TW201628638A - 紅球薑萃取物之用途 - Google Patents
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Abstract
一種紅球薑萃取物之製備方法，係用以製備應用於改善糖尿病視網膜病變之一紅球薑萃取物，其包含：將一紅球薑樣品浸漬於米醋中8小時，獲得一浸漬紅球薑樣品；將該浸漬紅球薑樣品以95~105℃之溫度、1.5~2.5kg/m2之壓力下蒸煮30分鐘，獲得一醋炙紅球薑樣品；及於70~90℃之溫度下，以一萃取溶劑萃取該醋炙紅球薑樣品8小時，該萃取溶劑為純水或體積百分濃度為95%之一乙醇溶液，以獲得該紅球薑萃取物。本發明另關於該紅球薑萃取物及該紅球薑萃取物之用途。
Description
本發明係關於一種紅球薑萃取物，特別係一種用以改善糖尿病視網膜病變之紅球薑萃取物，本發明另關於該紅球薑萃取物之製備方法，以及該紅球薑萃取物用以製備改善糖尿病視網膜病變藥物之用途。
糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy)為糖尿病(diabetes)的一種併發症，其係由於高血糖所誘導之血管壁機能不全，因而影響血管-視網膜屏障(blood-retinal barrier)之功能及提升患部血管之通透性等視網膜微循環(capillary circulation)的改變所造成之症狀，此為糖尿病患者致盲的主要原因。
習用治療糖尿病視網膜病變之方法包含雷射手術、玻璃體切除術(vitrectomy)及眼部注射皮質類固醇(cprtocpsterpod)等方法，惟三者均屬於侵入性醫療行為，且仍無法達到根治之效果，患者仍需隨時監控自己的血糖，並使自己的血糖維持在正常範圍(euglycemia)，而皮質類固醇之投藥更可能造成副作用之發生。據此，習用治療糖尿病視網膜病變之方法仍有改善之必要。
本發明係提供一種紅球薑萃取物之製備方法，係用以製備應用於改善糖尿病視網膜病變之紅球薑萃取物者。
本發明另提供一種紅球薑萃取物，係作為改善糖尿病視網膜
病變之活性成份者。
本發明再提供一種紅球薑萃取物之用途，係作為改善糖尿病視網膜病變之活性成份，以改善習用治療糖尿病視網膜病變之方法所造成之副作用者。
一種紅球薑萃取物的製備方法，係用以製備應用於改善糖尿病視網膜病變之一紅球薑萃取物，其包含：將一紅球薑樣品浸漬於米醋中8小時，獲得一浸漬紅球薑樣品；將該浸漬紅球薑樣品以95~105℃之溫度、1.5~2.5kg/m2之壓力下蒸煮30分鐘，獲得一醋炙紅球薑樣品；及於70~90℃之溫度下，以一萃取溶劑萃取該醋炙紅球薑樣品8小時，該萃取溶劑為純水或體積百分濃度為95%之一乙醇溶液，以獲得該紅球薑萃取物。
本發明之紅球薑萃取物的製備方法，其中，係將每5公斤之紅球薑樣品浸漬於5公升之米醋。
本發明之紅球薑萃取物的製備方法，其中，每500克之醋炙紅球薑樣品係以1公升之萃取溶劑進行萃取。
一種應用於改善糖尿病視網膜病變之紅球薑萃取物，係由如上述之紅球薑萃取物的製備方法製得。
一種紅球薑萃取物之用途，係應用於製備改善糖尿病視網膜病變的藥物，該紅球薑萃取物係投予一所需生物體，以改善該所需升物體之糖尿病視網膜病變現象，其中，該紅球薑萃取物係由如上述之紅球薑萃取物的製備方法製得。
本發明之紅球薑萃取物之用途，其中，該紅球薑萃取物係以每天每公斤所需個體體重600毫克之劑量投予該所需個體，且連續投予28天。
本發明之紅球薑萃取物的製備方法，係藉由將該紅球薑樣品浸漬於米醋，續經過高溫蒸煮，使該紅球薑樣品所含有之類黃酮化合物容
易釋出於後續使用之萃取溶劑，以獲得富含有類黃酮化合物之紅球薑萃取物，進而可以利用該些類黃酮化合物修復高血糖所導致之視網膜細胞的損傷現象，為本發明之功效。
本發明之應用於改善糖尿病視網膜病變之紅球薑萃取物，係富含有類黃酮化合物，可以改善糖尿病視網膜病變現象，以達到防止患者視力持續惡化之功效。
本發明之紅球薑萃取物之用途，係以富含有類黃酮化合物之紅球薑萃取物作為改善糖尿病視網膜病變之活性成份，防止習用藥物所導致之副作用的衍生，為本發明之功效。
第1a圖係本試驗第C0組糖尿病大鼠之眼底攝影(fundus photography)結果。
第1b圖係本試驗第C0組糖尿病大鼠之視網膜PAS、蘇木精染色結果。
第2a圖係本試驗第C1組糖尿病大鼠之眼底攝影(fundus photography)結果。
第2b圖係本試驗第C1組糖尿病大鼠之視網膜PAS、蘇木精染色結果。
第3a圖係本試驗第C2組糖尿病大鼠之眼底攝影(fundus photography)結果。
第3b圖係本試驗第C2組糖尿病大鼠之視網膜PAS、蘇木精染色結果。
第4a圖係本試驗第C3組糖尿病大鼠之眼底攝影(fundus photography)結果。
第4b圖係本試驗第C3組糖尿病大鼠之視網膜PAS、蘇木精染色結果。
第5a圖係本試驗第C4組糖尿病大鼠之眼底攝影(fundus photography)結果。
第5b圖係本試驗第C4組糖尿病大鼠之視網膜PAS、蘇木精染色結果。
為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明所述之「紅球薑樣品」係指紅球薑(Zingiber zerumbet)之塊莖(rhizome)，常被作為調味料及開味食材，可以用以治療牙痛、消化不良、腹瀉等症狀，亦具有促進血液循環之活性。
本發明之紅球薑萃取物係萃取自一紅球薑樣品，同時藉由米醋之浸漬及高溫蒸煮，使該紅球薑樣品所含有之類黃酮化合物容易於萃取過程中釋出，使該紅球薑萃取物富含類黃酮化合物，進而可以利用該些類黃酮化合物修復高血糖所導致之視網膜細胞的損傷現象。
詳而言之，本發明之一實施例的紅球薑萃取物係可以藉由包含以下步驟之方法製備獲得：提供如上述之紅球薑樣品，將該紅球薑樣品浸漬於米醋，續進行高溫蒸煮，以獲得一醋炙紅球薑樣品，另萃取該醋炙紅球薑樣品，即可以獲得該紅球薑萃取物。
該紅球薑樣品係可以於去除其表面之雜質後，浸漬於米醋之中，以避免該紅球薑樣品表面之雜質對後續步驟造成影響。於本實施例中，係將該紅球薑樣品置於一封閉容器中，以防止於浸漬過程中有外界雜質進入，如此，米醋即可以悶透滲入該紅球薑樣品，以形成一浸漬紅球薑樣品。舉例而言，本實施例係取得50kg之紅球薑新鮮塊根，洗淨去除泥土後，切片、陰乾以獲得5.3kg之紅球薑樣品(含水量為89.4%)，並取5kg之紅球薑樣品浸漬於5L之米醋中8小時，即可以獲得該浸漬紅球薑樣品。
續將該浸漬紅球薑樣品置於一密閉空間(例如一壓力鍋)內，並於95~105℃之溫度、1.5~2.5kg/cm2之壓力下進行蒸煮30分鐘，直至該浸漬紅球薑樣品外觀呈現黑褐色，可以判斷該浸漬紅球薑樣品已被
蒸透，即獲得一醋炙紅球薑樣品。該醋炙紅球薑樣品另可以經由冷凍乾燥，使該醋炙紅球薑樣品之含水量降至10%以下，以利於該醋炙紅球薑樣品之保存。
該醋炙紅球薑樣品另可以經由一萃取溶劑之萃取，以獲得該紅球薑萃取物。該萃取溶劑可以選擇為選擇為純水，或是體積百分濃度為95%之一乙醇溶液，使該醋炙紅球薑樣品所富含之黃酮類化合物得以釋出於該萃取溶劑中，以獲得該紅球薑萃取物。於本實施例中，係取500克之醋炙紅球薑樣品，以1公升之純水或該乙醇溶液，於70~90℃定溫回流8小時，重複萃取3次，最後藉由真空過濾、減壓濃縮及冷凍乾燥，以獲得該該紅球薑萃取物。
本發明之紅球薑萃取物係可以有效修復高血糖所導致之視網膜細胞的損傷現象，因而係能夠作為一種改善糖尿病視網膜病變之活性成分，例如可以將該紅球薑萃取物應用於製備改善糖尿病視網膜病變之藥物或保健食品，該紅球薑萃取物與醫藥學上可以接受之載劑或賦形劑組合形成一醫藥組合物，其中，該紅球薑萃取物係可以製備成任何方便食用之型式，如錠劑、膠囊、粉劑、粒劑或液劑等，或者將該紅球薑萃取物與其他食品或飲料組合，以一適於食用之樣態供生物體以口服方式服用。
又，該紅球薑萃取物係可以供投予一所需個體，例如以每天每公斤之所需個體體重投予600mg之紅球薑萃取物，且連續投予該所需個體28天，使黃酮類化合物等活性成分得以於該所需個體體內作用，而可以改善該所需個體之糖尿病視網膜病變現象。
為證實本發明紅球薑萃取物確實具有改善糖尿病視網膜病變現象之活性，遂進行以下試驗：
(A)紅球薑萃取物之製備及活性成分含量檢測
請參照第1表所示，各組紅球薑萃取物之製備方法係如上所
述，各取500克之紅球薑樣品或醋炙紅球薑樣品，以1公升之萃取溶劑進行萃取後，經由過濾、濃縮及冷凍乾燥後，以獲得各組之紅球薑萃取物。
類黃酮化合物(flavonoids)的含量測定，係以槲黃素(quercetin)作為標準品，利用其濃度及吸光值製成標準曲線。分別將氯化鋁水溶液(2%，1mL)加入該槲黃素標準品(濃度範圍為1~100mg/mL，1mL)與各組之紅球薑萃取物(濃度為1~100mg/mL，1mL)中，於室溫下靜置10分鐘後，量測於430nm波長下之吸光值，並依據吸光值量測結果回推各組紅球薑萃取物所含有之類黃酮類化合物的含量(以〝每克紅球薑萃取物所含有之槲黃素含量〞作為比較基準)，紀錄於第2表。
請參照第2表所示，根據上述試驗結果，藉由將該紅球薑樣品浸漬於米醋，續經過高溫蒸煮，使該紅球薑樣品所含有之類黃酮化合物
容易於萃取過程中釋出，溶解於該萃取溶劑(即，純水或該酒精溶液)中，而可以獲得富含有類黃酮類化合物之紅球薑萃取物。
(B)對高血糖所導致損傷之視網膜細胞的存活影響
本試驗係選用視網膜細胞(ARPE-19cells)，購自食品工業發展研究所，該視網膜細胞係培養於含有1.2g/L碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)、2.5mM L-麩氨酸(L-Glutamine)、15mM 4-羥乙基乙磺酸(HEPES)、0.5mM丙酮酸鈉(sodium pyruvate)及10%胎牛血清(FBS)之DME/F-12(1：1)培養液中，並置於溫度為37℃、二氧化碳濃度為5%及溼度為95%之培養箱中，每隔兩天更換一次新鮮培養液。
該視網膜細胞於繼代培養時，係先將培養液及細胞以1000rpm離心5分鐘，去除上清液後，再加入新的培養液，並且使10公分培養皿中維持細胞數為約1×105至1×106cells/mL。
本試驗進行時，係可以取出已經長8~9分滿之上述視網膜細胞的10公分培養皿，去除已變色之培養液，以8mL之PBS緩衝溶液沖洗細胞一次，加入胰蛋白酶/乙二胺乙酸(Trypsin/EDTA)反應1~3分鐘後，輕搖培養皿使細胞自壁上脫落，加入已回溫的培養液，輕輕將細胞沖散，再將含細胞之培養液分別置入離心管內，以1500rpm離心10分鐘，除去上清液後，再加入含血清之培養液，使細胞分散均勻，並取出20μL之細胞，加入20μL 0.04%之錐蟲藍(Trypan Blue)進行染色，放入細胞計數器，並於顯微鏡下計數活細胞數，細胞存活率必須不小於85%才可以進行後續試驗。
以含血清之培養液將上述視網膜細胞之濃度調整為1x105cell/mL，並且各取100μL之視網膜細胞接種於96孔盤，使每個槽孔含有1x104細胞，並於溫度為37℃、二氧化碳濃度為5%之培養箱進行隔夜培養。
經過24小時培養後，分別如第3表所示，加入葡萄糖水溶
液(使最終濃度為6mM)及100μL之紅球薑萃取物(濃度為1mg/mL，溶於DMSO中)，混合均勻後，於溫度為37℃，二氧化碳濃度為5%之培養箱續隔夜培養24小時。
24小時後，移除培養液，以磷酸緩衝液沖洗後，再加入100μL含有CCK-8之新鮮培養液，置於溫度為37℃，二氧化碳濃度為5%之培養箱反應2小時後，震搖5分鐘後，偵測每個槽孔於450nm波長下之吸光值，並依未經任何藥物處理之控制組的吸光值結果計算存活率，紀錄於第4表。存活率之換算公式：「各組之吸光值」/「未經任何藥物處理之控制組吸光值」×100%。
請參照第4表所示，依據上述試驗結果，萃取自該醋炙紅球薑樣品之紅球薑萃取物(即，第B5、B6組)確實具有修復高血糖所導致之視網膜細胞的損傷現象之能力。
(C)對糖尿病大鼠之糖尿病視網膜病變的影響
本試驗係選用購自財團法人國家實驗研究院國家實驗動物中心之Wistar雄性大鼠，該些大鼠皆在8週週齡以上，體重介於160~180克之間。該些大鼠係飼養於大仁科技大學動物中心，維持室溫為25±1℃之動物室，光照時間與黑暗時間各為12小時，該些大鼠可以自由進食及飲水。
使該些大鼠於空腹72小時後，以腹腔注射(intraperitioneal injection)方式將鏈脲佐菌素(streptozotocin，簡稱STZ)投予該些大鼠(投予劑量為60mg/kg)，以誘導形成糖尿病大鼠，續於72小時後，量測該些大鼠之血糖值，血糖值高於300mg/L，且出現三多症狀(多吃、多喝、多尿)之大鼠即可以視為成功誘導為第一型糖尿病大鼠。
分別將如第5表所示之紅球薑萃取物經口餵食該些糖尿病大鼠，每天餵食2次，連續餵食28天，於實驗前(第0天)及實驗後(第28天)分別量測該些糖尿病大鼠之眼壓及視網膜狀態之評估。
請參照第6表所示，各組糖尿病大鼠經***麻醉後，分別量測第0天及第28天之各組糖尿病大鼠的眼壓，另於第28天時，點入硫酸阿托平(atropine，0.25%)點眼液後，以***麻醉各組糖尿病大鼠，並於5分鐘後以眼底鏡(MiiS Horus Scope DOC100)進行各組糖尿病大鼠之眼底攝影，續犧牲各組糖尿病大鼠，將視網膜進行組織切片，並以PAS及蘇木精(periodic acid-Schiff/hematoxylin)進行染色。
請參照第6表所示，第C0組糖尿病大鼠之眼壓持續上升，而連續餵食萃取自該醋炙紅球薑樣品之紅球薑萃取物(即，第C3、C4組)之眼壓則有顯著的下降，其眼壓下降之趨勢與第2表所示之類黃酮類化合物的含量呈正相關。
續請參照第1a圖所示，該糖尿病大鼠之視網膜出現新生微細微血管，且眼部有血液滲出於眼球玻璃體(vitreous humour)，且另請參照第1b圖所示，該糖尿病大鼠之視網膜另有瀰漫性蛋白質樣纖維素物質
(diffused fibrinogen-like protein)蓄積及覆蓋，亦有出現細胞水腫、出血、血管擴張及血管新生的狀況；而連續餵食萃取自該醋炙紅球薑樣品之紅球薑萃取物(即，第C3、C4組)之糖尿病大鼠之視網膜病變情形有緩和的現象，顯示本發明之紅球薑萃取物確實可以改善糖尿病視網膜病變的情形，亦即，藉由米醋之浸漬及高溫蒸煮所釋出之類黃酮化合物確實可以修復高血糖所導致之視網膜細胞的損傷現象。
綜合上述，本發明之紅球薑萃取物的製備方法，係藉由將該紅球薑樣品浸漬於米醋，續經過高溫蒸煮，使該紅球薑樣品所含有之類黃酮化合物容易釋出於後續使用之萃取溶劑，以獲得富含有類黃酮化合物之紅球薑萃取物，進而可以利用該些類黃酮化合物修復高血糖所導致之視網膜細胞的損傷現象，為本發明之功效。
再者，本發明之應用於改善糖尿病視網膜病變之紅球薑萃取物，係富含有類黃酮化合物，可以改善糖尿病視網膜病變現象，以達到防止患者視力持續惡化之功效。
此外，本發明之紅球薑萃取物之用途，係以富含有類黃酮化合物之紅球薑萃取物作為改善糖尿病視網膜病變之活性成份，防止習用藥物所導致之副作用的衍生，為本發明之功效。
雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
Claims (6)
- 一種紅球薑萃取物的製備方法，係用以製備應用於改善糖尿病視網膜病變之一紅球薑萃取物，其包含：將一紅球薑樣品浸漬於米醋中8小時，獲得一浸漬紅球薑樣品；將該浸漬紅球薑樣品以95~105℃之溫度、1.5~2.5kg/m2之壓力下蒸煮30分鐘，獲得一醋炙紅球薑樣品；及於70~90℃之溫度下，以一萃取溶劑萃取該醋炙紅球薑樣品8小時，該萃取溶劑為純水或體積百分濃度為95%之一乙醇溶液，以獲得該紅球薑萃取物。
- 如申請專利範圍第1項所述之紅球薑萃取物的製備方法，其中，係將每5公斤之紅球薑樣品浸漬於5公升之米醋。
- 如申請專利範圍第1項所述之紅球薑萃取物的製備方法，其中，每500克之醋炙紅球薑樣品係以1公升之萃取溶劑進行萃取。
- 一種應用於改善糖尿病視網膜病變之紅球薑萃取物，係由如申請專利範圍第1~3項所述之紅球薑萃取物的製備方法製得。
- 一種紅球薑萃取物之用途，係應用於製備改善糖尿病視網膜病變的藥物，該紅球薑萃取物係投予一所需生物體，以改善該所需升物體之糖尿病視網膜病變現象，其中，該紅球薑萃取物係由如申請專利範圍第1~3項所述之紅球薑萃取物的製備方法製得。
- 如申請專利範圍第5項所述之紅球薑萃取物之用途，其中，該紅球薑萃取物係以每天每公斤所需個體體重600毫克之劑量投予該所需個體，且連續投予28天。
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2015
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