TW201922274A - VE-鈣黏蛋白表現促進劑及/或整聯蛋白α5表現促進劑 - Google Patents
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Abstract
本發明之目的在於提供一種有關微血管之穩定化之物質。本發明係基於發現了:選自由金盞花、西伯利亞人參、及肉蓯蓉所組成之群中之植物體之萃取物、或酵母萃取物增加VE-鈣黏蛋白或整聯蛋白α5之基因表現。
Description
本發明係關於一種有關微血管之穩定化之技術領域。
微血管係將動脈與靜脈連接之細小之血管,發揮對構成活體之細胞供給血液之作用。藉由自微血管所供給之血液,可將氧及營養素供給至細胞,並回收二氧化碳及老廢物。已知微血管伴隨年齡增加而減少,微血管之減少對各種器官之老化產生影響。例如,若微血管減少,則腺細胞之活性降低而使黏液之分泌降低。腺細胞存在於皮膚、眼、鼻、口、喉、胃、腸、膀胱、子宮、***、肛門等部位。藉由該等部位中之微血管減少,而黏液之分泌降低,根據部位之不同,可成為例如乾眼症、充血、鼻炎、口炎、牙齦炎、胃脹、胃炎、腹瀉、便秘、膀胱炎、***炎等各種疾病之原因。又,已知皮膚亦對微血管之狀態產生影響,藉由微血管減少,而表皮細胞之新陳代謝減少,從而代謝回轉減少;以及產生因真皮纖維母細胞之活性降低導致之彈性纖維之減少等,可引起皮膚之黃褐斑、皺紋、鬆弛、暗沉等美容上之問題。又,藉由因微血管之減少導致之血流之惡化,亦可產生對毛母細胞之影響、頭髮之乾燥脆弱、頭屑、脫髮、白頭髮等頭髮之問題。
與包含內膜、中膜、外膜之三層之動脈或靜脈不同,微血管僅包含內膜。微血管之內膜係包含血管內皮細胞及以血管內皮細胞為基底之基底膜。皮膚下之動脈係自皮下組織朝向真皮上行,於真皮層形成平面且網狀地擴展之皮下血管群落。自皮下血管群落所分支之微血管進而上行,於乳頭下層進而形成平面且網狀地擴展之乳頭下血管群落。自乳頭下血管群落所分支之微血管進而上行,於與表皮之交界之表皮基底膜之正下方之真皮乳頭層構成微血管環(capillary loop),可使氧及營養素到達存在於表皮基底層之表皮細胞。
於血管內皮細胞中,主要藉由VE-鈣黏蛋白之細胞黏著分子之作用而使內皮細胞間黏著,又,藉由於內皮細胞之細胞膜進行表現之整聯蛋白之作用,而經由基底膜與細胞外基質進行相互作用(非專利文獻1)。又,可知整聯蛋白等黏著分子亦於纖維母細胞中表現,纖維母細胞亦與細胞外基質進行相互作用(非專利文獻2)。
[先前技術文獻]
[非專利文獻]
[先前技術文獻]
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Nat. Rev. Cancer (2008), 8(8): 604-617
[非專利文獻2]J. Inv. Dermatology (2013) vol. 133, 899-906
[非專利文獻2]J. Inv. Dermatology (2013) vol. 133, 899-906
[發明所欲解決之問題]
本發明之課題在於提供一種有助於微血管之穩定化、功能提高、增加之作用之物質,而改善伴隨微血管之減少、惡化之症狀。
[解決問題之技術手段]
[解決問題之技術手段]
本發明者等人認為構成微血管之血管內皮細胞中之黏著分子有助於微血管之穩定化、功能提高、增加。基於該想法,發現:該等黏著分子中大量存在於血管內皮細胞中之VE-鈣黏蛋白、及參與血管細胞與細胞基質之黏著之整聯蛋白α5之表現有助於微血管之結構,從而完成本發明。
具體而言,本發明係關於下述之發明:
[1]一種血管內皮細胞中之黏著分子之表現促進劑,其包含選自由金盞花、西伯利亞人參、及肉蓯蓉所組成之群中之植物體之萃取物、或酵母萃取物。
[2]如項目1之黏著分子之表現促進劑,其包含選自由金盞花、西伯利亞人參、及肉蓯蓉所組成之群中之植物體之萃取物。
[3]如項目2之黏著分子之表現促進劑,其中上述黏著分子為VE-鈣黏蛋白。
[4]如項目1之黏著分子之表現促進劑,其包含選自西伯利亞人參及肉蓯蓉中之植物體之萃取物或酵母萃取物。
[5]如項目4之黏著分子之表現促進劑,其中上述黏著分子為整聯蛋白α5。
[發明之效果]
[1]一種血管內皮細胞中之黏著分子之表現促進劑,其包含選自由金盞花、西伯利亞人參、及肉蓯蓉所組成之群中之植物體之萃取物、或酵母萃取物。
[2]如項目1之黏著分子之表現促進劑,其包含選自由金盞花、西伯利亞人參、及肉蓯蓉所組成之群中之植物體之萃取物。
[3]如項目2之黏著分子之表現促進劑,其中上述黏著分子為VE-鈣黏蛋白。
[4]如項目1之黏著分子之表現促進劑,其包含選自西伯利亞人參及肉蓯蓉中之植物體之萃取物或酵母萃取物。
[5]如項目4之黏著分子之表現促進劑,其中上述黏著分子為整聯蛋白α5。
[發明之效果]
本發明之選自由金盞花、西伯利亞人參、及肉蓯蓉所組成之群中之植物體之萃取物、或包含酵母萃取物之黏著分子之表現促進劑可促進血管內皮細胞中之黏著分子之表現。藉由該等黏著分子之表現促進,可謀求微血管之穩定化、功能提高、或增加。
本發明係關於選自由金盞花、西伯利亞人參、及肉蓯蓉所組成之群中之植物體之萃取物、或包含酵母萃取物之血管內皮細胞中之黏著分子之表現促進劑。細胞黏著分子較佳為於血管內皮細胞中表現之黏著分子。此種細胞黏著分子中,可列舉:鈣黏蛋白及整聯蛋白,尤其可列舉:VE-鈣黏蛋白及整聯蛋白α5。
本發明可藉由以血管內皮細胞中之黏著分子之表現作為指標之篩選方法,而篩選候選藥劑。篩選方法包含例如以下之步驟:
於包含候選藥劑之培養基中培養血管內皮細胞;
測定血管內皮細胞中之黏著分子之基因表現;
於與對照進行比較而上述表現增加之情形時,決定候選藥劑作為提高黏著分子之表現之物質。
此處,對照係就於不含候選藥劑之培養基中進行培養之方面不同之情形之黏著分子之基因表現。針對對照之實驗,可與本發明之篩選方法平行地進行,亦可預先進行。
於包含候選藥劑之培養基中培養血管內皮細胞;
測定血管內皮細胞中之黏著分子之基因表現;
於與對照進行比較而上述表現增加之情形時,決定候選藥劑作為提高黏著分子之表現之物質。
此處,對照係就於不含候選藥劑之培養基中進行培養之方面不同之情形之黏著分子之基因表現。針對對照之實驗,可與本發明之篩選方法平行地進行,亦可預先進行。
本發明之篩選方法亦可包括於在包含候選藥劑之培養基中培養血管內皮細胞之步驟之前,培養血管內皮細胞之預培養步驟。又,亦可包括於在包含候選藥劑之培養基中培養血管內皮細胞之步驟之後,於不含候選藥劑之培養基中進而進行培養之後培養步驟。於包含候選藥劑之培養基中培養血管內皮細胞之步驟可於預培養步驟中所獲得之培養物中直接添加候選藥劑或其稀釋液進行培養,亦可置換至包含候選藥劑之培養基中進行培養。
黏著分子之基因表現之測定可藉由測定血管內皮細胞中之黏著分子之mRNA量或蛋白質量而決定。作為mRNA量之測定,可使用定量PCR或北方墨點法等本技術領域中已知之方法而進行。關於蛋白質量,可使用南方墨點法、免疫染色、FACS(Fluorescence-activated cell sorting,流式細胞螢光分選技術)等本技術領域中已知之任意方法而進行。於該等方法中,使用與黏著分子特異地結合之抗體。
於本發明中,於血管內皮細胞中提高黏著分子例如VE-鈣黏蛋白及/或整聯蛋白α5之表現之物質係發揮選自由微血管之穩定化、保護、增加、功能提高所組成之群中之至少一種作用。因此,亦可將於血管內皮細胞中提高黏著分子之表現之物質用作用以實現微血管之穩定化、保護、增加、或功能提高之藥劑。
血管內皮細胞係構成血管之內膜之細胞。動脈或靜脈係包含內膜、中膜、外膜之三層,但微血管係僅包括包含血管內皮細胞之內膜。於血管內皮細胞中,主要藉由VE-鈣黏蛋白之細胞黏著分子之作用而使內皮細胞間黏著,又,藉由整聯蛋白之作用,而使細胞外基質與血管內皮細胞黏著。作為血管內皮細胞,可為自活體所取得之內皮細胞、及其繼代之細胞,亦可為株化之細胞,又,亦可為臍帶血靜脈內皮細胞、及其繼代之細胞。作為血管內皮細胞,並不限定於以下者,可使用HUVEC、HMEC-1。
VE-鈣黏蛋白係鈣黏蛋白5或亦稱為CD144之分子量約140 kDa之蛋白質,且係屬於鈣黏蛋白超家族之蛋白質。VE-鈣黏蛋白係於內皮細胞為特異性,於***內皮細胞及血管內皮細胞中表現,存在於細胞膜。已知VE-鈣黏蛋白分子參與血管內皮或***內皮之透過性。認為藉由VE-鈣黏蛋白之表現增加,而血管內皮細胞彼此之黏著性提高,有助於血管內皮之穩定性。於由血管內皮細胞與纖維母細胞所製作之皮膚模型中,於使用抑制VE-鈣黏蛋白之表現之血管內皮細胞之皮膚模型中,亦顯示難以形成類血管之結構(圖1A~D)。雖然不欲限定於理論,但根據技術常識及該等實驗結果,顯示若抑制VE-鈣黏蛋白之表現,則微血管之穩定性喪失,微血管之量減少。
整聯蛋白係存在於細胞膜中之細胞膜蛋白質,作為細胞黏著分子發揮功能,與細胞外基質或基底膜進行相互作用。整聯蛋白係於α鏈與β鏈進行締合之異源二聚物中存在,確認至少18種作為α次單元,確認8種作為β次單元。已知整聯蛋白α5主要與整聯蛋白β1締合,而形成整聯蛋白α5β1。整聯蛋白α5β1亦稱為VLA-5、纖維黏連蛋白受體。於血管內皮細胞之細胞膜中表現之整聯蛋白α5係與構成細胞外基質(ECM)之纖維黏連蛋白結合。於由血管內皮細胞與纖維母細胞所製作之皮膚模型中,於使用抑制整聯蛋白α5之表現之血管內皮細胞之皮膚模型中,雖然皮膚模型相對於血管體積無變化(圖2C),但交叉之數量減少(圖2D),但血管之長度增大(圖2B)。認為藉由與細胞外基質之相互作用減弱,而成為容易進行血管之擴展之結果。於內皮細胞中表現之整聯蛋白中,顯示整聯蛋白α5之表現隨著年齡增加而降低(圖3C),而另一方面,整聯蛋白α3及α6之表現量因年齡增長之表現量之變化較少(圖3B及D)。雖然不欲限定於理論,但根據技術常識及該等實驗結果,顯示若抑制整聯蛋白α5之表現,則微血管與細胞外基質之間之相互作用減弱,其結果為,微血管之穩定性喪失。
藉由本發明之篩選方法所篩選之具有黏著分子表現促進作用之物質當於以VE-鈣黏蛋白基因之表現作為指標之情形時,亦可稱為VE-鈣黏蛋白基因表現促進劑。VE-鈣黏蛋白基因表現促進劑只要於血管內皮細胞中可促進VE-鈣黏蛋白基因之表現即可,可為任意物質。本發明之篩選方法之一態樣係以血管內皮細胞中之VE-鈣黏蛋白之基因表現作為指標,使用化妝品原材料、食品原材料、醫藥品原材料等任意之材料庫而進行篩選。作為以如此之方式所決定之具有VE‐鈣黏蛋白基因表現促進作用之物質,可列舉:選自由西伯利亞人參、金盞花、肉蓯蓉所組成之群中之至少一種植物體之萃取物(圖4)。
藉由本發明之篩選方法所篩選之具有黏著分子表現促進作用之物質係於以整聯蛋白α5基因表現作為指標之情形時,亦可稱為整聯蛋白α5基因促進劑。整聯蛋白α5基因表現促進劑只要於血管內皮細胞中可促進整聯蛋白α5基因之表現即可,可為任意物質。本發明之篩選方法之一態樣係以血管內皮細胞中之整聯蛋白α5之基因表現作為指標,使用化妝品原材料、食品原材料、醫藥品原材料等任意之材料庫進行篩選。作為以如此之方式所決定之促進整聯蛋白α5之基因表現之物質,可列舉:選自由西伯利亞人參、肉蓯蓉萃取物所組成之群中之至少一種植物體之萃取物及酵母萃取物(圖5)。
所謂西伯利亞人參(Siberian Ginseng),係指於***、中國、北海道等地域自生之五加科之植物,亦稱為刺五加(Eleutherococcus senticosus)。可將果實、葉、莖、花、根等植物體用作藥用用途,尤其可將根之根皮用作生藥。西伯利亞人參萃取物係指將西伯利亞人參之植物體、尤其是根之根皮藉由溶劑例如水、或丙二醇、乙醇等醇類等所萃取之萃取物。作為西伯利亞人參萃取物,可使用作為化妝品原料或健康食品材料所市售者。
金盞花萃取物係金盞花(Calendula officinalis)之花之萃取物。金盞花係南歐原產之菊科之植物。金盞花萃取物係指將金盞花之花藉由溶劑例如水、或丙二醇、乙醇等醇類等所萃取之萃取物。作為金盞花萃取物,可使用作為化妝品原料或健康食品材料所市售者。
所謂肉蓯蓉萃取物,係指鹽生肉蓯蓉(Cistanche salsa)之植物體之萃取物。鹽生肉蓯蓉係以中國內陸至中亞作為原產之草蓯蓉科之植物。植物體中,可使用莖、葉、花、根等,尤其可將使肉質莖乾燥而成者稱為肉蓯蓉,可用作生藥。肉蓯蓉萃取物係指將肉蓯蓉藉由溶劑例如水、或丙二醇、乙醇等醇類等所萃取之萃取物。作為肉蓯蓉萃取物萃取物,可使用作為化妝品原料或健康食品材料所市售者。
所謂酵母萃取物,係指Saccharomyces cerevisiae等酵母之萃取物。酵母萃取物可藉由將酵母之細胞壁藉由酸處理、鹼處理、或酵素處理等進行破壞而獲得。作為酵母萃取物,可使用作為化妝品原料或健康食品材料所市售者。
上述之植物或酵母之萃取物可藉由常法而獲得,例如可將成為其起源之植物或酵母與萃取溶劑一起進行常溫或加熱並進行浸漬或加熱回流後,進行過濾並濃縮而獲得。作為萃取溶劑,只要為通常用於萃取之溶劑,則可任意地使用,例如可單獨使用水性溶劑例如水、生理鹽水、磷酸緩衝液、硼酸緩衝液、或有機溶劑例如乙醇、丙二醇、1,3-丁二醇、甘油等醇類、含水醇類、氯仿、二氯乙烷、四氯化碳、丙酮、乙酸乙酯、己烷等,或將該等組合而使用。較佳為使用水作為溶劑。可直接使用利用上述溶劑進行萃取所獲得之萃取物,或使用例如藉由冷凍乾燥等所濃縮之萃取物,又,若需要,則亦可使用藉由吸附法,例如使用離子交換樹脂將雜質去除者;或藉由多孔性聚合物(例如Amberlite XAD-2)之管柱進行吸附後,利用所需之溶劑進行溶出,進而濃縮而成者。
藉由本發明之篩選方法所選擇之於血管內皮細胞中具有黏著分子之表現促進作用之物質亦可稱為微血管之保護、改善、增加、功能改善劑,亦可調配於化妝料、醫藥品、或準藥品中,亦可調配於食品例如補充品等營養補助食品中。本發明之具有黏著分子之表現促進作用之物質即VE-鈣黏蛋白基因表現促進劑、或整聯蛋白α5基因表現促進劑、微血管之保護、改善、增加、功能改善劑亦可利用任意之路徑進行投予,就作用於血管內皮細胞之方面而言,較佳為經口投予、經皮投予、經黏膜投予等投予路徑。
如以上所說明般,發現血管內皮細胞中之VE-鈣黏蛋白基因表現及/或整聯蛋白α5基因表現之促進有助於微血管之保護、改善、增加、功能提高。因此,本發明之另一態樣係關於包含VE-鈣黏蛋白基因表現劑及/或整聯蛋白α5基因表現劑之微血管之保護、改善、增加、功能改善劑。更具體而言,亦係關於包含應用血管內皮細胞中之黏著分子之表現促進劑之微血管之保護、改善、增加、功能提高方法。此處,血管內皮細胞中之黏著分子係VE-鈣黏蛋白及/或整聯蛋白α5。於進而另一態樣中,亦係關於包括將VE-鈣黏蛋白基因表現促進劑及/或整聯蛋白α5基因表現促進劑應用於皮膚之微血管之保護、改善、增加、功能提高方法。又,本發明中特定之萃取物可經由微血管之保護、改善、增加、功能提高,而作用於水腫、暗沉、異位性皮膚炎、酒渣鼻、乾眼症、口腔乾燥症、畏寒、皮膚粗糙脫毛等之改善,並使用。
於本說明書中,微血管之保護、改善、增加、功能提高方法係關於用於美容之美容方法,可與藉由醫師或醫療專業人員進行治療所區別。此種美容方法可個人地進行,亦可於美容室、或化妝品之零售店、美容沙龍等中進行。
本說明書中提及之所有文獻係將其整體藉由引用而併入至本說明書中。
以下說明之本發明之實施例僅用作例示,並不限定本發明之技術範圍。本發明之技術範圍並不僅限定於申請專利範圍之記載。只要不脫離本發明之主旨,則可進行本發明之變更例如本發明之構成要件之追加、刪除及替換。
[實施例]
[實施例]
實施例 1 :皮膚模型之製作
使用6孔板中之3個孔,利用下述之方法製作皮膚模型。於冰上將0.3%膠原蛋白16.7 mL放入至50 mL管中,一面攪拌10.6 mL之DMEM(-)培養基一面緩緩加入,藉此,製備膠原蛋白凝膠。其次,將人類纖維母細胞(HF)於DMEM(-)培養基中製備為10×105 cells/mL。於添加有0.5%FBS之EBM2培養基中以成為10×105 cells/mL之方式製備人類臍帶血靜脈內皮細胞(HUVEC)。於HF群中,分取2 ml之所製備之HF培養物,並且於HF-HUVEC群中分別分取2 ml之所製備之HF培養物及HUVEC培養物。與6 mL之添加有0.5%FBS之EBM2培養基進行混合而製備10 mL之細胞液。將所製備之細胞液10 ml與膠原蛋白凝膠溶液10 mL於冰上良好地攪拌,於6孔板之孔中,針對每一孔放入6 ml。於5%加濕環境下,於37℃下振盪一晩後,於37℃下靜置5天,製作HF皮膚模型及HF-HUVEC皮膚模型。於HF-HUVEC皮膚模型中,觀察HUVEC細胞成為血管之形狀。
使用6孔板中之3個孔,利用下述之方法製作皮膚模型。於冰上將0.3%膠原蛋白16.7 mL放入至50 mL管中,一面攪拌10.6 mL之DMEM(-)培養基一面緩緩加入,藉此,製備膠原蛋白凝膠。其次,將人類纖維母細胞(HF)於DMEM(-)培養基中製備為10×105 cells/mL。於添加有0.5%FBS之EBM2培養基中以成為10×105 cells/mL之方式製備人類臍帶血靜脈內皮細胞(HUVEC)。於HF群中,分取2 ml之所製備之HF培養物,並且於HF-HUVEC群中分別分取2 ml之所製備之HF培養物及HUVEC培養物。與6 mL之添加有0.5%FBS之EBM2培養基進行混合而製備10 mL之細胞液。將所製備之細胞液10 ml與膠原蛋白凝膠溶液10 mL於冰上良好地攪拌,於6孔板之孔中,針對每一孔放入6 ml。於5%加濕環境下,於37℃下振盪一晩後,於37℃下靜置5天,製作HF皮膚模型及HF-HUVEC皮膚模型。於HF-HUVEC皮膚模型中,觀察HUVEC細胞成為血管之形狀。
實施例 2 :血管內皮細胞之基因表現抑制
於HUVEC細胞中,使用siRNA,使用抑制VE-鈣黏蛋白(cad)、整聯蛋白α3(inta3)、整聯蛋白α5(inta5)、及整聯蛋白α6(inta6)之基因表現之Ambion Silencer Select SiRNA、CDH5(ID:s2780、s2781、s2782)、ITGA3(ID:s7541、s7542、s7543)、ITGA5(ID:s7547、s7548、s7549)、ITGA6(ID:s7492、s7493、s7494)。將HUVEC細胞製備為10×105 cells/mL。使各細胞沈澱,吸取培養基後添加套組之溶液100 μL進行混合。於經混合之細胞中分別添加各1 μL之上述之siRNA(Ambion)並將總量移至4D-Nucleofecter(Lonza)之比色管中。將CELL TYPE安裝至HUVEC中並開始4D-Nucleofecter而進行基因導入。於結束基因導入之各比色管中添加500 μL之EBM2(+)培養基,於預先加入10 mL之EBM2(+)培養基之10 cm培養皿中添加比色管之內容物之總量。於37℃下靜置一晩,第二天使用該細胞,以與實施例2相同之方式製作皮膚模型。針對導入有各siRNA之細胞,進行定量PCR,確認抑制目標之基因表現(資料未刊載)。
於HUVEC細胞中,使用siRNA,使用抑制VE-鈣黏蛋白(cad)、整聯蛋白α3(inta3)、整聯蛋白α5(inta5)、及整聯蛋白α6(inta6)之基因表現之Ambion Silencer Select SiRNA、CDH5(ID:s2780、s2781、s2782)、ITGA3(ID:s7541、s7542、s7543)、ITGA5(ID:s7547、s7548、s7549)、ITGA6(ID:s7492、s7493、s7494)。將HUVEC細胞製備為10×105 cells/mL。使各細胞沈澱,吸取培養基後添加套組之溶液100 μL進行混合。於經混合之細胞中分別添加各1 μL之上述之siRNA(Ambion)並將總量移至4D-Nucleofecter(Lonza)之比色管中。將CELL TYPE安裝至HUVEC中並開始4D-Nucleofecter而進行基因導入。於結束基因導入之各比色管中添加500 μL之EBM2(+)培養基,於預先加入10 mL之EBM2(+)培養基之10 cm培養皿中添加比色管之內容物之總量。於37℃下靜置一晩,第二天使用該細胞,以與實施例2相同之方式製作皮膚模型。針對導入有各siRNA之細胞,進行定量PCR,確認抑制目標之基因表現(資料未刊載)。
於導入siRNA而分別抑制VE-鈣黏蛋白、整聯蛋白α3、整聯蛋白α5、及整聯蛋白α6之表現之皮膚模型中,使用抗CD31抗體(經銷商R&D systems)作為一次抗體,並且使用AlexaFluor488標識抗羊抗體(經銷商Invitrogen)作為二次抗體而使血管內皮細胞可視化(圖1A及2A)。於抑制VE-鈣黏蛋白及整聯蛋白α5之表現之情形之皮膚模型中,於血管之結構中可見變化。使用圖像解析軟體(Imaris),測定血管之長度(μm)、體積(μm3
)、及交叉區域(μm2
),結果發現於抑制VE-鈣黏蛋白表現之情形時,於所有方面與對照進行比較均顯著減少(圖1B~D)(*:p<0.05、**:p<0.01)。於抑制整聯蛋白α5之表現之情形時,就血管之長度(μm)及交叉區域(μm2
)之方面與對照進行比較,顯著減少(圖2B~D)(*:p<0.05)。
實施例 3 :皮膚模型中之年齡之影響
將幼齡受驗者(0歲)之血管內皮細胞、老齡受驗者(50歲)之血管內皮細胞以2×105 cells/well播種於6孔板,靜置一晩,第二天使用RNeasy mini kit(QIAGEN)萃取RNA。利用nano drop測定所萃取之RNA之濃度,利用RNace-free water製備為100 ng/ml。所製備之RNA係使用TaqMan RNA-to-C 1-Step Kit(Applied Biosystems),使用針對下述之基因之引子(Applied Biosystems公司),利用Real Time PCR(Roche Light Cycler480II)進行定量。使用β-肌動蛋白(b-actin: Cat# Hs01060665_g1 )作為內部標準,結果發現於源自幼齡受驗者之細胞與源自老齡受驗者之細胞中,於VE-鈣黏蛋白(VE-Cadherin:Cat# Hs00170986_m1)及整聯蛋白α5(Integrin alpha5: Cat# Hs01547673_m1)之表現量中可見有意義差(圖3A~D:*:P<0.05),而另一方面,於整聯蛋白α3(Integrin alpha3: Cat# Hs01076879_m1)及整聯蛋白α6(Integrin alpha6: Cat# Hs01041011_m1)中表現量中未見有意義差。
將幼齡受驗者(0歲)之血管內皮細胞、老齡受驗者(50歲)之血管內皮細胞以2×105 cells/well播種於6孔板,靜置一晩,第二天使用RNeasy mini kit(QIAGEN)萃取RNA。利用nano drop測定所萃取之RNA之濃度,利用RNace-free water製備為100 ng/ml。所製備之RNA係使用TaqMan RNA-to-C 1-Step Kit(Applied Biosystems),使用針對下述之基因之引子(Applied Biosystems公司),利用Real Time PCR(Roche Light Cycler480II)進行定量。使用β-肌動蛋白(b-actin: Cat# Hs01060665_g1 )作為內部標準,結果發現於源自幼齡受驗者之細胞與源自老齡受驗者之細胞中,於VE-鈣黏蛋白(VE-Cadherin:Cat# Hs00170986_m1)及整聯蛋白α5(Integrin alpha5: Cat# Hs01547673_m1)之表現量中可見有意義差(圖3A~D:*:P<0.05),而另一方面,於整聯蛋白α3(Integrin alpha3: Cat# Hs01076879_m1)及整聯蛋白α6(Integrin alpha6: Cat# Hs01041011_m1)中表現量中未見有意義差。
實施例 4 :具有以 VE- 鈣黏蛋白基因表現作為指標之 VE- 鈣黏蛋白表現促進作用之物質之篩選方法
於添加有0.5%FBS之EBM2培養基中以成為10×105 cells/mL之方式製備人類臍帶血靜脈內皮細胞(HUVEC),於5%CO2 加濕環境下,於37℃下進行培養。作為候選藥劑,使用化妝品原材料材料庫。添加候選藥劑,進行6小時培養。培養後,將培養基去除,使用RNeasy mini kit(QIAGEN)自細胞萃取RNA。利用nano drop測定所萃取之RNA之濃度,利用RNace-free water製備為100 ng/ml。所製備之RNA係使用TaqMan RNA-to-C 1-Step Kit(Applied Biosystems),使用針對VE-鈣黏蛋白基因之引子,利用Real Time PCR(Roche Light Cycler480II)進行定量。
於添加有0.5%FBS之EBM2培養基中以成為10×105 cells/mL之方式製備人類臍帶血靜脈內皮細胞(HUVEC),於5%CO2 加濕環境下,於37℃下進行培養。作為候選藥劑,使用化妝品原材料材料庫。添加候選藥劑,進行6小時培養。培養後,將培養基去除,使用RNeasy mini kit(QIAGEN)自細胞萃取RNA。利用nano drop測定所萃取之RNA之濃度,利用RNace-free water製備為100 ng/ml。所製備之RNA係使用TaqMan RNA-to-C 1-Step Kit(Applied Biosystems),使用針對VE-鈣黏蛋白基因之引子,利用Real Time PCR(Roche Light Cycler480II)進行定量。
於使用西伯利亞人參萃取物、金盞花萃取物、肉蓯蓉萃取物作為候選藥劑之情形時,與對照進行比較,VE-鈣黏蛋白基因之表現顯著增加(p<0.05:圖4)。選擇該等萃取物作為具有VE-鈣黏蛋白之表現促進作用之物質。
實施例 5 :具有以整聯蛋白 α5 基因表現作為指標之整聯蛋白 α5 之表現促進作用之物質之篩選方法
於添加有0.5%FBS之EBM2培養基中以成為10×105 cells/mL之方式製備人類臍帶血靜脈內皮細胞(HUVEC),於5%CO2 加濕環境下,於37℃下進行培養。添加候選藥劑,進行6小時培養。培養後,將培養基去除,使用RNeasy mini kit(QIAGEN)自細胞中萃取RNA。利用nano drop測定所萃取之RNA之濃度,利用RNace-free water製備為100 ng/ml。所製備之RNA係使用TaqMan RNA-to-C 1-Step Kit(Applied Biosystems),使用針對整聯蛋白α5基因之引子,利用Real Time PCR(Roche Light Cycler480II)進行定量。
於添加有0.5%FBS之EBM2培養基中以成為10×105 cells/mL之方式製備人類臍帶血靜脈內皮細胞(HUVEC),於5%CO2 加濕環境下,於37℃下進行培養。添加候選藥劑,進行6小時培養。培養後,將培養基去除,使用RNeasy mini kit(QIAGEN)自細胞中萃取RNA。利用nano drop測定所萃取之RNA之濃度,利用RNace-free water製備為100 ng/ml。所製備之RNA係使用TaqMan RNA-to-C 1-Step Kit(Applied Biosystems),使用針對整聯蛋白α5基因之引子,利用Real Time PCR(Roche Light Cycler480II)進行定量。
於使用西伯利亞人參萃取物、酵母萃取物、肉蓯蓉萃取物作為候選藥劑之情形時,與對照進行比較,整聯蛋白α5基因之表現顯著增加(p<0.05:圖5)。選擇該等萃取物作為具有緊緻改善作用之物質。
圖1A係於使用抑制VE-鈣黏蛋白之基因表現之人類臍帶血靜脈內皮細胞(HUVEC)所製作之皮膚模型中,標識出血管結構之螢光顯微鏡照片。圖1B~D係於圖1A之螢光顯微鏡照片中,測定血管之長度(μm)、體積(μm3
)、及交叉區域(μm2
),並與對照進行比較之圖表。
圖2A係於使用抑制整聯蛋白α5之基因表現之人類臍帶血靜脈內皮細胞(HUVEC)所製作之皮膚模型中,標識出血管結構之螢光顯微鏡照片。圖2B~D係於圖2A之螢光顯微鏡照片中,測定血管之長度(μm)、體積(μm3
)、及交叉區域(μm2
),並與對照進行比較之圖表。
圖3A-D係將自幼齡受驗者所獲得之血管內皮細胞、及自老齡受驗者所獲得之血管內皮細胞中之VE-鈣黏蛋白、整聯蛋白α3、整聯蛋白α5、及整聯蛋白α6之基因表現等級進行比較之圖表。
圖4係表示篩選VE-鈣黏蛋白作為指標之西伯利亞人參、金盞花、肉蓯蓉萃取物對血管內皮細胞中之VE-鈣黏蛋白表現之影響之圖表。
圖5係表示篩選整聯蛋白α5作為指標之西伯利亞人參、酵母萃取物、肉蓯蓉萃取物對血管內皮細胞中之整聯蛋白α5之影響之圖表。
Claims (5)
- 一種血管內皮細胞中之黏著分子之表現促進劑,其包含選自由金盞花、西伯利亞人參、及肉蓯蓉所組成之群中之植物體之萃取物、或酵母萃取物。
- 如請求項1之黏著分子之表現促進劑,其包含選自由金盞花、西伯利亞人參、及肉蓯蓉所組成之群中之植物體之萃取物。
- 如請求項2之黏著分子之表現促進劑,其中上述黏著分子為VE-鈣黏蛋白。
- 如請求項1之黏著分子之表現促進劑,其包含選自西伯利亞人參及肉蓯蓉中之植物體之萃取物或酵母萃取物。
- 如請求項4之黏著分子之表現促進劑,其中上述黏著分子為整聯蛋白α5。
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