TW202010514A - Pedf衍生之短肽在治療骨關節炎中的應用 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種治療及/或預防骨關節炎之方法,其包括向有需要之個體投與包含PEDF衍生之短肽(PDSP)或該PDSP之變體的醫藥組合物,其中該PDSP包含人類色素上皮衍生因子(PEDF)之殘基93至106,且其中該PDSP之變體含有該PDSP之絲胺酸-93、丙胺酸-96、麩醯胺酸-98、異白胺酸-103、異白胺酸-104及精胺酸106且在其他位置處含有一或多個胺基酸取代,其中殘基位置編號係基於人類PEDF中之彼等。
Description
本發明係關於PEDF衍生之肽及其在損傷後之骨關節炎癒合中之用途。
骨關節炎(OA)是最常見之關節疾病類型,其係由滑膜關節中之關節軟骨之斷裂所引起的退化性病症。隨著年齡增長,關節軟骨在細胞層級(亦即,軟骨細胞)下退化。存在軟骨細胞及蛋白聚醣之數量降低,致使軟骨厚度之整體降低。關節軟骨細胞(AC)之結構及功能之斷裂致使骨關節炎,其影響全球數百萬人。然而,由於關節軟骨細胞沒有血管及靜止性,AC在較大外傷中之自我癒合之能力具有侷限性(Khan等人,2008,「Cartilage integration: evaluation of the reasons for failure of integration during cartilage repair
」Eur. Cell. Mater.,2008年9月3日;16:26-39)。另外,軟骨頻繁損傷,諸如與運動相關之外傷。因此,軟骨缺損及早期骨關節炎對於矯形外科醫師而言係主要的挑戰。
骨關節炎為進行性、異質性、退化性關節疾病,且為關節炎之最常見形式,尤其在老年人中。骨關節炎與關節中軟骨之斷裂有關且可在體內之幾乎任何關節中發生。其通常發生在髖、膝及脊柱之承重關節,但亦可影響手指、頸部及大腳趾。然而,骨關節炎很少影響其他關節除非涉及先前之損傷或過度之壓力。關節軟骨經由損傷或疾病之缺損是主要的存臨床挑戰。
在胚胎發育期間,軟骨中之軟骨細胞分化自間葉細胞。經分化軟骨細胞係正常成熟軟骨中所發現之唯一細胞類型,其合成足量之軟骨特異細胞外基質(ECM)以維持基質整合性。ECM之主要組分為水、聚集蛋白聚醣及阻礙經由底層骨骼之移動產生之經施加壓縮力之II型膠原蛋白。
對於OA之治療選項極具侷限性。這些治療包括鎮痛劑、非類固醇抗炎藥(NSAID)及類固醇或玻尿酸(HA;以改善關節潤滑)之關節內注射。物理療法是一種選項。手術選項範圍自關節鏡操作至全關節關節造形術。另外,正在研發藉由手術操作之同種異體移植體。此等有限之治療選項可提供一些緩解。然而,仍然存在對用於骨關節炎之較好治療之需求。
本發明之實施例係關於使用色素上皮衍生因子(PEDF)衍生之短肽用於治療及/或預防骨關節炎的方法。本發明之一些實施例係關於用於促進軟骨生成之方法。
本發明之一個態樣係關於用於治療及/或預防骨關節炎之醫藥組合物或方法。根據本發明之實施例之方法包括向對其有需要之個體投與包含PEDF衍生之短肽(PDSP)或PDSP之變體的醫藥組合物,其中PDSP包含人類色素上皮衍生因子(PEDF)之殘基93-106,且其中PDSP之變體含有PDSP之絲胺酸-93、丙胺酸-96、麩醯胺酸-98、異白胺酸-103、異白胺酸-104及精胺酸106且在其他位置處含有一或多個胺基酸取代,其中殘基位置編號係基於人類PEDF中之彼等。PDSP包含SEQ ID NO:1至75中之任一者序列之序列。
本發明之一個態樣係關於用於促進軟骨生成之醫藥組合物或方法。根據本發明之實施例之方法包含使多能間葉幹細胞與包含PEDF衍生之短肽(PDSP)或PDSP之變體的組合物接觸,其中PDSP包含人類色素上皮衍生因子(PEDF)之殘基93-106,且其中PDSP之變體含有PDSP之絲胺酸-93、丙胺酸-96、麩醯胺酸-98、異白胺酸-103、異白胺酸-104及精胺酸106且在其他位置處含有一或多個胺基酸取代,其中殘基位置編號係基於人類PEDF中之彼等。PDSP包含SEQ ID NO:1至75中之任一者序列之序列。
本發明之其他態樣藉由以下實施方式及所附申請專利範圍將變得顯而易見。
本發明之實施例係關於使用PEDF衍生之短肽(PDSP)預防及/或治療骨關節炎之方法。本發明係基於出人意料之發現:自色素上皮衍生因子(PEDF)衍生之某些短肽可藉由誘導間葉細胞分化以形成軟骨細胞來減輕骨關節炎中之疼痛且賦予關節軟骨修復。
骨關節炎為一種由滑膜關節中之關節軟骨(AC)之斷裂所引起之退化性病症。然而,由於關節軟骨細胞沒有血管及靜止性,AC自癒之能力具有侷限性。正常成熟軟骨包含在胚胎發育期間由間葉細胞分化之軟骨細胞。作為正常成熟軟骨中發現之唯一細胞類型的經分化軟骨細胞會合成足量之軟骨特異細胞外基質(ECM)以維持基質整合性。
人類色素上皮衍生因子(PEDF)為含有418個胺基酸、分子量為約50 kDa之分泌蛋白。PEDF為具有許多生物功能之多功能蛋白(參見例如,美國專利申請公開案第2010/0047212號)。發現PEDF之不同肽區域負責不同功能。舉例而言,已鑑定34-聚體片段(PEDF之殘基44-77)具有抗血管生成活性,同時已鑑定44-聚體片段(PEDF之殘基78-121)具有神經營養特性。
本發明之發明者發現PEDF之某些短肽可減輕骨關節炎中之疼痛。進一步發現疼痛減輕起因於此等PDSP誘導軟骨再生之能力。本發明者展示PDSP可誘導軟骨中或周圍存在之多能間葉幹細胞(MSC)分化成軟骨細胞。亦即,此等PDSP可促進軟骨生成。此可解釋PDSP誘導軟骨再生及疼痛減輕之能力。
如上文所提及,間葉細胞分化成軟骨細胞通常發生在胚胎發育中。在軟骨中,間葉幹細胞失去其多能性且增殖以形成軟骨生成細胞之密集型聚集體,該密集型聚集體隨後分化成軟骨原細胞,該軟骨原細胞合成軟骨細胞外基質(ECM)。軟骨原細胞變為成熟軟骨細胞,該成熟軟骨細胞通常不活動但仍可根據條件分泌且降解基質。因此,PDSP可誘導間葉細胞(軟骨中或周圍)以在軟骨中產生軟骨細胞的發現係真正出人意料的。
本發明之PDSP係基於對應於人類PEDF殘基93-121 (93
SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT121
;SEQ ID NO:1)之肽區域。基於此29-聚體,發明者鑑定絲胺酸-93、丙胺酸-96、麩醯胺酸-98、異白胺酸-103、異白胺酸-104及精胺酸-106對於活性而言係至關重要的,如由當此等殘基單獨地經丙胺酸(或丙胺酸-96之甘胺酸)替換時活性顯著降低證實。對比而言,29-聚體中之其他殘基之丙胺酸(或甘胺酸)替代並未明顯地改變活性,從而表明在此等其他殘基(亦即,殘基94、95、97、99-102、105及107-121)處具有胺基酸取代(特定言之,同源胺基酸取代)之PDSP變體亦可用於預防及/或治療骨關節炎,或用於誘導軟骨生成。
此等結果表明含有抗傷害感受效應之核心肽位於包含殘基93-106 (93
SLGAEQRTESIIHR106
;SEQ ID NO:2)之區域中。因此,具有抗傷害感受活性之最短PDSP肽可為14聚體。熟習此項技術者將瞭解在C及/或N端向此核心肽添加額外胺基酸不應影響此活性。亦即,本發明之PDSP可為包含人類PEDF之殘基93-106之任何肽。因此,用於本發明之PDSP肽可為14-聚體、15-聚體、16-聚體等,包括實驗中使用之29-聚體。
此外,如上文所提及,此等短肽內之取代可保留活性,只要保留關鍵殘基(絲胺酸-93、丙胺酸-96、麩醯胺酸-98、異白胺酸-103、異白胺酸-104及精胺酸-106)即可。另外,小鼠變體(其具有兩個取代:組胺酸-98及纈胺酸-103,與人類序列相比)亦為活性的。相應之小鼠序列為:mo-29聚體(SLGAEHRTESVIHRALYYDLITNPDIHST,SEQ ID NO:3)及mo-14聚體(SLGAEHRTESVIHR,SEQ ID NO:4)。因此,活性核心之通用序列為(93 S
-X-X-A
-X-Q
/H-X-X-X-I
/V
-I-X-R 106
,其中X表示任何胺基酸殘基;SEQ ID NO:5)。
本發明之PDSP肽可使用蛋白質/肽表現系統以化學方式合成或表現。此等PDSP肽可用於預防及/或治療骨關節炎之醫藥組合物中。醫藥組合物可包含任何醫藥學上可接受之賦形劑,且醫藥組合物可配製為適用於投與之形式,諸如局部施用、口服施用、注射等。用於此類應用之各種調配物為此項技術中已知的且可用於本發明之實施例。
本發明之一些實施例係關於用於治療及/或預防受試個體(例如,人、寵物或其他個體)之骨關節炎之方法。如本文所使用,術語「治療(treat/treating)」包括病況之部分或完全好轉,其可包括或可不包括完全治癒。該方法包含向個體投與醫藥組合物,其中醫藥組合物包含有效量之本發明之PDSP(包括PDSP之活性變體)。熟習此項技術者將瞭解有效量將取決於個體之狀態(例如,體重、年齡等)、投藥途徑及其他因素。發現此類有效量僅涉及常規技術且熟習此項技術者將不需要創造性之努力或過度實驗以發現有效量。
本發明之實施例將藉由以下特定實例以說明。在特定實例中,使用29聚體(SEQ ID NO:1)。然而,其他PDSP (例如,14聚體,SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3等)亦可用於實現相同結果。熟習此項技術者將瞭解,此等實例僅用於說明且變化及修改在不背離本發明之範疇之情況下係可能的。
材料及方法
達爾伯克(Dulbecco)改良之伊格爾(Eagle)培養基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶及抗生素購自Invitrogen (Carlsbad,CA,USA)。玻尿酸(HA)、單碘乙酸鹽(MIA)、二甲亞碸(DMSO)、珀可(Percoll)、胰島素、氫化可體松、牛血清白蛋白(BSA)、5-溴-2'-脫氧尿苷(BrdU)、赫斯特(Hoechst) 33258染料及艾爾遜藍8-GX均來自Sigma-Aldrich (St. Louis,MO,USA)。抗BrdU及抗SOX9抗體來自GeneTex (Taipei,Taiwan)。所有螢光染料結合之二次抗體購自BioLegend (San Diego,CA,USA)。蘇木精及曙紅(H&E)染料購自Merck (Rayway,NJ,USA)。合成性PEDF肽經合成,且為了維持穩定性,藉由在NH2
端乙醯化及/或在COOH端醯胺化加以修飾。合成性PEDF肽在GenScript (Piscataway,NJ)用質譜(>95%純度)表徵。各PEDF衍生之合成肽在DMSO中重構成儲備液(5 mM)。
本研究中使用之所有動物圈養於在溫度控制(24℃至25℃)及12:12明暗循環下之動物房中。標準實驗室食物及自來水可任意獲得。實驗程序經麥凱恩紀念醫院審查委員會(Mackay Memorial Hospital Review Board)(New Taipei City,Taiwan,R.O.C)批准,且按照台灣動物福利法規進行。
動物骨關節炎模型及治療
10週齡之成年雄性史泊格多利(Sprague-Dawley)大鼠(初始體重=312 ± 11 g)藉由腹膜內注射甲苯噻嗪(10 mg/kg)進行麻醉。之後,其右膝各自藉由單獨關節內注射含1 mg MIA之25 µl無菌生理鹽水來治療。在腿在膝骨處彎曲90°的情況下,使用27G針頭經由髕骨韌帶注射溶液。在MIA注射之後七天,小鼠經隨機分配至不同實驗組(各組n≧3)。為治療MIA誘導OA之大鼠模型,將PDSP肽溶解於25 µl之1% HA中,且肽溶劑DMSO用作媒劑/HA對照。
評估後爪重量分佈之變化
右(骨關節炎)及左(對側對照)肢之間的後爪重量分佈之變化用作骨關節炎膝中關節不適之指標。採用失能測試儀以測定後爪重量分佈,如先前所描述(Bove等人,Weight bearing as a measure of disease progression and efficacy of anti-inflammatory compounds in a model of monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis. Osteoarth Cart.,2003;11:821-830)。大鼠經置放於成角度置放之塑膠玻璃腔室中,使得各後爪靜置在單獨的力板上。藉由各後肢施加之力(以公克進行量測)在5秒時間段內為平均。各資料點為三個5秒讀數之平均值。後爪重量分佈之變化藉由測定施加在測試者左肢與右肢之間的重量(g)差來計算。結果呈現為左(對側對照組)肢與右(骨關節炎)肢之間的承重差或為基線讀數與治療後讀數之間的百分比差,如使用以下等式計算:
(1-(治療組之平均Δ重量/媒劑組之平均Δ重量)) × (100)
間葉幹細胞(MSC)之分離及培養
8週齡之成年雄性史泊格多利(Sprague-Dawley)大鼠藉由腹膜內注射甲苯噻嗪(10 mg/kg)進行麻醉。之後,以無菌方式採集其股骨,在PBS及抗生素之混合物中洗滌5分鐘,且隨後將該等股骨自所有軟組織上剝離,在其骺處橫切,且用肝素(AGGLUTEX INJ 5000 U/ML 5 ML;工作濃度100U/ml)及DMEM之混合物反覆地沖洗其骨髓空腔。收集所採集之細胞,藉由吸液分散且於室溫下以1000 ×g離心5分鐘。用DMEM使細胞集結粒再懸浮,且隨後將細胞懸浮液轉移至含有5 ml珀可(Percoll) (1.073 g/ml)之15 ml離心管。以1500 ×g離心30分鐘之後,獲得中間層中之單核細胞,用PBS洗滌三次,且隨後用10%熱滅活FBS及1%青黴素/鏈黴素懸浮於低葡萄糖DMEM中。隨後將細胞置放於75-cm2
燒瓶(Corning,MA,USA)中且在37℃下在95%空氣及5% CO2
下培育。每4天更換培養基。丟棄未附著細胞且保留黏附細胞。初級MSC在培養1週之後生長至大約80%至90%匯合。
MSC之軟骨生成分化
將5×103
個經擴展MSC置放於96孔盤之各孔中,且暴露於補充有10 ng/ml TGF-β3 (R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)及10 µM PDSP肽之150 µl軟骨生成培養基(較高葡萄糖DMEM,含有100 nM***、0.17 mM抗壞血酸-2磷酸鹽、10 µg/ml胰島素、5 µg/ml運鐵蛋白、5 ng/ml硒、1 mM丙酮酸鈉、2 mM L-麩醯胺酸及2% FBS)中。培養基每3天更換,且將細胞培養2週。
膝關節之組織學研究
剝離膝關節且切除周圍軟組織。標本經固定在4%多聚甲醛(PFA)溶液中,且隨後用Shandon TBD-2脫鈣劑(Thermo Scientific,Logan,UT)脫鈣。隨後將關節以正中矢狀地方式切開且嵌設於石蠟塊中。切片(5 µm厚)為縱向切割且用蘇木精及曙紅(H&E)染色或用於免疫組織化學研究。每膝20個切片經仔細製作以便包括大部分嚴重退化區域。
DNA合成之活體內偵測
為偵測細胞增殖,將BrdU在DMSO中重構成儲備液(80 mM)。在MIA注射7天(亦即,將MIA注射後之第7天設定為第0天)後的第1天、第4天、第8天,與350 μl PBS混合之150 μl BrdU經腹膜內注射至大鼠。DNA合成係藉由BrdU標記來評估,如用抗BrdU抗體偵測。
免疫螢光法及BrdU染色
為偵測活體內之DNA合成,石蠟嵌入式關節標本在二甲苯中脫蠟且在分級之乙醇系列中再水合,且隨後於室溫下暴露於1 N HCl中1小時,以用於後續之免疫組織化學。隨後用10%山羊血清及5% BSA封閉組織切片1小時。免疫染色使用抗SOX9 (1:100稀釋)及BrdU (1:100稀釋)之初級抗體在37℃下進行2小時,隨後於室溫下與適合之若丹明(rhodamine)或FITC共軛驢IgG一起培育1小時。藉由用赫斯特(Hoechst) 33258對比染色7分鐘來定位細胞核。使用具有CCD攝影機之Zeiss落射螢光顯微鏡來捕獲影像且自各樣本中之20個任意選擇之區域進行量測,且藉由在各切片內之手動計數重複三次執行盲定量。
脫蠟之膝關節標本亦用10%山羊血清封閉60分鐘,且隨後與抗BrdU之抗體一起培育。隨後,將切片與適合之過氧化酶標記之山羊免疫球蛋白(1:500稀釋;Chemicon,Temecula,CA)一起培育20分鐘,且隨後在用蘇木精對比染色之前與色素原基質(3,3'-二胺基聯苯胺)一起培育2分鐘。
艾爾遜藍(Alcian)染色及定量
對於艾爾遜藍染色,將培養基用PBS沖洗兩次,在4% (w/v)多聚甲醛中固定15分鐘,且隨後如先前所描述在含1% (w/v)艾爾遜藍8-GX (Sigma)之0.1 N HCl (pH 1.0)中培育隔夜(Ji Y.H.等人,Quantitative proteomics analysis of chondrogenic differentiation of C3H10T1/2 mesenchymal stem cells by iTRAQ labeling coupled with on-line two-dimensional LC/MS/MS,Mol. Cell. Proteom.,2010
,9(3):550-564.)。對於半定量分析,在室溫下用6 M鹽酸胍萃取經艾爾遜藍染色培養物2小時。所萃取染料之吸收在微量盤式讀數器(Bio-Rad)中在650 nm處量測。為量測DNA含量,將100 μL萃取物與100 μL 0.7 μg/ml赫斯特33258 (Sigma-Aldrich)在水中混合。在Ex/Em:340 nm/465 nm下讀取螢光,且與經認證之小牛胸腺超聲處理DNA標準(Sigma-Aldrich)之螢光相比較。
統計資料
結果表示為平均值±平均值之標準誤差(SEM)。使用單因子變異數分析以進行統計比較。除非另外規定,否則P < 0.05視為顯著的。
PDSP展現抗傷害感受效應以改善OA動物之關節不適
膝骨關節炎(OA)為常見之慢性退化性疾病,其特徵為關節軟骨之缺失。據報導將糖酵解之抑制劑MIA注射至嚙齒動物的股骨脛骨關節間隙以誘導類似於人類OA中所指出之AC缺失(Bove等人,2003)。另外,已確定將MIA注射至大鼠膝關節引起關節不適之劑量及時間依賴增加,其由MIA注射肢之後爪承重轉移界定。
為研究PDSP (PEDF短肽)是否具有抗傷害感受效應以改善關節不適,對10週齡雄性史泊格多利(Sprague-Dawley)大鼠(n=15)進行關節內注射1 mg MIA (溶解於25 µl無菌生理鹽水中)至右關節中以誘導最大程度之重量轉移(自右腿至左腿)且隨後用於研究29-聚體PDSP (SEQ ID NO:1)之藥理學反應。在MIA注射7天(設定為第0天)之後,將小鼠隨機分配至4個實驗組(各組n=3)且按以下進一步治療14天:(I) PDSP媒劑溶解於混合有PDSP媒劑之25 µl 1%玻尿酸(HA)中,(II) PDSP 29-聚體/HA (最終濃度0.2 mM PDSP與1% HA),(III)僅PDSP 29-聚體(快速注射)。在第1天、第4天、第8天及第12天(每週兩次)藉助於單關節內注射一次來施加治療。為測試在治療頻率降低之情況下的治療效果,在第1天及第8天對第IV組(29-聚體/HA)進行關節內注射一次(亦即,每週一次)。
如圖1中所示,結果顯示與媒劑/HA組相比較,29-聚體PDSP治療顯著減小MIA誘導之重量轉移(第II組及第IV組與第I組相比:63.3 ± 12.5%及58.1 ± 4.6%對比75.9 ± 4.7%;P < 0.05)。在另一方面,快速注射組不能降低MIA誘導之後爪承重分佈變化(77.2 ± 1.2%)。此等結果表明與玻尿酸組合之29-聚體PDSP對大鼠中之MIA誘導的關節不適展現出抗傷害感受效應。29-聚體PDSP快速注射結果亦暗示在缺不存在玻尿酸之情況下,29-聚體PDSP可迅速漏泄至全身循環。
已確定注射MIA之大鼠膝關節可在MIA治療後第7天以迅速及可複製之方式引起廣泛的軟骨細胞變性/壞死。因此,吾等進一步研究自媒劑/HA治療組及29-聚體/HA治療組之大鼠股骨脛骨關節的組織病理學特徵。
如圖2中所描繪,媒劑/HA治療組展示外側脛骨中之軟骨整合性的缺失及軟骨下骨骼塌陷,而29-聚體/HA治療組顯示良好之表面連續性。在顯微鏡下,媒劑/HA治療組展示軟骨細胞自軟骨之表面區域消失,且分散之細胞叢廣泛地出現在移動區域及輻射狀區域中。對比而言,29-聚體/HA治療組展示大量新生成之軟骨細胞佔據整個軟骨。組織學資料表明29-聚體PDSP誘導軟骨再生之能力可部分地負責減輕OA疼痛。
29-聚體促進MSC之軟骨生成活性及活體內軟骨生成細胞增殖
多能間葉幹細胞(MSC)之軟骨生成潛能使其為用於軟骨缺損之基於細胞的療法的有前景來源(M.F. Pittenger等人,1999,Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells,Science,284(5411):143-7)。此外,可誘導常駐MSC對軟骨損傷之反應以進行軟骨癒合之軟骨生成分化(T. B. Kurth等人,2011,Functional mesenchymal stem cell niches in adult mouse knee joint synovium in vivo,Arthritis Rheum.,63(5):1289-300)。在培養基中,吾等之資料展示色素上皮衍生因子(PEDF)衍生的短肽(29-聚體;位置Ser93-Thr121)在存在含有100 nM***及10 ng/ml TGF-β3之界定培養基下,展現出對MSC之活體外
軟骨生成促進活性。
具有單個丙胺酸或甘胺酸變異之29-聚體PDSP之丙胺酸掃描資料
在此研究中,設計且合成沿29-聚體序列對丙胺酸或甘胺酸之單個殘基取代以仔細分析29-聚體中之用於軟骨生成促進活性之關鍵殘基。基於位於93-121之PEDF之胺基酸序列總共合成29個肽變體,其包括具有單個丙胺酸變異之27個變體及具有單個甘胺酸變異(A96G及A107G)之2個變體。為評估大鼠MSC在經***(dexamethason)、TGF-β3及29-聚體變體處理之培養基中之軟骨生成,藉由艾爾遜藍染色偵測葡糖胺聚醣(GAG)(成熟軟骨細胞之標記)之表現水準。
如圖3中所示,在界定培養基(含有***及TGF-β3)中之MSC暴露於10 µM 29-聚體變體21天,接著使用艾爾遜藍染色來分析硫酸化GAG。結果展示與DMSO溶劑對照組相比,在用29-聚體PDSP處理之MSC培養基中染色強度明顯提高,如由在OD 650 nm下量化艾爾遜藍陽性材料證實(0.34 ± 0.013對比0.15 ± 0.024)。結果亦顯示S93A (0.12 ± 0.015)、A96G (0.14 ± 0.023)、Q98A (0.14 ± 0.017)、I103A (0.15 ± 0.013)、I104A (0.15 ± 0.027%)及R106A (0.16 ± 0.029)突變嚴重減弱29-聚體PDSP在MSC上之軟骨生成促進活性(0.12-0.16對比0.34)。此等結果表明29個胺基酸中之6個對於29-聚體活性為關鍵的。
另外,L94A (0.22 ± 0.032)、E97A (0.25 ± 0.023)、R99A (0.2 ± 0.02)、A107G (0.23 ± 0.035)及P116A (0.23 ± 0.029)突變引起29-聚體PDSP (外徑0.2~0.25對比0.34)之軟骨生成促進活性之部分降低。其餘取代並不顯著影響29-聚體PDSP(外徑> 0.26)之軟骨生成促進活性。
總體而言,丙胺酸掃描資料表明29-聚體(SEQ ID NO:1)對MSC之軟骨生成促進效應受到胺基酸取代之影響且核心肽為14聚體(SEQ ID NO:2)。此外,就誘導MSC軟骨生成分化而言,處於位置93、96、98、103、104及106之29-聚體PDSP可不經取代而不影響其功能。在另一方面,29-聚體PDSP序列中之其餘胺基酸殘基在不影響29-聚體PDSP功能之情況下,相對於單個胺基酸取代顯示更大之可撓性。因此,最小核心肽可表示為93 S-
X-
X-A-
X-Q
/H-X-X-X-X-I/V
-I
-X-R 106
,其中X表示任何胺基酸殘基(SEQ ID NO:5)。可與本發明之實施例一起使用之PDSP序列的幾個實例展示於下表中(位置編號係基於14聚體中之位置)。此等實例並不意謂限制。
29-聚體變體在實驗性OA之大鼠模型中之效應
29-聚體PDSP變體對MIA誘導後爪承重轉移之抗傷害感受效應
在動物研究中,29-聚體PDSP變體經調配至1% HA中達至0.2 mM之最終濃度,且隨後在MIA注射後第1天及第8天各自藉助於單個關節內注射來施用。在29-聚體變體治療14天後,用失能測試儀評估29-聚體變體(各組n=3)對MIA誘導之後爪承重轉移之抗傷害感受效應。
如圖4中所示,與媒劑/HA治療組相比,29-聚體/HA治療顯著減小MIA誘導之承重轉移(22.0 ± 0.66%對比47.1 ± 3.7%;P < 0.0004)。H105A變體亦能夠減小MIA誘導之重量轉移(21.4 ± 1.4%)。重要地,用S93A、A96G、Q98A、I103A、I104A及R106A變體治療對降低MIA誘導之後爪承重轉移無效應(值在45%至51%之間)。動物研究結果表明彼等關鍵殘基在維持29-聚體PDSP之抗傷害感受效應中起關鍵作用且在非關鍵性位點處之取代不影響PDSP之活性。
29-聚體變體對Sox9陽性軟骨細胞增殖之效應
吾等在MIA注射7天(設定為第0天)後之第1天開始BrdU治療以在用0.2 mM 29-聚體/HA治療時很快地監測細胞增殖。如圖5A (上部圖)中所示,在29-聚體/HA治療組中幾乎所有再生軟骨樣組織含有BrdU陽性細胞。然而,媒劑/HA治療膝之軟骨表面上之幾乎不存在BrdU陽性細胞,進而表明在MIA治療之後幾乎所有軟骨細胞經指定為壞死細胞死亡。
轉錄因子Sox9藉由導引軟骨細胞特異性基因之表現在幹/祖細胞軟骨生成中起重要作用。Sox9之免疫染色發現BrdU陽性細胞亦為Sox9陽性,進而表明BrdU陽性細胞藉由29-聚體潛在地朝向軟骨細胞發育誘導(圖5A;下部圖)。與媒劑/HA治療相比,0.2 mM 29-聚體治療顯示誘導BrdU陽性軟骨細胞在再生軟骨中擴增的顯著能力(圖5B;346 ± 57對比7 ± 3;P < 0.001)。總體而言,此等結果表明29-聚體可誘導軟骨生成細胞增殖以癒合軟骨。
接下來,在29-聚體治療14天之後,吾等檢測29-聚體變體對關節軟骨誘導細胞增殖之能力。膝關節之BrdU免疫染色顯示在29-聚體/HA及H105A/HA治療組之軟骨區域中可偵測到大量BrdU陽性細胞,而來自媒劑/HA治療之彼等含有較少BrdU陽性細胞(圖 6
;346 ± 57及297 ± 22對比7 ± 3)。在另一方面,用S93A、A96G、Q98A、I103A、I104A及R106A治療並未增加軟骨處之BrdU陽性細胞(值在30至62之間)。此動物研究證實,彼等關鍵殘基對維持29-聚體PDSP生物活性起關鍵作用。
綜合而言,丙胺酸掃描資料表明29-聚體之治療效應受到所選擇之胺基酸取代影響,如由骨關節炎之大鼠模型證實。此外,處於位置S93、A96、Q98、I103、I104及R106之29-聚體殘基在OA治療中對於29-聚體PDSP活性而言係重要的,而其他殘基可經取代而不顯著影響活性。
本發明之實施例已經以有限數目之實例來說明。熟習此項技術者將瞭解在不背離本發明之範疇下可進行變化或修改。因此,本發明之範疇應僅由隨附申請專利範圍限制。
圖1展示29-聚體及玻尿酸對MIA誘導之大鼠後爪承重分佈變化模型之效應。大鼠右(骨關節炎)膝經注射1 mg單碘乙酸鹽(MIA)且左(對側對照組)膝經注射生理鹽水。29-聚體及1% HA治療在MIA注射後第8天進行,進一步持續2週。後爪重量分佈(承重)之變化藉由使用失能測試儀來評估。給出之值表示各治療組之至少3隻大鼠之平均值± SE。與未經治療組相比,*P
<0.05。
圖2展示29-聚體PDSP (PEDF衍生之短肽)對MIA損傷關節軟骨影響之組織學分析結果。大鼠膝關節注射一次MIA。媒劑/HA及29-聚體/HA治療在MIA注射後第8天進行,進一步持續2週。來自三個獨立實驗之肢接軟骨之H&E染色切片之代表性顯微照片。F:股骨踝骨;T:脛骨踝骨,M:半月板。*指示股骨脛骨關節及右圖中之外側脛骨軟骨的放大視圖。箭頭指示壞死軟骨細胞。
圖3展示大鼠MSC之軟骨生成分化持續3週後,富含葡糖胺聚醣的細胞外基質藉由艾爾遜(Alcian)藍染色之半定量分析結果。MSC在補充有不同29-聚體變體(10 µM)之軟骨生成分化培養基中培育14天。藉由氯化鈲萃取之艾爾遜藍之OD值經展示與微團之總DNA含量相關。資料表示為平均值± SE。分別表示OD值≦ 0.16及0.25之黑色及灰色柱指示完全及部分地損害29-聚體之促進軟骨生成活性的突變。
圖4展示29-聚體變體對MIA誘導之大鼠後爪承重分佈變化模型之效應。大鼠右(骨關節炎)膝經注射1 mg MIA且左(對側對照組)膝經注射生理鹽水。29-聚體/HA、29-聚體變體/HA及媒劑/HA治療在MIA注射後第8天進行,進一步持續2週。後爪承重變化藉由使用失能測試儀來評估。給出之值表示各治療組之至少3隻大鼠之平均值± SE。
圖5展示PDSP誘導之軟骨生成細胞在損傷關節軟骨中以劑量依賴型方式增殖之結果。(A)上部圖:在29-聚體治療後第14天的細胞複製之組織學分析。標本經BrdU染色以指示DNA複製(深棕色)。初始放大率,200×。下部圖:代表性圖像展示Sox9之表現(綠色
;軟骨細胞之標記)且藉由雙重免疫染色分析來檢定關節軟骨中之BrdU(大紅
)。初始放大率,1000×。(B)評估每一軟骨區域範圍之BrdU陽性細胞之數量。與媒劑/HA組相比,*P < 0.001。
圖6展示29-聚體變體對MIA誘導OA之大鼠模型中之損傷關節軟骨之細胞***效應。大鼠右(骨關節炎)膝經注射1 mg MIA且左(對側對照組)膝經注射生理鹽水。29-聚體/HA、29-聚體變體/HA及媒劑/HA治療在MIA注射後第8天進行,進一步持續2週。膝關節經BrdU染色以識別增殖性細胞。計數膝關節切片之軟骨區域上之各視野的BrdU陽性細胞(初始放大率×100)。自6個切片/膝關節標本評估總BrdU+
細胞,各組中具有3隻大鼠。
Claims (10)
- 一種用於治療及/或預防骨關節炎之醫藥組合物,其包含:PEDF衍生之短肽(PDSP)或該PDSP之變體,其中該PDSP包含人類色素上皮衍生因子(PEDF)之殘基93-106,且其中該PDSP之變體含有該PDSP之絲胺酸-93、丙胺酸-96、麩醯胺酸-98、異白胺酸-103、異白胺酸-104及精胺酸106且在其他位置處含有一或多個胺基酸取代,其中殘基位置編號係基於人類PEDF中之彼等。
- 如請求項1之醫藥組合物,其中該PDSP包含S-X-X-A-X-Q/H-X-X-X-X-I/V-I-X-R (SEQ ID NO:5)之序列。
- 如請求項1之醫藥組合物,其中該PDSP包含SLGAEQRTESIIHR (SEQ ID NO:2)之序列。
- 如請求項1之醫藥組合物,其中該PDSP包含SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT (SEQ ID NO:1)之序列。
- 如請求項1之醫藥組合物,其中該PDSP包含SEQ ID NO:6至75中之任一者序列之序列。
- 一種用於促進軟骨生成之醫藥組合物,其包含:PEDF衍生之短肽(PDSP)或該PDSP之變體,其中該PDSP包含人類色素上皮衍生因子(PEDF)之殘基93-106,且其中該PDSP之變體含有該PDSP之絲胺酸-93、丙胺酸-96、麩醯胺酸-98、異白胺酸-103、異白胺酸-104及精胺酸106且在其他位置處含有一或多個胺基酸取代,其中殘基位置編號係基於人類PEDF中之彼等。
- 如請求項6之醫藥組合物,其中該PDSP包含S-X-X-A-X-Q/H-X-X-X-X-I/V-I-X-R (SEQ ID NO:5)之序列。
- 如請求項6之醫藥組合物,其中該PDSP包含SLGAEQRTESIIHR (SEQ ID NO:2)之序列。
- 如請求項6之醫藥組合物,其中該PDSP包含SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT (SEQ ID NO:1)之序列。
- 如請求項6之醫藥組合物,其中該PDSP包含SEQ ID NO:6至75中之任一者序列之序列。
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