序列表
本申請案含有序列表，其已以ASCII格式電子呈送且其全部內容以引用的方式併入本文中。創建於2017年3月23日之該ASCII複本名為24258_105007_SL.txt及係40,452個字組大小。 表現於腫瘤細胞上之程式化死亡配位體-1蛋白(PD-L1)與表現於免疫效應子細胞(例如T-細胞)上之程式化死亡-1蛋白(PD-1)之間的胞外相互作用對與腫瘤相關聯的免疫逃逸具有顯著影響。儘管使用抗-PD-1或抗-PD-L1抗體取得免疫檢查點阻斷之臨床成就，但PD-L1及PD-1相互作用潛在之調節機制及結構特徵在很大程度上尚屬未知。根據本文所述的發現結果，已證實PD-L1之N-連接之醣化將PD-L1蛋白配位體以存於腫瘤細胞上方式穩定及亦促進且增強其與PD-1之結合，此促進T細胞介導之免疫反應之抑制作用。相反地，已發現N-連接之醣化之異常或損失(諸如來自表現於腫瘤細胞上之PD-L1多肽之部分或完全去醣化)不利地影響(例如減弱或破壞)PD-L1/PD-1相互作用及促進腫瘤細胞上PD-L1之內部化及降解，此繼而抑制免疫抑制作用及促進效應子T-細胞之細胞毒性活性及腫瘤細胞之殺死。另外，因為腫瘤高度表現醣化PD-L1之患者的存活期短，故醣化PD-L1基於本文中的發現結果被識別為癌症治療之有效治療性標靶。本文中提供並描述癌症治療劑，諸如雙功能抗-醣化PD-L1抗體，其特異性及優先結合醣化PD-L1且與其相互作用以破壞醣化PD-L1/PD-1相互作用及使得表現於腫瘤細胞表面上的PD-L1去穩定化，藉此抑制免疫抑制作用及促進抗腫瘤細胞之T-細胞效應子功能以治療癌症。如本文所述之雙功能抗-醣化PD-L1抗體之腫瘤治療提供相對於對PD-L1之醣化形式無特異性之抗-PD-L1抗體增強之免疫抑制作用的抑制效應。在實施例中，抗-醣化PD-L1抗體為單株抗體，本文中命名為「MAb」。 本文中提供雙功能抗-醣化PD-L1抗體，其結合PD-L1之胞外域(ECD)中對應於醣化位點之抗原決定基，尤其PD-L1 ECD之N-端及C-端部分中或選擇性結合以阻斷或掩蔽彼等醣化位點。在PD-L1蛋白中醣化之胺基酸係在其胞外域中，如圖
1G
所顯示，在PD-L1之位置35、192、200及219之處，如本文SEQ ID NO:1中所編號。根據本發明發現結果，本文所述抗-醣化PD-L1抗體為雙功能，因為其減少、阻斷或抑制PD-L1與PD-1之結合及亦促進PD-L1內部化及降解以減小表現於腫瘤細胞上之PD-L1的濃度。在實施例中，所述雙功能抗-醣化PD-L1抗體結合非線性、構象抗原決定基。另外但不希望受理論限制地，抗-醣化PD-L1抗體結合包含醣化胺基酸之抗原決定基或在三維空間中接近醣化胺基酸；據認為該等醣化胺基酸尤其涉及PD-L1/PD-1相互作用及亦涉及維持腫瘤細胞表面上之PD-L1。不受理論限制地，醣化PD-L1之ECD N-端中與N35相關聯的聚醣結構可包含或貢獻於由PD-1蛋白識別並結合且在PD-1/PD-L1相互作用中具有重要作用之醣化PD-L1蛋白之功能性結構或構象。藉由結合在PD-L1 ECD之N-端區域中包含位置35的胺基酸之抗原決定基或接近位置35之抗原決定基，所述雙功能抗-醣化PD-L1抗體掩蔽醣化PD-L1蛋白之可尤其涉及PD-L1/PD-1相互作用之結合位點或區域。藉由結合，或通過結合、掩蔽PD-L1 ECD的C-端區域中之包含醣化胺基酸殘基(N192、N200及N219)之胺基酸，所述的雙功能抗-醣化PD-L1抗體可有效掩蔽醣化PD-L1蛋白之可尤其涉及腫瘤細胞表面上PD-L1之穩定化之結合位點或區域，藉此促進PD-L1內部化及降解且減小腫瘤細胞上PD-L1的含量。 本文所述的雙功能抗-醣化PD-L1抗體可結合至包含或掩蔽PD-L1 ECD之N-端及C-端區域兩區域中的胺基酸，特定言之非線性、構象抗原決定基中之胺基酸之抗原決定基，從而抗-醣化PD-L1抗體掩蔽或隱藏PD-L1蛋白之涉及PD-L1/PD-1相互作用及腫瘤細胞表面上PD-L1之穩定化之彼等含聚醣殘基或區域。該等抗-醣化PD-L1抗體抑制或阻斷PD-L1與PD-1結合及亦減小腫瘤細胞表面上PD-L1的含量，使得較少的PD-L1分子可用於結合至PD-1。抗-醣化PD-L1抗體在呈與效應子T-細胞及帶有PD-1之腫瘤或癌細胞之混合物形式提供時可促進T-細胞殺死該等腫瘤或癌細胞，並不受PD-1/PD-L1相互作用之免疫抑制。(參見，例如，圖11及實例9)。 本文所述的實例提供顯示如本文所述之抗-醣化PD-L1抗體在結合醣化PD-L1相對於非醣化PD-L1方面顯著差異(例如，2至3倍)之實驗結果。在實施例中，抗-醣化PD-L1抗體展現相對於非醣化PD-L1而言在奈莫耳範圍(例如，約5-20 nM或約10-20 nM)內之對醣化PD-L1之結合親和力。該等實例進一步顯示抗-醣化PD-L1抗體係藉由表現PD-L1之腫瘤細胞而非T細胞(活化或非活化)內部化(圖16A-16L)；在具有衍生自腫瘤細胞系之腫瘤之小鼠模型中，該等抗-醣化PD-L1抗體亦減小表現PD-L1之腫瘤細胞之存活率及腫瘤體積(圖17A-17D)。
定義
如本文中所使用，術語「一」或「一個」可意指一或多個。 如本文中所使用，除非特別指出僅指替代物或替代項互斥，否則術語「或」意指「及/或」，雖然本揭示案支持僅指替代物及「及/或」之定義。 如本文中所使用，術語「另一」意指至少一第二或更多。 如本文中所使用，術語「約」係用於指示數值包括用於測定該數值之器件、方法中之固有誤差、或研究個體之間之誤差。 如本文中所使用，除非另作指明，否則術語「程式化死亡配位體-1」或「PD-L1」係指多肽(本文中，術語「多肽」及「肽」可互換使用)或來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物，諸如靈長類(例如，人類、食蟹獼猴(cyno))、狗及齧齒動物(例如，小鼠及大鼠)之任何天然PD-L1，及在某些實施例中，包括各種PD-L1同功異型物、相關的PD-L1多肽(包括其SNP變異體)。 下文提供人類PD-L1之一例示性胺基酸序列(UniProtKB/Swiss-Prot:Q9NZQ7.1；GI:83287884)： mrifavfifm tywhllnaft vtvpkdlyvv eygsnmtiec kfpvekqldl aalivyweme dkniiqfvhg eedlkvqhss yrqrarllkd qlslgnaalq itdvklqdag vyrcmisygg adykritvkv napynkinqr ilvvdpvtse heltcqaegy pkaeviwtss dhqvlsgktt ttnskreekl fnvtstlrin tttneifyct frrldpeenh taelvipelp lahppnerth lvilgaillc lgvaltfifr lrkgrmmdvk kcgiqdtnsk kqsdthleet (SEQ ID NO:1)。在SEQ ID NO:1中，胺基端胺基酸1-18構成人類PD-L1蛋白之信號序列。相應地，成熟人類PD-L1蛋白由SEQ ID NO:1之胺基酸19-290組成。 針對包含本文所述多肽及肽之胺基酸殘基及此等胺基酸殘基之保守性取代之縮寫顯示於下表1中。包含一或多個保守性胺基酸取代之多肽或本文所述多肽之保守修飾變異體係指其中初始或天然生成之胺基酸經具有類似特徵(例如，類似電荷、疏水性/親水性、側鏈尺寸、主鏈構象、結構及剛性等)之其他胺基酸取代之多肽。因此，可通常在不改變多肽之生物活性、功能或其他所需性質(諸如其對抗原之親和力或其特異性)下進行此等胺基酸改變。一般而言，多肽之非必需區中之單個胺基酸取代實質上不改變生物活性。此外，結構或功能相似的胺基酸取代不太可能會破壞多肽之生物活性。
表 1. 胺基酸殘基及保守性胺基酸取代之實例
本文中，術語「抗體」、「免疫球蛋白」及「Ig」在寬廣意義上可互換使用，且具體而言包含例如個別抗-PD-L1抗體，諸如本文所述單株抗體，(包括促效劑、拮抗劑、中和抗體、全長或完整單株抗體、抗體之維持抗原結合活性之肽片段)、抗非醣化PD-L1抗體及抗醣化PD-L1抗體；具有多抗原決定基或單抗原決定基特異性之抗-PD-L1抗體組合物、多株或或單價抗體、多價抗體、由至少兩個完整抗體形成的多重特異性抗體(例如，雙重特異性抗體或雙互補位抗體，只要其等展現所需生物活性即可)、單鏈抗-PD-L1抗體及抗-PD-L1抗體之片段，如下文所述。抗體可為人類、人源化、嵌合及/或親和力成熟抗體。抗體可來自其他物種，例如，小鼠、大鼠、兔等。術語「抗體」意欲包括能夠結合至特異性分子抗原之多肽的免疫球蛋白類別中之B細胞多肽產物。抗體通常由兩對相同的多肽鏈組成，其中每對具有一條重鏈(約50-70 kDa)及一條輕鏈(約25 kDa)；及其中該等重鏈及輕鏈之胺基端部分包括約100個至約130個或更多個胺基酸之可變區及每一鏈之羧基端部分包括恆定區(參見，Antibody Engineering，Borrebaeck(編)，1995，第二版，Oxford University Press.；Kuby，1997，Immunology，第三版，W.H.Freeman and Company，New York)。在特定實施例中，由本文所提供之抗體所結合的特異性分子抗原包括PD-L1多肽、PD-L1肽片段或PD-L1抗原決定基。PD-L1多肽、PD-L1肽片段或PD-L1抗原決定基可係未醣化或經醣化。在一個特定實施例中，PD-L1多肽、PD-L1肽片段或PD-L1抗原決定基係經醣化。可例如藉由免疫檢定法、Biacore、或熟習此項技術者已知的其他技術識別結合至PD-L1抗原之抗體或其肽片段。抗體或其片段特異性結合至PD-L1抗原，在其結合至PD-L1抗原時以相比結合至任何交叉反應性抗原更高的親和力(如利用實驗技術，諸如放射免疫檢定(RIA)及酶聯免疫吸附檢定(ELISA)測定)。通常，特異性或選擇性結合反應將為至少兩倍於背景信號或雜訊，及更通常為5-10倍以上於背景信號或雜訊。關於抗體特異性之論述參見，例如，Fundamental Immunology 第二版，Paul編，1989，Raven Press，New York，第332至336頁。 本文所提供的抗體包括(但不限於)合成抗體、單株抗體、重組產生之抗體、多重特異性抗體(包括雙特異性抗體)、人類抗體、人源化抗體、駱駝抗體、嵌合抗體、胞內抗體(intrabody)、抗獨特性(抗-Id)抗體及上述任何者之功能性片段(例如，抗原結合片段，諸如PD-L1結合片段)。結合片段係指抗體重鏈或輕鏈多肽之一部分，諸如肽部分，其保留衍生得該片段之抗體的部分或全部結合活性。功能性片段(例如，抗原結合片段，諸如PD-L1結合片段)之非限制性實例包括單鏈Fv (scFv)(例如，包括單特異性、雙特異性、雙互補位、單價(例如，具有單V
H
或V
L
域)或二價等)、Fab片段、F(ab’)片段、F(ab)
2
片段、F(ab’)
2
片段、二硫鍵連接之Fv (sdFv)、Fd片段、Fv片段、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體及微型抗體(minibody)。特定言之，本文所提供抗體包括免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分，例如，包含結合至PD-L1抗原(特定言之，醣化PD-L1抗原)之抗原結合位點之抗原結合域或分子(例如，抗-PD-L1抗體之一或多個互補決定區(CDR))。此等抗體片段之描述可參見例如Harlow及Lane，1989，Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York；Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference，Myers(編)，New York: VCH Publisher, Inc.；Huston等人，1993，Cell Biophysics，22:189-224；Plückthun及Skerra，1989，Meth. Enzymol.，178:497-515及Day, E.D.，1990，Advanced Immunochemistry，第二版，Wiley-Liss, Inc.，New York，NY。本文所提供抗體可為免疫球蛋白分子之任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、任何類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)、或任何亞類別(例如，IgG2a及IgG2b)。在某些實施例中，抗-PD-L1抗體為完全人類抗體，諸如完全人類單株抗-PD-L1抗體。在某些實施例中，抗-PD-L1抗體為人源化抗體，諸如人源化單株抗-PD-L1抗體。在某些實施例中，本文所提供抗體為IgG抗體、或其某一類別(例如，人類IgG1或IgG4)或亞類別，特定言之，IgG1亞類別抗體。 四鏈抗體單元為一種由兩條相同輕(L)鏈及兩條相同重(H)鏈組成之異種四聚醣蛋白。就IgG而言，四鏈(未還原)抗體單元之分子量通常約150,000道爾頓。各L鏈係藉由一個共價雙硫鍵與H鏈連接，而兩條H鏈係藉由一或多個雙硫鍵彼此連接，端視H鏈同型而定。各H及L鏈亦具有有規律間隔的鏈內雙硫橋。在N-端，各H鏈具有一個可變域(V
H
)，其後就α及γ鏈各鏈而言接著三個恆定域(C
H
)及就μ及ε同型物而言接著四個C
H
域。各L鏈在N-端具有可變域(V
L
)，並在其羧基端接著一個恆定域(C
L
)。V
L
域係與V
H
域對齊，及C
L
域係與重鏈(C
H1
)之第一恆定域對齊。據信，特定胺基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之間形成介面。V
H
與V
L
的配對可共同形成單一抗原結合位點(然而，某些V
H
及V
L
域可結合與各自對應物V
H
或V
L
無關之抗原)。熟習此項技術者明瞭免疫球蛋白分子之基本結構。例如，不同類別抗體之結構及性質可參見Stites，Daniel P.等人，1994，Basic and Clinical Immunology，第8版，Appleton & Lange，Norwalk，CT，第71頁，第6章。 如本文中所使用，術語「抗原」或「靶抗原」為抗體可選擇性結合之預定分子。靶抗原可為多肽、肽、碳水化合物、核酸、脂質、半抗原或其他天然生成之化合物或合成化合物。在實施例中，靶抗原為小分子。在某些實施例中，靶抗原為多肽或肽，較佳係醣化PD-L1多肽。 如本文中所使用，術語「抗原結合片段」、「抗原結合域」、「抗原結合區」及類似術語係指代抗體之包含與抗原相互作用且賦予作為結合劑之抗體其針對抗原之特異性及親和力之胺基酸殘基的部分(例如，抗體之CDR為抗原結合區)。抗原結合區可衍生自任何動物物種，諸如齧齒動物(例如，兔、大鼠或倉鼠)及人類。在特定實施例中，抗原結合區可源自人類。 「經單離的」抗體實質上不含來自細胞或組織來源之細胞物質或其他污染性蛋白質及/或衍生得抗體之其他污染組分，或當化學合成時實質上不含化學前驅物或其他化學品。語句「實質上不含細胞物質」包括抗體自其所單離或重組產生之細胞之細胞組分分離之抗體製劑。因此，實質上不含細胞物質之抗體包括具有小於約30%、25%、20%、15%、10%、5%或1%(以乾重計)之異種蛋白(本文中亦稱為「污染性蛋白」)之抗體製劑。在某些實施例中，當抗體係重組產生時，其實質上不含培養基，例如，培養基表示小於約20體積%、15體積%、10體積%、5體積%或1體積%之蛋白質製劑。在某些實施例中，當抗體係藉由化學合成產生時，其實質上不含化學前驅物或其他化學品，例如，其係自參與蛋白質合成之化學前驅物或其他化學品分離。相應地，除了受關注之抗體外之外，此等抗體製劑具有小於約30%、25%、20%、15%、10%、5%或1%(以乾重計)之化學前驅物或化合物。污染組分亦可包括(但不限於)將干擾抗體之治療用途之物質，及可包括酵素、激素及其他蛋白性或非蛋白性溶質。在某些實施例中，抗體係經純化，(1)至大於或等於95重量%之抗體，如藉由Lowry法(Lowry等人，1951，J. Bio. Chem.，193: 265-275)所測定，諸如95重量%、96重量%、97重量%、98重量%或99重量%，(2)至足以藉由使用旋杯式定序儀得到N-端或內部胺基酸序列之至少15個殘基之程度，或(3)至在還原或非還原條件下藉由SDS-PAGE利用考馬斯藍或銀染色為均質性。經單離的抗體亦包括位於重組細胞內之原位抗體，因為該抗體的天然環境之至少一種組分將不存在的。經單離的抗體通常係藉由至少一個純化步驟製備。在一些實施例中，單離本文所提供的抗體。 如本文中所使用，術語「結合」係指分子之間的相互作用，包括，例如，形成複合物。例示性地，此等相互作用包括非共價相互作用，包括氫鍵、離子鍵、疏水相互作用及/或凡得瓦爾(van der Waals)相互作用。複合物亦可包括兩個或更多個分子藉由共價或非共價鍵、相互作用或力保持在一起之結合。抗體之單一抗原結合位點與其靶(抗原)分子上的抗原決定基(諸如PD-L1)之間之總非共價相互作用的強度為抗體或功能性片段對該抗原決定基之親和力。抗體針對單價抗原之締合(k
on
)與解離(k
off
)之比(k
on
/k
off
)為締合常數K
a
，其係親和力之一量度。抗體與抗原之不同複合物的K
a
值不同且取決於k
on
及k
off
二者。可利用本文所提供之任何方法或熟習此項技術者已知的任何其他方法確定本文所提供抗體之締合常數K
a
。在一個結合位點的親和力並非總是反映抗體與抗原間相互作用之真實強度。當含有多個抗原決定子之複合抗原(諸如醣化PD-L1)與含有多個結合位點之抗體接觸時，抗體與抗原在一個位點之處的相互作用將增大在第二結合位點之處相互作用的概率。多價抗體與抗原間之該等多重相互作用之強度稱為結合性(avidity)。抗體之結合性可係比其個別結合位點之親和力更佳的其結合能力之量度。例如，高結合性可補償如有時針對五聚IgM抗體所發現之低親和力，該等五聚IgM抗體可具有低於IgG之親和力，但IgM之由於其多價性所致之高結合性使其可有效地結合抗原。 「結合親和力」通常係指某一分子(例如，結合蛋白質，諸如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如，抗原)之間之非共價相互作用之總計強度。除非另有說明，否則如本文中所使用，「結合親和力」係指反映結合對之成員 (例如，抗體及抗原或受體及配位體)間以1:1相互作用之固有結合親和力。結合分子X對其結合搭配物Y之親和力可通常由解離常數(K
d
)表示。可藉由此項技術中已知的常見方法測量親和力，包括彼等述於本文中之方法。低親和力抗體通常會緩慢地結合抗原，且傾向於容易解離，而高親和力抗體通常會更快速結合抗體，且傾向於較長久保持與抗原結合。此項技術中已知多種測量結合親和力之方法，出於本發明之目的可使用其中任一者。特定說明性實施例包括下列：在一個實施例中，「K
d
」或「K
d
值」係藉由此項技術中已知的檢定，例如，藉由結合檢定測定。可在放射性標記之抗原結合檢定(RIA)，例如，利用受關注抗體之Fab部分及其抗原進行(Chen等人，1999，J. Mol. Biol.，293: 865-881)，來測量K
d
。亦可藉由利用表面電漿子共振(SPR)檢定(Biacore)，使用例如BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc.，Piscataway，NJ)，或藉由生物層干涉儀測定(BLI)，使用例如OctetQK384系統(ForteBio，Menlo Park, CA)，或藉由石英晶體微量天平(QCM)技術，來測量K
d
或K
d
值。亦可利用上文所述的相同表面電漿子共振或生物層干涉儀測定技術，使用例如BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc.，Piscataway，NJ)或OctetQK384系統(ForteBio，Menlo Park, CA)測定「締合速率」或「結締的速率」或「締合速率」或「k
on
」。 本文中，術語「抗-PD-L1抗體」、「特異性結合至PD-L1之抗體」、或「對PD-L1具特異性之抗體」、「特異性結合至PD-L1抗原決定基之抗體」、「選擇性結合至PD-L1之抗體」、「選擇性結合至PD-L1抗原決定基之抗體」、「優先結合至PD-L1之抗體」及類似術語可互換使用，且係指能夠尤其相比非醣化PD-L1或PD-L1之醣化突變體以足夠的親和力及特異性結合PD-L1(即，醣化或WT PD-L1)之抗體。如本文所提供之抗-醣化PD-L1抗體之「優先結合」可基於定量抗體與表現於細胞上之PD-L1(即，醣化PD-L1多肽、或PD-L1 WT、或醣化PD-L1)之结合相對於適宜對照諸如與非醣化或變異體PD-L1(例如，4NQ PD-L1)結合，或與諸如本文中例如實例6所述之表現PD-L1之非醣化或變異體形式(例如，4NQ PD-L1)之細胞，例如，分子工程化細胞、細胞系或腫瘤細胞單離物結合之螢光強度來確定或定義。所述抗-醣化PD-L1抗體優先與醣化PD-L1多肽或與表現醣化PD-L1(PD-L1 WT)之細胞的結合由藉由細胞流動式細胞測定法評估之經測得螢光結合強度(MFI)值表示，其相比於抗體與非醣化或突變體醣化PD-L1多肽或非醣化或突變體表現醣化PD-L1之細胞之結合相比為至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍或更大倍，且其中待檢定的抗體可直接或間接藉由螢光標籤或標記物檢測。在一個實施例中，該抗體係直接經螢光標記物(諸如FITC)標記。在實施例中，優先或選擇性結合醣化PD-L1之抗-醣化PD-L1抗體顯示比相同抗體針對結合本文所述之非醣化PD-L1或PD-L1醣化變異體(例如4NQ PD-L1，其為未經醣化)之MFI值大1.5倍至25倍、或2倍至20倍、或3倍至15倍、或4倍至8倍、或2倍至10倍、或2倍至5倍或更多倍之MFI值。意欲包括介於所有前述之間及等於其的倍數-螢光強度值。在一個實施例中，抗-醣化PD-L1抗體特異性且優先結合至醣化PD-L1多肽，諸如醣化PD-L1抗原、肽片段、或抗原決定基(例如，人類醣化PD-L1，諸如人類醣化PD-L1多肽、抗原或抗原決定基)。特異性結合至PD-L1(例如，醣化或野生型人類PD-L1)之抗體可結合至PD-L1之胞外域(ECD)或衍生自ECD之肽。特異性結合至PD-L1抗原(例如，人類PD-L1)之抗體可與相關抗原(例如，食蟹獼猴(cyno) PD-L1)交叉反應。在一個較佳實施例中，特異性結合至PD-L1抗原之抗體不與其他抗原交叉反應。可例如藉由免疫螢光結合檢定、免疫檢定法、免疫組織化學檢定法、Biacore或熟習此項技術者已知的其他技術識別特異性結合至PD-L1抗原之抗體。 在某些其他實施例中，如本文所述之結合至PD-L1之抗體具有小於或等於20 nM、19 nM、18 nM、17 nM、16 nM、15 nM、14 nM、13 nM、12 nM、11 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、0.9 nM、0.8 nM、0.7 nM、0.6 nM、0.5 nM、0.4 nM、0.3 nM、0.2 nM或0.1 nM，且/或大於或等於0.1 nM之解離常數(K
d
)。在某些實施例中，抗-PD-L1抗體結合至PD-L1之抗原決定基，其在來自不同物種之PD-L1蛋白中(例如，在人類及食蟹獼猴PD-L1之間)具保守性。當抗體結合至PD-L1抗原時，抗體係以高於任何與交叉反應性抗原之親和力特異性結合至PD-L1抗原，如使用實驗技術，諸如放射免疫檢定(RIA)及酶聯免疫吸收檢定(ELISA)所測定。通常，特異性或選擇性反應係至少兩倍於背景信號或雜訊，及係10倍以上於背景。關於抗體特異性之論述，參見，例如，Fundamental Immunology(第二版)，Paul編，1989，Raven Press，New York，第332頁至第336頁。在此等實施例中，抗體與「非靶」蛋白質結合之程度小於約10%之抗體與其特定靶蛋白之結合，例如，如藉由經螢光活化之細胞分選(FACS)分析或放射免疫沉澱(RIA)測定。 本文所述的抗-PD-L1抗體包括抗醣化PD-L1抗體或抗野生型PD-L1抗體，其中野生型PD-L1蛋白係經醣化，其等對醣化PD-L1具特異性。在一些實施例中，抗醣化PD-L1抗體結合至PD-L1之線性醣化基序。在一些實施例中，抗醣化PD-L1抗體結合至呈三維醣化基序中之一或多者附近的肽序列。在一些實施例中，抗醣化PD-L1抗體相對於非醣化PD-L1會選擇性地結合至PD-L1之一或多個醣化基序或具有PD-L1之醣化基序之PD-L1肽。在其他實施例中，抗-醣化PD-L1抗體結合至包含PD-L1蛋白之胺基酸之線性抗原決定基。在一些實施例中，抗醣化PD-L1抗體選擇性地結合至PD-L1之一或多個醣化基序，其中該等醣化基序包含SEQ ID NO:1之PD-L1多肽之N35、N192、N200及/或N219。在其他實施例中，抗-醣化PD-L1抗體結合至包含PD-L1蛋白之胺基酸之構象(非線性)抗原決定基。在一些實施例中，抗-醣化PD-L1抗體或其結合部分以比相對於非醣化PD-L1所展現K
d
小至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%的K
d
結合至醣化PD-L1。在某些實施例中，抗-醣化PD-L1抗體或其結合部分以比相對於非醣化PD-L1所展現K
d
小50%的K
d
結合至醣化PD-L1。在一些實施例中，抗-醣化PD-L1抗體或其結合部分以比相對於非醣化PD-L1所展現K
d
小1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%的K
d
結合至醣化PD-L1。在其他態樣中，抗-醣化PD-L1抗體或其結合部分以比相對於非醣化PD-L1所展現K
d
小至少5-10倍的K
d
結合至醣化PD-L1。在一個實施例中，抗-醣化PD-L1抗體或其結合部分以比相對於非醣化PD-L1所展現K
d
小至少10倍的K
d
結合至醣化PD-L1。在某些實施例中，抗體以比藉由結合至非醣化PD-L1所展現K
d
大不超過1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%或20%的K
d
結合至醣化PD-L1。在一個實施例中，抗-醣化PD-L1抗體或其結合部分以奈莫耳親和力，諸如5-20 nM或10-20 nM(含下限及上限值)之親和力結合至醣化PD-L1。 在一個實施例中，在如實例6中所述的細胞流動式細胞測量術結合檢定中，該抗體展現表示為與針對結合至表現非醣化PD-L1之細胞之MFI相比大1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍，及在某些實施例中，比與表現非醣化PD-L1之細胞之結合之MFI大不超過10倍、20倍、50倍或100倍的針對表現WT PD-L1之細胞之MFI的結合。 如本文中提及抗體時所使用，術語「重(H)鏈」係指約50-70 kDa之多肽鏈，其中胺基末端部分包含約115至130個或更多個胺基酸之可變(V)區(亦稱為V域)及包含恆定(C)區之羧基末端部分。恆定區(或恆定域)可係五種不同類型(例如，同功異型物)中之一者，基於重鏈恆定區之胺基酸序列，此五種類型稱為阿爾法(α)、德耳塔(δ)、艾普斯龍(ε)、伽瑪(γ)及繆(µ)。不同重鏈的大小不同：α、δ及γ包含約450個胺基酸，而µ及ε包含約550個胺基酸。當與輕鏈組合時，重鏈之此等不同類型產生抗體之五種熟知的類別(例如，同功異型物)，即，分別IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，包括IgG之四種亞類別，即，IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。抗體重鏈可為人類抗體重鏈。 如本文中提及抗體時所使用，術語「輕(L)鏈」係指約25 kDa之多肽鏈，其中該胺基末端部分包含約100至約110個或更多個胺基酸之可變域及包含恆定區之羧基末端部分。輕鏈(V及C域二者)之近似長度為211至217個胺基酸。輕鏈有兩種不同類型，基於恆定域之胺基酸序列，稱為卡帕(κ)及蘭姆達(λ)。此項技術中熟知輕鏈胺基酸序列。抗體輕鏈可為人類抗體輕鏈。 如本文中所使用，術語「可變(V)區」或「可變(V)域」係指抗體多肽之輕(L)鏈或重(H)鏈之通常位於L或H鏈之胺基末端之部分。H鏈V域具有約115至130個胺基酸之長度，而L鏈V域為約100至110個胺基酸長。該等H及L鏈V域係用於各特定抗體針對其特定抗原之結合及特異性。H鏈之V域可稱為「V
H
」。L鏈之V區可稱為「V
L
」。術語「可變」係指不同抗體中V域之某些片段之序列廣泛不同之事實。雖然V域介導抗原結合且界定特定抗體對其特定抗原之特異性，但可變性並非均勻地分佈在抗體V域之110個胺基酸範圍。反而，V域係由由各約9-12個胺基酸長之更可變(例如，極端可變性)的更短區(稱為「超變區」或「互補決定區」(CDR))間隔之約15-30個胺基酸之不易變化(例如，相對恆定)的延伸(稱為構架區(FR))組成。抗體H鏈及L鏈之V域各包含由三個超變區(其形成環連接，及在一些情況中形成β片狀結構之一部分)連接之四個FR(其主要採用β片狀組態)。各鏈中之超變區係藉由FR緊密相鄰地保持在一起，及與其他鏈之超變區有助於形成抗體之抗原結合位點(參見，例如，Kabat等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD))。該等C域不會直接涉及抗體與抗原之結合，但會展現各種效應子功能，諸如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)。不同抗體類別或類型中該等V域之序列廣泛不同。序列可變性集中在CDR中，其等主要負責抗體與抗原相互作用。在特定實施例中，抗體之可變域為人類或人源化可變域。 如本文中所使用，術語「互補決定區」、「CDR」、「超變區」、「HVR」及「HV」可互換使用。「CDR」係指抗體V
H
β-片狀構架之非構架區域內三個超變區(H1、H2或H3)中之一者，或指抗體V
L
β-片狀構架之非構架區域內三個超變區(L1、L2或L3)中之一者。當用於本文中時，該術語係指在序列上超變及/或形成結構限定環之抗體V域之區域。一般而言，抗體包含六個超變區：V
H
域中三個(H1、H2、H3)及V
L
域中三個(L1、L2、L3)。因此，CDR通常為穿插於V域之構架區序列中之高度可變序列。「構架」或「FR」殘基為彼等毗鄰CDR之可變區殘基。FR殘基存於例如嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體、域抗體、雙抗體、線性抗體、雙特異性抗體或雙互補位抗體。 許多超變區圈定可在使用中，並涵蓋於本文中。CDR區係熟習此項技術者熟知及已由例如Kabat定義為抗體V域中最具超變性之區域(Kabat等人，1977，J. Biol. Chem.，252: 6609-6616；Kabat，1978，Adv. Prot. Chem.，32:1-75)。Kabat CDR係基於序列可變性且係最常用的(參見，例如，Kabat等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)。CDR區序列亦已結構上由Chothia定義為彼等並非保守β-片狀構架之一部分，及因此能夠採用不同構象之殘基(Chothia等人，1987，J. Mol. Biol.，196: 901-917)。相反，Chothia係指結構環的位置。Chothia CDR-H1環的末端當利用Kabat CDR編號慣例編號的情況下根據環長度在H32與H34之間變化(此係因為Kabat編號方案係在H35A及H35B之處放入***；若既不存在35A亦不存在35B，則環末端在32；若僅存在35A，則環末端在33；若35A及35B二者均存在，則環末端在34)。此項技術中熟知兩種編號系統及術語。 最近，已開發通用編號系統且被廣泛採用，ImMunoGeneTics (IMGT) Information System
®
(Lefranc等人，2003，Dev. Comp. Immunol.，27(1): 55-77)。IMGT為特定於人類及其他脊椎動物之免疫球蛋白(Ig)、T細胞受體(TR)及主要組織相容性複合體(MHC)之整合性資訊系統。本文中，CDR係在就胺基酸序列及在輕鏈或重鏈中之位置提及。藉由使用根據結構特徵、CDR及構架殘基將可變域序列對齊並容易被識別之編號系統，免疫球蛋白V域之結構中CDR之「位置」在物種間係保守的且存在於稱為環之結構中。該資訊可用於移植及替換來自一個物種之免疫球蛋白之CDR殘基進入來自通常人類抗體之受體構架。Honegger等人，2001，J. Mol. Biol. 309: 657-670已開發另一編號系統(AHon)。熟習此項技術者熟知編號系統(包括(例如)Kabat編號及IMGT獨特編號系統)間之一致性(參見，例如，Kabat, 同上；Chothia等人，1987，J. Mol. Biol.，196:901-917，同前述；Martin，2010，Antibody Engineering，第2卷，第3章，Springer Verlag；及Lefranc等人，1999，Nuc. Acids Res.，27: 209-212)。 亦已藉由AbM、Contact及IMGT定義CDR區序列。AbM超變區代表Kabat CDR及Chothia結構環間的折衷方案，並為Oxford Molecular之AbM抗體模型軟體(參見，例如，Martin, 同上)所採用。「contact」超變區係基於可利用的複雜晶體結構之分析。此等超變區或CDR中每一者之殘基列示如下。 CDR區序列之例示性圈定顯示於下表2中。已藉由對許多結構之比較來確定典型抗體可變區中CDR之位置(Al-Lazikani等人，1997，J. Mol. Biol.，273:927-948；Morea等人，2000，Methods，20:267-279)。因為不同抗體中超變區中殘基的數量不同，故相對於典型位置之附加殘基習知上係以靠近典型可變區編號方案(Al-Lazikani等人，同上)中之殘基編號的a、b、c等編號。熟習此項技術者亦熟知此命名法。
表 2.CDR 區序列之例示性圈定
「親和力成熟」抗體為在其一或多個HVR中具有一或多個改變(例如，胺基酸序列修改，包括變化、新增及/或缺失)之抗體，相較於不具有彼等改變之親本抗體，該(等)改變會導致抗體對抗原之親和力改良。在某些實施例中，親和力成熟抗體將對靶抗原(諸如醣化PD-L1)具有奈莫耳或甚至皮莫耳的親和力。親和力成熟抗體可由此項技術中已知的程序製備。欲回顧，參見Hudson及Souriau，2003，Nature Medicine 9: 129-134；Hoogenboom，2005，Nature Biotechnol.，23:1105-1116；Quiroz及Sinclair，2010，Revista Ingeneria Biomedia 4: 39-51。 「嵌合」抗體為其中H鏈及/或L鏈之一部分(例如V域)為與源自特定物種或隸屬於特定抗體類別或亞類之抗體中之對應胺基酸序列相同或同源，而該(等)鏈之其餘部分(例如C域)與源自另一物種或隸屬於另一抗體類別或亞類之抗體中之對應序列相同或同源之抗體及此抗體之片段，只要其展現所需生物活性(參見，例如，美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，1984，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，81: 6851-6855)。 「人源化」非人類(例如鼠類)抗體為係指人類免疫球蛋白序列之抗體(例如接受者抗體)之嵌合形式，其中天然CDR殘基被來自非人類物種(例如供者抗體)(諸如具有針對抗原結合及相互作用之所需特異性、親和力及能力之小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類)之對應CDR之殘基替換。在一些情況中，人類免疫球蛋白之一或多個FR區殘基亦可被對應非人類殘基替換。另外，人源化抗體可包含未見於接受者抗體或供者抗體之殘基。為進一步改善人源化抗體的性能，可以進行此等修飾。亦可在CDR區中進行一或多種修飾以改良及改善例如親和力成熟抗體之人源化抗體的性能。人源化抗體H鏈或L鏈可包含實質上所有至少一個或多個可變區，其中所有或實質上所有CDR對應於彼等非人類免疫球蛋白之CDR及所有或實質上所有FR為彼等人類免疫球蛋白序列之FR。在某些實施例中，人源化抗體將包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常來自人類免疫球蛋白之Fc。雖然為熟習此項技術者已知，但若需要，則更多細節可參見例如Jones等人，1986，Nature，321:522-525；Riechmann等人，1988，Nature，332:323-329；及Presta，1992，Curr. Op. Struct. Biol.，2:593-596；Carter等人，1992，Proc. Natl. Acd. Sci. USA，89: 4285-4289；及美國專利第6,800,738號(在2004年10月5日頒予)、第6,719,971號(在2005年9月27日頒予)、6,639,055(在2003年10月28日頒予)、第6,407,213號(在2002年6月18日頒予)及第6,054,297號(在2000年4月25日頒予)。 本文中，術語「人類抗體」及「完全人類抗體」可互換使用，且係指具有胺基酸序列之抗體，該胺基酸序列對應於人類所產生及/或已利用由熟習此項技術者實踐之製造人類抗體之任何技術製造之抗體之胺基酸序列。具體而言，人類抗體之該定義排除包含非人類抗原結合殘基之人源化抗體。可利用此項技術中已知的各種技術，包括噬菌體展示庫(Hoogenboom及Winter，1991，J. Mol. Biol.，227:381；Marks等人，1991，J. Mol. Biol.，222:581)及酵母展示庫(Chao等人，2006，Nature Protocols，1: 755-768)，產生人類抗體。同樣可用於製備人類單株抗體的係Cole等人，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R. Liss，第77頁；Boerner等人，1991，J. Immunol.，147(1):86-95中描述之方法。亦可參見van Dijk及van de Winkel，2001，Curr. Opin. Pharmacol.，5: 368-74。可藉由將抗原投與至內源Ig基因座已失效及已經過基因修飾成具有編碼人類抗體之人類免疫球蛋白基因之轉殖基因動物(例如小鼠)來製備人類抗體，使得響應於抗原激發(challenge)而產生人類抗體 (參見，例如，Jakobovits, A.，1995，Curr. Opin. Biotechnol.，6(5):561-6；Brüggemann及Taussing，1997，Curr. Opin. Biotechnol.，8(4):455-8；及美國專利第6,075,181號及第6,150,584號，關於XENOMOUSE
TM
技術)。關於經由人類B-細胞融合瘤技術產生之人類抗體，亦可參見，例如，Li等人，2006，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557-3562。在特定實施例中，人類抗體包含源自人類之可變區及恆定區。在某些實施例中，「完全人類」抗-PD-L1抗體亦可包含結合PD-L1多肽且由為人類生殖系免疫球蛋白核酸序列之天然生成之體細胞變異體之核苷酸序列編碼之抗體。在一個特定實施例中，本文所提供之抗-PD-L1抗體為完全人類抗體。術語「完全人類抗體」包括具有對應於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變及恆定區之抗體，如Kabat等人所述(參見Kabat等人 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH出版物第91-3242號)。詞組「重組人類抗體」包括藉由重組方法製造、表現、建立或單離之人類抗體，諸如使用轉染至寄主細胞中之重組表現載體表現之抗體；自重組組合式人類抗體庫單離之抗體；自針對人類免疫球蛋白基因轉殖基因及/或轉殖染色體之動物(例如，小鼠或牛)單離之抗體(參見，例如，Taylor, L. D.等人，1992，Nucl. Acids Res. 20:6287-6295)；或藉由任何其他涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的方法製造、表現、建立或單離之抗體。此等重組人類抗體可具有源自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變及恆定區(參見Kabat, E. A.等人，同上)。然而，在某些實施例中，此等重組人類抗體係經受活體外誘變(或當使用針對人類Ig序列轉殖基因之動物時，活體內體細胞誘變)及因此重組抗體之V
H
及V
L
區的胺基酸序列為以下序列：雖然衍生自人類生殖系V
H
及V
L
序列及與其相關，但可非天然存在於活體內人類抗體生殖系庫中。 如本文中所使用，術語「抗原決定基」為單一抗體分子所結合的抗原分子之表面上之位點或區域，諸如抗原(例如，能夠被抗-PD-L1或抗-醣化PD-L1抗體之一或多個抗原結合區結合之PD-L1多肽或醣化PD-L1多肽)之表面上之局部區域。抗原決定基可具免疫原性且能夠引起動物免疫反應。抗原決定基不一定需要具免疫原性。抗原決定基通常由分子(諸如胺基酸或糖側鏈)之化學活性表面分組組成且具有特異性三維結構特徵及特異性電荷特徵。抗原決定基可為線性抗原決定基或構象抗原決定基。多肽之有助於抗原決定基之區域可為多肽之鄰接胺基酸，其形成線性抗原決定基，或抗原決定基可由多肽之兩個或更多個非鄰接胺基酸或區域形成，通常稱為構象抗原決定基。抗原決定基可係或可不係抗原之三維表面特徵。在某些實施例中，PD-L1抗原決定基係PD-L1多肽之三維表面特徵。在其他實施例中，PD-L1抗原決定基係PD-L1多肽之線性特徵。在一些實施例中，PD-L1抗原決定基係在一或多個位點處醣化。一般而言，抗原具有若干或許多不同抗原決定基及可與許多不同抗體反應。在一個特定實施例中，如本文所述的抗-醣化PD-L1抗體結合PD-L1(尤其係醣化PD-L1)之抗原決定基，其為構象抗原決定基。 抗體結合「抗原決定基」或與參考抗體「基本上相同的抗原決定基」或「相同的抗原決定基」，當兩種抗體在三維空間中識別相同、重疊或相鄰抗原決定基時。用於確定兩種抗體在三維空間中是否結合至相同、重疊或相鄰抗原決定基之最廣泛使用且快速的方法為競爭檢定，其可例如使用經標記抗原或經標記抗體以多種不同形式配置。在一些檢定中，將抗原固定於96-孔板上，或於細胞表面上表現，及未標記抗體阻斷經標記抗體與抗原結合之能力係使用可檢測信號(例如，放射性、螢光或酵素標記)測量。另外，可確定抗體之抗原決定基且然後使用此項技術中已知並例如於本文實例8中描述的方法進行比較。 術語「競爭」在用於競爭PD-L1靶蛋白或其肽上之相同抗原決定基或結合位點之抗-PD-L1抗體情況中時意指如藉由檢定確定的競爭，其中本研究中抗體防止、阻斷或抑制參考分子(例如，參考配位體或參考抗原結合蛋白，諸如參考抗體)與共同抗原(例如，PD-L1或其片段)特異性結合。多種競爭結合檢定可用於確定測試抗體是否與參考抗體競爭結合至PD-L1(例如，人類PD-L1或人類醣化PD-L1)。可採用的檢定之實例包括固相直接或間接放射免疫檢定 (RIA)；固相直接或間接酵素免疫檢定(EIA)；三明治競爭檢定(參見，例如，Stahli等人，1983，Methods in Enzymology 9: 242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白(Avidin)EIA(參見，例如，Kirkland等人，1986，J. Immunol. 137: 3614-3619)；固相直接標記檢定；固相直接標記三明治檢定(參見，例如，Harlow及Lane，1988，Antibodies，實驗室手冊，Cold Spring Harbor Press)；固相直接標記RIA，其使用經標記碘(1
125
標記)(參見，例如，Morel等人，1988，Molec. Immunol. 25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見，例如，Cheung等人，1990，Virology 176:546-552)；及直接標記RIA(Moldenhauer等人，1990，Scand. J. Immunol. 32:77-82)。通常，此檢定涉及使用結合至固體表面之經純化抗原(例如，PD-L1，諸如人類PD-L1或醣化PD-L1)、或具有未標記測試抗原結合蛋白(例如，測試抗-PD-L1抗體)或經標記參考抗原結合蛋白(例如，參考抗-PD-L1抗體)中任一者之細胞。競爭性抑制作用可藉由測定在存在已知量之測試抗原結合蛋白質下結合至固體表面或細胞之標籤之量來測定。通常，測試抗原結合蛋白質係以過量形式存在。藉由競爭檢定識別之抗體(競爭抗體)包括結合至與參考抗體相同之抗原決定基之抗體及/或結合至與由參考抗體所結合的抗原決定基足夠接近之相鄰抗原決定基(從而產生空間位阻)之抗體。本文中描述關於用於確定競爭結合之方法之其他細節。通常，當競爭抗體蛋白係以過量形式存在時，其將抑制參考抗體與共同抗原之特異性結合至少15%、或至少23%，例如，非限制性地，40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%或更大及介於所述量之間的量百分率。在一些情況中，抑制結合至少80%、85%、90%、95%、96%或97%、98%、99%或更大。 如本文中所使用，術語「阻斷性」抗體或「拮抗劑」抗體係指防止、抑制、阻斷或減小其所結合抗原之生物或功能性活性之抗體。阻斷性抗體或拮抗劑抗體可實質上或完全防止、抑制、阻斷或減小抗原之生物活性或功能。例如，阻斷性抗-PD-L1抗體可防止、抑制、阻斷或減小PD-L1與PD-1間的結合相互作用，由此防止、阻斷、抑制或減小與PD-1/PD-L1相互作用相關聯之免疫抑制功能。本文中，術語阻斷、抑制及中和可互換使用，及係指如本文所述抗-PD-L1抗體防止或以其他方式破壞或減小PD-L1/PD-1相互作用之能力。 如本文中所使用，術語「多肽」或「肽」係指連續陣列中經肽鍵連接之三個或更多個胺基酸之胺基酸聚合物。「多肽」可為蛋白質、蛋白質片段、蛋白質類似物、寡肽及類似者。包含多肽之胺基酸可源自天然或係合成的。多肽可自生物樣本純化。例如，PD-L1多肽或肽可由人類PD-L1或醣化PD-L1之至少3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個或25個鄰接胺基酸組成。在一些實施例中，多肽具有人類PD-L1或醣化PD-L1之至少25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、105個、110個、115個、120個、125個、130個、135個、140個、145個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、210個、220個、230個、240個、250個、260個、270個、280個或285個鄰接胺基酸。在某些實施例中，PD-L1多肽包含PD-L1多肽或醣化PD-L1多肽之胺基酸序列之至少5個鄰接胺基酸殘基、至少10個鄰接胺基酸殘基、至少15個鄰接胺基酸殘基、至少20個鄰接胺基酸殘基、至少25個鄰接胺基酸殘基、至少40個鄰接胺基酸殘基、至少50個鄰接胺基酸殘基、至少60個鄰接胺基酸殘基、至少70個鄰接胺基酸殘基、至少80個鄰接胺基酸殘基、至少90個鄰接胺基酸殘基、至少100個鄰接胺基酸殘基、至少125個鄰接胺基酸殘基、至少150個鄰接胺基酸殘基、至少175個鄰接胺基酸殘基、至少200個鄰接胺基酸殘基、至少250個鄰接胺基酸殘基。 如本文中所使用，術語「類似物」係指具有與參考多肽相似或相同的功能但不一定包含參考多肽之相似或相同胺基酸序列之多肽、或具有參考多肽之相似或相同結構之多肽。參考多肽可為PD-L1多肽、PD-L1多肽之片段、抗-PD-L1抗體或抗-醣化PD-L1抗體。具有與參考多肽相似的胺基酸序列之多肽係指具有與參考多肽之胺基酸序列至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同的胺基酸序列之多肽，該參考多肽可為如本文所述之PD-L1多肽或抗-PD-L1抗體。具有與參考多肽相似的結構之多肽係指具有與參考多肽之結構相似的二級、三級或四級結構之多肽，該參考多肽可為本文所述之PD-L1多肽或PD-L1抗體。可藉由熟習此項技術者已知的方法，包括(但不限於)X-射線結晶學、核磁共振及結晶學電子顯微鏡，來確定多肽之結構。較佳地，該類似物作用為雙功能抗-醣化PD-L1抗體。 如本文中所使用，術語「變異體」當在就PD-L1多肽或抗-PD-L1抗體而言使用時係指相比天然或未修飾PD-L1序列或抗-PD-L1抗體序列具有一或多個(諸如，例如，約1個至約25個、約1個至約20個、約1個至約15個、約1個至約10個或約1個至約5個)胺基酸序列取代、缺失及/或增加之多肽或抗-PD-L1抗體。例如，PD-L1變異體可由天然PD-L1之胺基酸序列之一或多個(諸如，例如，約1個至約25個、約1個至約20個、約1個至約15個、約1個至約10個或約1個至約5個)變化所致。此外，例如，抗-PD-L1抗體之變異體可由天然或先前未修飾抗-PD-L1抗體之胺基酸序列之一或多個(諸如，例如，約1個至約25個、約1個至約20個、約1個至約15個、約1個至約10個或約1個至約5個)變化所致。多肽變異體可自編碼該變異體之對應之核酸分子製備。在某些實施例中，該變異體為在一或多個CDR或構架區中具有一或多個胺基酸取代、缺失或***之抗-醣化PD-L1抗體，及較佳地，該類似物作用為雙功能抗-醣化PD-L1抗體。 術語「同一性」係指兩個或更多個多肽分子或兩個或更多個核酸分子之序列之間的關係，如藉由比對並比較該等序列來判定。「同一性百分率」意指所比較的分子中之胺基酸或核苷酸間相同殘基的百分率且基於所比較分子中最小分子的尺寸計算得。基於此等計算之目的，比對中的空位(若存在)須要藉由特定數學模型或電腦程式(例如「演算法」)定址。可用於計算所比對核酸或多肽之同一性的方法包括彼等述於Computational Molecular Biology，Lesk，A. M.編，1988，New York: Oxford University Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects，Smith, D. W.編，1993，New York: Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data，第I部分，Griffin, A. M.及Griffin, H. G.編，1994，New Jersey:Humana Press；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje, G.，1987，New York: Academic Press；Sequence Analysis Primer，Gribskov, M.及Devereux, J.編，1991，New York:M. Stockton Press；及Carillo等人，1988，SIAM J. Applied Math.，48:1073中之方法。 在同一性百分率之計算中，所比較的序列可以使得該等序列間最大匹配之方法進行比對。可用於確定同一性百分率之電腦程式之一個實例為GCG程式包，其包括GAP(Devereux等人，1984，Nucl. Acid Res.，12:387；Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)，其係一用於比對兩種多肽或多核苷酸以確定其序列同一性百分率之電腦演算法。該等序列可經比對以最佳地匹配其各自的胺基酸或核苷酸序列(「匹配跨度」，如藉由該演算法來確定)。空位開放罰分(其經計算為平均對角線的3倍，其中該「平均對角線」為所使用比較矩陣之對角線之平均，及該「對角線」為藉由特定比較矩陣指定給每對完美胺基酸匹配之評分或數值)；及空位延伸罰分(其通常為空位開放罰分的1/10倍)、以及比較矩陣(諸如PAM 250或BLOSUM 62)係結合該演算法使用。在某些實施例中，演算法亦使用標準比較矩陣(關於PAM 250比較矩陣，可參見Dayhoff等人，1978，Atlas of Protein Sequence and Structure，5:345-352；關於BLOSUM 62比較矩陣可參見Henikoff等人，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89: 10915-10919)。使用GAP程式以確定多肽或核苷酸序列之同一性百分率之例示性參數包括下列：(i)演算法：Needleman等人，1970，J. Mol.Biol.，48: 443-453；(ii)比較矩陣：BLOSUM 62，Henikoff等人，同上；(iii)空位罰分：12 (但不含末端空位罰分)；(iv)空位長度罰分：4；及(v)相似性臨限值：0。 用於比對兩種胺基酸序列之某些比對方案可僅使此兩個序列之短的區域進行匹配，及該所比對的小的區域可具有極高的序列同一性，即使此兩個全長序列之間無明顯關係。因此，可視需要調整所選比對方法(例如，GAP程式)以產生在靶多肽之跨代表性數量之胺基酸(例如，至少50個鄰接胺基酸)範圍之比對。 將關於參考多肽序列之胺基酸序列同一性百分率(%)定義為在比對序列並引入空位後(若有必要)達成最大序列同一性百分率，及未考慮任何保守取代為序列同一性之一部分時，候選序列中胺基酸殘基與參考多肽序列中胺基酸殘基相同之百分率。為確定百分比胺基酸序列一致性之目的，可以熟練專業者技術範圍內的方法實現比對，例如，利用公開可用的計算軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可決定用於比對序列之適宜參數，包括為得到最大對齊對所比較序列之全部長度所必須之任何算法。 如本文中所使用，術語「衍生物」係指包含參考多肽之已藉由引入胺基酸殘基取代、缺失或新增改變之胺基酸序列之多肽。該參考多肽可為PD-L1多肽或抗-PD-L1抗體。如本文中所使用，術語「衍生物」亦指已例如藉由將任何類型之分子共價連接至多肽而化學修飾之PD-L1多肽或抗-PD-L1抗體。例如，PD-L1多肽或抗-PD-L1抗體可例如藉由醣化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、藉由已知保護基/阻斷基衍生化、蛋白酶裂解、與細胞配位體連接、與肽或蛋白標籤分子或其他蛋白質連接等化學修飾。該等衍生物係以不同於天然生成或起始肽或多肽之方法在所連接分子之類型或位置方面進行修飾。衍生物可進一步包括缺失天然存於肽或多肽上之一或多個化學基團。藉由化學修飾，使用熟習此項技術者已知的技術，包括(但不限於)特異性化學裂解、乙醯化、調配、藉由衣黴素(tunicamycin)代謝合成等，可化學修飾PD-L1多肽或抗-PD-L1抗體之衍生物。此外，PD-L1多肽或抗-PD-L1抗體之衍生物可包含一或多個非經典胺基酸。多肽衍生物具有與參考多肽相似或相同的功能，該參考多肽可為本文中所述之PD-L1多肽或抗-PD-L1抗體，尤其係雙功能抗-醣化PD-L1單株抗體。 如本文中所使用，術語「融合蛋白質」係指包含至少兩個異源多肽之胺基酸序列之多肽。術語「融合」當在與PD-L1多肽或抗-PD-L1抗體結合使用時係指將PD-L1多肽或抗-PD-L1抗體、其變異體及/或衍生物與異源肽或多肽接合、融合或偶聯。在某些實施例中，融合蛋白質保留PD-L1多肽或抗-PD-L1抗體之生物活性。在某些實施例中，融合蛋白質包含偶聯、融合或接合至異源肽或多肽之PD-L1抗體V
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區、V
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區、V
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CDR(一個、兩個或三個V
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CDR)及/或V
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CDR(一個、兩個或三個V
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CDR)，其中該融合蛋白質係結合至PD-L1蛋白或肽上之抗原決定基。在其他實施例中，提供融合至Fc域(較佳地，人類Fc域)之醣化PD-L1肽。融合蛋白質可藉由如此項技術中所實施之化學偶聯反應或藉由分子重組技術製備。 如本文中所使用，術語「組合物」係指以視需要指定或有效量包含有指定組成成分(例如，本文所提供之多肽或抗體)之產品、以及直接或間接藉由特定組成成分以視需要指定或有效量組合或相互作用產生之任何所需產品。 如本文中所使用，術語「載劑」包括醫藥上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑、媒劑或穩定劑，其在所採用劑量及濃度下對暴露於該等載劑之細胞或哺乳動物無毒。通常，生理上可接受之載劑為pH緩衝水溶液。生理上可接受之載劑之實例包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(例如，小於約10個胺基酸殘基)多肽；蛋白，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、穀胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、蔗糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露糖或山梨糖醇；鹽形成抗衡離子，諸如鈉；及/或非離子表面活性劑，諸如TWEEN™、聚乙二醇(PEG)及PLURONICS™。術語「載劑」亦可指與治療劑一起投與之稀釋劑、佐劑(例如，費氏(Freund's)完全或不完全佐劑)、賦形劑或媒劑。該等載劑(包括醫藥載劑)可為無菌液體，諸如水及油，包括石油、動物油、植物油或合成油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及類似者。當組合物(例如醫藥組合物)經靜脈內投與時，水係例示性載劑。亦可使用鹽水溶液及葡萄糖及甘油水溶液作為液體載劑(尤其就注射溶液而言)。適宜的賦形劑(例如醫藥賦形劑)包括(但不限於)澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙二醇、水、乙醇及類似者。若需要，該組合物亦可包含少量潤濕劑或乳化劑或pH緩衝劑。組合物可呈溶液、懸浮液、乳劑、錠劑、丸劑、膠囊、粉劑、持續釋放調配物及類似者之形式。口服組合物(包括調配物)可包含標準載劑，諸如醫藥級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。適宜醫藥載劑的實例述於Remington’s Pharmaceutical Sciences，1990，Mack Publishing Co.，Easton, PA中。組合物(包括醫藥化合物)可包含例如呈單離或純化形式之治療有效量之抗-PD-L1抗體(諸如抗-醣化PD-L1抗體)，連同適宜量的載劑一起，以便提供適合恰當投與給個體(例如患者)之形式。該組合物或調配物應適於投與模式。 如本文中所使用，術語「賦形劑」係指惰性物質，其通常用為稀釋劑、媒劑、防腐劑、黏結劑或穩定劑，且包括(但不限於)蛋白質(例如血清白蛋白等)、胺基酸(例如，天冬胺酸、麩胺酸、離胺酸、精胺酸、甘胺酸、組胺酸等)、脂肪酸及磷脂(例如，磺酸烷基酯、辛酸酯等)、表面活性劑(例如，SDS、聚山梨醇酯、非離子表面活性劑等)、醣類(例如，蔗糖、麥芽糖、海藻糖等)及多元醇(例如，甘露醇、山梨糖醇等)。作為參考，亦可參見Remington’s Pharmaceutical Sciences, 同上，該案係以其全文引用的方式併入本文中。 如本文中所使用，術語「醫藥上可接受」或「藥理上可接受」係指當適宜地投與給動物(諸如人類)時不會產生不良、過敏性或其他不希望出現或不必要之反應之分子實體、調配物及組合物。熟習此項技術者根據本發明，如Remington's Pharmaceutical Sciences, 同上所例示，可知曉包含抗體或其他活性成分之醫藥組合物之製備。此外，就動物(例如人類)投與而言，應明瞭製劑需符合如聯邦或州政府之管理機構(諸如FDA生物標準辦公室)所要求或如美國藥典、歐洲藥典或用於動物(及更特定言之人類)之其他大體上認可之藥典中所列之無菌性、無熱原性、一般安全性及純度標準。 術語「醫藥調配物」係指一種製劑，其呈可允許活性成分(例如抗-PD-L1抗體及抗-醣化PD-L1抗體)之生物活性有效之該種形式且不含對將投與調配物之個體而言係不可接受毒性之其他組分。該調配物可係無菌，即，滅菌或不含所有活的微生物及其孢子等。 術語「包裝插頁」用於指通常包括在治療性產品商業包裝中之指示說明，其包含關於與該等治療性產品之使用有關的適應症、用法、劑量、投藥、禁忌症及/或警示之資訊。 如本文中所使用，術語「治療」係指投與或施用治療劑至有此需要的個體，或為達成至少一種陽性治療效應或效益，諸如治療疾病或健康相關病症之目的而對個體進行程序或方法。例如，治療可包括投與醫藥有效量之特異性結合至醣化PD-L1之抗體、或其組合物或調配物以達成治療各種類型癌症之目的。術語「治療療程」、「給藥療程」或「給藥方案」可互換使用及係指治療劑(諸如所述抗-醣化PD-L1抗體)之時間設定及劑量。如本文中所使用，術語「個體」係指罹患癌症或診斷罹患癌症之人類或非人類動物(諸如靈長類、哺乳動物及脊椎動物)。在較佳實施例中，該個體為人類。在一些實施例中，該個體為癌症患者。在一個實施例中，有需要的個體將或預期從雙功能抗-醣化PD-L1抗體治療獲益。 如本文中所使用，術語「治療效益」或「治療有效」係指在病症之醫學治療、療法、劑量投與方面，尤其作為使用雙功能抗-醣化PD-L1抗體及進行所述方法之結果，促進或增強有需要的個體(例如，罹患癌症或診斷罹患癌症之個體)之健康。此包括(但不限於)減小疾病之徵兆或症狀之頻率或嚴重度。例如，癌症之治療可涉及例如減小腫瘤尺寸，減少腫瘤之侵襲或嚴重度，減少癌細胞侵潤進入至周邊組織或器官中；減小腫瘤或癌症之生長速率，或預防或減少轉移。癌症之治療亦可係指在個體中達成持續反應或延長罹患癌症之個體之存活期。 如本文中所使用，術語「投與」或「投藥」係指物理上遞送(例如，藉由注射或經口途徑)存於體外的物質至患者中之動作，諸如藉由口服、皮下、黏膜、皮內、靜脈內、肌肉內遞送及/或本文所述或此項技術中已知之任何其他物理遞送方法。當疾病、病症或病狀或其症狀進行治療性治療時，物質之投與通常係在疾病、病症或病狀或其症狀之發作之後進行。預防性治療涉及在疾病、病症或病狀或其症狀之發作之前的某一時間投與物質。 如本文中所使用，術語「有效量」係指足以減輕、消除、緩解及/或改善癌症或與其有關之症狀之嚴重度及/或持續時間之治療劑(例如，本文所提供之抗體或醫藥組合物)之量。該術語亦包含減慢或改善癌症前進或進展所需的量；減慢或改善癌症之復發、發展或發作；及/或改良或增強另一癌症療法(例如，除了投與本文所提供抗-PD-L1抗體或抗-醣化PD-L1抗體之外的療法)之預防性或治療性效應。在一些實施例中，本文所提供抗體之有效量為約或等於0.1 mg/kg(每kg個體體重之mg抗體)至約或等於100 mg/kg。在某些實施例中，本文所提供抗體之有效量為約或等於0.1 mg/kg、約或等於0.5 mg/kg、約或等於1 mg/kg、約或等於3 mg/kg、約或等於5 mg/kg、約或等於10 mg/kg、約或等於15 mg/kg、約或等於20 mg/kg、約或等於25 mg/kg、約或等於30 mg/kg、約或等於35 mg/kg、約或等於40 mg/kg、約或等於45 mg/kg、約或等於50 mg/kg、約或等於60 mg/kg、約或等於70 mg/kg、80 mg/kg、90 mg/kg或100 mg/kg。此等量意欲包括其中之量及範圍。在一些實施例中，「有效量」亦指本文所提供抗體達成指定結果(例如，防止、阻斷或抑制細胞表面PD-1與細胞表面PD-L1結合；或防止、阻斷或抑制由PD-1/PD-L1介導之免疫抑制)的量。 術語「組合」在投與其他療法(例如，其他藥劑、癌症藥物、癌症療法)情形中包括使用多於一種療法(例如，藥物療法及/或癌症療法)。「組合」一或多種其他治療劑之投與包括同時(例如合併)及以任何順序連續投與。使用術語「組合」並不限制療法投與給個體之順序。舉非限制性實例而言，第一療法(例如，藥劑，諸如抗-醣化PD-L1抗體)可在投與第二療法(例如藥劑)至具有或診斷罹患癌症之個體之前(例如，1分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週、8週、9週、10週、11週或12週)、與其同時、或之後(例如，1分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、12小時、24小時、48小時、72小時、6小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週或12週或更長時間)投與。 療法之組合(例如，使用藥劑，包括治療劑)可比任何兩種或更多種單一療法之相加效應更有效(例如，具有協同效應)或可具有前述未預測到的其他效益，諸如副作用特性改良、治療效應之功效增加或持續時間延長、該組合係有效的患者群體增大等。該效應通常係出人意外的且無法預測。例如，治療劑之組合之協同效應通常允許使用減小劑量之一或多種該等藥劑及/或對癌症患者較不頻繁地投與該等藥劑。利用減小劑量之治療劑及癌症療法及/或較不頻繁地投與治療劑之能力降低發生與對個體投與療法相關聯之毒性之可能而不減小療法之有效性。另外，協同效應可使得療法在治療或改善癌症中之功效改良。此外，藉由療法(例如治療劑)之組合證實之協同效應可避免或減小與任何單一療法之使用相關聯之不良或不想要的副作用。
雙功能抗 - 醣化 PD-L1 抗體
本文提供結合至醣化PD-L1蛋白(例如，具有特異性N-聚醣結構之PD-L1蛋白；PD-L1之特異性醣肽)或醣化PD-L1肽之抗體或其結合片段且係雙功能的，因其減小或阻斷PD-L1/PD-1相互結合及亦促進腫瘤細胞上PD-L1之內部化及降解以及該等抗體在治療疾病(特定言之癌症)中之用途。相比非醣化PD-L1，該等抗體優先地結合至醣化PD-L1。如本文所述之雙功能抗-醣化PD-L1抗體可係IgG、IgM、IgA、IgD及IgE Ig類別，以及包含保留抗原結合活性之抗體CDR域之多肽。說明性地，雙功能抗-醣化PD-L1抗體可為嵌合、親和力成熟、人源化或人類抗體。在一個較佳實施例中，雙功能抗-醣化PD-L1抗體為單株抗體。在某些實施例中，該單株抗-醣化PD-L1抗體為STM073或STM108。在另一個較佳實施例中，該雙功能抗-醣化PD-L1抗體為人源化抗體或嵌合抗體，特定言之STM073或STM108之人源化或嵌合形式。藉由已知方法及如本文所述，可建立對醣化PD-L1抗原、其各自抗原決定基中之一或多者或前述任何者之共軛物具特異性之多株或單株抗體、抗體片段、結合域及CDR(包括前述任何者之工程化形式)，不論該等抗原或抗原決定基是否單離自天然來源或為天然化合物之合成衍生物或變異體。該等抗體可係雙特異性或雙互補位。 在一個實施例中，該抗體為嵌合抗體，例如，包含來自接枝至異源非人類、人類或人源化序列(例如，構架及/或恆定域序列)之非人類供者之抗原結合序列(例如，V域及/或CDR)之抗體。在一個實施例中，非人類供者序列係源自小鼠或大鼠。在特定實施例中，該V
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及V
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域係非人類的，例如，鼠類及恆定域係人類的。在一個實施例中，抗原結合序列係合成的，例如，藉由誘變(例如，人類噬菌體庫之噬菌體展示篩選等)獲得。在一個實施例中，嵌合抗體具有鼠類V區及人類C區。在一個實施例中，鼠類輕鏈V區係融合至人類κ輕鏈C區。在一個實施例中，鼠類重鏈V區係融合至人類IgG1 C區。 在一個實施例中，抗體為源自駱駝科抗體(較佳源自重鏈駱駝科抗體，不含輕鏈)之免疫球蛋白單可變域，其已知為V
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H域序列或Nanobodies™。Nanobody™ (Nb)為天然生成之單鏈抗體之最小功能性片段或單可變域(V
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H)及為熟習此項技術者已知。其等僅衍生自在駱駝科中看到的抗體之重鏈(Hamers-Casterman等人，1993，Nature，363: 446-448；Desmyter等人，1996，Nat. Struct. Biol.，第803-811頁)。在「駱駝科」家族中，發現不含多肽輕鏈之免疫球蛋白。「駱駝科」包含舊世界的駱駝(雙峰駱駝(Camelus bactrianus)及單峰駱駝(Camelus dromedarius))及新世界的駱駝(例如，羊駝(Lama paccos)、大羊駝(Lama glama)、原駝(Lama guanicoe)及駝馬(Lama vicugna))。本文中，該單可變域重鏈抗體稱為Nanobody™或V
H
H抗體。Nb之小尺寸及獨特生物物理性質優於用於識別非常見或隱藏式抗原決定基及用於結合進入至蛋白質標靶之腔或活性位點中之習知抗體片段。此外，Nb可設計為連接至報導子分子之多重特異性及多價抗體、或人源化抗體。Nb係穩定的，在胃-腸系統中存活且可輕易地製造。 在另一個實施例中，該抗體為雙特異性抗體。使兩個具不同特異性之抗原結合位點統一成單構築體，雙特異性抗體具有使得兩個具有強特異性之離散抗原結合在一起之能力及因此具有作為治療劑之極大潛能。雙特異性抗體初始係藉由將兩個融合瘤(各者能夠產生不同免疫球蛋白)融合製備。雙特異性抗體亦可藉由將兩個scFv抗體片段接合同時除去存於全免疫球蛋白中之Fc部分產生。該等構築體中之各scFv單元可包含一個來自抗體重鏈(V
H
)及輕鏈(V
L
)中各者之可變域，經由合成多肽連接子彼此接合，該連接子通常係經基因改造為具最小免疫原性同時最大程度上保留抗蛋白分解性。各自的scFv單元可藉由多種已知技術接合，該等技術包括併入橋接兩個scFv單元之短(通常少於10個胺基酸)多肽間隔基團，藉此建立雙特異性單鏈抗體。因此，所得雙特異性單鏈抗體為單多肽鏈上含有兩個具不同特異性之V
H
/V
L
對之物種，其中各自scFv單元中之V
H
及V
L
域係間隔長到足夠允許此兩域之間分子間締合之多肽連接子，使得經如此形成之scFv單元係藉由保持短到足以防止例如一個scFv單元之V
H
域與另一scFv單元之V
L
之間發生不想要的締合之多肽間隔基團彼此連續接合。 在另一個實施例中，該抗體為雙互補位抗體。如本文中所使用，術語「雙互補位抗體」係指包含識別並結合至相同蛋白標靶(例如，如本文所述之與腫瘤相關聯之PD-L1靶抗原或醣化PD-L1靶抗原)上兩個不同非重疊抗原決定基、抗原決定子或域之兩個抗原結合域之雙特異性結合分子。在一個實施例中，針對如本文所述之醣化PD-L1或其一或多個肽部分之雙互補位抗體包含第一免疫球蛋白可變域及第二免疫球蛋白可變域，其中該兩個結合域結合至相同靶醣化PD-L1蛋白上之兩個不同非重疊抗原決定基。藉由該第一及第二免疫球蛋白結合域識別之抗原決定基中之一者或兩者可經醣化或包含醣化殘基。較佳地，該等免疫球蛋白中之至少一者相對於非醣化形式優先結合醣化PD-L1蛋白之醣化形式。 在另一個實施例中，雙互補位抗體包含結合至醣化PD-L1靶分子上抗原決定基之免疫球蛋白(較佳係四價IgG)及結合至相同醣化PD-L1靶分子上之不同且非重疊抗原決定基之scFv，其中該免疫球蛋白及scFv係經連接子連接以允許免疫球蛋白及scFv結合至醣化PD-L1靶分子上之不同且非重疊抗原決定基。因此，雙互補位抗體係自結合至相同醣化PD-L1標靶上不同抗原決定基(或域)之兩種抗-醣化PD-L1抗體(即雙互補位結合)產生以增強結合親和力/結合性；以增加腫瘤細胞上之抗體負載以促進效應子功能，諸如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)；及/或以改良或增加腫瘤保留時間。此外，靶向與腫瘤相關聯之醣化PD-L1抗原上之兩個非重疊抗原決定基之二價雙互補位抗體具有引起細胞膜中醣化PD-L1靶分子叢集之潛力，此繼而可促進增加之內部化、溶酶體遷移及降解。可使用相關技術中已知的技術產生針對靶蛋白/抗原上兩個不同非重疊抗原決定基之雙互補位抗體。參見，例如，B. Roberts等人，1999，Int. J. Cancer，第81卷: 285-291 (癌胚抗原，CEA)；D. Lu等人，1999，J. Immunol. Methods，第
230
卷: 159–71(血管內皮生長因子受體2，VEGF2)；WO 2009/068627，Ablynx NV，在2009年6月4日公開；WO 2010/142534、及Ablynx NV，在2010年12月16日公開。 在一個實施例中，二價雙互補位抗體可藉由使用來自兩種不同的識別並結合至所給醣化PD-L1靶蛋白上不同非重疊抗原決定基之如本文所述識別的抗-醣化PD-L1抗體之可變域序列產生，其中該抗體包含連接至H鏈及/或L鏈的N-端，或替代性地，識別醣化PD-L1上之不同且非重疊抗原決定基之第二抗-PD-L1抗體之C
H
3域的C-端之抗-醣化PD-L1抗體中之一者之單鏈可變片段(scFv)。scFv可藉由肽連接子，例如，諸如彼等用於連接scFv中結合域者連接至第二抗-PD-L1抗體。參見，例如，Dimasi等人，J. Mol. Biol.，393: 672-692 (2009)。所得結合分子產物(或雙互補位抗體)包含四個抗-醣化PD-L1結合單元或每個分子臂上兩個結合單元，該等單元能夠與醣化PD-L1上兩種不同抗原決定基相互作用並與其結合。根據該實施例，靶向表現於腫瘤細胞表面上之醣化PD-L1上兩種非重疊抗原決定基之二價雙互補位抗體可藉由抗原決定基結合有效地使醣化PD-L1交聯以引起細胞表面上醣化PD-L1叢集，從而導致形成引發並促進增強之內部化及溶酶體降解之大複合物。在一個實施例中，雙互補位抗體係連接至毒素或抗癌藥物以產生如本文進一步描述之抗體-藥物共軛物(ADC)。該等抗-PD-L1雙互補位抗體之經增強之內部化及胞吞作用及溶酶體遷移最終導致更多量毒素遞送至靶細胞中及更多腫瘤細胞殺死或消退。如針對雙互補位抗-HER2 ADC所述在活體外及活體內均觀察到該等效應(J.Y. Li等人，2016，Cancer Cell，第29卷: 117-129)。闡釋性地，可產生雙互補位抗-醣化PD-L1抗體或抗-醣化PD-L1 ADC，其特異性結合至醣化膜結合之PD-L1之兩個非重疊抗原決定基以防止或阻斷其與其PD-1同源結合搭配物相互作用及促進其內部化及降解以及腫瘤細胞之殺死(若使用抗-醣化PD-L1 ADC)。在特定實施例中，抗-醣化PD-L1抗體為STM073、STM108或其ADC形式。 在其他實施例中，本發明所包涵的抗-醣化PD-L1結合分子或抗體可係多重互補位，即，包含會識別並結合相同醣化PD-L1靶分子上三個、四個或更多個不同(較佳非重疊)抗原決定基或抗原決定子之抗原結合域。於其他實施例中，該等抗-醣化PD-L1抗體係雙互補位或多重互補位且係多價，即，亦包含會識別並結合至不同靶醣化PD-L1分子上一或多個不同抗原決定基或抗原決定子之抗原結合位點或「互補位」。 適合使用之抗體片段的實例包括(但不限於)：(i)Fab片段，其係由V
L
、V
H
、C
L
及C
H1
域組成；(ii)「Fd」片段，其係由V
H
及C
H1
域組成；(iii)「Fv」片段，其係由單一抗體V
L
及V
H
域組成；(iv)「dAb」片段，其係由V
H
域組成；(v)經單離的CDR區；(vi) F(ab')2片段，其係二價片段，其包含兩個經連接之Fab片段；(vii)單鏈Fv分子(「scFv」)，其中該V
H
域及V
L
域係藉由使該兩域締合形成結合域的肽連接子連接；(viii)雙特異性單鏈Fv二聚物(參見美國專利第5,091,513號)；及(ix) 由基因融合構築的雙功能抗體、多價或多重特異性片段(美國專利申請公開案第20050214860號)。Fv、scFv或雙功能抗體分子可藉由併入連接V
H
與V
L
域之雙硫橋而穩定化。包含接合至C
H3
域之scFv之微型抗體(Hu等人，1996，Cancer Res.，56:3055-3061)亦可適用。此外，該等實施例中亦包涵抗體樣結合模擬肽。Liu等人，2003，Cell Mol. Biol.，49:209-216已報告「抗體樣結合模擬肽」(ABiP)，其為充作簡化抗體之肽及具有延長之血清半衰期之某些優點及較簡單合成方法。 動物可與抗原(諸如醣化PD-L1多肽或肽)一起培養以產生免疫反應並產生對醣化PD-L1多肽具特異性之抗體。通常，抗原係結合或共軛至另一分子以增強免疫反應。如本文中所使用，共軛物為結合至用於引起動物免疫反應之抗原之任何肽、多肽、蛋白或非蛋白物質。動物中回應於抗原培養所產生的抗體包含自產生多種個別抗體之B淋巴細胞製得之多種非相同分子(多株抗體)。多株抗體為抗體種類之混合群體，其各者可識別相同抗原上之不同抗原決定基。給定動物中產生多株抗體之恰當條件，動物血清中大多數抗體將會識別動物所免疫接種的抗原化合物上之集體抗原決定基。該特異性藉由親和力純化進一步增強以僅選擇識別受關注抗原或抗原決定基之其等抗體。 單株抗體為抗體之單一選殖種類，其中每一抗體分子識別相同抗原決定基，因為所有產生抗體之細胞係源自單一產生抗體之B-淋巴細胞。用於產生單株抗體(MAb)之方法一般與用於製備多株抗體之其等方法開始沿著相同路線。在一些實施例中，產生單株抗體使用齧齒動物(諸如小鼠及大鼠)。在一些實施例中，產生單株抗體使用兔、羊或青蛙細胞。大鼠之使用眾所周知及可提供某些優點。例行使用小鼠(例如BALB/c小鼠)及一般而言可得到高百分率之穩定融合。用於單株抗體生成之融合瘤技術涉及自事先經醣化PD-L1蛋白或肽免疫接種之小鼠單離之單一產生抗體之B淋巴細胞與永生化骨髓瘤細胞(例如，小鼠骨髓瘤細胞系)之融合。該技術提供一種繁殖單一產生抗體之細胞以得到無數個繼代之方法，使得可產生無限多個具有相同抗原或抗原決定基特異性之結構相同的抗體(即單株抗體)。 工程化抗體可使用單株及其他抗體及重組DNA技術以產生保留初始抗體之抗原或抗原決定基結合特異性之其他抗體或嵌合分子(即，該分子具有特異性結合域)來建立。該等技術可涉及將編碼抗體之免疫球蛋白可變區或CDR之DNA引入至不同抗體之用於構架區、恆定區或恆定區加上構架區之遺傳物質。參見，例如，美國專利第5,091,513號及第6,881,557號，該等案件係以引用的方式併入本文中。 藉由如本文所述之已知方法，可建立多株或單株抗體、具有結合活性之抗體片段、結合域及CDR(包括前述任何者之工程化形式)，其特異性結合至醣化PD-L1蛋白、其各自抗原決定基中之一或多者，及具有阻斷PD-L1與PD-1結合並促進腫瘤細胞中PD-L1之內部化之雙功能，或前述任何者之共軛物，無論該等抗原或抗原決定基係單離自天然來源或係天然化合物之合成衍生物或變異體。 可自任何動物來源(包括鳥及哺乳動物)產生抗體。較佳地，該等抗體為綿羊、鼠類(例如，小鼠及大鼠)、兔、山羊、天竺鼠、駱駝、馬或雞。此外，可藉由篩選人類抗體組合庫獲得人類抗體。例如，噬菌體抗體表現技術允許在無動物免疫接種下產生特異性抗體，如美國專利第6,946,546號所述，該案係以引用的方式併入本文中。此等技術進一步述於Marks，1992，Bio/Technol.，10:779-783；Stemmer，1994，Nature，370:389-391；Gram等人，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89:3576-3580；Barbas等人，1994，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，91: 3809-3813；及Schier等人，1996，Gene，169(2):147-155中。 用於在各種動物物種中產生多株抗體及用於產生各種類型之單株抗體(包括人源化抗體、嵌合抗體及完全人類抗體)之方法係此項技術中所熟知且高度可再現。例如，以下美國專利提供此等方法之描述且以引用的方式併入本文中：美國專利第3,817,837號；第3,850,752號；3,939,350號；第3,996,345號；第4,196,265號；第4,275,149號；第4,277,437號；第4,366,241號；第4,469,797號；第4,472,509號；第4,606,855號；第4,703,003號；第4,742,159號；第4,767,720號；第4,816,567號；第4,867,973號；第4,938,948號；第4,946,778號；第5,021,236號；第5,164,296號；第5,196,066號；第5,223,409號；第5,403,484號；第5,420,253號；第5,565,332號；第5,571,698號；第5,627,052號；第5,656,434號；第5,770,376號；第5,789,208號；第5,821,337號；第5,844,091號；第5,858,657號；第5,861,155號；第5,871,907號；第5,969,108號；第6,054,297號；第6,165,464號；第6,365,157號；第6,406,867號；第6,709,659號；第6,709,873號；第6,753,407號；第6,814,965號；第6,849,259號；第6,861,572號；第6,875,434號；第6,891,024號；第7,407,659號；及第8,178,098號。 預期如本文所提供針對醣化PD-L1之抗體將具有中和、阻斷、抑制或反作用於醣化PD-L1之效應(不論動物物種、單株細胞系或抗體之其他來源為何)之能力。某些動物物種可能因為其極有可能因經由抗體「Fc」部分活化補體系統而引起免疫或過敏性反應而對於產生治療性抗體而言較不佳。然而，整個抗體可經酵素消化為「Fc」(補體結合)片段，而後被消化為具有結合域或CDR之肽片段。Fc部分之移除可降低該抗體片段將引起非所要免疫反應之可能性及因此，不含Fc部分之抗體可優先用於預防性或治療性治療。如上文所述，亦可構築抗體為嵌合抗體、人源化抗體或部分或完全人類抗體，以便減小或消除因對動物投與抗體所致之可能之不良免疫效應，該抗體係已在另一物種中產生或具有另一物種之胺基酸序列。 抗體蛋白可為重組，或在活體外合成。預期在如本文所述之含抗-醣化PD-L1抗體之組合物中，每ml存在介於約0.001 mg與約10 mg之間的總抗體多肽。因此，組合物中抗體蛋白之濃度可為約、至少約或至多約或等於0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0 mg/ml或更大(或其中可衍生出的任何範圍)。其中，約、至少約、至多約或等於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%可係結合醣化PD-L1之抗體。 抗體或抗體之保留結合活性之免疫部分可化學共軛至或重組表現為與其他蛋白質之融合蛋白質。為了本文所述目的起見，所有該等融合蛋白質包含在抗體或抗體之免疫部分之定義中。在一些實施例中，包涵所產生的抗醣化PD-L1之雙功能抗體及抗體樣分子或連接至至少一種試劑以形成抗體共軛物或有效負載(payload)之多肽。為增加抗體分子作為診斷劑或治療劑之療效，抗體可連接或共價結合抗體之至少一個所需分子或部分或與其形成複合物。該經連接分子或部分可為(但不限於)至少一個效應子或報導子分子。效應子分子包含具有所需活性(例如細胞毒性活性)之分子。可連接至抗體之效應子分子之非限制性實例包括毒素、治療性酵素、抗生素、經放射標記之核苷酸及類似者。相反地，報導子分子定義為可使用檢定檢測到的任何部分。可共軛至抗體之報導子分子之非限制性實例包括酵素、放射性標記、半抗原、螢光標記、磷光分子、化學發光分子、發色團、發光分子、光親和分子、著色顆粒或配位體(諸如生物素)及類似者。此項技術中已知若干方法可用於連接或共軛抗體與共軛分子或部分。一些連接方法涉及使用金屬螯合物錯合物，舉非限制性實例而言，使用連接至抗體之有機螯合劑，諸如二伸乙基三胺五乙酸酐(DTPA)；伸乙基三胺四乙酸；N-氯-對甲苯磺醯胺；及/或四氯-3-6α-二苯基乙炔脲-3。抗體(特定言之本文所述抗體)亦可與酵素在偶聯劑(諸如戊二醛或過碘酸鹽)的存在下反應。與螢光素標記物之共軛物習知上係在該等偶聯劑的存在下或藉由與異硫氰酸鹽反應進行製備。在另一個實施例中，如本文所述之雙功能抗-醣化PD-L1抗體可偶聯或連接至化合物或物質，諸如聚乙二醇(PEG)，以增加投與後其在血漿、血清或血液中之活體內半衰期。 在一個特定實施例中，提供抗體(諸如單株抗體)及其人源化及嵌合形式及其抗原結合片段，其相對於非醣化PD-L1蛋白特異性且優先結合醣化PD-L1蛋白且具有阻斷PD-L1/PD-1結合且促進PD-L1內部化及降解之雙重活性。在一個實施例中，雙功能抗-醣化PD-L1抗體特異性或優先結合至在PD-L1蛋白之胺基酸序列(例如，如SEQ ID NO:1陳述)的位置35、192、200及/或219之處醣化之PD-L1蛋白。例如，抗-醣化PD-L1抗體之特異性或選擇性結合涉及抗體與醣化PD-L1抗原以比相對於非醣化PD-L1所展現K
d
一半更小的K
d
結合。在一個實施例中，抗-醣化PD-L1抗體以比相對非醣化PD-L1所展現K
d
小至少5倍的K
d
結合至醣化PD-L1蛋白。在一個實施例中，抗-醣化PD-L1抗體以比相對非醣化PD-L1所展現K
d
小至少10倍的K
d
結合至醣化PD-L1蛋白。在一個實施例中，在如實例6中所述的細胞流動式細胞測量術結合檢定中，抗體展現表示為與針對結合至表現非醣化PD-L1之細胞之MFI相比大1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍的針對表現WT PD-L1之細胞之MFI的結合。 在一個實施例中提供一種特異性且優先結合至醣化PD-L1的雙功能抗體或其結合片段，其特異性結合STM073所結合的PD-L1抗原決定基。在某些實施例中，該雙功能抗-醣化PD-L1抗體結合PD-L1上之涵蓋SEQ ID NO:1之人類PD-L1胺基酸序列之位置H69、Y112、R113及K124之抗原決定基。在一個實施例中，抗原決定基之該等胺基酸係非鄰接的及該抗原決定基為構象抗原決定基。人類PD-L1多肽之涵蓋STM073 MAb抗原決定基之區域具有序列V
H
GEEDLKVQH------DAGV
YR
CMISYGGADY
K
RITV(即，SEQ ID NO:85、或SEQ ID NO:1之V68-V128)，其中該等胺基酸殘基H69、Y112、R113及K124(其包含由MAb STM073識別之抗原決定基)加下劃線。在STM073抗原決定基序列中，介於在位置78之處的胺基酸殘基組胺酸(H)與在位置108之處的胺基酸殘基天冬胺酸(D)之間的虛線代表在SEQ ID NO:1之人類PD-L1胺基酸序列之位置79-107之處的胺基酸。 在另一個實施例中提供一種特異性且優先結合醣化PD-L1之雙功能抗體或其結合片段，其為抗-醣化PD-L1單株抗體STM108或其人源化或嵌合形式。在特定實施例中，該雙功能抗-醣化PD-L1特異性結合PD-L1上涵蓋SEQ ID NO:1之人類PD-L1胺基酸序列之位置S80、Y81、K162及S169之抗原決定基。人類PD-L1多肽之涵蓋STM108 MAb抗原決定基之區域具有胺基酸序列LKVQHS
SY
RQR------EGYP
K
AEVIWT
S
SDHQ(即，SEQ ID NO:1之L74-Q173)，其中該等胺基酸殘基S80、Y81、K162及S169(其包含由MAb STM108識別之抗原決定基)加下劃線。在STM108抗原決定基區域中，介於在位置84之處的胺基酸殘基精胺酸(R)與在位置158之處的胺基酸殘基麩胺酸(E)之間的虛線代表在SEQ ID NO:1之人類PD-L1胺基酸序列之位置85-157之處的胺基酸。因此，STM108 MAb抗原決定基之該等胺基酸係非鄰接的，及該抗原決定基為構象抗原決定基。 STM073 MAb之重鏈及輕鏈可變(V)域之核酸(DNA)及對應之胺基酸序列顯示於下表3中。表3提供STM073之成熟(即，不含信號肽)V
H
及V
L
域之核苷酸及胺基酸序列(分別為SEQ ID NO 2、3、10及11)及含有信號肽之V
H
及V
L
域序列(分別為SEQ ID NO:87、88、89及90)。在顯示於表3中之重鏈DNA及蛋白質V域序列中，胺基末端信號序列以斜體字型表示。表3中亦顯示STM073 MAb重鏈及輕鏈V域CDR，其藉由Kabat及Chothia兩種定義確定。 在一個實施例中，特異性且優先結合醣化PD-L1之雙功能抗-醣化PD-L1抗體包含SEQ ID NO:3之V
H
域及SEQ ID NO:11之V
L
域。在一個實施例中，雙功能抗-醣化PD-L1抗體與包含SEQ ID NO:3之V
H
域及SEQ ID NO:11之V
L
域之抗體競爭特異性結合至醣化PD-L1。在一個實施例中，特異性且優先結合醣化PD-L1之雙功能抗-醣化PD-L1抗體包含包含具有分別SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:8之胺基酸序列之Chothia CDR 1-3或具有分別SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:9之胺基酸序列之Kabat CDR 1-3或其組合之V
H
域。在一個實施例中，雙功能抗-醣化PD-L1抗體與包含包含具有分別SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:8之胺基酸序列之Chothia CDR 1-3或具有分別SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:9之胺基酸序列之Kabat CDR 1-3或其組合之V
H
域之抗體競爭特異性結合至醣化PD-L1。在一個實施例中，特異性且優先結合醣化PD-L1之雙功能抗-醣化PD-L1抗體包含包含具有分別SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14及SEQ ID NO:16之胺基酸序列之CDR 1-3之V
L
域。在一個實施例中，雙功能抗-醣化PD-L1抗體與包含包含具有分別SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14及SEQ ID NO:16之胺基酸序列之CDR 1-3之V
L
域之抗體競爭特異性結合至醣化PD-L1。在一個實施例中，特異性且優先結合醣化PD-L1之雙功能抗-醣化PD-L1抗體包含(a)具有分別SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:8之胺基酸序列之Chothia CDR 1-3或具有分別SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:9之胺基酸序列之Kabat CDR 1-3或其組合之V
H
域；及(b)包含具有分別SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14及SEQ ID NO:16之胺基酸序列之CDR 1-3之V
L
域。在實施例中，雙功能抗-醣化PD-L1抗體與包含上述V
H
及V
L
域及其中的CDR之抗體競爭特異性結合至醣化PD-L1。 在一個實施例中，特異性結合醣化PD-L1之雙功能抗-醣化PD-L1抗體包含與SEQ ID NO:3之胺基酸序列為80%、85%、90%、95%、98%或99%相同的V
H
域及/或與SEQ ID NO:11之胺基酸序列為80%、85%、90%、95%、98%或99%相同的V
L
域，及其抑制或阻斷醣化PD-L1結合至PD-1及促進表現於細胞膜上之PD-L1之去穩定化。在一個實施例中，特異性且優先結合醣化PD-L1之雙功能抗-醣化PD-L1抗體包含包含至少1、2或全部3個CDR具有相對於分別SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:8之胺基酸序列或分別SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:9之胺基酸序列而言至少1、2、3、4或5個胺基酸取代之CDR 1-3之V
H
域，該抗-醣化PD-L1抗體阻斷醣化PD-L1結合至PD-1及促進細胞膜上PD-L1之表現之去穩定化。在一個實施例中，特異性且優先結合醣化PD-L1之雙功能抗-醣化PD-L1抗體包含包含至少1、2或全部3個CDR具有相對於分別SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14及SEQ ID NO:16之胺基酸序列而言至少1、2、3、4或5個胺基酸取代之CDR 1-3之V
L
域。在一個實施例中，特異性且優先結合醣化PD-L1之雙功能抗-醣化PD-L1抗體包含(a)至少1、2或全部3個CDR具有相對於分別SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:8之胺基酸序列或SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:9之胺基酸序列而言至少1、2、3、4或5個胺基酸取代之CDR 1-3之V
H
域；及(b)至少1、2或全部3個CDR具有分別相對SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14及SEQ ID NO:16之胺基酸序列而言至少1、2、3、4或5個胺基酸取代之V
L
域，該抗體阻斷醣化PD-L1與PD-1結合及促進表現於細胞膜上之PD-L1之去穩定化。亦提供使用AbM、Contact或IMGT定義的CDR的STM073之人源化形式，其具有人類構架區及視需要之人類恆定域。 前述雙功能抗-醣化PD-L1抗體以比相對非醣化PD-L1而言所展現K
d
一半更小的K
d
結合至醣化PD-L1。在一個實施例中，雙功能抗-醣化PD-L1抗體以比相對PD-L1而言所展現K
d
小至少5倍的K
d
結合至醣化PD-L1蛋白。在一個實施例中，雙功能抗-醣化PD-L1抗體以比相對非醣化PD-L1蛋白而言所展現K
d
小至少10倍的K
d
結合至醣化PD-L1蛋白。在一個實施例中，雙功能抗-醣化PD-L1抗體對醣化PD-L1之結合親和力為5-20 nM或5-10 nM(含下限及上限值)。在一個實施例中，在如實例6中所述的細胞流動式細胞測量術結合檢定中，抗體展現表示為與針對結合至表現非醣化PD-L1之細胞之MFI相比大1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍的針對表現WT PD-L1之細胞之MFI的結合。 在一個實施例中，抗體抑制PD-1與PD-L1之相互作用，及特定言之抑制藉由效應子T-細胞表現之PD-1與藉由腫瘤細胞表現之PD-L1(特定言之，醣化PD-L1)之相互作用。該抗體進一步促進PD-L1之內部化及PD-L1之降解，藉此減小細胞表面上PD-L1之含量。 在另一個特定實施例中，提供特異性且優先結合醣化PD-L1之抗體或其結合片段(其為抗-醣化PD-L1單株抗體STM108)。STM108 MAb之成熟重鏈及輕鏈可變(V)域之核酸(DNA)及對應之胺基酸序列(SEQ ID NO:18、19、26及27)顯示於下表3中。未加工重鏈V域(即，在N-端包含信號序列)之DNA及胺基酸序列亦顯示於表3(分別SEQ ID NO:91及92)中。表3中亦顯示STM108 MAb重鏈及輕鏈V域CDR，根據Kabat及Chothia兩種定義。 在一個實施例中，特異性且優先結合醣化PD-L1之雙功能抗-醣化PD-L1抗體包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列之V
H
域及SEQ ID NO:27之胺基酸序列之V
L
域。在一個實施例中，雙功能抗-醣化PD-L1抗體與包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列之V
H
域及SEQ ID NO:27之胺基酸序列之V
L
域之抗體競爭特異性結合至醣化PD-L1。在一個實施例中，特異性且優先結合醣化PD-L1之雙功能抗-醣化PD-L1抗體包含包含具有分別SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:24之胺基酸序列之Chothia CDR1-3或具有分別SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:25之胺基酸序列之Kabat CDR 1-3或其組合之V
H
域。在一個實施例中，雙功能抗-醣化PD-L1抗體與包含包含具有分別SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:24之胺基酸序列之Chothia CDR 1-3或具有分別SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:25之胺基酸序列之Kabat CDR 1-3或其組合之V
L
域之抗體競爭特異性結合至醣化PD-L1。在一個實施例中，特異性且優先結合醣化PD-L1之雙功能抗-醣化PD-L1抗體包含包含具有分別SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30及SEQ ID NO:32之胺基酸序列之CDR 1-3之V
L
域。在一個實施例中，雙功能抗-醣化PD-L1抗體與包含包含具有分別SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30及SEQ ID NO:32之胺基酸序列之CDR 1-3之V
L
域之抗體競爭特異性結合至醣化PD-L1。在一個實施例中，特異性且優先結合醣化PD-L1之雙功能抗-醣化PD-L1抗體包含(a)包含具有分別SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:24之胺基酸序列之Chothia CDR 1-3或具有分別SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:25之胺基酸序列之Kabat CDR 1-3或其組合之V
H
域；及(b)包含具有分別SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30及SEQ ID NO:32之胺基酸序列之CDR 1-3之V
L
域。在實施例中，抗-醣化PD-L1抗體與包含上述V
H
及V
L
域及其中的CDR之抗體競爭特異性結合至醣化PD-L1。 在一個實施例中，特異性且優先結合醣化PD-L1之雙功能抗-醣化PD-L1抗體包含與SEQ ID NO:19之胺基酸序列為80%、85%、90%、95%、98%或99%相同的V
H
域及與SEQ ID NO:27之胺基酸序列為80%、85%、90%、95%、98%或99%相同的V
L
域。在一個實施例中，特異性且優先結合醣化PD-L1之雙功能抗-醣化PD-L1抗體包含包含至少1、2或全部3個CDR具有分別相對SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:24之胺基酸序列而言至少1、2、3、4或5個胺基酸取代之CDR 1-3或具有分別SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:25之胺基酸序列之CDR 1-3或其組合之V
H
域。在一個實施例中，特異性且優先結合醣化PD-L1之雙功能抗-醣化PD-L1抗體包含包含至少1、2或全部3個CDR具有分別相對SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30及SEQ ID NO:32之胺基酸序列而言至少1、2、3、4或5個胺基酸取代之CDR 1-3之V
L
域。在一個實施例中，特異性且優先結合醣化PD-L1之雙功能抗-醣化PD-L1抗體包含(a)至少1、2或全部3個CDR具有分別相對SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:24而言或分別相對SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:25而言至少1、2、3、4或5個胺基酸取代之CDR 1-3或其組合之V
H
域；及/或(b)包含至少1、2或全部3個CDR具有分別相對SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30及SEQ ID NO:32之胺基酸序列而言至少1、2、3、4或5個胺基酸取代之CDR 1-3 之V
L
域。亦提供使用AbM、Contact或IMGT定義的CDR的STM108之人源化形式，其具有人類構架區及視需要之人類恆定域。 在實施例中，前述抗-醣化PD-L1抗體以比相對非醣化PD-L1所展現K
d
一半更小的K
d
結合至醣化PD-L1。在一個實施例中，抗-醣化PD-L1抗體以比相對非醣化PD-L1所展現K
d
小至少5倍的K
d
結合至醣化PD-L1蛋白。在一個實施例中，抗-醣化PD-L1抗體以比相對非醣化PD-L1蛋白所展現K
d
小至少10倍的K
d
結合至醣化PD-L1蛋白。在一個實施例中，STM108 MAb對醣化PD-L1之結合親和力為5-20 nM或5-10 nM(含下限及上限值)。在一個實施例中，在如實例6中所述的細胞流動式細胞測量術結合檢定中，抗體展現表示為與針對結合至表現非醣化PD-L1之細胞之MFI相比大1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍的針對表現WT PD-L1之細胞之MFI的結合。該等抗-醣化PD-L1抗體抑制PD-1與PD-L1之相互作用，及特定言之抑制藉由效應子T-細胞表現之PD-1與藉由腫瘤細胞表現之PD-L1(特定言之醣化PD-L1)之相互作用。 在一個實施例中亦包涵一種經單離的雙功能抗-醣化PD-L1抗體，其結合人類PD-L1胺基酸序列DAGVYRCMISYGGADYKRITV(即，SEQ ID NO:1之D108-V128)中的抗原決定基。在一個實施例中，經單離的雙功能抗-醣化PD-L1抗體特異性結合人類PD-L1抗原決定基，其係非鄰接的且涵蓋顯示為以下序列中的加下劃線的胺基酸殘基之人類PD-L1胺基酸序列SEQ ID NO:1之位置Y112、R113及S117：DAGV
YR
CMI
S
YGGADYKRITV(SEQ ID NO:86)。 在一個實施例中提供一種經單離的雙功能抗-醣化PD-L1抗體，其包含(a)包含具有SEQ ID NO:4之胺基酸序列之Chothia CDR H1或具有SEQ ID NO:5之胺基酸序列之Kabat CDR H1；具有SEQ ID NO:6之胺基酸序列之Chothia CDR H2或具有SEQ ID NO:7之胺基酸序列之Kabat CDR H2；及具有SEQ ID NO:8之胺基酸序列之Chothia CDR H3或具有SEQ ID NO:9之胺基酸序列之Kabat CDR H3之V
H
域；及包含具有SEQ ID NO:12之胺基酸序列之CDR L1；具有SEQ ID NO:14之胺基酸序列之CDR L2；及具有SEQ ID NO:16之胺基酸序列之CDR L3之V
L
域。亦提供一種經單離的雙功能抗-醣化PD-L1抗體，其係具有根據詳述於表2(同上述)之IMGT、AbM或Contact定義之CDR之STM073之人源化形式。 在另一個實施例中提供一種經單離的雙功能抗-醣化PD-L1抗體，其包含(a)包含具有SEQ ID NO:20之胺基酸序列之Chothia CDR H1或具有SEQ ID NO:21之胺基酸序列之Kabat CDR H1；具有SEQ ID NO:22之胺基酸序列之Chothia CDR H2或具有SEQ ID NO:23之胺基酸序列之Kabat CDR H2；及具有SEQ ID NO:24之胺基酸序序列之Chothia CDR H3或具有SEQ ID NO:25之胺基酸序列之Kabat CDR H3之V
H
域；及包含具有SEQ ID NO:28之胺基酸序列之CDR L1；具有SEQ ID NO:30之胺基酸序列之CDR L2；及具有SEQ ID NO:32之胺基酸序列之CDR L3之V
L
域。亦提供一種經單離的雙功能抗-醣化PD-L1抗體，其係具有根據詳述於表2(同前述)之IMGT、AbM或Contact定義之CDR之STM108之人源化形式。 在另一個實施例中提供一種經單離的雙功能抗-醣化PD-L1抗體，例如，單株抗體、其嵌合或人源化形式、或其結合片段，其特異性結合至選自VHGEEDLKVQH------DAGVYRCMISYGGADYKRITV(SEQ ID NO:85)、DAGVYRCMISYGGADYKRITV(SEQ ID NO:86)或LKVQHSSYRQR------EGYPKAEVIWTSSDHQ (其分別為SEQ ID NO:1之胺基酸74至84及158至173)之胺基酸序列中之抗原決定基，該等序列係位於SEQ ID NO:1之人類PD-L1多肽序列中，即，包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列19-290之成熟PD-L1蛋白。在一個實施例中，抗體抑制PD-1與PD-L1之相互作用，及特定言之抑制藉由效應子T-細胞表現之PD-1與藉由腫瘤細胞表現之PD-L1(特定言之醣化PD-L1)之相互作用及促進來自細胞膜之PD-L1內部化至細胞中及PD-L1之胞內降解。 在另一個實施例中提供一種經單離的雙功能抗-醣化PD-L1抗體，例如，單株抗體、其嵌合或人源化形式或結合與MAb STM073相同之抗原決定基的其結合片段，或如本文所述之經單離的抗-醣化PD-L1 MAb，其中該抗原決定基包含SEQ ID NO:1之胺基酸殘基H69、Y112、R113及K124。在另一個實施例中，提供一種經單離的雙功能抗-醣化PD-L1抗體，例如，單株抗體、其嵌合或人源化形式或其結合片段，其在結合至醣化PD-L1時與SEQ ID NO:1之以下胺基酸殘基中之至少一者接觸：SEQ ID NO:1之H69、Y112、R113及K124。在實施例中，抗-醣化PD-L1抗體與包含PD-L1(即，醣化人類PD-L1)之抗原決定基區域之胺基酸殘基中之至少兩者、至少三者或四者接觸。 在另一個實施例中提供一種經單離的雙功能抗-醣化PD-L1抗體，例如，單株抗體、其嵌合或人源化形式或結合與MAb STM108相同之抗原決定基的其結合片段，或經單離的抗-醣化PD-L1 MAb，其結合包含SEQ ID NO:1之胺基酸殘基S80、Y81、K162及S169之抗原決定基。在另一個實施例中，提供一種經單離的雙功能抗-醣化PD-L1抗體，其在結合至醣化PD-L1時與以下胺基酸殘基中之至少一者接觸：SEQ ID NO:1之S80、Y81、K162及S169。 在另一個實施例中提供一種經單離的雙功能抗-醣化PD-L1抗體，例如，單株抗體、其嵌合或人源化形式或其結合片段，其在結合至醣化PD-L1時與以下胺基酸殘基中之至少一者：SEQ ID NO:1之Y112、R113及S117接觸。 在另一個實施例中提供一種經單離的雙功能抗-醣化PD-L1抗體，例如，單株抗體、其嵌合或人源化形式或其結合片段，其在結合至醣化PD-L1時與SEQ ID NO:1之V68至V128之胺基酸區域中、或SEQ ID NO:1之D108至V128之胺基酸區域中、或SEQ ID NO:1之L74至Q173之胺基酸區域中、或SEQ ID NO:1之L74至R84之胺基酸區域中及SEQ ID NO:1之E158至Q173之胺基酸區域中之至少一個胺基酸接觸。在另一個實施例中，提供一種經單離的雙功能抗-醣化PD-L1抗體，例如，單株抗體、其嵌合或人源化形式或其結合片段，其在結合至醣化PD-L1時與以下胺基酸殘基之群中之至少一者接觸：SEQ ID NO:1之V68至V128之胺基酸區域中H69、Y112、R113及K124。在另一個實施例中，提供一種經單離的雙功能抗-醣化PD-L1抗體，例如，單株抗體、其嵌合或人源化形式或其結合片段，其在結合至醣化PD-L1時與以下胺基酸殘基之群中之至少一者、至少兩者、至少三者或四者接觸：SEQ ID NO:1之V68至V173之胺基酸區域中H69、S80、Y81、Y112、R113、K124、K162、S169。在一個實施例中，提供一種經單離的雙功能抗-醣化PD-L1抗體，例如，單株抗體、其嵌合或人源化形式或其結合片段，其在結合至醣化PD-L1時與以下胺基酸殘基之群接觸：SEQ ID NO:1之D108至V128之胺基酸區域中Y112、R113、S117。 在另一個實施例中提供一種經單離的雙功能抗-醣化PD-L1抗體，例如，單株抗體、其嵌合或人源化形式或其結合片段，其在結合至醣化PD-L1時結合PD-L1蛋白(SEQ ID NO:1)之至少胺基酸區域V68-V128或至少胺基酸區域D108-V128或其組合。 又一個實施例提供一種經單離的核酸，其包含編碼V
H
域之SEQ ID NO:2或18之核苷酸序列及編碼抗體V
L
域之SEQ ID NO:10或26之核苷酸序列。在一個實施例中，提供一種編碼抗-醣化PD-L1抗體V
H
域之經單離的核苷酸序列，其中該核苷酸序列與SEQ ID NO:2或18之核苷酸序列為至少90-98%相同。在一個實施例中，提供一種編碼抗-醣化PD-L1抗體V
L
域之經單離的核苷酸序列，其中該核苷酸序列與SEQ ID NO:19或26之核苷酸序列為至少90-98%相同。在實施例中，編碼V
H
及/或V
L
域之核苷酸序列與分別SEQ ID NO:2或18、或SEQ ID NO:10或26為90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大相同。
表 3. 抗 - 醣化 PD-L1 MAb 之核苷酸及胺基酸序列 疾病治療
在某些態樣中，可投與如本文實施例中所述之抗體或其抗原結合片段(例如，特異性結合至醣化PD-L1之雙功能抗體)以治療罹患癌症之個體之癌症或預防具有發展出癌症之素因 (諸如遺傳素因、先前致癌物環境暴露、先前癌症發病率等)之個體之癌症。因此，本文提供藉由投與有需要的個體治療有效量之至少一種雙功能抗-醣化PD-L1抗體以治療癌症之治療癌症的方法。如本文所述，治療涉及減慢、防止、抑制或阻斷癌細胞之生長、增殖、遷移等及包括引起癌細胞之細胞殺死或細胞凋亡。治療亦可防止或引起腫瘤細胞轉移之退化。本文所述方法提供接受治療之個體(例如人類患者)效益，尤其對於表現可結合表現於免疫效應子細胞(諸如T-細胞，特定言之殺手或細胞毒素T-細胞)之細胞表面上之PD-1/與其相互作用之醣化PD-L1細胞表面蛋白之腫瘤細胞而言。 預期利用有效量之所述雙功能抗-醣化PD-L1抗體中之至少一者治療該等個體可使得該(等)抗體結合至腫瘤細胞上的醣化PD-L1及防止、阻斷或抑制PD-L1與PD-1之相互作用並促進PD-L1之內部化及降解以防止、阻斷或抑制表現PD-L1之腫瘤細胞與表現PD-1之T細胞之相互作用，藉此防止或避免T-細胞活性之免疫抑制作用且允許T細胞經活化以殺死具有PD-L1之腫瘤細胞。在一個較佳實施例中，雙功能抗-PD-L1抗體結合至人類PD-L1及該個體為人類患者。因此，本文所提供的方法對於需要藉由實施本發明方法達成之抗癌結果的個體、能夠從該結果獲益的個體或想要接受該結果之效益的個體有利。個體尋求涉及投與治療有效量之至少一種雙功能抗-醣化PD-L1抗體之方法之治療效益或接受該等治療效益通常係有利於此項技術。此外，本發明方法提供消除或避免副作用、不良結果、禁忌症及類似者或相比其他治療及治療方法降低該等問題產生之風險或可能性之其他優點。 在特定實施例中，對罹患或易患癌症之個體投與治療有效量之STM073或STM108之人源化或嵌合形式，其為雙功能抗-醣化PD-L1抗體。投與超過一種類型之抗-醣化PD-L1抗體以治療癌症可係有利。例如，STM073及STM108二者之嵌合或人源化形式可共同投與給有此需要的患者。或者，STM073之嵌合或人源化形式可與另一抗-醣化PD-L1抗體共同投與給有此需要的患者或STM108之嵌合或人源化形式可與另一抗-醣化PD-L1抗體共同投與給有此需要的患者。抗-醣化PD-L1抗體之共同投與可比僅投與任一抗體治療上或預防上更有效且/或可允許比單純抗體少的劑量或低的頻率之投與。 本發明治療方法可適用之癌症包括任何惡性細胞類型，諸如在實體腫瘤或血液性腫瘤，特定言之其表面上表現醣化PD-L1之細胞之腫瘤中發現之彼等。一般而言，腫瘤係指任何尺寸之惡性或潛在惡性贅瘤或組織塊，及包括原發性腫瘤及繼發性腫瘤。實體腫瘤為通常不包含囊腫或液體之異常組織塊或生長。例示性實體腫瘤可包括(但不限於)選自由胰臟、膽囊、結腸、盲腸、胃、腦、頭、頸、卵巢、睪丸、腎臟、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑色素瘤、***及***組成之群的器官之腫瘤。例示性血液性腫瘤包括骨髓之腫瘤、T或B細胞惡性病、白血病、淋巴瘤、胚細胞瘤、骨髓瘤及類似者。可使用本文所提供方法治療之癌症之其他實例包括(但不限於)癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤、白血病、鱗狀細胞癌、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀細胞癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸道癌及胃腸道間質癌)、胰癌、神經膠質母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、***癌、外陰癌、甲狀腺癌、各種類型之頭頸癌、黑色素瘤、淺表散播型黑色素瘤、小痣惡性黑色素瘤、肢端原位黑色素瘤、結節型黑色素瘤及B-細胞淋巴瘤(包括低度/濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)(NHL)；小淋巴球性(SL) NHL；中度/濾泡性NHL；中度擴散型NHL；高度免疫母細胞性NHL；高度淋巴母細胞性NHL；高度小非裂解型細胞NHL；巨大腫塊NHL；外套細胞淋巴瘤；與AIDS相關之淋巴瘤；及華氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia))、慢性淋巴球性白血病(CLL)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、毛細胞白血病、多發性骨髓瘤、急性骨髓性白血病(AML)及慢性成骨髓球性白血病。 具體而言，該癌症可係以下組織類型，然而，其無需受限於以下該等：惡性贅瘤；癌；未分化癌；梭形巨細胞癌；小細胞癌；乳突性癌；鱗狀細胞癌；淋巴上皮癌；基底細胞癌；毛母質癌；移行細胞癌；乳突性移行細胞癌；腺癌；惡性胃泌素瘤；膽管癌；肝細胞癌；組合型肝細胞癌及膽管癌；小梁狀腺癌；腺樣囊狀癌；在腺瘤性息肉中之腺癌；家族性結腸息肉腺癌；實體癌；惡性類癌腫瘤；小支氣管-肺泡腺癌；濾泡性腺癌；嫌色細胞癌；嗜酸性癌；親氧性腺癌；嗜鹼性癌；透明細胞腺癌；粒狀細胞癌；濾泡性腺癌；乳突性及濾泡性腺癌；非被嚢性硬化性癌；腎上腺皮質癌；內膜性癌；皮膚附屬器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聹腺腺癌；黏液表皮癌；囊腺癌；乳突性囊腺癌；乳突性漿液性囊腺癌；黏液性囊腺癌；黏液性腺癌；印戒細胞癌(signet ring cell carcinoma)；浸潤性腺管癌；髓狀癌；小葉癌；發炎性癌；乳腺帕哲氏病(Paget's disease)；腺泡細胞癌；腺鱗狀癌；腺癌w/鱗狀上皮化生；惡性胸腺瘤；惡性卵巢間質腫瘤；惡性卵泡膜細胞瘤；惡性顆粒細胞瘤；惡性睪丸母細胞瘤；塞爾托利氏細胞瘤(sertoli cell carcinoma)；惡性萊迪希氏細胞瘤(leydig cell tumor)；惡性脂質細胞瘤；惡性副神經節瘤；惡性***外副神經節瘤；嗜鉻細胞瘤；血管球狀肉瘤；惡性黑色素瘤；無黑色素黑色素瘤；淺表散播型黑色素瘤；惡性巨大色素痣黑色素瘤；上皮樣細胞黑色素瘤；惡性藍痣；肉瘤；纖維肉瘤；惡性纖維組織細胞瘤；黏液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；橫紋肌肉瘤；胚胎性橫紋肌肉瘤；腺泡型橫紋肌肉瘤；間質肉瘤；惡性混合瘤；米勒氏混合瘤(mullerian mixed tumor)；腎母細胞瘤；肝母細胞瘤；癌肉瘤；惡性間葉瘤；惡性布氏瘤(brenner tumor)；惡性***葉狀瘤；滑液肉瘤；惡性間皮瘤；無性細胞瘤；胚胎癌；惡性畸胎瘤；惡性卵巢甲狀腺癌(struma ovarii)；絨毛膜癌；惡性中腎瘤；血管肉瘤；惡性血管內皮瘤；卡波西氏肉瘤(kaposi's sarcoma)；惡性血管外皮細胞瘤；***肉瘤；骨肉瘤；皮質旁成骨肉瘤；軟骨肉瘤；惡性軟骨母細胞瘤；間葉性軟骨肉瘤；骨巨大細胞瘤；尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma)；惡性牙源性腫瘤；成釉細胞牙肉瘤；惡性成釉細胞瘤；成釉細胞纖維肉瘤；惡性松果腺瘤；脊索瘤；惡性膠質瘤；室管膜瘤；星形細胞瘤；原漿性星形細胞瘤；原纖維性星形細胞瘤；星形母細胞瘤；神經膠質母細胞瘤；寡樹突神經膠質瘤；成少突神經膠質細胞瘤；原始神經外胚層瘤；小腦肉瘤；節細胞性神經母細胞瘤；神經母細胞瘤；視網膜母細胞瘤；嗅神經源性腫瘤；惡性腦膜瘤；神經纖維肉瘤；惡性神經鞘瘤；惡性顆粒細胞瘤；惡性淋巴瘤；霍奇金氏症(Hodgkin's disease)；副肉芽腫；惡性小淋巴球性淋巴瘤；惡性大細胞淋巴瘤；惡性擴散性淋巴瘤；惡性濾泡性淋巴瘤；蕈狀肉芽腫；其他指定非霍奇金氏淋巴瘤；惡性組織細胞增生；多發性骨髓瘤；肥大細胞瘤；免疫增生性小腸病；白血病；淋巴樣白血病；漿細胞白血病；紅血球性白血病；淋巴肉瘤細胞性白血病；骨髓性白血病；嗜鹼粒細胞性白血病；嗜酸粒細胞性白血病；單核球白血病；肥大細胞白血病；巨核細胞白血病；髓樣肉瘤；及毛細胞白血病。 待治療的癌症較佳對PD-L1(特定言之醣化PD-L1)陽性。在某些實施例中，腫瘤細胞亦對腫瘤細胞標記物(諸如EGFR或HER2/neu表現，例如，於乳癌細胞上之表現)陽性。該等標記物之存在或不存在可指示與標靶治療劑，諸如酪胺酸激酶抑制劑(例如，吉非替尼(gefitinib)針對EGFR-陽性癌症，或赫賽汀(Herceptin)針對HER2/neu-陽性癌症)組合如本文所述之雙功能抗-醣化PD-L1抗體之組合療法將為有需要的個體提供治療效益。在某些實施例中，該癌症為BLBC。 可用於表徵癌症以引導療法之選擇或監測療法之其他標記物包括在非小細胞肺癌及間變性大細胞淋巴瘤中之ALK基因重排及過度表現；針對肝癌及生殖細胞瘤之α-胎蛋白(AFP)；針對多發性骨髓瘤、慢性淋巴球性白血病及部分淋巴瘤之α-2-微球蛋白(B2M)；針對絨毛膜癌及生殖細胞瘤之β-人類絨毛膜***(β-hCG)；針對卵巢癌及乳癌之BRCA1及BRCA2基因突變；針對慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞性白血病及急性骨髓性白血病之BCR-ABL融合基因(費城染色體(Philadelphia chromosome))；針對皮膚黑色素瘤及結腸直腸癌之BRAF V600突變；針對胃腸道間質腫瘤及黏膜型黑色素瘤之C-kit/CD117；針對乳癌之CA15-3/CA27.29；針對胰癌、膽囊癌、膽管癌及胃癌之CA19-9；針對卵巢癌之CA-125；針對髓質甲狀腺癌之抑鈣素；針對結腸直腸癌及一些其他癌症之癌胚抗原(CEA)；針對非霍奇金氏淋巴瘤之CD20；針對神經內分泌腫瘤之染色顆粒素A (Chromogranin A)(CgA)；針對膀胱癌之染色體3、7、17及9p21；針對肺癌之細胞角質蛋白片段21-1；針對非小細胞肺癌之EGFR基因突變分析；針對乳癌之***受體(ER)/孕酮受體(PR)；針對膀胱癌之纖維蛋白/纖維蛋白原；針對卵巢癌之HE4；針對乳癌、胃癌及胃腸道胃食道結點腺癌之HER2/neu基因擴增或蛋白質過度表現；針對多發性骨髓瘤及華氏巨球蛋白血症(Waldenström macroglobulinemia)之免疫球蛋白；針對結腸直腸癌及非小細胞肺癌之KRAS基因突變分析；針對生殖細胞瘤、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤及神經母細胞瘤之乳酸脫氫酶；針對小細胞肺癌及神經母細胞瘤之神經元特異性烯醇酶(NSE)；針對膀胱癌之核基質蛋白22；針對***癌之***-特異性抗原(PSA)；針對甲狀腺癌之甲狀腺球蛋白；及針對乳癌之尿激酶胞漿素原活化劑(uPA)及胞漿素原活化抑制劑(PAI-1)。 雙功能抗-醣化PD-L1抗體可用作用於多種方法之抗腫瘤藥劑。一個特定實施例係關於使用抗體作為抗腫瘤劑之方法，及因此包括使腫瘤細胞群體與治療有效量之抗體或含抗體組合物接觸一段足以阻斷或抑制腫瘤細胞生長或達成腫瘤細胞凋亡的時間。在一個實施例中，活體內腫瘤細胞之接觸係藉由對有需要的患者投與(例如，藉由靜脈內、皮下、腹膜內或瘤內注射)治療有效量之包含如本文所述雙功能抗-醣化PD-L1抗體之生理上耐受之組合物來達成。該抗體可經時藉由注射或藉由逐漸輸注以非經腸式投與。有用的投與及遞送療法包括靜脈內、腹膜內、口腔、肌肉內、皮下、腔內、鞘內、經皮、真皮、蠕動泵方法、或直接注射至含腫瘤細胞之組織中。 包含抗體之治療性組合物習知上係經靜脈內，諸如藉由注射(例如)單位劑量投與。術語「單位劑量」在提及治療性組合物使用時係指適用作針對個體之單元劑量的物理上離散單位；各單位包含經計算以產生出所需治療效應之預定量的活性物質及所需稀釋劑(即載劑或媒劑)。含雙功能抗-醣化PD-L1抗體之組合物係以與劑量調配物相容的方式及以治療有效量投與。欲投與的量取決於待治療的個體、個體系統利用活性成分之能力及所需治療效應之程度。欲投與的活性成分之精確量取決於醫師判斷及對於各個體不同。然而，用於全身施用之合適的劑量範圍係揭示於本文中及取決於投藥途徑。亦設想用於初始及追加投與之適合的療法及可通常涉及初始投與，接著，在一或多個時間間隔(小時)下藉由隨後的注射或其他投藥重複給藥。例示性多次投與係適用於維持持續高的血清及組織抗體含量。或者，設想足以維持血液中之濃度在針對活體內療法所指定的範圍內之連續靜脈內輸注。 預期抗-醣化PD-L1抗體可經全身性或局部投與以治療疾病，諸如以抑制腫瘤細胞生長或殺死罹患局部晚期或轉移性癌症之癌症患者的癌細胞。該等抗體可單獨地或與抗增殖藥物或抗癌藥物組合投與。在一個實施例中，投與抗-醣化PD-L1抗體以減小手術或其他程序前患者中的癌症負載。或者，其等可在週期性時間間隔下於手術之後投與以確保任何殘留癌症(例如，手術未消除之癌症)在尺寸或生長能力上有所減小及/或不存活。如上文所述，抗體之治療有效量為經計算以達成所需效應之預定量。因此，用於投與抗-醣化PD-L1抗體之劑量範圍為大到足以產生所需效應(其中腫瘤細胞分化及細胞循環之症狀減少)之其等範圍。最佳地，劑量不應大到引起不良副作用，諸如高黏度症候群、肺水腫、充血性心臟衰竭、神經學效應及類似者。一般而言，劑量將隨患者的年齡、身體狀態、體型及性別、及疾病的程度改變及可由熟習此項技術者(諸如醫療專業人員或臨床醫師)確定。當然，劑量可在發生任何併發症時由個別醫師調整。
治療方法
在某些實施例中，所述組合物及方法涉及單獨地或與第二或額外藥物或療法組合投與雙功能抗-醣化PD-L1抗體。該藥物或療法可施用於治療與PD-L1或醣化PD-L1相關聯，較佳與人類PD-L1或醣化人類PD-L1與人類PD-1之相互作用相關聯之任何疾病。例如，該疾病可為癌症。包含至少一種優先結合至醣化PD-L1蛋白且阻斷或抑制PD-L1與PD-1結合而且促進PD-L1內部化及降解之抗-PD-L1抗體抗體或其結合部分之組合物及方法在治療癌症或其他疾病中具有治療性或保護效應，特定言之藉由預防、減小、阻斷或抑制PD-1/PD-L1相互作用，藉此提供治療效應及治療。 包括組合療法之組合物及方法具有治療性或保護效應及可增強治療性或保護效應，且/或增加另一抗癌或抗過度增生療法之治療性效應。該等治療性及預防性方法及組合物可以可有效達成所需效應，諸如殺死癌細胞及/或抑制細胞過度增殖的組合量提供。該方法可涉及投與雙功能抗-醣化PD-L1抗體或其結合片段及第二療法。該第二療法可或可不具有直接細胞毒性效應。例如，該第二療法可為上調免疫系統而不具有直接細胞毒性效應之藥劑。可將組織、腫瘤及/或細胞暴露於一或多種包含一或多種藥劑(例如，抗體或抗癌藥劑)之組合物或醫藥調配物，或將組織、腫瘤及/或細胞暴露於兩種或更多種不同組合物或調配物，其中一種組合物提供例如1)抗體，2)抗癌藥劑，3)抗體及抗癌藥劑二者，或4)兩種或更多種抗體。在一些實施例中，該第二療法亦為抗-PD-L1抗體，較佳係相對於非醣化PD-L1優先結合醣化PD-L1之抗-醣化PD-L1抗體，或在其他實施例中，為抗-PD-1抗體。非限制性地，例示性抗-PD-1抗體包括帕姆單抗(pembrolizumab)及納武單抗(nivolumab)；例示性抗-PD-L1抗體包括阿特珠單抗(atezolizumab)。此外，預期該組合療法可與化療法、放射療法、手術療法或免疫療法組合使用。 舉例而言，本文在應用於細胞時使用術語「接觸」及「暴露」以描述將治療性多肽(較佳係如本文所述之抗-醣化PD-L1抗體)遞送至靶細胞或置為與靶細胞直接鄰接位置，特定言之以特異性結合至表現或高度表現於腫瘤或癌細胞表面上之靶抗原(例如PD-L1，特定言之，醣化PD-L1)之方法。由治療性抗-醣化PD-L1抗體或其結合片段之此類結合可防止、阻斷、抑制或減小效應子T-細胞上腫瘤或癌症細胞表現之PD-L1與PD-1之相互作用，藉此防止與PD-L1/PD-1相互作用相關聯的免疫抑制作用。在實施例中，亦將化療劑或放射治療劑與抗-醣化PD-L1抗體或其結合片段結合投與或遞送至個體。為達成細胞之殺死，例如，將一或多種藥劑以可有效殺死細胞或防止其分化之組合量遞送至細胞。 抗-醣化PD-L1抗體可在另一抗癌治療之前、期間、之後投與，或與另一抗癌治療以各種組合形式投與。投與間隔範圍係彼此同時投與至彼此前或後的數分鐘至數天至數週之時間。在抗體與抗癌藥劑分開提供給患者之實施例中，通常確保一段顯著時間期不會於各次遞送之間到期失效，使得所投與化合物仍能夠針對患者發揮有利組合之效應。闡釋性地，在該等情況下，預期可在彼此約12至24或72小時內及更特定言之在彼此約6-12小時內對患者提供抗體及抗癌療法。在一些情況下，咸希望顯著延長治療時間段，其中各次投與之間相隔數天(2天、3天、4天、5天、6天或7天)至數週(1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週或8週)。 在某些實施例中，治療過程或治療週期將持續1-90天或更長(該範圍包括期間天數及最後一天)。預期可在第1天至第90天中任何一天(該範圍包括期間天數及最後一天)或其任何組合提供一種藥劑，及在第1天至第90天中任何一天(該範圍包括期間天數及最後一天)或其任何組合提供另一藥劑。在單日內(24小時期間)，可對患者提供一或多次投與。此外，在治療過程之後，預期可能會有一段不投與抗癌治療的時間。該時間期可持續例如1-7天、及/或1-5週、及/或1-12個月或更長(該範圍包括期間天數及上限時間點)，端視患者的健康狀態，諸如預後、抵抗力、健康等而定。將視需要重複治療週期。可採用治療之各種組合。在顯示於下文之組合治療方案之代表性實例中，抗體(諸如抗-醣化PD-L1抗體)或其結合片段以「A」表示，而抗癌療法以「B」表示： A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A。 投與本發明實施例之任何抗體或療法至患者係遵照投與該等化合物之一般協定，如果有毒性的話，並考慮藥劑之毒性。因此，在一些實施例，要有監測不良事件及毒性的步驟，特別是歸因於組合療法所造成的不良事件及毒性。 在一個實施例中，提供一種方法，其涉及單獨地或與另一抗癌藥劑組合投與雙功能抗-醣化PD-L1抗體至有此需要的患者(即，罹患癌症或腫瘤之患者)。在投與抗-醣化PD-L1抗體之前，評估患者之腫瘤或癌症樣本中PD-L1之存在。若該評估之結果顯示患者之腫瘤或癌症對於醣化PD-L1為陽性，則將基於患者之醣化PD-L1+腫瘤或癌症將更適合用抗-醣化PD-L1抗體治療及治療可繼續進行以達成更有可能有益的結果之可能性來選擇該患者之治療。醫療專業人員或醫師可建議患者繼續抗-醣化PD-L1抗體治療方法，及該患者可基於醫療專業人員或醫師的建議來決定繼續治療。此外，在治療過程中，可檢定患者之腫瘤或癌細胞中醣化PD-L1之存在作為監測治療之進展或有效性之方法。若檢定顯示例如患者之腫瘤或癌細胞上醣化PD-L1之改變、損失或減小，則可由醫療專業人員結合患者決定治療是否應繼續或以某種方式改變(例如，更高的劑量、添加另一抗癌藥劑或療法及類似者)來採取決策。
化療法
根據本發明實施例之治療或治療性方法，可使用多種化學治療劑。術語「化療法」係指使用藥物以治療癌症。「化學治療劑」意指在治療癌症中投與的化合物或組合物。該等藥劑或藥物係依其在細胞中之活性模式(例如，其是否影響細胞週期基細胞生長及增殖及在什麼階段影響)分類。或者，化學治療劑可基於其與DNA直接交聯、***DNA中、或藉由影響細胞中核酸之合成引起染色體及有絲***異常之能力進行表徵。 化學治療劑之非限制性實例包括烷基化劑，諸如噻替哌及環磷醯胺；烷基磺酸酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯唑達帕(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美托達帕(meturedopa)及烏瑞替哌(uredopa)；伸乙基亞胺及甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三伸乙基蜜胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫基磷醯胺及三羥甲蜜胺；乙醯素(尤其係布拉它辛(bullatacin)及布拉它辛酮(bullatacinone))；喜樹鹼(包括合成類似拓樸替康(topotecan))；苔蘚蟲素(bryostatin)；卡裏斯他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；克利特非辛(cryptophycin)(特定言之克利特非辛1及克利特非辛8)；多拉司他汀(dolastatin)；多卡米星(duocarmycin)(包括合成類似物、KW-2189及CB1-TM1)；艾榴素(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；肉質網囊素(sarcodictyin)；海綿抑素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustards)，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、膽磷醯胺、雌氮芥、異環磷醯胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、氧化氮芥鹽酸鹽、美法侖(melphalan)、新氮芥、膽甾醇對苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)及烏拉莫司汀(uracil mustard)；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如烯二炔類抗生素(例如，卡奇黴素(calicheamicin)，尤其係卡奇黴素γ1及卡奇黴素ω1)；達內黴素(dynemicin)，包括達內黴素A；雙膦酸酯，諸如氯膦酸鹽；埃斯培拉黴素(esperamicin)；及新抑癌素生色團及相關色蛋白烯雙炔抗生素發色團、阿克拉黴素(aclacinomysins)、放線菌素(actinomycin)、奧沙尼菌素(authrarnycin)、氮絲胺酸、博來黴素、放線菌素C(cactinomycin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、放線菌素(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正亮胺酸、多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉基-多柔比星、氰基嗎啉基-多柔比星、2-吡咯啉并-多柔比星及去氧阿黴素(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂黴素(諸如絲裂黴素C)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalarnycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、波提洛黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈脲黴素、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)及佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、蝶羅呤(pteropterin)及曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)及硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿札胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二去氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱(enocitabine)及氟尿苷(floxuridine)；雄激素，諸如卡普睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)及睪內酯(testolactone)；抗腎上腺素，諸如米托坦(mitotane)及曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充液，諸如亞葉酸；醋葡醛內酯；醛磷醯胺糖苷；胺基乙醯丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；貝斯他布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；迪佛法明(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鳥胺酸(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃坡黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸嫁；羥基脲；蘑菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidainine)；類美登素(maytansinoid)，諸如美登素(maytansine)及安絲菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫匹達漠(mopidanmol)；氮濱(nitraerine)；噴托他丁(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；足葉草酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多醣錯合物；雷佐生(razoxane)；根黴素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺鍺胺(spirogermanium)；細交鍵孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；新月毒素(trichothecenes)(特別係T-2毒素、韋拉卡瑞A(verracurin A)、桿孢菌素A(roridin A)及蛇形菌素(anguidine))；尿烷(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；呱泊溴烷(pipobroman)；加賽特辛(gacytosine)；***糖苷(「Ara-C」)；環磷醯胺；類紫杉醇，例如，太平洋紫杉醇(paclitaxel)及多烯紫杉醇吉西他濱(docetaxel gemcitabine)；6-硫基烏嘌呤；巰基嘌呤；鉑配位錯合物，諸如順鉑、奧沙利鉑(oxaliplatin)及卡鉑；長春花鹼(vinblastine)；鉑；依託泊苷(etoposide)(VP-16)；異環磷醯胺(ifosfamide)；米托蒽醌；長春新鹼(vincristine)；長春瑞濱(vinorelbine)；諾安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙 (edatrexate)；道諾黴素(daunomycin)；胺基喋呤(aminopterin)；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(例如CPT-11)；拓樸異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視色素，諸如視黃酸；卡培他濱(capecitabine)；卡鉑、丙卡巴肼(procarbazine)、普里克黴素(plicomycin)、吉西他濱(gemcitabine)、溫諾平(navelbine)、法呢基(farnesyl)-蛋白轉移酶抑制劑、反式鉑(transplatinum)及上述任何者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。
放射療法
放射療法包括用引起DNA損傷之藥劑治療。放射療法已廣泛地用於癌症及疾病治療中及包括通常稱為γ-射線、X-射線及/或直接遞送放射性同位素至腫瘤細胞之放射療法。亦預期DNA損傷因素之其他形式，諸如微波、質子束照射(美國專利第5,760,395號及第4,870,287號)及UV-照射。最有可能的是，所有該等因素於DNA本身、DNA之前驅物、DNA之複製及修復及染色體之組裝及維持上均達成寬廣範圍之損傷。X-射線之例示性劑量範圍在50至200錀之日劑量持續經延長之時間段(3至4週)至2000至6000錀之單劑量範圍內。放射性同位素之劑量範圍廣泛地變化及取決於同位素之半衰期、所發射輻射之強度及類型、腫瘤細胞之吸收及接受治療的個體之耐受性。
免疫療法
在該等方法之一些實施例中，免疫療法可與如本文所述之雙功能抗-醣化PD-L1抗體之投與組合或結合使用。在癌症治療的背景內容中，免疫療法一般仰賴於使用免疫效應子細胞及分子以靶向及破壞癌細胞。利妥昔單抗(Rituximab)(RITUXAN®)為該一實例。其他檢查點抑制劑亦可以組合方式投與，包括易普利單抗(ipilimumab)。雙功能抗-醣化PD-L1抗體亦可與其他抗-PD-1或抗-PD-L1抑制劑(諸如抗PD-L1抗體，其包括阿特珠單抗(atezolizumab)、度伐魯單抗(durvalumab)或阿非魯單抗(avelumab))或抗PD-1抗體(包括納武單抗(nivolumab)、帕姆單抗(pembrolizumab)或彼地利株單抗(pidilizumab))組合投與。此外，該等實施例之雙功能抗-醣化PD-L1抗體中之一或多者可彼此組合投與。免疫效應子可為(例如)腫瘤細胞表面上對標記物(細胞表面蛋白或受體)具特異性之抗體。該抗體僅可充作療法之效應子或其可募集其他細胞以實際上達成細胞殺死。該抗體亦可共軛至藥物或毒素(化學治療劑、放射性核素、蓖麻毒蛋白A鏈、霍亂毒素、百日咳毒素等)及僅充作靶向劑。或者，效應子可為帶有與腫瘤細胞標靶直接或間接相互作用(例如，T-細胞上之PD-1/腫瘤細胞上之PD-L1相互作用)之表面分子之淋巴細胞。各種效應子細胞包括細胞毒性T細胞及自然殺手(NK)細胞。 在免疫療法之一個態樣中，腫瘤細胞必須帶有適合靶向之一些標記物(蛋白質/受體)。最佳地，腫瘤標記蛋白質/受體不存於大多數其他細胞(諸如非癌細胞或正常細胞)上。存在許多腫瘤標記物及其中的任何者在本發明實施例的背景內容中可能適合藉由與抗-醣化PD-L1抗體一起投與之另一藥物或療法之靶向。常見腫瘤標記物包括(例如)CD20、癌胚抗原(CEA)、酪胺酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化的路易士抗原(Sialyl Lewis Antigen)、MucA、MucB、PLAP、層黏連蛋白(laminin)受體、erbB及p155。免疫療法之一替代性態樣係將抗癌效應與免疫刺激效應組合。亦存在免疫刺激分子且包括細胞激素，諸如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN；趨化細胞素，諸如MIP-1、MCP-1、IL-8；及生長因子，諸如FLT3配位體。 當前所研究或使用之免疫療法之實例為免疫佐劑，例如，牛結核分枝桿菌(
Mycobacterium bovis
)、惡性瘧原蟲(
Plasmodium falciparum
)、二硝基氯苯及芳族化合物(美國專利第5,801,005號及第5,739,169號；Hui及Hashimoto，1998，Infection Immun.，66(11):5329-5336；Christodoulides等人，1998，Microbiology，144(Pt 11):3027-3037)；細胞激素療法，例如，α、β及γ干擾素；IL-1、GM-CSF及TNF(Bukowski等人，1998，Clinical Cancer Res.，4(10):2337-2347；Davidson等人，1998，J. Immunother.，21(5):389-398；Hellstrand等人，1998，Acta Oncologica，37(4):347-353)；基因療法，例如，TNF、IL-1、IL-2及p53(Qin等人，1998，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，95(24): 14411-14416；Austin-Ward等人，1998，Revista Medica de Chile，126(7): 838-845；美國專利第5,830,880號及第5,846,945號)；及單株抗體，例如，抗-CD20、抗-神經節苷脂GM2及抗-p185(Hollander，2012，Front. Immun.，3:3；Hanibuchi等人，1998，Int. J. Cancer，78(4): 480-485；美國專利第5,824,311號)。預期一或多種抗癌療法可與本文所述之抗體療法一起使用。
外科手術
罹患癌症之個體中約60%經歷一些類型之外科手術，其包括預防性、診斷性或分級治癒性及緩解手術。治癒性手術包括物理上移除、切除及/或破壞所有或部分癌組織之切除術及可與其他療法(諸如本文所述之抗-醣化PD-L1抗體治療、化療法、放射療法、激素療法、基因療法、免疫療法及/或替代療法及其組合)結合使用。腫瘤切除術係指物理上移除腫瘤之至少一部分。除了腫瘤切除術外，藉由外科手術治療包括雷射手術、冷凍手術、電子手術及顯微鏡控制手術(莫氏手術(Mohs’ surgery))。在切除癌細胞、組織或腫瘤之一部分或全部後，可在體內形成腔。治療可藉由在該區域灌注、直接注射或局部施用額外抗癌療法來達成。可例如每1、2、3、4、5、6或7天或每1、2、3、4及5週或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月重複該治療。該等療法亦可為不同劑量。
蛋白質純化
熟習此項技術者熟知蛋白質(包括抗體及特定言之抗-醣化PD-L1抗體)純化技術。在一個層級上，該等技術涉及將細胞、組織或器官均質化及粗分級分離成多肽及非多肽部分。除非另外指明，否則受關注之蛋白質或多肽可進一步使用層析及電泳技術純化以達成部分或完全純化(或純化至同質性)。特別適合製備純蛋白質或肽之分析方法為離子交換層析、尺寸排除層析、逆相層析、羥磷灰石層析、聚丙烯醯胺凝膠電泳、親和層析、免疫親和層析及等電聚集。一種特別有效的肽純化方法為快效液相層析(FPLC)或甚至高效液相層析(HPLC)。如本技術中一般所知曉，可改變進行各個純化步驟之順序，及/或可省略某些步驟，及可仍舊得到用於製備實質上經純化多肽之適合的方法。 經純化多肽(諸如本文所述之抗-醣化PD-L1抗體)係指可單離或單離自其他組分且相對其可天然得到之狀態而言純化至任何程度之多肽。因此，經單離或純化之多肽亦指非存於其可天然生成，例如，細胞、組織、器官、生物樣本及類似者的環境中之多肽。一般而言，「經純化」將係指已經過分級分離以移除各種其他組分之多肽組合物，及該組合物實質上保留其所表現生物活性。「實質上經純化」之組合物係指多肽形成組合物之主要組分，及如此，構成組合物蛋白質組分之約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%或更多之組合物。 熟習此項技術者根據本發明可知曉用於量化多肽(諸如抗體蛋白)之純化程度之各種方法。該等方法包括(例如)測定活性部分之特異性活性，或藉由SDS/PAGE分析評估某一部分中多肽的量。用於評估某一部分之純度之一較佳方法係計算該部分之特異性活性，將其與初始提取物之特異性活性進行比較，及由此計算其中的純度，藉由「純化倍數」評估。當然，用於表示活性量的實際單位將取決於經選擇以跟隨純化之特定檢定技術及經表現多肽是否展現可檢測活性。 一般不要求多肽將總是以其最純狀態提供。實際上，預期在某些實施例中，較少的實質上經純化產物可具有效用。部分純化可藉由使用更少純化步驟之組合，或藉由使用相同一般純化方案之不同形式來達成。例如，應瞭解，使用HPLC設備進行的陽離子交換柱層析通常將會導致比使用低壓層析系統之相同技術更大的純化「倍數」。展現較低相對純化程度之方法可在蛋白質產物之總回收率上，及維持所表現之蛋白質之活性上具有優點。 親和層析係仰賴於待單離的物質(蛋白質)與其可特異性結合的分子間之特異性親和力，例如，受體-配位體類型之相互作用之層析程序。管柱材料(樹脂)係藉由共價偶聯結合搭配物中之一者至不溶性基質合成。然後，該管柱材料能夠從傳送於管柱樹脂上之溶液特異性吸收物質。洗脫係藉由將條件改變為結合將被破壞/將不發生之條件(例如，經變化之pH、離子強度、溫度等)發生。基質應為不會吸收分子至任何明顯程度且具有寬廣範圍之化學、物理及熱穩定性之物質。配位體應以此種不影響其結合性質之方式偶聯。該配位體亦應提供相對緊密的結合；然而，經結合之物質之洗脫應在不破壞所需樣本蛋白質或配位體下發生。 尺寸排除層析(SEC)係溶液中之分子係基於其尺寸或以更技術術語表示，其流動動力體積分離之層析法。其通常係應用於大分子或大分子錯合物，諸如蛋白質及工業聚合物。通常，當使用水溶液以輸送樣本通過管柱時，該技術稱為凝膠過濾層析，相對於名稱凝膠滲透層析，其係在將有機溶劑用作移動相的情況下使用。SEC之根本原理係不同尺寸的顆粒將以不同速率洗脫(過濾)通過固定相，導致顆粒溶液基於尺寸而分離。若所有該等顆粒同時或接近同時加載，則相同尺寸的顆粒會一起洗脫。 高效(亦稱高壓)液相層析(HPLC)為通常用於生物化學及分析化學中以分離、識別及量化化合物之管柱層析之一種形式。HPLC使用固持層析填充材料(固定相)的管柱、將移動相移動通過管柱之泵及顯示分子滯留時間之檢測器。滯留時間係根據固定相間的相互作用、所分析的分子及所使用的溶劑改變。
醫藥製劑
在進行包含雙功能抗-醣化PD-L1抗體或醣化PD-L1多肽之醫藥組合物之臨床應用的情況下，製備適合預期應用之醫藥或治療性組合物一般係有益的。一般而言，醫藥組合物可包含有效量之已溶解或分散於醫藥上可接受之載劑中之一或多種多肽或其他藥劑。在某些實施例中，醫藥組合物可包含(例如)至少約0.1%多肽或抗體。在其他實施例中，多肽或抗體可佔該單位約2%至約75重量%，或例如介於約25重量%至約60重量%之間、及可從其間導出的任何範圍(包括上限及下限值)。每種治療上有用之組合物中活性化合物的量可以此種將以任何所給單位劑量獲得適合劑量的方式製備。熟習製備該等醫藥調配物技術者考量多種因素(諸如溶解度、生物可利用率、生物半衰期、投藥途徑、產品儲存期以及其他藥理學考慮)，及如此，多種劑量及治療方案可係期望的。 另外根據某些態樣，適合投與之組合物可在含或不含惰性稀釋劑之醫藥上可接受載劑中提供。該載劑應係可同化的且包括液態、半固態(例如，凝膠或膏劑)或固態載劑。載劑或稀釋劑之實例包括脂肪、油、水、鹽水溶液、脂質、脂質體、樹脂、黏合劑、填充劑及類似者或其組合。如本文中所使用，「醫藥上可接受之載劑」包括任何及所有水性溶劑(例如，水、醇/水溶液、乙醇、鹽水溶液、非經腸式媒劑，諸如氯化鈉、林格氏葡萄糖(Ringer's dextrose)等)、非水性溶劑(例如，丙二醇、聚乙二醇、植物油及可注射有機酯(諸如油酸乙酯))、分散介質、塗層(例如卵磷脂)、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如，抗細菌劑或抗真菌劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體、對羥基苯甲酸酯(例如，對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞)、等滲劑(例如，糖、氯化鈉)、吸收延遲劑(例如，單硬脂酸鋁、明膠)、鹽、藥物、藥物穩定劑(例如，緩衝劑、胺基酸，諸如甘胺酸及離胺酸、碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、山梨糖醇、甘露醇等)、凝膠、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、矯味劑、染料、流體及營養補充劑，諸如該等材料及其組合，將係熟習此項技術者所知曉。除了任何習知介質、試劑、稀釋劑或載劑對接受者或對於其包含在內的組合物之治療有效性有害的程度以外，其在實施該等方法之可投與組合物中之使用係適宜的。根據熟知參數調整醫藥組合物中各種組分之pH及精確濃度。根據某些態樣，將組合物與載劑以任何簡便及實用方式組合，即，藉由溶液、懸浮液、乳化、混合物、囊封、吸收、研磨及類似。該等程序對於熟習此項技術者而言係常規的。 在某些實施例中，該等組合物可包含不同類型之載劑，取決於其是否呈固態、液態或氣霧劑形式投與，及其是否需要針對投藥途徑(諸如注射)滅菌。該等組合物可經調配以用於靜脈內、皮內、經皮、鞘內、動脈內、腹膜內、鼻內、***內、直腸內、肌肉內、皮下、黏膜、經口、局部、經吸入(例如，氣霧劑吸入)、經注射、經輸注、經連續輸注、直接、經由導管、經由灌洗術、在脂質組合物(例如脂質體)中經局部灌注浴靶細胞、或藉由其他方法或如熟習此項技術者已知般之前述之任何組合投與。參見，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，1990。通常，該等組合物可製備成液體溶液或懸浮液中任一者；亦可製備適合在添加液體之後於注射之前用於製備溶液或懸浮液之固態或可復水形式；及該等製劑亦可進行乳化。 該等抗體可調配成以游離鹼、中性或鹽形式之組合物。醫藥上可接受之鹽包括酸加成鹽，例如，彼等與蛋白質組合物之游離胺基形成者，或其等係與無機酸(諸如(例如)鹽酸或磷酸)或諸如乙酸、草酸、酒石酸或杏仁酸之有機酸形成。與游離羧基形成之鹽亦可衍生自無機鹼，諸如(例如)鈉、鉀、銨、鈣或鐵氫氧化物；或諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸或普魯卡因(procaine)之有機鹼。 在其他實施例中，可使用包括多肽、一或多種脂質及水性溶劑之醫藥脂質媒劑組合物。如本文中所使用，術語「脂質」係指特徵上不溶於水中且可用有機溶劑萃取之寬廣範圍物質中之任何者。熟習此項技術者熟知該寬廣類別之化合物，及在本文中使用術語「脂質」時，其不受限於任何特定結構。實例包括包含長鏈脂族烴及其衍生物之化合物。脂質可係天然生成或合成(即，經人設計並生產)。然而，脂質通常為生物物質。生物脂質為此項技術所熟知且包括(例如)中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、類固醇、萜烯、溶脂質(lysolipid)、糖神經鞘脂質、醣脂質、硫脂、具有經醚-及酯連接之脂肪酸之脂質、可聚合脂質及其組合。當然，該等組合物及方法亦包涵除了本文具體描述之彼等之外的熟習此項技術者理解為脂質之化合物。一般技術者將熟悉可用於將組合物分散於脂質媒劑中之技術的範圍。例如，可將抗體分散於包含脂質之溶液中，用脂質溶解，用脂質乳化，與脂質混合，與脂質組合，共價結合至脂質，含於脂質中呈懸浮液形式，用膠束或脂質體包含或與其複合，或藉由熟習此項技術者已知的任何方法以其他方式與脂質或脂質結構結合。該分散液可或可不導致脂質體之形式。 術語「單位劑量」或「劑量」係指適合於個體中使用之物理上離散單位，各單位包含預定量之治療性抗體或含有治療性抗體之組合物，該量經計算以產生上文結合其投與(即，適宜途徑及治療方案)所述的所需反應的。根據治療次數及單位劑量兩者之欲投與的量取決於所需效應。投與給患者或個體之本發明實施例之組合物的實際劑量可由醫師並藉由生理因素(諸如個體的體重、年齡、健康狀況及性別、所治療疾病之類型、疾病穿透之程度、以往或同時進行的治療性干預、患者的自發症、投藥途徑及特定治療性物質之效力、穩定性及毒性)來確定。在其他非限制性實例中，劑量亦可包含每次投藥約1微克/kg/體重、約5微克/kg/體重、約10微克/kg/體重、約50微克/kg/體重、約100微克/kg/體重、約200微克/kg/體重、約350微克/kg/體重、約500微克/kg/體重、約1毫克/kg/體重、約5毫克/kg/體重、約10毫克/kg/體重、約50毫克/kg/體重、約100毫克/kg/體重、約200毫克/kg/體重、約350毫克/kg/體重、約500毫克/kg/體重至約1000毫克/kg/體重或更大及從其中導出之任何範圍。在可從本文所列數值導出之範圍之非限制性實例中，基於上文所述數值，可投與約5毫克/kg/體重至約100毫克/kg/體重、約5微克/kg/體重至約500毫克/kg/體重等之範圍。前述劑量包括介於彼等所指定者之間的量及意欲亦包括該等範圍之下限及上限值。在任何情況下，負責投與之專業者將決定組合物中活性成分之濃度及針對於個別個體之適宜劑量。 治療性組合物或製劑之特定性質並非用於限制。例如，適宜之組合物可呈與生理上耐受之液體、凝膠、或固體載劑、稀釋劑及賦形劑一起之調配物形式提供。在一些實施例中，該等治療性製劑可以類似於其他治療劑之方式投與給哺乳動物供獸用(諸如家畜)，及臨床上供人類使用。一般而言，如上所述，達成療效所需要的劑量將根據使用之類型及投藥模式、以及個別個體之特定要求改變。
作為生物標記的醣化 PD-L1
提供涉及使用至少一種雙功能抗-醣化PD-L1抗體於針對醣化PD-L1之檢定中作為生物標記之方法。該等方法可用於獲自罹患癌症或腫瘤之個體之腫瘤或癌細胞之生物標記評估。提供一種方法以判定罹患癌症的個體是否亦罹患表現醣化PD-L1(特定言之，該等細胞之細胞表面上可檢測水平之醣化PD-L1)之癌症或腫瘤。例如，若個體之癌症或腫瘤細胞經測試並確定表現細胞表面上之醣化PD-L1，則更有可能的是，經例如所述抗-醣化PD-L1抗體單獨地或與另一抗癌藥劑組合治療的個體將從治療中獲益。該等方法包括從罹患癌症或腫瘤之個體獲得樣本，使用此項技術中已知並使用或如上文所述之結合方法測試樣本之源自個體之癌症或腫瘤之細胞上醣化PD-L1之存在，及若發現個體之癌症或腫瘤對醣化PD-L1蛋白之細胞表面表現為陽性，則對該個體單獨地或與另一抗癌藥劑組合投與有效量之抗-醣化PD-L1抗體。在治療之前診斷個體為罹患表現醣化PD-L1之癌症或腫瘤可更有效地治療個體及使其受益，因為所投與的抗-醣化PD-L1抗體更有可能阻斷或抑制個體之表現醣化PD-L1之癌症或腫瘤細胞與個體之表現PD-1之T-細胞之相互作用，因此，藉由經活化T-細胞之殺死防止T-細胞活性之免疫抑制作用及促進殺死腫瘤或癌細胞。在一個實施例中，該方法可涉及首先選擇癌症或腫瘤可適合測試經表現醣化PD-L1蛋白之存在之個體。 可使用相似的方法以在癌症治療或療法(包括抗-醣化PD-L1抗體及另一抗癌藥物或治療之組合治療)過程中經時及在已中斷治療之後監測患者腫瘤細胞上醣化PD-L1之存在。該等方法亦可用於伴隨式診斷方法中，其中抗癌治療方案或組合治療涉及在治療之前及在治療過程中測試或檢定患者腫瘤或癌症樣本之表現醣化PD-L1之腫瘤或癌細胞(例如監測)，以確定成功的結果或其可能性。 在其他實施例中，該等抗-醣化PD-L1抗體可共軛至用於活體內成像之標記，例如，放射性核素，諸如針對PET或SPECT之I
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、針對光學成像之螢光染料、或針對MRI之順磁螯合物。可將經標記抗-醣化PD-L1抗體投與給患者(例如，靜脈內或其他非經腸投藥模式)，及在等待適當的時間之後，檢測經標記抗體之存在情況及位置以定位並量化腫瘤細胞。
其他藥劑
預期其他藥劑可與本發明實施例之某些態樣組合用於改良治療的療效。該等額外藥劑包括實現細胞表面受體及間隙接合(GAP junction)上調之藥劑、細胞生長抑制劑及分化劑、細胞黏著之抑制劑、增加過度增殖性細胞對細胞凋亡誘導劑之敏感性之藥劑或其他生物劑。藉由增加間隙接合的數量來促進細胞間信號傳導可增強於鄰近過度增殖性細胞群體上之抗-過度增殖效應。在其他實施例中，細胞生長抑制劑或分化劑可與本發明實施例之某些態樣組合使用以改良治療之抗過度增殖功效。預期細胞黏著之抑制劑可改良本發明實施例之功效。細胞黏著抑制劑之實例為黏著斑激酶(FAK)抑制劑及洛伐他汀(Lovastatin)。另外預期增加過度增殖性細胞對細胞凋亡敏感性之其他藥劑(諸如抗體c225)可與本發明實施例之某些態樣組合使用以改良治療功效。
套組及診斷
在另一個實施例中，提供一種包含治療劑及/或其他治療劑及遞送試劑之套組。在一些實施例中，該套組係用於製備及/或投與涉及本文所述抗-醣化PD-L1抗體之療法。該套組可包含一或多個裝納本文所述醫藥組合物中任何者之密封小瓶。該套組可包括(例如)至少一種抗-醣化PD-L1抗體及製備、調配及/或投與一或多種抗-醣化PD-L1抗體或進行所述方法一或多個步驟之試劑。在一些實施例中，該套組亦可包含適宜容器裝置，其係將不會與套組之組件(諸如Eppendorf管、檢定板、針筒、瓶或管)反應之容器。該容器可由可滅菌材料(諸如塑料或玻璃)製成。 該套組可進一步包括概述本文所述方法之程序步驟之說明書頁，及將遵循與本文所述實質上相同的程序或係一般技術者已知。說明書資訊可在包含機器可讀指令之電腦可讀媒體中，當使用電腦執行時，引起遞送醫藥有效量之治療劑之真實或虛擬程序之顯示。
融合物及共軛物
本文所提供之抗-醣化PD-L1抗體或醣化PD-L1多肽亦可與其他蛋白質表現為融合蛋白質或化學共軛至另一部分。在一些實施例中，該等抗體或多肽具有Fc部分，其可以同型或亞類形式變化，可為嵌合或雜合，及/或可經修飾，例如以改良效應子功能，控制半衰期或組織可接近性，增強生物物理特徵，諸如穩定性，及改良生產效率，此可與成本減少相關聯。可用於構築融合蛋白質之許多修飾及其製造方法係相關技術中已知的，例如，Mueller, J.P.等人，1997，Mol. Immun. 34(6):441-452；Swann, P.G.，2008，Curr. Opin. Immunol.，20:493-499；及Presta, L.G.，2008，Curr. Opin. Immunol.，20:460-470。在一些實施例中，Fc區為抗體之天然IgG1、IgG2或IgG4 Fc區。在一些實施例中，Fc區為雜合，例如，包含IgG2/IgG4 Fc恆定區之嵌合體。對Fc區之修飾包括(但不限於)經修飾以防止與Fc γ受體及補體結合之IgG4；經修飾以改良與一或多種Fc γ受體結合之IgG1；經修飾以減小效應子功能(胺基酸變化)至最小之IgG1；具有經改變/不含聚醣(通常藉由改變表現寄主)之IgG1；及與FcRn之pH-依賴性結合發生改變之IgG1。Fc區可包括抗體之完整鉸鏈區或非完整鉸鏈區。 另一個實施例包括已減小與FcR結合而增加其半衰期之IgG2-4雜合體及IgG4突變體。代表性IG2-4雜合體及IgG4突變體述於例如Angal等人，1993，Molec. Immunol.，30(1):105-108；Mueller等人，1997，Mol. Immun.，34(6):441-452；及美國專利第6,982,323號；該等專利均以其引用的方式併入本文中。在一些實施例中，缺失IgG1及/或IgG2域。例如，Angal等人(同上)描述IgG1及IgG2域中絲胺酸241改由脯胺酸置換之蛋白質。在一些實施例中，設想具有至少10個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個或至少100個胺基酸之融合蛋白質或多肽。 在一些實施例中，抗-醣化PD-L1抗體或醣化PD-L1多肽係連接至或共價結合至少一個部分或與至少一個部分形成複合物。該部分可為(但不限於)增加抗體作為診斷劑或治療劑之功效之部分。在一些實施例中，該部分可為成像劑、毒素、治療性酵素、抗生素、經放射性標記之核苷酸、化療劑及類似者。 在一些實施例中，共軛或融合至抗-醣化PD-L1抗體或醣化多肽或其部分之部分可為酵素、激素、細胞表面受體、毒素，諸如(但不限於)相思豆毒素、蓖麻毒素A、假單胞菌外毒素(即PE-40)、白喉毒素、蓖麻毒素、白樹毒素(gelonin)或美洲商陸(pokeweed)抗病毒蛋白)、蛋白質(諸如腫瘤壞死因子、干擾素(例如，α-干擾素、β-干擾素)、神經生長因子(NGF)、血小板源性生長因子(PDGF)、組織胞漿素原活化劑(TPA)或細胞凋亡劑(例如，腫瘤壞死因子-α、腫瘤壞死因子-β))、生物反應改良劑(諸如，例如，淋巴細胞活素(例如，介白素-1(「IL-1」)、介白素-2(「IL-2」)、介白素-6(「IL-6」))、粒細胞巨噬細胞群落刺激因子(「GM-CSF」)、粒細胞群落刺激因子(「G-CSF」)或巨噬細胞群落刺激因子(「M-CSF」)、或生長因子(例如，生長激素(「GH」))、細胞毒素(例如，細胞生長抑制劑或殺細胞劑，諸如太平洋紫杉醇、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D(gramicidin D)、溴化乙錠、吐根鹼(emetine)、絲裂黴素、依託泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼、長春花鹼、秋水仙素(colchicine)、多柔比星、道諾黴素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素(mithramycin)、放線菌素D、1-去氫睾固酮、糖皮質激素、普魯卡因、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)、基於妥布萊森(tubulysin)之微管抑制劑，例如類美登素，諸如類美登素DM1 (N2'-去乙醯基-N2'-(3-巰基-1-側氧基丙基)-美登素；莫登素(mertansine)或埃登素(emtansine)，取決於所使用的連接子；及類美登素DM4 (N2'-去乙醯基-n2'-(4-巰基-4-甲基-1-側氧基戊基)-6-甲基美登素；雷登素(ravtansine))，ImmunoGen, Inc.，Waltham，MA)及嘌呤黴素及其類似物或同源物)、抗代謝物(例如，甲胺喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶達卡巴嗪)、烷基化劑(例如，氮芥、噻替哌苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法侖(melphalan)、BiCNU® (卡莫司汀；BSNU)及洛莫司汀(CCNU)、環磷醯胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲黴素、絲裂黴素C及順二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑)、蒽環黴素(例如，道諾黴素(原名為正定黴素(daunomycin))及多柔比星)、抗生素(例如，放線菌素(dactinomycin)(原名為放線菌素(actinomycin))、博來黴素、光神霉素及安曲黴素(anthramycin)(AMC))、抗有絲***劑及/或微管蛋白抑制劑，例如，長春新鹼及長春花鹼、單甲基奧瑞司他汀F(MMAF)、單甲基奧瑞司他汀E(或去甲基-奧瑞司他汀E)(MMAE)，例如，維多汀(vedotin)；或其組合。
抗體 - 藥物共軛物 (ADC)
抗體藥物共軛物(ADC)為生物治療劑，其中強效細胞毒性藥物經化學連接子或偶聯劑共價連接至針對特異性靶抗原(特定言之，表現或過度表現於腫瘤或癌細胞表面上之靶抗原)之抗體(通常係單株抗體)。該等「經加載」抗體係設計成遞送致死性細胞毒性物質(cargoes)至腫瘤或癌細胞。ADC提供一種用於靶向加載藥物至腫瘤細胞同時減小副作用及減低全身性毒性至最低之方法。ADC藉助ADC之抗體組分與其靶抗原之特異性相互作用結合至細胞表面表現之靶抗原。在結合至靶抗原之後，ADC可經內部化至細胞中，特定言之，若抗體具有提高之內部化活性，則本文所述實施例之抗-醣化PD-L1抗體(例如，STM108及STM073)亦如此。因此，當該等ADC係內部化至細胞中時，其等直接用於殺死細胞或靶向細胞內部的分子，此導致細胞凋亡或細胞死亡。該等包含本文所述抗-醣化PD-L1抗體(特定言之，單株、人源化、嵌合或人類抗體)之ADC將抗體特異性靶向至腫瘤及癌細胞上之醣化PD-L1與細胞毒性藥物或化合物之癌殺死能力組合，藉此提供抗-醣化PD-L1抗體治療及療法之進一步的優點。此項技術中已知用於製備及使用ADC之技術而非意圖限制本文所述之抗-醣化PD-L1抗體。(參見，例如，Valliere Douglass, J.F.等人，2015，Mol. Pharm.，12(6):1774-1783；Leal, M.等人，2014，Ann. N.Y. Acad. Sci.，1321:41-54；Panowski, S.等人，2014，mAbs，6(1):34-45；Beck, A. 2014，mAbs，6(1):30-33；Behrens, C.R.等人，2014，mAbs，6(1):46-53；及Flygare, J.A.等人，2013，Chem. Biol. Drug Des.，81(1):113-121)。在實施例中，上述部分(特定言之，毒素及細胞毒素)之一部分或全部可與抗-醣化PD-L1抗體共軛以產生用於治療癌症之有效ADC。在實施例中，ADC之抗-醣化PD-L1抗體組分可為雙特異性、多重特異性、雙互補位或多重互補位抗體。 用於將治療性或細胞毒性部分與抗體共軛之技術係熟知的；參加，例如，Amon等人，「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」，MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY，Reisfeld等人(編)，1985，第243-56頁，Alan R. Liss, Inc.；Hellstrom等人，「Antibodies For Drug Delivery」，CONTROLLED DRUG DELIVERY (第2版)，Robinson等人(編)，1987，第623-53頁，Marcel Dekker, Inc.；Thorpe，「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」，MONOCLONAL ANTIBODIES '84:BIOLOGICAL AND CLINICAL APPLICATIONS，Pinchera等人(編)，1985，第475-506頁)；「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」，MONOCLONAL ANTIBODIES FOR CANCER DETECTION AND THERAPY，Baldwin等人(編)，1985，第303-16頁，Academic Press；Thorpe等人，Immunol. Rev. 62: 119-158 (1982)；Carter等人，Cancer J. 14(3): 154-169 (2008)；Alley等人，Curr. Opin. Chem. Biol. 14(4): 529-537 (2010)；Carter等人，Amer. Assoc. Cancer Res. Educ. Book. 2005(1): 147-154 (2005)；Carter等人，Cancer J. 14(3): 154-169(2008)；Chari，Acc. Chem Res. 41(1): 98-107 (2008)；Doronina等人，Nat. Biotechnol. 21(7): 778-784(2003)；Ducry等人，Bioconjug Chem. 21(1): 5-13(2010)；Senter, Curr. Opin. Chem. Biol. 13(3): 235-244 (2009)；及Teicher，Curr Cancer Drug Targets. 9(8): 982-1004 (2009)。ADC及ADC腫瘤學產品之回顧可參見Lambert，British J. Clin. Pharmacol.，76(2):248-262 (2013)及Bouchard等人，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，24:5357-5363 (2014)。 在特定實施例中，有利於PD-L1內部化至腫瘤細胞中之抗-醣化PD-L1抗體係通常藉由具有不穩定鍵之化學連接子共軛至高度強效之如上所述生物活性藥物或藥劑(諸如細胞毒性及/或化學治療劑、毒素或細胞毒素)或放射性核素，以產生抗-醣化PD-L1抗體-藥物共軛物(ADC)(本文中稱為抗-醣化PD-L1抗體-ADC)。例如，生物活性藥物或細胞毒性劑充作「細胞毒性有效負載」，其係遞送至細胞(特定言之表現由抗-醣化PD-L1抗體-ADC所結合的細胞表面靶受體或分子之腫瘤或癌細胞)中。該結合至其靶分子之抗-醣化PD-L1抗體-ADC係經內部化至釋放細胞毒性藥物有效負載之細胞中。藉由共軛至高度強效細胞毒性有效負載內部化本文所述抗-醣化PD-L1抗體之癌細胞殺死活性之增強可提供具有高抗腫瘤活性及一般而言良好耐受之輕度不利效應之抗癌ADC生物製劑。 本文實施例中所述之抗-醣化PD-L1抗體可連接至如本技術中已知並使用或尚未商業化之各種類型之細胞毒性或DNA作用之有效負載。例如，美登素為最先單離自埃塞俄比亞灌木卵葉美登木(
Maytenus ovatus
)樹皮之苯并橋環大環內酯(benzoansamacrolide)。該細胞毒性劑及其衍生物(例如類美登素)結合至長春花生物鹼(Vinca alkaloid)結合位點附近的微管蛋白。其等被視為對位於微管末端的微管蛋白具有高的親和力而對分佈貫穿微管中之位點之親和力較低。微管動力學之抑制作用引起細胞停滯在細胞週期之G2/M階段，最終導致細胞凋亡引起之細胞死亡。(Oroudjev等人，Mol. Cancer Ther.，10L2700-2713 (2010))。兩種美登素衍生物(含硫醇類美登素)包括DM1及DM4 (ImmunoGen, Inc.，Waltham, MA)廣泛地與不可逆及可逆連接子組合使用。特定言之，經硫醚連接子連接至抗體之DM1稱為「埃登素」；經SPP連接子連接至抗體之DM1稱為「莫登素」；經SPDB連接子連接之DM4稱為「雷登素」；及經sSPDB連接子連接之DM4稱為「索拉登素(soravtansine)」(ImmunoGen, Inc.，Waltham, MA)。在一個實施例中，抗-醣化PD-L1抗體-ADC包含微管蛋白作用之類美登素有效負載DM1。在一個實施例中，抗-醣化PD-L1抗體-ADC包含微管蛋白作用之類美登素有效負載DM4。在一個實施例中，抗-醣化PD-L1抗體-ADC包含DNA作用之有效負載，例如，DGN462 (ImmunoGen, Inc.，Waltham, MA)。在一個實施例中，抗-醣化PD-L1抗體-ADC之抗-醣化PD-L1抗體組分為STM073或其結合部分。在一個實施例中，抗-醣化PD-L1抗體-ADC之抗-醣化PD-L1抗體組分為STM108或其結合部分。 在一個特定實施例中，共軛至抗-醣化PD-L1抗體之細胞毒性劑為MMAE (單甲基奧瑞司他汀E(或去甲基-奧瑞司他汀E))，一種高毒性抗腫瘤劑，其之抗有絲***活性涉及藉由阻斷微管蛋白聚合抑制細胞分化。維多汀(國際非專利藥品名稱(International Nonproprietary Name))係指MMAE加上其MMAE-抗體共軛物中連接至抗體之連接結構。在更特定的實施例中，ADC為STM073-MMAE或STM108-MMAE。 眾多化學連接子係已知的且用於共軛細胞毒性或DNA作用之藥物有效負載至抗體以產生ADC。單獨或組合使用以產生包含抗-醣化PD-L1抗體(特定言之，如本文所述之在結合其標靶之後內部化之彼等)之ADC所包涵之某些連接子包括SMCC(4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷羧酸N-羥基琥珀醯亞胺酯)；SPDB (3-(2-吡啶基二硫基)丁酸N-琥珀醯亞胺基酯)；SPP (4-(2-吡啶基二硫基)戊酸N-琥珀醯亞胺基酯)；磺基-SPDB或sSPDB (N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺丁酸酯)；硫醚連接子琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(MCC)；及vc (纈胺酸-瓜胺酸二肽連接子)。舉例而言，經工程化連接子(例如，SMCC、SPDB、S-SPDB) (Immunogen, Inc.)已經設計成在ADC結合至腫瘤之前穩定及然後在ADC於癌細胞內部內部化後將有效負載功效最佳化。其他連接子(諸如二肽vc連接子，其為可組織蛋白酶裂解連接子)可用於將抗體共軛至細胞毒性劑，諸如奧瑞司他汀，其為衍生自多拉司他汀10之有絲***抑制劑，例如，單甲基奧瑞司他汀E(MMAE)，例如，維多汀。細胞毒素可共軛至抗體，使得多於一個毒素分子連接至各抗體分子，例如，每個抗體可平均存在2個、3個、4個、5個、6個、7個或8個毒素分子。 在一個特定實施例中，MMAE係經馬來醯亞胺基己醯基(MC)連接基間接連接至抗體半胱胺酸，該連接基係偶聯至纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苄氧羰基-MMAE (MC-vc-PAB-MMAE)。在「MC-vc-PAB-MMAE」線性結構中，「MC」係由馬來醯亞胺及己酸組成及為通常經H鏈上的半胱胺酸基團連接至抗體之部分。繼而，「MC」係連接至由纈胺酸(Val)及瓜胺酸(Cit)組成之「vc」連接子且其為藉由腫瘤或癌細胞內部的組織蛋白酶裂解之可組織蛋白酶裂解連接子。「vc」係連接至MMAE細胞毒素所連接的間隔基「PAB」(即，對胺基苯甲酸)。MC-vc-PAB-MMAE ADC在藉由蛋白酶諸如組織蛋白酶B裂解時釋放出游離膜可滲透MMAE。在一個實施例中，連接至抗體之連接子在胞外液中穩定，但一旦ADC已進入腫瘤或癌細胞則立刻被組織蛋白酶裂解，藉此活化MMAE或其他毒素藥物之抗有絲***機制。在另一個實施例中，單甲基奧瑞斯汀F (MMAF)係經馬來醯亞胺基己醯基連接至抗體半胱胺酸(MC-MMAF)。與MC-vc-PAB-MMAE ADC對比，MC-MMAF ADC係不可裂解的，例如MCC-DM1 ADC，及必須在細胞中內部化及降解，釋放出半胱胺酸-MC-MMAF作為細胞內部的活性藥物。 在一個實施例中，細胞毒性有效負載係在ADC內部化至細胞中之後釋放於溶酶體中。在溶酶體中，溶酶體酵素消化ADC之抗體組分。在溶酶體降解之後，藥物(及藥物-連接子)有效負載釋放於細胞質中，其中藥物結合胞內標靶，最終引起細胞死亡。最佳地，所釋放的有效負載具完全活性，其仍連接連接子。在結合至ADC之標靶導致不良轉運至溶酶體之其他實施例中，在靶細胞外部穩定但其一旦在細胞內部立刻裂解抗體組分之有效負載之連接子提供在細胞中但於溶酶體外部有效負載釋放之替代模式。在其他實施例中，連接子在胞外液中穩定，但一旦ADC已進入腫瘤或癌細胞立刻被組織蛋白酶裂解，藉此活化活化毒素藥物之抗有絲***或其他細胞毒性機制。在其他實施例中，藉由可裂解連接子之作用釋放之有效負載能夠進入鄰近癌細胞中且藉由旁觀者效應將其殺死，藉此增強ADC之靶向及腫瘤殺死活性。 在一個實施例中，本文所述之抗-醣化PD-L1抗體(諸如雙功能STM073或STM108 MAb)係經連接子SMCC (4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺基酯)偶聯至DM1。在另一個實施例中，如本文所述之抗-醣化PD-L1抗體(諸如STM073或STM108)係經連接子SPDB (3-(2-吡啶基二硫基)丁酸N-琥珀醯亞胺基酯)或sSPDB(N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基丁酸酯)偶聯至DM4。在另一個實施例中，奧瑞司他汀單甲基奧瑞司他汀E係經馬來醯亞胺基己醯基-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苄氧基羰基(MC-vc-PAB-MMAE)連接至本文所述之抗-醣化PD-L1抗體(諸如STM073或STM108)之半胱胺酸殘基。在一個特定實施例中，ADC為STM108-MC-vc-PAB-MMAE。在另一個特定實施例中，ADC為STM073-MC-vc-PAB-MMAE。在一個實施例中，抗-醣化PD-L1抗體-ADC每分子包含多個單位之藥物(諸如MMAE)，諸如每分子包含1-10個、1-5個、2-5個、3-5個或2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個單位之藥物(諸如MMAE)及其間的值。在其他實施例中，抗體藥物比可為2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大及介於2-10之間之範圍及其間的值。在實施例中，STM108或STM073抗體為雙特異性、多重特異性、雙互補位或多重互補位抗體或其抗原結合部分。該等包含如本文所述之雙功能抗-醣化PD-L1抗體之ADC(例如上述STM108-MC-vc-PAB-MMAE)為癌症治療提供在殺死腫瘤及癌細胞上之強化且多層面之抗癌效應。但就幾個闡釋性優點而言，抗-人類醣化PD-L1抗體(例如，MAb)-ADC(例如STM108-ADC)可阻斷PD-1/PD-L1相互作用，藉此增強T細胞免疫性及抗腫瘤細胞之效應子功能；其可選擇性地靶向表現於腫瘤及癌細胞上之醣化PD-L1；其可在結合之後將PD-L1內部化於腫瘤或癌細胞上，藉此減少腫瘤或癌細胞上之表面表現之PD-L1且進一步減低PD-L1之致癌可能性；其可引起抗體內部化所進入的腫瘤或癌細胞之細胞凋亡及釋放毒性藥物以損傷且最終殺死細胞；及其可藉由經由自已凋亡的腫瘤或細胞釋放毒性藥物殺死附近或鄰近的腫瘤或癌細胞而促進旁觀者效應。 在一些實施例中，如本文所述之抗體可共軛至標記物，諸如肽，以利於純化。在一些實施例中，該標記物為六-組胺酸肽(SEQ ID NO:93)，即，血球凝集素「HA」標籤，其對應於衍生自流行性感冒血球凝集素蛋白之抗原決定基(Wilson, I. A.等人，Cell，37:767-778 (1984))或「flag」標籤(Knappik, A.等人，Biotechniques 17(4): 754-761 (1994))。 在其他實施例中，共軛至如本文所述抗體及多肽之部分可為可在檢定中檢測到之成像劑。該等成像劑可為酵素、輔基、放射性標記、非放射性順磁金屬離子、半抗原、螢光標籤、磷光分子、化學發光分子、發色團、發光分子、生物發光分子、光親和分子、或著色顆粒或配位體(諸如生物素)。在實施例中，適合的酵素包括(但不限於)辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；輔基錯合物，包括(但不限於)鏈黴親和素(streptavidin)/生物素及抗生物素蛋白(avidin)/生物素；螢光材料，包括(但不限於)傘形酮(umbelliferone)、螢光素、螢光異硫氰酸酯、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅素；發光材料，包括(但不限於)魯米諾(luminol)；生物發光材料，包括(但不限於)螢光素酶、蟲螢光素及水母素；放射性材料，包括(但不限於)鉍(
213
Bi)、碳(
14
C)、鉻(
51
Cr)、鈷(
57
Co)、氟(
18
F)、釓(
153
Gd、
159
Gd)、鎵(
68
Ga、
67
Ga)、鍺(
68
Ge)、鈥(
166
Ho)、銦(
115
In、
113
In、
112
In、
111
In)、碘(
131
I、
125
I、
123
I、
121
I)、鑭(
140
La)、鎦(
177
Lu)、錳(
54
Mn)、鉬(
99
Mo)、鈀(
103
Pd)、磷(
32
P)、鐠(
142
Pr)、鉕(
149
Pm)、錸(
186
Re、
188
Re)、銠(
105
Rh)、釕(
97
Ru)、釤(
153
Sm)、鈧(
47
Sc)、硒(
75
Se)、鍶(
85
Sr)、硫(
35
S)、鍀(
99
Tc)、鉈(
201
Ti)、錫(
113
Sn、
117
Sn)、氚(
3
H)、氙(
133
Xe)、鐿(
169
Yb、
175
Yb)、釔(
90
Y)、鋅(
65
Zn)；使用各種正電子發射斷層攝影術之正電子發射金屬、及非放射性順磁金屬離子。 成像劑可藉由中間物(諸如，例如，此項技術中已知的連接子)，利用此項技術中已知的技術直接或間接地共軛至本文所述之抗體或多肽。參見，例如，美國專利第4,741,900號，其報告可共軛至抗體及如本文所述用作診斷劑之其他分子之金屬離子。一些共軛方法涉及使用連接至抗體之金屬螯合錯合物，使用例如有機螯合劑，諸如二伸乙基三胺五乙酸酐(DTPA)；伸乙基三胺四乙酸；N-氯-對甲苯磺醯胺；及/或四氯-3-6α-二苯基乙炔脲-3。單株抗體亦可與酵素在偶聯劑(諸如戊二醛或過碘酸鹽)的存在下反應。具有螢光素標記物之共軛物可在該等偶聯劑的存在下或藉由與異硫氰酸鹽反應進行製備。 在一些實施例中，本文所述之抗-醣化PD-L1抗體或醣化PD-L1多肽可共軛至第二抗體以形成抗體異質共軛物，例如，如美國專利第4,676,980號中所述。另外，該等異質共軛抗體可結合至半抗原(例如螢光素)，或結合至細胞標記物(例如，但非限制性地，4-1-BB、B7-H4、CD4、CD8、CD14、CD25、CD27、CD40、CD68、CD163、CTLA4、GITR、LAG-3、OX40、TIM3、TIM4、TLR2、LIGHT、ICOS、B7-H3、B7-H7、B7-H7CR、CD70、CD47)或結合至細胞激素(例如，IL-7、IL-15、IL-12、IL-4 TGF-β、IL-10、IL-17、IFNγ、Flt3、BLys)或趨化細胞素(例如，CCL21)。 在一些實施例中，本文所述之抗醣化PD-L1抗體或醣化PD-1多肽亦可連接至固體載體，其可用於進行免疫檢定或靶抗原或能夠結合至靶抗原之其他分子之純化，該靶抗原已藉由結合至如本文所述之抗體或抗原結合片段固定至載體。該等固體載體包括(但不限於)玻璃、纖維素、聚丙烯醯胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙醯或聚丙烯。
實例
包含以下實例以證實關於相比非醣化PD-L1及/或PD-L1醣化突變體優先結合醣化PD-L1之雙功能抗-醣化PD-L1抗體及本文所述使用方法之實施例。例示代表性雙功能抗-醣化PD-L1抗體。熟習此項技術者應明瞭所揭示的雙功能抗-醣化PD-L1抗體為實例而非意圖限制。
實例 1 材料及方法
細胞培養、穩定轉染物及轉染。所有細胞均從美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection)(ATCC)獲得。該等細胞生長在補充10%胎牛血清(FBS)之DMEM/F12或RPMI 1640培養基中。使用嘌呤黴素(InvivoGen，San Diego, CA, USA)選擇MDA-MB-468、BT549及293T細胞中的PD-L1穩定轉染物。對於暫態轉染，用DNA，諸如編碼PD-L1之DNA，使用SN脂質體(Hu, M. C.等人，2004，Cell，117:225-237)及lipofectamine
TM
2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)，暫態轉染該等細胞。 使用慢病毒感染來產生穩定細胞。用於敲低細胞中PD-L1之表現之基於慢病毒之shRNA (pGIPZ質體)(Shen, J.等人，2013，Nature，497:383-387)係購自shRNA/ORF核心設施(UT MD Anderson Cancer Center)。基於MDA-MB-231或A431細胞中PD-L1蛋白質表現之敲低效率，本發明者選擇兩種shPD-L1純系以用於本研究。成熟反義序列如下：TCAATTGTCATATTGCTAC (shPD-L1 #1，SEQ ID NO:34)、TTGACTCCATCTTTCTTCA (shPD-L1 #5，SEQ ID NO:35)。使用pGIPZ-shPD-L1/Flag-PD-L1雙重表現構築體以敲低內源性PD-L1及同時復原Flag-PD-L1，本發明者可建立表現內源性PD-L1敲低及Flag-PD-L1 WT或4NQ突變體之細胞系。為產生用於PD-L1及Flag-PD-L1之表現慢病毒之shRNA，本發明者用FuGENE 6轉染試劑轉染具有pGIPZ-非沉默(針對載體對照病毒)、pGIPZ-shPD-L1或pGIPZ-shPD-L1/PD-L1 WT，或pGIPZ-shPD-L1/ PD-L1 4NQ突變體的293T細胞。在轉染二十四小時後，更換培養基，及然後以24-小時時間間隔收集培養基。將所搜集的含有慢病毒之培養基離心以移除細胞碎片，及透過0.45-µm過濾器過濾。在感染前12小時時以50%匯合度接種細胞，及將培養基更換為用含有慢病毒之培養基。在感染24小時之後，將培養基更換為新鮮培養基及用1 µg/ml嘌呤黴素(InvivoGen)選擇經感染細胞。 質體。人類PD-L1純系係從shRNA/ORF核心設施(UT MD Anderson Cancer Center，Houston, TX, USA)獲得且使用已知的分子生物技術選殖至pCDH慢病毒表現載體中以建立PD-L1-Flag或PD-L1-Myc表現細胞系。此外，人類PD-L1核酸亦經選殖至pEGFP-N1及pCMV-HA哺乳動物細胞表現載體中以進行暫態轉染。pCDH/PD-L1-Flag表現載體用作模板，以藉由使用下表4中所呈現的引物進行定點誘變，產生PD-L1-Flag NQ突變體N35Q、N192Q、N200Q、N219Q及4NQ (N35Q/N192Q/N200Q/N219Q)。為建立pGIPZ-shPD-L1/Flag-PD-L1雙重表現構築體以敲低內源性PD-L1及同時復原Flag-PD-L1，選擇靶向PD-L1 mRNA之3’-UTR區之shPD-L1構築體(shPD-L1 #5)。Flag-PD-L1野生型(WT)或4NQ突變體DNA係經選殖至表現對內源性PD-L1具特異性之shRNA之pGIPZ-shPD-L1(Thermo Scientific，Pittsburgh, PA, USA)中。使用酵素消化及DNA序列分析證實所有構築體。
表 4. 用於定點突變之引物
進行qRT–PCR檢定以測量mRNA之表現(Shen等人，2013，Nature，497:383-7；及Chang等人，2011，Nature Cell Biology，13:317-23)(參見下表5)。用PBS洗滌細胞兩次且立刻在QIAzol中進行溶解。使用RNeasy迷你套組(Qiagen，Hilden, Germany)對經溶解的樣品進行總RNA提取。為測量mRNA之表現，藉由SuperScript III第一鏈cDNA合成系統，使用隨機六聚物(Life Technologies)，依製造商說明書，自1 µg經純化總RNA合成cDNA。使用即時PCR機器(iQ5，BioRad，Hercules, CA, USA)進行qPCR。使用比較性Ct法進行所有數據分析。首先，將結果標準化至內部對照β-肌動蛋白mRNA。
表 5. 用於 qRT-PCR 之引物。
抗體及化學品。於實例中所述的實驗中使用以下抗體：Flag (F3165；Sigma-Aldrich，St. Louis, MO, USA)；Myc (11667203001；Roche Diagnostics，Indianapolis, IN, USA)；HA (11666606001；Roche Diagnostics)；PD-L1 (13684；Cell Signaling Technology，Danvers, MA, USA)；PD-L1 (329702；BioLegend，San Diego, CA, USA)；PD-L1 (GTX117446；GeneTex，Irvine, CA, USA)；PD-L1 (AF156；R&D Systems，Minneapolis, MN, USA)；PD-1 (ab52587；Abcam，Cambridge, MA, USA)；B3GNT3 (ab190458；Abcam)；B3GNT3 (18098-1-AP；Proteintech，Chicago, IL, USA)；顆粒酶B (ab4059；Abcam)；EGFR (4267；Cell Signaling Technology)；α-微管蛋白(B-5-1-2；Sigma-Aldrich)；及β-肌動蛋白(A2228；Sigma-Aldrich)。就在實驗中使用而言，表皮生長因子(EGF)、環己醯亞胺及衣黴素係購自Sigma-Aldrich。吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、西妥昔單抗(cetuximab)及AG1478係從Calbiochem Corp (Billerica, MA, USA)獲得。 免疫墨點分析、免疫細胞化學法及免疫沉澱法。如前面所述進行免疫墨點分析(Lim等人，2008，Gastroenterology，135:2128-40；及Lee等人，2007，Cell，130: 440-455)。使用Odyssey®紅外成像系統(LI-COR Biosciences，Lincoln, NE, USA)進行影像獲取及譜帶強度之量化。就免疫沉澱法而言，將細胞溶解於緩衝液(50 mM Tris·HCl，pH 8.0，150 mM NaCl，5 mM乙二胺四乙酸(EDTA)及0.5% Nonidet P-40 (NP-40))中且以16,000 × g離心30分鐘以移除碎片。使經清除之溶胞物經受利用抗體之免疫沉澱。就免疫細胞化學法而言，在室溫下將細胞固定於4%多聚甲醛中15分鐘，在5% Triton X-100中滲透5分鐘，及然後使用初級抗體染色。所使用的二級抗體為抗小鼠Alexa Fluor 488或594染料共軛物及/或抗兔Alexa Fluor 488或594染料共軛物(Life Technologies)。用4',6-二醯胺基-2-苯基吲哚 (DAPI藍)(Life Technologies)染色細胞核。於固定之後，使用多光子共焦雷射掃描顯微鏡(Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA)觀察該等細胞。 PD-L1及PD-1 (PD-L1/PD-1)相互作用檢定。為測量PD-1蛋白與PD-L1蛋白相互作用，在室溫下將細胞固定在4%多聚甲醛中15分鐘及然後用重組人類PD-1-Fc嵌合蛋白(R&D Systems)培養1小時。所使用的二級抗體為抗人類Alexa Fluor 488染料共軛物(Life Technologies)。用4',6-二醯胺基-2-苯基吲哚(DAPI藍)(Life Technologies)染色細胞核。使用微盤讀取器Synergy Neo(BioTeK, Winooski, VT, USA)測量Alexa Fluor 488染料之螢光強度並藉由總蛋白質量將該強度標準化。為獲得影像，在固定之後，使用共焦雷射掃描顯微鏡(Carl Zeiss)觀察該等細胞。 共培養實驗及IL-2表現測量。如前文所述進行Jurkat T細胞與腫瘤細胞之共培養及IL-2表現測量(Sheppard, K. A.等人，2004，FEBS letters，574:37-41)。為分析腫瘤細胞對於T細胞失活之效應，將腫瘤細胞與表現人類PD-1之經活化之Jurkat T細胞(其係經Dynabeads®人類T-活化劑CD3/CD28 (Life Technologies)活化)共培養。將5:1(Jurkat:腫瘤細胞)比之共培養物培養12或24小時。依製造商所述測定培養基中所分泌IL-2的含量(人類IL-2 ELISA套組，Thermo Scientific)。 PD-L1之醣化分析。為證實PD-L1蛋白之醣化，用酵素PNGase F、Endo H、O-糖苷酶(New England BioLabs, Ipswich, MA, USA)依製造商所述處理細胞溶胞物。為染色醣化PD-L1蛋白，使用醣蛋白染色套組(Peirce/Thermo Scientific)依製造商所述染色經純化PD-L1蛋白。 人類乳腫瘤組織樣本之免疫組織化學染色。如先前所述進行免疫組織化學(IHC)染色(Lee等人，2007，Cell，130: 440-455；Lo等人，2007，Cancer Research，67: 9066-9076；Chang, C. J.等人，2011，Cancer cell，19:86-100)。簡言之，將組織試樣與抗PD-L1、EGFR、B3GNT3或顆粒酶B抗體及經生物素共軛之二級抗體培養及然後用抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶複合物培養。使用胺基-乙基哢唑色素原進行觀察。對於統計分析，使用Fisher精確檢驗及史匹曼(Spearman)秩相關係數；小於0.05之p-值在統計學上視為顯著。根據組織學評分，將染色強度分成四個組：高度(評分3)、中度(評分2)、低度(評分1)及陰性(評分0)。 N-醣肽之識別。用10 mM二硫蘇糖醇(DTT)在37℃還原經純化His標記PD-L1蛋白1小時，在黑暗中於室溫下用含在25 mM碳酸氫銨緩衝液中之50 mM碘乙醯胺烷基化1小時，及然後在37°C下用定序級胰蛋白酶以1:50之酵素與底物比處理過夜。然後，用甲酸稀釋經消化之產物至0.1%之最終濃度，及在LC-MS/MS分析之前藉由ZipTip C18 (Millipore)進一步淨化。在IBC處之Academia Sinica質譜法設施獲得LC-MS/MS資料。藉由奈米噴霧(nanospray)LC-MS/MS於偶聯至具有捕捉管柱Acclaim PepMap 100 (2 cm × 100 μm i.d)(Dionex)之UltiMate 3000 RSLC奈米系統(Dionex)之Orbitrap融合三雜交體(Thermo Scientific)上分析肽混合物。將肽混合物加載至Acclaim PepMap RSLC 25 cm × 75 μm i.d.管柱(Dionex)上及以500 nL/min之流速利用5%至35%溶劑B(100%乙腈，含0.1%甲酸)之梯度分離60分鐘。溶劑A為含在水中之0.1%甲酸。在與CID模式平行之HCD下用於MS及MS/MS資料獲取之參數為：3秒循環時間之頂部速度模式；FTMS：掃描範圍(m/z) = 400-2000；解析度 = 120 K；AGC標靶 = 2 × 10
5
；最大注射時間(ms) = 50；FTMSn (HCD)：單離模式 = 四極桿；單離視窗 = 1.6；碰撞能量(%) = 30，梯階碰撞能量為5%；解析度 = 30 K；AGC標靶 = 5 × 10
4
；最大注射時間 (ms) =60；ITMSn (CID)：單離模式 = 四極；單離窗 = 1.6；碰撞能量 (%) = 30；AGC標靶 = 1 × 10
4
。藉由蛋白質體發現者1.4(Proteome Discoverer 1.4)將原始資料轉化為Mascot通用格式(MGF)。就醣肽識別而言，使用Byonic(2.0-25版)，利用以下研究參數搜尋HCD MS
2
數據：肽公差 = 2 ppm；片段公差 = 6 ppm；錯誤裂解 = 1；修飾：脲基甲基半胱胺酸(固定)、甲硫胺酸氧化(常見2)，在N處脫醯胺(罕見1)。藉由人工將HCD及CID MS
2
結果組合以進一步校驗由Byonic所表明的醣肽命中。 統計分析。條形圖數據表示相對未處理或對照組平均倍率變化，具有三次獨立實驗之標準偏差。使用SPSS(版本20，SPSS, Chicago, IL)進行統計分析。使用史匹曼相關及曼惠特尼檢驗(Mann-Whitney test)分析蛋白質表現及BLBC子組間的相關性。對實驗數據進行學生t檢驗。P值＜ 0.05視為在統計學上顯著。
實例 2 PD-L1 蛋白質表現分析
為闡明PD-L1之根本機制，檢查人類腫瘤組織及癌細胞系中PD-L1之蛋白質表現。圖1A及1B及圖3A-3D說明藉由西方墨點分析之肺癌、乳癌、結腸癌及卵巢癌細胞系中之蛋白質表現；圖4A顯示不同PD-L1抗體於細胞中之PD-L1蛋白之結合。觀察到大多數PD-L1蛋白在~45 kDa下 (黑色圓) 檢測到，但少部分亦在33 kDa下(黑箭頭)出現。藉由靶向編碼序列(shPD-L1#1)或3’UTR (shPD-L1#5)中任一者之慢病毒短髮夾(hairpin)RNA(shRNA)敲低PD-L1下調PD-L1之33-及45-kDa兩種形式之表現(圖4B)。PD-L1之復原可恢復shPD-L1#5純系中兩種形式之表現(圖1C；圖4C顯示載體設計)。該等結果顯示西方墨點上之兩個譜帶為PD-L1蛋白及PD-L1之較高分子量形式指示轉譯後修飾。 醣化蛋白通常在西方墨點中產生異質模式，如針對PD-L1之較高分子量(~45 kDa)所觀察到。為測試針對PD-L1所觀察到醣化模式是否對應於醣化形式，用重組糖苷酶(肽-N-糖苷酶F；PNGase F)處理MDA-MB 231及海拉細胞以移除N-聚醣結構及然後接受西方墨點分析。如圖4D中所顯示，在PNGase F處理之後，45-kDa PD-L1中大部分被還原為PD-L1之33-kDa形式。一致地，在經純化His-標記之PD-L1中觀察到聚醣結構之陽性染色，但在存在PNGase F下並未觀察到(圖1D)。該等結果證實較高分子量之PD-L1實際上為PD-L1蛋白之醣化形式。 為重演細胞中PD-L1蛋白之表現，產生各種過度表現構築體以模擬該蛋白質之內源性表現。為避免N-端信號傳導肽處可能的裂解，在N-端或C-端任一端融合不同標籤序列(圖5A及5B，墨點(blot)上方)。類似於內源性PD-L1表現分析之結果，所有GFP-、HA-、Flag-或Myc-標記之PD-L1之暫態轉染具有西方墨點上自其實際尺寸~15 kDa的分子量偏移(圖1E及5A及5B)。與PNGase F處理對比，該PNGase F移除PD-L1蛋白上之所有N-聚醣結構，添加重組糖苷酶、內切糖苷酶H(Endo H)僅部分減少PD-L1醣化，這表明複雜類型之N-連接之聚醣結構(包含高甘露糖及雜合類型)主要存於PD-L1上。另外，在用N-連接之醣化抑制劑衣黴素(TM)處理細胞時，PD-L1之醣化完全受到抑制(圖1F及5A-5D)，但用O-糖苷酶處理時未受到抑制(圖5E)。總言之，該等結果指示PD-L1在所測試細胞中廣泛地N-連接之醣化(Heifetz, A.等人，1979，Biochemistry，18:2186-2192)。
實例 3 醣化分析
使用兩種PD-L1-特異性抗體(抗-PD-L1及抗-hB7-H1)之西方墨點分析指示PD-L1醣化發生於其胞外域(ECD，藉由抗-hB7-H1識別)上而非發生於其胞內域(ICD，藉由抗-PD-L1識別)上(圖1F及5C)。為精確指出醣化位點，進行源自不同物種之PD-L1胺基酸序列之序列比對以尋找進化上保守之NXT基序，即，一致N-醣化識別序列(Schwarz, F.等人，2011，Current opinion in structural biology，21: 576-582)。與先前的預測(Cheng等人，2013，JBC，288:11771-85)；及Vigdorovich等人，2013，Structure，21:707-17)一致，識別出四個NXT基序(圖1G及圖6A及6B)。為證實該等序列是否實際上醣化，藉由奈米LC-MS/MS分析經純化人類PD-L1之胰蛋白酶肽。識別帶有複雜類型N-聚醣之醣肽之4個N-醣化位點中之各者(圖7A-7H)，與對Endo H處理之表觀抗性一致(圖1E)。產生一系列天冬醯胺酸(N)改由麩醯胺酸(Q)之取代以確定PD-L1蛋白上的特異性醣化位點。所有四種突變體N35Q、N192Q、N200Q及N219Q展現相比WT PD-L1醣化之某種程度減少(圖1H，泳道2、3、4及5)。針對三種非-NXT NQ PD-L1突變體未觀察到可檢測之醣化差異(圖1H，泳道11、12及13)。此外，在所有四個天冬醯胺酸突變為麩醯胺酸(此藉由缺少對應於45 kDa下醣化形式之信號指示)之PD-L1 4NQ變異體中，PD-L1醣化完全失效(圖1H，泳道10(4NQ)及泳道14(WT))。基於PD-1/PD-L1複合物之結晶結構(Lin, D.Y.等人，2008，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，105:3011-3016)，PD-L1之該等四個醣化位點(N35、N192、N200及N219)係暴露於蛋白質表面上。基於預測，PD-L1醣化位點之突變(PD-L1 4NQ)並不影響總體結構。該等結果表明PD-L1僅呈N-醣化醣蛋白形式存於細胞中及所有四個NXT基序係經醣化。 所觀察到醣化PD-L1的含量明顯高於PD-L1蛋白之非醣化形式 (圖1A及1B及5C及5D)。基於該發現結果，本發明者研究醣化是否使得PD-L1蛋白穩定化。對此，在蛋白質合成抑制劑環己醯亞胺(CHX)的存在下測定蛋白質轉換率以確定醣化對PD-L1蛋白穩定性之效應。Flag-標記之PD-L1之轉換率必須係在經衣黴素(TM)處理之HEK 293T細胞中比在經DMSO處理HEK 293T細胞中快得多(圖2A；8A及8B)。針對A431細胞中之內源性PD-L1觀察到相似的結果(圖8C)。在藉由MG132抑制蛋白酶體之後，在12小時期間非醣化PD-L1之含量穩定地增加(圖2B)。一致地，非醣化PD-L1 4NQ係以短到4小時的半衰期快速地降解(圖2C)，與非醣化PD-L1 WT之情況相似(圖2A)，這表明受損醣化會導致經由26S蛋白酶體降解PD-L1。
實例 4 PD-L1 之結合親和力
PD-L1為藉由癌症進展期間其與PD-1之結合之關鍵免疫抑制劑(Okazaki, T.等人，2013，Nature immunology，14:1212-1218)。因此，對WT PD-L1及醣化缺乏突變體PD-L1與PD-1之結合親和力進行比較。PD-L1 WT及4NQ突變體PD-L1穩定地表現於MDA-MB-468及HEK-293T細胞中，及選擇具有相似量的PD-L1 WT及4NQ表現之穩定純系及然後與重組PD-1/Fc融合蛋白質培養，接著添加抗人類IgG(Fc特異性)螢光共軛物以進行信號放大(Cheng, X.等人，2013，The Journal of biological chemistry，288:11771-11785)(圖8D)。雖然在醣化及非醣化PD-L1之間膜局部化無明顯改變 (圖8E(共焦影像)及8F(生物素化拆毀))，但在經TM處理或未經處理之穩定轉染物之間觀察到細胞膜上之PD-1結合之顯著差異(圖2D，顯示於右側之定量圖)。另外，TM處理使得PD-L1醣化失效或4NQ突變體之表現減弱PD-L1與PD-1之締合作用(圖2E及8G)。活體外結合實驗亦證實PD-L1 4NQ/PD-1/Fc相互作用之損失，表明PD-L1之醣化增強其與PD-1之締合作用(圖2F)。因為免疫抑制活性與涉及細胞毒性T-細胞之細胞-細胞相互作用相關聯，故進行共培養實驗以測量IL-2表現水平，該IL-2表現水平為Jurkat T-細胞中在暴露於PD-L1穩定純系之後受到PD-L1及PD-1相互作用抑制之T-細胞免疫反應之指標(Yang, W.等人，2008，Investigative ophthalmology & visual science，49:2518-2525) (圖8H)。一致地，PD-L1醣化之損失會損及其與PD-1之相互作用及促進釋放可溶性IL-2(圖2G)。該等結果顯示PD-L1糖表型(glycophenotype)之完整性係為其免疫抑制功能所需。
實例 5 PD-L1 糖表型之功能性
PD-L1 WT及4NQ突變體穩定地表現於內源性PD-L1耗盡之MDA-MB-468及BT549細胞中。使用該等細胞系，分析PD-1及PD-L1結合親和力。如所顯示，醣化變異體PD-L1 4NQ及PD-1之間的締合作用減小(圖9A)。活體外結合實驗進一步證實醣化係為PD-L1及PD-1締合作用所需(圖9B)。活體外藉由共培養BT549表現PD-L1 WT及PD-L1 4NQ之穩定細胞系與人類初級T細胞來測定T細胞介導之腫瘤細胞殺死(時移顯微鏡)。與PD-1結合之損失一致，PD-L1 4NQ穩定細胞系顯示更多的T細胞介導之癌細胞殺死(圖9C)。此外，在同基因4T1小鼠模型中活體內測量PD-L1之免疫抑制功能，在該模型中，在已接受表現PD-L1 WT或PD-L1 4NQ之4T1細胞中任一者之BALB/c小鼠中測量腫瘤生長。與具有表現PD-L1 WT之細胞的小鼠相比，具有表現PD-L1 4NQ之細胞的小鼠顯示減小之腫瘤尺寸及更多活化之細胞毒性T細胞(圖9D及9E)。總言之，該等資料證實PD-L1醣化之損失會損及其與PD-1之相互作用及損及PD-1/PD-L1相互作用以允許腫瘤細胞逃避T-細胞免疫監視之能力。因此，PD-L1係非醣化、或異常醣化之腫瘤細胞提供適合被功能性效應子T-細胞殺死之標靶。藉由其膜表現之PD-L1之受損醣化防止或阻斷腫瘤細胞逃避T-細胞免疫監視之該機制進一步證實PD-L1糖表型之完整性係為其免疫抑制功能所需。 此外，使用上述同基因4T1 BALB/c小鼠模型以確定代表性雙功能抗體(稱為STM073)對16-天研究期間動物中腫瘤生長之效應 (即，免疫抑制功能)。簡言之，本研究中，在第0天，動物接受表現野生型(醣化) PD-L1之4T1細胞(1 x 10
5
個4T1細胞)。在此後的第3天、第5天、第7天、第9天、第11天及第13天，用STM073 MAb (100 μg)或IgG對照抗體(100 μg)藉由注射處理4T1-動物。在處理期間，評估動物之死亡率及腫瘤體積。圖9F呈現顯示經STM073(「73」) MAb處理之小鼠的腫瘤體積相比對照動物之腫瘤體積可測量地減低之箱圖。
實例 6 產生結合醣化 PD-L1 之單株抗體
依標準化協定，藉由將SP2/0鼠類骨髓瘤細胞與單離自人類PD-L1-免疫接種之BALB/c小鼠(n=6)之脾臟細胞(Antibody Solution, Inc.)融合獲得產生抗醣化人類PD-L1所產生之單株抗體之融合瘤。在融合之前，使用FACS分析驗證來自免疫接種小鼠之血清之與PD-L1免疫原之結合。產生產生單株抗體(MAb)之融合瘤及所有該等MAb之同型為IgG1。再次測試產生抗體之融合瘤之特異性。 為識別對醣化PD-L1抗原具特異性及相對非醣化PD-L1而言優先結合其之抗-醣化PD-L1 MAb(即醣化PD-L1特異性MAb)，進行不同類型之檢定。在檢測MAb優先結合至醣化PD-L1之篩選檢定中，基於藉由FACS分析(使用細胞膜結合之蛋白質)之螢光強度測量值來確定抗體結合。舉例而言，使用BT549人類乳癌細胞系進行該檢定。闡釋性地，根據習知程序用生物素標記過度表現PD-L1 WT(完全醣化)之BT549細胞及然後與過度表現PD-L1 4NQ(完全非醣化PD-L1變異體)之BT549細胞混合。將混合細胞與抗-PD-L1抗體(例如，抗-醣化PD-L1抗體)培養，及進一步與作為檢測劑之與FITC共軛之二級抗體培養。於洗滌之後，藉由FACS/流動式細胞測量術分析測量螢光強度(測得之螢光強度，MFI)以評估抗-PD-L1抗體與膜結合之PD-L1 WT(於細胞上)或與4NQ PD-L1(於細胞上)之相對結合。選擇展現對WT PD-L1相對4NQ PD-L1明顯更高的MFI之抗體以用於進一步評估。STM073及STM108雙功能MAb之螢光結合分析之結果顯示於下表6中，此顯示結合至表現野生型(醣化)PD-L1之BT549細胞(BT549PD-L1WT細胞)之抗體相對結合至表現變異體(非醣化4NQ) PD-L1之BT549細胞(BT549PD-L1 4NQ細胞)之抗體之MFI值。表6中的實驗結果顯示STM073 MAb結合至BT549PD-L1WT細胞(表現醣化PD-L1之細胞)之MFI值相比結合至BT549PD-L1 4NQ細胞(表現非醣化PD-L1之細胞)之MFI值高約5倍。類似地，測得STM108結合至BT549PD-L1WT細胞之MFI值相比結合至BT549PD-L1 4NQ細胞之MFI值高約4倍。
表 6. 測得之抗 - 醣化 PD-L1 MAb 之螢光強度值
基於結合分析，選擇四十二個候選產生Mab之融合瘤，生長於ADCF培養基中，及濃縮其含有單株抗體之上清液並純化。 在一些情況下，使用活細胞成像檢定IncuCyte™(Essen Bioscience)，進一步測試經純化MAb之中和或抑制PD-L1與PD-1間相互作用(PD-L1/PD-1相互作用)之能力。對於該檢定，將表現PD-L1之BT-549細胞與抗人類PD-L1抗體培養及與螢光標記之PD-1-Fc融合蛋白質培養。依製造商說明書，每小時藉由IncuCyte™ Zoom量化配位體及受體結合。基於該檢定，發現所測試的42個MAb中有15個MAb完全阻斷PD-L1與PD-1之結合。此15個MAb中顯示強阻斷功效的一些MAb亦結合非醣化PD-L1至某種程度。 在另一個檢定中，將醣化人類PD-L1蛋白及非醣化PD-L1(即，經PNGase F處理之PD-L1蛋白)塗覆於固相上並測試MAb與PD-L1抗原之結合親和力。應明瞭「PD-L1抗原」與「PD-L1蛋白」同義。該等MAb中有十二(12)個抗體顯示相比非醣化PD-L1蛋白(經PNGase F處理之蛋白)，與醣化PD-L1蛋白之更高親和力的相互作用。對於進一步的特異性分析，藉由西方墨點及FACS流動式細胞測量術分析法分析所選MAb。由各種分析法可知，發現MAb(諸如STM073及STM108)相比PD-L1之非醣化形式特異性結合PD-L1之醣化形式，此進一步驗證該等MAb對醣化PD-L1抗原之特異性。
實例 7 識別特異性結合醣化 PD-L1 之單株抗體之結合區
為識別單株抗-醣化PD-L1抗體之結合至醣化PD-L1之區域，將野生型(醣化)PD-L1(PD-L1 WT)及醣化變異體蛋白N35/3NQ、N192/3NQ、N200/3NQ及N219/3NQ(其中在位置35、192、200或219之處的醣化位點中之一者為在該位置之處的野生型天冬醯胺酸(N)及其他三個位置已經突變為麩醯胺酸(Q)，已經過突變而致其非醣化)(圖10A)過度表現於PD-L1敲低BT549細胞中。如藉由西方墨點確定，一些MAb識別具有相比其他PD-L1突變體高的結合水平之特定PD-L1突變體，證實該等MAb具位點特異性。例如，MAb STM073結合突變體N35/3NQ、N192/3NQ及N200/3NQ，但不結合突變體N219/3Q，證實該抗體係結合至PD-L1之N35、N192及N200區域，而非結合至N219(圖10B)。另外，使用肝癌細胞溶胞物之西方墨點分析亦顯示代表性抗-醣化PD-L1抗體(諸如STM073)之PD-L1醣化之差別性模式(圖10C)。 進一步藉由免疫組織化學(IHC)染色證實該等MAb之組織病理相關性。在細胞離心染色分析中，抗-醣化PD-L1單株抗體一致地識別並結合PD-L1蛋白之醣化部分，但不結合非醣化PD-L1蛋白。在人類三陰性乳癌患者樣本中，抗-醣化PD-L1單株抗體亦顯示1:30比之膜及細胞質染色。該等資料證實抗-醣化PD-L1單株抗體可用於生物標記分析法中以檢測作為生物標記之醣化PD-L1。
實例 8 結合醣化 PD-L1 之抗體之抗原決定基圖譜分析
藉由CovalX AG (Switzerland)進行小鼠單株抗-醣化PD-L1抗體STM073之抗原決定基圖譜分析。為確定藉由一般而言抗-醣化PD PD-L1抗體(且特定言之STM073 MAb)識別之抗原決定基之性質，例如，線性或構象中任一者，進行研究以評估PD-L1抗原蛋白與抗-PD-L1抗體間之相互作用是否可藉由該抗原之蛋白分解所產生之非結構化肽抑制。若藉由PD-L1抗原之完全蛋白分解所產生的肽能夠抑制抗體與抗原結合，該相互作用並非係基於構象，及該抗原決定基為線性。自抗原之序列產生之重疊肽庫之簡單競爭檢定係足夠確定抗原決定基之序列。或者，若藉由PD-L1抗原之完全蛋白分解所產生的肽無法抑制抗體與抗原結合，則判定標靶之構象為相互作用所需要的，及抗原決定基係構象的，例如，連續(具有特殊構象，諸如環)或非連續(由於三級結構所致)。為進一步闡明與構象抗原決定基之結合，亦採用共價標記、肽圖譜分析及高解析度質譜法。 競爭檢定顯示自PD-L1抗原產生之肽並不抑制MAb STM073與PD-L1抗原結合，證實STM073 MAb抗原決定基為構象而非線性。使用化學交聯、高質量MALDI質譜法及nLC-Orbitrap質譜法，表徵介於PD-L1蛋白與抗體之間之相互作用表面。使用PD-L1之胃蛋白酶蛋白分解，利用抗體所得經胃蛋白酶產生之PD-L1肽及完整PD-L1蛋白之混合物之競爭檢定及藉由已知方法分析抗原/抗體相互作用顯示無可檢測之STM073單株抗體藉由PD-L1肽結合至PD-L1抗原之抑制作用。因此，判定PD-L1上之藉由抗-PD-L1 MAb STM073所識別之抗原決定基為構象而非線性。判定STM073之抗原決定基包括胺基酸殘基H69、Y112、R113及K124，其在始於V68而終於V128(位置79至107中之區域以虛線表示)之序列V
H
GEEDLKVQH------DAGV
YR
CMISYGGADY
K
RITV (SEQ ID NO:85)中加下劃線。發現STM108與序列LKVQHSSYRQR------EGYPKAEVIWTSSDHQ中之抗原決定基結合，該等序列為SEQ ID NO:1之分別胺基酸74至84及158至173，及與SEQ ID NO.1之殘基S80、S81、K162及S169(於SEQ ID NO:1之殘基74至173中)接觸。
實例 9 T 細胞殺死檢定
T細胞殺死檢定係用於判定如本文所述抗-醣化PD-L1單株抗體對腫瘤細胞之細胞毒性活性。所遵循的協定如下：第0天，自表現醣化野生型PD-L1-(PD-L1 WT)之BT549 RFP靶細胞培養物移除含血清培養基且用PBS輕輕地沖洗兩次。收穫細胞並計數。離心(1000 RPM，4分鐘)細胞懸浮液及將細胞小球以50,000個細胞/mL再懸浮於培養基中。使用手動多通道吸移管，將該等細胞接種(100 µL/孔，即，5000個細胞/孔)至平底微量滴定板的各孔中。允許該板在環境溫度下靜置30分鐘及然後置於IncuCyte ZOOM®活細胞成像器中，於該處在安排第一次掃描之前讓其平衡20分鐘。每3小時安排二十四小時(24小時)重複掃描(10x物鏡)，第一次掃描則係立刻開始。接下來的18小時(過夜)監測細胞匯合率直到達到所需匯合率(例如，20%)。 在次日的早晨，檢定當天(即第1天)，在檢定介質(4x最終檢定濃度為2.5 µM)中製備IncuCyte™卡斯蛋白酶3/7細胞凋亡綠色螢光檢測試劑(Essen BioScience 4440)之10 µM溶液且在培養箱中使其加熱至37℃。以4x最終檢定濃度在檢定介質中製備抗-CD3抗體(100 ng/mL) + IL-2 (10 ng/mL) T細胞活化劑處理且加熱至37℃。亦製得測試MAb。從培養箱移去靶細胞板且吸清培養基，小心不要損傷細胞層。使用多通道吸移管，將25 µL溫卡斯蛋白酶3/7溶液轉移至各孔中。此後，將25 µL溫和的抗-CD3抗體 + IL-2及抗體置於細胞板之適宜孔中。又添加50 µL包含效應子細胞(PBMC或總T細胞)之培養基以形成100 µL之總檢定體積。將去泡細胞板定位於IncuCyte ZOOM®儀器中且在第一次掃描之前允許平衡20分鐘。每2至3小時安排24-小時重複掃描持續至多5天。(物鏡10x；容器類型：Corning 3596；掃描模式：標準；掃描型式：每孔2個影像；通道：相 + 「綠色」 (+ 「紅色」，若使用NucLight™ Red靶細胞))。 爲了分析，在IncuCyte™軟體中藉由隨時間計數視野中「大」綠色螢光物體(細胞核)的總數來量化靶細胞凋亡。從對應於紅細胞核數量之紅色物體計數測量靶細胞之增殖。數據表示為每mm
2
螢光物體的數量。數據顯示添加如本文所述之抗體(特定言之STM073)，增強腫瘤細胞之殺死(圖11)。
實例 10 結合檢定
為確定本文所述抗-醣化PD-L1單株抗體是否特異性抑制PD-1與PD-L1之相互作用，進行以下結合檢定。在檢定的第0天，自表現PD-L1之BT549靶細胞培養物移去含血清培養基且用D-PBS輕輕地沖洗兩次。收穫細胞並計數。離心(1000 RPM，5分鐘)細胞懸浮液及將細胞小球以50,000個細胞/mL再懸浮於培養基中。使用手動多通道吸移管以將該等細胞接種(100 μL//孔，即，5000個細胞/孔)至平底微量滴定板的各孔中。使該板在環境溫度下靜置30分鐘。此後，將含有細胞之板在5% CO
2
培養箱中培養過夜。 在檢定的第1天(即次日的早晨)，製備含有1 μg/mL PD-1/Fc及1:400稀釋之Alex Fluor 488-山羊抗人類IgG之培養基並在培養箱中加熱至37℃。從培養箱移去該等細胞板且吸清培養基，小心不要損傷細胞層。以劑量依賴性方式將50 μL測試抗體添加至各孔。將50 μL含有PD-1/Fc及Alex Fluor 488-山羊抗人類IgG之培養基添加至各孔。將該細胞板定位於IncuCyte ZOOM®儀器中且在第一次掃描之前允許平衡20分鐘。每1至2小時安排24-小時自動化重複掃描(10x)持續24小時。物鏡：10x；Vessel Type：Corning 3596；掃描模式：標準；掃描型式：每孔4個影像；通道：相 + 「綠色」。 圖12A及12B顯示代表性MAb STM073及STM108以劑量依賴性方式抑制PD-1/Fc與表現PD-L1之細胞之結合。對照檢定結果顯示於圖
12C
中。
實例 11 PD-L1 內部化檢定
為判定抗-醣化PD-L1單株抗體是否促進PD-L1內部化及降解，將A431細胞在無血清培養基中培養過夜及然後與10 μg抗-醣化PD-L1抗體培養兩天。然後，收穫該等細胞，並藉由西方墨點法評估細胞中之PD-L1。圖13顯示與STM073培養顯示相比對照(IgG)而言細胞中PD-L1之含量減小。 使用pHrodo™ Red微尺度標記套組(ThermoFischer Scientific，Rochester, NY)，依製造商說明書，藉由以pHrodo™ Red染料標記抗體，觀察STM073及STM108 MAb之細胞內部化。簡言之，就分析而言，在時間點0，接種該等細胞；在接種後24小時時，用經標記STM073或STM108 MAb(5 μg/mL)培養該等細胞。於1小時後，使用IncuCyte ZOOM
®
儀器開始細胞之影像掃描，且每1小時安排24-小時重複掃描(10x)。物鏡：10x；容器類型：Corning 356407；掃描模式：標準；掃描型式；每孔3個影像；通道：相 + 「紅色」。圖14A：野生型BT549細胞(人類腺管癌、乳癌細胞系)與STM073培養；圖14B：將過度表現PD-L1 WT(醣化)之BT 549細胞與STM073培養；圖14C：將NCI-H226細胞(人類肺癌細胞系、鱗狀細胞間皮瘤)與STM073培養；圖14D：將MCF-7細胞(人類乳癌細胞系、腺癌)與STM073培養；及圖14E：將表現PD-L1 WT(醣化)之BT 549細胞與STM108培養。
實例 12 由抗 - 醣化 PD-L1 抗體結合 PD-L1 促進 PD-L1 內部化及降解
圖15A-15C提供在抗-醣化PD-L1 MAb STM108與表現於BT549-PD-L1細胞上之PD-L1結合之後藉由活細胞成像分析之PD-L1內部化及降解之一個實例。在圖15A-15C中，抗-PD-L1抗體為STM108，其係使用pHrodo™ Red微尺度標記套組(ThermoFisher Scientific，Rochester, NY)，如上文在實例11中所述，共軛至紅色螢光染料(pHrodo™ Red(琥珀醯亞胺酯(pHrodo™ Red，SE))。綠色染色反映經LysoTracker® Green DND-26染色之細胞，其為在藉由活細胞成像所成像的活細胞中染色酸性區室(溶酶體)之細胞可滲透綠色染料。圖15A顯示在第一時間點(時間0)，STM108抗體係經內部化至細胞中，如藉由由箭頭指示的細胞之強紅色胞內染色觀察到。圖15B顯示圖15A之時間0之後的時間2分鐘時描繪於圖15A之相同細胞中弱化之胞內紅色染色。圖15C顯示在圖15A之時間0之後4分鐘時缺少紅色胞內染色，此反映細胞內部的STM108抗體及/或抗體-抗原複合物發生降解。該等影像反映抗-醣化PD-L1抗體(諸如STM108 MAb)在結合至表現於細胞表面上之PD-L1之後達成PD-L1之內部化及降解。
實例 13 由抗 - 醣化 PD-L1 抗體所結合之 PD-L1 在腫瘤細胞相對總 T 細胞中之內部化
測試與活化或非活化T細胞相比，抗-醣化PD-L1抗體在結合細胞表面表現之PD-L1之後內部化至PD-L1陽性腫瘤細胞中之能力。將抗-醣化PD-L1抗體STM004、STM073及STM108、及作為對照之小鼠IgG與來自周邊血液之非活化總T細胞、來自周邊血液之活化總T細胞及表現PD-L1之NCI-H226細胞培養。爲了T細胞活化，將總T細胞與珠粒(例如，惰性超順磁性珠粒)混合，與抗-CD3及抗-CD28抗體(例如，ThermoFisher Scientific，Rochester, NY)以1:1比共價偶聯以模擬受抗原展示細胞刺激的方式刺激T細胞(參見，例如，A. Trickett等人，2003，J. Immunol. Methods，275，Issues 1-2:251-255)。用pHrodo™ Red標記所有抗體及如實例11中所述觀察內部化。圖16A-16D及圖16E-16H顯示所測試抗體中無一者係內部化至非活化總T細胞或活化總T細胞中。圖16I-16L顯示雙功能、內部化STM073及STM108 MAb係在與該等細胞培養之後經內部化至NCI-H226細胞中，如藉由紅色胞內染色，相比經標記對照抗體mIgG(圖16I)及相比經標記非內部化STM004 MAb(圖16J)獲得證實，此未顯示紅色胞內染色。該實例證實雙功能抗-醣化PD-L1抗體係選擇性地內部化至表現PD-L1之腫瘤細胞中但未內部化至活化或非活化T細胞中。
實例 14 PD-L1 ADC 在腫瘤細胞殺死中之效力及腫瘤體積之減小
實施活體外及活體內實驗以評估包含偶聯至細胞毒素MMAE之抗人類醣化PD-L1 MAb(即STM108 MAb)之ADC在腫瘤殺死中及在減小腫瘤體積中之功效。STM108-ADC包含經半胱胺酸化學連接至如上文所述之MC-vc-PAB-MMAE之STM108 MAb以特異性遞送MMAE細胞毒素有效負載至表現PD-L1之腫瘤或癌細胞。測得之STM108-ADC (STM108-MC-vc-PAB-MMAE)之物理性質如下：
結合該實例，圖17A-17D呈現進行以評估STM108-ADC相比對照(IgG及僅STM108 MAb)在殺死表現PD-L1及表現非-PD-L1之腫瘤細胞中及在減小腫瘤移植小鼠之腫瘤體積中之功效之實驗結果。圖17A顯示表現PD-L1之MDA-MB231(人類乳癌細胞系)腫瘤細胞(「MB231」)在暴露於不同濃度(nM)之STM108-ADC之後之存活率% (經填充之黑色圓)與經分子水平工程化以敲除其PD-L1表現之MB231細胞(「MB231 PDL1 KO」)在暴露於不同濃度之STM108-ADC(即「ADC108」之後之存活率% (經填充之黑色正方形))的比較。如所觀察到，其表面上不表現PD-L1之MB231細胞之存活率在甚至最高濃度下亦不會受STM108-ADC顯著影響，而表現PD-L1之MB231細胞之存活率明顯降低，尤其在1 nM高至100 nM之STM108-ADC濃度下。在圖17B中，使用乳癌之MDA-MB231小鼠模型，其中用IgG-MMAE對照(100 μg)；用STM108-ADC，在50 μg下、在100 μg下、或在150 μg下；或僅用STM108 MAb(100 μg)處理移植有源自MB231細胞之腫瘤之動物。結果證實相比經IgG-MMAE對照處理之動物，用STM108-ADC在所有劑量水平下處理具有腫瘤之動物有效地減小腫瘤體積，及用STM108 MAb(100 μg)處理在某種程度上減小。此外，驚人地發現到約第18天經STM108-ADC(100 μg)處理之5隻動物中有3隻(3/5)發生完全緩解(「CR」)及經STM108-ADC (150 μg)處理之動物5隻中有4隻(4/5)發生完全緩解。 圖17C顯示經分子水平上工程化以在細胞表面上表現人類PD-L1之4T1乳癌細胞(「4T1 hPDL1」)在暴露於不同濃度(nM)之STM108-ADC之後的存活率%(開放紅色圓)與天然不表現PD-L1之4T1細胞(「4T1」)在暴露於不同濃度之STM108-ADC(即「ADC108」)之後之存活率%(開放紅色正方形)的比較。如所觀察到，在大於10 nM至100 nM之STM108-ADC濃度下，其表面上不表現PD-L1之4T1細胞之存活率在甚至最高濃度下亦不會受STM108-ADC顯著影響，而表現PD-L1之4T1細胞之存活率降低。 使用乳癌之4T1同基因小鼠模型，其中動物(Balb/c小鼠)移植有源自已經分子水平上工程化以在細胞表面上表現PD-L1之4T1乳癌細胞(「4T1 hPD-L1」)之腫瘤，或其中該等Balb/c小鼠移植有源自細胞表面上天然不表現PD-L1之未轉染4T1乳癌細胞(「4T1」)之腫瘤。依在MD安德森的機構動物照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)批准之指南下，進行利用BALB/c小鼠(6-至8-週齡雌性；Jackson Laboratories，Bar Harbor，Maine, USA)之所有程序。根據各組的平均腫瘤體積將小鼠分組。將4T1細胞(1 × 10
5
個細胞含在與25 μL Matrixgel Basement膜基質[BD Biosciences，San Jose, CA, USA])混合之25 μL培養基中)注射至***脂肪墊中。在小鼠腫瘤細胞培養之後的第3天、第5天、第7天、第9天、第11天及第13天經腹膜內注射IgG-MMAE對照(100 μg)、STM108 MAb(100 μg)或STM108-ADC(150 μg)。每3天用游標卡尺測量腫瘤，及使用以下公式計算腫瘤體積：π/6 × 長 × 寬
2
。 如圖17D中所觀察到，在具有具有很少或無細胞表面PD-L1表現之4T1-源性腫瘤之動物(開放圓/點線)中，該等結果顯示所有治療類型(即IgG-MMAE對照、STM108 MAb或STM108-ADC)之腫瘤體積隨時間增加。在具有源自表現PD-L1之4T1細胞之腫瘤且經IgG-MMAE對照處理之動物中，經處理之動物之腫瘤體積亦隨時間增加(實心黑色圓)。相比之下，在具有源自表現PD-L1之4T1細胞之腫瘤且經STM108 MAb(實心藍色圓)或經STM108-ADC(實心紅色圓)中任一者處理之動物中，腫瘤體積有效地減小。此外，驚人地發現到約第21天經STM108-ADC處理之7隻動物中有5隻(5/7)發生完全緩解(「CR」)。 活體內結果凸顯出該等有益及有效抗腫瘤及治療性態樣，該等態樣係關於如上文所述包含抗-醣化PD-L1 MAb(諸如STM108)之ADC於治療癌症(例如，兩種類型之乳腫瘤)中之用途，該等活體內結果顯示在已經抗-醣化PD-L1 MAb ADC治療之動物在治療之後的25天內(例如，到約第15天至第23天)腫瘤體積明顯減小及腫瘤完全緩解。 於本揭示案之範圍內，本文中所揭示及主張專利權之所有方法可在無過度實驗之情形下製得及實現。雖然已依實施例及較佳實施例說明該等組合物及方法，但彼等熟習此項技術者咸瞭解，可在不脫離所述之概念、精神及範圍下，改變方法、及本文所述之方法之步驟或步驟之順序。更具體言之，應明瞭化學上及生理上均相關之某些試劑可改由本文所述試劑替換同時將達成相同或相似結果。所有彼等熟習此項技術者所知之該等類似之替代及改變屬於如隨附之專利申請範圍所定義之所述實施例的精神、範圍及概念。 本文引用之所有專利、經公開之專利申請案及其他公開案係以引用的方式併入本申請案中。