TW201625697A - 用於增強之免疫反應之組合物及使用方法，及癌症療法 - Google Patents

Abstract

本發明提供抗體組合物，其包括例如結合於腫瘤壞死因子受體超家族成員(亦即18)的抗體、經工程改造之抗體及抗體片段。所提供之組合物適用於提高CD4+及CD8+ T細胞反應，及治療、改善及預防可藉由增強免疫反應來對抗的疾病，例如癌症。本發明亦提供編碼此類分子之聚核苷酸及載體及具有該等聚核苷酸或載體之宿主細胞；以及包含此類分子之醫藥組合物及其使用方法。

Description

用於增強之免疫反應之組合物及使用方法，及癌症療法

本發明係關於如下抗體、抗體片段及抗原結合分子，其結合於腫瘤壞死因子受體超家族成員18/糖皮質激素誘導之TNFR相關蛋白(「GITR」)，且更特定言之為促效劑、刺激經由該受體進行之信號傳導，及/或調節免疫反應。

糖皮質激素誘導之TNFR相關蛋白(「GITR」)為腫瘤壞死因子超家族(TNFRSF)之成員，其包括超過20種I型跨膜蛋白、數種拼接變異體及數種病毒蛋白，其均具有富含半胱胺酸之域作為共有結構特徵。GITR之胞外域(ECD)由3個富含半胱胺酸之域(CRD)組成，繼而為跨膜域(TM)及胞內域(ICD)。

於鼠類及人類CD4+CD25+調節性T細胞上偵測到組成性GITR表現，該表現可在活化後進一步增加。相比之下，CD4+CD25效應T細胞及CD8+CD25效應T細胞以低至不可偵測之水準表現GITR，在T細胞受體活化後其快速上調。亦在經活化之NK細胞、樹突狀細胞及巨噬細胞上偵測到GITR表現。GITR下游之信號轉導路徑已展示包括MAPK及標準NFκB路徑。已表明各種TRAF家族成員作為GITR下游之信號傳導中間物(Nocentini等人，(2005)Eur.J.Immunol.,35：1016-1022)。

經由GITR活化細胞被認為視細胞類型及微環境而定用於數種功能，包括(但不限於)共刺激以增強增殖及效應功能，抑制調節性T細胞之抑制作用及避免活化誘發之細胞死亡(Shevach及Stephens(2006)Nat.Rev.Immunol.,6：613-618)。Ko等人((2005)J.Exp.Med.,202：885-891)首次展現在小鼠同基因型腫瘤模型中針對小鼠GITR之促效單株抗體有效誘導腫瘤特異性免疫性且根除所形成之腫瘤。另外及/或替代地，具有功能性Fc效應子活性之抗mGITR已在一些臨床前模型中展示消耗調節性T細胞以及提高所選腫瘤環境中之T效應細胞增殖及細胞激素分泌。此等發現表明mGITR之促效抗體可破壞免疫耐受平衡，從而又使得T細胞可對抗腫瘤及持久性病毒感染。然而，迄今為止研究主要集中於替代抗體於嚙齒動物系統中之用途。由於小鼠及人類GITR中結構之差異，未知小鼠中之替代研究所見之發現是否可轉換為人類GITR功能之改變。

已鑑別特異性結合於人類糖皮質激素誘導之腫瘤壞死因子受體超家族成員18(「GITR」)的抗體，其中該等抗體在於活體外交聯時具有活體外hGITR促效劑活性，且其中該等抗體賦予活體內hGITR活性且在腫瘤位點誘導提高之Teff：Treg比率，從而抑制腫瘤發展。因此，本發明提供特異性結合且經由靶向表現人類GITR之細胞促進胞內信號傳導及/或調節免疫反應的促效抗體、抗體片段及抗原結合分子。在一個態樣中，本發明提供特異性結合於人類GITR之經分離抗體、抗體片段及抗原結合分子，其中該抗體、抗體片段或抗原結合分子結合於富含半胱胺酸之域1(「CRD1」)內之抗原決定基，且其中該抗體、抗體片段或抗原結合分子為GITR之促效劑，且其中該抗體、抗體片段或抗原結合分子視情況具有完整或增加之FcR效應功能。

在一些實施例中，抗體、抗體片段或抗原結合分子結合於人類 GITR之殘基41-65內的抗原決定基。在一些實施例中，該抗體、抗體片段或抗原結合分子與結合於人類GITR之殘基41-65內之抗原決定基的抗體或抗體片段競爭。在一些實施例中，抗體、抗體片段或抗原結合分子結合於人類GITR之殘基41-65內的至少一個胺基酸殘基，例如抗體、抗體片段或抗原結合分子結合於與人類GITR之殘基41-65重疊的抗原決定基。

在一些實施例中，抗體、抗體片段或抗原結合分子結合於SEQ ID NO：4，且包含構成人類重鏈之(a)重鏈可變區，其中：i)重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22，且ii)重鏈CDR2包含選自SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：27中之任一者的序列，且iii)重鏈CDR3包含SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：109；及(b)輕鏈可變區，其中i)輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：31，且ii)輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33，且iii)輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34。

關於抗體、抗體片段或抗原結合分子之其他實施例，在一些實施例中，重鏈可變區與SEQ ID NO：16之可變區具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性，且輕鏈可變區與SEQ ID NO：17之可變區具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性。在特定實施例中，抗體、抗體片段或抗原結合分子包含有包含SEQ ID NO：16之重鏈及包含SEQ ID NO：17之輕鏈。在一些實施例中，抗體、抗體片段或抗原結合分子與包含有包含SEQ ID NO：16之重鏈及包含SEQ ID NO：17之輕鏈的抗體競爭。

在一些實施例中，重鏈FR4為人類生殖系FR4。在特定實施例中，重鏈FR4為SEQ ID NO：42。

在一些實施例中，輕鏈FR4為人類生殖系FR4。在特定實施例中，輕鏈FR4為SEQ ID NO：50。

在一些實施例中，提供一種抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中：i)重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：84；ii)重鏈CDR2包含SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：80；iii)重鏈CDR3包含SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：109；iv)輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：85；v)輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：82，且vi)輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：83。

在一些實施例中，提供一種抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中：i)重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22；ii)重鏈CDR2包含SEQ ID NO：23；iii)重鏈CDR3包含SEQ ID NO：29；iv)輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：30；v)輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33，且vi)輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34。

在一些實施例中，提供一種抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中：i)重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22；ii)重鏈CDR2包含SEQ ID NO：24；iii)重鏈CDR3包含SEQ ID NO：29；iv)輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：31；v)輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33，且vi)輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34。

在一些實施例中，提供一種抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中：i)重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22；ii)重鏈CDR2包含SEQ ID NO：25；iii)重鏈CDR3包含SEQ ID NO：29；iv)輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：30；v)輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33，且vi)輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34。

在一些實施例中，提供一種抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中：i)重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22；ii)重鏈CDR2包含SEQ ID NO：26；iii)重鏈CDR3包含SEQ ID NO：29；iv)輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：30；v)輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33，且vi)輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34。

在一些實施例中，提供一種抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中：i)重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22；ii)重鏈CDR2包含SEQ ID NO：27；iii)重鏈CDR3包含SEQ ID NO：29；iv)輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：30；v)輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33，且vi)輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34。

在一些實施例中，提供一種抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中：i)重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22；ii)重鏈CDR2包含SEQ ID NO：25；iii)重鏈CDR3包含SEQ ID NO：109；iv)輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：30；v)輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33，且vi)輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34。

在另一態樣中，本發明提供特異性結合GITR之抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中該抗體或抗體片段包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中：i)重鏈之CDR1包含選自由SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：84組成之群的胺基酸序列；ii)重鏈之CIR2包含選自由SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：62及SEQ ID NO：80組成之群的胺基酸序列；iii)重鏈之CDR3包含SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：109；iv)輕鏈之CDR1包含選自由SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：85及SEQ ID NO：86組成之群的胺基酸序列；v)輕鏈之CDR2包含選自由SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：64及SEQ ID NO：82組成之群的胺基酸序列；且輕鏈之CDR3包含SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：83。

在抗體、抗體片段或抗原結合分子之其他實施例中，重鏈可變區與選自由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：99及SEQ ID NO：105組成之群的序列的可變區具有至少90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列 一致性，且輕鏈可變區與選自由SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：7組成之群的序列的可變區具有至少90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性。在特定實施例中，經分離抗體、抗體片段或抗原結合分子包含有包含選自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：99及SEQ ID NO：105中之任一者的序列的重鏈可變域；且輕鏈可變域包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9。在一些實施例中，經分離抗體、抗體片段或抗原結合分子包含SEQ ID NO：6之重鏈可變域及SEQ ID NO：7之輕鏈可變域。在一些實施例中，經分離抗體或抗體片段包含有包含SEQ ID NO：8之重鏈可變域及包含SEQ ID NO：9之輕鏈可變域。在其他實施例中，經分離抗體或抗體片段包含有包含SEQ ID NO：10之重鏈可變域及包含SEQ ID NO：7之輕鏈可變域。在其他實施例中，經分離抗體或抗體片段包含有包含SEQ ID NO：12之重鏈可變域及包含SEQ ID NO：7之輕鏈可變域。在其他實施例中，經分離抗體或抗體片段包含有包含SEQ ID NO：14之重鏈可變域及包含SEQ ID NO：7之輕鏈可變域。

關於抗體、抗體片段或抗原結合分子之其他實施例，在一些實施例中，重鏈可變區與SEQ ID NO：99之可變區具有至少90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性，且輕鏈可變區與SEQ ID NO：7之可變區具有至少90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性。在一些實施例中，經分離抗體或抗體片段包含有包含SEQ ID NO：99之重鏈可變域及包含SEQ ID NO：7之輕鏈可變域。

關於抗體、抗體片段或抗原結合分子之其他實施例，在一些實施例中，重鏈可變區與SEQ ID NO：105之可變區具有至少90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性，且輕 鏈可變區與SEQ ID NO：7之可變區具有至少90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性。在一些實施例中，經分離抗體或抗體片段包含有包含SEQ ID NO：105之重鏈可變域及包含SEQ ID NO：7之輕鏈可變域。

在一些實施例中，將結合於GITR之抗體、抗體片段或抗原結合分子人類化。在某些實施例中，抗體或抗體片段包含人類恆定區。

在一些實施例中，抗體片段為Fab'片段。在一些實施例中，抗體片段為單鏈抗體(scFv)。在一些實施例中，抗體片段為單域抗體或奈米抗體。

在一些實施例中，抗體或抗體片段與第二抗體或抗體片段交聯。在一些實施例中，將抗體糖基化。

在一些實施例中，抗體、抗體片段或抗原結合分子為IgG。在某些實施例中，抗體、抗體片段或抗原結合分子包含IgG同型抗體Fc區。在特定實施例中，抗體、抗體片段或抗原結合分子包含IgG1或IgG2同型抗體Fc區。在某些實施例中，抗體、抗體片段或抗原結合分子為IgG1或IgG2抗體。在一些實施例中，抗體、抗體片段或抗原結合分子含有至少一種突變，其調節(亦即增加或減少)抗體或抗體片段與Fc受體之結合。在一些實施例中，抗體、抗體片段或抗原結合分子含有至少一種突變，其調節(亦即增加或減少)活化Fc受體之抗體、抗體片段或抗原結合分子。在特定實施例中，抗體、抗體片段或抗原結合分子含有至少一種突變，其增加抗體或抗體片段與Fc受體之結合。在某些實施例中，抗體、抗體片段或抗原結合分子含有至少一種突變，其增加活化Fc受體之抗體、抗體片段或抗原結合分子。

在一些實施例中，抗體、抗體片段或抗原結合分子與人類及非人類靈長類動物GITR交叉反應。在一些實施例中，抗體、抗體片段或抗原結合分子不與嚙齒動物GITR(例如大鼠GITR或小鼠GITR)交叉 反應。

在一相關態樣中，本發明進一步提供編碼如本文所述之本發明之抗體、抗體片段或抗原結合分子的聚核苷酸。在一些實施例中，編碼輕鏈可變區之聚核苷酸與選自SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54及SEQ ID NO：102之核酸序列具有至少90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼重鏈可變區之聚核苷酸與選自SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：107及SEQ ID NO：115之核酸序列具有至少90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈可變區之聚核苷酸具有選自SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54及SEQ ID NO：102之核酸序列。在一些實施例中，編碼重鏈可變區之聚核苷酸具有選自SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：107及SEQ ID NO：115之核酸序列。

在一相關態樣中，本發明進一步提供包含如本文所述之本發明之抗體、抗體片段或抗原結合分子及醫藥學上可接受之載劑的組合物。在一些實施例中，本發明提供包含本發明之抗體、抗體片段或抗原結合分子的醫藥組合物，其用於投與個體。

在一些實施例中，組合物進一步包含標靶抗原，例如癌症相關抗原或腫瘤相關抗原。在一些實施例中，標靶抗原為病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原或寄生蟲抗原。

在一些實施例中，組合物進一步包含CTLA4之拮抗劑。在一些實施例中，組合物進一步包含PD-1/PD-L1(例如B7-H1或其類似物，PD-1抗體)相互作用之抑制劑。

在另一態樣中，本發明進一步提供包含如本文所述之本發明之 抗體或抗體片段的套組。

在一些實施例中，套組進一步包含用於與抗體共同投與之第二藥劑。在一些實施例中，第二藥劑為標靶抗原，例如癌症相關抗原或腫瘤相關抗原。在一些實施例中，標靶抗原為病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原或寄生蟲抗原。

在一些實施例中，第二藥劑為CTLA4之拮抗劑。在一些實施例中，第二藥劑為PD-1/PD-L1(例如B7-H1)相互作用之抑制劑。

視情況，抗體或抗體片段及第二藥劑以混合物之形式提供。視情況，抗體或抗體片段及第二藥劑以各別調配物形式提供。

在另一態樣中，本發明提供為有需要之個體提高T細胞反應的方法，其包含投與個體治療有效量之如本文所述之本發明之抗促效劑抗體或抗體片段。在另一態樣中，本發明提供一種本發明之抗GITR促效劑抗體或抗體片段，其用於提高個體之T細胞反應。在另一態樣中，本發明提供一種包含本發明之抗體或抗體片段的組合物，其用於提高個體之T細胞反應。

在另一態樣中，本發明提供為有需要之個體治療表現腫瘤相關抗原之癌症的腫瘤生長的方法，其包含投與個體治療有效量之如本文所述之本發明之抗GITR促效劑抗體、抗體片段或抗原結合分子。本發明進一步提供一種本發明之抗GITR促效劑抗體或抗體片段，其用於治療個體之癌症的腫瘤生長。本發明進一步提供一種包含本發明之抗體或抗體片段的組合物，其用於降低、抑制或預防個體的表現腫瘤相關抗原之癌症的腫瘤生長。

關於方法及醫學用途之實施例，在一些實施例中，將抗GITR促效劑抗體、抗體片段或抗原結合分子與抗原共同投與。在一些實施例中，抗原為癌症相關抗原或腫瘤相關抗原。在一些實施例中，將抗GITR促效劑抗體或抗體片段與來自患者之癌細胞(亦即自體癌細胞)共 同投與。

在一些實施例中，將抗GITR促效劑抗體、抗體片段或抗原結合分子與CTLA4之拮抗劑共同投與。在一些實施例中，將抗GITR促效劑抗體或抗體片段與PD-1/PD-L1(例如B7-H1)相互作用之抑制劑共同投與。

在一些實施例中，將抗GITR促效劑抗體、抗體片段或抗原結合分子與化學治療劑或細胞毒素共同投與。

在一些實施例中，T細胞反應為CD8+細胞毒性T淋巴細胞性(CTL)T細胞反應。在一些實施例中，T細胞反應為CD4+輔助T細胞(Th)反應。

在一些實施例中，患者患有表現腫瘤相關抗原之癌症。在一些實施例中，癌症選自由以下組成之群：黑色素瘤、卵巢癌、結腸直腸癌、***癌、非小細胞肺癌(NSCLC)及乳癌。在一個實施例中，癌症類型選自由以下組成之群：胰臟癌、黑色素瘤、乳癌、肺癌、支氣管癌、結腸直腸癌、***癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、腦癌或中樞神經系統癌症、周邊神經系統癌症、食道癌、子宮頸癌、子宮或子宮內膜癌、口腔癌或咽癌、頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、肝癌、腎癌、睪丸癌、膽道癌、小腸或附件癌、唾液腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤及血液組織癌。

在一些實施例中，患者患有傳染病，例如病毒感染、細菌感染、真菌抗原或寄生蟲抗原。在一些實施例中，將抗GITR促效劑抗體與病毒抗原(例如來自HCV、HSV或HIV)共同投與。在一些實施例中，將抗GITR促效劑抗體與細菌抗原共同投與。在一些實施例中，將抗GITR促效劑抗體與真菌抗原共同投與。在一些實施例中，將抗GITR促效劑抗體與寄生蟲抗原(例如絲蟲病)共同投與。

在其他實施例中，提供用於療法之經分離抗體、抗體片段或抗 原結合分子。在某些實施例中，提供抗體、抗體片段或抗原結合分子以用於為有需要之個體提高T細胞反應。在某些實施例中，提供抗體、抗體片段或抗原結合分子以用於為有需要之個體治療腫瘤生長。

定義

「抗體」係指免疫球蛋白家族之多肽，其能夠非共價、可逆且特異性結合相應抗原。例示性抗體結構單元包含四聚體。各四聚體由兩條一致多肽鏈對構成，各對具有經由二硫鍵連接之一條「輕」鏈(約25kD)及一條「重」鏈(約50-70kD)。識別之免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε及μ恆定區基因以及多種免疫球蛋白可變區基因。將輕鏈歸類為κ或λ。重鏈歸類為γ、μ、α、δ或ε，其又分別定義免疫球蛋白類別IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。本發明之抗體可具有任何同型/類別(例如IgG、IgM、IgA、IgD及IgE)或任何子類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。各鏈之N端界定具有約100至110個或110個以上胺基酸主要負責抗原識別的可變區。術語可變輕鏈(V_L)及可變重鏈(V_H)分別指輕鏈及重鏈之此等區。除V區以外，重鏈與輕鏈含有恆定(C)區或域。免疫球蛋白C區之分泌形式由三個C域CH1、CH2、CH3、視情況存在之CH4(Cμ)及鉸鏈區組成。免疫球蛋白C區之膜結合形式亦具有膜及胞內域。各輕鏈在N端處具有VL，繼而在其另一端具有恆定域(C)。VL與VH比對，且CL與重鏈之第一恆定域比對。VH及VL對一起形成單一抗原結合位點。如本文所用之「習知抗體」IgG免疫球蛋白係指呈天然存在之構型的抗體。通常，習知抗體IgG具有四條鏈，兩條一致重鏈及兩條一致輕鏈，其經由二硫鍵連接在一起。如本文所用，「抗體」亦涵蓋具有特定結合特異性(亦即對GITR)之抗體變異體及習知抗體結構。因此，對GITR具有特定結合特異性之全長抗體、嵌合抗體及人類化抗體屬於此概念之範疇。

抗體以完整免疫球蛋白形式或以藉由用各種肽酶消化而產生之 多個明確表徵的片段形式存在。因此，舉例而言，胃蛋白酶在鉸鏈區中之二硫鍵下方消化抗體以產生F(ab)'₂，即Fab之二聚體，其自身為藉由雙硫鍵接合於V_H-C_H1之輕鏈。F(ab)'₂可在溫和條件下還原以破壞鉸鏈區中之二硫鍵，從而將(Fab')₂二聚物轉化成Fab'單體。Fab'單體基本上為具有鉸鏈區之一部分的Fab。Paul,Fundamental Immunology,第3版(1993)。儘管各種抗體片段關於消化完整抗體定義，但熟習此項技術者應瞭解此類片段可以化學方法或藉由使用重組DNA方法重新合成。如本文所用，「抗體片段」係指藉由修改全抗體產生或使用重組DNA方法重新合成的對GITR保留結合特異性及促效劑活性的抗體之一或多個部分。抗體片段之實例包括具有相同結合特異性之Fv片段、單鏈抗體(ScFv)、Fab、Fab'、Fd(Vh及CH1域)、dAb(Vh及經分離CDR)；及此等片段之多聚型式(例如F(ab')₂)。抗體片段亦可併入單域抗體、最大抗體、微型抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、vNAR、雙scFv及如抗體之化合物的其他變異體中以實現本發明中所提供之結合特異性及活性。

本發明之上下文中所用之「Fab」域包含重鏈可變域、恆定區CH1域、輕鏈可變域及輕鏈恆定區CL域。域之相互作用藉由CH1與CL域之間的二硫鍵穩定。在一些實施例中，Fab之重鏈域自N端至C端以次序VH-CH，且Fab之輕鏈域自N端至C端以次序VL-CL。在一些實施例中，Fab之重鏈域自N端至C端以次序CH-VH，且Fab之輕鏈域以次序CL-VL。儘管Fab曾藉由木瓜蛋白酶消化完整免疫球蛋白鑑別，但在本發明的上下文中，「Fab」通常藉由任何方法以重組方式產生。各Fab片段關於抗原結合為單價的，亦即其具有單一抗原結合位點。

免疫球蛋白重鏈之包含CH2及CH3域之C端部分為「Fc」域。如本文所用之「Fc區」係指抗體之恆定區，不包括第一恆定區免疫球蛋白域。Fc係指IgA、IgD及IgG之最後兩個恆定區免疫球蛋白域，及IgE 及IgM之最後三個恆定區免疫球蛋白域，及此等域N端之可撓性鉸鏈。對於IgA及IgM，Fc可包括J鏈。對於IgG，Fc包含免疫球蛋白域Cγ2及Cγ3及Cγ1與Cγ之間的鉸鏈。在此項技術中，應瞭解Fc區之邊界可變化，然而，人類IgG重鏈Fc區通常指定包含殘基C226或P230至其羧基端，其使用根據Kabat等人(1991,NIH Publication 91-3242,National Technical Information Service,Springfield,Va.)中之EU指數的編號。「Fc區」可指分離形式之此區或在抗體或抗體片段之情形下的此區。「Fc區」包括Fc區(例如CH2及CH3區中)之天然存在之對偶基因變異體以及調節效應功能之修飾。Fc區亦包括不引起生物功能改變之變異體。舉例而言，免疫球蛋白Fc區之N端或C端可缺失一或多個胺基酸而生物功能不會實質性損失。舉例而言，在某些實施例中，C端離胺酸可藉由置換或移除而經修飾。在特定實施例中，改變或移除Fc區中之一或多個C端殘基。在某些實施例中，Fc中之一或多個C端殘基(例如末端離胺酸)缺失。在某些其他實施例中，Fc中之一或多個C端殘基經替代性胺基酸取代(例如末端離胺酸經置換)。此類變異體可根據此項技術中已知之一般規則選擇以對活性具有最小影響(參見例如Bowie等人，Science 247：306-1310,1990)。Fc域為Ig之由細胞受體(諸如FcR)識別之部分，且與補體活化蛋白C1q結合。CH2外顯子之5'部分中所編碼的下部鉸鏈區在抗體內提供柔韌性以結合於FcR受體。

「互補決定域」或「互補決定區」(「CDR」)可互換地指V_L及V_H之高變區。CDR為具有針對此類標靶蛋白特異性的抗體鏈的標靶蛋白結合位點。各人類V_L或V_H中存在三個CDR(CDR1-3，自N端依序編號)，佔可變域之約15-20%。CDR在結構上與標靶蛋白之抗原決定基互補，因此直接促成結合特異性。V_L或V_H之剩餘延伸區段(所謂構架區)的胺基酸序列展現較少變化(Kuby,Immunology，第4版，第4章，W.H.Freeman及Co.,New York,2000)。

CDR及構架區之位置可使用此項技術中之各種熟知定義確定，例如Kabat、Chothia、國際免疫遺傳學資料庫(international ImMunoGeneTics database，IMGT)(在全球資訊網之imgt.cines.fr/上)及AbM(參見例如Johnson等人，Nucleic Acids Res.,29：205-206(2001)；Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.,196：901-917(1987)；Chothia等人，Nature,342：877-883(1989)；Chothia等人，J.Mol.Biol.,227：799-817(1992)；Al-Lazikani等人，J.Mol.Biol.,273：927-748(1997))。抗原結合位點之定義亦描述於以下文獻中：Ruiz等人，Nucleic Acids Res.,28：219-221(2000)；及Lefranc,M.P.,Nucleic Acids Res.,29：207-209(2001)；MacCallum等人，J.Mol.Biol.,262：732-745(1996)；及Martin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86：9268-9272(1989)；Martin等人，Methods Enzymol.,203：121-153(1991)；及Rees等人，In Sternberg M.J.E.(編),Protein Structure Prediction,Oxford University Press,Oxford,141-172(1996)。

根據Kabat，V_H中之CDR胺基酸殘基之編號為31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)及95-102(HCDR3)；且V_L中之CDR胺基酸殘基之編號為24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)及89-97(LCDR3)。根據Chothia，V_H中之CDR胺基酸之編號為26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)及95-102(HCDR3)；且V_L中之胺基酸殘基之編號為26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)及91-96(LCDR3)。藉由組合Kabat及Chothia之CDR定義，CDR由人類VH中之胺基酸殘基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)及95-102(HCDR3)及人類VL中之胺基酸殘基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)及89-97(LCDR3)組成。

術語「結合特異性決定子」或「BSD」可互換地指互補決定區內決定抗體之結合特異性所要的最小鄰接或非鄰接胺基酸序列。最小結合特異性決定子可在一或多個CDR序列內。在一些實施例中，最小結 合特異性決定子存在於抗體之重鏈及輕鏈的部分或全長CDR3序列內(亦即僅藉其決定)。

如本文所用之「抗體輕鏈」或「抗體重鏈」係指分別包含V_L或V_H之多肽。內源V_L由基因區段V(可變區)及J(接合區)編碼，且內源V_H由V、D(多樣區)及J編碼。V_L或V_H各包括CDR以及構架區。在本申請案中，抗體輕鏈及/或抗體重鏈有時可統稱為「抗體鏈」。如熟習此項技術者容易地認識到，此等術語涵蓋含有不破壞V_L或V_H之基本結構的突變的抗體鏈。

如本文所用，術語「價數」係指多肽中潛在標靶結合位點之數目。各標靶結合位點特異性結合一個標靶分子或標靶分子上之特定位點。當多肽包含超過一個標靶結合位點時，各標靶結合位點可特異性結合相同或不同分子(例如可結合於不同分子，例如不同抗原，或相同分子上之不同抗原決定基)。習知抗體例如具有兩個結合位點且為二價。抗體、抗原結合分子及其片段可為單價(亦即結合一個標靶分子)、二價或多價(亦即結合超過一個標靶分子)。

為製備單株或多株抗體，可使用此項技術中已知之任何技術(參見例如Kohler及Milstein,Nature 256：495-497(1975)；Kozbor等人，Immunology Today 4：72(1983)；Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，第77-96頁.Alan R.Liss,Inc.1985)。製備單鏈抗體之技術(美國專利第4,946,778號)可適合於將抗體製備成本發明多肽。此外，可使用轉殖基因小鼠或其他生物體(諸如其他哺乳動物)表現靈長類化或人類化抗體。替代地，可使用噬菌體呈現技術鑑別特異性結合於所選抗原之抗體及雜聚Fab片段(參見例如McCafferty等人，上述；Marks等人，Biotechnology,10：779-783,(1992))。

靈長類化或人類化非人類抗體之方法為此項技術中熟知。一般而言，靈長類化或人類化抗體具有一或多個自非靈長類動物或非人類 之來源引入其中之胺基酸殘基。此等非靈長類動物或非人類胺基酸殘基通常稱為引入殘基，其通常獲自引入可變域。人類化可基本上遵循Winter及合作者之方法(參見例如Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science 239：1534-1536(1988)及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992))藉由用嚙齒動物CDR或CDR序列替代人類抗體序列相應序列進行。因此，此類人類化抗體為嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中實質上少於完整人類可變域已經來自非人類物種之相應序列取代。實務上，靈長類化或人類化抗體通常為靈長類動物或人類抗體，其中一些互補決定區(「CDR」)殘基及可能的一些構架(「FR」)殘基經起始物種(例如嚙齒動物抗體)中之類似位點之殘基取代以賦予結合特異性。

術語「嵌合抗體」為一種抗體分子，其中(a)恆定區或其一部分經改變、置換或交換以使得抗原結合位點(可變區)連接於類別、效應功能及/或物種不同或改變或完全不同之分子的恆定區，從而賦予嵌合抗體新特性，例如酶、毒素、激素、生長因子及藥物；或(b)可變區或其一部分經具有不同或改變之抗原特異性的可變區改變、置換或交換。

本發明之抗體或抗原結合分子進一步包括一或多個免疫球蛋白鏈，其化學結合於其他蛋白質或與其他蛋白質一起表現為融合蛋白。其亦包括雙特異性抗體。雙特異性或雙功能抗體為具有兩個不同重鏈/輕鏈對及兩個不同結合位點之人工雜交抗體。本發明之其他抗原結合片段或抗體部分包括二價scFv(雙功能抗體)、雙特異性scFv抗體(其中抗體分子識別兩個不同抗原決定基)、單一結合域(dAb)及微型抗體。

本文所述之各種抗體或抗原結合片段可藉由酶學或化學修飾完 整抗體產生或使用重組DNA方法重新合成(例如單鏈Fv)或使用噬菌體呈現庫鑑別(參見例如McCafferty等人，Nature 348：552-554,1990)。舉例而言，微型抗體可使用此項技術中所述之方法產生，例如Vaughan及Sollazzo,Comb Chem High Throughput Screen.4：417-30 2001。雙特異性抗體可藉由包括融合融合瘤或連接Fab'片段之多種方法產生。參見例如Songsivilai及Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)；Kostelny等人，J.Immunol.148,1547-1553(1992)。單鏈抗體可使用噬菌體呈現庫或核糖體呈現庫、基因改組庫鑑別。此類庫可自合成、半合成或天然及免疫活性來源建構。

術語「抗原結合分子」或「非抗體配體」係指使用非免疫球蛋白蛋白質骨架之抗體模擬物，包括(但不限於)纖連蛋白、高親和性多聚體、單鏈多肽結合分子及如抗體之結合肽模擬物。

術語「可變區」或「V區」可互換地指包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4之重鏈或輕鏈。內源可變區藉由免疫球蛋白重鏈V-D-J基因或輕鏈V-J基因編碼。V區可為天然存在、重組或合成的。

如本文所用，術語「可變區」或「V區」可互換地指可變區之子序列，包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3。內源V區由免疫球蛋白V基因編碼。V區可為天然存在、重組或合成的。

如本文所用，術語「J區」係指所編碼之可變區之子序列，其包含CDR3及FR4之C端部分。內源J區由免疫球蛋白J基因編碼。J區可為天然存在、重組或合成的。

「人類化」抗體為保留非人類抗體之反應性(例如結合特異性、活性)同時在人類中免疫原性較少的抗體。其可例如藉由保留非人類CDR區且用人類對應物置換抗體之其餘部分獲得。參見例如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984)；Morrison及Oi, Adv.Immunol.,44：65-92(1988)；Verhoeyen等人，Science,239：1534-1536(1988)；Padlan,Molec.Immun.,28：489-498(1991)；Padlan,Molec.Immun.,31(3)：169-217(1994)。

術語「相應人類生殖系序列」係指如下編碼人類可變區胺基酸序列或子序列的核酸序列，相較於由人類生殖系免疫球蛋白可變區序列編碼的所有其他已知可變區胺基酸序列，其與參考可變區胺基酸序列或子序列共有所測定之最高胺基酸序列一致性。相應人類生殖系序列亦可指，相較於所評估之所有其他可變區胺基酸序列，與參考可變區胺基酸序列或子序列具有最高胺基酸序列一致性的人類可變區胺基酸序列或子序列。相應人類生殖系序列可為單獨構架區、單獨互補決定區、構架及互補決定區、可變區(如上文所定義)或包含可變區之序列或子序列之其他組合。序列一致性可使用本文所述之方法測定，例如使用BLAST、ALIGN或此項技術中已知的另一比對演算法比對兩個序列。相應人類生殖系核酸或胺基酸序列可與參考可變區核酸或胺基酸序列具有至少約90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。相應人類生殖系序列可例如經由公開可獲得之國際免疫遺傳學資料庫(IMGT)(在全球資訊網之imgt.cines.fr/上)及V-base(在全球資訊網之vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk上)測定。

短語「特異性結合」或「選擇性結合」當在描述抗原(例如蛋白質)與抗體、抗體片段或抗體衍生之結合劑之間的相互作用的上下文中使用時，係指一種結合反應，其決定了抗原在非均質蛋白質群及其他生物製劑(例如生物樣品，例如血液、血清、血漿或組織樣品)中的存在。因此，在某些指定的免疫分析條件下，具有特定結合特異性的抗體或結合劑對特定抗原的結合為背景的至少兩倍且不以顯著量實質上結合於存在於樣品中的其他抗原。在一個實施例中，在指定免疫分析條件下，具有特定結合特異性的抗體或結合劑對特定抗原的結合為 背景的至少十(10)倍且不以顯著量實質上結合於存在於樣品中的其他抗原。在此類條件下特異性結合於抗體或結合劑可能需要抗體或試劑已關於其對特定蛋白質(例如人類GITR)之特異性進行選擇。如本文所用，特異性結合包括選擇性結合於人類GITR之其抗體片段及結合分子，且不包括與例如鼠類GITR分子或其他TNF受體超家族成員交叉反應的抗體。在一些實施例中，選擇與非人類靈長類動物GITR(例如獼猴GITR)交叉反應之抗體或抗體片段。

多種免疫分析形式可以用於選擇與特定蛋白質特異性免疫反應的抗體。舉例而言，固相ELISA免疫分析常規地用於選擇與蛋白質發生特異性免疫反應的抗體(關於可用於測定特異性免疫反應性的免疫分析形式及條件之描述，參見例如Harlow及Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual(1998))。通常，特異性或選擇性結合反應產生的信號為背景信號的至少兩倍且更通常，為背景信號的至少10至100倍。

術語「平衡解離常數(Ko，M」係指解離速率常數(kd，時間^-1)除以締合速率常數(k_a，時間^-1，M^-1)。可使用此項技術中任何已知方法量測平衡解離常數。本發明抗體之平衡解離常數一般小於約10^-7或10^-8M，例如小於約10^-9M或10^-10M，在一些實施例中，小於約10^-11M、10^-12M或10^-13M。在一些實施例中，經分離抗體或抗體片段以約1nM或1nM以下之平衡解離常數(K_D)結合於人類GITR。在一些實施例中，抗體或抗體片段以小於1nM之K_D結合於人類GITR。在一些實施例中，抗體或抗體片段以在約0.5nM至約1.0nM範圍內之K_D結合於人類GITR。

如本文所用，術語「抗原結合區」係指本發明之GITR結合分子中負責分子與GITR之間的特異性結合的域。抗原結合區包括至少一個抗體重鏈可變區及至少一個抗體輕鏈可變區。本發明之各GITR結 合分子中存在至少一個此類抗原結合區，且各抗原結合區可彼此一致或不同。在一些實施例中，本發明之GITR結合分子的抗原結合區中之至少一者充當GITR之促效劑。

術語「抗體促效劑」或「促效劑」可互換地指能夠活化受體以誘導完整或部分受體介導之反應的抗體。舉例而言，GITR之促效劑結合於GITR且誘導GITR介導之胞內信號傳導(例如增加之NF-κB表現活化)。抗體促效劑類似於天然配體GITR-L刺激經由GITR進行之信號傳導。GITR-L與GITR之結合由於IκB降解而誘導NFκB活化。在一些實施例中，GITR抗體促效劑可藉由其結合GITR及誘導T細胞(例如CD8⁺ CTL或CD4⁺ Th細胞)增殖、存活、細胞溶解活性及/或細胞激素產生(例如IFNγ、IL-10、IL-13、TNFα)之能力鑑別或如本文另外所述鑑別。

術語「GITR」或「糖皮質激素誘導之腫瘤壞死因子受體」或「腫瘤壞死因子受體超家族成員18」或「TNFRSF18」可互換地指作為TNF受體超家族之成員的I型跨膜蛋白。GITR以高水準表現於CD4⁺ CD25⁺及活化效應CD4⁺及CD8⁺ T細胞上。GITR之核酸及胺基酸序列已知且以GenBank寄存編號NM_004195.2→NP_004186.1(同功異型物1前驅物；NM_148901.1→NP_683699.1(同功異型物2前驅物)；及NM_148902.1→NP_683700.1(同功異型物3前驅物))公開。亦參見GenBank寄存編號NM_005092→NP_005083.2。結構上，GITR胺基酸序列為I型跨膜蛋白，其為TNF受體超家族之成員，其具有信號肽、包含三個富含半胱胺酸之域(CRD)的細胞外域(ECD)且其全長與Genbank寄存編號NP_004186.1、NP_683699.1、NP_005083.2或NP_005083.2之胺基酸序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。結構上，GITR核酸序列之全長與Genbank寄存編號NM_004195.2、 NM_148901.1、NM_148902.1、NM_005092或SEQ ID NO：1-4之核酸序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。功能上，嚙齒動物GITR之促效作用抑制、至少短暫抑制CD25⁺調節性T細胞(Treg)之活性。GITR促效作用進一步提高免疫活性，例如經活化效應CD4⁺及CD8⁺ T細胞之增殖、存活、細胞激素產生及細胞溶解活性。參見例如Nocentini等人，Eur J Immunol(2007)37：1165-1169；Expert Opin Ther Patents(2007)17(5)：567-757；Shevach及Stephens,Nature Reviews Immunology(2006)6：613-618。

本發明多肽之「活性」指多肽在其天然細胞或組織中之結構、調節或生物化學功能。多肽活性之實例包括直接活性與間接活性。GITR促效作用之例示性活性包括胞內信號傳導，其得到增加之NF-κB活化，經活化效應CD4⁺及CD8⁺ T細胞之增加之增殖、存活、細胞激素產生(例如IFNγ、IL-10、IL-13、TNFα)及細胞溶解活性。在治療學上，GITR之促效作用增強活體內抗腫瘤及抗病毒T細胞反應。

術語「經分離」在用於核酸或蛋白質時表示核酸或蛋白質基本上不含在天然狀態下其所結合之其他細胞組分。其較佳為均質狀態。其可為乾燥或水溶液形式。純度及均質性通常使用諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相層析之分析化學技術來測定。實質上純化作為製劑中存在之主要物質的蛋白質。詳言之，經分離基因與側接該基因且編碼除所關注之基因外之蛋白質的開放閱讀框架分離。術語「經純化」表示核酸或蛋白質基本上在電泳凝膠中產生一個條帶。特定言之，其意謂核酸或蛋白質至少85%純、更佳至少95%純且最佳至少99%純。

術語「核酸」或「聚核苷酸」指脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其單股或雙股形式之聚合物。除非特別限制，否則該術語涵蓋含有天然核苷酸之已知類似物的核酸，該等已知類似物具有與參考 核酸類似之結合特性且以與天然存在之核苷酸類似之方式代謝。除非另外指明，否則特定核酸序列亦隱含地涵蓋其經保守修飾之變異體(例如簡併密碼子取代)、對偶基因、直系同源物、SNP及互補序列以及明確指明之序列。特定言之，簡併密碼子取代可藉由產生如下序列來達成，其中一或多個所選(或所有)密碼子之第三位置經混合鹼基及/或去氧肌苷殘基取代。(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；及Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。

術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換用於指胺基酸殘基之聚合物。該等術語適用於胺基酸聚合物，其中一或多個胺基酸殘基為相應天然存在之胺基酸的人工化學模擬物，以及適用於天然存在之胺基酸聚合物及非天然存在之胺基酸聚合物。

術語「胺基酸」指天然存在及合成之胺基酸，以及以類似於天然存在之胺基酸的方式發揮功能的胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然存在之胺基酸為由遺傳密碼編碼之胺基酸，以及後期經修飾之胺基酸，例如羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸及O-磷絲胺酸。胺基酸類似物指具有與天然存在之胺基酸相同之基本化學結構(亦即α碳結合於氫、羧基、胺基及R基)的化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。此類類似物具有經修飾之R基(例如正白胺酸)或經修飾之肽主鏈，但保留與天然存在之胺基酸相同之基本化學結構。胺基酸模擬物係指具有與胺基酸之一般化學結構不同之結構，但以與天然存在之胺基酸類似之方式發揮功能的化合物。

「經保守修飾之變異體」適用於胺基酸與核酸序列。關於特定核酸序列，經保守修飾之變異體係指編碼一致或基本上一致胺基酸序列之彼等核酸，或其中該核酸不依照基本上一致序列來編碼胺基酸序列。由於遺傳密碼之簡併性，多個功能上一致之核酸編碼任何既定蛋 白質。舉例而言，密碼子GCA、GCC、GCG及GCU均編碼胺基酸丙胺酸。因此，在丙胺酸由密碼子指定之每個位置上，密碼子可變成任一所述相應密碼子而不改變所編碼之多肽。此類核酸變異為「靜默變異」，其為一種經保守修飾之變異。本文中編碼多肽之每個核酸序列亦描述核酸之每種可能靜默變異。熟習此項技術者應認識到核酸中之各密碼子(除通常為甲硫胺酸之唯一密碼子之AUG及通常為色胺酸之唯一密碼子之TGG外)可經修飾以產生功能上一致之分子。因此，編碼多肽之核酸的各靜默變異隱含於各所述序列中。

關於胺基酸序列，熟習此項技術者應認識到改變、添加或缺失編碼序列中之單個胺基酸或較小百分比之胺基酸的核酸、肽、多肽或蛋白質序列的個別取代、缺失或添加為「經保守修飾之變異體」，其中該變化使胺基酸經化學上類似之胺基酸取代。提供功能上類似之胺基酸的保守取代表在此項技術中眾所周知。此類經保守修飾之變異體另外為且不排除本發明之多晶型變異體、種間同源物及對偶基因。

以下八個組各含有彼此保守取代之胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天冬醯胺N)、麩醯胺酸(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)***酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；及8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(參見例如Creighton,Proteins(1984))。

「序列一致性百分比」藉由在比較窗比較兩個最佳比對之序列來測定，其中比較窗中之聚核苷酸序列部分相較於用於最佳比對兩個序列的參考序列(其不包含添加或缺失)(例如本發明之多肽)可包含添加或缺失(亦即空隙)。藉由如下步驟計算百分比：測定兩個序列中存在之一致核酸鹼基或胺基酸殘基的位置數，得到匹配位置數，將匹配位置數除以比較窗中之總位置數且將結果乘以100，得到序列一致性百 分比。

在兩個或兩個以上核酸或多肽序列之情況下，術語「一致」或「一致性」百分比係指兩個或兩個以上序列或子序列為相同序列。如使用以下序列比較算法中之一者或藉由人工比對及目視檢查所量測，當在比較窗或指定區域上比較及比對以獲得最大一致性時，若兩個序列具有指定百分比之相同胺基酸殘基或核苷酸(亦即在指定區域上，或未指定時在整個參考序列上，至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)，則兩個序列為「實質上一致」。本發明提供分別與本文中例示之多肽或聚核苷酸(例如SEQ ID NO：6-10、12、14、59及61中之任一者中所例示的可變區；SEQ ID NO：16-17中之任一者中所例示的可變區段；SEQ ID NO：22-34中之任一者中所例示之CDR；SEQ ID NO：35-50中之任一者中所例示的FR；及SEQ ID NO：51-58及60中之任一者中所例示的核酸序列)實質上一致的多肽或聚核苷酸。視情況，一致性存在於長度為至少約15、25或50個核苷酸之區域上，或更佳長度為100至500或1000個或1000個以上核苷酸之區域上，或參考序列之全長上。關於胺基酸序列，一致性或實質一致性可存在於長度為至少5、10、15或20個胺基酸，視情況長度為至少約25、30、35、40、50、75或100個胺基酸、視情況長度為至少約150、200或250個胺基酸之區域上或參考序列之全長上。關於較短之胺基酸序列，例如具有20個或20個以下之胺基酸的胺基酸序列，實質一致性在一個或兩個胺基酸殘基根據本文中定義之保守取代經保守取代時存在。

為進行序列比較，通常將一個序列充當與測試序列比較之參考序列。當使用序列比較算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦內，必要時指定子序列座標，且指定序列算法程序參數。可使用預設程式參數，或可指定替代參數。基於程式參數，隨後序列比較算法計算測 試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。

如本文所用之「比較窗」包括對選自由20至600、通常約50至約200、更通常約100至約150組成之群的鄰接位置之編號中的任一者之區段的參考，其中在兩個序列經最佳比對後，可將序列與鄰接位置之相同編號之參考序列比較。用於比較之序列比對方法為此項技術中熟知。可藉由如下方法進行最佳序列比對以進行比較，例如Smith及Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c之局部同源算法，Needleman及Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443之同源比對算法，Pearson及Lipman(1988)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85：2444之相似性方法搜尋，此等算法之電腦化實施(Wisconsin Genetics軟體套件，Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)，或手動比對及視覺檢查(參見例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(1995增刊))。

適用於測定序列一致性百分比及序列相似性百分比之兩個算法實例為BLAST及BLAST 2.0算法，其分別描述於Altschul等人，(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402及Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。用於進行BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。此算法包括藉由鑑別查詢序列中之長度W之短字來首先鑑別高評分序列對(HSP)，該等短字在與資料庫序列中相同長度之字比對時匹配或滿足某些正值臨限值分數T。T稱為鄰域字分數臨限值(Altschul等人，同上)。此等初始鄰域字命中者充當用於起始搜尋之種子以尋找含有其之較長HSP。字命中者沿各序列以兩個方向延伸，只要累積比對分數可增加即可。對於核苷酸序列，累積分數使用參數M(一對匹配殘基之獎勵分數；始終>0)及N(失配殘基之罰分；始終<0)計算。對於胺基酸序列，使用計分矩陣計算累積分數。當以下情況時，字命中者沿 各方向之延伸中斷：累積比對分數自其達成之最大值降低量X；累積分數由於一或多個負評分殘基比對之累積而變成0或0以下；或達到任一序列之末端。BLAST算法參數W、T及X確定比對之靈敏性及速度。BLASTN程式(對於核苷酸序列)使用以下作為預設值：字長(W)為11，期望值(E)為10，M=5，N=-4且比較兩個股。對於胺基酸序列，BLASTP程式使用以下作為預設值：字長為3且期望值(E)為10，且BLOSUM62計分矩陣(參見Henikoff及Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)比對(B)為50，期望值(E)為10，M=5，N=-4，且比較兩個股。

BLAST算法亦對兩個序列之間的相似性進行統計學分析(參見例如Karlin及Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。藉由BLAST算法得到之一種相似性量測結果為最小總機率(P(N))，其提供兩個核苷酸或胺基酸序列之間隨機出現匹配之機率的指示。舉例而言，若測試核酸與參考核酸比較時的最小總機率小於約0.2，更佳小於約0.01，且最佳小於約0.001，則認為核酸與參考序列相似。

如下所述，兩個核酸序列或多肽實質上一致的指示為第一核酸所編碼之多肽與針對第二核酸所編碼之多肽產生的抗體具有免疫交叉反應性。因此，多肽通常與第二多肽實質上一致，例如，其中兩個肽僅因保守取代而不同。如下所述，兩個核酸序列實質上一致之另一指示為兩個分子或其補體在嚴格條件下彼此雜交。兩個核酸序列實質上一致之另一指示為可使用相同引子擴增序列。

術語「連接」在用於描述抗原結合區如何連接在本發明之GITR結合分子內的情形下時涵蓋實體上接合該等區域之所有可能方式。諸多抗原結合區由化學鍵(諸如共價鍵(例如肽鍵或二硫鍵)或非共價鍵)頻繁接合，該等化學鍵可為直接鍵(亦即兩個抗原結合區之間無連接 子)或間接鍵(亦即兩個或兩個以上抗原結合區之間藉助於至少一個連接分子)。

術語「個體(subject/individual)」及「患者」可互換地指哺乳動物，例如人類或非人類靈長類哺乳動物。哺乳動物亦可為實驗室哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠。在一些實施例中，哺乳動物可為農用哺乳動物(例如馬、綿羊、牛、豬、駱駝)或馴養哺乳動物(例如犬、貓)。

如本文所使用，術語「治療」任何疾病或病症在一個實施例中係指改善疾病或病症(亦即，減緩或遏制或減少疾病或其至少一個臨床症狀之發展)。在另一實施例中，「治療」係指緩解或改善至少一種身體參數，包括患者可能辨別不出之身體參數。在另一實施例中，「治療」係指在身體上(例如，穩定可辯別之症狀)、生理上(例如穩定身體參數)或其兩方面上調節疾病或病症。在另一實施例中，「治療」係指預防或延遲疾病或病症之發作或發展或進展。

術語「治療上可接受之量」或「治療有效劑量」可互換地指足以實現所要結果(亦即降低腫瘤尺寸、抑制腫瘤生長、預防癌轉移、抑制或預防病毒、細菌、真菌或寄生蟲感染)的量。在一些實施例中，治療上可接受之量不誘導或引起不良副作用。治療上可接受之量可藉由首先投與低劑量、隨後遞增地增加劑量直至達成所要作用來確定。「預防有效劑量」及「治療有效劑量」的本發明之GITR促效抗體可分別預防疾病症狀(包括與癌症或傳染病有關之症狀)之發作或使其嚴重性降低。

術語「共同投與」係指兩種活性劑同時存在於個體之血液中。共同投與之活性劑可同時或依序傳遞。

如本文所用，片語「基本上由……組成」係指方法或組合物中所包括之活性藥劑的屬類或種類，以及用於方法或組合物之預定目的 的任何非活性載劑或賦形劑。在一些實施例中，片語「基本上由……組成」明確排除包括一或多種除本發明之促效抗GITR抗體以外的其他活性劑。在一些實施例中，片語「基本上由……組成」明確排除包括一或多種除本發明之促效抗GITR抗體及第二共同投與藥劑以外的其他活性劑。

術語「癌症相關抗原」或「腫瘤相關抗原」或「腫瘤特異性標記物」或「腫瘤標記物」可互換地指相較於正常細胞偏好表現於癌細胞之表面上的分子(通常蛋白質、碳水化合物或脂質)，且其適用於藥理學藥劑偏好靶向癌細胞。時常，癌症相關抗原為相較於正常細胞在癌細胞中過度表現之細胞表面分子，例如相較於正常細胞1倍過度表現、2倍過度表現、3倍或3倍以上過度表現。時常，癌症相關抗原為癌細胞中不適當合成之細胞表面分子，例如相較於正常細胞上表現之分子含有缺失、添加或突變之分子。時常，癌症相關抗原僅表現於癌細胞之細胞表面上且不合成或表現於正常細胞之表面上。例示性細胞表面腫瘤標記物包括蛋白質c-erbB-2及人類表皮生長因子受體(HER)(乳癌)、PSMA(***癌)及碳水化合物黏液素(多種癌症(包括乳癌、卵巢癌及結腸直腸癌)中)。

如本文所用，關於抗原結合部分(例如Fab)之術語「第一」、「第二」、「第三」及「第四」在存在超過一個各部分時用於便利地辨別。除非另外說明，否則此等術語之使用不欲賦予抗體之特定次序或取向。

除非上下文明確指示，否則術語「一(a/an)」及「該」包括複數個指示物。

促效抗GITR抗體

本發明提供如下抗體、抗體片段及抗原結合分子，其結合於GITR且刺激經由GITR進行之信號傳導及/或在活體內誘導加強之免疫 反應。抗體、抗體片段及抗原結合分子可用於提高針對標靶抗原之CD4+ T輔助細胞(Th)及/或CD8+細胞溶解性T淋巴細胞(CTL)反應其亦可用於治療如下疾病病狀，其發展可藉由有效免疫反應逆轉或抑制，包括癌症及感染性疾病。

本發明之抗體、抗體片段及抗原結合分子展示欲用於人類患者中之適合特性，例如其具有免疫原性問題之低風險以用於人類(除結合特異性決定區(BSD)、尤其至少CDR3外，其由人類生殖系核酸序列編碼)；對GITR具有高親和力(例如K_D為至少小於1nM)；不與TNFR超家族之其他成員交叉反應；與人類及非人類靈長類動物GITR交叉反應；且以低劑量促進GITR信號傳導(例如在活體外分析中以小於3nM之濃度)。整個說明書中亦展現其他活性及特徵。

因此，本發明提供作為GITR之促效劑的抗體、抗體片段及抗原結合分子。所提供之抗GITR抗體、抗體片段或抗原結合分子含有源自起始或參考單株抗體(例如以下表1及表2中所述之抗體)之重鏈及輕鏈的CDR3內的最小結合序列決定子(BSD)。重鏈及輕鏈可變區之其餘序列(CDR及FR)(例如V區及J區)來自相應人類生殖系及親和力成熟胺基酸序列。V區可選自人類V區庫。進一步序列改進可藉由親和力成熟或此項技術中已知之其他方法完成以使結合活性或本發明之抗體、抗體片段或抗原結合分子之活性達最佳。

在另一實施例中，抗GITR抗體之重鏈及輕鏈或抗體片段含有例如選自人類V區庫之來自相應人類生殖系序列之人類V區(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3)，及來自起始單株抗體(例如表1及表2中所述之抗體)之CDR3-FR4序列區段。CDR3-FR4序列區段可藉由用相應人類生殖系序列置換序列區段及/或藉由親和力成熟而進一步改進。舉例而言，可用相應人類生殖系序列置換BSD周圍之FR4及/或CDR3序列，同時保留來自起始單株抗體之CDR3的BSD。

在一些實施例中，重鏈V區之相應人類生殖系序列為VH3 3-13/30：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK(SEQ ID NO：89)。在一個實施例中，SEQ ID NO：89中之最後一個胺基酸離胺酸(「K」)經精胺酸(「R」)取代。在一些實施例中，重鏈J區之相應人類生殖系序列為JH4。在一些實施例中，重鏈J區包含人類生殖系JH4部分序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：90)。來自人類生殖系JH4之全長J區為YFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：91)。根據免疫球蛋白可變區基因之標準命名法提及可變區基因。當前免疫球蛋白基因資訊可經由全球資訊網例如於ImMunoGeneTics(IMGT)、V-base及PubMed資料庫上獲得。亦參見Lefranc,Exp Clin Immunogenet.2001；18(2)：100-16；Lefranc,Exp Clin Immunogenet.2001；18(3)：161-74；Exp Clin Immunogenet.2001；18(4)：242-54；及Giudicelli等人，Nucleic Acids Res.2005年1月1日；33(資料庫專刊)：D256-61。

在一些實施例中，輕鏈V區之相應人類生殖系序列為VKIII L16/A27：EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSP(SEQ ID NO：92)。在一些實施例中，輕鏈J區之相應人類生殖系序列為JK2。在一些實施例中，輕鏈J區包含人類生殖系Jk2部分序列FGQGTKLEIK(SEQ ID NO：93)。來自人類生殖系Jk2之全長J區為YTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：94)。

在一些實施例中，重鏈V區與如下胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性：(E/Q)VQLVESGGGLVQ(P/S)GGSLRLSCAASGFSLSSYGVDWVRQAPGKGLEW(L/V)GVIWGGGGTYY(A/T)(A/S)S(L/V)M(A/G)RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA(K/R)(H/N)AYGHDGGFAMDYWGQ GTLVTVSS(SEQ ID NO：16)。

在一些實施例中，輕鏈V區與如下胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性：EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRAS(E/Q)SVSSN(L/V)AWYQQ(K/R)PGQAPRLLIYGASNRATGIP(D/A)RFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCGQSYSYPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：17)。

在一些實施例中，i)重鏈CDR3包含胺基酸序列HAYGHDGGFAMDY(SEQ ID NO：29)或NAYGHDGGFAMDY(SEQ ID NO：109)；且ii)輕鏈CDR3可變區包含胺基酸序列GQSYSYPFT(SEQ ID NO：34)或SYSYPF(SEQ ID NO：83)。

在一些實施例中，本發明之抗體或抗體片段包含重鏈可變區，其包含有包含胺基酸序列SYGVD(SEQ ID NO：22)或GFSLSSY(SEQ ID NO：84)之CDR1；包含胺基酸序列VIWGGGGTYY(A/T)(A/S)S(L/V)M(A/G)(SEQ ID NO：28)或WGGGG(SEQ ID NO：80)之CDR2；及包含HAYGHDGGFAMDY(SEQ ID NO：29)或NAYGHDGGFAMDY(SEQ ID NO：109)之胺基酸序列的CDR3。

在一些實施例中，本發明之抗體或抗體片段包含輕鏈可變區，其包含有包含胺基酸序列RAS(E/Q)SVSSN(L/V)A(SEQ ID NO：32)或S(E/Q)SVSSN(SEQ ID NO：87)之CDR1；包含胺基酸序列GASNRAT(SEQ ID NO：33)或GAS(SEQ ID NO：82)之CDR2；及包含GQSYSYPFT(SEQ ID NO：34)或SYSYPF(SEQ ID NO：83)之胺基酸序列的CDR3。

在一些實施例中，本發明之抗體或抗體片段包含重鏈可變區，其包含有包含胺基酸序列SYGVD(SEQ ID NO：22)或GFSLSSY(SEQ ID NO：84)之CDR1；包含胺基酸序列VIWGGGGTYY(A/T)(A/S)S(L/V)M(A/G)(SEQ ID NO：28)或WGGGG (SEQ ID NO：80)之CDR2；及包含HAYGHDGGFAMDY(SEQ ID NO：29)或NAYGHDGGFAMDY(SEQ ID NO：109)之胺基酸序列的CDR3。本發明之此類抗體或抗體片段進一步包含輕鏈可變區，其包含有包含胺基酸序列RAS(E/Q)SVSSN(L/V)A(SEQ ID NO：32)或S(E/Q)SVSSN(SEQ ID NO：87)之CDR1；包含GASNRAT(SEQ ID NO：33)或GAS(SEQ ID NO：82)之CDR2；及包含GQSYSYPFT(SEQ ID NO：34)或SYSYPF(SEQ ID NO：83)之胺基酸序列的CDR3。

在一些實施例中，本發明之抗體或抗體片段包含重鏈可變區，其包含有包含胺基酸序列SYGVD(SEQ ID NO：22)或GFSLRSY(SEQ ID NO：79)之CDR1；包含胺基酸序列VIWGGGGTNYNSALMA(SEQ ID NO：62)或WGGGG(SEQ ID NO：80)之CDR2；及包含HAYGHDGGFAMDY(SEQ ID NO：29)或NAYGHDGGFAMDY(SEQ ID NO：109)之胺基酸序列的CDR3。在一些實施例中，抗體或抗體片段經人類化。

在一些實施例中，本發明之抗體或抗體片段包含輕鏈可變區，其包含有包含胺基酸序列KASENVDTFVS(SEQ ID NO：63)或SENVDTF(SEQ ID NO：81)之CDR1；包含胺基酸序列GASNRYT(SEQ ID NO：64)或GAS(SEQ ID NO：82)之CDR2；及包含GQSYSYPFT(SEQ ID NO：34)或SYSYPF(SEQ ID NO：83)之胺基酸序列的CDR3。在一些實施例中，抗體或抗體片段經人類化。

在一些實施例中，本發明之抗體或抗體片段包含重鏈可變區，其包含有包含胺基酸序列SYGVD(SEQ ID NO：22)或GFSLRSY(SEQ ID NO：79)之CDR1；包含胺基酸序列VIWGGGGTNYNSALMA(SEQ ID NO：62)或WGGGG(SEQ ID NO：80)之CDR2；及包含HAYGHDGGFAMDY(SEQ ID NO：29)或NAYGHDGGFAMDY(SEQ ID NO：109)之胺基酸序列的CDR3。此類抗體或抗體片段進一步包含輕鏈 可變區，其包含有包含胺基酸序列KASENVDTFVS(SEQ ID NO：63)或SENVDTF(SEQ ID NO：81)之CDR1；包含胺基酸序列GASNRYT(SEQ ID NO：64)或GAS(SEQ ID NO：82)之CDR2；及包含GQSYSYPFT(SEQ ID NO：34)或SYSYPF(SEQ ID NO：83)之胺基酸序列的CDR3。在一些實施例中，抗體或抗體片段經人類化。

在一些實施例中，重鏈可變區包含有包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的FR1；包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的FR2；包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的FR3；及包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的FR4。在一些實施例中，重鏈可變區包含有包含選自SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：36之胺基酸序列的FR1；包含選自SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39之胺基酸序列的FR2；包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的FR3；及包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的FR4。所鑑別之胺基酸序列可具有一或多個經取代之胺基酸(例如來自親和力成熟)或一個或兩個經保守取代之胺基酸。

在一些實施例中，輕鏈可變區包含有包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的FR1；包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的FR2；包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列的FR3；及包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的FR4。在一些實施例中，輕鏈可變區包含有包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的FR1；包含選自SEQ ID NO：44及SEQ ID NO：45之胺基酸序列的FR2；包含選自SEQ ID NO：47及SEQ ID NO：48之胺基酸序列的FR3；及包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的FR4。所鑑別之胺基酸序列可具有一或多個經取代之胺基酸(例如來自親和力成熟)或一個或兩個經保守取代之胺基酸。

本發明之抗GITR抗體的可變區在其全長上與相應人類生殖系可變區胺基酸序列一般具有至少約85%(例如至少約85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)之整 個可變區(例如FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)胺基酸序列一致性。舉例而言，抗GITR抗體之重鏈可與人類生殖系可變區EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK-YFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：89及91)(VH3 3-13/30+CDR3+JH4，連字符表示CDR3，其長度可為可變的)具有至少約85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性。在一個實施例中，SEQ ID NO：89中之最後一個胺基酸離胺酸(K)經精胺酸(R)取代。抗GITR抗體之輕鏈可與人類生殖系可變區EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC-YTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：98及94)(VKIII L16/A27+CDR3+JK2；連字符表示CDR3，其長度可為可變的)具有至少約85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性。在一些實施例中，僅構架區內之胺基酸經添加、缺失或取代。在一些實施例中，序列一致性比較排除CDR3。

表1中所列抗體之CDR可藉由此項技術中已知之熟知編號系統(包括本文所述之編號系統)確定。表2列出藉由如下方法定義之CDR：(1)使用Kabat等人，(1991),「Sequences of Proteins of Immunological Interest，」第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(「Kabat」編號方案)，NIH公開號91-3242中所述之編號系統；及(2)Chothia，參見Al-Lazikani等人，(1997)「Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins,」J.Mol.Biol.273：927-948。

在一些實施例中，結合於SEQ ID NO：4之本發明之抗GITR抗體或抗體片段係選自以下中之任一者：i)如下抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中：重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：23，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：29，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：30，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33，且輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34；ii)如下抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中：重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：24，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：29，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：31，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33，且輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34；iii)如下抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中：重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：25，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：29，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：30，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33，且輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34；iv)如下抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中：重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：26，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：29，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：30，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33，且輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34；v)如下抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中：重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：27，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：29，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：30，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33，且輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34；及vi)如下抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中：重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22，重鏈CDR2包含SEQ ID NO：25，重鏈CDR3包含SEQ ID NO：109，輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：30，輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33，且輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34。在一些實施例中，抗體或抗體片段經人類化。在特定實施例中，抗體或抗體片段包含人類恆定區。在一些實施例中，抗體或抗體片段包含IgG Fc區。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段經糖基化。在一些實施例中，抗體或抗體片段經修飾或表現於經修飾之細胞中，其中此類修飾使抗體或抗體片段之FcR效應功能增加。在某些實施例中，抗體或抗原片段在活體內誘導提高之Teff；Treg比率。在一些實施例中，抗體或抗體片段在活體內誘導加強之免疫反應。在一些實施例中，在抗體或抗體片段與第二抗體或抗體片段交聯時，其為SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之促效劑。

在一些實施例中，本發明之抗GITR抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO：16之重鏈可變區具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的重鏈可變區，且包含與SEQ ID NO：17之輕鏈可變區具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的輕鏈可變區。

在一些實施例中，本發明之抗GITR抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO：6之重鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的重鏈可變區，且包含與SEQ ID NO：7之輕鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的輕鏈可變區。

在一些實施例中，本發明之抗GITR抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO：8之重鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的重鏈可變區，且包含與SEQ ID NO：9之輕鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的輕鏈可變區。

在一些實施例中，本發明之抗GITR抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO：10之重鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的重鏈可變區，且包含與SEQ ID NO：7之輕鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的輕鏈可變區。

在一些實施例中，本發明之抗GITR抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO：12之重鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的重鏈可變區，且包含與SEQ ID NO：7之輕鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的輕鏈可變區。

在一些實施例中，本發明之抗GITR抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO：14之重鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的重鏈多肽，且包含與SEQ ID NO：7之輕鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的輕鏈多肽。

在一些實施例中，本發明之抗GITR抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO：99之重鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的重鏈可變區，且包含與SEQ ID NO：7之輕鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的輕鏈可變區。

在一些實施例中，本發明之抗GITR抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO：105之重鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的重鏈可變區，且包含與SEQ ID NO：7之輕鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的輕鏈可變區。

在一些實施例中，本發明之抗GITR抗體或抗體片段包含與SEQ ID NO：61之重鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的重鏈多肽，且包含與SEQ ID NO：59之輕鏈可變區具有至少90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的輕鏈多肽。

在一些實施例中，此類抗體為人類或人類化抗體。VH、VL、全長輕鏈及全長重鏈序列(胺基酸序列及編碼胺基酸序列之核苷酸序列)可「混合且匹配」以產生其他結合GITR之本發明抗體。此類經「混合且匹配」之結合GITR之抗體可使用此項技術中已知之結合分析(例如ELISA及實例部分所述之其他分析)測試以確認活性。當鏈經混合且匹配時，自特定VH/VL配對之VH序列應用結構上類似之VH序列置換。同樣，來自特定全長重鏈/全長輕鏈配對之全長重鏈序列應經結構上類似之全長重鏈序列置換。同樣，自特定VH/VL配對之VL序列應用結構上類似之VL序列置換。同樣，自特定全長重鏈/全長輕鏈配對之全長輕鏈序列應用結構上類似之全長輕鏈序列置換。因此，在一個態樣中，本發明提供一種經分離單株抗體或抗體片段，其具有：包含選自由SEQ ID NO：6、8、10、12、14、99及105組成之群的胺基酸序列的重鏈可變區；及包含選自由SEQ ID NO：7及9組成之群的胺基酸序列的輕鏈可變區；其中該抗體特異性結合於GITR。

在一些實施例中，本發明之抗GITR抗體或抗體片段包含與選自SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：100及SEQ ID NO：106中之任一者的重鏈序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的重鏈多肽；且包含與SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：70之輕鏈具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的輕鏈多肽。在某些實施例中，本發明之抗GITR抗體或抗體片段包含選自SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：100及SEQ ID NO：106中之任一者的重鏈 多肽；且包含SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：70之輕鏈多肽。

為鑑別長度小於20個胺基酸之胺基酸序列，可容許一或兩個保守胺基酸殘基取代，同時仍保留所要特定結合及/或促效活性。

本發明之抗GITR抗體及抗體片段一般以例如小於約10^-8M或10^-9M或小於約10^-10M或10^-11M，且在一些實施例中，小於約10^-12M或10^-13M之平衡解離常數(K_D)結合GITR，包括同功異型物1、同功異型物2及同功異型物3。

結合於相同抗原決定基之抗體

本發明提供結合於人類GITR之殘基41-65內之抗原決定基的抗體及抗體片段，其中此類抗體及抗體片段為GITR之促效劑。本發明亦提供與表1中所述之結合GITR之抗體結合於相同抗原決定基的抗體及抗體片段。因此，其他抗體及抗體片段可基於其在GITR結合分析中與本發明之其他抗體交叉競爭(例如以統計學上顯著之方式競爭性抑制其結合)的能力鑑別。測試抗體抑制本發明之抗體及抗體片段與GITR蛋白(例如人類GITR)之結合的能力展現測試抗體可與結合於GITR之抗體或抗體片段競爭；此類抗體可根據非限制性理論結合於GITR蛋白上與其所競爭之抗體或抗體片段相同或相關(例如結構上類似或空間上接近)的抗原決定基。在某一實施例中，結合於GITR上與本發明之抗體或抗體片段相同之抗原決定基的抗體為人類或人類化單株抗體。此類人類或人類化單株抗體可如本文所述製備及分離。

經工程改造及經修飾之抗體

此外，本發明之抗體或抗體片段可使用具有本文(例如表1)所示之CDR及/或VH及/或VL序列中之一或多者的抗體作為起始物質製備以工程改造經修飾之抗體或抗體片段，該經修飾之抗體可相較於起始抗體具有改變之特性。抗體或抗體片段可藉由修飾一或兩個可變區(亦即VH及/或VL)內(例如一或多個CDR區內及/或一或多個構架區內) 之一或多個殘基工程改造。另外或替代地，抗體或抗體片段可藉由修飾恆定區內之殘基工程改造以例如改變抗體之效應功能。

可進行之可變區工程改造之一種類型為CDR移植。抗體主要經由位於六個重鏈及輕鏈互補決定區(CDR)中的胺基酸殘基與標靶抗原相互作用。出於此原因，與CDR外之序列相比，CDR內之胺基酸序列在個別抗體之間更多樣化。由於CDR序列負責大多數之抗體-抗原相互作用，故可藉由建構如下表現載體來表現模擬特定抗體之特性的重組抗體，其包括來自特定抗體之CDR序列，該CDR序列移植於來自具有不同特性之不同抗體的構架序列上(參見例如Riechmann,L.等人，1998 Nature 332：323-327；Jones,P.等人，1986 Nature 321：522-525；Queen,C.等人，1989 Proc.Natl.Acad.,U.S.A.86：10029-10033；Winter之美國專利第5,225,539號，及Queen等人之美國專利第5,530,101號；第5,585,089號；第5,693,762號及第6,180,370號)。

因此，本發明之另一實施例係關於一種經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區，其分別包含具有選自由SEQ ID NO：22、79及84組成之群的胺基酸序列的CDR1序列；具有選自由SEQ ID NO：23、24、25、26、27、62及80組成之群的胺基酸序列的CDR2序列；具有選自由SEQ ID NO：29、34及109組成之群的胺基酸序列的CDR3序列；及輕鏈可變區，其分別包含具有選自由SEQ ID NO：30、31、63、81、85及86組成之群的胺基酸序列的CDR1序列；具有選自由SEQ ID NO：33、64及82組成之群的胺基酸序列的CDR2序列；及由選自由SEQ ID NO：34及83組成之群的胺基酸序列組成的CDR3序列。因此，此類抗體含有單株抗體之VH及VL CDR序列，又可含有來自此等抗體之不同構架序列。在某些實施例中，經分離抗體或抗體片段包含與此段落中之相應序列具有至少約85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之胺基酸序列一致 性的序列。

此類構架序列可獲自公共DNA資料庫或公開文獻，其包括生殖系抗體基因序列。舉例而言，人類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖系DNA序列可見於「VBase」人類生殖系序列資料庫(可在網際網路之www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上獲得)以及Kabat,E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開號91-3242；Tomlinson,I.M.等人，1992 J.fol.Biol.227：776-798；及Cox,J.P.L.等人，1994Eur.J Immunol.24：827-836。

用於本發明抗體之構架序列的實例為結構上類似於本發明所選抗體所用之構架序列(例如本發明單株抗體所用之共同序列及/或構架序列)的構架序列。VH CDR1、2及3序列及VL CDR1、2及3序列可移植於構架區上，該等構架區具有與獲得構架序列之生殖系免疫球蛋白基因中所發現之序列一致的序列，或CDR序列可移植於與生殖系序列相比含有一或多種突變之構架區上。舉例而言，已發現，在某些情況下，構架區內之殘基突變有益於維持或提高抗體之抗原結合能力(參見例如Queen等人之美國專利第5,530,101號；第5,585,089號；第5,693,762號及第6,180,370號)。

可變區修飾之另一類型為使VH及/或VL CDR1、CDR2及/或CDR3區內的胺基酸殘基發生突變，從而改良所關注之抗體之一或多種結合特性(例如親和力)，此稱為「親和力成熟」。可進行定點突變誘發或PCR介導之突變誘發以引入突變，且可在如本文所述及實例中提供的活體外或活體內分析及/或此項技術中已知之替代方案或其他分析中評估對抗體結合或其他所關注之功能特性之作用。可引入保守修飾。突變可為胺基酸取代、添加或缺失。此外，通常，在CDR區內不超過一個、兩個、三個、四個或五個殘基改變。

本發明之經工程改造之抗體或抗體片段包括如下抗體或抗體片段，其中對VH及/或VL內之構架殘基進行修飾例如以改良抗體之特性。典型地進行此類構架修飾以降低抗體之免疫原性。舉例而言，一種方法為使一或多個構架殘基「回復突變」成相應生殖系序列。更特定言之，已進行體細胞突變之抗體可含有不同於獲得抗體之生殖系序列的構架殘基。此類殘基可藉由比較抗體構架序列與獲得抗體之生殖系序列來鑑別。為使構架區序列恢復其生殖系構型，體細胞突變可藉由例如定點突變誘發「回復突變」為生殖系序列。本發明亦意欲涵蓋此類「回復突變」抗體。

構架修飾之另一類型包括使構架區內，或甚至一或多個CDR區內之一或多個殘基突變，以移除T細胞抗原決定基，從而降低抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱為「去免疫」，且進一步詳細描述於Carr等人之美國專利公開案第20030153043號中。

在存在時，視需要，抗GITR抗體或抗體片段之恆定區可為任何類型或次型，且可經選擇而來自藉由本發明方法治療之個體的物種(例如人類、非人類靈長類動物或其他哺乳動物，例如農用哺乳動物(例如馬、綿羊、牛、豬、駱駝)、馴養哺乳動物(例如犬、貓)或嚙齒動物(例如大鼠、小鼠、倉鼠、兔))。在一些實施例中，抗GITR抗體經工程改造以產生人類化或Humaneered®抗體。在一些實施例中，恆定區同型為IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。在某些實施例中，恆定區同型為IgG₁。

除構架或CDR區內進行之修飾以外或替代該等修飾，本發明之抗體或抗體片段可經工程改造以包括Fc區內之修飾，通常以改變抗體之一或多個功能特性，諸如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。此外，本發明之抗體或抗體片段可經化學修飾(例如一或多個化學部分可連接於抗體)或經修飾以改變其糖基化以再 次改變抗體或抗體片段之一或多個功能特性。

在一個實施例中，CH1之鉸鏈區經修飾以使得鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數改變，例如增加或減少。此方法進一步描述於Bodmer等人之美國專利第5,677,425號中。改變CH1之鉸鏈區中半胱胺酸殘基之數目以例如便於組裝輕鏈及重鏈或提高或降低抗體或抗體片段之穩定性。

在另一實施例中，抗體之Fc鉸鏈區經突變以改變抗體之生物半衰期。更特定言之，將一或多個胺基酸突變引入Fc鉸鏈片段之CH2-CH3域界面區以使得抗體對葡萄球菌蛋白A(Staphylococcyl protein A；SpA)之結合相對於天然Fc鉸鏈域SpA結合減弱。此方法進一步詳細描述於Ward等人之美國專利第6,165,745號中。

在另一實施例中，抗體經修飾以提高其生物半衰期。可使用各種方法。舉例而言，可引入以下突變中之一或多者：如Ward之美國專利第6,277,375號中所述之T252L、T254S、T256F。或者，為延長生物半衰期，抗體可在CH1或CL區內改變以含有獲自IgG之Fc區之CH2域的兩個環的救助受體結合抗原決定基，如Presta等人之美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所述。

在其他實施例中，Fc區藉由用不同胺基酸殘基置換至少一個胺基酸殘基來改變，以改變抗體之效應功能。舉例而言，一或多個胺基酸可經不同胺基酸殘基置換以使得該抗體具有改變之針對效應子配體的親和力，但保留親本抗體之抗原結合能力。親和力改變之效應子配體可為例如Fc受體(FcR)或補體之C1組分。此方法進一步詳細描述於Winter等人之美國專利第5,624,821號與第5,648,260號中。

在另一實施例中，一或多個選自胺基酸殘基之胺基酸可經不同胺基酸殘基置換，以使得抗體具有改變之C1q結合及/或降低或消除之補體依賴性細胞毒性(CDC)。此方法進一步詳細描述於Idusogie等人 之美國專利第6,194,551號中。

含有此類突變之抗體介導降低或無抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)。在一些實施例中，IgG1恆定區之胺基酸殘基L234及L235取代為Ala234及Ala235。在一些實施例中，IgG1恆定區之胺基酸殘基N267取代為Ala267。

在另一實施例中，一或多個胺基酸殘基經改變以從而改變抗體固定補體之能力。此方法進一步描述於Bodmer等人之PCT公開案WO 94/29351中。

在另一實施例中，Fc區經修飾以提高抗體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之能力及/或藉由修飾一或多個胺基酸來提高抗體對Fcγ受體之親和力。此方法進一步描述於Presta之PCT公開案WO 00/42072中。此外，已定位人類IgG1上對FcγR1、FcγRII、FcγRIII及FcRn之結合位點且已描述具有改良之結合的變異體(參見Shields,R.L.等人，2001 J.Biol.Chen.276：6591-6604)。

在另一實施例中，抗體之糖基化經修飾。舉例而言，可製備去糖基化抗體(意即，缺乏糖基化之抗體)。糖基化可經改變以例如提高抗體對「抗原」之親和力。此類碳水化合物修飾可藉由例如改變抗體序列內之一或多個糖基化位點來完成。舉例而言，可進行一或多個胺基酸取代，從而去除一或多個可變區構架糖基化位點，從而去除該位點處之糖基化。此類去糖基化可提高抗體對抗原之親和力。此類方法進一步詳細描述於Co等人之美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中。

另外或替代地，可製得具有改變類型之糖基化的抗體，諸如具有降低量之海藻糖基殘基之低海藻糖基化抗體或具有增加之二等分GlcNac結構之抗體。此類改變之糖基化模式已展示會提高抗體之ADCC能力。此類碳水化合物修飾可藉由例如在糖基化機構改變之宿 主細胞中表現抗體來完成。具有經改變之糖基化機構之細胞已描述於此項技術中，且可用作表現本發明之重組抗體從而產生具有經改變之糖基化之抗體的宿主細胞。舉例而言，Hang等人之EP 1,176,195描述一種細胞株，其中編碼海藻糖基轉移酶之FUT8基因在功能上被破壞，使得此類細胞株中所表現之抗體展現低海藻糖基化。Presta之PCT公開案WO 03/035835描述一種變異型CHO細胞株Lecl3細胞，其使海藻糖連接至Asn(297)所連碳水化合物之能力降低，亦導致該宿主細胞中所表現之抗體發生低海藻糖基化(亦參見Shields,R.L.等人，2002 J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人之PCT公開案WO 99/54342描述經工程改造以表現醣蛋白修飾型醣基轉移酶(例如β(1,4)-N乙醯基葡糖胺轉移酶III(GnTIII))的細胞株，使得經工程改造之細胞株內所表現之抗體展現增加之二分GlcNac結構，從而提高抗體之ADCC活性(亦參見Umana等人，1999 Nat.Biotech.17：176-180)。

抗原結合域移植至替代構架或骨架中

可使用多種抗體/免疫球蛋白構架或骨架，只要所得多肽包括特異性結合於GITR之至少一個結合區即可。此類構架或骨架包括人類免疫球蛋白之5種主要個體基因型或其片段，且包括其他動物物種之免疫球蛋白，其較佳具有人類化態樣。就此而言，單一重鏈抗體(諸如在駱駝中所鑑別之單一重鏈抗體)備受關注。熟習此項技術者繼續發現及開發新穎的構架、骨架及片段。

在一個態樣中，本發明係關於使用上面可移植本發明之CDR的非免疫球蛋白骨架產生基於非免疫球蛋白之抗體。可使用已知或未來的非免疫球蛋白構架及骨架，只要其包含特異性針對標靶GITR蛋白(例如人類及/或獼猴GITR)之結合區即可。已知非免疫球蛋白構架或骨架包括(但不限於)纖維結合蛋白(Compound Therapeutics,Inc.,Waltham，MA)、錨蛋白(Molecular Partners AG,Zurich, Switzerland)、域抗體(Domantis,Ltd.,Cambridge,MA及Ablynx nv,Zwijnaarde,Belgium)、脂質運載蛋白(Pieris Proteolab AG,Freising,Germany)、小模組免疫藥物(Trubion Pharmaceuticals Inc.,Seattle,WA)、最大抗體(Avidia,Inc.,Mountain View,CA)、蛋白A(Affibody AG,Sweden)及阿菲林(affilin)(γ-晶狀體球蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH,Halle,Germany)。

纖維結合蛋白骨架係基於纖維結合蛋白III型域(例如纖維結合蛋白III型之第十模組(10 Fn3域))。纖維結合蛋白III型域具有分佈在兩個β片之間的7或8個β股，其自身彼此間填塞而形成蛋白質之核心，且進一步含有使β股彼此間連接且暴露於溶劑的環(與CDR類似)。在β片夾層結構之各邊緣處存在至少三個此類環，其中邊緣為蛋白質垂直於β股方向之邊界(參見US 6,818,418)。此等基於纖維結合蛋白之骨架不為免疫球蛋白，然而總體摺疊與包含駱駝及駱馬IgG之完整抗原識別單元之最小功能抗體片段(重鏈可變區)之摺疊密切相關。由於此結構，故非免疫球蛋白抗體模擬在性質及親和力上與抗體類似之抗原結合特性。類似於活體內抗體親和力成熟方法，活體外環隨機化及改組策略中可使用此等骨架。此等基於纖維結合蛋白之分子可用作骨架，其中分子之環區域可使用標準選殖技術用本發明之CDR置換。

錨蛋白技術係基於使用其中以來源於錨蛋白之重複模組作為承載可用於結合於不同標靶之可變區之骨架的蛋白質。錨蛋白重複模組為一種由兩個逆平行α螺旋及β轉彎組成之33個胺基酸多肽。可變區之結合主要藉由使用核糖體呈現來最佳化。

高親和性多聚體來源於天然含A域蛋白，諸如LRP-1。此等域本質上用於蛋白質-蛋白質相互作用，且在人類中逾250種蛋白質在結構上係基於A域。高親和性多聚體係由多個不同「A域」單體(2-10個)經由胺基酸連接子連接而組成。可結合於靶抗原的高親和性多聚體可使 用例如美國專利申請公開案第20040175756號、第20050053973號、第20050048512號及第20060008844號中所述之方法產生。

親和抗體親和性配位體為由三螺旋束組成的小型簡單蛋白質，該三螺旋束係基於蛋白質A之IgG結合域中之一者的骨架。蛋白A為來自細菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的表面蛋白。此骨架域係由58個胺基酸組成，其中13個隨機化以產生具有許多配體變異體之親和抗體庫(參見例如US 5,831,012)。親和抗體分子模擬抗體，與分子量為150kDa之抗體相比，其分子量為6kDa。儘管親和抗體分子具有小尺寸，但親和抗體分子之結合位點類似於抗體之結合位點。

抗運載蛋白(Anticalins)為Pieris ProteoLab AG公司開發之產品。其來源於脂質運載蛋白(一組廣泛的小型穩定蛋白質，其通常涉及化學敏感或不溶化合物之生理學運輸或儲存)。若干種天然脂質運載蛋白出現於人類組織或體液中。蛋白質架構使人聯想到免疫球蛋白，其中高變環位於剛性構架上。然而，與抗體或其重組片段相比，脂質運載蛋白由具有160至180個胺基酸殘基之單一多肽鏈組成，該多肽鏈僅略大於單一免疫球蛋白域。一組構成結合袋之四個環展示明顯的結構可塑性且包容多個側鏈。結合位點因此可以專有方法再成形以利用高親和性及特異性識別不同形狀之指定標靶分子。大菜粉蝶(Pieris Brassicae)之後膽色素結合蛋白(bilin-binding protein；BBP)，脂質運載蛋白家族中之一種蛋白質，已用於藉由對該組四個環進行突變誘發來開發抗運載蛋白。描述抗運載蛋白之專利申請案之一個實例存在於PCT公開案第WO 1999/16873號中。

阿菲林分子為小型非免疫球蛋白蛋白質，其經設計而對蛋白質及小分子具特異性親和力。新阿菲林分子可極快速地選自兩個庫，各庫均基於不同的源自人類之骨架蛋白。阿菲林分子對免疫球蛋白蛋白質不展示任何結構同源性。目前使用兩種阿菲林骨架，其一為γ結晶 體(人類結構性眼晶狀體蛋白質)，且另一者為「泛素」超家族蛋白質。兩種人類骨架均極小，展示高溫穩定性且對pH值變化及變性劑幾乎具有抗性。此高穩定性主要歸因於蛋白質之β片結構擴大。源自γ結晶體之蛋白質的實例描述於WO200104144中且「泛素樣」蛋白之實例描述於WO2004106368中。

蛋白質抗原決定基模擬物(PEM)為模擬蛋白質之β髮夾二級結構(涉及蛋白質-蛋白質相互作用的主要二級結構)的中等尺寸、環狀、肽樣分子(MW 1-2kDa)。

人類或人類化抗體

本發明提供特異性結合於GITR蛋白(例如人類GITR)之經工程改造之人類抗體。相較於嵌合、靈長類化或人類化抗體，當向人類個體投與時，本發明之人類GITR結合抗體之抗原性進一步降低。

人類GITR結合抗體可使用此項技術中已知之方法產生。舉例而言，使用Humaneered^®技術平台(KaloBios,Sout San Francisco,CA)將非人類抗體轉化為經工程改造之人類抗體。美國專利公開案第20050008625號描述用人類可變區置換抗體中之非人類抗體可變區同時相對於非人類抗體維持相同或提供較佳結合特徵的活體內方法。該方法依賴於抗原決定基引導之用全人類抗體對非人類參考抗體之可變區的置換。所得人類抗體一般在結構上與參考非人類抗體不相關，但與參考抗體結合同一抗原上之同一抗原決定基。

本發明之抗GITR抗體係基於經工程改造之人類抗體，其中V區序列與人類生殖系V區序列具有實質性胺基酸序列一致性，同時保留參考抗體之特異性及親和力。參見美國專利公開案第2005/0255552號及美國專利公開案第2006/0134098號，其均特此以引用的方式併入本文中。該改良方法鑑別出來自參考抗體之可變區的確定抗原結合特異性所需的最少序列資訊，且向人類部分V區基因序列庫傳遞資訊以產生 人類抗體V區之抗原決定基集中庫。可使用基於微生物之分泌系統來使庫之成員表現為抗體Fab片段，且使用群落轉移結合分析篩選例如庫之抗原結合Fab。參見例如美國專利公開案第2007/0020685號。可進一步表徵陽性純系以鑑別具有最高親和力之純系。所得經工程改造之人類Fab保留親本參考抗GITR抗體之結合特異性，通常相較於親本抗體對抗原具有相等或較高親和力，且具有相較於人類生殖系抗體V區具有高度序列一致性的V區。

產生抗原決定基集中庫所需之最小結合特異性決定子(BSD)通常由重鏈CDR3(「CDRH3」)內之序列及輕鏈CDR3(「CDRL3」)內之序列表示。BSD可包含CDR3之部分或整個長度。BSD可包含鄰接或非鄰接胺基酸殘基。在一些情形下，抗原決定基集中庫由連接於來自參考抗體之獨特CDR3-FR4區的人類V區序列建構，該參考抗體含有BSD及人類生殖系J區序列(參見美國專利公開案第2005/0255552號)。替代地，人類V區庫可藉由連續卡匣置換產生，其中最初僅參考抗體V區之一部分經人類序列庫置換。在殘餘參考抗體胺基酸序列之情形下，隨後所鑑別之支持結合之人類「卡匣」於第二庫篩選中再組合以產生全人類V區(參見美國專利公開案第2006/0134098號)。

在各情形下，使用含有來自參考抗體之特異性決定子的配對重鏈及輕鏈CDR3區、CDR3-FR4區或J區來限制結合特異性，使得自庫獲得之抗原結合物保留參考抗體之抗原決定基特異性。其他成熟變化可在庫建構期間引入各鏈之CDR3區中以鑑別具有最佳結合動力學之抗體。所得經工程改造之人類抗體具有源自人類生殖系庫之V區序列，保留CDR3區內之短BSD序列且具有人類生殖系構架4(FR4)區。

駱駝抗體

自駱駝及單峰駝(雙峰駱駝(Camelus bactrianus)及單峰駱駝(Calelus dromaderius))家族成員(包括新世界成員，諸如駱馬物種(例 如羊駝(Lama pacos)、大羊駝(Lama glama)及瘦駝(Lama vicugna)))獲得之抗體蛋白已在尺寸、結構複雜性及對人類個體之抗原性方面加以表徵。如自然界中所發現之來自此哺乳動物家族之某些IgG抗體缺少輕鏈，因此在結構上不同於其他動物抗體之具有兩條重鏈及兩條輕鏈之典型四鏈四級結構。參見PCT/EP93/02214(1994年3月3日公開之WO 94/04678)。

駱駝抗體之鑑別為VHH之區域(小型單一可變域)可藉由遺傳工程改造來獲得，以產生對標靶具有高親和力之小蛋白質，從而產生低分子量源自抗體之蛋白質，稱為「駱駝奈米抗體」。參見美國專利1998年6月2日頒予的第5,759,808號；亦參見Stijlemans,B.等人，2004 J Biol Chem 279：1256-1261；Dumoulin,M.等人，2003 Nature 424：783-788；Pleschberger,M.等人，2003 Bioconjugate Chem 14：440-448；Cortez-Retamozo,V.等人，2002 Int J Cancer 89：456-62；及Lauwereys,M.等人，1998 EMBO J 17：3512-3520。經工程改造之駱駝抗體及抗體片段之庫可購自例如Ablynx,Ghent,Belgium。如同非人類來源之其他抗體，駱駝抗體之胺基酸序列可重組改變以得到與人類序列更密切類似之序列，亦即，奈米抗體可經「人類化」。從而可進一步減小駱駝抗體對人類之天然低抗原性。

駱駝奈米抗體之分子量為人類IgG分子之約十分之一，且蛋白質之實體直徑僅為幾奈米。小尺寸之一種結果為駱駝奈米抗體結合能夠結合於較大抗體蛋白質在功能上不可見的抗原位點，亦即，駱駝奈米抗體適用作偵測抗原之試劑(否則使用經典免疫技術，抗原會隱匿)，及可能之治療劑。因此，小尺寸之又一結果為駱駝奈米抗體由於結合於標靶蛋白之凹槽或窄隙中之特定位點而可具抑制作用，且因此相較於經典抗體之功能，可以更緊密類似於經典低分子量藥物之功能的能力來發揮作用。

低分子量及緊湊尺寸進一步使駱駝奈米抗體具有極大的熱穩定性(對極端pH值及蛋白水解消化具有穩定性)，及弱抗原性。另一結果為駱駝奈米抗體容易自循環系統移至組織中，且甚至跨過血腦障壁且可治療影響神經組織之病症。奈米抗體可進一步促進藥物傳輸跨過血腦障壁。參見2004年8月19日公開之美國專利申請案20040161738。此等特徵與對人類之低抗原性組合指示巨大治療潛力。另外，此等分子可表現於諸如大腸桿菌之原核細胞中，且以與噬菌體形成之融合蛋白形式表現且具功能性。

因此，本發明之一個特徵為對GITR具有高親和力之駱駝抗體或奈米抗體。在本文之某些實施例中，駱駝抗體或奈米抗體在駱駝動物中天然產生，亦即，駱駝動物使用本文針對其他抗體所述之技術經GITR或其肽片段免疫之後而產生。或者，對結合GITR的駱駝奈米抗體進行工程改造，亦即以GITR作為標靶，使用淘選程序，自例如呈現經適當誘變之駱駝奈米抗體蛋白質之噬菌體庫中選擇而產生。經工程改造之奈米抗體可進一步藉由遺傳工程改造定製以使其在受者個體中之半衰期為45分鐘至2週。在一特定實施例中，駱駝抗體或奈米抗體係藉由將本發明之人類抗體之重鏈或輕鏈之CDR序列移植至奈米抗體或單域抗體構架序列中來獲得，如PCT/EP93/02214中之實例所述。在一些實施例中，根據下述方法，本發明提供多價駱駝抗體或奈米抗體。

多價抗體

在另一態樣中，提供本發明之包含GITR結合抗體或其片段之多價分子(單特異性、雙特異性或多特異性)。本發明之抗體或其抗原結合區可經衍生或連接於另一功能分子，例如另一肽或蛋白質(例如另一抗體或受體之配體)，以產生結合於至少兩個不同結合位點(其可為相同或不同標靶位點或分子)之多價分子。在一些實施例中，本發明 抗體經衍生或功能上連接(例如)於超過一個其他功能分子以產生結合於兩個或兩個以上不同結合位點的多價分子，該等結合位點為相同標靶分子上之相同或不同結合位點。在某些實施例中，多價結合位點相同。在一些實施例中，本發明抗體經衍生或連接於超過一個其他功能分子以產生結合至少兩個標靶分子上之兩個或兩個以上不同結合位點的多特異性分子；如本文所用，此類多特異性分子亦意欲由術語「雙特異性分子」或「多特異性」涵蓋。為產生本發明之雙特異性分子，本發明之抗體可在功能上與一或多個其他結合分子(諸如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬劑)連接(例如藉由化學偶合、遺傳融合、非共價結合或以其他方式連接)，從而產生多價分子。本發明包括如下雙特異性分子，其包含至少一個針對GITR之第一結合特異性及針對第二標靶抗原決定基之第二結合特異性。舉例而言，第二標靶抗原決定基為GITR之不同於第一標靶抗原決定基之另一抗原決定基。另外，對於分子為多特異性之本發明，在一些實施例中，除第一及第二標靶抗原決定基以外，該分子進一步包括第三結合特異性。

在一個實施例中，本發明之雙特異性分子包含至少一種抗體或其抗體片段(包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或單鏈Fv)作為結合特異性。抗體亦可為輕鏈或重鏈二聚體或其任何最小片段，諸如Fv或單鏈構築體，如Ladner等人之美國專利第4,946,778號中所述。

雙功能抗體為二價雙特異性分子，其中VH及VL域在單多肽鏈上表現，其由過短而不容許同一鏈上之兩個域之間配對的連接子連接。VH及VL域與另一鏈之互補域配對，從而產生兩個抗原結合位點(參見例如Holliger等人，1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak等人，1994 Structure 2：1121-1123)。雙功能抗體可藉由在同一細胞內表現具有結構VHA-VLB及VHB-VLA(VH-VL構型)或VLA-VHB及VLB-VHA(VL-VH構型)之兩個多肽鏈來產生。其中大多數可在細菌 中以可溶形式表現。單鏈雙功能抗體(scDb)係藉由約15個胺基酸殘基之連接子連接兩個形成雙功能抗體的多肽鏈來產生(參見Holliger及Winter,1997 Cancer Immunol.Immunother.,45(3-4)：128-30；Wu等人，1996 Immunotechnology,2(1)：21-36)。scDb可以可溶性、活性單體形式表現於細菌中(參見Holliger及Winter,1997 Cancer Immunol.Immunother.,45(34)：128-30；Wu等人，1996 Immunotechnology,2(1)：21-36；Pluckthun及Pack,1997 Immunotechnology,3(2)：83-105；Ridgway等人，1996 Protein Eng.,9(7)：617-21)。雙功能抗體可與Fc融合而產生「二-雙功能抗體」(參見Lu等人，2004 J.Biol.Chem.,279(4)：2856-65)。

可用於本發明之雙特異性分子中之其他抗體為鼠、嵌合及人類化單株抗體。

本發明之雙特異性及/或多價分子可藉由使用此項技術中已知之方法結合組成性結合特異性來製備舉例而言，雙特異性及/或多價分子之各結合特異性可分別產生，隨後彼此結合。當結合特異性為蛋白質或肽時，可使用多種偶合劑或交聯劑進行共價結合。交聯劑之實例包括蛋白A、碳化二亞胺、N-丁二醯亞胺基-S-乙醯基-硫乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫基雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰伸苯基二順丁烯二醯亞胺(oPDM)、N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)及磺基丁二醯亞胺基4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(磺基-SMCC)(參見例如Karpovsky等人，1984 J.Exp.Med.160：1686；Liu,MA等人，1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括以下文獻中所述之方法：Paulus,1985 Behring Ins.Mitt.No.78,118-132；Brennan等人，1985 Science 229：81-83)及Glennie等人，1987 J.Immunol.139：2367-2375)。結合劑為SATA及磺基-SMCC，其均購自Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)。

當結合特異性為抗體時，其可藉由兩條重鏈之恆定域鉸鏈區之硫氫基鍵結來結合。在一個特定實施例中，在結合之前，鉸鏈區經修飾以含有奇數個硫氫基殘基，例如一個。

或者，結合特異性可在同一載體中編碼，且在同一宿主細胞中表現及組裝。在雙特異性及/或多價分子為mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab')2或配體×Fab融合蛋白的情況下，此方法尤其適用。本發明之雙特異性及/或多價分子可為包含一個單鏈抗體及一個結合決定子之單鏈分子，或包含兩個結合決定子之單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩個單鏈分子。製備雙特異性分子之方法描述於例如美國專利5,260,203號、美國專利第5,455,030號、美國專利第4,881,175號、美國專利第5,132,405號、美國專利第5,091,513號、美國專利第5,476,786號、美國專利第5,013,653號、美國專利第5,258,498號及美國專利第5,482,858號中。

雙特異性及/或多價分子與其特異性標靶之結合可藉由例如酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(REA)、FACS分析、生物分析(例如生長抑制)或西方墨點分析來確認。此等分析中之每一者通常藉由使用經標記之試劑(例如抗體)來偵測備受關注之蛋白質-抗體複合物的存在，該經標記之試劑對所關注之該複合物具特異性。

半衰期延長之抗體

本發明提供特異性結合於GITR蛋白、活體內半衰期延長之抗體及抗體片段。

許多因素可影響蛋白質之活體內半衰期。舉例而言，腎臟過濾、肝中代謝、藉由蛋白水解酶(蛋白酶)降解及免疫原性反應(例如蛋白質由抗體中和及由巨噬細胞及樹突狀細胞吸收)。多種策略可用於延長本發明抗體之半衰期。舉例而言，藉由化學連接於聚乙二醇(PEG)、reCODE PEG、抗體骨架、聚唾液酸(PSA)、羥基乙基澱粉 (HES)、結合白蛋白之配體及碳水化合物遮蔽物；藉由與結合於血清蛋白質之蛋白質(諸如白蛋白、IgG、FcRn)遺傳融合且轉移；藉由與結合於血清蛋白質之其他結合部分(諸如奈米抗體、Fab、DARPin、高親和性多聚體、親和抗體及抗運載蛋白)偶合(遺傳方式或化學方式)；藉由與rPEG、白蛋白、白蛋白域、白蛋白結合蛋白及Fc遺傳融合；或藉由併入奈米載體、緩釋調配物或醫學裝置中。

為了延長活體內抗體之血清循環，諸如高分子量PEG之惰性聚合物分子可經由PEG與抗體之N末端或C末端之位點特異性結合或經由存在於離胺酸殘基上之ε胺基、使用或不使用多官能性連接子連接於抗體或其片段。為使抗體發生聚乙二醇化，通常使抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)(諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)在使一或多個PEG基團連接於抗體或抗體片段的條件下反應。聚乙二醇化可藉由與反應性PEG分子(或類似之反應性水溶聚合物)之醯化反應或烷基化反應來進行。如本文所用，術語「聚乙二醇」意欲涵蓋已用於衍生其他蛋白質之任何PEG形式，諸如單(C1-C10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。在某些實施例中，待聚乙二醇化之抗體為去糖基化抗體。將使用使生物活性損失降至最小之線性或分枝聚合物衍生化。結合度可藉由SDS-PAGE及質譜密切監測以確保PEG分子與抗體之適當結合。未反應之PEG可藉由尺寸排阻或藉由離子交換層析而與抗體-PEG結合物分離。可使用熟習此項技術者熟知的方法(例如本文所述之免疫分析)測試PEG衍生化抗體的結合活性以及活體內功效。蛋白質聚乙二醇化方法在此項技術中已知且可應用於本發明之抗體。參見例如Nishimura等人之EP 0 154 316及Ishikawa等人之EP 0 401 384。

其他經修改之聚乙二醇化技術包括再建化學正交導引工程改造技術(ReCODE PEG)，其經由包括tRNA合成酶及tRNA之再建系統將 化學上特定的側鏈併入生物合成蛋白質中。此技術能夠將超過30種新胺基酸併入生物大腸桿菌、酵母及哺乳動物細胞之合成蛋白質中。tRNA將非天然胺基酸併入琥珀密碼子所定位之任何位置，從而將琥珀密碼子自終止密碼子轉換為傳遞化學上指定胺基酸之合併信號的密碼子。

重組聚乙二醇化技術(rPEG)亦可用於延長血清半衰期。此技術包括以遺傳方式將300至600個胺基酸非結構化蛋白質尾與現有醫藥蛋白質融合。由於此類非結構化蛋白質鏈之表觀分子量比其實際分子量大約15倍，因此蛋白質之血清半衰期大大延長。與需要化學結合及再純化之傳統聚乙二醇化相比，此製造方法大大簡化且產物為均質的。

另一技術為聚唾液酸化，其使用天然聚合物聚唾液酸(PSA)延長有效壽命且改良治療肽及蛋白質之穩定性。PSA為唾液酸聚合物(一種糖)。當用於傳遞蛋白質及治療肽藥物時，聚唾液酸為結合提供保護性微環境。此提高治療性蛋白質在循環中之有效壽命且防止其被免疫系統識別。PSA聚合物天然地存在於人體中。進化逾數百萬年之某些細菌採用PSA聚合物覆蓋其壁。此等天然聚唾液酸化細菌接著能夠憑藉分子擬態來阻擋身體之防禦系統。此類細菌中可容易產生大量具有預定物理特徵之PSA(天然之終極隱匿技術)。由於細菌PSA與人體中之PSA在化學上相同，因此細菌PSA完全不具免疫原性，即使在與蛋白質偶合時。

另一技術包括使用連接於抗體之羥基乙基澱粉(「HES」)衍生物。HES為來源於糯性玉米澱粉之經修飾天然聚合物，且可藉由身體之酶代謝。通常投與HES溶液以取代血容量不足及改良血液之流變特性。抗體之羥基乙基澱粉化能夠藉由提高分子穩定性以及藉由減小腎清除率而延長循環半衰期，從而提高生物活性。藉由改變不同參數，諸如HES分子量，可定製廣泛範圍之HES抗體結合物。

亦可藉由將一或多個胺基酸修飾(亦即取代、***或缺失)引入IgG恆定域或其FcRn結合片段(較佳Fc或鉸鏈Fc域片段)中來產生活體內半衰期延長的抗體。參見例如國際公開案第WO 98/23289號；國際公開案第WO 97/34631號；及美國專利第6,277,375號。

另外，抗體可與白蛋白結合以便使得抗體或抗體片段在活體內更穩定或在活體內具有較長半衰期。該等技術為此項技術中所熟知，參見例如國際公開案第WO 93/15199號、第WO 93/15200號及第WO 01/77137號，及歐洲專利第EP 413,622號。

延長半衰期之策略尤其適用於奈米抗體、基於纖維結合蛋白之結合子及需要延長活體內半衰期之其他抗體或蛋白質。

抗體結合物

本發明提供特異性結合於GITR蛋白質之抗體或其片段，其與異源蛋白質或多肽(或其片段，較佳至少10個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個或至少100個胺基酸之多肽)以重組方式融合或以化學方式結合(包括共價與非共價結合)而產生融合蛋白。特定言之，本發明提供融合蛋白，其包含本文所述抗體之抗原結合片段(例如Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH域、VH CDR、VL域或VL CDR)及異源蛋白質、多肽或肽。使蛋白質、多肽或肽與抗體或抗體片段融合或結合之方法在此項技術中已知。參見例如美國專利第5,336,603號、第5,622,929號、第5,359,046號、第5,349,053號、第5,447,851號及第5,112,946號；歐洲專利第EP 307,434號及第EP 367,166號；國際公開案第WO 96/04388號及第WO 91/06570號；Ashkenazi等人，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539；Zheng等人，1995,J.Immunol.154：5590-5600；及Vil等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：11337-11341。

其他融合蛋白可經由基因改組、基元改組、外顯子改組及/或密碼子改組(統稱為「DNA改組」)技術產生。DNA改組可用於改變本發明抗體或其片段之活性(例如具有較高親和力及較低解離速率的抗體或其片段)。一般而言，參見美國專利第5,605,793號、第5,811,238號、第5,830,721號、第5,834,252號及第5,837,458號；Patten等人，1997,Curr.Opinion Biotechnol.8：724-33；Harayama,1998,Trends Biotechnol.16(2)：76-82；Hansson等人，1999,J.Mol.Biol.287：265-76；及Lorenzo及Blasco,1998,Biotechniques 24(2)：308-313(此等專利及公開案各特此以全文引用的方式併入本文中)。抗體或其片段，或所編碼之抗體或其片段在重組之前可如下改變：藉由易錯PCR進行隨機突變誘發、隨機核苷酸***或其他方法。編碼特異性結合於GITR蛋白質之抗體或其片段的聚核苷酸可與一或多種異源分子之一或多種組分、基元、區段、部分、域、片段等重組。

此外，抗體或其片段可與諸如肽之標記序列融合以促進純化。在較佳實施例中，標記胺基酸序列為六組胺酸(SEQ ID NO：11)肽，尤其諸如pQE載體(QIAGEN,Inc.,9259 Eton Avenue,Chatsworth,Calif.,91311)中所提供之標記，其中許多可購得。如Gentz等人，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824中所述，例如六組胺酸(SEQ ID NO：11)為融合蛋白之純化提供方便。適用於純化之其他肽標記包括(但不限於)紅血球凝集素(「HA」)標記，其對應於來源於流感紅血球凝集素蛋白之抗原決定基(Wilson等人，1984,Cell 37：767)；及「flag」標記。

在其他實施例中，本發明之抗體或其片段與診斷劑或偵測劑結合。作為臨床測試程序之一部分，此類抗體可適用於監測或預後疾病或病症之發作、發展、進展及/或嚴重性，諸如測定特定療法之功效。此類診斷及偵測可藉由使抗體與可偵測物質偶合來實現，可偵測 物質包括(但不限於)不同酶，諸如(但不限於)辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；輔基，諸如(但不限於)抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生物素蛋白/生物素；螢光物質，諸如(但不限於)傘酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺螢光素、二甲胺基磺萘醯氯或藻紅素；發光物質，諸如(但不限於)魯米諾(luminol)；生物發光物質，諸如(但不限於)螢光素酶、螢光素及水母素；放射性物質，諸如(但不限於)碘(131I、125I、123I及121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115In、113In、112In及111In)、鎝(99Tc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn及117Tin；及使用各種正電子發射斷層攝影之正電子發光金屬，及非放射性順磁金屬離子。

此外，本發明涵蓋結合於治療部分或藥物部分的抗體或其片段，該治療部分或藥物部分調節結合於治療部分之抗體或其片段的既定生物作用或反應及用途。治療部分或藥物部分不應視為限於經典化學治療劑。舉例而言，藥物部分可為具有所要生物活性之蛋白質、肽或多肽。此類蛋白質可包括例如毒素，諸如相思子毒素、蓖麻毒素A、綠膿桿菌外毒素、霍亂毒素或白喉毒素；蛋白質，諸如腫瘤壞死因子、α干擾素、β干擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖維蛋白溶酶原活化因子；細胞凋亡劑；抗血管生成劑；或生物反應調節劑，諸如淋巴激素。抗體或其片段可結合於治療部分(諸如細胞毒素，例如細胞抑制劑或殺細胞劑)、治療劑或放射性金屬離子(例如α-發射體)。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞不利的任何試劑。

舉例而言，抗體可與以下結合：治療部分，諸如放射性金屬離 子，諸如α-發射體，諸如213Bi；或適用於放射金屬離子(包括(但不限於)131In、131LU、131Y、131Ho、131Sm)與多肽之結合的巨環螯合劑。在某些實施例中，巨環螯合劑為1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N',N",N'"-四乙酸(DOTA)，其可經由連接子分子連接於抗體。此類連接子分子在此項技術中通常已知且描述於Denardo等人，1998,Clin Cancer Res.4(10)：2483-90；Peterson等人，1999,Bioconjug.Chem.10(4)：553-7；及Zimmerman等人，1999,Nucl.Med.Biol.26(8)：943-50，各以全文引用的方式併入本文中。

使治療部分與抗體結合的技術已熟知，參見例如Arnon等人，「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」，於Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(編)，第243-56頁(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人，「Antibodies For Drug Delivery」，於Controlled Drug Delivery(第2版)；Robinson等人(編)，第623-53頁(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review」,Monoclonal Antibodies 84：Biological And Clinical Applications,Pinchera等人(編)，第475-506頁(1985)；「Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」,Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人(編)，第303-16頁(Academic Press 1985)；及Thorpe等人，1982,Immunol.Rev.62：119-58。

抗體亦可連接於固體載體，其尤其適用於標靶抗原之免疫分析或純化。此類固體載體包括(但不限於)玻璃、纖維素、聚丙烯醯胺、耐綸、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。

編碼促效抗GITR抗體之聚核苷酸

抗GITR抗體、抗原結合分子及其片段可藉由此項技術中已知之任何方法製備，包括(但不限於)重組表現、化學合成及酶促消化抗體四聚體，而全長單株抗體可藉由例如融合瘤或重組製備來獲得。重組表現可來自此項技術中已知之任何適當宿主細胞，例如哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞等。

本發明進一步提供編碼本文所述之抗體的聚核苷酸，例如本文所述之編碼包含互補決定區之重鏈或輕鏈可變區或區段的聚核苷酸。在一些實施例中，編碼重鏈可變區之聚核苷酸包含與選自由SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：107及SEQ ID NO：115組成之群的聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性的序列。在一些實施例中，編碼輕鏈可變區之聚核苷酸包含與選自由SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54及SEQ ID NO：102組成之群的聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性的序列。

在一些實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：67之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：68之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。

在一些實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：72之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之聚核苷酸與選擇自SEQ ID NO：73之聚核苷酸具有至少 85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。

在一些實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：74之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：68之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。

在一些實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：76之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：68之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。

在一些實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：78之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：68之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。

在一些實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸與選自由SEQ ID NO：103組成之群的聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：104之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。

在一些實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：108之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：104之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。

在一些實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：116之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：68之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。

在一些實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：118之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：68之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。

在一些實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：120之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之聚核苷酸與選自由SEQ ID NO：68組成之群的聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。

在一些實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：122之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：68之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。

在一些實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：124之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：68之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。

在一些實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：131之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：68之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。

在一些實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：133之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：68之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。

在一些實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：135之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：68之聚核苷酸具有至少85%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。

在一些實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：137之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：68之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。

在一些實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：139之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：68之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。

在一些實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：141之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：68之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。

在一些實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：143之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：68之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。

在一些實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：60之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之聚核苷酸與SEQ ID NO：58之聚核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。

本發明之聚核苷酸僅可編碼抗GITR抗體之可變區序列。其亦可編碼抗體之可變區與恆定區。一些聚核苷酸序列編碼包含例示性小鼠抗GITR抗體中之一者的重鏈與輕鏈之可變區的多肽。一些其他聚核苷酸編碼與小鼠抗體中之一者的重鏈及輕鏈之可變區分別實質性一致的兩個多肽區段。

聚核苷酸序列可藉由重新固相DNA合成或藉由編碼抗GITR抗體或其結合片段之現有序列(例如如本文中所述之序列)之PCR突變誘發來產生。核酸之直接化學合成可藉由此項技術中已知之方法實現，諸如Narang等人，1979,Meth.Enzymol.68：90之磷酸三酯法；Brown等人，Meth.Enzymol.68：109,1979之磷酸二酯法；Beaucage等人，Tetra.Lett.,22：1859,1981之胺基磷酸二乙酯法；及美國專利第4,458,066號之固體載體法。藉由PCR向聚核苷酸序列引入突變可如以下文獻中所述進行：例如PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(編),Freeman Press,NY,NY,1992；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications,Innis等人(編),Academic Press,San Diego,CA,1990；Mattila等人，Nucleic Acids Res.19：967,1991；及Eckert等人，PCR Methods and Applications 1：17,1991。

本發明亦提供產生上述抗GITR抗體之表現載體及宿主細胞。不同表現載體可用於表現編碼抗GITR抗體鏈、片段或結合片段之聚核 苷酸。基於病毒之表現載體與非病毒表現載體均可用於在哺乳動物宿主細胞中產生抗體。非病毒載體及系統包括質體、游離型載體，其通常具有用於表現蛋白質或RNA及人類人工染色體的表現卡匣(參見例如Harrington等人，Nat Genet 15：345,1997)。舉例而言，適用於在哺乳動物(例如人類)細胞中表現抗GITR聚核苷酸及多肽之非病毒載體包括pThioHis A、B及C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B及C(Invitrogen,San Diego,CA)、MPSV載體及此項技術中已知用於表現其他蛋白質之許多其他載體。適用的病毒載體包括基於逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒之載體；基於SV40、乳頭狀瘤病毒、HBP埃-巴二氏病毒(HBP Epstein Barr virus)、牛痘病毒載體及勝利基森林病毒(Semliki Forest virus；SFV)之載體。參見Brent等人，同上；Smith,Annu.Rev.Microbiol.49：807,1995；及Rosenfeld等人，Cell 68：143,1992。

表現載體之選擇視欲表現載體之預定宿主細胞而定。通常，表現載體含有啟動子及可操作地連接於編碼抗GITR抗體鏈或片段之聚核苷酸的其他調節序列(例如增強子)。在一些實施例中，誘導性啟動子用於防止所***之序列表現，在誘導條件下除外。誘導性啟動子包括例如***糖、lacZ、金屬硫蛋白啟動子或熱休克啟動子。經轉型之生物體培養物可在使群體不偏向表現產物被宿主細胞良好耐受的非誘導條件下擴增。除啟動子之外，其他調節元件亦可為抗GITR抗體鏈或片段之有效表現所必需或需要的。此等元件通常包括ATG起始密碼子及相鄰的核糖體結合位點或其他序列。另外，表現效率可藉由包括適於所用細胞系統之增強子來增強(參見例如Scharf等人，Results Probl.Cell Differ.20：125,1994；及Bittner等人，Meth.Enzymol.,153：516,1987)。舉例而言，SV40增強子或CMV增強子可用於增強哺乳動物宿主細胞中之表現。

表現載體亦可提供分泌信號序列位置以與由所***之抗GITR抗體序列編碼之多肽形成融合蛋白。更通常，所***之抗GITR抗體序列在包含於載體中之前連接於信號序列。待用於接收編碼抗GITR抗體輕鏈及重鏈可變域之序列的載體有時亦編碼恆定區或其一部分。此類載體允許可變區以與恆定區形成之融合蛋白形式表現，從而產生完整抗體或其片段。通常，此類恆定區為人類恆定區。

含有及表現抗GITR抗體鏈之宿主細胞可為原核或真核細胞。大腸桿菌為一種適用於選殖及表現本發明聚核苷酸之原核宿主。適用之其他微生物宿主包括桿菌(諸如枯草桿菌(Bacillus subtilis))，及其他腸內菌科(諸如沙門氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia))，及多種假單胞菌種。在此等原核宿主中，亦可產生表現載體，其通常含有與宿主細胞相容之表現控制序列(例如複製起點)。另外，將存在任何數目之多種熟知啟動子，諸如乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或來自噬菌體λ之啟動子系統。啟動子通常控制表現(視情況與操縱序列一起控制表現)，且具有用於起始且完成轉錄及轉譯之核糖體結合位點序列及其類似序列。諸如酵母之其他微生物亦可用於表現本發明之抗GITR多肽。亦可使用昆蟲細胞與桿狀病毒載體之組合。

在一些較佳實施例中，以哺乳動物宿主細胞用於表現及產生本發明之抗GITR多肽。舉例而言，其可為表現內源免疫球蛋白基因之融合瘤細胞株(例如如實例中所述之骨髓瘤融合瘤純系)或含有外源表現載體之哺乳動物細胞株(例如下文舉例說明之SP2/0骨髓瘤細胞)。此等細胞包括任何正常死亡或正常或異常永生動物或人類細胞。舉例而言，已開發出能夠分泌完整免疫球蛋白之多種適合宿主細胞株，包括CHO細胞株、各種Cos細胞株、海拉細胞(HeLa cells)、骨髓瘤細胞株、經轉型之B細胞及融合瘤。以哺乳動物組織細胞培養物用於表現 多肽之用途一般論述於例如Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987中。哺乳動物宿主細胞之表現載體可包括表現控制序列，諸如複製起點、啟動子及增強子(參見例如Queen等人，Immunol.Rev.89：49-68,1986)，及必需的處理資訊位點(諸如核糖體結合位點、RNA拼接位點、聚腺苷酸化位點)，及轉錄終止子序列。此等表現載體通常含有來源於哺乳動物基因或來源於哺乳動物病毒之啟動子。合適啟動子可為組成性、細胞類型特異性、階段特異性及/或可調節或可調控的。適用之啟動子包括(但不限於)金屬硫蛋白啟動子、組成性腺病毒主要晚期啟動子、***(dexamethasone)誘導性MMTV啟動子、SV40啟動子、MRP polIII啟動子、組成性MPSV啟動子、四環素(tetracycline)誘導性CMV啟動子(諸如人類立即早期CMV啟動子)、組成性CMV啟動子及此項技術中已知之啟動子-增強子組合。

引入含有所關注之聚核苷酸序列之表現載體的方法視細胞宿主之類型而變化。舉例而言，氯化鈣轉染通常用於原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可用於其他細胞宿主。(一般參見Sambrook等人，同上)。其他方法包括例如電穿孔、磷酸鈣處理、脂質體介導之轉型、注射及顯微注射、衝擊法、病毒顆粒(virosome)、免疫脂質體、聚陽離子：核酸結合物、裸DNA、人工病毒粒子、與疱疹病毒結構蛋白VP22融合(Elliot及O'Hare,Cell 88：223,1997)、DNA之藥劑增強性吸收，及離體轉導。就長期高產率產生重組蛋白質而言，通常需要穩定的表現。舉例而言，穩定表現抗GITR抗體鏈或結合片段之細胞株可使用本發明之表現載體製備，本發明之表現載體含有病毒複製起點或內源性表現元件及可選標記基因。在引入載體之後，可允許細胞在豐富培養基中生長1-2天，隨後將豐富培養基與選擇性培養基交換。可選標記之目的為賦予選擇耐藥性，且其存在允許成功表現所引入序列 的細胞在選擇性培養基中生長。經穩定轉染之耐藥性細胞可使用適合於該細胞類型之組織培養技術增殖。

鑑別促效抗GITR抗體之分析

鑑別促效抗GITR抗體之分析為此項技術中已知且如本文所述。促效抗GITR抗體結合於GITR且促進、誘導、刺激胞內經由GITR進行之信號傳導。

抗GITR抗體與GITR之結合可使用此項技術中已知之任何方法測定。舉例而言，與GITR之結合可使用已知技術測定，該等技術包括(但不限於)ELISA、西方墨點、表面電漿子共振(例如BIAcore)及流式細胞術。

經由GITR進行之胞內信號傳導可使用此項技術中已知之任何方法量測。舉例而言，經由GITR活化促進NFκB及MAPK信號傳導。量測NFκB及MAPK活化之方法為此項技術中之標準方法(例如使用報導基因分析、NFκB蛋白之核轉位、MAPK蛋白之磷酸化狀態)。經由GITR活化為在經由T細胞受體活化存在下(例如在初級或標靶抗原存在下)促進經活化CD4⁺及CD8⁺ T細胞增殖的共刺激信號。量測細胞增殖之方法為此項技術中之標準方法(例如³H-胸苷併入分析，CFSE標記)。經由GITR信號傳導亦在經由T細胞受體活化存在下共刺激經活化之CD4⁺及CD8⁺ T細胞而產生細胞激素。經由GITR信號傳導亦共刺激經活化之NK細胞而產生細胞激素。細胞激素可為Th1型細胞激素(例如干擾素γ、IL-2及TNF)及Th2型細胞激素(例如IL-4、IL-5、IL-10及IL-13)中之任一者或兩者。量測細胞激素產生之方法為此項技術中熟知(例如ELISA分析、ELISpot分析)。經由GITR活化亦可誘導細胞凋亡。量測細胞凋亡之方法為此項技術中之標準方法(例如磷脂結合蛋白V染色)。在進行活體外分析時，可將與促效抗GITR抗體接觸之測試細胞或來自測試細胞之培養物上清液與尚未與促效抗GITR抗體 接觸之對照細胞或來自對照細胞之培養物上清液比較。

亦可在活體內量測本發明抗體之GITR促效功能。較佳促效抗GITR抗體能夠活化及擴增CD4⁺及CD8⁺ T細胞。CD4⁺及CD8⁺ T細胞之活體內活化及擴增可使用此項技術中已知之任何方法(例如藉由流式細胞術)量測。較佳促效抗GITR抗體可在治療上適用於抑制腫瘤生長或促進腫瘤收縮。腫瘤生長或其抑制可使用此項技術中已知之任何方法(例如視覺檢查、測徑規、稱量、成像技術，包括MRI)量測。較佳促效抗GITR抗體可在治療上適用於預防、降低、抑制或去除傳染病之誘因，例如細菌、真菌、病毒或寄生蟲感染。促效抗GITR抗體在增強T細胞反應或降低疾病嚴重性中之功效可藉由投與個體治療有效量之抗體且比較投與抗體之前及之後的個體來測定。促效抗GITR抗體在增強T細胞反應或降低疾病嚴重性中之功效亦可藉由投與治療測試個體有效量之抗體且比較測試個體與尚未投與抗體之對照個體來測定。

包含促效抗GITR抗體之組合物

本發明提供醫藥組合物，其包含與醫藥學上可接受之載劑一起調配之本發明抗GITR抗體或抗原結合分子視情況，醫藥組合物另外含有一或多種適用於治療或預防既定病症之其他治療劑。醫藥學上可接受之載體使組合物提高或穩定，或可促進組合物之製備。醫藥學上可接受之載劑包括生理上相容之溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。

本發明之醫藥組合物可藉由此項技術中已知之多種方法投與。投藥途徑及/或模式視所要結果而變化。較佳投與為靜脈內、肌肉內、腹膜內或皮下投與或接近標靶位點投與。醫藥學上可接受之載劑應適用於靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸、鼻內、吸入、脊髓或表皮投與(例如藉由注射或輸注)。視投藥途徑而定，活性化合物(例如本發 明之抗體或抗原結合片段或多價分子(例如單特異性、雙特異性或多特異性分子))可包覆於材料中以保護化合物使其免受酸之作用及可使化合物不活化之其他自然條件。

可將單獨或與其他適合組分組合形式的抗體或其片段製成氣溶膠調配物(亦即其可經「霧化)」以經由吸入投與。氣溶膠調配物可置於諸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣及其類似物的可接受加壓之推進劑中。

在一些實施例中，組合物為無菌且流動的。舉例而言，可藉由使用諸如卵磷脂之包衣、藉由在分散液之情況下維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。在諸多情形下，組合物中較佳包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇或山梨糖醇)及氯化鈉。藉由使組合物中包括延遲吸收之試劑(例如單硬脂酸鋁或明膠)，可使可注射組合物長時間吸收。在某些實施例中，可製備組合物以使用適當賦形劑(例如蔗糖)以凍乾形式儲存。

本發明之醫藥組合物可根據此項技術中熟知且常規實踐之方法製備。醫藥學上可接受之載劑部分藉由所投予之特定組合物以及藉由投與組合物使用之特定方法決定。因此，存在本發明之醫藥組合物之多種適合調配物。調配抗體及確定適當給藥劑量及時程之適用方法可見於例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版，University of the Sciences in Philadelphia,Lippincott Williams及Wilkins(2005)編；Martindale：The Complete Drug Reference,Sweetman,2005,London：Pharmaceutical Press.；Martindale,Martindale：The Extra Pharmacopoeia，第31版，1996,Amer Pharmaceutical Assn；及Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978中，其各特此以引用的方式併入本文中。醫藥組合物較佳在GMP 條件下製造。通常，本發明之醫藥組合物中採用治療有效劑量或有用劑量之抗GITR抗體。抗GITR抗體藉由熟習此項技術者已知之習知方法調配成醫藥學上可接受之劑型。調節劑量方案以得到所要反應(例如治療反應)。在確定治療或預防有效劑量時，可投與低劑量，隨後逐漸增加直至在最少或無不適宜副作用下達成所要反應為止。舉例來說，如由治療情況的緊急狀態所指示，可單次團式投與，可隨時間投與數個分次劑量，或可按比例減少或增加劑量。尤其有利的是以劑量單位形式配製非經腸組合物以便於劑量的投與及均勻性。如本文所用之單位劑型係指適合作為單一劑量用於待治療之個體的實體上不連續單位；各單位含有經計算以與所需醫藥載劑結合產生所需治療作用之預定量活性化合物。

可改變本發明之醫藥組合物中之活性成分的實際劑量，使得可獲得在對患者無毒性之情況下有效達成特定患者、組合物及投與模式之所需治療反應的量的活性成分。所選劑量取決於多種藥物動力學因素，其包括本發明所用特定組合物或其酯、鹽或醯胺之活性、投藥途徑、投藥時間、所用特定化合物之***速率、治療持續時間、與所用特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或物質、所治療患者之年齡、性別、體重、病狀、一般健康狀況及先前病史及其類似因素。

與第二藥劑共調配

在一些實施例中，藥理學組合物包含抗GITR抗體或抗原結合分子與第二藥理學藥劑之混合物。與本發明之抗GITR促效劑抗體或抗原結合分子之混合物中包括的例示性第二藥劑包括(但不限於)初級或標靶抗原、提高腫瘤細胞之免疫原性的藥劑、抑制或抑止共抑制信號之藥劑。

本發明之抗GITR抗體或抗原結合分子可與初級或標靶抗原共調配(亦即以混合物之形式提供或以混合物形式製備)。標靶抗原或疫苗 取決於待治療之疾病病狀。舉例而言，標靶抗原可來自腫瘤細胞、細菌細胞、真菌、病毒或寄生蟲。標靶抗原可視需要為肽、多肽、細胞或聚核苷酸之形式。

在一個實施例中，標靶抗原來自例如選自由以下組成之群的病毒：肝炎A型、肝炎B型、肝炎C型、流感病毒、水痘、腺病毒、單純疱疹I型(HSV I)、單純疱疹II型(HSV II)、牛瘟、鼻病毒、埃可病毒(echovirus)、輪狀病毒、呼吸道融合細胞病毒、乳頭狀瘤病毒、乳多泡病毒、巨細胞病毒、埃克諾病毒(echinovirus)、蟲媒病毒、漢坦病毒(hantavirus)、柯薩奇病毒(coxsackie virus)、腮腺炎病毒、麻疹病毒、風疹病毒、脊髓灰質炎病毒、人類免疫缺陷病毒I型(HIV I)及人類免疫缺陷病毒II型(HIV II)、任何小RNA病毒科、腸病毒、杯狀病毒科、諾沃克病毒群(Norwalk group of viruses)中之任一者、披衣病毒(諸如甲病毒、黃病毒)、冠狀病毒、狂犬病毒、馬堡病毒(Marburg virus)、埃博拉病毒(ebola virus)，副流感病毒、正黏液病毒、布尼亞病毒(bunyavirus)、沙粒狀病毒、呼腸孤病毒、輪狀病毒、環狀病毒、人類T細胞白血病病毒I型、人類T細胞白血病病毒II型、猴免疫缺乏病毒、慢病毒、多瘤病毒、小病毒、埃-巴二氏病毒、人類疱疹病毒6、猴庖疹病毒1(B病毒)及痘病毒。

在一個實施例中，標靶抗原來自例如選自由以下組成之群的細菌：奈瑟氏菌屬(Neisseria spp)、鏈球菌屬(Streptococcus spp)、變異鏈球菌(S.mutans)、嗜血桿菌屬(Haemophilus spp.)、莫拉菌屬(Moraxella spp)、鮑特氏菌屬(Bordetella spp)、分支桿菌屬(Mycobacterium spp)、軍團菌屬(Legionella spp)、埃希氏菌屬(Escherichia spp)、弧菌屬(Vibrio spp)、耶爾森菌屬(Yersinia spp)、曲桿菌屬(Campylobacter spp)、沙門氏菌屬(Salmonella spp)、李氏菌屬(Listeria spp.)、螺旋桿菌屬(Helicobacter spp)、假單胞菌屬 (Pseudomonas spp)、葡萄球菌屬(Staphylococcus spp.)、腸球菌屬(Enterococcus spp)、梭菌屬(Clostridium spp.)、芽孢桿菌屬(Bacillus spp)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium spp.)、疏螺旋體屬(Borrelia spp.)、艾利希體屬(Ehrlichia spp)、立克次體屬(Rickettsia spp)、衣原體屬(Chlamydia spp.)、鉤端螺旋體屬(Leptospira spp.)、密螺旋體屬(Treponema spp)。

在一些實施例中，將抗GITR抗體或抗原結合分子以與腫瘤相關抗原(TAA)之混合物形式共調配。TAA可為經分離多肽或肽，可為完整細胞之一部分或腫瘤細胞溶解物之一部分。TAA可為聚核苷酸，例如裸質體，或包含編碼一或多種TAA之聚核苷酸的病毒載體。已知TAA之實例包括(但不限於)黑色素瘤相關抗原(與黑色素瘤相關之MAGE-1、MAGE-3、TRP-2、黑素體膜醣蛋白gp100、gp75及MUC-1(黏蛋白-1))；可例如與卵巢、黑色素瘤或結腸癌相關之CEA(癌胚抗原)；由卵巢癌表現之葉酸受體α；由包括(但不限於)骨髓瘤之多種不同腫瘤表現的游離人類絨膜***β(hCGβ)次單位；與乳癌相關之HER-2/neu；與小細胞肺癌有關之腦脊髓炎抗原HuD；與神經母細胞瘤相關之酪胺酸羥化酶；與***癌相關之***特異性抗原(PSA)；與卵巢癌相關之CA125；且B細胞淋巴瘤之個體基因型決定子可產生腫瘤特異性免疫性(歸因於個體基因型特異性體液免疫反應)。此外，人類T細胞白血病病毒1型之抗原已展示誘導針對病毒誘發性人類成人T細胞白血病(ATL)的特異性CTL反應及抗腫瘤免疫性。參見例如Haupt等人，Experimental Biology and Medicine(2002)227：227-237；Ohashi等人，Journal of Virology(2000)74(20)：9610-9616。已知其他TAA且其可用於與抗GITR抗體共調配。

在一些實施例中，將抗GITR抗體或抗原結合分子與來自患者之自體腫瘤細胞或來自另一患者之相同組織類型之同種異體腫瘤細胞共 調配。腫瘤細胞可為完整細胞、腫瘤細胞溶解物、凋亡腫瘤細胞或總腫瘤mRNA之形式。腫瘤細胞可經轉染以表現提高或增強患者中腫瘤細胞之免疫原性的多肽，例如經轉染以表現粒細胞群落刺激因子(GM-CSF)。腫瘤細胞可來自任何癌性組織，包括(但不限於)上皮癌或癌瘤，以及肉瘤及淋巴瘤。在一些實施例中，癌症為黑色素瘤、卵巢癌、腎癌、結腸直腸癌、***癌、肺癌(包括非小細胞肺癌(NSCLC))、乳癌、神經膠質瘤、纖維肉瘤、血液癌或頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)。參見例如Pardee等人，Immunotherapy(2009)1(2)：249-264及其中所論述之參考文獻。在一些實施例中，腫瘤細胞來自例如胰臟癌、黑色素瘤、乳癌、肺癌、支氣管癌、結腸直腸癌、***癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、腦或中樞神經系統癌症、周邊神經系統癌症、食道癌、子宮頸癌、子宮或子宮內膜癌、口腔或咽之癌症、肝癌、腎癌、睪丸癌、膽道癌、小腸或附件癌、唾液腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤及血液組織之癌症。

在一些實施例中，將抗GITR抗體或抗原結合分子與細胞毒性劑共調配。舉例而言，將抗GITR抗體或抗原結合分子與結合於且減少或消耗CD4+ CD25+調節性T細胞(Treg)之促效抗體或抗原結合分子共調配。例示性Treg細胞消耗抗體或抗原結合分子結合於CD25或CCR4。參見Expert Opin Ther Patents(2007)17(5)：567-575及其中所論述之參考文獻。

在一些實施例中，將抗GITR抗體或抗原結合分子與共抑制信號之抑制劑共調配。例示性抑制劑包括CTLA-4之抑制劑及PD-1/PD-L1(例如B7-H1)相互作用之抑制劑。在一些實施例中，將抗GITR抗體與結合於且抑制CTLA-4之抗體共調配。在一些實施例中，將抗GITR抗體與結合於且抑制PD-1之抗體共調配。在一些實施例中，將抗GITR抗體與結合於且抑制B7-H1之抗體共調配。參見例如Expert Opin Ther Patents(2007)17(5)：567-575；及Melero，等人，Clin Cancer Res(2009)15(5)：1507-1509及其中所論述之參考文獻。在某些實施例中，調配物包含包括抗GITR抗體或抗原結合分子及共抑制信號之抑制劑的雙特異性分子。在一些實施例中，調配物包含包括抗GITR抗體或抗原結合分子及CTLA4之抑制劑的雙特異性分子。在一些實施例中，調配物包含包括抗GITR抗體或抗原結合分子及PD-1/PD-L1之抑制劑的雙特異性分子。在一些實施例中，調配物包含包括抗GITR抗體或抗原結合分子及B7H1之抑制劑的雙特異性分子。

抗GITR抗體或抗原結合分子亦可與一或多種免疫刺激劑共調配。舉例而言，在一些實施例中，將抗GITR抗體與免疫刺激性細胞激素(例如IL-7、IL-12或IL-15)共調配。替代地，可將抗GITR抗體或抗原結合分子與第二免疫刺激性抗體共調配。舉例而言，亦可將抗GITR抗體或抗原結合分子與腫瘤壞死因子受體超家族之另一成員的促效抗體或抗原結合分子共調配。例示性第二免疫刺激標靶包括(但不限於)TNFRSF4腫瘤壞死因子受體超家族成員4(亦稱為OX40)或腫瘤壞死因子受體超家族成員9(亦稱為TNFRSF9、4-1BB或CD137)。參見例如Expert Opin Ther Patents(2007)17(5)：567-575；Pardee等人，Immunotherapy(2009)1(2)：249-264；及Melero，等人，Clin Cancer Res(2009)15(5)：1507-1509及其中所論述之參考文獻。

亦可將抗GITR抗體或抗原結合分子與化學治療劑共調配。所選藥劑取決於待治療之病狀，例如癌症或傳染病，諸如細菌感染、真菌感染、病毒感染或寄生蟲感染。可將抗GITR抗體或抗原結合分子與熟習此項技術者已知治療待治療疾病病狀的化學治療劑共調配。舉例而言，用於治療癌症及傳染病之化學治療劑為此項技術中已知且例如描述於如下文獻中：Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics，第11版，Brunton,Lazo及Parker編，McGraw-Hill (2006)；2010 Physicians' Desk Reference(PDR)，第64版，Thomson PDR。

在一些實施例中，可將抗GITR抗體或抗原結合分子與抗腫瘤劑共調配。可用於與抗GITR抗體混合於組合物中的例示性抗腫瘤劑包括烷基化劑(例如氮芥、伸乙亞胺及甲基三聚氰胺、甲基肼衍生物、磺酸烷酯、亞硝基脲、三氮烯及鉑配位錯合物)；抗代謝物(例如葉酸類似物、嘧啶類似物、嘌呤類似物)；天然產物(例如長春花生物鹼、紫杉烷、表鬼臼毒素、喜樹鹼、抗生素及蒽醌)。在一些實施例中，將抗GITR抗體或抗原結合分子與抗代謝物抗腫瘤藥劑共調配，例如葉酸類似物(例如甲胺喋呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、曲美沙特(trimetrexate))、嘧啶類似物(例如5-氟尿嘧啶、卡培他濱(capecitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、吉西他濱(gemcitabine))、嘌呤類似物(例如巰基嘌呤(mercaptopurine)、噴司他汀(pentostatin)、克拉屈濱(cladribine)、氟達拉濱(fludarabine))或其混合物。在一些實施例中，將抗GITR抗體或抗原結合分子與烷基化劑抗腫瘤藥劑共調配，例如氮芥(例如氮芥、環磷醯胺、異環磷醯胺、美法侖(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil))、伸乙亞胺(例如六甲蜜胺(altretamine))及甲基三聚氰胺(例如噻替派(thiotepa))、甲基肼衍生物(例如丙卡巴肼(procarbazine))、磺酸烷酯(例如白消安(busulfan))、亞硝基脲(例如卡莫司汀(carmustine)、鏈脲菌素(streptozocin))、三氮烯(例如達卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide))及鉑配位錯合物(例如順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin))。

在一些實施例中，可將抗GITR抗體或抗原結合分子與抗病毒劑共調配。例示性抗病毒劑包括(但不限於)抗疱疹病毒劑(例如阿昔洛韋(acyclovir)、西多福韋(cidofovir)、泛昔洛韋(famciclovir)、膦甲酸(foscarnet)、賽奧韋(thiovir)、福米韋生(fomivirsen)、更昔洛韋 (ganciclovir)、碘苷(idoxuridine)、噴苷洛韋(penciclovir)、曲氟尿苷(trifluridine)、發昔洛韋(valacyclovir)、瓦金洛韋(valgenciclovir)、雷西莫特(resiquimod))；抗流感病毒劑(例如金剛胺(amantadine)、奧司他韋(oseltamivir)、金剛乙胺(rimantadine)、紮那米韋(zanamivir)、帕拉米韋(peramivir)、E-118958)；抗肝炎劑(例如阿地福韋酯(adefovir dipivoxil)、干擾素α、拉米夫定(lamivudine)、恩替卡韋(entecavir)、克來夫定(clevudine)、恩曲他濱(emtricitabine)、替比夫定(telbivudine)、替諾福韋(tenofovir)、偉拉咪定(viramidine)、BILN 2061、NM283)及其他抗病毒劑(例如病毒唑(ribavirin)、咪喹莫特(imiquimod)、馬立巴韋(maribavir)、sICAM-1、普可那利(pleconaril))。抗病毒劑可為抗反轉錄病毒劑。例示性抗反轉錄病毒劑包括(但不限於)齊多夫定(zidovudine)、地達諾新(didanosine)、司他夫定(stavudine)、紮西他濱(zalcitabine)、拉米夫定(lamivudine)、阿巴卡韋(abacavir)、提諾法韋(tenofavir)、恩曲他濱(emtricitabine)、奈韋拉平(nevirapine)、依法韋侖(efavirenz)、地拉韋啶(delavirdine)、沙奎那韋(saquinavir)、茚地那韋(indinavir)、利托那韋(ritonavir)、奈非那韋(nelfinavir)、安普那韋(amprenavir)、洛匹那韋(lopinavir)、阿紮那韋(atazanavir)、夫沙那韋(fosamprenavir)及恩夫韋地(enfuvirtide)。

在一些實施例中，可將抗GITR抗體或抗原結合分子與抗細菌劑共調配。例示性抗細菌劑包括(但不限於)磺醯胺(例如對胺基苯磺醯胺(sulfanilamide)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、磺胺甲基異噁唑(sulfamethoxazole)、磺胺異噁唑(sulfisoxazole)、磺胺醋醯胺(sulfacetamide))、甲氧苄啶(trimethoprim)、喹諾酮(例如萘啶酸(nalidixic acid)、西諾沙星(cinoxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、環丙沙星(ciprofloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)、氟羅沙星(fleroxacin)、培氟沙星(perfloxacin)、左氧氟沙星 (levofloxacin)、加雷沙星(garenoxacin)及吉米沙星(gemifloxacin))、烏洛托品(methenamine)、呋喃妥因(nitrofurantoin)、青黴素(penicillin)(例如青黴素G、青黴素V、甲氧西林(methicilin)、苯唑西林(oxacillin)、氯唑西林(cloxacillin)、雙氯西林(dicloxacillin)、萘夫西林(nafcilin)、安比西林(ampicillin)、阿莫西林(amoxicillin)、卡本西林(carbenicillin)、替卡西林(ticarcillin)、美洛西林(mezlocillin)及哌拉西林(piperacillin))、頭胞菌素(例如頭孢唑林(cefazolin)、頭孢力新(cephalexin)、頭孢羥胺苄(cefadroxil)、頭孢西丁(cefoxitin)、頭孢克洛(cefaclor)、頭孢羅齊(cefprozil)、頭孢呋辛(cefuroxime)、頭孢呋辛酯(cefuroxime acetil)、氯碳頭孢(loracarbef)、頭孢替坦(cefotetan)、頭孢雷特(ceforanide)、頭孢噻肟(cefotaxime)、頭孢泊肟酯(cefpodoxime proxetil)、頭孢布烯(cefibuten)、頭孢地尼(cefdinir)、頭孢妥侖匹酯(cefditoren pivorxil)、頭孢唑肟(ceftizoxime)、頭孢曲松(ceftriaxone)、頭孢哌酮(cefoperazone)、頭孢他啶(ceftazidime)及頭孢吡肟(cefepime))、碳青黴烯(例如亞胺培南(imipenem)、安曲南(aztreonam))及胺基糖苷(例如新黴素(neomycin)、卡那黴素(kanamycin)、鏈黴素(streptomycin)、慶大黴素(gentamicin)、妥布黴素(tobramycin)、奈替米星(netilmicin)及阿米卡星(amikacin))。

在一些實施例中，可將抗GITR抗體或抗原結合分子與抗寄生蟲劑共調配。例示性抗寄生蟲劑包括(但不限於)抗瘧疾劑(例如喹啉，包括(chloroquine)、甲氟喹(mefloquine)、奎寧(quinine)、奎尼丁(quinidine)及伯胺喹(primaquine)；二胺基嘧啶，包括乙胺嘧啶(pyrimethamine)、磺胺多辛(sulfadoxine)、四環素(tetracycline)、阿托喹酮(atovaquone)及氯胍(proguanil))；抗原蟲劑，包括兩性黴素(amphotericin)、氯奎、依氟鳥胺酸(eflornithine)、吐根素(emetine)、煙黴素(fumagillin)、8-羥基喹啉、美拉腫醇(melarsoprol)、甲硝噠唑 (metronidazole)、米替福新(miltefosine)、硝呋莫司(nifurtimox)、硝唑尼特(nitazoxanide)、巴龍黴素(paromomycin)、潘他米丁(pentamidine)、葡萄糖酸銻鈉及蘇拉明(suramin)。

在一些實施例中，可將抗GITR抗體或抗原結合分子與抗真菌劑共調配。例示性抗真菌劑包括(但不限於)多烯(例如遊黴素(natamycin)、龜裂殺菌素(rimocidin)、非律平(filipin)、耐絲他汀(nystatin)、兩性黴素B、坎底辛(candicin)及哈黴素(hamycin))、咪唑(例如咪康唑(miconazole)、酮康唑(ketoconazole)、克黴唑(clotrimazole)、益康唑(econazole)、聯苯苄唑(bifonazole)、布康唑(butoconazole)、芬替康唑(fenticonazole)、異康唑(isoconazole)、奧昔康唑(oxiconazole)、舍他康唑(sertaconazole)、硫康唑(sulconazole)、噻康唑(tioconazole))、***(例如氟康唑(fluconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、艾沙康唑(isavuconazole)、拉夫康唑(ravuconazole)、泊沙康唑(posaconazole)、伏立康唑(voriconazole)、特康唑(terconazole))、噻唑(例如阿巴芬淨(abafungin))、烯丙胺(例如特比萘芬(terbinafine)、阿莫羅芬(amorolfine)、萘替芬(naftifine)、布替萘芬(butenafine))、棘白菌素(echinocandin)(例如阿尼芬淨(anidulafungin)、卡泊芬淨(caspofungin)、米卡芬淨(micafungin))、苯甲酸、環吡酮(ciclopirox)、托萘酯(tolnaftate)、十一碳烯酸、氟胞嘧啶或5-氟胞嘧啶、灰黃黴素(griseofulvin)及鹵苯炔醚(haloprogin)。

套組

本發明之抗GITR組合物可提供於套組中。抗GITR抗體、抗體片段或抗原結合分子一般在小瓶或容器中。視需要，抗體可為液體或乾燥(例如凍乾)形式。套組可包含如本文所述之本發明之抗GITR抗體、抗體片段或抗原結合分子，且視情況亦含有第二或第三藥劑。在一些實施例中，套組含有本發明之抗GITR抗體、抗體片段或抗原結合分 子及醫藥學上可接受之稀釋劑。抗GITR抗體、抗體片段或抗原結合分子可與第二或第三藥劑一起以同一調配物或各別調配物形式(例如混合物形式或於各別容器中)提供於套組中。套組可含有提供一或多種劑量之抗GITR抗體、抗體片段或抗原結合分子之等分試樣。若提供多次投藥之等分試樣，則劑量可為均勻或變化的。變化之給藥方案可視需要遞增或減少。抗GITR抗體、抗體片段或抗原結合分子及第二藥劑之劑量可獨立地為一致或不同的。

在一些實施例中，套組可進一步含有標靶抗原。標靶抗原或疫苗取決於待治療之疾病病狀。舉例而言，標靶抗原可來自腫瘤細胞、細菌細胞、真菌、寄生蟲或病毒。標靶抗原可視需要為肽、多肽、細胞、聚核苷酸(例如裸質體或病毒載體)形式。在一些實施例中，標靶抗原為腫瘤相關抗原。例示性標靶抗原如本文中論述；此項技術中已知之其他標靶抗原亦可用。

在一些實施例中，套組進一步含有細胞毒性劑。舉例而言，套組可含有結合於且減少或消耗CD4+ CD25+調節性T細胞(Treg)之促效抗體或抗原結合分子。例示性Treg細胞消耗抗體或抗原結合分子結合於CD25或CCR4。參見Expert Opin Ther Patents(2007)17(5)：567-575及其中所論述之參考文獻。

在一些實施例中，套組進一步含有共抑制信號之抑制劑。例示性抑制劑包括CTLA-4之抑制劑及PD-1/PD-L1(例如B7-H1)相互作用之抑制劑。在一些實施例中，套組進一步含有結合於且抑制CTLA-4之抗體。在一些實施例中，套組進一步含有結合於且抑制PD-1之抗體。在一些實施例中，套組進一步含有結合於且抑制B7-H1之抗體。參見例如Expert Opin Ther Patents(2007)17(5)：567-575；及Melero，等人，Clin Cancer Res(2009)15(5)：1507-1509及其中所論述之參考文獻。

在一些實施例中，套組進一步含有一或多種免疫刺激劑。舉例而言，在一些實施例中，套組含有免疫刺激性細胞激素，例如IL-7、IL-12或IL-15。替代地，套組可含有第二免疫刺激性抗體。舉例而言，套組可含有腫瘤壞死因子受體超家族之另一成員的促效抗體或抗原結合分子。例示性第二免疫刺激標靶包括(但不限於)TNFRSF4腫瘤壞死因子受體超家族成員4(亦稱為OX40)或腫瘤壞死因子受體超家族成員9(亦稱為TNFRSF9、4-1BB或CD137)。參見例如Expert Opin Ther Patents(2007)17(5)：567-575；Pardee等人，Immunotherapy(2009)1(2)：249-264；及Melero等人，Clin Cancer Res(2009)15(5)：1507-1509及其中所論述之參考文獻。

在一些實施例中，套組進一步含有化學治療劑。所選藥劑取決於待治療之病狀，例如癌症或傳染病，諸如細菌感染、真菌感染、病毒感染或寄生蟲感染。例示性化學治療劑包括此項技術中已知及本文所述之任何抗腫瘤、抗病毒、抗細菌、抗寄生蟲及抗真菌劑。

提高T細胞反應之方法 進行治療或預防之病狀

本發明之抗GITR促效抗體及抗體片段可用於增強有需要之患者的CD4⁺ T輔助細胞及CD8⁺細胞溶解性T細胞反應。因此，抗體可用於提高或增強患者之T細胞反應，例如以實現可用提高或增強之免疫反應對抗的疾病的降低、逆轉、抑制或預防。在一個態樣中，本發明提供為有需要之個體提高T細胞反應的方法，其包含投與個體治療有效量之如本文所述之本發明之抗GITR促效劑抗體或抗體片段。在一個態樣中，本發明亦提供一種抗GITR促效劑抗體或抗體片段，其用於提高個體之T細胞反應。在另一態樣中，本發明提供一種組合物，其包含此類用於提高個體之T細胞反應的抗體或抗體片段。

進行治療之病狀包括癌症及傳染病。出於治療目的，患者可患 有癌症或腫瘤或傳染病，例如細菌、病毒、真菌或寄生蟲感染。出於預防目的，患者可處於癌症之緩解中或可預計暴露於細菌、病毒、真菌或寄生蟲感染。抗體亦可充當佐劑以提高或促進或增強針對初級抗原或標靶抗原(例如疫苗)之免疫反應。

在一些實施例中，患者患有癌症，懷疑患有癌症或正處於癌症之緩解中。用抗GITR抗體進行治療之癌症通常表現如本文所述之腫瘤相關抗原(TAA)。進行治療之癌症包括(但不限於)上皮癌或癌瘤，以及肉瘤及淋巴瘤。在一些實施例中，癌症為黑色素瘤、卵巢癌、腎癌、結腸直腸癌、***癌、肺癌(包括非小細胞肺癌(NSCLC))、乳癌、神經膠質瘤或纖維肉瘤。參見例如Pardee等人，Immunotherapy(2009)1(2)：249-264及其中所論述之參考文獻。在一些實施例中，癌症類型選自由以下組成之群：胰臟癌、黑色素瘤、乳癌、肺癌、支氣管癌、結腸直腸癌、***癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、腦癌或中樞神經系統癌症、周邊神經系統癌症、食道癌、子宮頸癌、子宮或子宮內膜癌、口腔癌或咽癌、肝癌、腎癌、睪丸癌、膽道癌、小腸或附件癌、唾液腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤、血液組織癌及頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)。

在一個態樣中，本發明提供為有需要之個體治療表現腫瘤相關抗原之癌症的腫瘤生長的方法，其包含投與個體治療有效量之如本文所述之本發明之抗GITR促效劑抗體或抗體片段。本發明亦提供本發明之抗GITR促效劑抗體或抗體片段，其用於治療個體之表現腫瘤相關抗原之癌症的腫瘤生長。本發明進一步提供一種包含本發明之抗體或抗體片段的組合物，其用於降低、抑制或預防個體的表現腫瘤相關抗原之癌症的腫瘤生長。

在一些實施例中，促進個體之癌症的診斷或預後的方法包含使用本發明之抗GITR促效劑抗體或抗體片段來偵測個體之腫瘤中或周 圍GITR的表現。

在一些實施例中，患者患有傳染病，例如細菌、病毒、真菌或寄生蟲感染。抗GITR促效抗體可用於降低、抑制及/或預防例如絲蟲病及利什曼體病(leishmaniasis)中之寄生蟲。

在一些實施例中，抗GITR促效抗體可用於治療病毒感染，包括(但不限於)肝炎病毒感染，例如慢性肝炎C型(HCV)感染、單純疱疹病毒(HSV)感染或人類免疫缺陷病毒(HIV)感染。在一些實施例中，抗GITR促效抗體可用於治療選自由以下組成之群的病毒感染：肝炎A型、肝炎B型、肝炎C型、流感病毒、水痘、腺病毒、單純疱疹I型(HSV I)、單純疱疹II型(HSV II)、牛瘟、鼻病毒、埃可病毒、輪狀病毒、呼吸道融合細胞病毒、乳頭狀瘤病毒、乳多泡病毒、巨細胞病毒、埃克諾病毒、蟲媒病毒、漢坦病毒、柯薩奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、風疹病毒、脊髓灰質炎病毒、人類免疫缺陷病毒I型(HIV I)及人類免疫缺陷病毒II型(HIV II)、任何小RNA病毒科、腸病毒、杯狀病毒科、諾沃克病毒群中之任一者、披衣病毒(諸如甲病毒、黃病毒)、冠狀病毒、狂犬病毒、馬堡病毒、埃博拉病毒，副流感病毒、正黏液病毒、布尼亞病毒、沙粒狀病毒、呼腸孤病毒、輪狀病毒、環狀病毒、人類T細胞白血病病毒I型、人類T細胞白血病病毒II型、猴免疫缺乏病毒、慢病毒、多瘤病毒、小病毒、埃-巴二氏病毒、人類疱疹病毒6、猴庖疹病毒1(B病毒)及痘病毒。

在一些實施例中，抗GITR促效抗體可用於治療細菌感染，包括(但不限於)以下之感染：奈瑟氏菌屬、鏈球菌屬、變異鏈球菌、嗜血桿菌屬、莫拉菌屬、鮑特氏菌屬、分支桿菌屬、軍團菌屬、埃希氏菌屬、弧菌屬、耶爾森菌屬、曲桿菌屬、沙門氏菌屬、李氏菌屬、螺旋桿菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、梭菌屬、芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬、疏螺旋體屬、艾利希體屬、立克次體屬、衣原體 屬、鉤端螺旋體屬、密螺旋體屬。

投與抗GITR抗體

醫師或獸醫可以低於為達成所要治療作用所需之水準開始給與醫藥組合物中所用之本發明之抗體或抗體片段，且逐漸增加劑量直至達成所要作用為止。一般而言，本發明組合物之有效劑量視多種不同因素而變化，包括待治療之特定疾病或病狀、投藥方法、標靶位點、患者之生理學狀態、患者為人類或動物、所投與之其他藥物及治療為預防性或治療性的。需要滴定治療劑量以使安全性及功效達最佳。為投與抗體，劑量在每公斤宿主體重約0.0001至100mg範圍內，且更通常在0.01至5mg範圍內。舉例而言，劑量可為每公斤體重1mg或每公斤體重10mg或在1-10mg/kg範圍內。給藥可視需要或適宜時為每天、每週、每兩週、每月或更頻繁或更不頻繁。例示性治療方案需要每週投與一次或每兩週投與一次或一個月一次或每3至6個月一次。

在一些實施例中，投與編碼本發明之抗GITR抗體、抗體片段或抗原結合分子的聚核苷酸。在藥劑為核酸之實施例中，典型劑量可在每公斤體重約0.1mg至每公斤體重約100mg(且包括約100mg)範圍內，例如在每公斤體重約1mg至每公斤體重約50mg之間。在一些實施例中，每公斤體重約1、2、3、4、5、10、15、20、30、40或50mg。

抗體或抗體片段可以單次劑量或分次劑量投與。抗體或抗體片段通常在多個時機投與。視需要或適宜時，單次劑量之間的時間間隔可為每週、每兩週、每月或每年。時間間隔亦可為不規則的，其藉由量測患者中抗GITR抗體或抗體片段之血液含量所指示。在一些方法中，調節劑量以達成1-1000μg/ml之血漿抗體或抗體片段濃度，且在一些方法中為25-300μg/ml。替代地，抗體或抗體片段可以持續釋放調配物形式投與，在此情況下不需要頻繁投與。劑量及頻率視患者中 抗體或抗體片段之半衰期而變化。一般而言，人類化抗體展示的半衰期比嵌合抗體及非人類抗體之半衰期長。投藥之劑量及頻率可視治療為預防性或治療性的而變化。在預防性應用中，以相對不頻繁之時間間隔長期投予相對較低劑量。一些患者在其餘生中繼續接受治療。在治療性應用中，有時需要以相對短時間間隔投與相對高劑量，直至疾病之進展降低或終止，且較佳直至患者展示疾病之症狀部分或完全改善。之後，可向患者投與預防性方案。

與第二藥劑共同投與

在一些實施例中，將抗GITR抗體、抗體片段或抗原結合分子與第二或第三藥理學藥劑共同投與。抗GITR抗體、抗體片段或抗原結合分子及第二或第三藥劑可以混合物形式或各別調配物形式投與。抗GITR抗體、抗體片段或抗原結合分子及第二或第三藥劑可同時或依序投與。抗GITR抗體、抗體片段或抗原結合分子及第二或第三藥劑可視需要經由相同投藥途徑或經由不同投藥途徑投與。用於與本發明之抗GITR促效抗體、抗體片段或抗原結合分子共同投與的例示性第二藥劑及第三藥劑包括(但不限於)初級或標靶抗原、提高腫瘤細胞之免疫原性的藥劑、抑制或抑止共抑制信號之藥劑。抗GITR促效抗體、抗體片段或抗原結合分子亦可與用於治療所治療疾病病狀之化學治療劑共同投與，例如以提高化學治療劑之功效或進一步提高針對標靶抗原之免疫反應。抗GITR促效抗體、抗體片段或抗原結合分子亦可用於與治療指定疾病病狀之現有程序(例如輻射或手術)的組合療法。

本發明之抗GITR抗體、抗體片段或抗原結合分子可與初級或標靶抗原共同投與。標靶抗原或疫苗取決於待治療之疾病病狀。舉例而言，標靶抗原可來自腫瘤細胞、細菌細胞、真菌、病毒或寄生蟲。標靶抗原可視需要為肽、多肽、細胞或聚核苷酸之形式。

在一些實施例中，將抗GITR抗體、抗體片段或抗原結合分子與來自例如選自由以下組成之群的病毒的標靶抗原共同投與：肝炎A型、肝炎B型、肝炎C型、流感病毒、水痘、腺病毒、單純疱疹I型(HSV I)、單純疱疹II型(HSV II)、牛瘟、鼻病毒、埃可病毒、輪狀病毒、呼吸道融合細胞病毒、乳頭狀瘤病毒、乳多泡病毒、巨細胞病毒、埃克諾病毒、蟲媒病毒、漢坦病毒、柯薩奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、風疹病毒、脊髓灰質炎病毒、人類免疫缺陷病毒I型(HIV I)及人類免疫缺陷病毒II型(HIV II)、任何小RNA病毒科、腸病毒、杯狀病毒科、諾沃克病毒群中之任一者、披衣病毒(諸如甲病毒、黃病毒)、冠狀病毒、狂犬病毒、馬堡病毒、埃博拉病毒，副流感病毒、正黏液病毒、布尼亞病毒、沙粒狀病毒、呼腸孤病毒、輪狀病毒、環狀病毒、人類T細胞白血病病毒I型、人類T細胞白血病病毒II型、猴免疫缺乏病毒、慢病毒、多瘤病毒、小病毒、埃-巴二氏病毒、人類疱疹病毒6、猴庖疹病毒1(B病毒)及痘病毒。

在一些實施例中，將抗GITR抗體、抗體片段或抗原結合分子與來自例如選自由以下組成之群的細菌的標靶抗原共同投與：奈瑟氏菌屬、鏈球菌屬、變異鏈球菌、嗜血桿菌屬、莫拉菌屬、鮑特氏菌屬、分支桿菌屬、軍團菌屬、埃希氏菌屬、弧菌屬、耶爾森菌屬、曲桿菌屬、沙門氏菌屬、李氏菌屬、螺旋桿菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、梭菌屬、芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬、疏螺旋體屬、艾利希體屬、立克次體屬、衣原體屬、鉤端螺旋體屬、密螺旋體屬。

在一些實施例中，將抗GITR抗體、抗體片段或抗原結合分子與腫瘤相關抗原(TAA)共同投與。TAA可為經分離多肽或肽，可為完整細胞之一部分或腫瘤細胞溶解物之一部分。例示性TAA如上文所述；此項技術中已知之其他TAA亦可用。

在一些實施例中，將抗GITR抗體、抗體片段或抗原結合分子與 來自患者的自體腫瘤細胞或來自另一患者之相同組織類型的同種異體腫瘤細胞共同投與。腫瘤細胞可為完整細胞、腫瘤細胞溶解物、凋亡腫瘤細胞或總腫瘤mRNA之形式。腫瘤細胞可經轉染以表現提高或增強患者中腫瘤細胞之免疫原性的多肽，例如經轉染以表現粒細胞群落刺激因子(GM-CSF)。腫瘤細胞可來自任何癌性組織，包括(但不限於)上皮癌或癌瘤，以及肉瘤及淋巴瘤。在一些實施例中，癌症為黑色素瘤、卵巢癌、腎癌、結腸直腸癌、***癌、肺癌(包括非小細胞肺癌(NSCLC))、乳癌、神經膠質瘤或纖維肉瘤。參見例如Pardee等人，Immunotherapy(2009)1(2)：249-264及其中所論述之參考文獻。在一個實施例中，腫瘤細胞來自例如胰臟癌、黑色素瘤、乳癌、肺癌、支氣管癌、結腸直腸癌、***癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、腦癌或中樞神經系統癌症、周邊神經系統癌症、食道癌、子宮頸癌、子宮或子宮內膜癌、口腔癌或咽癌、肝癌、腎癌、睪丸癌、膽道癌、小腸或附件癌、唾液腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤、血液組織癌及頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)。

在一些實施例中，將抗GITR抗體、抗體片段或抗原結合分子與細胞毒性劑共同投與。舉例而言，將抗GITR抗體或抗原結合分子與結合於且減少或消耗CD4+ CD25+調節性T細胞(Treg)之促效抗體或抗原結合分子共同投與。例示性Treg細胞消耗抗體或抗原結合分子結合於CD25或CCR4。參見Expert Opin Ther Patents(2007)17(5)：567-575及其中所論述之參考文獻。

在一些實施例中，將抗GITR抗體、抗體片段或抗原結合分子與共抑制信號之抑制劑共同投與。例示性抑制劑包括CTLA-4之抑制劑及PD-1/PD-L1(例如B7-H1)相互作用之抑制劑。在一些實施例中，將抗GITR抗體與結合於且抑制CTLA-4之抗體共同投與。在一些實施例中，將抗GITR抗體與結合於且抑制PD-1之抗體共同投與。在一些實 施例中，將抗GITR抗體與結合於且抑制B7-H1之抗體共同投與。參見例如Expert Opin Ther Patents(2007)17(5)：567-575；及Melero等人，Clin Cancer Res(2009)15(5)：1507-1509及其中所論述之參考文獻。

亦可將抗GITR抗體、抗體片段或抗原結合分子與一或多種免疫刺激劑共同投與。舉例而言，在一些實施例中，將抗GITR抗體或抗體片段與免疫刺激性細胞激素(例如IL-7、IL-12或IL-15)共同投與。替代地，可將抗GITR抗體、抗體片段或抗原結合分子與第二免疫刺激性抗體共同投與。舉例而言，亦可將抗GITR抗體、抗體片段或抗原結合分子與腫瘤壞死因子受體超家族之另一成員的促效抗體、抗體片段或抗原結合分子共同投與。例示性第二免疫刺激標靶包括(但不限於)TNFRSF4腫瘤壞死因子受體超家族成員4(亦稱為OX40)或腫瘤壞死因子受體超家族成員9(亦稱為TNFRSF9、4-1BB或CD137)。參見例如Expert Opin Ther Patents(2007)17(5)：567-575；Pardee等人，Immunotherapy(2009)1(2)：249-264；及Melero等人，Clin Cancer Res(2009)15(5)：1507-1509及其中所論述之參考文獻。

亦可將抗GITR抗體、抗體片段或抗原結合分子與化學治療劑共同投與。所選藥劑取決於待治療之病狀，例如癌症或傳染病，諸如細菌感染、真菌感染、病毒感染或寄生蟲感染。可將抗GITR抗體、抗體片段或抗原結合分子與熟習此項技術者已知治療所治療疾病病狀之化學治療劑共同投與。例示性化學治療劑如本文中論述；此項技術中已知之其他化學治療劑亦可用。

圖1A-C說明本發明之GITR mAb之抗原決定基定位。圖1A描繪與質譜偶聯之氫/氘交換(HDXMS)分析的結果。結果指出MAB1(親本mAb)抗原決定基之ECD的CRD1區(SEQ ID NO：88)。圖1B描繪使用人類GITR之細胞外域(hGITR ECD)製備的N端缺失構築體之示意圖。圖 1C描繪MAB與hGITR ECD構築體之結合結果。來自人類GITR(hGITR)細胞外域(ECD)之富含半胱胺酸之域1(CRD1)的N端缺失使MAB4及MAB5與hGITR不能結合。圖1D描繪丙胺酸掃描突變誘發之結果。除GITR突變體E78A外，MAB7結合於所有突變蛋白質。執行ForteBio^TM結合分析，且結果亦確認MAB7不能結合於hGITRE78A突變蛋白質(未示)。

圖2A-2E描繪抗GITR MAB抗體之結合實驗的結果。如藉由ELISA分析所測定，MAB4及MAB5特異性結合於來自人類及獼猴之GITR(A)，但不特異性結合於來自嚙齒動物之GITR(B)；且MAB7具有類似概況(C)。如藉由FACS競爭分析所測定，MAB7與GITR配體結合競爭(D)。ELISA分析亦展示本發明之抗GITR抗體不結合於TNF受體超家族(TNFRSF)之其他成員(E)。Protagen^TM晶片分析亦確認該等抗體不結合於其他非標靶蛋白質(未示出)。

圖3說明經工程改造以表現GITR之293細胞中的胞內信號傳導。圖3A說明重組人類GITR配體(GITR-L)活化經穩定轉染以過度表現人類GITR之293細胞中的胞內信號傳導。圖3B說明單株抗體MAB4及MAB5在該等抗體交聯時與GITR-L相當地活化經轉染以過度表現人類GITR之293細胞中的胞內信號傳導(GITRL之EC₅₀為約65nM，相比之下，在交聯劑存在下促效抗體之EC₅₀為約2.5nM)。圖3C說明交聯MAB抗體活化細胞中之胞內信號傳導，因為MAB7及MAB8亦以類似於交聯MAB4之方式促進經人類GITR及NFkB-螢光素酶報導基因穩定轉染之293細胞中的NFκB活化。圖3D說明交聯之MAB4及MAB5促進經獼猴GITR及NFκB-螢光素酶報導基因穩定轉染之293細胞中的NFκB活化。交聯MAB7可見類似活化(資料未示)。

圖4說明MAB7對T細胞之活體外共刺激活性取決於T細胞活化。使抗CD3(OKT3)、抗CD28(CD28.2)及抗GITR mAb於珠粒上交聯(以 1：1：3之比率)，隨後與PBMC一起培育。MAB7為CD4+ T細胞之共活化劑且在TCR接合後刺激CD4+ T細胞(4A)及CD8+ T細胞(4B)中之T細胞增殖以及細胞激素產生，例如IFNγ產生(4C)。MAB4及5可見類似結果(資料未示)。

圖5A-D說明在不同水準之GITR表現細胞中，MAB7之活體外ADCC活性。MAB7能夠誘導經由FcgRIIIa進行之信號傳導，其中在GITR信號傳導水準增加後活性增加。

圖6說明GITR在hGITR-hGITRL基因嵌入小鼠中發揮功能。自hGITR-hGITRL基因嵌入小鼠分離脾細胞且在未用CD3及CD8抗體刺激或用其刺激下培養48小時，隨後用不同濃度之對照或MAB7脈衝處理30分鐘，隨後固定且用結合螢光團之抗體染色且藉由流式細胞術分析。圖6A描繪如下結果，其展示在經刺激CD8+ T細胞上hGITR之表現上調。圖6B藉由hFc染色描繪結合於T細胞之抗hGITR抗體之結果，其展示MAB7可結合於小鼠CD8+ T細胞上所表現之hGITR。圖6C及6D描繪MAB7結合於經刺激CD8+ T細胞與增加之T細胞活化相關，如藉由胞內pIKK染色(6C)及T細胞活化(6D)所示。*p<0.05，**p<0.005。

圖7A-C說明MAB7在活體內發揮功能。用單次劑量之媒劑(n=8/時間點)或MAB7(n=10/時間點)抗體處理具有確定之Colon26腫瘤的hGITR-hGITRL雙基因嵌入小鼠。圖7A描繪每週兩次腫瘤量測及使用方程式(L×W²)/2計算之腫瘤體積的結果。所示資料來自十五(15)天時間點組。圖7B及7C描繪來自全血之結果，且圖7D及7E描繪來自腫瘤的結果，該等腫瘤在給藥後3天收集且藉由流式細胞術分析免疫細胞上之細胞表面hGITR表現。(*p<0.05，****p<0.00005)。

圖8說明MAB7在活體內對Colon26腫瘤引發抗腫瘤免疫反應。用單次劑量之媒劑(n=8/時間點)或MAB7(n=10/時間點)處理具有確定之Colon26腫瘤的hGITR-hGITRL雙基因嵌入小鼠。圖8A描繪給藥後3天 T調節細胞之結果。圖8B-8C描繪遵循腫瘤中之處理水準給藥15天後腫瘤位點中所存在之淋巴細胞(8B)及經活化CD8+ T細胞(8C)的結果。將細胞之絕對數根據腫瘤尺寸標準化以說明媒劑與MAB7處理組之間腫瘤尺寸之顯著差異。圖8D描繪處理動物中得到之Teff/Treg比率，其藉由將總瘤內活化CD8+ T細胞與CD4+ FOXP3+ Treg比較以產生T_eff/T_reg比率而測定。圖8E描繪來自與Colon26腫瘤細胞一起離體培育且使用IFNg ELISPOT分析量測CTL反應的經純化CD8+ T細胞的脾細胞分析之結果。(*p<0.05，***p<0.0005)。

GITR促效抗體MAB2、MAB3、MAB4、MAB5、MAB6、MAB7及MAB8之產生

人類抗體MAB2、MAB3、MAB4、MAB5、MAB6、MAB7及MAB8藉由工程改造鼠類單株GITR促效抗體MAB1以與人類生殖系抗體具有較大序列同源性而產生。MAB2、MAB3、MAB4、MAB5、MAB6、MAB7及MAB8保留親本鼠類抗體MAB1之抗原決定基特異性、親和力及獼猴GITR交叉反應性。相較於初始鼠類抗體，MAB2、MAB3、MAB4、MAB5、MAB6、MAB7及MAB8與人類生殖系序列具有高得多的同源性，因此應更加為人類免疫系統所容許。

使用Humaneered^®技術平台(可經由KaloBios(South San Francisco,CA(在全球資訊網之kalobios.com上))獲得)將小鼠單株MAB1工程改造以使其蛋白質序列更接近人類生殖系序列且降低其免疫原性。Humaneered^®抗體極接近人類抗體，其具有與人類生殖系序列具有高同源性之V區序列，同時仍保留親本或參考抗體之特異性及親和力(美國專利公開案2005/0255552及2006/0134098)。該方法首先鑑別參考Fab之重鏈及輕鏈可變區中的最小抗原結合特異性決定子(BSD)(通常重鏈CDR3及輕鏈CDR3內之序列)。因為此等重鏈及輕鏈 BSD維持在方法期間所建構之所有庫中，故各庫為抗原決定基集中庫，且所得Humaneered^®抗體保留初始小鼠抗體之抗原決定基特異性。

隨後，產生完整鏈庫(其中整個輕鏈或重鏈可變區經人類序列之庫置換)及/或卡匣庫(其中小鼠Fab之重鏈或輕鏈可變區之一部分經人類序列之庫置換)。可使用基於細菌分泌系統來使庫之成員表現為抗體Fab片段，且使用群落轉移結合分析(CLBA)篩選庫之抗原結合Fab。可進一步表徵陽性純系以鑑別具有最高親和力之純系。在殘餘鼠類序列之情形下，將支持結合之所鑑別人類卡匣組合於最終庫篩選中以產生全人類V區。

所得Humaneered^®抗體Fab具有源自人類庫之V區序列，保留CDR3區內鑑別之短BSD序列且具有人類生殖系構架4區。藉由將重鏈及輕鏈之可變區選殖於IgG表現載體中將此等Fab轉化為完整IgG。此方法中產生之Humaneered^®抗體保留親本鼠類抗體之結合特異性，其相較於親本抗體通常對抗原具有相等或較高親和力，且在蛋白質層面具有相較於人類生殖系抗體基因具有高度序列一致性的V區。

方法 鼠類抗GITR mAb MAB1之產生

用人類GITR之N端區域(aa 26-161)使用需要多位點重複免疫(RIMMS)的程序(McIntyre GD.Hybridoma 1997)使Bcl-2轉殖基因小鼠(C57BL/6-Tgn(bcl-2)22 wehi品系)免疫，繼而自高力價小鼠產生融合瘤。使用針對hGITR之夾心ELISA及NFκB報導基因分析來鑑別且選擇分泌MAB1之融合瘤以確認hGITR結合及促效活性。

鼠類V區之選殖

使用標準方法藉由RT-PCR自獲自融合瘤細胞株的RNA擴增來自鼠類單株MAB1之可變區。重鏈可變區自具有HV3(5'- GGGTCTAGACACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTC-3'(SEQ ID NO：95))及HC恆定(5'-GCGTCTAGAAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC-3'(SEQ ID NO：96))之MAB1 cDNA擴增。輕鏈可變區自具有LV3(5'-GGGTCTAGACACCATGGAGWCACAKWCTCAGGTCTTTRTA-3'(SEQ ID NO：97))及LC恆定(5'-GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG-3'(SEQ ID NO：19))之相同cDNA擴增。將可變重鏈及輕鏈產物***pcDNA3.1載體中且檢驗序列。使用重鏈及輕鏈載體作為模板來PCR併入限制酶位點以供選殖於KaloBios載體中：將Vh在NcoI(5')及NheI(3')處選殖於KB1292-His(KB1292之經修飾形式，其編碼C端可撓性連接子及CH1上胺基酸序列AAGASHHHHHH(SEQ ID NO：13)之6-His標記物(SEQ ID NO：11))中；將Vk在NcoI(5')及BsiWI(3')處選殖於KB1296中。隨後藉由用BssHII及ClaI限制消化及接合將此等各別重鏈及輕鏈載體組合成於單一雙順反子KaloBios Fab表現載體中。將Fab片段由此載體表現於大腸桿菌中。測試此Fab之hGITR-抗原結合且稱為MAB1rFab。

Fab純化

Fab片段藉由使用KaloBios表現載體自大腸桿菌分泌而表現。使細胞在2×YT培養基中生長至約0.6之OD500。藉由添加達100μM之IPTG且在33℃下震盪4小時誘導表現。根據標準方法藉由滲透性溶解且藉由親和層析使用Ni-NTA管柱(HisTrap HP管柱；GE Healthcare目錄號17-5247-01)純化自周質部分獲得組裝之Fab。將Fab於含有500mM咪唑之緩衝液中溶離且針對PBS(pH7.4)在無鈣及鎂下充分透析。

庫建構

為限制鑑別人類GITR結合中支持BSD-FR4的互補人類CDR的複雜性，採用卡匣庫方法，其中僅親本鼠類V區之一部分經人類序列庫置換。初始鼠類MAB1 Vk最接近人類生殖系VkIII，故在製備Vk卡匣 庫時使用含有VkIII生殖系之兩個KaloBios庫(KB1423及KB1424)的混合物。含有VH3生殖系之KaloBios庫(KB1413，KB1414)用於建構Vh卡匣庫。藉由重疊PCR建構兩類卡匣：使用上述生殖系限制KaloBios庫擴增FR1、CDR1及FR2中含有人類序列之前端卡匣(8C1VK3FE-01及MAB1VH3FE-01)及FR3中含有人類序列之FR3卡匣(MAB1VK3FR3-01及MAB1VH3FR3-01)。將各Vh卡匣庫在NcoI(5')及KpnI(3')處選殖於載體KB1292-His中；將各Vk卡匣庫在NcoI(5')及HindIII(3')處選殖於載體KB1296-B(KaloBios載體KB1296之經修飾形式，其在FR4中添加有靜默HindIII位點)中。隨後藉由用BssHII及ClaI消化，隨後接合，將所得Vh或Vk質體庫與來自經最佳化之參考Fab的互補鏈(MAB1opVK或MAB1 opVH)組合(例如將Vh前端庫與經最佳化之參考Vk載體組合)，得到表現完整Fab之雙順反子載體之庫。

無VH3前端純系以高親和力結合人類GITR，因此，建構第二VH3前端庫(MAB1VH3FE-02)。此庫在FR1、FR2及CDR2群中含有人類序列，其中CDR2群在所有位置編碼親本鼠類殘基或所選人類生殖系殘基。此庫之FR3區域序列來自選自VH3FR3庫(MAB1VH3FR3-01)之六個純系。

最終Vk完整鏈庫(MAB1VK3FCL-01)藉由組合來自VK前端之純系與VKFR3卡匣庫來建構，該等VKFR3卡匣庫所具有的突變誘發VK CDR2在所有位置編碼親本鼠類或所選人類生殖系殘基。將所得Vk完整鏈庫在NcoI及HindIII位點選殖於KB1296b中。將此VK完整鏈庫與多個所選VH3FR3庫純系配對以使得功能性Fab表現，且藉由CLBS篩選。抗原特異性純系藉由人類GITR特異性ELISA確認且藉由抗原親和力滴定ELISA分級。VH3完整鏈庫(MAB1VH3FcL-01)使用來自第二VH3前端庫(MAB1VH3FE-02)之所選純系產生，該第二VH3前端庫所具有的CDR2序列群在各位置含有親本鼠類或人類殘基。將此VH完整 鏈庫在NcoI及KpnI位點選殖於KB1292-his中。為產生最終完整鏈人類Fab表現庫，將所選VK完整鏈純系與VH完整鏈庫在BssHII及ClaI位點組合。

通用ELISA

將重組人類GITR及人類Fc融合蛋白(hGITR-hFc)用於所有ELISA分析。通常，藉由在4℃下隔夜培育使以PBS(pH 7.4)稀釋之hGITR-hFc抗原以每孔200ng結合於96孔微量滴定盤。用PBST沖洗三次後，在37℃下用1% BSA之PBS溶液阻斷培養盤一小時，隨後用PBST沖洗一次。隨後將含Fab細胞培養基或經稀釋純化之Fab(50μL)添加至各孔中。在37℃下培育一小時或在4℃下隔夜培育後，用PBST沖洗培養盤三次。將用PBST(50μL)1：5000稀釋之抗人類κ鏈HRP結合物(Sigma #A7164)添加至各孔中，且在室溫下培育培養盤45分鐘。用PBST洗滌培養盤三次，隨後將100μL SureBlue TMB受質(KPL #52-00-03)添加至各孔中，且在室溫下培育培養盤約10分鐘。於分光光度計中在650nm下讀取培養盤。

親和力滴定ELISA

為評估所選Fab產生純系之抗原結合，開發出親和力滴定ELISA。此分析組合兩個連續ELISA步驟：第一個，使用山羊抗人類Fab(Jackson ImmunoResearch Lab #109-005-097)捕捉物及山羊抗人類κ(Sigma #A7164)偵測物量測細胞培養基中之Fab濃度以標準化第二抗原滴定ELISA中所用之Fab之量；第二ELISA，即普通抗原特異性ELISA，以相同量之起始Fab產生抗原結合稀釋曲線。藉由比較不同純系之稀釋曲線，鑑別高親和力純系。

群落轉移結合ELISA(CLBA)

基本上如(美國專利公開案2005/0255552及2006/0134098)中所述，使用以2.0μg/mL塗佈hGITR-hFC之PBS(pH7.4)溶液的硝化纖維 素濾膜執行Fab片段之Humaneered®抗體庫篩選。使用以PBST 1：5000稀釋之山羊抗人類κ鏈HRP結合物(Sigma #A7164)偵測結合於塗有抗原之濾膜的Fab，且用ECL加西方墨點偵測系統(GE Healthcare #RPN2132)產生墨點。

移除MAB4中之糖基化位點

藉由用精胺酸置換離胺酸或用精胺酸置換離胺酸及用天冬醯胺置換組胺酸移除MAB4重鏈之FR3與CDR3之接合點中的糖基化位點「KH」。藉由基於PCR之突變誘發使用p50H質體作為DNA模板來完成KH至RH及KH至RN的轉化。反向引子(TCTGGCGCAGTAATACACGGCC，SEQ ID NO：110)併入精胺酸替代離胺酸；正向引子(NNKGCCTATGGCCATGATGGCG，SEQ ID NO：111)在組胺酸位點具有簡併NNK三核苷酸。PCR反應用100ng模板、0.2μM各引子、200μM dNTP及2.5U pfuUltraII DNA聚合酶(Strategene)以50μl反應體積進行。PCR條件為94℃ 3分鐘，1個循環；94℃ 15秒，52℃ 20秒及65℃ 5分鐘，30個循環；及最後在72℃下5分鐘，1個循環。將DpnI(2U)添加至PCR反應中且在37℃下培育30分鐘以移除模板p50H。藉由1% SYBR凝膠分離擴增之MAB4重鏈變異體且使用Qiagen Gel純化套組純化。用T4 DNA聚核苷酸激酶處理經凝膠純化之PCR產物，接合且在安比西林選擇下轉型於DH5α化學勝任細胞(Invitrogen)中。

藉由群落PCR使用正向(GCCTTTCTCTCCACAGG，SEQ ID NO：112)及反向(GGCAAACAACAGATGGCTGG，SEQ ID NO：113)引子遵循GoTaqClear方案(Promega)選擇具有MAB7及MAB8重鏈之純系。PCR條件為94℃ 3分鐘，1個循環；94℃ 10秒，55℃ 30秒，72℃ 45秒，25次；及最後在72℃下5分鐘，1個循環。清洗PCR反應物以藉由與核酸外切酶I及Shrimp鹼性磷酸酶一起在37℃下培育樣品30分鐘 及在80℃下培育15分鐘測序。對PCR樣品測序且使用純系處理軟體(Clone Manager software)分析結果。

抗體產生及純化

所產生之抗體MAB2、MAB3、MAB4、MAB5、MAB6、MAB7及MAB8(IgG1κ)藉由根據製造商之方案使用293fectin轉染試劑(Invitrogen #51-0031)將如下載體共轉染於293 Freestyle細胞中產生。

MAB2-p35H+p35κ

MAB3-p38H+p38κ

MAB4-p50H+p35κ

MAB5-p51H+p35κ

MAB6-p56H+p35κ

MAB7-pMAB7H+p35κ

MAB8-pMAB8H+p35κ

使用5-mL HiTrap蛋白A HP管柱(GE Healthcare #17-0403-03)自293 Freestyle細胞上清液純化抗體。使用IgG溶離緩衝液(Pierce #21004)溶離抗體，且藉由透析將緩衝液交換於PBS中。於AKTA-FPLC液相層析系統(GE Healthcare)上進行蛋白A親和層析。

特異性ELISA

為進行特異性ELISA，由表現TNFRSF家族成員之細菌製成粗細胞溶解物。為防止與培養盤之非特異性結合，每毫升細菌溶解物添加50μL 5% BSA。用含TNFRSF之細菌溶解物以每孔100μL溶解物/BSA塗佈HisGrab 96孔鎳盤(Pierce #15142)且在室溫下培育1小時。隨後用PBST沖洗培養盤三次，隨後用10% FBS之PBS溶液稀釋MAB至0.5μg/mL且向各孔添加100μL。在室溫下培育培養盤1小時，隨後用PBST沖洗三次。用1：1 PBST：10% FBS之PBS溶液1：5000稀釋結合於HRP之抗人類κ抗體(Sigma #A7164)且向各孔中添加100μL。在室溫下 培育培養盤1小時，隨後用PBST洗滌三次。向各孔中添加100μL SureBlue TMB受質，且在室溫下培育培養盤約10分鐘，隨後用每孔100μL 2N H₂SO₄終止反應。於分光光度計中在450nm下讀取培養盤。

ELISA(GITR結合、物種交叉反應性、丙胺酸掃描)

使用384孔盤評定MAB與來自各種物種之GITR、各種丙胺酸突變構築體或GITR細胞外域的結合，其中用大鼠、小鼠、人類或獼猴GITR細胞外域(ECD)以每孔50ng塗佈384孔盤且在4℃下培育隔夜。在室溫下用1% BSA之PBS溶液阻斷培養盤一小時，隨後用PBST沖洗三次。隨後用PBS稀釋MAB至0.5μg/mL或1μg/mL且向各孔中添加20μL。在室溫下培育培養盤1小時，隨後用PBST洗滌三次。用阻斷緩衝液(25μL)1：5000稀釋抗人類κ抗體(Sigma #A7164)、抗人類γ抗體(Jackson Immunoresearch 109-036-098)、山羊抗小鼠抗體(Jackson ImmunoResearch 115-035-071)與HRP之結合物且添加至各孔中，或添加用阻斷緩衝液1：1000稀釋之結合hrp之HIS抗體(QIAGEN 1014992)。在室溫下培育培養盤1小時，隨後用PBST洗滌六次。將25μL SureBlue TMB(KPL 52-00-02)受質添加至各孔中且在室溫下培育培養盤約10分鐘。於分光光度計中在650nm下讀取培養盤。

細胞株、細胞

為產生293-hGITR-NFκB報導基因細胞株，用NFκB-螢光素酶報導基因及人類GITR(或獼猴GITR)穩定轉染293細胞。藉由在與GITR-L或促效抗體一起培育24小時後量測細胞內誘導之螢光素酶含量測定此等細胞中GITR信號傳導路徑之活化。為評定交聯Ab之作用，將其與過量F(ab')₂山羊抗人類Fcγ片段特異性抗體或蛋白A一起培育，隨後用於報導基因分析中。

產生純系道迪細胞株(Daudi cell line)，其表現人類免疫細胞上可 見之GITR量。

製備獼猴且使用MAB測定GITR結合。簡言之，將獼猴血液轉移於50mL錐形管(Falcon，#352098)中，隨後用PBS(HyClone，#SH30256.01)1：2稀釋且混合。使經稀釋血液小心地在18mL 90% Ficoll Paque PLUS(GE Healthcare #17-1440-03，用PBS稀釋)上分層，且在室溫下在不制動下以2,000×g於桌上型離心機中旋轉管30分鐘。在不干擾Ficoll上分散之PBMC層下小心地移除血漿層。隨後小心收集PBMC且將PBS添加至經分離PBMC中直至錐形管中之體積為45mL為止，混合，隨後在室溫下以300×g於桌上型離心機中旋轉15分鐘。小心抽吸上清液，添加4mL 1×BD溶解溶液(BD #555899)且使樣品輕緩渦旋。在室溫下在黑暗中培育3分鐘後，將40mL PBS添加至各樣品中，且使其在室溫下以200×g於桌上型離心機中旋轉10分鐘。小心抽吸上清液且用45mL PBS洗滌顆粒兩次，隨後在室溫下以200×g於桌上型離心機中旋轉10分鐘。過濾所得顆粒且以1×10⁶個細胞/毫升再懸浮於補充有青黴素/鏈黴素/麩醯胺酸(Hyclone #SV30082.01)之CTL測試培養基(CTLT-005)中。將100μL經純化獼猴PBMC置於96孔圓底盤(Corning，#3799)中。為活化PBMC，將100μL M-280甲苯磺醯基活化之與SP34-2/CD28.2抗體結合的戴諾珠粒(dynabead)(Life Technologies #142.04)添加至各孔中。使用3：1 CD3/CD28珠粒與PBMC之比率且於37℃組織培養培育箱中培育培養盤48小時。對於第0天染色，將200μL PBMC置於96孔圓底盤(Corning，#3799)中。對於刺激48小時之樣品，小心移除100μL上清液且將孔之其餘內含物小心地再懸浮且將200μL轉移至FACS染色培養盤。

FACS

用再懸浮於200μL冷PBS中之細胞製備培養盤。將LIVE/DEAD可固定染料(Life Technologies #L23105)於50μL DMSO中復原，且每毫 升冷PBS添加1μL經復原染料，且立即將細胞顆粒再懸浮於100μL LIVE/DEAD PBS溶液中，在冰上避光培育30分鐘，隨後洗滌且再懸浮於100μL含有2μg/mL MAB7或同型人類IgG1對照抗體之冷FACS緩衝液中且在冰上避光培育培養盤30分鐘。洗滌且再懸浮於100μL如下抗體混合物(PerCP Cy5.5抗人類CD3(BD #552852)、Alexa Fluor 700抗人類CD4(BD #560836)、V450抗人類CD8(BD #561426)、PE-Cy7抗人類CD25(BD #561405)及含PE抗人類之FACS緩衝液(Jackson Immuno #109-116-098))中，隨後於冰上避光培育培養盤30分鐘，隨後在4℃下以3,200RPM於桌上型離心機中旋轉1分鐘。用FACS緩衝液洗滌細胞，隨後再懸浮於100μL BD CytoFix(BD #554655)中且在室溫下避光培育培養盤15分鐘，隨後洗滌兩次且再懸浮於100μL FACS緩衝液中。用箔(Beckman Coulter，#538619)覆蓋培養盤且儲存在4℃下直至準備讀取為止。在FACS讀取之日，將培養盤以3,200RPM於桌上型離心機中旋轉1分鐘，且將50μL CML乳膠珠粒(Life Technologies #C37259)(每毫升FACS緩衝液4×10⁵個)添加至各孔中。於BD Fortessa流式細胞儀上讀取培養盤且使用FlowJo分析資料。

轉殖基因小鼠

藉由用人類GITR cDNA序列置換小鼠GITR之整個編碼序列(外顯子及內含子)產生hGITR基因嵌入小鼠。起始密碼子上游及終止密碼子下游之未轉譯序列來自小鼠基因組。藉由標準技術於BALB/c ES細胞中進行基因靶向，其中靶向載體具有源自BALB/c之同源組。藉由PCR鑑別數種ES細胞純系且藉由南方墨點法確認以含有精確人類cDNA嵌入。遵循標準小鼠胚胎學技術，將陽性ES細胞純系注入囊胚中，將其轉移於假孕接受者哺育母體中以產生嵌合後代。使雄性嵌合小鼠與生殖系中表現Cre重組酶之BALB/c雌性小鼠雜交以去除側接loxP之新黴素耐受性卡匣。一種純系產生白色後代，表明標靶ES細胞 可生殖系傳遞。去除側接loxP之卡匣藉由PCR基因分型確認。BALB/c wt小鼠之後續飼養步驟移除Cre重組酶。

藉由用後面有牛生長激素聚-A信號之人類GITRL cDNA序列置換小鼠之外顯子1之編碼部分產生hGITRL基因嵌入小鼠。所有ES細胞研究及小鼠胚胎學類似於上述程序進行。藉由兩個基礎品系異種交配2代以產生同型接合雙基因嵌入小鼠來產生hGITR-hGITRL雙基因嵌入小鼠。

功能分析

在促效活性之NFkB報導基因分析中測試MAB之功能活性。用PBS稀釋MAB至6μg/mL，且在室溫下在3倍過量之F(ab')₂片段山羊抗人類Fcγ特異***聯劑存在/不存在下培育30分鐘。替代地，用PBS稀釋MAB至6μg/mL且在室溫下在2倍過量蛋白A存在/不存在下培育30分鐘。隨後降10μL經培育MAB添加至384孔白色透明底分析盤中。將用hGITR及NFκB報導基因穩定轉染之HEK-293細胞株稀釋至5×10⁵個細胞/毫升且將20μL細胞懸浮液添加至各孔中。將培養盤在37℃組織培養培育箱中培育24小時。將30μL Cell Bright Glo添加至各孔中且在Acquest上讀取培養盤之發光情況。

使用HEK293 NFκB報導子親本細胞評定MAB阻斷配體結合之能力，且hGITR穩定細胞用於競爭結合分析及FACS分析。簡言之，將所收集之細胞以每毫升1×10⁶個細胞，每孔100μL塗佈於96孔圓底FACS盤(Corning)，隨後再懸浮於每孔200μL冷FACS緩衝液(1×PBS+1%FBS-HI+0.1%疊氮化鈉)中。自270nM至1.52pM於FACS緩衝液中以每孔100μL進行人類GITR配體滴定。將培養盤於冰上避光培育1小時，洗滌細胞，隨後得到4nM同型對照，或製備MAB溶液且以每孔100μL添加至適當孔中且將培養盤於冰上避光培育1小時，洗滌細胞，隨後以每孔100μL添加用FACS緩衝液1：100稀釋製備之PE結 合之山羊抗人類偵測抗體(Jackson ImmunoResearch)，且將培養盤於冰上避光培育30分鐘。用FACS緩衝液洗滌細胞，隨後以每孔100μL BD CytoFix(BD Biosciences)固定細胞且於冰上再避光培育15分鐘。洗滌經固定細胞兩次，以每孔150μL FACS緩衝液之最終體積再懸浮且在1週內於BD Fortessa流式細胞儀(BD Bioscience)上分析樣品。

在表現內源水準之GITR的初級T細胞上亦可經由自初級T細胞之增殖及細胞激素分泌發現MAB之促效活性。根據製造商之說明，使MABs結合於M-280甲苯磺醯基活化之珠粒(Invitrogen #142.04)上。在一些實驗中，亦使促效CD3(OKT3)及CD28(CD28.2)抗體結合於珠粒。將1×10⁵個新鮮純化之經CFSE標記之人類PBMC塗佈於96孔圓底組織培養物盤中之10μL CTL測試培養基(CTL #CTLW-010)中。隨後以1個T細胞：1個珠粒之比率添加100μL MAB結合珠粒。隨後在37℃組織培養培育箱中培育培養盤3天。培養基中所分泌細胞激素之含量使用MSD多重分析根據製造商之說明量測。將細胞用抗-CD4、-CD8a、-CD25、-GITR抗體及LIVE/DEAD染料染色，染色後，固定細胞且於流式細胞儀上讀取。藉由CFSE染色評定各CD4及CD8細胞之增殖，且添加計數珠粒，隨後FACS讀取，以使得可將樣品標準化。

MAB對T細胞之共刺激活性亦使用ELISpot方法量測以偵測IFNg。簡言之，藉由用70%乙醇塗佈2分鐘，繼而PBS洗滌，且與50μg IFNg單株抗體一起於PBS(Mabtech 3321-3)中培育隔夜製備ELISPOT盤(Millipore MSIPS4510)。給藥後15天，自媒劑或MAB7處理小鼠之脾分離經純化CD8+ T細胞。將T細胞以每孔0.25×10⁶個細胞塗佈於經塗佈ELISPOT盤中之CTL培養基(CTL測試培養基(CTL CTLT-005)，1mM Hepes(Mediatech MT25-060-C1)、2mM L-麩醯胺酸(Mediatech MT25-005-Cl)、1mM丙酮酸鈉(Mediatech MT25-000-Cl)、100μM MEM非必需胺基酸(Mediatech MT25-025-Cl)、66μM 2-巰基 乙醇(Gibco 21985-023)、100U/mL Pten/Strep(Gibco 10378016))中。在37℃下用10% ConA sup(BD Biosciences 354115)處理Colon26細胞48小時以上調MHC類別II表現，且用CTL培養基洗滌，隨後添加至T細胞中。將Colon26腫瘤細胞(20,000個/孔)添加至CTL中且在37℃下培育24-48小時。隨後用0.05% Tween-20/PBS洗滌培養盤，將10μg經生物素標記之抗IFNg Mab(Mabtech R4-6A2-生物素)添加至各孔中且在37℃下培育2小時。隨後用0.05% Tween-20/PBS洗滌培養盤，將Vectastain ABC溶液(Vector Labs PK6100)添加至各孔中且在室溫下培育1小時。隨後用0.05% Tween-20/PBS洗滌細胞，將根據製造商之方案製備之AEC受質(Sigma A6926)添加至各孔中且在室溫下培育4分鐘。隨後用自來水沖洗培養盤，乾燥且儲存於黑暗中24小時，隨後讀取。

使用報導子分析量測MAB誘導ADCC之能力。在96孔白色盤(Perkin Elmer F6178)中，將2×10³個hGITR-道迪細胞與4×10⁴個傑卡特(Jurkat)-V158細胞(穩定表現人類FcgRIIIa之V158變異體及NFAT報導子)一起以1個道迪細胞比20個傑卡特細胞之比率於50μL RPMI+10% FBS中培育。將相等體積之MAB添加至孔中且於37℃組織培養培育箱中培育培養盤3小時。培育後，將60μL Bright Glo添加至各孔中且在光度計上讀取培養盤。

使用自小鼠分離之脾進行活體外脾細胞分析。簡言之，藉由於gentleMACS Octo解離器(Miltenyi Biotech 130-095-937)上使用gentleMACS C管(Miltenyi Biotech 130-096-334)於5mL含有5% BSA(Miltenyi Biotech 130-091-376)之AutoMACS沖洗溶液(Miltenyi Biotech 130-091-222)中自動均質化將來自小鼠之脾解離。將勻漿經由0.70μM孔徑細胞過濾器(Fisher Scientific 22363548)過濾且用10mL AutoMACS緩衝液洗滌。再懸浮脾細胞且以每孔100,000個細胞塗佈於 96孔組織培養盤(Costar 3799)中之RPMI(HyClone SH30027.02)+10%人類血清(Cellgro 35-060.C1)+1×Pen/Strep/L-Glut(Gibco 15 140-112)中。為進行T細胞刺激，將0.4μg/mL抗小鼠CD3(eBioscience 16-0031-86)及0.8μg/mL抗小鼠CD28(eBioscience 13-0281-86)抗體添加至適當孔中。48小時後，將細胞立即分析或用對照或治療抗體脈衝處理30分鐘至96小時，用螢光團結合之抗體染色且藉由流式細胞術分析。

流式細胞術：對於表面標記物，將細胞在4℃下用抗CD19(BD Biosciences 562291)、抗CD8(Biolegend 100725)、抗CD4(eBioscience 25-0041)、抗CD69(BD Biosciences 561238)、抗hGITR(Miltenyi Biotech 130-092-895)及抗hIgG(Life Sciences A-10631)抗體染色30分鐘。為進行胞內染色，與細胞表面抗體一起培育後，洗滌細胞，根據製造商之方案用FOXP3 Fix/Perm緩衝液(Biolegend 421403)固定且滲透，且在4℃下與抗磷酸化IKKa/b抗體(Cell Signaling 2697)或抗FOXP3抗體(eBioscience 50-4774-42)一起培育30分鐘。於BD LSRFortessa細胞計數器上使用BD FACSDiva軟體(BD Biosciences)讀取細胞，且使用FlowJo軟體(TreeStar Inc.)分析流動資料.

活體內腫瘤模型.將鼠類Colon26癌瘤細胞培養於補充有10% FBS(Gibco 10099-141)、10mM HEPES(Gibco 15630-080)及1mM丙酮酸鈉(Gibco 11360-070)之RPMI 1640培養基(HyClone SH30027.02)中。用100μL含0.5×10⁶個Colon26細胞之RPMI於側腹中皮下注射8-10週齡雌性hGITR-hGITRL基因嵌入小鼠。使用數位測徑規量測腫瘤且使用方程式(L×W²)/2計算腫瘤體積。當腫瘤達到180mm³之平均尺寸時，將小鼠隨機分組且給與媒劑(PBS)或200μL PBS中之治療抗體(15mg/kg)的單次腹膜內注射。給與治療抗體後7天，將小鼠處死且收集腫瘤以藉由流式細胞術分析。所有動物實驗均在AAALAC認可機構中使用 IACUC批准方案進行。

在Prism軟體中使用具有兩尾95%信賴區間之史都登氏t檢驗(student's t-test)或進行圖基校正(Tukey correction)之單因子ANOVA進行統計分析。

結果 鼠類及參考V區胺基酸序列

將來自表現MAB1之雜交瘤細胞的RT-PCR產物測序，且使用ThermoElectron LTQ-Orbitrap質譜儀在蛋白質層面對此序列進行大體上(95%或大於95%)檢驗。隨後將MAB1之重鏈及輕鏈可變區選殖於KaloBios載體中以產生參考Fab MAB1rFab。MAB1中之第一胺基酸必須自天冬醯胺(N)變為麩胺酸(E)殘基以使得能夠選殖於KaloBios載體中而產生參考Fab；因此，MAB1rFab在第一VK位置中具有麩胺酸。Fab MAB1rFab具有來自與人類恆定區融合之MAB1的完整鼠類V區。除MAB1rFab以外，建構經最佳化之Fab，即MAB1opFab。MAB1rFab中之數個構架胺基酸殘基在MAB1opFab中變為人類生殖系殘基。

參考及經最佳化之參考Fab親和力分析

併入經最佳化之參考MAB1opFab的FR1及FR3中的人類生殖系殘基為由用於擴增人類V區譜系之PCR引子指定的殘基，因此存在於Humaneered®抗體V區庫之所有成員中。建構經最佳化之參考Fab以評定向人類生殖系之任何變化是否改變Fab結合之特性。使用ForteBio Octed QK系統及塗有經生物素標記之hGITR-hFc的Striptavidin高結合生物感測器分析MAB1rFab、MAB1opFab的親和力常數(Ka(1/Ms)、Kd(1/s)及KD(M)。相較於MAB1rFab，MAB1opFab具有極類似Kd，但Ka改良五倍，表明MAB1rFab中之胺基酸變化為容許的。

Humaneered®抗體Fab之庫建構及選擇

產生重鏈及輕鏈前端及FR3卡匣庫(生殖系家族限於VH3及VKIII) 且藉由CLBA篩選。對於VK，自VK前端(MAB1VK3FE-01)與FR3(MAB1VK3FR3-01)卡匣庫鑑別支持結合於人類GITR之純系。對於VH，自FR3卡匣庫(MAB1VH3FR3-01)而非自VH3前端庫(MAB1VH3FE-01)鑑別支持結合於人類GITR之純系。因為Vk前端及FR3卡匣庫中之大部分成員在CLBA中呈陽性，故使用此兩種庫之整個譜系藉由用在所有位置編碼親本鼠類或所選人類生殖系(VKIII L-16)殘基的突變誘發VK CDR2進行重疊PCR來建構Vk完整鏈庫(MAB1VK3FcL-01)。經由CLBA自VH3FR3庫(MAB1VH3FR3-01)鑑別出多種hGITR陽性純系且藉由人類GITR特異性ELISA確認。使用其中六者與VK完整鏈庫(MAB1Vk3FcL-01)配對，使得能夠進行功能性Fab表現及對此庫進行篩選。

因為自VH前端庫(MAB1VH3FE-01)未鑑別到以高親和力結合hGITR之純系，故隨後建構第二VH3前端庫(MAB1VH3FE-02)。此庫在來自六種所選VHFR3純系之CDR1及FR3序列的各位置具有親本鼠類或人類生殖系(VH3 3-30)殘基。自VK完整鏈庫(MAB1Vk3FcL-01)與第二VH前端庫(MAB1VH3FE-02)鑑別到多個hGITR結合物。此等純系藉由對含Fab之細胞上清液進行人類GITR特異性ELISA分析確認且藉由hGITR親和力滴定ELISA進行等級排序。

基於hGITR親和力滴定ELISA，自VK完整鏈庫(MAB1VK3FcL01)選擇四種VK完整鏈純系，且自MAB1VH3FE-02庫選擇六種純系。將該六種VH純系用作主鏈來建構VH完整鏈庫，其中CDR2之各位置具有MAB1鼠類或最接近人類生殖系(VH3 3-30)殘基。將此VH完整鏈譜系與四種VK完整鏈純系配對以形成最終人類完整鏈Fab庫。CLBA鑑別出多種hGITR結合純系，其藉由ELISA使用各別培養物上清液作為Fab來源來確認。基於DNA序列分析及hGITR親和力滴定ELISA結果選擇五種人類完整鏈Fab純系(MAB2、MAB3、MAB4、MAB5及 MAB6)。

使用ForteBio Octet分析測試Humaneered®抗體Fab對GITR抗原之親和力

表現五種人類完整鏈Fab(MAB2、MAB3、MAB4、MAB5及MAB6)且純化。隨後，使用ForteBio Octet系統將此等人類Fab之結合動力學與經最佳化之參考Fab(MAB1opFab)之動力學比較(數值資料概括於表3中)。

*a、b、c指示三個各別Forte實驗。將兩個樣品之重複實驗的結果進行整體擬合。

抗體MAB2、MAB3、MAB4、MAB5、MAB6之胺基酸序列及與人類生殖系序列之一致性百分比

表1中展示五種Fab(MAB2、MAB3、MAB4、MAB5、MAB6)之可變區胺基酸序列。五種Fab與人類生殖系序列之一致性百分比藉由將Vh及Vk胺基酸序列與單一生殖系序列(分別為VKIII L16/A27及VH3 3-30；表4)比對來測定。各鏈之計算省略CDRH3及CDRL3中之殘基。

人類GITR抗原決定基之保守性

藉由間接競爭ELISA評估抗原決定基之保守性。所有五種Fab阻斷親本小鼠抗體MAB1與人類GITR之結合，表明此等人類Fab保留初始鼠類抗體之抗原決定基特異性。

藉由ELISA分析MAB4及MAB5之抗原特異性

為測試IgG(即MAB2、MAB3、MAB4及MAB5)中親本小鼠抗體MAB1之抗原特異性是否保留，在ELISA分析中測試抗體與一組人類TNFR之結合。用MAB4及MAB5進行一種此類分析的結果(圖2C)展示MAB4及MAB5類似於鼠類抗體MAB1保留對GITR之高特異性。用MAB2、MAB3及MAB6獲得類似結果。

在ELISA中抗體結合於人類及獼猴而非嚙齒動物GITR蛋白

親本小鼠抗體MAB1結合於人類及獼猴而非嚙齒動物GITR蛋白。圖2A-B展示，抗體MAB4及MAB5能夠如MAB1般以類似方式結合人類與獼猴GITR而非嚙齒動物GITR。用MAB6、7、8、9、10、11、12及13發現類似結果。

GITR促效抗體MAB4及MAB5對人類GITR(hGITR)及獼猴GITR(cGITR)之結合親和力藉由Biacore分析測定。參見表5。單株抗體MAB4及MAB5以次奈莫耳結合親和力(KD)結合於人類GITR。抗體MAB4及MAB5以比對人類GITR之結合親和力低約2-3倍的奈莫耳結合親和力結合於獼猴GITR。在多種生物化學分析(包括流式細胞術、ELISA、Biacore及Protagen^TM晶片分析)中，本發明之抗GITR促效抗體選擇性結合於人類及獼猴GITR。

單株抗體MAB7結合於人類以及獼猴CD4+ T細胞。經分離獼猴或人類PBMC之FACS分析展現MAB7結合經分離CD4+ T細胞。另外，FACS實驗展現對PBMC(CD4+ T細胞)進行CD3/CD28活化後，GITR(由於MAB7結合)及CD25上調。(資料未示)

報導基因分析及細胞分析中抗體之功能活性

在報導基因分析中分析抗體之功能活性(圖3)。MAB4、MAB5、MAB7及MAB8 IgG在交聯時各以類似於GITR配體(GITR-L)之水準誘導NFκB活性。參見圖3A-D。用MAB2、MAB3及MAB6獲得類似結果(資料未示)。

MAB7與人類GITR配體競爭結合人類GITR表現穩定細胞株。競爭分析以三組值進行，FACS競爭分析展現抑制配體結合。參見圖2D。

為確認對內源GITR之功能活性，使抗體與珠粒結合且與經純化經CFSE標記之人類PBMC一起培育。相較於同型對照抗體，MAB7誘導CD4+ T細胞(圖4A)與CD8+ T細胞(圖4B)之增殖的增加。此增殖增加亦伴隨數種細胞激素之分泌增加，包括IFNγ(圖4C)、TNFα、IL-10及IL-13(未示)。用MAB 4、MAB5發現類似結果(未示)。吾人能夠展示MAB7所誘導之增殖及IFNγ產生增加取決於珠粒上抗CD3及抗CD28促效抗體之存在。若無此等共刺激抗體，則MAB對CD4+或CD8+ T細胞無促效作用。用MAB2、MAB3、MAB4；MAB5及MAB6獲得類似結果。

在活體外分析中亦發現，在高水準之GITR存在時，MAB7展示誘導FcgRIIIa信號傳導(經展示與ADCC活性相關)之能力。將道迪-hGITR細胞與MAB7或對照Ab一起培育，且傑卡特-V158細胞株展示 在活體外分析中MAB7能夠誘導FcgRIIIa信號傳導，且MAB7誘導FcgRIIIa信號傳導之能力與道迪細胞之表面上表現的受體水準有關(亦即較高之受體水準等同於較大之FcgRIIIa信號傳導誘導)。參見圖5。

hGITR表現於T細胞上且在hGITR-hGITRL基因嵌入小鼠中發揮功能。自野生型或hGITR-hGITRL基因嵌入小鼠分離脾細胞且在無刺激下或使用CD3及CD28抗體刺激下培養24、48、72或96小時。隨後將細胞用螢光團結合之抗體染色且藉由流式細胞術分析，展現表現人類GITR，且共刺激使野生型或轉殖基因小鼠中GITR表達譜增加。自hGITR-hGITRL基因嵌入小鼠分離之脾細胞展示響應於共刺激在培養物中誘導GITR表現(圖6A)。MAB7有效結合CD8+細胞上所表現之hGITR(圖6B)；且如藉由pIKK染色(圖6C)及T細胞活化標記物CD25+(圖6D)所量測，MAB7與經刺激T細胞之結合與增加之T細胞活化有關。

MAB7在活體內發揮功能。如上所述，用單次劑量之媒劑(n=8/時間點)或MAB7(n=10/時間點)抗體處理具有確定之Colon26腫瘤的hGITR-hGITRL雙基因嵌入小鼠。每週兩次量測腫瘤且使用方程式(L×W²)/2計算腫瘤體積。MAB處理動物展現Colon26腫瘤生長延遲。治療後三天，收集全血(圖7B-7C)及腫瘤(圖7D-7E)且藉由流式細胞術分析免疫細胞上之細胞表面hGITR表現。結果表明hGITR佔用且脫落，從而對於血液與腫瘤中之T調節細胞與T輔助細胞，使來自處理組之hGITR減少(*p<0.05，****p<0.00005)。

MAB7在活體內引發對Colon26腫瘤之抗腫瘤免疫反應。用單次劑量之媒劑(n=8/時間點)或MAB7(n=10/時間點)處理具有確定之Colon26腫瘤的hGITR-hGITRL雙基因嵌入小鼠。圖8A描繪給藥後3天之結果，展現處理動物中之Treg降低。圖8B-8C描繪給藥後15天之結果，展現處理後，增加之淋巴細胞(8B)及增加之經活化CD8+ T細胞 (8C)存在於腫瘤位點中。將細胞之絕對數根據腫瘤尺寸標準化以說明媒劑與MAB7處理組之間腫瘤尺寸之顯著差異。MAB7結果表明處理使處理動物中之Teff/Treg比率增加，如藉由將總瘤內活化CD8+ T細胞與CD4+ FOXP3+ Treg比較所測定。參見圖8D。另外，來自將經純化CD8+ T細胞與Colon26腫瘤細胞一起離體培育且使用IFNg ELISPOT分析量測CTL反應的脾細胞分析之結果表明來自MAB7處理動物之CD8+ T細胞中的腫瘤特異性IFNg反應增加。(*p<0.05，***p<0.0005)。參見圖8E。

應瞭解，本文所述之實例及實施例僅出於說明之目的，且根據其之各種修改或變化將由熟習此項技術者提出且包括在本申請案之精神及範圍內及隨附申請專利範圍之範疇內。本文中所引用之所有公開案、序列寄存編號、專利及專利申請案均出於所有目的特此以全文引用之方式併入。

SEQ ID NO：1-GITR同功異型物1前驅物(GenBank編號NP_004186.1)

SEQ ID NO：2-GITR同功異型物2前驅物(GenBank編號NP_683699.1)

SEQ ID NO：3-GITR同功異型物3前驅物(GenBank編號NP_683700.1)

SEQ ID NO：4-GITR富含半胱胺酸之域1(CRD1)，殘基34-65

SEQ ID NO：5-GITR抗體結合區，殘基41-65

SEQ ID NO：6-MAB2重鏈可變區(FR1至FR4)之胺基酸序列

SEQ ID NO：7-MAB2、MAB4、MAB5、MAB6、MAB7及MAB8輕鏈可變區(FR1至FR4) 之胺基酸序列

SEQ ID NO：8-MAB3重鏈可變區(FR1至FR4)之胺基酸序列

SEQ ID NO：9-MAB3輕鏈可變區(FR1至FR4)之胺基酸序列

SEQ ID NO：10-MAB4重鏈可變區(FR1至FR4)之胺基酸序列

SEQ ID NO：11-六組胺酸，6-His標記物

SEQ ID NO：12--MAB5重鏈可變區(FR1至FR4)之胺基酸序列

SEQ ID NO：13-C端可撓性連接子及6-His標記物

SEQ ID NO：14-MAB6重鏈可變區(FR1至FR4)之胺基酸序列

SEQ ID NO：15-5-aa Gly-Ser連接子

SEQ ID NO：16-共同重鏈可變區(FR1至FR4)

SEQ ID NO：17-共同輕鏈可變區(FR1至FR4)

SEQ ID NO：18-15-aa Gly-Ser連接子，(GGGGS) ₃

SEQ ID NO：19-輕鏈可變區RT-PCR擴增引子LC恆定區

SEQ ID NO：20-重鏈IgG1恆定區，粗體之Leu-Leu殘基亦可為Ala-Ala

SEQ ID NO：21-κ鏈

SEQ ID NO：22-MAB1-8之CDRH1的胺基酸序列(Kabat)

SEQ ID NO：23-MAB2之CDRH2的胺基酸序列(Kabat)

SEQ ID NO：24-MAB3之CDRH2的胺基酸序列(Kabat)

SEQ ID NO：25-MAB4之CDRH2的胺基酸序列(Kabat)

SEQ ID NO：26-MAB5之CDRH2的胺基酸序列(Kabat)

SEQ ID NO：27-MAB6之CDRH2的胺基酸序列(Kabat)

SEQ ID NO：28-共同重鏈CDR2(Kabat)

SEQ ID NO：29-MAB1-7之CDRH3的胺基酸序列(Kabat/Chothia)

SEQ ID NO：30-MAB2、MAB4、MMABS、MAB6、MAB7及MAB8之CDRL1的胺基酸序列 (Kabat)

SEQ ID NO：31-MAB3之CDRL1的胺基酸序列(Kabat)

SEQ ID NO：32-共同輕鏈CDR1(Kabat)

SEQ ID NO：33-MAB2-8之CDRL2的胺基酸序列(Kabat)

SEQ ID NO：34-MAB1-8之CDRL3的胺基酸序列(Kabat)

SEQ ID NO：35-MAB2及MAB3之重鏈FR1的胺基酸序列

SEQ ID NO：36-MAB4、MAB5、MAB6、MAB7及MAB8之重鏈FR1的胺基酸序列

SEQ ID NO：37-共同重鏈FR1之胺基酸序列

SEQ ID NO：38-MAB2、MAB4、MAB7及MAB8之重鏈FR2的胺基酸序列

SEQ ID NO：39-MAB3、MAB5及MAB6之重鏈FR2的胺基酸序列

SEQ ID NO：40-共同重鏈FR2

SEQ ID NO：41-重鏈FR3之胺基酸序列

SEQ ID NO：42-重鏈FR4之胺基酸序列

SEQ ID NO：43-輕鏈FR1之胺基酸序列

SEQ ID NO：44-MAB2、MAB4、MAB5、MAB6、MAB7及MAB8之輕鏈FR2的胺基酸 序列

SEQ ID NO：45-MAB3之輕鏈FR2的胺基酸序列

SEQ ID NO：46-共同輕鏈FR2

SEQ ID NO：47-MAB2、MAB4、MAB5、MAB6、MAB7及MAB8之輕鏈FR3的胺基酸 序列

SEQ ID NO：48-MAB3之輕鏈FR3的胺基酸序列

SEQ ID NO：49-共同輕鏈FR3

SEQ ID NO：50-輕鏈FR4之胺基酸序列

SEQ ID NO：51-MAB2 VH之核酸序列

SEQ ID NO：52-MAB2、MAB4、MAB5及MAB6 VK之核酸序列

SEQ ID NO：53-MAB3 VH之核酸序列：

SEQ ID NO：54-MAB3 VK之核酸序列：

SEQ ID NO：55-MAB4 VH之核酸序列：

SEQ ID NO：56-MAB5 VH之核酸序列：

SEQ ID NO：57-MAB6 VH之核酸序列：

SEQ ID NO：58-親本小鼠Vk之可變區的核酸序列

SEQ ID NO：59-親本小鼠Vk之可變區的胺基酸序列

SEQ ID NO：60-親本小鼠VH之可變區的核酸序列

SEQ ID NO：61-親本小鼠VH之可變區的胺基酸序列

SEQ ID NO：62-MAB1之CDRH2的胺基酸序列(Kabat)

SEQ ID NO：63-MAB1之CDRL1的胺基酸序列(Kabat)

SEQ ID NO：64-MAB1之CDRL2的胺基酸序列(Kabat)

SEQ ID NO：65-MAB2之重鏈的胺基酸序列

SEQ ID NO：66-MAB2、MAB4、MAB5、MAB6、MAB7及MAB8之輕鏈的胺基酸序列

SEQ ID NO：67-編碼MAB2之重鏈的核酸序列

SEQ ID NO：68-編碼MAB2、MAB4、MAB5及MAB6之輕鏈的核酸序列

SEQ ID NO：69-MAB3之重鏈的胺基酸序列

SEQ ID NO：70-MAB3之輕鏈的胺基酸序列

SEQ ID NO：71-編碼MAB3之重鏈的核酸序列

SEQ ID NO：72-編碼MAB3之輕鏈的核酸序列

SEQ ID NO：73-MAB4之重鏈的胺基酸序列

SEQ ID NO：74-編碼MAB4之重鏈的核酸序列

SEQ ID NO：75-MAB5之重鏈的胺基酸序列

SEQ ID NO：76-編碼MAB5之重鏈的核酸序列

SEQ ID NO：77-MAB6之重鏈的胺基酸序列

SEQ ID NO：78-編碼MAB6之重鏈的核酸序列

SEQ ID NO：79-MAB1之CDRH1的胺基酸序列(Chothia)

SEQ ID NO：80-MAB1-8之CDRH2的胺基酸序列(Chothia)

SEQ ID NO：81-MAB1之CDRL1的胺基酸序列(Chothia)

SEQ ID NO：82-MAB1-8之CDRL2的胺基酸序列(Chothia)

SEQ ID NO：83-MAB1-8之CDRL3的胺基酸序列(Chothia)

SEQ ID NO：84-MAB2-8之CDRH1的胺基酸序列(Chothia)

SEQ ID NO：85-MAB2、MAB4、MAB5、MAB6、MAB7及MAB8之CDRL1的胺基酸序列 (Chothia)

SEQ ID NO：86-MAB3之CDRL1的胺基酸序列(Chothia)

SEQ ID NO：87-CDRL1之共同胺基酸序列(Chothia)

SEQ ID NO：88-GITR之細胞外域(ECD)的富含半胱胺酸之域1(CRD1)區

SEQ ID NO：89-重鏈V區(VH33-13/30)之人類生殖系序列

SEQ ID NO：90-人類生殖系JH4部分序列

SEQ ID NO：91-來自人類生殖系JH4之全長J區

SEQ ID NO：92-輕鏈V區(VKIII L16/A27)之人類生殖系序列

SEQ ID NO：93-人類生殖系Jk2部分序列

SEQ ID NO：94-來自人類生殖系Jk2之全長J區

SEQ ID NO：95-重鏈可變區RT-PCR擴增引子HV3

SEQ ID NO：96-重鏈可變區RT-PCR擴增引子HC恆定區

SEQ ID NO：97-輕鏈可變區RT-PCR擴增引子LV3

SEQ ID NO：98-人類生殖系可變區(VKIII L16/A27)

SEQ ID NO：99-MAB7之重鏈可變區的胺基酸序列

SEQ ID NO：100-MAB7之重鏈胺基酸序列

SEQ ID NO：101-MAB7 VH之核酸序列

SEQ ID NO：102-MAB7/MAB8 VL之核酸序列

SEQ ID NO：103-MAB7重鏈之核酸序列

SEQ ID NO：104-MAB7/MAB8輕鏈之核酸序列

SEQ ID NO：105-MAB8之重鏈可變區胺基酸序列

SEQ ID NO：106-MAB8之重鏈胺基酸序列

SEQ ID NO：107-MAB8 VH之核酸序列

SEQ ID NO：108-MAB8重鏈之核酸序列

SEQ ID NO：109-MAB8之CDRH3的胺基酸序列

SEQ ID NO：110-引子

SEQ ID NO：111-引子

SEQ ID NO：112-引子

SEQ ID NO：113-引子

Claims (33)

1. 一種經分離抗體或抗體片段或其抗原結合分子，其結合於SEQ ID NO：4，且其中該抗體、抗體片段或抗原結合分子包含(a)重鏈可變區，其中：i)重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22，且ii)重鏈CDR2包含選自SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：27中之任一者的序列，且iii)重鏈CDR3包含SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：109；及(b)輕鏈可變區，其中i)輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：31，且ii)輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33，且iii)輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34。
2. 如請求項1之抗體、其抗體片段或抗原結合分子，其中該重鏈可變區與SEQ ID NO：16具有至少95%序列一致性，且其中該輕鏈可變區與SEQ ID NO：17具有至少95%序列一致性。
3. 如請求項1之抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中重鏈FR4為人類生殖系FR4及/或輕鏈FR4為人類生殖系FR4。
4. 如請求項3之抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中該重鏈FR4為SEQ ID NO：42及/或該輕鏈FR4為SEQ ID NO：50。
5. 如請求項1之抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中：A：i)該重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22，ii)該重鏈CDR2包含SEQ ID NO：23，iii)該重鏈CDR3包含SEQ ID NO：29，iv)該輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：30， v)該輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33，且vi)該輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34；或B：i)該重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22，ii)該重鏈CDR2包含SEQ ID NO：24，iii)該重鏈CDR3包含SEQ ID NO：29，iv)該輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：31，v)該輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33，且vi)該輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34；或C：i)該重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22，ii)該重鏈CDR2包含SEQ ID NO：25，iii)該重鏈CDR3包含SEQ ID NO：29，iv)該輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：30，v)該輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33，且vi)該輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34；或D：i)該重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22，ii)該重鏈CDR2包含SEQ ID NO：26，iii)該重鏈CDR3包含SEQ ID NO：29，iv)該輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：30，v)該輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33，且vi)該輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34；或E：i)該重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22，ii)該重鏈CDR2包含SEQ ID NO：27，iii)該重鏈CDR3包含SEQ ID NO：29，iv)該輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：30，v)該輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33，且vi)該輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34；或 F：i)該重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22，ii)該重鏈CDR2包含SEQ ID NO：25，iii)該重鏈CDR3包含SEQ ID NO：109，iv)該輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：30，v)該輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33，且vi)該輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34。
6. 如請求項1或2之抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中該抗體或抗體片段包含有包含SEQ ID NO：16之重鏈及包含SEQ ID NO：17之輕鏈的經分離抗體或其抗原結合片段，或與包含有包含SEQ ID NO：16之重鏈及包含SEQ ID NO：17之輕鏈的經分離抗體或其抗原結合片段競爭。
7. 如請求項1之抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中該抗體、抗體片段或抗原結合分子包含有包含選自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：99及SEQ ID NO：105中之任一者的序列的重鏈可變域；及包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9之輕鏈可變域。
8. 如請求項7之抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中該抗體、抗體片段或抗原結合分子包含以下中之任一者：i)包含SEQ ID NO：6之重鏈可變域及包含SEQ ID NO：7之輕鏈可變域；ii)包含SEQ ID NO：8之重鏈可變域及包含SEQ ID NO：9之輕鏈可變域；iii)包含SEQ ID NO：10之重鏈可變域及包含SEQ ID NO：7之輕鏈可變域；iv)包含SEQ ID NO：12之重鏈可變域及包含SEQ ID NO：7之輕鏈可變域； v)包含SEQ ID NO：14之重鏈可變域及包含SEQ ID NO：7之輕鏈可變域；vi)包含SEQ ID NO：99之重鏈可變域及包含SEQ ID NO：7之輕鏈可變域；及vii)包含SEQ ID NO：105之重鏈可變域及包含SEQ ID NO：7之輕鏈可變域。
9. 如請求項1之抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中該抗體或抗體片段或抗原結合分子經人類化。
10. 如請求項1之抗體、抗體片段或抗原結合分子，其包含Fab'片段及/或單鏈抗體(scFv)。
11. 如請求項1之抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中該抗體或抗體片段包含IgG Fc及/或人類恆定區。
12. 如請求項11之抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中該抗體、抗體片段或抗原結合分子包含有包含選自SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：100及SEQ ID NO：106中之任一者的序列的重鏈；及包含SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：70之輕鏈。
13. 如請求項1之抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中該抗體或抗體片段與第二抗體或抗體片段交聯，該抗體、抗體片段或抗原結合分子為SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之促效劑。
14. 一種經分離抗體或抗體片段或其抗原結合分子，其係結合SEQ ID NO：4，其選自以下中之任一者：A.如下抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中：i)重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22，ii)重鏈CDR2包含SEQ ID NO：23， iii)重鏈CDR3包含SEQ ID NO：29，iv)輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：30，v)輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33，且vi)輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34；B.如下抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中：i)重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22，ii)重鏈CDR2包含SEQ ID NO：24，iii)重鏈CDR3包含SEQ ID NO：29，iv)輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：31，v)輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33，且vi)輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34；C.如下抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中：i)重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22，ii)重鏈CDR2包含SEQ ID NO：25，iii)重鏈CDR3包含SEQ ID NO：29，iv)輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：30，v)輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33，且vi)輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34；D.如下抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中：i)重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22，ii)重鏈CDR2包含SEQ ID NO：26，iii)重鏈CDR3包含SEQ ID NO：29，iv)輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：30，v)輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33，且vi)輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34；E.如下抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中： i)重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22，ii)重鏈CDR2包含SEQ ID NO：27，iii)重鏈CDR3包含SEQ ID NO：29，iv)輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：30，v)輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33，且vi)輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34；及F.如下抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中：ii)重鏈CDR1包含SEQ ID NO：22，ii)重鏈CDR2包含SEQ ID NO：25，iii)重鏈CDR3包含SEQ ID NO：109，iv)輕鏈CDR1包含SEQ ID NO：30，v)輕鏈CDR2包含SEQ ID NO：33，且vi)輕鏈CDR3包含SEQ ID NO：34。
15. 如請求項14之抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中該抗體或抗體片段或抗原結合分子經人類化。
16. 如請求項14之抗體、抗體片段或抗原結合分子，其包含Fab'片段及/或單鏈抗體(scFv)。
17. 如請求項14之抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中該抗體或抗體片段包含IgG Fc及/或人類恆定區。
18. 如請求項17之抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中該抗體、抗體片段或抗原結合分子包含有包含選自SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：100及SEQ ID NO：106中之任一者的序列的重鏈；及包含SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：70之輕鏈。
19. 如請求項14之抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中該抗體或抗體片段與第二抗體或抗體片段交聯，該抗體、抗體片段或抗 原結合分子為SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之促效劑。
20. 如請求項1或14之抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中該抗體或抗體片段經糖基化。
21. 如請求項1或14之抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中該抗體經修飾或表現於經修飾之細胞中，其中此類修飾使該抗體、抗體片段或抗原結合分子之FcR效應功能提高。
22. 如請求項1至21中任一項之抗體、抗體片段或抗原結合分子，其中i)該抗體或抗體片段在活體內誘導提高之Teff：Treg比率；ii)該抗體或抗體片段在活體內誘導加強之免疫反應；及/或iii)該抗體與非人類靈長類動物GITR交叉反應且不與嚙齒動物GITR交叉反應。
23. 一種聚核苷酸，其編碼如請求項1至21中任一項之抗體、抗體片段或抗原結合分子。
24. 一種組合物，其包含如請求項1至21中任一項之經分離抗體、抗體片段或抗原結合分子，及醫藥學上可接受之載劑。
25. 如請求項24之組合物，其進一步包含靶向腫瘤相關抗原之結合分子、CTLA4之拮抗劑或PD-1/PD-L1相互作用之抑制劑。
26. 一種套組，其包含如請求項1至21中任一項之抗體、抗體片段或抗原結合分子。
27. 一種如請求項1至21中任一項之經分離抗體、抗體片段或抗原結合分子之用途，其係用於製造為有需要之個體提高T細胞反應的藥物。
28. 一種如請求項1至21中任一項之經分離抗體、抗體片段或抗原結合分子之用途，其係用於製造為有需要之個體治療表現腫瘤相 關抗原之癌症的腫瘤生長用的藥物。
29. 如請求項27或28之用途，其中將該抗體、抗體片段或抗原結合分子係與i)抗原、CTLA4之拮抗劑或PD-1/PD-L1相互作用之抑制劑，ii)化學治療劑或細胞毒素，iii)來自個體之癌細胞及/或iv)腫瘤相關抗原共同投與。
30. 如請求項27或28之用途，其中該T細胞反應為CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)T細胞反應或CD4+輔助T細胞(Th)反應。
31. 如請求項30之用途，其中該癌症選自由以下組成之群：黑色素瘤、卵巢癌、結腸直腸癌、***癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、乳癌及頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)。
32. 如請求項1至21中任一項之經分離抗體、抗體片段或抗原結合分子，其係用於為有需要之個體提高T細胞反應。
33. 如請求項1至21中任一項之經分離抗體、抗體片段或抗原結合分子，其係用於為有需要之個體治療腫瘤生長。