TW201818972A - 針對ｍｅｌｋ的單株抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於針對MELK的單株抗體。再者，本發明提供使用該抗體來診斷MELK關連病症之方法、檢測MELK蛋白質方法、判定利用MELK抑制劑治療後之藥效之方法、篩選藉由MELK抑制劑獲致之治療效果高之對象之方法、及含有該抗體之診斷用藥。

Description

針對MELK的單株抗體及其用途
本發明係關於針對MELK的單株抗體、使用該抗體來診斷MELK關連病症之方法、檢測MELK蛋白質之方法、判定利用MELK抑制劑治療後之藥效之方法、篩選藉由MELK抑制劑獲致之治療效果高之對象之方法、及含有該抗體之診斷用藥。
MELK，亦即母體胚性白胺酸拉鏈激酶(參照序列：Genbank存取編號NM_014791.3；SEQ ID NO：21)，以前鑑別為涉及哺乳動物胚胎發生之snfl/AMPK絲胺酸‧蘇胺酸激酶家族之新成員(Heyer BS et al.,Dev Dyn.1999 Aug,215(4)：344-51(非專利文獻1))。此基因顯示在幹細胞之再生(Nakano I et al.,J Cell Biol.2005 Aug 1,170(3)：413-27(非專利文獻2))、細胞周期之進行(Blot J et al.,Dev Biol.2002 Jan 15,241(2)：327-38(非專利文獻3)；Seong HA et al.,Biochem J.2002 Feb 1,361(Pt 3)：597-604(非專利文獻4))、及mRNA前驅物之剪接(splicing)(Vulsteke V et al.,J Biol Chem.2004 Mar 5,279(10)：8642-7.Epub 2003 Dec 29(非專利文獻5))中發揮重要的作用。
此外，藉由使用含有23,040個基因之跨基因體全 區之cDNA微陣列之基因表現輪廓解析，顯示MELK在乳癌受到向上調控(Lin ML et al.,Breast Cancer Res.2007,9(1)：R17(非專利文獻6)、WO2006/016525(專利文獻1)、WO2008/023841(專利文獻2))。實際上，MELK在例如肺癌細胞、膀胱癌細胞、淋巴瘤細胞、及子宮頸癌細胞等的數種癌細胞中受到向上調控(參照WO2004/031413(專利文獻3)、WO2007/013665(專利文獻4)、及WO2006/085684(專利文獻5))。由多數的人組織及癌細胞株的北方墨點解析已實際證實了MELK在大部分乳癌及乳癌細胞株顯著地以高位準過量表現，但在正常的重要臟器(心臟、肝臟、肺臟、及腎臟)則不表現(WO2006/016525(專利文獻1))。再者，由siRNA所致之MELK表現之抑制，顯示會顯著地阻礙人類乳癌細胞之增殖(專利文獻1)，抗MELK低分子抑制劑會使小鼠之乳癌異種移植片縮小(Chung S et al.,Oncotarget.2012 Dec,3(12)：1629-1640(非專利文獻7)、Chung S et al.,Oncotarget.2016 Feb 24,7(14)：18171-18182(非專利文獻8))。
因此，MELK被認為是抗癌劑之適當標靶，預測針對其之單株抗體在治療時可作為有用的診斷用藥。除了針對乳癌、惡性淋巴瘤、及結腸癌之曲妥珠單抗(Trastuzumab)之診斷用藥、利妥昔單抗(Rituximab)之診斷用藥、及貝伐單抗(Bevacizumab)之診斷用藥之類的單株抗體之臨床應用之成功例，尚有針對其他分子標靶的一些單株抗體正開發中，該等診斷效果正在評價中。該等診斷用藥，考量選擇對於治療藥有效果的患者之觀點，期待連結到更有效果的治療法。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]WO2006/016525
[專利文獻2]WO2008/023841
[專利文獻3]WO2004/031413
[專利文獻4]WO2007/013665
[專利文獻5]WO2006/085684
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Heyer BS et al., Dev Dyn. 1999 Aug, 215(4):344-51
[非專利文獻2]Nakano I et al., J Cell Biol. 2005 Aug 1, 170(3):413-27
[非專利文獻3]Blot J et al., Dev Biol. 2002 Jan 15, 241(2):327-38
[非專利文獻4]Seong HA et al., Biochem J. 2002 Feb 1, 361(Pt 3):597-604
[非專利文獻5]Vulsteke V et al., J Biol Chem. 2004 Mar 5, 279(10):8642-7. Epub 2003 Dec 29
[非專利文獻6]Lin ML et al., Breast Cancer Res. 2007, 9(1):R17
[非專利文獻7]Chung S et al., Oncotarget. 2012 Dec, 3(12):1629-1640
[非專利文獻8]Chung S et al., Oncotarget. 2016 Feb 24, 7(14):18171-18182
使用分子標靶治療藥在腫瘤治療時的診斷用藥，重要的是檢測出在大部分目標腫瘤會過度表現且在正常組織不表現、或僅會表現最小程度的細胞蛋白質。但是以專一地高感度檢測在腫瘤表現之蛋白質係有困難，獲得針對如此的蛋白質的抗體亦為困難。例如，針對考量作為抗癌劑之標靶之MELK已有一些市售抗體。但是本案發明人等利用取得之市售抗體嘗試進行MELK表現細胞之染色，結果即使在MELK之表現位準低的細胞仍會出現陽性訊息(偽陽性)。如此的免疫學上的專一性不充分的抗體，會令人擔心無法清楚地以抗體之反應強度作為指標來檢測MELK之表現位準之差異。因此本發明之課題在於提供會對於MELK專一且高感度地結合之抗體。
本案發明人等從對於小鼠以MELK抗原進行免疫而獲得之單株抗體之中尋找對於MELK專一地結合之抗體，結果成功地鑑別出能夠專一地結合於在細胞強制表現之MELK蛋白質且能夠專一地以良好感度檢測於細胞、組織內表現之內因性之MELK蛋白質之選殖體。
具體而言，本發明係關於以下：
[1]一種抗體或其抗原結合性斷片，能夠與MELK蛋白質或其部分胜肽結合， 包含重鏈可變區及輕鏈可變區中之任一者或兩者，該重鏈可變區包括：含有SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列之CDR3，該輕鏈可變區包括：含有SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列之CDR3。
[2]如[1]所述之抗體或其抗原結合性斷片，其中，包含含有SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列之輕鏈可變區中之任一者或兩者。
[3]如[1]或[2]所述之抗體或其抗原結合性斷片，專一性地認識由SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列構成之多胜肽。
[4]一種抗體或其抗原結合性斷片，針對對於MELK之專一性的結合，和如[1]至[3]中任一項所述之抗體競爭。
[5]如[1]至[4]中任一項所述之抗體或其抗原結合性斷片，係結合了親和性標記、酵素標記、放射性同位體標記、或螢光標記。
[6]一種多核苷酸，係編碼為如[1]至[5]中任一項所述之抗體或其抗原結合性斷片。
[7]一種用於診斷MELK關連病症、判定利用MELK抑制劑治療後之藥效、或篩選利用MELK抑制劑之治療效果高之對象之試藥，含有如[1]至[5]中任一項所述之抗體或其抗原結合 性斷片。
[8]一種診斷在對象中之MELK關連病症或該病症之發病因素之方法，包括以下之步驟：(a)使從該對象單離之試樣和如申請專利範圍第1至5項中任一項之抗體或其抗原結合性斷片接觸之步驟；(b)藉由檢測該抗體或其抗原結合性斷片與該試樣之結合，以檢測該試樣中之MELK蛋白質之步驟：及(c)將該試樣中之MELK蛋白質位準與對照比較之步驟，於和對照比較，MELK蛋白質位準較高時，代表該對象罹患該病症或有其發病風險。
[9]如[7]所述之試藥或如[8]所述之方法，該MELK關連病症係表現MELK之癌或子宮內膜症。
[10]如[9]所述之試藥或方法，其中，該癌係選自於由乳癌、膀胱癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病(CML)、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、***癌、腎癌、及小細胞肺癌(SCLC)構成之群組。
[11]一種檢測試樣中之MELK蛋白質之方法，包括以下之步驟：(a)使從對象單離之試樣和如[1]至[5]中任一項所述之抗體或其抗原結合性斷片接觸之步驟；及(b)檢測該抗體或其抗原結合性斷片與該試樣之結合，以檢測該試樣中之MELK蛋白質之步驟。
[12]一種判定在對象中之利用MELK抑制劑治療後之藥 效之方法，包括以下之步驟：(a)使從該對象單離之試樣接觸如[1]至[5]中任一項所述之抗體或其抗原結合性斷片之步驟；(b)藉由檢測該抗體或其抗原結合性斷片與該試樣之結合，以檢測該試樣中之MELK蛋白質之步驟；(c)將該試樣中之MELK蛋白質位準與藥劑投予前之表現位準進行比較之步驟，於和藥劑投予前相較，MELK蛋白質位準較低時，代表在該對象中有藥效。
[13]一種篩選利用MELK抑制劑之治療效果高之對象之方法，包括以下之步驟：(a)使從該對象單離之試樣接觸如[1]至[5]中任一項所述之抗體或其抗原結合性斷片之步驟；(b)藉由檢測該抗體或其抗原結合性斷片與該試樣之結合，以檢測該試樣中之MELK蛋白質之步驟；(c)將該試樣中之MELK蛋白質位準與對照進行比較之步驟，於和對照相較，MELK蛋白質位準為同程度或更高位準時，代表在該對象中之利用MELK抑制劑之治療效果高。
[14]如[8]至[13]中任一項所述之方法，其中，該試樣係從該對象單離之細胞或組織。
[15]一種製造會和MELK蛋白質或其部分胜肽結合之抗體之方法，包括以下步驟：(a)培養含有導入了如[6]所述之多核苷酸之載體之細胞之步驟；及(b)從該細胞之培養物或培養基回收該抗體之步驟。
本發明更關於以下：
[16]一種檢測MELK關連病症或該病症之發病因素之診斷標記之方法，包括以下步驟：(a)使從該對象單離之試樣接觸如[1]至[5]中任一項所述之抗體或其抗原結合性斷片之步驟；及(b)藉由檢測該抗體或抗原結合性斷片與該試樣之結合，以檢測該試樣中之MELK蛋白質作為該標記之步驟。
[17]如[1]至[5]中任一項所述之抗體或其抗原結合性斷片，係使用在診斷MELK關連病症或該病症之發病因素。
[18]一種如[1]至[5]中任一項所述之抗體或其抗原結合性斷片之用途，係用於製造用以診斷MELK關連病症或該病症之發病因素之試藥。
[19]一種檢測MELK抑制劑之藥效標記之方法，包括以下步驟：(a)使從該對象單離之試樣接觸如[1]至[5]中任一項所述之抗體或其抗原結合性斷片之步驟；及(b)藉由檢測該抗體或抗原結合性斷片與該試樣之結合，以檢測該試樣中之MELK蛋白質作為該標記之步驟。
[20]如[1]至[5]中任一項所述之抗體或其抗原結合性斷片，係用於判定利用MELK抑制劑治療後之藥效。
[21]一種如[1]至[5]項中任一項所述之抗體或其抗原結合性斷片之用途，係用於製造用以判定利用MELK抑制劑治療後之藥效之試藥。
[22]一種檢測MELK抑制劑治療應答性標記之方法，包 括以下步驟：(a)使從該對象單離之試樣接觸如[1]至[5]中任一項所述之抗體或其抗原結合性斷片之步驟；及(b)檢測該抗體或抗原結合性斷片與該試樣之結合，以檢測該試樣中之MELK蛋白質作為該標記之步驟。
[23]如[1]至[5]中任一項所述之抗體或其抗原結合性斷片，係用於篩選利用MELK抑制劑之治療效果高之對象。
[24]如[1]至[5]中任一項所述之抗體或其抗原結合性斷片之用途，係用於製造用以篩選利用MELK抑制劑之治療效果高之對象之試藥。
除了上述以外，本發明之其他目的及特徵可藉由併同附帶的圖表及實施例，閱讀以下之詳細說明而充分明瞭。但是前述發明內容及以下之詳細說明皆是例示的態樣，應理解的是，不是用於限定本發明或本發明之其他替代的態樣。尤其本發明係參照一些特定態樣在本說明書中說明，但此說明係舉例說明本發明，應理解為不作為限定本發明者。該技術領域中有通常知識者可在不脫離附帶之申請專利範圍記載之本發明之精神及範圍而想到各種變化及適用形態。同樣，本發明之其他目的、特徵、利益、及優點可由本概要及以下記載之特定態樣明瞭，該技術領域中有通常知識者可輕易地明白。如此的目的、特徵、利益、及好處，可以合併附帶的實施例、數據、圖表、及從它們得出的妥當的推論，單獨或考慮載入到本說明書之參考文獻而明瞭。
第1圖係在使用了強制表現系細胞株之免疫組織化學染色中，顯示抗MELK抗體(OTSMAb01)之專一性之顯微鏡照片。利用抗MELK抗體(OTSMAb01)進行免疫組織化學染色之結果，由MELK強制表現細胞株(MELK/293T)製作之石臘標本觀察到專一性的染色，但作為陰性對照之導入了空載體(Empty Vector)的細胞株(Mock/293T)則未被染色。另一方面，市售抗體(MELK(N449)pAb(Bioworld Technology)、MELK(HPA017214)pAb(Sigma-Aldrich))也進行免疫組織化學染色，結果MELK/293T觀察到專一性的染色，但模擬物(Mock)未被染色。又，照片下之圖顯示從免疫組織化學染色之結果算出之MELK陽性細胞佔強制表現細胞數之比例(%)。
第2圖AB係顯示在MELK之表現量相異之各種細胞株中、使用了OTSMAb01之西方墨點法的MELK表現的結果照片。PK-45P、BT-549、MDA-MB-231、A549為MELK高表現細胞株，MCF-7、Hep G2、HT-29為MELK低表現細胞株。
第2B圖係接續第2A圖。
第3A圖，第3圖AB係使用了MELK表現細胞株之免疫組織化學染色中，顯示抗MELK抗體(OTSMAb01)之專一性之顯微鏡照片。上方分格之本發明之抗MELK抗體(OTSMAb01)利用免疫組織化學染色之結果，從PK-45P、BT-549、MDA-MB-231、A549等MELK高表現細胞株製作之石臘切片觀察到有染色，但MCF-7、Hep G2、HT-29等低表現細胞株則幾乎未被染色。另一方面，中央分格、下方分格之市售抗體 (MELK(N449)pAb、MELK(HPA017214)pAb)獲得之結果中，MELK高表現細胞株、低表現細胞株皆觀察到染色。藉由使用細胞株之解析，得知相較於市售抗體，本發明之抗MELK抗體(OTSMAb01)在免疫組織化學染色法有較高專一性。又，照片下之圖，係由免疫組織化學染色之結果算出MELK陽性細胞佔各細胞株之比例(%)之圖。
第3B圖係接續第3A圖。
第4圖顯示使用了乳癌臨床檢體1~3之免疫組織化學染色與在半定量RT-PCR之表現之相關性。A：藉由使用了本發明之抗MELK抗體(OTSMAb01)之免疫組織化學染色，觀察到在全部的乳癌檢體皆為MELK陽性結果。另一方面，正常乳腺檢體幾乎未被染色。B：顯示從免疫組織化學染色之結果算出MELK陽性細胞數佔腫瘤細胞之比例之圖。C：藉由同一症例之RT-PCR得到的表現解析，獲得與免疫組織化學染色相關性之結果。藉由使用了臨床檢體之解析，得知本發明之抗MELK抗體(OTSMAb01)在免疫組織化學染色法有高專一性。
詳細說明
實施或試驗本發明之態樣時可以使用和本說明書記載的方法及材料為類似或同等任意的方法及材料，但理想之方法、裝置、及材料記載於此。但是針對本發明之材料及方法記載前，應理解本說明書記載之特定之大小、形狀、尺寸、材料、方法論、實驗方案等可依慣例的實驗法及最適化而變更，故本發明不限於此等。本記載使用之專門用語係為了說明特定之類 型或態樣，應理解並不意欲限定僅依附帶申請專利範圍限定之本發明之範圍。
本發明提供能夠專一地結合於MELK蛋白質或其部分胜肽之抗MELK單株抗體。本發明提供本發明之抗MELK單株抗體在免疫組織化學染色法之MELK蛋白質檢測有高專一性之證據。
本發明之抗MELK抗體(OTSMAb01)至少於可變區具有下列胺基酸序列。
OTSMAb01、重鏈可變區胺基酸序列(不含訊息序列)： (SEQ ID NO：7)
OTSMAb01、輕鏈可變區胺基酸序列(不含訊息序列)： (SEQ ID NO：8)
本發明之抗體亦可利用使用編碼為前述胺基酸序列之DNA之重組技術製造。
本發明之抗體，可藉由從對小鼠之免疫感作獲得之多數抗體產生融合瘤，以免疫染色法篩選選擇在強制表現細胞(陽性對照細胞)顯示陽性、在陰性對照細胞顯示陰性之和MELK有結合性之抗體以取得。針對所選擇之抗體更進一步選擇在內因性MELK表現細胞(陽性對照細胞)顯示陽性、在陰性 對照細胞顯示陰性之抗體。當與MELK之交互作用不是那麼強時，帶有弱結合力之抗體作為背景而交纏。因而藉由使用預先測定內因性MELK表現量之細胞株實施免疫染色並篩選，可以選出和目的之MELK有強結合性之抗體。
本發明之抗體會專一地結合於MELK。因此本發明之抗體，作為檢測MELK或表現MELK之細胞或組織的工具為有用。又，本發明之抗體，可利用作為和能檢測該抗體之標記結合之標記體，該標記體例如在檢測大腸癌等表現MELK之癌細胞或癌組織方面更理想。結合於本發明之抗體之標記只要是可檢測結合於MELK之抗體之標記即可，可列舉親和性標記(例如：生物素、抗生物素蛋白等)、酵素標記(例如：西洋山葵過氧化酶、鹼性磷酸酶等)、螢光標記(例如：FITC、玫瑰紅(rhodamine)等)等。
本發明之抗體在癌症治療患者之選擇時作為診斷用藥使用時，本發明之抗體可直接使用，但也可製成適合各種使用形態之組成物。
I.定義
本說明書使用之「1個(a)」、「1個(an)」及「該(the)」之用語，若無其他特明指明，係指「至少1個」。
關於物質(例如：胜肽、抗體、多核苷酸等)使用之「經單離」及「經精製」之用語，代表該物質若非經如此步驟則實質上在天然源中不含有可能含有之至少1種之物質。因此經單離或精製之抗體，係指實質上不含此抗體來源之細胞或組織源的其他細胞材料例如糖質、脂質及其他混入蛋白質的抗體。理想 態樣中，本發明之抗體係經單離或精製。
「多胜肽」及「蛋白質」之用語在本說明書可互換的使用，係指胺基酸殘基之聚合物。本用語除了可適用在天然型胺基酸聚合物，也適用在含有1個或多數個非天然型胺基酸殘基之非天然型胺基酸聚合物。非天然型胺基酸包括胺基酸類似體及胺基酸模倣體等。
「多核苷酸」、「寡核苷酸」、及「核酸」之用語，在本說明書係互換地使用，指核苷酸之聚合物。
若無特別記載，「MELK關連病症」之用語係指表現MELK之癌或子宮內膜症。
若無特別記載、「癌」之用語係指過度表現MELK基因之癌，其例包括乳癌、膀胱癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病(CML)、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、***癌、腎癌、或小細胞肺癌(SCLC)等，但不限定於此等。
本說明書使用之「抗體」之用語，意欲包括針對於指定之蛋白質或其胜肽有專一性的反應性的免疫球蛋白及其斷片。抗體可包括和其他蛋白質或標記融合之抗體、及抗體斷片。再者，本說明書中，抗體係以最廣的含意使用，具體而言，只要可顯示所望之生物學的活性，則涵蓋完整的單株抗體、多株抗體、由至少二個完整的抗體形成的多專一性抗體(例如：雙專一性抗體)、及抗體斷片。「抗體」係指全部類型(例如：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM)。
「抗體斷片」，係完整的抗體的一部分，一般包 括完整的抗體的一或多數抗原結合區或可變區。故本發明中，抗體斷片可包括完整的抗體的一或多數抗原結合部分。本說明書使用之抗體之「抗原結合部分」或「抗原結合性斷片」的用語，係指保持能夠專一地結合於抗原(例如：MELK)之能力之抗體之一或多數免疫學上有活性的斷片。抗體之抗原結合機能可由全長抗體之斷片實施而顯示。抗體斷片，例如包括Fab、Fab’、F(ab’)2、及Fv斷片、直鏈狀抗體，及單鏈抗體分子。不拘結構，抗體斷片會與由完整的抗體所辨認之抗原為相同之抗原結合。「抗體斷片」之用語，也包括會專一地和抗原結合之合成多胜肽或基因操作多胜肽，例如由輕鏈可變區構成之多胜肽、由重鏈及輕鏈之可變區構成之「Fv」斷片、輕鏈及重鏈之可變區利用胜肽連結基連結之重組單鏈多胜肽分子(「scFv蛋白質」)，及由模倣了超可變區之胺基酸殘基構成之最小辨認單元。
若無特別記載，本說明書使用之技術用語及科學用語皆有和本發明所屬技術領域之人士共通理解之用語相同之含意。
本發明中，MELK蛋白質與抗體的專一性的結合，例如可利用抗體間之競爭予以評價。具體而言，本發明之抗體，例如可將包括由SEQ ID NO：7之胺基酸序列構成之重鏈可變區、及由SEQ ID NO：8之胺基酸序列構成之輕鏈可變區之抗體作為參照抗體，來評價候選抗體之專一性。代表的參照抗體，為OTSMAb01。候選抗體對於參照抗體與人MELK蛋白質間之抗原抗體反應進行競爭的情形，可以確認候選抗體帶有和 參照抗體為同等之專一性。例如，候選抗體不存在時結合於MELK蛋白質之抗體之量，於候選抗體共存下使參照抗體與MELK蛋白質反應時，有10%、20%、30%、或40%，更佳為50%、或其以上之參照抗體之結合受到抑制的情形，可判定抗體間發生競爭。抗體間之競爭之評價，不只可使用MELK蛋白質，只要參照抗體會結合，也可使用其部分胜肽。理想的部分胜肽例如由SEQ ID NO：9之胺基酸序列構成之部分胜肽。
II.抗體之產生
本發明使用抗MELK單株抗體。該抗體可依該技術領域周知之方法提供。
本發明使用之例示的抗體產生技術，記載如下。
(i)單株抗體
單株抗體係由實質上為均勻的抗體的集團獲得。亦即，構成集團之各個抗體，除了有可能以些微量存在之天然的變異以外為相同。如此，「單株」之修飾語，係指並非和別個抗體之混合物的抗體的特徵。
例如單株抗體，可使用Kohler et al.,Nature,256：495(1975)首次記載之融合瘤法產生，或也可依重組DNA法(US4,816,567號)產生。
融合瘤法中，係將小鼠或其他適當的寄主動物，例如倉鼠等以MELK多胜肽(MELK蛋白質或其部分多胜肽)進行免疫，來誘發產生或能產生會和MELK多胜肽專一地結合之抗體的淋巴球。或將淋巴球於試管內(in vitro)以MELK多胜肽進行免疫亦可。之後，使用聚乙二醇等適當的融合劑使淋巴球 與骨髓瘤細胞融合，形成融合瘤細胞(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986))。
將所製備之融合瘤細胞接種在含有會妨礙未融合之親代骨髓瘤細胞之增殖或生存的一或多數物質之理想的適當培養基中，使其在培養基中增殖。例如：親代骨髓瘤細胞有欠缺酵素次黃嘌呤-鳥糞嘌呤磷酸基核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)時，融合瘤用之培養基一般可含有次黃嘌呤、胺喋呤、及胸苷(HAT培養基)，藉由該等物質，會妨礙HGPRT缺損細胞之增殖。
理想的骨髓瘤細胞，係指會有效率的融合，且輔助經選擇之抗體產生細胞產生安定的高位準的抗體且對於HAT培養基等培養基有感受性。理想的骨髓瘤細胞株為小鼠骨髓瘤株，例如包括來自可由Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California USA取得之MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤者，及可由American Type Culture Collection,Manassas,Virginia,USA取得之SP-2細胞或X63-Ag8-653細胞。關於人單株抗體之產生，也有人記載人骨髓瘤細胞株及小鼠-人異質骨髓瘤細胞株(Kozbor,J.Immunol.,133：300 1(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
將融合瘤細胞已增殖之培養基進行關於對於抗原之單株抗體之產生的分析。較佳為由融合瘤細胞產生之單株抗 體之結合專一性，利用免疫沈降法、或放射免疫測定法(RIA)或酵素結合免疫吸附測定(ELISA)等，以試管內結合測定來決定。
單株抗體之結合親和性例如可依照Munson et al.,Anal Biochem.107：220-39(1980)之30Scatchard分析判定。
鑑別了產生所期望的專一性、親和性、及/或活性之抗體之融合瘤細胞後，將此選殖體以極限稀釋法進行次選殖，並可依標準的方法使其增殖(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986))。適合此目的之培養基，包括例如D-MEM培養基或RPMI1640培養基。再者，融合瘤細胞也可利用動物之腹水腫瘤之類的活體內方式增殖。
由次選殖體分泌之單株抗體可精製至成為均勻。例如可依照對於一般的蛋白質使用的分離法及精製法進行抗體之分離及精製。例如：不限於此等，可適當地選用並組合親和性層析等管柱層析、過濾、超過濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳、及等電點電泳，以從培養基、腹水、或血清中適當地將抗體予以分離及單離(Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。蛋白質A管柱及蛋白質G管柱可作為親和性管柱使用。應使用之例示的蛋白質A管柱，包括例如：Hyper D、POROS、及Sepharose F.F.(Pharmacia)。
例示的層析，除了親和性層析以外，例如尚包括離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾、逆相層析、吸附層析 等(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。層析程序可依照HPLC及FPLC等液相層析進行。
編碼為單株抗體之DNA，可使用習知程序(例如藉由使用會專一地結合在編碼為小鼠抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)輕易地單離並定序。融合瘤細胞，可作為如此的DNA的理想供給源。若將DNA單離，並配置在表現載體中，然後將其轉染到其他方法不產生免疫球蛋白蛋白質之大腸菌(E.coli)細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、或骨髓瘤細胞等寄主細胞中，可達成單株抗體在重組寄主細胞中之合成。關於編碼為抗體之DNA在細菌中之重組表現之總說，包括Skerra et al.,Curr.Opinion in Immunol.,5：256-262(1993)及Pluckthun,Immunol.Revs.,130：151-188(1992)。
用以產生針對MELK顯示反應性之專一性的抗體或抗體斷片之其他方法，係指使用MELK蛋白質或其部分胜肽來篩選在細菌中表現之編碼為免疫球蛋白基因或其一部分之表現庫。例如能使用表現完全的Fab斷片、VH區、及Fv區的噬菌體表現庫使其在細菌中表現。可參照例如：Ward et al.,Nature 341：544-546(1989)；Huse et al.,Science 246：1275-1281(1989)；及McCafferty et al.,Nature 348：552-554(1990)。例如藉由使用MELK胜肽對於如此的庫進行篩選，可鑑別對於MELK有反應性之免疫球蛋白斷片。或也可為了產生抗體或其斷片，使用SCID-hu小鼠(可從Genpharm取得)。
在進一步態樣中，抗體或抗體斷片可以從使用McCafferty et al.,Nature,348：552-554(1990)記載之技術所製作之抗體噬菌體庫單離。Clackson et al.,Nature,352：624-628(1991)及Marks et al.,J MoL BioL,222：581-597(1991)中，分別記載使用噬菌體庫之小鼠抗體及人抗體之單離。之後的刊物中，記載利用鏈曳步產生高親和性(nM範圍)人抗體(Marks et al.,BioTechnology,10：779-783(1992))，及作為建構非常大之噬菌體庫之策略的組合感染及活體內重組(Waterhouse et al.,Nuc.Acids.Res.,21：2265-2266(1993))。如上所述，該等技術係可替代用以將單株抗體單離之習知單株抗體融合瘤技術的方法。
本發明提供適合MELK關連病症之診斷、利用MELK抑制劑治療後之藥效之判定、及篩選利用MELK抑制劑之治療效果高之對象之抗體。本發明成功地建立了能於免疫組織化學染色中以高專一性檢測MELK蛋白質之小鼠單株抗體選殖體(OTSMAb01)。已實際驗證此抗體選殖體使用於乳癌臨床檢體之免疫組織化學染色，則乳癌檢體會有陽性結果，正常乳腺檢體則幾乎不被染色。再者，使用市售之抗MELK抗體，由MELK高表現細胞株、低表現細胞株製作之試樣皆有染色，反觀使用本發明之抗MELK抗體時，由MELK高表現細胞株製作之試樣會專一地染色。如此，有高抗原專一性之本發明之抗體，有利於選擇MELK表現位準高的患者，甚至選擇利用MELK抑制劑所為之治療有效的可能性高之患者方面。
本發明之抗MELK小鼠單株抗體選殖體(OTSMAb01) 之重鏈可變區(H鏈V區)及輕鏈可變區(L鏈V區)之胺基酸序列，分別示於SEQ ID NO：7及8。
重鏈可變區及輕鏈可變區中含有的CDR(互補決定區)可依該技術領域中周知之方法決定。例如：Kabat等人(Kabat E.A.et al.,(1991)Sequence of Proteins of Immunological Interest.5th Edition)或Chothia等(Chothia et al.,J.Mol.Biol.(1987)196；901-917)記載之方法一般使用在CDR決定。依Kabat之定義決定之本發明之抗MELK小鼠單株抗體選殖體(OTSMAb01)之重鏈可變區之CDR1、2、3，分別示於SEQ ID NO：1、2、3，此選殖體之輕鏈可變區之CDR1、2、3，分別示於SEQ ID NO：4、5、6。
故本發明提供一種抗體或其抗原結合性斷片，係包括重鏈可變區及輕鏈可變區中任一者或兩者且可結合於MELK蛋白質或其部分胜肽的抗體或其抗原結合性斷片，該重鏈可變區包括：含有SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列之CDR3，該輕鏈可變區包括：含有SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列之CDR3。
本發明中，本發明之抗體所結合之MELK蛋白質之部分胜肽，較佳為含有相當於MELK蛋白質(SEQ ID NO：22) 之264-601位之胺基酸序列(SEQ ID NO：9)且由從SEQ ID NO：22選擇之胺基酸序列構成。更佳為本發明中，MELK蛋白質之部分胜肽可由SEQ ID NO：9之胺基酸序列構成。
上述包括「含有SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列之CDR3」之重鏈可變區之一例，係含有SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列之重鏈可變區。上述包括「含有SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列之CDR3」之輕鏈可變區之一例，係含有SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列之輕鏈可變區。
因此一態樣中，本發明提供一種抗體或其抗原結合性斷片，包括含有SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列之輕鏈可變區中之任一者或兩者。
本發明之抗體可依習知的方法製備。例如可依習知之基因重組技術將編碼為抗體多胜肽之多核苷酸***到適當的載體，將該載體載入到寄主，並使該寄主產生抗體，以製備抗體(例如參照Vandamme,A.M.et al.,Eur.J.Biochem.(1990)192,767-75)。
編碼為本發明之抗體之可變區(V區)之多核苷酸之核酸序列，可由本發明之抗體之V區之胺基酸序列推測。編碼為本發明之抗體選殖體之重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)之核酸序列分別可以使用例如：SEQ ID NO：10及11所示之核 酸序列。編碼為本發明之抗體之V區之多核苷酸，可藉由如固相技術(Beaucage SL & Iyer RP,Tetrahedron(1992)48,2223-311；Matthes et al.,EMBO J(1984)3,801-5)及寡核苷酸合成技術(Jones et al.,Nature(1986)321,522-5)之習知方法，依據序列資訊合成。
編碼為抗體V區之多核苷酸係***到含有編碼為抗體恆定(C)區之多核苷酸之表現載體。
為了產生本發明所使用之抗體，將編碼為該抗體(抗體基因)之多核苷酸***到表現載體，以使抗體基因能在表現控制要素(例如：強化子、啟動子)之控制下表現。使用表現載體對於寄主細胞進行形質轉換，使抗體表現。
於抗體基因之表現，可將編碼為抗體之H鏈之多核苷酸與編碼為L鏈之多核苷酸***個別表現載體，之後將獲得之重組表現載體對於寄主細胞進行同時形質轉換。或也可將編碼為抗體之H鏈之多核苷酸與編碼為L鏈之多核苷酸之兩者一起***到單一的表現載體，之後將獲得之重組表現載體對於寄主細胞進行形質轉換(例如：WO94/11523號)。
可依公知之方法使抗體基因表現。在哺乳類細胞表現時，可將習知的有用的啟動子、欲表現之抗體基因、及聚(A)訊息(位在相對於抗體基因之3'末端為下游)予以功能性地連結。例如：可使用人類巨細胞病毒早期基因啟動子/強化子系作為有用的啟動子/強化子系。
其他啟動子/強化子系，例如可使用來自病毒(例如：反轉錄病毒、多瘤病毒、腺病毒及猴病毒40(SV40))者，及來自哺 乳類細胞者(例如：人類伸長因子1α(HEF1α))於本發明之抗體之表現。
使用SV40啟動子/強化子系時，基因表現可依Mulligan等人(Nature(1979)277,108-14)的方法輕易地進行。使用HEF1α啟動子/強化子系時，基因表現可依Mizushima等人(Nucleic Acids Res.(1990)18,5322)的方法輕易地進行。
在大腸菌表現時，可將習知之有用的啟動子、用以使關注對象之抗體分泌之訊息序列、及抗體基因予以功能性地連結。啟動子可以使用lacZ啟動子或araB啟動子。使用lacZ啟動子時，基因表現可依Ward等人(Nature(1098)341,544-6.；FASBE J.(1992)6,2422-7)的方法進行，另一方面，使用araB啟動子時，基因表現可依Better等人(Science(1988)240,1041-3)的方法進行。
針對用於抗體分泌之訊息序列，當意欲使關注對象之抗體分泌到大腸菌之細胞周邊空間時，可使用pelB訊息序列(Lei,S.P.et al.,J.Bacteriol.(1987)169,4379-83.)。將分泌到細胞周邊空間中的抗體予以單離，之後使抗體再度折疊以成為適當的立體結構。
可使用來自病毒(例如：SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV))等之複製起點。為了使寄主細胞系之基因副本數增加，表現載體也可更含有胺基糖苷磷酸轉移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸菌黃嘌呤-鳥糞嘌呤磷酸基核糖基轉移酶(Ecogpt)基因及二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等選擇標記基因。針對本發明使用之抗體之產生，使用包括真核生物 及原核生物之細胞系的任意表現系。真核生物細胞包括動物(例如：哺乳類、昆蟲、黴菌及真菌、酵母)之樹立細胞株。原核生物細胞包括大腸菌細胞等細菌細胞。本發明使用之抗體宜在CHO細胞、COS細胞、骨髓瘤細胞、BHK細胞、Vero細胞、及HeLa細胞等哺乳類細胞中表現較佳。
然後將經形質轉換之寄主細胞於試管內或活體內培養，使關注對象之抗體產生。寄主細胞之培養可依任意公知之方法實施。本說明書能使用之培養基，也可為DMEM、MEM、RPMI1640或IMDM培養基。培養基也可含有胎牛血清(FCS)等血清補充物。
重組抗體產生時，除了使用上述寄主細胞，也可使用基因轉殖動物作為寄主。例如將抗體基因***編碼為動物之母乳中原本會產生之蛋白質(例如：β酪蛋白)之基因之預定部位，並製備融合基因。將含有已導入抗體基因之融合基因之DNA斷片注射到非人動物之胚胎，然後將此胚胎對於雌性動物導入。體內有該胚胎之該雌性動物會產下基因轉殖非人動物。關注對象之抗體會從該基因轉殖非人動物或其子孫分泌到母乳中。為了增加含有該抗體之母乳之量，也可對該基因轉殖動物投予適當的激素(Ebert,K.M.et al.,Bio/Technology(1994)12,699-702)。
可將如上述表現產生之抗體從細胞或寄主動物體單離並精製。本發明使用之抗體之單離及精製，也可對於親和性管柱進行。抗體之單離及精製可使用以往使用之其他方法，因此方法無特殊限制。例如可將各式各樣的層析、過濾、超過 濾、鹽析及透析單獨使用或組合使用，將關注對象之抗體予以單離及精製(Antibodies A Laboratory Manual.Ed.Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。
(ii)抗體斷片
為了產生抗體斷片已開發了各式各樣的技術。以往係藉由完整的抗體之蛋白質分解消化而獲得該等斷片(例如參照Morimoto et al.,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)及Brennan et al.,Science,229：81(1985))。但是該等斷片現在可藉由重組寄主細胞直接產生。例如可以從抗體噬菌體庫將抗體斷片予以單離。或可以從大腸菌直接回收Fab'-SH斷片，進行化學的偶聯，並形成F(ab')2斷片(Carter et al.,Bio/Technology 10：163-167(1992))。依其他方式，可以從重組寄主細胞培養物將F(ab')2斷片直接單離。為了產生抗體斷片之其他技術，對於該技術領域中有通常知識者係明顯。其他態樣中，最適抗體係單鏈Fv斷片(scFv)。參照WO93/16185號；US5,571,894號；及US5,587,458號。又，抗體斷片可如例如US5,641,870號記載，係「直鏈狀抗體」。如此的直鏈狀抗體斷片可有單一的專一性或雙專一性。
(iii)標記化抗體
使本發明之抗體任意地與親和性標記、酵素標記、放射性同位體標記、螢光標記、或化學發光標記結合。例如藉由在表現MELK之癌內部存在且可檢測之標記之存在，能夠判定診斷對象中是否有癌或腫瘤。又，可藉由癌內部之標記之局部性，判定病症之擴大。
適合使用的標記包括，例如：螢光素(fluorescein)及玫瑰紅等螢光標記；及冷光素酶等酵素標記。使用之可檢測之/檢測用之標記，可依使用之影像化樣式來選擇。如此的標記與抗體之結合體，可使用該技術領域公知之實驗步驟及技術製作。本發明中，本發明之抗體可於即將使用時與所望之標記結合，也可以已和標記結合之抗體之形式提供。
抗體與標記之結合體，可以使用N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸酯、亞胺基硫烷(iminothiolane，IT)、醯亞胺酯之二官能性衍生物(例如二亞胺代己二酸二甲酯鹽酸鹽(adipimidic acid dimethyl HCl))、活性酯(例如辛二酸二琥珀醯亞胺酯(disuccinimidyl suberate))、醛(例如戊二醛)、雙疊氮化合物(例如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮鹽衍生物(例如雙-(對重氮鹽基苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2,6-二異氰酸酯)、及雙-活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)等各種二官能性蛋白質偶聯劑進行製作。或可利用例如重組技術或胜肽合成製作含有抗體及標記之融合蛋白質。如此的融合蛋白質之理想例可列舉ECFP、EYFP、或EGFP等標記蛋白質與抗體之融合蛋白質。
III.MELK關連病症之診斷、利用MELK抑制劑之治療效果高之對象之篩選(治療前診斷)、或利用MELK抑制劑治療後之藥效之判定(治療後診斷)
MELK，作為MELK關連病症之診斷標記，及用以評價該病症對於MELK抑制劑之應答性及該抑制劑之藥效之標記為 有用。因此本發明之抗體，可以作為用以診斷癌等MELK關連病症、用以篩選利用MELK抑制劑之治療效果高之對象、或用以判定利用MELK抑制劑治療後之藥效之標記之檢測試藥。
更具體而言，可以利用本發明之抗體而檢測從對象單離之試樣中之MELK蛋白質，並實施MELK關連病症之診斷、利用MELK抑制劑之治療效果高之對象之篩選、或利用MELK抑制劑治療後之藥效之判定。因此本發明，提供在從對象單離之試樣中使用本發明之抗體檢測MELK蛋白質以診斷對象中之MELK關連病症或該病症之發病因素之方法、篩選利用MELK抑制劑之治療效果高之對象之方法、及判定利用MELK抑制劑治療後之藥效之方法。該等方法包括以下步驟：(a)使從對象單離之試樣與本發明之抗體或其抗原結合性斷片接觸之步驟；(b)藉由對於該抗體或其抗原結合性斷片與該試樣之結合進行檢測，以檢測該試樣中之MELK蛋白質之步驟：及(c)將該試樣中之MELK蛋白質位準與對照進行比較之步驟。
典型的態樣中，前述試樣係從前述對象單離之細胞或組織，較佳為從前述對象單離之組織。因此通常本發明之各方法皆針對從對象單離之試樣以試管內(in vitro)的方式實施。利用活組織檢查法(生檢)、採血等方法從對象將組織、細胞予以單離之方法係為公知。或也可利用經由為了治療之醫療性處置(外科手術等)而從對象取出的生物體試樣。從對象單離之細胞、組織在與抗體接觸前也可進行適當處理。例如一般而 言，從對象獲得之組織試樣可於冷凍後切片，再以醇、福馬林等進行固定而作為免疫組織學解析用的試樣。或利用福馬林等將組織試樣、培養細胞等固定後，進行石臘包埋而獲得用以進行免疫組織學解析的切片。
本發明之抗體或其抗原結合性斷片之與試樣之結合，亦即，與試樣中之抗原蛋白質之結合，可依照該技術領域中具有通常知識者公知之方法進行檢測。更具體而言，可藉由將本發明之抗體與前述試樣接觸後、利用洗淨以去除未結合於試樣中之MELK者，之後檢測殘留在試樣中之抗體，以檢測本發明之抗體與試樣中之MELK蛋白質之結合。此時抗體有直接標記時，可藉由檢測標記以檢測和MELK蛋白質結合之本發明之抗體之存在。標記若為酵素、螢光物質、發光物質、或粒子等可檢測者，則可直接檢測該等標記。此外，本發明之抗體經生物素等親和性物質(結合性物質)標記時(親和性標記)，可以利用標記抗生物素蛋白等結合伙伴來捕捉抗體之存在。或本發明之抗體未經直接標記時，可利用針對抗體之結合試藥來檢測本發明之抗體。例如，可將作為抗體結合試藥之蛋白質A、或針對抗體之抗體進行標記而利用在抗體之檢測。
MELK關連病症之診斷的情形，前述步驟(c)中，當相較於對照位準(正常對照位準，較佳為從未罹患MELK關連病症之健常對象單離之試樣中之MELK蛋白質之表現位準)，MELK蛋白質位準較高時，代表對象罹患有MELK關連病症或有其發病風險。
又，當篩選利用MELK抑制劑之治療效果高之對象時，前 述步驟(c)中，當相較於對照位準(較佳為診斷為MELK關連病症之對象之組織中之MELK蛋白質之表現位準)，MELK蛋白質位準為同程度或較高時，代表對象中之利用MELK抑制劑之治療效果高。
另一方面，判定利用MELK抑制劑治療後之藥效的情形，前述步驟(c)中，相較於對照位準(較佳為從藥劑投予前之對象單離之試樣中之MELK蛋白質之表現位準)，MELK蛋白質位準較低時，代表在對象中有藥效。
依本發明之診斷方法顯示有MELK關連病症之患者，成為利用MELK抑制劑治療之對象可能性高。因此可接續本發明之診斷方法，對於顯示有MELK關連病症之患者投予MELK抑制劑。或也可進一步對於顯示MELK抑制劑之治療效果高之患者經篩選後投予MELK抑制劑。又，接受MELK抑制劑之投予之患者中，顯示該抑制劑有治療效果時，可繼續對於相同患者投予MELK抑制劑。
亦即本發明係關於一種MELK關連病症之治療方法，包括以下步驟：利用本發明之方法鑑定選自以下之群中之任意患者，並對於該患者投予MELK抑制劑：依本發明之診斷方法顯示有MELK關連病症之患者；顯示MELK抑制劑之治療效果有高可能性之患者；及已接受MELK抑制劑之投予之患者中，該抑制劑有治療效果之患者。
本發明中，對於患者投予之MELK抑制劑可使用公知之化合物。例如阻礙MELK之酵素作用之各種化合物為公 知(WO2012/016082,WO2013/109388,Oncotarget.2012,3：1629-1640,Oncotarget.2016；7：17652-17664)。
關於本發明，從知道未罹患MELK關連病症(例如：非癌性)之生物體試樣測定之對照位準，稱為「正常對照位準」。從對象單離之試樣中的MELK蛋白質位準相較於正常對照位準為較高時，可診斷對象有應接受治療之MELK關連病症。
另一方面，從知道罹患MELK關連病症(例如：癌性)之生物體試樣測定之對照位準，稱為「病症對照位準(例如：癌性對照位準)」。從利用MELK抑制劑治療前之對象單離之試樣中的MELK蛋白質位準與病症對照位準為同程度或更高時，可診斷對象利用MELK抑制劑之治療效果高。
又，當從利用MELK抑制劑治療後之對象單離之試樣中的MELK蛋白質位準相較於藥劑投予前之同對象之病症對照位準為低時，可診斷治療有藥效，亦即，對象利用MELK抑制劑之治療效果高。
特定態樣中，也可將從應接受治療之MELK關連病症(例如癌)之器官之非罹患區域(例如：非癌性區域)獲得之正常細胞(或組織)作為正常對照使用。於其他態樣中，對照位準也可基於對於從知道病症狀態(例如：癌性或非癌性)之對象而來的試樣中之預先測定之MELK蛋白質位準進行解析而獲得之結果，利用統計方法決定。再者，對照位準，可從來自以前試驗之試樣(細胞或組織)之表現模式之資料庫獲得。評價對象之試樣為組織試樣時，宜將來自相同組織之試樣作為對照試 樣較佳。
再者，可依本發明之一態樣，將生物體試樣中之MELK蛋白質位準和從多數參照試樣所測定之多數對照位準進行比較。宜使用來自與來自對象之生物體試樣之組織型為類似之組織型之參照試樣測得之對照位準較佳。再者，宜使用病症狀態已判明之集團中的MELK蛋白質位準的基準值較佳。基準值可依該技術領域中公知之任意方法獲得。例如可將平均值+/- 2 S.D.或平均值+/- 3 S.D.之範圍作為基準值。
試樣中之MELK蛋白質位準，其位準為對照位準之例如高出10%、25%、或50%、或高超過1.1倍、超過1.5倍、超過2.0倍、超過5.0倍、超過10.0倍、或更高時，可視為高。試樣中之MELK蛋白質位準，其位準為對照位準之例如低10%、25%、或50%、或低超過1.1倍、超過1.5倍、超過2.0倍、超過5.0倍、超過10.0倍、或更低時，可視為低。
典型的態樣中，MELK關連病症係表現MELK之癌或子宮內膜症。表現MELK之癌，例如：乳癌、膀胱癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病(CML)、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、***癌、腎癌、或小細胞肺癌(SCLC)但不限定於此等。
進一步態樣中，本發明提供一種檢測MELK關連病症或該病症之發病因素之診斷標記之方法，包括使用本發明之抗體或其抗原結合性斷片檢測試樣中之MELK蛋白質以作為該診斷標記之步驟。已明白MELK在某種癌細胞中會比起正 常組織，表現更增強。因此若能夠專一地檢測MELK之表現位準，則作為和其關連之病症之診斷標記有用。在與本發明之關連中，MELK關連病症或該病症之發病因素之診斷標記，特徵為：係藉由和本發明之抗體或其抗原結合性斷片之結合而檢測之從對象單離之試樣中之MELK蛋白質，其表現位準相較於對照位準為高時，代表該對象罹患該病症或有其發病風險。在此，前述對照位準，係正常對照位準，較佳為從未罹患MELK關連病症之健常對象單離之試樣中之MELK蛋白質之表現位準。一般而言，對照位準宜為和在欲檢測診斷標記之癌細胞所由來之組織為相同之組織中之表現位準較佳。
本發明也提供用以在MELK關連病症或該病症之發病因素之診斷使用之本發明之抗體或其抗原結合性斷片。或本發明提供用以診斷MELK關連病症或該病症之發病因素之試藥之製造時使用本發明之抗體或其抗原結合性斷片之用途。
此外，本發明提供檢測MELK抑制劑治療應答性標記之方法，包括使用本發明之抗體或其抗原結合性斷片檢測作為該應答性標記之試樣中之MELK蛋白質之步驟。已知MELK在某種癌細胞中專一地表現增強，如此的癌細胞的增殖會受MELK抑制劑而抑制(WO2004/031413,WO2006/016525,WO2007/013665,WO2008/023841)。亦即，可將MELK之表現作為指標，預測針對MELK抑制劑之應答性。原因在於MELK若以高位準表現，則可以期待利用MELK抑制劑所獲致之細胞增殖抑制作用。因此若能夠專一地檢測MELK之表現位準，則作為MELK抑制劑治療應答性標記為有用。在與本發明之關連 中，MELK抑制劑治療應答性標記，係指利用與本發明之抗體或其抗原結合性斷片之結合而檢測之從對象單離之試樣中之MELK蛋白質，其特徵為：其表現位準相較於對照位準為同程度或更高時，代表對象中之利用MELK抑制劑之治療效果高。在此，前述對照位準較佳為病症對照位準，亦即從知道罹患MELK關連病症之對象之病症部位單離之試樣中之MELK蛋白質之表現位準，尤佳為從利用MELK抑制劑之治療效果高之對象在治療前單離之試樣中之MELK蛋白質之表現位準。
本發明也提供用以篩選利用MELK抑制劑之治療效果高之對象之用途的本發明之抗體或其抗原結合性斷片。或本發明提供在用以篩選利用MELK抑制劑治療效果高之對象之試藥之製造時之本發明之抗體或其抗原結合性斷片之用途。
本發明也提供檢測MELK抑制劑之藥效標記之方法，包括使用本發明之抗體或其抗原結合性斷片來檢測試樣中之MELK蛋白質作為該藥效標記之步驟。已知MELK在某種癌細胞中會專一地表現增強，如此的癌細胞之增殖會因MELK抑制劑而受抑制(WO2004/031413,WO2006/016525,WO2007/013665,WO2008/023841)。所以，有如此的癌細胞之癌組織會因MELK抑制劑而縮小或死滅。亦即可將MELK之表現位準作為指標，評價在有如此的癌細胞之對象中之MELK抑制劑之藥效。原因是若從有MELK陽性之癌細胞之組織單離之試樣中的MELK的表現位準相較於利用MELK抑制劑治療前所單離之試樣為減少，則可視為因MELK抑制劑導致MELK陽性之癌細胞減少。因此若能夠專一地檢測MELK之表現位準，則作為MELK 抑制劑之藥效標記為有用。在與本發明之關連中，MELK抑制劑之藥效標記係利用與本發明之抗體或其抗原結合性斷片之結合檢測從已經投予MELK抑制劑之對象單離之試樣中之MELK蛋白質，其特徵為：其表現位準相較於對照位準為較低時，代表該對象有MELK抑制劑之藥效。在此，前述對照位準較佳為從藥劑投予前之該對象之病症部位單離之試樣中之MELK蛋白質之表現位準。
本發明也提供用以判定利用MELK抑制劑治療後之藥效時使用之本發明之抗體或其抗原結合性斷片。或本發明提供為了判定利用MELK抑制劑治療後之藥效之試藥之製造時之本發明之抗體或其抗原結合性斷片之用途。
IV.MELK關連病症之診斷、利用MELK抑制劑之治療效果高之對象之篩選、或利用MELK抑制劑之治療後之藥效之判定用之試藥或套組
本發明提供用於MELK關連病症之診斷、利用MELK抑制劑之治療效果高之對象之篩選、或利用MELK抑制劑之治療後之藥效之判定用之試藥或套組。具體而言，該等套組包括作為MELK蛋白質之檢測試藥的本發明之抗體或其抗原結合性斷片。於一態樣，可以將本發明之診斷用藥或套組用之抗體利用螢光物質、發光物質、或放射性同位體予以標記。用以將抗體進行標記之的方法及用以對於標記抗體進行檢測的方法，係該技術領域中周知，可以將任意之標記及方法利用在本發明。
本套組可包括本發明之抗體或其抗原結合性斷片與其他標記檢測試藥之組合。本套組可更包括針對MELK之陽 性及陰性之對照試藥，及用以對於本發明之抗體進行檢測之二次抗體。例如已知會高表現MELK之細胞株之培養切片或組織試樣，可用於作為有用的陽性對照試藥。又，例如：從健常對象或非癌性組織獲得之組織試樣，可用於作為有用的陰性對照試藥。用以檢測本發明之抗體之二次抗體，宜利用螢光物質、發光物質、放射性同位體、或酵素予以標記較佳。本發明之套組也可包括緩衝液、稀釋液、濾器、針、針筒、及記載了使用說明之附帶文書(例如書面、磁帶、CD-ROM等)，從商業方面或使用者的立場方面希望使用的其他材料。該等試藥等可以保存在附標籤的容器中。適當的容器包括瓶、小玻璃瓶、及試管。容器可以由玻璃或塑膠等各種材料形成。
本發明已針對其特定之態樣在本說明書中詳細說明，但前述說明事實上係例示性地說明，應理解為係說明本發明及其理想態樣。該技術領域中有通常知識者可通過例行的實驗，由其中輕易地理解在不脫離本發明精神及範圍內進行各種變更及修正。故本發明可由上述說明規定，而意欲由附帶的申請專利範圍及它們的均等範圍所規定。
以下參照實施例對於本發明更詳細地記載。但是以下之材料、方法及實施例係為了協助該技術領域中有通常知識者製作及使用本發明之某形態，但另一方面，僅是用於說明本發明之態樣，故絕對不意欲限定本發明之範圍。該技術領域中有通常知識者可以在本發明之實施或試驗中使用和本說明書記載者為類似或同等方法及材料。
又，本說明書引用之全部先前技術文獻納入本發 明說明書中作為參考。
【實施例】
以下舉實施例對於本發明詳細說明，但是本發明不限於此等實施例。
[材料及方法]
細胞培養
製作在從GenHunter購入之人類胎兒腎細胞株293T中導入MELK表現載體而得的MELK強制表現細胞株(MELK/293T)，製作作為陰性對照之導入了空載體的細胞株(Mock/293T)。於5%CO2之加濕氣體環境中，在37℃維持於補充了10%胎牛血清(FBS)及1%盤尼西林/鏈黴素之DMEM中。從ATCC購入之人類乳癌細胞株MCF-7，於5%CO2之加濕氣體環境中，於37℃維持於補充了10%胎牛血清(FBS)、1%盤尼西林/鏈黴素、非必須胺基酸、丙酮酸鈉及胰島素之MEM中。將從JCRB購入之人類肝癌細胞株Hep G2，在5%CO2之加濕氣體環境中，於37℃維持在補充了10%胎牛血清(FBS)及1%盤尼西林/鏈黴素之DMEM中。將從東北大學加齡醫學研究所分讓之人類胰臟癌細胞株PK-45P、從大日本製藥購入之人類肺癌細胞株A549，在5%CO2之加濕氣體環境中，於37℃維持在補充了10%胎牛血清(FBS)及1%盤尼西林/鏈黴素之RPMI1640中。將從ATCC購入之人乳癌細胞株BT-549，於5%CO2之加濕氣體環境中，於37℃維持在補充了10%胎牛血清(FBS)、1%盤尼西林/鏈黴素、HEPES、丙酮酸鈉及胰島素之RPMI1640中。將從ATCC購入之人大腸癌細胞株HT-29，在5%CO2之加濕氣體環 境中，於37℃維持在補充了10%胎牛血清(FBS)及1%盤尼西林/鏈黴素之McCoy's5A中。將從ATCC購入之人乳癌細胞株MDA-MB-231，在無CO2之加濕氣體環境中，於37℃維持在補充了10%胎牛血清(FBS)及1%盤尼西林/鏈黴素之L-15中。
臨床檢體
來自外科切除之乳癌的組織試樣(福馬林固定石臘切片、冷凍組織)，及此等的對應臨床資訊，以取得書面的知情同意後，由神奈川癌症中心取得。
免疫組織化學染色(IHC)
將經福馬林固定石臘切片化的MELK/293T、Mock/293T、MCF-7、Hep G2、HT-29、PK-45P、BT-549、MDA-MB-231、A549及臨床檢體，在二甲苯中浸3分鐘3次脫石臘後，分別在100%乙醇浸1分鐘2次、在90%、70%、及50%乙醇各浸1分鐘後使其再水合。將已經為了抗原賦活處理而浸於抗原賦活液pH9(Nichirei Bioscience)之切片於125℃進行30秒溫育。溫育後在室溫放置20分鐘，以流水水洗5分鐘。以3.0%過氧化氫水浸10分鐘，實施內因性過氧化酶之阻斷，以Wash Buffer(TBS-T(Takara Bio))清洗5分鐘3次。再者，為了阻斷非專一性的反應，在切片上適當滴加蛋白質阻斷(Protein Block)液(Dako)，靜置10分鐘。於濕潤箱分別適當滴加1次抗體(OTSMAb01、MELK(N449)pAb、MELK(HPA017214)pAb)，靜置60分鐘後，以清洗緩衝液(Wash Buffer)清洗5分鐘3次。於濕潤箱適量滴加作為2次抗體之Histofine Simple Stain MAX-PO(Nichirei Bioscience)，靜置30分鐘。以清洗緩衝液， 進行5分鐘清洗3次。利用DAB基質溶液(Nichirei Bioscience)進行呈色反應。將切片浸於蘇木素(Dako)20秒，以流水洗淨。於50%、70%、及90%乙醇各浸1分鐘、及於100%乙醇浸1分鐘2次，進行脫水。最後將切片以二甲苯浸3分鐘2次進行透徹，利用Mount-Quick(DAIDO SANGYO)進行封入。
RT-PCR
臨床冷凍組織(乳癌)，係將冷凍組織片浸於TRIzol Reagent(Invitrogen)，磨碎並進行氯仿萃取。於獲得之萃取液中加入約等量的70%乙醇，使用RNeasy Mini kit(QIAGEN)萃取總RNA。使用SuperScript II Reverse Transcriptase(Invitrogen)之反轉錄酵素，利用總RNA合成cDNA。以cDNA作為模板，使用ExTaq(Takara Bio)實施PCR反應。表現解析目的基因係MELK，管家基因基因係β肌動蛋白(β-actin)。MELK，係使用MELK-1F：5'-ATGATCACCTCACGGCTA-3'(SEQ ID NO：12)、MELK-1R：5'-AGGTGTTCTGCATAAGG-3'(SEQ ID NO：13)之引子組，β肌動蛋白係使用Beta-actin Fw：5'-AGGATGCAGAAGGAGATCAC-3'(SEQ ID NO：14)、Beta-actin Re：5'-AGAAAGGGTGTAACGCAACT-3'(SEQ ID NO：15)之引子組放大。以瓊脂糖凝膠進行PCR放大產物之電泳，並比較MELK基因之表現量。
西方墨點法
從MCF-7、Hep G2、HT-29、PK-45P、BT-549、MDA-MB-231及A549以RIPA溶解緩衝液(Lysis Buffer)萃取蛋白質。將目的蛋白質以SDS聚丙烯醯胺凝膠電氣泳動(SDS-PAGE)分離。將已分離之目的蛋白質轉移到硝基纖維素(NC)。以阻斷溶液 Block-Ace(DS Pharmabio)阻斷對於膜表面之非專一性結合後，和能結合於目的蛋白質之試驗抗體一起溫育。以TBST Wash Buffer將膜上之多餘試驗抗體洗淨，然後和能結合於試驗抗體之經過氧化酶(HRP)標記之二次抗體一起溫育，以Wash Buffer洗去膜上之多餘二次抗體。以ECL西方墨點法檢測系統(GE Healthcare)，使其產生可檢測之化學發光，使用底片記錄。
[實施例1]抗MELK單株抗體之製作
(1)抗MELK抗體產生融合瘤之取得
進行人MELK蛋白質(SEQ ID NO：22)之免疫抗原區域之分析，結果採取長迴圈(loop)結構之264-601胺基酸區域(SEQ ID NO：9)，總抗原性分數(total antigenic score)良好地推移，序列專一性亦良好，故預測抗原性高(醫學生物學研究所(股)公司)。因此，為了產生MELK專一性抗體，將編碼為人MELK基因(SEQ ID NO：21)之人MELK蛋白質(SEQ ID NO：22)之264-601胺基酸區域(SEQ ID NO：9)之重組蛋白質作為免疫原。於佛洛依德佐劑(Freund Adjuvant)加入抗原胜肽50μg後、進行乳劑化，對於Balb/c小鼠(日本SLC(股)公司)之皮下進行注射，藉此以進行初次免疫。第2次以後之免疫，係藉由將同樣製備之相當於25μg抗原胜肽量對於皮下進行注射以實施。最終免疫3日後，從小鼠無菌地製備脾臟細胞，依常法以聚乙二醇法進行與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0之細胞融合。
(2)抗MELK抗體產生融合瘤之挑選
抗MELK抗體之挑選，係利用使用了表現全長MELK蛋白質(SEQ ID NO：22)之293T細胞株之免疫組織化學染色以進 行。亦即，將強制表現全長MELK蛋白質之293T細胞株進行福馬林固定石臘切片化後，實施免疫染色，挑選於MELK強制表現細胞株(MELK/293T)呈強反應之融合瘤。
針對試驗之融合瘤當中確認以高位準產生MELK專一性抗體之融合瘤選殖體OTSMAb01之免疫組織化學染色之結果如第1圖所示。如第1圖之照片及圖所示，使用OTSMAb01染色時，與市售之抗MELK多株抗體MELK(N449)pAb及MELK(HPA017214)pAb同樣，從MELK強制表現細胞株(MELK/293T)製作之石臘切片呈現染色，亦即MELK陽性細胞之比例高。另一方面，從作為陰性對照之已導入空載體(Empty Vector)之細胞株(Mock/293T)製作之石臘切片，幾乎未呈染色，顯示MELK陽性細胞之比例低。由該等結果顯示融合瘤選殖體OTSMAb01，在免疫組織化學染色，作為產生專一地檢測MELK之抗體之融合瘤為有用。
選擇此融合瘤選殖體OTSMAb01進一步用於產生實驗用之抗體。將融合瘤選殖體OTSMAb01大量培養，於2~3週後收集培養液。使用蛋白質A管柱(GE Healthcare，NJ)從培養液精製抗體。本說明書中，本發明之抗體也稱為選殖體OTSMAb01。
[實施例2]抗MELK單株抗體之專一性之評價
然後使用MELK之表現量不同的各種細胞株，評價OTSMAb01之專一性。亦即，比較使用OTSMAb01之免疫組織化學染色及西方墨點法之結果，探討是否呈因應MELK蛋白質之表現量之染色。
首先，利用使用OTSMAb01之西方墨點法，確認來自各種人癌組織之細胞株中之內因性之MELK蛋白質之表現量。如第2圖，來自人胰臟癌之細胞株PK-45P、來自人乳癌之細胞株BT-549及MDA-MB-231，及來自人肺癌之細胞株A549，為MELK高表現細胞株，來自人乳癌之細胞株MCF-7、來自人肝癌之細胞株Hep G2及來自人結腸癌之細胞株HT-29，為MELK低表現細胞株。
然後，針對從該等細胞株製作之石臘切片，使用OTSMAb01及市售之抗MELK多株抗體進行免疫組織化學染色。如第3圖，使用OTSMAb01染色時，從確認高表現MELK之細胞株PK-45P、BT-549、MDA-MB-231、及A549製作之石臘切片，確認呈染色。該等石臘切片檢測到高比例之細胞有陽性訊息。另一方面，從MELK之表現量少之細胞株MCF-7、Hep G2、HT-29製作之石臘切片，幾乎未染色，幾乎未檢測到陽性訊息。
另一方面，使用市售之抗MELK抗體MELK(N449)pAb(Bioworld Technology)、MELK(HPA017214)pAb(Sigma-Aldrich)染色時，無關乎內因性MELK蛋白質之表現量為多少，試驗之全部細胞株中有高比例之細胞檢測到訊息。所以，懷疑該等市售抗體測到的檢測結果含有偽陽性訊息。
由以上結果，明白顯示本發明之抗MELK抗體(OTSMAb01)對於為了獲得免疫組織化學染色法之試樣中之MELK蛋白質之表現量相關之檢測結果為有用工具，和市售之抗MELK抗體比較，具有能以較高專一性和MELK結合之有利性質。
[實施例3]臨床檢體中之MELK蛋白質之檢測
本發明之抗MELK抗體(OTSMAb01)之在免疫組織化學染色之專一性，使用乳癌臨床檢體進行評價。在乳癌臨床檢體1~3之腫瘤區域及非腫瘤區域之MELK之蛋白質及RNA之表現，分別使用免疫組織化學染色及半定量RT-PCR進行檢測，結果示於第4圖。如第4圖所示，在確認MELK之RNA表現之腫瘤區域，檢測到被OTSMAb01染色之細胞，亦即MELK陽性細胞，但在未確認MELK之RNA表現之非腫瘤區域，則幾乎未染色，未檢測到MELK陽性細胞。此結果顯示OTSMAb01在臨床檢體也能專一地檢測MELK蛋白質。
[實施例4]抗MELK單株抗體之可變區之胺基酸序列分析
分析本發明之抗MELK抗體(OTSMAb01)之可變區之胺基酸序列。
使用RNeasy mini kit(QIAGEN)從融合瘤OTSMAb01萃取中總RNA。使用Super Script II Reverse Transcriptase(Invitrogen)，從總RNA合成cDNA。cDNA合成用之引子如下。
重鏈3'引子之mIGCUniRv：5'-CTGGGAAGGTGTGCACAC-3'(SEQ ID NO：16)
輕鏈3'引子之mIGKRv2：5'-GTTGTTCAAGAAGCACACGAC-3'(SEQ ID NO：17)
使用5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends(Invitrogen)在cDNA末端附加dC之聚合物，使用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen)，將編碼為單株 抗體之可變區之多核苷酸放大。放大用之引子如下。引子序列中之鹼「I」代表肌苷。
重鏈5'及輕鏈5'引子之5' RACE Abridged Anchor Primer：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3'(SEQ ID NO：18)、重鏈3'引子之mIGCUniRv2：5'-TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3'(SEQ ID NO：19)，及輕鏈3'引子之mIGKNesRv2：5'-CAGATGTTAACTGCTCACTGGATGG-3'(SEQ ID NO：20)。
將PCR產物選殖到pGEM-T Easy Vector(Promega)。將***斷片區域定序，並決定OTSMAb01之可變區(不含訊息序列)之核酸序列。
小鼠單株抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區之胺基酸序列及核酸序列，依以下之方式決定。
OTSMAb01、重鏈可變區胺基酸序列(不含訊息序列)： (SEQ ID NO：7)(由SEQ ID NO：10所示之核酸序列編碼)
OTSMAb01、重鏈可變區核酸序列： (SEQ ID NO：10)
OTSMAb01、輕鏈可變區胺基酸序列(不含訊息序列)： (SEQ ID NO：8) (由SEQ ID NO：11所示之核酸序列編碼)
OTSMAb01、輕鏈可變區核酸序列： (SEQ ID NO：11)
依Kabat之定義決定之本發明之抗體(OTSMAb01)之CDR序列如下。
重鏈CDR1(CDR-H1)：DYYMH(SEQ ID NO：1)；重鏈CDR2(CDR-H2)：WIDPENGNTIYDPKFQG(SEQ ID NO：2)；重鏈CDR3(CDR-H3)：HHYSAMDY(SEQ ID NO：3)；輕鏈CDR1(CDR-L1)：RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO：4)：輕鏈CDR2(CDR-L2)：KVSNRFS(SEQ ID NO：5)；及輕鏈CDR3(CDR-L3)：SQSTYVPLT(SEQ ID NO：6)
[產業利用性]
本發明成功地製作能以高專一性檢測從臨床檢體等對象單離之試樣中的MELK蛋白質的抗MELK抗體。藉由使用本發明之抗MELK抗體，能以高感度且低背景檢測試樣中之MELK蛋白質。因此本發明之抗體對於診斷表現MELK之癌等MELK關連病症有用。又，本發明之抗體可檢測因應試樣中之MELK之表現量之MELK，故對於利用MELK抑制劑之治療效果高之對象之篩選(治療前診斷)、對象中之利用MELK抑制劑治療後之藥效之判定(治療後診斷)也有用。
<110> 腫瘤療法科學股份有限公司
<120> 針對MELK的單株抗體及其用途
<130> ONC-A1606P
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<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
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<220>
<223> VL CDR
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<213> 人造序列
<220>
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<223> L鏈可變區
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 作為免疫原之MELK斷片
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<220>
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<223> L鏈可變區核酸序列
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<220>
<223> 針對MELK之人為合成之正向引子序列
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<223> 針對beta肌動蛋白之人為合成的反向引子序列
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n為肌苷
<220>
<221> misc_feature
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<223> n為肌苷
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<223> 針對VL之人為合成之3’引子序列
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<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> CDS
<222> (185)..(2140)
<300>
<308> GenBank存取編號(Genbank acc no.)NM_014791.3
<309> 2015-09-25
<313> (1)..(2486)
<400> 21
<210> 22
<211> 651
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22

Claims (15)

  1. 一種抗體或其抗原結合性斷片，能夠與MELK蛋白質或其部分胜肽結合，包含重鏈可變區及輕鏈可變區中之任一者或兩者，該重鏈可變區包括：含有SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列之CDR3，該輕鏈可變區包括：含有SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列之CDR3。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之抗體或其抗原結合性斷片，其中，包含含有SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列之輕鏈可變區中之任一者或兩者。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之抗體或其抗原結合性斷片，專一性地認識由SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列形成之多胜肽。
  4. 一種抗體或其抗原結合性斷片，針對對於MELK之專一性的結合，和如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之抗體競爭。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之抗體或其抗原結合性斷片，係結合了親和性標記、酵素標記、放射性同 位體標記、或螢光標記。
  6. 一種多核苷酸，係編碼為如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之抗體或其抗原結合性斷片。
  7. 一種用於診斷MELK關連病症、判定利用MELK抑制劑治療後之藥效、或篩選利用MELK抑制劑之治療效果高之對象之試藥，含有如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之抗體或其抗原結合性斷片。
  8. 一種診斷在對象中之MELK關連病症或該病症之發病因素之方法，包括以下之步驟：(a)使從該對象單離之試樣和如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之抗體或其抗原結合性斷片接觸之步驟；(b)藉由檢測該抗體或其抗原結合性斷片與該試樣之結合，以檢測該試樣中之MELK蛋白質之步驟；及(c)將該試樣中之MELK蛋白質位準與對照比較之步驟，於和對照比較，MELK蛋白質位準較高時，代表該對象罹患該病症或有其發病風險之步驟。
  9. 如申請專利範圍第7項所述之試藥或如申請專利範圍第8項所述之方法，其中，該MELK關連病症係表現MELK之癌或子宮內膜症。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之試藥或方法，其中，該癌係選自於由乳癌、膀胱癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病(CML)、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、***癌、腎癌、及小細胞肺癌(SCLC)構成之群組。
  11. 一種檢測試樣中之MELK蛋白質之方法，包括以下之步驟：(a)使從對象單離之試樣和如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之抗體或其抗原結合性斷片接觸之步驟；及(b)檢測該抗體或其抗原結合性斷片與該試樣之結合，以檢測該試樣中之MELK蛋白質之步驟。
  12. 一種判定在對象中之利用MELK抑制劑治療後之藥效之方法，包括以下之步驟：(a)使從該對象單離之試樣接觸如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之抗體或其抗原結合性斷片之步驟；(b)藉由檢測該抗體或其抗原結合性斷片與該試樣之結合，以檢測該試樣中之MELK蛋白質之步驟；(c)將該試樣中之MELK蛋白質位準與藥劑投予前之表現位準進行比較之步驟，於和藥劑投予前相較，MELK蛋白質位準較低時，代表在該對象中有藥效。
  13. 一種篩選利用MELK抑制劑之治療效果高之對象之方法，包括以下之步驟：(a)使從該對象單離之試樣接觸如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之抗體或其抗原結合性斷片之步驟；(b)藉由檢測該抗體或其抗原結合性斷片與該試樣之結合，以檢測該試樣中之MELK蛋白質之步驟；(c)將該試樣中之MELK蛋白質位準與對照進行比較之步驟，於和對照相較，MELK蛋白質位準為同程度或更高位準時，代表在該對象中之利用MELK抑制劑之治療效果高之步驟。
  14. 如申請專利範圍第8至13項中任一項所述之方法，其中，該試樣係從該對象單離之細胞或組織。
  15. 一種製造會和MELK蛋白質或其部分胜肽結合之抗體之方法，包括以下步驟：(a)培養含有導入了如申請專利範圍第6項所述之多核苷酸之載體之細胞之步驟；及(b)從該細胞之培養物或培養基回收該抗體之步驟。
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