TW202003853A - 基因修飾細胞及其製備方法 - Google Patents
基因修飾細胞及其製備方法 Download PDFInfo
- Publication number
- TW202003853A TW202003853A TW108108890A TW108108890A TW202003853A TW 202003853 A TW202003853 A TW 202003853A TW 108108890 A TW108108890 A TW 108108890A TW 108108890 A TW108108890 A TW 108108890A TW 202003853 A TW202003853 A TW 202003853A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- car
- cells
- cell
- gmr
- human
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 14
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims abstract description 236
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 57
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 36
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 369
- 108010092372 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptors Proteins 0.000 claims description 31
- 102000016355 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptors Human genes 0.000 claims description 31
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 30
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 29
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 27
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 20
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 20
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 14
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 14
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 claims description 13
- 102000046157 human CSF2 Human genes 0.000 claims description 13
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 claims description 13
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 claims description 10
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 claims description 6
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 5
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 claims description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Chemical group NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004472 Lysine Chemical group 0.000 claims description 5
- 208000037538 Myelomonocytic Juvenile Leukemia Diseases 0.000 claims description 5
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 claims description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 5
- 201000005992 juvenile myelomonocytic leukemia Diseases 0.000 claims description 5
- 101100166600 Homo sapiens CD28 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 206010052360 Colorectal adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 3
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 claims 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 claims 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 abstract description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 abstract description 3
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 abstract 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 49
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 44
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 42
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 40
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 39
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 28
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 26
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 26
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 26
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 24
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 23
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 22
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 21
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 20
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 20
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 20
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 17
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 17
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 17
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 16
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 15
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 15
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 14
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 14
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 14
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 13
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 11
- 210000000224 granular leucocyte Anatomy 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 10
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 10
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 9
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 9
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 9
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 9
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 8
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 8
- 102200017268 rs121918392 Human genes 0.000 description 8
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 7
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 7
- 102220551795 Tumor suppressor candidate gene 1 protein_E21A_mutation Human genes 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 7
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 7
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 6
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 102200124760 rs587777729 Human genes 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 5
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 5
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 5
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 5
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 5
- 102100036301 C-C chemokine receptor type 7 Human genes 0.000 description 4
- -1 CD8α Proteins 0.000 description 4
- 101000716065 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 7 Proteins 0.000 description 4
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 description 4
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 4
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 4
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 4
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 4
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 4
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 4
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000011022 operating instruction Methods 0.000 description 4
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 4
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 4
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 4
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 3
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 3
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 3
- 238000010824 Kaplan-Meier survival analysis Methods 0.000 description 3
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 3
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 3
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 3
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 108091029842 small nuclear ribonucleic acid Proteins 0.000 description 3
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 3
- KWTSXDURSIMDCE-QMMMGPOBSA-N (S)-amphetamine Chemical group C[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 KWTSXDURSIMDCE-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 101150009389 BZLF1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108091008048 CMVpp65 Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108010031111 EBV-encoded nuclear antigen 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 2
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 2
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 2
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 2
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 2
- 210000000173 T-lymphoid precursor cell Anatomy 0.000 description 2
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 229940025084 amphetamine Drugs 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 2
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 2
- AOGZLQUEBLOQCI-UHFFFAOYSA-N ginsenoside-Re Natural products CC1OC(OCC2OC(OC3CC4(C)C(CC(O)C5C(CCC45C)C(C)(CCC=C(C)C)OC6OC(CO)C(O)C(O)C6O)C7(C)CCC(O)C(C)(C)C37)C(O)C(O)C2O)C(O)C(O)C1O AOGZLQUEBLOQCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102100023990 60S ribosomal protein L17 Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- PVVHEXFYPTXMIY-NKUQFGIGSA-N C=Cc1ccc(/C=C\C=C/C=C\C=C/C(C=C2)=C/C2=C\C(CC2)=CC2=C)cc1 Chemical compound C=Cc1ccc(/C=C\C=C/C=C\C=C/C(C=C2)=C/C2=C\C(CC2)=CC2=C)cc1 PVVHEXFYPTXMIY-NKUQFGIGSA-N 0.000 description 1
- 0 CC1C2C(**)=C*C2CC1 Chemical compound CC1C2C(**)=C*C2CC1 0.000 description 1
- LDFKYJWUORFCBH-UHFFFAOYSA-N CCCCCCCC(CC1CC(CC2)C2CC1)C(CC1)CCC1C1CCCC1 Chemical compound CCCCCCCC(CC1CC(CC2)C2CC1)C(CC1)CCC1C1CCCC1 LDFKYJWUORFCBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108091007741 Chimeric antigen receptor T cells Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 101100044298 Drosophila melanogaster fand gene Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101150064015 FAS gene Proteins 0.000 description 1
- 208000004930 Fatty Liver Diseases 0.000 description 1
- 101150090209 HCST gene Proteins 0.000 description 1
- 206010019708 Hepatic steatosis Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 description 1
- 101000946860 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Proteins 0.000 description 1
- 101000934341 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD5 Proteins 0.000 description 1
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 description 1
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical group NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 101150028321 Lck gene Proteins 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- 240000007019 Oxalis corniculata Species 0.000 description 1
- 101100335198 Pneumocystis carinii fol1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000042773 Small Nucleolar RNA Human genes 0.000 description 1
- 108020003224 Small Nucleolar RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 description 1
- 102100035794 T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Human genes 0.000 description 1
- 102100025244 T-cell surface glycoprotein CD5 Human genes 0.000 description 1
- 101150009046 Tnfrsf1a gene Proteins 0.000 description 1
- 101710187830 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 description 1
- 102100033733 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Human genes 0.000 description 1
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 101150058049 car gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000032677 cell aging Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 108091007930 cytoplasmic receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 208000010706 fatty liver disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 1
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 102000053350 human FCGR3B Human genes 0.000 description 1
- 102000027596 immune receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008915 immune receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000005008 immunosuppressive cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 210000002570 interstitial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000001142 lung small cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N pacific blue Chemical compound FC1=C(O)C(F)=C2OC(=O)C(C(=O)O)=CC2=C1 VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 231100000240 steatosis hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 1
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/464416—Receptors for cytokines
- A61K39/464418—Receptors for colony stimulating factors [CSF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70521—CD28, CD152
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
- C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/524—CH2 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/526—CH3 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本發明係關於一種具有優異之靶細胞毒殺性之變異型嵌合抗原受體(CAR)表現細胞之製備。
本發明提供一種基因修飾細胞，其係導入有編碼具有與人類粒細胞-巨噬細胞菌落刺激因子(GM-CSF)受體特異性地結合之標靶結合區、跨膜區、及細胞內訊號傳遞區之嵌合抗原受體(CAR)蛋白質之聚核苷酸者，且上述標靶結合區為序列編號1所表示之胺基酸序列中之第21號麩胺酸被置換為其他胺基酸之變異體。
Description
本發明係關於一種於過繼免疫療法之領域中較有用之表現嵌合抗原受體之基因修飾細胞及其製備方法。
若更詳細地進行說明，則本發明係關於一種基因修飾細胞及該等之製備方法及醫藥用途等，該基因修飾細胞具有優異之靶細胞毒殺性，且導入有編碼人類粒細胞-巨噬細胞菌落刺激因子(GM-CSF)受體特異性變異型嵌合抗原受體之聚核苷酸。
業界報告稱使用有表現以腫瘤相關抗原作為標靶之嵌合抗原受體(CAR，chimeric antigen receptor)之T細胞(CAR-T)之過繼免疫療法之抗腫瘤效果較強，且近年來急速地進行開發。尤其是於B細胞上表現之CD19未於造血幹細胞中表現，而於B系列腫瘤細胞中表現，故而為過繼免疫療法之理想標靶。因此，業界不斷進行以對B細胞腫瘤之治療作為目標之CAR之開發，且於臨床試驗中亦表現出顯著效果，而受到較高之關注。
另一方面，業界正在開發對其他腫瘤細胞之CAR-T療法。例如，幼年型骨髓單核細胞性白血病(JMML)或急性骨髓性白血病(AML)係作為預後不良之白血病而為人所知，且期待開發CAR-T療法。迄今為止，業界將CD33、CD123等作為標靶而進行臨床試驗。又，報告有著眼於GM-CSF受體於幼年型骨髓單核細胞性白血病(JMML)或急性骨髓性白血病(AML)之腫瘤細胞表面進行高表現之GM-CSF受體特異性嵌合抗原受體(以下，稱為GMR.CAR)(非專利文獻1、2)。然而，針對AML之CAR-T療法尚未發現於臨床上有效者，且於使腫瘤細胞植活於生物體內之動物實驗中亦未確認到充分之效果(非專利文獻3、4)。作為未開發針對JMML或AML之CAR-T療法之原因，例如可列舉難以進行標靶抗原之選擇之方面。
已知於將骨髓系抗原作為CAR-T療法之標靶抗原情形時，不僅於腫瘤細胞中表現，亦於正常之骨髓系細胞或樹狀細胞等中表現，且有可能產生由脫靶效應(on-target/off-tumor)反應所引起之問題(非專利文獻3、4、5)。因此，要求探索針對上述疾病之新穎標靶抗原並且提供安全且於生物體內具有優異效果之CAR。
[先前技術文獻]
[非專利文獻]
非專利文獻1：Journal of Hematology & Oncology, 2016, 9: 27, DOI 10.1186/s13045-016-0256-3
非專利文獻2：The 22nd Annual Meeting JSGCT2016: Japan Society of Gene and Cell Therapy Program and Abstracts, 2016. 07. 13, P0-70
非專利文獻3：Journal of Hematology & Oncology, 2017, 10: 151, DOI 10.1186/s13045-017-0519-7
非專利文獻4：Blood, 2013, 122 (18), 3138-3148
非專利文獻5：Blood Cancer Journal, 2016, 6, e458; doi: 10.1038/bcj. 2016. 61
[發明所欲解決之問題]
如上所述，將骨髓系抗原等作為標靶之CAR-T技術尚在開發中，期待開發出安全性較高且發揮於生物體內之優異效果之CAR。
[解決問題之技術手段]
本發明者等人為了解決上述課題而進行努力研究。其結果為，發現對使用GM-CSF多肽之胺基酸殘基第21號麩胺酸被置換為其他胺基酸之變異型GM-CSF作為標靶結合區之GM-CSF受體特異性變異型嵌合抗原受體(以下，記載為「變異型GMR.CAR」)進行基因導入所得之T細胞(以下，記載為「變異型GMR.CAR-T細胞」)於AML等之治療中兼具優異之細胞毒殺活性與安全性。
即，本發明如下所述。
[1]一種基因修飾細胞，其係導入有編碼具有與人類粒細胞-巨噬細胞菌落刺激因子(GM-CSF)受體特異性地結合之標靶結合區、跨膜區、及細胞內訊號傳遞區之嵌合抗原受體(CAR，chimeric antigen receptor)蛋白質之聚核苷酸者，且上述標靶結合區係具有序列編號1所表示之胺基酸序列中之第21號麩胺酸被置換為其他胺基酸之序列之變異體多肽。
[2]如上述[1]中所記載之細胞，其於細胞膜上表現與GM-CSF受體結合之CAR蛋白質。
[3]如上述[1]或[2]中所記載之細胞，其中CAR蛋白質進而包含共刺激區及/或細胞外間隔區。
[4]如上述[1]至[3]中任一項所記載之細胞，其中細胞內訊號傳遞區為人類CD3ζ。
[5]如上述[3]或[4]中所記載之細胞，其中共刺激區為人類CD28或人類4-1BB。
[6]如上述[3]至[5]中任一項所記載之細胞，其中細胞外間隔區包含人類IgG1之鉸鏈、CH2、及/或CH3區或其一部分、及/或人工間隔序列。
[7]如上述[1]至[6]中任一項所記載之細胞，其中標靶結合區係具有序列編號1所表示之胺基酸序列中之第21號麩胺酸被置換為精胺酸或離胺酸之序列之變異體多肽。
[8]一種CAR蛋白質表現細胞之製備方法，其包含使用載體將編碼與人類GM-CSF受體特異性地結合之嵌合抗原受體(CAR)蛋白質之聚核苷酸導入至細胞之操作，且上述蛋白質包含序列編號1所表示之胺基酸序列中之第21號麩胺酸被置換為其他胺基酸之胺基酸序列。
[9]一種載體，其係包含編碼與人類GM-CSF受體特異性地結合之嵌合抗原受體(CAR)蛋白質之聚核苷酸者，且上述蛋白質包含序列編號1所表示之胺基酸序列中之第21號麩胺酸被置換為其他胺基酸之胺基酸序列。
[10]一種針對與GM-CSF受體表現細胞相關之疾病之治療劑，其包含如上述[1]至[7]中任一項所記載之細胞。
[11]一種醫藥組合物，其包含如上述[10]中所記載之治療劑及醫藥上所容許之載體。
[12]如上述[10]中所記載之治療劑或如上述[11]中所記載之組合物，其中與GM-CSF受體表現細胞相關之疾病係選自幼年型骨髓單核細胞性白血病(JMML)、急性骨髓性白血病(AML)、神經膠質瘤(glioma)、神經母細胞瘤、神經膠母細胞瘤、腦腫瘤、直腸結腸腺癌、***癌、腎癌、黑色素瘤及肺小細胞癌。
本說明書包含成為本案之優先權之基礎之日本專利申請編號2018-050266號之揭示內容。
[發明之效果]
本發明之GMR.CAR-T細胞於將以急性骨髓性白血病(AML)為代表之於細胞表面表現GM-CSF受體之各種細胞作為標靶之過繼免疫療法中，安全性優異，且顯示出較強之腫瘤細胞毒殺作用。
以下對本發明之實施形態詳細地進行說明。
於本說明書中，所謂「嵌合抗原受體(CAR)」係指可將標靶特異性移植至T細胞(例如初始T細胞、幹細胞記憶T細胞、中央記憶T細胞、效應細胞記憶T細胞、或該等之組合等T細胞)等細胞之修飾受體。又，CAR亦作為人工T細胞受體、嵌合T細胞受體、或嵌合免疫受體而為人所知。
於本說明書中，所謂「區」為多肽內之區域，表示獨立於其他區域而摺疊為特定結構之區域。
於在本說明書中使用之情形時，於「聚核苷酸」中包含天然或合成之DNA(Deoxyribonucleic Acid，去氧核糖核酸)及RNA(Ribonucleic Acid，核糖核酸)、例如基因組DNA、cDNA(互補DNA)、mRNA(信使RNA)、rRNA(核糖體RNA)、shRNA(小髮夾RNA)、snRNA(核內小分子RNA)、snoRNA(核仁小分子RNA)、miRNA(微小RNA)、及/或tRNA，但並不限定於該等。
於本說明書中，所謂「編碼」係指如該領域中通常所使用般，特定之核苷酸序列將特定之蛋白質或(多)肽之胺基酸序列資訊加密，於本說明書中，於「編碼」之上下文中使用正義鏈及反義鏈之兩者。
如上所述，本發明提供一種基因修飾細胞，其係導入有編碼具有與人類粒細胞-巨噬細胞菌落刺激因子(GM-CSF)受體特異性地結合之標靶結合區、跨膜區、及細胞內訊號傳遞區之嵌合抗原受體(CAR)蛋白質之聚核苷酸者，且上述標靶結合區係具有序列編號1所表示之胺基酸序列中之第21號麩胺酸被置換為其他胺基酸之序列之變異體多肽。
於本說明書中，所謂「具有～序列」包含含有所記載之序列以外之序列之情形，又，亦可包含僅含有所記載之序列之情形(即「由～序列構成」)。
本發明之CAR蛋白質包含與人類GM-CSF受體特異性地結合之「標靶結合區」。標靶(GM-CSF受體)結合區對GM-CSF受體顯示出特異性之結合性，能夠對在細胞表面上表現GM-CSF受體之靶細胞進行特異性免疫應答。
因此，作為GM-CSF受體結合區，可使用作為與具有序列編號1之胺基酸序列之GM-CSF受體結合之細胞激素之GM-CSF之胺基酸殘基第21號麩胺酸被置換為其他胺基酸之多肽。或者，只要保持對於GM-CSF受體之結合能力，則亦可使用於其他胺基酸殘基部分亦被置換之變異體。進而，只要保持對於GM-CSF受體之結合能力，則亦可使用該等多肽之片段、即結合性片段。
作為GM-CSF之胺基酸殘基第21號胺基酸被置換為其他胺基酸之多肽，只要為保持對GM-CSF受體之結合活性者，則並無特別限定，例如可使用置換為精胺酸(序列編號2之胺基酸序列)、置換為離胺酸(序列編號3之胺基酸序列)、置換為組胺酸(序列編號4之胺基酸序列)、置換為天冬胺酸(序列編號5之胺基酸序列)、置換為絲胺酸(序列編號6之胺基酸序列)、置換為丙胺酸(序列編號7之胺基酸序列)、置換為***酸(序列編號8之胺基酸序列)等。
作為較佳之態樣，可使用GM-CSF之胺基酸殘基第21號胺基酸被置換為作為鹼性胺基酸之精胺酸、離胺酸、或組胺酸之多肽。
作為更佳之態樣，可使用GM-CSF之胺基酸殘基第21號胺基酸被置換為精胺酸或離胺酸之多肽。
此處，所謂具有「對於人類GM-CSF受體之結合能力」意指對於人類GM-CSF受體之結合常數例如為1-1000 nM以下。該結合能力可為和抗原與抗體之結合能力相比相對較弱之結合。
再者，標靶結合區只要為保持對於人類GM-CSF受體之結合能力者，則可代替上述多肽而使用。例如可使用作為源自保持與GM-CSF受體之結合能力之抗體之單鏈多肽的單鏈抗體(scFv)，可使用連結有免疫球蛋白重鏈(H鏈)及輕鏈(L鏈)片段之Fv區之抗體多肽作為標靶結合區。
進而，亦可使用與靶細胞上表現之受體蛋白質特異性地結合之配體、例如親和抗體(affibody)、源自天然型受體之配體結合區、(例如腫瘤細胞上之)受體之溶解性蛋白質/肽配體、肽、及用以促進免疫應答之疫苗等。
本說明書之CAR蛋白質視情形可包含「細胞外間隔區」。細胞外間隔區較理想為促進CAR與抗原之結合，使向細胞內之訊號傳遞亢進之序列。例如可使用抗體之Fc片段、或其片段或者衍生物、抗體之鉸鏈區、或其片段或者衍生物、抗體之CH2區、抗體之CH3區、人工間隔序列、或該等之組合。
作為本發明之一態樣，作為細胞外間隔區，可使用(i)IgG4之鉸鏈、CH2、及CH3區、(ii)IgG4之鉸鏈區、(iii)IgG4之鉸鏈及CH2、(iv)CD8a之鉸鏈區、(v)IgG1之鉸鏈、CH2、及CH3區、(vi)IgG1之鉸鏈區、或者(vii)IgG1之鉸鏈及CH2、或該等之組合。例如，作為IgG1之鉸鏈區，可適宜地使用具有由序列編號9所表示之核苷酸序列編碼之以下之胺基酸序列(序列編號10)者，但並不限定於此。
又，作為IgG1之CH2區，可適宜地使用具有由序列編號11所表示之核苷酸序列編碼之胺基酸序列(序列編號12)者，作為CH3區，可適宜地使用具有由序列編號13所表示之核苷酸序列編碼之胺基酸序列(序列編號14)者。
作為較佳之態樣，細胞外間隔區可使用人類IgG1之鉸鏈、CH2、及CH3區或其一部分。
又，作為較佳之態樣，細胞外間隔區能夠以(i)單獨為人類IgG1之鉸鏈區(序列編號10)、(ii)人類IgG1之鉸鏈區(序列編號10)及CH2區(序列編號12)及CH3區(序列編號14)之組合、(iii)人類IgG1之鉸鏈區(序列編號10)及CH3區(序列編號14)之組合、(iv)單獨為CH3區(序列編號14)使用。
作為本發明之一態樣，作為細胞外間隔區所使用之人工間隔序列，可使用式(G4S)n所表示之間隔序列。式中，n為1～10，較佳為n＝3。例如可適宜地使用具有序列編號15者。具有此種間隔序列之間隔有時亦被稱為肽連結子。於本發明中可適宜地使用於該領域中適宜地使用之肽連結子。於該情形時，肽連結子之構成及鏈長可於不損及所獲得之CAR蛋白質之功能之範圍內選擇適當者。
作為進而較佳之態樣，細胞外間隔區可使用人類IgG1之鉸鏈區(序列編號10)及(G4S)3之間隔序列(序列編號15)之組合。
細胞外間隔區可自上述所例示者中適當加以選擇，或基於該領域中之技術常識而進一步進行修飾，而用於本發明。
細胞外間隔區能夠以可存在於標靶結合區與跨膜區之間之方式，連結編碼各區域之胺基酸序列之鹼基序列而***至載體，並於宿主細胞中表現。或者，細胞外間隔區亦可修飾編碼預先製備之質體CAR蛋白質之聚核苷酸作為模板。
細胞外間隔區之修飾例如於考慮導入有編碼CAR之聚核苷酸之CAR-T細胞於宿主細胞中之CAR基因表現率之提高、訊號傳遞、細胞之老化、腫瘤中之分佈、抗原識別或對活體內(in vivo)活性之影響之情形時較有用。
本發明之CAR蛋白質包含：細胞外區，其存在於細胞膜上，且包含標靶結合區及任意之細胞外間隔區；跨膜區；及細胞內區，其包含細胞內訊號傳遞區及任意之共刺激區。如於該領域中所周知般，相對於細胞外區及細胞內區均為親水性區，「跨膜區」係具有對於構成細胞膜之脂質雙層之親和性之區域。關於本發明之GMR.CAR中之跨膜區，CAR蛋白質可存在於細胞膜上，只要不損及標靶結合區與細胞內訊號傳遞區之功能，則並無特別限定，亦有可能存在源自與下述共刺激區相同之蛋白質之多肽發揮作為跨膜區之功能之情形。
作為本發明之一態樣，跨膜區例如可使用CD28、CD3ε、CD8α、CD3、CD4或4-1BB等跨膜區。
作為較佳之態樣，跨膜區可使用人類CD28(Uniprot No.: P10747 (153-179))。具體而言，可適宜地使用具有由序列編號16所表示之核苷酸序列(NCBI Accession No.: NM_006139.3 (679-759))編碼之胺基酸序列(序列編號17)者作為跨膜區。
本發明之CAR蛋白質視情形可包含「共刺激區」。共刺激區與共刺激配體特異性地結合，藉此傳導CAR-T細胞之增殖、細胞激素產生、功能分化、靶細胞之細胞死亡之類的由細胞引起之共刺激應答，但並不限定於該等。
作為本發明之一態樣，共刺激區例如可使用CD27、CD28、4-1BB(CD137)、CD134(OX40)、Dap10、CD27、CD2、CD5、CD30、CD40、PD-1、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、TNFR-1、TNFR-II、Fas、Lck。
作為較佳之態樣，共刺激區可使用人類CD28(Uniprot No.: P10747(180-220))或4-1BB(GenBank: U03397.1)等。具體而言，可適宜地使用具有由序列編號18所表示之核苷酸序列(NCBI Accession No.: NM_006139.3 (760-882))編碼之胺基酸序列(序列編號19)者作為共刺激區。
本發明之CAR蛋白質包含「細胞內訊號傳遞區」。細胞內訊號傳遞區傳遞免疫細胞之效應功能之發揮所需之訊號。
作為本發明之一態樣，作為細胞內訊號傳遞區，例如可使用人類CD3ζ鏈、FcγRIII、FcεRI、Fc受體之細胞質末端、具有免疫受體酪胺酸活化基元(ITAM)之細胞質受體或該等之組合。
作為較佳之態樣，細胞內訊號傳遞區可使用人類CD3ζ鏈(例如NCBI Accession No. NM＿000734.3之核苷酸299-637)。具體而言，可適宜地使用具有由序列編號20所表示之核苷酸序列編碼之胺基酸序列(序列編號21)者作為細胞內訊號傳遞區。
目標之聚核苷酸可依據常法而容易地製備。可根據表示各區域之胺基酸序列之NCBI(National Center of Biotechnology Information，美國國家生物技術信息中心)參考序列識別符(RefSeq ID)或基因庫(GenBank)之登記編號取得編碼胺基酸序列之鹼基序列，可使用標準分子生物學及/或化學程序製備本發明之聚核苷酸。例如可基於該等鹼基序列合成核酸，又，可組合自cDNA基因庫使用聚合酶連鎖反應(PCR)所獲得之DNA片段而製備本發明之聚核苷酸。
因此，本發明之編碼GMR.CAR之聚核苷酸可連結編碼上述各區域之聚核苷酸而製備，可藉由將該聚核苷酸導入至適當之細胞中而製備GMR.CAR-T細胞。又，GMR.CAR亦可藉由將編碼標靶結合區以外之構成成分相同之現有之CAR蛋白質之聚核苷酸作為模板，依據常法將標靶結合區進行重組而製備。
進而，視目的可將編碼現有之CAR蛋白質之聚核苷酸作為模板，使用反向PCR(iPCR)法等而修飾1個以上之區域、例如細胞外間隔區。關於細胞外間隔區之修飾技術，例如係記載於Oncoimmunology, 2016, Vol. 5, No. 12, e1253656等中。
作為本發明之一實施形態，
可使用如下基因修飾細胞，其導入有編碼嵌合抗原受體(CAR)蛋白質之聚核苷酸，該嵌合抗原受體(CAR)蛋白質具有：包含序列編號2或序列編號3之胺基酸序列，且與人類粒細胞-巨噬細胞菌落刺激因子(GM-CSF)受體特異性地結合之標靶結合區；包含序列編號17之胺基酸序列之跨膜區；及包含序列編號21之胺基酸序列之細胞內訊號傳遞區。
作為本發明之一實施形態，
可使用如下基因修飾細胞，其導入有編碼嵌合抗原受體(CAR)蛋白質之聚核苷酸，該嵌合抗原受體(CAR)蛋白質具有：包含序列編號2或序列編號3之胺基酸序列，且與人類粒細胞-巨噬細胞菌落刺激因子(GM-CSF)受體特異性地結合之標靶結合區；包含序列編號10、序列編號12、序列編號14及/或序列編號15之胺基酸序列之細胞外間隔區；包含序列編號17之胺基酸序列之跨膜區；及包含序列編號21之胺基酸序列之細胞內訊號傳遞區。
再者，上述所謂「包含序列編號10、序列編號12、序列編號14及/或序列編號15之胺基酸序列」係指包含序列編號10、序列編號12、序列編號14及序列編號15之胺基酸序列中之任意1個或2個以上之組合中之任一種。以下，於本說明書中同樣。
作為待導入上述聚核苷酸之細胞，可使用包含源自哺乳動物、例如人類之細胞或源自猴、小鼠、大鼠、豬、牛、狗等非人類哺乳動物之T細胞或T細胞之細胞群。例如可使用利用血液(末梢血、臍帶血等)、骨髓等體液、組織或器官所採集、單離、純化、誘導之細胞。可使用末梢血單核細胞(PBMC)、免疫細胞[樹狀細胞、B細胞、造血幹細胞、巨噬細胞、單核細胞、NK(Natural Killer，自然殺手)細胞或血細胞(嗜中性球、嗜鹼性球)]、臍帶血單核細胞、纖維母細胞、前驅脂肪細胞、幹細胞、皮膚角化細胞、間質細胞、脂肪肝細胞、各種癌細胞株或神經幹細胞。
作為本發明之較佳之實施態樣之一，例如可使用釋出細胞毒殺性蛋白質(穿孔素(perforin)、顆粒酶(granzyme)等)之細胞。具體而言，例如可使用T細胞、T細胞之前驅細胞(造血幹細胞、淋巴細胞前驅細胞等)、NK細胞、NK-T細胞或含有該等之細胞群。進而，作為可分化成該等細胞之細胞，包含ES細胞(embryonic stem cells，胚胎幹細胞)、iPS細胞(induced pluripotent stem cells，誘導性多功能幹細胞)等各種幹細胞。於T細胞中包含CD8陽性T細胞、CD4陽性T細胞、抑制性T細胞、細胞毒殺性T細胞、或腫瘤浸潤淋巴細胞。於含有T細胞及T細胞之前驅細胞之細胞群中包含PBMC。上述細胞為自生物體採集者、將其擴大培養所得者或建立為細胞株者均可。於將表現所製造之CAR之細胞或自該細胞分化之細胞移植至生物體之情形時，較理想為向該生物體本身或自同種之生物體採集之細胞中導入核酸。
作為用以實現本發明之基因修飾細胞而導入聚核苷酸並用於過繼免疫療法中之T細胞，可使用期待持續之抗腫瘤效果之T細胞、例如幹細胞記憶T細胞。幹細胞記憶T細胞之分析可依據常法，例如依據(Yang Xu, et al. blood. 2014; 123: 3750-3759)等記載而容易地確認。
作為本發明之實施態樣之一，由CAR表現質體所轉導之T細胞為CD45R0-、CD62L+、CD45RA+及CCR7+之細胞可作為待導入上述聚核苷酸之細胞使用。
作為本發明之更佳之實施態樣之一，為CD8+、CD45RA+、CCR7+、CD62L+之細胞可作為至少50%以上之細胞待導入上述聚核苷酸之細胞使用。
用以製備基因修飾細胞之聚核苷酸之導入方法只要係通常使用者則可為任一種，並無特別限定。於使用載體進行導入之情形時，作為可使用之載體，並無特別限定，例如可列舉：慢病毒載體、反轉錄病毒載體、泡沫病毒載體、腺相關病毒載體等。又，作為非病毒性之態樣，可使用質體轉位子，可適宜地使用sleeping beauty轉位子系統(例如記載於Huang X, Guo H, et al. Mol Ther. 2008; 16: 580-9；Singh H, Manuri PR, et al. Cancer Res. 2008; 68: 2961-71；Deniger DC, Yu J, et al. PLoS One. 2015; 10: e0128151；Singh H, Moyes JS, et al. Cancer Gene Ther. 2015; 22: 95-100；Hou X, Du Y, et al. Cancer Biol Ther. 2015; 16: 8-16；Singh H, Huls H, et al. Immunol Rev. 2014; 257: 181-90；及Maiti SN, Huls H, et al. J Immunother. 2013; 36: 112-23中)或piggybac轉位子系統(記載於Nakazawa Y, Huye LE, et al. J Immunother. 2009; 32: 826-36；Galvan DL, Nakazawa Y, et al. J Immunother. 2009; 32: 837-44；Nakazawa Y, Huye LE, et al. Mol Ther. 2011; 19: 2133-43；Huye LE, Nakazawa Y, et al. Mol Ther. 2011; 19: 2239-48；Saha S, Nakazawa Y, et al. J Vis Exp. 2012; (69): e4235；Nakazawa Y, Saha S, et al. J Immunother. 2013; 36: 3-10；及Saito S, Nakazawa Y, et al. Cytotherapy. 2014; 16: 1257-69中)。
作為本發明之較佳之態樣之一，可使用非病毒性之態樣、尤其是piggybac轉位子系統。具體例係示於實施例。
本發明之細胞藉由對在表面表現GM-CSF受體之靶細胞引起受體特異性免疫應答，而於細胞內傳遞訊號並活化。表現CAR之細胞之活化根據宿主細胞之種類或CAR之細胞內區域而有所不同，例如可根據將細胞激素之釋出、細胞增殖率之提高、細胞表面分子之變化等作為指標而加以確認。細胞毒殺性蛋白質之釋出(穿孔素、顆粒酶等)帶來表現受體之細胞之破壞。
本發明進而提供一種包含編碼與人類GM-CSF受體特異性地結合之嵌合抗原受體(CAR)蛋白質之聚核苷酸之載體。本發明之載體可適宜地用於製備上述本發明之基因修飾細胞。
本發明之表現GMR.CAR之細胞較理想為安全性優異之細胞。由於為安全性優異之細胞，故而並無特別限定，例如，較理想為可對靶細胞進行特異性免疫應答，另一方面，例如不會對正常之造血幹細胞帶來影響。於與骨髓相關抗原相關之疾病中，作為嚴重之副作用，例如已知有骨髓抑制。
因此，作為本發明之表現GMR.CAR之細胞，較理想為於表現GMR.CAR之細胞殺傷靶細胞之投予量下，完全不驅逐骨髓細胞之細胞。
作為本發明之一態樣，作為本發明之表現GMR.CAR之細胞，可適宜地使用不會對正常細胞帶來影響之表現GMR.CAR之細胞。作為安全性之指標，並無特別限定，例如可將於以IC50值比較對於帶來影響之末梢細胞及/或骨髓細胞之殺傷能力、與對腫瘤細胞之殺傷能力之情形時該比足夠大作為指標而加以確認。
本發明之表現GMR.CAR之細胞可用作疾病之治療劑。因此，本發明提供一種包含上述本發明之細胞之針對與GM-CSF受體表現細胞相關之疾病之治療劑。該治療劑包含表現CAR蛋白質之細胞作為活性成分，進而亦可包含適當之賦形劑。作為期待利用本發明之治療劑所治療之疾病，只要為對該細胞顯示出敏感性之疾病即可，並無特別限定，例如可列舉與表現、尤其是高表現GM-CSF受體之細胞相關之疾病、例如血癌(白血病)，具體而言，例如可列舉幼年型骨髓單核細胞性白血病(JMML)、急性骨髓性白血病(AML)。進而可列舉實體癌，具體而言，例如可列舉：神經膠質瘤、神經母細胞瘤、神經膠母細胞瘤、腦腫瘤、直腸結腸腺癌、***癌、腎癌、黑色素瘤及肺小細胞癌等。
於對實體癌應用上述治療劑之情形時，包含於GM-CSF受體形成靶細胞之微小環境之細胞、例如源自骨髓之免疫抑制細胞(MDSCs)等中表現之疾病。關於該疾病，即便於在靶細胞中未表現GM-CSF受體之情形時，例如為了提高腫瘤細胞毒殺活性，亦可與其他治療劑並用而使用。
此處，所謂「表現、尤其是高表現GM-CSF受體」有可能存在意指表現強度較高(例如平均螢光強度(MFI)較高)之情形與意指表現率(陽性率)較高之情形。於意指表現率較高之細胞之情形時，例如係指CD33/CD116表現率(陽性率)至少為40%以上之細胞。就於腫瘤細胞中均質地表現之觀點而言，較佳為該表現率為80%以上之細胞。更佳為係指該表現率為90%以上之細胞。
本發明之治療劑之一態樣為針對表現GM-CSF受體之腫瘤細胞之抗癌劑。本發明之治療劑或抗癌劑可單獨使用，亦可與不同機制之藥劑及/或治療組合而使用。
因此，本發明之治療劑可單獨設為醫藥組合物之形態，或與其他有效成分組合而設為醫藥組合物之形態。本發明之治療劑或醫藥組合物可局部投予或全身投予，並未限定投予形態，例如於治療白血病之情形時，較佳為設為靜脈內投予。於醫藥組合物中，除本發明之治療劑及其他有效成分以外，根據投予形態，可包含於該領域中通常所使用之載體、賦形劑、緩衝劑、穩定劑等。本發明之治療劑之投予量係根據患者之體重、年齡、疾病之嚴重程度等而有所變動者，並無特別限定，例如可於0.0001～1 mg/kg體重之範圍內1天1次～數次、每2天、每3天、每1週、每2週、每月、每2個月、每3個月進行投予。
本發明之治療劑之一態樣係關於一種於細胞移植前對患者進行調節之方法，其包括對患者投予有效量之作為本發明之基因修飾細胞之包含CAR蛋白質之細胞。於某一態樣中，細胞移植為幹細胞移植。幹細胞移植係適宜地使用造血幹細胞移植(骨髓移植、臍帶血移植、末梢血幹細胞移植)。
本發明之治療劑之一態樣包括：減少患者體內之GM-CSF受體表現細胞之數量作為細胞移植前之患者之調節。患者體內之GM-CSF受體表現細胞為GM-CSF受體表現正常細胞或GM-CSF受體表現癌細胞。對上述患者之調節亦可為於細胞移植前減少GM-CSF受體表現正常及癌細胞之兩者。
[實施例]
以下列舉實施例更具體地說明本發明，但本發明並不僅限定於以下之實施例。
[實施例1 GMR.CAR表現質體(CAR 001)之製備]
將於人類GM-CSF(NCBI Accession No.: NM_000758之轉譯區(序列編號22、33～464個鹼基：終止密碼子前)之5'側附有EcoRI部位、於3'側附有編碼IgG1之鉸鏈之鹼基序列及BclI部位之PCR產物次選殖至pTA2選殖載體(TOYOBO)。對次選殖人類GM-CSF與IgG1之鉸鏈序列所得之pTA2選殖載體進行EcoRI與BclI雙酶消化，並切割出人類GM-CSF與IgG1之鉸鏈序列。另一方面，於pSL1190載體(Amersham公司)上，連接藉由將SFG-CD19.CAR(Savoldo et al. J Clin Invest 2011; 121 (5): 1822-1826)以NcoI與SphI進行雙酶消化所獲得之抗CD19 scFv(FMC63; Zola H. et al. Immunol Cell Biol. 1991; 69 (Pt6): 411-412)-CD28-CD3ζ之片段，藉此製備pSL1190-CD19.CAR載體。
於將pSL1190-CD19.CAR載體以EcoRI與BamHI進行雙酶消化後，使用相容位點(compatible site)連接上述所切割之人類GM-CSF與IgG1之鉸鏈序列，藉此製備pSL1190-GMR.CAR載體。進而，藉由以EcoRI與NotI將pIRII-CD19.CAR載體(Huye et al. Mol Ther 2011; 19 (12): 2239-2248)進行雙酶消化，去除CD19.CAR片段，取而代之，連接藉由以EcoRI與NotI將pSL1190-GMR.CAR載體雙酶消化所獲得之片段，藉此獲取GMR.CAR表現質體(CAR 001)。圖1中表示所製備之CAR 001之載體圖。
[實施例2 變異型GMR.CAR表現質體之製備(E21R、E21H、E21S、E21A)]
將CAR 001作為模板，藉由反向PCR法製備變異型GMR.CAR之表現質體。
反向PCR中所使用之5'側PCR引子係設計為將GM-CSF多肽(序列編號1)之第21號麩胺酸(E)分別置換為精胺酸(R)、組胺酸(H)、絲胺酸(S)或丙胺酸(A)而進行合成(序列編號23～26，委託EUROFINSGENOMICS股份有限公司)。3'側引子係合成對所有變異型共通之設計者(序列編號27)(委託EUROFINSGENOMICS股份有限公司)。
E21R製備用前置引子：AGAGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTA(序列編號23)
E21H製備用前置引子：CACGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTA(序列編號24)
E21S製備用前置引子：AGCGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTA(序列編號25)
E21A製備用前置引子：GCCGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTAGA(序列編號26)
反置引子：CTGGATGGCATTCACATCGAGGGTC(序列編號27)
將CAR 001調整為50 ng/μL而用作模板，各PCR引子係以反應液中濃度成為0.2或0.3 μM之方式進行調整。反向PCR係使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit(東洋紡織股份有限公司)，反應組成係依據套組所隨附之操作說明。反應條件係於(i)94℃ 2分鐘、(ii)98℃ 10秒、(iii)68℃ 7分鐘下進行10個循環之(ii)及(iii)。
利用1～1.2%瓊脂糖凝膠電泳，分離PCR反應後之樣品之一部分，並確認目標尺寸之直鏈狀之質體之生成。依據套組所隨附之操作說明，對剩餘之PCR反應後之樣品進行Dpn I處理，藉此進行將經甲基化之模板質體CAR 001切割並排除之反應。其後，利用套組所隨附之T4聚核苷酸激酶(Polynucleotide Kinase)使直鏈狀質體自連接(Self-Ligation)，而製成環狀質體。其後，利用環狀質體將大腸桿菌DH5α(東洋紡織股份有限公司)轉形，並於含50 μg/mL安比西林之LB瓊脂培養基上培養約16小時。
將所出現之菌落進而於含50 μg/mL安比西林之LB液體培養基中培養約16小時。自所培養之大腸桿菌培養液，使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)將各質體純化，並進行鹼基序列確認，將確認到目標之鹼基序列之置換之質體分別設為CAR 002(E21R GMR.CAR)、CAR 004(E21H GMR.CAR)、CAR 006(E21S GMR.CAR)或CAR 008(E21A GMR.CAR)。
[實施例3 變異型GMR.CAR表現質體之製備(E21K, E21D, E21F)]
以與實施例2同樣之方式製備GM-CSF多肽(序列編號1)之第21號麩胺酸(E)被置換為離胺酸(K)、天冬胺酸(D)或***酸(F)之質體。具體而言，人工合成附加有於5'側經限制酶XhoI切割之序列、與於3'側經限制酶DraIII切割之序列的XhoI-分泌訊號序列-GM-CSF變異體-鉸鏈序列-DraIII之片段(委託EUROFINSGENOMICS股份有限公司)。使該片段與利用XhoI與DraIII對CAR 001進行處理所得之片段結合，並分別設為CAR 003(E21K GMR.CAR)、CAR 005(E21D GMR.CAR)或CAR 007(E21F GMR.CAR)。
[實施例4 變異型間隔修飾GMR.CAR表現質體之製備]
變異型間隔修飾GMR.CAR表現質體係藉由在製備間隔修飾GMR.CAR表現質體後，將該等作為模板並組入變異而製備。
將CAR 001作為模板，藉由反向PCR法製備對細胞外間隔區部分進行了修飾之GMR.CAR表現質體。具體而言，製備於圖2～3中分別示出載體圖之CH2CH3部分缺失體(圖2)及CH2CH3部分缺失與(G4S)3之***體(圖3)。
反向PCR中所使用之PCR引子係如下所示，分別設計CH2CH3部分缺失體用引子(序列編號28及29)及CH2CH3部分缺失與(G4S)3之***體用引子(序列編號30及31)，並進合成(委託EUROFINSGENOMICS股份有限公司)。
＜CH2CH3部分缺失體用引子＞
前置引子：5'-TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTC-3'(序列編號28)
反置引子：5'-TGGGCATGTGTGAGTTTTGTCAGGAGAT-3'(序列編號29)
＜CH2CH3部分缺失與(G4S)3之***體用引子＞
前置引子：
5'-GGTGGTGGTGGATCCGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGG-3'(序列編號30)
反置引子：5'-TGGGCATGTGTGAGTTTTGTCAGGAGATTTGGGC-3'(序列編號31)
將CAR 001調整為50 ng/μL而用作模板，各PCR引子係以反應液中濃度成為0.2或0.3 μM之方式進行調整。反向PCR係使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit(東洋紡織股份有限公司)，反應組成係依據套組所隨附之操作說明。反應條件係於(i)94℃ 2分鐘、(ii)98℃ 10秒、(iii)68℃ 7分鐘下，進行10個循環之(ii)及(iii)。
利用1～1.2%瓊脂糖凝膠電泳，分離PCR反應後之樣品之一部分，並確認目標尺寸之直鏈狀之質體之生成。繼而，藉由依據套組所隨附之操作說明，對剩餘之PCR反應後之樣品進行Dpn I處理，藉此進行將經甲基化之模板質體CAR 001切割並排除之反應。其後，利用套組所隨附之T4聚核苷酸激酶使直鏈狀質體自連接，而製成環狀質體。利用所獲得之各環狀質體將大腸桿菌DH5α(東洋紡織股份有限公司)轉形，並於含50 μg/mL安比西林之LB瓊脂培養基上培養約16小時。
將所出現之菌落進而於含50 μg/mL安比西林之LB液體培養基中培養約16小時。自所培養之大腸桿菌培養液，使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)將各質體純化，並進行鹼基序列確認，而獲取確認到目標之鹼基序列之修飾之變異型間隔修飾GMR.CAR表現質體：CAR 009(GMR.CAR dCH2CH3)及CAR 010(GMR.CAR dCH2CH3+(G4S)3)。
將所製備之CAR 009及CAR 010作為模板，藉由反向PCR法製備變異型間隔修飾GMR.CAR表現質體。分別將所製備之質體之載體圖示於圖4～7。製備將GM-CSF多肽(序列編號1)之第21號之E置換為R之CH2CH3部分缺失體(圖4)、將第21號之E置換為K之CH2CH3部分缺失體(圖5)、將第21號之E置換為R之CH2CH3部分缺失與(G4S)3之***體(圖6)及將21號之E置換為K之CH2CH3部分缺失與(G4S)3之***體(圖7)。
於本實施例中，反向PCR中所使用之PCR引子係如下所示，分別設計將E置換為R之引子(序列編號32及33)及將E置換為K之引子(序列編號34及33)，並進行合成(委託EUROFINSGENOMICS股份有限公司)。
＜將E置換為R之引子＞
前置引子：5'-AGAGCCCGGCGTCTCCTGAACCTG-3'(序列編號32)
反置引子：5'-CTGGATGGCATTCACATGCTCCCAGGG-3'(序列編號33)
＜將E置換為K之引子＞
前置引子：5'-AAGGCCCGGCGTCTCCTGAACCTG-3'(序列編號34)
反置引子：5'-CTGGATGGCATTCACATGCTCCCAGGG-3'(序列編號33)
將CAR 009及CAR 010調整為50 ng/μL而用作模板，各PCR引子係以反應液中濃度成為0.2或0.3 μM之方式進行調整。反向PCR係使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit(東洋紡織股份有限公司)，反應組成係依據套組所隨附之操作說明。反應條件係於(i)94℃ 2分鐘、(ii)98℃ 10秒、(iii)68℃ 7分鐘下，進行10個循環之(ii)及(iii)。
利用1～1.2%瓊脂糖凝膠電泳，分離PCR反應後之樣品之一部分，並確認目標尺寸之直鏈狀之質體之生成。繼而，藉由依據套組所隨附之操作說明，對剩餘之PCR反應後之樣品進行Dpn I處理，藉此進行將經甲基化之模板質體切割並排除之反應。其後，利用套組所隨附之T4聚核苷酸激酶使直鏈狀質體自連接，而製成環狀質體。利用所獲得之各環狀質體將大腸桿菌DH5α(東洋紡織股份有限公司)轉形，並於含50 μg/mL安比西林之LB瓊脂培養基上培養約16小時。
將所出現之菌落進而於含50 μg/mL安比西林之LB液體培養基中培養約16小時。自所培養之大腸桿菌培養液，使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)將各質體純化，並進行鹼基序列確認，而獲取確認到目標之鹼基序列之修飾之變異型間隔修飾GMR.CAR表現質體：CAR 011(E21R GMR.CAR dCH2CH3)、CAR 012(E21KGMR.CAR E dCH2CH3)、CAR 013(E21RGMR.CAR dCH2CH3+(G4S)3)及CAR 014(E21KGMR.CAR dCH2CH3+(G4S)3)。
[實施例5 GMR.CAR-T細胞之培養、擴增]
＜PBMC之分離與非特異性刺激OKT3 blast之製備(第0天)＞
自健康成人供體採集末梢血，利用D-PBS(Phosphate Buffer Solution，磷酸鹽緩衝液)(和光純藥工業股份有限公司)稀釋為2倍後，於Ficoll-Paque PLUS中使稀釋末梢血成為多層，並進行400×g、30分鐘之離心分離，而分取PBMC。利用D-PBS將所分取之PBMC洗淨2次，並藉由離心分離進行單離。使單離之PBMC以成為2～4×106
個/well/2 mL之方式懸浮於含5 ng/mL IL(interleukin，介白素)-15之TexMACS培養基中。準備利用含有抗人類CD3抗體及抗人類CD28抗體之D-PBS對24孔未處理培養板於37℃、2小時下進行抗體塗覆所得之培養板，以2 mL/well接種細胞懸浮液並進行T細胞之特異性刺激，而開始製備OKT3 blast。
於第3天製備OKT3 blast之再刺激用抗體固相培養板。具體而言，以500 μL/well將利用D-PBS製備為1 μg/mL之抗人類CD3抗體及抗人類CD28抗體添加至24孔未處理培養板平底，並於4℃下徹夜培養，藉此將抗體固相於培養板上。
另一方面，自第0天起受到刺激之OKT3 blast藉由轉移至未對抗體進行固相之24孔細胞培養用平底多孔培養板，而暫時不進行刺激。
於第4天，自前一天經固相之培養板去除上清液，並添加OKT3 blast，藉此開始OKT3 blast之利用抗人類CD3抗體及抗人類CD28抗體之再刺激。再刺激係實施至第7天，但於該期間，適當地進行培養基更換及IL-15之添加。
＜PBMC之病毒肽脈衝(第0天)＞
對所單離之PBMC利用peptivator肽庫(註冊商標、Miltenyi Biotec)進行病毒肽刺激。具體而言，於向D-PBS 50 μL中分別添加有0.05 μg/μL之AdV5 Hexon、CMV pp65、EBV BZLF1及EBV EBNA-1之肽庫中使PBMC懸浮，並於37℃下實施30分鐘病毒肽刺激。30分鐘後，向PBMC中添加適量之D-PBS並使之懸浮，其後進行4分鐘之UV(Ultra Violet，紫外線)照射。UV照射結束後將PBMC回收，於對細胞數進行計數後，以成為0.5～6×106
個/well/2 mL之方式懸浮於含10 ng/mL IL-7及5 ng/mL IL-15之TexMACS培養基中，並轉移至24孔處理培養板作為飼養細胞。
＜GMR.CAR表現載體之電導入(第0天)＞
為了向PBMC導入變異型GMR.CAR表現質體CAR 002(E21R GMR.CAR)、CAR 003(E21K GMR.CAR)、CAR 004(E21H GMR.CAR)、CAR 005(E21D GMR.CAR)、CAR 006(E21S GMR.CAR)、CAR 007(E21F GMR.CAR)或CAR 008(E21A GMR.CAR)，分別將CAR 5 μg、pCMV-piggyBac質體5 μg、附屬於P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTM
×Kit(LonzaJapan股份有限公司)之P3初生細胞溶液(Primary Cell solution)100 μL進行混合，並添加至10×106
個之PBMC中。
繼而，將全部量之細胞移至Nucleocuvette中，並利用4D-Nucleofection(Program No: FI-115)進行電基因導入。將經電基因導入之細胞於室溫下放置10分鐘，將全部量添加至裝有飼養細胞之24孔處理培養板中而開始培養。同樣地培養1～15×106
個細胞作為未實施基因導入操作之Mock-T細胞。適當地進行廢棄培養中之培養基之一半，並添加一半含2倍量即20 ng/mL IL-7及10 ng/mL IL-15之TexMACS培養基之培養基更換作業。Mock-T細胞係於24孔處理培養板上繼續培養，並根據細胞之增殖程度進行培養基更換與擴增。
＜CAR-T細胞之擴增(第7天)＞
將全部量之細胞懸浮液移至填充有於含10 ng/mL IL-7及5 ng/mL IL-15之TexMACS培養基30 mL中對上述製備之OKT3 blast進行肽脈衝與UV照射所得之飼養細胞2×106
個的G-Re×10中，進行GMR.CAR-T細胞之擴增直至第14天。藉由以下之方法測定在第14天為止所擴增之GMR.CAR-T細胞之表現率。
＜GMR.CAR表現率之評價(第14天)＞
對細胞數進行計數，並對1～2×105
個細胞藉由流式細胞儀分析，評價GMR.CAR-T之表現率。採集1～2×105
個細胞，添加PE大鼠抗人類GM-CSF抗體(BD Pharmingen)2.5 μL及APC抗人類CD3抗體(Miltenyi Biotec)5 μL並使該等懸浮，於4℃下、遮光下進行抗體標記反應20分鐘。20分鐘後，利用適量之D-PBS洗淨細胞，藉由離心分離使細胞沈澱並去除上清液，其後再懸浮於適量之D-PBS中，對所得之樣品使用FACSCalibur(Becton Dickinson股份有限公司)進行分析，以IgG1/CD3陽性或GM-CSF/CD3陽性作為指標而測定GMR.CAR之表現率。
使用GMR.CAR表現質體(CAR 001)，藉由對PBMC之電導入操作及T細胞之培養、擴增操作而獲得GMR.CAR-T細胞，將所獲得之GMR.CAR-T細胞設為CAR-T 001，同樣地，將藉由使用CAR 002(E21R GMR.CAR)、CAR 003(E21K GMR.CAR)、CAR 004(E21H GMR.CAR)、CAR 005(E21D GMR.CAR)、CAR 006(E21S GMR.CAR)、CAR 007(E21F GMR.CAR)或CAR 008(E21A GMR.CAR)質體之操作而獲得之GMR.CAR-T細胞分別設為CAR-T 002(E21R)、CAR-T 003(E21K)、CAR-T 004(E21H)、CAR-T 005(E21D)、CAR-T 006(E21S)、CAR-T 007(E21F)、及CAR-T 008(E21A)。
將CAR-T 001～008於第14天之表現分析結果示於圖8。於各細胞群中之GMR.CAR表現率分別為CAR-T 001：20.89%、CAR-T 002(E21R)：16.68%、CAR-T 003(E21K)：15.94%、CAR-T 004(E21H)：17.89%、CAR-T 005(E21D)：19.83%、CAR-T 006(E21S)：21.00%、CAR-T 007(E21F)：20.47%、CAR-T 008(E21A)：20.01%，與Mock-T細胞中之表現率(5.66%)相比均較高，成功製備變異型GMR.CAR表現T細胞。
[實施例6 GMR.CAR-T之抗腫瘤細胞活性]
為了評價於實施例5中所獲得之CAR-T 001～008之腫瘤細胞毒殺活性，進行與腫瘤細胞之共培養試驗。具體而言，使用THP-1細胞(ATCC(American Type Culture Collection，美國菌種保存中心))，以成為5×105
個/mL之方式利用含10%FBS(Fetal Bovine Serum，胎牛血清)之RPMI 1640培養基(Thermo Fisher Scientific)製備腫瘤細胞[靶細胞(T)]，並以500 μL/well接種至48孔處理培養板。於實施例5中所獲取之CAR-T 001～CAR-T 008[效應細胞(E)]係以E：T比成為1：5～1：100之方式利用含10%FBS之RPMI 1640培養基加以稀釋。
即，於E：T比＝1：5之情形時，GMR.CAR-T細胞係以成為1×105
個/mL之方式製備，並以500 μL/well添加至接種有腫瘤細胞之48孔處理培養板。同樣地，於E：T比＝1：50、1：100之情形時，GMR.CAR-T細胞分別係以成為0.1×105
個/mL或0.05×105
個/mL之方式製備，並以500 μL/well添加至接種有腫瘤細胞之48孔處理培養板。共培養試驗係進行5天。對Mock-T細胞亦進行同樣之共培養試驗，亦設定以相同細胞數僅培養腫瘤細胞所得之群(CAR-T未添加群)作為對照群。
於共培養試驗第5天回收各孔之細胞，向經離心分離之細胞中添加APC抗人類CD3抗體(Miltenyi Biotec)5 μL及PE抗人類CD33抗體(Miltenyi Biotec)5 μL並使該等懸浮，於4℃下、遮光下進行抗體標記反應20分鐘。20分鐘後，利用適量之D-PBS洗淨細胞，藉由離心分離使細胞沈澱並完全去除上清液，其後，利用450 μL之D-PBS進行再懸浮，進而添加50 μL之CountBright absolute counting beads(Invitrogen)，對所獲得之樣品使用FACSCanto II(Becton Dickinson股份有限公司)及FLOWJO(Becton Dickinson股份有限公司)進行分析，基於計數珠算出CD33之陽性細胞數。利用以下之計算式算出CAR-T 001～CAR-T 008及Mock-T細胞之抗腫瘤細胞活性%。
＜抗腫瘤細胞活性%之算出＞
計算式：
・抗腫瘤細胞活性%＝100－(CAR-T添加群之CD33陽性細胞數)/(CAR-T未添加群之CD33陽性細胞數)x100
圖9中表示CAR-T 001～CAR-T 008對於THP-1細胞之抗腫瘤細胞活性%之結果。與CAR-T 001相比，CAR-T 002～CAR-T 008均被確認到同等以上之對於THP-1細胞之抗腫瘤細胞活性。
[實施例7 變異型間隔修飾GMR.CAR-T細胞之培養、擴增]
＜PBMC之分離與非特異性刺激OKT3 blast之製備(第0天)＞
自健康成人供體採集末梢血，利用D-PBS(和光純藥工業股份有限公司)稀釋為2倍後，於Ficoll-Paque PLUS中使稀釋末梢血成為多層，並進行400×g、30分鐘之離心分離，而分取PBMC。利用D-PBS將所分取之PBMC洗淨2次，並藉由離心分離進行單離。使單離之PBMC以成為2～4×106
個/well/2 mL之方式懸浮於含5 ng/mL IL-15之TexMACS培養基中。準備利用含有抗人類CD3抗體及抗人類CD28抗體之D-PBS對24孔未處理培養板於37℃、2小時下進行抗體塗覆所得之培養板，以2 mL/well接種細胞懸浮液並進行T細胞之特異性刺激，而開始製備OKT3 blast。
於第3天製備OKT3 blast之再刺激用抗體固相培養板。具體而言，以500 μL/well將利用D-PBS製備為1 μg/mL之抗人類CD3抗體及抗人類CD28抗體添加至24孔未處理培養板平底，並於4℃下徹夜進行培養，藉此將抗體固相於培養板上。
另一方面，自第0天起受到刺激之OKT3 blast藉由轉移至未對抗體進行固相之24孔細胞培養用平底多孔培養板，而暫時不進行刺激。
於第4天，自前一天經固相之培養板去除上清液，並添加OKT3 blast，藉此開始OKT3 blast之利用抗人類CD3抗體及抗人類CD28抗體之再刺激。再刺激係實施至第7天，但於該期間，適當地進行培養基更換及IL-15之添加。
＜PBMC之病毒肽脈衝(第0天)＞
對所單離之PBMC利用peptivator肽庫(註冊商標、Miltenyi Biotec)進行病毒肽刺激。具體而言，於向D-PBS 50 μL中分別添加有0.05 μg/μL之AdV5 Hexon、CMV pp65、EBV BZLF1及EBV EBNA-1之肽庫中使PBMC懸浮，並於37℃下實施30分鐘病毒肽刺激。30分鐘後，向PBMC中添加適量之D-PBS並使之懸浮，其後進行4分鐘之UV照射。UV照射結束後將PBMC回收，於對細胞數進行計數後，以成為0.5～6×106
個/well/2 mL之方式懸浮於含10 ng/mL IL-7及5 ng/mL IL-15之TexMACS培養基中，並轉移至24孔處理培養板作為飼養細胞。
＜基因導入操作(第0天)＞
為了向PBMC導入GMR.CAR表現質體，將CAR 001及CAR 009～CAR 014中之任一種5 μg、pCMV-piggyBac質體5 μg、附屬於P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTM
×Kit(LonzaJapan股份有限公司)之P3初生細胞溶液(Primary Cell solution)100 μL進行混合，並添加至10～15×106
個之PBMC中。
繼而，將全部量之細胞移至Nucleocuvette中，並利用4D-Nucleofection(Program No: FI-115)進行電基因導入。將經電基因導入之細胞於室溫下放置10分鐘，將全部量添加至裝有飼養細胞之24孔處理培養板中而開始培養。同樣地培養1～15×106
個細胞作為未實施基因導入操作之Mock-T細胞。適當地進行廢棄培養中之培養基之一半，並添加一半含2倍量即20 ng/mL IL-7及10 ng/mL IL-15之TexMACS培養基之培養基更換作業。Mock-T細胞係於24孔處理培養板上繼續培養，並根據細胞之增殖程度進行培養基更換與擴增。
＜CAR-T細胞之擴增(第7天)＞
將全部量之細胞懸浮液移至填充有於含10 ng/mL IL-7及5 ng/mL IL-15之TexMACS培養基30 mL中對上述製備之OKT3 blast進行肽脈衝與UV照射所得之飼養細胞2～10×106
個的G-Re×10中，進行GMR.CAR-T細胞之擴增直至第14天。藉由以下之方法測定在第14天為止所擴增之GMR.CAR-T細胞之表現率。
＜GMR.CAR表現率之評價(第14天)＞
對細胞數進行計數，並對1～2×105
個細胞藉由流式細胞儀分析，評價GMR.CAR-T之表現率。採集1～2×105
個細胞，向經離心分離之細胞中添加PE大鼠抗人類GM-CSF抗體(Miltenyi Biotec)5 μL及APC小鼠抗人類CD3抗體(Miltenyi Biotec)5 μL並使該等懸浮，於4℃下、遮光下進行抗體標記反應20分鐘。20分鐘後，利用適量之D-PBS洗淨細胞，藉由離心分離使細胞沈澱並去除上清液，其後再懸浮於適量之D-PBS中，對所得之樣品使用FACSCantoII(Becton Dickinson股份有限公司)及FLOWJO(Becton Dickinson股份有限公司)進行分析，以GM-CSF/CD3陽性作為指標而測定GMR.CAR之表現率。
於本實施例中，使用表現質體(CAR 001及CAR 009～CAR 014)，藉由對PBMC之電導入操作及T細胞之培養、擴增操作而獲得GMR.CAR-T細胞，將所獲得之GMR.CAR-T細胞分別設為CAR-T 001-A、CAR-T 009、CAR-T 010、CAR-T 011、CAR-T 012、CAR-T 013及CAR-T 014。
將CAR-T 001-A及CAR-T 009～CAR-T 014於第14天之表現分析結果示於圖10。GMR.CAR表現率分別為CAR-T 001-A：28.0%、CAR-T 009：31.7%、CAR-T 010：31.0%、CAR-T 011：30.1%、CAR-T 012：31.7%、CAR-T 013：35.4%、CAR-T 014：30.7%，與Mock-T細胞中之表現率0.54%相比均較高，成功製備間隔部位不同之GMR.CAR表現T細胞。藉由利用Mock-T細胞稀釋所製備之GMR.CAR表現T細胞，而將表現率統一為28.0%，並於以下之實施例中評價抗腫瘤細胞活性及安全性。
[實施例8 變異型間隔修飾GMR.CAR-T之抗腫瘤細胞活性]
為了評價實施例7中所獲得之CAR-T 001-A及CAR-T 009～CAR-T 014之腫瘤細胞毒殺活性，而進行與腫瘤細胞之共培養試驗。具體而言，使用THP-1細胞(American Type Culture Collection(ATCC))，以成為4×105
個/mL之方式利用含10%FBS之RPMI 1640培養基(Thermo Fisher Scientific)製備THP-1細胞[靶細胞(T)]，並以500 μL/well接種至48孔處理培養板(孔內之細胞數成為2.0×105
個)。
CAR-T 001-A及CAR-T 009～CAR-T 014[效應細胞(E)]係以E：T比成為1：25及1：125之方式利用含10%FBS之RPMI 1640培養基加以稀釋。即，於E：T比1：25之情形時，CAR-T係以成為0.16×105
個/mL之方式製備，並以500 μL/well添加至接種有腫瘤細胞之48孔處理培養板(孔內之CAR-T細胞數成為0.08×105
個)。同樣地，於E：T比1：125之情形時，係以成為0.032×105
個/mL之方式製備，並以500 μL/well添加至接種有腫瘤細胞之48孔處理培養板(孔內之CAR-T細胞數成為0.016×105
個)。
抗腫瘤細胞活性%之算出係以與實施例6同樣之方式進行。圖11中表示CAR-T 001-A、CAR-T 009～CAR-T 014及Mock-T細胞對於THP-1細胞之抗腫瘤細胞活性%之結果。CAR-T 009～CAR-T 014均被確認到與CAR-T 001-A相比同等以上之對於THP-1細胞之抗腫瘤細胞活性。
[實施例9 變異型間隔修飾GMR.CAR-T抗腫瘤細胞活性持續性評價]
於過繼免疫療法中期待效果之CAR-T細胞要求持續之細胞毒殺活性。因此，為了評價GMR.CAR-T之抗腫瘤細胞活性之持續性而進行下述實驗。
以與實施例7同樣之方式，使用表現質體(CAR 010～CAR 014)進行對PBMC之電導入操作及T細胞之培養、擴增操作，而新製備GMR.CAR-T細胞(CAR-T 010-A～CAR-T 014-A)。
將於本實施例中所使用之CAR-T 010-A～014-A於第14天之表現分析結果示於圖12。GMR.CAR表現率分別為CAR-T 010-A：26.2%、CAR-T 011-A：27.6%、CAR-T 012-A：18.5%、CAR-T 013-A：29.8%、CAR-T 014-A：26.9%，與Mock-T細胞中之表現率(0.50%)相比均較高，成功製備間隔部位不同之GMR.CAR表現T細胞。
繼而，藉由利用Mock-T細胞稀釋所製備之GMR.CAR表現T細胞，而將表現率統一為18.5%，並評價連續之抗腫瘤細胞活性。
為了評價CAR-T 010-A～CAR-T 014-A之腫瘤細胞毒殺活性之持續性，而進行長時間之與腫瘤細胞之共培養試驗。具體而言，使用THP-1、MV4-11、Kasumi-1細胞(American Type Culture Collection(ATCC))及shinAML-1細胞(於信州大學附屬醫院自AML患者建立之細胞株)，以成為5×105
個/mL之方式利用含10%FBS之RPMI 1640培養基(Thermo Fisher Scientific)製備各腫瘤細胞[靶細胞(T)]，並以500 μL/well接種至48孔處理培養板(孔內之腫瘤細胞數成為2.5×105
個)。
CAR-T 010-A～014-A[效應細胞(E)]係以E：T比成為1：1之方式利用含10%FBS之RPMI 1640培養基加以稀釋。即，CAR-T係以成為5×105
個/mL之方式製備，並以500 μL/well添加至接種有各腫瘤細胞之48孔處理培養板(孔內之CAR-T細胞數成為2.5×105
個)。再者，各群分別準備2孔，1孔係用作利用FACSCanto II(Becton Dickinson股份有限公司)之「分析用」，另1孔係用作於以下之期間中用以向新腫瘤細胞進行添加之「繼續用」。
作為期間1之共培養試驗係進行4天。亦對未進行基因導入之Mock-T細胞進行同樣之共培養試驗，又，亦設定以相同細胞數僅培養腫瘤細胞所得之群(CAR-T未添加群)作為對照群。
於共培養試驗第4天回收「分析用」之孔之細胞，向經離心分離之細胞中添加APC抗人類CD3抗體(Miltenyi Biotec)5 μL及PE抗人類CD33抗體(Miltenyi Biotec)5 μL並使該等懸浮，於4℃下、遮光下進行抗體標記反應20分鐘。20分鐘後，利用適量之D-PBS洗淨細胞，藉由離心分離使細胞沈澱並完全去除上清液，其後，利用450 μL之D-PBS進行再懸浮，進而添加50 μL之CountBright absolute counting beads(Invitrogen)，對所獲得之樣品使用FACSCanto II、FLOWJO(Becton Dickinson股份有限公司)進行分析，並基於計數珠算出CD33之陽性細胞數。至此設為期間1。
關於與共培養開始時相比腫瘤細胞被殺傷(腫瘤細胞數減少)之群，進入下述之期間2。具體而言，準備2孔預先以2.5×105
個/500 μL/well接種之腫瘤細胞，向其中分別以500 μL/well均分地添加於期間1中作為「繼續用」而預先共培養之培養液，進而進行共培養4天。於培養期間4天或3天內重複進行該作業。再者，關於與共培養開始時相比腫瘤細胞數增加之群，不進入以下之期間。
圖13～圖17中表示將各腫瘤細胞設為標靶時之分別於第4天、8天、12天、15天、19天、22天之抗腫瘤細胞活性評價之結果。確認到CAR-T 010-A～CAR-T 014-A對任一腫瘤細胞株持續地具有殺傷效果。
[實施例10 GMR.CAR-T之與末梢細胞相關之作用]
於本實施例中所使用之GMR.CAR-T細胞(CAR-T 001-B及CAR-T 009-B～CAR-T 014-B)係藉由下述方法而新製備。
＜基因導入操作(第0天)＞
以與實施例7同樣之方式製備OKT3 blast後，為了向PBMC導入GMR.CAR表現質體，將CAR 001及CAR 009～014中之任一種5 μg、pCMV-piggyBac質體5 μg、附屬於P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTM
×Kit(LonzaJapan股份有限公司)之P3初生細胞溶液(Primary Cell solution)100 μL進行混合，並添加至15～20×106
個之PBMC中。
將全部量之細胞移至Nucleocuvette中，並利用4D-Nucleofection(Program No: FI-115)進行電基因導入。將經電基因導入之細胞於室溫下放置10分鐘，利用含有抗CD28抗體之D-PBS於37℃、2小時下進行抗體塗覆後，添加至裝有飼養細胞之24孔未處理培養板而開始培養。同樣地培養1～20×106
個細胞作為未實施基因導入操作之Mock-T細胞。於第3天將細胞自24孔未處理培養板移至24孔處理培養板而繼續培養。
適當地進行廢棄培養中之培養基之一半，並添加一半含2倍量即20 ng/mL IL-7及10 ng/mL IL-15之TexMACS培養基之培養基更換作業。Mock-T細胞係於24孔處理培養板上繼續培養，並根據細胞之增殖程度進行培養基更換與擴增。
繼而，以與實施例7同樣之方式進行CAR-T細胞之擴增及GMR.CAR表現率之評價。
將本實施例中所使用之CAR-T 001-B及CAR-T 009-B～CAR-T 014-B於第14天之表現分析結果示於圖18。GMR.CAR表現率分別為CAR-T 001-B：45.9%、CAR-T 009-B：37.2%、CAR-T 010-B：42.4%、CAR-T 011-B：46.4%、CAR-T 012-B：41.1%、CAR-T 013-B：48.3%、CAR-T 014-B：51.2%，與Mock-T細胞中之表現率0.56%相比均較高，成功製備GMR.CAR表現T細胞。
其次，藉由利用Mock-T細胞稀釋所製備之GMR.CAR表現T細胞，而將表現率統一為37.2%，並確認對於末梢血細胞之影響。為了確認CAR-T 001-B及CAR-T 009-B～CAR-T 014-B對於末梢血細胞之影響，而實施與末梢血細胞之共培養試驗。
＜多形核白血球(PMN)、PBMC之分離＞
自健康成人供體採集末梢血，利用D-PBS稀釋為2倍後，於polymorph prep(AXS)中使稀釋末梢血成為多層，並進行450×g、35分鐘之離心分離，而分取PMN及PBMC。利用D-PBS將所分取之PMN與PBMC洗淨2次，並藉由離心分離進行單離。
使用CAR-T 001-B及CAR-T 009-B～CAR-T 014-B，進行與所單離之PMN、PBMC、腫瘤細胞株MV4-11之共培養試驗。具體而言，以成為2×105
個/mL之方式，利用含10%FBS之RPMI 1640培養基(Thermo Fisher Scientific)製備PMN、PBMC、MV4-11[靶細胞(T)]，並以500 μL/well接種至48孔處理培養板(孔內之細胞數成為1×105
個)。
CAR-T 001-B及CAR-T 009-B～CAR-T 014-B[效應細胞(E)]係以E：T比成為1：1與1：10之方式利用含10%FBS之RPMI 1640培養基加以稀釋。即，用於E：T比＝1：1之樣品之CAR-T係以成為2×105
個/mL之方式製備，並以500 μL/well添加至接種有PMN或PBMC、MV4-11之48孔處理培養板(孔內之CAR-T細胞數為1×105
個)。
同樣地，於E：T比＝1：10之情形時，CAR-T係以成為0.2×105
個/mL之方式製備，並以500 μL/well添加至接種有PMN或PBMC、MV4-11之48孔處理培養板(孔內之CAR-T細胞數成為0.1×105
個)。
＜與PMN之共培養試驗＞
共培養試驗係進行3天。對Mock-T細胞亦進行同樣之共培養試驗，亦設定以相同細胞數培養PMN所得之群作為對照群(CAR-T未添加群)。
於共培養試驗第3天回收各孔之細胞，向經離心分離之細胞中添加FITC抗人類CD3抗體(BioLegend)0.1 μL、PE抗人類GM-CSF抗體(Miltenyi Biotec)5 μL、APC抗人類CD11b抗體(BioLegend)0.1 μL並使該等懸浮，於4℃下、遮光下進行抗體標記反應20分鐘。20分鐘後，利用適量之D-PBS洗淨細胞，藉由離心分離使細胞沈澱並去除上清液，其後使之再懸浮於D-PBS 450 μL中，並添加counting beads 50 μL，對所獲得之樣品使用FACSCantoII進行分析，將CD3-CD11b+設為嗜中性球而測定活細胞數，算出測得之細胞數成為10倍所得之數值作為存活細胞數，並算出與僅利用PMN進行培養所得之值之相對比。
＜與PBMC之共培養試驗＞
共培養試驗係進行3天。對Mock-T細胞亦進行同樣之共培養試驗，亦設定以相同細胞數培養PBMC所得之群作為對照群(CAR-T未添加群)。
於共培養試驗第3天回收各孔之細胞，向經離心分離之細胞中添加FITC抗人類CD3抗體0.1 μL、PE抗人類GM-CSF抗體5 μL、APC抗人類CD11b抗體0.1 μL、Pacific blue抗人類CD16抗體(BioLegend)0.1 μL、APC-cy7抗人類CD19抗體(BioLegend)0.1 μL並使該等懸浮，於4℃下、遮光下進行抗體標記反應20分鐘。20分鐘後，利用適量之D-PBS洗淨細胞，藉由離心分離使細胞沈澱並去除上清液，其後使之再懸浮於D-PBS 450 μL中，並添加counting beads 50 μL，對所獲得之樣品使用FACSCantoII進行分析，將CD3-CD11b+作為單核細胞，將CD3-CD16+作為NK細胞，將CD3-CD19+作為B細胞而測定活細胞數，算出測得之細胞數成為10倍所得之數值作為存活細胞數，並算出與僅利用PBMC進行培養所得之值之相對比。
＜與MV4-11之共培養試驗＞
共培養試驗係進行3天。對Mock-T細胞亦進行同樣之共培養試驗，亦設定以相同細胞數培養MV4-11所得之群作為對照群(CAR-T未添加群)。
於共培養試驗第3天回收各孔之細胞，向經離心分離之細胞中添加APC抗人類CD33 5 μL、FITC抗人類CD3 0.2 μL、PE抗人類GM-CSF 5 μL並使該等懸浮，於4℃下、遮光下進行抗體標記反應20分鐘。20分鐘後，利用適量之D-PBS洗淨細胞，藉由離心分離使細胞沈澱並去除上清液，其後使之再懸浮於D-PBS 450 μL中，並添加counting beads 50 μL，對所獲得之樣品使用FACSCantoII進行分析，測定CD33+腫瘤活細胞，將使所測定之細胞數成為10倍所得之數值算出為腫瘤存活細胞數，並算出與僅利用MV4-11進行培養所得之值之相對比。
圖19中表示以E：T比1：1及1：10將MV4-11設為標靶時之腫瘤存活細胞數相對比、與將末梢血細胞PMN、PBMC設為標靶時之存活細胞數相對比。CAR-T 001-B及CAR-T009-B～CAR-T014-B均於E：T比1：1下殺傷幾乎全部之腫瘤，另一方面，未對B細胞、NK細胞、嗜中性球(neutrophil)等末梢血細胞帶來影響。於E：T比1：10下，CAR-T 001-B及CAR-T 009-B～CAR-T 014-B均未殺傷腫瘤及末梢血細胞。根據該結果顯示，CAR-T 001-B及CAR-T 009-B～CAR-T 014-B若為具有腫瘤殺傷能力之細胞數，則不會對B細胞、NK細胞、嗜中性球等末梢血細胞帶來影響。
[實施例11 GMR.CAR-T之與骨髓細胞相關之作用]
為了評價實施例7中所製備之CAR-T 001-A及CAR-T 009～CAR-T 014對於正常骨髓細胞之影響，而進行源自骨髓細胞之菌落形成試驗。
具體而言，以成為1×104
個/mL之方式利用含10%FBS、20 ng/mL之IL-3、SCF(Stem Cell Factor，幹細胞因子)及TPO(Thrombopoietin，血小板生成素)之RPMI 1640培養基(Thermo Fisher Scientific)製備源自健康人之骨髓細胞之CD34陽性組分(Veritas)[靶細胞(T)]。同樣地，以成為6×103
個/mL之方式利用含10%FBS、20 ng/mL之IL-3、SCF及TPO之RPMI 1640培養基(Thermo Fisher Scientific)製備MV4-11[靶細胞(T)]。
以50 μL/well將所製備之各靶細胞接種至96孔圓底培養板上。向其中以50 μL/well接種CAR-T 001-A及CAR-T 009～CAR-T 014[效應細胞(E)]，以相對於源自健康人之骨髓細胞之CD34陽性組分E：T比成為20：1、6：1、2：1、0.6：1、0.2：1之方式，利用含10%FBS之RPMI 1640培養基加以稀釋，以相對於MV4-11 E：T比成為1：1、0.5：1、0.25：1、0.125：1之方式，利用含10%FBS之RPMI 1640培養基加以稀釋。即，於96孔圓底培養板中，以100 μL/well利用含有10%FBS、10 ng/mL之IL-3、SCF及TPO之RPMI 1640培養基以上述E：T比共培養效應細胞與靶細胞。
共培養係進行2天。亦對未經基因導入之Mock-T細胞進行同樣之共培養試驗，又，亦設定以相同細胞數僅培養源自健康人之骨髓細胞之CD34陽性組分、或僅培養MV4-11所得之群作為對照群(CAR-T未添加群)。
2天後，混合共培養液100 μL與MethoCult Classic(Veritas)1 mL，並接種至SmartDish 6孔板(Veritas)。接種第7天後確認到菌落形成，其後進行計數。再者，於CD34陽性組分之情形時，觀察到複數種菌落，由於難以進行菌落之判別，故而使用自動菌落計數裝置之STEMvision(Veritas)，分成紅血球系細胞菌落與骨髓系細胞菌落而進行計數。另一方面，MV4-11之菌落由於僅為1種，故而無需判別，使用顯微鏡手動進行計數。
圖20中示出於將源自健康人之骨髓細胞之CD34陽性組分設為標靶時，自以各E：T比繪製之點所描繪之S型曲線。對照群以外係使用3孔平均值繪製，對照群係使用6孔平均值繪製。S型曲線係使用GraphPad Prism 4 ver. 4.03(GraphPad)輸出，將參數設定為TOP＝100、BOTTOM≠0後，藉由以下之式實施擬合。
[數1]
圖21中示出於將MV4-11設為標靶時，自以各E：T比繪製之點所描繪之S型曲線。繪製係使用2孔平均值。S型曲線係於將參數設定為TOP＝100、BOTTOM＝0後，藉由上述式實施擬合。
圖22中表示根據圖20算出之IC50值、根據圖21算出之EC50值、進而根據該等算出之安全範圍。其結果為，對於影響較大之骨髓系，安全範圍最大者為CAR-T 014。
[實施例12 GMR.CAR-T於體內之效果1]
以與實施例10同樣之方式，使用表現質體(CAR 009、CAR 011及CAR 012)進行對PBMC之電導入操作及T細胞之培養、擴增操作，而新製備GMR.CAR-T細胞(CAR-T 009-C、CAR-T 011-C及CAR-T 012-C)。將於本實施例中所使用之CAR-T 009-C、CAR-T 011-C及CAR-T 012-C於第14天之表現分析結果示於圖23。GMR.CAR表現率分別為CAR-T 009-C：25.7%、CAR-T 011-C：32.1%、CAR-T 012-C：25.2%。
為了確認該等GMR.CAR-T細胞於THP-1帶癌小鼠模型中之效果，而進行下述活體內實驗。小鼠係使用7週齡之雌性NSG小鼠NOD.Cg-Prkdc＜scid ＞Il2rg＜ tm1Wjl ＞/SzJ(日本Charles River)，以6週齡交付後，進行6天適應，其後用於實驗中。
於第0天使THP-1細胞株以成為1×106
個/小鼠之方式利用150 μL之D-PBS懸浮，並對NSG小鼠於異氟烷麻醉下進行頸靜脈內投予。
於第3天使培養第16天之CAR-T細胞以總T細胞成為5×106
個/小鼠之方式利用150 μL之D-PBS懸浮，並對NSG小鼠於異氟烷麻醉下自頸靜脈投予。
每隔1～2天觀察小鼠之狀態直至第148天，進行卡普蘭-邁耶(Kaplan-Meier)分析，並藉由對數等級(Log-rank)(Cochran-Mantel-Haenszel)實驗進行統計分析。
又，觀察小鼠之狀態，對判斷達到以下所設定之人道終點之小鼠進行安樂死而使小鼠死亡。
人道終點：
・跛行
・腫瘤之直徑達到20 mm
・體重於7天內減少25%以上。
其結果為，如圖24所示，顯示CAR-T 009-C(P值＝0.0086)、CAR-T 011-C(P值＝0.0011)及CAR-T 012-C(P值＝0.0011)與PBS投予群相比，顯著地延長小鼠之存活期間。
進而，於CAR-T 011-C及CAR-T 012-C投予小鼠與CAR-T 009-C投予小鼠間之統計分析中，顯示CAR-T 011-C(P值＝0.0042)及CAR-T 012-C(P值＝0.0136)與CAR-T 009-C相比，顯著地延長小鼠之存活期間。
根據該等結果顯示，於THP-1帶癌小鼠模型中，CAR-T 011-C及CAR-T 012-C與CAR-T 009-C相比，具有較強之抗腫瘤效果。
[實施例13 GMR.CAR-T於活體內之效果2]
以與實施例10同樣之方式，使用表現質體(CAR 009～CAR 014)進行對PBMC之電導入操作及T細胞之培養、擴增操作，而新製備GMR.CAR-T細胞(CAR-T 009-D～CAR-T 014-D)。將本實施例中所使用之CAR-T 009-D～CAR-T 014-D於第14天之表現分析結果示於圖25。GMR.CAR表現率分別為CAR-T 009-D：33.3%、CAR-T 010-D：39.6%、CAR-T 011-D：35.1%、CAR-T 012-D：37.4%、CAR-T 013-D：43.0%、CAR-T 014-D：40.9%。
根據所獲得之表現率與細胞數算出CAR陽性細胞數，使投予至各群之CAR陽性細胞成為1.2×106
。為了確認於MV4-11帶癌小鼠模型中之效果，而與實施例12同樣地進行下述活體內實驗。使用8週齡之雌性NSG小鼠，以6週齡交付後進行13天適應，其後用於實驗中。
於第0天使MV4-11細胞株以成為1×106
個/小鼠之方式利用150 μL之D-PBS懸浮，並對NSG小鼠於異氟烷麻醉下自頸靜脈投予。
於第3天以成為CAR陽性細胞1.2×106
個/小鼠之方式，利用150 μL之D-PBS使培養第16天之CAR-T細胞懸浮，並對NSG小鼠於異氟烷麻醉下自頸靜脈投予。
每隔1～2天觀察小鼠之狀態直至第116天，進行卡普蘭-邁耶分析，並藉由對數等級(Cochran-Mantel-Haenszel)實驗進行統計分析。又，觀察小鼠之狀態，對與實施例12同樣地判斷到達人道終點之小鼠進行安樂死而使小鼠死亡。
又，於第52天使用塗佈有EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid，乙二胺四乙酸)-2K之血細胞比容毛細管(TOKYO GLASS KIKAI)，採血100 μL左右，藉由委託業務之定量PCR(MLL-AF4嵌合mRNA定量(SRL))對血液中之腫瘤細胞之殘留量進行定量。
其結果為，如圖26及27所示，顯示CAR-T 009-D(P值＝0.0042)、CAR-T 011-D(P值＝0.0216)、CAR-T 012-D(P值＝0.0042))、CAR-T 010-D(P值＝0.0042)、CAR-T 013-D(P值＝0.0042)及CAR-T 014-D(P值＝0.0042)與PBS投予群相比，顯著地延長小鼠之存活期間。
進而，根據第116天之卡普蘭邁耶分析、及圖28所示之第52天之末梢血中腫瘤之定量PCR之結果顯示，於MV4-11帶癌小鼠模型中，CAR-T 010-D及CAR-T 014-D與CAR-T 013-D相比，具有較強之抗腫瘤效果。
[實施例14 GMR.CAR-T於活體內之效果3]
以與實施例10同樣之方式，使用表現質體(CAR 001及CAR 014)進行對PBMC之電導入操作及T細胞之培養、擴增操作，而新製備GMR.CAR-T細胞(CAR-T 001-C及CAR-T 014-F)。又，作為用於表現率算出之比較對照用，使用於Morita. et. al. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development Vol. 8 March 2018中所記載之無CH2CH3之CD19.CAR質體同樣地製備CD19.CAR-T。
將於本實施例中所使用之CAR-T 001-C及CAR-T 014-F於第14天之表現分析結果示於圖29。GMR.CAR表現率分別為CAR-T 001-C：32.3%與CAR-T 014-F：14.1%。
根據所獲得之表現率與細胞數算出CAR陽性細胞數，使投予至各群之CAR陽性細胞成為0.7×106
個。為了確認於MV4-11帶癌小鼠模型中之效果，而與實施例12同樣地進行下述活體內實驗。使用7週齡之雌性NSG小鼠，以6週齡交付後，進行6天適應，其後用於實驗中。
於第0天使MV4-11細胞株以成為1×106
個/小鼠之方式利用150 μL之D-PBS懸浮，並對NSG小鼠於無麻醉下自尾靜脈投予。
於第3天使培養第16天之CAR-T細胞以成為CAR陽性細胞0.7×106
個/小鼠之方式利用150 μL之D-PBS懸浮，並對NSG小鼠於無麻醉下自尾靜脈投予。
每隔1～2天觀察小鼠之狀態直至第105天，進行卡普蘭-邁耶分析，並藉由對數等級(Cochoran-Mantel-Haenszel)實驗進行統計分析。又，觀察小鼠之狀態，對與實施例12同樣地判斷到達人道終點之小鼠進行安樂死而使小鼠死亡。
其結果為，如圖30所示，顯示CAR-T 014-F(P值＝0.0050)與PBS投予群相比，顯著地延長小鼠之存活期間，顯示CAR-T 014-F(P值＝0.0081)與CAR-T 001-C相比，亦顯著地延長小鼠之存活期間。
[實施例15 於腫瘤細胞表面之GMRα(CD116)之表現分析]
利用流式細胞儀，對上述實施例之抗腫瘤細胞活性評價中所使用之腫瘤細胞株之細胞表面之GMRα(CD116)之表現率進行分析。對作為急性骨髓性白血病(AML)之細胞株之THP-1、Kasumi-1、shinAML-1、MV4-11株進行分析。具體而言，採集1～2×105
個細胞，添加APC抗人類CD116抗體(Miltenyi Biotec)5 μL及PE抗人類CD33抗體(Miltenyi Biotec)5 μL並使該等懸浮，於4℃下、遮光下進行抗體標記反應20分鐘。20分鐘後，利用適量之D-PBS洗淨細胞，藉由離心分離使細胞沈澱並去除上清液，其後再懸浮於適量之D-PBS中，對所得之樣品使用FACSCalibur進行分析，並測定CD33/CD116之表現率。
表1中表示各腫瘤細胞表面之CD33/CD116表現率。於THP-1、Kasumi-1、shinAML-1及MV4-11之全部中，CD33/CD116陽性率為90%以上。
[表1] 
[實施例16 GMR.CAR表現T細胞之表現型分析]
以與實施例7同樣之方式，使用表現質體CAR 014進行對PBMC之電導入操作及T細胞之培養、擴增操作，而新製備GMR.CAR-T細胞(CAR-T 014-E)。將CAR-T 014-E於第14天之表現分析結果示於圖31。GMR.CAR表現率為9.75%，高於在Mock-T細胞中之表現率(1.75%)，成功製備GMR.CAR表現T細胞。
對所製備之GMR.CAR表現T細胞之細胞數進行計數，並藉由流式細胞儀分析，對1×106
個細胞評價GMR.CAR-T細胞之表現型。採集1×106
個細胞，向經離心分離之細胞中添加人類BD Fc Block(Becton Dickinson股份有限公司)，藉此進行Fc受體之封閉處理，其後適量添加BB515小鼠抗人類CD197抗體(Becton Dickinson股份有限公司)、PE小鼠抗人類CD27抗體(Becton Dickinson股份有限公司)、APC小鼠抗人類CD62L抗體(Becton Dickinson股份有限公司)、APC-H7小鼠抗人類CD45RO抗體(Becton Dickinson股份有限公司)、Brilliant Violet421小鼠抗人類CD56抗體(Becton Dickinson股份有限公司)、BV510小鼠抗人類CD8抗體(Becton Dickinson股份有限公司)、BV605小鼠抗人類CD45RA抗體(Becton Dickinson股份有限公司)、BV650小鼠抗人類CD3抗體(Becton Dickinson股份有限公司)及BV786小鼠抗人類CD4抗體(Becton Dickinson股份有限公司)並使該等懸浮，於4℃下、遮光下進行20分鐘抗體標記反應。
20分鐘後，利用適量之含3%FBS之D-PBS洗淨細胞，藉由離心分離使細胞沈澱並去除上清液，其後再懸浮於適量之含3%FBS之D-PBS中，對所獲得之樣品使用FACSCelesta(Becton Dickinson股份有限公司)及FLOWJO(Becton Dickinson股份有限公司)進行分析，將CD3陽性且CD45RA/CD62L陽性或CD3陽性且CD45RA/CD197陽性作為指標，分析GMR.CAR之表現型。其結果為，所製備之GMR.CAR表現T細胞之六成以上為幹細胞記憶T細胞。
[產業上之可利用性]
根據本發明，提供一種與在細胞表面表現人類粒細胞-巨噬細胞菌落刺激因子(GM-CSF)受體之靶細胞特異性地結合而賦予優異之細胞毒殺活性之CAR-T細胞。本發明之細胞可用於針對AML等疾病之過繼免疫治療。
於本說明書中所引用之所有刊物、日本專利及專利申請係直接藉由引用而編入至本說明書中。
圖1表示CAR001之載體圖。
圖2表示間隔區經修飾之GMR.CAR(CH2CH3部分缺失體、GMR.CAR dCH2CH3)之載體圖之例。
圖3表示間隔區經修飾之GMR.CAR(CH2CH3部分缺失-(G4S)3***體、GMR.CAR dCH2CH3+(G4S)3)之載體圖之例。
圖4表示間隔區經修飾之(E21R)GMR.CAR(CH2CH3部分缺失體、E21RGMR.CAR dCH2CH3)之載體圖之例。
圖5表示間隔區經修飾之(E21K)GMR.CAR(CH2CH3部分缺失體、E21KGMR.CAR dCH2CH3)之載體圖之例。
圖6表示間隔區經修飾之(E21R)GMR.CAR(CH2CH3部分缺失-(G4S)3***體、E21RGMR.CAR dCH2CH3+(G4S)3)之載體圖之例。
圖7表示間隔區經修飾之(E21K)GMR.CAR(CH2CH3部分缺失-(G4S)3***體、E21KGMR.CAR dCH2CH3+(G4S)3)之載體圖之例。
圖8表示導入有編碼CAR之聚核苷酸之CAR-T細胞(CAR-T 001～CAR-T 008)於第14天之GM-CSF表現分析之結果。
圖9表示CAR-T 001～CAR-T 008對於THP-1細胞之抗腫瘤細胞活性%。
圖10表示導入有編碼CAR之聚核苷酸之CAR-T細胞(CAR-T 001-A、CAR-T 009～CAR-T 014)於第14天之GM-CSF表現分析之結果。
圖11表示CAR-T 001-A及CAR-T 009～CAR-T 014對於THP-1細胞之抗腫瘤細胞活性%。
圖12表示導入有編碼CAR之聚核苷酸之CAR-T細胞(CAR-T 010-A～CAR-T 014-A)於第14天之GM-CSF表現分析之結果。
圖13表示CAR-T 010-A～CAR-T 014-A對於THP-1細胞之於E：T比＝1：1下之持續性腫瘤細胞殺傷能力。
圖14表示CAR-T 010-A～CAR-T 014-A對於MV4-11細胞之於E：T比＝1：1下之持續性腫瘤細胞殺傷能力。
圖15表示CAR-T 010-A～CAR-T 014-A對於Kasumi-1細胞之於E：T比＝1：1下之持續性腫瘤細胞殺傷能力。
圖16表示CAR-T 010-A～CAR-T 014-A對於shinAML-1細胞之於E：T比＝1：1下之持續性腫瘤細胞殺傷能力。
圖17表示圖13～16中之孔內之腫瘤細胞數。
圖18表示導入有編碼CAR之聚核苷酸之CAR-T細胞(CAR-T 001-B及CAR-T 009-B～CAR-T 014-B)於第14天之GM-CSF表現分析之結果。
圖19表示E：T比1：1及1：10下之相對於MV4-11細胞之腫瘤存活細胞數相對比與相對於末梢血細胞之存活細胞數相對比。
圖20表示相對於源自健康人之骨髓細胞之自以各E：T比繪製之點描繪之S型曲線。
圖21表示相對於MV4-11細胞之自以各E：T比繪製之點描繪之S型曲線。
圖22表示基於根據圖20算出之IC50值、根據圖21算出之EC50值而算出之安全範圍。
圖23表示導入有編碼CAR之聚核苷酸之CAR-T細胞(CAR-T 009-C、CAR-T 011-C及CAR-T 012-C)於第14天之GM-CSF表現分析之結果。
圖24表示CAR-T 009-C、CAR-T 011-C及CAR-T 012-C於THP-1帶癌小鼠模型中之實驗結果。
圖25表示導入有編碼CAR之聚核苷酸之CAR-T細胞(CAR-T 009-D～CAR-T 014-D)於第14天之GM-CSF表現分析之結果。
圖26表示CAR-T 009-D、CAR-T 011-D及CAR-T 012-D於MV4-11帶癌小鼠模型中之實驗結果。
圖27表示CAR-T 010-D、CAR-T 013-D及CAR-T 014-D於MV4-11帶癌小鼠模型中之實驗結果。
圖28表示CAR-T 009-D～CAR-T 014-D於第52天之末梢血中腫瘤之定量PCR之結果。(ND表示無法檢測)
圖29表示導入有編碼CAR之聚核苷酸之CAR-T細胞(CAR-T 001-C、CAR-T 014-F、及比較對照之CD19 T細胞)於第14天之GM-CSF表現分析之結果。
圖30表示CAR-T 001-C及CAR-T 014-F於MV4-11帶癌小鼠模型中之實驗結果。
圖31表示導入有編碼CAR之聚核苷酸之CAR-T細胞(CAR-T 014-E)於第14天之GM-CSF表現分析之結果。
Claims (12)
- 一種基因修飾細胞，其係導入有編碼具有與人類粒細胞-巨噬細胞菌落刺激因子(GM-CSF)受體特異性地結合之標靶結合區、跨膜區、及細胞內訊號傳遞區之嵌合抗原受體(CAR，chimeric antigen receptor)蛋白質之聚核苷酸者，且上述標靶結合區係具有序列編號1所表示之胺基酸序列中之第21號麩胺酸被置換為其他胺基酸之序列之變異體多肽。
- 如請求項1之細胞，其於細胞膜上表現與GM-CSF受體結合之CAR蛋白質。
- 如請求項1或2之細胞，其中CAR蛋白質進而包含共刺激區及/或細胞外間隔區。
- 如請求項1至3中任一項之細胞，其中細胞內訊號傳遞區為人類CD3ζ。
- 如請求項3或4之細胞，其中共刺激區為人類CD28或人類4-1BB。
- 如請求項3至5中任一項之細胞，其中細胞外間隔區包含人類IgG1之鉸鏈、CH2、及/或CH3區或其一部分、及/或人工間隔序列。
- 如請求項1至6中任一項之細胞，其中標靶結合區係具有序列編號1所表示之胺基酸序列中之第21號麩胺酸被置換為精胺酸或離胺酸之序列之變異體多肽。
- 一種CAR蛋白質表現細胞之製備方法，其包含使用載體將編碼與人類GM-CSF受體特異性地結合之嵌合抗原受體(CAR)蛋白質之聚核苷酸導入至細胞之操作，且上述蛋白質包含序列編號1所表示之胺基酸序列中之第21號麩胺酸被置換為其他胺基酸之胺基酸序列。
- 一種載體，其係包含編碼與人類GM-CSF受體特異性地結合之嵌合抗原受體(CAR)蛋白質之聚核苷酸者，且上述蛋白質包含序列編號1所表示之胺基酸序列中之第21號麩胺酸被置換為其他胺基酸之胺基酸序列。
- 一種針對與GM-CSF受體表現細胞相關之疾病之治療劑，其包含如請求項1至7中任一項之細胞。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項10之治療劑及醫藥上所容許之載體。
- 如請求項10之治療劑或如請求項11之組合物，其中與GM-CSF受體表現細胞相關之疾病係選自幼年型骨髓單核細胞性白血病(JMML)、急性骨髓性白血病(AML)、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、神經膠母細胞瘤、腦腫瘤、直腸結腸腺癌、***癌、腎癌、黑色素瘤及肺小細胞癌。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018-050266 | 2018-03-16 | ||
| JP2018050266 | 2018-03-16 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW202003853A true TW202003853A (zh) | 2020-01-16 |
| TWI817994B TWI817994B (zh) | 2023-10-11 |
Family
ID=67907182
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW108108890A TWI817994B (zh) | 2018-03-16 | 2019-03-15 | 基因修飾細胞及其製備方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20200407455A1 (zh) |
| EP (1) | EP3766977A4 (zh) |
| JP (1) | JP7296133B2 (zh) |
| TW (1) | TWI817994B (zh) |
| WO (1) | WO2019177151A1 (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115181751A (zh) * | 2021-04-02 | 2022-10-14 | 苏州博腾生物制药有限公司 | 靶向白蛋白的嵌合抗原受体及其使用方法 |
| CN114934071B (zh) * | 2021-04-30 | 2023-10-17 | 四川大学华西医院 | 一种表达免疫调节因子的car载体及其应用 |
| CN117616039A (zh) * | 2021-05-11 | 2024-02-27 | 新加坡保健集团 | 嵌合抗原受体及包含其的经修饰细胞 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015066262A1 (en) | 2013-11-04 | 2015-05-07 | Trustees Of Dartmouth College | Methods for preventing toxicity of adoptive cell therapy |
| WO2018052142A1 (ja) * | 2016-09-16 | 2018-03-22 | キッセイ薬品工業株式会社 | 遺伝子改変細胞及びその作製方法 |
| JP6381598B2 (ja) | 2016-09-23 | 2018-08-29 | キヤノン株式会社 | 画像通信装置及びその制御方法とプログラム |
| CN106543288A (zh) * | 2016-10-24 | 2017-03-29 | 山东兴瑞生物科技有限公司 | 一种间皮素嵌合抗原受体修饰的t细胞制备及胰腺癌治疗上的应用 |
-
2019
- 2019-03-15 TW TW108108890A patent/TWI817994B/zh active
- 2019-03-15 WO PCT/JP2019/010854 patent/WO2019177151A1/ja unknown
- 2019-03-15 JP JP2020506674A patent/JP7296133B2/ja active Active
- 2019-03-15 US US16/980,961 patent/US20200407455A1/en active Pending
- 2019-03-15 EP EP19766785.0A patent/EP3766977A4/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPWO2019177151A1 (ja) | 2021-03-11 |
| US20200407455A1 (en) | 2020-12-31 |
| EP3766977A1 (en) | 2021-01-20 |
| JP7296133B2 (ja) | 2023-06-22 |
| WO2019177151A1 (ja) | 2019-09-19 |
| EP3766977A4 (en) | 2021-12-08 |
| TWI817994B (zh) | 2023-10-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7062720B2 (ja) | 細胞免疫療法のための方法および組成物 | |
| JP7033549B2 (ja) | 細胞に基づくネオ抗原ワクチンおよびその使用 | |
| JP7048494B2 (ja) | 修飾ｔ細胞に対する条件的活性型キメラ抗原受容体 | |
| TW202134264A (zh) | 嵌合抗原受體及其用途 | |
| RU2700765C2 (ru) | Способ и композиции для клеточной иммунотерапии | |
| US20220025001A1 (en) | Nucleic acid constructs for co-expression of chimeric antigen receptor and transcription factor, cells containing and therapeutic use thereof | |
| WO2019160956A1 (en) | Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15 | |
| BR112020007710A2 (pt) | métodos para produzir células que expressam receptor de antígeno quimérico | |
| BR112021003305A2 (pt) | métodos para produzir células que expressam receptor de antígeno quimérico | |
| US20230074800A1 (en) | Car-t cell therapies with enhanced efficacy | |
| CN107567461A (zh) | 制备嵌合抗原受体表达细胞的方法 | |
| JP2020534869A (ja) | 遺伝子編集ｔ細胞及びその使用 | |
| US10683355B2 (en) | Genetically-modified cells and method for producing same | |
| JP2021520800A (ja) | ヒトｔ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子に特異性を有する最適化された操作されたヌクレアーゼ | |
| JP2023515211A (ja) | キメラ抗原受容体発現細胞を作製する方法 | |
| JP2020527036A (ja) | 癌免疫療法用ｍｒ１制限ｔ細胞受容体 | |
| TWI817994B (zh) | 基因修飾細胞及其製備方法 | |
| JP2021536245A (ja) | 血液中または濃縮ｐｂｍｃ中のリンパ球を遺伝子改変するための方法および組成物 | |
| TW202146644A (zh) | 一種新穎的ｃｄ１６陽性自然殺手細胞及一種培養ｃｄ１６陽性自然殺手細胞的方法 | |
| JP2021536256A (ja) | 修飾ｔ細胞に対する条件的活性型キメラ抗原受容体 | |
| WO2023145961A1 (ja) | ＩＧＦ１Ｒを標的とするｐｒｅ－ｐｒｏ前駆体型キメラ抗原受容体発現細胞 | |
| WO2023234330A1 (ja) | Ｅｇｆｒを標的とするキメラ抗原受容体発現細胞 | |
| WO2020241827A1 (ja) | Ａｌｋを標的とするキメラ抗原受容体発現細胞 | |
| WO2020085480A1 (ja) | 高効率な遺伝子改変細胞の作製方法 | |
| CN117165529A (zh) | 一种经过基因修饰的t细胞及其制备方法和应用 |