TW201817875A - ω－羥基脂肪酸生產之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種生產至少一種ω-羥基脂肪酸之方法，該方法包含：(a)使至少一種烷烴與至少一種重組的酵母細胞在水性培養基中接觸，其中該酵母細胞能夠氧化該烷烴成為對應之ω-羥基脂肪酸，且該酵母細胞包含降低的脂肪酸降解能力。

Description

ω-羥基脂肪酸生產之方法
本發明關於自至少一種烷烴生產至少一種ω-官能化羧酸之生物技術方法。該方法特別地可在乙酸鹽的存在下使用酵母細胞自至少一種烷烴生產對應之ω-羥基羧酸及/或其酯。
ω-羥基脂肪酸為很有價值的單體，其可用於合成以類聚乙烯生物為底質之塑膠的獨特家族。ω-羥基脂肪酸目前主要以需要昂貴的觸媒及苛刻的條件之化學方式生產。因此，以生物技術方式生產ω-羥基脂肪酸較佳。
有許多本技術中已知用於生產ω-羥基脂肪酸及/或其酯之生物技術方式。例如，能夠自用作為基質的羧酸生產ω-官能化羧酸之基因改造細胞先前至少已於WO2009077461及EP2322598中說明。非常類似的程序說明於使用假絲酵母(Candida)細胞之WO2011008232中，其中阻斷細胞內的β-氧化路徑且自用作為基質的脂肪酸形成ω- 官能化羧酸。該等方法具有使用脂肪酸作為起始材料的缺點。這是因為所使用之脂肪酸及其衍生物主要只能自植物及動物油或脂肪獲得。作為原料的動物脂肪仍只符合少數顧客的認同，且含有短鏈及中鏈脂肪酸的植物油很難獲得或僅生產於熱帶地區(破壞雨林的結果)。再者，特別的植物及動物油或脂肪原料具有特異性，但是限定的脂肪酸型材導致偶合產生。
WO2013024114揭示生產ω-官能化羧酸及/或其酯之方法，包括來自簡單的碳來源(諸如葡萄糖、蔗糖、***糖、木糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、澱粉、纖維素和半纖維素，但亦為甘油，或非常簡單的有機分子，諸如CO2、CO或合成氣體)之ω-羥基脂肪酸。獲得該等簡單的糖(尤其為葡萄糖)通常更貴。自簡單的碳來源生產ω-羥基脂肪酸及/或其酯之方法亦被視為複雜的，因為在此方法中所使用之細胞必須先經基因改造以增加自該等簡單的碳來源之羧酸生產。這因此增加生產成本。
陰溝假絲酵母(Candida cloacae)及熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)被發現能夠以作為唯一的碳來源之烷烴生長。例如，熱帶假絲酵母能夠氧化中鏈至長鏈烷烴以合成二羧酸。接著已知經合成之二羧酸通過β-氧化路徑降解。在具有阻斷或抑制之β-氧化路徑的熱帶假絲酵母中，二羧酸總是為主要產物且以低選擇率生產非常少量的ω-羥基脂肪酸。
在本技術中對自除了脂肪酸及/或簡單的碳以外的碳 來源生產ω-羥基脂肪酸之環保、簡單且可持續的方法因此有需求。
本發明提供氧化至少一種烷烴之方法，其中該方法為可在乙酸鹽存在下進行的生物催化方法。乙酸鹽特別地可用作為氧化烷烴以生產至少一種ω-羥基脂肪酸之共基質。在自烷烴生產ω-羥基脂肪酸之方法中使用該等基因改造細胞可增加能以輕易取得的替代用石化原料用於其生產的該等化合物之生產的靈活性。使用能夠整合烷烴轉化成ω-羥基脂肪酸的整個方式於其內的全細胞生物觸媒亦使得轉化過程更簡單，因為僅少數製程步驟涉入轉化。亦可消除ω-羥基脂肪酸生產對常使用之昂貴的碳基質(諸如脂肪酸)之依賴。
本發明提供自至少一種碳基質生產至少一種ω-羥基脂肪酸之方法，其中該方法包含： (a)使碳基質與至少一種酵母細胞在水性培養基中接觸，其中酵母細胞能夠氧化碳基質成為對應之ω-羥基脂肪酸及/或二羧酸；且酵母細胞包含降低的脂肪酸降解能力，其中水性培養基包含至少一種C1至C4有機化合物。
降低的脂肪酸降解能力特別地可為下列的結果：(i)相對於野生型細胞，至少一種涉及β-氧化路徑之酵素的表現降低；及/或(ii)在至少一種涉及β-氧化路徑之酵素中的至少一種 功能喪失突變。
C1至C4有機化合物可用作為共基質。共基質可為至少一種C1至C4有機化合物。C1至C4共基質特別地可為能量來源且可選自由下列所組成之群組：C1至C4烷烴、C1至C4醇、C1至C4醛、C1至C4羧酸、C1至C4羧酸鹽及彼等之混合物。共基質更特別地可為至少一種C2至C4有機化合物。共基質可選自由下列所組成之群組：C2至C4烷烴、C2至C4醇、C2至C4醛、C2至C4羧酸、C2至C4羧酸鹽及彼等之混合物。共基質特別地可為至少一種C2至C4烷烴。C2至C4共基質可為支鏈或非支鏈。在一個實例中，共基質為至少一種C2至C4醇。C2至C4醇可包括一元醇和多元醇。C1至C4共基質可選自由下列所組成之群組：乙酸鹽、乙酸、丙酸、丙酸鹽、乙醇、丙醇、乙二醇和甘油。在一個實例中，C1至C4有機化合物可為用作為水性培養基中的能量來源之唯一的共基質。在此實例中，水性培養基包含至少一種C1至C4有機化合物作為共基質且沒有葡萄糖。水性培養基更特別地包含未檢測出的葡萄糖。
根據本發明的任何態樣，碳基質可選自由下列所組成之群組：烷烴、脂肪醇、脂肪醛及彼等之混合物。碳基質特別地可包含7至22個碳數目。碳基質更特別地可包含8至22個、8至20個、8至19個、9至18個、10至22個、12至22個、10至20個、10至18個、10至16個、10至14個、7至14個或10至12個碳原子。碳基質甚至更特別地可為包含7至22個、10至14個、7至14個或10至12個碳原子的烷烴。
在本發明的一個態樣中，其係提供自至少一種烷烴生產至少一種ω-羥基脂肪酸之方法，該方法包含：(a)使烷烴與至少一種酵母細胞在水性培養基中接觸，其中酵母細胞能夠氧化烷烴成為對應之ω-羥基脂肪酸，且酵母細胞包含降低的脂肪酸降解能力；且其中水性培養基包含乙酸鹽。
降低的脂肪酸降解能力特別地可為下列的結果：(i)相對於野生型細胞，至少一種涉及β-氧化路徑之酵素的表現降低；及/或(ii)在至少一種涉及β-氧化路徑之酵素中的至少一種功能喪失突變。
乙酸鹽可用作為共基質。存在於包含酵母細胞之水性培養基中的乙酸鹽增加自烷烴形成ω-羥基脂肪酸之選擇率。形成ω-羥基脂肪酸之選擇率特別地可以發酵產物總重量為基準計至多70%，甚至至多75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%，亦即相對於沒有乙酸鹽存在之方法的ω-羥基脂肪酸與二羧酸的總重量。
因此，本發明之方法可為自至少一種烷烴生產至少一種ω-羥基脂肪酸之方法，其相對於沒有乙酸鹽存在於水性培養基中之方法具有增加形成ω-羥基脂肪酸之選擇率。特別在根據本發明的任何態樣之方法中，形成較少的副產物，諸如二羧酸。因此，將會有較少的起始材料浪費，使 ω-羥基脂肪酸之生產成為最有成本效益之方法。產量因此可更高及/或更多的產量可於更短的時期內獲得。這進一步導致節省的成本及時間。
如本文所使用之術語〝乙酸鹽〞係指不可避免地生成之乙酸及其鹽二者，因為如本技術中已知，由於微生物係在水性環境中起作用，所以在鹽與酸之間總是以平衡存在。乙酸鹽可用作為根據本發明的任何態樣之方法中的共基質。分子乙酸對乙酸鹽之比係取決於系統的pH，亦即在恆定的〝乙酸鹽〞濃度下較低的pH，相對於乙酸鹽之較高的分子乙酸濃度。
在根據本發明的任何態樣之水性培養基中的共基質濃度可為關鍵的態樣。共基質之濃度可選自介於80至800毫莫耳/公升、100至800、100至700、100至600、100至500、110至500、120至500、130至500、140至500、150至500、160至500、160至550、160至450、160至400、150至350毫莫耳/公升之間的範圍及類似者。
共基質特別地可為乙酸鹽。在根據本發明的任何態樣所使用之水性培養基中的乙酸鹽濃度可維持在所述及之特定濃度下。乙酸鹽特別地可以至少80毫莫耳/公升之最低濃度存在於根據本發明的任何態樣之方法的水性培養基中。存在於水性培養基中的乙酸鹽濃度更特別地可大於或等於約85毫莫耳/公升、90毫莫耳/公升、95毫莫耳/公升、100毫莫耳/公升、150毫莫耳/公升、160毫莫耳/公升、170毫莫耳/公升、180毫莫耳/公升、190毫莫耳/公升、200毫 莫耳/公升、250毫莫耳/公升、300毫莫耳/公升、350毫莫耳/公升、400毫莫耳/公升、450毫莫耳/公升、500毫莫耳/公升、550毫莫耳/公升、600毫莫耳/公升、650毫莫耳/公升、700毫莫耳/公升、750毫莫耳/公升、800毫莫耳/公升及類似者。在一個實例中，在水性培養基中的乙酸鹽濃度可低於可導致抑制根據本發明的任何態樣之酵母細胞的氧化能力之濃度。在水性培養基中的乙酸鹽濃度更特別地可大於0毫莫耳/公升。在水性培養基中的乙酸鹽濃度甚至更特別地可為可檢測的量。在水性培養基中的乙酸鹽濃度可選自介於20-800毫莫耳/公升、30至800、40至800、50至800、60至800、70至800、80至800、100至800、100至700、100至600、100至500、110至500、120至500、130至500、140至500、150至500、160至500、160至550、160至450、160至400、150至350毫莫耳/公升之間的範圍及類似者。在一個實例中，在水性培養基中的乙酸鹽濃度可不於且等於160毫莫耳/公升及/或不大於且等於500毫莫耳/公升。
如本文所使用之術語〝約〞係指在20百分比之內的變異。如本文所使用之術語〝約〞係指特別為+/-20%，更特別為+/-10%，甚至更特別為+/-5%之給定的測量或值。
技術人員能夠以本技術中已知的方法維持乙酸鹽在所欲水平下。技術人員應特別定期地測量在水性培養基中的乙酸鹽濃度且藉由添加較高或較低的乙酸鹽濃度至培養基中以據此調整乙酸鹽濃度。技術人員將能夠使用本技術中 已知的任何方法測量在水性培養基中的乙酸鹽濃度。例如，可使用乙酸鹽比色檢定套組(Sigma-Aldrich)、真空蒸餾和氣相層析術、測量傳導率、UV/可見光光譜測量及本技術中已知的其他方法。在一個實例中，乙酸鹽可使用NMR測量。乙酸鹽濃度特別地可使用半定量1H-NMR光譜法測量。可使用三甲基矽基丙酸鈉(T(M)SP)作為內部量化標準。在另一實例中，乙酸鹽濃度可使用來自R-Biopharm之酵素套組(物件編號：10148261035)依照製造商的指示測量。在一個實例中，乙酸鹽可以與水性培養基之連續進料分開的連續流動添加至水性培養基中。在另一實例中，乙酸鹽可為補足之培養基的一部分。乙酸鹽特別地可作為營養物進料的一部分或單獨進料至水性培養基中。無論採取何種路徑進料乙酸鹽至水性培養基中，技術人員應瞭解維持在水性培養基中的乙酸鹽濃度之方式。在一個實例中，在培養基中的乙酸鹽濃度可藉由每發酵約20小時補足乙酸鹽來維持。在另一實例中，補足培養基中的乙酸鹽可從培養及/或發酵過程開始起約每5、10、15、20、25、30小時進行。在另一實例中，可能不一定需要補足乙酸鹽，因為在生產ω-羥基脂肪酸之方法中可能不使用乙酸鹽。
乙酸鹽特別地可為在細胞中產生能量及還原等效物(NADH/NADPH/FADH)之共基質。此反應的共產物為二氧化碳。本文所使用之術語〝共基質〞係指可被多重基質酵素使用以進行反應的基質。例如，可消耗乙酸鹽及/或乙醇以生產能量，該能量可用於還原其他的共基質(諸如 NAD/NADP/FAD+)以分別生產NADH/NADPH/FADH。乙醇及/或乙酸鹽因此可用於維持細胞的水性培養基或細胞溶質中的NAD+/NADH、NADP+/NADPH及/或FAD+/FADH之比。反應特別地可如下：乙醯基CoA+NAD+→NADH+H2O+CO2 反應1
在一個實例中，在水性培養基中的乙酸鹽濃度在80%之反應期間維持在根據本發明的任何態樣所使用之任何濃度下。在另一實例中，可在50%、55%、60%、65%、70%、75%、85%、90%、95%或100%之反應時間內維持乙酸鹽濃度。關於此點，〝反應時間〞係指在過程發生期間的時期。反應時間特別地指當發生碳基質轉化成所欲產物ω-羥基脂肪酸及/或二羧酸時的時期。在一個實例中，反應時間係指當反應開始至當反應結束及/或完成時(亦即在碳基質用完時)的時期。在一個實例中，基質可為烷烴，且反應係在發酵器中的烷烴用完時完成且反應停止及不再以烷烴進料至發酵器中。因此，反應時間係指從轉化開始(亦即當烷烴在容器中與酵母細胞在適合的反應條件下接觸時，烷烴先轉化成可檢測量的ω-羥基脂肪酸及/或二羧酸之所欲產物時)至反應結束時(亦即當不再有碳基質(諸如烷烴)時及/或當容器中有另一阻止反應繼續的因素時)之時期。在一個實例中，反應時期可為24小時、42小時、72小時、96小時、100小時、120小時、150小時、180小時、200小時、220小時、240小時及類似者。在另一實例中，反應時期可為115、116、117、118、119、120、121小時 及類似者。
來自混合物的剩餘乙酸鹽可再使用。這特別地意指可容許所形成的ω-羥基脂肪酸積聚且接著以本技術中已知的方式分離。剩餘乙酸鹽可因此維持在反應混合物中且再使用。ω-羥基脂肪酸可以分批模式或連續模式移除。在後者的例子中，所形成的ω-羥基脂肪酸係以本技術中已知的分離步驟連續移除。
根據本發明的任何態樣之方法可包含生產乙酸鹽的早先步驟。乙酸鹽可以本技術中已知的任何方式生產，以外源性引入此化合物至至少酵母細胞中以生產ω-羥基脂肪酸。乙酸鹽特別地可自NaAc、HAc及/或類似者引入水性培養基中。
在一個實例中，NaAc可在轉化期期間進料及HAc可藉由自動pH調整而進料。如本文所使用之術語〝轉化期〞係指當微生物轉化基質成為標的發酵產物時的發酵階段。例如，轉化期可指熱帶假絲酵母ATCC20962轉化烷烴成為ω-羥基脂肪酸之發酵階段。
轉化期可接在微生物細胞週期中的生長期之後。如本文所使用之術語〝生長期〞係指當微生物的數目與微生物細胞週期中的靜止期相比而快速增加時的時期。生長期可對應於微生物細胞週期中的滯後期及指數生長期。
因此，根據本發明的任何態樣之方法可包含早先步驟：a’)生產酵母細胞。此步驟的目標可為增加細胞數。此步驟可對應於微生物細胞週期中的生長期。在此步驟中， 細胞可在至少一種能量來源(諸如基質，如葡萄糖)中培養，根據本技術中已知的方法優化生長。
在一個實例中，碳基質氧化成對應之ω-羥基脂肪酸係發生在酵母細胞的轉化期期間。在轉化期期間可不添加能量來源。在轉化期期間可先添加共基質。在酵母細胞之生長期期間已存在的能量來源，在此轉化期期間幾乎沒有可檢測量的能量來源。能量來源可選自由下列所組成之群組：葡萄糖、蔗糖、果糖、乙酸、甘油及類似者。在轉化期期間沒有可檢測出濃度的能量來源。在培養基中的能量來源濃度特別地可少於5、0.5、0.3、0.2或0.1毫莫耳/公升。在生長期期間的能量來源特別地可為葡萄糖。在根據本發明的任何態樣之轉化期，葡萄糖濃度可低於20毫莫耳/公升。特別地，在培養基中的葡萄糖濃度可少於5、0.5、0.3、0.2或0.1毫莫耳/公升。在此實例中，能量來源可與根據本發明的任何態樣之共基質不同。
在另一實例中，根據本發明的任何態樣所使用之能量來源可與所使用之共基質相同。所使用之共基質特別地可為至少一種C1-C4有機化合物且這亦可為生物體在生長期期間的能量來源。亦可為共基質的能量來源更特別地可為乙酸、甘油及類似者。
根據本發明的任何態樣之酵母細胞可用於自所有的烷烴生產ω-羥基脂肪酸，具有高的時空產量、高的碳產量及高濃度的培養上清液。由於該等優點，可促進有效的後處理。
酵母細胞可能夠氧化烷烴成為對應之ω-羥基脂肪酸。這可為野生型細胞中天然發生的性狀。此烷烴轉化成對應之ω-羥基脂肪酸所必要的酵素可為酵母細胞中之ω-氧化路徑的一部分。在一個實例中，烷烴轉化成對應之ω-羥基脂肪酸所需的必要酵素可以基因方式引入酵母細胞中。烷烴轉化成對應之ω-羥基脂肪酸所需的必要酵素可選自由下列所組成之群組：細胞色素P450羥化酶複合物(其係由細胞色素P450單加氧酶(CYP蛋白質)及伴隨的NADPH細胞色素P450還原酶(NCP)所組成)、脂肪醇氧化酶、脂肪醛脫氫酶及類似者。技術人員將能夠容易地鑑定可以重組方式引入能夠進行烷烴轉化成對應之ω-羥基脂肪酸之酵母細胞中的酵素。在另一實例中，酵母細胞可天然地包含進行烷烴氧化成對應之ω-羥基脂肪酸所必要的酵素。
酵母細胞可另外包含降低的脂肪酸降解能力。降低的脂肪酸降解能力之此特性可藉由使用本技術中熟知的重組技術之基因改造引入野生型細胞中。在一個實例中，野生型菌株熱帶假絲酵母ATCC 20336可使用本技術中已知的方法基因改造以具有降低的脂肪酸降解能力。細胞特別地可使用在Pictaggio,S(1992)Biotechnology,10：894-97中所揭示之方法改造以生產ATCC20962。在另一實例中，野生型酵母細胞可天然地包含降低/抑制的脂肪酸降解能力。例如，具有降低的脂肪酸降解能力之野生型酵母細胞可為來自解脂假絲酵母(Candida lipolytica)之菌株。菌株特別地可為在Institute of Forestry and Pedology,Academia Sinica(1979,Acta Microbiologica Sinica,19(1)：64-70中所揭示之解脂假絲酵母19-2。
如本文連同細胞一起使用的短語〝野生型〞可表示具有如野生中天然所見之形式的基因組組成(genome make-up)之細胞。該術語可應用於全細胞及個別基因。術語〝野生型〞因此亦可包括在其他方面已經基因改造(亦即關於一或多個基因)，但與關注之基因無關的細胞。術語〝野生型〞因此不包括其中關注之特異性基因的基因序列經人為使用重組方法至少部分改變的該等細胞。根據本發明的任何態樣之野生型酵母細胞因此係指不具有關於完整基因組的基因突變及/或以重組方式引起的特別基因之細胞。在一個實例中，野生型酵母細胞可包含能夠氧化烷烴成為對應之ω-羥基脂肪酸之酵素的野生型表現及/或導致酵母細胞包含降低的脂肪酸降解能力之相關酵素的野生型表現。因此，在一個實例中，關於酵素E1之野生型細胞可指在細胞中具有酵素E1的天然/未改變表現之細胞。關於與脂肪酸降解有關的酵素之野生型細胞可以相同的方式解釋且可指在細胞中具有該等特異性酵素的天然/未改變表現之細胞。在又另一實例中，野生型細胞可包含在至少一種涉及β-氧化路徑的酵素中之天然發生的功能喪失突變。野生型酵母細胞因此可包括具有天然發生的突變之酵母細胞。該等天然發生的突變可在至少一種涉及β-氧化路徑的酵素中，相對於不具有天然發生的突變之細胞，因此導致細胞具有降低的脂肪酸降解能力。在野生型細胞中的酵素 突變可導致降低的酵素表現或無功能的酵素表現。
如本文所使用之術語〝具有降低的脂肪酸降解能力〞特別地意指個別細胞將在相同的條件下以比具有正常的脂肪酸降解能力之野生型細胞更低的速率降解脂肪酸，尤其為那些自環境攝取之脂肪酸。更特別地，由於至少一種編碼涉及β-氧化路徑之酵素的基因之刪除、抑制或失活，使此細胞的脂肪酸降解更低。在一個實例中，至少一種涉及β-氧化路徑之酵素在可相比的條件下相對於個別野生型微生物中的相同酵素之活性喪失5、10、20、40、50、75、90或99%之活性。在另一實例中，根據本發明的任何態樣所使用之酵母細胞可具有野生型細胞或可相比的細胞之脂肪酸降解能力的至多例如95、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.2、0.1或0百分比之脂肪酸降解能力。
熟習本技術領域者通曉各種可用於細胞中刪除編碼酵素之基因或降低此等酵素之活性的技術，例如藉由暴露細胞於放射活性，繼而積聚或篩選所得突變體、定點引入點突變或剔除對活性酵素編碼的經細胞色素整合之基因，如在Sambrook/Fritsch/Maniatis(1989)中所述。
細胞之脂肪酸降解能力更特別地可以各種方式降低。如本文所使用之術語〝基因刪除〞意指可改造編碼基因之核酸序列，使得降低以基因編碼之活性多肽的表現。酵素表現可指在細胞中的酵素活性。例如，基因可藉由移除框內(in-frame)包含對多肽之催化活性中心編碼的序列之序 列的一部分而刪除。另一選擇地，可改變核糖體結合位點，使得核糖體不再轉譯對應之RNA。熟習本技術領域者能夠例行地測量由活細胞表現之酵素活性，該測量係使用標準的檢定法，如在酵素學教科書中所述，例如Cornish-Bowden(1995)。
脂肪酸降解可以一系列的酵素催化反應實現。首先，脂肪酸被攝收且經由涉及具有脂肪酸-CoA接合酶活性之至少一種外膜蛋白及至少一種內膜相關蛋白的運送/醯基活化機制而跨細胞膜移位。在細胞內部，欲降解之脂肪酸須經酵素催化之其他的β-氧化路徑反應。涉及β-氧化路徑之酵素的一般說明可至少揭示於Beopoulos,A.(2011)Appl Microbio Biotechnol,90：1193-1206中。第一個細胞內步驟包含通過醯基-CoA脫氫酶轉化醯基-CoA成為烯醯基-CoA。醯基-CoA脫氫酶之活性可使用本技術中已知的任何方法檢定。例如，藉由在340奈米下以分光光度法監測在100mM MOPS，pH 7.4、0.2mM烯醯基-CoA、0.4mM NAD+中的NADH濃度。所得烯醯基-CoA係經由3-羥基醯基-CoA通過以烯醯基-CoA水合酶/3-羥醯基-CoA脫氫酶催化之水合及氧化而轉化成3-酮基醯基-CoA。烯醯基-CoA水合酶/3-羥基醯基-CoA脫氫酶活性(更尤其形成產物NADH)可以分光光度法檢定，如現有技術中所述。最後，3-酮基醯基-CoA硫解酶催化3-酮基醯基-CoA***，得到乙醯基-CoA及縮短兩個碳原子的進料醯基-CoA。可檢定酮基醯基-CoA硫解酶之活性，如現有技術中所述，例如在 Antonenkov,V.,1997中。
在另一實例中，涉及β-氧化路徑之酵素可辨識作為基質的脂肪酸或其衍生物，轉化其成為代謝物，其構成β-氧化路徑的一部分。例如，醯基-CoA脫氫酶(EC 1.3.99.-)為涉及β-氧化路徑之酵素，因為其與脂肪酸-CoA交互作用且轉化脂肪酸-CoA酯成為烯醯基-CoA，其為構成β-氧化的一部分之代謝物。在另一實例中，如本文所使用之術語〝涉及β-氧化路徑之酵素〞包含來自包含醯基-CoA脫氫酶(EC 1.3.99.-)、烯醯基-CoA水合酶(EC 4.2.1.17)、3-羥基醯基-CoA脫氫酶EC 1.1.1.35)和3-酮基醯基-CoA硫解酶(EC 2.3.1.16)之群組的任何多肽。醯基-CoA合成酶(EC 6.2.1.1)可催化脂肪酸轉化成脂肪酸之CoA酯，亦即其中羧基之官能基-OH經-S-CoA置換且引入脂肪酸至β-氧化路徑之分子。在一個實例中，如本文所使用之術語〝醯基-CoA脫氫酶〞可為能夠催化醯基-CoA轉化成烯醯基-CoA之多肽，作為β-氧化路徑的一部分。如本文所使用之術語〝烯醯基-CoA水合酶〞亦可述及為3-羥基醯基-CoA脫氫酶，其係指能夠催化烯醯基-CoA通過水合及氧化而轉化成3-酮基醯基-CoA之多肽，作為β-氧化路徑的一部分。如本文所使用之術語〝酮基醯基-CoA硫解酶〞可指能夠催化3-酮基醯基-CoA***之多肽，得到縮短兩個兩個碳原子的醯基-CoA及乙醯基-CoA，作為β-氧化路徑的最後步驟。
在一個實例中，降低的脂肪酸降解能力可為相對於野生型細胞，降低至少一種選自由下列所組成之群組的酵素 之表現的結果：醯基-CoA脫氫酶、2,4-二烯醯基-CoA還原酶、烯醯基-CoA水合酶、3-酮基醯基-CoA硫解酶和醯基-輔酶A氧化酶。降低的脂肪酸降解能力亦可為至少一種選自由下列所組成之群組的酵素之功能喪失的結果：醯基-CoA脫氫酶、2,4-二烯醯基-CoA還原酶、烯醯基-CoA水合酶、3-酮基醯基-CoA硫解酶和醯基-輔酶A氧化酶。具有降低表現及/或功能喪失之酵素特別地可為醯基-輔酶A氧化酶(EC 6.2.1.3)。醯基-輔酶A氧化酶更特別地可選自由下列所組成之群組：POX1、POX2、POX3、POX4、POX5和POX6。
根據本發明的任何態樣之酵母細胞降低的脂肪酸降解能力可為至少一種涉及如上文列示之β-氧化路徑的酵素中至少一者之功能喪失突變的結果。功能喪失突變可為天然發生的現象。在另一實例中，功能喪失突變可由基因方式誘發。相對於沒有功能喪失突變的細胞，天然發生或由人工方式的功能喪失突變可導致細胞等量生產涉及β-氧化路徑之特異性酵素。然而，在細胞中的突變可導致細胞生產無功能型式的酵素。根據本發明的任何態樣之功能喪失突變通常可導致強力還原或甚至完全缺少β氧化。功能喪失突變可為導致β-氧化顯著降低的點突變、***、刪除(全部或部分)或基因置換。該等功能喪失突變可天然發生或以重組方式進行。
其中可降低脂肪酸之β-氧化的酵母菌株包括在至少一種編碼直接涉及β-氧化之酵素的基因中攜有至少一種功能 喪失突變的所有菌株。該等菌株亦包含攜有至少一種僅間接影響β-氧化之功能喪失突變的所有菌株，包括通過生物合成及過氧小體的功能之影響。根據本發明的任何態樣之該等細胞可具有在涉及β-氧化路徑的酵素中至少一者之突變的組合或在超過一種涉及β-氧化路徑的酵素中之突變的組合。在一個實例中，根據本發明的任何態樣之酵母細胞可在至少一種選自由下列所組成之群組的基因中攜有至少一種功能喪失突變：POX1、POX2、POX3、POX4、POX5、POX6、MFE1和POT1。此突變可以天然或重組方式發生於基因中。
根據本發明的任何態樣所使用之酵母細胞可能夠轉化至少一種烷烴成為對應之ω-羥基脂肪酸。在一個實例中，根據本發明的任何態樣之酵母細胞可具有一次(primary)或單一端(monoterminal)氧化烷烴(尤其為正烷烴)的能力。
根據本發明的任何態樣之酵母細胞可選自由下列所組成之群組：假絲酵母、蘇草酵母(Yarrowia)、畢赤酵母(Pichia)、球擬酵母(Torulopsis)、紅酵母(Rhodotorula)和威克酵母(Wickerhamiella)。酵母細胞特別地可選自由下列所組成之群組：熱帶假絲酵母、陰溝假絲酵母、解脂蘇草酵母(Yarrowia lipolytica)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、黏紅酵母(Rhodotorula glutinis)、擬威克酵母(Wickerhamiella domercqiae)及類似者。
在一個實例中，酵母細胞具有阻斷或抑制之β-氧化路 徑。此特性可為天然存在於細胞中或可以本技術中已知的基因方式引入。在另一實例中，細胞可為熱帶假絲酵母ATCC 20962菌株或具有存取編號CGMCC 14251之解脂蘇草酵母C122菌株(在2017年6月19日由中國北京朝陽區100101北辰西路1號(No.1 Beichen West Road,Chaoyang District,Beijing 100101,China)的中國科學院(Chinese Academy of Sciences)，微生物研究所(Institute of Microbiology)的中國普通微生物菌種保藏中心(China General Microbiological Culture Collection Center)寄存)。解脂蘇草酵母CGMCC 14251具有下列表現型：其不可在以烷烴(諸如十二烷)或脂肪酸(諸如十二烷酸)作為單獨的碳來源之最低營養培養基(minimum medium)中生長。
在一個特別的實例中，自熱帶假絲酵母ATCC20336所衍生之菌株(如熱帶假絲酵母ATCC20962)可用於生產ω-羥基脂肪酸。熱帶假絲酵母ATCC20962為其中β-氧化路徑係藉由破壞編碼醯基-輔酶A氧化酶之POX4及POX5基因而阻斷之菌株。
根據本發明的任何態樣所使用之酵素可為重組體。如本文所使用之術語〝重組體〞係指分子或經此分子編碼，特別為多肽或核酸，其本身不天然發生，但為基因工程的結果，或係指包含重組分子之細胞。例如，若核酸分子包含與編碼催化活性多肽的序列功能性連結之啟動子且啟動子已經工程化，使得相對於包含原始未改變之核酸分子的對應之野生型細胞中的多肽水平，催化活性多肽過度表 現，則核酸分子為重組體。
技術人員將能夠使用本技術中已知的任何方法基因改造細胞或微生物。根據本發明的任何態樣，基因改造細胞可經基因改造，使得其在限定時間間隔內(在2小時內，特別在8小時或24小時內)形成比野生型細胞多至少一倍或兩倍，尤其為至少10倍、至少100倍、至少1000倍或至少10000倍的胺基酸。產物形成的增加可例如藉由將根據本發明的任何態樣之細胞及野生型細胞分別單獨在相同的條件下(相同的細胞密度、相同的營養培養基、相同的培養條件)於適合的營養培養基中培養指定的時間間隔且接著測定在營養培養基中之標的產物(ω羥基脂肪酸)的量而測定。
基因改造細胞或微生物可在基因上不同於野生型細胞或微生物。在根據本發明的任何態樣之基因改造微生物與野生型微生物之間的基因差別可為存在於基因改造微生物中的完整基因、胺基酸、核苷酸等，該等可能不存在於野生型微生物中。根據本發明的任何態樣之細胞可根據本技術中已知的任何方法經基因轉變。細胞特別地可根據WO2013024114中所揭示之方法生產。
在相同的上下文中，短語〝降低的酵素Ex活性〞與參考本發明的任何態樣所使用之短語〝降低的酵素Ex表現〞可交換使用，可瞭解其意指活性降低至少0.5，特別為至少0.1，更特別為至少0.01，甚至更特別為至少0.001，且最特別為至少0.0001倍。短語〝降低的活性〞亦包含未檢 測出的活性(〝零活性〞)。降低特定酵素的活性可例如藉由選擇性突變或熟習本技術領域者已知用於降低特定酵素的活性之其他措施來實現。熟習本技術領域者特別找到藉助於中斷特異性基因以改造及降低蛋白質表現且伴隨降低的酵素活性之指導，例如至少在Dubeau等人於2009年、Singh & Röhm於2008年、Lee等人於2009年之指導及類似者。降低在根據本發明的任何態樣之細胞中的酵素活性可藉由改造包含核酸序列之一的基因來達成，其中改造係選自包含由下列所組成之群組：***外來DNA於基因中、刪除基因的至少一部分、在基因序列中的點突變，RNA干擾(siRNA)、反義RNA或改造(***、刪除或點突變)調節序列(諸如啟動子和終止子)或在基因側翼的核糖體結合位點。
應瞭解外來DNA就此點意指〝外來〞至基因(且不是至生物體)的任何DNA序列，亦即內源性DNA序列亦可就此點作為〝外來DNA〞起作用。關於此點，特別佳的是使基因以選擇標記基因的而中斷，因此外來DNA為選擇標記基因，其中***較佳地藉由在基因座中的同源重組而實現。
上文述及與所有下文述及之酵素及基因的表現係藉助於1維和2維蛋白質凝膠分離，接著以適當的評估軟體經光學鑑定在凝膠中的蛋白質濃度而測定。
若酵素活性的降低唯獨基於降低對應之基因表現，則降低的酵素活性之量化可簡單地藉由比較在野生型與基因改造細胞之間的1維或2維蛋白質凝膠分離而測定。常用於 製備具有細菌的蛋白質凝膠及鑑定蛋白質之方法為Hermann等人所述之程序(Electrophoresis,22：1712-23(2001)。蛋白質濃度亦可藉由對欲測定之蛋白質具有特異性之抗體的西方點墨雜交法(Sambrook等人之Molecular Cloning：a laboratory manual,2nd Ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.USA,1989)，接著以用於濃度測定的適當軟體之光學評估(Lohaus和Meyer之(1989)Biospektrum,5：32-39；Lottspeich之(1999),Angewandte Chemie 111：2630-2647)進行分析。當以欲測定之酵素活性催化之反應的可能產物可在微生物中快速代謝，或者在野生型中的活性本身太低而使該方法不可能適當地測定以生產形成為基準測定之酵素活性時，則上述方法亦總是一個選項。
在整個本說明書中所提及之與本發明有關而陳述之存取編號係對應於2011年07月26日的NCBI ProteinBank資料庫登錄；通常登錄之版本編號係以〝數字〞識別，諸如〝.1〞。
所有陳述之百分比(%)為質量百分比，除非另有其他陳述。
烷烴為飽和烴，其係取決於碳原子數目及烷烴結構(亦即支鏈、直鏈或環等)而具有各種應用。烷烴(在技術上總是非環或開環化合物)具有化學通式CnH2n+2。根據本發明的任何態樣所使用之烷烴可為具有3至22、6至18或8至14個碳原子的未經取代之烷烴。烷烴特別地可為非支鏈。 烷烴更特別地可選自由下列所組成之群組：辛烷、癸烷、十二烷和十四烷。根據本發明的任何態樣所使用之烷烴甚至更特別地可包含至少6個C原子。烷烴特別地可選自由下列所組成之群組：C7-C22烷烴。烷烴更特別地可選自由下列所組成之群組：C8-C22、C8-C20、C8-C18、C8-C16、C10-C20、C10-C18、C10-C16、C10-C14、C10-C12烷烴及類似者。烷烴甚至更特別地可選自由下列所組成之群組：C10-C12烷烴及類似者。在一個實例中，根據本發明的任何態樣所使用之烷烴可選自由下列所組成之群組：癸烷、十一烷、十二烷及類似者。
根據本發明的任何態樣之方法的ω-羥基脂肪酸之選擇率可以發酵產物的總重量(亦即ω-羥基脂肪酸與二羧酸的總重量)為基準計至多70%，甚至至多75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。
因此，根據本發明的任何態樣之方法提供使用簡單的微生物(諸如酵母細胞，特別為熱帶假絲酵母或解脂蘇草酵母)自烷烴發酵以達成選擇性生產ω-羥基脂肪酸之簡單且有效的方式。可以不需要繁瑣的基因改造。可選擇的優勢產物為代替二羧酸之ω-羥基脂肪酸。
如本文所使用之術語〝接觸〞意指在步驟(a)中造成根據本發明的任何態樣之細胞與包含烷烴及/或乙酸鹽的培養基之間的直接接觸。例如，細胞及包含烷烴及/或乙酸鹽的培養基在步驟(a)中可在不同的隔區中。烷烴特別地可 呈氣態且添加至包含根據本發明的任何態樣之細胞的培養基中。
根據本發明的任何態樣之方法可為批式培養、進料批式培養或半連續式發酵。在一個實例中，該方法為進料批式培養。根據本發明的任何態樣，發酵可在通氣的培養條件下進行。
根據本發明之方法對發酵條件沒有特定的要求，如培養基、pH值或發酵時間，該等皆可為慣例的條件。在一個實例中，根據本發明的任何態樣之方法可在具有pH介於5與8、5.5與7之間的水性培養基中進行。壓力可介於1與10巴之間。
術語〝水性溶液〞或〝培養基〞包含任何包含水的溶液，主要以水作為溶劑，可使用該溶液保持根據本發明的任何態樣之細胞至少暫時地呈代謝活性及/或活力狀態，且包含任何額外的基質，若此等為必要的。熟習本技術領域者通曉許多水性溶液之製備，該水性溶液通常稱為可用於保持細胞的培養基。有利的是使用最低營養培養基作為水性溶液，亦即合理簡單的組成之培養基，與複合培養基對比，其僅包含保持細胞呈代謝活性及/或活力狀態必需的最低設定之鹽及營養物，以避免產物受到不想要的副產物之不必要污染。例如，M9培養基可用作為最低營養培養基。細胞係經碳來源培育足夠生產所欲產物之充份長的時間。例如，至少1、2、4、5、10或20小時。所選擇的溫度必須使得根據本發明的任何態樣之細胞維持催化能力及 /或代謝活性，例如10至42℃，較佳為30至40℃，特別為32至38℃。
淬取根據本發明的任何態樣之ω-羥基脂肪酸的方式可包括水性兩相系統(例如包含聚乙二醇)、毛細管電解、層析數及類似者。在一個實例中，當使用層析數作為淬取方式時，可使用離子交換管柱。在另一實例中，胺基酸可使用pH位移而沈澱。技術人員可以簡單的嘗試錯誤法容易地鑑定最適合於淬取ω-羥基脂肪酸的方式。
根據本發明的另一態樣，其係提供酵母細胞在水性培養基中自至少一種烷烴生產至少一種ω-羥基脂肪酸之用途，其中酵母細胞包含降低的脂肪酸降解能力；且水性培養基包含用作為共基質的乙酸鹽。
根據本發明另外的態樣，根據本發明的任何態樣所生產之ω-羥基脂肪酸可用作為聚醯胺(特別為聚醯胺-12)生產之原料。在WO/2009/077461中所揭示之方法特別地可用於自根據本發明的任何態樣所生產之ω-羥基脂肪酸選擇性地生產聚醯胺-12。
根據本發明的一個態樣，其係提供生產聚醯胺之方法，其包含：(i)藉由本技術中已知的任何方式轉化根據本發明的任何態樣所生產之ω-羥基脂肪酸成為至少一種ω-胺基羥基脂肪酸，及(ii)使用ω-胺基羥基脂肪酸作為聚合反應的單體以生產聚醯胺。
根據本發明的又另一態樣，其係提供至少一種C1至C4有機化合物在發酵過程期間增加自至少一種碳基質形成ω-羥基脂肪酸的選擇率之用途，其中該方法包含(a)使碳基質與至少一種酵母細胞在水性培養基中接觸，其中酵母細胞能夠氧化碳基質成為對應之ω-羥基脂肪酸及/或二羧酸；且酵母細胞包含降低的脂肪酸降解能力，其中水性培養基包含至少一種C1至C4有機化合物。C1至C4有機化合物特別為乙酸鹽。
總而言之，ω-羥基脂肪酸可進一步轉化成ω-側氧羧酸且接著成為ω-胺基羧酸，其接著以聚合反應轉化成聚醯胺。技術人員將能夠基於本技術中已知的方法找到適合於該等轉化之技術。在一個實例中，更多的酵素(諸如烷烴單加氧酶、醇脫氫酶或醇氧化酶)可引入根據本發明的任何態樣之細胞中以轉化ω-羥基脂肪酸成為ω-側氧羧酸。細胞亦可表現至少一種ω-轉胺酶以轉化ω-側氧羧酸成為ω-胺基羧酸。在另一實例中，根據本發明的任何態樣所生產之ω-羥基脂肪酸可引入能夠轉化ω-羥基脂肪酸成為ω-胺基羧酸之其他細胞中。
圖1為根據比較例1以葡萄糖進料時，10-羥基癸酸及癸二酸隨時間之濃度的圖形。
圖2為根據實施例1以NaAc及HAc進料時，10-羥基癸酸及癸二酸隨時間之濃度的圖形。
圖3為根據實施例2使用不同的烷烴基質之ω-羥基脂肪酸及二羧酸之濃度的圖形。
圖4為根據實施例3以NaAc進料時，10-羥基癸酸及癸二酸隨時間之濃度的圖形。
圖5為根據比較例2以葡萄糖進料時，10-羥基癸酸及癸二酸隨時間之濃度的圖形。
實施例
前文說明較佳的實施態樣，如那些熟習本技術領域者所瞭解，該等實施態樣可在設計、建構或操作上進行變化或修飾而不偏離申請專利範圍之範疇。該等變化例如意欲由申請專利範圍之範疇所涵蓋。
方法及材料
在實施例中，發酵產品的鑑定係使用GC-MS進行及發酵產品的量係經由氣體層析術-火焰游離檢測(GC-FID)測定。
發酵產品的樣品在注入於GC-FID分析前先以TMS(三甲基矽化)衍化處理。
詳細的程序如下：將樣品溶解在乙酸乙酯或乙腈中(若必要時)，接著將溶液與衍化試劑(N,O-雙(三甲基矽基)三氟乙醯胺，BSTFA)以1：1(v/v)在2毫升小瓶中(80微升：80微升於300微升內插瓶(insert vial)中)混合。隨後將混合 物在注入GC-FID分析前於烘箱中加熱至80℃經30分鐘。
儀器：Agilent 7890B；入口條件：溫度：260℃，分流比：20：1；注入體積：1微升；管柱：Agilent 19091J-413L，HP5，30公尺x 320微米 x 0.25微米；載送氣體：氦氣；管柱流速：固定，1毫升/分鐘；烘箱程序：60℃(保持1分鐘)，10℃/分鐘至300℃(保持5分鐘)；FID檢測器：溫度：280℃；空氣流速：300毫升/分鐘；H2燃料流速：30毫升/分鐘；補充流速(makeup flow)：25毫升/分鐘。
實施例1
種子培養期：
將在瓊脂平皿上的熱帶假絲酵母ATCC20962菌株群落在100毫升種子培養基中預培育且在1公升折流式震盪燒瓶中以200rpm，30℃震盪20小時。
種子培養基含有(每公升)：葡萄糖，30克；玉米浸液(Sigma)，9克；KH2PO4，2克；K2HPO4，1克；MgSO4，1.0克；CaCl2，0.1克；NaCl，0.1克；尿素，3.6克；及1 毫升/公升之微量元素溶液(每公升：H3BO3，0.5克；CuSO4．5H2O，0.04克；KI，0.1克；FeCl3．6H2O，0.6克；MnSO4．H2O，0.4克；Na2MoO4．2H2O，0.2克；ZnSO4．7H2O，0.4克)。
生長期：
將細胞以10%(v/v)接種至1.4公升DASGIP發酵器(用於微生物研究及發展的DASGIP平行生物反應器系統(Parallel Bioreactor System)，1公升操作體積)中的400毫升生長培養基中。添加30克/公升癸烷以誘發相關酵素(諸如細胞色素P450)的表現(He,F.之(2005),Yeast,22：481-491；Van Beillen,J.B.之(2006),App and Env.Microbiology：59-65；及Kogure T.之(2007),FEMS Microbiol Lett：106-111)。將培養物在30℃下以1.0vvm之通氣速率生長30小時，作為生長期。將pH以自動添加4莫耳/公升之NaOH溶液或5莫耳/公升之HCl溶液維持在5.80。將溶解氧以攪動及O2階式控制模式維持在25%飽和。在生長6小時後，將葡萄糖(600克/公升)以下列公式為基準經指數方式進料，其中μ=0.05小時-1及YX/S=0.35克DCW(細胞乾重)/克葡萄糖，且ms=0.04克/克之DCW*小時。CS0為基質濃度，CX0為開始進料時的DCW。
生長培養基含有(每公升)：葡萄糖，30克；(NH4)2SO4，8克；玉米浸液(Sigma)，9克；KH2PO4,2克；K2HPO4，1克；MgSO4，1.0克；CaCl2，0.1克；NaCl，0.1克；消泡劑204(Sigma批號#：MKBP4191V)，1毫升和1毫升/公升之微量元素溶液(每公升：H3BO3，0.5克；CuSO4．5H2O，0.04克；KI，0.1克；FeCl3．6H2O，0.6克；MnSO4．H2O，0.4克；Na2MoO4．2H2O，0.2克；ZnSO4．7H2O，0.4克)。
轉化期：
癸烷之轉化係在生長期之30小時後開始。pH係在2小時內以4莫耳/公升之NaOH溶液逐漸上升至7.5。將癸烷以0.4毫升/小時之速率進料及將NaAc(300克/公升，pH7.5)以1.0至2.0毫升/小時(Ac-之濃度係從10克/公升至30克/公升)之速率進料。將著將pH以自動添加75%(v/v)HAc維持在7.5。轉化期持續130小時。以間隔時間取出培養液樣品以測定細胞密度、殘餘葡萄糖、Ac-濃度及產物濃度。
殘餘葡萄糖濃度係以酵素方式(葡萄糖氧化酶)測定且未檢測出濃度。
乙酸基團(Ac-)濃度係以H-NMR方法量化，其係以對照具有已知濃度的內標準物(TMSP，3-(三甲基矽基)丙-2,2,3,3-d4酸鈉鹽)計算樣品。Ac-之濃度為10克/公升至30克/公升。
當以NaAc及HAc進料時，將10-羥基癸酸及癸二酸隨時間之濃度顯示於圖2中。
樣品萃取：
將200微升樣品培養液以添加5M HCl酸化至pH 1至2，接著添加8倍(1.6毫升)乙酸乙酯(EA)。在劇烈震盪後，在25℃下以13000rpm離心2分鐘以取得EA相。接著以1毫升EA相用於GC-FID分析以測定培養液中的氧化產物(10-羥基癸酸及癸二酸)。
比較例1
種子培養期及生長期係如實施例1的那些方式進行。在轉化期中，癸烷之轉化係在生長期之30小時後開始。pH係在2小時內以4莫耳/公升之NaOH溶液逐漸上升至7.5。將癸烷以0.4毫升/小時之速率進料及將葡萄糖(600克/公升)以保持葡萄糖濃度在約10克/公升之速率進料。將著將pH以自動添加4莫耳/公升之NaOH溶液維持在7.5。轉化期持續130小時。以間隔時間取出培養液樣品以測定細胞密度、殘餘葡萄糖及產物濃度。
如圖1中所示，當葡萄糖根據比較例1於轉化期進料時，則主要產物為癸二酸，其濃度在160小時為13.88克/公升，且幾乎未發現10-羥基癸酸(0.15克/公升)。10-羥基癸酸之選擇率為1.1%。
然而，如圖2中所示，當NaAc及HAc根據實施例1於轉化期進料時，則優勢產物為10-羥基癸酸，而不為癸二酸(在160小時以7.56克/公升之10-羥基癸酸相對於0.96克/公 升之癸二酸)。10-羥基癸酸之選擇率為88.7%。
實施例2
種子培養期及生長期係如實施例1的那些方式進行。接著在4℃下以4500rpm離心4分鐘以收集誘發之細胞。將收集之細胞另外以10mM PBS(磷酸鹽緩衝食鹽水，pH7.5)清洗以獲得靜止細胞。
將等分的靜止細胞懸浮在含有NaAc(28克/公升)及烷烴基質(10克/公升)於25毫升10mM PBS(pH7.5)中的培養基中，以製得OD10之細胞懸浮液。將此細胞懸浮液用於轉化期中。分別測試三種作為基質的烷烴：癸烷、十一烷及十二烷。轉化期係在30℃及200rpm下以純氧置換其中的空氣之250毫升Schott折流式震盪燒瓶中進行24小時。將培養液中的產物在酸化後以等量的乙酸乙酯萃取。各產物之濃度量化係以GC-FID測定。在24小時轉化後，殘餘NaAc濃度為約2-3克/公升。
在圖3中對所有三種該等基質的結果顯示主要產物全部皆為ω-羥基脂肪酸。10-羥基癸酸及癸二酸之濃度分別為0.452克/公升及0.039克/公升，且10-羥基癸酸之選擇率為92.0%。11-羥基十一烷酸及十一烷二酸之濃度分別為0.469克/公升及0.098克/公升，且11-羥基十一烷酸之選擇率為82.7%。12-羥基十二烷酸及十二烷二酸之濃度分別為0.502克/公升及0.204克/公升，且12-羥基十二烷酸之選擇率為71.1%。
實施例3
種子培養期：
將在瓊脂平皿上的具有存取編號CGMCC 14251之解脂蘇草酵母C122菌株群落(在2017年6月19日由中國北京朝陽區100101北辰西路1號的中國科學院，微生物研究所的中國普通微生物菌種保藏管理中心寄存)在50毫升種子培養基中預培育且在500毫升折流式震盪燒瓶中以200rpm，30℃震盪24小時。
種子培養基含有(每公升)：葡萄糖，10克；蛋白腖，20克；酵母萃取液，10克；癸烷，3克。
接著在4℃下以4500rpm離心4分鐘以收集誘發之細胞。將收集之細胞另外以10mM PBS(磷酸鹽緩衝食鹽水，pH7.5)清洗以獲得靜止細胞。
將等分的靜止細胞懸浮在含有NaAc(28克/公升)及烷烴基質(40克/公升)於25毫升10mM PBS(pH7.5)中的培養基中，以製得OD20之細胞懸浮液。將此細胞懸浮液用於轉化期中。測試作為烷烴基質之癸烷。
轉化期：
轉化期係在30℃及200rpm下以純氧置換其中的空氣之250毫升Schott折流式震盪燒瓶中進行24小時。將培養液中的產物在酸化後以等量的乙酸乙酯萃取。各產物之濃度量化係以GC-FID測定。
圖4為根據實施例3以NaAc進料時，10-羥基癸酸及癸二酸隨時間之濃度的圖形。在圖4中的結果顯示主要產物為ω-羥基脂肪酸。10-羥基癸酸之濃度為0.260克/公升，且10-羥基癸酸之選擇率為58.3%。
比較例3
種子培養期及轉化期係如實施例3的那些方式進行，除了在轉化期以外，以葡萄糖(20克/公升)置換NaAc。
在圖5中的結果顯示主要產物為癸二酸。癸二酸之濃度為0.205克/公升，且10-羥基癸酸之選擇率為4.0%。

Claims (15)

  1. 一種生產至少一種ω-羥基脂肪酸之方法，該方法包含：(a)使至少一種烷烴與至少一種酵母細胞在水性培養基中接觸，其中該酵母細胞能夠氧化該烷烴成為對應之ω-羥基脂肪酸，且該酵母細胞包含降低的脂肪酸降解能力；該降低的脂肪酸降解能力為下列的結果，(i)相對於野生型細胞，至少一種涉及β-氧化路徑之酵素的表現降低；及/或(ii)在至少一種涉及β-氧化路徑之酵素中的至少一種功能喪失突變；且該水性培養基包含用作為共基質的乙酸鹽。
  2. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中在步驟(a)中的該乙酸鹽濃度為至少20毫莫耳/公升。
  3. 根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中該乙酸鹽濃度係維持在80至800毫莫耳/公升之間。
  4. 根據前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該乙酸鹽濃度係維持在160至500毫莫耳/公升之間。
  5. 根據前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該水性培養基包含未檢測出濃度的葡萄糖。
  6. 根據前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該乙酸鹽係選自由NaAc和HAc所組成之群組。
  7. 根據前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該烷烴包含至少6個碳原子。
  8. 根據前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該烷烴係選自由C 7-C 22烷烴所組成之群組。
  9. 根據前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該烷烴係選自由C 10-C 12所組成之群組。
  10. 根據前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該酵母細胞係選自由假絲酵母(Candida)、蘇草酵母(Yarrowia)、畢赤酵母(Pichia)、球擬酵母(Torulopsis)、紅酵母(Rhodotorula)和威克酵母(Wickerhamiella)所組成之群組。
  11. 根據前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該酵母細胞係選自由熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)和解脂蘇草酵母(Yarrowia lipolytica)所組成之群組。
  12. 根據前述申請專利範圍中任一項之方法，其中該降低的脂肪酸降解能力為相對於野生型細胞，至少一種選自由醯基-CoA脫氫酶、2,4-二烯醯基-CoA還原酶、烯醯基-CoA水合酶和3-酮基醯基-CoA硫解酶所組成之群組的酵素之表現降低的結果。
  13. 一種酵母細胞在水性培養基中自至少一種烷烴生產至少一種ω-羥基脂肪酸之用途，其中該酵母細胞能夠氧化該烷烴成為對應之ω-羥基脂肪酸，且該酵母細胞包含降低的脂肪酸降解能力；該降低的脂肪酸降解能力為下列的結果：(i)相對於野生型細胞，至少一種涉及β-氧化路徑之酵素的表現降低；及/或(ii)在至少一種涉及β-氧化路徑之酵素中的至少一種功能喪失突變；且該水性培養基包含用作為共基質的乙酸鹽。
  14. 根據申請專利範圍第13項之用途，其中該乙酸鹽濃度係維持在20至800毫莫耳/公升之間。
  15. 根據申請專利範圍第13或14項之用途，其中該烷烴係選自由C 7-C 22烷烴所組成之群組。
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