TW201819631A - Ｈｓｐａ５基因的啓動子 - Google Patents

Ｈｓｐａ５基因的啓動子 Download PDF

Info

Publication number
TW201819631A
TW201819631A TW106134006A TW106134006A TW201819631A TW 201819631 A TW201819631 A TW 201819631A TW 106134006 A TW106134006 A TW 106134006A TW 106134006 A TW106134006 A TW 106134006A TW 201819631 A TW201819631 A TW 201819631A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
promoter
hspa5
polynucleotide
nucleotide sequence
gene
Prior art date
Application number
TW106134006A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI812596B (zh
Inventor
增田兼治
野中浩一
種村裕幸
Original Assignee
日商第一三共股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日商第一三共股份有限公司 filed Critical 日商第一三共股份有限公司
Publication of TW201819631A publication Critical patent/TW201819631A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI812596B publication Critical patent/TWI812596B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8518—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic expressing industrially exogenous proteins, e.g. for pharmaceutical use, human insulin, blood factors, immunoglobulins, pseudoparticles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
    • C12Y306/04—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) acting on acid anhydrides; involved in cellular and subcellular movement (3.6.4)
    • C12Y306/0401—Non-chaperonin molecular chaperone ATPase (3.6.4.10)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明之課題係提供一種於來自哺乳動物的培養細胞等之宿主細胞中，使當作蛋白質性醫藥品之外來蛋白質的產生亢進之手段。 本發明之解決手段係提供具有新穎之Hspa5基因的啟動子之轉形細胞、使用該轉形宿主細胞使外來蛋白質高分泌生產之方法。

Description

Hspa5基因的啟動子
本發明關於一種使用了哺乳動物細胞之外來蛋白質之製造方法，該哺乳動物細胞係利用具有Hspa5基因的啟動子之外來基因表現載體，將哺乳動物宿主細胞轉形而構築者。
隨著基因重組技術的發展，治療用蛋白質或抗體醫藥之類的蛋白質性醫藥品正在急速地擴大其市場。其中又以抗體醫藥係對人體投予也不會引起有害的免疫反應，且因其高度特異性而正興盛地被開發中。
就使代表抗體醫藥之蛋白質性醫藥生產的宿主而言，可舉出微生物或酵母、昆蟲、動植物細胞、基因轉殖動植物等。對於蛋白質性醫藥的生理活性或抗原性而言，摺疊或糖鏈修飾之類的轉譯後修飾是有必要的，所以無法進行複雜的轉譯後修飾的微生物、或糖鏈結構大不相同的植物，並不適合作為宿主。具有與人類類似的糖鏈結構，且能夠轉譯後修飾，並進一步考慮安全性之面，CHO細胞(Chinese Hamster Ovary：中國倉鼠卵巢)等之哺乳動物培養細胞係成為現在的主流。
以哺乳動物培養細胞為宿主的情形，與微生物等比較，而有低增殖速度、低生產性、昂貴的成本等的問題(非專利文獻1)。又，為了要在臨床利用蛋白質性醫藥品，係必須要大量的投予，因而世界性地來說，其生產能力之不足亦成為問題。由於在以哺乳類培養細胞表現系統來製造蛋白質性醫藥品之情形，相較於合成低分子醫藥品而製造成本高，故藉由各製造步驟的改良來謀求製造成本的減少，但哺乳類培養細胞表現系統中之生產量的提升亦為製造成本減少之有力的方法(非專利文獻2、3)。於是，為了使哺乳動物培養細胞中之外來基因的生產性提升，迄今已試誤研究了啟動子或增強子、藥物篩選標記、基因增幅、培養工程學的手法等多種的方法。當將CHO細胞作為宿主細胞使用之情形，對於外來基因的表現，亦即對於蛋白質性醫藥品的生產而言，通常使用來自病毒的人巨細胞病毒主要立即早期啟動子(Human cytomegalovirus major immediate early promoter)(以下為CMV啟動子)(非專利文獻4、5、6)。又，已知於CHO細胞中，將為延長因子1α(elongation factor-1 alpha)的EF-1α(專利文獻1、非專利文獻7)、為人類核糖體蛋白基因的RPL32或RPS11之轉錄起始點的上游區域之多核苷酸(啟動子區域)單獨或與其他異種啟動子組合而可使用於蛋白質表現(非專利文獻8、專利文獻2)。然而，此等之啟動子係回應作為宿主之哺乳動物培養細胞的細胞內之生理狀況，而調整下游之外來基因的表現，多數係於哺乳動物培養細胞之增殖活躍的對數 增殖期其活性會達到最大。所以，在到達最大細胞密度以後的穩定期，其表現調節機能減弱的情形多，故期待一種能夠橫跨哺乳動物培養細胞的培養期間而強力地表現外來基因之啟動子的開發。
先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1 日本專利第3051411號
專利文獻2 WO2013/080934
非專利文獻
非專利文獻1 Florian M.Wurm.,Nat. Biotechnol. 22(11): 1393-1398,2004
非專利文獻2 Farid SS., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 848(1): 8-18,2007
非專利文獻3 Werner RG. Economic aspects of commercial manufacture of biopharmaceuticals. J Biotechnol. 113(1-3): 171-182,2004
非專利文獻4 Durocher Y et al., Curr Opin Biotechnol. 20(6): 700-707,2009
非專利文獻5 Boshart M et al., Cell. 41(2): 521-530,1985
非專利文獻6 Foecking MK et al., Gene. 45(1): 101-105,1986
非專利文獻7 Deer JR. and Allison DS.,Biotechnol. Prog. 20: 880-889,2004
非專利文獻8 Hoeksema F. et al., Biotechnology Research International、Volume2011, Article ID 492875, 11pages
非專利文獻9 Okumura T et al., J Biosci Bioeng., 120(3): 340-346,2015
非專利文獻10 Langmead B et al., Genome Biology. 10: 1186,2009
非專利文獻11 Mortazavi A et al., Nature Methods. 5: 621-628,2008
發明之概要
本發明之課題在於提供一種手段，其係於哺乳動物培養細胞等之宿主細胞中，使用具有高的外來基因表現亢進活性的啟動子，而使當作蛋白質性醫藥品之外來蛋白質的生產量亢進。可藉由找出於CHO細胞等中具有與人類EF-1α啟動子相同程度以上的啟動子活性，且在從哺乳動物培養細胞的對數增殖期起到穩定期為止的廣泛的期間中維持高的啟動子活性之啟動子，而提供哺乳動物細胞會穩定地達成外來基因之高表現的手段，並提供對於哺乳類培養細胞表現系統中之蛋白質生醫藥品之生產量的提升，亦即對於製造成本減少有貢獻的手段。
本發明人們為要解決前述課題而致力反覆進行研究的結果，發現了熱休克蛋白A5(Hspa5/GRP78)基因的起始密碼子之上游約3kbp的多核苷酸係具有優異的啟動子活性，且能夠使於哺乳動物培養細胞中為表現對象之外來蛋白質的生產性顯著地提升，而完成了本發明。亦即，本發明係包含以下的發明。
(1)一種由序列編號1所記載之核苷酸序列或該核苷酸序列之部分序列所構成的多核苷酸，其係來自中國倉鼠的Hspa5基因的啟動子，且特徵為包含由序列編號9所記載之核苷酸序列所構成的多核苷酸。
(2)如前述(1)所記載之多核苷酸，其係由序列編號1所記載之核苷酸序列所構成。
(3)如前述(1)所記載之多核苷酸，其係由序列編號5所記載之核苷酸序列所構成。
(4)如前述(1)所記載之多核苷酸，其係由序列編號6所記載之核苷酸序列所構成。
(5)如前述(1)所記載之多核苷酸，其係由序列編號7所記載之核苷酸序列所構成。
(6)如前述(1)所記載之多核苷酸，其係由序列編號8所記載之核苷酸序列所構成。
(7)如前述(1)所記載之多核苷酸，其係由序列編號9所記載之核苷酸序列所構成。
(8)一種由序列表之序列編號2所記載之核苷酸序列所構成的多核苷酸，其係來自人類的Hspa5基因的啟動子。
(9)一種由序列表之序列編號3所記載之核苷酸序列所構成的多核苷酸，其係來自小鼠的Hspa5基因的啟動子。
(10)一種由序列表之序列編號4所記載之核苷酸序列所構成的多核苷酸，其係來自大鼠的Hspa5基因的啟動子。
(11)一種具有啟動子活性之多核苷酸，其係由相對於如前述(1)至(10)中任一者所記載之核苷酸序列而具有95%以上同一性之核苷酸序列所構成的多核苷酸。
(12)一種具有啟動子活性之多核苷酸，其係由相對於如前述(1)至(10)中任一者所記載之核苷酸序列而具有99%以上同一性之核苷酸序列所構成的多核苷酸。
(13)一種具有啟動子活性之多核苷酸，其係在嚴苛的條件下與由與如前述(1)至(12)中任一者所記載之核苷酸序列互補的核苷酸序列所構成的多核苷酸進行雜交之多核苷酸。
(14)一種外來基因表現單元，其係由包含如前述(1)至(13)中任一者所記載之多核苷酸所構成。
(15)如前述(14)所記載之外來基因表現單元，其中，外來基因為編碼多聚體蛋白質之基因。
(16)如前述(14)所記載之外來基因表現單元，其中，外來基因為編碼異多聚體蛋白質(heteromultimeric protein)之基因。
(17)如前述(14)所記載之外來基因表現單元，其中，外來基因為編碼抗體或其抗原結合片段之基因。
(18)一種外來基因表現載體，其係包含如前述(14)至(17)中任一者所記載之外來基因表現單元。
(19)一種外來基因表現載體，其係包含如前述(14)至(17)中任一者所記載之外來基因表現單元及選自下述A群之(a)至(e)所記載之多核苷酸的任一個
或複數個的多核苷酸；A群
(a)由序列表之序列編號35所記載之核苷酸序列所構成的多核苷酸、(b)由序列表之序列編號36所記載之核苷酸序列所構成的多核苷酸、(c)由序列表之序列編號37所記載之核苷酸序列所構成的多核苷酸、(d)由相對於前述(a)至(c)中任一者所記載之核苷酸序列而具有95%以上同一性之核苷酸序列所構成的多核苷酸，其為具有外來基因表現亢進活性的多核苷酸、(e)由相對於上記(a)至(c)中任一者所記載之核苷酸序列而具有99%以上同一性之核苷酸序列所構成的多核苷酸，其為具有外來基因表現亢進活性的多核苷酸。
(20)一種轉形細胞，其係導入有如前述(18)或(19)所記載之外來基因表現載體。
(21)如前述(20)所記載之轉形細胞，其中細胞係來自哺乳動物的培養細胞。
(22)如前述(21)所記載之轉形細胞，其中來自哺乳動物的培養細胞為COS-1細胞、293細胞、或CHO細胞。
(23)一種蛋白質之製造方法，其特徵為培養如前述(20)至(22)中任一者所記載之轉形細胞，從培養物取得來自外來基因的蛋白質。
(24)一種如前述(1)至(13)中任一者所記載之多核苷酸之用途，其目的為於轉形細胞中使外來基因表現。
(25)一種如前述(18)或(19)所記載之外來基因表現載體之用途，其目的為於轉形細胞中使外來基因表現。
藉由本發明之外來基因的製造方法，變得能夠使治療用蛋白質或抗體等之外來基因的表現顯著地亢進。又，本發明之啟動子係藉由與DNA元件組合，變得能夠使治療用蛋白質或抗體等之外來基因的表現更為亢進。
圖1A呈示使用了1L Jar的人類化抗體X表現株X#1及X#2之饋料批次培養(Fed batch culture)結果。圖1A呈示活細胞數的經時變化。
圖1B呈示使用了1L Jar的人類化抗體X表現株X#1及X#2之饋料批次培養結果。圖1B呈示生產量的經時變化。
圖2A呈示在饋料批次培養的各採樣日之各基因的表現量。圖2A呈示Jar#1的結果，將Jar#1之第4天的細胞之表現量高的前20基因進行了作圖。
圖2B呈示在饋料批次培養的各採樣日之各基因的表現量。圖2B呈示Jar#2的結果，將Jar#1之第4天的細胞之表現量高的前20基因進行了作圖。
圖2C呈示在饋料批次培養的各採樣日之各基因的表現量。圖2C呈示Jar#3的結果，將Jar#1之第4天的細胞之表現量高的前20基因進行了作圖。
圖3係呈示以***了各啟動子的螢火蟲螢光素酶表現載體進行轉染，且將於該1日後測定之螢火蟲螢光素酶(luc2)的發光量以水母螢光素酶(Rluc)的發光量進行了標準化之值的圖。
圖4係使用了Hspa5基因、人類RPS7基因、或是來自人類EF1-α基因的啟動子作為抗體H鏈及L鏈基因的啟動子之人類化抗體基因Y表現載體pDSLHA4.1-Hspa5-Y、pDSLHA4.1-hRPS7-Y、及pDSLHA4.1-hEF1α-Y的概略圖。
圖5A係在使用了人類化抗體Y表現穩定庫(stable pool)的饋料批次培養，將藉由Hspa5基因啟動子所表現的抗體生產量與人類RPS7基因啟動子、或是人類EF1-α基因啟動子進行了比較之圖。圖5A呈示各採樣日之活細胞數。
圖5B係在使用了人類化抗體Y表現穩定庫的饋料批次培養，將藉由Hspa5基因啟動子所表現的抗體生產量與人類RPS7基因啟動子、或是人類EF1-α基因啟動子進行了比較之圖。圖5B呈示各採樣日之生產量。
圖5C係在使用了人類化抗體Y表現穩定庫的饋料批次培養，將藉由Hspa5基因啟動子所表現的抗體生產量與人類RPS7基因啟動子、或是人類EF1-α基因啟動子進行了比較之圖。圖5C呈示各採樣日之1細胞每1天的抗體生產量。
圖6係將使用了人類化抗體Y表現穩定庫的饋料批次培養中之H鏈基因的經時性的相對表現量，以Hspa5基因啟動子、與人類RPS7基因啟動子或是人類EF1-α基因啟動子來進行了比較之圖。
圖7A係在使用了水母螢光素酶(Rluc)表現穩定庫的饋料批次培養，將藉由Hspa5基因啟動子(3kbp)所表現的水母螢光素酶生產量與人類RPS7基因啟動子、或是人類EF1-α基因啟動子進行了比較之圖。圖7A呈示各採樣日之活細胞數。
圖7B係在使用了水母螢光素酶(Rluc)表現穩定庫的饋料批次培養，將藉由Hspa5基因啟動子(3kbp)所表現的水母螢光素酶生產量與人類RPS7基因啟動子、或是人類EF1-α基因啟動子進行了比較之圖。圖7B呈示各採樣日之每103細胞的水母螢光素酶發光量。
圖8A係在使用各啟動子長的Hspa5基因啟動子而而製作之人類化抗體Y表現穩定庫的饋料批次培養，將抗體生產量與人類RPS7基因啟動子、或是人類EF1-α基因啟動子進行了比較之圖。圖8A呈示各採樣日之活細胞數。
圖8B係在使用各啟動子長的Hspa5基因啟動子而製作之人類化抗體Y表現穩定庫的饋料批次培養，將抗體生產量與人類RPS7基因啟動子、或是人類EF1-α基因啟動子進行了比較之圖。圖8B呈示各採樣日之生產量。
圖8C係在使用各啟動子長的Hspa5基因啟動子而製作之人類化抗體Y表現穩定庫的饋料批次培養，將抗體 生產量與人類RPS7基因啟動子、或是人類EF1-α基因啟動子進行了比較之圖。圖8C呈示各採樣日之1細胞每1天的抗體生產量。
圖9A呈示使用Hspa5基因啟動子(0.6kbp)而取得之人類化抗體Y表現單株之藉由饋料批次培養的抗體生產量評價結果。圖9A呈示各採樣日之活細胞數。
圖9B呈示使用Hspa5基因啟動子(0.6kbp)而取得之人類化抗體Y表現單株之藉由饋料批次培養的抗體生產量評價結果。圖9B呈示各採樣日之生產量。
圖9C呈示使用Hspa5基因啟動子(0.6kbp)而取得之人類化抗體Y表現單株之藉由饋料批次培養的抗體生產量評價結果。圖9C呈示各採樣日之1細胞每1天的抗體生產量。
圖10A係在使用來自各生物種的Hspa5基因啟動子而製作之人類化抗體Y表現穩定庫的饋料批次培養，將抗體生產量進行了比較之圖。圖10A呈示各採樣日之活細胞數。ch 1.1kb、ch 0.6kb呈示分別將中國倉鼠Hspa5基因啟動子的1.1kbp、0.6kbp之部分序列使用於抗體表現用啟動子而取得之穩定庫的饋料批次培養結果。
圖10B係在使用來自各生物種的Hspa5基因啟動子而製作之人類化抗體Y表現穩定庫的饋料批次培養，將抗體生產量進行了比較之圖。圖10B呈示各採樣日之生產量。ch 1.1kb、ch 0.6kb呈示分別將中國倉鼠Hspa5基因啟動子的1.1kbp、0.6kbp之部分序列使用於抗體表現用啟動子而取得之穩定庫的饋料批次培養結果。
圖10C係在使用來自各生物種的Hspa5基因啟動子而製作之人類化抗體Y表現穩定庫的饋料批次培養，將抗體生產量進行了比較之圖。圖10C呈示各採樣日之1細胞每1天的抗體生產量。ch 1.1kb、ch 0.6kb呈示分別將中國倉鼠Hspa5基因啟動子的1.1kbp、0.6kbp之部分序列使用於抗體表現用啟動子而取得之穩定庫的饋料批次培養結果。
圖11A係在使用含或是不含DNA元件A7的人類化抗體Y表現載體而製作之穩定庫的饋料批次培養，將抗體生產量進行了比較之圖。圖11A呈示各採樣日之活細胞數。
圖11B係在使用含或是不含DNA元件A7的人類化抗體Y表現載體而製作之穩定庫的饋料批次培養，將抗體生產量進行了比較之圖。圖11B呈示各採樣日之生產量。
圖11C係在使用含或是不含DNA元件A7的人類化抗體Y表現載體而製作之穩定庫的饋料批次培養，將抗體生產量進行了比較之圖。圖11C呈示各採樣日之1細胞每1天的抗體生產量。
圖12係來自中國倉鼠的Hspa5基因的啟動子之多核苷酸的核苷酸序列。
圖13係來自人類的Hspa5基因的啟動子之多核苷酸的核苷酸序列。
圖14係來自小鼠的Hspa5基因的啟動子之多核苷酸的核苷酸序列。
圖15係來自大鼠的Hspa5基因的啟動子之多核苷酸的核苷酸序列
用以實施發明之形態
以下，具體地說明本發明。
於本說明書中，所謂「基因」，係意指被轉錄為mRNA且被轉譯為蛋白質的部分，係不僅是DNA，亦包含其mRNA、cDNA及其RNA。
於本說明書中，「多核苷酸」係以與核酸相同的意義使用，亦包含DNA、RNA、探針、寡核苷酸、及引子。
於本說明書中，不區別「多肽」與「蛋白質」而使用。
於本說明書中，所謂「基因表現」，係意指某基因被轉錄為mRNA的現象、及/或自該mRNA轉譯蛋白質的現象。
於本說明書中，所謂「外來基因」，係意指被人工地導入宿主細胞的基因。
於本說明書中，所謂「外來蛋白質」，係意指外來基因所編碼的蛋白質。
於本說明書中，所謂「基因表現單元」，係意指於轉錄之讀框的方向至少具有啟動子區域、外來基因、轉錄終止子區域(多腺苷酸附加信號(poly-A additional signal))之多核苷酸。
於本說明書中，所謂「啟動子」，係意指參與自DNA往RNA的轉錄之開始的轉錄因子所結合之區域。於本說明書中，亦有時稱為「啟動子區域」。作為啟動子，可例示例如自起始密碼子的上游約3kbp之核苷酸起至在緊接對應於起始密碼子之核苷酸序列之前的核苷酸為止的多核苷酸，亦可包含5’UTR、及內含子。
於本說明書中，所謂「啟動子活性」，係指轉錄因子結合於啟動子，開始轉錄且進行基因所編碼的蛋白質之生產的活性，能夠將螢火蟲螢光素酶等之報導基因所編碼的蛋白質之活性當成指標來進行檢驗。
於本說明書中，所謂「具有啟動子活性」，係指與將在後述(實施例5)所記載之饋料批次培養的抗體表現量當成指標之啟動子活性的評價以同樣的條件，而顯示與人類EF-1α基因啟動子同等以上的抗體表現量。
於本說明書中，所謂「DNA元件」，係意指在被配置於基因表現單元的附近、或含基因表現單元之外來基因表現載體上的情形，具有外來基因表現亢進活性之多核苷酸。
於本說明書中，所謂「抗體之抗原結合片段」，係意指具有與抗原之結合活性的抗體之部分片段，包含Fab、F(ab’)2等，但只要具有與抗原之結合能，則不限定於此等之分子。
於本說明書中，所謂「同一性」係指如在該領域所周知地，藉由序列的比較而決定之2個以上的核苷酸序列或胺基酸序列之序列間的關係。於該領域中， 「同一性」還意指按照情形，藉由一列之2個以上的核苷酸序列間或2個以上的胺基酸序列間的一致性而決定之時的核酸分子間或多肽間之序列相關性的程度。「同一性」係可藉由算出2個以上的序列之中較小者、與以特定之數學模型或電腦程式(亦即「演算法」)而被特定位址的間隔排比(gap alignment)(存在之情形)之間之相同一致的百分率而進行評價。具體而言，可使用European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute(EMBL-EBI)所提供之ClustalW2等的軟體藉以進行評價，但若是該技術領域者所使用之物，則不限定於此。
於本說明書中，所謂「在嚴苛的條件下進行雜交」，係指一般所謂會形成特異性的雜交種而不會形成非特異性的雜交種之條件。可舉出例如由對某核酸之同一性為80%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、最佳99%以上之核苷酸序列所構成的核酸之互補股會進行雜交，而由較其同一性低之核苷酸序列所構成的核酸之互補股不會進行雜交之條件。更具體而言，係意指在市售的雜交溶液ExpressHyb Hybridization Solution(Clontech公司製)中於68℃進行雜交、或以使用固定了DNA之濾器而在0.7至1.0M的NaCl存在下於68℃進行雜交之後，使用0.1至2倍濃度的SSC溶液(1倍濃度SSC係指150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉)於68℃進行清洗之條件或與其同等之條件進行雜交。
1.外來基因之表現亢進所使用的啟動子
本發明之來自外來基因的蛋白質之製造方法所使用的外來啟動子係熱休克蛋白A5基因(以下稱為「Hspa5」)的啟動子。若是具有作為Hspa5啟動子之活性的多核苷酸，則不特別限定，但就Hspa5的啟動子而言，較佳為自起始密碼子的上游約3kbp之核苷酸起至在緊接對應起始密碼子之核苷酸序列的之前之核苷酸為止的多核苷酸。
Hspa5的啟動子之來源並不特別限定，但可為來自哺乳類者，可舉出例如來自中國倉鼠、人類、小鼠、大鼠等之Hspa5的啟動子。
作為本發明之來自外來基因的蛋白質之製造方法所使用的啟動子，適合者為來自中國倉鼠的Hspa5的啟動子，更加適合者為序列表之序列編號1及圖12所記載之多核苷酸。序列編號1之核苷酸序列，係由自來自中國倉鼠的自Hspa5之起始密碼子的上游約3kbp之核苷酸起至在緊接對應起始密碼子之核苷酸序列的之前之核苷酸所構成的序列。序列編號2、3、及4之核苷酸序列，係分別由自來自人類、小鼠、大鼠的自Hspa5之起始密碼子的上游約1kbp之核苷酸起至在緊接對應起始密碼子之核苷酸序列的之前之核苷酸所構成的序列。將序列編號2、3、及4之核苷酸序列也分別呈示於圖13、圖14、圖15。
就來自中國倉鼠的Hspa5的啟動子而言，亦可為由序列編號1所記載之序列之部分序列所構成的核 苷酸序列，可例示包含序列編號5、6、7、8及9記載之序列的多核苷酸，該等係分別由自Hspa5之起始密碼子的上游約2.5、2.0、1.5、1.1及0.6kbp之核苷酸起至在緊接對應起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸所構成的序列，較佳為序列編號7、8及9所記載之多核苷酸，更佳為序列編號8及9所記載之多核苷酸。
又，本發明之來自外來基因的蛋白質之製造方法所使用的啟動子，亦可為由相對於序列編號1至9所示的任一個之核苷酸序列而具有80%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、最佳為99%以上的同一性之核苷酸序列所構成，且具有啟動子活性之多核苷酸。
本發明之來自外來基因的蛋白質之製造方法所使用的啟動子，亦可為會與由互補的核苷酸序列所構成的多核苷酸在嚴苛的條件下進行雜交，且具有啟動子活性之多核苷酸，該互補的核苷酸序列係和由選自包含序列編號1至9所記載之核苷酸序列之群組的任一個之核苷酸序列所構成的多核苷酸互補。
本發明之來自外來基因的蛋白質之製造方法所使用的啟動子，亦可為變異多核苷酸且具有啟動子活性之多核苷酸，該變異多核苷酸係由在選自包含序列編號1至9所記載之核苷酸序列之群組的任一個之核苷酸序列中，有1或複数、較佳為1至300個、進一步較佳為1至30個的核苷酸缺失、置換、及/或附加之核苷酸序列所構成。
前述核苷酸序列之變異(缺失、置換、及/或附加)的導入可藉由Kunkel法或者是Gapped duplex法等之在該技術領域周知的手法、或以此為準的方法來進行，可利用例如利用了特定位點突變誘發法的變異導入用套組(例如Mutant-K(Takara Bio公司製)或者是Mutant-G(Takara Bio公司製)、Takara Bio公司的LA PCR in vitro Mutagenesis系列套組等。這樣的變異多核苷酸亦可當成本發明之啟動子來使用。
本發明之啟動子所具有的外來基因表現亢進活性，係能夠將螢火蟲螢光素酶等之報導基因所編碼的蛋白質之活性、或是在饋料批次培養的抗體生產量當成指標來進行檢驗。將使用了本發明之啟動子的情形與使用了人類EF-1α啟動子之情形進行比較，在饋料批次培養之抗體生產量為同等以上、較佳為上升為1.2倍以上、更佳為上升為1.5倍以上之情形下，可判斷該啟動子具有外來基因表現亢進活性。即便是以1.2倍程度以上的亢進，亦可期待細胞之培養規模的削減、培養時間及精製步驟的縮短，能夠達成作為結果之產量的提升與培養成本的削減。若產量提升，則能夠達成穩定地供給作為醫藥之外來蛋白質。又，若培養成本削減，則可減少作為醫藥之外來蛋白質的原價。
2.外來基因表現單元
本發明之來自外來基因的蛋白質之製造方法所使用的外來基因表現單元(以下，有時稱為「本發明之基因表現單元」，係於轉錄之讀框的方向至少具有前述1.所記載 之本發明之啟動子、外來基因、及轉錄終止子區域(多腺苷酸附加信號)者。
又，多腺苷酸附加序列若是對於自啟動子的轉錄為具有引起轉錄終結之活性的序列即可，亦可為與啟動子之基因為相同的或不相同的基因者。
3.外來基因之表現亢進所使用的DNA元件
可藉由將DNA元件與前述2.所記載之本發明之基因表現單元進行組合而使用，而使外來基因的表現更亢進。進行組合而使用的DNA元件，係能夠將與乙醯化組蛋白H3之相互作用當成指標來取得。組蛋白(H3、H4)之乙醯化一般被說是參與轉錄的活性化，主要被認為有2種學說。係與所謂藉由組蛋白尾部乙醯化而在電荷上被中和，DNA與組蛋白的結合會變鬆之核小體的立體結構變化有關係的學說(Mellor J.(2006)Dynamic nucleosomes and gene transcription.Trends Genet.22(6)：320-329)；及所謂會參與各樣的轉錄因子之募集(recruit)的學說(Nakatani Y.(2001)Histone acetylases-versatile players.Genes Cells.6(2)：79-86)。無論在任一種學說，組蛋白的乙醯化參與轉錄活性化的可能性都高，且能夠藉由使用了抗乙醯化組蛋白H3抗體的染色質免疫沉澱(Chromatin Immunoprecipitation；ChIP)，而將與乙醯化組蛋白H3進行相互作用的DNA元件濃縮。
作為與本發明之啟動子進行組合而使用的外來基因之表現亢進所使用的DNA元件，可舉出A2、A7、及A18。
A2係位於人類第15號染色體80966429~80974878，而AT含量62.2%、8450bp的多核苷酸。A2之核苷酸序列係記載於序列表之序列編號35。
A7係位於人類第11號染色體88992123~89000542，而AT含量64.52%、8420bp的多核苷酸。A7之核苷酸序列係記載於序列表之序列編號36。
A18係位於人類第4號染色體111275976~111284450，而AT含量62.54%、8475bp的多核苷酸。A18之核苷酸序列係記載於序列表之序列編號37。
與本發明之啟動子進行組合而使用的DNA元件所具有的外來基因表現亢進活性，係能夠以SEAP等之報導基因所編碼的蛋白質之活性作為指標而進行檢驗。
與本發明之啟動子進行組合而使用的情形，可單獨使用前述DNA元件之任意1種，亦可將DNA元件的1種複製2個以上來使用。或是亦可將2種以上DNA元件進行組合而使用。
本發明中所使用之DNA元件，亦可為由相對於序列編號35至37所示的核苷酸序列而具有80%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、最佳為99%以上的同一性之核苷酸序列所構成，且具有外來基因表現亢進活性之核苷酸序列。核苷酸序列的同源性檢索，係例如能夠以日本DNA資料庫(DNA Databank of JAPAN)等為對象，而使用FASTA或BLAST等的程式來進行。
若為該技術領域者，則可藉由參照Molecular Cloning(Sambrook,J.et al.,Molecular Cloning：a Laboratory Manual 2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,10 Skyline Drive Plainview,NY(1989))等，而輕易地取得本發明之啟動子的這種同源基因。又，前述之核苷酸序列的同一性，係可同樣地藉由FASTA檢索或BLAST檢索來決定。
前述多核苷酸之變異(缺失、置換、及/或附加)的導入可藉由Kunkel法或者是Gapped duplex法等之在該技術領域周知的手法、或以此為準的方法來進行，可利用例如利用了特定位點突變誘發法的變異導入用套組(例如Mutant-K(Takara Bio公司製)或者是Mutant-G(Takara Bio公司製)、Takara Bio公司的LA PCR in vitro Mutagenesis系列套組。這樣的變異多核苷酸亦可當成本發明之DNA元件來使用。
4.多核苷酸的取得
於本發明中，包含編碼後述之產生亢進之對象的外來蛋白質之外來基因的多核苷酸，係可藉由以下所示之一般性的方法來取得。例如，可藉由使用根據該基因片段而合成之DNA探針，將來自表現外來基因之細胞或組織的cDNA庫進行篩選而單離。mRNA的製備，係可藉由該技術領域中所通常使用之手法來進行。例如，可將前述細胞或組織以胍試藥、酚試藥等處理而得到全RNA，然後藉由使用了以寡聚脫氧胸腺嘧啶(oligo(dT))纖維素管柱或瓊脂糖(sepharose)2B為承載體之多尿苷酸 -瓊脂糖等的親和性管柱法、或是藉由批次法，而得到多腺苷酸+RNA(mRNA)。再者，亦可藉由蔗糖密度梯度離心法等而將多腺苷酸+RNA進一步分劃。接著，將所得到的mRNA作為鑄模，而使用寡聚脫氧胸腺嘧啶引子及反轉錄酶來合成單股cDNA，使用DNA合成酶I、DNA連接酶及核糖核酸酶H(RNaseH)等而自該單股cDNA來合成雙股cDNA。將所合成之雙股cDNA藉由T4DNA合成酶而平滑化後，經過接合子(adaptor)(例如EcoRI接合子)的連結、磷酸化等，組入至λgt11等的λ噬菌體而進行活體內組裝，藉以製作cDNA庫。又，於λ噬菌體以外亦可使用質體載體來製作cDNA庫。然後，自cDNA庫選擇具有目標之DNA之株(陽性殖株)即可。
又，從基因體DNA將用於蛋白質之產生的包含前述啟動子、終止子區域之多核苷酸、包含前述DNA元件或外來基因之多核苷酸單離的情形，係按照一般手法(Molecular Cloning(1989),Methods in Enzymology 194(1991))，藉由從為採取源的生物之細胞株抽取基因體DNA篩選多核苷酸而進行。基因體DNA的抽取可按照例如Cryer等人的方法(Methods in Cell Biology,12,39-44(1975))及P.Philippsen等人的方法(Methods Enzymol.,194,169-182(1991))而進行。
包含作為目標之啟動子、DNA元件、或外來基因之多核苷酸的取得，亦可藉由例如PCR法(PCR Technology.Henry A.Erlich,Atockton press(1989))而進行。使用了PCR法的多核苷酸之增幅中，係使用20~ 30mer的合成單股DNA作為引子，使用基因體DNA作為鑄模。被增幅的基因係確認了多核苷酸序列之後使用。就PCR的鑄模而言，能夠使用人造細菌染色體(BAC)等之基因體DNA庫。
另一方面，包含序列未知的外來基因之多核苷酸的取得，可藉由以下(a)及(b)來進行：(a)藉由例行方法來製作基因庫；(b)自所製作的基因庫選擇期望的多核苷酸，將該多核苷酸增幅。基因庫可藉由以下來製備：將從為採取源的生物之細胞株藉由例行方法而得到的染色體DNA，以適當的限制酵素來進行部分消化而片段化，將所得到的片段連結至適當的載體，將該載體導入適當的宿主。又，亦可藉由以下製備：從細胞抽取mRNA，由此合成cDNA後，連結至適當的載體，將該載體導入適當的宿主。就此時所用的載體而言，通常可使用已知作為基因庫製備用載體而周知的質體，亦可廣泛地使用噬菌體載體或黏接質體(cosmid)等。進行轉形或轉導之宿主，若使用因應前述載體的種類之物即可。包含外來基因之多核苷酸的選擇，係自前述基因庫，藉由使用包含外來基因中特有的序列之標記探針的菌落雜交法、溶菌斑雜交法(Plaque hybridization)等來進行。
也還可將包含外來基因之多核苷酸化學性地全合成。可藉由以下方法來合成基因，例如製作互補的2對寡核苷酸，並使此等降溫後黏著(annealing)之方法；或藉由DNA連接酶而將數條被降溫後黏著的DNA連結之方法；或製作一部分互補的數條寡核苷酸，藉由PCR而填補間隙之方法等。
多核苷酸序列的決定可藉由通常的方法，例如雙去氧鏈終止法(dideoxy chain-termination method)(Sanger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,74,5463-5467(1977))等來進行。再者，前述多核苷酸序列的決定，亦可藉由使用市售的定序套組等而輕易地進行。
5.外來基因表現載體
就本發明之來自外來基因的蛋白質之製造方法所使用的外來基因表現載體而言，係提供一種包含前述2.所記載之外來基因表現單元的載體，其中該外來基因表現單元係包含前述1.所記載之啟動子。本發明之來自外來基因的蛋白質之製造方法所使用的外來基因表現載體亦可包含前述3.所記載之DNA元件的1種、套數(copy number)2個以上之DNA元件的1種、DNA元件的2種以上之組合。於藉由前述之外來基因表現載體而使外來基因在宿主細胞內表現之際，可將DNA元件配置於緊鄰基因表現單元的之前或之後，或配置於與基因表現單元分離的位置。又，亦可使用包含複數的DNA元件之1個外來基因表現載體。而且，DNA元件的方向可為對於基因表現單元為順向或反向之任一者。
就外來基因而言，並未特別限定，但可舉出分泌型鹼性磷酸酶(SEAP)、綠色螢光蛋白質(GFP)、螢光素酶等之報導基因、α-澱粉酶基因、α-半乳糖苷酶基因等之各種酵素基因、為醫藥上有用之生理活性蛋白質的干擾素α、干擾素γ等之各種干擾素基因、IL1、IL2等之各種介白素基因、紅血球生成素(EPO)基因、顆粒性白 血球菌落刺激因子(G-CSF)基因等之各種細胞介素基因、生長因子基因、或編碼多聚體蛋白質之基因，例如編碼抗體或為其抗原結合片段的異多聚體之基因等。此等之基因可為藉由任何手法所得之物。
「抗體之抗原結合片段」係意指具有與抗原之結合活性的抗體之部分片段，包含Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、雙價抗體(diabody)、線狀抗體、及由抗體片段所形成之多特異性抗體等。又，Fab’亦包含在抗體之抗原結合片段中，該Fab’係將F(ab’)2在還原條件下進行了處理之抗體的可變區域之一價的片段。但是，只要具有與抗原之結合能，則不限定於此等之分子。又，此等之抗原結合片段中，不僅包含將抗體蛋白質的全長分子以適當的酵素進行了處理者，亦包含使用基因工程學上被改變之抗體基因而於適當的宿主細胞中產生之蛋白質。
又，本發明之來自外來基因的蛋白質之製造方法所使用的外來基因表現載體中，可包含用以選出轉形體之篩選標記。能夠藉由使用會對於例如淺藍菌素(cerulenin)、金擔子素(aureobasidin)、吉歐黴素(Zeocin)、刀豆胺酸、環己醯亞胺、潮黴素、嘌呤黴素(puromycin)、殺稻瘟菌素、四環素、康黴素、胺芐青黴素、新黴素等之藥劑賦予耐性的藥劑耐性標記等，而進行轉形體的選出。又，亦能夠藉由使賦予對乙醇等之溶劑耐性、或對甘油或鹽等之滲透壓耐性、銅等之金屬離子耐性等之基因為標記，而進行轉形體的選出。
本發明之來自外來基因的蛋白質之製造方法所使用的外來基因表現載體，亦可為不會被***染色體DNA的載體。普遍性地，外來基因表現載體被基因導入至宿主細胞之後，會隨機地被***染色體，但可使用來自猴病毒四十型(simian virus 40，SV40)或乳突狀瘤病毒(papilloma virus)(BPV、HPV)、EBV等之哺乳動物病毒的構成成分，藉以作為能夠自我複製的附加型載體(episomal vector)而在被導入之宿主細胞中使用。例如，具有來自SV40之複製起點及編碼為異側作用因子(trans-acting factor)的SV40大型T抗原之序列的載體或具有編碼來自EBV的oriP及EBNA-1之序列的載體等係廣泛地被使用。DNA元件之效果係能夠不論載體的種類、或是對染色體之***的有無，而顯示外來基因表現亢進活性。
6.轉形細胞
本發明之來自外來基因的蛋白質之製造方法所使用的轉形細胞，係使用前述5.之外來基因表現載體而進行了導入的轉形細胞。
就要使之進行轉形的宿主細胞而言，係真核細胞，較佳為哺乳動物細胞，進一步較佳為來自人類、小鼠、大鼠、倉鼠、猴、或牛的細胞。就哺乳動物細胞而言，可舉出COS-1細胞、293細胞、CHO細胞(CHO-K1、DG44、CHO dhfr-、CHO-S)等，但不限定於此等。
於本發明中，就對宿主細胞之表現載體的導入方法而言，若為導入基因會穩定地存在於宿主內，且 可使之適當表現的方法，則可為任何方法，被普遍性地使用之方法，可舉出例如磷酸鈣法(Ito et al.,(1984)Agric.Biol.Chem.,48,341)、電穿孔法(Becker,D.M.et al.(1990)Methods.Enzymol.,194,182-187)、球形質體法(Creggh et al.,Mol.Cell.Biol.,5,3376(1985))、乙酸鋰法(Itoh,H.(1983)J.Bacteriol.153,163-168)、脂質體轉染(lipofection)法等。
7.外來蛋白質的製造方法
本發明之外來蛋白質的製造方法，係可藉由利用周知的方法來培養前述6.的項目所記載之轉形細胞，並由該培養物採取且精製而進行。「培養物」係除了培養上清液之外，還意指培養細胞、或細胞的破碎物之任意一者。而且，就可使用6.的項目所記載之轉形細胞而產生的外來蛋白質而言，係不僅是單體蛋白質，亦能夠選擇多聚體蛋白質。進行由不相同的複數的次單元所構成之異多聚體蛋白質的生產之情形，必須將編碼此等之次單元的複數的基因分別導入6.的項目所記載之宿主細胞。
培養轉形細胞的方法，係可按照該宿主細胞的培養所使用之通常的方法來進行。
轉形細胞是哺乳動物細胞之情形，例如在37℃、5%或8%CO2條件下培養，培養時間為24~1000小時程度，且培養可藉由靜置、振盪、攪拌、通氣下的批次培養、饋料批次培養、灌流培養或連續培養等來實施。
要從前述的培養物(培養液)來確認外來蛋白質基因之表現產物，可藉由十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺 膠體電泳(SDS-PAGE)、西方墨點法、酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)等來進行。
8.抗體蛋白質的製造方法
就使用前述7.的項目所記載之製造方法所製造的異多聚體蛋白質而言，可舉出抗體蛋白質。抗體蛋白質係由2分子的重鏈多肽及2分子的輕鏈多肽所構成的四聚體蛋白質。所以，為了要以維持著抗原結合能之形態來取得抗體蛋白質，係必須於前述6.的項目所記載之轉形細胞中導入有重鏈及輕鏈的基因雙方。於此情形，重鏈及輕鏈的基因表現單元可存在於相同的表現載體上，或是亦可存在於不相同的表現載體上。
就本發明中所製造之抗體而言，可舉出將兔、小鼠、大鼠等實驗動物以期望的抗原進行免疫所製作之抗體。又，亦可作為本發明中所製造之抗體而舉出以前述之抗體為原料的嵌合抗體、及人類化抗體。再者，關於藉由基因改變動物或噬菌體顯示法所取得之人類抗體，亦為本發明中所製造之抗體。
就用於抗體製造的抗體基因而言，只要從該抗體基因所轉錄、轉譯之重鏈多肽與輕鏈多肽的組合保持著與任意之抗原蛋白質結合的活性，則不限定於具有特定之多核苷酸序列的抗體基因。
又，就抗體基因而言，並不必一定要編碼抗體的全長分子，可使用編碼抗體之抗原結合片段的基因。此等之編碼抗原結合片段的基因，可藉由基因工程學上改變編碼抗體蛋白質的全長分子的基因來取得。
9.其他的外來蛋白質的製造方法
就成為本發明的製造方法之對象的外來蛋白質而言，除了前述的抗體之外，還可舉出來自人類或非人類動物的各種蛋白質、其抗原結合片段、其修飾物等。就該種的蛋白質等而言，可舉出心房利鈉尿胜肽(ANP)、腦利鈉尿胜肽(BNP)、C型利鈉尿胜肽(CNP)、升壓素、體抑素、生長激素(GH)、胰島素、催產素、飢餓肽、瘦素、脂聯素、腎素、降鈣素、骨保護素(osteoprotegerin)、似胰島素生長因子(IGF)等的胜肽激素、介白素、趨化介素、干擾素、腫瘤壞死因子(TNFα/β還有TNF超家族等)、神經生長因子(NGF)、細胞增殖因子(EGF、FGF、PDGF、HGF、TGF等)、造血因子(CSF、G-CSF、紅血球生成素等)、脂肪細胞激素(adipocytokine)等的細胞介素、TNF受體等的受體、溶菌酶、蛋白酶、蛋白質酶、胜肽酶等的酵素、其機能性片段(將原本的蛋白質之生物活性的一部分或全部保持之片段)、包含該等的蛋白質所構成的融合蛋白質等，但並非被特別限定於該等之物。
[實施例]
以下，藉由實施例而具體地說明本發明。但是，此等之實施例並非任何限定本發明之技術範圍者。本發明之實施例中使用的質體、限制酵素、DNA修飾酵素等係市售之物，可按照例行方法來使用。又，關於DNA的選殖、多核苷酸序列的決定、宿主細胞的轉形、轉形細胞的培養、由所得培養物之蛋白質的採取、用於精製等的操作亦為該技術領域者所熟知之物、或可藉由文獻而知悉之物。
(實施例1)人類化抗體基因X表現株的構築
1-1)人類化抗體基因X表現載體的構築
構築了具有非專利文獻9記載之pDSLH4.1作為載體基本骨架的人類化抗體基因X表現載體pDSLH4.1-X。
1-2)人類化抗體X表現穩定庫的製作
馴化CHO-K1細胞(ATCC)，使其能夠達成在使用了無血清培養基之懸浮狀態的培養，得到了宿主細胞CHO-O1細胞。使用基因導入裝置Neon轉染系統(Invitrogen)，將在(1-1)構築之人類化抗體基因X表現載體pDSLH4.1-X對CHO-O1細胞進行基因導入，於T-25燒瓶以5%CO2、37℃進行了培養。於基因導入1天後添加遺傳黴素(Geneticin)(生命技術公司(Life Technologies Corporation))，使最終濃度為800μg/mL，進行了1週的藥物篩選培養。然後，於125mL容量的三角燒瓶以5%CO2、37℃進行培養，製作了人類化抗體X表現穩定庫。
1-3)人類化抗體X表現株的構築
將在(1-2)製作之人類化抗體X表現穩定庫予以單株化，取得了人類化抗體X表現株X#1及X#2。
具體而言，使在(1-2)製作之人類化抗體X表現穩定庫懸浮於軟瓊脂培養基，接種至6孔盤，以5%CO2、37℃進行了培養。培養後，使用ClonePix 2(Genetix)而將人類化抗體X高表現群落採集至96孔盤。所採集之群落係以24孔盤、6孔盤、T-25燒瓶、125mL容量的三角燒瓶依序進行擴大培養，取得了人類化抗體X表現株X#1及X#2。
(實施例2)人類化抗體X表現株X#1及X#2的轉錄體(transcriptome)解析
使用在實施例1構築之人類化抗體X表現株X#1及X#2，而進行饋料批次培養，針對其經時試樣實施轉錄體解析，特定了高表現基因。
2-1)人類化抗體X表現株X#1及X#2的饋料批次培養
將在實施例1構築之人類化抗體X表現株於1L Jar進行了饋料批次培養。Jar#1係使用X#1細胞株，基本培養基/饋料培養基(feed medium)使用了G13(JX Energy公司製特製培養基)/F13(JX Energy公司製特製培養基)；Jar#2係使用X#1細胞株，基本培養基/饋料培養基使用了DA1(生命技術公司製特製培養基)/DAFM3(生命技術公司製特製培養基)；Jar#3係使用X#2細胞株，基本培養基/饋料培養基使用了G13/F13。
將活細胞數與抗體生產量的推移分別呈示於圖1A、圖1B。抗體生產量若在細胞株間進行比較，則X#1比X#2高，而在基本培養基/饋料培養基間的比較，則G13/F13比DA1/DAFM3要來得高。
2-2)人類化抗體X表現株X#1及X#2的轉錄體解析
使用RNAiso Plus(Takara Bio)，從在(2-1)實施之饋料批次培養的第4、7、9、11、14天的細胞抽取了總RNA。接著，使用TruSeq RNA Sample Prep套組v2(illumina)而製作了序列庫。具體而言，係將從總RNA將PolyA+ RNA單離、片段化而取得之RNA片段作為鑄模，而合成了雙股cDNA。將所合成之雙股cDNA的兩末端予以平滑化.磷酸化處理了之後，進行3’-dA突出處理，連結了標引接合子(Indexed Adapter)。以連結了接合子的雙股cDNA為鑄模，進行了藉由PCR的增幅之後，將以使用了AMPure XP(BECKMAN COULTER)的磁珠法所得到的PCR產物予以精製，作為序列庫。然後，使用序列庫而形成作為DNA序列之鑄模的叢集，供應至2000系統(illumina)，實施高速DNA定序，而取得了DNA序列數據。
2-3)轉錄體解析結果的數據分析
利用序列分析(sequence analysis)所得到的前導序列(lead sequence)，係使用非專利文獻10記載的Bowtie(版本1.0.0)而與參考序列進行了比對(mapping)。參考序列係於NCBI中所登錄之中國倉鼠的染色體序列，加入基於NCBI中所登錄之中國倉鼠的基因資訊(genetic information)進行抽取之剪接序列(splices sequence)而製作。又，前導序列的表現量(RPKM：每百萬個比對讀序中每千個鹼基的外顯子[內含子/基因間]模式之讀序數(Reads per kilobase of exon[intron/intergenic]model per million mapped reads))與新穎基因表現區域係使用非專利文獻11記載的ERANGE 3.2而進行了研究探討。
將在Jar#1的第4天之細胞的表現量高的前20基因呈示於表1，將Jar#1、Jar#2、Jar#3的各採樣日之前述 20基因的表現量分別呈示於圖2A、圖2B、圖2C。Hspa5(熱休克蛋白5)基因係於Jar#1、2、3的全部條件下，而Fth1(鐵蛋白重鏈1)基因係於Jar#2、3的條件下見到了在培養後期之表現量上升。暗示了Hspa5基因係無關細胞株、培養基的條件，而於培養後期表現量上升，且於培養後期其啟動子活性提升。
(實施例3)高表現基因的啟動子區域之選殖
在實施例2發現之表現量高的前20基因之中，針對除了tRNA以外的18基因，進行了各基因的啟動子區域之選殖。
3-1)Hspa5的啟動子區域之選殖
就Hspa5的啟動子區域而言，以GenBank中登錄為NM_001246739.1之mRNA的序列及登錄為NW_003615108.1之中國倉鼠基因體的支架序列(scaffold sequence)作為參考，而使用了自Hspa5之起始密碼子序列的上游約3.0kbp之核苷酸起至在緊接對應起始密碼子序列之核苷酸序列的之前之核苷酸為止的序列。
Hspa5的啟動子區域，係以CHO細胞的基因體DNA為模板，而利用使用了以下所示的引子組(primer set)與KOD FX Neo(TOYOBO)的PCR進行增幅，並利用QIAquick PCR純化套組(QIAGEN)進行了精製。將所精製之DNA片段利用KpnI-HindIII進行了消化之後，***pGL4.10[luc2](PROMEGA)的KpnI-HindIII位點間，而構築了pGL4.10-Hspa5。將所選殖之Hspa5的啟動子區域之核苷酸序列表示為序列表之序列編號1。
Hspa5啟動子的引子組
Hspa5-KpnI-F：GGGGGGGTACCTATAGCCCAGGCACACATGAACTTG(序列編號10)
Hspa5-HindIII-R：GGGGGAAGCTTCTTGCCGGCGCTGTGGGCCAGTGCT(序列編號11)
3-2)其他高表現基因的啟動子區域之選殖
依照前述3-1)所記載之方法，進行Rps14(核糖體蛋白S14)、Gapdh(甘油醛三磷酸脫氫酶)、Eef1a1(真核轉譯延長因子1-α1)、Rps11(40S核糖體蛋白S11樣)、Rplp0(60S acidic核糖體蛋白P0樣)、Rps4(核糖體蛋白S4)、PKM(丙酮酸激酶M1/M2樣)、Rps2(核糖體蛋白S2)、Actb(β-肌動蛋白)、Chub2(聚泛素)、Rps3(40S核糖體蛋白S3a樣)、Prdx1(過氧化物還原酶1)、Rpsa(核糖體蛋白SA)、Rps25(40S核糖體蛋白S25樣)、Rp18(60S核糖體蛋白L8樣)、Fth1(鐵蛋白重鏈1)、Hspd1(熱休克蛋白1)的啟動子區域之選殖，並***pGL4.10[luc2]的多選殖位點。
3-3)pGL4.10-hEF1α的構築
其次，以pEF1/V5-His A(Invitorogen)為模板，而利用使用了以下所示的引子組與KOD-Plus-Ver.2(TOYOBO)的PCR來增幅人類EF1-α啟動子，並利用QIAquick PCR純化套組進行了精製。將所精製之DNA片段利用NheI-HindIII進行了消化之後，***pGL4.10[luc2]的NheI-HindIII位點間，而構築了pGL4.10-hEF1α。
hEF1α啟動子的引子組
hEF1α-NheI-F：GAGTGGGCTAGCGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTG(序列編號12)
hEF1α-HindIII-R：GAGTGGAAGCTTCCTCACGACACCTGAAATGGAAG(序列編號13)
(實施例4)以螢火蟲螢光素酶的暫時性表現量為指標之各啟動子的活性評價
4-1)轉染
(1-2)將所記載之CHO-O1細胞以Opti-MEM I Reduced Serum Medium(生命技術公司)懸浮成為2.5×105細胞/mL，對24孔盤每一孔接種了1mL。將***了在實施例3所構築之各啟動子的pGL4.10[luc2]3.2μg與轉染效率修正用的對照載體pGL4.74[hRluc/TK](PROMEGA)0.4μg，利用OptiPro SFM(生命技術公司)68μL進行了稀釋。另一方面，將Lipofectamine 2000 CD(生命技術公司)8μL利用OptiPro SFM 68μL進行稀釋，與前述質體溶液混合，並在室溫放置了20分鐘。然後，於2孔各添加半量，以5%CO2、37℃進行了培養。
4-2)螢光素酶測定法
轉染的次日，使用雙螢光素酶報告基因檢測系統(Dual-Luciferase Reporter Assay System)(PROMEGA)而測定了螢光素酶的暫時性表現量。具體而言，將培養液進行9000G×1分鐘離心而除去上清液，以PBS清洗了1次之後，使用套組附加的被動裂解緩衝液(passive lysis buffer)而製備了細胞溶解液(lysate)。然後，使用前述套組與光度計而測定了螢火蟲螢光素酶與水母螢光素酶的發光量。
將以***了各啟動子的螢光素酶表現載體進行轉染，且於該次日測定之螢火蟲螢光素酶(luc2)的發光量以水母螢光素酶(Rluc)的發光量進行了標準化之值呈示於 圖3。Eef1a1係顯示強的啟動子活性，與作為對照所使用的人類EF1-α為相同程度。Hspa5係在已研究探討啟動子之中顯示了為Eef1a1的次強的啟動子活性。
(實施例5)以抗體表現量為指標之藉由饋料批次培養的Hspa5啟動子之評價
Hspa5基因係由於在轉錄體解析中，於培養後期表現量上升，而暗示了其在培養後期之啟動子活性的增強。又，Hspa5基因的啟動子係於利用了螢光素酶測定法之藉由暫時性表現的評價中，顯示了強的啟動子活性。於是，製作抗體穩定表現的細胞，並藉由饋料批次培養而進行了本啟動子之評價。
5-1)抗體表現載體的構築
構築了人類化抗體基因Y表現載體pDSLHA4.1-hRPS7-Y，其係具有非專利文獻9記載之pDSLH4.1作為載體基本骨架，且於抗體H鏈及L鏈基因的啟動子使用了專利文獻2所記載之人類RPS7，而於DNA元件使用了專利文獻2所記載之A7。接著，構築了pDSLHA4.1-Hspa5-Y、及pDSLHA4.1-hEF1α-Y，該等係將人類化抗體基因Y表現載體pDSLHA4.1-hRPS7-Y之抗體H鏈及L鏈基因的啟動子置換為Hspa5、或是人類EF1-α。將載體概略呈示於圖4。
pDSLHA4.1-Hspa5-Y係藉由以下的方法所構築。首先，以pGL4.10-Hspa5為模板，而利用使用了以下所示的引子組與PrimeSTAR Max DNA聚合酶(Takara Bio)的PCR增幅中國倉鼠Hspa5啟動子，並利用QIAquick PCR 純化套組進行了精製。將所精製之DNA片段利用NotI-XbaI進行了消化之後，***H鏈基因表現載體pDSH1.1-hRPS7-Y、及L鏈基因表現載體pDSL2.1-hRPS7-Y的NotI-NheI位點間，而分別構築了pDSH1.1-Hspa5-Y、pDSL2.1-Hspa5-Y。其次，於pDSH1.1-Hspa5-Y的AatII-HindIII間***將pDSL2.1-Hspa5-Y利用AatII-HindIII予以消化所得到的DNA片段，而構築了pDSLH3.1-Hspa5-Y。於pDSLH3.1-Hspa5-Y的表現匣(expression cassette)上游***專利文獻2所記載之DNA元件A7，而構築了pDSLHA4.1-Hspa5-Y。
Hspa5啟動子的引子組
Hspa5-NotI-F：GGGGGGCGGCCGCTATAGCCCAGGCACACATGAACTTG(序列編號14)
Hspa5-XbaI-R：GGGGGTCTAGACTTGCCGGCGCTGTGGGCCAGTGCT(序列編號15)
另一方面，pDSLHA4.1-hEF1α-Y係藉由以下的方法所構築。首先，以pGL4.10-hEF1α為模板，而利用使用了以下所示的引子組與KOD-Plus-Ver.2的PCR增幅人類EF1-α啟動子，並利用QIAquick PCR純化套組進行了精製。將所精製之DNA片段利用NotI-NheI進行了消化之後，***H鏈基因表現載體pDSH1.1-hRPS7-Y、及L鏈基因表現載體pDSL2.1-hRPS7-Y的NotI-NheI位點間，分別構築了pDSH1.1-hEF1α-Y、pDSL2.1-hEF1α-Y。其次，於 pDSH1.1-hEF1α-Y的AatII-HindIII間***將pDSL2.1-hEF1α-Y利用AatII-HindIII予以消化所得到的DNA片段，而構築了p DSLH3.1-hEF1α-Y。於pDSLH3.1-hEF1α-Y的表現匣上游***專利文獻2所記載之DNA元件A7，而構築了pDSLHA4.1-hEF1α-Y。
hEF1α啟動子的引子組
hEF1α-NotI-F：GAGTGGGCGGCCGCGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTG(序列編號16)
hEF1α-NheI-R：GAGTGGGCTAGCCCTCACGACACCTGAAATGGAAG(序列編號17)
5-2)人類化抗體Y表現穩定庫的製作
將在(5-1)構築之抗體表現載體pDSLHA4.1-Hspa5-Y、pDSLHA4.1-hRPS7-Y或是pDSLHA4.1-hEF1α-Y利用(4-1)所記載之方法轉染至(1-2)所記載之CHO-O1細胞。基因導入1天後，將培養液離心而除去上清液，以含有Geneticin 800μg/mL的培養基懸浮，並在6孔盤進行了1週的藥物篩選培養。然後，於T-25燒瓶，接著於125mL容量的三角燒瓶，以5%CO2、37℃進行培養，製作了人類化抗體Y表現穩定庫。穩定庫係利用各個抗體表現載體以N=2進行了製作。
5-3)藉由人類化抗體Y表現穩定庫之饋料批次培養的抗體生產量評價
使用在(5-2)製作之人類化抗體Y表現穩定庫，而於125mL容量的三角燒瓶進行了饋料批次培養。基本培養基係使用了G13，饋料培養基係使用了F13。
將活細胞數、抗體生產量、1細胞每1天的抗體生 產量(SPR：比生產率(specific production rate))的推移分別呈示於圖5A、圖5B、圖5C。1細胞每1天的抗體生產量，係將在採樣時間點之抗體生產量除以採樣時間點為止的累計活細胞數而算出。在培養初期，在Hspa5的啟動子的抗體生產量、1細胞每1天的抗體生產量都與作為對照所使用的人類RPS7啟動子為相同程度，比人類EF1-α啟動子還低。然而，在Hspa5啟動子，在培養的中期以後1細胞每1天的抗體生產量係大幅地上升，在培養第10天的時間點分別顯示了人類RPS7啟動子、人類EF1-α啟動子的1.3、0.9倍之值，在培養第14天的時間點分別顯示了人類RPS7啟動子、人類EF1-α啟動子的1.8、1.4倍之值。其結果，在培養第14天的Hspa5啟動子之抗體生產量係分別達到人類RPS7啟動子、人類EF1-α啟動子的1.5、1.4倍之值，大幅超出了現在所頻繁使用之啟動子的抗體生產量。
5-4)藉由人類化抗體Y表現穩定庫之饋料批次培養的mRNA表現量評價
使用在(5-3)實施之饋料批次培養中經時性地取得之細胞，將目標之抗體Y基因之在mRNA層次的表現量藉由即時(real-time)PCR進行了比較。以使用RNeasy Micro套組(QIAGEN)而從饋料批次培養的第4、6、9、10、11天的細胞抽取之總RNA為模板，使用PrimeScript High Fidelity RT-PCR套組(Takara Bio)而進行反轉錄反應，合成了cDNA。其次，以反轉錄反應液為模板，而使用以下所示的引子組與SYBR Premix Ex Taq II(Takara Bio)， 實施了即時PCR。H鏈基因係使用在基因導入時使用之人類化抗體Y表現載體，而Gapdh基因係使用將利用以下所示的引子組增幅之DNA片段進行了TOPO選殖之質體DNA來製作檢量曲線，算出了各試樣之H鏈基因及Gapdh基因的套數。於圖6呈示將各試樣之H鏈基因的套數除以Gapdh基因的套數而進行了標準化之H鏈基因的表現量。在Hspa5啟動子之H鏈基因的mRNA表現量，在培養初期係與作為對照所使用的人類RPS7啟動子為相同程度，比人類EF1-α啟動子還低。然而，在培養中期以後，在Hspa5啟動子之H鏈基因的表現量大幅上升，大幅超出了人類RPS7啟動子、人類EF1-α啟動子之值。此mRNA表現量的經時變化係與圖5C所示之蛋白質表現量的結果為同樣的結果。由以上顯示了：在Hspa5啟動子的培養後期中之蛋白質表現量的上升係藉由啟動子活性的上升所致。
H鏈基因的引子組
HC-F：TGGCTGAACGGCAAAGAGTA(序列編號18)
HC-R：TTGGCCTTGGAGATGGTCTT(序列編號19)
Gapdh基因的引子組
Gapdh-F：GTATTGGACGCCTGGTTACCAG(序列編號20)
Gapdh-R：AGTCATACTGGAACATGTAGAC(序列編號21)
(實施例6)以水母螢光素酶表現量為指標之 藉由饋料批次培養的Hspa5啟動子之評價
6-1)水母螢光素酶表現載體的構築
於水母螢光素酶表現載體pGL4.82[hRluc/Puro](PROMEGA)的多選殖位點***Hspa5啟動子、人類RPS7啟動子、或是人類EF1-α啟動子，構築了pGL4.82-Hspa5、pGL4.82-hRPS7、或是pGL4.82-hEF1α。
具體而言，將在(3-1)製備之利用KpnI-HindIII已進行完消化的Hspa5的啟動子序列***pGL4.82[hRluc/Puro]的KpnI-HindIII位點間，而構築了pGL4.82-Hspa5。
其次，以pDSLHA4.1-hRPS7-Y為模板，而利用使用了以下所示的引子組與PrimeSTAR Max DNA聚合酶(Takara Bio)的PCR增幅人類RPS7啟動子，並利用QIAquick PCR純化套組進行了精製。將所精製之DNA片段利用XhoI-HindIII進行了消化之後，***pGL4.82[hRluc/Puro]的XhoI-HindIII位點間，而構築了pGL4.82-hRPS7。
hRPS7啟動子的引子組
hRPS7-XhoI-F：GGGGGCTCGAGTGTATATTAACAGCACATTA(序列編號22)
hRPS7-HindIII-R：GGGGGAAGCTTCGGCTTTCTCCTGGGAGAAC(序列編號23)
又，將在(3-3)製備之NheI-HindIII已進行完消化的人類EF1-α啟動子序列***pGL4.82[hRluc/Puro]的NheI-HindIII位點間，而構築了pGL4.82-hEF1α。
6-2)水母螢光素酶表現穩定庫的製作
將在(6-1)構築之水母螢光素酶表現載體pGL4.82-Hspa5、pGL4.82-hRPS7、或是pGL4.82-hEF1α利用(4-1)所記載之方法轉染至(1-2)所記載之CHO-O1細胞。基因導入1天後，將培養液離心而除去上清液，以含有嘌呤黴素(Puromycin)8μg/mL的培養基懸浮，並在6孔盤進行了12天藥物篩選培養。然後，於T-25燒瓶，接著於125mL容量的三角燒瓶，以5%CO2、37℃進行培養，製作了水母螢光素酶表現穩定庫。穩定庫係利用各個水母螢光素酶表現載體以N=3進行了製作。
6-3)藉由水母螢光素酶表現穩定庫之饋料批次培養的生產量評價
使用在(6-2)製作之水母螢光素酶表現穩定庫，而於125mL容量的三角燒瓶進行了饋料批次培養。基本培養基係使用了G13，饋料培養基係使用了F13。饋料批次針對培養之第3、4、7、9、11天的細胞，使用海腎螢光素酶檢測***(Renilla Luciferase Assay System)(PROMEGA)，而測定了水母螢光素酶的表現量。
具體而言，將培養液進行9000G×1分鐘離心而除去上清液，以PBS清洗了1次之後，使用套組附加的海腎螢光素酶檢測裂解緩衝液(Renilla Luciferase Assay Lysis Buffer)而製備了細胞溶解液。然後，使用前述套組與光度計而測定了水母螢光素酶的發光量。
將活細胞數、及每103細胞之水母螢光素酶發光量的推移分別呈示於圖7A、圖7B。培養初期的細胞中，在Hspa5啟動子的水母螢光素酶發光量係比作為對照所 使用的人類RPS7啟動子還高，且與人類EF1-α啟動子為相同程度。然而，培養的中期以後之細胞中的水母螢光素酶發光量，在Hspa5啟動子係經時性地上升了，而另一方面，在人類RPS7啟動子、人類EF1-α啟動子係大幅降低了。因此，培養第11天時間點的細胞中，在Hspa5啟動子的水母螢光素酶發光量係顯示了分別為人類RPS7啟動子、人類EF1-α啟動子的4.5、4.8倍之大的值。亦即，測試了水母螢光素酶之表現的結果，可確認到在Hspa5啟動子，與既存的人類RPS7啟動子、人類EF1-α啟動子比較而超出抗體表現系統的生產量之增強效果。由以上顯示了：於抗體以外之蛋白質的生產中，Hspa5啟動子亦為有用。
(實施例7)以在饋料批次培養的抗體表現量為指標之Hspa5啟動子長的研究探討
7-1)抗體表現載體的構築
構築了將人類化抗體基因Y表現載體pDSLHA4.1-hRPS7-Y之抗體H鏈及L鏈基因的啟動子置換為Hspa5啟動子之部分序列的pDSLHA4.1-Hspa5-2.5-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-2.0-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-1.5-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-1.1-Y、及pDSLHA4.1-Hspa5-0.6-Y。在各個表現載體，作為Hspa5啟動子之部分序列，而使用了自Hspa5之起始密碼子序列的上游約2.5、2.0、1.5、1.1、0.6kbp之核苷酸起至在緊接對應起始密碼子序列之核苷酸序列的之前之核苷酸為止的序列。
pDSLHA4.1-Hspa5-2.5-Y係藉由以下的方法所構 築。首先，以pGL4.10-Hspa5為模板，而利用使用了以下所示的引子組與PrimeSTAR Max DNA聚合酶的PCR增幅中國倉鼠Hspa5啟動子之部分序列，並利用QIAquick PCR純化套組進行了精製。將所精製之DNA片段利用NotI-XbaI進行了消化之後，***H鏈基因表現載體pDSH1.1-hRPS7-Y、及L鏈基因表現載體pDSL2.1-hRPS7-Y的NotI-NheI位點間，而分別構築了pDSH1.1-Hspa5-2.5-Y、pDSL2.1-Hspa5-2.5-Y。其次，於pDSH1.1-Hspa5-2.5-Y的AatII-HindIII間***將pDSL2.1-Hspa5-2.5-Y利用AatII-HindIII予以消化所得到的DNA片段，而構築了pDSLH3.1-Hspa5-2.5-Y。於pDSLH3.1-Hspa5-2.5-Y的表現匣上游***專利文獻2所記載之DNA元件A7，而構築了pDSLHA4.1-Hspa5-2.5-Y。利用同樣的方法，構築了pDSLHA4.1-Hspa5-2.0-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-1.5-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-1.1-Y、及pDSLHA4.1-Hspa5-0.6-Y。
Hspa5啟動子2.5kbp的引子組
Hspa5-NotI-2500F：GGGGGGCGGCCGCTGGTCGGTGGTTAAGAGCAC(序列編號24)
Hspa5-XbaI-R：GGGGGTCTAGACTTGCCGGCGCTGTGGGCCAGTGCT(序列編號15)
Hspa5啟動子2.0kbp的引子組
Hspa5-NotI-2000F：GGGGGGCGGCCGCTCCCAACTGGACACAGTAAT(序列編號25)
Hspa5-XbaI-R：GGGGGTCTAGACTTGCCGGCGCTG TGGGCCAGTGCT(序列編號15)
Hspa5啟動子1.5kbp的引子組
Hspa5-NotI-1500F：GGGGGGCGGCCGCAATTCTACCTGTACCACTCA(序列編號26)
Hspa5-XbaI-R：GGGGGTCTAGACTTGCCGGCGCTGTGGGCCAGTGCT(序列編號15)
Hspa5啟動子1.1kbp的引子組
Hspa5-NotI-1100F：GGGGGGCGGCCGCCGGGAACATTATGGGGCGAC(序列編號27)
Hspa5-XbaI-R：GGGGGTCTAGACTTGCCGGCGCTGTGGGCCAGTGCT(序列編號15)
Hspa5啟動子0.6kbp的引子組
Hspa5-NotI-600F：GGGGGGCGGCCGCGGAACTGACACGCAGACCCC(序列編號28)
Hspa5-XbaI-R：GGGGGTCTAGACTTGCCGGCGCTGTGGGCCAGTGCT(序列編號15)
7-2)人類化抗體Y表現穩定庫的製作
將在(5-1)及(7-1)構築之抗體表現載體pDSLHA4.1-hRPS7-Y、pDSLHA4.1-hEF1α-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-2.5-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-2.0-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-1.5-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-1.1-Y、或是pDSLHA4.1-Hspa5-0.6-Y利用(4-1)所記載之方法轉染至(1-2)所記載之CHO-O1細胞。然後，利用(5-2)所記載之方法進行藥物篩選培養，製作了人類化抗體Y表現穩定庫。穩定庫係利用各個抗 體表現載體以N=3進行了製作。
7-3)藉由人類化抗體Y表現穩定庫之饋料批次培養的抗體生產量評價
使用在(7-2)製作之人類化抗體Y表現穩定庫，而於125mL容量的三角燒瓶進行了饋料批次培養。基本培養基係使用了G13，饋料培養基係使用了F13。
將活細胞數、抗體生產量、1細胞每1天的抗體生產量(SPR：比生產率)的推移分別呈示於圖8A、圖8B、圖8C。意外地，在使Hspa5啟動子的長度變短成3.0kbp至0.6或是1.1kbp時，會自培養初期階段顯示高的生產性，在培養第5天的時間點，抗體生產量、1細胞每1天的抗體生產量都比作為對照所使用的人類RPS7啟動子、人類EF1-α啟動子還高。再者，無關於Hspa5啟動子的長度，而在培養的中期以後，1細胞每1天的抗體生產量上升，且培養第14天時間點之在0.6及1.1kbp的Hspa5啟動子之值都顯示了人類EF1-α啟動子的2.3倍之值。其結果，在培養第14天之0.6及1.1kbp的Hspa5啟動子之抗體生產量都超出0.5g/L，分別達到了在人類EF1-α啟動子的2.1、2.0倍之值。藉由使Hspa5啟動子的長度最適化，而使其啟動子能可發揮至最大，得到了凌駕現在所頻繁使用之啟動子的抗體生產量的結果。
7-4)人類化抗體Y表現單株之藉由饋料批次培養的抗體生產量評價
從在(7-2)使用Hspa5啟動子之部分序列0.6kbp而製 作之人類化抗體Y表現穩定庫取得單株，進行了藉由饋料批次培養的抗體生產量之評價。
首先，利用流式細胞儀而進行了高表現細胞的濃縮。具體而言，將培養液進行200G×3分鐘離心而除去上清液，以2% BSA-PBS清洗了2次之後，以2%BSA-PBS進行了再懸浮。於所得到的細胞懸浮液添加螢光異硫氰酸鹽(FITC)結合的山羊F(ab’)2片段抗人類IgG(fluorescein isothiocyanate(FITC)-conjugated Goat F(ab’)2 Fragment Anti-Human IgG)(H+L)(Beckman Coulter)，在4℃靜置30分鐘而進行了染色。然後，進行200G×3分鐘離心而除去上清液，以2%BSA-PBS清洗了2次之後，以2%BSA-PBS進行了再懸浮。將所得到的細胞懸浮液利用BD FACS Aria Fusionsorter(Becton Dickinson)而進行了分選。分選係利用以下的條件實施。最初，在取FSC-Area為橫軸、取SSC-Area為縱軸的點狀圖，進行了以SSC之值分劃為2個，再以FSC之值分劃為4個。然後，於FSC之值最小，且SSC之值小的分劃之細胞集團中，分選了顯示出高螢光強度的前5%之細胞集團。
其次，將所分選之細胞集團進行了培養之後，懸浮於軟瓊脂培養基，並接種至6孔盤，以5%CO2、37℃進行了培養。培養後，使用ClonePix 2而將人類化抗體Y高表現群落採集至96孔盤。所採集之群落係以24孔盤、6孔盤、T-25燒瓶、125mL容量的三角燒瓶依序進行了擴大培養。
針對所得到的人類化抗體Y表現單株進行批 次培養，而選擇了高表現單株。接著，針對所選擇之人類化抗體Y表現單株，於125mL容量的三角燒瓶進行了饋料批次培養。基本培養基係使用了G13，饋料培養基係使用了F13。
將活細胞數、抗體生產量、1細胞每1天的抗體生產量(SPR：比生產率)的推移分別呈示於圖9A、圖9B、圖9C。與穩定庫的情形同樣地，於多數的殖株中，在培養的中期以後，1細胞每1天的抗體生產量係上升了。又，所評價之12殖株之中，5殖株顯示2g/L以上，且在生產量最高的#48係達到了約4g/L。由以上得知：藉由使用將啟動子長進行了最適化的Hspa5啟動子，而不用評價大量的殖株亦能夠取得高生產殖株，且顯示約4g/L之非常高之生產量的殖株亦包含於其中。
(實施例8)以抗體表現量為指標之藉由饋料批次培養的人類、小鼠、大鼠Hspa5啟動子之評價
8-1)抗體表現載體的構築
構築了將人類化抗體基因Y表現載體pDSLHA4.1-hRPS7-Y之抗體H鏈及L鏈基因的啟動子置換為人類、小鼠、大鼠Hspa5啟動子的pDSLHA4.1-hHspa5-Y、pDSLHA4.1-mHspa5-Y、pDSLHA4.1-rHspa5-Y。作為Hspa5啟動子，而分別使用了自Hspa5之起始密碼子序列的上游約1.0kbp之核苷酸起至在緊接對應起始密碼子序列之核苷酸序列的之前之核苷酸為止的序列。將所選殖之人類、小鼠、大鼠Hspa5啟動子的核苷酸序列分別表示為序列表之序列編號2、 3、4。
pDSLHA4.1-hHspa5-Y係藉由以下的方法所構築。首先，以人類基因體DNA為模板，利用使用了以下所示的引子組與PrimeSTAR Max DNA聚合酶的PCR增幅人類Hspa5啟動子，並利用QIAquick PCR純化套組進行了精製。將所精製之DNA片段利用NotI-NheI進行了消化之後，***H鏈基因表現載體pDSH1.1-hRPS7-Y、及L鏈基因表現載體pDSL2.1-hRPS7-Y的NotI-NheI位點間，而分別構築了pDSH1.1-hHspa5-Y、pDSL2.1-hHspa5-Y。其次，於pDSH1.1-hHspa5-Y的AatII-HindIII間***將pDSL2.1-hHspa5-Y利用AatII-HindIII予以消化所得到的DNA片段，而構築了pDSLH3.1-hHspa5-Y。於pDSLH3.1-hHspa5-Y的表現匣上游***專利文獻2所記載之DNA元件A7，而構築了pDSLHA4.1-hHspa5-Y。利用同樣的方法，構築了pDSLHA4.1-mHspa5-Y、pDSLHA4.1-rHspa5-Y。
人類Hspa5啟動子的引子組
Hspa5-human-NotI-F：GTGTTGCGGCCGCACAGTAGGGAGGGGACTCAGAGC(序列編號29)
Hspa5-human-NheI-R：GTGGGGCTAGCCTTGCCAGCCAGTTGGGCAGCAG(序列編號30)
小鼠Hspa5啟動子的引子組
Hspa5-mouse-NotI-F：GGTGGGCGGCCGCATGGTGGAAAGTGCTCGTTTGACC(序列編號31)
Hspa5-mouse-XbaI-R：GGTGGTCTAGAGCCGGCGC TGAGGACCAGTCGCTC(序列編號32)
大鼠Hspa5啟動子的引子組
Hspa5-rat-NotI-F：GGTGAGCGGCCGCCTCAACGGAGAAGGGCTCCGGAC(序列編號33)
Hspa5-rat-XbaI-R：GGTAGGTCTAGACTTGCCGGCGCTGTGGACCAGTC(序列編號34)
8-2)人類化抗體Y表現穩定庫的製作
將在(7-1)及(8-1)構築之抗體表現載體pDSLHA4.1-Hspa5-1.1-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-0.6-Y、pDSLHA4.1-hHspa5-Y、pDSLHA4.1-mHspa5-Y、或是pDSLHA4.1-rHspa5-Y利用(4-1)所記載之方法轉染至(1-2)所記載之CHO-O1細胞。然後，利用(5-2)所記載之方法進行藥物篩選培養，製作了人類化抗體Y表現穩定庫。穩定庫係利用各個抗體表現載體以N=2進行了製作。
8-3)藉由人類化抗體Y表現穩定庫之饋料批次培養的抗體生產量評價
使用在(8-2)製作之人類化抗體Y表現穩定庫，而於125mL容量的三角燒瓶進行了饋料批次培養。基本培養基係使用了G13，饋料培養基係使用了F13。
將活細胞數、抗體生產量、1細胞每1天的抗體生產量(SPR：比生產率)的推移分別呈示於圖10A、圖10B、圖10C。即使在使用人類、小鼠、大鼠之任意一者的Hspa5啟動子而製作之穩定庫，亦與中國倉鼠的Hspa5啟動子同樣地，在培養的中期以後，1細胞每1天的抗體生產量上升，且可達成高的抗體生產量。由以上暗示了：即 使在使用了人類、小鼠、大鼠、中國倉鼠之任意一者的Hspa5啟動子的情形，亦可使抗體生產性提升，且其效果不受生物種影響。
(實施例9)以在饋料批次培養的抗體表現量為指標之Hspa5啟動子與A7之組合效果的研究探討
9-1)人類化抗體Y表現穩定庫的製作
將在(7-1)構築之含DNA元件A7的抗體表現載體pDSLHA4.1-Hspa5-1.1-Y或是pDSLHA4.1-Hspa5-0.6-Y、或不含DNA元件A7的抗體表現載體pDSLH3.1-Hspa5-1.1-Y或是pDSLH3.1-Hspa5-0.6-Y，利用(4-1)所記載之方法轉染至(1-2)所記載之CHO-O1細胞。然後，利用(5-2)所記載之方法進行藥物篩選培養，製作了人類化抗體Y表現穩定庫。穩定庫係利用各個抗體表現載體以N=2進行了製作。
9-2)藉由人類化抗體Y表現穩定庫之饋料批次培養的抗體生產量評價
使用在(9-1)製作之人類化抗體Y表現穩定庫，而於125mL容量的三角燒瓶進行了饋料批次培養。基本培養基係使用了G13，饋料培養基係使用了F13。
將活細胞數、抗體生產量、1細胞每1天的抗體生產量(SPR：比生產率)的推移分別呈示於圖11A、圖11B、圖11C。即使在使用了0.6及1.1kbp的Hspa5啟動子之任一者的情形，在含A7的抗體表現載體，係與不含A7的抗體表現載體比較，而抗體生產量、1細胞每1天的抗體生產量都較高。在培養第14天時間點之含A7的0.6 及1.1kbp之Hspa5啟動子的抗體生產量，係顯示了不含A7的0.6及1.1kbp之Hspa5啟動子的分別2.1、1.5倍之值。又，無關於A7的有無，而在培養的中期以後，1細胞每1天的抗體生產量係上升了。由以上得知：由於將Hspa5啟動子與DNA元件A7進行組合而使用，而藉著加乘效果有效地實現了高生產。
產業上的可利用性
利用本發明之外來基因的製造方法，而能夠達成使治療用蛋白質或抗體等之外來基因的生產性提升。尤其是藉由使用熱休克蛋白A5基因的啟動子之本發明的製造方法，而能夠達成使生產性提升，該熱休克蛋白A5基因的啟動子係橫跨哺乳動物細胞的培養期間而不使外來基因表現調節機能減弱，且能夠橫跨哺乳動物培養細胞的培養期間而強力表現外來基因。
[序列表之非關鍵詞文字]
序列編號1：來自中國倉鼠的Hspa5的啟動子
序列編號2：來自人類的Hspa5的啟動子
序列編號3：來自小鼠的Hspa5的啟動子
序列編號4：來自大鼠的Hspa5的啟動子
序列編號5：來自中國倉鼠的Hspa5的啟動子由自Hspa5之起始密碼子的上游約2.5kbp之核苷酸起至在緊接對應起始密碼子之核苷酸序列的之前之核苷酸為止所構成的核苷酸序列
序列編號6：來自中國倉鼠的Hspa5的啟動子由自Hspa5之起始密碼子的上游約2.0kbp之核苷酸起至在緊接對應起始密碼子之核苷酸序列的之前之核苷酸為止所構成的核苷酸序列
序列編號7：來自中國倉鼠的Hspa5的啟動子由自Hspa5之起始密碼子的上游約1.5kbp之核苷酸起至在緊接對應起始密碼子之核苷酸序列的之前之核苷酸為止所構成的核苷酸序列
序列編號8：來自中國倉鼠的Hspa5的啟動子由自Hspa5之起始密碼子的上游約1.1kbp之核苷酸起至在緊接對應起始密碼子之核苷酸序列的之前之核苷酸為止所構成的核苷酸序列
序列編號9：來自中國倉鼠的Hspa5的啟動子由自Hspa5之起始密碼子的上游約0.6kbp之核苷酸起至在緊接對應起始密碼子之核苷酸序列的之前之核苷酸為止所構成的核苷酸序列
序列編號10：Hspa5啟動子的引子Hspa5-KpnI-F
序列編號11：Hspa5啟動子的引子Hspa5-HindIII-R
序列編號12：hEF1α啟動子的引子hEF1α-NheI-F
序列編號13：hEF1α啟動子的引子hEF1α-HindIII-R
序列編號14：Hspa5啟動子的引子Hspa5-NotI-F
序列編號15：Hspa5啟動子的引子Hspa5-XbaI-R
序列編號16：hEF1α啟動子的引子hEF1α-NotI-F
序列編號17：hEF1α啟動子的引子hEF1α-NheI-R
序列編號18：人類化抗體Y之H鏈基因的引子HC-F
序列編號19：人類化抗體Y之H鏈基因的引子HC-R
序列編號20：Gapdh基因的引子Gapdh-F
序列編號21：Gapdh基因的引子Gapdh-R
序列編號22：hRPS7啟動子的引子hRPS7-XhoI-F
序列編號23：hRPS7啟動子的引子hRPS7-HindIII-R
序列編號24：Hspa5啟動子2.5kbp的引子Hspa5-NotI-2500F
序列編號25：Hspa5啟動子2.0kbp的引子Hspa5-NotI-2000F
序列編號26：Hspa5啟動子1.5kbp的引子Hspa5-NotI-1500F
序列編號27：Hspa5啟動子1.1kbp的引子Hspa5-NotI-1100F
序列編號28：Hspa5啟動子0.6kbp的引子Hspa5-NotI-600F
序列編號29：人類Hspa5啟動子的引子Hspa5-human-NotI-F
序列編號30：人類Hspa5啟動子的引子Hspa5-human-NheI-R
序列編號31：小鼠Hspa5啟動子的引子Hspa5-mouse-NotI-F
序列編號32：小鼠Hspa5啟動子的引子Hspa5-mouse-XbaI-R
序列編號33：大鼠Hspa5啟動子的引子Hspa5-rat-NotI-F
序列編號34：大鼠Hspa5啟動子的引子Hspa5-rat-XbaI-R
序列編號35：DNA元件A2之核苷酸序列
序列編號36：DNA元件A7之核苷酸序列
序列編號37：DNA元件A18之核苷酸序列
<110> 第一三共股份有限公司
<120> Hspa5的啟動子
<130> FP1713
<150> JP2016-195564
<151> 2016-10-03
<160> 37
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 2949
<212> DNA
<213> 中國倉鼠
<400> 1
<210> 2
<211> 999
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
<210> 3
<211> 1000
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 3
<210> 4
<211> 1000
<212> DNA
<213> 擬鯉(Rutilus rutilus)
<400> 4
<210> 5
<211> 2506
<212> DNA
<213> 中國倉鼠
<400> 5
<210> 6
<211> 2006
<212> DNA
<213> 中國倉鼠
<400> 6
<210> 7
<211> 1507
<212> DNA
<213> 中國倉鼠
<400> 7
<210> 8
<211> 1109
<212> DNA
<213> 中國倉鼠
<400> 8
<210> 9
<211> 609
<212> DNA
<213> 中國倉鼠
<400> 9
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-Kpnl-F
<400> 10
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-HindIII-R
<400> 11
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hEF1α-NheI-F
<400> 12
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hEF1α-HindIII-R
<400> 13
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-NotI-F
<400> 14
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-XbaI-R
<400> 15
<210> 16
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hEF1a-NotI-F
<400> 16
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hEF1a-NheI-R
<400> 17
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HC-F
<400> 18
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HC-R
<400> 19
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gapdh-F
<400> 20
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gapdh-R
<400> 21
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hRPS7-XhoI-F
<400> 22
<210> 23
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hRPS7-HindIII-R
<400> 23
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-NotI-2500F
<400> 24
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-NotI-2000F
<400> 25
<210> 26
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-NotI-1500F
<400> 26
<210> 27
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-NotI-1100F
<400> 27
<210> 28
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-NotI-600F
<400> 28
<210> 29
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-human-NotI-F
<400> 29
<210> 30
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-human-NheI-R
<400> 30
<210> 31
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HSpa5-mouse-NotI-F
<400> 31
<210> 32
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-mouse-XbaI-R
<400> 32
<210> 33
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-rat-NotI-F
<400> 33
<210> 34
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-rat-XbaI-R
<400> 34
<210> 35
<211> 8450
<212> DNA
<213> 智人
<400> 35
<210> 36
<211> 8420
<212> DNA
<213> 智人
<400> 36
<210> 37
<211> 8475
<212> DNA
<213> 智人
<400> 37

Claims (25)

  1. 一種由序列編號1所記載之核苷酸序列或該核苷酸序列之部分序列所構成的多核苷酸，其係來自中國倉鼠的Hspa5基因的啟動子，且特徵為包含由序列編號9所記載之核苷酸序列所構成的多核苷酸。
  2. 如請求項1之多核苷酸，其係由序列編號1所記載之核苷酸序列所構成。
  3. 如請求項1之多核苷酸，其係由序列編號5所記載之核苷酸序列所構成。
  4. 如請求項1之多核苷酸，其係由序列編號6所記載之核苷酸序列所構成。
  5. 如請求項1之多核苷酸，其係由序列編號7所記載之核苷酸序列所構成。
  6. 如請求項1之多核苷酸，其係由序列編號8所記載之核苷酸序列所構成。
  7. 如請求項1之多核苷酸，其係由序列編號9所記載之核苷酸序列所構成。
  8. 一種由序列表之序列編號2所記載之核苷酸序列所構成的多核苷酸，其係來自人類的Hspa5基因的啟動子。
  9. 一種由序列表之序列編號3所記載之核苷酸序列所構成的多核苷酸，其係來自小鼠的Hspa5基因的啟動子。
  10. 一種由序列表之序列編號4所記載之核苷酸序列所構成的多核苷酸，其係來自大鼠的Hspa5基因的啟動子。
  11. 一種具有啟動子活性之多核苷酸，其係由相對於如請求項1至10中任一項之核苷酸序列而具有95%以上同一性之核苷酸序列所構成的多核苷酸。
  12. 一種具有啟動子活性之多核苷酸，其係由相對於如請求項1至10中任一項之核苷酸序列而具有99%以上同一性之核苷酸序列所構成的多核苷酸。
  13. 一種具有啟動子活性之多核苷酸，其係在嚴苛的條件下與由與如請求項1至12中任一項之核苷酸序列互補的核苷酸序列所構成的多核苷酸進行雜交之多核苷酸。
  14. 一種外來基因表現單元，其係由包含如請求項1至13中任一項之多核苷酸所構成。
  15. 如請求項14之外來基因表現單元，其中外來基因為編碼多聚體蛋白質之基因。
  16. 如請求項14之外來基因表現單元，其中外來基因為編碼異多聚體蛋白質(heteromultimeric protein)之基因。
  17. 如請求項14之外來基因表現單元，其中外來基因為編碼抗體或其抗原結合片段之基因。
  18. 一種外來基因表現載體，其包含如請求項14至17中任一項之外來基因表現單元。
  19. 一種外來基因表現載體，其包含如請求項14至17中任一項之外來基因表現單元及選自下述A群之(a)至(e)所記載之多核苷酸的任一個或複數個的多核苷酸；A群(a)由序列表之序列編號35所記載之核苷酸序列所構成的多核苷酸、(b)由序列表之序列編號36所記載之核苷酸序列所構成的多核苷酸、 (c)由序列表之序列編號37所記載之核苷酸序列所構成的多核苷酸、(d)由相對於該(a)至(c)中任一者所記載之核苷酸序列而具有95%以上同一性之核苷酸序列所構成，其為具有外來基因表現亢進活性的多核苷酸、(e)由相對於該(a)至(c)中任一者所記載之核苷酸序列而具有99%以上同一性之核苷酸序列所構成，其為具有外來基因表現亢進活性的多核苷酸。
  20. 一種轉形細胞，其導入有如請求項18或19之外來基因表現載體。
  21. 如請求項20之轉形細胞，其中細胞係來自哺乳動物的培養細胞。
  22. 如請求項21之轉形細胞，其中來自哺乳動物的培養細胞為COS-1細胞、293細胞、或CHO細胞。
  23. 一種蛋白質之製造方法，其特徵為培養如請求項20至22中任一項之轉形細胞，且從培養物取得來自外來基因的蛋白質。
  24. 一種如請求項1至13中任一項之多核苷酸之用途，其目的為於轉形細胞中使外來基因表現。
  25. 一種如請求項18或19之外來基因表現載體之用途，其目的為於轉形細胞中使外來基因表現。
TW106134006A 2016-10-03 2017-10-02 Hspa5基因的啓動子 TWI812596B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016-195564 2016-10-03
JP2016195564 2016-10-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201819631A true TW201819631A (zh) 2018-06-01
TWI812596B TWI812596B (zh) 2023-08-21

Family

ID=61831803

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW106134006A TWI812596B (zh) 2016-10-03 2017-10-02 Hspa5基因的啓動子

Country Status (10)

Country Link
US (2) US11555204B2 (zh)
EP (1) EP3521428A4 (zh)
JP (2) JP7382138B2 (zh)
KR (1) KR102553990B1 (zh)
CN (1) CN109790539A (zh)
AU (1) AU2017340716A1 (zh)
CA (1) CA3039037C (zh)
SG (2) SG11201902998SA (zh)
TW (1) TWI812596B (zh)
WO (1) WO2018066492A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020032153A1 (ja) 2018-08-09 2020-02-13 第一三共株式会社 Ｈｓｐａ８遺伝子のプロモーター
TW202146432A (zh) * 2020-04-03 2021-12-16 日商第一三共股份有限公司 新基因表現單元
TW202400789A (zh) * 2022-04-26 2024-01-01 日商第一三共股份有限公司 Ｅｎｏ１基因的啟動子

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5196523A (en) * 1985-01-01 1993-03-23 The University Of Southern California Control of gene expression by glucose, calcium and temperature
JP3051411B2 (ja) 1989-03-14 2000-06-12 持田製薬株式会社 新規ｄｎａならびにそれを含有する発現プラスミド
SE468050C (sv) * 1991-03-15 1998-04-27 Pharmacia & Upjohn Ab Rekombinant derivat av human faktor VIII
US7049132B1 (en) 1999-06-28 2006-05-23 University Of Southern California Stress-responsive induction of a therapeutic agent and methods of use
EP1284290A1 (en) 2001-08-08 2003-02-19 Aventis Behring GmbH Increase of the expression levels of factor VIII by insertion of spliceable nucleotide sequences into factor VIII cDNA
CN1454900A (zh) 2002-04-29 2003-11-12 上海复旦深慧基因科技有限公司 一种新的葡萄糖及胰岛素应答元件
US20090018031A1 (en) 2006-12-07 2009-01-15 Switchgear Genomics Transcriptional regulatory elements of biological pathways tools, and methods
CN101861391A (zh) 2007-08-10 2010-10-13 韦恩州立大学 通过翻译调控基因表达***检测和调节细胞死亡的组合物和方法
US8815779B2 (en) 2009-09-16 2014-08-26 SwitchGear Genomics, Inc. Transcription biomarkers of biological responses and methods
KR101833570B1 (ko) 2010-07-07 2018-03-02 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 외래 유전자 발현 증강 활성을 갖는 ｄｎａ 요소
CN104066839B (zh) 2011-11-28 2018-02-16 第一三共株式会社 衍生自人基因的启动子
AU2014210856B2 (en) 2013-02-01 2019-10-24 Selexis S.A. Enhanced transgene expression and processing

Also Published As

Publication number Publication date
WO2018066492A1 (ja) 2018-04-12
US20190241907A1 (en) 2019-08-08
EP3521428A4 (en) 2020-06-24
CA3039037A1 (en) 2018-04-12
JP7382138B2 (ja) 2023-11-16
KR20190056378A (ko) 2019-05-24
TWI812596B (zh) 2023-08-21
KR102553990B1 (ko) 2023-07-10
EP3521428A1 (en) 2019-08-07
SG11201902998SA (en) 2019-05-30
AU2017340716A2 (en) 2019-09-05
AU2017340716A1 (en) 2019-05-02
CN109790539A (zh) 2019-05-21
JPWO2018066492A1 (ja) 2019-07-18
CA3039037C (en) 2021-08-31
US11555204B2 (en) 2023-01-17
US20230257767A1 (en) 2023-08-17
JP2022136096A (ja) 2022-09-15
SG10201912370RA (en) 2020-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230257767A1 (en) Promoter of Hspa5 Gene
US11060108B2 (en) DNA element having the activity of enhancing foreign gene expression
US9862969B2 (en) Promoter derived from human gene
TW202020160A (zh) Hspa8 基因之啟動子
WO2021201268A1 (ja) 新規遺伝子発現ユニット
WO2023210607A1 (ja) Ｅｎｏ１遺伝子のプロモーター