TW201825123A - 用於腦部靶向的長效蛋白質共軛物 - Google Patents

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鄭聖燁
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Abstract

本發明係關於包含用於腦部靶向的胜肽和生理活性物質的用於腦部靶向的長效共軛物，且係關於具有改善的持久性和穩定性的包含生理活性物質的長效共軛物，其可通過血腦屏障（BBB）且包含生理活性物質。包含用於腦部靶向的胜肽和生理活性物質的本發明之用於腦部靶向的長效共軛物可通過血腦屏障，因此使治療與腦部疾病相關的疾病成為可能，且另外地，可於活體內維持生理活性物質之活性並增加其於血液中的半生期。

Description

用於腦部靶向的長效蛋白質共軛物
本發明係關於能夠靶向腦部的長效蛋白質共軛物和製備其之方法。此外，本發明係關於新穎的用於腦部靶向的胜肽和其用途。
儘管對於將治療劑有效遞送至腦部有成長的需求，用於腦部的新藥劑之開發相較於該等用於身體之剩下的部分者係以遠較緩慢的速率進展。此緩慢的進展很大係導因於其中大部分藥物無法通過形成血腦屏障（以下稱為BBB）的腦微血管壁穿透入腦部中的情況。BBB係由腦血管之內皮細胞間的緊密型連結和進一步強化此等緊密型連結的星狀細胞建立的結構，且其具有防止血液中的物質通過血管壁自由地擴散至腦實質中的角色。由於此原因，許多被開發用來治療腦部疾病的藥物具有其等無法良好地通過BBB的問題。幾乎100%的巨分子藥物和超過98%的小分子藥物無法通過BBB。僅僅非常小數目的藥物（例如具有高脂質可溶性和400至500道耳頓或更小的分子量的小分子藥物）可事實上通過BBB。此外，於此等能夠通過BBB的小分子中，僅有一小部分可以醫藥上顯著的量通過BBB。
僅有一些腦部疾病（諸如抑鬱、情感疾患、慢性疼痛、和癲癇）可對通過BBB的小分子藥物反應。大多數腦部疾病（諸如阿滋海默氏病、中風／神經保護、腦部和脊髓損傷、腦癌、腦部之HIV感染、產生運動失調的病症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症（ALS）、亨汀頓氏病、影響腦部的幼兒先天基因錯誤、帕金森氏病、和多發性硬化）不對習用脂質可溶性小分子量藥物反應。
目前，能夠遞送藥物通過BBB的載劑之開發正活躍地進行中。其間，雖然已知具有特殊胺基酸序列的胜肽會通過BBB且能夠遞送藥物、siRNA、等等，然而，對於遞送具有特殊結構的大型生理活性物質之可能性的研究仍遠低於期望（Kumar等人，Nature . 2007, 448: 39至43）。此外，關於腦部疾病（對其而言僅有極少有效小分子藥物可得）之治療，對於新穎且改善的藥物之開發和研究有增加的需求。
技術問題
本發明之目的之一係提供用於腦部靶向的長效共軛物，其可通過血腦屏障（BBB）、維持生理活性之有效性、且含有能夠延長生理活性物質之半生期的生物可相容的物質。
本發明之另一個目的係提供用於腦部靶向的長效共軛物，其中生理活性物質係（藉由彼此結合）連接至免疫球蛋白Fc區與其融合的用於腦部靶向的胜肽之免疫球蛋白Fc區。
本發明又另一個目的係提供式1之用於腦部靶向的長效共軛物，其係含有用於腦部靶向的胜肽和生理活性物質的長效共軛物。 X-L1 -F-L2 -Y 其中， X係生理活性物質； Y係用於腦部靶向的胜肽； L1 和L2 係胜肽連接子或非胜肽連接子，其中當L1 和L2 係胜肽連接子時，該等胜肽連接子包含0至1,000個胺基酸；且 F係包含FcRn結合區的免疫球蛋白恆定區。
本發明之又另一個目的係提供多核苷酸，其編碼用於腦部靶向的胜肽，至該胜肽該免疫球蛋白Fc區係藉由融合或非胜肽連接子連接、或生理活性物質；載體，其含有該多核苷酸；轉形株，其含有該載體；和套組，其包含該多核苷酸、載體、和轉形株之一或多者。
本發明之又另一個目的係提供用於腦部靶向的長效共軛物，其係於該用於腦部靶向的胜肽共軛物被編碼並接著化學連接之後，其中用於腦部靶向的胜肽共軛物之免疫球蛋白Fc區（其與用於腦部靶向的胜肽共軛物之用於腦部靶向的胜肽融合）係藉由彼此結合連接至生理活性物質。
本發明之又另一個目的係提供用於製備該用於腦部靶向的長效共軛物的方法，其係於該用於腦部靶向的胜肽共軛物被編碼並接著化學連接之後，其中用於腦部靶向的胜肽共軛物之免疫球蛋白Fc區（其與用於腦部靶向的胜肽共軛物之用於腦部靶向的胜肽融合）係藉由彼此結合連接至生理活性物質。
本發明之又另一個目的係提供用於製備以上式1之用於腦部靶向的長效共軛物的方法。
本發明之又另一個目的係提供含有該用於腦部靶向的長效共軛物的組成物。
本發明之又另一個目的係提供該用於腦部靶向的長效共軛物於醫藥劑之製備中的用途
本發明之又另一個目的係提供新穎的用於腦部靶向的胜肽。
本發明之又另一個目的係提供多核苷酸，其編碼該用於腦部靶向的胜肽；載體，其含有該多核苷酸；轉形株，其含有該載體；和套組，其包含該多核苷酸、載體、和轉形株之一或多者。技術方案
為了達成以上目的，本發明之一個方面提供用於腦部靶向的長效共軛物，其可通過BBB、維持生理活性之有效性、且含有能夠延長生理活性物質之半生期的生物可相容的物質；或用於製備該用於腦部靶向的長效共軛物的方法。
於一個更特殊的實施方式中，本發明提供式1之用於腦部靶向的長效共軛物： [式1] X-L1 -F-L2 -Y 其中， X係生理活性物質； Y係用於腦部靶向的胜肽； L1 和L2 係胜肽連接子或非胜肽連接子，其中當L1 和L2 係胜肽連接子時，該等胜肽連接子包含0至1,000個胺基酸；且 F係包含FcRn結合區的免疫球蛋白恆定區。
於一個特殊的實施方式中，F可呈二聚體形式。
於根據先前的實施方式的用於腦部靶向的長效共軛物中，該長效共軛物通過血腦屏障並將生理活性物質遞送至腦組織中。
於根據先前的實施方式的用於腦部靶向的長效共軛物中，該用於腦部靶向的胜肽包含胜肽、蛋白質、或抗體，且其中該胜肽、蛋白質、或抗體之各者含有允許通過血腦屏障的胺基酸序列。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，該用於腦部靶向的胜肽可透過藉由被動運輸的途徑或藉由受體介導性運輸的途徑通過血腦屏障，但該運輸途徑不限於其等。例如，該用於腦部靶向的胜肽可係可通過血腦屏障的胜肽、蛋白質、或抗體，但其等之類型和大小並不特別受限。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，術語「胺基酸」係論及胺基酸部分，其包含任何天然存在的或非天然存在的或合成的胺基酸殘基，即任何包含至少一個羧基殘基和至少一個胺基殘基（其等係通過一、二、三、或更多個碳原子，典型係通過單一（α）碳原子直接連接）的部分。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，該用於腦部靶向的胜肽透過藉由受體介導性運輸的途徑通過血腦屏障。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，該藉由受體介導性運輸的途徑之特徵在於通過血腦屏障係藉由透過選自由以下者所組成之群組之任一者的受體介導性運輸途徑執行：胰島素受體、運鐵蛋白受體、低密度脂蛋白受體、低密度脂蛋白受體相關性蛋白質、瘦素受體、菸鹼乙醯膽鹼受體、麩胱甘肽運輸蛋白、鈣活化性鉀通道、和糖化終產物受體（receptor for advanced glycation endproduct，RAGE）、和該等受體之配體和與該等受體或配體結合的抗體，但不限於其等。該用於腦部靶向的胜肽可選自由可通過血腦屏障的胜肽、蛋白質、或抗體所組成之群組，或其可係自該胜肽、蛋白質、或抗體分離的部分胜肽序列，但不限於其等。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，該生理活性物質可選自由以下者所組成之群組：毒素；或類升糖素胜肽-1（GLP-1）受體促效劑；升糖素受體促效劑；胃抑制性多肽（GIP）受體促效劑；纖維母細胞生長因子（FGF）受體促效劑；膽囊收縮素受體促效劑；胃泌素受體促效劑；黑皮質素受體促效劑；人類生長激素；生長激素釋放激素；生長激素釋放胜肽；干擾素；干擾素受體；群落刺激因子（顆粒球群落刺激因子）；介白素；介白素受體；酵素；介白素結合蛋白；細胞介素結合蛋白；巨噬細胞活化因子；巨噬細胞胜肽；B細胞因子；T細胞因子；蛋白質A；過敏抑制因子；壞死醣蛋白；免疫毒素；淋巴毒素；腫瘤壞死因子；腫瘤抑制子；轉形生長因子；α-1抗胰蛋白酶；白蛋白；α-乳白蛋白；缺脂脂蛋白-E；紅血球生成素；高醣苷化紅血球生成素；血管生成素（angiopoietin）；血紅素；凝血酶；凝血酶受體活化胜肽；凝血酶調節素（thrombomodulin）；凝血因子VII；凝血因子VIIa；凝血因子VIII；凝血因子IX；凝血因子XIII；血纖維蛋白溶酶原活化子；血纖維蛋白結合胜肽；尿激酶；鏈球菌激酶；水蛭素；蛋白質C；C反應性蛋白質；腎素抑制子；膠原蛋白酶抑制子；超氧化物歧化酶；瘦素；血小板衍生性生長因子；上皮生長因子；表皮生長因子；血管抑制素；血管收縮肽；骨成形性生長因子；骨成形性蛋白質；抑鈣素；胰島素；心房利尿鈉肽（atriopeptin）；軟骨誘發因子；依降鈣素（elcatonin）；結締組織活化因子；組織因子途徑抑制子；濾泡刺激激素；黃體成長激素；黃體成長激素釋放激素；神經生長因子；軸突生成（axogenesis）因子-1；腦利尿鈉肽；神經膠衍生性神經營養因子；netrin；嗜中性球抑制因子；神經營養因子；neurturin；副甲狀腺素；鬆弛素；分泌素；體介素；類胰島素生長因子；腎上腺皮質激素；升糖素；膽囊收縮素；胰多肽；胃泌素釋放胜肽；促皮質素釋放因子；甲狀腺刺激激素；autotaxin；乳鐵蛋白；肌肉生長抑制素（myostatin）；活性依賴性神經保護性蛋白質（ADNP）、β-分泌酶（secretase）1（BACE1）、類澱粉蛋白前驅蛋白（APP）、神經細胞黏著分子（NCAM）、類澱粉蛋白β、tau、糖化終產物受體（RAGE）、α-突觸核蛋白（synuclein）、或其等之促效劑或拮抗劑；受體、受體促效劑；細胞表面抗原；單株抗體；多株抗體；抗體片段；病毒衍生性疫苗抗原；活化至少一種受體促效劑的雜合多肽或嵌合多肽；和其等之類似物。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，該毒素係選自由以下者所組成之群組：美登素（maytansine）或其衍生物、auristatin或其衍生物、duocarmycin或其衍生物、和吡咯并苯并二氮呯（PBD）或其衍生物； 該類升糖素胜肽-1（GLP-1）受體促效劑係選自由以下者所組成之群組：天然exendin-3或天然exendin-4、和其等之類似物； 該FGF受體促效劑係選自由以下者所組成之群組：FGF1或其類似物、FGF19或其類似物、FGF21或其類似物、和FGF23或其類似物； 該干擾素係選自由以下者所組成之群組：干擾素-α、干擾素-β、和干擾素-γ； 該干擾素受體係選自由以下者所組成之群組：干擾素-α受體、干擾素-β受體、干擾素-γ受體、和可溶性第I型干擾素受體； 該介白素係選自由以下者所組成之群組：介白素-1、介白素-2、介白素-3、介白素-4、介白素-5、介白素-6、介白素-7、介白素-8、介白素-9、介白素-10、介白素-11、介白素-12、介白素-13、介白素-14、介白素-15、介白素-16、介白素-17、介白素-18、介白素-19、介白素-20、介白素-21、介白素-22、介白素-23、介白素-24、介白素-25、介白素-26、介白素-27、介白素-28、介白素-29、和介白素-30； 該介白素受體係介白素-1受體或介白素-4受體； 該酵素係選自由以下者所組成之群組：β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、艾杜糖醛酸酶（iduronidase）、艾杜糖醛酸（iduronate）-2-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性α-葡萄糖苷酶、酸性神經醯胺酶、酸性神經磷脂酶、半乳糖腦苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、芳基硫酸酯酶B、β-己醣胺酶A、β-己醣胺酶B、肝素N -硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、N -乙醯半乳胺糖-6硫酸酯酶、溶酶體酸性脂酶、α-N -乙醯基-葡萄胺糖苷酶、葡萄糖腦苷脂酶、丁醯膽鹼酯酶、幾丁質酶、麩胺酸去羧酶、伊米苷酶（imiglucerase）、脂酶、尿酸酶、血小板活化因子乙醯基水解酶、中性內肽酶、髓過氧化酶、α-半乳糖苷酶-A、阿加半乳糖苷酶（agalsidase）α、阿加半乳糖苷酶β、α-L-艾杜糖醛酸酶、丁醯膽鹼酯酶、幾丁質酶、麩胺酸去羧酶、和伊米苷酶； 該介白素結合蛋白係IL-18bp； 該細胞介素結合蛋白係腫瘤壞死因子（TNF）結合蛋白； 該神經生長因子係選自由以下者所組成之群組：神經生長因子、睫狀神經營養因子、軸突生成因子-1、腦利尿鈉肽、神經膠衍生性神經營養因子、netrin、嗜中性球抑制因子、神經營養因子、和neurturin； 該肌肉生長抑制素受體係選自由以下者所組成之群組：TNFR (P75)、TNFR (P55)、IL-1受體、VEGF受體、和B細胞活化性因子受體； 該肌肉生長抑制素受體拮抗劑係IL1-Ra； 該細胞表面抗原係選自由以下者所組成之群組：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD11a、CD11b、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD45、和CD69；且 該抗體片段係選自由以下者所組成之群組：scFv、Fab、Fab′、F(ab′)2 、和Fd。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，該GLP-1受體促效劑係選自由以下者所組成之群組：天然exendin-4；exendin-4衍生物，其中exendin-4之N端胺基團被缺失；exendin-4衍生物，其中exendin-4之N端胺基團係以羥基基團取代；exendin-4衍生物，其中exendin-4之N端胺基團係以二甲基基團修飾；exendin-4衍生物，其中exendin-4之N端胺基團係以羧基基團取代；exendin-4衍生物，其中exendin-4之第1個胺基酸（組胺酸）之α-碳被缺失；exendin-4衍生物，其中exendin-4之第12個胺基酸（離胺酸）係以絲胺酸取代、和exendin-4衍生物，其中exendin-4之第12個胺基酸（離胺酸）係以精胺酸取代。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，L1 係連接至F之N端區域，且L2 係連接至F之C端區域。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，式1之F-L2 -Y係由以下式2表示： [式2]其中： Fa 和Fb 各自係單股多肽鏈，其包含免疫球蛋白Fc區，該Fc區包含鉸鏈區、CH2域、和CH3域，其中Fa 和Fb 係藉由該鉸鏈區中的雙硫鍵連接，藉此該共軛物包含Fc片段，且Fa 和L1 係共價鍵結； BTPa1 、……、BTPan 之各者（彼此係相同或不同）係用於腦部靶向的胜肽； BTPb1 、……、BTPbn′ 之各者（彼此係相同或不同）係用於腦部靶向的胜肽； L2a1 、……、L2an 之各者（彼此係相同或不同）係胜肽連接子；且 L2b1 、……、L2bn′ 之各者（彼此係相同或不同）係胜肽連接子； 其中n和n′各自獨立地係整數。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，L1 係連接至Fa 之N端，且L2a1 和L2b1 係各自連接至Fa 和Fb 之C端。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，n = n′，且各自符合L2a1 = L2b1 、……、L2an = L2bn′ 且BTPa1 = BTPb1 、……、BTPan = BTPbn′ 之條件。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，F係Fa 和Fb 、L2 -Y係（L2a -Y）n 和（L2b -Y）n′ ，其中該用於腦部靶向的長效共軛物係由以下式3表現： [式3]其中X係生理活性物質； L1 係胜肽連接子或非胜肽連接子； Fa 和Fb 各自係免疫球蛋白Fc區，其含有鉸鏈區、CH2域、和CH3域，且Fa 和Fb 係藉由該鉸鏈區中的半胱胺酸殘基間的雙硫鍵彼此共價鍵結； Ya 和Yb （其等係用於腦部靶向的胜肽）彼此係相同種類或彼此係不同種類； L2a 和L2b （其等分別係胜肽連接子）彼此係相同種類或彼此係不同種類；且 n和n′各自獨立地係1或更多的整數。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，L1 係連接至Fa 之N端區域，且L2a 和L2b 各自分別係連接至Fa 和Fb 之C端區域。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，L1 係連接至X之胺基團或巰基基團。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，L1 係連接至X之N端胺基團、位於離胺酸殘基之側鏈的胺基團、或位於半胱胺酸殘基之側鏈的-SH基團（巰基基團）。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，X（其係生理活性物質）係由2至1,000個胺基酸所組成的多肽。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，n和n′係1至5的整數。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，L1 係具有0.5 kDa至100 kDa的大小的非胜肽連接子。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，該非胜肽連接子係聚乙二醇。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，L2 （其係胜肽連接子）係(GS)m 、(GGS)m 、(GGGS)m 、或(GGGGS)m ，其中m係1至10。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，式1之L1 和L2 之一係胜肽連接子且另一係非胜肽連接子。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，當式1之L1 係非胜肽連接子且L2 係胜肽連接子時，該胜肽連接子含有0至1,000個胺基酸。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，關於式1之用於腦部靶向的長效共軛物，X之N端和F之N端係藉由L1 連接且Y之N端和F之C端係藉由L2 連接。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，關於式1之用於腦部靶向的長效共軛物，L1 之一端係連接至X之離胺酸殘基或半胱胺酸殘基、等等且L1 之另一端係連接至F之N端；且Y之N端和F之C端係藉由L2 連接。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，當式1之L1 和L2 之任一者或二者皆係非胜肽連接子時，該非胜肽連接子係選自由以下者所組成之群組：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化（polyoxyethylated）多元醇、聚乙烯醇、多醣、聚葡萄醣、聚乙烯基乙基醚、生物可降解聚合物、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸、脂肪酸、高分子量聚合物、低分子量化合物、核苷酸、和其等之組合。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，當式1之L1 和L2 之任一者或二者皆係胜肽連接子時，X和F、或F和Y係藉由L1 和L2 透過共價化學鍵、非共價化學鍵、或其等之組合彼此連接；且L1 和L2 各自含有0至1,000個胺基酸。當該胜肽連接子含有零個胺基酸時，其等係藉由胜肽鍵（其係共價鍵）連接。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，當式1之L1 和L2 之任一者或二者皆係胜肽連接子時，L1 和L2 不含胺基酸，其中(i) X和F、或F和Y係藉由胜肽鍵連接；或(ii) X和F、和F和Y係藉由胜肽鍵連接。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，當L1 和L2 之任一者係胜肽連接子且該二者之另一者係非胜肽連接子時，該胜肽連接子係含有0至1,000個胺基酸的連接子且該非胜肽連接子係聚乙二醇。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，式1之F包含免疫球蛋白Fc區。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，該免疫球蛋白Fc區包含一至四個選自由CH1、CH2、CH3、和CH4域所組成之群組的域。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，該免疫球蛋白Fc區進一步包含鉸鏈區。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，該免疫球蛋白Fc區係IgG之Fc區。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，關於該免疫球蛋白Fc區，該恆定區係衍生自IgG1或IgG4。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，該免疫球蛋白Fc區係IgG4 Fc區。
於根據先前的實施方式之任一者的用於腦部靶向的長效共軛物中，該免疫球蛋白Fc區係無醣苷化的（aglycosylated）人類序列之IgG4 Fc區。
本發明之另一個方面提供用於製備式1之用於腦部靶向的長效共軛物的方法。
於一個特殊的實施方式中，該方法包含(i)製備：(a) X-L1 -F，其中X（其係生理活性物質）、L1 （其係胜肽或非胜肽連接子）、和F（其包含免疫球蛋白Fc區）係連接；和(b) L2 -Y，其中Y（其係用於腦部靶向的胜肽）和L2 （其係胜肽或非胜肽連接子）係連接；和(ii)連接(a) X-L1 -F和(b) L2 -Y。
於另一個特殊的實施方式中，(a)之L1 係胜肽連接子，且(b)之L2 係非胜肽連接子。
於另一個特殊的實施方式中，該方法包含(i)製備：(a) X-L1 ，其中X（其係生理活性物質）和L1 （其係胜肽或非胜肽連接子）係連接；和(b) F-L2 -Y，其中Y（其係用於腦部靶向的胜肽）、L2 （其係胜肽或非胜肽連接子）、和F（其包含免疫球蛋白Fc區）係連接；和(ii)連接(a) X-L1 和(b) F-L2 -Y。
於又另一個特殊的實施方式中，(a)之L1 係非胜肽連接子，且(b)之L2 係胜肽連接子。
於又另一個特殊的實施方式中，該方法係用於製備式1之用於腦部靶向的長效共軛物的方法，其包含(i)製備F-L2 -Y，其中Y（其係用於腦部靶向的胜肽）、L2 （其係胜肽或非胜肽連接子）、和F（其包含免疫球蛋白Fc區）係連接；和(ii)藉由L1 （其係胜肽或非胜肽連接子）連接F-L2 -Y和X。
於又另一個特殊的實施方式中，L1 係非胜肽連接子，且L2 係胜肽連接子。
於又另一個特殊的實施方式中，該非胜肽連接子和X和Y係藉由其等各自之官能基之各者連接，且特別地，該非胜肽連接子之反應性基團係選自由醛基團、順丁烯二醯亞胺基團、和琥珀醯亞胺衍生物所組成之群組。
本發明之又另一個方面提供長效共軛物，其包含彼此不同的生理活性物質，其中用於腦部靶向的胜肽共軛物、用於腦部靶向的胜肽係與該免疫球蛋白Fc區融合，被編碼並接著化學結合，且不同的生理活性物質係連接至該經化學結合的免疫球蛋白Fc區。
該經化學結合的免疫球蛋白Fc區共軛物包含二個免疫球蛋白Fc區（Fc區之二聚體形式，其中單體Fc區係連接），且分別與該二個免疫球蛋白Fc區之各者結合的生理活性物質可連接至該免疫球蛋白Fc區之單一位置（單體Fc區）或該二個免疫球蛋白Fc區之二個位置（Fc區之各個二聚體形式）。
該化學結合可係共價鍵，更特別係雙硫鍵，且甚至更特別係二個免疫球蛋白Fc區之鉸鏈區中形成的雙硫鍵，但該結合並不特別限於其等。
更特別地，該長效共軛物可呈其中二聚體係藉由以下者間的化學鍵形成的形式：(i)第一免疫球蛋白Fc區，其中用於腦部靶向的胜肽係透過上述胜肽連接子（例如胜肽鍵）連接至一個分子的免疫球蛋白Fc區之C端區域、和(ii)第二免疫球蛋白Fc區，其中用於腦部靶向的胜肽係透過上述胜肽連接子（例如胜肽鍵）連接至一個分子的免疫球蛋白Fc區之C端區域、和一個分子的生理活性物質可連接至該二個免疫球蛋白Fc區分子之一之N端區域；或可呈其中生理活性物質係連接至該等免疫球蛋白Fc區分子之二者之N端區域之各者的形式，但該等形式並非特別限於其等。該第一和第二免疫球蛋白Fc區（其等係呈融合蛋白質的形式）可藉由該免疫球蛋白Fc區和該用於腦部靶向的胜肽間的胜肽鍵符合讀框地融合，且該免疫球蛋白Fc區可包含鉸鏈區、CH2域、和CH3域，但該免疫球蛋白Fc區並不特別限於其等。
該第一和第二免疫球蛋白Fc區間的化學鍵可特別係共價鍵，更特別係雙硫鍵，且更特別係該二個免疫球蛋白Fc區之鉸鏈區中形成的雙硫鍵，但該化學鍵並不特別限於其等。
本發明之又另一個方面提供含有用於腦部靶向的長效蛋白質共軛物的組成物。
本發明之又另一個方面提供用於腦部靶向的長效蛋白質共軛物於製備醫藥藥物的用途。
本發明之又另一個方面提供新穎的用於腦部靶向的胜肽。
於一個特殊的實施方式中，該用於腦部靶向的胜肽係由選自SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、和40之胺基酸序列的任一胺基酸序列所組成者。
本發明之又另一個方面提供經分離的多核苷酸，其編碼該用於腦部靶向的胜肽。
本發明之又另一個方面提供重組表現載體，其含有該多核苷酸。
本發明之又另一個方面提供轉形株，其含有該重組表現載體。有利功效
本發明之用於腦部靶向的長效共軛物（其含有用於腦部靶向的胜肽和生理活性物質）具有以下功效：其可活體內通過血腦屏障（BBB）、維持生理活性、和顯著地增加血液半生期。該用於腦部靶向的長效共軛物亦具有改善的穩定性和因此可用作為用於治療腦部相關性疾病的治療劑。此外，本發明提供新穎的用於腦部靶向的胜肽，且因此可製備新穎的用於腦部靶向的長效共軛物以用作為用於治療腦部相關性疾病的治療劑。
於以下，將詳細描述本發明。同時，本文中揭露的解釋和例示性實施方式之各者可應用於其等之各自的其他解釋和例示性實施方式。即，所有本文中揭露的種種因子之組合皆屬於本發明之範圍。此外，本發明之範圍不應受限於以下本文中提供的特殊揭露內容。
此外，所屬技術領域中具有通常知識者會認知到或能夠使用不超出例行實驗即確認一些本發明中描述的發明之特殊實施方式之同等物。此外，如此同等物係意欲被包含在本發明中。
於本發明之整個說明書通篇，使用胺基酸之習用單字母和三字母密碼。此外，使用一般允許用於其他胺基酸的三字母密碼，諸如二胺基丙酸（DAP）。此外，本文中提及的胺基酸係根據IUPAC-IUB之命名規則縮寫。
本發明之一個方面提供用於腦部靶向的長效共軛物，其含有用於腦部靶向的胜肽和生理活性物質。更特別地，該用於腦部靶向的長效共軛物可係以下者：其中用於腦部靶向的胜肽（其係藉由胜肽連接子及／或直接融合、或非胜肽連接子基於免疫球蛋白Fc區連接）和生理活性物質係連接，但不限於其等。本發明之用於腦部靶向的長效共軛物之特徵在於用於腦部靶向的胜肽係藉由胜肽連接子、直接融合、或非胜肽連接子連接至免疫球蛋白Fc區，不連接至生理活性物質。
於一個更特殊的實施方式中，本發明提供以下式1之用於腦部靶向的長效共軛物： [式1] X-L1 -F-L2 -Y 於式1中， X係生理活性物質； Y係用於腦部靶向的胜肽； L1 和L2 係胜肽連接子或非胜肽連接子； 當L1 和L2 係胜肽連接子時，該胜肽連接子含有0至1,000個胺基酸；且 F係包含FcRn結合區的免疫球蛋白恆定區。
本發明之長效共軛物形式之特徵在於生理活性物質係基於用於腦部靶向的胜肽和Fc區連接。特別地，本發明之長效共軛物之特徵在於該用於腦部靶向的胜肽係藉由胜肽連接子連接至免疫球蛋白Fc區且該生理活性物質係藉由非胜肽連接子連接至其；然而，兩種類型皆可藉由胜肽連接子及／或非胜肽連接子連接，但該連接不限於其等。該胜肽連接子可係含有0至1,000個胺基酸的連接子，但可包含任何可形成本發明之共軛物的胜肽連接子而無限制。當該胜肽連接子不含胺基酸時，該共軛物可呈藉由胜肽鍵而非連接子融合的形式。
用於腦部靶向的長效共軛物之式1之「F-L2 -Y」可係具有以下式2之結構的用於腦部靶向的長效共軛物。 [式2]於以上式2中， Fa 和Fb 各自係單股多肽鏈，其包含免疫球蛋白Fc區，該Fc區包含鉸鏈區、CH2域、和CH3域，其中Fa 和Fb 係藉由該鉸鏈區中的雙硫鍵連接，且藉此含有Fc片段，且Fa 和L1 係彼此共價鍵結； BTPa1 、……、BTPan 之各者（彼此係相同或不同）係用於腦部靶向的胜肽； BTPb1 、……、BTPbn′ 之各者（彼此係相同或不同）係用於腦部靶向的胜肽； L2a1 、……、L2an 之各者（彼此係相同或不同）係胜肽連接子；且 L2b1 、……、L2bn′ 之各者（彼此係相同或不同）係胜肽連接子； 其中n和n′可各自獨立地係整數。
於該用於腦部靶向的長效共軛物中，L1 可連接至Fa 之N端且L2a1 和L2b1 可各自分別連接至Fa 和Fb 之C端。
於式2之用於腦部靶向的長效共軛物中，n = n′，且各自可符合L2a1 = L2b1 、……、L2an = L2bn′ 且BTPa1 = BTPb1 、……、BTPan = BTPbn′ 之條件，但該等條件不限於其等。
該用於腦部靶向的長效共軛物之式1之F係Fa 和Fb 且「L2 -Y」係(L2a -Y)n 和(L2b-Y)n′ 且該用於腦部靶向的長效共軛物可由以下式3表現。 [式3]於以上式3中， X係生理活性物質； L1 係胜肽連接子或非胜肽連接子； Fa 和Fb 各自係免疫球蛋白Fc區，其含有鉸鏈區、CH2域、和CH3域，且Fa 和Fb 係藉由該鉸鏈區中的半胱胺酸殘基間的雙硫鍵彼此共價鍵結； Ya 和Yb （其等係用於腦部靶向的胜肽）彼此係相同種類或彼此係不同種類； L2a 和L2b （其等係胜肽連接子）彼此係相同種類或彼此係不同種類；且 n和n′各自獨立地係1或更多的整數。
當n和n′各自獨立地係2或更多的整數時，該用於腦部靶向的長效共軛物可係以下者，其中該等相同或不同的用於腦部靶向的胜肽之至少二者係連接，且和該至少二個相同或不同的用於腦部靶向的胜肽可呈縱排連接的形式，但該連接形式不限於其等。
N和n′可係1或2或更多的整數，且n和n′可係相同或不同的整數，但n和n′不限於其等。n和n′可係1至10、和1至5，例如n和n′可各自係1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10，但該n之數字被包含而不受限，若該Fc區和生理活性物質，被以構成欲藉由通過BBB來遞送的本發明之用於腦部靶向的長效共軛物的部分的零件的形式連接。
該用於腦部靶向的長效共軛物可係以下者：其中X之N端區域和F之N端區域係藉由L1 連接，且Y之N端區域和F之C端區域係藉由L2 連接。此外，該用於腦部靶向的長效共軛物可呈以下形式：其中L1 之一端係連接至X之離胺酸殘基或半胱胺酸殘基、等等且L1 之另一端係連接至F之N端區域；且Y之N端區域和F之C端區域係藉由L2 連接。
該用於腦部靶向的長效共軛物可呈以下形式：其中L1 係連接至F之N端區域，且L2 係連接至F之C端區域；或L1 係連接至Fa 之N端區域，且L2a 和L2b 係各自分別連接至Fa 和Fb 之C端區域。
L1 可連接至X之胺基團或巰基基團；且L1 可連接至X之N端胺基團、位於離胺酸殘基之側鏈的胺基團、或位於半胱胺酸殘基之側鏈的-SH基團（巰基基團），但不限於其等。
用於本文中，術語「N端區域」係論及胜肽或蛋白質之胺基端，且對於本發明之目的，係論及能夠結合至連接子（包含非胜肽連接子、等等）的位置。例如，可包含位於N端區域附近的胺基酸殘基以及N端區域之最末端的胺基酸殘基皆，且特別地，可包含從最末端區域開始的第一個至第二十個胺基酸殘基，但該等胺基酸殘基之位置並非特別限於其等。
用於本文中，術語「C端區域」係論及胜肽或蛋白質之羧基端，且對於本發明之目的，係論及能夠結合至連接子（包含非胜肽連接子、等等）的位置。例如，位於C端附近的胺基酸殘基以及C端區域之最末端胺基酸殘基皆可被包含，且特別地，可包含從最末端區域開始的第一個至第二十個胺基酸殘基，但該等胺基酸殘基之位置並非特別限於其等。
用於本文中，術語「用於腦部靶向的長效共軛物」係論及共軛物，其包含用於腦部靶向的胜肽和生理活性物質、和免疫球蛋白恆定區，且具有以下結構：其中該用於腦部靶向的胜肽和生理活性物質係各自分別直接或間接連接至FcRn結合區。術語「用於腦部靶向的長效共軛物」可與「長效共軛物」可互換地使用，且其係論及以下物質：其中於該長效共軛物中包含的生理活性物質係連接至生物相容的物質，其包含能夠延長該生理活性物質之活性之持續期間的免疫球蛋白恆定區且具有FcRn結合區、和含有0至1,000個胺基酸的胜肽連接子及／或非胜肽連接子。
該用於腦部靶向的長效共軛物可藉由通過血腦屏障將生理活性物質遞送至腦組織中，但並不特別限於其等。
於以下，構成該用於腦部靶向的長效共軛物的元件會以更多細節描述。
用於本文中，術語「用於腦部靶向的胜肽」包含胜肽、或蛋白質、或抗體，其含有可通過BBB的胺基酸序列。該用於腦部靶向的胜肽對應於構成本發明之用於腦部靶向的長效共軛物的一個部分。
此外，該用於腦部靶向的胜肽可係從已知的胜肽、蛋白質、或抗體分離的序列和具有可通過BBB的活性。
用於本文中，術語「胺基酸」係論及胺基酸部分，其包含任何天然存在的或非天然存在的或合成的胺基酸殘基，即任何包含至少一個羧基殘基和至少一個胺基殘基（其等係通過一、二、三、或更多個碳原子，典型係通過單一（α）碳原子直接連接）的部分。
本發明之用於腦部靶向的胜肽之特徵可在於其可透過藉由被動運輸的途徑或藉由受體介導性運輸的途徑通過血腦屏障，但該運輸途徑不限於其等。例如，該用於腦部靶向的胜肽可係可通過血腦屏障的胜肽、蛋白質、或抗體，但其等之種類和大小不特別受限。
同時，該用於腦部靶向的胜肽可係透過藉由受體介導性運輸的途徑通過血腦屏障者。
同時，該用於腦部靶向的胜肽可係透過藉由受體介導性運輸的途徑通過血腦屏障者。
特別地，該用於腦部靶向的胜肽可藉由透過選自由以下者所組成之群組之任一者的受體介導性運輸途徑通過血腦屏障：胰島素受體、運鐵蛋白受體、低密度脂蛋白受體、低密度脂蛋白受體相關性蛋白質、瘦素受體、菸鹼乙醯膽鹼受體、麩胱甘肽運輸蛋白、鈣活化性鉀通道、和糖化終產物受體（RAGE）、和該等受體之配體和與該等受體或配體結合的抗體，但該途徑並不特別限於其等；且此外，可係選自由可通過血腦屏障的胜肽、蛋白質、和抗體所組成之群組，或可係自該等胜肽、蛋白質、和抗體分離的部分胜肽序列，但該途徑並不特別限於其等。例如，可使用SEQ ID NO: 2之HAITYPRH胜肽（BTP1胜肽）、SEQ ID NO: 4之THR胜肽（BTP2胜肽）、SEQ ID NO: 6之Angiopep-2胜肽（BTP3胜肽）、SEQ ID NO: 8之ApoB胜肽（BTP4胜肽）、SEQ ID NO: 10之ApoE胜肽（BTP5胜肽）、等等，但可包含任何可藉由通過血腦屏障將所連接的F-L2 -Y結構遞送至腦部的胜肽而不受限。
於另一個特殊的實施方式中，SEQ ID NO: 20之BTP6胜肽、SEQ ID NO: 22之BTP7胜肽、SEQ ID NO: 24之BTP8胜肽、SEQ ID NO: 26之BTP9胜肽、SEQ ID NO: 28之BTP10胜肽、SEQ ID NO: 30之BTP11胜肽、SEQ ID NO: 32之BTP12胜肽、SEQ ID NO: 34之BTP13胜肽、SEQ ID NO: 36之BTP14胜肽、SEQ ID NO: 38之BTP15胜肽、或SEQ ID NO: 40之BTP16胜肽，但該胜肽不限於其等。
於另一個特殊的實施方式中，該用於腦部靶向的胜肽可係： (1) Angiopep-2：TFFYGGSRGKRNNFKTEEY-OH （SEQ ID NO：41）、 (2) ApoB (3371-3409)：SVIDALQYKLEGTTRLTRKRGLKLATALSLSNKFVEGS（SEQ ID NO：42）、 (3) ApoE(159-167)2 ：(LRKLRKRLL)2 （SEQ ID NO：43）、 (4)胜肽-22：Ac-C(&)MPRLRGC(&)-NH2 （SEQ ID NO：44）、 (5) THR：THRPPMWSPVWP-NH2 （SEQ ID NO：45）、 (6) THR逆-對映：pwvpswmpprht-NH2 （SEQ ID NO：46）、 (7) CRT：C(&)RTIGPSVC(&)（SEQ ID NO：47）、 (8)瘦素30：YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVL（SEQ ID NO：48）、 (9) RVG29：YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG-OH （SEQ ID NO：49） (10)D CDX：GreirtGraerwsekf-OH （SEQ ID NO：50） (11)蜜蜂神經毒素（Apamin）：C(&1 )NC(&2 )KAPETALC(&1 )-ARRC(&2 )QQH-NH2 （SEQ ID NO：51）、 (12) MiniAp-4：[Dap](&)KAPETALD(&)（SEQ ID NO：52）、 (13) GSH：γ-L-麩胺醯基-CG-OH (14) G23：HLNILSTLWKYRC（SEQ ID NO：53）、 (15) g7：GFtGFLS(O-β-Glc)-NH2 （SEQ ID NO：54）、 (16) TGN：TGNYKALHPHNG（SEQ ID NO：55）、 (17) TAT(47-57)：YGRKKRRQRRR-NH2 （SEQ ID NO：56）、 (18) SynB1：RGGRLSYSRRRFSTSTGR（SEQ ID NO：57）、 (19)哌口井二酮：&(N-MePhe)-(N-MePhe)哌口井二酮、或 (20) PhPro：(苯基脯胺酸)4 -NH2 （SEQ ID NO：58）， 但該胜肽不限於其等。
於以上序列中，&係根據於（J. Pept. Res. , 2005, 65, 550至555；J. Spengler等人）中描述的用於環狀胜肽的命名的符號，且「&」指示連結點。例如，於單鏈中的第一個「&」指出化學鍵之一端之位置且第二個「&」指出該化學鍵接附至其的位置接附。例如，「&Ala-Ala-Phe-Leu-Pro&」意謂化學鍵於丙胺酸和脯胺酸間形成且藉此形成環狀胜肽。若存在二或更多個化學鍵，可使用諸如&1和&2的編碼以指出相對應化學鍵形成的位置。例如，若指出「&1Asp(&2)-Trp-Phe-Dpr(&2)-Leu-Met&1」，其意謂一個化學鍵係於Asp和Met間形成，且一個化學鍵係於Asp和Dpr間形成。同時，[Dap]意指二胺基丙酸。
用於本文中，術語「生理活性物質」（其可係形成該用於腦部靶向的長效共軛物之部分的構件）一起係論及活體內具有生理活性的物質，且此等物質具有各種各樣的生理活性。該生理活性物質（X）可係由以下者所組成的多肽：2個胺基酸至1,000個胺基酸、2個胺基酸至950個胺基酸、2個胺基酸至900個胺基酸、2個胺基酸至850個胺基酸、2個胺基酸至800個胺基酸、2個胺基酸至750個胺基酸、2個胺基酸至700個胺基酸、5個胺基酸至700個胺基酸、5個胺基酸至650個胺基酸、5個胺基酸至600個胺基酸、5個胺基酸至550個胺基酸、5個胺基酸至500個胺基酸、5個胺基酸至450個胺基酸、5個胺基酸至400個胺基酸、5個胺基酸至350個胺基酸、5個胺基酸至300個胺基酸、5個胺基酸至250個胺基酸、5個胺基酸至200個胺基酸、5個胺基酸至150個胺基酸、5個胺基酸至100個胺基酸、5個胺基酸至90個胺基酸、約5個胺基酸至約80個胺基酸、5個胺基酸至70個胺基酸、5個胺基酸至60個胺基酸、5個胺基酸至50個胺基酸、5個胺基酸至40個胺基酸、t 5個胺基酸至30個胺基酸、5個胺基酸至25個胺基酸、或5個胺基酸至20個胺基酸，但不限於其等。構成該生理活性物質的多肽包含胜肽、寡肽、多肽、和蛋白質之所有者。
該生理活性物質可係毒素或生理活性多肽，且可包含種種生理活性多肽，諸如細胞介素、介白素、介白素結合蛋白、酵素、抗體、生長因子、轉錄因子、凝血因子、疫苗、結構蛋白質、配體蛋白質或受體、細胞表面抗原、和受體拮抗劑，其等係用於預防或治療人類疾病的目的、於小腸和胰臟分泌且展現對於糖尿病和肥胖的治療功效的生理活性胜肽、和G蛋白質偶聯受體（GPCR）促效劑或拮抗劑、或其類似物，但該生理活性物質不限於其等。
用於本文中，術語「X之類似物」係論及可展現與X之活性類型相同的活性的物質，且其包含X之促效劑、X之衍生物、X之片段、X之變體、等等之所有者
特別地，該毒素可選自美登素及／或其衍生物、auristatin及／或其衍生物、duocarmycin及／或其衍生物、吡咯并苯并二氮呯（PBD）及／或其衍生物，其等係有效於癌細胞之凋亡，但可包含任何展現對於癌症細胞之凋亡的功效的毒素而不受限。
特別地，該生理活性多肽之實例可包含GLP-1受體促效劑、升糖素受體促效劑、胃抑制性多肽（GIP）受體促效劑、纖維母細胞生長因子（FGF）受體促效劑（FGF1、FGF19、FGF21、FGF23、等等）、膽囊收縮素受體促效劑、胃泌素受體促效劑、黑皮質素受體促效劑、人類生長激素、生長激素釋放激素、生長激素釋放胜肽、干擾素和干擾素受體（例如干擾素-α、-β和-g、可溶性第I型干擾素受體、等等）、群落刺激因子、介白素（例如介白素-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-20、-21、-22、-23、-24、-25、-26、-27、-28、-29、-30、等等）和介白素受體（例如IL-1受體、IL-4受體、等等）、酵素（例如β-葡萄糖苷酶）、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性α-葡萄糖苷酶、酸性神經醯胺酶、酸性神經磷脂酶、半乳糖腦苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、B、β-己醣胺酶A、B、肝素N -硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、N-乙醯半乳胺糖-6硫酸酯酶、溶酶體酸性脂酶、α-N -乙醯基-葡萄胺糖苷酶、葡萄糖腦苷脂酶、丁醯膽鹼酯酶、幾丁質酶、麩胺酸去羧酶、伊米苷酶、脂酶、尿酸酶、血小板活化因子乙醯基水解酶、中性內肽酶、髓過氧化酶、α-半乳糖苷酶-A、阿加半乳糖苷酶α、β、α-L-艾杜糖醛酸酶、丁醯膽鹼酯酶、幾丁質酶、麩胺酸去羧酶、伊米苷酶、脂酶、尿酸酶、血小板活化因子乙醯基水解酶、中性內肽酶、和髓過氧化酶、等等）、介白素和細胞介素結合蛋白（例如IL-18bp、TNF結合蛋白、等等）、巨噬細胞活化因子、巨噬細胞胜肽、B細胞因子、T細胞因子、蛋白質A、過敏抑制因子、壞死醣蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、腫瘤壞死因子、腫瘤抑制子、轉形生長因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、缺脂脂蛋白-E、紅血球生成素、高醣苷化紅血球生成素、血管生成素、血紅素、凝血酶、凝血酶受體活化胜肽、凝血酶調節素、凝血因子VII、凝血因子VIIa、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子XIII、血纖維蛋白溶酶原活化子、血纖維蛋白結合胜肽、尿激酶、鏈球菌激酶、水蛭素、蛋白質C、C反應性蛋白質、腎素抑制子、膠原蛋白酶抑制子、超氧化物歧化酶、瘦素、血小板衍生性生長因子、上皮生長因子、表皮生長因子、血管抑制素、血管收縮肽、骨成形性生長因子；骨成形性蛋白質、抑鈣素、胰島素、心房利尿鈉肽、軟骨誘發因子、依降鈣素、結締組織活化因子、組織因子途徑抑制子、濾泡刺激激素、黃體成長激素、黃體成長激素釋放激素、神經生長因子（例如神經生長因子、睫狀神經營養因子、軸突生成因子-1、腦利尿鈉肽、神經膠衍生性神經營養因子、netrin、嗜中性球抑制因子、神經營養因子、neurturin）、副甲狀腺素、鬆弛素、分泌素、體介素、類胰島素生長因子、腎上腺皮質激素、升糖素、膽囊收縮素、胰多肽、胃泌素釋放胜肽、促皮質素釋放因子、甲狀腺刺激激素、autotaxin、乳鐵蛋白、肌肉生長抑制素、活性依賴性神經保護性蛋白質（ADNP）、β-分泌酶1（BACE1）、類澱粉蛋白前驅蛋白（APP）、神經細胞黏著分子（NCAM）、類澱粉蛋白β、tau、糖化終產物受體（RAGE）、α-突觸核蛋白、或其等之促效劑或拮抗劑、其等之受體（例如TNFR(P75)、TNFR(P55)、IL-1受體、VEGF受體、B細胞活化性因子受體、等等）、受體拮抗劑（例如IL1-Ra、等等）、細胞表面抗原（例如CD 2、3、4、5、7、11a、11b、18、19、20、23、25、33、38、40、45、69、等等）、單株抗體、多株抗體、抗體片段（例如scFv、Fab、Fab′、F(ab′)2和Fd）、病毒衍生性疫苗抗原、活化至少一種受體促效劑的雜合多肽或嵌合多肽、等等，但該生理活性多肽不限於其等。
用於本文中，術語「艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶」（其係與Hunter氏徵候群（MPS-II）有關的硫酸酯酶酵素）係對硫酸肝素和硫酸皮膚素之溶酶體降解為必須的酵素。於本發明之特殊的實施方式中，可將「idursulfase」（其係艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之經純化型）用作為艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，且idursulfase被包含在艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶中係明顯的。該idursulfase可係（例如）idursulfase α或idursulfase β，但不限於其等。
艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶可藉由所屬技術領域中已知的方法製備或製造，且特別地，其可自動物細胞（至其中動物細胞表現載體被***並培養）且於其之培養後純化，或可購買商業可得的酵素以使用之，但艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之製備方法不限於其等。
可於本發明中應用的生理活性多肽可呈天然形式，或係該等藉由於原核細胞（諸如大腸桿菌）或真核細胞（諸如酵母菌細胞、昆蟲細胞、或動物細胞）中的基因重組製備者。此外，該生理活性多肽可係具有與天然形式之活性或相同物種之活性同等的活性的類似物（例如於一或多個胺基酸位置的突變體衍生物），但該可應用的生理活性多肽不限於其等。
同時，該GLP-1受體促效劑可選自由以下者所組成之群組：天然exendin-4；exendin-4衍生物，其中exendin-4之N端胺基團被缺失；exendin-4衍生物，其中exendin-4之N端胺基團係以羥基基團取代；exendin-4衍生物，其中exendin-4之N端胺基團係以二甲基基團修飾；exendin-4衍生物，其中exendin-4之N端胺基團係以羧基基團取代；exendin-4衍生物，其中exendin-4之第1個胺基酸（組胺酸）之α-碳係缺失；exendin-4衍生物，其中exendin-4之第12個胺基酸（離胺酸）係以絲胺酸取代、和exendin-4衍生物，其中exendin-4之第12個胺基酸（離胺酸）係以精胺酸取代，但該GLP-1受體促效劑並不特別限於其等。
於一個特殊的實施方式中，本發明提供用於腦部靶向的長效共軛物，其之特徵在於生理活性物質係藉由彼此結合連接至免疫球蛋白Fc區與之融合的用於腦部靶向的胜肽之該免疫球蛋白Fc區。
用於本文中，術語「F」係論及包含免疫球蛋白恆定區和FcRn結合區的物質，且特別地，其對應於構成本發明之用於腦部靶向的長效共軛物的一個部分。例如，F可係包含FcRn結合區的免疫球蛋白Fc區。
於另一個特殊的實施方式中，該用於腦部靶向的胜肽（其與免疫球蛋白Fc區融合）之免疫球蛋白Fc區可係免疫球蛋白Fc區以外的生物相容的物質。
用於本文中，術語「生物相容的物質」係論及當與生理活性物質融合或共價鍵結以形成共軛物時可藉由增加生理活性物質之活體內半生期而延長活性之持續期間的物質。例如，由於最優先事項在於增加半生期和生體可用率並維持持續的活性，該等可與生理活性物質融合或連接的物質之實例可係種種生物相容的物質，例如聚乙二醇、脂肪酸、膽固醇、白蛋白和其片段、白蛋白結合物質、彈性蛋白、彈性蛋白之水溶性前驅物和數個彈性蛋白蛋白質之部分序列之重複單元之聚合物、抗體、抗體片段、FcRn結合物質、活體內結締組織、核苷酸、纖維接合素、運鐵蛋白、多醣、聚合物、等等可被包含而不受限。
由於免疫球蛋白Fc區係可被活體內代謝的生物可降解多肽，其對於用作為藥物載體而言係安全的。此外，該免疫球蛋白Fc區相較於整個免疫球蛋白之分子具有相對低的分子量，其對於共軛物之製備、純化、和產生係有利的。此外，因為Fab區域（其由於抗體和抗體間的胺基酸序列之不同而展現高度異質性）被移除，預期到物質之同質性可被大大增加且誘發血液抗原性之風險亦可被降低。
用於腦部靶向的胜肽共軛物（其與免疫球蛋白Fc區融合）係藉由胜肽鍵連接至該免疫球蛋白Fc區且係於表現其的宿主細胞中以長效共軛物的形式製造。該表現宿主可係微生物（諸如大腸桿菌或酵母菌細胞）、昆蟲細胞、動物細胞、等等而不受限。
用於本文中，術語「免疫球蛋白恆定區」可係形成用於腦部靶向的長效共軛物之部分的構件，且包含該免疫球蛋白之重鏈恆定區2（CH2）和重鏈恆定區3（CH3），不包含重鏈和輕鏈可變區和輕鏈恆定區（CL1）。鉸鏈區可被包含在該等重鏈恆定區中。
該免疫球蛋白恆定區可係免疫球蛋白Fc區。
F之免疫球蛋白恆定區可包含一至四個選自由CH1、CH2、CH3、和CH4域所組成之群組的域。
本發明之免疫球蛋白恆定區可係1)CH1域、CH2域、CH3域、和CH4域、2)CH1域和CH2域、3)CH1域和CH3域、4) CH2域和CH3域、和5)一或二或更多個選自免疫球蛋白之CH1域、CH2域、CH3域、和CH4域和鉸鏈區（或鉸鏈區之部分）的域間的組合（例如CH2域和CH3域和鉸鏈區（或鉸鏈區之部分）間的組合）、和6)重鏈恆定區和輕鏈恆定區之各個域間的二聚體。本發明之鉸鏈區不僅包含天然鉸鏈區且亦包含所屬技術領域中已知的鉸鏈區之所有者之部分。
特別地，F之免疫球蛋白恆定區可包含鉸鏈區、CH2域、和CH3域，但並不特別限於其等。
此外，本發明之免疫球蛋白Fc區不僅包含天然胺基酸序列且亦包含其序列衍生物（突變體）。胺基酸序列衍生物係論及由於缺失、***、非保守或保守取代、或其等之組合而於至少一個胺基酸殘基具有差異的胺基酸序列。例如，可將位於位置214至238、297至299、318至322、或327至331的胺基酸殘基（已知其等於免疫球蛋白Fc之共軛中係重要的）用作為用於修飾的適合位置。此外，種種其他種類的衍生物係可能的，包含具有能夠形成雙硫鍵的區域之缺失、或一些位於天然Fc之N端的胺基酸殘基之缺失或位於天然Fc之N端的甲硫胺酸殘基之添加者。進一步，為了移除效應功能，缺失可於補體結合位置（諸如C1q結合位置）和抗體依賴性細胞介導性細胞毒性（ADCC）位置發生。製備該免疫球蛋白Fc區之如此序列衍生物的技術係於國際專利公開案編號WO 97/34631、WO 96/32478、等等中揭露。
蛋白質和胜肽中的胺基酸交換（其一般不會改變該等蛋白質或胜肽之活性）係所屬技術領域中已知的（H. Neurath, R. L. Hill,The Protein , Academic Press, New York, 1979）。最常發生的交換係Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。於一些例子中，該Fc區可藉由磷酸化、硫酸化、丙烯酸化（acrylation）、醣苷化、甲基化、法呢基化（farnesylation）、乙醯化、醯胺化、等等修飾。
上述免疫球蛋白恆定區衍生物可係該等顯示與本發明之免疫球蛋白恆定區之生物活性完全相同的生物活性和具有改善的對熱、pH、等等的結構穩定性者。
此外，該免疫球蛋白Fc區可獲自從人類或諸如乳牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠、天竺鼠、等等的動物活體內分離的天然形式，或可係其重組物或衍生物，其等係自經轉形動物細胞或微生物獲得。於本文中，該Fc區可藉由自活人類或動物體分離完整免疫球蛋白並以蛋白酶處理經分離的免疫球蛋白而自天然免疫球蛋白獲得。當完整免疫球蛋白係以木瓜酵素處理時，其被切成Fab和Fc區，而當完整免疫球蛋白係以胃蛋白酶處理時，其被切成pF′c和F(ab)2 片段。此等片段可使用尺寸排除層析術、等等分離。於一個更特殊的實施方式中，關於人類衍生性Fc區，該免疫球蛋白Fc區可係自微生物獲得的重組免疫球蛋白Fc區。
此外，該免疫球蛋白恆定區可呈天然聚醣、增加或減少的聚醣（相較於天然型）之形式、或呈去醣苷化形式。該免疫球蛋白Fc聚醣之增加、減少、或移除可藉由習用方法（諸如化學方法、酵素性方法、和使用微生物的基因工程方法）達成。藉由自Fc區移除聚醣獲得的免疫球蛋白Fc區顯示於對補體（C1q部分）的結合親和力之顯著減少和於抗體依賴性細胞毒性或補體依賴性細胞毒性之減少或喪失，且因此其不會於活體內誘發非必須的免疫反應。於此方面，呈現去醣苷化或無醣苷化免疫球蛋白Fc區的免疫球蛋白Fc區可能係符合作為藥物載體的本發明之原始目標的更適合形式。
用於本文中，術語「去醣苷化」係論及自Fc區酵素性移除糖部分，且術語「無醣苷化」係論及於原核生物（更特別地，大腸桿菌）中製造的未經醣苷化的免疫球蛋白恆定區。
同時，該免疫球蛋白Fc區可係衍生自人類或動物（包含乳牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠、和天竺鼠），且較佳地，其係衍生自人類。
此外，該免疫球蛋白（Ig）Fc區可係衍生自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM、或其等之組合或雜合物。例如，其可衍生自IgG或IgM，其等係人類血液中最充足的蛋白質之二，且其可衍生自IgG，其已知會增強配體結合蛋白之半生期。同時，用於本文中，術語「組合」意謂編碼相同來源的單鏈免疫球蛋白Fc區的多肽係連接至不同來源的單鏈多肽以形成二聚體或多聚體。即，二聚體或多聚體可從二或更多個選自由IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc、和IgE Fc片段所組成之群組的片段製備。
用於本文中，術語「雜合物」意謂對應於二或更多個不同來源的免疫球蛋白Fc片段的序列係於單一鏈的免疫球蛋白Fc區中存在。於本發明中，種種雜合形式係可能的。即，該雜合域可由一至四個選自由IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc、和IgD Fc之CH1、CH2、CH3、和CH4所組成之群組的域構成，且可進一步包含鉸鏈區。
同時，IgG亦可被分成IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4子類型，且本發明可包含其等之組合或雜合物，例如IgG2和IgG4子類型，且特別地，幾乎不具有效應功能（諸如補體依賴性細胞毒性（CDC））的IgG4之Fc區，但不限於其等。此外，於一個實施方式中，該免疫球蛋白Fc區可係IgG1 Fc區或IgG4 Fc區，但不限於其等。
用於本文中，術語式1之「L1 及／或L2 」（其係形成該用於腦部靶向的長效共軛物之部分的構成元件）係論及將用於腦部靶向的胜肽或生理活性物質連接至免疫球蛋白Fc區的連接子。該連接子基本上係論及可使用共價鍵、等等連接二個融合伙伴的連接體。除了連接融合伙伴外，連接子亦可具有於該等融合伙伴間提供某種大小的空隙或提供彈性或剛性的角色，但該等連接子之角色並不特別受限於其等。
於一個特殊的實施方式中，式1之L1 和L2 之一者可係胜肽連接子且式1之L1 和L2 之另一者可係非胜肽連接子。供選擇地，式1之L1 和L2 之一者可係胜肽連接子，式1之L1 和L2 之另一者可係非胜肽連接子，和L1 和L2 二者皆可係胜肽連接子而L1 和L2 二者皆可係非胜肽連接子，但式1之L1 和L2 並非特別限於其等。
於另一個特殊的實施方式中，當式1之L1 和L2 之任一者或二者皆係非胜肽連接子時，該非胜肽連接子可係選自由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、聚葡萄醣、聚乙烯基乙基醚、生物可降解聚合物、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸、脂肪酸、高分子量聚合物、低分子量化合物、核苷酸、和其等之組合所組成之群組，但該非胜肽連接子不限於其等。
於又另一個特殊的實施方式中，當L1 係非胜肽連接子且L2 係胜肽連接子時，該胜肽連接子可含有0至1,000個胺基酸。於另一個特殊的實施方式中，當L1 係非胜肽連接子且L2 係胜肽連接子時、且該該胜肽連接子不含胺基酸時，F和Y（其係用於腦部靶向的胜肽）可直接藉由融合形成。
於又另一個特殊的實施方式中，當L1 和L2 之任一者或二者皆係胜肽連接子時，X和F、或F和Y係藉由L1 和L2 透過共價化學鍵、非共價化學鍵、或其等之組合彼此連接；且L1 和L2 各自含有0至1,000個胺基酸。當該胜肽連接子不含胺基酸時，X和F、或F和Y可藉由胜肽鍵連接。
於又另一個特殊的實施方式中，當L1 和L2 之任一者或二者皆係胜肽連接子、且L1 和L2 各自不含胺基酸時，(i) X和F、或F和Y可藉由胜肽鍵連接；或(ii) X和F、或F和Y可藉由胜肽鍵連接。
用於本文中，術語「胜肽連接子」包含連結二個融合伙伴或胺基酸之聚合物的胜肽共軛物。特別地，該胜肽連接子可含有0至1,000個胺基酸序列，和更特別地，0至900個胺基酸序列，0至800個胺基酸序列，0至700個胺基酸序列，0至600個胺基酸序列，0至500個胺基酸序列，0至400個胺基酸序列，0至300個胺基酸序列，0至250個胺基酸序列，0至200個胺基酸序列，0至150個胺基酸序列，0至100個胺基酸序列，0至90個胺基酸序列，0至80個胺基酸序列，0至70個胺基酸序列，0至60個胺基酸序列，0至50個胺基酸序列，0至40個胺基酸序列，0至30個胺基酸序列，0至25個胺基酸序列，0至20個胺基酸序列，0至15個胺基酸序列，或0至10個胺基酸序列，但胺基酸序列之數目並不特別限於其等。
此外，該胜肽連接子之實例可包含胺基酸序列組成的胜肽，其係呈其中GGGGS（SEQ ID NO: 59）模體、GS模體、GGGS（SEQ ID NO: 60）模體、或GGSG（SEQ ID NO: 61）模體係重複的形式，且此等模體可重複1至10次，但該等模體並非特別限於其等。
此外，當L2 係胜肽連接子時，L2 係(GS)m 、(GGS)m 、(GGGS)m 、或(GGGGS)m ，且m可係1至10，但不限於其等。
於又另一個特殊的實施方式中，當L1 和L2 之任一者係胜肽連接子且該二者之另一者係非胜肽連接子時，該胜肽連接子係含有0至1,000個胺基酸的連接子且該非胜肽連接子係聚乙二醇，但該等連接子不限於其等。
用於本文中，術語「非胜肽連接子」係論及生物相容的連接子，其中二個或更多個重複單元係連接，且該等重複單元係透過任何胜肽鍵以外的共價鍵彼此連接。
於又另一個特殊的實施方式中，當該非胜肽連接子和X和Y各自係藉由其等各自之官能基連接時，該非胜肽連接子之官能基可係選自由醛基團、順丁烯二醯亞胺基團、和琥珀醯亞胺衍生物所組成之群組。L1 可係於兩端皆具有官能基的非胜肽聚合物，且該於兩端的官能基皆可係胺反應性基團或巰基反應性基團，且該於兩端的官能基可彼此係相同種類或彼此係不同種類，但不限於其等。
該非胜肽聚合物（其係欲於本發明中使用的非胜肽連接子）可係選自由以下者所組成之群組：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、聚葡萄醣、聚乙烯基乙基醚、生物可降解聚合物，諸如聚乳酸（PLA）和聚乳酸-羥乙酸（PLGA）、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸、寡核苷酸、和其等之組合，且例如係聚乙二醇，但該非胜肽聚合物不限於其等。所屬技術領域中已知的其等之衍生物和所屬技術領域之技術水平中可輕易地製備的衍生物亦被包含在本發明之範圍內。
關於欲於本發明中使用的非胜肽聚合物，可使用任何對活體內蛋白質降解具有抗性的聚合物而無限制。該非胜肽聚合物之分子量可在超過0 kDa至約100 kDa的範圍，例如約0.5 kDa至約100 kDa、約1 kDa至約100 kDa、或約1 kDa至約20 kDa，但該分子量不限於其等。
用於本文中，術語「約」係論及範圍，其包含±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1、等等之所有者，且包含同等或類似於在該等值之後者的值之所有者，但該範圍不限於其等。
此外，關於該非胜肽連接子，不僅可使用單一種類的聚合物但亦可使用不同種類的聚合物之組合。
同時，該非胜肽聚合物（其係於本發明中使用的非胜肽連接子）可具有欲連接至F和X或Y之官能基的官能基，使得免疫球蛋白Fc區和生理活性物質可於其等間形成共價鍵。
特別地，該非胜肽連接子可具有至少二個末端官能基，特別係2或3個末端官能基，且更特別係二個末端官能基。
該官能基可選自由醛基團、順丁烯二醯亞胺基團、和琥珀醯亞胺衍生物所組成之群組，但該官能基不限於其等。
於以上，醛基團之實例可包含丙醛基團或丁醛基團，但該醛基團不限於其等。
於以上，琥珀醯亞胺衍生物之實例可包含戊酸琥珀醯亞胺酯、甲基丁酸琥珀醯亞胺酯、甲基丙酸琥珀醯亞胺酯、丁酸琥珀醯亞胺酯、丙酸琥珀醯亞胺酯、N -羥基琥珀醯亞胺、羥基琥珀醯亞胺基、琥珀醯亞胺基羧基甲基、或碳酸琥珀醯亞胺酯，但該琥珀醯亞胺衍生物不限於其等。
該非胜肽連接子之二端之官能基可係彼此相同或不同。
例如，位於該非胜肽連接子之一端之官能基可係順丁烯二醯亞胺基團且位於另一端之官能基可係醛基團（例如丙醛基團或丁醛基團）。當將於兩端皆具有羥基官能基的聚乙二醇用作為非胜肽聚合物時，以下者係可能的：於種種反應性基團中藉由已知的化學反應活化該羥基基團或使用具有商業可得的經修飾反應性基團的聚乙二醇製備本發明之共軛物。
此外，該非胜肽聚合物可係同官能性非胜肽聚合物，其中該非胜肽連接子之二個端或三端之所有者皆係醛基團。
例如，該非胜肽連接子可係於兩端皆具有丙醛基團的非胜肽聚合物，且特別係於兩端皆具有丙醛基團的聚乙二醇，但並不特別限於其等。
當該非胜肽連接子於兩端皆具有反應性醛基團之官能基時，其有效於最小化非專一性反應和於兩端分別連接至生理活性多肽和免疫球蛋白。藉由還原性胺化通過醛鍵形成的最終產物相較於該等通過醯胺鍵者明顯更穩定。該醛官能基於N端以低pH選擇性地反應和且於高pH（例如pH 9.0）與離胺酸殘基形成共價鍵。
本發明之用於腦部靶向的共軛物可係長效共軛物，其中彼此不同的生理活性物質被包含，其係以以下方式製備：用於腦部靶向的胜肽共軛物（其與免疫球蛋白Fc區融合）被編碼並接著化學結合，並接著不同的生理活性物質係連接至經化學結合的免疫球蛋白Fc區。
經化學結合的免疫球蛋白Fc區共軛物包含二個免疫球蛋白Fc區（其中單體Fc區係連接的Fc區之二聚體形式），且結合至該二個免疫球蛋白Fc區之各者的生理活性物質可連接至該免疫球蛋白Fc區之單一位置（單體Fc區）或該二個免疫球蛋白Fc區之二個位置（Fc區之各個二聚體形式）。
該化學結合可係共價鍵，更特別係雙硫鍵，且甚至更特別係二個免疫球蛋白Fc區之鉸鏈區中形成的雙硫鍵，但該結合並不特別限於其等。
更特別地，該用於腦部靶向的長效共軛物可呈其中二聚體係藉由以下者間的化學鍵形成的形式：(i)第一免疫球蛋白Fc區，其中用於腦部靶向的胜肽係透過上述胜肽連接子（例如胜肽鍵）連接至一個分子的免疫球蛋白Fc區之C端區域和(ii)第二免疫球蛋白Fc區，其中用於腦部靶向的胜肽係透過上述胜肽連接子（例如胜肽鍵）連接至一個分子的免疫球蛋白Fc區之C端區域，且一個分子的生理活性物質可連接至該二個免疫球蛋白Fc區分子之一者之N端區域；或可呈其中生理活性物質係連接至該等免疫球蛋白Fc區分子之二者之N端區域之各者的形式，但該等形式並非特別限於其等。該第一和第二免疫球蛋白Fc區（其等係呈融合蛋白質的形式）可係藉由該免疫球蛋白Fc區和該用於腦部靶向的胜肽間的胜肽鍵符合讀框地融合，且該免疫球蛋白Fc區可包含鉸鏈區、CH2域、和CH3域，但該免疫球蛋白Fc區並不特別限於其等。
該第一和第二免疫球蛋白Fc區間的化學鍵可特別係共價鍵，更特別係雙硫鍵，且更特別地，該二個免疫球蛋白Fc區之鉸鏈區中形成的雙硫鍵，但該化學鍵並不特別限於其等。
本發明之又另一個方面提供用於製備式1之用於腦部靶向的長效共軛物的的方法。
於一個特殊的實施方式中，該用於製備式1之用於腦部靶向的長效共軛物的方法可包含：i)製備：(a) X-L1 -F，其中X（其係生理活性物質）、L1 （其係胜肽或非胜肽連接子）、和F（其包含免疫球蛋白Fc區）係連接；和(b) L2 -Y，其中Y（其係用於腦部靶向的胜肽）和L2 （其係胜肽或非胜肽連接子）係連接；並(ii)連接(a) X-L1 -F和(b) L2 -Y。特別地，於一個特殊的實施方式中，(a)之L1 可係胜肽連接子和(b)之L2 可係非胜肽連接子。
於另一個特殊的實施方式中，該用於製備式1之用於腦部靶向的長效共軛物的方法可包含：i)製備：(a) X-L1 ，其中X（其係生理活性物質）和L1 （其係胜肽或非胜肽連接子）係連接；和(b) F-L2 -Y，其中Y（其係用於腦部靶向的胜肽）、L2 （其係胜肽或非胜肽連接子）、和F（其包含免疫球蛋白Fc區）係連接；和(ii)連接(a) X-L1 和(b) F-L2 -Y。特別地，於一個特殊的實施方式中，(a)之L1 可係非胜肽連接子和(b)之L2 可係胜肽連接子。
於又另一個特殊的實施方式中，該用於製備式1之用於腦部靶向的長效共軛物的方法可包含：(i)製備：(a) X-L1 ，其中X（其係生理活性物質）和L1 （其係胜肽或非胜肽連接子）係連接；和(b) F-L2 -Y，其中Y（其係用於腦部靶向的胜肽）、L2 （其係胜肽或非胜肽連接子）、和F（其包含免疫球蛋白Fc區）係連接；和(ii)連接(a) X-L1 和(b) F-L2 -Y。特別地，於一個特殊的實施方式中，L1 可係非胜肽連接子和L2 可係胜肽連接子。L2 可不含胺基酸，於該例子中該長效共軛物可以F-Y形式直接融合。
於又另一個特殊的實施方式中，該非胜肽連接子和X和Y可藉由其等各自之官能基連接，其中該非胜肽連接子之官能基可係選自由醛基團、順丁烯二醯亞胺基團、和琥珀醯亞胺衍生物所組成之群組。
本發明之含有用於腦部靶向的胜肽和生理活性物質的長效共軛物可通過血腦屏障、維持生理活性、並藉此展現改善的持久性和穩定性。
本發明之又另一個方面提供該用於腦部靶向的胜肽、編碼該用於腦部靶向的胜肽的經分離的多核苷酸、含有該多核苷酸的表現載體、和含有該表現載體的轉形株。
同時，該用於腦部靶向的胜肽可包含該等呈胜肽本身、其鹽（例如該胜肽之醫藥上可接受的鹽）、或其溶劑合物之形式之所有者。
此外，該用於腦部靶向的胜肽可呈任何醫藥上可接受的形式。
該鹽之種類不特別受限。然而，該鹽較佳係對接受者（例如哺乳動物）而言係安全且有效者，但並不特別限於其等。
術語「醫藥上可接受的」係論及物質，其可有效地用於醫藥決定之範圍內的所欲用途而不誘發過度毒性、刺激、過敏反應、等等。
用於本文中，術語「醫藥上可接受的 鹽」係論及衍生自醫藥上可接受的無機鹽、有機鹽、或鹼的鹽。適合的鹽之實例可包含氫氯酸、溴酸、硫酸、硝酸、過氯酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、磷酸、羥乙酸、乳酸、柳酸、琥珀酸、甲苯-對-磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、等等。衍生自適合的鹼的鹽之實例可包含鹼金屬（諸如鈉、鉀、等等）；鹼土金屬（諸如鎂；銨、等等）。
用於本文中，術語「溶劑合物」係論及根據本發明的胜肽或其鹽和溶劑分子間形成的錯合物。
編碼該用於腦部靶向的胜肽的經分離的多核苷酸包含與相對應序列具有75%或更高，特別係85%或更高，更特別係90%或更高，且甚至更特別係95%序列相同性的多核苷酸序列，係包含在本發明之範圍內。
根據本發明的重組載體典型可以載體或用於表現的載體的形式構築以用於選殖，且可使用原核或真核細胞作為宿主細胞來構築。
用於本文中，術語「載體」係論及能夠於適當的宿主細胞中表現目標蛋白質的重組載體，其係包含可操作地連接以使基因***物能夠被表現的調節性因子的基因構築體。
本發明之用於腦部靶向的長效共軛物可藉由執行該重組載體至宿主細胞中的轉形或轉染來獲得。
於本發明中，編碼該用於腦部靶向的胜肽的多核苷酸可係可操作地連接至啟動子。
用於轉形含有根據本發明的多核苷酸的重組載體方法不限於以上實施方式，且可使用所屬技術領域中習用的轉形或轉染方法而無限制。
本發明之轉形株可藉由將含有根據本發明的多核苷酸的重組載體導入至宿主細胞中來獲得。
欲於本發明中使用的適當宿主可不特別受限，只要其可表現本發明之多核苷酸。適當的宿主之實例可包含艾氏菌屬的細菌，諸如大腸桿菌；屬於芽孢桿菌屬的細菌，諸如枯草芽孢桿菌；屬於假單胞菌屬的細菌，諸如戀臭假單胞菌（Pseudomonas putida ）；酵母菌，諸如巴斯德畢赤酵母菌（Pichia pastoris ）、啤酒釀母菌、和粟酒裂殖酵母菌；昆蟲細胞，諸如秋夜盜蛾（Spodoptera frugiperda ）（Sf9）、和動物細胞，諸如CHO、COS、和BSC。
於以下，本發明將參照以下實施例更詳細描述。然而，此等實施例僅用於闡明目的，且本發明不欲限於此等實施例。實施例 1 ：其中免疫球蛋白 Fc 區和用於腦部靶向的胜肽係共軛的融合蛋白質之製備
對於含有用於腦部靶向的胜肽和生理活性多肽的長效共軛物（其中生物相容的物質（其包含免疫球蛋白恆定區和FcRn結合區）、用於腦部靶向的胜肽、和生理活性物質係藉由胜肽連接子連接）之製備，製備免疫球蛋白Fc區和用於腦部靶向的胜肽與之連接的融合蛋白質。
於此方面，選擇五種胜肽作為該用於腦部靶向的胜肽（表1）。 [表1]
作為能夠增加與其連接的生理活性多肽之半生期的生物相容的物質，選擇包含鉸鏈區的IgG4 Fc區，並將該包含鉸鏈區的IgG4 Fc區和該用於腦部靶向的胜肽於基因水平融合，並將該等融合產物之各者***至各自的表現載體中。
融合蛋白質之合成係藉由透過胜肽連接子或透過直接融合的方法連接該等IgG4 Fc區（其等包含鉸鏈區）和該等用於腦部靶向的胜肽，且特別地，係藉由透過胜肽鍵連接該等IgG4 Fc區（其等包含鉸鏈區）和該等用於腦部靶向的胜肽（由Bioneer Corporation，韓國合成）（表2）。如可於以下表2之序列中見到的，含有該IgG4 Fc區（其包含鉸鏈區）和用於腦部靶向的胜肽的融合蛋白質之製備係藉由使用連接子或透過直接融合的方法連接用於腦部靶向的胜肽之N端與IgG4 Fc區之C端。 [表2]
因為編碼該用於腦部靶向的胜肽（其係與所合成的免疫球蛋白Fc區融合）的基因於其兩端包含Nde I和Bam HI，將該基因***至pET22b 表現載體（其係以Nde I和Bam HI消化）中。該表現載體（編碼與所合成的免疫球蛋白Fc區融合的該用於腦部靶向的胜肽的基因***至其）係***至BL21 (DE3) 品系中且藉此該長效融合蛋白質（其中該免疫球蛋白Fc區和該用於腦部靶向的胜肽係連接）被表現。實施例 2 ：用於腦部靶向的胜肽之製備
對於種種用於腦部靶向的胜肽（其等與免疫球蛋白Fc區融合）之偵測，設計並合成包含用於腦部靶向的BTP1至BTP5的另外的胜肽（表3）。 [表3]
為確認該等用於腦部靶向的胜肽是否事實上可於腦部靶向起作用，執行試管內和活體內測試。實施例 3 ：用於腦部靶向的胜肽之胞吞轉送分析
執行胞吞轉送實驗以測定用於腦部靶向的胜肽之血腦屏障（BBB）通過之水平。將hCMEC/D3 細胞（其等係人類大腦內皮細胞）於微孔膜上以5 ´ 104 個細胞/cm2 的濃度培養10日。為確認BBB形成，使用FITC-聚葡萄醣（70 kDa）執行穿透測試並藉此確認緊密型連結之形成。接著，將25 mM FITC-BTP5、FITC-BTP11、FITC-BTP12、FITC-BTP16、和FITC-Exendin4、FITC-P-8（負對照組，P-8）置於hCMEC/D3 細胞上。於2小時和24小時後，測量FITC之螢光強度（圖1）。
結果，相較於該等exendin-4和負對照組（P-8）者，BTP之所有者皆顯示更高水平的通過。確認了該等用於腦部靶向的胜肽（諸如BTP5、BTP11、和BTP16）之通過水平隨時間增加。
此等結果意謂於本發明中確認的用於腦部靶向的胜肽可有效率地通過BBB。實施例 4 ：用於腦部靶向的胜肽之腦部分佈之確認
於小鼠執行腦部分佈測試以測定用於腦部靶向的胜肽之BBB通過之水平。小鼠係以2 mg/頭的濃度通過小鼠之總頸動脈（CCA）投予，且小鼠之腦部被分離並切成片段，且用於腦部靶向的胜肽之通過BBB的水平係在顯微鏡下使用FITC之螢光觀察（圖2）。
有鑒於注射特徵，通過CCA注射的用於腦部靶向的胜肽必須擴散至腦部區域之一側，且作為測試之結果，使用12.5´放大率之顯微鏡觀察至腦部之一側的擴散係可能的。此外，使用顯微鏡於200´放大率的放大率確認了於海馬體（其於長期記憶扮演重要角色）之細胞體存在的區域觀察到FITC之螢光。基於此等結果，確認了該等用於腦部靶向的胜肽通過BBB並進入腦組織。
此等結果意謂本發明之用於腦部靶向的胜肽不僅可用於試管內靶向且亦可用於活體內腦部靶向，意謂生理活性物質（其等係連接至該等用於腦部靶向的胜肽）亦可通過BBB並被有效地遞送至腦部。此外，此等結果意謂關於本發明之共軛物（其呈長效共軛物之形式），活體內持續期間係增加，且由於持續期間增加，至腦部的靶向可被更高效率地執行。實施例 5 ：用於含有免疫球蛋白 Fc 區和用於腦部靶向的胜肽的融合蛋白質的表現載體之製備
構築表現載體以表現另外的融合蛋白質。選擇含有鉸鏈區的IgG4 Fc區作為能夠增加所連接的生理活性多肽之半生期的生物相容的物質，並將含有鉸鏈區的IgG4 Fc區和該用於腦部靶向的胜肽於基因水平融合，並將所融合的產物***至各自的表現載體中。
融合蛋白質之合成係藉由透過胜肽連接子或透過直接融合的方法連接該等IgG4 Fc區（其等包含鉸鏈區）和該等用於腦部靶向的胜肽，且特別地，係藉由透過胜肽鍵連接該等IgG4 Fc區（其等包含鉸鏈區）和該等用於腦部靶向的胜肽（由Bioneer Corporation，韓國合成）（表4）。如可於以下表4之序列中見到的，含有該等IgG4 Fc區（其等具有以下表4之序列且包含鉸鏈區）和該等用於腦部靶向的胜肽的融合蛋白質係藉由使用連接子或透過直接融合的方法連接該等用於腦部靶向的胜肽之N端至IgG4 Fc區之C端來製備。 [表4]
因為編碼該用於腦部靶向的胜肽（其係與所合成的免疫球蛋白Fc區融合）的基因於其兩端包含Nde I和Bam HI，將該基因***至pET22b 表現載體（其係以Nde I和Bam HI消化）中。該表現載體（編碼與所合成的免疫球蛋白Fc區融合的該用於腦部靶向的胜肽的基因***至其）係***至BL21 (DE3) 品系中且藉此該長效融合蛋白質（其中該免疫球蛋白Fc區和該用於腦部靶向的胜肽係連接）被表現。實施例 6 ：用於其中免疫球蛋白 Fc 區和至少二個用於腦部靶向的胜肽係連接的融合蛋白質的表現載體之製備
構築表現載體以表現另外的融合蛋白質以增加受體結合親和力。選擇包含鉸鏈區的IgG4 Fc區作為能夠增加連接的生理活性多肽之半生期的生物相容的物質，並於基因水平藉由定位突變誘發PCR將連接子和用於腦部靶向的胜肽***至所構築的表現載體中。特別地，該等連接子和用於腦部靶向的胜肽係於免疫球蛋白Fc區之C端和該用於腦部靶向的胜肽之N端，或該用於腦部靶向的胜肽之C端和載體之Bam H I位置被包含的位置間***，使用SEQ ID NO引子（表5）。構築表現含有二或更多個重複的用於腦部靶向的胜肽的融合蛋白質（表6）的表現載體。此等融合蛋白質具有於表6中顯示的序列。例如，於Fc-BTP22共軛物中，連接子係***二單元的表2之BTP5胜肽中並藉此連接至Fc片段之CH3區域之C端方向。特別地，如可於以下表6中確認的，融合蛋白質係透過連接免疫球蛋白Fc區之C端和該等用於腦部靶向的胜肽之各者之N端、或透過直接融合的方法來製備。於此例子中，該等用於腦部靶向的胜肽係呈以縱排連接的形式，意謂該等用於腦部靶向的胜肽係呈其中用於腦部靶向的單一單元胜肽係透過連接子連接的形式。 [表5] [表6] 實施例 7 ：其中免疫球蛋白 Fc 區和用於腦部靶向的胜肽係融合的融合蛋白質之表現
融合蛋白質（其中免疫球蛋白Fc區和該等用於腦部靶向的胜肽係連接）之表現係在pET22b 載體（Novagen）之T7 啟動子之控制下執行。大腸桿菌BL21-DE3 （大腸桿菌B F-dcm ompT hsdS (rB- mB- ) gal l DE3 ）；Novagen）係使用所構築的表現載體之各者轉形。轉形係根據Novagen所建議的方法執行。收集單一菌落（其中各個重組表現載體被轉形）和並將其等接種至含有胺苄青黴素（50 μg/mL）的2´ Luria培養液（LB）培養基中並於37°C下培養15小時。將重組品系培養液和含有30%甘油的2´ LB培養基以1:1比率（v/v）混和，並將各1 mL的混合物等分至冷凍管中並儲存於-140°C下，並將所得物用作為用於生產重組融合蛋白質的細胞原種。
對於其中免疫球蛋白Fc區和用於腦部靶向的胜肽係融合的共軛物之表現，將各個小瓶的細胞原種溶解，接種至500 mL的2´ Luria培養液（LB）中，並於於37°C下在搖晃水浴中培養14至16小時。當600 nm的OD達到4.0或更高時，將培養終止並將所得的培養物用作為種子培養基。將種子培養基（1.6 L）接種至發酵培養基中並開始最初批次發酵。培養條件係37°C，提供空氣（2 L/分鐘；1 vvm），和攪拌速率（650 rpm），並使用20%氨水溶液將pH維持於6.70。關於發酵之進展，當培養基中的養分受限時，藉由添加饋料溶液進行饋料批式培養。基於OD值監視細菌生長且當OD值達到120或更高時，將IPTG導入至其達0.5 mM的最終濃度。於導入後將培養進一步進行約23至25小時。於培養完成時，藉由離心機收集重組品系並將其等儲存於-80°C下直到使用。實施例 8 ：其中免疫球蛋白 Fc 區和用於腦部靶向的胜肽係融合的融合蛋白質之回收和再摺疊
使細胞破裂與再摺疊以將實施例7中表現的融合蛋白質（其中免疫球蛋白Fc區之各者和該等用於腦部靶向的胜肽之各者係融合）轉換成可溶性形式。將對應於200 mL的各個細胞培養液的細胞沈澱小丸再懸浮於200 mL的溶胞緩衝溶液（50 mM Tris，pH 9.0、1 mM EDTA（pH 8.0）、0.2 M NaCl、和0.5% Triton X-100）中。於15,000 psi的壓力下使用微細流體均質機處理器M-110EH（型號M1475C，AC Technology Corp.）使細胞破裂。將破裂的細胞之溶胞產物於4°C下於12,200´g下離心30分鐘並將上清液丟棄並再懸浮在200 mL的溶胞緩衝溶液（0.5% Triton X-100和1 mM EDTA（pH 8.0））中。在於4°C下於12,200´g下離心30分鐘後將沈澱小丸再懸浮在200 mL的洗滌緩衝溶液（20 mM Tris（pH 8.0））中並接著以相同方式離心。將沈澱小丸再懸浮在100 mL的緩衝溶液（8 M胍-HCl和50 mM Tris（pH 8.0））中並於室溫下攪拌2小時。於2小時後，於23°C下於12,200´g下離心所得物30分鐘並收集上清液。接著，將2.5 mM二硫蘇糖醇添加至其並於37°C下攪拌混合物30分鐘。對於融合蛋白質（其中溶解的免疫球蛋白Fc區和該等用於腦部靶向的胜肽係融合）之再摺疊，使用蠕動泵以1 mL/min的流率將3.5 L的緩衝溶液（3 M尿素、1 mM半胱胺酸、0.160 M精胺酸、50 mM Tris（pH 9.2）、和20% 甘油）添加至其同時於4°C下攪拌36小時。該等融合蛋白質（其中溶解的免疫球蛋白Fc區和該等用於腦部靶向的胜肽係融合）內的免疫球蛋白Fc區係以二聚體的形式表現。實施例 9 ：透過親和力層析術的純化
於完成再摺疊後，將樣本於4°C下於12,200´g下離心30分鐘並收集上清液並以Satorius過濾器（0.22 μm）過濾，並使用50% HCl將樣本之pH調整至pH 7.5。使樣本與以10 mM Tris（pH 7.0）緩衝溶液平衡的蛋白質A-sepharose（GE healthcare）管柱結合，並接著溶析其中該等免疫球蛋白Fc區和該等用於腦部靶向的胜肽係融合的共軛物蛋白質。實施例 10 ：透過疏水性層析術的純化
於將0.6 M硫酸銨導入至經溶析的樣本中後，使經導入0.6 M硫酸銨的樣本與使用10 mM Tris（pH 7.0）緩衝溶液和0.6 M硫酸銨作為緩衝溶液平衡的苯基HP（GE healthcare）管柱結合，融合蛋白質（其中該等免疫球蛋白Fc區和該等用於腦部靶向的胜肽係融合）係以6管柱體積於0%至100%的線性濃度梯度使用10 mM Tris（pH 7.5）緩衝溶液溶析。實施例 11 ：其中免疫球蛋白 Fc 區和用於腦部靶向的胜肽係連接的融合蛋白質之腦部分佈之確認
於小鼠執行腦部分佈測試以測定融合蛋白質（其中該等免疫球蛋白Fc區和該等用於腦部靶向的胜肽係連接）之血腦屏障通過的水平。小鼠係通過靜脈內注射以10 mg/kg的濃度投予。於二個小時後，分離小鼠之腦部並測量融合蛋白質（其中該等免疫球蛋白Fc區和該等用於腦部靶向的胜肽係連接）之濃度且藉此確認融合蛋白質之血腦屏障通過的水平（圖3）。
結果，顯示所測量的免疫球蛋白Fc區和用於腦部靶向的胜肽之血腦屏障通過的水平相較於該等免疫球蛋白Fc區者係更高，且在腦部中相較於在血清中該等免疫球蛋白Fc區和該等用於腦部靶向的胜肽之濃度相較於該等免疫球蛋白Fc區者係更高。確認了於其中二或更多個相同種類的用於腦部靶向的胜肽係連接至免疫球蛋白Fc區的融合蛋白質之例子中，測量出濃度相較於當僅僅一個用於腦部靶向的胜肽係連接時係更高，且亦顯示具有更高的T/S比率。
此等結果建議了本發明之融合蛋白質，其中該等免疫球蛋白Fc區和該用於腦部靶向的胜肽可有效地通過BBB並遞送至腦部中。此外，此等結果意謂了呈長效共軛物之形式的本發明之融合蛋白質增加其等之活體內持續期間，且由於持續期間增加，至腦部中的靶向可更有效地執行。
於以下，執行進一步實驗以確認本發明之長效融合蛋白質（即使於其中生理活性物質係連接至其中免疫球蛋白Fc區和用於腦部靶向的胜肽係連接的長效融合蛋白質的例子中）是否亦可藉由通過BBB有效地遞送至腦部且藉此展現生理活性。實施例 12 ：包含 idursulfase 和 PEG 的共軛物之製備
製備含有idursulfase（大約72 kDa）的用於腦部靶向的長效共軛物作為含有典型大小的蛋白質作為生理活性物質的用於腦部靶向的長效共軛物之實例。作為該用於腦部靶向的長效共軛物之前驅物，首先如下製備經單PEG化的共軛物，其中聚乙二醇係連接以作為至idursulfase的連接子。
於將idursulfase（Shire，愛爾蘭）濃縮至適當的濃度後，對於10 K丁基-ALD(2) PEG（10 kDa聚乙二醇，其中於兩端的氫各自被修改成丁醛，NOF，日本）之PEG化，於4°C下於以下條件下執行反應約2小時：其中idursulfase對10 K丁基-ALD(2) PEG的莫耳比率被設為1:10且idursulfase濃度被設為10 mg/mL。特別地，反應係藉由將氰基硼氫化鈉（NaBH3 CN）（即還原劑）加至0.1 M磷酸鉀緩衝溶液（pH 6.0）執行。idursulfase-10 K PEG（其係經單PEG化的共軛物）係藉由將反應物使用磷酸鉀緩衝溶液（pH 6.0）和NaCl之濃度梯度施加至Source 15Q管柱（GE, USA）來純化。實施例 13 ： idursulfase-10 kDa PEG-Fc-BTP22 共軛物（其係用於腦部靶向的長效共軛物）之製備
接著，用於腦部靶向的長效共軛物係藉由將idursulfase-10 kDa PEG共軛物連接至含有用於腦部靶向的胜肽的Fc片段來製備。反應係藉由將idursulfase-10 K PEG對Fc-BTP22（即用於腦部靶向的融合蛋白質之代表性實例）的莫耳比率設為1:10並將idursulfase濃度設為10 mg/mL 25°C執行15小時。特別地，添加Dulbecco氏磷酸鹽緩衝溶液（DPBS）和10 mM NaBH3 CN（作為還原劑）作為反應物。
於反應完成後，將反應物使用磷酸鈉緩衝溶液（pH 6.0）和NaCl之濃度梯度施加至Source 15Q管柱（GE, USA），且接著，使用硫酸銨之濃度梯度和磷酸鈉（pH 6.0）施加至Source 15ISO管柱（GE, USA），並藉此純化idursulfase-10 K PEG-Fc-BTP22，其係所欲的用於腦部靶向的長效共軛物。idursulfase-10 K PEG-Fc-BTP22可與idursulfase-Fc-BTP22可互換地使用。實施例 14 ：包含 GIP 衍生物和 PEG 的共軛物之製備
製備具有葡萄糖依賴性促胰島素多肽（GIP）受體刺激活性的人工GIP衍生物（其由40個胺基酸殘基所組成）之用於腦部靶向的長效共軛物作為含有典型大小的胜肽作為生理活性物質的用於腦部靶向的長效共軛物之實例。作為該長效共軛物之前驅物，如下製備經單PEG化的共軛物（至其作為連接子的聚乙二醇係連接至該人工GIP衍生物）。
對於10 K MAL-PEG-ALD（10 kDa聚乙二醇，其中於一端的氫原子被修改成3-[N -（3-N -順丁烯二醯亞胺基-1-側氧基脯胺醯基）胺基]丙基基團且位於相反端的氫原子被修改成3-側氧基丙基基團（丙基醛基團），NOF，日本）至該GIP衍生物之C端半胱胺酸的PEG化，反應係於4°C下於以下條件下執行約1小時：其中GIP衍生物對PEG的莫耳比率被設成1:1.3且GIP衍生物濃度被設成3 mg/mL。特別地，反應係於溶劑（50 mM Tris-HCl（pH 7.5） + 45%異丙醇）中執行。GIP衍生物-10 K PEG（其係經單PEG化的共軛物）係使用SP HP（GE, USA）管柱純化，其利用檸檬酸鈉緩衝溶液（pH 3.0） + 45%乙醇和KCl之濃度梯度。實施例 15 ： GIP 衍生物 -10 K PEG-Fc-BTP22a 共軛物之製備
接著，用於腦部靶向的長效共軛物係藉由將GIP衍生物-10 K PEG共軛物連接至含有用於腦部靶向的胜肽的Fc片段來製備。反應係藉由將總反應濃度設成4.55 mg/mL、同時將GIP衍生物-10 k PEG（於實施例14中純化）對Fc-BTP22的莫耳比率設成1:2於4°C下執行16小時。特別地，將作為還原劑的20 mM NaBH3 CN添加至反應物。
於反應完成後，將反應物使用磷酸鈉緩衝溶液（pH 7.5）和硫酸銨之濃度梯度施加至Source 15ISO管柱（GE, USA），且接著，再次施加至相同的管柱，並藉此純化GIP衍生物-10 k PEG-Fc-BTP22（其係所欲的用於腦部靶向的長效共軛物）。GIP衍生物-10 K PEG-Fc-BTP22可與GIP衍生物-Fc BTP22可互換地使用。實施例 16 ：用於腦部靶向的長效共軛物之胞吞轉送之分析
執行胞吞轉送實驗以確認於實施例中獲得的用於腦部靶向的長效共軛物之通過血腦屏障的水平。將hCMEC/D3 細胞（其等係人類大腦內皮細胞）以5 ´ 104 個細胞/cm2 的濃度在微孔膜上培養10日。為確認BBB形成，使用FITC-聚葡萄醣（70 kDa）執行穿透測試並藉此確認緊密型連結之形成。接著，將25 mM長效共軛物置於hCMEC/D3 細胞上。於2小時和24小時後，使用ELISA套組測量蛋白質濃度。
結果，GIP衍生物-10 K PEG-Fc-BTP22相較於對照組顯示更高水平的血腦屏障通過，且確認了GIP衍生物-10 K PEG-Fc-BTP22之通過水平隨時間增加（圖4）。對於idursulfase-10 K PEG-Fc-BTP22觀察到類似的通過水平（數據未顯示）。
此等結果意謂於本發明中確認的腦部靶向長效共軛物可有效地通過BBB。實施例 17 ： idursulfase-10 kDa PEG-Fc-BTP22 共軛物之活性之測量
為檢查隨idursulfase-10 K PEG-Fc-BTP22共軛物之製備的idursulfase之比活性之任何改變之存在，執行針對酵素之比活性的試管內實驗。使4-甲基繖形酮基α-L-吡喃艾杜糖醛酸-2-硫酸鹽鈉鹽（4-Methylumbelliferyl α-L-idopyranosiduronic acid-2-sulfate sodium salt，4MU-α-idopyraA-2）（其已知為idursulfase之酵素受質）與idursulfase β和IDS-Fc-BTP22於37°C下反應4小時，且接著，與α-艾杜糖醛酸酶（其係二級反應酵素）於37°C下反應24小時。藉由測量對應物質之螢光來測量4-甲基繖形酮（4 MU）（最終產物）之酵素活性（圖5）。
結果，顯示自由idursulfase和idursulfase-10 K PEG-Fc-BTP22之酵素活性分別為23.4 ± 1.94 nmol/min/μg和10.8 ± 1.39 nmol/min/μg。特別地，酵素活性之值係基於比活性根據重量（μg）之轉換率計算。即，於自由idursulfase的例子中，值係藉由酵素反應之數目除以重量獲得，且於idursulfase-10 K PEG-Fc-BTP22的例子中，值係藉由酵素反應之數目除以該共軛物內的idursulfase部分具有的重量之轉換率獲得。結論性地，idursulfase-10 K PEG-Fc-BTP22之酵素活性係46.6%且相較idursulfase者稍微部分減低。然而，確認了即使當該酵素係以本發明之用於腦部靶向的長效共軛物之形式製備時，於相對應的共軛物中觀察到顯著的酵素活性。
由於該用於腦部靶向的胜肽連接至Fc區，以上製備的長效共軛物可通過血腦屏障，維持所連接的生理活性物質之生理活性，且因此可提供具有改善的持續期間和穩定性的長效共軛物，且藉此能夠提供用於開發使通過BBB成為可能的新穎治療劑的平台。
基於以上，本發明所屬技術領域中具有通常知識者會能夠瞭解到本發明可在無修改本發明之技術概念或基本特徵下以其他特別形式實施。於此方面，本文中揭露的例示性實施方式僅係用於闡明目的且不應被解釋成限制本發明之範圍。相反地，本發明意欲不僅涵蓋例示性實施方式且亦涵蓋種種更改、修改、同等物、和其他可被包含在如所附申請專利範圍界定的本發明之精神和範圍內的實施方式。
無
圖1顯示確認用於腦部靶向的胜肽通過血腦屏障的水平的胞吞轉送之實驗結果。
圖2顯示確認用於腦部靶向的胜肽通過血腦屏障的水平的於小鼠中執行的腦部分佈實驗之結果。
圖3顯示確認用於腦部靶向的胜肽（免疫球蛋白Fc區與之連接）通過血腦屏障的水平和單獨免疫球蛋白Fc區通過血腦屏障的水平的結果。
圖4顯示確認用於腦部靶向的長效共軛物（其含有GIP衍生物（即生理活性物質））通過血腦屏障的水平的胞吞轉送之實驗結果。
圖5顯示確認含有idursulfase（即生理活性物質）的用於腦部靶向的長效共軛物關於生理活性之維持的能力的結果。
<110> 韓美藥品股份有限公司<120> 用於腦部靶向的長效蛋白質共軛物<130> OPA17345-PCT<150> KR 10-2016-0173863<151> 2016-12-19<150> KR 10-2017-0126537<151> 2017-09-28<160> 81<170> KoPatentIn 3.0<210> 1<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<220><223> BTP1<400> 1catgcaattt atccgcgtca t 21<210> 2<211> 7<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP1<400> 2His Ala Ile Tyr Pro Arg His 1 5 <210> 3<211> 36<212> DNA<213> 人工序列<220><223> BTP2<400> 3acccatcgtc cgccgatgtg gagcccggtt tggccg 36<210> 4<211> 12<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP2<400> 4Thr His Arg Pro Pro Met Trp Ser Pro Val Trp Pro 1 5 10 <210> 5<211> 57<212> DNA<213> 人工序列<220><223> BTP3<400> 5accttttttt atggtggcag ccgtggtaaa cgcaataact ttaaaaccga agaatat 57<210> 6<211> 19<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP3<400> 6Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr 1 5 10 15 Glu Glu Tyr <210> 7<211> 114<212> DNA<213> 人工序列<220><223> BTP4<400> 7agcgttattg atgcactgca gtataaactg gaaggtacca cacgtctgac ccgcaaacgt 60ggtctgaaac tggccaccgc actgtcactg agcaataaat ttgttgaagg tagc 114<210> 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Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110<210> 16<211> 107<212> PRT<213> 人工序列<220><223> IgG4之CH3<400> 16Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 100 105 <210> 17<211> 45<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 連接子15a.a.<400> 17ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcg 45<210> 18<211> 15<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 連接子15a.a.<400> 18Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15<210> 19<211> 90<212> DNA<213> 人工序列<220><223> BTP6<400> 19taccaacaga tcctcaccag tatgccttcc agaaacgtga tccaaatatc caacgacctg 60gagaacctcc gggatcttct tcacgtgctg 90<210> 20<211> 30<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP6<400> 20Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile 1 5 10 15 Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu 20 25 30<210> 21<211> 87<212> DNA<213> 人工序列<220><223> BTP7<400> 21tacaccattt ggatgcccga gaatccgaga cctgggacac cttgtgacat ttttaccaat 60agtagaggga agagagcatc caatggg 87<210> 22<211> 29<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP7<400> 22Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Gly Thr Pro Cys Asp 1 5 10 15 Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Asn Gly 20 25 <210> 23<211> 84<212> DNA<213> 人工序列<220><223> BTP8<400> 23aagtcagtca gaacttggaa tgagatcata ccttcaaaag ggtgtttaag agttgggggg 60aggtgtcatc ctcatgtgaa cggg 84<210> 24<211> 28<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP8<400> 24Lys Ser Val Arg Thr Trp Asn Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu 1 5 10 15 Arg Val Gly Gly Arg Cys His Pro His Val Asn Gly 20 25 <210> 25<211> 36<212> DNA<213> 人工序列<220><223> BTP9<400> 25catctgaata ttctgagcac cctgtggaaa tatcgt 36<210> 26<211> 12<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP9<400> 26His Leu Asn Ile Leu Ser Thr Leu Trp Lys Tyr Arg 1 5 10 <210> 27<211> 90<212> DNA<213> 人工序列<220><223> BTP10<400> 27ctgcgcaagc tgcgtaagcg gctcctccgc gatgccgatg acctgttacg taaacttcgc 60aaacgtctgc ttcgtgacgc agacgatctg 90<210> 28<211> 30<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP10<400> 28Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Leu 1 5 10 15 Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu 20 25 30<210> 29<211> 60<212> DNA<213> 人工序列<220><223> BTP11<400> 29accgaggagc tgcgggtgcg cctcgcctcc cacctgcgca agctgcgtaa gcggctcctc 60 60<210> 30<211> 20<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP11<400> 30Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg 1 5 10 15 Lys Arg Leu Leu 20<210> 31<211> 102<212> DNA<213> 人工序列<220><223> BTP12<400> 31ctgcgggtgc gcctcgcctc ccacctgcgc aagctgcgta agcggctcct cttacgtgtt 60cgtctggcaa gccatcttcg taaacttcgc aaacgtctgc tt 102<210> 32<211> 34<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP12<400> 32Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu 1 5 10 15 Leu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg 20 25 30 Leu Leu <210> 33<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220><223> BTP13<400> 33ggtaaaggcc cgaaatggat gcgttga 27<210> 34<211> 8<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP13<400> 34Gly Lys Gly Pro Lys Trp Met Arg 1 5 <210> 35<211> 30<212> DNA<213> 人工序列<220><223> BTP14<400> 35ggtcataaag caaaaggccc gcgtaaatga 30<210> 36<211> 9<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP14<400> 36Gly His Lys Ala Lys Gly Pro Arg Lys 1 5 <210> 37<211> 30<212> DNA<213> 人工序列<220><223> BTP15<400> 37gttattgcaa aaattaagaa accgaaatga 30<210> 38<211> 9<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP15<400> 38Val Ile Ala Lys Ile Lys Lys Pro Lys 1 5 <210> 39<211> 30<212> DNA<213> 人工序列<220><223> BTP16<400> 39aagtggaaaa ccccgaaagt tcgtgtgtga 30<210> 40<211> 9<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP16<400> 40Lys Trp Lys Thr Pro Lys Val Arg Val 1 5 <210> 41<211> 19<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP<400> 41Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr 1 5 10 15 Glu Glu Tyr <210> 42<211> 38<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP<400> 42Ser Val Ile Asp Ala Leu Gln Tyr Lys Leu Glu Gly Thr Thr Arg Leu 1 5 10 15 Thr Arg Lys Arg Gly Leu Lys Leu Ala Thr Ala Leu Ser Leu Ser Asn 20 25 30 Lys Phe Val Glu Gly Ser 35 <210> 43<211> 18<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP<400> 43Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg 1 5 10 15 Leu Leu <210> 44<211> 8<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP<220><221> 雜項特徵<222> (1)<223> Xaa1經乙醯化<400> 44Cys Met Pro Arg Leu Arg Gly Cys 1 5 <210> 45<211> 12<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP<400> 45Thr His Arg Pro Pro Met Trp Ser Pro Val Trp Pro 1 5 10 <210> 46<211> 12<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP<400> 46Pro Trp Val Pro Ser Trp Met Pro Pro Arg His Thr 1 5 10 <210> 47<211> 10<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP<400> 47Cys Cys Arg Thr Ile Gly Pro Ser Val Cys 1 5 10<210> 48<211> 30<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP<400> 48Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile 1 5 10 15 Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu 20 25 30<210> 49<211> 29<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP<400> 49Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Gly Thr Pro Cys Asp 1 5 10 15 Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Asn Gly 20 25 <210> 50<211> 16<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP<400> 50Gly Arg Glu Ile Arg Thr Gly Arg Ala Glu Arg Trp Ser Glu Lys Phe 1 5 10 15 <210> 51<211> 18<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP<400> 51Cys Asn Cys Lys Ala Pro Glu Thr Ala Leu Cys Ala Arg Arg Cys Gln 1 5 10 15 Gln His <210> 52<211> 9<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP<220><221> 雜項特徵<222> (1)<223> Xaa係二胺基丙酸<400> 52Xaa Lys Ala Pro Glu Thr Ala Leu Asp 1 5 <210> 53<211> 13<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP<400> 53His Leu Asn Ile Leu Ser Thr Leu Trp Lys Tyr Arg Cys 1 5 10 <210> 54<211> 7<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP<220><221> 雜項特徵<222> (7)<223> O-β-Glc接附至其<400> 54Gly Phe Thr Gly Phe Leu Ser 1 5 <210> 55<211> 12<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP<400> 55Thr Gly Asn Tyr Lys Ala Leu His Pro His Asn Gly 1 5 10 <210> 56<211> 11<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP<400> 56Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 57<211> 18<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP<400> 57Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr 1 5 10 15 Gly Arg <210> 58<211> 8<212> PRT<213> 人工序列<220><223> BTP<400> 58Phe Pro Phe Pro Phe Pro Phe Pro 1 5 <210> 59<211> 5<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 胜肽連接子模體<400> 59Gly Gly Gly Gly Ser 1 5<210> 60<211> 4<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 胜肽連接子模體<400> 60Gly Gly Gly Ser 1 <210> 61<211> 4<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 胜肽連接子模體<400> 61Gly Gly Ser Gly 1 <210> 62<211> 124<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Fc-BTP22-F<400> 62tctccctgtc tctgggtaaa ggtggaggcg gttcacttcg caagttacgt aaacgcttac 60tgttacgtaa acttcggaag cgcttactgg gcggaggtgg ctctctgcgt aaactgcgca 120aacg 124<210> 63<211> 124<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Fc-BTP22-R<400> 63cgtttgcgca gtttacgcag agagccacct ccgcccagta agcgcttccg aagtttacgt 60aacagtaagc gtttacgtaa cttgcgaagt gaaccgcctc cacctttacc cagagacagg 120gaga 124<210> 64<211> 112<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Fc-BTP23-F<400> 64aactgcgcaa acgtctgtta ggcggtggcg gatcgctgcg taaactgcgc aaacgtctgt 60tacttcggaa gctgagaaaa cgcttacttt aaggatccga attcgagctc cg 112<210> 65<211> 112<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Fc-BTP23-R<400> 65cggagctcga attcggatcc ttaaagtaag cgttttctca gcttccgaag taacagacgt 60ttgcgcagtt tacgcagcga tccgccaccg cctaacagac gtttgcgcag tt 112<210> 66<211> 130<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Fc-BTP24-F<400> 66tctccctgtc tctgggtaaa ggtggaggcg gttcaacaga agagttacgt gttcgtctgg 60caagccattt acgtaaactt cgcaaacgtc tgttaggcgg aggtggctct accgaggagc 120tgcgggtgcg 130<210> 67<211> 130<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Fc-BTP24-R<400> 67cgcacccgca gctcctcggt agagccacct ccgcctaaca gacgtttgcg aagtttacgt 60aaatggcttg ccagacgaac acgtaactct tctgttgaac cgcctccacc tttacccaga 120gacagggaga 130<210> 68<211> 118<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Fc-BTP25-F<400> 68agctgcgtaa gcggctcctc ggcggtggcg gatcgacgga agaacttcgc gtccggttag 60cgtcacatct tcggaaatta cggaagcgct tgctgtgagg atccgaattc gagctccg 118<210> 69<211> 118<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Fc-BTP25-R<400> 69cggagctcga attcggatcc tcacagcaag cgcttccgta atttccgaag atgtgacgct 60aaccggacgc gaagttcttc cgtcgatccg ccaccgccga ggagccgctt acgcagct 118<210> 70<211> 97<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Fc-BTP26-F<400> 70tctccctgtc tctgggtaaa ggtggaggcg gttcaaaatg gaagacacca aaggtgcgcg 60ttggcggagg tggctctaag tggaaaaccc cgaaagt 97<210> 71<211> 97<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Fc-BTP26-R<400> 71actttcgggg ttttccactt agagccacct ccgccaacgc gcacctttgg tgtcttccat 60tttgaaccgc ctccaccttt acccagagac agggaga 97<210> 72<211> 85<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Fc-BTP27-F<400> 72aaaccccgaa agttcgtgtg ggcggtggcg gatcgaaatg gaaaactcct aaagtacggg 60tctgaggatc cgaattcgag ctccg 85<210> 73<211> 85<212> DNA<213> 人工序列<220><223> Fc-BTP27-R<400> 73cggagctcga attcggatcc tcagacccgt actttaggag ttttccattt cgatccgcca 60ccgcccacac gaactttcgg ggttt 85<210> 74<211> 15<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 連接子<400> 74ggtggaggcg gttca 15<210> 75<211> 54<212> DNA<213> 人工序列<220><223> BTP5<400> 75cttcgcaagt tacgtaaacg cttactgtta cgtaaacttc ggaagcgctt actg 54<210> 76<211> 15<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 連接子<400> 76ggcggaggtg gctct 15<210> 77<211> 5<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 連接子<400> 77Gly Gly Gly Gly Ser 1 5<210> 78<211> 15<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 連接子<400> 78ggcggtggcg gatcg 15<210> 79<211> 57<212> DNA<213> 人工序列<220><223> BTP5<400> 79ctgcgtaaac tgcgcaaacg tctgttactt cggaagctga gaaaacgctt actttaa 57<210> 80<211> 60<212> DNA<213> 人工序列<220><223> BTP11<400> 80acagaagagt tacgtgttcg tctggcaagc catttacgta aacttcgcaa acgtctgtta 60 60<210> 81<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220><223> BTP16<400> 81aagtggaaaa ccccgaaagt tcgtgtg 27

Claims (43)

  1. 一種式1之用於腦部靶向的長效共軛物， [式1] X-L1 -F-L2 -Y 其中： X係生理活性物質； Y係用於腦部靶向的胜肽； L1 和L2 係胜肽連接子或非胜肽連接子，其中當L1 和L2 係胜肽連接子時，該等胜肽連接子包含0至1,000個胺基酸；且 F係包含FcRn結合區的免疫球蛋白恆定區。
  2. 根據申請專利範圍第1項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中該長效共軛物通過血腦屏障並藉此將生理活性物質遞送至腦組織中。
  3. 根據申請專利範圍第1項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中該用於腦部靶向的胜肽包含胜肽、蛋白質、或抗體，且其中該胜肽、蛋白質、或抗體之各者包含允許通過血腦屏障的胺基酸序列。
  4. 根據申請專利範圍第3項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中該用於腦部靶向的胜肽透過藉由被動運輸的途徑或藉由受體介導性運輸的途徑通過血腦屏障。
  5. 根據申請專利範圍第1項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中該生理活性物質係選自由以下者所組成之群組：毒素；或類升糖素胜肽-1（GLP-1）受體促效劑；升糖素受體促效劑；胃抑制性多肽（GIP）受體促效劑；纖維母細胞生長因子（FGF）受體促效劑；膽囊收縮素受體促效劑；胃泌素受體促效劑；黑皮質素受體促效劑；人類生長激素；生長激素釋放激素；生長激素釋放胜肽；干擾素；干擾素受體；群落刺激因子；介白素；介白素受體；酵素；介白素結合蛋白；細胞介素結合蛋白；巨噬細胞活化因子；巨噬細胞胜肽；B細胞因子；T細胞因子；蛋白質A；過敏抑制因子；壞死醣蛋白；免疫毒素；淋巴毒素；腫瘤壞死因子；腫瘤抑制子；轉形生長因子；α-1抗胰蛋白酶；白蛋白；α-乳白蛋白；缺脂脂蛋白-E；紅血球生成素；高醣苷化紅血球生成素；血管生成素（angiopoietin）；血紅素；凝血酶；凝血酶受體活化胜肽；凝血酶調節素（thrombomodulin）；凝血因子VII；凝血因子VIIa；凝血因子VIII；凝血因子IX；凝血因子XIII；血纖維蛋白溶酶原活化子；血纖維蛋白結合胜肽；尿激酶；鏈球菌激酶；水蛭素；蛋白質C；C反應性蛋白質；腎素抑制子；膠原蛋白酶抑制子；超氧化物歧化酶；瘦素；血小板衍生性生長因子；上皮生長因子；表皮生長因子；血管抑制素；血管收縮肽；骨成形性生長因子；骨成形性蛋白質；抑鈣素；胰島素；心房利尿鈉肽（atriopeptin）；軟骨誘發因子；依降鈣素（elcatonin）；結締組織活化因子；組織因子途徑抑制子；濾泡刺激激素；黃體成長激素；黃體成長激素釋放激素；神經生長因子；軸突生成（axogenesis）因子-1；腦利尿鈉肽；神經膠衍生性神經營養因子；netrin；嗜中性球抑制因子；神經營養因子；neurturin；副甲狀腺素；鬆弛素；分泌素；體介素；類胰島素生長因子；腎上腺皮質激素；升糖素；膽囊收縮素；胰多肽；胃泌素釋放胜肽；促皮質素釋放因子；甲狀腺刺激激素；autotaxin；乳鐵蛋白；肌肉生長抑制素（myostatin）；活性依賴性神經保護性蛋白質（ADNP）、β-分泌酶（secretase）1（BACE1）、類澱粉蛋白前驅蛋白（APP）、神經細胞黏著分子（NCAM）、類澱粉蛋白β、tau、糖化終產物受體（receptor for advanced glycation endproduct，RAGE）、α-突觸核蛋白（synuclein）、或其等之促效劑或拮抗劑；受體、受體促效劑；細胞表面抗原；單株抗體；多株抗體；抗體片段；病毒衍生性疫苗抗原；活化至少一種受體促效劑的雜合多肽或嵌合多肽；和其等之類似物。
  6. 根據申請專利範圍第5項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中： 該毒素係選自由以下者所組成之群組：美登素（maytansine）或其衍生物、auristatin或其衍生物、duocarmycin或其衍生物、和吡咯并苯并二氮呯（PBD）或其衍生物； 該類升糖素胜肽-1（GLP-1）受體促效劑係選自由以下者所組成之群組：天然exendin-3或天然exendin-4、和其等之類似物； 該FGF受體促效劑係選自由以下者所組成之群組：FGF1或其類似物、FGF19或其類似物、FGF21或其類似物、和FGF23或其類似物； 該干擾素係選自由以下者所組成之群組：干擾素-α、干擾素-β、和干擾素-γ； 該干擾素受體係選自由以下者所組成之群組：干擾素-α受體、干擾素-β受體、干擾素-γ受體、和可溶性第I型干擾素受體； 該介白素係選自由以下者所組成之群組：介白素-1、介白素-2、介白素-3、介白素-4、介白素-5、介白素-6、介白素-7、介白素-8、介白素-9、介白素-10、介白素-11、介白素-12、介白素-13、介白素-14、介白素-15、介白素-16、介白素-17、介白素-18、介白素-19、介白素-20、介白素-21、介白素-22、介白素-23、介白素-24、介白素-25、介白素-26、介白素-27、介白素-28、介白素-29、和介白素-30； 該介白素受體係介白素-1受體或介白素-4受體； 該酵素係選自由以下者所組成之群組：β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、艾杜糖醛酸酶（iduronidase）、艾杜糖醛酸（iduronate）-2-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性α-葡萄糖苷酶、酸性神經醯胺酶、酸性神經磷脂酶、半乳糖腦苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、芳基硫酸酯酶B、β-己醣胺酶A、β-己醣胺酶B、肝素N -硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、N -乙醯半乳胺糖-6硫酸酯酶、溶酶體酸性脂酶、α-N -乙醯基-葡萄胺糖苷酶、葡萄糖腦苷脂酶、丁醯膽鹼酯酶、幾丁質酶、麩胺酸去羧酶、伊米苷酶（imiglucerase）、脂酶、尿酸酶、血小板活化因子乙醯基水解酶、中性內肽酶、髓過氧化酶、α-半乳糖苷酶-A、阿加半乳糖苷酶（agalsidase）α、阿加半乳糖苷酶β、α-L-艾杜糖醛酸酶、丁醯膽鹼酯酶、幾丁質酶、麩胺酸去羧酶、和伊米苷酶； 該介白素結合蛋白係IL-18bp； 該細胞介素結合蛋白係TNF結合蛋白； 該神經生長因子係選自由以下者所組成之群組：神經生長因子、睫狀神經營養因子、軸突生成因子-1、腦利尿鈉肽、神經膠衍生性神經營養因子、netrin、嗜中性球抑制因子、神經營養因子、和neurturin； 該肌肉生長抑制素受體係選自由以下者所組成之群組：TNFR (P75)、TNFR (P55)、IL-1受體、VEGF受體、和B細胞活化性因子受體； 該肌肉生長抑制素受體拮抗劑係IL1-Ra； 該細胞表面抗原係選自由以下者所組成之群組：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD11a、CD11b、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD45、和CD69；且 該等抗體片段係選自由以下者所組成之群組：scFv、Fab、Fab′、F(ab′)2 、和Fd。
  7. 根據申請專利範圍第6項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中該GLP-1受體促效劑係選自由以下者所組成之群組：天然exendin-4；exendin-4衍生物，其中exendin-4之N端胺基團被缺失；exendin-4衍生物，其中exendin-4之N端胺基團係以羥基基團取代；exendin-4衍生物，其中exendin-4之N端胺基團係以二甲基基團修飾；exendin-4衍生物，其中exendin-4之N端胺基團係以羧基基團取代；exendin-4衍生物，其中exendin-4之第1個胺基酸（組胺酸）之α-碳被缺失；exendin-4衍生物，其中exendin-4之第12個胺基酸（離胺酸）係以絲胺酸取代、和exendin-4衍生物，其中exendin-4之第12個胺基酸（離胺酸）係以精胺酸取代。
  8. 根據申請專利範圍第4項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中於該藉由受體介導性運輸的途徑中，該用於腦部靶向的長效共軛物藉由透過選自由以下者所組成之群組之任一者的受體介導性運輸途徑通過血腦屏障：胰島素受體、運鐵蛋白受體、低密度脂蛋白受體、低密度脂蛋白受體相關性蛋白質、瘦素受體、菸鹼乙醯膽鹼受體、麩胱甘肽運輸蛋白、鈣活化性鉀通道、和糖化終產物受體（RAGE）、和該等受體之配體和與該等受體或配體結合的抗體。
  9. 根據申請專利範圍第1項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中L1 係連接至F之N端區域，且L2 係連接至F之C端區域。
  10. 根據申請專利範圍第1項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中式1之F-L2 -Y係由以下式2表示： [式2]其中： Fa 和Fb 各自係單股多肽鏈，其包含免疫球蛋白Fc區，該Fc區包含鉸鏈區、CH2域、和CH3域，其中Fa 和Fb 係藉由該鉸鏈區中的雙硫鍵連接且藉此包含Fc片段，且Fa 和L1 係彼此共價鍵結； BTPa1 、……、BTPan 之各者（彼此係相同或不同）係用於腦部靶向的胜肽； BTPb1 、……、BTPbn′ 之各者（彼此係相同或不同）係用於腦部靶向的胜肽； L2a1 、……、L2an 之各者（彼此係相同或不同）係胜肽連接子；且 L2b1 、……、L2bn′ 之各者（彼此係相同或不同）係胜肽連接子； 其中n和n′各自獨立地係整數。
  11. 根據申請專利範圍第10項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中L1 係連接至Fa 之N端，且L2a1 和L2b1 係各自分別連接至Fa 和Fb 之C端。
  12. 根據申請專利範圍第11項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中n = n′，且各自符合L2a1 = L2b1 、……、L2an = L2bn′ 且BTPa1 = BTPb1 、……、BTPan = BTPbn′ 之條件。
  13. 根據申請專利範圍第10項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中L1 係連接至X之N端胺基團、位於離胺酸殘基之側鏈的胺基團、或位於半胱胺酸殘基之側鏈的-SH基團（巰基基團）。
  14. 根據申請專利範圍第10項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中X（其係生理活性物質）係由2至1,000個胺基酸所組成的多肽。
  15. 根據申請專利範圍第10項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中n和n′係1至5的整數。
  16. 根據申請專利範圍第10項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中L1 係具有0.5 kDa至100 kDa的大小的非胜肽連接子。
  17. 根據申請專利範圍第16項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中該非胜肽連接子係聚乙二醇。
  18. 根據申請專利範圍第1項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中L2 （其係胜肽連接子）係(GS)m 、(GGS)m 、(GGGS)m 、或(GGGGS)m ，其中m係1至10。
  19. 根據申請專利範圍第1項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中L1 和L2 之一係胜肽連接子且另一者係非胜肽連接子。
  20. 根據申請專利範圍第1項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中當L1 係非胜肽連接子且L2 係胜肽連接子時，該胜肽連接子包含0至1,000個胺基酸。
  21. 根據申請專利範圍第1或10項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中當L1 和L2 之任一者或二者皆係非胜肽連接子時，該非胜肽連接子係選自由以下者所組成之群組：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化（polyoxyethylated）多元醇、聚乙烯醇、多醣、聚葡萄醣、聚乙烯基乙基醚、生物可降解聚合物、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸、脂肪酸、高分子量聚合物、低分子量化合物、核苷酸、和其等之組合。
  22. 根據申請專利範圍第1項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中當L1 和L2 之任一者或二者皆係胜肽連接子時，X和F、或F和Y係藉由L1 和L2 透過共價化學鍵、非共價化學鍵、或其等之組合彼此連接；且L1 和L2 各自包含0至1,000個胺基酸。
  23. 根據申請專利範圍第1項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中當L1 和L2 之任一者或二者皆係胜肽連接子時，L1 和L2 各自包含0至1,000個胺基酸，其中： (i) X和F、或F和Y係藉由胜肽鍵連接；或 (ii) X和F、和F和Y係藉由胜肽鍵連接。
  24. 根據申請專利範圍第1項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中當L1 和L2 之任一者係胜肽連接子且該二者之另一者係非胜肽連接子時，該胜肽連接子係包含0至1,000個胺基酸的連接子且該非胜肽連接子係聚乙二醇。
  25. 根據申請專利範圍第1項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中F包含免疫球蛋白Fc區。
  26. 根據申請專利範圍第25項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中該免疫球蛋白Fc區包含一至四個選自由CH1、CH2、CH3、和CH4域所組成之群組的域。
  27. 根據申請專利範圍第25項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中該免疫球蛋白Fc區進一步包含鉸鏈區。
  28. 根據申請專利範圍第10或25項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中該免疫球蛋白Fc區係IgG之Fc區。
  29. 根據申請專利範圍第28項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中該免疫球蛋白Fc區係IgG4 Fc區。
  30. 根據申請專利範圍第29項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中該免疫球蛋白Fc區係無醣苷化的（aglycosylated）人類序列之IgG4 Fc區。
  31. 根據申請專利範圍第1項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中X之N端和F之N端係藉由L1 連接且Y之N端和F之C端係藉由L2 連接。
  32. 根據申請專利範圍第1項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中： L1 之一端係連接至X之離胺酸殘基或半胱胺酸殘基且L1 之另一端係連接至F之N端；且 Y之N端和F之C端係藉由L2 連接。
  33. 一種用於製備根據申請專利範圍第1項的用於腦部靶向的長效共軛物的方法，其包含： (i)製備： (a) X-L1 -F，其中X（其係生理活性物質）、L1 （其係胜肽或非胜肽連接子）、和F（其包含免疫球蛋白Fc區）被連接；和 (b) L2 -Y，其中Y（其係用於腦部靶向的胜肽）和L2 （其係胜肽或非胜肽連接子）被連接；和 (ii)連接(a) X-L1 -F和(b) L2 -Y。
  34. 一種用於製備根據申請專利範圍第1項的用於腦部靶向的長效共軛物的方法，其包含： (i)製備： (a) X-L1 ，其中X（其係生理活性物質）和L1 （其係胜肽或非胜肽連接子）被連接；和 (b) F-L2 -Y，其中Y（其係用於腦部靶向的胜肽）、L2 （其係胜肽或非胜肽連接子）、和F（其包含免疫球蛋白Fc區）被連接；和 (ii)連接(a) X-L1 和(b) F-L2 -Y。
  35. 一種用於製備根據申請專利範圍第1項的用於腦部靶向的長效共軛物的方法，其包含： (i)製備F-L2 -Y，其中Y（其係用於腦部靶向的胜肽）、L2 （其係胜肽或非胜肽連接子）、和F（其包含免疫球蛋白Fc區）被連接；和 (ii)藉由L1 （其係胜肽或非胜肽連接子）連接F-L2 -Y和X。
  36. 根據申請專利範圍第33至35項中之任一項的方法，其中(a)之L1 係胜肽連接子，且(b)之L2 係非胜肽連接子。
  37. 根據申請專利範圍第33至35項中之任一項的方法，其中(a)之L1 係非胜肽連接子，且(b)之L2 係胜肽連接子。
  38. 根據申請專利範圍第1項的用於腦部靶向的長效共軛物，其中L1 係於兩端皆具有官能基的非胜肽連接子，其中該於兩端的官能基各自係胺反應性基團或巰基反應性基團，且該等於兩端的官能基彼此係相同種類或彼此係不同種類。
  39. 根據申請專利範圍第33至35項中之任一項的方法，其中非胜肽連接子和X和Y係藉由其等之官能基之各者連接，其中該非胜肽連接子之官能基係選自由醛基團、順丁烯二醯亞胺基團、和琥珀醯亞胺衍生物所組成之群組。
  40. 一種用於腦部靶向的胜肽，其係由選自SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、和40之胺基酸序列的任一胺基酸序列所組成。
  41. 一種經分離的多核苷酸，其編碼根據申請專利範圍第40項的用於腦部靶向的胜肽。
  42. 一種重組表現載體，其包含根據申請專利範圍第41項的多核苷酸。
  43. 一種轉形株，其包含根據申請專利範圍第42項的重組表現載體。
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