垃圾或內臟也可能攜帶有助於病毒傳播的ASF。例如，正在努力採取國際措施和保持對養豬場的警惕，以防止疾病進一步傳播。自2007年以來，東歐、中國和***已經爆發了幾次ASF。ASF最近在比利時的野豬種群中也被診斷出來。

ASF由屬於非洲豬瘟病毒科（Asfarviridae）家族的大型雙鏈DNA病毒引起。DNA基因組表現出長度從160到210kbp（取決於分離物）的顯著變化。基因組包含150至167個開放閱讀框，具體指定了ASFV顆粒的54種結構蛋白和超過100種感染蛋白[Dixon et al., 2013. Virus Res 173: 3–14]。迄今為止已確定出8個血清群，命名為血清群1-8，但很可能存在更多種。病毒的複雜性和可變性使得產生預防ASF感染的疫苗變得複雜。已經使用了幾種不同的方法，包括滅活疫苗、亞單位疫苗、減毒活疫苗和重組減毒活疫苗[Arias et al., 2017. Vaccines 5, 35；doi:10.3390/vaccines5040035]。

據發現，滅活疫苗即使在佐劑存在下也不提供保護[Stone et al., 1967. Am J Vet Res 28: 475-481；Blome et al., 2014. Vaccine 32: 3879-3882]。

亞單位疫苗未提供或僅提供部分保護。這可能部分是由於大量編碼的蛋白（約160種）和選擇相關蛋白的困難。此外，大量ASFV蛋白的序列與已知蛋白並不相似[Dunigan et al., 2006. Virus Research 117: 119-132]，使其難以預測這些蛋白的功能。

減毒活疫苗獲自毒力株（毒性菌株）或天然低毒力株如OURT88/3[Boinas et al., 2004. J Gen Virol 85: 2177-2187]和NH/68[Gil et al., 2008. Arch Virol 153: 1845-1854]。這些減毒活疫苗通常提供高達100%的針對同源菌株的保護，但針對異源菌株僅提供部分交叉保護。此外，它們常常會引起不可接受的副作用如肺炎、運動紊亂、壞死病灶、流產甚至死亡[Sánchez-Cordón et al., 2018. Vet J 233: 41–48；Arias et al., 2017. Vaccines 5, 35；doi:10.3390/vaccines5040035]。

最近已經用重組減毒活疫苗獲得了最有希望的結果，在這種疫苗中引入了基因缺失（基因刪除）或基因缺失的組合而達到可接受的安全性和功效水準。已經觀察到對某些分離株的保護作用，但是要與不同水準的殘餘毒力組合，這顯然取決於所使用的各個菌株[Sánchez-Cordón et al., 2018. Vet J 233: 41–48；Arias et al., 2017. Vaccines 5, 35；doi:10.3390/vaccines5040035]。這些缺失突變體的長期遺傳穩定性是未知的，因為長期遺傳穩定性是現場條件（field conditions）下的更大試驗的結果。

因此，需要提供一種有效且安全並且針對大量不同ASFV毒株感染提供保護的疫苗。

發明概要因此，本發明提供了一種重組核酸分子，優選重組DNA分子，其包含編碼含有來自非洲豬瘟病毒蛋白的T細胞抗原的多表位的表達盒，其中所述T細胞抗原通過含有蛋白酶體切割信號的間隔子、優選地通過1-10個氨基酸殘基的間隔子分隔開。所述多表位優選包含2-50個作為T細胞抗原的肽。所述多表位優選包含2-50個作為T細胞抗原的九肽，優選地為如表1中所描述的九肽 1-13及15-20，該九肽通過約1-5個氨基酸殘基的間隔子分開，優選如表2中所描述的間隔子序列 1-11。

本發明的重組分子可以進一步編碼通用T細胞表位。本發明的所述重組分子可以優選在多表位的5'末端進一步包含針對泛素的核苷酸序列。

本發明進一步提供了一種包含本發明的重組分子的病毒顆粒。所述病毒顆粒可以進一步包含標記蛋白。

本發明進一步提供了一種刺激豬免疫反應的方法，包括給予本發明的重組分子和/或本發明的病毒顆粒。所述的給予優選地為與包含非洲豬瘟病毒的B細胞抗原的病毒顆粒進行組合，所述B細胞抗原優先選自非洲豬瘟病毒的蛋白p30、p54、p72、EP402R、A104R和/或B602L，以有效誘導免疫反應的量給予豬。所述重組分子優選腸胃外給予，優選肌肉內和/或皮內給予，優選通過免疫電穿孔給予。所述重組分子和/或病毒顆粒優選給予2-4次，優選間隔約2周。優選重組核酸分子和/或病毒顆粒的至少一次給予與來自非洲豬瘟病毒蛋白的合成T細胞抗原的給予進行組合。重組分子和/或病毒顆粒的至少一次重複給予與包含非洲豬瘟病毒的B細胞抗原（優先選自非洲豬瘟病毒的蛋白p30、p54、p72、EP402R、A104R和/或B602L）的病毒顆粒的給予進行組合。

本發明進一步提供了一種包含本發明的重組核酸分子和/或本發明的病毒顆粒和獸醫學上可接受的賦形劑的組合物。

本發明進一步提供了一種疫苗，其包含有效免疫量的含有本發明的重組分子和/或本發明的病毒顆粒的組合物，以及獸醫學上可接受的賦形劑。

本發明進一步提供了一種預防或改善在豬中非洲豬瘟病毒感染和/或傳播的方法，包括向至少一隻豬給予本發明的重組分子和/或本發明的病毒顆粒。所述重組分子和/或病毒顆粒的給予優選地與包含非洲豬瘟病毒的B細胞抗原的病毒顆粒的給予進行組合，所述B細胞抗原優先選自非洲豬瘟病毒的蛋白p30、p54、p72、EP402R、A104R和/或B602L。

本發明進一步提供了一種病毒顆粒，包含非洲豬瘟病毒的B細胞抗原，優先選自非洲豬瘟病毒的蛋白p30、p54、p72、EP402R、A104R和/或B602L。

本發明進一步提供了一種病毒顆粒組以及試劑盒（kit of parts），包括非洲豬瘟病毒的B細胞抗原，優先選自非洲豬瘟病毒的蛋白p30、p54、p72、EP402R、A104R和/或B602L。

本發明進一步提供了一種病毒顆粒組，包括含有如請求項1-5中任一項的重組分子的病毒顆粒，及一種或多種包含非洲豬瘟病毒的B細胞抗原的病毒顆粒，所述B細胞抗原優先選自非洲豬瘟病毒的蛋白p30、p54、p72、EP402R、A104R和/或B602L。

本發明進一步提供了一種試劑盒，包括含有本發明的重組分子的病毒顆粒和一種或多種包含非洲豬瘟病毒的B細胞抗原（優先選自非洲豬瘟病毒的蛋白p30、p54、p72、EP402R、A104R和/或B602L）的病毒顆粒。

本發明進一步提供了一種包括含有本發明的重組分子和來自非洲豬瘟病毒蛋白的合成T細胞抗原的病毒顆粒的試劑盒。

本發明進一步提供了一種包含非洲豬瘟病毒的B細胞抗原的病毒顆粒或包含非洲豬瘟病毒的B細胞抗原的病毒顆粒組，用於在保護豬免於後續感染非洲豬瘟的方法中使用。

具體實施方式 4.1定義

正如本文所用，術語“T細胞表位”或“T細胞抗原”是指抗原在經細胞內處理後能夠被免疫系統識別的表位。在處理後，T細胞表位會與至少一個MHC分子結合，並在抗原呈遞細胞的表面上表達為MHC-肽複合物。由MHC I類分子呈遞的T細胞表位的長度通常為8至11個氨基酸，而MHC II類分子可以遞呈長度約12-25個氨基酸，優選地約13-17個氨基酸的肽。軟體程式能夠基於例如，蛋白的兩親性譜、序列基序、定量矩陣、人工神經網路、支援向量機、定量結構活性關係和分子對接模擬來預測蛋白中潛在T細胞表位[Desai and Kulkarni-Kale, 2014. Methods Mol Biol 1184: 333-64]。這些程式包括IEDB Analysis Resource、ELISpot（PepScan, Lelystad, the Netherlands）、RANKPEP [Reche et al., 2004. Immunogenetics 56: 405-19]、nHLAPred [Bhasin and Raghava, 2007. J Biosci 32: 31-42]、和NetMHC [Lundegaard et al., 2008. Nucleic Acids Res 36: W509-12]。

優選的T細胞表位或T細胞抗原(如本申請案所使用之術語)為MHC I類表位，也稱為胞毒型T細胞表位，包含8-11個氨基酸殘基，優選地約9個氨基酸殘基。

正如本文所用，術語“多表位”是指具有諸如T細胞表位(優選MHC I類表位)的多個表位的生物分子，優選肽或蛋白。各個表位優選通過連接子序列分隔開。所述連接子序列允許靈活性並且可以參與將多表位處理成各個表位。

正如本文所用，術語“表達盒”是指提供存在於所述盒中的一個或多個開放閱讀框的表達的核酸分子。表達盒優選包含啟動子序列、至少一個開放閱讀框和優選包含多腺苷酸化信號的3'非翻譯區。表達盒可以進一步包含增強子序列、一種或多種轉錄後調節元件和/或一種或多種內含子序列。為了在真核細胞中表達，轉錄後調控元件和/或一個或多個內含子序列可以增強表達盒的轉錄產物，即信使RNA的核輸出，以允許RNA在細胞質中翻譯。優選所述表達盒優化為用於在豬中表達。

正如本文所用，術語“肽”是指包含2-50個氨基酸殘基的蛋白樣（蛋白類，proteinaceous）分子。在將蛋白加工成單獨的肽之前，肽可以存在於較大的蛋白中。

正如本文所用，術語“蛋白”是指包含超過50個氨基酸殘基的蛋白質分子。

正如本文所用，術語“九肽”是指包含九個氨基酸殘基的肽。

正如本文所用，術語“間隔子”是指存在於多表位的各個表位之間並且允許靈活性和允許通過蛋白酶體加工表位和通過MHC呈遞各個表位的小肽，優選1-10個氨基酸殘基，更優選1-5個氨基酸殘基。合適的間隔子的氨基酸序列提供於，例如，US 20130011424和文獻Toes et al., 2001. J Exp Med 194: 1-12中，其結合於本文中作為參考。

正如本文所用，術語“通用T細胞表位”是指由許多不同MHC分子結合和展示並因此被認為活化許多個體的免疫系統的肽序列。所述通用T細胞表位優選地為MHC II類表位，也稱為T輔助細胞表位。

正如本文所用，術語“針對泛素的核苷酸序列”是指編碼泛素的核苷酸分子。泛素是一種76個氨基酸的蛋白，其序列在從無脊椎動物到哺乳動物的整個進化過程中高度保守。泛素參與ATP依賴性非溶酶體蛋白水解。所述核苷酸序列優選表達氨基酸序列NMQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRG。

正如本文所用，術語“病毒顆粒”是指被減毒而不能自主傳播的感染性病毒顆粒或病毒樣顆粒。病毒顆粒的基因組優選包含與所述顆粒從感染的細胞中脫落（shedding）相關的基因缺失。所述基因的缺失向編碼例如重組DNA分子的外源基因（包括編碼根據本發明的B細胞表位和/或T細胞表位的表達盒）的***提供了空間。

正如本文所用，術語“豬”是指偶蹄目動物的豬科（Suidae ）家族中的動物。豬這一術語包括家豬和其祖先，常見的為歐亞野豬（Sus scrofa）、巴拉望鬍鬚豬（Palawan bearded pig）、波爾尼亞鬍鬚豬（Bornean bearded pig）、海德豬（Heude’s pig）或越南疣豬、米沙鄢疣豬（Visayan warty pig）、西裡伯斯疣豬（Celebes warty pig）、弗洛雷斯疣豬（Flores warty pig）、敏多羅疣豬（Mindoro warty pig）、菲律賓疣豬（Philippine warty pig）、爪哇疣豬（Java warty pig）、豬鹿（babirusa）和疣豬（warthog）。

正如本文所用，術語“有效量”是指根據本發明的重組分子和/或根據本發明的一種或多種病毒顆粒對豬被非洲豬瘟病毒後續感染產生影響的量。 4.2 重組核酸分子

本發明提供了一種重組核酸分子，其包含編碼包含來自非洲豬瘟病毒蛋白的T細胞抗原的多表位的表達盒，其中所述T細胞抗原通過含有蛋白酶體切割信號的間隔子、優選地通過1-10個氨基酸殘基的間隔子分隔開。

核酸分子（優選RNA或DNA）優選通過重組技術（包括使用聚合酶、限制酶和連接酶）生產，這正如本領域技術人員所知。或者，所述核酸通過人工基因合成，例如，通過合成部分或完全重疊的寡核苷酸，或通過有機化學和重組技術的組合而提供，這正如本領域技術人員所知。優選所述核酸經密碼子優化而增強編碼多表位的表達盒在接種的豬中的表達。進一步的優化可以包括去除隱蔽的剪接部位，去除隱蔽的polyA尾和/或去除導致mRNA不利折疊的序列。由剪接部位側接的內含子的存在可以促使從感染細胞的細胞核中輸出。

在一個實施方式中，所述核酸分子是RNA，包括未修飾的RNA、修飾的RNA、以及優選的自我複製的RNA。所述自我複製的RNA可以基於用於擴增RNA分子的病毒系統，如衍生自α病毒、黃病毒、彈狀病毒、麻疹病毒和/或黃病毒的病毒系統。所述RNA可以與分子如納米顆粒、聚乙烯亞胺、陽離子脂質（包括合成的陽離子脂質，如N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨（DOTMA）、Lipfectamine和SAINT^® ）、和/或殼聚糖（chitosans）複合（絡合）或縮合。

表達盒優選包含用於高表達水準的工具（方式，means），如例如，病毒源（例如，人巨細胞病毒）的強啟動子，或衍生自高度表達於細胞如豬細胞中的基因的啟動子（Running Deer and Allison, 2004. Biotechnol Prog 20: 880-889；美國專利號：5888809）。

進一步提供了包含重組核酸分子的宿主細胞，該重組核酸分子包含根據本發明的表達盒。所述宿主細胞可以生長或儲存，用於未來生產根據本發明的重組核酸分子。所述細胞優選是細菌細胞，例如，大腸桿菌。

在向豬給予之前，優選將核酸溶解於，例如，緩衝溶液如PBS中。給予優選每只動物含有1μg至1mg核酸。

所述重組核酸分子包含編碼多表位的表達盒，表達來自非洲豬瘟病毒蛋白的2-50個T細胞抗原，優選5-30個T細胞抗原，更優選約20個T細胞抗原，如18個T細胞抗原、19個T細胞抗原、20個T細胞抗原和21個T細胞抗原。合適的T細胞抗原優選使用可用的軟體程式預測。優選的T細胞抗原具有主要組織相容性複合體（major histocompatibility complex，MHC）I類結合親和力。包括於合適的T細胞抗原的分析中的優選軟體程式稱為NetMHC [Andreatta and Nielsen, 2016. Bioinformatics 32: 511-7]，其基於允許在比對（alignment）中***和缺失的人工神經網路。它能夠學習不同MHC分子的長度分佈。優選不選擇自身肽作為合適的T細胞抗原，因為這些肽可能引起自身免疫疾病。

所述2-50個T細胞抗原是6-15個氨基酸殘基、優選8和11個氨基酸殘基、更優選約9個氨基酸殘基的肽，其通過含有蛋白酶體切割信號的間隔子分開，優選通過1-10個氨基酸殘基的間隔子分開。優選的T細胞抗原衍生自非洲豬瘟病毒蛋白MGF_505-7R、NP1450L、G1340L、B385R、G1211R、E423R、NP1450L、MGF_5059R、E301R、C717R、EP424R、F778R、CP530R、R298L、CP2475L、O174L、MGF_360-2L、NP1450L、M1249L和/或MGF_360-1l。

優選的T細胞抗原選自表1中所示的肽。表1. 優選的T細胞抗原的氨基酸序列

1	TLNLLLSY	11	YTLNHAFTL
2	KTFCKNLPY	12	SMSLNYYFY
3	MSVSTFWPY	13	FINSTDFLY
4	RINRNYYPY	14	YYYGYYYQL
5	ITYLNNMGY	15	AINTFMYYY
6	RTASSAELY	16	YQLDLFTAL
7	ATQQLALNY	17	CIDLGANAF
8	SIITRHLEY	18	FSFGRTLVY
9	KTFSDLSNY	19	SSMDDISAY
10	YRFVWYQPF	20	CIDLGADAF

包含根據本發明的表達盒的優選重組核酸分子優選編碼表1的肽1-20，更優選肽1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20，更優選從N末端開始依次為肽1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、15、16、17、19、20、11、18。

所述間隔子優選為約1-5個氨基酸殘基，包括2個氨基酸殘基，3個氨基酸殘基和4個氨基酸殘基。優選的間隔子包括表2中所示的肽。表2. 間隔子序列

1	ARY	7	AQW
2	NQF	8	ADRRY
3	ADRRF	9	ADNQF
4	ADAQW	10	ADRIW
5	RRW	11	ADARY
6	ADARW

優選的重組核酸分子包含根據本發明的表達盒，優選編碼通用T細胞表位。所述通用T細胞表位優選位於非洲豬瘟病毒的T細胞表位之前，因此位於這些T細胞表位的N端。這種通用T細胞表位的實例提供於文獻Khatun et al., 2017. Chemistry 23: 4233-4254中。優選的通用T細胞表位由稱為PADRE的非天然pan DR表位提供，其具有氨基酸序列aKXVAAWTLKAAaZC，其中X表示L-環己基丙氨酸，而Z表示氨基己酸（Alexander et al., 2000. J Immunol 164: 1625-1633）。出於表達目的，優選使用具有序列AKFVAAWTLKAAAARY的衍生物。

優選的重組核酸分子包含根據本發明的表達盒，優選進一步優選在多表位的5'端處包含編碼泛素的核苷酸序列。將泛素融合至包含T細胞抗原的多表位增強對蛋白酶體的靶向作用，致使對多表位的加工改善和T細胞反應增強。

優選的重組核酸分子包含圖1B中所描述的核苷酸序列。 4.3 病毒顆粒

本發明進一步提供了一種病毒顆粒，包括含有編碼多表位的表達盒的重組核酸分子，該多表位包含根據本發明的來自非洲豬瘟病毒蛋白的T細胞抗原。

本發明進一步提供了一種病毒顆粒，包含表達非洲豬瘟病毒的B細胞抗原的重組核酸分子。所述B細胞抗原優先選自非洲豬瘟病毒的蛋白p30、p54、p72、EP402R (pEP402R)、A104R (pA104R)和/或B602L (pB602L)。本領域技術人員將會了解用語“蛋白EP402R”是指pEP402R；用語“蛋白A104R”是指pA104R；及用語“蛋白B602L”是指pB602L。所述B細胞抗原優選包含非洲豬瘟病毒的蛋白p30、p54、p72、EP402R、A104R和/或B602L的氨基酸序列，優選包含非洲豬瘟病毒的蛋白p30、p54、p72、EP402R、A104R和/或B602L的基本上完整的氨基酸序列。這種氨基酸序列的實例由以下提供：來自菌株Badajoz 1971的磷蛋白p30的UniProt登錄號P34204（P30_ASFB7）；來自菌株Badajoz 1971的包膜蛋白p54的UniProt登錄號Q65194；來自菌株Badajoz 1971的主要衣殼蛋白p70的UniProt登錄號P22776；來自菌株Badajoz 1971的CD2同系物EP402R的UniProt登錄號Q89501；來自Badajoz菌株1971的病毒組蛋白樣蛋白A104R的UniProt登錄號P68742；和來自菌株Badajoz 1971的蛋白B602L的UniProt登錄號Q65169。

所述B細胞抗原優選使用級聯表達盒表達，例如，用於表達p30和B602L；p72和A104R和/或p54和EP402R，或三個表達盒，例如，用於表達p54和EP402R和K205R的表達盒。編碼B細胞抗原的DNA構建體可以合成產生，例如，正如技術人員所知，獲自GenScript。B細胞抗原編碼區優選用不同的MVA啟動子和轉錄終止序列進行克隆，從而驅動這些基因的表達。此外，所述B細胞抗原優選提供有序列標記從而允許檢測蛋白表達。合適的標記包括6xHis標記、c-myc結構域（EQKLISEEDL）、血凝素標記（YPYDVPDYA）、麥芽糖結合蛋白、谷胱甘肽-S-轉移酶、麥芽糖結合蛋白、FLAG標記肽、生物素受體肽、鏈黴親和素結合肽和鈣調蛋白結合肽，如文獻Chatterjee, 2006. Cur Opin Biotech 17, 353-358中介紹的那些。FLAG標記是優選標記。所述標記優選存在於B細胞抗原的C端。

可以用作傳遞所述重組核酸分子（優選DNA分子）的載體的病毒顆粒包括基於腺相關病毒、慢病毒的顆粒，例如，基於逆轉錄病毒的載體，例如，基於以下的病毒顆粒：莫洛尼鼠白血病病毒（Moloney Murine Leukemia Virus）、脾臟聚焦形成病毒（Spleen-Focus Forming Virus）、骨髓增生性肉瘤病毒（Myeloproliferative Sarcoma Virus）、鼠幹細胞病毒（Murine Stem Cell Virus）或SFGγ逆轉錄病毒（Rivière et al., 1995. PNAS 92: 6733-6737）、腺病毒、單純皰疹病毒、痘病毒如改良痘苗病毒安卡拉（Modified Vaccinia Ankara）（MVA; Mackowiak et al., 1999. Adv Vet Med 41: 571–583；Cottingham et al., 2008. PLoS One 20:e1638）或金絲雀痘病毒（canary poxvirus）、沙粒病毒（arenavirus）、麻疹病毒（measles virus）、新城疫病毒（Newcastle Disease virus）（Kortekaas et al., 2010. Vaccine 28: 2271-2276）和/或布尼亞病毒（bunyavirus）如裂谷熱病毒（Rift Valley fever virus）（Wichgers Schreur et al., 2014. J Virol 88: 10883-10893）。

優選的病毒顆粒基於痘病毒。所述病毒顆粒優選是基於改變的痘苗病毒安卡拉（MVA）的顆粒，如描述於文獻Cottingham et al., 2008. PLoS One 20:e1638中。MVA中優選的表達盒包含MVA 13.5啟動子序列，例如，這描述於US20150299267中。優選表達盒根據本領域技術人員已知的方法與步驟通過細菌人工染色體（BAC）-重組而***MVA（減毒天花病毒）疫苗載體的TK基因中。

所述病毒顆粒優選產生於真核細胞中。所述真核細胞優選是可以使用本領域技術人員已知的標準方法很容易感染和/或轉染的細胞，如例如，酵母細胞和雞成纖維細胞。所述真核細胞優選是昆蟲細胞或哺乳動物細胞。合適的昆蟲細胞包括，例如，卵巢草地夜蛾（Spodoptera frugiperda）細胞如Sf9和Sf21、施耐德果蠅（Drosophila Schneider）2細胞和白紋伊蚊（Aedes albopictus）C6/36細胞。合適的哺乳動物細胞包括，例如，幼倉鼠腎細胞（Baby Hamster Kidney）、人類胚胎腎細胞（Human Embryonic Kidney）如HEK293和自由式HEK293FTM細胞（ThermoFisher Scientific）、VERO細胞、MDCK細胞、CHO細胞、HeLa和PER.C6細胞（Fallaux, F. J. et al. 1998. Hum Gene Ther 9: 1909-1917）。優選的細胞是人胚腎細胞如HEK293和自由式HEK293FTM細胞。

在一個實施方式中，所述病毒顆粒進一步包含標記蛋白。所述標記蛋白允許確認已接受根據本發明的病毒顆粒的豬。所述標記蛋白允許將接種的豬與感染野生型ASFV的豬區分開。所述標記蛋白優選為螢光蛋白、β-葡糖醛酸糖苷酶、β-半乳糖苷酶、高斯螢光素酶、海腎（Renilla）螢光素酶和/或分泌型鹼性磷酸酶。本領域技術人員將理解的是，所述標記蛋白的編碼序列存在於根據本發明的病毒顆粒的基因組中，從而使標記蛋白表達於已接受本發明的病毒顆粒的細胞中。

本發明進一步提供了包含非洲豬瘟病毒的B細胞抗原的病毒顆粒組。

本發明進一步提供了一種包括含有非洲豬瘟病毒的B細胞抗原的病毒顆粒的試劑盒。

所述B細胞抗原優先選自非洲豬瘟病毒的蛋白p30、p54、p72、EP402R、A104R和/或B602L。所述B細胞抗原優選包含非洲豬瘟病毒的蛋白p30、p54、p72、EP402R、A104R和/或B602L的氨基酸序列，優選包含非洲豬瘟病毒的蛋白p30、p54、p72、EP402R、A104R和/或B602L的基本上完整的氨基酸序列。這種氨基酸序列的實例由以下提供：來自菌株Badajoz 1971的磷蛋白p30的UniProt登錄號P34204（P30_ASFB7）；來自菌株Badajoz 1971的包膜蛋白p54的UniProt登錄號Q65194；來自菌株Badajoz 1971的主要衣殼蛋白p70的UniProt登錄號P22776；來自菌株Badajoz 1971的CD2同系物EP402R的UniProt登錄號Q89501；來自Badajoz菌株1971的病毒組蛋白樣蛋白A104R的UniProt登錄號P68742；和來自菌株Badajoz 1971的蛋白B602L的UniProt登錄號Q65169。

本發明進一步提供了一種試劑盒，其包括含有重組分子的病毒顆粒，該重組分子包含編碼包含根據本發明的來自非洲豬瘟病毒蛋白的T細胞抗原的多表位的表達盒，以及一種或多種包含優先選自根據本發明的非洲豬瘟病毒的蛋白p30、p54、p72、EP402R、A104R和/或B602L的非洲豬瘟病毒的B細胞抗原的病毒顆粒。

本發明進一步提供一種試劑盒，包括含有以下表達盒的重組分子的病毒顆粒，該表達盒編碼包含根據本發明的來自非洲豬瘟病毒蛋白的T細胞抗原和來自非洲豬瘟病毒蛋白的合成T細胞抗原的多表位。 4.4 刺激豬中免疫反應的方法

本發明提供了一種刺激豬中免疫反應的方法，包括向豬以有效誘導免疫反應的量給予本發明的重組分子和/或本發明的病毒顆粒。

本發明提供了一種刺激豬中免疫反應的方法，包括向豬以有效誘導免疫反應的量給予如請求項1-5中任一項的重組分子及/或如請求項6或7的病毒顆粒，與包含非洲豬瘟病毒的B細胞抗原的病毒顆粒進行組合，所述B細胞抗原優先選自非洲豬瘟病毒的蛋白p30、p54、p72、EP402R、A104R和/或B602L。

本發明的重組分子和/或本發明的病毒顆粒優選以組合物、優選藥物組合物提供。

重組核酸分子和/或病毒顆粒可以通過本領域技術人員已知的任何方法，包括注射、局部被動擴散或離子電滲療法的貼片、電穿孔、熱微孔化、鼻噴霧器、氣溶膠上呼吸和肺吸入、聲孔效應、化學物質和機械磨蝕、以及動力學/彈道傳遞（kinetic/ballistic delivery）[Weniger et al., 2018. Vaccine 36: 427-437]給予豬。

優選通過腸胃外，例如，通過注射給予重組核酸分子和/或病毒顆粒。根據本發明的重組核酸分子和/或病毒顆粒優選用常規的無毒藥用載體、佐劑或賦形劑進行配製。正如本文所用，術語腸胃外包括皮下、皮內或真皮內、靜脈內、肌肉內、關節內、滑膜內、胸骨內、鞘內、病灶內和顱內注射或輸注技術。

根據本發明的重組核酸分子更優選通過電穿孔給予，更優選通過肌內/皮內電穿孔給予豬。電穿孔可以使用，例如，由以下組成的電極陣列進行：向下壓於由50μL質粒製劑的Mantoux遞送並施加100ms的25V脈衝製成的皮膚皰疹上的直徑0.43mm、間距為1.5mm的鍍金套管針陣列（Inovio Pharmaceuticals，Plymouth Meeting，PA）；可攜式脈衝發生器（CUY21 EDIT；Nepa Gene，Ichikawa，Japan）和鑷子電極（6個10毫秒脈衝，輸出電流300-600mA）；具有安裝於手柄（型號MP 35）上的無針微貼片型圓形電極BTX ECM 830脈衝發生器（Genetronics，San Diego，CA），其中該脈衝發生器分別施加60、70或80 V的六個方波脈衝，脈衝持續時間60 ms，脈衝間隔200 ms和三次脈衝後極性反轉。

進一步的優選方法採用在右大腿上的兩個部位相隔約3cm地進行肌肉內給予，每個注射部位0.25mL的體積。注射後立即在注射部位使用線性/六角形針電極施用使用Cliniporator（IGEA）的體內電穿孔程式。針之間的空間優選為約2cm，而電穿孔器優選設定在100V。使用50V/cm的電流維持0.6A的平均安培數。間隔50-500毫秒、優選約200毫秒，施加約5-50毫秒、優選約20毫秒的2-20個脈衝，優選5-10個脈衝，優選約8個脈衝。

優選重複進行所述給予，優選重複1-3次，從而使重組分子和/或病毒顆粒總共給予2-4次。重複給予優選以約2周的間隔進行。

保護性免疫反應可以要求產生細胞和血清學免疫兩者。因此，在刺激豬的免疫反應的優選方法中，重組分子和/或病毒顆粒的至少一次給予與包含來自非洲豬瘟病毒蛋白的T細胞抗原的合成肽的給予進行組合，該合成肽為優選2-50個肽，更優選約10-30個肽，例如約20個肽，例如18個肽，19個肽，20個肽和21個肽。

包含T細胞抗原的所述肽優選是6-15個氨基酸殘基，優選8和11個氨基酸殘基，更優選約9個氨基酸殘基的肽。優選的肽選自表1中所示的肽。

所述肽優選腸胃外給予，如通過注射給予，更優選通過肌內注射給予。

在刺激豬的免疫反應的優選方法中，重組分子和/或病毒顆粒的至少一次給予與包含非洲豬瘟病毒的B細胞抗原、優先選自非洲豬瘟病毒的蛋白p30、p54、p72、EP402R、A104R和/或B602L的病毒顆粒的給予進行組合。

給予豬的本發明病毒顆粒的量通常為每只動物1,000-1,000,000,000個感染性病毒顆粒。使用本領域技術人員已知的標準技術，例如，劑量反應曲線可以確定感染顆粒的量。

本發明進一步提供了一種組合物，優選獸醫學上可接受的組合物，其包含本發明的重組分子和/或病毒顆粒，以及獸醫學上可接受的賦形劑。

所述組合物優選是水性或油性懸浮液。這種懸浮液可以根據本領域已知的技術使用合適的分散劑或潤濕劑（例如，吐溫80）和懸浮劑配製。可以使用的可接受載體和溶劑包括甘露醇、水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，無菌的固定油通常用作溶劑或懸浮介質。為此目的，可以使用任何溫和的固定油，包括合成甘油單酯或甘油二酯。脂肪酸如油酸及它們的甘油酯衍生物都適用於製備合適的組合物，因為它們是天然的藥用油，如橄欖油或蓖麻油，尤其是其聚氧乙基化形式。這些油溶液或懸浮液也可以含有長鏈醇稀釋劑或分散劑，或瑞士藥典（Pharmacopoea Helvetica）中所述的類似醇。

本發明進一步提供了一種疫苗，其包含有效免疫量的包含本發明的重組分子和/或病毒顆粒的組合物，以及獸醫學上可接受的賦形劑。所述疫苗優選地進一步包含含有非洲豬瘟病毒的B細胞抗原的病毒顆粒，所述B細胞抗原優先選自非洲豬瘟病毒的蛋白p30、p54、p72、EP402R、A104R和/或B602L。

包含本發明的病毒顆粒的組合物優選進一步包含佐劑，包括細胞激素如干擾素-γ、免疫刺激核酸序列如CpG寡核苷酸、脂質體、病毒樣顆粒、表面活性劑如十六烷基胺、聚陰離子如吡喃和硫酸葡聚糖。

優選的佐劑是ISCOM，如國際專利申請WO2002026255A1中所述。ISCOM技術與其他佐劑相比具有幾個優勢。ISCOM會刺激體液和細胞介導的免疫反應。ISCOM是高效佐劑，使之能夠進一步減少根據本發明的不活化的或其部分的用量。優選的ISCOM是ISCOM Matrix-M。

另一種優選的佐劑是BLP。BLP是自身輔助性（self-adjuvanting）疫苗遞送載體，衍生自滅活的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）細菌。乳酸乳球菌是一種常用於食品工業的安全細菌，如用於生產乳酪和益生菌飲料。BLP通過簡單的熱酸處理產生，致使產生主要由肽聚糖表面構成的堅固細胞形狀基質。如WO 2010/033031中所述，肽聚糖優選包含乳酸乳球菌細胞壁水解酶AcmA的C端肽聚糖結合域LysM。該表面可誘導對抗致病病原體所需的長效免疫。BLP顆粒的非活體性質允許劑量準確而沒有傳播的風險。

BLP還提供了可以有效負載所選擇的特定抗原的安全且通用骨架，例如，本發明的一種或多種包含非洲豬瘟病毒的T細胞抗原和/或B細胞抗原的病毒顆粒。通過使用WO2010/033031中描述的非共價偶聯技術實現BLP對抗原的完全負載。該技術允許抗原融合與BLP的簡單混合，從而致使抗原與顆粒表面的穩固而立即的結合。所得到的抗原覆蓋的BLP優選通過鼻（噴霧）或口腔（膠囊）的黏膜層遞送於豬，而不需要注射。

本發明進一步提供了預防或改善豬中的非洲豬瘟病毒感染和/或傳播的方法，包括向至少一隻豬給予包含編碼包含來自非洲豬瘟病毒蛋白的T細胞抗原的多表位的表達盒的重組分子和/或包含所述重組分子的病毒顆粒。所述重組分子及/或病毒顆粒的給予優選地與包含非洲豬瘟病毒的B細胞抗原的病毒顆粒的給予進行組合，所述B細胞抗原優先選自非洲豬瘟病毒的蛋白p30、p54、p72、EP402R、A104R和/或B602L。

所述方法提供對後續野生型毒性的非洲豬瘟病毒感染的保護。保護定義為疾病的臨床表現的存活和缺乏，以及降低通過任何傳播途徑（包括水準和垂直傳播）的野生型病毒的繼續傳播。保護開始的時間和持久保護是疫苗功效的一部分。此外，針對不同病毒物種或血清型的廣泛保護也是根據本發明的疫苗功效的一部分。

本發明進一步提供了包含非洲豬瘟病毒的T細胞抗原(優選地包含編碼一多表位的表達盒，所述多表位包含來自非洲豬瘟病毒蛋白的T細胞抗原)或B細胞抗原的病毒顆粒，或包含非洲豬瘟病毒的T細胞抗原和B細胞抗原的病毒顆粒組，用於在保護豬免受隨後續非洲豬瘟病毒感染的方法中使用。

本發明進一步提供了包含含有非洲豬瘟病毒的T細胞抗原(優選地包含編碼一多表位的表達盒，所述多表位包含來自非洲豬瘟病毒蛋白的T細胞抗原)和B細胞抗原的病毒顆粒的試劑盒，用於在保護豬免於後續感染非洲豬瘟病毒的方法中使用。

出於清楚和簡明描述的目的，這些特徵描述為相同或單獨實施方式的部分，然而，應當理解的是，本發明的範圍可以包括具有所描述的全部或一些特徵的組合的實施方式。 5. 實施例實施例1：基於ASFV T細胞表位的表達的DNA接種方法：

基於已知的ASF分離株的完整基因組序列和豬的基因組序列，表位預測程式NetMHCpan用於提供獨立於病毒株或豬品種的T細胞表位列表（參見表1）。19個最高排位的T細胞表位用於產生多表位合成DNA疫苗。DNA序列編碼19個九肽表位，由3-5個氨基酸的含有蛋白酶體切割和進一步加工的信號的間隔子分隔開（參見圖1A）。表位14並未使用，是因為它很可能會干擾正確的加工。為此目的還包括所謂的PADRE通用T細胞表位序列（參見圖1B）。為了增強蛋白酶體降解，在合成基因的5'端上添加針對泛素的核苷酸序列。這致使通過蛋白酶體的降解更有效和表位向宿主T細胞的呈遞改善。最後，CpG佐劑序列加入到合成基因的3'UTR中。合成基因的密碼子優化形式由GenScript Corporation化學合成，並使用NheI和NotI限制性部位克隆到質粒pCVI中的CMV啟動子後面（通過刪除ClaI-限制性片段獲得的pCI-neo [Promega]的衍生物）。獲得的質粒命名為pCVI-ASFDVAC2。

三組每組6只的豬用於疫苗接種-挑戰研究。來自第1組的動物用pCVI-ASFDVAC2接種三次。來自第2組的動物也接種了三次，但與第三次DNA接種同時，它們還接受了具有與合成基因的T細胞表位相對應的合成九肽的混合物的加強劑。來自對照組（第3組）的動物用空質粒pCVI接種三次。豬以2周的間隔進行接種。疫苗使用cliniporator^® 設備（IGEA Clinical Biophysics，Carpi，Italy）通過免疫-電穿孔進行肌肉/皮內施用。由電穿孔設備產生的電脈衝改進了周圍組織對DNA的攝取。這些肽通過肌內接種施用。在最後一次接種後兩周，這些豬用ASFV Netherlands ’86菌株（Wageningen Bioveterinary Research, The Netherlands；參見Terpstra and Wensvoort, 1986. Tijdschrift voor diergeneeskunde 111: 389-392）進行挑戰。菌株在豬肺泡巨噬細胞中生長。對感染的豬的臨床症狀進行了超過2周的隨訪。通過PCR測定血液中的病毒水準。使用全病毒作為抗原通過ELISA檢查抗體反應。在用病毒或二十種九肽的混合物體外刺激之後，通過ELISPOT測定IFN-γ分泌細胞的水準。結果：

未接種疫苗的對照組（第3組）的挑戰感染導致40%的存活率。疫苗接種導致第1組和第2組的存活率約為83%（參見圖2A）。第2組的豬的總臨床評分顯著低於其他組的豬（圖2B）。從第一次接種（p.v.）後第42天（挑戰[p.c.]的第0天）直至實驗結束，該組中的豬對於九肽的混合物也具有顯著的IFN-γ分泌細胞反應（參見圖2C）。第2組中的豬從第49天p.v.（第7天p.c.）開始具有針對九肽混合物的顯著IFN-γ分泌細胞反應。在對照組中未觀察到針對九肽混合物的IFN-γ分泌細胞反應。所有組在第56天p.v.（第14天p.c.）顯示出針對病毒的顯著IFN-γ分泌細胞反應。在各組之間血液病毒DNA水準無顯著差異。在ASF抗體ELISA的阻斷百分比水準上未觀察到顯著差異。實施例2：使用表達ASFV T細胞和B細胞表位的MVA載體進行接種方法：

基於多表位DNA疫苗的有前景的結果，合成的ASFDVAC2基因提供有MVA 13.5啟動子序列並通過根據公開的方法的BAC重組工程***到MVA（減毒天花）疫苗載體的TK基因中（Cottingham, 2012. Methods Mol Biol 890: 37-57）。所獲得的病毒命名為MVA-VAC2。MVA-VAC2的***物從5'端開始包括，TK左側翼、MVA 13.5L啟動子、Kozak序列、合成的ASFDVAC2基因、來自mH5的終止序列和TK右側翼。

此外，採用級聯（p30 + B602L; p72 + A104R）或三重（p54 + EP402R + K205R）基因表達盒（分別為MVA-p30/B602L、MVA-p72/A104R和MVA-p54/EP402R/K205R），使用BAC重組工程將編碼六種眾所周知的主要ASFV B細胞抗原（p30、p54、p72、EP402R、A104R和B602L）的基因***MVA載體中。為此，生成合成的DNA構建體（GenScript）並且蛋白編碼的區域提供了不同的MVA啟動子和轉錄終止序列以驅動這些基因的表達。此外，為了容許檢測蛋白表達，每個蛋白編碼區域提供有C端FLAG標記序列。

各10只豬的三組用於疫苗接種-挑戰實驗。第1組的動物使用10^8 TCID50 MVA-VAC2肌肉內接種兩次。第2組的動物用表達T細胞表位和B細胞表位（每個10^ 8 TCID50）的所有4種MVA-重組體的組合接種兩次。第3組的未接種疫苗的動物作為對照。第二次疫苗接種後兩周，用ASFV Netherlands ’86菌株挑戰動物。結果：

對未接種疫苗的動物（第3組）的挑戰感染導致了0%存活率（參見圖3A）。值得注意的是，用所有4種MVA重組體（第2組）的組合接種的10只豬中有9只存活並且僅顯示輕微的發病率持續僅幾天。在僅用MVA-VAC2接種的第1組動物中，4只豬存活。與第2組的動物相比，該組的動物表現出更多的發病率和持續更長的時間（參見圖3B）。這些結果與細胞介導的免疫（CMI）對應很好，正如用針對T細胞九肽表位或整個ASFV抗原的混合物的IFN-γ分泌細胞反應進行的測量（圖3C）。結論：

在該研究中，通過使用由表達ASFV T細胞以及B細胞表位的MVA載體病毒構成的組合疫苗獲得了ASFV疫苗開發的有前景的結果。組合疫苗在挑戰後提供了對抗死亡和臨床疾病的保護。

圖1A-圖1E. 序列圖1A. 重組核酸分子的***物，指示泛素和T細胞表位。圖1B. ASFDVAC2的***物。以黑體表示的是泛素氨基酸序列，以及如表1所示的T細胞抗原1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、15、16、17、19、20、11和18，斜體表示PADRE氨基酸序列和CpG核酸序列。圖1C. MVA-p30 + B602L核酸序列（3106bp）。指示的是，從5'端開始，大寫字母示出的SwaI部位、TK左側翼（flank）、粗體和底線示出的MVA 13.5L啟動子、Kozak序列、粗體示出的菌株E75的p30基因的編碼序列、底線示出的FLAG-標記序列、斜體示出的終止密碼子、大寫字母示出的來自mH5的終止序列、粗體和底線示出的mH5早期/晚期啟動子序列、Kozak序列、粗體示出的BA71V-B602L（9RL）編碼序列、底線示出的三個FLAG標記序列、斜體示出的終止密碼子、大寫字母示出的來自C11R的終止序列、TK右側翼以及大寫字母示出的SwaI部位。圖1D. MVA-p54 + EP402R + K205R核酸序列（3309bp）。指示的是，從5'端開始，大寫字母示出的SwaI部位、TK左側翼、粗體和底線示出的MVA 13.5L啟動子、Kozak序列、粗體示出的p54基因的編碼序列、底線示出的FLAG標記序列、斜體示出的終止密碼子、大寫字母示出的來自mH5的終止序列、mH5早期/晚期啟動子序列、粗體示出的BA71V-B602L（9RL）編碼序列、底線示出的三個FLAG標記序列、斜體示出的終止密碼子、大寫字母示出的來自C11R的終止序列、粗體和底線示出的LEO啟動子序列、Kozak序列、粗體示出的BA71V-K205R基因的編碼序列、底線示出的FLAG標記序列、斜體示出的終止密碼子、大寫字母示出的來自M2L的終止序列、TK右側翼和大寫字母示出的SwaI部位。圖1E. MVA-p72 + A104R核酸序列（2992bp）。指示的是，從5'端開始，大寫字母示出的SwaI部位、TK左側翼、粗體和底線示出的MVA 13.5L啟動子、Kozak序列、粗體示出的p72基因的編碼序列、底線示出的FLAG標記序列、斜體示出的終止密碼子、大寫字母示出的來自mH5的終止序列、粗體和底線示出的mH5早期/晚期啟動子序列、Kozak序列、粗體示出的BA71V-A140R的編碼序列、底線示出的FLAG標記序列、斜體示出的終止密碼子、大寫字母示出的來自C11R的終止序列、TK右側翼和大寫字母示出的SwaI部位。圖2A-圖2C. 用重組核酸構建體接種的結果圖2A. 生存曲線。圖2B. 在挑戰後指定的天數（DPC）時的每組臨床評分。白色柱表示死亡的動物。圖2C. 源自指定DPC時從豬中分離的外周血單核細胞的ELISPOT結果。正如所示，細胞用培養基、病毒和肽（疫苗）進行刺激。圖3A-圖3C. 用病毒構建體接種的結果圖3A. 生存曲線。圖3B. 不同組中的豬的平均發病率指數。圖3C. 三個治療組的細胞介導免疫反應。在挑戰後指定的天數（X軸：DPC）時從豬中分離出外周血單核細胞。Y軸：用ELISPOT測定的干擾素γ產量。正如所示，細胞用培養基（陰性對照）、病毒（AVP）和肽進行刺激。

(無)

Claims

一種重組核酸分子，優選地重組DNA分子，包含編碼含有來自非洲豬瘟病毒蛋白的T細胞抗原的多表位的表達盒，其中所述T細胞抗原通過含有蛋白酶體切割信號的間隔子、優選地通過1-10個氨基酸殘基的間隔子分隔開。
如請求項1所述的重組分子，其中編碼的所述多表位包含作為T細胞抗原的2-50個肽。
如請求項1或2所述的重組分子，其中編碼的所述多表位包含作為T細胞抗原的2-50個九肽，優選地如表1中所描述的九肽 1-13及15-20，其等通過約1-5個氨基酸殘基的間隔子分隔開，優選地如表2中所描述的間隔子序列1-11。
如請求項1-3中任一項所述的重組分子，進一步編碼通用T細胞表位。
如請求項1-4中任一項所述的重組分子，進一步包含針對泛素的核苷酸序列，優選地在所述多表位的5'末端，所述重組分子優選地包含圖1B中所描述的核苷酸序列。
一種病毒顆粒，包含請求項1-5中任一項所述的重組分子。
如請求項6所述的病毒顆粒，進一步包含標記蛋白。
一種刺激豬的免疫反應的方法，包括以有效誘導免疫反應的量向所述豬給予請求項1-5中任一項所述的重組分子和/或請求項6或7所述的病毒顆粒，與包含非洲豬瘟病毒的B細胞抗原的病毒顆粒進行組合，所述B細胞抗原優先選自非洲豬瘟病毒的蛋白p30、p54、p72、EP402R、A104R和/或B602L。
如請求項8所述的方法，其中經腸胃外給予所述重組分子和/或所述病毒顆粒。
如請求項8或9所述的方法，其中給予所述重組分子和/或所述病毒顆粒2-4次，優選地間隔約2周，及所述重組分子及/或所述病毒顆粒的至少一次給予與包含非洲豬瘟病毒的B細胞抗原的病毒顆粒的給予進行組合，所述B細胞抗原優先選自非洲豬瘟病毒的蛋白p30、p54、p72、EP402R、A104R和/或B602L。
如請求項8-10中任一項所述的方法，其中所述重組分子和/或所述病毒顆粒的至少一次給予與來自非洲豬瘟病毒蛋白的合成T細胞抗原的給予進行組合。
一種用於預防或改善豬的非洲豬瘟病毒感染和/或傳播的方法，包括向至少一隻豬給予請求項1-5中任一項所述的重組分子和/或請求項6或7所述的病毒顆粒，其中所述重組分子及/或所述病毒顆粒的給予與包含非洲豬瘟病毒的B細胞抗原的病毒顆粒的給予進行組合，所述B細胞抗原優先選自非洲豬瘟病毒的蛋白p30、p54、p72、EP402R、A104R和/或B602L。
一種病毒顆粒組，包含含有請求項1-5中任一項所述的重組分子的病毒顆粒和一種或多種包含非洲豬瘟病毒的B細胞抗原的病毒顆粒，所述B細胞抗原優先選自非洲豬瘟病毒的蛋白p30、p54、p72、EP402R、A104R和/或B602L。
一種試劑盒，包括含有請求項1-5中任一項所述的重組核酸分子的病毒顆粒和一種或多種包含非洲豬瘟病毒的B細胞抗原的病毒顆粒，所述B細胞抗原優先選自非洲豬瘟病毒的蛋白p30、p54、p72、EP402R、A104R和/或B602L。
如請求項13所述的病毒顆粒組，用於在保護豬免受非洲豬瘟病毒後續感染的方法中使用。
如請求項14所述的試劑盒，用於在保護豬免受非洲豬瘟病毒後續感染的方法中使用。