TW202019870A - 艾拉菲諾鹽 - Google Patents

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Abstract

本發明關於一種艾拉菲諾(elafibranor)的鹽類。

Description

艾拉菲諾鹽
本發明關於一種艾拉菲諾的鹽類、用於製備其的方法及其用途。
式(I)的艾拉菲諾(Elafibranor)為目前在第三期臨床試驗中評估的用於治療非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis)(NASH)的分子。艾拉菲諾的製造及用途描述於WO2004005233及WO2011144579中。
Figure 02_image001
(I)
由發明人傳達的研究已顯示可以改善艾拉菲諾的物理化學特性，如其穩定性(特別是其光穩定性)及溶解度。
已發現可以藉由將艾拉菲諾的游離酸轉換成艾拉菲諾的鹽類進一步改善艾拉菲諾的物理化學特性。
本發明關於艾拉菲諾的鹽類及用於製備其的方法。
本發明亦提供一種包含本發明的鹽類之治療有效劑量及藥學上可接受之載體的藥物組合物。
本發明進一步提供包含本發明之鹽類以及一種或多種其他治療劑的組合。
本發明亦提供本發明的鹽類用於治療的用途。具體而言，本發明的鹽類可用於肝臟疾病的治療，所述肝臟疾病具體而言為NAFLD(非酒精性脂肪肝疾病)、NASH(非酒精性脂肪肝炎)、肝纖維化(liver fibrosis)或肝硬化(cirrhosis)。
本發明進一步提供本發明的鹽類在藥劑製造上的用途，如用於治療肝臟疾病的藥劑，所述肝臟疾病具體而言為NAFLD(非酒精性脂肪肝疾病)、NASH(非酒精性脂肪肝炎)、肝纖維化或肝硬化。
本發明亦提供用於治療患有肝臟疾病之個體的方法，所述肝臟疾病具體而言為NAFLD(非酒精性脂肪肝疾病)、NASH(非酒精性脂肪肝炎)、肝纖維化或肝硬化，所述方法包含對所述個體施予治療有效劑量的本發明之鹽類。
在一特定實施例中，本發明可以用於NAFLD(非酒精性脂肪肝疾病)、NASH(非酒精性脂肪肝炎)或肝硬化的治療。
藉由參考下文詳細描述並結合形成本揭露之一部分的附圖及實例，本發明將更易於理解。應理解的是本發明並不以本文所述及/或繪示的特定產物、方法、條件或參數為限，且本文所用的術語係僅為描述特定實施例作為實例之目的而非用於限制所請發明。
在此文件中引用的或描述的每個專利、專利申請案及出版物皆藉由引用併入本文。
除非有另外定義，否則本文使用的所有技術與科學術語具有與本發明所屬領域具有通常知識者的通常理解相同的含義。
除非有另外定義，如前文及全文揭露中，下述術語及縮寫應理解為具有下列含意：
除非文中另有明確表示，在本揭露中的單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」也包含複數引用，且對特定數值的引用至少包含所述特定數值。因此，對所屬技術領域具有通常知識者而言，例如引用「一溶劑(a solvent)」係對這些溶劑及其等同物等的一種或多種引用等等。
如前文所使用術語「疾病(disease)」指的是疾病、異常、狀態(condition)、症狀或適應症(indication)。此術語可與用語「疾病或異常(disease or disorder)」互換使用。
如本文所使用術語「治療(treatment)」或「療法(trerapy)」(以及其不同詞彙形式)包含預防(preventative)(例如，預防(prophylactic))、治療(curative)或舒緩(palliative)治療。這些預防、治療或舒緩治療可為全部或部分。例如，完全消除不期望的症狀或部分消除一種或多種不期望的症狀將代表為本文所表示的「治療」。
如本文所使用的詞彙「治療有效劑量(therapeutically effective amount)」指的是研究人員、獸醫、醫學醫生或其他臨床醫生在組織、系統、動物、個體或人類中所求引出(elicits)生物或藥物反應之有效化合物的含量，其包含下列一種或多種：
(1)避免疾病或狀態；例如，在可能易患疾病、狀態或異常但尚未經歷或展現疾病之病理學或症狀學的個體中避免疾病、狀態或異常；
(2)抑制疾病或狀態；例如，在經歷或展現疾病、狀態或異常的病理學或症狀學的個體中抑制疾病、狀態或異常(即，包含阻止病理學及/或症狀學的進一步發展)；以及
(3)改善疾病或狀態；例如，在經歷或展現疾病、狀態或異常的病理學或症狀學的個體中改善疾病、狀態或異常(即，包含逆轉病理學及/或症狀學)。
「藥學上可接受的(pharmaceutically acceptable)」指的是在合理醫療判斷(sound medical judgment)的範疇中，在合理的受益/風險比(benefit/risk ratio)內適合用於接觸人類及動物的組織而不產生過度的毒性、刺激、過敏反應或其他併發症問題的這些化合物、材料、組合物及/或劑型。
本發明提供艾拉菲諾的鹽類。儘管艾拉菲諾的游離酸形式為所屬技術領域具有通常知識者已知，本揭露係針對此分子的不同鹽類形式。艾拉菲諾的鹽類可具有的包含化學純度、流動性、溶解度、形態學或結晶特性及穩定性(如儲存穩定性、對脫水的穩定性、對光的穩定性、對多晶轉換的穩定性、低吸濕性(hygroscopicity)及低溶劑殘留含量)的優良特性。
當術語「純度(purity)」提及本文所揭露的艾拉菲諾的其中一種鹽類時，意為未稀釋或未與其他鹽類及/或降解的副產物及/或外來材料混合之特定鹽類形式的程度(degree)，並以重量百分比(percentage by weight)(wt%)表示。
當術語「純度(purity)」提及本文所揭露的艾拉菲諾的其中一種鹽類之配方或劑型時，所述配方或劑型包含作為活性藥劑的特定結晶形式(以及一種或多種其他材料，如藥學上可接受的載體)，意為所述活性藥劑在配方或劑型中包含艾拉菲諾的特定鹽類且無其他艾拉菲諾的鹽類的程度，並也以重量百分比(wt%)表示。
由於特定鹽類的重量百分比可以藉由不同儀器、不同校正及/或不同套裝軟體進行的測量而變化，所屬技術領域具有通常知識者將理解任何經測量的純度等級會顯示一些變異性。由於這些變異性的來源，當提及鹽類形式的純度百分比時通常使用字詞「大約(about)」或「至少(at least)」列舉純度。在一特定實施中，「大約」指的是數值正或負10%的變異，特別是正或負5%。
為了決定用於所提用途之化合物最適合的形式，已探討化合物之各種鹽類的存在。
已合成並特性化(characterized)式(I)之化合物的新穎鹽類。
一些新穎鹽類具有非常良好的穩定性，有助於他們在藥劑形式之製備上的用途。
在鹽類研究期間，發明人發現符合感興趣之鹽類的清單，即藥學上可接受之相對離子(counter-ions)的清單，所述相對離子當與艾拉菲諾結合時最可能形成鹽類。
本文揭露艾拉菲諾的15種不同的鹽類。表1中呈現經測試之鹼類(bases)的清單。
相對離子可選自下列非全面的清單(non-exhaustive list)：氨(ammonia)、L-精胺酸(L-arginine)、苄苯乙胺(benethamine)、苄星(benzathine)、叔丁基胺(tert-butylamine)(叔丁胺(erbumine))、氫氧化鈣(calcium hydroxide)、氫氧化膽鹼(choline hydroxide)、丹醇(deanol)、二乙醇胺(diethanolamine)(2,2’-亞胺基雙(乙醇)(2,2’-iminobis(ethanol))、二乙胺(diethylamine)、依泊胺(epolamine)(1-(2-羥乙基)吡咯啶(1-(2-hydroxyethyl)pyrrolidine)、2-(二乙胺)-乙醇(2-(diethylamino)-ethanol)、乙醇胺(ethanolamine)(2-胺基乙醇(2-aminoethanol))、乙二胺(ethylenediamine)、甘胺酸(glycine)、海巴明(hydrabamine)、1H-咪唑(1H-imidazole)、L-離胺酸(L-Lysine)、氫氧化鎂(magnesium hydroxide)、葡甲胺(meglumine)(N-甲基-葡萄糖胺(N-methyl-glucamine))、4-(2-羥乙基)-嗎啉(4-(2-hydroxyethyl)-morpholine)、哌嗪(piperazine)、氫氧化鉀(potassium hydroxide)、氫氧化鈉、三乙醇胺(triethanolamine)(2,2',2"-氮基-三(乙醇)(2,2',2"-nitrilo-tris(ethanol))、胺基丁三醇(tromethamine)、氫氧化鋅(zinc hydroxide)，特別是胺基丁三醇、鉀、鈉、苄苯乙胺、苄星、L-精胺酸、乙醇胺、葡甲胺、甘胺酸、叔丁胺、L-離胺酸、依泊胺、膽鹼，較佳為胺基丁三醇、鉀、鈉、苄苯乙胺、苄星、L-精胺酸，更佳為胺基丁三醇、鉀、鈉、L-精胺酸，再更佳為胺基丁三醇。
在一特定實施例中，本發明關於艾拉菲諾的氨、L-精胺酸、苄苯乙胺、苄星、叔丁基胺 (叔丁胺)、鈣、膽鹼、丹醇、二乙醇胺(2,2’-亞胺基雙(乙醇))、二乙胺、依泊胺(1-(2-羥乙基)吡咯啶)、2-(二乙胺)-乙醇、乙醇胺(2-胺基乙醇) 、乙二胺、甘胺酸、海巴明、1H-咪唑、L-離胺酸、鎂、葡甲胺(N-甲基-葡萄糖胺)、4-(2-羥乙基)-嗎啉、哌嗪、鉀、鈉、三乙醇胺(2,2',2"-氮基-三(乙醇))、胺基丁三醇或鋅鹽。
在進一步特定實施例中，艾拉菲諾的鹽類選自艾拉菲諾的胺基丁三醇、鉀、鈉、L-精胺酸(L-arginate)、苄苯乙胺、苄星、乙醇胺、葡甲胺、甘胺酸、叔丁胺、L-離胺酸、膽鹼、依泊胺、鎂或2-胺基2-甲基-1丙醇鹽。在又另一實施例中，艾拉菲諾的鹽類選自胺基丁三醇、鉀、鈉及L-精胺酸艾拉菲諾鹽。在另一實施例中，艾拉菲諾的鹽類選自胺基丁三醇、鉀及L-精胺酸艾拉菲諾鹽。在進一步的實施例中，艾拉菲諾的鹽類為艾拉菲諾的胺基丁三醇鹽。
在另一實施例中，艾拉菲諾鹽選自下列鹽類I至鹽類XV，且其可形成結晶形式： I.           結晶狀(crystalline)艾拉菲諾胺基丁三醇鹽(鹽類I)具有包含下列繞射峰值(以角度程度±0.2°的2θ表示)的X射線繞射圖樣：6.5°、12.2°、15.0°、15.3°、16.9°、17.3°、17.6°、18.4°、19.4°以及22.6°。 藉由示差掃描熱析儀在5°C/分鐘的加熱速率下艾拉菲諾胺基丁三醇鹽(鹽類I)具有148°C的熔點。 II.        結晶狀艾拉菲諾鉀鹽(鹽類II)具有包含下列繞射峰值(以角度程度±0.2°的2θ表示)的X射線繞射圖樣：4.6°、8.0°、11.7°、13.1°以及13.6°。 藉由示差掃描熱析儀在5°C/分鐘的加熱速率下艾拉菲諾鉀鹽(鹽類II)具有247°C的熔點。 III.     藉由示差掃描熱析儀在5°C/分鐘的加熱速率下艾拉菲諾鈉鹽(鹽類III)具有261°C的熔點。 IV.    結晶狀艾拉菲諾L-精胺酸鹽(鹽類IV)具有包含下列繞射峰值(以角度程度±0.2°的2θ表示)的X射線繞射圖樣：3°、5.9°、8.8°、11.7°、13.2°、19.8°以及19.9°。 藉由示差掃描熱析儀在5°C/分鐘的加熱速率下艾拉菲諾L-精胺酸鹽(鹽類IV)具有167°C的熔點。 V.       藉由示差掃描熱析儀在5°C/分鐘的加熱速率下艾拉菲諾苄苯乙胺鹽(鹽類V)具有125-158°C的熔點，其對應於多晶型簇(polycrystalline cluster)的熔化(melting)。 VI.    藉由示差掃描熱析儀在5°C/分鐘的加熱速率下艾拉菲諾苄星鹽(鹽類VI)具有138-148°C的熔點，其對應於桿型(rods)及多晶型簇的熔化。 VII. 藉由示差掃描熱析儀在5°C/分鐘的加熱速率下艾拉菲諾乙醇胺鹽(鹽類VII)具有118-160°C的熔點，其對應於等同物(equants)的熔化。 VIII.         藉由示差掃描熱析儀在5°C/分鐘的加熱速率下艾拉菲諾葡甲胺鹽(鹽類VIII)具有對應於兩種多晶型簇熔化的為35-88°的第一熔點以及為133-158°C的第二熔點。 IX.    藉由示差掃描熱析儀在5°C/分鐘的加熱速率下艾拉菲諾甘胺酸鹽(鹽類IX)具有對應於等同物熔化的第一熔點為148-188°C，對應於標準品(stands)/條板(laths)熔化的第二熔點為178-223°C。 X.       藉由示差掃描熱析儀在5°C/分鐘的加熱速率下艾拉菲諾叔丁胺鹽(鹽類X)具有148-161°C的熔點，其對應於多晶型簇的熔化。 XI.    藉由示差掃描熱析儀在5°C/分鐘的加熱速率下艾拉菲諾L-離胺酸鹽(鹽類XI)具有104-162°C的熔點，其對應於多晶型簇的熔化。 XII. 藉由示差掃描熱析儀在5°C/分鐘的加熱速率下艾拉菲諾膽鹼鹽(鹽類XII)具有116-159°C的熔點，其對應於多晶型簇的熔化。 XIII.         藉由示差掃描熱析儀在5°C/分鐘的加熱速率下艾拉菲諾依泊胺鹽(鹽類XII)具有108-158°C的熔點，其對應於多晶型簇的熔化。 XIV.        艾拉菲諾鎂鹽(鹽類XIV)。鎂鹽顯示142-162°C的熔點，其對應於多晶型簇的溶化接著是棒劑(sticks)的熔化(163-215°C)。 XV.           艾拉菲諾2-胺基2-甲基-1丙醇鹽(鹽類XV)。鹽類XV具有138-161°C的熔點，其對應於等同物及片晶(platelets)的熔化。
在另一實施例中，艾拉菲諾鹽選自結晶形式的胺基丁三醇、鉀以及L-精胺酸艾拉菲諾鹽的鹽類I至鹽類XV。在進一步的實施例中，艾拉菲諾的鹽類為結晶形式的艾拉菲諾之胺基丁三醇鹽。
示差掃描熱析儀或DSC為熱分析技術，其中測量樣品與參考物溫度增加所需要之熱含量(amount of heat)的差異作為溫度的函數。DSC數據顯示相對於溫度繪示的熱流(heat flow)差值。當樣品進行熱事件時，其有效的根據與熱事件相關的潛熱(latent heat)改變熱流，然後反映在基線上的峰值或位移。DSC可用於表示如熔化溫度(melting temperature)或融合熱(heat of fusion)之結晶型的熱特性。因此，可藉由DSC特性化本文揭露的艾拉菲諾之鹽類的熔點。
單晶X射線繞射(single-crystal X-ray diffraction)提供結晶型中有關原子及鍵結位置的三維結構資訊。然而，由於例如不足的結晶大小或難以製備足夠用於單晶X射線繞射之品質的結晶，從結晶形式取得這些結構並不是一直可能或可行。然而，結構鑑別資訊可以從其他如X射線粉末繞射及拉曼光譜法(Raman spectroscopy)的固態技術取得。這些技術用於在固態結晶形式上產生數據。當曾經在已知的晶型上收集數據，所述數據能夠用來鑑別在其他材料中的那種結晶形式的存在。因此，這些數據有效地特性化結晶形式。例如，X射線粉末繞射圖樣或其的一部份可以作為特性化結晶形式的指紋。X射線粉末繞射曲線(plot)為具有x軸上之散射角2θ(繞射)及y軸上之強度的x-y圖。在此曲線當中的峰值可用於特性化結晶形式。儘管在整個散射圖當中的峰值可用來特性化結晶形式，更具特徵的峰值(more characteristic peaks)的子集(subset)亦可用來更準確的特性化結晶形式。因為峰值強度可隨著樣品定向(orientation)變化，數據經常藉由在x軸上峰值的位置表示而不是在y軸上強度的峰值來表示。在x軸上的峰值位置亦具有變異性(variability)。此變異性有幾種來源，其中一種來自樣品的製備。
在不同狀態下製備相同結晶材料的樣品可得到些微不同的散射圖。如顆粒大小、濕氣含量、溶劑含量及定向等因子可影響樣品如何散射X射線。另一個變異的來源來自儀器參數。不同X射線儀器的操作使用不同的參數，且這些可導致來自相同結晶型樣品之些微不同的散射圖樣。相似地，不同的套裝軟體對X射線數據的處理不同，且此也導致了變異性。這些及其他變異性的來源為所屬技術領域者所習知。由於這些變異性的來源，通常提及X射線散射峰值時在以2θ表示峰值之前使用用語「大約」。用語「大約」併入了在多數樣品狀態及多數數據收集及數據處理條件的此變異性，導致大約正或負0.2的散射角(2θ)的在峰值的變異性。因此，在多數樣品、數據收集及數據處理條件下，當述及峰值為大約在10.5散射角(2θ)時，所述峰值會在10.3(2θ)及10.7(2θ)之間的任何位置出現。
高效液相層析儀或HPLC為用以從混合物中分離各化合物，以鑑別各化合物並對各化合物定量的層析技術。HPLC為所屬技術領域中用來測定化合物純度的技術。
如所屬技術領域具有通常知識者已知，可使用HPLC偵測艾拉菲諾的鹽類I至鹽類XV的純度。
在本發明的較佳實施例中，鹽類I至鹽類XV實質上不含雜質。「實質上不含(substantially free)」意指在本發明中鹽類I至鹽類XV包含低於10%、較佳為低於5%以及更佳為低於2%的雜質或不純物，再更佳為低於1%的雜質或不純物。
在本發明某些實施例中，雜質的實質上不存在意為如形成酸的鹽、殘留溶劑或任何其他可能從艾拉菲諾的製備及/或分離而得的雜質之外來物的實質上不存在。
發明人已取得具有下列在350 nm下測量的百分比面積之光譜純度的化合物之鹽類形式： -鹽類I具有99.9%的純度。 -鹽類II具有100%的純度。 -鹽類III具有99.7%的純度。 -鹽類IV具有99.8%的純度。
本發明進一步的態樣提供用於製備實質上純的艾拉菲諾之鹽類的方法。如本文所使用詞彙「實質上純的(substantially pure)」意指所述鹽類具有大約90%重量百分比的純度，較佳為大約95%重量百分比以及更佳為大約98%重量百分比。
一般而言，在一些實施例中，用於製備實質上純的艾拉菲諾之鹽類I至鹽類XV的方法包含將艾拉菲諾與溶劑接觸以形成飽和或接近飽和的溶液。因此，本文揭露的所有晶型藉由在成熟(maturation)步驟期間將艾拉菲諾溶解於不同類型的溶劑製備。一些鹽類可於再結晶步驟後取得。
用於所述方法中的溶劑可改變。具體而言，溶劑可為質子溶劑(protic solvent)、非質子溶劑(aprotic solvent)或其組合。接觸溶劑的艾拉菲諾可為固體形式(例如，粉劑)或液體形式(例如，在包含共溶劑的溶液中或經濃縮的油劑/凝膠/膠劑)。所述方法的溫度也可改變。
在本發明的特定實施例中，在避光下完成溶解。
在一些實施例中，如選自鹽類I至鹽類XV之艾拉菲諾的鹽類係如部分水合的至少部分溶合(solvated)。在另一實施例中，如選自鹽類I至鹽類XV之艾拉菲諾的鹽類係不溶合的，鹽類特別為無水的(anhydrous)。
根據本發明的特定實施例，較佳為鹽類I、鹽類II、鹽類III以及鹽類IV。根據進一步實施例，較佳為結晶型的鹽類I、鹽類II以及鹽類IV。
根據另一實施例，本發明關於艾拉菲諾的胺基丁三醇鹽(鹽類I)。在另一實施例中，本發明關於結晶型的艾拉菲諾的胺基丁三醇鹽(鹽類I)。
本發明的另一態樣關於包含如上述鹽類之艾拉菲諾之鹽類的藥物組合物，特別是選自鹽類I至鹽類XV的鹽類。
在特定實施例中，藥物組合物包含鹽類I、鹽類II、鹽類III或鹽類IV。在另一特定實施例中，藥物組合物包含結晶型的鹽類I、鹽類II或鹽類IV。
在更特定的實施例中，藥物組合物包含鹽類I。
藥物組合物可包含在上述任何實施例中之艾拉菲諾的鹽類及藥學上可接受的賦形劑。
藥物組合物包含治療有效劑量的艾拉菲諾之鹽類。
本組合物可以任何投藥(administration)的形式配製。例如，組合物可被配製用以口服、局部、腸胃外(parenterally)、腸內(enterally)或藉由吸入(inhalation)投藥。艾拉菲諾的鹽類可配製成用以單獨投藥或與常規藥學的載體、稀釋劑或賦形劑組合，所述載體、稀釋劑或賦形劑可為液體或固體。可接受的固體載體、稀釋劑或賦形劑可作為在其他東西中的結合劑、崩散劑(disintegrant)、填料、潤滑劑(lubricant)、助滑劑(glidant)、壓縮助劑(compression aid)、加工助劑(processing aid)、顏料、甜味劑、防腐劑、懸浮/分散劑、錠劑崩解劑(tablet disintegrating agent)、包埋材料(encapsulating material)、成膜劑或被膜(coating)、調味劑(flavoring agent)或印刷油墨(printing ink)的功能。任何用於製備任何劑量單位形式的材料較佳為藥學上純的且實質上在使用的含量上無毒性。
此外，艾拉菲諾的鹽類可併入緩釋製劑及配方中。在這種情況下的投藥包含藉由特別是(inter alia)下列路徑投藥：口服；靜脈內(intravenous)、肌肉內(intramuscular)、皮下(subcutaneous)、眼內(intraocular)、滑液囊內(intrasynovial)、包含經皮(transdermal)的上皮(transepithelial)、眼用(ophthalmic)、舌下(sublingual)及口頰的(buccal)；包含眼的局部(topically)、皮的(dermal)、眼的(ocular)、直腸的(rectal)及經由吹氣的鼻腔吸入(nasal inhalation via insufflation)、噴霧劑(aerosol)以及直腸全身(rectal systemic)。
在粉劑中，載體、稀釋劑或賦形劑可以是與細碎的活性成分混合之細碎的固體。在錠劑中，活性成分與載體、稀釋劑或賦形劑混合，所述載體、稀釋劑或賦形劑以適當的比例具有必要壓縮特性，並以所需的形狀及大小壓縮。對於口服治療性投藥，活性化合物可與載體、稀釋劑或賦形劑併用，並以可消化的錠劑、口頰錠(buccal tablets)、喉錠(troches)、膠囊、酏劑(elixirs)、懸浮劑、糖漿、薄片(wafers)及其類似物的形式使用。在這種治療性有效的組合物中，活性化合物的含量較為優良，以使能夠獲得合適的劑量。
液體載體、稀釋劑或賦形劑可以用來製備溶液、懸浮劑、乳劑、糖漿、酏劑及其類似物。本發明的活性成分可以溶解或懸浮在如水、有機溶劑、兩者之混合物之藥學上可接受的液體，或藥學上可接受的油脂或脂肪中。液態載體、稀釋劑或賦形劑可以含有其他合適的藥學添加劑，如助溶劑(solubilizers)、乳化劑(emulsifiers)、緩衝劑、防腐劑、甜味劑、調味劑、懸浮劑、增稠劑、顏料、黏度調節劑、穩定劑或滲透壓調節劑(osmo-regulators)。
合適的固體載體、稀釋劑或賦形劑可包含例如磷酸鈣(calcium phosphate)、二氧化矽(silicon dioxide)、硬酯酸鎂(magnesium stearate)、滑石(talc)、糖、乳糖(lactose)、糊精(dextrin)、澱粉、明膠(gelatin)、纖維素、甲基纖維素(methyl cellulose)、乙基纖維素(ethylcellulose)、羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose)、微晶型纖維素(microcrystalline cellulose)、聚乙烯吡咯啶(polyvinylpyrrolidine)、低熔點蠟(low melting waxes)、離子交換樹脂(ion exchange resins)、交聯縮甲基纖維素(croscarmellose carbon)、***膠(acacia)、預糊化澱粉(pregelatinized starch)、吡咯烷酮(crospovidone)、HPMC、聚乙烯吡咯烷酮(povidone)、二氧化鈦(titanium dioxide)、多晶纖維素(polycrystalline cellulose)、氫氧化甲基鋁(aluminum methahydroxide)、瓊脂(agar-agar)、西黃蓍膠(tragacanth)或其混合物。
液體載體、稀釋劑或賦形劑合適的實例例如，用於口服、局部或腸胃外投藥的包含水(特別是含有如上所述的添加劑，例如纖維素衍生物，較佳為羧甲基纖維素鈉溶液)、酒精(包含一元醇(monohydric alcohols)及多元醇(polyhydric alcohols)，例如乙二醇)及其衍生物以及油脂(例如，經分餾的椰子油及花生油(arachis oil))或其混合物。
用於腸胃外投藥的載體、稀釋劑或賦形劑亦可為油酯(oily ester)，如油酸乙酯(ethyl oleate)及肉豆蔻酸異丙酯(isopropyl myristate)。也考慮到用於腸胃外投藥之無菌液體形式組合物的無菌液體載體、稀釋劑或賦形劑。作為游離鹼或藥學上可接受的鹽之活性化合物的溶液可以在適當地混合有界面活性劑的水中製備，如羥丙基纖維素(hydroxypropylcellulose)。也可在甘油(glycerol)、液體聚乙二醇(liquid polyethylene glycols)及其混合物以及油脂中製備懸浮劑。在儲存及使用的原始狀態下，這些製備方法可以含有防腐劑以避免微生物的生長。
適合用於注射使用的藥學形式包含例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solutions)或分散液、及用臨時製備無菌的可注射溶液或分散液的無菌粉末(sterile powder)。在所有情況下，此形式較佳為無菌的且為以可容易注射(easy syringability)的流體。其較佳在製造及儲存的條件下為穩定且較佳為防止如細菌及真菌的微生物污染作用。載體、稀釋劑或賦形劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇(propylene glycol)、液體聚乙二醇(liquid polyethylene glycol)及其類似物)、其合適的混合物及植物油的溶劑或分散介質。可維持適當的流動性(proper fluidity)，例如，藉由使用如卵磷脂(lecithin)的被膜、藉由在分散體的條件下對所需顆粒尺寸的維持以及藉由表面活性劑的使用。防止微生物的作用可藉由各種抗菌劑和抗真菌劑來達成，例如對羥苯甲酸(paraben)、氯丁醇(chlorobutanol)、酚、抗壞血酸、硫柳汞(thimerosal)及其類似物。在許多情況下，較佳為包含例如糖或氯化鈉的等滲劑(isotonic agents)。可注射劑型組成物的吸收之延長可藉由在組成物中使用如單硬脂酸鋁(aluminum monostearate)或凝膠(gelatin)來延遲吸收而達到。
無菌可注射溶液可藉由將藥學上適當量的艾拉菲諾的鹽，在適當的溶劑中，根據需要與上述列舉的各種其他成分併用，然後過濾滅菌來製備。一般而言，分散劑可藉由併入無菌活性成分至含有基本分散介質及來自上述列舉的所需其它成分的無菌載體來製備。在用於無菌注射溶液的製備之無菌粉末情況中，較佳的製備的方法可包含產生活性成分(ingredients)或產生活性成分(ingredients)之真空乾燥及冷凍乾燥技術，並加上從前述無菌過濾的溶液其本身得到的任何額外地所需成分。
亦揭露的是，產生這些藥物組合物的方法，所述方法包含結合艾拉菲諾之鹽類與藥學上可接受之賦形劑。可根據本發明的方法使用任何將活性劑與藥學上可接受的賦形劑結合的方法，且所屬領域具有通常知識者能夠輕易理解合適的組合技術。在一些實施例中，組合的步驟可以如將所需量的艾拉菲諾之鹽類加入現存的物質中一樣簡單，如液體飲料(beverage)或粉末飲料混合物。在另一實施例中，組合的步驟包含通常用於混合活性劑與賦形劑以製備藥劑形式(例如，固體、半固體、液體或適合用於吸入的形式)、化妝品項目(如粉末、乳霜、乳液或軟化劑)或食品項目(例如，固體、半固體或液體)的任何技術。
另一方面，本揭露提供一種用於在所需的個體中治療疾病的治療方法，所述方法包含對所述個體施予艾拉菲諾的鹽類。艾拉菲諾的鹽類可藉由任何上述的路徑並結合本發明之藥物組合物來施予。
所述個體為哺乳類個體，較佳為人類個體。然而，所述個體亦可為任何包含實驗動物的動物。因此，所屬技術領域具有通常知識者可以輕易理解本發明的鹽類、結晶形式及組合物特別適合用於施予至任何動物，特別是哺乳類，且包含但不旨在限於人類、如貓(feline)或犬(canine)個體之家畜、如但不限於牛(bovine)、馬(equine)、山羊(caprine)、綿羊(ovine)及豬(porcine)個體之農場動物、野生動物(不論在野外或動物園)、如小鼠(mice)、大鼠(rats)、兔(rabbits)、山羊(goats)、綿羊(sheep)、豬(pigs)、狗(dogs)、貓(cats)及其類似動物的實驗動物、如雞(chickens)、火雞(turkeys)、鳴禽(songbirds)及其類似動物的禽類(avian species)，亦即用於獸醫用途。
本發明的鹽類可用於治療數種疾病或狀態的方法。具體而言，本發明之艾拉菲諾的鹽類係施予所需的個體以治療揭露於WO 2004/005233、WO 2004/005243、WO 2011/064350或WO 2014/111584中的任何疾病或狀態。
具體而言，艾拉菲諾的鹽類有效用於如免疫、發炎、代謝、纖維化和膽汁淤積之疾病的治療。在一特定實施例中，所述疾病選自由代謝性肝疾病、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性肝炎(NASH)、藥物引發的肝臟疾病、酒精引發的肝臟疾病、感染劑引發的肝臟疾病、發炎性肝臟疾病、免疫系統缺陷介導的肝臟疾病(immune system dysfunction-mediated liver diseases)、血脂異常(dyslipidemia)、心血管疾病、再狹窄(restenosis)、X症候群(syndrome X)、代謝症候群、糖尿病、肥胖、高血壓(hypertension)、如原發性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis)(PSC)、原發型膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)(PBC)的慢性膽管病(chronic cholangiopathies)、膽道閉鎖(biliary atresia)、第三型進行性家族性肝內膽汁鬱積(progressive familial intrahepatic cholestasis type 3)(PFIC3)、炎症性腸疾病(inflammatory bowel disease)、克隆氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis)、瘢瘤(keloid)、老年心臟梗塞(old myocardial infarction)、硬皮症/全身性硬化症(scleroderma/systemic sclerosis)、發炎性疾病、神經退化疾病(neurodegenerative diseases)、癌症、肝癌、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma)、胃腸癌(gastrointestinal cancer)、胃癌(gastric cancer)、與神經纖維瘤相關的腦膜瘤(meningioma associated with neurofibromatosis)、胰神經內分泌瘤(pancreatic neuroendocrine tumors)、胰外分泌瘤(pancreatic exocrine tumors)、白血病(leukemia)、骨髓增生/骨髓發育不良疾病(myeloproliferative/myelodisplastic diseases)、肥大細胞增多症(mastocytosis)、皮膚纖維肉瘤(dermatofibrosarcoma)、包含乳癌、肺癌、甲狀腺癌或直腸癌的實體瘤(solid tumors)、***癌(prostate cancer)、任何起因的肝纖維化或硬化、代謝疾病引發的肝纖維化或硬化、NAFLD引發的纖維化或硬化、NASH引發的纖維化或硬化、酒精引發的肝纖維化或硬化、藥物引發的肝纖維化或硬化、感染劑引發的肝纖維化或硬化、寄生蟲感染引發的肝纖維化或硬化、細菌感染引發的肝纖維化或硬化、病毒感染引發的纖維化或硬化、HBV感染引發的肝纖維化或硬化、HCV感染引發的肝纖維化或硬化、HIV感染引發的肝纖維化或硬化、HCV及HIV雙重感染引發的肝纖維化或硬化、輻射或化療引發的纖維化或硬化、膽道纖維化(biliary tract fibrosis)、由任何慢性膽汁鬱積疾病引起的肝纖維化或硬化、任何病因的腸管纖維化(gut fibrosis of any etiology)、克隆氏病引發的纖維化、潰瘍性結腸炎引發的纖維化、腸(例如，小腸)纖維化、大腸纖維化(colon fibrosis)、胃纖維化(stomach fibrosis)、皮膚纖維化(skin fibrosis)、表皮纖維化(epidermis fibrosis)、內皮纖維化(endodermis fibrosis)、由硬皮症/全身性硬化症引起的皮膚纖維化、肺纖維化(lung fibrosis)、與如COPD、氣喘(asthma)、肺氣腫(emphysema)、吸菸者的肺纖維化(smoker’s lung fibrosis)、結核病(tuberculosis)、肺纖維變性(pulmonary fibrosis)、特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis)(IPF)的慢性感染性氣道疾病繼發的(consecutive to)肺纖維化、心纖維化(heart fibrosis)、腎纖維化(kidney fibrosis)、腎性全身性纖維化(nephrogenic systemic fibrosis)、肌肉纖維化(muscle fibrosis)、軟組織(例如，縱膈(mediastinum)或腹膜(retroperitoneum))纖維化、骨髓纖維化(bone marrow fibrosis)、關節纖維化(joint fibrosis)、肌腱纖維化(tendon fibrosis)、軟骨纖維化(cartilage fibrosis)、胰纖維化(pancreas fibrosis)、子宮纖維化(uterus fibrosis)、神經系統纖維化(nervous system fibrosis)、睪丸纖維化(testis fibrosis)、卵巢纖維化(ovary fibrosis)、腎上腺纖維化(adrenal gland fibrosis)、動脈纖維化(artery fibrosis)、靜脈纖維化(vein fibrosis)、眼纖維化(eye fibrosis)、心肌內膜纖維化(endomyocardial fibrosis)、縱隔纖維化(mediastinal fibrosis)、骨髓纖維化(myelofibrosis)、腹膜後纖維化(retroperitoneal fibrosis)、進階大區域纖維化(progressive massivefibrosis)(一種煤工塵肺(coal workers' pneumoconiosis)的併發症)、增生性纖維化(proliferative fibrosis)、腫瘤性纖維化(neoplastic fibrosis)、植入周圍纖維化(peri-implantational fibrosis)及石綿肺症(asbestosis)、關節纖維化(arthrofibrosis)、黏連性肩關節囊炎(adhesive capsulitis)所組成之群組。
在一特定實施例中，疾病選自由代謝性肝疾病、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性肝炎(NASH)、藥物引發的肝臟疾病、酒精引發的肝臟疾病、感染劑引發的肝臟疾病、發炎性肝臟疾病、免疫系統缺陷介導的肝臟疾病、血脂異常、心血管疾病、再狹窄、X症候群、代謝症候群、糖尿病、肥胖、高血壓、如原發性硬化性膽管炎(PSC)、原發型膽汁性肝硬化(PBC)的慢性膽管病、膽道閉鎖、第三型進行性家族性肝內膽汁鬱積(PFIC3)、炎症性腸疾病、克隆氏病、潰瘍性結腸炎、肝癌、肝細胞癌、胃腸癌、胃癌、大腸直腸癌(colorectal cancer)、代謝疾病引發的肝纖維化或硬化、NAFLD引發的纖維化或硬化、NASH引發的纖維化或硬化、酒精引發的肝纖維化或硬化、藥物引發的肝纖維化或硬化、感染劑引發的肝纖維化或硬化、寄生蟲感染引發的肝纖維化或硬化、細菌感染引發的肝纖維化或硬化、病毒感染引發的纖維化或硬化、HBV感染引發的肝纖維化或硬化、HCV感染引發的肝纖維化或硬化、HIV感染引發的肝纖維化或硬化、HCV及HIV雙重感染引發的肝纖維化或硬化、輻射或化療引發的纖維化或硬化、膽道纖維化、由任何慢性膽汁鬱積疾病引起的肝纖維化或硬化、任何病因的腸管纖維化、克隆氏病引發的纖維化、潰瘍性結腸炎引發的纖維化、腸(例如，小腸)纖維化、大腸纖維化、胃纖維化、肺纖維化、與如COPD、氣喘、肺氣腫、吸菸者的肺纖維化、結核病、肺纖維變性、特發性肺纖維化(IPF)的慢性感染性氣道疾病繼發的肺纖維化所組成之群組。
在進一步的態樣中，艾拉菲諾的鹽類用於纖維母細胞(fibroblasts)的增生及/或活化的抑制，所述纖維母細胞負責膠原纖維的產生及/或負責細胞外基質(extracellular matrix)的產生。
根據本發明，術語「自體免疫疾病(autoimmune diseases)」用於指明由人體對體內正常存在的物質及組織的異常免疫反應引起的狀態。所述疾病可以受限於某些器官(例如，在第一型糖尿病或自體免疫甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis))或涉及在不同位置的特定組織(例如，古巴士德氏病(Goodpasture’s disease)對肺及腎的基底膜造成影響)。
術語「發炎(inflammation)」用於指明由涉及宿主細胞、血管、蛋白質及其他介體(mediators)所產生的保護性反應，其可以用於消除細胞/組織損傷的成因以及原有損傷導致之壞死細胞/組織，並開始進行修復的狀態。發炎反應可藉由疼痛、熱、發紅、腫脹、血管擴張、血流加速及功能喪失來顯現。
根據本發明，術語「纖維化(fibrosis)」、「纖維變性疾病(fibrotic disease)」、「纖維變性異常(fibrotic disorder)」及其傾向(declinations)表示在器官或組織過度地沉積纖維結締組織的病理狀態。更具體而言，纖維化為對組織受損做出反應時，由結締組織形成持久纖維性傷痕及過度產生細胞外基質病理過程。生理上地，結締組織的沉積會破壞基礎(underlying)器官/組織的結構(architecture)及功能。
根據本發明，纖維化或纖維變性異常可能與任何器官或組織纖維化相關。特定的器官纖維化之說明性、非限制性的實例包含肝臟、腸管、腎臟、皮膚、表皮、內皮、肌肉、肌腱、軟骨、心臟、胰臟、肺臟、子宮、神經系統、睪丸、陰莖、卵巢、腎上腺、動脈、靜脈、腸(例如，小腸)、膽道、軟組織(例如，縱膈或腹膜)、骨髓、關節或胃纖維化，特別是肝臟、腎臟、皮膚、表皮、內皮、肌肉、肌腱、軟骨、心臟、胰臟、肺臟、子宮、神經系統、睪丸、卵巢、腎上腺、動脈、靜脈、腸(例如，小腸)、膽道、軟組織(例如，縱膈或腹膜)、骨髓、關節、眼或胃纖維化。
根據本發明，術語「膽汁鬱積(cholestasis)」、或「膽汁鬱積性疾病(cholestatic disease)」、或「膽汁鬱積性異常(cholestatic disorder)」及其傾向表示由肝細胞分泌受損或經由肝內或肝外膽管阻塞膽汁流量而導致膽汁流量減少定義的病理狀態。因此，膽汁鬱積的臨床定義為正常應排至膽囊的物質被保留的任何狀態。
在一特定的實施例中，纖維變性異常選自由肝臟、腸管、肺臟、心臟、腎臟、肌肉、皮膚、軟組織(例如，縱膈或腹膜)、骨髓、腸以及關節(例如，膝蓋、肩膀或其他關節)纖維化所組成之群組。
在一特定實施例中，纖維變性異常選自由肝臟、肺臟、皮膚、腎臟及腸纖維化所組成之群組。
在本發明的更特定的實施例中，經治療的纖維變性異常選自下列纖維化疾病的非全面的清單所組成之群組：非酒精性肝炎(NASH)、肺纖維變性、特發性肺纖維化、皮膚纖維化、眼纖維化(如囊膜性纖維化(capsular fibrosis))、心肌內膜纖維化、縱隔纖維化、骨髓纖維化、腹膜後纖維化、進階大區域纖維化(一種煤工塵肺的併發症)、增生性纖維化、腫瘤性纖維化、慢性感染性氣道疾病繼發的肺纖維化(COPD、氣喘、肺氣腫、吸菸者的肺纖維化、結核病)、酒精或藥物引發的肝臟纖維化、肝硬化、感染引發的肝纖維化、輻射或化療引發的纖維化、腎性全身性纖維化、克隆氏病、潰瘍性結腸炎、瘢瘤、老年心臟梗塞、硬皮症/全身性硬化症、關節纖維化、黏連性肩關節囊炎的一些形式、如原發性硬化性膽管炎(PSC)、原發型膽汁性肝硬化(PBC)的慢性纖維化膽管病、膽道閉鎖、第三型進行性家族性肝內膽汁鬱積(PFIC3)、植入周圍纖維化以及石綿肺症。
膽汁鬱積由肝細胞分泌受損(肝細胞膽汁鬱積)而導致膽汁流量減少、或經由肝內或肝外膽管(intra-or extrahepatic bile ducts)阻塞膽汁流量(阻塞性膽汁淤積)來定義。在臨床實務上，膽汁鬱積為從肝臟流出的膽汁緩慢或阻塞。根據本發明的特定的實施例，硬化性疾病選自由原發型膽汁性肝硬化(PBC)、原發性硬化性膽管炎(PSC)、姙娠肝內膽汁滯留症(intrahepatic cholestasis of pregnancy)、進行性家族性肝內膽汁鬱積(progressive familial intrahepatic cholestasis)、膽道閉鎖、膽石病(Cholelithiasis)、感染性膽管炎(Infectious Cholangitis)、與蘭格漢氏細胞組織細胞增多病相關的膽管炎(Cholangitis associated with Langerhans cell histiocytosis)、Alagille症候群(Alagille syndrome)、非症候群性膽管缺乏(Non syndromic ductal paucity)、藥物引發的膽汁鬱積及全靜脈營養療法相關的膽汁鬱積(Total parenteral nutrition-associated cholestasis)所組成之群組。在較佳的實施例中，膽汁鬱積性疾病為PBC或PSC，特別是PBC。
發炎性疾病、纖維化疾病、代謝性疾病及膽汁鬱積性疾病的實例包含代謝性肝疾病、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性肝炎(NASH)、藥物引發的肝臟疾病、酒精引發的肝臟疾病、感染劑引發的肝臟疾病、發炎性肝臟疾病、免疫系統缺陷介導的肝臟疾病、血脂異常、心血管疾病、再狹窄、X症候群、代謝症候群、糖尿病、肥胖、高血壓、如原發性硬化性膽管炎(PSC)、原發型膽汁性肝硬化(PBC)的慢性膽管病、膽道閉鎖、第三型進行性家族性肝內膽汁鬱積(PFIC3)、炎症性腸疾病疾病、克隆氏病、潰瘍性結腸炎、瘢瘤、老年心臟梗塞、硬皮症/全身性硬化症、發炎性疾病、神經退化性疾病、癌症、肝癌、肝細胞癌、胃腸癌、胃癌、與神經纖維瘤相關的腦膜瘤、胰神經內分泌瘤、胰外分泌瘤、白血病、骨髓增生/骨髓發育不良疾病、肥大細胞增多症、皮膚纖維肉瘤、包含乳癌、肺癌、甲狀腺癌或直腸癌的實體瘤、***癌、任何起因的肝纖維化或硬化、代謝疾病引發的肝纖維化或硬化、NAFLD引發的纖維化或硬化、NASH引發的纖維化或硬化、酒精引發的肝纖維化或硬化、藥物引發的肝纖維化或硬化、感染劑引發的肝纖維化或硬化、寄生蟲感染引發的肝纖維化或硬化、細菌感染引發的肝纖維化或硬化、病毒感染引發的纖維化或硬化、HBV感染引發的肝纖維化或硬化、HCV感染引發的肝纖維化或硬化、HIV感染引發的肝纖維化或硬化、HCV及HIV感染引發的肝纖維化或硬化、輻射或化療引發的纖維化或硬化、膽道纖維化、由任何慢性膽汁鬱積疾病引起的肝纖維化或硬化、任何病因的腸管纖維化、克隆氏病引發的纖維化、潰瘍性結腸炎引發的纖維化、腸(例如，小腸)纖維化、大腸纖維化、胃纖維化、皮膚纖維化、表皮纖維化、內皮纖維化、由硬皮症/全身性硬化症引起的皮膚纖維化、肺纖維化、與如COPD、氣喘、肺氣腫、吸菸者的肺纖維化、結核病、肺纖維變性、特發性肺纖維化(IPF)的慢性感染性氣道疾病繼發的肺纖維化、心纖維化、腎纖維化、腎性全身性纖維化、肌肉纖維化、軟組織(例如，縱膈或腹膜)纖維化、骨髓纖維化、關節纖維化、肌腱纖維化、軟骨纖維化、胰纖維化、子宮纖維化、神經系統纖維化、睪丸纖維化、卵巢纖維化、腎上腺纖維化、動脈纖維化、靜脈纖維化、眼纖維化、心肌內膜纖維化、縱膈纖維化、骨髓纖維化、腹膜後纖維化、進階大區域纖維化(一種煤工塵肺的併發症)、增生性纖維化、腫瘤性纖維化、植入物周圍纖維化及石綿肺症、關節纖維化、黏連性肩關節囊炎。
特別是，所述疾病選自由代謝性肝疾病、非酒精性脂肪肝疾病 (NAFLD)、非酒精性肝炎 (NASH)、藥物引發的肝臟疾病、酒精引發的肝臟疾病、感染劑引發的肝臟疾病、發炎性肝臟疾病、免疫系統缺陷介導的肝臟疾病、血脂異常、心血管疾病、再狹窄、X症候群、代謝症候群、糖尿病、肥胖、高血壓、如原發性硬化性膽管炎(PSC)、原發型膽汁性肝硬化(PBC)的慢性膽管病、膽道閉鎖、第三型進行性家族性肝內膽汁鬱積(PFIC3)、炎症性腸疾病、克隆氏病、潰瘍性結腸炎、肝癌、肝細胞癌、胃腸癌、胃癌、大腸直腸癌、代謝疾病引發的肝纖維化或硬化、NAFLD引發的纖維化或硬化、NASH引發的纖維化或硬化、酒精引發的肝纖維化或硬化、藥物引發的肝纖維化或硬化、感染劑引發的肝纖維化或硬化、寄生蟲感染引發的肝纖維化或硬化、細菌感染引發的肝纖維化或硬化、病毒感染引發的纖維化或硬化、HBV感染引發的肝纖維化或硬化、HCV感染引發的肝纖維化或硬化、HIV感染引發的肝纖維化或硬化、HCV及HIV雙重感染引發的肝纖維化或硬化、輻射或化療引發的纖維化或硬化、膽道纖維化、由任何慢性膽汁鬱積疾病引起的肝纖維化或硬化、任何病因的腸管纖維化、克隆氏病引發的纖維化、潰瘍性結腸炎引發的纖維化、腸(例如，小腸)纖維化、大腸纖維化、胃纖維化、肺纖維化、與如COPD、氣喘、肺氣腫、吸菸者的肺纖維化、結核病、肺纖維變性、特發性肺纖維化(IPF)的慢性感染性氣道疾病繼發的肺纖維化所組成之群組。
根據本發明被治療的個體可基於幾種與發炎性、代謝性、纖維化及膽汁鬱積性疾病相關的標準來被選擇，如先前的藥物治療、相關的病理學、基因型、風險因子的暴露、病毒感染以及任何其他可藉由成像方法及免疫學、生物化學、酵素、化學或核酸偵測方法手段評估的生物標記。
本發明藉由參照下列實例進一步描述，以下詳細描述本發明之鹽類形式的製備。
實例
分析
HPLC法
以水柱，沃特斯公司，管柱Phenomenex Synergi Polar-RP (Water column Waters, column Phenomenex Synergi Polar-RP)，4.6 x 150 mm進行HPLC分析。表1呈現用於分析鹽類樣品的HPLC參數，特別是決定母含量(parent content)以確認化學計量(stoichiometry)。
表1：HPLC條件
Figure 108127655-A0304-0001
樣品的製備：
將大約1 mg的固體再結晶反應殘留物置入10 mL容量瓶中，然後以10ML MeOH溶解。樣品在MeOH中溶解之後立即處理溶液，將其包裝、避光儲存。
結果：所有對應至艾拉菲諾鹽的結晶樣品(形式I至形式IV)具有至少99.7%的純度百分比。
X射線粉末繞射(XRPD)分析
X射線粉末繞射(XRPD)分析以Brüker AXS D2 Phaser，在θ-θ組態(configuration)下使用銅對陰極(copper anti-cathode)、單晶矽樣品固持器以及Lynxeye偵測器進行。用於X射線圖樣所需的儀器操作狀態描述於表2中。
表2
Figure 108127655-A0304-0002
樣品的製備：
將粉末樣品以避免較佳定向(preferred orientation)(非隨機定向結晶)並確保樣品表面之平整度的方式分散在矽樣品持固器上。
形式I、形式II及形式IV(無水及脫水)的X射線散射分別繪示於第20圖、第21圖及第22圖。
光學顯微影像(Optical microscopy，OM)
藉由光學顯微影像的表徵化在配備有數位相機及電動平台(motorized stage)之LEICA DMIRB顯微鏡上進行。顯微鏡圖樣的擷取以Microvision Instruments影像分析站進行。
樣品的製備：
幾毫克的測試樣品放置在具有矽油的顯微鏡玻璃板上，以顯微鏡蓋玻片覆蓋，藉由在蓋玻片上施以輕壓分散然後分析。
以交叉偏振光記錄各種影像。
形式I的光學顯微影像繪示於第1圖。形式II的光學顯微影像繪示於第2a圖、第2b圖及第2c圖。形式III的光學顯微影像繪示於第3圖。形式IV的光學顯微影像繪示於第4a及第4b圖。形式V、形式VI、形式VII、形式VIII、形式IX、形式X、形式XI、形式XII、形式XIII、形式XIV及形式XV的光學顯微影像分別繪示於第5圖、第6圖、第7圖、第8圖、第9圖、第10圖、第11圖、第12圖、第13圖、第14圖及第15圖。
示差掃描熱析儀(DSC)
示差掃描熱析儀(DSC)分析在Q1000 TA儀器分析儀上進行。樣品在非氣密(non-airtight)鋁膠囊中秤重，然後其被褶起並放入熱量計烘箱中。樣品從室溫加熱至200°C。使用每分鐘5°C的升溫速度且烘箱持續通以每分鐘50 mL的氮氣氣流(Air Liquide gas, Alphagaz N2 quality)。
用於DSC圖譜所需的儀器操作狀態在表3中描述。形式I、形式II形式III及形式IV的DSC熱分析圖分別繪示於第16圖、第17圖、第18圖及第19圖。
表3
Figure 108127655-A0304-0003
光穩定性方案(protocol)
艾拉菲諾鹽粉末藉由暴露至根據對應於Heraeus SUNTEST CPS設備為在UV光下最大暴露17小時的ICH指南Q1B的UV光而被受壓(stressed)。
對於艾拉菲諾鹽中的每一個，將大約15 mg的樣品放置在石英管 (quartz cell)中。為了使僅由於在SUNTEST設備腔內溫度的降解與僅由於UV暴露的降解之間產生差異，避光的第二艾拉菲諾鹽樣品亦放置在SUNTEST腔中。所有樣品隨後以HPLC分析。
為了證實與母化合物相較時，鹽類中的每一個具有任何光穩定性的改善，艾拉菲諾游離酸亦藉由暴露在對艾拉菲諾鹽樣品所描述的相同條件的UV光下受壓。
溶解度評估
化合物的溶解度在pH 1、pH 3、pH 5及pH 7.4的緩衝水溶液中偵測。
飽和是在測試介質的給定體積中添加過量的活性成分而得。懸浮液在20°C下避光並藉由軌道攪拌超過24小時攪拌。
對於艾拉菲諾游離酸及在所有介質中，在24小時之後取得可溶性部分(fraction)。為了偵測所研究的鹽類能夠達到最大溶解程度，對於艾拉菲諾胺基丁三醇鹽及在所有介質中，在30分鐘、1小時、2小時及24小時之後取得可溶性部分。
30分鐘、1小時、2小時及/或24小時之後，藉由離心分離懸浮物並以允許其注射入層析系統的溶劑混合物稀釋。對於各介質在溶液中的濃度(以母濃度表示)藉由HPLC偵測(外標)。
24小時之後對藉由離心分離的不可溶解部分進行XRPD分析。
測試介質的製備： -      pH 1 HCl/KCl緩衝液：在100 mL容量瓶中將0.373 g KCl與13.4 ml HCl的混合物以去離子水加至100 mL完成。 -      pH 3 檸檬酸鹽緩衝液：將1.051 g 檸檬酸單水合物溶解於250 mL 的去離子水。以NaOH調整NaOH值至3。 -      pH 5 檸檬酸鹽/磷酸鹽緩衝液：製備溶液I：在100 mL容量瓶中將2.8392 g Na2 HPO4 以去離子水加至100 mL完成。製備溶液II：在100 mL容量瓶中將2.1004 g檸檬酸單水合物以去離子水加至100 mL完成。將48.5 mL溶液II加入51.5 mL溶液I。 -      pH 7.4 磷酸鹽緩衝液：在1L容量瓶中將38 g Na2 HPO4 •12H2 O及3.8 g Na2 HPO4 •2H2 O的混合物以去離子水加至1 L完成。
鹽類篩選
宏觀的觀察(Macroscopic observation)
可以分離出幾種固體殘留物，以用於將艾拉菲諾與所有相對離子結合。
對於經測試之相對離子的每一個，觀察到的固體殘留物並非全部以相同的特徵存在(顏色、尺寸/含量、固體殘留物的形狀及是否有任何可見的無晶形結晶)。考慮這些特性，可以為每個相對離子選擇要進一步特徵化(characteristics)的相關樣品。
當4種鹼(苄苯乙胺、L-精胺酸、氫氧化鉀及氫氧化鈉)與艾拉菲諾結合時，導致在幾種結晶介質中形成明顯的固體殘留物。
帶入物質進入艾拉菲諾之其他11種相對離子的結合，導致在一些結晶介質中產生固體殘留物，但具有較低量的固體物質或僅導致液體/玻璃狀(vitreous)殘留物，在這些玻璃狀殘留物中僅存在少量固體。
經分離之固體的顏色
重要而值得注意的是，當15種經測試的鹼中的5種鹼(苄苯乙胺、苄星、L-精胺酸、氫氧化鉀及氫氧化鈉)與艾拉菲諾結合時，導致在幾種結晶介質中具有大量材料含量的白色固體。
光學顯微影像
選擇一定數量的「相對離子/結晶介質(crystallization medium)」耦合物(couples)在交聯偏振光下藉由光學顯微影像觀察。可在不同樣品之間比較結晶的型態(當觀察到明確定義的晶體形狀時)。在此情況下，光學顯微影像分析在不同樣品(固態殘留物)上進行，以在所有經觀察的樣品中鑑別良好的結晶材料。
其他物理特性
已在各個感興趣的潛在鹽類目標中進行進一步的圖譜以及融化溫度範圍的比較，以最終確定所有經測試之相對離子之間的排名。
對於熱階顯微鏡(hot-stage microscopy)實驗，經分析樣品的熱行為(thermal behaviors)總結於表4中(艾拉菲諾單獨在各種介質中結晶的樣品也為了比較的目的而被分析)。
合成
根據WO2011144579描述的方法理解艾拉菲諾(下文實驗部分中的「化合物(compound)」)的合成，然後粗材料於異丙醇(isopropanol)中再結晶。
表4呈現經測試之鹼(相對離子)及對應的反應物及其之供應商的清單。
表4
Figure 108127655-A0304-0004
實例1：胺基丁三醇鹽(形式I)
以對應於1：1化學計量對1020.13 mg的艾拉菲諾游離酸添加321.45 mg之量的胺基丁三醇。加入4.05 mL的乙醇並在20分鐘內於70°C下避光攪拌懸浮液直到完全溶解。然後加入54 mL的乙酸乙酯。在70°C下攪拌溶液，且結晶反應在60分鐘內發生(永遠避光)：在交叉偏振光下觀察時係為雙折射的經聚集的白色顆粒的外觀。
胺基丁三醇鹽的懸浮液被允許冷卻至室溫(避光)，藉由過濾移除上清液。過濾的期間，固體材料藉由數毫升的第一濾液(帶回至結晶中，充氣(balloon)以移除固體殘留物)清洗一次，然後以數毫升的乙酸乙酯清洗一次。在真空90°C下2小時最終乾燥成粉末。
所得產率為大約92%(大約1.3 g回收)。
在第1圖中報告分離樣品的顯微鏡觀察。在正交偏光鏡(crossed polarizer)和分析器(analyzer)之間觀察時，顆粒的高度雙折射(birefringence)指出樣品被良好地結晶。
結晶樣品的熱分析圖僅在149°C的起始(onset)溫度下檢測到顯示一個強烈的熱吸收事件，其對應於艾拉菲諾胺基丁三醇鹽的熔點。
HPLC曲線(第24圖)繪示與參照母化合物比較時，在分離的固體中沒有活性成分的降解。批次純度為99.96%。
第20圖繪示鹽類I(在EtOH/AcEt中結晶)的X射線散射曲線，且表5列出第20圖的散射圖中XRPD峰值位置的數值。
表5
Figure 108127655-A0304-0005
基於XRPD及HPLC的結果，我們可以總結的是艾拉菲諾：胺基丁三醇的化學計量為1：1。
在不同pH下進行不同的溶解度測試。顯而易見的是艾拉菲諾胺基丁三醇鹽比在pH 7.4下的艾拉菲諾有更好的溶解度(參見表6)。
表6
Figure 108127655-A0304-0006
實例2：鉀鹽(形式II)
在CH3 CN中結晶的樣品
以對應於1：1化學計量對大約243 mg的艾拉菲諾游離酸添加42.29 mg的氫氧化鉀。用於溶解作用，加入4 mL的乙醇(在70°C下於旋轉蒸發器內攪拌)。為了完整溶解，攪拌延長幾分鐘。然後於70°C下蒸發溶劑(乙醇)以乾燥得到薄膜。薄膜以4 mL乙腈再懸浮，其導致立即的結晶作用。然後所得到的懸浮液保持在低於周邊溫度的溫度2小時，以進行更重要的結晶。上清液從瓶中移除且在動態真空於90°C下大約1小時最終乾燥成粉末之前，樣品以乙腈清洗兩次。
所得產率為大約75%。
在此鹽類樣品中艾拉菲諾的百分比藉由外標測定，藉由HPLC發現為89.6%，其與目標艾拉菲諾鉀鹽中91.0%的理論艾拉菲諾部分沒有明顯的差異(第25圖)。
產生之樣品的顯微鏡觀察在第2c圖中報告。在正交偏光鏡和分析器之間觀察時，顆粒的高度雙折射指出樣品被結晶。
結晶樣品的熱分析圖顯示兩個主要事件(參見第15圖)： - 以185°C的起始溫度(onset temperature)偵測到廣且小的吸熱轉變(endothermic transition)，其能夠對應至與焓鬆弛(enthalpic relaxation)相關的玻璃轉換(glass transition)或固體-固體轉換； -以247°C的起始溫度偵測到強烈的吸熱(endothermic)事件；此第二事件最有可能對應至艾拉菲諾鉀鹽的熔化。
第21圖繪示鹽類II(在CH3 CN中結晶)的X射線散射曲線，以及表7列出第21圖的散射圖中XRPD峰值位置的數值。
表7
Figure 108127655-A0304-0007
基於XRPD及HPLC結果，我們可以總結艾拉菲諾：鉀的化學計量為1：1。
實例3：鈉鹽(形式III)
在丙酮中結晶的樣品
首先將大約103 mg的艾拉菲諾游離酸溶解於1 mL的丙酮中(在旋轉蒸發器中於50°C下攪拌)。然後加入對應於1：1化學計量的268 μL體積之1N氫氧化鈉，攪拌持續數分鐘。所得到的溶液被允許冷卻至室溫，然後保持在低於周邊溫度的溫度下。儲存4天的期間之後，觀察到大量結晶。
從瓶中移除上清液，並在動態真空於90°C下大約2小時最終乾燥成粉末。所得產率為大約93%。
在此鹽類樣品中，艾拉菲諾的百分比藉由HPLC發現為87.3%。HPLC曲線繪示與參照母化合物(reference parent compound)比較時，在經分離的固體中沒有活性成分的降解(第26圖)。
產生之樣品的顯微鏡觀察在第3圖中報告。在正交偏光鏡和分析器之間觀察時，顆粒的高度雙折射指出樣品被良好地結晶。
結晶樣品的熱分析圖顯示三個主要事件(參見第16圖)： - 以22°C的起始溫度偵測到廣的吸熱轉變，其對應於乾燥終點或塊材(bulk)上的經吸附的水的損失； - 以209°C的起始溫度偵測到小的放熱(exothermic)事件，其可能對應於鹽類之非晶部分的結晶反應成結晶鹽的形式、或固體-固體轉換； - 以261°C的起始溫度偵測到強烈的吸熱事件；此第三事件對應於艾拉菲諾鈉鹽的熔化。
基於DSC及HPLC結果，我們可以總結艾拉菲諾：鈉的化學計量為1：1。
實例4a：精胺酸鹽(形式IV)
通用程序：以對應於1：1化學計量對大約214 mg的艾拉菲諾游離酸添加97.10 mg之量的L-精胺酸。加入6 mL的丙酮及1.5 mL的水(在50°C下於旋轉蒸發器中攪拌)用於溶解作用。在完整溶解化合物兩者之前，發生再結晶且出現白色和片狀固體殘留物。
在丙酮中結晶的樣品
所得到的懸浮液被允許冷卻至室溫，且然後以丙酮及1,4-二氧陸圜(dioxane 1-4)清洗，在顆粒最終再懸浮於苯甲酮(cateone)之前於真空下乾燥。於丙酮中的懸浮液中的經清洗的殘留物保持在低於周邊溫度下。儲存14天的期間之後，觀察到具有非常小之顆粒的懸浮液。
粉末最終藉由在真空下過濾來被分離。
所得產率為大約84%。
產生之樣品的顯微鏡圖在第4a圖中報告。在正交偏光鏡和分析器之間觀察時，顆粒的雙折射指出樣品被結晶。
結晶的樣品熱分析圖顯示3個吸熱事件，其顯示所述批次包含天然的艾拉菲諾游離酸。
在丙酮/H2 O中結晶的樣品
攪拌延長至30分鐘，以發生更重要的結晶。粉末最終藉由在真空下過濾來被分離。
所得產率為大約82%。
在此鹽類樣品中，艾拉菲諾的百分比藉由HPLC發現為68%，此與在目標艾拉菲諾精胺酸鹽中的71.1%的理論艾拉菲諾部分沒有明顯的差異。HPLC曲線繪示與參照母化合物比較時，在經分離的固體中沒有活性成分的降解(第26圖)。
產生之樣品的顯微鏡觀察在第4b圖中報告。當在正交偏光鏡和分析器之間觀察時，顆粒的雙折射指出樣品被結晶。
結晶樣品的熱分析圖僅顯示以167°C的起始溫度偵測到一個強烈的吸熱事件，其對應至艾拉菲諾精胺酸鹽的熔化並伴隨熱分解(decompositio)(不穩定訊號)。
第22圖繪示鹽類IV(在丙酮/H2 O中結晶)的X射線散射曲線，以及表8列出第22圖的散射圖中XRPD峰值位置的數值。
表8：
Figure 108127655-A0304-0008
基於DSC及HPLC結果，我們可以總結艾拉菲諾：精胺酸的化學計量為1：1。
實例4b：精胺酸水合鹽
大約20 mg之實例4a的樣品提交至具有在脫附相(desorption phase)中於60%RH停止的動態蒸氣吸附(Dynamic Vapor Sorption)(DVS)循環中。然後，相對溼度維持在60%，以使所產生之水合物的形式可被特徵化。
將取得水合的分析樣品之水吸附實驗與進行在無水鹽形式批次(實例4a)的第一次DVC循環比較，確認有發生相同的轉換。
經分析的水合艾拉菲諾L-精胺酸鹽樣品之粉末展現各種顯示研究材料為結晶狀(crystalline)的散射峰。
第23圖繪示鹽類IV二水合物(dihydrate)(在丙酮/H2 O中結晶)的X射線散射曲線，以及表9列出第23圖的散射圖中XRPD峰值位置的數值。
表9：
Figure 108127655-A0304-0009
實例5：苄苯乙胺鹽(形式V)
艾拉菲諾游離酸(1 eq)在丙酮/H2 O中與1莫耳當量(molar equivalent)的苄苯乙胺結晶。
產生之樣品的顯微鏡觀察在第5圖中報告。在正交偏光鏡和分析器之間觀察時，顆粒的雙折射指出樣品被結晶。
實例6：苄星鹽(形式VI)
艾拉菲諾游離酸(1 eq)在丙酮/H2 O中與1莫耳當量的苄星結晶。
產生之樣品的顯微鏡觀察在第6圖中報告。在正交偏光鏡和分析器之間觀察時，顆粒的雙折射指出樣品被結晶。
實例7：乙醇胺鹽(形式VII)
艾拉菲諾游離酸(1 eq)在丙酮/H2 O中與1莫耳當量的乙醇胺結晶。
產生之樣品的顯微鏡觀察在第7圖中報告。在正交偏光鏡和分析器之間觀察時，顆粒的雙折射指出樣品被結晶。
實例8：葡甲胺鹽(形式VIII)
艾拉菲諾游離酸(1 eq)在丙酮中與1莫耳當量的葡甲胺結晶。
產生之樣品的顯微鏡觀察在第8圖中報告。在正交偏光鏡和分析器之間觀察時，顆粒的雙折射指出樣品被結晶。
實例9：甘胺酸鹽(形式IX)
艾拉菲諾游離酸(1 eq)在丙酮/H2 O中與1莫耳當量的甘胺酸結晶。
產生之樣品的顯微鏡觀察在第9圖中報告。在正交偏光鏡和分析器之間觀察時，顆粒的雙折射指出樣品被結晶。
實例10：叔丁胺鹽(形式X)
艾拉菲諾游離酸(1 eq)在丙酮/H2 O中與1莫耳當量的叔丁胺結晶。
產生之樣品的顯微鏡觀察在第10圖中報告。在正交偏光鏡和分析器之間觀察時，顆粒的雙折射指出樣品被結晶。
實例11：L-離胺酸鹽(形式XI)
艾拉菲諾游離酸(1 eq)在EtOH/H2 O中與1莫耳當量的L-離胺酸結晶。
產生之樣品的顯微鏡觀察在第11圖中報告。在正交偏光鏡和分析器之間觀察時，顆粒的雙折射指出樣品被結晶。
實例12：膽鹼鹽(形式XII)
艾拉菲諾游離酸(1 eq)在丙酮/H2 O中與1莫耳當量的膽鹼-OH結晶。
產生之樣品的顯微鏡觀察在第12圖中報告。在正交偏光鏡和分析器之間觀察時，顆粒的雙折射指出樣品被結晶。
實例13：依泊胺鹽(形式XIII)
艾拉菲諾游離酸(1 eq)在THF/H2 O中與1莫耳當量的羥乙基吡咯啶(hydroxyethyl-pyrrolidine)結晶。
產生之樣品的顯微鏡觀察在第13圖中報告。在正交偏光鏡和分析器之間觀察時，顆粒的雙折射指出樣品被結晶。
實例14：鎂鹽(形式XIV)
艾拉菲諾游離酸(1 eq)在H2 O中與1莫耳當量的氫氧化鎂結晶。
產生之樣品的顯微鏡觀察在第14圖中報告。在正交偏光鏡和分析器之間觀察時，顆粒的雙折射指出樣品被結晶。
實例15：2-胺基2-甲基-1丙醇鹽(形式XV)
艾拉菲諾游離酸(1 eq)在H2 O中與1莫耳當量的2-胺基2-甲基-1丙醇結晶。
產生之樣品的顯微鏡觀察在第15圖中報告。在正交偏光鏡和分析器之間觀察時，顆粒的雙折射指出樣品被結晶。
實例16：光穩定性
結晶樣品藉由暴露至根據上述光穩定性規程的UV光而受壓。
進行不同的光穩定性測試。下列表10呈現對艾拉菲諾游離酸及艾拉菲諾鹽類所取得的結果。
Figure 108127655-A0304-0010
在所測試狀態中暴露至UV光17小時之後，發現艾拉菲諾L-精胺酸鹽(形式IV，實例4a)僅有4%的降解，與艾拉菲諾游離酸(27%降解)、艾拉菲諾鈉鹽(形式III；89%降解)、艾拉菲諾鉀鹽(形式II；13%降解)以及艾拉菲諾胺基丁酸鹽(形式I；10%降解)比較下，為最穩定的經測試的批次。
與艾拉菲諾游離酸比較時，經測試的艾拉菲諾L-精胺酸鹽(形式IV)、艾拉菲諾鉀鹽(形式II)及艾拉菲諾胺基丁酸鹽(形式I)具有光穩定性的顯著改善。
實例17：體外測試
材料&方法
在二甲亞碸 (DMSO, Sigma Aldrich cat# 276855)中溶解化合物。商業上可取得SB525334(Sigma Aldrich cat# S8822)、Crenolanib(Selleckchem cat# S2730)、TGFβ1(PeproTech cat# 100-21)、PDGF-BB(Peprotech cat# 100-14B)以及Rosiglitazone(Yick-Vic Chemicals & Pharmaceuticals cat# PH-4472B)。非諾貝酸(fenofibric acid)及GW501516藉由Genfit合成。
Gal4-PPAR分析
猴腎COS-7細胞維持在37°C下，含有5% CO2 及95%空氣之加濕氛圍(humidified atmosphere)中的供應有10%胎牛血清、1%丙酮酸鈉(sodium pyruvate)、1%必需胺基酸、1%L-麩醯胺酸(L-glutamine)以及1%抗生素的標準培養狀態(Dulbecco's modified Eagle's 基本培養基(minimal medium)：DMEM)中。每2天更換一次培養基。所有經測試的化合物溶解於DMSO中。使用4µl JetPEITM (Polyplus transfection)/µg的DNA轉染細胞。簡言之，在96孔盤中，每孔150ng的DNA轉染貼附型(adherent)COS-7細胞(關於Gal4(RE)_TkpGL3質體與編碼感興趣之核酸受體((pGal4-hPPARalpha、pGal4-hPPARgamma、pGal4-hPPARdelta、pGal4-mPPARalpha、pGal4-mPPARgamma以及pGal4-mPPARdelta)的質體或pGal4phi質體(負對照組)之間比例為10：1)。細胞經酵素脫附，並以每孔40,000個細胞的密度接種於96孔盤中，然後在37°C下培養24小時。在DMEM 0%胎牛血清中提供經測試的化合物(感興趣的化合物或參考分子)或載體(DMSO 0.1%)進行活化。以Steady-Glo Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI)測量螢光酵素(luciferase)活性。所有轉活化(transactivation)實驗進行至少2次。使用Prism®(來自GraphPad)軟體了解活化曲線。也使用Prism®擬合(fit)標準曲線，然後決定特定的EC50 值、對參考分子的最大影響及希爾斜率(hill slope)。
各個新配位(ligand)的Emax效果以新配位得到的最大誘導(平穩期(plateau))及對應之參考化合物取得的誘導的比率表示。對於PPARalpha、PPARgamma以及PPARdelta的參考化合物分別為非諾貝特(fenofibrate，100µM)、羅格列酮(rosiglitazone，10µM)以及GW501516 (1µM)。
hHSC培養
人類初級肝星狀細胞(human primary hepatic stellate cells，hHSC)(ScienCell, Innoprot)在提供有2%胎牛血清(FBS, ScienCell cat# 0010)、1%盤尼西林/鏈黴素(ScienCell cat# 0503)以及星狀細胞生長添加物(stellate cell growth supplement)(SteCGS; ScienCell cat# 5352)的STeCM培養基(ScienCell cat# 5301)中培養。用於更良好的貼附，細胞培養瓶以聚-L離胺酸(Poly-L Lysine，Sigma cat# P4707)塗佈。
經PDGF誘導的hHSC之增生的測定
hHSC在上述的標準狀態下培養。細胞隨後以每孔1.2x104 個細胞的密度接種在96孔盤中，並在37°C且5% CO2 下培養隔夜，接著以磷酸緩衝鹽溶液(Phosphate Buffer Saline)(PBS, Invitrogen cat# 14190)清洗細胞，並在另外的24小時以無血清且無SteCGS的培養基置換生長培養基。在加入PDGF-BB (10ng/mL)之前，細胞以所有化合物預處理1小時。隨後再繼續處理另外20小時。藉由溴脫氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine)(BrdU)併以使用BrdU標記及偵測套組(Roche cat# 11647229001)測量細胞增生。將BrdU標記溶液被加入細胞中，接著在固定、加入核酸酶、加入抗-BrdU-POD以及過氧化酶基質(peroxidase substrate)之前另外培養4小時。使用酵素連結免疫吸附法判讀機(ELISA plate reader)(Tecan)於波長405nm下(與參考波長於690 nm)測定吸光值。
經TGF-β1誘導的hHSC之活化
hHSC在上述的標準狀態下培養。細胞隨後以每孔7x104 個細胞的密度接種在24孔盤中以用於基因表現研究，以及在每孔2x104 個細胞的密度接種在96孔盤中藉由ELISA測量α-SMA。隔天，移除細胞培養基，以PBS清洗細胞(Invitrogen cat# 14190)。在無血清及無SteCGS的培養基中剝奪(deprived)hHSC 24小時。為了根據本發明之化合物的處理，血清剝奪的hHSC與化合物預培養1小時，接著在另外的24小時之期間，於無血清及無SteCGS的培養基中加入纖維源性刺激的(profibrogenic stimuli)TGFβ1 (1ng/mL)。
α-SMA ELISA
使用夾心(Sandwich)ELISA法測量α-SMA的等級(level)。簡言之，首先在4°C隔夜下以捕獲抗體(小鼠單株抗-ACTA2(mouse monoclonal anti-ACTA2)，Abnova)塗佈ELISA盤孔。在三次PBS + 0,2% Tween 20清洗之後，加入包含PBS +0.2% BSA的阻隔溶液1小時，接續另一清洗循環。在室溫下，使細胞裂解液(cell lysates)移入孔中用以與捕獲抗體結合2小時。清洗程序之後，室溫下加入偵測抗體(生物素化小鼠單株抗-ACTA2(biotinylated mouse monoclonal anti-ACTA2)，Abnova)2小時，接著進行3次清洗。用於偵測，首先在室溫下加入HRP-conjugated Streptavidin(R&D Systems cat# DY998)30分鐘。清洗之後，加入HRP受質TMB (HRP substrate TMB)(BD Bioscience, cat# 555214)，並在室溫黑暗下培養7分鐘。氧化之後，TMB形成水溶性藍色反應產物，其在加入硫酸(停止溶液(solution stop)之後變成黃色，使用分光光度計能夠精確測量450nm處的強度。所呈現的顏色與溶解物中存在的α-SMA的含量成正比(directly proportional)。
基因表現
跟隨製造商的指示使用RNeasy Mini Kit (Qiagen)分離總RNA。總RNA(200ng用於體外樣品)使用M-MLV RT (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase)(Invitrogen cat# 28025)在1x RT緩衝液(Invitrogen)、0.5mM DTT(Invitrogen)、0.18mM dNTPs(Promega)、200ng pdN6(Amersham)以及30U RNase抑制劑(Promega)中反轉錄(reverse transcribed)為cDNA。
然後使用CFX96 Touch™ 即時(Real-Time) PCR 偵測系統(Detection System)(Biorad)進行定量PCR。簡言之，PCR反應在96-WP形式中進行，總體積為25 ul，其中含有1µL反轉錄反應、 0.5µL 反向(reverse)及正向(forward)引子(各10 pmol)以及12,5 µl的2X iQ SYBR Green Supermix (BioRad)。
表11：人類引子
Figure 108127655-A0304-0011
使用作為人類樣品中的參考的36B4基因的表現標準化表現等級。
對於每一個基因，為了使PCR反應效率接近100%、相關係數接近1，藉由選擇最佳點(至少三個點)繪製標準曲線。使用管家基因(housekeeping gene)及目標基因(target gene)之兩者的標準曲線公式，測定表現等級(考量每個目標基因的特異性PCR效率)。
結果及結論：
表12及表13顯示根據本發明的化合物在三種相似於艾拉菲諾游離酸的PPAR異形體(isoforms)(分別為人類及鼠類)具有活性。
表12
Figure 108127655-A0304-0012
表13
Figure 108127655-A0304-0013
PDGF的過度活化與如器官纖維化及腫瘤形成的多種人類異常有關。PDGF藉由刺激其增生、遷移及存活在肌纖維母細胞的擴大中扮演重要的角色。意外地，我們的實驗數據顯示根據本發明的化合物以劑量依賴方式抑制以PDGF-BB處理誘導的hHSC的增生(第28圖)。如第28圖中所展示，根據本發明的化合物的功效與選擇性PDGFR抑製劑Crenolanib的功效相當。
分化的肌纖維母細胞的異常持久是許多纖維化疾病的特徵。隨著肝臟的損傷，靜止(quiescent)的HSC進行活化的程序，其藉由分化成(α-SMA)-陽性的肌纖維母細胞特徵化。根據本發明的化合物減少了α-SMA蛋白分泌(第29圖)以及在TGFβ1-活化的hHSC中之基因表現。藉由根據本發明的化合物減少了其他TGFβ1刺激之標誌，所述標誌包含細胞外基質膠原(extracellular matrix collagen)1A1(COL1A1)以及基質膠原(matrix collagen)4A1(COL4A1)(第31圖)。毒性試驗證實，α-SMA等級降低並非由於hHSC的毒性或細胞凋亡。
綜上所述，本案已經顯示出對本發明化合物的抗纖維化活性。這些結果證實根據本發明的化合物可以提供多種纖維性疾病的治療效益。
無。
用於圖式、表格及本文中的縮寫： AcOEt                   乙酸乙酯(Ethyl acetate) CH3 CN                  乙腈(Acetonitrile) c.p.s.                      每秒計數(count per second) DSC                       示差掃描熱析儀(Differential Scanning Calorimeter) EtOH                     乙醇(Ethanol) H2 O                       水 IPA                        異丙醇(Isopropyl alcohol) KCl                        氯化鉀(Potassium chloride) Na2 HPO4 磷酸氫二鈉(Di-sodium hydrogenophosphate) NAFLD                 非酒精性脂肪肝疾病 NaOH                    氫氧化鈉(Sodium hydroxide) NASH                    非酒精性肝炎 OM                        光學顯微影像(Optical Microscopy) RH                         相對溼度(relative humidity) THF                       四氫呋喃(Tetrahydrofuran) XRPD                    X射線粉末繞射(X-ray powder diffraction) 第1圖：鹽類I的光學顯微影像 第1圖繪示在交叉偏振光(cross-polarized light)下於EtOH/AcEt中結晶的鹽類I之光學顯微影像(放大上圖x81以及下圖x325) 第2a圖、第2b圖及第2c圖：鹽類II的光學顯微影像 第2a圖繪示在交叉偏振光下於IPA中再結晶的鹽類II之光學顯微影像(放大x84) 第2b圖繪示在交叉偏振光下於IPA/H2 O中再結晶的鹽類II之光學顯微影像(放大x81) 第2c圖繪示在交叉偏振光下於CH3 CN中再結晶的鹽類II之光學顯微影像(放大x81) 第3圖：鹽類III的光學顯微影像 第3圖繪示在交叉偏振光下於丙酮(acetone)中結晶的鹽類III之光學顯微影像(放大x81) 第4a及第4b圖：鹽類IV的光學顯微影像 第4a圖繪示在交叉偏振光下於丙酮中再結晶的鹽類IV之光學顯微影像(放大x81) 第4b圖繪示在交叉偏振光下於丙酮/H2 O中再結晶的鹽類IV之光學顯微影像(放大x81) 第5圖：鹽類V的光學顯微影像 第5圖繪示在交叉偏振光下於丙酮/H2 O中再結晶的鹽類V之光學顯微影像(放大x84) 第6圖：鹽類VI的光學顯微影像 第6圖繪示在交叉偏振光下於丙酮/H2 O中再結晶的鹽類VI之光學顯微影像(放大x25) 第7圖：鹽類VII的光學顯微影像 第7圖繪示在交叉偏振光下於丙酮/H2 O中再結晶的鹽類VII之光學顯微影像(放大x84) 第8圖：鹽類VIII的光學顯微影像 第8圖繪示在交叉偏振光下於丙酮中再結晶的鹽類VIII之光學顯微影像(放大x84) 第9圖：鹽類IX的光學顯微影像 第9圖繪示在交叉偏振光下於丙酮/H2 O中再結晶的鹽類IX之光學顯微影像(放大x84) 第10圖：鹽類X的光學顯微影像 第10圖繪示在交叉偏振光下於丙酮/H2 O中再結晶的鹽類X之光學顯微影像(放大x84) 第11圖：鹽類XI的光學顯微影像 第11圖繪示在交叉偏振光下於EtOH/H2 O中再結晶的鹽類XI之光學顯微影像(放大x84) 第12圖：鹽類XII的光學顯微影像 第12圖繪示在交叉偏振光下於丙酮/H2 O中再結晶的鹽類XII之光學顯微影像(放大x84) 第13圖：鹽類XIII的光學顯微影像 第13圖繪示在交叉偏振光下於THF/H2 O中再結晶的鹽類XIII之光學顯微影像(放大x84) 第14圖：鹽類XIV的光學顯微影像 第14圖繪示在交叉偏振光下於H2 O中再結晶的鹽類XIV之光學顯微影像(放大x84) 第15圖：鹽類XV的光學顯微影像 第15圖繪示在交叉偏振光下於H2 O中再結晶的鹽類XV之光學顯微影像(放大x84) 第16圖：鹽類I的DSC熱譜圖 第16圖繪示鹽類I在5°C/分鐘的DSC圖譜 第17圖：鹽類II的DSC熱譜圖 第17圖繪示鹽類II在5°C/分鐘的DSC圖譜 第18圖：鹽類III的DSC熱譜圖 第18圖繪示鹽類III在5°C/分鐘的DSC圖譜 第19圖：鹽類IV的DSC熱譜圖 第19圖繪示鹽類IV在5°C/分鐘的DSC圖譜 第20圖：鹽類I的X射線繞射 第20圖繪示鹽類I的X射線繞射圖譜(在EtOH/AcEt中結晶) 第21圖：鹽類II的X射線繞射 第21圖繪示鹽類II的X射線繞射圖譜(在CH3 CN中結晶) 第22圖：鹽類IV的X射線繞射 第22圖繪示鹽類IV的X射線繞射圖譜(在丙酮/H2 O中結晶) 第23圖：鹽類IV二水合物(dihydrate)的X射線繞射 第23圖繪示鹽類IV二水合物的X射線繞射圖譜(在丙酮/H2 O中結晶) 第24圖：鹽類I的層析圖譜 第24圖繪示鹽類I的HPLC圖譜(在EtOH/AcEt中結晶) 第25圖：鹽類II的層析圖譜 第25圖繪示鹽類II的HPLC圖譜(在CH3 CN中結晶) 第26圖：鹽類III的層析圖譜 第26圖繪示鹽類III的HPLC圖譜(在丙酮中結晶) 第27圖：鹽類IV的層析圖譜 第27圖繪示鹽類IV的HPLC圖譜(在丙酮/H2 O中結晶) 第28圖：經PDGF誘導的hHSC之增生 第28圖繪示根據本發明的化合物以劑量依賴方式(dose-dependent way)抑制以PDGF-BB處理所誘導的hHSC之增生。 第29圖：在TGFβ1-活化的hHSC中，α-SMA蛋白分泌的減少 第29圖繪示根據本發明的化合物在TGFβ1-活化的hHSC中減少α-SMA蛋白的分泌。 第30圖：在TGFβ1-活化的hHSC中，COL1A1分泌的減少 第30圖繪示根據本發明的化合物在TGFβ1-活化的hHSC中減少COL1A1的分泌。 第31圖：在TGFβ1-活化的hHSC中，COL4A1分泌的減少 第31圖繪示根據本發明的化合物在TGFβ1-活化的hHSC中減少COL4A1的分泌。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
無。

Claims (14)

  1. 一種艾拉菲諾(elafibranor)的鹽類。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之鹽類，其選自由艾拉菲諾的胺基丁三醇鹽(tromethamine salt)(鹽類I)、鉀鹽(potassium salt)(鹽類II)、鈉鹽(sodium salt)(鹽類III)、L-精胺酸鹽(L-arginine salt)(鹽類IV)、苯乙苄胺鹽(benethamine salt)(鹽類V)、苄星鹽(benzathine salt)(鹽類VI)、乙醇胺鹽(ethanolamine salt)(鹽類VII)、葡甲胺鹽(meglumine salt)(鹽類VIII)、甘胺酸鹽(glycine salt)(鹽類IX)、叔丁胺鹽(erbumine salt)(鹽類X)、L-離胺酸鹽(L-lysine salt)(鹽類XI)、膽鹼鹽(choline salt)(鹽類 XII)、依泊胺鹽(epolamine salt)(鹽類XIII)、鎂鹽(magnesium salt)(鹽類XIV)及2-胺基2-甲基-1丙醇鹽(2-amino-2-methyl-propan-1-ol salt)(鹽類XV)所組成之群組。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之鹽類，其為結晶型。
  4. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之鹽類，其為非晶型。
  5. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之鹽類，其為多晶型。
  6. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之鹽類，其為結晶型之艾拉菲諾的胺基丁三醇鹽，且具有包含峰值(以角度程度±0.2°的2θ表示)在6.5°、12.2°、15.0°、15.3°、16.9°、17.3°、17.6°、18.4°、19.4°以及22.6°的X射線粉末繞射圖樣。
  7. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之鹽類，其為結晶型之艾拉菲諾的鉀鹽，且具有包含峰值(以角度程度±0.2°的2θ表示)在4.6°、8.0°、11.7°、13.1°以及13.6°的X射線粉末繞射圖樣。
  8. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之鹽類，其為結晶型之艾拉菲諾的L-精胺酸鹽，且具有包含峰值(以角度程度±0.2°的2θ表示)在5.9°、8.8°、11.7°、13.2°、19.8°以及19.9°的X射線粉末繞射圖樣。
  9. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之鹽類，其為艾拉菲諾的鈉鹽。
  10. 一種製備艾拉菲諾的鹽類的方法，其包含步驟： (i)避光，將式(I)的游離酸及提供用於鹽類形成之相對離子的鹼，依據合適的溶劑中的鹼以選自1：1至2：1的酸/鹼莫耳比溶解； (ii)於從40°C至100°C的溫度下攪拌式(I)的游離酸及鹼，較佳為於70°C下； (iii)將合適的溶劑加入(ii)所得之混合物並慢慢降溫至室溫，或(iii)移除(ii)所得之混合物的溶劑，將合適的結晶溶劑加入殘留物中； (iv)藉由過濾分離沉澱的結晶。
  11. 一種藥物組合物，其包含根據申請專利範圍第1項至第9項中任一項所述之艾拉菲諾的鹽類及藥學上可接受的載體。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之藥物組合物，其以可注射懸浮劑、凝膠、油劑、丸劑、栓劑、粉末、膠囊錠(gel caps)、膠囊、噴霧劑的形式或蓋倫形式(galenic form)的手段或確保延長及/或緩釋的裝置配製。
  13. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項所述之鹽類用作為藥劑。
  14. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項所述之鹽類用於治療選自由非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝纖維化及肝硬化所組成之群組的疾病的方法。
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