TW201930594A - B型肝炎病毒(hbv)疫苗及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明描述編碼B型肝炎病毒(HBV)核心抗原及聚合酶抗原之聚核苷酸，及相關組合。亦描述表現該HBV核心及聚合酶抗原之載體，諸如DNA質體或病毒載體，以及含有該等表現載體之免疫原性組合物。亦描述使用該等免疫原性組合物，特別在患有慢性HBV感染之個體中，誘發針對HBV之免疫反應或治療HBV誘發之疾病的方法。

Description

B型肝炎病毒(HBV)疫苗及其用途

B型肝炎病毒(HBV)係編碼四個開放閱讀框架及七種蛋白質的3.2 kb親肝性小DNA病毒。有約二十億人感染HBV，且有約兩億四千萬人患有慢性B型肝炎感染(慢性HBV)，該病以病毒及亞病毒粒子持久存在於血液中超過6個月為特徵(1)。持久的HBV感染經由病毒肽及循環抗原長期刺激HBV特異性T細胞受體而導致循環及肝內HBV特異性CD4+及CD8+ T細胞的T細胞耗盡。因此，T細胞多功能性減弱(亦即，IL-2、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IFN-γ含量降低，及增殖缺乏)。

自1980年代起，已有可用的針對HBV感染之安全且有效的預防性疫苗，且成為B型肝炎預防之主要手段(3)。世界衛生組織(World Health Organization)建議所有嬰兒接受疫苗接種，且在存在較低或中等B型肝炎地方性流行的國家中，建議所有兒童及青少年(＜18歲)以及處於風險群體類別的某些人接受疫苗接種。由於接受疫苗接種，使得全世界感染率大幅下降。不過，預防性疫苗不能治癒已確定之HBV感染。

慢性HBV當前係用IFN-α及核苷或核苷酸類似物進行治療，但由於在感染之肝細胞中存留有作為病毒RNA之模板起重要作用的稱為共價閉合環狀DNA (cccDNA)之細胞內病毒複製中間物且因此存留有新病毒粒子而最終無法治癒。普遍認為，誘發病毒特異性T細胞及B細胞反應可以有效地除去載有cccDNA之肝細胞。當前靶向HBV聚合酶之療法抑制病毒血症，但對存在於核中之cccDNA及相關之循環抗原產生的作用有限。最嚴格的治癒形式可以除去生物體中之HBV cccDNA，此既不為觀察到的自然發生之結果，亦非任何治療性干預之結果。然而，HBV表面抗原(HBsAg)之喪失係臨床上可信的治癒等效結果，因為疾病復發僅在嚴重免疫抑制情況下才會發生，而此可接著藉由預防性治療加以預防。因此，至少自臨床觀點看，HBsAg之喪失與針對HBV的最嚴格免疫重建形式相關。

舉例而言，經證實，利用聚乙二醇化干擾素(pegIFN)-α進行之免疫調節在維持有限治療療程之治療結束後反應方面優於核苷或核苷酸療法。除直接抗病毒作用外，據報導，IFN-α在細胞培養物及人類化小鼠中對cccDNA起到表觀遺傳抑制作用，使病毒粒子生產率及轉錄本減少(4)。然而，此療法仍伴隨副作用且且部分由於IFN-α對HBV特異性T細胞僅具有較弱的調節作用，總體反應相當低。詳言之，治癒率較低(＜10%)且毒性較高。同樣，直接作用於HBV之抗病毒劑，即HBV聚合酶抑制劑恩替卡韋(entecavir)及替諾福韋(tenofovir)，作為單藥療法有效誘導病毒抑制作用且針對耐藥性突變體之出現具有較高基因屏障作用且由此預防肝病之進展。然而，利用此類HBV聚合酶抑制劑很少實現由HBsAg喪失或血清轉化定義的慢性B型肝炎之治癒。因此，該等抗病毒劑理論上需要無限期投與以預防肝病之復發，與針對人類免疫缺陷病毒(HIV)之抗反轉錄病毒療法類似。

治療性疫苗接種有可能除去長期感染患者之HBV(5)。已經研究許多策略，但迄今為止，尚未證實治療性疫苗接種之成功性。

因此，由於具有較高治癒率的良好耐受之治療方法有限，對於B型肝炎病毒(HBV)，特別是慢性HBV治療之醫療需求尚未得到滿足。本發明藉由提供用於誘發針對B型肝炎病毒(HBV)感染之免疫反應的免疫原性組合物及方法滿足此需求。本發明之免疫原性組合物及方法可以用於向個體，諸如患有慢性HBV感染之個體提供治療性免疫。

在一通用態樣中，本申請案係關於一種編碼HBV抗原，諸如截短之HBV核心抗原或HBV聚合酶抗原的非天然存在之核酸分子。根據本申請案之一個實施例的HBV抗原係能夠在哺乳動物中誘發針對至少兩種HBV基因型之免疫反應(體液及細胞免疫反應)，較佳在哺乳動物中誘發針對至少HBV基因型B、C及D之T細胞反應，更佳地，在人類個體中誘發針對至少HBV基因型A、B、C及D之CD8 T細胞反應的共同抗原。

在一個實施例中，本申請案之非天然存在之核酸分子編碼由SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14之胺基酸序列組成的截短之HBV核心抗原，且該非天然存在之核酸分子包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15至少90%一致的聚核苷酸序列。較佳地，該非天然存在之核酸分子包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15之聚核苷酸序列。

在一個實施例中，本申請案之非天然存在之核酸分子編碼包含與SEQ ID NO: 4至少98%一致之胺基酸序列的HBV聚合酶抗原，其中該HBV聚合酶抗原不具有逆轉錄酶活性及核糖核酸酶H(RNAse H)活性。較佳地，HBV聚合酶抗原包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。更佳地，非天然存在之核酸分子包含與SEQ ID NO : 3或SEQ ID NO: 16至少90%一致，最佳與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16達100%一致之聚核苷酸序列。

在另一通用態樣中，本申請案係關於一種包含本申請案之非天然存在之核酸分子的載體，較佳地為DNA質體或病毒載體。

在另一通用態樣中，本申請案係關於一種包含本申請案之非天然存在之核酸分子或載體的重組宿主細胞。

在另一通用態樣中，本申請案係關於一種由本申請案之非天然存在之核酸分子編碼的非天然存在之多肽。

在又一通用態樣中，本申請案係關於一種組合物，其包含本申請案之非天然存在之核酸分子、載體、重組宿主細胞及非天然存在之多肽中的至少一種，及醫藥學上可接受之載劑。

在另一通用態樣中，本申請案係關於一種免疫原性組合，特定言之套組，其包含：
(a) 包含編碼HBV聚合酶抗原之第一聚核苷酸的第一非天然存在之核酸分子，該HBV聚合酶抗原具有與SEQ ID NO: 4至少98%一致的胺基酸序列，其中該HBV聚合酶抗原不具有逆轉錄酶活性及核糖核酸酶H活性；
(b) 包含編碼截短之HBV核心抗原之第二聚核苷酸的第二非天然存在之核酸分子，該截短之HBV核心抗原由SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14之胺基酸序列組成；以及
(c) 醫藥學上可接受之載劑，
其中該第一非天然存在之核酸分子及該第二非天然存在之核酸分子係存在於同一非天然存在之核酸分子中或兩個不同的非天然存在之核酸分子中。

在一些實施例中，本申請案之免疫原性組合，特定言之套組包含存在於第一載體中之第一聚核苷酸及存在於第二載體中之第二聚核苷酸。較佳地，該第一載體不同於該第二載體。更佳地，該載體係質體載體或病毒載體。更佳地，該第一載體及該第二載體各自為質體DNA載體。

在一個實施例中，本申請案之免疫原性組合，特定言之套組包含：
a) 包含編碼HBV聚合酶抗原之第一聚核苷酸序列的第一質體DNA載體，該HBV聚合酶抗原具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列； b) 包含編碼截短之HBV核心抗原之第二聚核苷酸的第二質體DNA載體，該截短之HBV核心抗原由SEQ ID NO: 2或14之胺基酸序列組成；以及
c) 醫藥學上可接受之載劑，
其中該第一質體DNA載體及該第二質體DNA載體各自進一步包含抗生素抗性基因及複製起點，且
其中該第一質體DNA載體與該第二質體DNA載體係存在於同一組合物中或兩種不同組合物中。

在一個特定實施例中，本申請案之免疫原性組合，特定言之套組包含：
a) 第一質體DNA載體，自3'端至5'端，其包括含SEQ ID NO: 7之聚核苷酸序列的啟動子序列、含SEQ ID NO: 8之聚核苷酸序列的強化子序列、含SEQ ID NO: 5之聚核苷酸序列的信號肽編碼序列、含SEQ ID NO: 3之聚核苷酸序列的第一聚核苷酸序列及含SEQ ID NO: 11之聚核苷酸序列的聚腺苷酸化信號序列； b) 第二質體DNA載體，自3'端至5'端，其包括含SEQ ID NO: 7之聚核苷酸序列的啟動子序列、含SEQ ID NO: 8之聚核苷酸序列的強化子序列、含SEQ ID NO: 5之聚核苷酸序列的信號肽編碼序列、含SEQ ID NO: 1之聚核苷酸序列的第二聚核苷酸序列及含SEQ ID NO: 11之聚核苷酸序列的聚腺苷酸化信號序列；以及 c) 醫藥學上可接受之載劑， 其中該第一質體DNA載體及該第二質體DNA載體各自進一步包含具有SEQ ID NO: 12之聚核苷酸序列的卡那黴素抗性基因及具有SEQ ID NO:10之聚核苷酸序列的複製起點，且
其中該第一質體DNA載體與該第二質體DNA載體係存在於同一組合物中或兩種不同組合物中。

在其他實施例中，本申請案之免疫原性組合，特定言之套組包含存在於同一載體中之第一聚核苷酸及第二聚核苷酸。較佳地，該載體係質體載體或病毒載體。更佳地，該載體係腺病毒載體，諸如Ad26或Ad35載體。

在一個實施例中，本申請案之免疫原性組合，特定言之套組包含：
a) 載體，其包含編碼具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之HBV聚合酶抗原的第一聚核苷酸序列，及編碼由SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14之胺基酸序列組成的截短之HBV核心抗原之第二聚核苷酸；以及 b) 醫藥學上可接受之載劑。

在一個特定實施例中，本申請案之免疫原性組合，特定言之套組包含病毒載體，較佳地腺病毒載體，自5'端至3'端，該載體包括含SEQ ID NO: 17之聚核苷酸序列的啟動子序列、含SEQ ID NO: 23之聚核苷酸序列的調控序列、含SEQ ID NO: 18之聚核苷酸序列的信號肽編碼序列、含SEQ ID NO: 15之聚核苷酸序列的第二聚核苷酸序列、含SEQ ID NO: 22之聚核苷酸序列的連接子編碼序列、含SEQ ID NO: 16之聚核苷酸序列的第一聚核苷酸序列，及含SEQ ID NO: 24之聚核苷酸序列的聚腺苷酸化信號序列，及醫藥學上可接受之載劑。

本申請案之其他態樣係關於製造本申請案之聚核苷酸、載體、多肽及組合物以及免疫原性組合或套組的方法。

且在又一通用態樣中，本申請案係關於一種在有需要之個體中誘發針對B型肝炎病毒(HBV)之免疫反應的方法，該方法包含向該個體投與免疫原性有效量的本申請案之組合物或免疫原性組合。較佳地，該方法在個體中誘發針對至少兩種HBV基因型之免疫反應，諸如抗體反應及/或T細胞反應。較佳地，該方法在個體中誘發針對至少HBV基因型B、C及D之T細胞反應。更佳地，該方法在人類個體中誘發針對至少HBV基因型A、B、C及D之CD8 T細胞反應。在一實施例中，該方法進一步包含向該個體投與另一免疫原性藥劑，較佳地另一HBV抗原。

在另一態樣中，本申請案係關於一種治療有需要之個體的B型肝炎病毒(HBV)誘發之疾病的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量的本申請案之組合物或免疫原性組合。較佳地，該個體患有慢性HBV感染，且該HBV誘發之疾病係選自由晚期纖維化、肝硬化及肝細胞癌(HCC)組成之群。在一實施例中，該方法進一步包含向該個體投與另一治療劑，較佳地另一抗HBV抗原。

本申請案亦係關於用於誘發針對B型肝炎病毒(HBV)之免疫反應的本申請案之組合物、免疫原性組合或套組；以及本申請案之組合物、免疫原性組合或套組在製造用於誘發針對B型肝炎病毒(HBV)之免疫反應的藥物中的用途。該用途可以進一步包含與另一免疫原性藥劑，較佳地另一HBV抗原之組合。較佳地，該個體患有慢性HBV感染。

本申請案進一步係關於用於治療有需要之個體的HBV誘發之疾病的本申請案之組合物、免疫原性組合或套組；以及本申請案之組合物、免疫原性組合或套組在製造用於治療有需要之個體的HBV誘發之疾病之藥物中的用途。該用途可以進一步包含與另一治療劑，較佳地另一抗HBV抗原之組合。較佳地，該個體患有慢性HBV感染，且該HBV誘發之疾病係選自由晚期纖維化、肝硬化及肝細胞癌(HCC)組成之群。

自以下揭示內容，包括本發明之詳細說明及其較佳實施例以及所附申請專利範圍，將易於瞭解本發明之其他態樣、特徵及優勢。

相關申請案之交叉引用

本申請案主張2017年12月19日申請之臺灣專利申請案第106144659號之優先權，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。
對以電子方式提交之序列表之引用

本申請案含有序列表，該序列表係以2018年12月10日創建的檔案名稱為「688097-403 Sequence Listing」且大小為46.6 KB之ASCII格式序列表經由EFS-Web以電子方式提交。此經由EFS-Web提交之序列表係說明書之一部分且以全文引用的方式併入本文中。

先前技術及本說明書通篇引用或描述各種出版物、文章及專利；該等參考文獻各自以全文引用的方式併入本文中。本說明書中所包括的文獻、操作、材料、器件、文章或類似物之論述係出於提供本發明之內容的目的。此類論述並非承認任何或所有該等內容形成關於所揭示或所要求的任何發明之現有技術的一部分。

除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域的一般技術者通常所理解相同的含義。另外，本文中使用之某些術語具有如本說明書中所述之含義。本文中引用的所有專利、公開之專利申請案及出版物均以引用的方式併入，就如同在本文中完整闡述一般。

必須注意的是，除非上下文另外明確指示，否則如本文及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一個(種)(a/an)」及「該(the)」包括複數個(種)指示物。

除非另外指示，否則在一系列要素之前的術語「至少」應理解為指該系列中之每一要素。熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗即確定本文所描述的本發明之具體實施例的許多等效物。本發明意欲涵蓋此類等效物。

在本說明書通篇及隨後的申請專利範圍中，除非上下文另有要求，否則詞語「包含(comprise)」及變化形式諸如「包含(comprises)」及「包含(comprising)」應理解為暗示包括一個所述整數或步驟或者一組整數或步驟，但不排除任何其他整數或步驟或者整數或步驟組。當在本文中使用時，術語「包含」可以用術語「含有」或「包括」取代，或有時當在本文中使用時，用術語「具有」取代。

當在本文中使用時，「由……組成」不包括所要求要素中未說明之任何要素、步驟或成分。當在本文中使用時，「基本上由……組成」不排除不會實質上影響技術方案之基本及新穎特徵之材料或步驟。每當本文中在本申請案之態樣或實施例之上下文中使用時，前述術語「包含」、「含有」、「包括」及「具有」中之任一個可以用術語「由……組成」或「基本上由……組成」替代以改變本發明之範圍。

如本文所使用，在多個所述要素之間的連接性術語「及/或」係理解為涵蓋個別及組合選擇兩種。舉例而言，當兩個要素藉由「及/或」連結時，第一個選擇係指第一要素之適用性，不含第二要素。第二個選擇係指第二要素之適用性，不含第一要素。第三個選擇係指第一要素與第二要素一起之適用性。此等選擇中之任一個應理解為在該含義之範圍內，且因此滿足如本文所使用之術語「及/或」之要求。該等選擇中多於一個之同時適用性亦應理解為在該含義之範圍內，且因此滿足術語「及/或」之要求。

除非另外規定，否則任何數值，諸如本文所描述之濃度或濃度範圍，應理解為在所有情況下以術語「約」修飾。因此，一個數值通常包括所述值±10%。舉例而言，1 mg/mL濃度包括0.9 mg/mL至1.1 mg/mL。同樣，1 mg/mL至10 mg/mL之濃度範圍包括0.9 mg/mL至11 mg/mL。除非上下文另外明確地指示，否則如本文所使用，使用的數字範圍明確地包括所有可能的子範圍及在該範圍內的所有個別數值，包括該等範圍內之整數及該等值之分數。

短語「序列一致性百分比(%)」或「%一致性」或「與……%一致」當參照胺基酸序列使用時描述兩個或兩個以上比對之胺基酸序列中匹配(「相配(hit))」的一致胺基酸之數量與構成該等胺基酸序列之總長度的胺基酸殘基之數量的比較。換言之，當比較兩個或兩個以上序列且對準達到最大對應性，使用此項技術中已知之序列比較演算法量測時，或當手動地比對並目視檢查時，使用比對，可以確定該等序列中相同胺基酸殘基之百分含量(例如在胺基酸序列全長內90%、91%、92%、93%、94%、95%、97%、98%、99%或100%一致性)。因此，供比較以確定序列一致性的序列可能因胺基酸之取代、添加或缺失而不同。適合用於比對蛋白質序列之程式係熟習此項技術者已知的。蛋白質序列之序列一致性百分比可以例如用諸如CLUSTALW、Clustal Omega、FASTA或BLAST之程式，例如使用NCBI BLAST演算法確定(Altschul SF等人(1997),Nucleic Acids Res . 25:3389-3402)。

如本文在向個體投與兩種或兩種以上療法或組分之情形中所使用的術語及短語「組合」、「與……組合」、「共遞送」及「與……一起投與」係指同時投與兩種或兩種以上療法或組分，諸如兩個載體，例如DNA質體，或免疫原性組合及佐劑。「同時投與」可以為至少在同一天內投與兩種組分。當兩種組分係「一起投與」或「組合投與」時，其可以在較短時間段內，諸如在24、20、16、12、8或4小時內或在1小時內以獨立組合物依序投與，或其可以單一組合物形式同時投與。使用術語「與……組合」並不限定向個體投與療法或組分之次序。舉例而言，第一療法或組分(例如編碼HBV抗原之第一DNA質體)可以在投與第二療法或組分(例如編碼HBV抗原之第二DNA質體)之前(例如5分鐘至一小時之前)、伴隨地或同時地，或之後(例如5分鐘至一小時之後)投與。在一些實施例中，第一療法或組分(例如編碼HBV抗原之第一DNA質體)及第二療法或組分(例如編碼HBV抗原之第二DNA質體)係以同一組合物投與。在其他實施例中，第一療法或組分(例如編碼HBV抗原之第一DNA質體)及第二療法或組分(例如編碼HBV抗原之第二DNA質體)係以獨立組合物投與。

如本文所使用，「非天然存在之」核酸或多肽係指自然界中不存在的核酸或多肽。「非天然存在之」核酸或多肽可以為經合成、處理、製造及/或以其他方式在實驗室及/或製造環境中操作的。非天然存在之核酸或多肽可以包含經處理、加工或操作而展現在處理之前天然存在之核酸或多肽中不存在之特性的天然存在之核酸或多肽。如本文所使用，「非天然存在之」核酸或多肽可以為自發現其之天然來源分離或分開的核酸或多肽，且其與在天然來源中與其關聯之序列不具有共價鍵。「非天然存在之」核酸或多肽可以以重組方式或其他方法，諸如化學合成製備。

如本文所使用，「個體」意謂將利用根據本申請案之一個實施例的方法治療或已利用該方法治療的任何動物，較佳為哺乳動物，最佳為人類。如本文所使用，術語「哺乳動物」涵蓋任何哺乳動物。哺乳動物之實例包括(但不限於)牛、馬、綿羊、豬、貓、狗、小鼠、大鼠、兔、天竺鼠、非人類靈長類動物(NHP)諸如猴或猿、人類等，更佳為人類。

如本文所使用，術語「可操作地連接」係指鍵聯或毗連，其中如此描述之組分係呈允許其以其預期方式發揮作用的關係。舉例而言，可操作地連接至所關注核酸序列之調控序列能夠引導該所關注核酸序列之轉錄，或可操作地連接至所關注胺基酸序列之信號序列能夠將該所關注胺基酸序列分泌或轉位至膜上。

為了幫助本申請案之讀者，說明書分成各種段落或部分，或針對本申請案之各種實施例。該等分離不應認為一個段落或部分或實施例之物質與另一段或部分或實施例之物質無關聯。相反，熟習此項技術者應理解，本說明書具有廣闊應用且涵蓋可以涵蓋之各種部分、段落及語句之所有組合。任何實施例之論述僅意欲為例示性的，且並不意欲表明本發明之範疇，包括申請專利範圍，侷限於此等實例。舉例而言，儘管本文所描述的本申請案之HBV載體(例如質體DNA或病毒載體)之實施例可以含有按特定次序佈置之特定組分，包括(但不限於)某些啟動子序列、強化子或調控序列、信號肽、HBV抗原編碼序列、聚腺苷酸化信號序列等，但一般熟習此項技術者應瞭解，本文所揭示之概念可以同等地應用於按可以在本申請案之HBV載體中使用的其他次序佈置之其他組分。本申請案涵蓋使用具有可以用於本申請案之HBV載體中之任何序列的呈任何組合形式之可應用組分中之任一種，無論是否明確地描述特定組合。

B 型肝炎病毒 ( HBV )

如本文所使用，「B型肝炎病毒」或「HBV」係指肝DNA病毒科之病毒。HBV係編碼四個開放閱讀框架及七種蛋白質的親肝性小(例如3.2 kb)DNA病毒。參見圖 1A 。HBV編碼之七種蛋白質包括小(S)、中等(M)及大(L)表面抗原(HBsAg)或包膜(Env)蛋白質、前核心蛋白、核心蛋白、病毒聚合酶(Pol)及HBx蛋白質。HBV表現三種表面抗原，或包膜蛋白，即L、M及S，其中S最小且L最大。M及L蛋白質中之額外結構域分別命名為前S2及前S1。核心蛋白係病毒核衣殼之次單元。Pol係合成病毒DNA(逆轉錄酶、核糖核酸酶H及引子)所需的，其出現在定位於受感染肝細胞之細胞質的核衣殼中。前核心蛋白係具有N末端信號肽之核心蛋白且在自受感染細胞分泌之前，在其N及C末端經歷蛋白水解加工為所謂的B型肝炎e抗原(HBeAg)。HBx蛋白質係共價閉合環狀DNA(cccDNA)高效轉錄所需的。HBx並非病毒結構蛋白。除核心及聚合酶共有mRNA外，HBV之所有病毒蛋白均具有其自身mRNA。除前核心蛋白之外，該等HBV病毒蛋白均不經歷轉譯後蛋白質水解加工。

HBV病毒粒子含有病毒包膜、核衣殼，及部分呈雙股之DNA基因組的單一複本。核衣殼包含120個核心蛋白二聚體且經內嵌有S、M及L病毒包膜或表面抗原蛋白質之衣殼膜覆蓋。在進入細胞之後，病毒去殼且與病毒聚合酶共價結合的含衣殼之鬆環DNA(rcDNA)遷移至核中。在該過程期間，核心蛋白磷酸化誘導結構變化，暴露出核定位信號，使得衣殼能夠與所謂的內輸蛋白(importin)相互作用。該等內輸蛋白介導核心蛋白與核孔複合物之結合，在該結合後，衣殼解離且聚合酶/rcDNA複合物釋放至核中。在核內，rcDNA變得去蛋白化(移除聚合酶)且經宿主DNA修復機構轉變成共價閉合環狀DNA(cccDNA)基因組，自該基因組，重疊之轉錄本編碼HBeAg、HBsAg、核心蛋白、病毒聚合酶及HBx蛋白質。核心蛋白、病毒聚合酶及前基因組RNA(pgRNA)在細胞質中締合並自組裝成不成熟的含pgRNA之衣殼粒子，該等衣殼粒子進一步轉化成為成熟rcDNA-衣殼且充當共同中間物，經包覆且以感染病毒粒子形式分泌，或轉運回到核中以補充及維持穩定cccDNA池。參見圖 1B 。

迄今為止，HBV基於包膜蛋白上存在之抗原性抗原決定基而分成四種血清型(adr、adw、ayr、ayw)，且基於病毒基因組之序列而分成八種基因型(A、B、C、D、E、F、G及H)。HBV基因型分佈於不同地理區域。舉例而言，亞洲最流行之基因型係基因型B及C。基因型D主要存在於非洲、中東及印度，而基因型A在北歐、撒哈拉沙漠以南非洲(sub-Saharan Africa)及西非較為普遍。

HBV 抗原

如本文所使用，術語「HBV抗原」、「HBV之抗原性多肽」、「HBV抗原性多肽」、「HBV抗原蛋白質」、「HBV免疫原性多肽」及「HBV免疫原」皆指能夠在個體中誘發針對HBV之免疫反應，例如體液及/或細胞介導之反應的多肽。HBV抗原可以為HBV多肽、其片段或抗原決定基，或多個HBV多肽、其部分或衍生物之組合。HBV抗原能夠在宿主中產生保護性免疫反應，例如誘發針對病毒性疾病或感染之免疫反應，及/或在個體中針對病毒性疾病或感染產生免疫(亦即，接種疫苗)，由此保護個體免受病毒性疾病或感染影響。舉例而言，HBV抗原可以包含來自來源於任何HBV基因型，例如基因型A、B、C、D、E、F、G及/或H之任何HBV蛋白質，諸如HBeAg、前核心蛋白、HBsAg(S、M或L蛋白質)、核心蛋白、病毒聚合酶或HBx蛋白質，或其組合的多肽或其免疫原性片段。

(1) HBV 核心抗原

如本文所使用，術語「HBV核心抗原」、「HBcAg」及「核心抗原」均係指能夠在個體中誘發針對HBV核心蛋白之免疫反應，例如體液及/或細胞介導之反應的HBV抗原。術語「核心」、「核心多肽」及「核心蛋白」均係指HBV病毒核心蛋白。全長核心抗原通常係183個胺基酸長度且包括組裝結構域(胺基酸1至149)及核酸結合結構域(胺基酸150至183)。該34個殘基之核酸結合結構域係前基因組RNA衣殼化所需的。此結構域亦用作核輸入信號。其包含17個精胺酸殘基且具有較高鹼性，與其功能相符。HBV核心蛋白在溶液中呈二聚體形式，且該等二聚體自組裝成二十面體衣殼。每個核心蛋白二聚體具有在任一側上側接一個α-螺旋結構域的四個α-螺旋束。不含該核酸結合結構域的截短之HBV核心蛋白亦能夠形成衣殼。

在本申請案之一個實施例中，HBV抗原係截短之HBV核心抗原。如本文所使用，「截短之HBV核心抗原」係指不含完整長度之HBV核心蛋白但能夠在個體中誘發針對HBV核心蛋白之免疫反應的HBV抗原。舉例而言，HBV核心抗原可以經修飾成使核心抗原中通常含有十七個精胺酸(R)殘基的帶大量正電荷(富含精胺酸)之C末端核酸結合結構域的一或多個胺基酸缺失。本申請案的截短之HBV核心抗原較佳為不包含HBV核心核輸入信號的C末端截短之HBV核心蛋白及/或已缺失C末端HBV核心核輸入信號的截短之HBV核心蛋白。在一個實施例中，截短之HBV核心抗原包含在C末端核酸結合結構域中之缺失，諸如缺失該C末端核酸結合結構域之1至34個胺基酸殘基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34個胺基酸殘基，較佳缺失全部34個胺基酸殘基。在一個較佳實施例中，截短之HBV核心抗原包含C末端核酸結合結構域中之缺失，較佳缺失全部34個胺基酸殘基。

本申請案之HBV核心抗原可以為來源於多種HBV基因型(例如基因型A、B、C、D、E、F、G及H)之共同序列。如本文所使用，「共同序列」意謂基於同源蛋白質之胺基酸序列比對，例如藉由比對(例如使用Clustal Omega)同源蛋白質之胺基酸序列所測定的人工胺基酸序列。其可以為基於來自至少100個天然HBV分離株之HBV抗原(例如核心、pol等)之序列計算的在序列比對中各位置處所發現的最常見胺基酸殘基之次序。共同序列可以為非天然存在的且不同於原生病毒序列。共同序列可以藉由使用多序列比對工具比對來自不同來源之多個HBV抗原序列，且在有變化之比對位置選擇最常見的胺基酸來設計。較佳地，HBV抗原之共同序列係來源於HBV基因型B、C及D。術語「共同抗原」用以指具有共同序列之抗原。

根據本申請案的例示性截短之HBV核心抗原不具有核酸結合功能，且能夠在哺乳動物中誘發針對至少兩種HBV基因型之免疫反應。較佳地，截短之HBV核心抗原能夠在哺乳動物中誘發針對至少HBV基因型B、C及D之T細胞反應。更佳地，截短之HBV核心抗原能夠在人類個體中誘發針對至少HBV基因型A、B、C及D之CD8 T細胞反應。

較佳地，本申請案之HBV核心抗原係共同抗原，較佳為來源於HBV基因型B、C及D之共同抗原，更佳為來源於HBV基因型B、C及D的截短之共同抗原。根據本申請案的例示性截短之HBV核心共同抗原由與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14至少90%一致，諸如與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致之胺基酸序列組成。SEQ ID NO: 2及SEQ ID NO: 14係來源於HBV基因型B、C及D之核心共同抗原。SEQ ID NO: 2及SEQ ID NO: 14缺失天然核心抗原中C末端帶大量正電(富含精胺酸)之核酸結合結構域的34個胺基酸。

在本申請案之一個特定實施例中，HBV核心抗原係由SEQ ID NO: 2之胺基酸序列組成的截短之HBV抗原。在另一特定實施例中，HBV核心抗原係由SEQ ID NO: 14之胺基酸序列組成的截短之HBV抗原。

(2) HBV 聚合酶抗原

如本文所使用，術語「HBV聚合酶抗原」、「HBV Pol抗原」或「HBV pol抗原」係指能夠在個體中誘發針對HBV聚合酶的免疫反應，例如體液及/或細胞介導之反應的HBV抗原。術語「聚合酶」、「聚合酶多肽」、「Pol」及「pol」均係指HBV病毒DNA聚合酶。HBV病毒DNA聚合酶具有四個結構域，自N末端至C末端，包括充當負股DNA合成之引子的末端蛋白質(TP)結構域；對於聚合酶功能不重要的間隔子；用於轉錄之逆轉錄酶(RT)結構域；以及核糖核酸酶H結構域。

在本申請案之一個實施例中，HBV抗原包含HBV Pol抗原，或其任何免疫原性片段或組合。HBV Pol抗原可以含有改善該抗原之免疫原性的其他修飾，諸如藉由將突變引入聚合酶及/或核糖核酸酶結構域之活性位點中以降低或基本上除去某些酶活性。

較佳地，本申請案之HBV Pol抗原不具有逆轉錄酶活性及核糖核酸酶H活性，且能夠在哺乳動物中誘發針對至少兩種HBV基因型之免疫反應。較佳地，HBV Pol抗原能夠在哺乳動物中發針對至少HBV基因型B、C及D之T細胞反應。更佳地，HBV Pol抗原能夠在人類個體中誘發針對至少HBV基因型A、B、C及D之CD8 T細胞反應。

因此，在一些實施例中，HBV Pol抗原係失活之Pol抗原。在一個實施例中，失活之HBV Pol抗原在聚合酶結構域之活性位點中包含一或多個胺基酸突變。在另一個實施例中，失活之HBV Pol抗原在核糖核酸酶H結構域之活性位點中包含一或多個胺基酸突變。在一個較佳實施例中，失活之HBV pol抗原在聚合酶結構域及核糖核酸酶H結構域兩者之活性位點中包含一或多個胺基酸突變。舉例而言，可以例如藉由用天冬醯胺殘基(N)置換一或多個天冬胺酸殘基(D)，消除或降低金屬配位功能，由此降低或基本上消除逆轉錄酶功能來使HBV pol抗原之聚合酶結構域中核苷酸/金屬離子結合所需之「YXDD」基元突變。作為「YXDD」基元突變之替代或除該突變之外，可以例如藉由用天冬醯胺殘基(N)置換一或多個天冬胺酸殘基(D)及/或用麩醯胺酸(Q)置換麩胺酸殘基(E)，由此降低或基本上消除核糖核酸酶H功能來使HBV pol抗原之核糖核酸酶H結構域中Mg^{2 +} 配位所需之「DEDD」基元突變。在一個特定實施例中，HBV pol抗原係藉由以下方式修飾：(1)使聚合酶結構域之「YXDD」基元中的天冬胺酸殘基(D)突變成天冬醯胺殘基(N)；以及(2)使核糖核酸酶H結構域之「DEDD」基元中的第一個天冬胺酸殘基(D)突變成天冬醯胺殘基(N)及使第一個麩胺酸殘基(E)突變成麩醯胺酸殘基(N)，由此降低或基本上消除pol抗原之逆轉錄酶及核糖核酸酶H功能。

在本申請案的一個較佳實施例中，HBV pol抗原係共同抗原，較佳為來源於HBV基因型B、C及D之共同抗原，更佳為來源於HBV基因型B、C及D的失活之共同抗原。根據本申請案的例示性HBV pol共同抗原包含與SEQ ID NO: 4至少90%一致，諸如與SEQ ID NO: 4至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳與SEQ ID NO: 4至少98%一致，諸如與SEQ ID NO: 4至少98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致的胺基酸序列。SEQ ID NO: 4係在聚合酶及核糖核酸酶H結構域之活性位點中包含四個突變的來源於HBV基因型B、C及D之pol共同抗原。詳言之，該四個突變包括聚合酶結構域之「YXDD」基元中的天冬胺酸殘基(D)突變成天冬醯胺殘基(N)；以及核糖核酸酶H結構域之「DEDD」基元中的第一個天冬胺酸殘基(D)突變成天冬醯胺殘基(N)及麩胺酸殘基(E)突變成麩醯胺酸殘基(Q)。

在本申請案之一個特定實施例中，HBV pol抗原包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。在本申請案之其他實施例中，HBV pol抗原由SEQ ID NO: 4之胺基酸序列組成。

(3) HBV 核心抗原與 HBV 聚合酶抗原之融合物

如本文所使用，術語「融合蛋白」或「融合物」係指具有至少兩個通常不存在於單一天然多肽中之多肽結構域的單一多肽鏈。

在本申請案之一個實施例中，HBV抗原包括包含截短之HBV核心抗原可操作地連接至HBV Pol抗原或HBV Pol抗原可操作地連接至截短之HBV核心抗原的融合蛋白，該連接較佳經由連接子進行。

如本文所使用，術語「連接子」係指充當分子橋以可操作地連接兩種不同分子的化合物或部分，其中該連接子之一部分可操作地連接至第一分子，且其中該連接子之另一部分可操作地連接至第二分子。舉例而言，在含有第一多肽及第二異源多肽之融合蛋白中，連接子主要用作該第一與第二多肽之間的間隔子。在一個實施例中，連接子係由經肽鍵連接在一起的胺基酸構成，較佳由經肽鍵連接的1至20個胺基酸構成，其中胺基酸係選自20種天然存在之胺基酸。在一個實施例中，該1至20個胺基酸係選自甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸及離胺酸。較佳地，連接子係由大量無空間位阻之胺基酸，諸如甘胺酸及丙胺酸構成。例示性連接子係聚甘胺酸，尤其是(Gly)₅ 、(Gly)₈ ；聚(Gly-Ala)及聚丙胺酸。如以下實例中所示的一種例示性適合連接子係(AlaGly)_n ，其中n係2至5之整數。

較佳地，本申請案之融合蛋白能夠在哺乳動物中誘發針對至少兩種HBV基因型之HBV核心及HBV Pol的免疫反應。較佳地，融合蛋白能夠在哺乳動物中誘發針對至少HBV基因型B、C及D之T細胞反應。更佳地，該融合蛋白能夠在人類個體中誘發針對至少HBV基因型A、B、C及D之CD8 T細胞反應。

在本申請案之一個實施例中，融合蛋白包含具有與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14至少90%一致，諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致之胺基酸序列的截短之HBV核心抗原；連接子；及具有與SEQ ID NO: 4至少90%一致，諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致之胺基酸序列的HBV Pol抗原。

在本申請案的一個較佳實施例中，融合蛋白包含由SEQ ID NO: 14之胺基酸序列組成之截短之HBV核心抗原；包含(AlaGly)_n 之連接子，其中n係2至5之整數；及具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的HBV Pol抗原。更佳地，根據本申請案之一個實施例的融合蛋白包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。

在本申請案之一個實施例中，融合蛋白進一步包含信號序列。較佳地，信號序列具有SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 19之胺基酸序列。更佳地，融合蛋白包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列。

聚核苷酸及載體

在另一通用態樣中，本申請案提供編碼根據本申請案之HBV抗原的非天然存在之核酸分子，及包含該非天然存在之核酸的載體。非天然存在之核酸分子可以包含編碼本申請案之HBV抗原的任何聚核苷酸序列，其可以根據本發明，使用此項技術中已知之方法製備。較佳地，聚核苷酸編碼本申請案之截短之HBV核心抗原及HBV聚合酶抗原中的至少一種。聚核苷酸可以呈藉由重組技術(例如選殖)獲得或合成製造(例如化學合成)之RNA形式或DNA形式。DNA可以為單股或雙股的，或者可以含有雙股及單股序列之部分。DNA可以例如包含基因組DNA、cDNA或其組合。聚核苷酸亦可為DNA/RNA雜合體。本申請案之聚核苷酸及載體可以用於製造重組蛋白、在宿主細胞中表現蛋白質或製造病毒粒子。較佳地，聚核苷酸係DNA。

在本申請案之一個實施例中，非天然存在之核酸分子包含編碼截短之HBV核心抗原的聚核苷酸，該截短之HBV核心抗原由與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14至少90%一致，諸如與SEQ ID NO: 2至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳地與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14有98%、99%或100%一致的胺基酸序列組成。在本申請案之一個特定實施例中，非天然存在之核酸分子編碼由SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14之胺基酸序列組成的截短之HBV核心抗原。

本申請案的編碼由SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14之胺基酸序列組成的截短之HBV核心抗原之聚核苷酸序列的實例包括(但不限於)與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15至少90%一致，諸如與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳地與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15有98%、99%或100%一致之聚核苷酸序列。編碼截短之HBV核心抗原的例示性非天然存在之核酸分子具有SEQ ID NO:1或15之聚核苷酸序列。

在本申請案之一個實施例中，非天然存在之核酸分子編碼HBV聚合酶抗原，該HBV聚合酶抗原包含與SEQ ID NO: 4至少90%一致，諸如與SEQ ID NO: 4至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳地與SEQ ID NO: 4達100%一致的胺基酸序列。在本申請案之一個特定實施例中，非天然存在之核酸分子編碼由SEQ ID NO: 4之胺基酸序列組成的HBV聚合酶抗原。

本申請案的編碼包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之HBV Pol抗原的聚核苷酸序列之實例包括(但不限於)與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16至少90%一致，諸如與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳地與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16有98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。編碼HBV pol抗原的例示性非天然存在之核酸分子具有SEQ ID NO:3或16之聚核苷酸序列。

在本申請案之另一實施例中，非天然存在之核酸分子編碼包含截短之HBV核心抗原可操作地連接至HBV Pol抗原或HBV Pol抗原可操作地連接至截短之HBV核心抗原的融合蛋白，該連接較佳經由連接子進行。在一個特定實施例中，本申請案之非天然存在之核酸分子編碼：截短之HBV核心抗原，該截短之HBV核心抗原由與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14至少90%一致，諸如與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳地與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14達100%一致，更佳與SEQ ID NO: 14達100%一致的胺基酸序列組成；連接子；以及HBV聚合酶抗原，該HBV聚合酶抗原包含與SEQ ID NO: 4至少90%一致，諸如與SEQ ID NO: 4至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳地與SEQ ID NO: 4有98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在本申請案之一個特定實施例中，非天然存在之核酸分子編碼融合蛋白，該融合蛋白包含由SEQ ID NO: 14之胺基酸序列組成的截短之HBV核心抗原；包含(AlaGly)_n 之連接子，其中n係2至5之整數；以及包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的HBV Pol抗原。在本申請案之一個特定實施例中，非天然存在之核酸分子編碼包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列的融合蛋白。

本申請案的編碼融合蛋白之聚核苷酸序列的實例包括(但不限於)與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15至少90%一致，諸如與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳地與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15有98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列可操作地連接至與SEQ ID NO: 22至少90%一致，諸如與SEQ ID NO: 22至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳地與SEQ ID NO: 22有98%、99%或100%一致的連接子編碼序列，該連接子編碼序列進一步可操作地連接至與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16至少90%一致，諸如與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳地與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16有98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。在本申請案之特定實施例中，非天然存在之核酸分子編碼融合蛋白，該融合蛋白包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15可操作地連接至SEQ ID NO: 22，SEQ ID NO: 22進一步可操作地連接至SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16。

本申請案亦係關於一種載體，其包含編碼HBV抗原的分離之聚核苷酸。如本文所使用，「載體」係用於將遺傳物質載運至另一細胞中的核酸分子，在該另一細胞中，其可以複製及/或表現。根據本發明，熟習此項技術者已知之任何載體均可以使用。載體之實例包括(但不限於)質體、病毒載體(噬菌體、動物病毒及植物病毒)、黏質體及人工染色體(例如YAC)。較佳地，載體係DNA質體。載體可以為DNA載體或RNA載體。一般熟習此項技術者可以根據本發明，經由標準重組技術構築本申請案之載體。

本申請案之載體可以為表現載體。如本文所使用，術語「表現載體」係指包含編碼能夠轉錄之RNA之核酸的任何類型之基因構築體。表現載體包括(但不限於)用於重組蛋白表現之載體，諸如DNA質體或病毒載體；及用於將核酸遞送至個體中以在該個體之組織中表現的載體，諸如DNA質體或病毒載體。熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計可取決於諸如待轉型宿主細胞之選擇、所需蛋白質之表現量等因素。

本申請案之載體可以含有多種調控序列。如本文所使用，術語「調控序列」係指允許、促成或調節核酸分子之功能調控，包括宿主細胞或生物體中核酸或其一種衍生物(亦即，mRNA)之複製、重複、轉錄、剪接、轉譯、穩定性及/或轉運的任何序列。在本發明的上下文中，此術語涵蓋啟動子、強化子及其他表現控制元件(例如聚腺苷酸化信號及影響mRNA穩定性之元件)。

在本申請案之一些實施例中，載體係非病毒載體。非病毒載體之實例包括(但不限於)DNA質體、細菌人工染色體、酵母人工染色體、噬菌體等。非病毒載體之實例包括(但不限於) RNA複製子、mRNA複製子、經修飾之mRNA複製子或自擴增mRNA、閉合線性脫氧核糖核酸，例如線性共價閉合DNA，例如線性共價閉合雙股DNA分子。較佳地，非病毒載體係DNA質體。「DNA質體」與「DNA質體載體」、「質體DNA」或「質體DNA載體」可互換使用，意思指能夠在適合宿主細胞中自主複製的大體上呈圓形的雙股DNA序列。用於表現編碼之聚核苷酸的DNA質體通常包含複製起點、多選殖位點及可選擇標記物，該可選擇標記物例如可以為抗生素抗性基因。可以使用的適合DNA質體之實例包括(但不限於)用於熟知表現系統(包括原核及真核系統兩種)中的可商購之表現載體，諸如pSE420(Invitrogen, San Diego, Calif.)，其可以用於在大腸桿菌中產生及/或表現蛋白質；pYES2(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)，其可以用於在酵母菌株釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )中產生及/或表現；MAXBAC^® 完全桿狀病毒表現系統(Thermo Fisher Scientific)，其可以用於在昆蟲細胞中產生及/或表現；pcDNA^TM 或pcDNA3^TM (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific)，其可以用於在哺乳動物細胞中高程度組成性蛋白質表現；以及pVAX或pVAX-1(Life, Thermo Fisher Scientific)，其可以用於在大部分哺乳動物細胞中高程度短暫表現所關注蛋白質。任何可商購之DNA質體的主鏈均可藉由使用常規技術及容易得到的起始物質進行修飾以使宿主細胞中蛋白質之表現達到最佳，以便逆轉某些元件(例如複製起點及/或抗生素抗性卡匣)之取向，置換質體內源性啟動子(例如抗生素抗性卡匣中之啟動子)，及/或置換編碼轉錄蛋白質之聚核苷酸序列(例如抗生素抗性基因之編碼序列)。(參見例如，Sambrook等人, Molecular Cloning a Laboratory Manual, 第二版, Cold Spring Harbor Press (1989))。

較佳地，DNA質體係適於在哺乳動物宿主細胞中表現蛋白質的表現載體。適於在哺乳動物宿主細胞中表現蛋白質的表現載體包括(但不限於)pcDNA^TM 、pcDNA3^TM 、pVAX、pVAX-1、ADVAX、NTC8454等。較佳地，表現載體係基於pVAX-1，其可以進一步經修飾以使哺乳動物細胞中蛋白質之表現達到最佳。pVAX-1係DNA疫苗中之常用質體，且含有較強的人類即刻早期巨細胞病毒(CMV-IE)啟動子，隨後為源於牛生長激素(bGH)之聚腺苷酸化序列(pA)。pVAX-1還含有pUC複製起點及由允許細菌質體繁殖之小原核生物啟動子驅動的卡那黴素抗性基因。

本申請案之載體亦可為病毒載體。一般而言，病毒載體係載運經修飾病毒DNA或RNA的經遺傳工程改造之病毒，該病毒DNA或RNA已呈現非感染性，但仍含有病毒啟動子及轉殖基因，由此允許經由病毒啟動子轉譯轉殖基因。由於病毒載體常常缺乏感染性序列，故其需要輔助病毒或包裝株來進行大規模轉染。可以使用的病毒載體之實例包括(但不限於)腺病毒載體、腺相關病毒載體、痘病毒載體、腸病毒載體、委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan Equine Encephalitis virus)載體、勝利基森林病毒(Semliki Forest Virus)載體、菸草鑲嵌病毒載體、慢病毒載體、沙粒狀病毒(arenavirus)之病毒載體、複製缺陷型沙粒狀病毒之病毒載體或有複製能力的沙粒狀病毒之病毒載體、二片段或三片段沙粒狀病毒、感染性沙粒狀病毒之病毒載體、包含沙粒狀病毒基因組區段且其中該基因組區段之一個開放閱讀框架缺失或功能失活(且經編碼如本文所描述之HBV抗原之核酸置換)的核酸、沙粒狀病毒諸如淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)，例如純系13病毒株或MP病毒株，以及沙粒狀病毒諸如胡寧病毒(Junin virus)，例如Candid #1病毒株等。該載體亦可為非病毒載體。

較佳地，病毒載體係腺病毒載體，例如重組腺病毒載體。重組腺病毒載體可以例如來源於人類腺病毒(HAdV或AdHu)，或猴類腺病毒，諸如黑猩猩或大猩猩腺病毒(ChAd、AdCh或SAdV)或恆河猴腺病毒(rhAd)。較佳地，腺病毒載體係重組人類腺病毒載體，例如重組人類腺病毒血清型26，或重組人類腺病毒血清型5、4、35、7、48中之任一種等。在其他實施例中，腺病毒載體係rhAd載體，例如rhAd51、rhAd52或rhAd53。可用於本申請案中之重組病毒載體可以根據本發明，使用此項技術中已知之方法製備。舉例而言，考慮到遺傳密碼之簡併性，可以設計出編碼相同多肽之若干種核酸序列。編碼本申請案之HBV抗原的聚核苷酸可以視情況經密碼子優化，以確保在宿主細胞(例如細菌或哺乳動物細胞)中適當表現。密碼子優化係此項技術中廣泛應用之技術，且根據本發明，用於獲得經密碼子優化之聚核苷酸的方法將為熟習此項技術者所熟知。

本申請案之載體，例如DNA質體或病毒載體(特定言之，腺病毒載體)可以包含任何調控元件以產生該載體之習知功能，包括(但不限於)由該載體之聚核苷酸序列編碼的HBV抗原之複製及表現。調控元件包括(但不限於)啟動子、強化子、聚腺苷酸化信號、轉譯終止密碼子、核糖體結合元件、轉錄終止子、選擇標記物、複製起點等。載體可以包含一或多個表現卡匣。「表現卡匣」係載體中引導細胞機構製備RNA及蛋白質的部分。表現卡匣通常包含三種組分：啟動子序列、開放閱讀框架，及視情況包含聚腺苷酸化信號之3'非轉譯區域(UTR)。開放閱讀框架(ORF)係含有所關注蛋白質(例如HBV抗原)的自起始密碼子至終止密碼子之編碼序列的閱讀框架。表現卡匣之調控元件可以可操作地連接至編碼所關注HBV抗原之聚核苷酸序列。如本文所使用，術語「可操作地連接」係以最廣泛合理的內容解釋，且指依功能關係連接聚核苷酸元件。當聚核苷酸之放置與另一聚核苷酸具有功能關係時，其係「可操作地連接」。舉例而言，若啟動子影響編碼序列之轉錄，則其係可操作地連接至該編碼序列。適用於本文所描述之表現卡匣中的任何組件可以任何組合形式且按任何次序使用以製備本申請案之載體。

載體可以包含啟動子序列，較佳地在表現卡匣內包含啟動子序列，用以控制所關注HBV抗原之表現。術語「啟動子」係以習知意義使用，且指啟動該可操作地連接之核苷酸序列之轉錄的核苷酸序列。啟動子係與其轉錄之核苷酸序列位於相同股上，且鄰近該核苷酸序列。啟動子可以為組成性、誘導性或阻遏性。啟動子可以為天然存在或合成性。啟動子可以來源於包括病毒、細菌、真菌、植物、昆蟲及動物之來源。啟動子可以為同源啟動子(亦即，來源於與載體相同之基因來源)或異源啟動子(亦即，來源於不同載體或基因來源)。舉例而言，若欲採用之載體係DNA質體，則啟動子可以對於質體為內源性(同源)或來源於其他來源(異源)。較佳地，該啟動子係位於表現卡匣內編碼HBV抗原之聚核苷酸的上游。

可以使用的啟動子之實例包括(但不限於)來自猴病毒40(SV40)之啟動子、小鼠乳癌病毒(MMTV)啟動子、人類免疫缺陷病毒(HIV)啟動子諸如牛免疫缺陷病毒(BIV)長末端重複序列(LTR)啟動子、莫洛尼病毒(Moloney virus)啟動子、禽類白血病病毒(ALV)啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子諸如CMV即刻早期啟動子(CMV-IE)、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus，EBV)啟動子，或勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)啟動子。啟動子亦可為來自人類基因，諸如人類肌動蛋白、人類肌凝蛋白、人類血紅蛋白、人類肌肉肌酸或人類金屬硫蛋白之啟動子。啟動子亦可為天然或合成的組織特異性啟動子，諸如肌肉或皮膚特異性啟動子。

較佳地，啟動子係強真核啟動子，較佳地為巨細胞病毒即刻早期(CMV-IE)啟動子。例示性CMV-IE啟動子之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 17中。

載體可以包含使表現之轉錄物穩定，促進RNA轉錄物之核輸出及/或改善轉錄-轉譯偶聯之另外的聚核苷酸序列。此類序列之實例包括聚腺苷酸化信號及強化子序列。聚腺苷酸化信號通常位於載體之表現卡匣內所關注蛋白質(例如HBV抗原)之編碼序列的下游。強化子序列係當經轉錄因子結合時促進相關聯之基因之轉錄的調控性DNA序列。強化子序列較佳在載體之表現卡匣內位於編碼HBV抗原之聚核苷酸序列的上游，但在啟動子序列的下游。

根據本發明，熟習此項技術者已知之任何聚腺苷酸化信號均可使用。舉例而言，聚腺苷酸化信號可以為SV40聚腺苷酸化信號(例如SEQ ID NO: 24)、LTR聚腺苷酸化信號、牛生長激素(bGH)聚腺苷酸化信號、人生長激素(hGH)聚腺苷酸化信號或人類β-血球蛋白聚腺苷酸化信號。較佳地，聚腺苷酸化信號係牛生長激素(bGH)聚腺苷酸化信號或SV40聚腺苷酸化信號。例示性bGH聚腺苷酸化信號之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO: 11中。例示性SV40聚腺苷酸化信號之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO: 24中。

根據本發明，熟習此項技術者已知之任何強化子序列均可使用。舉例而言，強化子序列可以為人類肌動蛋白、人類肌凝蛋白、人類血紅蛋白、人類肌肉肌酸，或病毒強化子，諸如來自CMV、HA、RSV或EBV之強化子。特定強化子之實例包括(但不限於)土拔鼠(Woodchuck) HBV轉錄後調控元件(WPRE)、來源於人類載脂蛋白A1前驅體(ApoAI)之內含子/外顯子序列、1型人類T細胞白血病病毒(HTLV-1)長末端重複序列(LTR)之非轉譯R-U5結構域、剪接強化子、合成兔β-血球蛋白內含子或其任何組合。較佳地，強化子序列係HTLV-1 LTR之非轉譯R-U5結構域、兔β-血球蛋白內含子及剪接強化子三個連續元件構成的複合序列，在本文中稱作「三強化子序列」。例示性三強化子序列之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO: 8中。另一例示性強化子序列係SEQ ID NO: 23中顯示之ApoAI基因片段。

載體可以包含編碼信號肽序列之聚核苷酸序列。較佳地，編碼信號肽序列之聚核苷酸序列係位於編碼HBV抗原之聚核苷酸序列的上游。信號肽通常引導蛋白質之定位，促進產生蛋白質之細胞分泌蛋白質，及/或改善抗原表現及交叉呈現至抗原呈現細胞。信號肽當自載體表現時可以存在於HBV抗原之N末端，但例如在自細胞分泌時，經信號肽酶裂解。信號肽已裂解的經表現蛋白質通常稱為「成熟蛋白」。根據本發明，此項技術中已知之任何信號肽均可使用。舉例而言，信號肽可以為胱抑素S信號肽；免疫球蛋白(Ig)分泌信號，諸如Ig重鏈γ信號肽SPIgG或Ig重鏈ε信號肽SPIgE。

較佳地，信號肽序列係胱抑素S信號肽。胱抑素S信號肽之例示性核酸及胺基酸序列分別顯示於SEQ ID NO: 5及6中。免疫球蛋白分泌信號之例示性核酸及胺基酸序列分別顯示於SEQ ID NO: 18及19中。

載體，諸如DNA質體亦可包括細菌複製起點及用於在細菌細胞，例如大腸桿菌中選擇及維持質體的抗生素抗性表現卡匣。細菌複製起點及抗生素抗性卡匣可以與編碼HBV抗原之表現卡匣相同之取向或以相反(逆向)取向定位於載體中。複製起點(ORI)係這樣一種序列，在該序列處，複製起始，使得質體能夠在細胞內複製及存活。適用於本申請案中之ORI的實例包括(但不限於)ColE1、pMB1、pUC、pSC101、R6K及15A，較佳為pUC。pUC ORI之例示性核苷酸序列顯示於SEQ ID NO:10中。

用於在細菌細胞中選擇及維持之表現卡匣通常包括可操作地連接至抗生素抗性基因之啟動子序列。較佳地，可操作地連接至抗生素抗性基因之啟動子序列不同於可操作地連接至編碼所關注蛋白質，例如HBV抗原之聚核苷酸序列的啟動子序列。抗生素抗性基因可以經密碼子優化，且抗生素抗性基因之序列組成通常針對細菌，例如大腸桿菌之密碼子使用進行調整。根據本發明，熟習此項技術者已知之任何抗生素抗性基因均可使用，包括(但不限於)卡那黴素抗性基因(Kan^r )、安比西林(ampicillin)抗性基因(Amp^r )及四環素抗性基因(Tet^r )，以及賦予對氯黴素(chloramphenicol)、博萊黴素(bleomycin)、大觀黴素(spectinomycin)、卡本西林(carbenicillin)等之抗性的基因。

較佳地，載體抗生素表現卡匣中之抗生素抗性基因係卡那黴素抗性基因(Kan^r )。Kan^r 基因之序列顯示於SEQ ID NO: 13中。較佳地，Kan^r 基因經密碼子優化。經密碼子優化之Kan^r 基因的例示性核酸序列顯示於SEQ ID NO: 12中。Kan^r 可以可操作地連接至其天然啟動子，或Kan^r 基因可以連接至異源啟動子。在一個特定實施例中，Kan^r 基因可操作地連接至安比西林抗性基因(Amp^r )啟動子，稱為bla啟動子。bla啟動子之例示性核苷酸序列顯示於SEQ ID NO: 9中。

在本申請案之一個特定實施例中，載體係DNA質體，其包含表現卡匣，該表現卡匣包括編碼選自由以下組成之群之HBV抗原中之至少一種的聚核苷酸：包含與SEQ ID NO: 4至少98%一致，諸如與SEQ ID NO: 4至少98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致之胺基酸序列的HBV pol抗原，及由SEQ ID NO: 2之胺基酸序列組成的截短之HBV核心抗原；可操作地連接至該編碼HBV抗原之聚核苷酸的上游序列，自5'端至3'端，其包含啟動子序列(較佳為SEQ ID NO: 7之CMV啟動子序列)、強化子序列(較佳為SEQ ID NO: 8之三強化子序列)及編碼信號肽序列(較佳為具有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的胱抑素S信號肽)之聚核苷酸序列；以及可操作地連接至該編碼HBV抗原之聚核苷酸的下游序列，其包含聚腺苷酸化信號，較佳為SEQ ID NO: 11之bGH聚腺苷酸化信號。此類載體進一步包含抗生素抗性表現卡匣，其包括編碼抗生素抗性基因，較佳地Kan^r 基因，更佳與SEQ ID NO: 12至少90%一致，諸如與SEQ ID NO: 12至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳與SEQ ID NO: 12達100%一致的經密碼子優化之Kan^r 基因的聚核苷酸可操作地連接至SEQ ID NO: 9之Amp^r (bla)啟動子，該啟動子在該編碼抗生素抗性基因之聚核苷酸的上游且可操作地連接至該聚核苷酸；以及複製起點，較佳為SEQ ID NO:10之pUC ori。較佳地，抗生素抗性卡匣及複製起點相對於HBV抗原表現卡匣以逆向取向存在於質體中。包含上述特徵的例示性DNA質體顯示於圖 2A 及 2B 中。

在本申請案之另一特定實施例中，載體係病毒載體，較佳為腺病毒載體，更佳為Ad26或Ad35載體，其包含表現卡匣，該表現卡匣包括編碼選自由以下組成之群之HBV抗原中之至少一種的聚核苷酸：包含與SEQ ID NO: 4至少98%一致，諸如與SEQ ID NO: 4至少98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致之胺基酸序列的HBV pol抗原，及由SEQ ID NO: 14之胺基酸序列組成的截短之HBV核心抗原；可操作地連接至該編碼HBV抗原之聚核苷酸的上游序列，自5'端至3'端，其包含啟動子序列(較佳為SEQ ID NO: 17之CMV啟動子序列)、強化子序列(較佳為SEQ ID NO: 23之ApoAI基因片段序列)及編碼信號肽序列(較佳為具有SEQ ID NO: 19之胺基酸序列的免疫球蛋白分泌信號)之聚核苷酸序列；以及可操作地連接至該編碼HBV抗原之聚核苷酸的下游序列，其包含聚腺苷酸化信號，較佳為SEQ ID NO: 24之SV40聚腺苷酸化信號。

在本申請案之一個實施例中，諸如質體DNA載體或病毒載體(較佳為腺病毒載體，更佳為Ad26或Ad35載體)之載體編碼具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的HBV Pol抗原。較佳地，該載體包含HBV Pol抗原之編碼序列，其與SEQ ID NO: 3之聚核苷酸序列至少90%一致，諸如與SEQ ID NO: 3有90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳與SEQ ID NO: 3達100%一致。

在本申請案之一個實施例中，諸如質體DNA載體或病毒載體(較佳為腺病毒載體，更佳為Ad26或Ad35載體)之載體編碼由SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14之胺基酸序列組成的截短之HBV核心抗原。較佳地，該載體包含截短之HBV核心抗原的編碼序列，其與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15之聚核苷酸序列至少90%一致，諸如與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15有90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15達100%一致。

在本申請案之又一實施例中，諸如質體DNA載體或病毒載體(較佳為腺病毒載體，更佳為Ad26或Ad35載體)之載體編碼融合蛋白，其包含具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的HBV Pol抗原及由SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14之胺基酸序列組成的截短之HBV核心抗原。較佳地，該載體包含該融合物之編碼序列，其含有與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15至少90%一致，諸如與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15，更佳與SEQ ID NO: 15有98%、99%或100%一致的截短之HBV核心抗原之編碼序列，其係可操作地連接至與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16至少90%一致，諸如與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16，更佳與SEQ ID NO: 16有98%、99%或100%一致的HBV Pol抗原之編碼序列。較佳地，該截短之HBV核心抗原之編碼序列係經由與SEQ ID NO: 22至少90%一致，諸如與SEQ ID NO: 22至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳與SEQ ID NO: 22有98%、99%或100%一致之連接子編碼序列，可操作地連接至HBV Pol抗原之編碼序列。在本申請案之特定實施例中，載體包含具有SEQ ID NO: 15之融合物之編碼序列，其可操作地連接至SEQ ID NO: 22，其進一步可操作地連接至SEQ ID NO: 16。

編碼本申請案之HBV抗原的聚核苷酸及表現載體可以根據本發明，利用此項技術中已知之任何方法製備。舉例而言，可以使用熟習此項技術者熟知的標準分子生物學技術，例如聚合酶鏈反應(PCR)等將編碼HBV抗原之聚核苷酸引入或「選殖」至表現載體中。

細胞、多肽及抗體

本申請案亦提供包含本文所描述之聚核苷酸及載體中之任一種的細胞，較佳為分離之細胞。該等細胞可以例如用於產生重組蛋白或用於產生病毒粒子。

因此，本申請案之實施例亦係關於製備本申請案之HBV抗原的方法。該方法包括用包含可操作地連接至啟動子的編碼本申請案之HBV抗原之聚核苷酸的表現載體轉染宿主細胞，使經轉染之細胞在適於表現HBV抗原之條件下生長，及視情況純化或分離該細胞中表現之HBV抗原。HBV抗原可以藉由此項技術中已知之任何方法，包括親和層析法、尺寸排阻層析法等自細胞分離或收集。根據本發明，用於表現重組蛋白之技術將為一般熟習此項技術者熟知的。亦可在不純化或分離所表現之蛋白質的情況下，例如藉由分析用編碼HBV抗原之表現載體轉染且在適於表現HBV抗原之條件下生長之細胞的上清液來研究所表現之HBV抗原。

因此，亦提供包含與SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 4之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列的非天然存在或重組之多肽。如上下文所描述，編碼該等序列的分離之核酸分子、包含該等序列可操作地連接至啟動子之載體及包含該多肽、聚核苷酸或載體之組合物亦涵蓋在本申請案內。

在本申請案之一個實施例中，重組多肽包含與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列至少90%一致，諸如與SEQ ID NO: 2有90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致的胺基酸序列。較佳地，非天然存在或重組之多肽由SEQ ID NO: 2組成。

在本申請案之另一實施例中，非天然存在或重組之多肽包含與SEQ ID NO: 4之胺基酸序列至少90%一致，諸如與SEQ ID NO: 4有90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致的胺基酸序列。較佳地，非天然存在或重組之多肽包含SEQ ID NO: 4。

在本申請案之另一實施例中，非天然存在或重組之多肽包含與SEQ ID NO: 14之胺基酸序列至少90%一致，諸如與SEQ ID NO: 14有90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致的胺基酸序列。較佳地，非天然存在或重組之多肽由SEQ ID NO: 14組成。

亦提供特異性結合至本申請案之非天然存在之多肽的抗體或其抗原結合片段。在本申請案之一個實施例中，對本申請案之非天然存在之HBV抗原具有特異性的抗體不特異性結合至另一HBV抗原。舉例而言，特異性結合至具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之HBV Pol抗原的本申請案之抗體將不會特異性結合至不具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的HBV Pol抗原。

如本文所使用，術語「抗體」包括多株抗體、單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、Fv抗體、Fab抗體及F(ab')2抗體；雙功能混合物(例如Lanzavecchia等人, Eur. J. Immunol. 17:105, 1987)、單鏈抗體(Huston等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879, 1988；Bird等人, Science 242:423, 1988)；以及具有改變之恆定區的抗體(例如美國專利第5,624,821號)。

如本文所使用，「特異性結合至」抗原的抗體係指以1×10^{− 7} M或更小之KD結合至抗原的抗體。較佳地，「特異性結合至」抗原之抗體以1×10^{− 8} M或更小，更佳5×10^{− 9} M或更小、1×10^{− 9} M或更小、5×10^{− 10} M或更小，或1×10^{− 10} M或更小之KD結合至抗原。術語「KD」係指解離常數，其係由Kd與Ka之比率(亦即，Kd/Ka)得到且以莫耳濃度(M)表示。抗體之KD值可以根據本發明，使用此項技術中已知之方法測定。舉例而言，抗體之KD可以藉由使用表面電漿子共振，諸如藉由使用生物感測器系統，例如Biacore®系統，或藉由使用生物膜層干涉測量術，諸如Octet RED96系統測定。

抗體KD值越小，則該抗體結合至靶抗原之親和力越高。

組合物、免疫原性組合及疫苗

本申請案亦係關於包含根據本申請案之一或多種HBV抗原、編碼一或多種HBV抗原之聚核苷酸及/或載體的組合物、免疫原性組合，更特定言之套組，及疫苗。本文所描述的本申請案之HBV抗原、聚核苷酸(包括RNA及DNA)及/或載體中之任一種均可用於本申請案之組合物、免疫原性組合或套組，及疫苗中

本申請案提供包含編碼由與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14至少90%一致之胺基酸序列組成的截短之HBV核心抗原，或包含與SEQ ID NO: 4至少90%一致之胺基酸序列之HBV聚合酶抗原的分離或非天然存在之核酸分子(DNA或RNA)的組合物，包含該分離或非天然存在之核酸分子的載體，及/或由該分離或非天然存在之核酸分子編碼的分離或非天然存在之多肽。

在本申請案之一個實施例中，組合物包含編碼截短之HBV核心抗原的分離或非天然存在之核酸分子(DNA或RNA)，該截短之HBV核心抗原由與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14至少90%一致，較佳與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14達100%一致之胺基酸序列組成。

在本申請案之一個實施例中，組合物包含編碼HBV Pol抗原的分離或非天然存在之核酸分子(DNA或RNA)，該HBV Pol抗原包含與SEQ ID NO: 4至少90%一致，較佳與SEQ ID NO: 4達100%一致之胺基酸序列。

在本申請案之一個實施例中，組合物包括：含編碼截短之HBV核心抗原之聚核苷酸序列的分離或非天然存在之核酸分子(DNA或RNA)，該截短之HBV核心抗原由與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14至少90%一致，較佳與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14達100%一致之胺基酸序列組成；以及含編碼HBV Pol抗原之聚核苷酸序列的分離或非天然存在之核酸分子(DNA或RNA)，該HBV Pol抗原包含與SEQ ID NO: 4至少90%一致，較佳與SEQ ID NO: 4達100%一致之胺基酸序列。截短之HBV核心抗原及HBV Pol抗原之編碼序列可以存在於同一分離或非天然存在之核酸分子(DNA或RNA)中，或兩個不同的分離或非天然存在之核酸分子(DNA或RNA)中。

在本申請案之一個實施例中，組合物包括含編碼截短之HBV核心抗原之聚核苷酸的載體，較佳地DNA質體或病毒載體(諸如腺病毒載體)，該截短之HBV核心抗原由與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14至少90%一致，較佳與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14達100%一致之胺基酸序列組成。

在本申請案之一個實施例中，組合物包括含編碼HBV Pol抗原之聚核苷酸的載體，較佳地DNA質體或病毒載體(諸如腺病毒載體)，該HBV Pol抗原包含與SEQ ID NO: 4至少90%一致，較佳與SEQ ID NO: 4達100%一致之胺基酸序列。

在本申請案之一個實施例中，組合物包括：含編碼截短之HBV核心抗原之聚核苷酸的載體，較佳地DNA質體或病毒載體(諸如腺病毒載體)，該截短之HBV核心抗原由與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14至少90%一致，較佳與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14達100%一致之胺基酸序列組成；以及含編碼HBV Pol抗原之聚核苷酸的載體，較佳地DNA質體或病毒載體(諸如腺病毒載體)，該HBV Pol抗原包含與SEQ ID NO: 4至少90%一致，較佳與SEQ ID NO: 4達100%一致之胺基酸序列。包含截短之HBV核心抗原之編碼序列的載體及包含HBV Pol抗原之編碼序列的載體可以為相同載體，或兩種不同的載體。

在本申請案之一個實施例中，組合物包括含編碼融合蛋白之聚核苷酸的載體，較佳地DNA質體或病毒載體(諸如腺病毒載體)，該融合蛋白包含由與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14至少90%一致，較佳與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14達100%一致之胺基酸序列組成的截短之HBV核心抗原可操作地連接至包含與SEQ ID NO: 4至少90%一致，較佳與SEQ ID NO: 4達100%一致之胺基酸序列的HBV Pol抗原，或該HBV Pol抗原可操作地連接至該截短之HBV核心抗原。較佳地，該融合蛋白進一步包含將截短之HBV核心抗原可操作地連接至HBV Pol抗原或將HBV Pol抗原可操作地連接至截短之HBV核心抗原的連接子。較佳地，該連接子具有胺基酸序列(AlaGly)_n ，其中n係2至5之整數。

在本申請案之一個實施例中，組合物包含由與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14至少90%一致，較佳與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14達100%一致之胺基酸序列組成的分離或非天然存在之截短之HBV核心抗原。

在本申請案之一個實施例中，組合物包括含與SEQ ID NO: 4至少90%一致，較佳與SEQ ID NO: 4達100%一致之胺基酸序列的分離或非天然存在之HBV Pol抗原。

在本申請案之一個實施例中，組合物包含由與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14至少90%一致，較佳與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14達100%一致之胺基酸序列組成的分離或非天然存在之截短之HBV核心抗原；以及包含與SEQ ID NO: 4至少90%一致，較佳與SEQ ID NO: 4達100%一致之胺基酸序列的分離或非天然存在之HBV Pol抗原。

在本申請案之一個實施例中，組合物包含分離或非天然存在之融合蛋白，該融合蛋白包含由與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14至少90%一致，較佳與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14達100%一致之胺基酸序列組成的截短之HBV核心抗原可操作地連接至包含與SEQ ID NO: 4至少90%一致，較佳與SEQ ID NO: 4達100%一致之胺基酸序列的HBV Pol抗原，或該HBV Pol抗原可操作地連接至該截短之HBV核心抗原。較佳地，該融合蛋白進一步包含將截短之HBV核心抗原可操作地連接至HBV Pol抗原或將HBV Pol抗原可操作地連接至截短之HBV核心抗原的連接子。較佳地，該連接子具有胺基酸序列(AlaGly)_n ，其中n係2至5之整數。

本申請案亦係關於免疫原性組合或套組，其包含表現根據本申請案之實施例之截短之HBV核心抗原及HBV pol抗原的聚核苷酸。編碼本文所描述的本申請案之HBV核心及pol抗原之任何聚核苷酸及/或載體均可用於本申請案之免疫原性組合或套組中。

根據本申請案之實施例，疫苗組合或套組包含：
(a) 包含編碼HBV聚合酶抗原之第一聚核苷酸的第一非天然存在之核酸分子，該HBV聚合酶抗原具有與SEQ ID NO: 4至少98%一致的胺基酸序列，其中該HBV聚合酶抗原不具有逆轉錄酶活性及核糖核酸酶H活性；
(b) 包含編碼截短之HBV核心抗原之第二聚核苷酸的第二非天然存在之核酸分子，該截短之HBV核心抗原由SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14之胺基酸序列組成；以及
(c) 醫藥學上可接受之載劑，
其中該第一非天然存在之核酸分子及該第二非天然存在之核酸分子係存在於同一非天然存在之核酸分子中或兩個不同的非天然存在之核酸分子中。

根據本申請案之實施例，疫苗組合或套組中之聚核苷酸可以連接或分開，由此使自此類聚核苷酸表現之HBV抗原融合在一起或作為獨立蛋白質產生，無論自相同抑或不同聚核苷酸表現。在一個實施例中，第一聚核苷酸及第二聚核苷酸係存在於獨立載體，例如DNA質體或病毒載體中，以同一組合物或獨立組合物形式組合使用，由此使所表現之蛋白質亦為獨立蛋白質，但組合使用。在另一個實施例中，由第一聚核苷酸及第二聚核苷酸編碼的HBV抗原可以由同一載體表現，由此產生HBV核心-pol融合抗原。視情況，核心及pol抗原可以藉由短連接子接合或融合在一起。或者，由第一聚核苷酸及第二聚核苷酸編碼的HBV抗原可以使用在核心與pol抗原編碼序列之間的核糖體滑移位點(ribosomal slippage site) (又稱為順式水解酶位點)，獨立地由單一載體表現。此策略產生雙順反子表現載體，其中個別核心及pol抗原係由單一mRNA轉錄物產生。取決於mRNA轉錄物上編碼序列之次序，由此類雙順反子表現載體產生之核心及pol抗原可以具有另外的N或C末端殘基。可用於此目的的核糖體滑移位點之實例包括(但不限於)來自***病毒(FMDV)之FA2滑移位點。另一種可能係由第一聚核苷酸及第二聚核苷酸編碼之HBV抗原可以獨立地由兩個獨立載體表現，一個載體編碼HBV核心抗原且一個編碼HBV pol抗原。

在一個較佳實施例中，第一聚核苷酸及第二聚核苷酸係存在於獨立載體，例如DNA質體或病毒載體中。較佳地，該等獨立載體係存在於同一組合物中。

根據本申請案之較佳實施例，免疫原性組合或套組包含存在於第一載體中之第一聚核苷酸及存在於第二載體中之第二聚核苷酸。第一載體與第二載體可以相同或不同。較佳地，該等載體係DNA質體。

在本申請案之一個特定實施例中，免疫原性組合或套組包括：含編碼截短之HBV核心抗原之聚核苷酸的第一載體，該截短之HBV核心抗原由與SEQ ID NO: 2至少90%一致，較佳與SEQ ID NO: 2達100%一致之胺基酸序列組成；以及含編碼HBV聚合酶抗原之聚核苷酸的第二載體，該HBV聚合酶抗原包含與SEQ ID NO: 4至少98%一致，較佳與SEQ ID NO: 4達100%一致之胺基酸序列。

在本申請案之一個特定實施例中，第一載體係第一DNA質體且第二載體係第二DNA質體。該第一DNA質體及該第二DNA質體各自包含複製起點，較佳為SEQ ID NO: 10之pUC ORI，及抗生素抗性卡匣，其較佳包含具有與SEQ ID NO: 12至少90%一致之聚核苷酸序列的經密碼子優化之Kan^r 基因，該基因較佳處於bla啟動子，例如SEQ ID NO: 9中顯示之bla啟動子的控制下。該第一DNA質體及該第二DNA質體各自獨立地進一步包含以下至少一個：啟動子序列、強化子序列，及編碼可操作地連接至第一聚核苷酸序列或第二聚核苷酸序列之信號肽序列的聚核苷酸序列。較佳地，該第一DNA質體及該第二DNA質體各自包含可操作地連接至第一聚核苷酸或第二聚核苷酸之上游序列，其中該上游序列自5'端至3'端包含SEQ ID NO: 7之啟動子序列、SEQ ID NO: 8之強化子序列及編碼具有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列之信號肽序列的聚核苷酸序列。該第一DNA質體及該第二DNA質體各自亦可包含位於HBV抗原編碼序列下游的聚腺苷酸化信號，諸如SEQ ID NO: 11之bGH聚腺苷酸化信號。

在本申請案之一個特定實施例中，第一載體係第一病毒載體且第二載體係第二病毒載體。較佳地，該第一病毒載體及該第二病毒載體各自為腺病毒載體，更佳為Ad26或Ad35載體，其包含表現卡匣，該表現卡匣包括編碼本申請案之HBV pol抗原或截短之HBV核心抗原的聚核苷酸；可操作地連接至該編碼HBV抗原之聚核苷酸的上游序列，該上游序列自5'端至3'端包含啟動子序列(較佳為SEQ ID NO: 17之CMV啟動子序列)、強化子序列(較佳為SEQ ID NO: 23之ApoAI基因片段序列)及編碼信號肽序列(較佳為具有SEQ ID NO: 19之胺基酸序列之免疫球蛋白分泌信號)的聚核苷酸序列；以及可操作地連接至該編碼HBV抗原之聚核苷酸的下游序列，該下游序列包含聚腺苷酸化信號，較佳為SEQ ID NO:24之SV40聚腺苷酸化信號。

在另一較佳實施例中，第一聚核苷酸及第二聚核苷酸係存在於單一載體，例如DNA質體或病毒載體中。較佳地，該單一載體係腺病毒載體，更佳為Ad26載體，其包含表現卡匣，該表現卡匣包括編碼本申請案之HBV pol抗原及截短之HBV核心抗原，較佳地編碼呈融合蛋白形式的本申請案之HBV pol抗原及截短之HBV核心抗原的聚核苷酸；可操作地連接至該編碼HBV pol及截短之核心抗原之聚核苷酸的上游序列，該上游序列自5'端至3'端包含啟動子序列(較佳為SEQ ID NO: 17之CMV啟動子序列)、強化子序列(較佳為SEQ ID NO: 23之ApoAI基因片段序列)及編碼信號肽序列(較佳為具有SEQ ID NO: 19之胺基酸序列之免疫球蛋白分泌信號)的聚核苷酸序列；以及可操作地連接至該編碼HBV抗原之聚核苷酸的下游序列，該下游序列包含聚腺苷酸化信號，較佳為SEQ ID NO: 24之SV40聚腺苷酸化信號。

當本申請案之免疫原性組合包含第一載體，諸如DNA質體或病毒載體，及第二載體，諸如DNA質體或病毒載體時，該第一載體及該第二載體各自之量不受特別限制。舉例而言，第一DNA質體及第二DNA質體可以按重量計以10:1至1:10，諸如按重量計以10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10之比率存在。較佳地，第一DNA質體及第二DNA質體按重量計係以1:1之比率存在。

本申請案之組合物及免疫原性組合可以包含編碼另外的HBV抗原之另外的聚核苷酸或載體及/或另外的HBV抗原或其免疫原性片段。然而，在特定實施例中，本申請案之組合物及免疫原性組合不包含某些抗原。

在一個特定實施例中，本申請案之組合物或免疫原性組合或套組不包含HBsAg或編碼HBsAg之聚核苷酸序列。

在另一特定實施例中，本申請案之組合物或免疫原性組合或套組不包含HBV L蛋白質或編碼HBV L蛋白質之聚核苷酸序列。

在本申請案之又一特定實施例中，本申請案之組合物或免疫原性組合不包含HBV包膜蛋白或編碼HBV包膜蛋白之聚核苷酸序列。

本申請案之組合物及免疫原性組合亦可包含醫藥學上可接受之載劑。醫藥學上可接受之載劑係無毒的且不應干擾活性成分之功效。醫藥學上可接受之載劑可以包括一或多種賦形劑，諸如黏合劑、崩解劑、膨潤劑、懸浮劑、乳化劑、潤濕劑、潤滑劑、調味劑、甜味劑、防腐劑、染料、增溶劑及包覆劑。醫藥學上可接受之載劑可包括媒劑，諸如脂質(奈米)粒子。該載劑或其他材料之確切性質可以取決於投與途徑，例如肌肉內、皮內、皮下、經口、靜脈內、皮膚、黏膜內(例如腸)、鼻內或腹膜內途徑。對於液體可注射製劑，例如懸浮液及溶液，適合的載劑及添加劑包括水、二醇、油、醇、防腐劑、著色劑及類似物。對於固體口服製劑，例如散劑、膠囊、囊片、膠囊錠(gelcap)及錠劑，適合的載劑及添加劑包括澱粉、糖、稀釋劑、成粒劑、潤滑劑、黏合劑、崩解劑及類似物。對於鼻噴霧劑/吸入劑混合物，水溶液/懸浮液可以包含水、二醇、油、潤滑劑、穩定劑、潤濕劑、防腐劑、芳族物、調味劑及類似物作為適合的載劑及添加劑。

本申請案之組合物及免疫原性組合可以用適於向個體投與之任何物質調配以有助於投與並改善功效，包括(但不限於)經口(腸)投與及非經腸注射。非經腸注射包括靜脈內注射或輸注、皮下注射、皮內注射及肌肉內注射。本申請案之組合物亦可調配用於其他投藥途徑，包括經黏膜、眼、直腸、長效植入、舌下投與(即在舌頭下方，自口腔黏膜投與，繞過門脈循環)、吸入或鼻內投與。

在本申請案之一個較佳實施例中，本申請案之組合物及免疫原性組合係調配用於非經腸注射，較佳經皮下、皮內注射或肌肉內注射，更佳肌肉內注射。

根據本申請案之實施例，供投與之組合物及免疫原性組合通常將包含於醫藥學上可接受之載劑，例如水性載劑，諸如緩衝生理食鹽水及類似物，例如磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)中之緩衝溶液。視需要，該等組合物及免疫原性組合亦可含有醫藥學上可接受之物質以接近生理條件，諸如pH調節及緩衝劑。舉例而言，本申請案的包含質體DNA之組合物或免疫原性組合可以含有磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)作為醫藥學上可接受之載劑。質體DNA之存在濃度可以為例如0.5 mg/mL至5 mg/mL，諸如為0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL或5 mg/mL，較佳為1 mg/mL。

可以根據此項技術中熟知之方法，將本申請案之組合物及免疫原性組合調配為疫苗(又稱為「免疫原性組合物」)。此類組合物可以包括用以增強免疫反應之佐劑。根據本發明，調配物中各組分之最佳比率可以藉由熟習此項技術者熟知之技術測定。

在本申請案之一個特定實施例中，組合物或免疫原性組合係DNA疫苗。DNA疫苗通常包括含有處於強真核啟動子控制下的編碼所關注抗原之聚核苷酸的細菌質體。在將質體遞送至宿主之細胞質中之後，即產生並內源性加工編碼之抗原。所得抗原通常誘發體液及細胞介導之免疫反應。DNA疫苗之優勢至少係由於其提供改良之安全性，具有溫度穩定性，可以容易地用於表現抗原變異體且易於製造。可以使用本申請案之DNA質體中之任一種製備此類DNA疫苗。

在本申請案之其他特定實施例中，組合物或免疫原性組合係RNA疫苗。RNA疫苗通常包含至少一個編碼所關注抗原，例如HBV抗原之單股RNA分子。與DNA疫苗類似，在將RNA遞送至宿主之細胞質中之後，即產生並內源性加工編碼之抗原，誘發體液及細胞介導之免疫反應。RNA序列可以經密碼子優化以提高轉譯效率。RNA分子可以根據本發明，藉由此項技術中已知之任何方法，諸如藉由添加例如具有至少30個腺苷殘基之聚腺苷酸尾；及/或用經修飾之核糖核苷酸，例如7-甲基鳥苷帽對5端加帽進行修飾以增進穩定性及/或轉譯，該經修飾之核糖核苷酸可以在RNA合成期間併入或在RNA轉錄之後以酶進行工程改造。RNA疫苗亦可為由α病毒表現載體開發之自我複製RNA疫苗。自我複製RNA疫苗包含來源於屬於α病毒科之病毒的複製酶RNA分子，其具有控制HBV抗原RNA複製之次基因組啟動子，隨後為位於該複製酶下游的人工聚腺苷酸尾。

在某些實施例中，本申請案之組合物或免疫原性組合中包括佐劑，或將佐劑與本申請案之組合物或免疫原性組合共投與。佐劑之使用係可選的，且當該組合物係用於疫苗接種目的時，其可以進一步增強免疫反應。適於共投與或包括在根據本申請案之組合物中的佐劑應較佳地為可能安全、具有良好耐受性且有效用於人類之佐劑。佐劑可以為小分子或抗體，包括(但不限於)免疫檢查點抑制劑(例如抗PD1、抗TIM-3等)、鐸樣受體促效劑(toll-like receptor agonist)(例如TLR7促效劑及/或TLR8促效劑)、RIG-1促效劑、IL-15超級促效劑(Altor Bioscience)、突變IRF3及IRF7基因佐劑、STING促效劑(Aduro)、FLT3L基因佐劑、IL-12基因佐劑及IL-7-hyFc。佐劑亦可例如選自以下抗HBV藥劑：HBV DNA聚合酶抑制劑；免疫調節劑；鐸樣受體7調節劑；鐸樣受體8調節劑；鐸樣受體3調節劑；干擾素α受體配體；玻尿酸酶抑制劑；IL-10調節劑；HBsAg抑制劑；鐸樣受體9調節劑；親環蛋白抑制劑；HBV預防性疫苗；HBV治療性疫苗；HBV病毒進入抑制劑；靶向病毒mRNA之反義寡核苷酸，更具體地說抗HBV反義寡核苷酸；短干擾RNA (siRNA)，更具體地說抗HBV siRNA；核酸內切酶調節劑；核糖核苷酸還原酶抑制劑；B型肝炎病毒E抗原抑制劑；靶向B型肝炎病毒之表面抗原的HBV抗體；HBV抗體；CCR2趨化因子拮抗劑；胸腺素促效劑；細胞介素，諸如IL12；衣殼組裝調節劑、核蛋白抑制劑(HBV核心或衣殼蛋白抑制劑)；核酸聚合物(NAP)；視黃酸誘導性基因1之刺激劑；NOD2刺激劑；重組胸腺素α-1；B型肝炎病毒複製抑制劑；PI3K抑制劑；cccDNA抑制劑；免疫檢查點抑制劑，諸如PD-L1抑制劑、PD-1抑制劑、TIM-3抑制劑、TIGIT抑制劑、Lag3抑制劑及CTLA-4抑制劑；在免疫細胞(更具體地說T細胞)上表現之共刺激受體諸如CD27、CD28等的促效劑；BTK抑制劑；用於治療HBV之其他藥物；IDO抑制劑；精胺酸酶抑制劑；以及KDM5抑制劑。

本申請案亦提供製備本申請案之組合物及免疫原性組合的方法。製備組合物或免疫原性組合之方法包含將本申請案的編碼HBV抗原之分離之聚核苷酸、載體及/或多肽與一或多種醫藥學上可接受之載劑混合。一般熟習此項技術者將熟悉用於製備此類組合物之習知技術。

誘發免疫反應之方法

本申請案亦提供在有需要之個體中誘發針對B型肝炎病毒(HBV)之免疫反應的方法，其包含向該個體投與免疫原性有效量的本申請案之組合物或免疫性組合物。本文所描述的本申請案之組合物及免疫原性組合中之任一種均可用於本申請案之方法中。

如本文所使用，術語「感染」係指致病物對宿主之侵襲。當致病物能夠侵襲宿主，且在宿主內複製或繁殖時，認為其具有「感染性」。感染物之實例包括病毒，例如HBV及某些物種之腺病毒、朊病毒、細菌、真菌、原蟲及類似物。「HBV感染」特指HBV對宿主生物體，諸如宿主生物體之細胞及組織之侵襲。

當關於本文所描述之方法使用時，短語「誘發免疫反應」涵蓋在有需要之個體中引起針對感染，例如HBV感染之所需免疫反應或作用。「誘發免疫反應」亦涵蓋提供針對病原體，例如HBV之治療性免疫以進行治療。如本文所使用，術語「治療性免疫」或「治療性免疫反應」意思指經疫苗接種之個體能夠控制該疫苗接種所針對之病原體感染，例如藉由用HBV疫苗進行疫苗接種引起針對HBV感染之免疫。在一個實施例中，「誘發免疫反應」意謂在有需要之個體中產生免疫，例如以提供針對疾病，諸如HBV感染之治療作用。在某些實施例中，「誘發免疫反應」係指引起或改善針對HBV感染之細胞免疫，例如T細胞反應。在某些實施例中，「誘發免疫反應」係指引起或改善針對HBV感染之體液免疫反應。在某些實施例中，「誘發免疫反應」係指引起或改善針對HBV感染之細胞及體液免疫反應。

如本文所使用，術語「保護性免疫」或「保護性免疫反應」意思指經疫苗接種之個體能夠控制該疫苗接種所針對之病原體感染。通常，產生「保護性免疫反應」之個體僅產生輕度至中度臨床症狀或完全無症狀。通常，針對某一病原體具有「保護性免疫反應」或「保護性免疫」之個體將不會死於該病原體感染。

通常，本申請案之組合物及免疫原性組合的投與將具有治療目的，用於在HBV感染或發展HBV感染特有之症狀之後產生針對HBV之免疫反應，例如用於治療性疫苗接種。

如本文所使用，「免疫原性有效量」或「免疫有效量」意謂足以在有需要之個體中誘發所需免疫作用或免疫反應的組合物、聚核苷酸、載體或抗原之量。免疫原性有效量可以為足以在有需要之個體中誘發免疫反應的量。免疫原性有效量可以為足以在有需要之個體中產生免疫性，例如針對疾病，諸如HBV感染提供治療作用的量。免疫原性有效量可以取決於多種因素而變化，諸如個體之身體狀況，年齡、體重、健康狀況等；具體應用，例如提供保護性免疫或治療性免疫；以及免疫需要針對之具體疾病，例如病毒感染。一般熟習此項技術者根據本發明可以容易地確定免疫原性有效量。

在本申請案之特定實施例中，免疫原性有效量係指足以達成以下作用中之一種、兩種、三種、四種或更多種的組合物或免疫原性組合之量：(i) 降低或改善HBV感染或其相關症狀之嚴重程度；(ii)縮短HBV感染或其相關症狀之持續時間；(iii)預防HBV感染或其相關症狀進展；(iv)使HBV感染或其相關症狀消退；(v)預防HBV感染或其相關症狀之發展或發作；(vi)預防HBV感染或其相關症狀之復發；(vii)減少患HBV感染之個體的住院；(viii)縮短患HBV感染之個體之住院時間；(ix)增加患HBV感染之個體之存活期；(x)消除個體之HBV感染；(xi)抑制或減少個體中之HBV複製；及/或(xii)增強或改善另一療法之預防或治療作用。

免疫原性有效量亦可為足以減小HBsAg含量以符合臨床血清轉化之發展；利用個體之免疫系統達成持續清除HBsAg以及減少受感染肝細胞；誘導HBV抗原特異性活化之T細胞群；及/或在12個月內達成持續減損HBsAg。目標指標之實例包括低於500個複本之HBsAg國際單位(IU)臨限值之較低HBsAg及/或較高CD8計數。

作為指導通則，免疫原性有效量當用於DNA質體時可以在約0.1 mg/mL至10 mg/mL總DNA質體範圍內，諸如為0.1 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、0.75 mg/mL、1 mg/mL、1.5 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL、8 mg/mL、9 mg/mL或10 mg/mL。較佳地，DNA質體之免疫原性有效量小於8 mg/mL，更佳小於6 mg/mL，甚至更佳為3-4 mg/mL。免疫原性有效量可以來自一個載體或質體，或來自多個載體或質體。免疫原性有效量可呈單一組合物或呈多種組合物投與，諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種組合物(例如錠劑、膠囊或可注射劑，或適於皮內遞送，例如適於使用皮內遞送貼片皮內遞送的任何組合物)，其中多個膠囊或多次注射液的投與總體向個體提供免疫原性有效量。舉例而言，當使用兩個DNA質體時，免疫原性有效量可以為3-4 mg/mL，具有1.5-2 mg/mL各質體。亦可按所謂的初打-加打療程，向個體投與免疫原性有效量，且隨後向該個體投與另一劑免疫原性有效量。此初打-加打療程之一般概念係熟習疫苗領域之技術者熟知的。可以依需要，在該療程中視情況增加投與其他追加劑。

可以藉由將兩個DNA質體(例如編碼HBV核心抗原之第一DNA質體及編碼HBV pol抗原之第二DNA質體)混合並將混合物遞送至單一解剖部位來將包含該兩個質體的免疫原性組合投與個體。或者，可進行兩次獨立的免疫接種，分別遞送單一表現質體。在此類實施例中，無論兩個質體係作為混合物以單次免疫接種投與抑或分兩次獨立的免疫接種投與，第一DNA質體及第二DNA質體均可按重量計以10:1至1:10，諸如按重量計以10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10之比率投與。較佳地，第一DNA質體及第二DNA質體按重量計係以1:1之比率投與。

較佳地，根據本申請案之方法治療的個體係感染HBV之個體，特別是患有慢性HBV感染之個體。急性HBV感染之特徵在於先天免疫系統之高效活化加上隨後的廣泛適應性反應(例如HBV特異性T細胞、中和抗體)，由此通常造成成功抑制複製或移除受感染之肝細胞。反之，此類反應會因高病毒及抗原負荷而減弱或減小，例如大量產生HBV包膜蛋白，且可以於亞病毒粒子中釋放超過感染性病毒1,000倍之量。

慢性HBV感染係以病毒負荷、肝酶含量(壞死性發炎活性)、HBeAg或HBsAg負荷，或者針對該等抗原之抗體之存在等特徵分階段說明。cccDNA含量保持相對恆定，每個細胞有約10至50個複本，即使病毒血症可能變化極大。cccDNA物種之存留導致慢性化。更具體言之，慢性HBV感染各階段包括：(i)免疫耐受期，以高病毒負荷及正常或最小升高程度之肝酶為特徵；(ii)免疫活化HBeAg陽性期，在此階段觀察到較低或下降之病毒複製程度及明顯升高之肝酶；(iii)非活動性HBsAg攜帶期，該階段係具有低病毒負荷之低複製狀態且在血清中具有可以遵循HBeAg血清轉化之正常肝酶含量；以及(iv)HBeAg陰性期，在該階段中，定期發生病毒複製(再活化)且伴隨肝酶含量之波動，前核心及/或基礎核心啟動子中常有突變，使得受感染細胞無法產生HBeAg。

如本文所使用，「慢性HBV感染」係指個體中可偵測到HBV存在超過6個月。患有慢性HBV感染之個體可以處於慢性HBV感染之任何階段。慢性HBV感染係根據其在該領域中之普通含義理解。慢性HBV感染可例如以急性HBV感染之後HBsAg存留達6個月或更長時間為特徵。舉例而言，本文所提及的慢性HBV感染遵循疾病控制與預防中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)所公開之定義，根據該定義，慢性HBV感染可藉由實驗室標準表徵，諸如：(i)針對B型肝炎核心抗原之IgM抗體呈陰性(IgM抗HBc)及針對B型肝炎表面抗原(HBsAg)、B型肝炎e抗原(HBeAg)或有關B型肝炎病毒DNA之核酸測試呈陽性；或(ii)針對HBsAg或有關HBV DNA之核酸測試呈陽性，或間隔至少6個月兩次針對HBeAg呈陽性。

較佳地，免疫原性有效量係指足以治療慢性HBV感染的本申請案之組合物或免疫原性組合之量。

在一些實施例中，患有慢性HBV感染之個體正在經歷核苷類似物(NUC)治療，且受NUC抑制。如本文所使用，「受NUC抑制」係指個體具有不可偵測之HBV病毒含量及穩定丙胺酸轉胺酶(ALT)含量達至少六個月。核苷/核苷酸類似物治療之實例包括HBV聚合酶抑制劑，諸如恩替卡韋及替諾福韋。較佳地，患有慢性HBV感染之個體不會患上晚期肝纖維化或肝硬化。此類個體通常會具有小於3分的針對纖維化之METAVIR分數及小於9 kPa之肝纖維化掃描(fibroscan)結果。METAVIR分數係藉由B型肝炎患者之肝切片之組織病理學評價來評估炎症及纖維化程度的一種常用評分系統。該評分系統指定兩個標準化數字：一個反映炎症之程度且一個反映纖維化之程度。

咸信消除或減輕慢性HBV可以允許包括病毒誘發肝硬化及肝細胞癌在內之重度肝病的早期疾病攔截。因此，本申請案之方法亦可用作治療HBV誘發之疾病的療法。HBV誘發疾病之實例包括(但不限於)肝硬化、癌症(例如肝細胞癌)及纖維化，特別是以3分或更高的針對纖維化之METAVIR分數為特徵的晚期纖維化。在此類實施例中，免疫原性有效量係足以在12個月內達成HBsAg之持久喪失且明顯減輕臨床疾病(例如肝硬化、肝細胞癌等)的量。

根據本申請案之實施例的方法進一步包含向有需要之個體投與另一免疫原性藥劑(諸如另一HBV抗原或其他抗原)或另一抗HBV藥劑(諸如核苷類似物或其他抗HBV藥劑)與本申請案之組合物的組合。舉例而言，另一抗HBV藥劑或免疫原性藥劑可以為小分子或抗體，包括(但不限於)免疫檢查點抑制劑(例如抗PD1、抗TIM-3等)、鐸樣受體促效劑(例如TLR7促效劑及/或TLR8促效劑)、RIG-1促效劑、IL-15超級促效劑(Altor Bioscience)、突變IRF3及IRF7基因佐劑、STING促效劑(Aduro)、FLT3L基因佐劑、IL-12基因佐劑、IL-7-hyFc；結合HBV env之CAR-T(S-CAR細胞)；衣殼組裝調節劑；cccDNA抑制劑、HBV聚合酶抑制劑(例如恩替卡韋及替諾福韋)。該一或多種其他抗HBV活性劑可以例如為小分子、抗體或其抗原結合片段、多肽、蛋白質或核酸。該一或多種其他抗HBV藥劑可例如選自HBV DNA聚合酶抑制劑；免疫調節劑；鐸樣受體7調節劑；鐸樣受體8調節劑；鐸樣受體3調節劑；干擾素α受體配體；玻尿酸酶抑制劑；IL-10調節劑；HBsAg抑制劑；鐸樣受體9調節劑；親環蛋白抑制劑；HBV預防性疫苗；HBV治療性疫苗；HBV病毒進入抑制劑；靶向病毒mRNA之反義寡核苷酸，更具體地說抗HBV反義寡核苷酸；短干擾RNA (siRNA)，更具體地說抗HBV siRNA；核酸內切酶調節劑；核糖核苷酸還原酶抑制劑；B型肝炎病毒E抗原抑制劑；靶向B型肝炎病毒之表面抗原的HBV抗體；HBV抗體；CCR2趨化因子拮抗劑；胸腺素促效劑；細胞介素，諸如IL12；衣殼組裝調節劑、核蛋白抑制劑(HBV核心或衣殼蛋白抑制劑)；核酸聚合物(NAP)；視黃酸誘導性基因1之刺激劑；NOD2刺激劑；重組胸腺素α-1；B型肝炎病毒複製抑制劑；PI3K抑制劑；cccDNA抑制劑；免疫檢查點抑制劑，諸如PD-L1抑制劑、PD-1抑制劑、TIM-3抑制劑、TIGIT抑制劑、Lag3抑制劑及CTLA-4抑制劑；在免疫細胞(更具體地說T細胞)上表現之共刺激受體諸如CD27、CD28等的促效劑；BTK抑制劑；用於治療HBV之其他藥物；IDO抑制劑；精胺酸酶抑制劑；以及KDM5抑制劑。

遞送方法

本申請案之組合物及免疫原性組合可以根據本發明，藉由此項技術中已知之任何方法投與個體，包括(但不限於)非經腸投與(例如肌肉內、皮下、靜脈內或皮內注射)、經口投與、經皮投與及鼻投與。較佳地，組合物及免疫原性組合係非經腸(例如藉由肌肉內注射或皮內注射)或經皮投與。

在組合物或免疫原性組合包含一或多個DNA質體的本申請案之一些實施例中，投與可以藉由經皮膚注射，例如肌肉內或皮內注射，較佳肌肉內注射實現。肌肉內注射可以與電穿孔組合，亦即，施加電場以有助於DNA質體遞送至細胞中。如本文所使用，術語「電穿孔」係指使用跨膜電場脈衝在生物膜中誘導產生微觀路徑(孔)。在活體內電穿孔期間，向細胞施加適當幅值及持續時間之電場，誘導短暫的細胞膜滲透性增強狀態，由此實現無法獨自跨越細胞膜之分子的細胞吸收。藉由電穿孔產生此類孔有助於諸如質體、寡核苷酸、siRNA、藥物等生物分子穿過細胞膜之一側到達另一側。經顯示，利用活體內電穿孔來遞送DNA疫苗使宿主細胞對質體之吸收明顯增加，同時亦會在注射部位引起輕度至中度炎症。因此，相較於習知注射，利用皮內或肌肉內電穿孔使轉染效率及免疫反應顯著改良(例如分別增加1,000倍及100倍)。

在一個典型實施例中，將電穿孔與肌肉內注射組合。然而，亦可將電穿孔與其他非經腸投與形式，例如皮內注射、皮下注射等組合。

經由電穿孔投與本申請案之組合物、免疫原性組合或疫苗可以使用電穿孔器件實現，該等電穿孔器件可經組態以將有效引起細胞膜中形成可逆孔的能量脈衝遞送至所希望的哺乳動物組織。電穿孔器件可以包括電穿孔組件及電極總成或手柄總成。電穿孔組件可以包括以下電穿孔器件組件中之一或多個：控制器、電流波形產生器、阻抗測試儀、波形記錄器、輸入元件、狀態報告元件、通信端口、記憶體組件、電源及電源開關。電穿孔可以使用活體內電穿孔器件實現。可以有助於遞送本申請案之組合物及免疫原性組合，特別是包含DNA質體者的電穿孔器件及電穿孔方法之實例包括CELLECTRA®(Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell, PA)、Elgen電穿孔器(Inovio Pharmaceuticals, Inc.)、Tri-Grid^TM 遞送系統(Ichor Medical Systems, Inc., San Diego, CA 92121)，及彼等說明於：美國專利第7,664,545號、美國專利第8,209,006號、美國專利第9,452,285號、美國專利第5,273,525號、美國專利第6,110,161號、美國專利第6,261,281號、美國專利第6,958,060號及美國專利第6,939,862號、美國專利第7,328,064號、美國專利第6,041,252號、美國專利第5,873,849號、美國專利第6,278,895號、美國專利第6,319,901號、美國專利第6,912,417號、美國專利第8,187,249號、美國專利第9,364,664號、美國專利第9,802,035號、美國專利第6,117,660號，及國際專利申請公開案WO2017172838中者，其等皆以全文引用的方式併入本文中。活體內電穿孔器件之其他實例描述於與本申請案同一天提交的標題名稱為「用於遞送B型肝炎病毒(HBV)疫苗之方法及裝置(Method and Apparatus for the Delivery of Hepatitis B Virus(HBV)Vaccines)」的代理人案號為688097-405WO1之國際專利申請案中，其內容以全文引用的方式併入本文中。用於遞送本申請案之組合物及免疫原性組合的申請案亦涵蓋使用脈衝電場，如例如美國專利第6,697,669號中所描述，其以全文引用的方式併入本文中。

在組合物或免疫原性組合包含一或多個DNA質體的本申請案之其他實施例中，投與方法係經皮投與。經皮投與可以與表皮磨蝕組合，以有助於將DNA質體遞送至細胞。舉例而言，可以使用皮膚貼片進行表皮磨蝕。在移除皮膚貼片後，組合物或免疫原性組合可以沈積於經磨蝕之皮膚上。

遞送方法不限於上述實施例，且用於細胞內遞送之任何手段均可使用。本申請案之方法所涵蓋的其他細胞內遞送方法包括(但不限於)脂質體包封、奈米粒子等。

佐劑

在本申請案之一些實施例中，誘發針對HBV之免疫反應的方法進一步包含投與佐劑。術語「佐劑」與「免疫刺激劑」在本文中可互換地使用，且定義為刺激免疫系統之一或多種物質。在此情形下，佐劑係用於增強針對本申請案之HBV抗原及抗原性HBV多肽之免疫反應。

根據本申請案之實施例，佐劑可以存在於本申請案之免疫原性組合或組合物中，或以獨立組合物形式投與。佐劑可以為例如小分子或抗體。適用於本申請案中之佐劑的實例包括(但不限於)免疫檢查點抑制劑(例如抗PD1、抗TIM-3等)、鐸樣受體促效劑(例如TLR7促效劑及/或TLR8促效劑)、RIG-1促效劑、IL-15超級促效劑(Altor Bioscience)、突變IRF3及IRF7基因佐劑、STING促效劑(Aduro)、FLT3L基因佐劑、IL-12基因佐劑及IL-7-hyFc。佐劑之實例可以例如選自以下抗HBV藥劑：HBV DNA聚合酶抑制劑；免疫調節劑；鐸樣受體7調節劑；鐸樣受體8調節劑；鐸樣受體3調節劑；干擾素α受體配體；玻尿酸酶抑制劑；IL-10調節劑；HBsAg抑制劑；鐸樣受體9調節劑；親環蛋白抑制劑；HBV預防性疫苗；HBV治療性疫苗；HBV病毒進入抑制劑；靶向病毒mRNA之反義寡核苷酸，更具體地說抗HBV反義寡核苷酸；短干擾RNA (siRNA)，更具體地說抗HBV siRNA；核酸內切酶調節劑；核糖核苷酸還原酶抑制劑；B型肝炎病毒E抗原抑制劑；靶向B型肝炎病毒之表面抗原的HBV抗體；HBV抗體；CCR2趨化因子拮抗劑；胸腺素促效劑；細胞介素，諸如IL12；衣殼組裝調節劑、核蛋白抑制劑(HBV核心或衣殼蛋白抑制劑)；核酸聚合物(NAP)；視黃酸誘導性基因1之刺激劑；NOD2刺激劑；重組胸腺素α-1；B型肝炎病毒複製抑制劑；PI3K抑制劑；cccDNA抑制劑；免疫檢查點抑制劑，諸如PD-L1抑制劑、PD-1抑制劑、TIM-3抑制劑、TIGIT抑制劑、Lag3抑制劑及CTLA-4抑制劑；在免疫細胞(更具體地說T細胞)上表現之共刺激受體諸如CD27、CD28等的促效劑；BTK抑制劑；用於治療HBV之其他藥物；IDO抑制劑；精胺酸酶抑制劑；以及KDM5抑制劑。

本申請案之組合物及免疫原性組合亦可與至少一種其他抗HBV藥劑組合投與。適合用於本申請案的抗HBV藥劑之實例包括(但不限於)小分子、抗體，及/或結合HBV env之CAR-T療法(S-CAR細胞)、衣殼組裝調節劑、TLR促效劑(例如TLR7及/或TLR8促效劑)、cccDNA抑制劑、HBV聚合酶抑制劑(例如恩替卡韋及替諾福韋)及/或免疫檢查點抑制劑等。該至少一種抗HBV藥劑可例如選自HBV DNA聚合酶抑制劑；免疫調節劑；鐸樣受體7調節劑；鐸樣受體8調節劑；鐸樣受體3調節劑；干擾素α受體配體；玻尿酸酶抑制劑；IL-10調節劑；HBsAg抑制劑；鐸樣受體9調節劑；親環蛋白抑制劑；HBV預防性疫苗；HBV治療性疫苗；HBV病毒進入抑制劑；靶向病毒mRNA之反義寡核苷酸，更具體地說抗HBV反義寡核苷酸；短干擾RNA (siRNA)，更具體地說抗HBV siRNA；核酸內切酶調節劑；核糖核苷酸還原酶抑制劑；B型肝炎病毒E抗原抑制劑；靶向B型肝炎病毒之表面抗原的HBV抗體；HBV抗體；CCR2趨化因子拮抗劑；胸腺素促效劑；細胞介素，諸如IL12；衣殼組裝調節劑、核蛋白抑制劑(HBV核心或衣殼蛋白抑制劑)；核酸聚合物(NAP)；視黃酸誘導性基因1之刺激劑；NOD2刺激劑；重組胸腺素α-1；B型肝炎病毒複製抑制劑；PI3K抑制劑；cccDNA抑制劑；免疫檢查點抑制劑，諸如PD-L1抑制劑、PD-1抑制劑、TIM-3抑制劑、TIGIT抑制劑、Lag3抑制劑及CTLA-4抑制劑；在免疫細胞(更具體地說T細胞)上表現之共刺激受體諸如CD27、CD28等的促效劑；BTK抑制劑；用於治療HBV之其他藥物；IDO抑制劑；精胺酸酶抑制劑；以及KDM5抑制劑。此類抗HBV藥劑可以與本申請案之組合物及免疫原性組合同時或依序投與。

初打 / 加打免疫接種方法

本申請案之實施例亦涵蓋在所謂的初打-加打療程中，向個體投與免疫原性有效量之組合物或免疫原性組合，且隨後向該個體投與另一劑免疫原性有效量之組合物或免疫原性組合。因此，在一個實施例中，本申請案之組合物或免疫原性組合係用於引發免疫反應之初打疫苗。在另一個實施例中，本申請案之組合物或免疫原性組合係用於增強免疫反應之加打疫苗。本申請案之初打及加打疫苗可以用於本文所描述的本申請案之方法中。此初打-加打療程之一般概念係熟習疫苗領域之技術者熟知的。本文所描述的本申請案之組合物及免疫原性組合中之任一種可以用作初打及/或加打疫苗以引發及/或增強針對HBV之免疫反應。

在本申請案之一些實施例中，本申請案之組合物或免疫原性組合可以投與用於初打免疫接種。該組合物或免疫原性組合可以再投與用於加打免疫接種。視需要，該組合物或疫苗組合之進一步加打投與可以視情況添加至該療程中。佐劑可以存在於用於加打免疫接種的本申請案之組合物中，存在於欲投與本申請案之組合物或免疫原性組合一起投與以用於加打免疫接種的獨立組合物中，或獨自投與以作為加打免疫接種。在該療程中包括佐劑的該等實施例中，佐劑較佳用於加打免疫接種。

初打-加打療程之說明性且非限制性實例包括向個體投與單次劑量的免疫原性有效量之本申請案之組合物或免疫原性組合以引發免疫反應；且隨後投與另一劑免疫原性有效量的本申請案之組合物或免疫原性組合以增強免疫反應，其中該加打免疫接種先在初始投與初打免疫接種之後約兩至六週，較佳四週投與。視情況，在初始投與初打免疫接種之後約10至14週，較佳12週，再投與該組合物或免疫原性組合，或其他佐劑之加打免疫接種。

套組

本文亦提供一種包含本申請案之免疫原性組合的套組。套組可以包含呈獨立組合物形式之第一聚核苷酸及第二聚核苷酸，或套組可以包含呈單一組合物形式之第一聚核苷酸及第二聚核苷酸。套組可以進一步包含一或多種佐劑或免疫刺激劑，及/或其他抗HBV藥劑。

在投與動物或人類生物體中時誘發或刺激抗HBV免疫反應的能力可以使用此項技術中之多種標準分析法在活體外或活體內評價。有關可用於評價免疫反應之起始及活化之技術的大體描述，參見例如Coligan等人(1992及1994年, Current Protocols in Immunology; J Wiley & Sons Inc編, National Institute of Health)。細胞免疫性之量測可藉由量測由活化之效應細胞，包括來源於CD4+及CD8+ T細胞之該等細胞所分泌之細胞介素譜(例如藉由ELISPOT定量產生IL-10或IFN γ之細胞)、藉由確定免疫效應細胞之活化狀態(例如藉由經典的[³ H]胸苷吸收或基於流式細胞測量術進行之T細胞增殖分析)、藉由分析致敏個體中之抗原特異性T淋巴細胞(例如細胞毒性分析中之肽特異性溶解等)進行。

刺激細胞及/或體液反應之能力可以藉由抗體結合及/或結合競爭來測定(參見例如，Harlow, 1989, Antibodies, Cold Spring Harbor Press)。舉例而言，可以藉由酶聯結免疫吸附分析法(ELISA)量測響應於提供免疫原之組合物之投與而產生之抗體的力價。亦可藉由中和抗體分析法量測免疫反應，其中病毒之中和定義為經由特異性抗體對該病毒之反應/抑制/中和引起之感染性損失。免疫反應亦可藉由抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)分析法量測。
實施例

實施例部分 1

實施例1包含一種分離或非天然存在之核酸分子，其包含編碼截短之HBV核心抗原的聚核苷酸序列，該截短之HBV核心抗原由與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14至少90%一致，較佳與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14達100%一致的胺基酸序列組成；較佳該截短之HBV核心抗原能夠在哺乳動物中誘發針對至少兩種HBV基因型的免疫反應；更佳該截短之HBV核心抗原能夠在哺乳動物中誘發針對至少HBV基因型B、C及D之T細胞反應；又更佳地，該截短之HBV核心抗原能夠在人類個體中誘發針對至少HBV基因型A、B、C及D之CD8 T細胞反應；且最佳地，該截短之HBV核心抗原編碼序列包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15至少90%一致，諸如90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致的聚核苷酸。

實施例2包含如實施例1之非天然存在之核酸分子，其中該截短之HBV核心抗原由SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14之胺基酸序列組成。

實施例3包含如實施例1或實施例2之非天然存在之核酸分子，其進一步包含編碼可操作地連接至該HBV聚合酶抗原之信號序列的聚核苷酸序列。

實施例4包含如實施例3之非天然存在之核酸分子，其中該信號序列包含SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 19之胺基酸序列，較佳該信號序列係由SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18之聚核苷酸序列編碼。

實施例5包含如實施例1至4中任一項之非天然存在之核酸分子，其中編碼該截短之核心HBV抗原的該聚核苷酸序列與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15至少90%一致。

實施例6包含如實施例5之非天然存在之核酸分子，其中編碼該截短之核心HBV抗原的該聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15之聚核苷酸序列。

實施例7包括含編碼HBV聚合酶抗原之第一聚核苷酸序列的非天然存在之核酸分子，該HBV聚合酶抗原包含與SEQ ID NO: 4至少98%一致的胺基酸序列，其中該HBV聚合酶抗原不具有逆轉錄酶活性及核糖核酸酶H活性。

實施例8包含如實施例7之非天然存在之核酸分子，其中該HBV聚合酶抗原能夠在哺乳動物中誘發針對至少兩種HBV基因型之免疫反應，較佳該HBV聚合酶抗原能夠在哺乳動物中誘發針對至少HBV基因型B、C及D之T細胞反應，且更佳地，該HBV聚合酶抗原能夠在人類個體中誘發針對至少HBV基因型A、B、C及D之CD8 T細胞反應。

實施例9包含如實施例7之非天然存在之核酸分子，其中該HBV聚合酶抗原包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。

實施例10包含如實施例7至9中任一項之非天然存在之核酸分子，其進一步包含編碼可操作地連接至該HBV聚合酶抗原之信號序列的聚核苷酸序列。

實施例11包含如實施例10之非天然存在之核酸分子，其中該信號序列包含SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 19之胺基酸序列，較佳該信號序列係由SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18之聚核苷酸序列編碼。

實施例12包含如實施例7至11中任一項之非天然存在之核酸分子，其中該第一聚核苷酸序列與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16至少90%一致。

實施例13包含如實施例12之非天然存在之核酸分子，其中該第一聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16之聚核苷酸序列。

實施例14包含如實施例7至13中任一項之非天然存在之核酸分子，其進一步包含編碼截短之HBV核心抗原的第二聚核苷酸序列，該截短之HBV核心抗原由SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14之胺基酸序列組成。

實施例15包含如實施例14之非天然存在之核酸分子，其中該第二聚核苷酸序列與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15至少90%一致。

實施例16包含如實施例15之非天然存在之核酸分子，其中該第二聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15之聚核苷酸序列。

實施例17包含如實施例14至16中任一項之非天然存在之核酸分子，其編碼包含該截短之HBV核心抗原可操作地連接至該HBV聚合酶抗原的融合蛋白。

實施例18包含如實施例17之非天然存在之核酸分子，其中該融合蛋白包含該截短之HBV核心抗原經由連接子可操作地連接至該HBV聚合酶抗原。

實施例19包含如實施例18之非天然存在之核酸分子，其中該連接子包含胺基酸序列(AlaGly)n，且n係2至5之整數，較佳該連接子係由包含SEQ ID NO: 22之聚核苷酸序列編碼。

實施例20包含如實施例19之非天然存在之核酸分子，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。

實施例21包含如實施例17至20中任一項之非天然存在之核酸分子，其中該融合蛋白進一步包含信號序列，較佳該信號序列包含SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 19之胺基酸序列，更佳該信號序列係由SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18之聚核苷酸序列編碼。

實施例22包含如實施例7至21中任一項之非天然存在之核酸分子，其進一步包含啟動子序列、視情況一或多個另外的調控序列，較佳該啟動子序列包含SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 17之聚核苷酸序列，且該另外的調控序列係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 23之強化子序列，及SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO:24之聚腺苷酸化信號序列。

實施例23包含如實施例7至22中任一項之非天然存在之核酸分子，其中該非天然存在之核酸分子不編碼選自由B型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原及HBV L蛋白質抗原組成之群的HBV抗原。

實施例24包含一種載體，其包含如實施例1至24中任一項之非天然存在之核酸分子。

實施例25包含如實施例24之載體，其中該非天然存在之核酸分子自5'端至3'端包含啟動子序列、強化子序列、信號肽編碼序列、該第一聚核苷酸序列及聚腺苷酸化信號序列，視情況該非天然存在之核酸分子進一步包含該第二聚核苷酸序列。

實施例26包含如實施例24或25之載體，其中該載體係質體DNA載體，且該質體DNA載體進一步包含複製起點及抗生素抗性基因。

實施例27包含如實施例26之載體，其中該質體DNA載體含有包含SEQ ID NO: 10之聚核苷酸序列的複製起點、包含SEQ ID NO: 12之聚核苷酸序列的抗生素抗性基因、包含SEQ ID NO: 7之聚核苷酸序列的啟動子序列、包含SEQ ID NO: 8之聚核苷酸序列的強化子序列、包含SEQ ID NO: 5之聚核苷酸序列的信號肽編碼序列、包含SEQ ID NO: 3之聚核苷酸序列的第一聚核苷酸序列及包含SEQ ID NO: 11之聚核苷酸序列的聚腺苷酸化信號序列，及視情況，包含SEQ ID NO: 1之聚核苷酸序列的第二聚核苷酸序列。

實施例28包含如實施例24或25之載體，其中該載體係腺病毒載體，較佳為Ad26或Ad35載體。

實施例29包含如實施例28之載體，其中該載體係包含編碼如實施例1至6中任一項之截短之核心HBV抗原的非天然存在之核酸的Ad26載體。

實施例30包含如實施例28之載體，其中該載體係包含編碼如實施例7至13中任一項之HBV聚合酶抗原的非天然存在之核酸的Ad26載體。

實施例31包含如實施例28之載體，其中該載體係包含編碼如實施例17至21中任一項之融合蛋白的非天然存在之核酸的Ad26載體。

實施例31a包含如實施例28至31中任一項之載體，其中該腺病毒載體含有包含SEQ ID NO: 17之聚核苷酸序列的啟動子序列、包含SEQ ID NO: 23之聚核苷酸序列的調控序列、包含SEQ ID NO: 18之聚核苷酸序列的信號肽編碼序列、包含SEQ ID NO: 15之聚核苷酸序列的第二聚核苷酸序列、包含SEQ ID NO: 22之聚核苷酸序列的連接子編碼序列、包含SEQ ID NO: 16之聚核苷酸序列的第一聚核苷酸序列及包含SEQ ID NO:24之聚核苷酸序列的聚腺苷酸化信號序列。

實施例32包含由如實施例1至32中任一項之非天然存在之核酸分子編碼的非天然存在之多肽。

實施例33包含一種宿主細胞，其包含如實施例1至23中任一項之非天然存在之核酸分子或如實施例24至32中任一項之載體。

實施例34包含一種組合物，其包含如實施例1至23中任一項之非天然存在之核酸分子、如實施例24至32中任一項之載體或如實施例33之非天然存在之多肽，及醫藥學上可接受之載劑。

實施例35包含如實施例34之組合物，其包含如實施例7至13中任一項之第一聚核苷酸、如實施例14至16中任一項之第二聚核苷酸及醫藥學上可接受之載劑，其中該第一聚核苷酸及該第二聚核苷酸不包含在同一核酸分子中或同一核酸載體中。

實施例36包含如實施例35之組合物，其中該第一聚核苷酸及該第二聚核苷酸係包含在兩個獨立載體，較佳腺病毒載體，更佳Ad26載體中。

實施例37包含一種套組，其包含：
(a) 包含編碼HBV聚合酶抗原之第一聚核苷酸的第一非天然存在之核酸分子，該HBV聚合酶抗原具有與SEQ ID NO: 4至少98%一致的胺基酸序列，其中該HBV聚合酶抗原不具有逆轉錄酶活性及核糖核酸酶H活性； (b) 包含編碼截短之HBV核心抗原之第二聚核苷酸的第二非天然存在之核酸分子，該截短之HBV核心抗原由SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14之胺基酸序列組成；以及 (c) 醫藥學上可接受之載劑， 其中該第一非天然存在之核酸分子及該第二非天然存在之核酸分子係存在於同一非天然存在之核酸分子中或兩個不同的非天然存在之核酸分子中。

實施例38包含如實施例37之套組，其中該HBV聚合酶抗原能夠在哺乳動物中誘發針對至少兩種HBV基因型之免疫反應，較佳該HBV聚合酶抗原能夠在哺乳動物中誘發針對至少HBV基因型B、C及D之T細胞反應，且更佳地，該HBV聚合酶抗原能夠在人類個體中誘發針對至少HBV基因型A、B、C及D之CD8 T細胞反應。

實施例39包含如實施例37之套組，其中該HBV聚合酶抗原包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。

實施例40包含如實施例37至39中任一項之套組，其中該第一非天然存在之核酸分子及該第二非天然核酸分子中的至少一個進一步包含編碼可操作地連接至該HBV聚合酶抗原及該截短之HBV核心抗原中之至少一種的信號序列之聚核苷酸序列。

實施例41包含如實施例40之套組，其中該信號序列獨立地包含SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 19之胺基酸序列，較佳該信號序列獨立地由SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18之聚核苷酸序列編碼。

實施例42包含如實施例37至41中任一項之套組，其中該第一聚核苷酸序列與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16至少90%一致。

實施例43包含如實施例42之套組，其中該第一聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16之聚核苷酸序列。

實施例44包含如實施例37至43中任一項之套組，其中該第二聚核苷酸序列與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15至少90%一致。

實施例45包含如實施例44之套組，其中該第二聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15之聚核苷酸序列。

實施例46包含如實施例37至45中任一項之套組，其中該第一非天然存在之核酸分子及該第二非天然核酸分子中的至少一個進一步包含啟動子序列、視情況之強化子序列，且亦視情況包含聚腺苷酸化信號序列，較佳該啟動子序列具有SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 17之聚核苷酸序列，該強化子序列獨立地具有SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 23之聚核苷酸序列，且該聚腺苷酸化信號序列獨立地具有SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 24之聚核苷酸序列。

實施例47包含如實施例37至46中任一項之套組，其中該套組不含編碼選自由B型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原及HBV L蛋白質抗原組成之群之HBV抗原的核酸分子，亦不含選自由B型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原及HBV L蛋白質抗原組成之群之HBV抗原。

實施例48包含如實施例37至47中任一項之套組，其中該第一非天然存在之核酸分子及該第二非天然存在之核酸分子係存在於同一載體中。

實施例49包含如實施例48之套組，其中該載體編碼呈兩種獨立蛋白質形式之HBV聚合酶抗原及截短之HBV核心抗原。

實施例50包含如實施例49之套組，其中該載體編碼包含截短之HBV核心抗原可操作地連接至HBV聚合酶抗原之融合蛋白。

實施例51包含如實施例50之套組，其中該融合蛋白包含該截短之HBV核心抗原經由連接子可操作地連接至該HBV聚合酶抗原。

實施例52包含如實施例51之套組，其中該連接子包含胺基酸序列(AlaGly)n，且n係2至5之整數，較佳該連接子係由包含SEQ ID NO: 22之聚核苷酸序列編碼。

實施例53包含如實施例52之套組，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。

實施例54包含如實施例53之套組，其中該融合蛋白進一步包含信號序列，較佳該信號序列具有SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 19之胺基酸序列，更佳該信號序列係由SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18之聚核苷酸序列編碼。

實施例55包含如實施例54之套組，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列。

實施例56包含如實施例48至55中任一項之套組，其中該載體自5'端至3'端含有啟動子序列、強化子序列、信號肽編碼序列、該第二聚核苷酸序列、連接子編碼序列、該第一聚核苷酸序列及聚腺苷酸化信號序列。

實施例57包含如實施例56之套組，其中該載體係腺病毒載體，較佳為Ad26或Ad35載體。

實施例58包含如實施例57之套組，其中該腺病毒載體含有包含SEQ ID NO: 17之聚核苷酸序列的啟動子序列、包含SEQ ID NO: 23之聚核苷酸序列的調控序列、包含SEQ ID NO: 18之聚核苷酸序列的信號肽編碼序列、包含SEQ ID NO: 15之聚核苷酸序列的第二聚核苷酸序列、包含SEQ ID NO: 22之聚核苷酸序列的連接子編碼序列、包含SEQ ID NO: 16之聚核苷酸序列的第一聚核苷酸序列及包含SEQ ID NO: 24之聚核苷酸序列的聚腺苷酸化信號序列。

實施例59包含如實施例58之套組，其中該套組不含編碼選自由B型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原及HBV L蛋白質抗原組成之群之HBV抗原的核酸分子，亦不含選自由B型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原及HBV L蛋白質抗原組成之群之HBV抗原。

實施例60包含如實施例37至59中任一項之套組，其中該第一非天然存在之核酸分子及該第二非天然存在之核酸分子係存在於兩個不同的載體中。

實施例61包含如實施例60之套組，其中該第一非天然存在之核酸分子係存在於第一質體DNA載體中，且該第二非天然存在之核酸分子係存在於第二質體DNA載體中。

實施例62包含如實施例61之套組，其中該第一質體DNA載體及該第二質體DNA載體各自包含複製起點、抗生素抗性基因，且自5'端至3'端包含啟動子序列、調控序列、信號肽編碼序列、該第一聚核苷酸序列或該第二聚核苷酸序列，及聚腺苷酸化信號序列。

實施例63包含如實施例62之套組，其中該抗生素抗性基因係具有與SEQ ID NO: 12至少90%一致，較佳與SEQ ID NO: 12達100%一致之聚核苷酸序列的卡那黴素抗性基因。

實施例64包含如實施例63之套組，其包含
(a) 第一質體DNA載體，自3'端至5'端，其包括含SEQ ID NO: 7之聚核苷酸序列的該啟動子序列、含SEQ ID NO: 8之聚核苷酸序列的該調控序列、含SEQ ID NO: 5之聚核苷酸序列的該信號肽編碼序列、含SEQ ID NO: 3之聚核苷酸序列的該第一聚核苷酸序列及含SEQ ID NO: 11之聚核苷酸序列的該聚腺苷酸化信號序列； (b) 第二質體DNA載體，自3'端至5'端，其包括含SEQ ID NO: 7之聚核苷酸序列的該啟動子序列、含SEQ ID NO: 8之聚核苷酸序列的該調控序列、含SEQ ID NO: 5之聚核苷酸序列的該信號肽編碼序列、含SEQ ID NO: 1之聚核苷酸序列的該第二聚核苷酸序列及含SEQ ID NO: 11之聚核苷酸序列的該聚腺苷酸化信號序列；以及 (c) 醫藥學上可接受之載劑， 其中該第一質體DNA載體及該第二質體DNA載體各自進一步包含具有SEQ ID NO: 12之聚核苷酸序列的卡那黴素抗性基因及具有SEQ ID NO: 10之聚核苷酸序列的複製起點，且 其中該第一質體DNA載體與該第二質體DNA載體係在同一組合物或兩種不同組合物中。

實施例65包含如實施例60之套組，其中該第一非天然存在之核酸分子係存在於第一腺病毒載體，較佳Ad26載體中，且該第二非天然存在之核酸分子係存在於第二腺病毒載體，較佳Ad26載體中。

實施例66包含如實施例65之套組，其中該第一腺病毒載體及該第二腺病毒載體各自5'端至3'端包含啟動子序列、調控序列、信號肽編碼序列、該第一聚核苷酸序列或該第二聚核苷酸序列，及聚腺苷酸化信號序列。

實施例67包含如實施例66之套組，其包含
(a) 第一Ad26載體，自3'端至5'端，其包括含SEQ ID NO: 17之聚核苷酸序列的啟動子序列、含SEQ ID NO: 23之聚核苷酸序列的調控序列、含SEQ ID NO: 17之聚核苷酸序列的信號肽編碼序列、含SEQ ID NO: 15之聚核苷酸序列的第一聚核苷酸序列及含SEQ ID NO: 24之聚核苷酸序列的聚腺苷酸化信號序列； (b) 第二Ad26載體，自3'端至5'端，其包括含SEQ ID NO: 17之聚核苷酸序列的啟動子序列、含SEQ ID NO: 23之聚核苷酸序列的調控序列、含SEQ ID NO: 17之聚核苷酸序列的信號肽編碼序列、含SEQ ID NO: 16之聚核苷酸序列的第二聚核苷酸序列及含SEQ ID NO: 24之聚核苷酸序列的聚腺苷酸化信號序列；以及 (c) 醫藥學上可接受之載劑， 其中該第一Ad26載體與該第二Ad26載體各自係在同一組合物或兩種不同組合物中。

實施例68包含如實施例64至67中任一項之套組，其中該套組不含編碼選自由B型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原及HBV L蛋白質抗原組成之群之HBV抗原的核酸分子，亦不含選自由B型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原及HBV L蛋白質抗原組成之群之HBV抗原。

實施例69包含如實施例34至36中任一項之組合物，或如實施例37至68中任一項之套組，其係用於在有需要之個體中誘發針對B型肝炎病毒(HBV)之免疫反應，較佳該個體患有慢性HBV感染。

實施例70包含一種另一免疫原性藥劑、較佳另一HBV抗原與如實施例34至36中任一項之組合物或如實施例37至68中任一項之套組的組合，其係用於在有需要之個體中誘發針對B型肝炎病毒(HBV)之免疫反應，較佳該個體患有慢性HBV感染。

實施例71包含如實施例34至36中任一項之組合物，或如實施例37至68中任一項之套組，其係用於治療有需要之個體的B型肝炎病毒(HBV)誘發之疾病，較佳該個體患有慢性HBV感染，且該HBV誘發之疾病係選自由晚期纖維化、肝硬化及肝細胞癌(HCC)組成之群。

實施例72包含一種另一治療劑、較佳另一抗HBV藥劑與如實施例34至36中任一項之組合物或如實施例37至68中任一項之套組的組合，其係用於治療有需要之個體的B型肝炎病毒(HBV)誘發之疾病，較佳該個體患有慢性HBV感染，且該HBV誘發之疾病係選自由晚期纖維化、肝硬化及肝細胞癌(HCC)組成之群。

實施例部分 2

實施例1包含一種非天然存在之核酸分子，其包含編碼HBV聚合酶抗原之第一聚核苷酸序列，該HBV聚合酶抗原包含與SEQ ID NO: 4至少98%一致之胺基酸序列，其中該HBV聚合酶抗原不具有逆轉錄酶活性及核糖核酸酶H活性。

實施例2包含如實施例1之非天然存在之核酸分子，其中該HBV聚合酶抗原能夠在哺乳動物中誘發針對至少兩種HBV基因型之免疫反應，較佳該HBV聚合酶抗原能夠在哺乳動物中誘發針對至少HBV基因型B、C及D之T細胞反應，且更佳地，該HBV聚合酶抗原能夠在人類個體中誘發針對至少HBV基因型A、B、C及D之CD8 T細胞反應。

實施例3包含如實施例1之非天然存在之核酸分子，其中該HBV聚合酶抗原包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。

實施例4包含如實施例1至3中任一項之非天然存在之核酸分子，其進一步包含編碼可操作地連接至該HBV聚合酶抗原之信號序列的聚核苷酸序列。

實施例5包含如實施例4之非天然存在之核酸分子，其中該信號序列包含SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 19之胺基酸序列，較佳該信號序列係由SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18之聚核苷酸序列編碼。

實施例6包含如實施例1至5中任一項之非天然存在之核酸分子，其中該第一聚核苷酸序列與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16至少90%一致。

實施例7包含如實施例6之非天然存在之核酸分子，其中該第一聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16之聚核苷酸序列。

實施例8包含如實施例1至7中任一項之非天然存在之核酸分子，其進一步包含編碼截短之HBV核心抗原的第二聚核苷酸序列，該截短之HBV核心抗原由SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14之胺基酸序列組成。

實施例9包含如實施例8之非天然存在之核酸分子，其中該第二聚核苷酸序列與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15至少90%一致。

實施例10包含如實施例9之非天然存在之核酸分子，其中該第二聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15之聚核苷酸序列。

實施例11包含如實施例8至10中任一項之非天然存在之核酸分子，其編碼包含該截短之HBV核心抗原可操作地連接至該HBV聚合酶抗原的融合蛋白。

實施例12包含如實施例11之非天然存在之核酸分子，其中該融合蛋白包含該截短之HBV核心抗原經由連接子可操作地連接至該HBV聚合酶抗原。

實施例13包含如實施例12之非天然存在之核酸分子，其中該連接子包含(AlaGly)_n 之胺基酸序列，且n係2至5之整數，較佳地該連接子係由包含SEQ ID NO: 22之聚核苷酸序列編碼。

實施例14包含如實施例13之非天然存在之核酸分子，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。

實施例15包含如實施例11至14中任一項之非天然存在之核酸分子，其中該融合蛋白進一步包含信號序列，較佳該信號序列包含SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 19之胺基酸序列，更佳該信號序列係由SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18之聚核苷酸序列編碼。

實施例16包含如實施例1至15中任一項之非天然存在之核酸分子，其進一步包含啟動子序列、視情況之一或多個另外的調控序列，較佳該啟動子序列包含SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 17之聚核苷酸序列，且該另外的調控序列係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 23，及SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO:24之聚腺苷酸化信號序列。

實施例17包含如實施例1至16中任一項之非天然存在之核酸分子，其中該非天然存在之核酸分子不編碼選自由B型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原及HBV L蛋白質抗原組成之群的HBV抗原。

實施例18包含一種載體，其包含如實施例1至17中任一項之非天然存在之核酸分子。

實施例19包含如實施例18之載體，其中該非天然存在之核酸分子自5'端至3'端包含啟動子序列、強化子序列、信號肽編碼序列、該第一聚核苷酸序列及聚腺苷酸化信號序列，視情況，該非天然存在之核酸分子進一步包含該第二聚核苷酸序列。

實施例20包含如實施例18或19之載體，其中該載體係質體DNA載體，且該質體DNA載體進一步包含複製起點及抗生素抗性基因。

實施例21包含如實施例20之載體，其中該質體DNA載體含有包含SEQ ID NO:10之聚核苷酸序列的該複製起點、包含SEQ ID NO: 12之聚核苷酸序列的該抗生素抗性基因、包含SEQ ID NO: 7之聚核苷酸序列的該啟動子序列、包含SEQ ID NO: 8之聚核苷酸序列的該強化子序列、包含SEQ ID NO: 5之聚核苷酸序列的該信號肽編碼序列、包含SEQ ID NO: 3之聚核苷酸序列的該第一聚核苷酸序列及包含SEQ ID NO: 11之聚核苷酸序列的該聚腺苷酸化信號序列，及視情況，包含SEQ ID NO: 1之聚核苷酸序列的該第二聚核苷酸序列。

實施例22包含如實施例18或19之載體，其中該載體係腺病毒載體，較佳為Ad26或Ad35載體。

實施例23包含如實施例22之載體，其中該腺病毒載體含有包含SEQ ID NO: 17之聚核苷酸序列的該啟動子序列、包含SEQ ID NO: 23之聚核苷酸序列的該調控序列、包含SEQ ID NO: 18之聚核苷酸序列的該信號肽編碼序列、包含SEQ ID NO: 15之聚核苷酸序列的該第二聚核苷酸序列、包含SEQ ID NO: 22之聚核苷酸序列的該連接子編碼序列、包含SEQ ID NO: 16之聚核苷酸序列的該第一聚核苷酸序列及包含SEQ ID NO: 24之聚核苷酸序列的該聚腺苷酸化信號序列。

實施例24包含一種非天然存在之多肽，其係由如實施例1至17中任一項之非天然存在之核酸分子編碼。

實施例25包含一種宿主細胞，其包含如實施例1至17中任一項之非天然存在之核酸分子或如實施例18至23中任一項之載體。

實施例26包含一種組合物，其包含如實施例1至17中任一項之非天然存在之核酸分子、如實施例18至23中任一項之載體或如實施例24之非天然存在之多肽，及醫藥學上可接受之載劑。

實施例27包含如實施例26之組合物，其包含如實施例1至7中任一項之第一聚核苷酸、如實施例8至10中任一項之第二聚核苷酸及醫藥學上可接受之載劑，其中該第一聚核苷酸及該第二聚核苷酸不包含在同一核酸分子中或同一核酸載體中。

實施例28包含一種套組，其包含：
(a) 包含編碼HBV聚合酶抗原之第一聚核苷酸的第一非天然存在之核酸分子，該HBV聚合酶抗原具有與SEQ ID NO: 4至少98%一致之胺基酸序列，其中該HBV聚合酶抗原不具有逆轉錄酶活性及核糖核酸酶H活性；
(b) 包含編碼截短之HBV核心抗原之第二聚核苷酸的第二非天然存在之核酸分子，該截短之HBV核心抗原由SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14之胺基酸序列組成；以及
(c) 醫藥學上可接受之載劑，
其中該第一非天然存在之核酸分子及該第二非天然存在之核酸分子係存在於同一非天然存在之核酸分子中或兩個不同的非天然存在之核酸分子中。

實施例29包含如實施例28之套組，其中該HBV聚合酶抗原能夠在哺乳動物中誘發針對至少兩種HBV基因型之免疫反應，較佳該HBV聚合酶抗原能夠在哺乳動物中誘發針對至少HBV基因型B、C及D之T細胞反應，且更佳地，該HBV聚合酶抗原能夠在人類個體中誘發針對至少HBV基因型A、B、C及D之CD8 T細胞反應。

實施例30包含如實施例29之套組，其中該HBV聚合酶抗原包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。

實施例31包含如實施例28至30中任一項之套組，其中該第一非天然存在之核酸分子及該第二非天然核酸分子中的至少一個進一步包含編碼可操作地連接至該HBV聚合酶抗原及該截短之HBV核心抗原中之至少一種的信號序列之聚核苷酸序列。

實施例32包含如實施例31之套組，其中該信號序列獨立地包含SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 19之胺基酸序列，較佳該信號序列獨立地由SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18之聚核苷酸序列編碼。

實施例33包含如實施例28至32中任一項之套組，其中該第一聚核苷酸序列與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16至少90%一致。

實施例34包含如實施例33之套組，其中該第一聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16之聚核苷酸序列。

實施例35包含如實施例28至34中任一項之套組，其中該第二聚核苷酸序列與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15至少90%一致。

實施例36包含如實施例35之套組，其中該第二聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15之聚核苷酸序列。

實施例37包含如實施例28至36中任一項之套組，其中該第一非天然存在之核酸分子及該第二非天然核酸分子中的至少一個進一步包含啟動子序列、視情況之強化子序列且亦視情況包含聚腺苷酸化信號序列，較佳該啟動子序列具有SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 17之聚核苷酸序列，該強化子序列獨立地具有SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 23之聚核苷酸序列，且該聚腺苷酸化信號序列獨立地具有SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 24之聚核苷酸序列。

實施例38包含如實施例28至37中任一項之套組，其中該套組不含編碼選自由B型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原及HBV L蛋白質抗原組成之群之HBV抗原的核酸分子，亦不含選自由B型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原及HBV L蛋白質抗原組成之群之HBV抗原。

實施例39包含如實施例28至38中任一項之套組，其中該第一非天然存在之核酸分子及該第二非天然存在之核酸分子係存在於同一載體中。

實施例40包含如實施例39之套組，其中該載體編碼呈兩種獨立蛋白質形式之該HBV聚合酶抗原及該截短之HBV核心抗原。

實施例41包含如實施例39之套組，其中該載體編碼包含該截短之HBV核心抗原可操作地連接至該HBV聚合酶抗原之融合蛋白。

實施例42包含如實施例41之套組，其中該融合蛋白包含該截短之HBV核心抗原經由連接子可操作地連接至該HBV聚合酶抗原。

實施例43包含如實施例42之套組，其中該連接子包含(AlaGly)_n 之胺基酸序列，且n係2至5之整數，較佳該連接子係由包含SEQ ID NO: 22之聚核苷酸序列編碼。

實施例44包含如實施例43之套組，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。

實施例45包含如實施例44之套組，其中該融合蛋白進一步包含信號序列，較佳該信號序列具有SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 19之胺基酸序列，更佳該信號序列係由SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18之聚核苷酸序列編碼。

實施例46包含如實施例45之套組，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列。

實施例47包含如實施例41至46中任一項之套組，其中該載體自5'端至3'端含有啟動子序列、強化子序列、信號肽編碼序列、該第二聚核苷酸序列、連接子編碼序列、該第一聚核苷酸序列及聚腺苷酸化信號序列。

實施例48包含如實施例47之套組，其中該載體係腺病毒載體，較佳為Ad26或Ad35載體。

實施例49包含如實施例48之套組，其中該腺病毒載體含有包含SEQ ID NO: 17之聚核苷酸序列的該啟動子序列、包含SEQ ID NO: 23之聚核苷酸序列的調控序列、包含SEQ ID NO: 18之聚核苷酸序列的該信號肽編碼序列、包含SEQ ID NO: 15之聚核苷酸序列的該第二聚核苷酸序列、包含SEQ ID NO: 22之聚核苷酸序列的該連接子編碼序列、包含SEQ ID NO: 16之聚核苷酸序列的該第一聚核苷酸序列及包含SEQ ID NO: 24之聚核苷酸序列的該聚腺苷酸化信號序列。

實施例50包含如實施例49之套組，其中該套組不含編碼選自由B型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原及HBV L蛋白質抗原組成之群之HBV抗原的核酸分子，亦不含選自由B型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原及HBV L蛋白質抗原組成之群之HBV抗原。

實施例51包含如實施例28至38中任一項之套組，其中該第一非天然存在之核酸分子及該第二非天然存在之核酸分子係存在於兩個不同的載體中。

實施例52包含如實施例51之套組，其中該第一非天然存在之核酸分子係存在於第一質體DNA載體中，且該第二非天然存在之核酸分子係存在於第二質體DNA載體中。

實施例53包含如實施例52之套組，其中該第一質體DNA載體及該第二質體DNA載體各自包含複製起點、抗生素抗性基因，且自5'端至3'端包含啟動子序列、調控序列、信號肽編碼序列、該第一聚核苷酸序列或該第二聚核苷酸序列，及聚腺苷酸化信號序列。

實施例54包含如實施例53之套組，其中該抗生素抗性基因係具有與SEQ ID NO: 12至少90%一致，較佳與SEQ ID NO: 12達100%一致之聚核苷酸序列的卡那黴素抗性基因。

實施例55包含如實施例54之套組，其包含
(a) 第一質體DNA載體，自3'端至5'端，其包括含SEQ ID NO: 7之聚核苷酸序列的該啟動子序列、含SEQ ID NO: 8之聚核苷酸序列的該調控序列、含SEQ ID NO: 5之聚核苷酸序列的該信號肽編碼序列、含SEQ ID NO: 3之聚核苷酸序列的該第一聚核苷酸序列及含SEQ ID NO: 11之聚核苷酸序列的該聚腺苷酸化信號序列；
(b) 第二質體DNA載體，自3'端至5'端，其包括含SEQ ID NO: 7之聚核苷酸序列的該啟動子序列、含SEQ ID NO: 8之聚核苷酸序列的該調控序列、含SEQ ID NO: 5之聚核苷酸序列的該信號肽編碼序列、含SEQ ID NO: 1之聚核苷酸序列的該第二聚核苷酸序列及含SEQ ID NO: 11之聚核苷酸序列的該聚腺苷酸化信號序列；以及
(c) 醫藥學上可接受之載劑，
其中該第一質體DNA載體及該第二質體DNA載體各自進一步包含具有SEQ ID NO: 12之聚核苷酸序列的卡那黴素抗性基因及具有SEQ ID NO: 10之聚核苷酸序列的複製起點，且
其中該第一質體DNA載體與該第二質體DNA載體係在同一組合物或兩種不同組合物中。

實施例56包含如實施例55之套組，其中該套組不含編碼選自由B型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原及HBV L蛋白質抗原組成之群之HBV抗原的核酸分子，亦不含選自由B型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原及HBV L蛋白質抗原組成之群之HBV抗原。

實施例57包含如實施例26之組合物，或如實施例27至55中任一項之套組，其係用於在有需要之個體中誘發針對B型肝炎病毒(HBV)之免疫反應，較佳該個體患有慢性HBV感染。

實施例58包含一種另一免疫原性藥劑、較佳另一HBV抗原與如實施例26之組合物或如實施例27至55中任一項之套組的組合，其係用於在有需要之個體中誘發針對B型肝炎病毒(HBV)之免疫反應，較佳該個體患有慢性HBV感染。

實施例59包含如實施例26或27之組合物，或如實施例28至56中任一項之套組，其係用於治療有需要之個體的B型肝炎病毒(HBV)誘發之疾病，較佳該個體患有慢性HBV感染，且該HBV誘發之疾病係選自由晚期纖維化、肝硬化及肝細胞癌(HCC)組成之群。

實施例60包含一種另一治療劑、較佳另一抗HBV藥劑與如實施例26或27之組合物或如實施例28至56中任一項之套組的組合，其係用於治療有需要之個體的B型肝炎病毒(HBV)誘發之疾病，較佳該個體患有慢性HBV感染，且該HBV誘發之疾病係選自由晚期纖維化、肝硬化及肝細胞癌(HCC)組成之群。
實例

本申請案之以下實例進一步說明本申請案之性質。應理解，以下實例並不限制本申請案且本申請案之範圍係由所附申請專利範圍決定。

實例 1 ： HBV 核心及 Pol 抗原序列之產生及質體優化

肝炎核心蛋白上之T細胞抗原決定基被認為對於消除B型肝炎感染及B型肝炎病毒蛋白，諸如聚合酶極為重要，可以用來改善反應之廣度。因此，選擇B型肝炎核心及聚合酶蛋白質作為設計治療性B型肝炎病毒(HBV)疫苗之抗原。

HBV 核心及聚合酶抗原共同序列之衍生化

基於HBV基因型B、C及D，產生HBV pol及核心抗原共同序列。自不同來源獲得不同HBV序列並針對核心及聚合酶蛋白質分別進行比對。隨後將所有亞型(A至H)之原始序列比對侷限於HBV基因型B、C及D。根據各蛋白質比對，確定單獨各亞型中及所有接合BCD序列中之共同序列。在變化之比對位置中，使用共同序列中最常見的胺基酸。

HBV 核心抗原之優化

HBV核心抗原共同序列係藉由使原生病毒蛋白質中產生缺失來優化。詳言之，使對應於C末端帶大量正電之區段的前基因組RNA衣殼化所需之三十四個胺基酸缺失。

HBV Pol 抗原 之優化

HBV pol抗原共同序列係藉由改變四個殘基以移除逆轉錄酶及核糖核酸酶H活性來優化。詳言之，將逆轉錄酶結構域之「YXDD」基元中的天冬胺酸殘基(D)變成天冬醯胺殘基(N)以除去任何配位功能，且由此消除核苷酸/金屬離子結合。另外，將核糖核酸酶H結構域之「DEDD」基元中的第一個天冬胺酸殘基(D)變成天冬醯胺殘基(N)且將第一個麩胺酸殘基(E)變成麩醯胺酸殘基(A)以除去Mg^{2 +} 配位。另外，HBV pol抗原序列經密碼子優化以擾亂包膜蛋白，包括S蛋白質及具有N末端延伸之S蛋白質形式前S1及前S2的內部開放閱讀框架。因此，包膜蛋白(前S1、前S2及S蛋白質)及X蛋白質之開放閱讀框架移除。

HBV 核心及 Pol 抗原表現策略之優化

測試三種不同策略以自質體載體獲得核心及pol抗原的最大及相等表現：(1)HBV核心及pol抗原與在編碼序列之間***之小AGAG框內融合以產生單一核心-Pol融合蛋白(圖 2A )；(2)藉助於核糖體滑移位點，特別是來自***(FMDV)之FA2滑移位點自一個質體表現核心及pol抗原以產生自單一mRNA表現個別核心及pol蛋白質之雙順反子表現載體(圖 2B )；以及(3)兩個獨立質體分別編碼HBV核心及pol抗原(圖 2C )。

活體外表現分析

將根據以上三種表現策略中之每一個的共同HBV核心及pol抗原之編碼序列選殖至可商購之表現質體pcDNA3.1中。用該等載體轉染HEK-293T細胞並藉由西方墨點法，使用HBV核心特異性抗原評價蛋白質表現。

轉錄後調控元件之優化

針對藉由使主要轉錄物穩定，促進其核輸出及/或改善轉錄-轉譯偶合來增進蛋白質表現，評價四個不同的轉錄後調控元件：(1)土拔鼠HBV轉錄後調控元件(WPRE)(GenBank：J04514.1)；(2)來源於人類載脂蛋白A1前驅體之內含子/外顯子序列(GenBank：X01038.1)；(3)1型人類T細胞白血病病毒(HTLV-1)長末端重複序列(LTR)之非轉譯R-U5結構域(GenBank：KM023768.1)；以及(4) HTLV-1 LTR、合成兔β-血球蛋白內含子(GenBank：V00882.1)及剪接強化子構成之複合序列(三重複合序列)。強化子序列係引入該等質體中CMV啟動子與HBV抗原編碼序列之間。利用西方墨點法未觀察到當在存在與不存在WPRE元件下自質體表現時核心抗原表現之顯著差異(圖 2D )。然而，當藉由西方墨點法評價經具有其他三個轉錄後調控序列之質體轉染之HEK293T細胞中的核心抗原表現時，該三強化子序列引起最強的核心抗原表現(圖 2E )。

選擇實現高效蛋白質分泌之信號肽

評價在HBV核心抗原之N末端處框內引入之三個不同信號肽：(1) Ig重鏈γ信號肽SPIgG(BAA75024.1)；(2) Ig重鏈ε信號肽SPIgE(AAB59424.1)；以及(3)胱抑素S前驅體信號肽SPCS(NP_0018901.1)。使用Signal P預測程式，藉由計算機模擬來優化核心融合物之信號肽裂解位點。藉由分析上清液中之核心蛋白含量來測定分泌效率。利用西方墨點分析使用在N末端融合之三個不同信號肽的核心抗原分泌展示，胱抑素S信號肽引起最高效之蛋白質分泌(圖 2F )。

DNA 疫苗載體優化

將在具有N末端胱抑素S信號肽序列之HBV抗原編碼序列的上游含有該三複合物強化子序列之經優化表現卡匣選殖至DNA疫苗載體pVax-1(Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)中。pVax-1中之表現卡匣含有人類CMV-IE啟動子，隨後為牛生長激素(BGH)源性聚腺苷酸化序列(pA)。細菌繁殖係由pUC複製起點驅動且卡那黴素抗性基因(Kan R)係由小真核啟動子驅動。pUC複製起點、KanR表現卡匣及由CMV-IE啟動子驅動之表現卡匣在質體主鏈內均呈相同取向。不過，在pVax-1載體中觀察到的核心抗原表現量明顯低於在pcDNA3.1載體中觀察到的表現量。

採用若干策略來改善蛋白質表現：(1)將整個pUCori-KanR卡匣倒轉成逆時針取向(pVD-核心)；以及(2)改變KanR基因之密碼子用法以及用來自pcDNA3.1載體之Amp啟動子替代Kan啟動子(pDK-核心)。兩種策略均恢復核心抗原表現，但用pDK載體之核心抗原表現量最高，該載體含有密碼子調整之Kan R基因、AmpR啟動子(代替KanR啟動子)及反向取向之pUCori-KanR卡匣。

將如圖 2G 中所示的四個不同HBV核心/pol抗原經優化之表現卡匣引入pDK質體主鏈中以分別測試圖 2A - 2C 中示出之三種表現策略。藉由西方墨點分析，使用核心及pol特異性抗體，針對核心及pol抗原表現在活體外測試該等質體。當核心及pol抗原係由獨立載體，即個別DNA載體pDK-核心及pDK-pol編碼時，實現細胞及分泌核心及pol抗原的最一致表現圖譜(圖 2H )。pDK-pol及pDK-核心載體之示意性表示分別顯示於圖 3A 及 3B 中。

實例 2 ： 表現截短之 HBV 核心抗原與 HBV Pol 抗原之融合物的腺病毒載體之產生

產生一種經設計為自單一開放閱讀框架表現融合蛋白的腺病毒載體。亦可設想例如使用兩個獨立表現卡匣，或使用2A樣序列分開該兩個序列以表現兩種蛋白質之另外的組態。

有關腺病毒載體之表現卡匣的設計

表現卡匣(圖解於圖 8A 及圖 8B 中)包含CMV啟動子(SEQ ID NO: 17)、內含子(SEQ ID NO: 23)(來源於人類ApoAI基因之片段，Genbank寄存號X01038鹼基對295-523，帶有ApoAI第二內含子)，隨後為在人類免疫球蛋白分泌信號編碼序列(SEQ ID NO: 18)之後的經優化編碼序列，即單獨核心或核心與聚合酶融合蛋白，且隨後為SV40聚腺苷酸化信號(SEQ ID NO: 24)。

包括分泌信號係歸因於過去一些含有分泌型轉殖基因的腺病毒載體顯示可製造性之改良，同時不影響所引發之T細胞反應的經驗(小鼠實驗)。

核心蛋白的最後兩個殘基(VV)及聚合酶蛋白質之前兩個殘基(MP)若融合，則產生接合序列(VVMP)，其存在於人類多巴胺受體蛋白(D3同功異型物)以及側接同源序列上。

核心與聚合酶序列之間AGAG連接子之***消除此同源序列且恢復成在人類蛋白質組之Blast中無其他匹配(hit)。

實例 3 ： 在小鼠中進行的 DNA 疫苗之活體內免疫原性研究

在小鼠中測試含有編碼HBV核心抗原或HBV聚合酶抗原之DNA質體的免疫治療性DNA疫苗。本研究之目的係設計用於偵測該疫苗在經由電穿孔肌肉內遞送至BALB/c小鼠中之後誘發的T細胞反應。初始免疫原性研究集中在確定由引入之HBV抗原引發的細胞免疫反應。

詳言之，測試質體包括pDK-Pol質體及pDK-核心質體，分別如圖 3A 及 3B 中所示且如上文在實例1中所描述。pDK-Pol質體編碼具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的聚合酶抗原，且pDK-核心質體編碼具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的核心抗原。首先，個別地測試由各質體誘發之T細胞反應。使用適合用於小鼠模型中之脛前肌中的可商購之TriGrid^TM 遞送系統-肌肉內(TDS-IM)，將DNA質體(pDNA)疫苗經由電穿孔肌肉內遞送至Balb/c小鼠中。有關藉由電穿孔將DNA肌肉內遞送至小鼠之方法及器件的另外的說明，參見國際專利申請公開案WO2017172838，及與本申請案同一天提交且代理人案號為688097-405U1的題為「用於遞送B型肝炎病毒(HBV)疫苗之方法及裝置(Method and Apparatus for the Delivery of Hepatitis B Virus(HBV)Vaccines)」的美國專利申請案，其揭示內容以全文引用的方式併入本文中。詳言之，將具有電極之間之間距為2.5 mm及電極直徑為0.030吋之電極陣列的TDS-IM v1.0器件之TDS-IM陣列經皮***選定之肌肉中，其中導電長度為3.2 mm及有效穿透深度為3.2 mm，且其中電極之菱形組態的長軸平行於肌纖維取向。在電極***之後，起始注射以將DNA(例如0.020 ml)分配於肌肉中。在完成IM注射之後，在約400 ms之總持續時間內，以10%工作循環(亦即，在約400 ms持續時間內，有效地施加電壓總計約40 ms)局部施加250 V/cm電場(施加之電壓為59.4-65.6 V，施加電流之限值小於4 A，0.16 A/sec)，總計6次脈衝。在完成電穿孔程序之後，移除TriGridTM陣列且使動物恢復。如表1中所概述，向BALB/c小鼠投與高劑量(20 µg)。向六隻小鼠投與編碼HBV核心抗原之質體DNA(pDK-核心；第1組)，向六隻小鼠投與編碼HBV pol抗原之質體DNA(pDK-pol；第2組)，且兩隻小鼠接受空載體作為陰性對照。動物間隔兩週接受兩次DNA免疫接種且在最後一次免疫接種之後一週收集脾細胞。

表 1 ：預備試驗之小鼠免疫接種實驗設計 .
CT，脛前肌；EP，電穿孔。

藉由IFN-γ酶聯免疫斑點(ELISPOT)分析及定量抗原特異性反應。在此分析法中，將自經免疫接種之動物分離的脾細胞與包含核心蛋白、Pol蛋白質或小肽前導序列及接合序列(每種肽2 µg/ml)的肽池一起培育隔夜。該等池由重疊11個殘基之15聚體肽組成，該等殘基匹配核心及Pol疫苗載體之基因型BCD共同序列。將較大的94 kDa HBV Pol蛋白質自中間分至兩個肽池中。用同源肽池刺激抗原特異性T細胞且使用ELISPOT分析法評估IFN-γ陽性T細胞。利用適當抗體且隨後顯色偵測來觀測在微量盤上呈有色斑點(稱為斑點形成細胞(SFC))形式的單一抗原特異性T細胞釋放之IFN-γ。

在用DNA疫苗質體pDK-核心(第1組)免疫接種之小鼠中獲得針對HBV核心之顯著T細胞反應，達到每10⁶ 個細胞1,000個SFC(圖 4 )。針對Pol 1肽池的Pol T細胞反應較強(每10⁶ 個細胞約1,000個SFC)。針對Pol-2之抗Pol細胞反應較弱可能歸因於小鼠中有限之MHC多樣性，此現象稱為T細胞免疫顯性，定義為一種抗原中之不同抗原決定基的不均等識別。進行確證研究以確證本研究中獲得的結果(資料未顯示)。

以上結果展示，用編碼HBV抗原之DNA質體疫苗進行疫苗接種誘發針對投與之HBV抗原的細胞免疫反應。

實例 4 ： 在小鼠中進行的組合之 pDK - 核心 / pDK - Pol 質體之劑量發現研究

此利用組合質體之劑量發現研究的目的係評價在小鼠中使用不同DNA劑量，在一個部位施用編碼HBV核心及pol抗原之DNA質體(pDNA)載體之混合物的免疫反應。在本研究中，在小鼠中測試含有兩個質體，即實例1中所述之pDK-pol及pDK-核心質體之1:1(w/v)混合物的免疫治療性DNA疫苗。如上文在實例3中所描述，經由電穿孔將DNA疫苗肌肉內遞送至Balb/c小鼠之一個解剖部位中。如表2中所概述，每個部位用含10 µg、1 µg及0.1 µg各質體DNA的組合之核心 及Pol 表現質體進行疫苗接種。測試每組中之八隻小鼠，且兩隻小鼠投與空載體作為陰性對照。動物間隔三週接受兩次DNA免疫接種且在最後一次免疫接種之後一週收集脾細胞。

表 2 ： 利用組合質體之劑量發現研究的小鼠免疫接種實驗設計。
pDNA，質體DNA；CT，脛前肌；EP，電穿孔。

如實例1中所描述，藉由IFN-γ酶聯免疫斑點(ELISPOT)分析及定量抗原特異性反應。在用由質體pDK-核心及pDK-Pol組成之組合DNA疫苗免疫接種之BALB/c小鼠中實現針對核心及Pol的相當大的T細胞反應(圖 5 )。就免疫反應幅值而言，用10 µg各質體免疫接種之第1組與僅用1 µg各質體免疫接種之第2組之間無統計學差異。此結果表明，在約1 µg核心抗原及Pol抗原表現質體下，T細胞反應達到最大程度。然而，在低10倍之DNA暴露下，亦即在0.1 µg各質體下，觀察到SFC明顯減少。針對Pol 1肽池之Pol T細胞反應係佔主導。針對Pol-2之抗Pol細胞反應較弱可能歸因於近親配種之小鼠中有限之MHC多樣性，此現象稱為T細胞免疫顯性，定義為一種抗原中之不同抗原決定基的不等識別。

以上結果展示，在用表現HBV核心及pol抗原之DNA質體之組合免疫接種的小鼠中，在1 µg各質體之劑量下發現相當大的T細胞反應，且在每一質體0.1 µg劑量下仍觀察到一定免疫反應。

實例 5 ： 在小鼠中進行之免疫干擾研究

歸於實際原因，將需要開發呈組合(混合)之載體調配物形式的組合HBV核心及pol抗原DNA疫苗。然而，利用多價疫苗可能發生免疫顯性且可能缺乏針對亞顯性抗原之免疫反應。因此，評估當與在不同解剖部位免疫接種任一載體相比較時由投與兩種抗原表現質體混合在一起之組合引起的免疫干擾，亦即核心及/或Pol特異性細胞反應之降低。

如實例3中所描述，經由電穿孔，用pDK-核心及/或pDK-pol DNA質體經肌肉內對Balb/c小鼠進行疫苗接種。如表3中概述，DNA質體(pDNA)係以每個部位5 µg之劑量投與，該等DNA質體係個別地施加、在一個部位組合(混合)施加或在獨立部位組合施加。動物間隔三週接受兩次DNA免疫接種且在最後一次免疫接種之後一週收集脾細胞。

表 3 ： 免疫干擾研究之小鼠免疫接種實驗設計.
CT，脛前肌。

如實例1中所描述，藉由IFN-γ酶聯免疫斑點(ELISPOT)分析及定量抗原特異性反應。在此實驗中，確定在BALB/c小鼠中強烈的核心及Pol特異性抗原反應(圖 6 )。基於混合兩種質體且施加於相同部位之第3組與在兩個不同部位經由電穿孔個別地施加表現核心及pol抗原之pDNA的第4組之間獲得基本上相同的T細胞反應，未觀察到明顯的免疫干擾。第1組有一隻動物顯示較低的針對Pol-2池之異常反應。在C57/Bl6小鼠中重複該實驗得到相當的結果。

以上結果展示，當組合兩種HBV抗原表現質體pDK-核心及pDK-Pol時，觀察到基本上無免疫干擾。

實例 6 ： DNA 疫苗在非人類靈長類動物中之功效的評價

本研究之目的係評價在食蟹獼猴(Cynomolgus monkey/Macaca fascicularis)中經由電穿孔肌肉內遞送之治療性HBV DNA疫苗的功效，及誘發並量測HBV特異性T細胞反應/細胞活化。

疫苗

本研究中使用之疫苗係分別編碼HBV核心抗原及HBV聚合酶抗原之兩個獨立DNA質體的組合。詳言之，如圖 3A 及 3B 中分別所示且如實例1中所描述，該等DNA質體係pDK-Pol質體(編碼具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的HBV聚合酶抗原)及pDK-核心質體(編碼具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的HBV核心抗原)。

投與該等DNA質體，將其以兩種質體之1:1(w/w)混合物形式遞送於一個解剖部位。利用適合用於非人類靈長類動物(NHP)模型中之TriGrid^TM 遞送系統-肌肉內(TDS-IM)對NHP進行電穿孔。有關藉由電穿孔將DNA肌肉內遞送至NHP之方法及器件的另外的說明，參見國際專利申請公開案WO2017172838，及與本申請案同一天提交且代理人案號為688097-405U1的題為「用於遞送B型肝炎病毒(HBV)疫苗之方法及裝置」的美國專利申請案，其揭示內容以全文引用的方式併入本文中。詳言之，將具有電極之間間距為6.0 mm且電極直徑為0.021或0.023吋之電極陣列的TDS-IM v1.0或TDS-IM v2.0之TDS-IM陣列分別經皮***選定之肌肉中，且該等電極之菱形組態的長軸平行於肌纖維取向。導電長度對於TDS-IM v1.0或TDS-IM v2.0均為5.0 mm，而有效穿透深度對於TDS-IM v1.0為15.5 mm且對於TDS-IM v2.0為9.0 mm。在電極***之後，起始注射以將DNA(例如1.0 ml)分配於肌肉中。在完成IM注射之後，在約400 ms總持續時間內，以10%工作循環(亦即，在約400 ms持續時間內，有效施加電壓總計約40 ms)局部施加250 V/cm電場(施加之電壓為142.4-157.6 V，施加電流之限值為0.6-4 A，0.16 A/sec)，且總計6次脈衝。在完成電穿孔程序之後，移除TriGridTM陣列且使動物恢復。初始免疫原性研究集中在確定由引入之HBV抗原引發的細胞免疫反應。

非人類靈長類動物

食蟹獼猴(n=30)係來源於中國(Covance Research Products Inc. USA)，在研究開始時，其年齡為2.5至5歲且重3.0至5.0 kg。根據獸醫學指南及國家研究委員會，Guide for the Care and Use of Laboratory Animals , 第8版, Washington DC: National Academies Press(2011)，將其群體性圈養於豐富環境中。在開始研究之前，使動物適應環境2週時間。在經電穿孔投與各質體之前，用***使猴麻醉。在每次免疫接種之後2週，將血液收集於含有肝素鈉之小瓶中。使用菲科爾梯度(ficoll gradient)分離PBMC並將其儲存於液氮貯罐中以待分析。

在非人類靈長類動物中之肌肉內 / 電穿孔投藥

如表4中所概述，在第0天、第36天及第62天，進行三次質體投與(第1組)。利用設定成19 mm(短)注射深度的遞送系統，經由電穿孔將pDK-核心(1.0 mg)及pDK-Pol(1.0 mg)投與四頭肌(股外側肌)中。對於每次注射，交替腿肌肉投與。含有DNA質體之注射器裝備有適於NHP四頭肌之注射深度限制器，適合用於肌肉中約10 mm之注射目標深度且菱形組態之長軸平行於肌纖維取向。在完成IM注射之後，立即啟動電穿孔裝置，在總計40 mS持續時間內，經400 mS時間間隔以250 V/cm電極間距之幅值對肌肉進行電刺激。在第0天、第14天、第50天及第76天收集樣品，並藉由ELISPOT及細胞內細胞介素染色進行分析。

表 4 ： NHP疫苗接種實驗設計

ELISPOT 分析

使用靈長類動物IFN-γ ELISpot套組(R&D Systems, USA, 目錄號EL961)，藉由IFN-γ酶聯免疫斑點(ELISPOT)分析及定量抗原特異性反應。在此分析法中，將自經免疫接種之動物分離的PBMC一式三份孔地與包含核心蛋白及Pol蛋白質之肽池(2µg/ml)一起培育隔夜。該等池由重疊11個殘基之15聚體肽組成，該等殘基匹配核心及Pol疫苗載體之基因型ABCD共同序列。合成90%純度的肽(JPT, Germany)。將較大的94 kDa HBV Pol蛋白質自中間分至兩個肽池中。利用適當抗體且隨後顯色偵測來觀測在微量盤上呈有色斑點(稱為斑點形成細胞(SFC))形式的單一抗原特異性T細胞釋放之IFN-γ。結果顯示於圖 7A 中。

細胞內細胞介素染色 ( ICS )

使用細胞內細胞介素染色(ICS)研究疫苗誘發之T細胞反應。將冷凍之PBMC解凍並在10% FBS、RPMI培養基中靜置隔夜，隨後在10% FBS、含有Golgiplug蛋白質轉運抑制劑(Protein Transport Inhibitor)(1 μg/μl)之RPMI培養基中，用疫苗—***序列匹配之核心、Pol-1或Pol-2肽池(2 μg/μl)、DMSO或白細胞活化混合液刺激6小時。用可固定的死活細胞鑑定染料(fixable viability dye) eFluor 780(65-0865-14, eBioscience)對經刺激之細胞染色，並用固定/透性化溶液(554714, BD Biosciences)處理20分鐘，隨後如下表5中所示，用細胞內染色混合物染色30分鐘。使用Fortessa流式細胞儀，利用適當單色補償對照獲得經染色之細胞。反應量值報導為在刺激之後表現IFN-γ、TNF-α或IL-2之CD4⁺ 或CD8⁺ T細胞的百分含量。結果顯示於圖 7B 中。

表 5 ： 用於細胞內細胞介素染色分析之抗體組

結果

ELISPOT資料(圖 7A )顯示在兩次免疫接種之後出現強烈的核心及Pol-2反應。第三次免疫接種使IFN-γ量值大大增加。Pol-1肽池引發中等反應，該反應亦在第三次免疫接種下改善，不過改善程度明顯不如核心及Pol-2高。因為未能成功自第五隻猴抽取到血液，故第76天資料僅包括來自四隻NHP之結果。每一組內之較大變化係由NHP來源於遠親雜交種引起，且基因多樣性可以引起不同免疫反應。

ICS分析資料(圖 7B )顯示，由HBV肽刺激引起之細胞介素反應係CD8驅動的且對核心及Pol-2肽池具有特異性，與先前利用ELISPOT觀察到的相同。在ICS分析中起反應之NHP與ELISPOT分析中起反應之個體相同。儘管少數個體之ICS反應不如同在ELISPOT資料中所見一般顯示陽性，但此可以歸於ELISPOT分析之較高靈敏度。

結論

以上結果展示，在藉由經電穿孔肌肉內注射，用pDK核心及pDK-Pol疫苗之組合免疫接種之NHP中，在1.0 mg各質體之劑量下發現明顯之T細胞反應，並在兩次免疫接種之後偵測到肽特異性反應且在三次免疫接種之後反應甚至更大。在第76天，ELISPOT分析結果顯示，肽池核心、Pol-1及Pol-2在各測試NHP(4/5隻NHP)中誘發陽性IFN-γ T細胞反應。針對來自經免疫接種NHP之PBMC的ICS分析顯示，HBV肽特異性反應係CD8驅動的，且針對核心及Pol-2肽池之反應最強。

實例 7 ： DNA 疫苗在人類個體中之功效的評價

評價在人類個體中經電穿孔肌肉內遞送之治療性HBV DNA疫苗的功效。

人類個體

人類個體係患有呈HBsAg陽性之慢性HBV感染的成年患者。用HBV聚合酶抑制劑(恩替卡韋或替諾福韋)治療人類個體。

疫苗

向人類患者投與分別編碼HBV核心抗原及HBV聚合酶抗原之兩個獨立DNA質體的組合。詳言之，如圖 3A 及 3B 中分別所示且如實例1中所描述，該等DNA質體係pDK-Pol質體(編碼具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的HBV聚合酶抗原)及pDK-核心質體(編碼具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的HBV核心抗原)。根據隨機分組、安慰劑對照之遞增劑量試驗，該等DNA質體係以兩個質體之1:1混合物形式以不同劑量，特定言之0.25 mg、1 mg及6 mg總質體之劑量投與。

在人類個體中之肌肉內 / 電穿孔投與

使用適合用於人類之TriGrid^TM 遞送系統-肌肉內(TDS-IM)，藉由電穿孔以2至3次肌肉內免疫接種向人類個體投與DNA質體。一些患者投與安慰劑(亦即，不含HBV抗原編碼序列之質體)作為對照。使用適合用於人類之TriGrid^TM 遞送系統-肌肉內(TDS-IM)，藉由電穿孔遞送質體DNA。有關藉由電穿孔將DNA肌肉內遞送至人類之方法及器件的另外的說明，參見國際專利申請公開案WO2017172838，及與本申請案同一天提交且代理人案號為688097-405U1的題為「用於遞送B型肝炎病毒(HBV)疫苗之方法及裝置」的美國專利申請案，其揭示內容以全文引用的方式併入本文中。舉例而言，可以將分別具有電極之間間距為6.0 mm且電極直徑為0.023吋之電極陣列的TDS-IM v2.0之TDS-IM陣列經皮***選定之肌肉中，其中該等電極之菱形組態的長軸平行於肌纖維取向。導電長度可以為5.0 mm，而有效穿透深度可以為19 mm。在電極***之後，起始注射以將DNA(例如1.0 ml)分配於肌肉中。在完成IM注射之後，在約400 ms之總持續時間內，以10%工作循環(亦即，在約400 ms持續時間內，有效地施加電壓總計約40 ms)局部施加250 V/cm電場(施加之電壓為142.4-157.6 V，施加電流之限值為0.6-4 A，0.16 A/sec)，總計6次脈衝。在電穿孔程序完成之後，移除TriGridTM陣列並使人類個體恢復。

在免疫接種後之各種時間點，自患者收集血液樣品。評價在免疫接種後3至6個月患者中免疫接種後HBsAg含量的發展，特別是評價符合演變成臨床血清轉化之含量。在免疫接種後6至12個月的患者中評價HBsAg之持久喪失及臨床疾病(例如肝硬化、肝細胞癌)之減輕。

實例 8 ：在小鼠中進行的腺病毒載體之活體內免疫原性研究

在小鼠中測試含有編碼HBV核心抗原或HBV聚合酶抗原之腺病毒載體的免疫治療性DNA疫苗。本研究之目的係偵測該疫苗在肌肉內遞送至F1小鼠(C57BL/6×Balb/C)中之後誘發的T細胞反應。初始免疫原性研究集中在確定由引入之HBV抗原引發的細胞免疫反應。確切地說，測試的腺病毒載體含有如圖8A及8B中所示之表現卡匣。

活體內免疫原性研究

為了評價腺病毒疫苗之活體內免疫原性，將HBV腺病毒載體經肌肉內投與F1小鼠體內。該等免疫原性研究集中在確定由HBV抗原核心及聚合酶引發的細胞免疫反應。如表6中所概述，對F1小鼠進行投與。動物接受一次HBV載體免疫接種。在九週後收集脾細胞。

表 6 ：關於用腺病毒載體免疫接種小鼠之實驗設計
IM：肌肉內；vp：病毒粒子；

關於 HBV 腺病毒載體免疫原性之評價

藉由IFN-γ酶聯免疫斑點(ELISPOT)分析及定量抗原特異性反應。在本分析中，將自免疫接種之動物分離的脾細胞與包含核心及Pol蛋白質(2 µg/ml各肽)之肽池一起培育。該等池由重疊11個殘基之15聚體肽組成，該等殘基匹配核心及Pol腺病毒載體之基因型ABCD共同序列。將較大的94 kDa HBV Pol蛋白質自中間分至兩個肽池中。在ELISPOT中，利用適當抗體且隨後顯色偵測來觀測在微量盤上呈有色斑點(稱為斑點形成細胞(SFC))形式的單一抗原特異性T細胞釋放之IFN-γ。

結果顯示於圖 9 中。自該等結果可以看出，HBV腺病毒載體，尤其是核心聚合酶融合物及核心腺病毒載體之組合引起核心及聚合酶特異性T細胞反應。此等資料指示，編碼HBV核心及pol抗原之腺病毒載體針對F1小鼠中之核心及pol產生穩定的T細胞反應。

應理解，本文所描述之實例及實施例僅出於說明之目的，且在不背離其廣義發明概念情況下，可以對以上描述之實施例作出改變。因此，應理解，本發明不限於所揭示之特定實施例，而是意圖涵蓋在所附申請專利範圍所限定之本發明精神及範圍內之修改。
參考文獻 1. Cohen et al. “Is chronic hepatitis B being undertreated in the United States?”J. Viral Hepat . (2011) 18(6), 377-83. 2. Obeng-Adjei et al. “DNA vaccine cocktail expressing genotype A and C HBV surface and consensus core antigens generates robust cytotoxic and antibody responses and mice and Rhesus macaques”Cancer Gene Therapy (2013) 20, 652-662. 3. World Health Organization, Hepatitis B: Fact sheet No. 204 [Internet] 2015 March. Available from http://www.who.nt/mediacentre/factsheets/fs204/en/. 4. Belloni et al. “IFN-α inhibits HBV transcription and replication in cell culture and in humanized mice by targeting the epigenetic regulation of the nuclear cccDNA minichromosome”J. Clin. Invest . (2012) 122(2), 529-537. 5. Michel et al. “Therapeutic vaccines and immune-based therapies for the treatment of chronic hepatitis B: perspectives and challenges.”J. Hepatol . (2011) 54(6), 1286-1296.

當結合隨附圖式閱讀時，將更好地理解本發明之前述發明內容以及以下實施方式。應理解，本發明不限於附圖中顯示之確切實施例。

在附圖中：

圖 1A-1B 描繪B型肝炎病毒之基因組及病毒生命週期；圖 1A 係B型肝炎病毒(HBV)之基因組的圖式；在原生病毒中，聚合酶蛋白質(Pol)含有在不同開放閱讀框架中的包膜蛋白之編碼序列；該等包膜蛋白(前S1、前S2及S)係在同一開放閱讀框架中；圖 1B 顯示HBV之病毒生命週期；

圖 2A-2H 顯示如實例1中所描述的編碼HBV pol及核心抗原之表現卡匣及DNA質體的設計及優化；圖 2A 係一種表現策略之示意性表示，其中HBV核心及pol抗原之編碼序列係框內融合；圖 2B 係一種表現策略之示意性表示，其中核心及pol抗原之編碼序列係藉助於核糖體FA2滑移位點自單一質體表現；圖 2C 係一種表現策略之示意性表示，其中核心及pol抗原係由兩個獨立質體表現；圖 2D 係在存在及不存在轉錄後調控元件WPRE下表現核心抗原之質體轉染的HEK293T細胞中核心抗原表現之西方墨點(Western blot)；表現係使用α-核心抗體在細胞溶解產物(左)及上清液(sup；右)中測試；圖 2E 係西方墨點分析，顯示出用核心表現質體轉染之HEK293T細胞中核心表現的比較，該核心表現質體包括來源於人類載脂蛋白A1前驅體之內含子/外顯子序列(「AI內含子」)、1型人類T細胞白血病病毒(HTLV-1)長末端重複序列(LTR)之非轉譯R-U5結構域(「HTLV R」)，或HTLV-1 LTR、合成兔β-血球蛋白內含子及剪接強化子構成之三強化子複合序列(「triple」)；未標記之泳道係作為尺寸標記物的經純化之核心蛋白；表現係在溶解產物(左)及上清液(sup；右)中測試；利用三強化子複合序列之核心抗原表現量最高；圖 2F 係使用不同信號肽與HBV核心抗原N末端之融合物的核心抗原分泌情況之西方墨點分析；利用胱抑素S信號肽觀察到最高效之蛋白質分泌；圖 2G 係圖 2A - 2C 中所示三種表現策略各自之經優化HBV核心/聚合酶抗原表現卡匣的示意性表示；CMVpr：人類CMV-IE啟動子；TRE：三強化子序列；SP：胱抑素S信號肽；FA2：FMDV核糖體滑移位點；pA：BGH聚腺苷酸化信號；圖 2H 係有關含有圖 2G 中所示表現卡匣中之每一個的pDK載體之HBV核心及pol抗原表現的西方墨點分析；泳道1及2：pDK-核心；泳道3及4：pDK-聚合酶；泳道5及6：pDK-核心FA2聚合酶；泳道7及8：pDK-核心-聚合酶融合物：當該等抗原係由獨立載體編碼時，觀察到細胞及經分泌核心及聚合酶抗原之最一致的表現圖譜；

圖 3A - 3B 顯示根據本申請案之實施例之DNA質體的示意性表示；圖 3A 顯示根據本申請案一個實施例的編碼HBV核心抗原之DNA質體；圖 3B 顯示根據本申請案一個實施例的編碼HBV聚合酶(pol)抗原之DNA質體；HBV核心及pol抗原係在CMV啟動子控制下表現且在N末端帶有胱抑素S信號肽，該信號肽在自細胞分泌時自所表現之抗原裂解；該質體之轉錄調控元件包括位於CMV啟動子與編碼HBV抗原之聚核苷酸序列之間的強化子序列及位於編碼HBV抗原之聚核苷酸序列下游的bGH聚腺苷酸化序列；在該質體中以反向取向包括含處於Amp^r (bla)啟動子控制下之卡那黴素(kanamycin)抗性基因的第二表現卡匣；亦包括反向取向之複製起點(pUC)；

圖 4 顯示如實例2中所描述，用表現HBV核心抗原或HBV pol抗原之不同DNA質體免疫接種的Balb/c小鼠之ELISPOT反應；用於刺激自各種經疫苗接種之動物組分離之脾細胞的肽池以灰度指示；y軸上指示的反應性T細胞之數量以每10⁶ 個脾細胞的斑點形成細胞(SFC)數表示；

圖 5 顯示根據實例3中描述之劑量發現研究，用表現HBV核心抗原及HBV pol抗原之DNA質體的組合免疫接種之Balb/C小鼠的ELISPOT反應；用於刺激自各種經疫苗接種之動物組分離之脾細胞的肽池以灰度指示；y軸上指示的反應性T細胞之數量以每10⁶ 個脾細胞的斑點形成細胞(SFC)數表示；

圖 6 顯示根據如實例4中所描述之免疫干擾研究，用表現HBV核心抗原及HBV pol抗原之DNA質體(pDNA)免疫接種之Balb/c小鼠的ELISPOT反應；第1組，僅核心 pDNA；第2組，僅Pol pDNA；第3組，混合的核心 與Pol pDNA；第4組，分別在不同部位施用之核心 及Pol pDNA；用於刺激自各種經疫苗接種之動物組分離之脾細胞的肽池以灰度指示；y軸上指示的反應性T細胞之數量以每10⁶ 個脾細胞的斑點形成細胞(SFC)數表示；

圖 7A 及 7B 顯示如實例5中所描述，在NHP中根據本申請案之一個實施例之DNA疫苗的免疫原性；圖 7A 顯示在用表現HBV核心及Pol抗原之DNA質體免疫接種之後的IFN-γ細胞介素反應；用於刺激自經疫苗接種之動物組分離之PBMC的肽池以灰度指示；y軸上指示的反應性T細胞之數量以每10⁶ 個PBMC的斑點形成細胞(SFC)數表示；圖 7B 顯示如藉由流式細胞測量術量測的針對核心、Pol-1及Pol-2肽池之CD4及CD8記憶T細胞免疫反應；圖中顯示由第76天得到的結果，以各池減去僅DMSO介質背景之後的針對該3個池之CD4或CD8 T細胞反應(IFN-γ、IL-2及TNF-α)百分比表示；CD4反應顯示於左側且CD8反應顯示於右側；

圖 8A 及 8B 顯示根據本申請案之實施例的腺病毒載體中之表現卡匣之示意性表示；圖 8A 顯示截短之HBV核心抗原的表現卡匣，其含有CMV啟動子、內含子(來源於人類ApoAI基因之片段-GenBank寄存編號X01038鹼基對295-523，帶有ApoAI第二內含子)、人類免疫球蛋白分泌信號，隨後為截短之HBV核心抗原的編碼序列及SV40聚腺苷酸化信號；圖 8B 顯示截短之HBV核心抗原可操作地連接至HBV聚合酶抗原之融合蛋白的表現卡匣，除HBV抗原外，其在其他方面與截短之HBV核心抗原之表現卡匣相同；且

圖 9 顯示如實例8中所描述，用HBV腺病毒載體免疫接種之F1小鼠(C57BL/6×Balb/C)的ELISPOT反應；用於刺激自各種經疫苗接種動物組分離之脾細胞的HBV核心或聚合酶肽池以黑色(核心)及灰度(pol)指示；Pol1及pol2反應相加；X軸顯示腺病毒載體劑量及實驗組。y軸上指示的反應性T細胞之數量以每10⁶ 個脾細胞的斑點形成細胞(SFC)數表示。

Claims (25)

1. 一種組合物，其包含： (a) 包含編碼HBV聚合酶抗原之第一聚核苷酸的第一非天然存在之核酸分子，該HBV聚合酶抗原具有與SEQ ID NO: 4至少90%一致之胺基酸序列，其中該HBV聚合酶抗原不具有逆轉錄酶活性及核糖核酸酶H(RNAse H)活性； (b) 包含編碼截短之HBV核心抗原之第二聚核苷酸的第二非天然存在之核酸分子，該截短之HBV核心抗原由與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14至少95%一致之胺基酸序列組成；以及 (c) 醫藥學上可接受之載劑， 其中該第一非天然存在之核酸分子及該第二非天然存在之核酸分子係存在於同一非天然存在之核酸分子中或兩個不同的非天然存在之核酸分子中。
2. 一種套組，其包含： (a) 包含編碼HBV聚合酶抗原之第一聚核苷酸的第一非天然存在之核酸分子，該HBV聚合酶抗原具有與SEQ ID NO: 4至少90%一致之胺基酸序列，其中該HBV聚合酶抗原不具有逆轉錄酶活性及核糖核酸酶H活性； (b) 包含編碼截短之HBV核心抗原之第二聚核苷酸的第二非天然存在之核酸分子，該截短之HBV核心抗原由與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14至少90%一致之胺基酸序列組成；以及 (c) 醫藥學上可接受之載劑， 其中該第一非天然存在之核酸分子及該第二非天然存在之核酸分子係存在於同一非天然存在之核酸分子中或兩個不同的非天然存在之核酸分子中。
3. 如請求項1或請求項2之組合物或套組，其中該第一聚核苷酸編碼包含與SEQ ID NO: 4至少98%一致之胺基酸序列的HBV聚合酶抗原，且該第二聚核苷酸編碼由SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14之胺基酸序列組成的HBV核心抗原。
4. 如請求項1或請求項2之組合物或套組，其中該第一聚核苷酸編碼含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的HBV聚合酶抗原。
5. 如請求項1至4中任一項之組合物或套組，其中該第一非天然存在之核酸分子及該第二非天然存在之核酸分子中的至少一個進一步包含編碼可操作地連接至該HBV聚合酶抗原及該截短之HBV核心抗原中之至少一種的信號序列的聚核苷酸序列。
6. 如請求項5之組合物或套組，其中該信號序列獨立地包含SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 19之胺基酸序列，較佳地該信號序列係由SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 18之聚核苷酸序列編碼。
7. 如請求項1至6中任一項之組合物或套組，其中該第一聚核苷酸序列與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16至少90%一致。
8. 如請求項7之組合物或套組，其中該第一聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16之聚核苷酸序列。
9. 如請求項1至8中任一項之組合物或套組，其中該第二聚核苷酸序列與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15至少90%一致。
10. 如請求項9之組合物或套組，其中該第二聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15之聚核苷酸序列。
11. 如請求項1至10中任一項之組合物或套組，其中該第一非天然存在之核酸分子及該第二非天然存在之核酸分子係存在於同一載體中。
12. 如請求項11之組合物或套組，其中該載體編碼包含該截短之HBV核心抗原視情況經由連接子可操作地連接至該HBV聚合酶抗原的融合蛋白。
13. 如請求項12之組合物或套組，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。
14. 如請求項12或請求項13之組合物或套組，其中該載體自5'端至3'端含有啟動子序列、強化子序列、信號肽編碼序列、該第二聚核苷酸序列、連接子編碼序列、該第一聚核苷酸序列及聚腺苷酸化信號序列。
15. 如請求項14之組合物或套組，其中該載體係腺病毒載體，較佳為Ad26或Ad35載體。
16. 如請求項15之組合物或套組，其中該腺病毒載體含有包含SEQ ID NO: 17之聚核苷酸序列的該啟動子序列、包含SEQ ID NO: 23之聚核苷酸序列的調控序列、包含SEQ ID NO: 18之聚核苷酸序列的該信號肽編碼序列、包含SEQ ID NO: 15之聚核苷酸序列的該第二聚核苷酸序列、包含SEQ ID NO: 22之聚核苷酸序列的該連接子編碼序列、包含SEQ ID NO: 16之聚核苷酸序列的該第一聚核苷酸序列及包含SEQ ID NO: 24之聚核苷酸序列的該聚腺苷酸化信號序列。
17. 如請求項1至10中任一項之組合物或套組，其中該第一非天然存在之核酸分子及該第二非天然存在之核酸分子係存在於兩個不同載體中。
18. 如請求項17之組合物或套組，其中該第一非天然存在之核酸分子係存在於第一質體DNA載體中，且該第二非天然存在之核酸分子係存在於第二質體DNA載體中。
19. 如請求項18之組合物或套組，其中該第一質體DNA載體及該第二質體DNA載體各自包含複製起點、抗生素抗性基因且自5'端至3'端包含啟動子序列、調控序列、信號肽編碼序列、該第一聚核苷酸序列或該第二聚核苷酸序列，及聚腺苷酸化信號序列。
20. 如請求項19之組合物或套組，其中該抗生素抗性基因係具有與SEQ ID NO: 12至少90%一致，較佳地與SEQ ID NO: 12達100%一致之聚核苷酸序列的卡那黴素抗性基因。
21. 如請求項20之組合物或套組，其包含 (a) 第一質體DNA載體，自3'端至5'端，其包括含SEQ ID NO: 7之聚核苷酸序列的該啟動子序列、含SEQ ID NO: 8之聚核苷酸序列的該調控序列、含SEQ ID NO: 5之聚核苷酸序列的該信號肽編碼序列、含SEQ ID NO: 3之聚核苷酸序列的該第一聚核苷酸序列及含SEQ ID NO: 11之聚核苷酸序列的該聚腺苷酸化信號序列； (b) 第二質體DNA載體，自3'端至5'端，其包括含SEQ ID NO: 7之聚核苷酸序列的該啟動子序列、含SEQ ID NO: 8之聚核苷酸序列的該調控序列、含SEQ ID NO: 5之聚核苷酸序列的該信號肽編碼序列、含SEQ ID NO: 1之聚核苷酸序列的該第二聚核苷酸序列及含SEQ ID NO: 11之聚核苷酸序列的該聚腺苷酸化信號序列；以及 (c) 醫藥學上可接受之載劑， 其中該第一質體DNA載體及該第二質體DNA載體各自進一步包含具有SEQ ID NO: 12之聚核苷酸序列的卡那黴素抗性基因及具有SEQ ID NO:10之聚核苷酸序列的複製起點，且 其中該第一質體DNA載體與該第二質體DNA載體係在同一組合物或兩種不同組合物中。
22. 如請求項1至21中任一項之組合物或套組，其係用於在有需要之個體中誘發針對B型肝炎病毒之免疫反應，較佳該個體患有慢性HBV感染。
23. 如請求項1至21中任一項之組合物或套組，其係用於治療有需要之個體的B型肝炎病毒(HBV)誘發之疾病，較佳該個體患有慢性HBV感染，且該HBV誘發之疾病係選自由晚期纖維化、肝硬化及肝細胞癌(HCC)組成之群。
24. 一種非天然存在之核酸分子，其包含編碼HBV聚合酶抗原之第一聚核苷酸序列，該HBV聚合酶抗原包含與SEQ ID NO: 4至少98%一致之胺基酸序列，其中該HBV聚合酶抗原不具有逆轉錄酶活性及核糖核酸酶H活性，其中該HBV聚合酶抗原能夠在哺乳動物中誘發針對至少兩種HBV基因型之免疫反應，較佳地，該HBV聚合酶抗原能夠在哺乳動物中誘發針對至少HBV基因型B、C及D之T細胞反應，且更佳地，該HBV聚合酶抗原能夠在人類個體中誘發針對至少HBV基因型A、B、C及D之CD8 T細胞反應，視情況，該非天然存在之核酸分子進一步包含編碼截短之HBV核心抗原的第二聚核苷酸序列，該截短之HBV核心抗原由SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 14之胺基酸序列組成。
25. 如請求項24之非天然存在之核酸分子，其編碼包含該截短之HBV核心抗原視情況經由連接子可操作地連接至該HBV聚合酶抗原的融合蛋白。