TW202016547A - 腎病變蛋白生物標記及其應用 - Google Patents
腎病變蛋白生物標記及其應用 Download PDFInfo
- Publication number
- TW202016547A TW202016547A TW108121862A TW108121862A TW202016547A TW 202016547 A TW202016547 A TW 202016547A TW 108121862 A TW108121862 A TW 108121862A TW 108121862 A TW108121862 A TW 108121862A TW 202016547 A TW202016547 A TW 202016547A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- nephropathy
- protein
- kidney disease
- biomarker
- diabetic
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
- G01N2333/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
- G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/34—Genitourinary disorders
- G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本發明涉及生物標記、方法,以及分析套組,係用於在有需要的個體中鑑定並篩選腎病變,特別是糖尿病性腎病變,或在糖尿病患者體內預測糖尿病性腎病變或早期進行性腎功能衰退(early progressive renal function decline,ERFD)。
Description
相關申請案。本申請案主張根據美國專利法第119條(35U.S.C. §119)於2018年6月21日提出申請的美國臨時申請案USSN第62/688,142之權益,其全部內容透過引用併入本文。
本發明涉及生物標記、方法,以及分析套組,係用於在有需要的個體中鑑定並篩選腎病變,特別是糖尿病性腎病變,或在糖尿病患者體內預測糖尿病性腎病變或早期進行性腎功能衰退(early progressive renal function decline,ERFD)。
腎損傷,也稱為腎病變,可由例如藥物毒性、發炎反應、高血壓,以及糖尿病所引起。腎臟疾病通常是一種進行性疾病,這表示腎臟的損害往往是永久性而無法回復的。因此,在損害發生前儘早發現腎臟疾病非常重要。如果在早期階段發現腎臟疾病,可以很有效地進行治療。慢性腎病變的治療著重於減緩腎臟損害的進展,通常是透過控制潛在的原因。慢性腎病變可發展為末期腎衰竭,若沒有人工過濾(透析)或腎移植的話就會致命。特定而言,糖尿病性腎病變(diabetic nephropathy,DN)為糖尿病患者中最常見的併發症之一。腎病變在大約20-40%的第二型糖尿病(type 2 diabetic,T2D)患者中發展[1]。此外,糖尿病性腎病變(DN)為末期腎臟疾病(end-stage renal disease,ESRD)的主要原因。微量白蛋白尿(尿白蛋白***30-300 mg/24小時)為腎功能不全的第一個跡象,因為它可以發展為大量白蛋白尿(> 300 mg/24小時),隨後發展為腎功能衰竭[2,3]。
通常,透過分析蛋白尿含量(例如,尿白蛋白的含量)或透過檢查腎小球濾過率(glomerular filtration rate,GFR)來診斷腎病變。其他相關參數包括例如收縮壓(systolic blood pressure,SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure,DBP),空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、血紅蛋白A1c (hemoglobin A1c,HbA1c)。然而,這些方法缺乏足夠的靈敏度及/或選擇性,尤其是在沒有明顯症狀發生時檢測早期腎病變。雖然腎病變也可透過腎活體組織切片來檢測,但是這種侵入性手術並不是理想的方法,因為大多數患者不願意這樣做,因此可能導致晚期診斷,直到臨床特徵外顯或已經發展疾病惡化。腎臟活體組織切片也可能導致嚴重出血併發症的風險。
需要開發一種用於檢測腎病變之方法,特別是用於一般篩檢、早期檢測,以及非侵入性之方法。
於本發明中,意外地發現,相較於未患有腎病變的對照個體,克氏細胞蛋白(CC16)在腎病變患者中特異性且高度表現。還發現克氏細胞蛋白(CC16)與糖尿病患者中糖尿病性腎病變或早期進行性腎功能衰退(ERFD)的發展高度相關。因此,克氏細胞蛋白(CC16)可作為診斷腎病變的特異性生物標記,尤其適用於早期檢測;且還用於預測糖尿病患者的糖尿病性腎病變或早期進行性腎功能衰退(ERFD)。
於一方面,本發明提供一種用於檢測在個體中的腎病變之方法,該方法包括:
(i) 提供從該患者獲得的生物樣品;以及
(ii) 檢測該生物樣品中的生物標記以獲得檢測含量,將該檢測含量與該生物標記的參考含量進行比較以獲得比較結果,並基於該比較結果評估該個體是否患有腎病變或有是否具有發展腎病變之風險,其中該生物標記包括克氏細胞蛋白(CC16),且相較於該參考含量,該檢測含量的增加表示該個體患有腎病變或具有發展腎病變的風險。
於一些具體實施例中,該個體為糖尿病患者。
於一些具體實施例中,該腎病變為糖尿病性腎病變。
於一些具體實施例中,如果確定該個體患有腎病變,則對該個體進行治療腎病變之方法。
另一方面,本發明提供一種預測在糖尿病患者中的糖尿病性腎病變或早期進行性腎功能衰退(ERFD)之方法,該方法包括:
(i) 提供從該糖尿病患者獲得的生物樣品;以及
(ii) 檢測該生物樣品中的生物標記以獲得檢測含量,將該檢測含量與該生物標記的參考含量進行比較以獲得比較結果,並基於該比較結果評估該個體是否患有腎病變或是否具有發展腎病變或早期進行性腎功能衰退(ERFD)之風險,其中該生物標記包括克氏細胞蛋白(CC16),且相較於該參考含量,該檢測含量的增加表示發生糖尿病性腎病變或早期進行性腎功能衰退(ERFD)的風險較高。
於一些具體實施例中,若確定糖尿病患者具有較高的風險發生糖尿病性腎病變或早期進行性腎功能衰退(ERFD),則對該個體進行預防糖尿病性腎病變或早期進行性腎功能衰退(ERFD)之方法。
於本發明之一些具體實施例中,透過質譜法進行該檢測。
於本發明之一些具體實施例中,該生物樣品為尿液樣品。
於本發明之一些具體實施例中,可進一步檢測一種或多種額外的生物標記或參數以提高該檢測之準確性。在某些實例中,根據本發明之待檢測的生物標記還包括β2-微球蛋白(β2-microglobulin,B2M)。
於本發明之一些具體實施例中,該腎病變為慢性腎病變(chronic kidney disease,CKD)。
於本發明之一些具體實施例中,該慢性腎病變(CKD)為早期慢性腎病變(CKD),具體而言是第一階段或第二階段,或者該慢性腎病變(CKD)為第三階段或第四階段慢性腎病變(CKD)。
於另一方面,本發明提供一種用於實施本文所述方法之套組以及使用該套組以檢測如本文所述之生物標記的存在或含量之說明書。
還提供一種試劑之用途,該試劑特異性識別如本文所述之生物標記以用於在有需要之個體中診斷腎病變,或用於在糖尿病患者中預測糖尿病性腎病變或早期進行性腎功能衰退(ERFD),或用於製備套組或組合物,用於在有需要之個體內診斷腎病變,或用於在糖尿病患者中預測糖尿病性腎病變或早期進行性腎功能衰退(ERFD)。
於以下之描述中闡述了本發明之一個或多個具體實施例之細節。從以下幾個具體實施例之詳細描述以及所附申請專利範圍,本發明之其他特徵或優點將變得顯而易見。
為了提供對本發明之清楚並快速的理解,首先定義某些術語。在整個詳細描述中闡述了額外的定義。除非另有定義,否則本文所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之技術人員通常理解的含義相同之含義。
如本文所用,冠詞「一」以及「一個」係指該冠詞的一個或多於一個(即,至少一個)語法對象。舉例來說,「一元素」表示一個元素或多於一個元素。
如本文所用,「約」或「近似」等詞係指本領域普通技術人員將理解的可接受偏差程度,這可能會有所不同,具體取決於使用它的環境。通常,「約」或「近似」可表示在引用值附近具有±10%範圍之數值。
如本文所用,「包含(動詞)」或「包含(動名詞)」等詞通常以包括(動詞)/包括(動名詞)的含義使用,其代表允許存在一種或多種特徵、成分或組成分。「包含(動詞)」或「包含(動名詞)」等詞包括「由......組成(動詞)」或「由......組成(動名詞)」等詞。
如本文所用,「受試者」、「個體」以及「患者」等詞係指需要診斷、預後、處理,或治療的任何哺乳動物個體,特別是人類。其他個體可包括牛、狗、貓、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠、馬等。
如本文所用,本文使用之「診斷」乙詞通常包括確定個體是否可能受目標疾病、病症,或功能障礙之影響。本領域技術人員通常基於一種或多種診斷指標(即,標記)進行診斷,診斷該標記的存在、不存在,或其指示疾病、病症或功能障礙的存在或不存在的含量。本領域技術人員將理解,診斷並不表示以100%的準確度確定特定疾病的存在或不存在,而是在個體中存在某種疾病的可能性增加。
如本文所用,「抗體」乙詞係指能夠結合抗原的免疫球蛋白。本文使用之抗體目的在於包括完整抗體以及能夠結合抗原決定位、抗原,或目標抗原片段的任何抗體片段(例如,F(ab')2
、Fab'、Fab、Fv)。本發明之抗體為免疫反應性或免疫特異性的,因此特異性且選擇性地結合目標蛋白質,例如克氏細胞蛋白(CC16)或Β2-微球蛋白(B2M)蛋白質。用於目標蛋白質的抗體較佳為免疫特異性的,亦即,與相關材料基本上不會有交叉反應,儘管它們可以識別其跨物種的同源物。「抗體」乙詞包括所有類型的抗體(例如,單株抗體以及多株抗體)。
如本文所用,「治療」乙詞係指將一種或多種活性劑應用或施用於個體,該個體受疾病、該疾病之症狀或病症,或該疾病之進展的影響,目的在於治療、治癒、緩解、減輕、改變、補救、改善,促進,或影響該疾病、該疾病之症狀或病症,由該疾病引起之殘疾,或該疾病之進展。
如本文所用,「預防」乙詞係指針對疾病或疾病的症狀或病症之預防或避免的措施,其包括,但不限於,將一種或多種活性劑應用或施用於一個體,該個體為尚未被診斷為患有該疾病或該疾病的症狀或病症的患者,但可能受該疾病影響或容易罹患該疾病。預防措施之目的在於避免、預防,或推遲該疾病之發生或該疾病的症狀或狀況。
如本文所用,「正常個體」乙詞可用於指基本上處於健康狀態而沒有特定疾病(例如,腎病變)之個體,並且可以指單個正常/健康個體或一群正常/健康的個體。
如本文所用,「對照個體」乙詞可用於指未患有目標疾病(例如,腎病變)之個體,並且可以指單個對照個體或一群對照個體。於一些具體實施例中,對照個體可以指正常/健康個體。於一些具體實施例中,對照個體可以指未患有腎病變之個體(或糖尿病患者)。
如本文所用,「異常量」係指相較於未患有目標疾病(例如,腎病變)的個體或參考量或對照量,增加的指示劑的量。特定而言,例如,異常量可以比參考量高出5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%,或100%或更多。參考量可指對照樣品(例如,不含目標疾病的組織或細胞或任何生物學樣品)中測量的量。於本領域中,透過使用常規檢測以及統計方法分析來自正常個體群體的樣品中標記的檢測量,可以獲得一範圍的正常量值。
如本文所用,如本文所用之生物標記的「低表現」以及「高表現」係指相對於樣品中發現的生物標記含量的相對術語。於一些具體實施例中,可透過比較對照組、未患病樣品中的生物標記表現含量,以確定低表現及高表現,其中低表現可指相對於對照、未患病樣品的表現含量為較低或相當的表現含量,而高表現可指對相對於對照、未患病樣品中的表現含量為較高的表現含量。
如本文所用,生物學標記(生物標記)為客觀測量並評價的特徵(例如,蛋白質、胺基酸、代謝物、基因或遺傳表現),作為正常或異常生物過程、疾病、致病過程,或對治療或治療干預的反應之指標。生物標記可包括存在或不存在指示特定生物過程的特徵或模式或特徵之集合。生物標記測量可增加或減少以指示某種生物事件或過程。標記主要用於診斷及預後目的。然而,其可用於本文所述之治療、監測、藥物篩選以及其他目的,包括評估治療劑之有效性。
如本文所用,待透過本文所述之任何方法分析的生物樣品可為從待診斷的個體獲得的任何類型之樣品。於一些具體實施例中,生物樣品可為體液樣品,例如,血液樣品、尿液樣品,或腹水樣品。通常,生物樣品為尿液樣品。在其他具體實施例中,血液樣品可為全血或其部分,例如血清或血漿,進行肝素化或EDTA處理,以避免血液凝固。或者,該生物樣品可為組織樣品或從腎取得的活體組織切片樣品。
如本文所用,如本文所用之「生理參數」乙詞通常係指可被監測以確定與患者相關的一種或多種定量生理層面及/或活性的任何參數。生理參數之實例包括,但不限於,年齡、性別、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、空腹血糖(FBG)、血紅蛋白A1c (HbA1c)、糖尿病持續時間、肌酸酐、預估的腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)、白蛋白尿、尿白蛋白與肌酸酐比(albumin to creatinine ratio,ACR)及其任何組合。在某些特定具體實施例中,該生理參數包括空腹血糖(FBG)及/或舒張壓(DBP)。
如本文所用,「腎病變」乙詞係指其中發生腎損傷的生理狀況,其特異性地破壞其適當調節血液與尿液中溶質濃度的能力。腎病變可透過一種或多種病理學變化來描述特徵:腎小球大小、簇狀纖維化、鮑氏囊纖維化、擴張、微血管變窄、基底膜增厚、細胞增多(腎小球環間膜或內皮)、白血球浸潤、微血管血栓、腎小管萎縮、壞死、液泡及透明液滴變化、基底膜增厚、擴張、發炎細胞與管腔內的鑄型、間質纖維化、水腫、急性與慢性白血球浸潤、小動脈纖維化、血栓形成,透明變化及變窄。一般而言,在腎病變的早期階段,腎臟仍能很好地過濾掉血液中的廢棄物;在中期階段,腎臟可能需要更加努力地擺脫廢棄物;在晚期階段,腎臟可能會停止工作。通常且常規地,可以透過尿蛋白濃度來評估腎病變。腎病變的早期臨床特徵可能為尿液中白蛋白濃度低但異常 (白蛋白***率(albumin excretion rate,AER):30-300 mg/24小時;或白蛋白對肌酐比(albumin to creatinine ratio,ACR):30-300 mg/g),稱為微量白蛋白尿,該患者患有初始腎病變(初期腎病變);若未經過適當的治療,這樣的患者會發展為持續的微量白蛋白尿並轉變為嚴重的腎病變(明顯的腎病變),也稱為大量白蛋白尿(白蛋白***率(AER) > 300 mg/24小時或白蛋白對肌酐比(ACR) > 300 mg/g),最後進展為末期腎病變(end stage renal disease,ERSD)。預估的腎小球濾過率(eGFR)也可作為腎病變的指標。慢性腎病變(CKD)可以下列情況定義:在帶有或沒有蛋白尿的患者中具有預估的腎小球濾過率(eGFR)低於60 ml/min超過3個月;或是儘管預估的腎小球濾過率(eGFR)含量低或高,但蛋白尿超過3個月。還可以基於例如血清肌酸酐濃度、尿蛋白濃度、尿蛋白與肌酸酐比,或透過使用追蹤劑化合物如鄰苯二甲酸酯來評估腎病變。
於一些具體實施例中,慢性腎病變(CKD)可被認為包括五(5)個腎損傷階段,從階段1中的非常輕微的損傷到階段5中的完全腎衰竭。參見表A。
特定而言,如本文所述之慢性腎病變(CKD)的早期階段可包括如上所示的階段1與階段2,這些患者可具有相對較高(正常)的預估的腎小球濾過率(eGFR)但具有至少一個腎損傷跡象,例如微量白蛋白。
如本文所用,「糖尿病性腎病變」乙詞係指由糖尿病引起的腎病變。於某些具體實施例中,該糖尿病為第二型糖尿病。許多糖尿病患者在微量白蛋白尿發病前經歷了早期進行性腎功能衰退(ERFD),儘管他們仍可能具有正常的腎功能。一旦衰退過程開始,沒有適當的治療,它會進展並可能導致腎功能受損。特定而言,當預估的腎小球濾過率(eGFR)在每1.73 m2
下降的損失超過3.3 mL/分鐘時,可以確定為早期進行性腎功能衰退(ERFD)。
本 揭露(至少部分地)基於將克氏細胞蛋白(CC16)鑑定為新的可靠的腎病變生物標記。如以下一些實施例所證明的,在患有腎病變的個體的尿液樣品中發現克氏細胞蛋白(CC16)含量增加。因此,本文描述的腎病變檢測方法可用於鑑定個體是否患有、懷疑患有,或具有發展腎病變之風險。本文描述之檢測方法可應用於任何個體,尤其是作為初始、常規,以及經常性(或早期)篩選的方法,以鑑定患有腎病變或具有進展性腎病變風險的那些患者。如在以下其他實施例中進一步證明的,糖尿病患者中克氏細胞蛋白(CC16)的存在與早期進行性腎功能衰退(ERFD)的後期發展相關。因此,當應用於糖尿病患者時,本文所述之檢測方法可用於預測發生早期進行性腎功能衰退(ERFD)或糖尿病性腎病變的風險。
於一些具體實施例中,進一步檢測Β2-微球蛋白(B2M)以提高該檢測的準確性。
如本文所用,克氏細胞蛋白(CC16)為15.8-kDa同型二元體蛋白,其由非纖毛細支氣管克氏細胞在氣道中大量分泌。已經顯示克氏細胞蛋白(CC16)調節發炎反應的各種介質的產生及/或活性,包括PLA2、干擾素-γ以及腫瘤壞死因子-α (Clinical & Experimental Allergy 30(4):469-75,2000年5月)。β2-微球蛋白(B2M)為主要組織相容性錯合物(major histocompatibility complex,MHC)第I類分子的次單位。這些蛋白質生物標記的胺基酸序列為本領域熟知的,例如克氏細胞蛋白(CC16):P11684,而β2-微球蛋白(B2M):P61769。
可透過常規技術確定生物樣品中本文所述之生物標記的存在以及含量。於一些具體實施例中,如本文所述之生物標記的存在及/或含量可透過質譜分析確定,其允許以高靈敏度以及具有再現性直接測量分析物。有許多質譜分析方法可供選擇。質譜分析的實例包括,但不限於,基質輔助雷射脫附電離飛行時間質譜儀(matrix-assisted laser desorption ionization/time of flight,MALDI-TOF)、表面增強雷射解吸電離/飛行時間質譜儀(surface-enhanced laser desorption ionisation/time of flight,SELDI-TOF)、液相色層分析-質譜儀(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)、液相色層分析串聯質譜儀(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS-MS),以及電噴霧電離質譜儀(electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)。這種方法的一個實例為串聯質譜儀(tandem mass spectrometry,MS/MS),其涉及質量選擇或分析的多個步驟,通常透過某種形式的碎片分開。
於其他具體實施例中,生物標記的存在及/或含量可透過免疫分析來確定。免疫分析之實例包括,但不限於,西方墨點分析法、酵素聯結免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)、放射免疫沉澱分析(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)、免疫螢光分析(immunofluorescence assay,IFA)、酵素聯結螢光免疫分析(enzyme-linked fluorescent immunoassay,ELFA)、電化學發光(electrochemiluminescence,ECL),以及毛細管凝膠電泳(capillary gel electrophoresis,CGE)。於一些實例中,可使用特異性識別該生物標記的試劑來確定該生物標記的存在及/或含量,例如特異性結合該生物標記之抗體。
如本文所用之抗體可為多株抗體或單株抗體。透過以有效量的胜肽或抗原組分注射至適合的實驗動物,從該動物收集血清,並透過任何已知的免疫吸附技術分離特定血清來製備針對特定蛋白質的多株抗體。可容易地用於產生本發明中使用的多株抗體的動物包括雞、小鼠、兔、大鼠、山羊、馬等。
為了進行本文所述之方法,於生物樣品中檢測或測量本文所述之生物標記的含量,該生物樣品取自有此需要的個體(例如,沒有任何腎病變症狀的人類患者,或患有、懷疑患有腎病變或具有罹患腎病變風險的人類患者)透過本領域已知的任何方法進行,例如本文所述的那些方法,如質譜儀。通常,該生物樣品為尿液樣品。
於一些具體實施例中,可以將源自候選個體的樣品中的生物標記的含量與標準值進行比較。如本文所述之更高量的生物標記可以指示陽性結果,亦即該個體患有腎病變或具有發展腎病變之風險,或者當該個體為糖尿病患者時,他/她具有發展糖尿病性腎病變或早期進行性腎功能衰退(ERFD)的更高風險。標準值表示在該對照樣品中如本文所述之生物標記的含量。該對照樣品可取自未患有腎病變的個體。另外,該對照樣品可取自一群這樣的個體的樣品之混合物。或者,該對照個體在例如年齡、性別及/或種族背景中與候選個體匹配。較佳地,該對照樣品與候選個體的生物樣品為相同物種之樣品。
於某些實例中,對照樣品中標記的含量在對照樣品中是無法被檢測到的(亦即,參考值為0),使用常規分析方法,例如,質譜法與免疫分析,以及使用相同分析法在來自個體的生物樣品中檢測到的標記(可檢測標記)的存在則可以指示一陽性結果。
於一些具體實施例中,克氏細胞蛋白(CC16)被檢測為根據本發明之第一生物標記。相較於該生物標記的(第一)對照含量,該第一生物標記的更高含量可指示第一陽性結果。於一些另外的具體實施例中,進一步檢測β2-微球蛋白(B2M)作為根據本發明之第二生物標記。相較於該生物標記的(第二)對照含量,該第二生物標記的更高含量可指示第二陽性結果,具有增加的準確性。於更進一步的具體實施例中,可以另外測量一個或多個生理參數。例如,這種生理參數可選自由預估的腎小球濾過率(eGFR)、白蛋白尿、尿白蛋白與肌酸酐比(ACR),以及其任何組合所組成之群組。
當個體,例如人類患者,被診斷為患有、懷疑患有腎病變或具有罹患腎病變的風險時,該個體可進行進一步的測試(例如,常規物理測試,包括手術活體組織切片或成像方法,例如X-射線成像、核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)或超音波)以確認疾病的發生及/或確定腎病變的階段與類型。
於一些具體實施例中,本文所述之方法可進一步包括治療該腎病變患者以至少緩解與該疾病相關之症狀。可以透過給予腎病變的常規藥物進行治療。此類藥物之實例包括,但不限於,(i) 用於減少白蛋白尿的藥物,例如磷酸二酯酶抑制劑,例如,雙嘧達莫以及己酮可可鹼;(ii) 抗高血壓藥物,如血管緊縮素轉換酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制劑,例如,咪達普利,以及血管緊縮素受體阻斷劑(angiotension receptor blocker,ARB),例如,氯沙坦;(iii) 磷酸鹽結合劑,例如司維拉姆碳酸鹽、碳酸鑭,以及Al(OH)3
己糖醇錯合物;(iv) 鈣補充劑,如碳酸鈣、檸檬酸鈣,以及維生素D;(v) 抗貧血藥物,例如,促紅血球形成素(erythropoietin,EPO)以及鐵補充劑;(vi) 用於降低血脂的藥物,例如他汀類藥物,例如辛伐他汀、普伐他汀,以及阿托伐他汀;(vii) 降低尿酸的藥物,例如,異嘌呤醇、非布索坦,以及苯溴馬隆;(viii) 其他藥物,例如,皮質類固醇,如潑尼松龍、非甾體抗炎藥(non-steriodal anti-inflammatory drugs,NSAIDs),以及N-乙醯半胱胺酸(用於預防造影劑引起的腎病變(contrast-induced nephropathy, CIN))。這些藥物可以一有效量給予一有需要的個體。腎病變的治療還可包括具有低蛋白質及/或低鹽飲食的食物療法。
如本文所用,「有效量」係指可以單獨或與一種或多種其他活性物質組合施用於該個體的每種活性物質的量,以賦予該個體治療效果。可變動該有效量且必須由本領域技術人員確定,這取決於給藥時的具體情況、病症的嚴重程度、患者的各個參數,包括性別、年齡、體重、身高、身體狀況、治療方案、平行治療的性質(如果有的話)、特定的給藥途徑,以及由醫務人員的知識和專業判斷的其他可能因素。這些因素為本領域普通技術人員所熟知的,並且無需進一步的常規實驗即可引入。
本發明還提供用於實施該方法之套組或組合物,其包括特異性識別如本文所述之生物標記的試劑(例如,抗體或標記試劑)。該套組可進一步包括使用該套組檢測本文所述之生物標記的存在或含量的說明書,進而在有此需要的個體中檢測腎病變,或用於預測糖尿病患者中的糖尿病性腎病變或早期進行性腎功能衰退(ERFD)。包含如本文所述之檢測試劑的組成分可以套組的形式包裝在一起。例如,檢測試劑可以包裝在單獨的容器中,例如抗體(與固體基質結合或與用於將它們結合到基質的試劑分開包裝),對照試劑(陽性及/或陰性)及/或可檢測之標記,用於進行分析的說明(例如,書寫、磁帶、VCR、CD-ROM等)也可包括在該套組中。例如,該套組的分析形式可為晶片或酵素聯結免疫吸附分析(ELISA)。進一步提供了這種試劑用於實施本文所述方法之用途。這種試劑包括特異性識別生物標記之試劑。於一些具體實施例中,此類試劑包括(i) 特異性識別克氏細胞蛋白(CC16)之分子,可選擇地(ii) 特異性識別β2-微球蛋白(B2M)之分子,或(iii) (i)與(ii)之組合。該試劑可以與載體混合,例如醫藥上可接受之載體,以形成用於檢測或診斷目的之組合物。這種載體的實例包括可注射鹽水、可注射蒸餾水、可注射緩衝溶液及其類似物。
無需進一步詳細說明,相信本領域技術人員將能夠基於以上描述最大程度地應用本發明。因此,以下具體實施例的目的在於說明,而非以任何方式限制本發明之適用範圍。本文引用之所有文獻均透過引用併入本文。
實施例
在本研究中,使用C18
盤以及基質輔助雷射脫附/電離飛行時間質譜儀(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)來比較來自以下4組的238名個體的尿蛋白質譜:具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病(T2D)患者、不具有微量或大量白蛋白尿的糖尿病(DM)患者、由非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿的患者,以及健康對照組。發現β2-微球蛋白(B2M)以及克氏細胞蛋白(CC16)在由非糖尿病或糖尿病引起的蛋白尿患者的尿液內高度釋放。在區分腎病變以及健康個體時,β2-微球蛋白(B2M)以及克氏細胞蛋白(CC16)標記的敏感性與特異性組合分別為77.3%與91.8%。在區分具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病(T2D)患者與第二型糖尿病(T2D)患者時,該組合標記的敏感性與特異性分別為66%與73%。β2-微球蛋白(B2M)以及克氏細胞蛋白(CC16)對早期進行性腎功能衰退(ERFD)的預測能力在追蹤時間內125名第二型糖尿病(T2D)患者中得到驗證。β2-微球蛋白(B2M)以及克氏細胞蛋白(CC16)的組合標記用於發生早期進行性腎功能衰退(ERFD)的優勢比(odds ratio,OR)為7.59 (95% CI: 1.97-29.24)。以C18
盤-MALDI-TOF MS方法檢測β2-微球蛋白(B2M)以及克氏細胞蛋白(CC16)可能是一種有吸引力的實用檢測方法,用於快速診斷非糖尿病/糖尿病患者的腎病變,並作為在基線未顯示明顯腎臟疾病的第二型糖尿病(T2D)患者早期進行性腎功能衰退(ERFD)的預測因子。
縮寫:DM (diabetes mellitus) = 糖尿病;DN (diabetic nephropathy) = 糖尿病性腎病變;WDM-NP (patients with micro- or macroalbuminuria due to nondiabetic disease) =由於非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿的患者;DM-WNP (patients with type 2 diabetes mellitus without micro- or macroalbuminuria) = 不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者;DM-NP (patients with type 2 diabetes mellitus with microalbuminuria) = 具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者;MALDI-TOF-MS =基質輔助雷射脫附/電離飛行時間質譜儀;SELDI-TOF-MS (surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) = 表面增強雷射解吸電離/飛行時間質譜儀;SA (Sinapic acid) =芥子酸;CC16 = 克氏細胞蛋白;B2M = β2-微球蛋白。
1.
材料與方法
1.1
化學品
聚二甲基矽氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)預聚物購自Dow Corning公司(Sylgard 184密德蘭縣,密西根州,美國)。乙腈(Acetonitrile,ACN)以及三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)購自J.T. Baker公司(菲利普斯堡,紐澤西州,美國)。二硫蘇糖醇(Dithiothreitol,DTT)、碘乙醯胺(iodoacetamide,IAA),以及甲酸(formic acid,FA)購自Sigma-Aldrich公司(聖路易斯市,密蘇里州,美國)。十八烷基塗覆的二氧化矽顆粒(C18
, 3 µm,100 Å,Develosil)購自Nomura化學股份有限公司(瀨戶市,日本)。芥子酸(Sinapic acid,SA)購自Bruker Daltonics公司(德國)。胰蛋白酶(修飾的,定序等級)購自Promega公司(麥迪森市,威斯康辛州,美國)。尿素購自Bio Basic公司(多倫多市,加拿大)。
1.2
研究人口及樣品
橫切面研究設計用於透過C18盤/MALDI-TOF MS發現及驗證蛋白質標記。研究方案,包括樣品採集、製備,以及分析,由台灣台中市的中國醫藥大學的地方倫理委員會批准,並按照赫爾辛基宣言的原則進行。所有個體(n = 238)在研究之前已經提供了他們的知情同意書。根據臨床病程以及尿白蛋白***含量定義以下4組:具有微量白蛋白尿的糖尿病患者(DM-NP;n = 53,30 >白蛋白與肌酸酐比(ACR) > 300 mg/g),不具有微量或大量白蛋白尿的糖尿病患者 (DM-WNP;n = 87,白蛋白與肌酸酐比(ACR) > 30 mg/g),非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(WDM-NP;n = 48,30 mg/g > 白蛋白與肌酸酐比(ACR)),以及健康對照組(n = 50;白蛋白與肌酸酐比(ACR) > 30 mg/g)。該4組的臨床特徵如表1所示。
表 1.
健康、WDM-NP、DM-WNP,以及DM-NP個體的臨床與生化參數。
數值表示為平均值±標準偏差。WDM-NP組,由非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者;DM-WNP組,不具有微量或大量白蛋白尿的糖尿病(DM)患者;DM-NP,具有微量白蛋白尿的糖尿病患者;BMI,身體質量指數;eGFR,預估的腎小球濾過率;ACR,白蛋白與肌酸酐比。
1.3
研究人群進行後續核查
共有125名第二型糖尿病(T2D)個體,其中56名患有早期進行性腎功能衰退(ERFD)(病例),69名沒有早期進行性腎功能衰退(ERFD)(對照)被納入該巢式病例對照研究。所有患者在入組時腎功能正常(預估的腎小球濾過率[eGFR] > 60 mL/分鐘/1.73 m2
,白蛋白與肌酸酐比(ACR) > 300 mg/g)。在這些參與者中,56人有早期進行性腎功能衰退(ERFD),69人在追蹤期間沒有早期進行性腎功能衰退(ERFD)。早期進行性腎功能衰退(ERFD)被定義為每年預估的腎小球濾過率(eGFR)每1.73 m2
下降超過3.3 mL/分鐘[12]。使用改良的腎病變飲食(Modified Diet in Renal Disease,MDRD)方程式[13]預估腎小球濾過率(GFR)。
1.4
用於蛋白質分析的尿液樣品製備
將中段尿液收集在15 mL離心管中用於蛋白質取樣。為了降低蛋白質降解效果,將500 µL蛋白酶抑制劑混合物溶液(1種蛋白酶抑制劑片劑溶解在10 mL二次蒸餾水(ddH2
O)中)加入到10 mL每種收集的尿液樣品中。將尿液樣品在3000g
、4o
C下離心20分鐘。消除沉澱後,立即收集上清液或在-80o
C下儲存。
1.5
透過
C18
盤進行蛋白質去鹽以及透過
MALDI-TOF MS
進行蛋白質分析
根據我們之前的研究[11]製造C18
盤。首先以100%甲醇溶液洗滌C18
斑點以除去污染物以及非特異性吸附的化合物。將尿液樣品(20 µL)直接加載到C18
斑點上並作用10分鐘或直至它們乾燥為止。然後以二次蒸餾水(ddH2
O)洗滌斑點以除去鹽類。使用3 µL 80% 乙腈(ACN)/0.1% TFA溶液從C18
盤流洗該去鹽蛋白質。對於MALDI-TOF MS分析,將流洗的蛋白質與2 µL芥子酸(SA)溶液(在30% 乙腈(ACN)/0.1%TFA中的飽和芥子酸(SA))在MALDI標靶上混合。在芥子酸(SA)/蛋白質共結晶後,使用線性模式,以配備有Smartbeam雷射系統的MALDI-TOF/TOF MS系統(Ultraflex III TOF/TOF;Bruker Daltonics公司)分析MALDI-標靶。
1.6
蛋白質標記峰之純化
使用配備有LC管柱(XBridge Protein BEH C4
管柱,300Å,3.5 µm,2.1 mm x 150 mm;Waters公司)的液相色層分析(liquid chromatography,LC)幫浦系統(Ultimate 3000;Dionex公司)來純化蛋白質。流動相為溶劑A (5% 乙腈(ACN)與0.1% 甲酸(FA))以及溶劑B (100% 乙腈(ACN)以及0.1% 甲酸(FA))。以250 µL/分鐘的流速梯度流洗設定如下:1%溶劑B持續1.5分鐘,1%至30%溶劑B超過1分鐘,30%至80%溶劑B超過16分鐘,80%溶劑B持續2分鐘,5分鐘內80%溶劑B降至1%溶劑B。以UV偵測器(VWD-3400 RS;Dionex公司)在220以及280 nm的波長下監測流洗液。以60秒的間隔收集流洗液。透過MALDI-TOF MS分析每個級分以確認標記峰在m/z
~ 15860處的成功純化。將具有標記峰m/z
15860的純化蛋白質次區段及其相鄰次區段(作為對照次區段)在離心濃縮器(miVac Duo Concentrator;Genevac公司,紐約州,美國)中乾燥,然後進行溶液內消化以及以nanoLC-MS/MS分析進行鑑定。
1.7
溶液內消化
將m/z
15800處的純化的蛋白質標記峰重新溶解在4 M尿素中,並於37o
C下以10 mM DTT還原45分鐘。然後,加入55 mM IAA,將混合物於黑暗中於25o
C作用60分鐘。向蛋白質溶液中加入碳酸氫銨緩衝液(10 mM)以將尿素濃度降至1 M以下。然後將胰蛋白酶以1:25 (w/w)的酶-基質比率在37o
C下加入蛋白質溶液中作用16小時。將胜肽溶液以C18
Z-tips去鹽,在離心濃縮器中乾燥,然後以10 µL的0.1% 甲酸(FA)重構以用於nanoLC-MS/MS分析。
1.8 NanoLC-MS/MS
分析
NanoLC-MS/MS使用奈米流超高效液相色層分析系統(UltiMate 3000 RSLCnano系統;Dionex公司)與混合四極桿飛行時間(Q-TOF)質譜儀(maXis Impact;Bruker公司)偶聯進行。樣品上樣後,將胜肽從捕獲管柱中流洗到分析管柱(Acclaim PepMap C18
,2 µm,100Å,75 µm x 250 mm;Thermo Scientific公司)中,與Q-TOF質譜儀上的奈米電噴霧電離源偶聯。使用8% 乙腈(ACN)(0.1%甲酸(FA))至40% 乙腈(ACN)(0.1%甲酸(FA))在36分鐘內的梯度流洗,以300 nL/分鐘的流速用於胰蛋白酶胜肽分離。每個TOF MS掃描的8個電荷前體+ 2、+ 3,以及+4被動態選擇並分離用於MS/MS碎片離子掃描。MS以及MS/MS累積分別設定為1以及10 Hz。
1.9
蛋白質資料庫檢索
使用DataAnalysis (版本4.1;Bruker公司)將nanoLC-MS/MS獲得的光譜轉換為xml檔案,並使用MASCOT (版本2.2.07)針對Swissprot (版本51.0)資料庫進行搜索。前體離子以及碎片離子耐受性的MASCOT搜索參數分別為80 ppm以及0.07 Da。選擇了以下搜索參數:分類學(Taxonomy)、人類(Human);錯過的***(missed cleavages),1;酵素(enzyme)、胰蛋白酶(trypsin);固定修飾(fixed modifications),胺基甲醯基甲基(carbamidomethyl)(C);以及可變修飾(variable modifications),氧化(oxidation)(M)以及去醯胺(deamidation)(NQ)。如果胜肽的個體MASCOT離子評分高於25 (p
> 0.01),則認為胜肽是「鑑定的」。
1.10
尿液中
β2-
微球蛋白
(B2M)
以及克氏細胞蛋白的酵素聯結免疫吸附分析
(ELISA)
根據製造商的說明書,使用商業套組(Cloud-Clone公司)透過酵素聯結免疫吸附分析(ELISA)測量尿液β2-微球蛋白(B2M)以及克氏細胞蛋白(CC16)濃度。所有樣品均使用相同的設備以及同一實驗室技術人員處理,他們對所有臨床數據不知情。Mann-Whitney檢驗用於比較中間值的差異,其表示為具有四分位數值的中間值(25%,75%)。
1.11
統計分析
連續數據表示為平均值以及標準偏差或中位數以及四分位數範圍,分類數據表示為比例。兩個獨立的樣本T檢驗用於比較連續變量的均值,卡方檢驗用於比較組間分類變量的頻率。使用邏輯回歸模型估算潛在的尿生物標記以及早期進行性腎功能衰退(ERFD)之間的關聯,並計算優勢率(OR)以及95%信賴區間(confidence intervals,CIs)。構築接受者操作特徵(receiver operating characteristic,ROC)曲線以確定潛在生物標記的靈敏度與特異性。使用SigmaPlot 11.1 (Systat軟體公司,加州,美國)以及SPSS統計軟體22.0 (IBM公司,紐約州,美國)進行統計學分析。p值小於0.05 (雙側)被認為是顯著的。
2.
結果
2.1
以
C18
盤製備尿液樣品
尿液中的高鹽含量會干擾MALDI結晶並導致較差的質譜儀訊號。為了評估鹽對尿蛋白質分析的影響,將20 µL尿液直接應用於MALDI-TOF MS分析而不去鹽。為了避免鹽干擾效應,我們使用疏水性C18
盤去除鹽但保留尿液樣品中的蛋白質。將去鹽尿液樣品應用於C18
盤後,蛋白質訊號得到極大改善。
為了評估在該研究中獲得蛋白質譜所需的最小蛋白質量,測試了不同的尿蛋白量。當施用0.6-2.38 µg量時獲得相似的蛋白質譜。在健康、WDM-NP、DM-WNP,以及DM-NP組別的尿液樣品中透過Bradford蛋白質分析法測量的蛋白質濃度(表示為具有四分位數值的中間值(25%,75%))分別為0.06 μg/μL (0.03–0.09 μg/μL)、0.34 μg/μL (0.13–1.11 μg/μL)、0.05 μg/μL (0.03–0.08 μg/μL),以及0.13 μg/μL (0.10–0.19 μg/μL)。因此,在該研究中,20 µL尿液樣品中的蛋白質量足以提供資訊蛋白質譜。
2.2
正常以及病理性尿液中的蛋白質***模式
透過MALDI-TOF MS分析來自87個DM-WNP患者、53個DM-NP患者、48個WDM-NP患者,以及50個健康對照的去鹽尿蛋白樣品。來自健康以及WDM-NP個體的代表性MALDI-TOF質譜顯示在圖1中。發現m/z
11732±2 (或氧化形式m/z
11748±2)以及m/z
15840±3 (或氧化形式m/z
~15856±3)的顯著峰在WDM-NP以及DM-NP個體內高度表現;還進行了它們的代表性假凝膠以及光譜分析(數據未顯示)。使用9.7 kDa的峰(鞘脂苷B)作為內部標準品,以評估11.7 kDa以及15.8 kDa的兩個蛋白質標記峰的診斷值。如圖2A所示,WDM-NP以及DM-NP的峰值比率為11.7/9.7 kDa,顯著高於健康組(p
> 0.001)。在WDM-NP以及DM-NP的峰值比率為15.8/9.7 kDa,這顯著高於健康組(p
> 0.001)以及DM-WNP組(p
> 0.001)(圖2B)。
為了區分WDM-NP患者以及健康個體,研究了接受者操作特徵(ROC)圖的曲線下面積(area under the curve,AUC)。對於11.7 kDa峰,曲線下面積(AUC)為0.75,對於15.8 kDa峰,曲線下面積(AUC)為0.74。因為這兩個峰可以在單個MALDI-TOF質譜中同時檢測,所以兩者都可以作為診斷標記。這2個峰的敏感性及特異性分別為77.3%以及91.8%,改善的曲線下面積(AUC)為0.8,因此可作為區分WDM-NP (腎病變)以及健康個體的標記。對於DM-NP (糖尿病性腎病變)與DM-WNP患者的區分,對於11.7 kDa峰,曲線下面積(AUC)為0.6,對於15.8 kDa峰,曲線下面積(AUC)為0.67。在這種情況下,這兩個峰的組合標記具有66%以及73%的靈敏度以及特異性,曲線下面積(AUC)為0.62。
2.3
差異表現蛋白之純化與鑑定
據報導,11.7 kDa峰值為β2-微球蛋白(B2M)[14],且在我們之前的研究[15]中也有鑑定。為了確認15.8 kDa峰的特性,尿液樣品透過C4
反相色層分析法分級,如材料與方法部分所述。進行來自DM-NP個體的尿蛋白的LC-UV色層分析圖(數據未顯示),並且從次區段10純化15.8 kDa峰,其基於m/z
647.91的雙電荷胰蛋白酶胜肽峰的MS/MS定序鑑定為克氏細胞蛋白(CC16)(Mascot鑑定得分為88),顯示對應於序列KLVDTLPQKPR的完整y-以及b-離子系列(圖3)。
2.4 β2-
微球蛋白
(B2M)
以及克氏細胞蛋白
(CC16)
的酵素聯結免疫吸附分析
(ELISA)
評估
由於酵素聯結免疫吸附分析(ELISA)通常用於臨床實驗室以量化蛋白質標記豐度以用於診斷,所以對11.7 kDa β2-微球蛋白(B2M)以及15.8 kDa 克氏細胞蛋白(CC16)進行酵素聯結免疫吸附分析(ELISA)以評估尿液中兩種標記的相對豐度。(圖4) WDM-NP、DM-NP,以及DM-WNP組的β2-微球蛋白(B2M)表現顯著高於健康對照組(p
>0.001)。然而,DM-NP組的克氏細胞蛋白(CC16)的表現只有相對於DM-WNP組(p
>0.05)以及健康對照組(p
>0.001)顯著較高。為了區分WDM-NP患者以及健康個體,評估接受者操作特徵(ROC)圖的曲線下面積(AUC),發現β2-微球蛋白(B2M)為0.87,克氏細胞蛋白(CC16)為0.67,β2-微球蛋白(B2M)以及克氏細胞蛋白(CC16)的組合的曲線下面積(AUC)為0.74。在區分DM-NP與DM-WNP的情況下,β2-微球蛋白(B2M)的曲線下面積(AUC)為0.59,克氏細胞蛋白(CC16)的曲線下面積(AUC)為0.60,組合的曲線下面積(AUC)為0.60。
2.5
驗證已發展為早期進行性腎功能衰退
(ERFD)
的第二型糖尿病
(T2D)
患者的蛋白質標記
巢式病例對照研究設計用於研究β2-微球蛋白(B2M)以及克氏細胞蛋白(CC16)在第二型糖尿病(T2D)患者腎病變發展中的預測能力。作為主要終點的具有(n = 56)以及不具有(n = 69)早期進行性腎功能衰退(ERFD)的第二型糖尿病(T2D)個體在基線檢查時具有相似的人口統計學(年齡與性別)、糖尿病持續時間、BMI、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、HbA1c、肌酸酐以及白蛋白與肌酸酐比(ACR)。早期進行性腎功能衰退(ERFD)患者的預估的腎小球濾過率(eGFR)高於不具有早期進行性腎功能衰退(ERFD)的患者(平均±標準偏差:114.13±25.86對98.86±23.36 [p
值= 0.001])。白蛋白與肌酸酐比(ACR)不是預測早期進行性腎功能衰退(ERFD)的基線的重要標記(卡方檢驗的p
值為0.196 (表2))。對於兩個潛在的尿標記,56例具有早期進行性腎功能衰退(ERFD)的第二型糖尿病(T2D)患者中的16例(28.6%)以及69例不具有早期進行性腎功能衰退(ERFD)的第二型糖尿病(T2D)患者中的9例(13.0%)在基線時具有可檢測的克氏細胞蛋白(CC16)標記(克氏細胞蛋白(CC16)/SAP比 > 0)(卡方檢驗的p
值為0.031 (表2))。兩組之間沒有觀察到β2-微球蛋白(B2M)存在的顯著差異(早期進行性腎功能衰退(ERFD)以及非早期進行性腎功能衰退(ERFD)組為39.3%對上31.9%,p
= 0.389)。數據顯示克氏細胞蛋白(CC16)在基線時的存在與早期進行性腎功能衰退(ERFD)的後期發展有關。
表 2.
以預估的腎小球濾過率(eGFR)下降/年 ≧3.3%分層(早期進行性腎功能衰退(ERFD))的人口統計學以及臨床特徵
縮寫:ACR,白蛋白與肌酸酐比;SBP,收縮壓;DBP,舒張壓;eGFR,預估的腎小球濾過率;BMI,身體質量指數;ERFD,早期腎功能下降;DM,糖尿病。
第1組:β2-微球蛋白(B2M)/SAP_MALDI比率= 0,且克氏細胞蛋白(CC16)/SAP MALDI比率= 0
第2組:β2-微球蛋白(B2M)/SAP_MALDI比率= 0,且克氏細胞蛋白(CC16)/SAP MALDI比率> 0,β2-微球蛋白(B2M)/SAP_MALDI比率> 0,且克氏細胞蛋白(CC16)/SAP MALDI比率= 0
第3組:β2-微球蛋白(B2M)/SAP_MALDI比> 0,且克氏細胞蛋白(CC16)/SAP MALDI比率> 0
邏輯回歸用於進一步檢查潛在生物標記β2-微球蛋白(B2M)以及克氏細胞蛋白(CC16)的獨立或組合對早期進行性腎功能衰退(ERFD)的影響(表3)。當比較具有標記的個體以及不具有標記的個體時,對於β2-微球蛋白(B2M)標記以及克氏細胞蛋白(CC16)標記,在調整追蹤時間後,早期進行性腎功能衰退(ERFD)的優勢率(OR)分別為2.01 (95%CI:0.90-4.52)以及4.87 (95%CI:1.77-13.44)。此外,克氏細胞蛋白(CC16)以及β2-微球蛋白(B2M)組合應用可增加早期進行性腎功能衰退(ERFD)風險的顯著累加效果(交互項的p值= 0.003)。當比較具有兩種標記的個體以及沒有任何標記的個體時,早期進行性腎功能衰退(ERFD)的優勢率(OR)為7.59 (95%CI:1.97-29.24)。
表 3.
邏輯回歸模型 a
邏輯回歸模型的P
值,未經調整b
根據追蹤時間調整的邏輯回歸模型的P
值
第1組:β2-微球蛋白(B2M)/SAP_MALDI比率= 0,且克氏細胞蛋白(CC16)/SAP MALDI比率= 0
第2組:β2-微球蛋白(B2M)/SAP_MALDI比率= 0,且克氏細胞蛋白(CC16)/SAP MALDI比率> 0,β2-微球蛋白(B2M)/SAP_MALDI比率> 0,且克氏細胞蛋白(CC16)/SAP MALDI比率= 0
第3組:β2-微球蛋白(B2M)/SAP_MALDI比> 0,且克氏細胞蛋白(CC16)/SAP MALDI比率> 0
3.
討論與結論
最近,MALDI-TOF MS已成功被核准作為醫院常規細菌鑑定的體外診斷設備[16]。因此,透過MALDI-TOF MS檢測的疾病標記對於臨床使用變得實用。由於尿液中的鹽會干擾MALDI-TOF質譜訊號,因此在本研究中,使用C18
盤從臨床樣品中快速去除鹽並保留尿樣中的尿蛋白以用於MALDI-TOF MS分析。我們的結果顯示克氏細胞蛋白(CC16)在WDM-NP以及DM-NP組中比在健康組(p
>0.001)以及DM-WNP組中更高表現(p
>0.001)。然而,在酵素聯結免疫吸附分析(ELISA)結果中,DM-NP組中克氏細胞蛋白(CC16)表現僅略高於DM-WNP組(p
= 0.05)。這些結果還表示MALDI-TOF MS可以比酵素聯結免疫吸附分析(ELISA)分析更具體地鑑定克氏細胞蛋白(CC16)。
β2-微球蛋白(B2M)是一種低分子量蛋白質,被腎小球過濾並在近端小管中退化[17]。一些研究表示,尿β2-微球蛋白(B2M)在腎小管損傷中增加,表示尿β2-微球蛋白(B2M)為腎小管損傷的早期診斷標記[18,19]。在第二型糖尿病中,尿β2-微球蛋白(B2M)***與大血管疾病[20]以及腎病變[1,21,22]有關。
15.8-kDa克氏細胞蛋白(CC16)(也稱為CC10、子宮珠蛋白,或尿蛋白1)透過腎小球濾過迅速消除,並在腎近端小管細胞中重新吸收並分解代謝。近端小管細胞的功能障礙可導致克氏細胞蛋白(CC16)的再吸收減少及其尿液中的含量增加。 據報導,克氏細胞蛋白(CC16)為成人[23]以及兒童[24]患者近端腎小管功能障礙的標記。這種蛋白質標記對近端腎小管功能障礙中非常微小的缺陷很敏感,這些缺陷可能無法透過檢測經典的尿液低分子量蛋白質來檢測[25]。據我們所知,我們的研究是第一個在腎病變和糖尿病性腎病變(DN)患者尿液中發現高克氏細胞蛋白(CC16)表現的研究。
透過長期追蹤研究,發現β2-微球蛋白(B2M)以及克氏細胞蛋白(CC16)(發生早期進行性腎功能衰退(ERFD)的優勢率(OR)為7.59)是在基線中尚未表現出明顯腎臟疾病的第二型糖尿病(T2D)患者中早期進行性腎功能衰退(ERFD)的獨立預測因子,並表示β2-微球蛋白(B2M)以及克氏細胞蛋白(CC16)的蛋白質峰值透過C18盤/MALDI-TOF檢測可以提高尿白蛋白出現前預測腎病變的敏感性。
透過大樣本量的分析,我們發現並驗證了2個蛋白質峰,β2-微球蛋白(B2M)(11.7 kDa)以及克氏細胞蛋白(CC16)(15.8 kDa),作為與腎病變相關的生物標記,並驗證了包括糖尿病以及非糖尿病患者在內的238個人的辨別能力。用於發展早期進行性腎功能衰退(ERFD)之組合的β2-微球蛋白(B2M)以及克氏細胞蛋白(CC16)標記的優勢率(OR)為7.59 (95%CI:1.97-29.24)。這是克氏細胞蛋白(CC16)作為腎病變以及糖尿病性腎病變(DN)的尿標記的第一份報導。因此,我們透過C18
盤-MALDI-TOF MS檢測β2-微球蛋白(B2M)以及克氏細胞蛋白(CC16)的方法可以提供第二型糖尿病患者腎病變的快速診斷以及預測。參考資料
1. Dihazi H, Muller GA, Lindner S, Meyer M, Asif AR, et al. (2007) Characterization of diabetic nephropathy by urinary proteomic analysis: identification of a processed ubiquitin form as a differentially excreted protein in diabetic nephropathy patients. Clin Chem 53: 1636-1645.
2. Remuzzi G, Schieppati A, Ruggenenti P (2002) Clinical practice. Nephropathy in patients with type 2 diabetes. N Engl J Med 346: 1145-1151.
3. Otu HH, Can H, Spentzos D, Nelson RG, Hanson RL, et al. (2007) Prediction of diabetic nephropathy using urine proteomic profiling 10 years prior to development of nephropathy. Diabetes Care 30: 638-643.
4. Gerstein HC, Mann JF, Yi Q, Zinman B, Dinneen SF, et al. (2001) Albuminuria and risk of cardiovascular events, death, and heart failure in diabetic and nondiabetic individuals. JAMA 286: 421-426.
5. Indovina P, Marcelli E, Pentimalli F, Tanganelli P, Tarro G, et al. (2013) Mass spectrometry-based proteomics: the road to lung cancer biomarker discovery. Mass Spectrom Rev 32: 129-142.
6. Tan HT, Lee YH, Chung MC (2012) Cancer proteomics. Mass Spectrom Rev 31: 583-605.
7. Cravatt BF, Simon GM, Yates JR, 3rd (2007) The biological impact of mass-spectrometry-based proteomics. Nature 450: 991-1000.
8. Chang CT, Yang CY, Tsai FJ, Lin SY, Chen CJ (2015) Mass Spectrometry-Based Proteomic Study Makes High-Density Lipoprotein a Biomarker for Atherosclerotic Vascular Disease. Biomed Res Int 2015: 164846.
9. Papale M, Di Paolo S, Magistroni R, Lamacchia O, Di Palma AM, et al. (2010) Urine proteome analysis may allow noninvasive differential diagnosis of diabetic nephropathy. Diabetes Care 33: 2409-2415.
10. Wu J, Chen YD, Yu JK, Shi XL, Gu W (2011) Analysis of urinary proteomic patterns for type 2 diabetic nephropathy by ProteinChip. Diabetes Res Clin Pract 91: 213-219.
11. Liao HY, Tsai FJ, Lai CC, Tseng MC, Hsu CY, et al. (2016) Rapid fabrication of functionalized plates for peptides, glycopeptides and protein purification and mass spectrometry analysis. Analyst 141: 2183-2190.
12. Lindeman RD, Tobin J, Shock NW (1985) Longitudinal studies on the rate of decline in renal function with age. J Am Geriatr Soc 33: 278-285.
13. Levey AS, Bosch JP, Lewis JB, Greene T, Rogers N, et al. (1999) A more accurate method to estimate glomerular filtration rate from serum creatinine: a new prediction equation. Modification of Diet in Renal Disease Study Group. Ann Intern Med 130: 461-470.
14. Zhang Y, Oetting WS, Harvey SB, Stone MD, Monkkonen T, et al. (2009) Urinary Peptide patterns in native kidneys and kidney allografts. Transplantation 87: 1807-1813.
15. Chang CT, Liao HY, Huang WH, Lin SY, Tsai TY, et al. (2015) Early prediction of severe acute pancreatitis by urinary beta-2 microglobulin/saposin B peak ratios on MALDI-TOF. Clin Chim Acta 440: 115-122.
16. Seng P, Drancourt M, Gouriet F, La Scola B, Fournier PE, et al. (2009) Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis 49: 543-551.
17. Moresco RN, Sangoi MB, De Carvalho JA, Tatsch E, Bochi GV (2013) Diabetic nephropathy: traditional to proteomic markers. Clin Chim Acta 421: 17-30.
18. Sharifiaghdas F, Kashi AH, Eshratkhah R (2011) Evaluating percutaneous nephrolithotomy-induced kidney damage by measuring urinary concentrations of beta2-microglobulin. Urol J 8: 277-282.
19. Piscator M (1991) Early detection of tubular dysfunction. Kidney Int Suppl 34: S15-17.
20. Yoshikawa R, Wada J, Seiki K, Matsuoka T, Miyamoto S, et al. (2007) Urinary PGDS levels are associated with vascular injury in type 2 diabetes patients. Diabetes Res Clin Pract 76: 358-367.
21. Schardijn GH, Statius van Eps LW (1987) Beta 2-microglobulin: its significance in the evaluation of renal function. Kidney Int 32: 635-641.
22. Hong CY, Chia KS (1998) Markers of diabetic nephropathy. J Diabetes Complications 12: 43-60.
23. Bernard A, Lauwerys R, Noel A, Vandeleene B, Lambert A (1991) Determination by Latex Immunoassay of Protein-1 in Normal and Pathological Urine. Clinica Chimica Acta 201: 231-245.
24. Martin-Granado A, Vazquez-Moncholi C, Luis-Yanes MI, Lopez-Mendez M, Garcia-Nieto V (2009) Determination of Clara cell protein urinary elimination as a marker of tubular dysfunction. Pediatric Nephrology 24: 747-752.
25. Bernard A, Lauwerys R (1995) Low-Molecular-Weight Proteins as Markers of Organ Toxicity with Special Reference to Clara Cell Protein. Toxicology Letters 77: 145-151.
無
為了說明本發明,以下說明具體實施例。然而,應該理解的是,本發明不限於所示之較佳具體實施例。
於圖式中:
圖1所示為來自健康個體以及患有WDM-NP、DM-WNP,以及DM-NP的患者之尿液樣品的代表性MALDI-TOF質譜。
圖2A-2B所示為來自39個健康的、44個WDM-NP、85個DM-WNP,以及51個DM-NP個體的尿液樣品中(2A) 11.7 kDa以及(2B) 15.8 kDa蛋白質的***含量。相對強度表示為盒形圖,表示為具有四分位數值的介質(25%,75%)。誤差線表示最小值與最大值。*p
>0.05,***p
≤ 0.001。
圖3所示為透過nanoLC-M/MS鑑定m/z
647.91峰的對應胜肽。
圖4A-4B所示為來自39個健康的、44個WDM-NP、85個DM-WNP,以及51個DM-NP個體的尿液樣品中(圖4A) β2-微球蛋白(B2M)以及(圖4B)克氏細胞蛋白(CC16)的***含量。相對強度表示為盒形圖,表示為具有四分位數值的介質(25%,75%)。誤差線表示最小值與最大值。 *p
> 0.05,**p
> 0.01,***p
≤ 0.001。
無
Claims (17)
- 一種檢測個體腎病變之方法,該方法包括: (i) 提供從該患者獲得的生物樣品;以及 (ii) 檢測該生物樣品中的生物標記以獲得檢測含量,將該檢測含量與該生物標記的參考含量進行比較以獲得比較結果,並基於該比較結果評估該個體是否患有腎病變或有是否具有發展腎病變之風險,其中該生物標記包含克氏細胞蛋白(Clara-cell protein,CC16),且相較於該參考含量,該檢測含量的增加表示該個體患有腎病變或具有發展腎病變的風險。
- 如請求項1之方法,其中該檢測透過質譜法或免疫分析法進行。
- 如請求項1之方法,其中該生物樣品為尿液樣品。
- 如請求項1之方法,其中該生物標記進一步包含β2-微球蛋白(2-microglobulin,B2M)。
- 如請求項1之方法,其中該腎病變為慢性腎病變(chronic kidney disease,CKD)。
- 如請求項5之方法,其中該慢性腎病變(CKD)為早期慢性腎病變(CKD),具體而言是第1階段或第2階段,或該慢性腎病變(CKD)為第3階段或第4階段慢性腎病變(CKD)。
- 如請求項1之方法,其中該個體為糖尿病患者。
- 如請求項1之方法,其中該腎病變為糖尿病性腎病變。
- 如請求項1之方法,進一步包括進行治療腎病變之方法。
- 一種預測糖尿病患者的糖尿病性腎病變或早期進行性腎功能衰退(early progressive renal function decline,ERFD)之方法,該方法包括: (i) 提供從該糖尿病患者獲得的生物樣品;以及 (ii) 檢測該生物樣品中的生物標記以獲得檢測含量,將該檢測含量與該生物標記的參考含量進行比較以獲得比較結果,並基於該比較結果評估該個體是否患有腎病變或是否具有發展腎病變或早期進行性腎功能衰退(ERFD)之風險,其中該生物標記包括克氏細胞蛋白(CC16),且相較於該參考含量,該檢測含量的增加表示發生糖尿病性腎病變或早期進行性腎功能衰退(ERFD)的風險較高。
- 如請求項10之方法,其中該檢測透過質譜法或免疫分析法進行。
- 如請求項10之方法,其中該生物樣品為尿液樣品。
- 如請求項10之方法,其中該生物標記包括克氏細胞蛋白(CC16)以及β2-微球蛋白(B2M)。
- 如請求項10之方法,進一步包括進行一種預防糖尿病性腎病變或早期進行性腎功能衰退(ERFD)之方法。
- 一種用於實施如請求項1至14中任一項之方法的套組,其包括特異性識別該生物標記的試劑,以及使用該套組檢測該生物標記的存在或含量之說明書。
- 如請求項15之套組,其中該試劑與可檢測標記連接。
- 一種試劑之用途,該試劑為(i)特異性識別克氏細胞蛋白(CC16)之分子,(ii)任選地與特異性識別β2-微球蛋白(B2M)的分子組合,或(iii)兩者,以一方法進行如請求項1至9中任一項所述之用於檢測個體中的腎病變之方法,或如請求項1至14中任一項所述之用於預測糖尿病患者的糖尿病性腎病變或早期進行性腎功能衰退(ERFD)之方法,或製備套組或組合物,以用於進行如請求項1至9中任一項所述的用於進行個體腎病變檢測方法,或如請求項1至14中任一項所述之預測糖尿病患者的糖尿病性腎病變或早期進行性腎功能衰退(ERFD)之方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201862688142P | 2018-06-21 | 2018-06-21 | |
US62/688,142 | 2018-06-21 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW202016547A true TW202016547A (zh) | 2020-05-01 |
TWI822802B TWI822802B (zh) | 2023-11-21 |
Family
ID=68983459
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW108121862A TWI822802B (zh) | 2018-06-21 | 2019-06-21 | 腎病變蛋白生物標記及其應用 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210208165A1 (zh) |
EP (1) | EP3811083B1 (zh) |
CN (1) | CN112639476A (zh) |
AU (1) | AU2019290752A1 (zh) |
CA (1) | CA3103150A1 (zh) |
TW (1) | TWI822802B (zh) |
WO (1) | WO2019242750A1 (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113552369B (zh) * | 2021-07-23 | 2023-10-20 | 江苏省中医院 | 蛋白标志物联合用于2型糖尿病、2型糖尿病肾病的诊断的用途 |
CN114574573B (zh) * | 2022-03-15 | 2024-01-05 | 南京羿检医学科技有限公司 | 测定尿液微囊泡中rna含量的试剂在制备糖尿病肾病诊断试剂中的应用 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2535718B1 (en) * | 2007-05-11 | 2014-07-09 | The Institutes for Pharmaceutical Discovery, LLC | Methods for early diagnosis of kidney disease |
CN103299192B (zh) * | 2010-09-21 | 2016-05-11 | 普罗蒂阿米克斯国际有限公司 | 与糖尿病前期、糖尿病以及糖尿病相关病症相关的生物标记 |
US20140038203A1 (en) * | 2012-07-09 | 2014-02-06 | Musc Foundation For Research Development | Methods for detecting or predicting kidney disease |
CN103344635B (zh) * | 2013-07-18 | 2016-03-30 | 博奥赛斯(天津)生物科技有限公司 | 一种克拉拉细胞蛋白纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 |
CN104611340A (zh) * | 2015-01-08 | 2015-05-13 | 山西医科大学 | 重组人cc16基因、其真核表达载体的构建及重组蛋白的纯化 |
CN107541544A (zh) * | 2016-06-27 | 2018-01-05 | 卡尤迪生物科技(北京)有限公司 | 用于确定微生物分布谱的方法、***、试剂盒、用途和组合物 |
-
2019
- 2019-06-21 EP EP19822034.5A patent/EP3811083B1/en active Active
- 2019-06-21 CN CN201980053941.2A patent/CN112639476A/zh active Pending
- 2019-06-21 CA CA3103150A patent/CA3103150A1/en active Pending
- 2019-06-21 US US17/253,821 patent/US20210208165A1/en active Pending
- 2019-06-21 TW TW108121862A patent/TWI822802B/zh active
- 2019-06-21 AU AU2019290752A patent/AU2019290752A1/en active Pending
- 2019-06-21 WO PCT/CN2019/092329 patent/WO2019242750A1/en active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2019290752A1 (en) | 2021-01-21 |
EP3811083B1 (en) | 2024-02-14 |
EP3811083A1 (en) | 2021-04-28 |
US20210208165A1 (en) | 2021-07-08 |
TWI822802B (zh) | 2023-11-21 |
CA3103150A1 (en) | 2019-12-20 |
CN112639476A (zh) | 2021-04-09 |
EP3811083A4 (en) | 2022-03-23 |
WO2019242750A8 (en) | 2020-07-02 |
WO2019242750A1 (en) | 2019-12-26 |
EP3811083C0 (en) | 2024-02-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9176148B2 (en) | Method for the early detection of renal disease using proteomics | |
US7662578B2 (en) | Method and kit for the early detection of impaired renal status | |
US8394601B2 (en) | Peptide biomarkers predictive of renal function decline and kidney disease | |
US8673574B2 (en) | Diagnosis and monitoring of renal failure using peptide biomarkers | |
EP2281203B1 (en) | A marker for graft failure and mortality | |
CA2575475C (en) | Method for diagnosing liver fibrosis | |
Kistler et al. | Identification of a unique urinary biomarker profile in patients with autosomal dominant polycystic kidney disease | |
CN109564225B (zh) | 作为指示不良事件的标志物的组蛋白和/或proADM | |
US20070178442A1 (en) | Method for diagnosing liver fibrosis | |
TWI822802B (zh) | 腎病變蛋白生物標記及其應用 | |
US20150011423A1 (en) | Means and methods for assessing kidney toxicity | |
EP3012634B1 (en) | Biomarker for rheumatoid arthritis diagnosis or activity evaluation | |
CN114026427A (zh) | 诊断肾病的标志物以及诊断方法 | |
US20200292558A1 (en) | Prognosis and progression biomarkers for chronic kidney disease | |
EP2391653B1 (en) | Biomarkers associated with nephropathy | |
WO2019242751A1 (en) | Small molecular biomarkers for nephropathy and applications thereof | |
WO2007148720A1 (ja) | ネフローゼ症候群の疾患関連たんぱく質およびその使用 | |
EP3132269B1 (en) | Diagnosis of chronic kidney disease by quantitative analysis of post-translational modifications of plasma proteins | |
WO2008047485A1 (fr) | Procédé de diagnostic d'un métabolisme anormal du fer en utilisant de l'hepcidine active en tant qu'indicateur | |
Delrue | The use of proteomics in diabetic nephropathy | |
D'Addessi et al. | Calcium oxalate nephrolithiasis: Urinary “medium size peptides” analysis using MALDI-TOF mass spectrometry. | |
AU2012310100A1 (en) | Means and methods for assessing kidney toxicity |