TW201812017A - 快速檢測細胞樣品內細菌及黴漿菌含量之方法 - Google Patents

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一種快速檢測細胞樣品內細菌及黴漿菌含量之方法，其係可適用於以含有各種活性物質之生物製劑，採用新技術建立格蘭氏細菌及黴漿菌實時聚合酶鏈反應單一次檢測法，可達到快速檢測及有效降低檢測成本，是目前生物製劑產品無菌安全檢測之高效率檢測方法。此方法為一種具生物活性的被驗試樣中的微生物檢測方法，其特徵為：包括檢測格蘭氏細菌及黴漿菌的被驗試樣之裝置、試劑及步驟，以達到同時且快速檢測出細菌及黴漿菌為目的。

Description

快速檢測細胞樣品內細菌及黴漿菌含量之方法
本發明係針對人類細胞治療產品採用新技術建立格蘭氏細菌及黴漿菌實時聚合酶鏈反應單一次檢測法以達到快速高效檢測及有效降低檢測成本。
由於新興生物技術的快速發展，細胞培養、保存等技術逐漸成熟，國際上細胞治療產品陸續核准上市，對於傳統化學或生物藥品無法治癒之疾病，細胞治療產品應用於臨床，提供醫師或病人多元治療之選擇。
有鑑於細胞治療產品之特異性與複雜性，使得細胞治療產品的審查，有異於其他藥品審查的要求，相關衛生主管機關已制定專屬審查基準。
前述審查基準包括人類細胞治療產品製程管制之放行測試，其中包括確保細胞治療產品安全性(safety)的微生物測試。
為確保細胞治療產品安全性(safety)的微生物測試，習知係針對格蘭氏細菌及黴漿菌分別檢測，各別檢測除耗時且耗工外，檢測費用更高出許多，對於生物製劑產品之無菌安全檢測造成不便且對產品生物活性影響甚鉅。
上述習知鈦合金與習知先前專利技獻、技術文獻所揭示之檢驗方法，存有較低效能或僅具單一檢測菌種性質的問題與缺點。
緣此，本發明有鑑於聚合脢連鎖反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)具有讓極微量的DNA可以在2小時內大量複製幾十億倍，大幅減少DNA複製所需耗費的時間，但操作過程仍有感染外來汙染物之極高風險。
因此本發明乃進一步利用實時聚合脢連鎖反應(Real Time Polymerase Chain Reaction)及適當試劑加以改良之操作程序，不但快速、安全且同時可完成細菌及黴漿菌之檢測方法。
關於本發明之檢測步驟如下：
1.首先從細胞樣品中採樣1毫升(mL)至另一全新無菌的微量離心管中。
2.利用離心機以800rpm離心5分鐘，沉澱去除樣品中的細胞及其碎屑。
3.取出微量離心管中的上清液體，並加至另一全新無菌的微量離心管。
4.上清液體以高速13,000g離心6分鐘(或可用10,000g離心15分鐘)，使液體內之細菌與黴漿菌沉降至微量離心管底部。
5.待離心結束後，丟棄上清液體，並加入100微毫升(μl)之裂解溶液(lysis buffer)，利用漩渦震盪器(vortex)將微量離心管底部之沉澱物與裂解溶液混合均勻。
6.蓋緊並密封微量離心管，以防止加熱過程(乾式加熱器 加熱95℃，10分鐘)中離心管發生爆口情況。
7.取18微毫升(μl)的Femto細菌實時聚合酶鏈反應混合物(real-time PCR master mix)至每個Real-time PCR專用檢測反應管中。
8.取2微毫升(μl)的無模板對照組(No template control)到相對應的反應管中。
9.取2微毫升(μl)的待測樣品到相對應的反應管中。
10.取2微毫升(μl)的細菌/黴漿菌DNA標準品到相對應的反應管中。
11.將Real-time PCR儀器專用檢測反應管之開口緊密蓋緊。
12.利用桌上型離心機快速離心，去除反應管管壁內殘餘之液體與小氣泡。
13.將專用檢測反應管放至儀器內，開始進行檢測反應。
圖一實施例是實時聚合脢連鎖反應Cq值檢測圖表。
圖二實施例是實時聚合脢連鎖反應Tm值檢測圖表。
本發明檢測過程中使用之微量離心管、Real-time PCR儀器專用檢測反應管或其他相關塑膠耗材皆需為無菌耗材，並在生物安全櫃中進行操作。
本發明實施例所使用之細胞樣品係採自體細胞治療產品。
1.首先從細胞樣品中採樣1毫升(mL)至另一全新無菌的微量離心管中。
2.利用離心機以800rpm離心5分鐘，沉澱去除樣品中的細胞及其碎屑。
3.取出微量離心管中的上清液體，並加至另一全新無菌的微量離心管。
4.上清液體以高速13,000g離心6分鐘(或可用10,000g離心15分鐘)，使液體內之細菌與黴漿菌沉降至微量離心管底部。
5.待離心結束後，丟棄上清液體，並加入100微毫升(μl)之裂解溶液(lysis buffer)，利用漩渦震盪器(vortex)將微量離心管底部之沉澱物與裂解溶液混合均勻。
6.蓋緊並密封微量離心管，以防止加熱過程(乾式加熱器加熱95℃，10分鐘)中離心管發生爆口情況。
7.取18微毫升(μl)的Femto細菌實時聚合酶鏈反應混合物(real-time PCR master mix)至每個Real-time PCR專用檢測反應管中。
8.取2微毫升(μl)的無模板對照組(No template control)到相對應的反應管中。
9.取2微毫升(μl)的待測樣品到相對應的反應管中。
10.取2微毫升(μl)的細菌/黴漿菌DNA標準品到相對應的反應管中。
11.將Real-time PCR儀器專用檢測反應管之開口緊密蓋緊。
12.利用桌上型離心機快速離心，去除反應管管壁內殘餘之液體與小氣泡。
13.將專用檢測反應管放至儀器內，開始進行檢測反應。
上述第一圖~第二圖所示之本發明之快速檢測細胞樣品內細菌及黴漿菌含量之方法，僅為便於說明之較佳實施例之一，其他等效之試劑、裝置、組合結構與方法、技術，當屬本發明之範疇，並且，舉凡是針對本發明之試劑、裝置、組合結構與方法局部改變或修飾，或者等效之技術手段、方法置換，當不脫本發明之範疇，其範圍將由以下之申請專利範圍來界定之。

Claims (5)

  1. 一種快速檢測細胞樣品內細菌及黴漿菌含量之方法包含：提供一實時聚合酶鏈反應儀器，提供對檢體進行檢測；提供一螢光探針以對單一聚合酶鏈反應疾病及微生物快速檢測；提供一生物安全櫃裝置，以對該檢體進行實時聚合酶鏈反應檢測的操作步驟；提供一檢測試劑，對一個以上之該檢體進行檢測。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該生物安全櫃生物裝置係使用安全等級至少第二級以上。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該檢測試劑為Femo試劑。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該檢測步驟包含：(a)首先從細胞樣品中採樣1毫升(mL)至另一全新無菌的微量離心管中；(b)利用離心機以800rpm離心5分鐘，沉澱去除樣品中的細胞及其碎屑；(c)取出微量離心管中的上清液體，並加至另一全新無菌的微量離心管；(d)上清液體以高速13,000g離心6分鐘(或可用10,000g離心15分鐘)，使液體內之細菌與黴漿菌沉降至微量離心管底部。(e)待離心結束後，丟棄上清液體，並加入100微毫升( μl)之裂解溶液(lysis buffer)，利用漩渦震盪器(vortex)將微量離心管底部之沉澱物與裂解溶液混合均勻。(f)蓋緊並密封微量離心管，以防止加熱過程(乾式加熱器加熱95℃，10分鐘)中離心管發生爆口情況。(g)取18微毫升(μl)的Femto細菌實時聚合酶鏈反應混合物(real-time PCR master mix)至每個Real-time PCR專用檢測反應管中。(h)取2微毫升( μl)的無模板對照組(No template control)到相對應的反應管中。(i)取2微毫升( μl)的待測樣品到相對應的反應管中。(j)取2微毫升( μl)的細菌/黴漿菌DNA標準品到相對應的反應管中。(k)將Real-time PCR儀器專用檢測反應管之開口緊密蓋緊。(l)利用桌上型離心機快速離心，去除反應管管壁內殘餘之液體與小氣泡。(m)將專用檢測反應管放至儀器內，開始進行檢測反應。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該檢測步驟(f)加熱溫度約90-100°C。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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