TW201622739A - 以ｎｒｆ２為主之癌症治療及檢測方法與用途 - Google Patents

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Abstract

本發明尤其揭示用於治療個體中之癌症之方法及用途。在多種不同實施例中，該方法或用途包括量測患有癌症之候選個體或來自該候選個體之癌症樣品中之核因子紅血球-2相關因子2(NRF2)或NRF2靶基因之表現，且測定該樣品中或該患有癌症之個體中之該NRF2之量，接著將該所測定之NRF2或所測定之NRF2靶基因之量與NRF2或NRF2靶基因之基線或參考量進行比較。若該樣品中或該患有癌症之個體中之該NRF2或NRF2靶基因之量低於該NRF2或NRF2靶基因之基線或參考量，則可用或用本文所闡述之肽或肽模擬物序列，諸如P1,P2,P3,P4,P5,P6(SEQ ID NO：1)或P6,P5,P4,P3,P2,P1(SEQ ID NO：2)，例如CBP501治療該患有癌症之個體。

Description

以NRF2為主之癌症治療及檢測方法與用途
本專利申請案主張2014年5月22日申請之美國臨時申請案第62/002,076號及2014年8月12日申請之美國臨時申請案第62/036,476號之權利，其以全文引用之方式併入本文中。
細胞週期包含S期(DNA複寫)、M期(有絲***)及S與M期之間的兩個間隔期(G1及G2期)。細胞週期中之檢查點確保精確進展，諸如監測DNA完整性、DNA複寫、細胞大小及周圍環境之狀態(Maller,J.L.Curr.Opin.Cell Biol.,3：26(1991))。保持基因組完整性對於多細胞有機體尤其重要，且存在多個監測基因組狀態之檢查點。其中G1及G2檢查點分別存在於DNA複寫及有絲***之前。在進入S期之前校正DNA損傷亦為重要的，因為一旦受損DNA經複寫，其常產生突變(Hartwell,L.Cell,71：543(1992))。不修復廣泛DNA損傷的經由G1及G2檢查點之進展誘導細胞凋亡及/或災變。
大部分癌細胞在G1檢查點相關蛋白質(諸如p53、Rb、MDM-2、p16INK4及p19ARF)中攜有異常(Levine,A.J.Cell,88：323(1997))。或者，突變可導致癌基因產物(例如Ras、MDM-2及細胞週期素D)之過度表現及/或過度活化，其降低G1檢查點之嚴格度。除此等突變以外，過度生長因子信號傳導可由生長因子之過度表現而產生且可降低 G1檢查點之嚴格度。連同功能突變之損失及增加，生長因子受體或下游信號轉導分子之連續活化可藉由更動G1檢查點而導致細胞轉化。作廢之G1檢查點促成癌細胞中觀測到之較高突變率及多種突變。因此，大部分癌細胞依賴於G2檢查點以相對於過度DNA損傷而存活(O'Connor及Fan,Prog.Cell Cycle Res.,2：165(1996))。
咸信促使細胞週期G2在DNA損傷之後停滯之機制保留於酵母至人類之物種中。在受損DNA存在下，使Cdc2/細胞週期素B激酶因蘇胺酸-14及酪胺酸-15殘基對Cdc2激酶之抑制性磷酸化而保持不活化或降低細胞週期素B之蛋白質量。在有絲***之起始，雙磷酸酶Cdc25移除此等抑制性磷酸鹽且藉此激活Cdc2/細胞週期素B激酶。Cdc2/細胞週期素B之活化相當於M期之起始。
在***酵母中，回應受損DNA之細胞週期停滯需要蛋白激酶Chk1。Chk1激酶充當若干拉德(rad)基因產物之下游且藉由DNA損傷後之磷酸化而經修飾。已知出芽酵母之激酶Rad53及***酵母之激酶Cds1傳導來自未複寫DNA之信號。Chk1與Cds1之間似乎存在一些複聯，因為Chk1與Cds1之消除均在破壞由受損DNA誘導之G2停滯中達到頂點。有趣的是，Chk1及Cds1均使Cdc25磷酸化且促使Rad24與Cdc25結合，其使Cdc25螯合至細胞溶質且阻止Cdc2/細胞週期素B活化。因此，Cdc25似乎為此等激酶之共同標靶，意謂此分子為G2檢查點中不可缺少之因子。
在人類中，回應於DNA損傷，hChk1(***酵母Chk1之人類同系物)與Chk2/HuCds1(出芽酵母Rad53及***酵母Cds1之人類同系物)均使Cdc25C在絲胺酸-216處(重要調節位點)磷酸化。此磷酸化產生用於較小酸性蛋白質14-3-3s(***酵母Rad24與Rad25之人類同系物)之結合位點。此磷酸化之調節作用藉由以下事實明示，即在Cdc25C上將絲胺酸-216取代為丙胺酸可破壞人類細胞中之細胞週期G2停滯。然 而，未充分理解G2檢查點之機制。
在多個實施例中，本文揭示治療個體中之癌症之方法。在一個實施例中，方法包含a)量測患有癌症之候選個體或來自該候選個體之癌症樣品中核因子紅血球-2相關因子2(NRF2)或NRF2靶基因之表現，及測定該樣品中或該患有癌症之個體中NRF2之量，b)將所測定之NRF2或所測定之NRF2靶基因之量與NRF2或NRF2靶基因之基線或參考量進行比較，藉此確定該樣品中或該患有癌症之個體中NRF2或NRF2靶基因之量是否低於NRF2或NRF2靶基因之基線或參考量；及c)若該樣品中或該患有癌症之個體中NRF2或NRF2靶基因之表現低於NRF2或NRF2靶基因之基線或參考量，則用P1,P2,P3,P4,P5,P6(SEQ ID NO：1)或P6,P5,P4,P3,P2,P1(SEQ ID NO：2)(例如CBP501)治療該患有癌症之個體。在另一實施例中，方法包含a)篩檢患有癌症之候選個體或來自該候選個體之癌症樣品中的正常或功能性KEAP 1或降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變，及測定正常或功能性KEAP 1或降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變是否存在；及b)若該個體具有正常或功能性KEAP 1或不具有降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變，則用P1,P2,P3,P4,P5,P6(SEQ ID NO：1)或P6,P5,P4,P3,P2,P1(SEQ ID NO：2)(例如CBP501)治療該患有癌症之個體。
在多個實施例中，本文揭示治療個體中之癌症之方法。在一個實施例中，方法包含a)鑑別及/或選擇患有癌症之個體，其中該個體中之NRF2表現或NRF2靶基因表現低於NRF2或NRF2靶基因之基線或參考量，或其中該個體具有正常或功能性KEAP 1或不具有降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變，及b)若樣品中或個體中之NRF2或NRF2靶基因低於NRF2或NRF2靶基因之基線或參考量，或若個體 具有正常或功能性KEAP 1或不具有降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變，則用本文所闡述之肽或肽模擬物(例如CBP501)治療該個體中之癌症。在另一實施例中，方法包含a)量測患有癌症之候選個體或來自該候選個體之癌症樣品中核因子紅血球-2相關因子2(NRF2)或NRF2靶基因之表現，及測定該個體或癌症樣品中NRF2或NRF2靶基因之量，b)將所測定NRF2或所測定NRF2靶基因之量與NRF2或NRF2靶基因之基線或參考量進行比較，藉此確定NRF2或NRF2靶基因之量是否低於NRF2或NRF2靶基因之基線或參考量，及c)若樣品中或個體中之NRF2或NRF2靶基因低於NRF2或NRF2靶基因之基線或參考量，則選擇該個體用如本文所闡述之肽或肽模擬物(例如CBP501)進行癌症治療。
本文進一步揭示選擇及/或鑑別個體以用如本文所闡述之肽或肽模擬物(例如CBP501)進行癌症治療之方法。在一個實施例中，方法包括a)篩檢正常或功能性KEAP 1或降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變，及b)若存在正常或功能性KEAP 1或不存在降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變，則選擇該個體用如本文所闡述之肽或肽模擬物(例如CBP501)進行癌症治療。在另一實施例中，方法包括a)量測患有癌症之候選個體或來自該候選個體之癌症樣品中核因子紅血球-2相關因子2(NRF2)或NRF2靶基因之表現，及測定該個體或癌症樣品中NRF2或NRF2靶基因之量，b)將所測定NRF2或所測定NRF2靶基因之量與NRF2之基線或參考量進行比較，以確定NRF2或NRF2靶基因之量是否低於NRF2或NRF2靶基因之基線或參考量，及c)若樣品中或個體中之NRF2或NRF2靶基因低於NRF2或NRF2靶基因之基線或參考量，則將該個體鑑別為用如本文所闡述之肽或肽模擬物(例如CBP501)進行癌症治療之候選者。
在篩檢或鑑別候選個體以用如本文所闡述之肽或肽模擬物(例如 CBP501)進行癌症治療之實施例中，某些態樣有時可包含a)篩檢正常或功能性KEAP 1或降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變，及b)若存在正常或功能性KEAP 1或不存在降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變，則將該個體鑑別為用如本文所闡述之肽或肽模擬物(例如CBP501)進行癌症治療之候選者。
本文額外揭示判別癌症特徵之方法，判別該癌症為對用如本文所闡述之肽或肽模擬物(例如CBP501)進行之治療反應較強或反應較弱。在一個實施例中，方法包括a)量測癌症細胞中核因子紅血球-2相關因子2(NRF2)或NRF2靶基因之表現，及測定經表現NRF2或NRF2靶基因之量，及b)將所測定NRF2或所測定NRF2靶基因之量與NRF2或NRF2靶基因之預定值進行比較，以確定NRF2或NRF2靶基因之量是否低於或高於NRF2或NRF2靶基因之預定值，及c)若NRF2或NRF2靶基因表現低於或高於NRF2或NRF2靶基因之預定值，則判別該癌症為對用如本文所闡述之肽或肽模擬物(例如CBP501)進行之治療反應較強或反應較弱。在另一實施例中，方法包括a)篩檢正常或功能性KEAP 1或降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變，及/或b)若存在或不存在正常或功能性KEAP 1，或不存在或存在降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變，則判別該癌症為對用如本文所闡述之肽或肽模擬物(例如CBP501)進行之治療反應較強或反應較弱。
在多個實施例中，NRF2靶基因為麩胱甘肽還原酶(GSR)、葡萄糖-6-磷酸去氫酶(G6PD)、ATP結合盒式區亞家族C成員2(ABCC2)、醛基-酮基還原酶家族1C1(AKR1C1)、醛基-酮基還原酶家族1C3(AKR1C3)、NAD(P)H去氫酶醌1(NQO1)、AKR1B10、γ-麩胺醯半胱胺酸合成酶調節劑次單元(γGCSm)及/或麩胱甘肽過氧化酶1(GPX1)中之任一者。
在一些實施例中，相較於對如本文所闡述之肽或肽模擬物(例如 CBP501)治療反應較弱之癌細胞，由對如本文所闡述之肽或肽模擬物(例如CBP501)治療反應之癌細胞中之表現測定基線或參考量或預定值。
在一些實施例中，樣品包含生物樣品。在某些態樣中，樣品可包含細胞、組織或器官(例如肺)生檢或血液或血清樣品。
在某些態樣中，個體為哺乳動物。哺乳動物可為人類。在一些態樣中，個體為人類。
在多個實施例中，藉由定量分析法量測表現。在一些態樣中，用或藉由與分析物接觸量測或偵測表現，該分析物偵測NRF2蛋白質或由NRF2靶基因編碼之蛋白質；或偵測KEAP 1蛋白質或靶基因，或降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變。在一些實施例中，藉由與偵測NRF2轉錄物或NRF2靶基因轉錄物之分析物接觸，或藉由定序包含KEAP 1或降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變的核酸來量測或偵測表現。在一些實施例中，藉由免疫分析法量測或偵測表現。在一些實施例中，藉由抗體免疫分析法量測或偵測表現。在一些實施例中，藉由西方墨點法、ELISA、西方墨點法、免疫組織化學或免疫細胞化學量測或偵測表現。在某些實施例中，藉由測定NRF2之cDNA或NRF2靶基因之cDNA量測或偵測表現。在一些態樣中，藉由NRF2 RNA或NRF2靶基因RNA之反轉錄及NRF2 cDNA或NRF2靶基因cDNA之聚合酶鏈反應(RT-PCR)，或KEAP 1 RNA或KEAP 1基因之反轉錄及KEAP 1 cDNA之聚合酶鏈反應(RT-PCR)來量測或偵測表現。
在某些實施例中，肽或肽模擬物(例如CBP501)包含其鹽或前藥或其前藥之鹽。在各種態樣中，鹽包含鈉鹽、鈣鹽、鎂鹽、硝酸鹽、鉀鹽、磷酸鹽、磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、檸檬酸鹽、碳酸鹽、抗壞血酸鹽、丁二酸鹽、三氟乙酸鹽或乙酸鹽。
在一些實施例中，本文所述之方法包含投與G2檢查點抑制劑藥劑(例如肽或肽模擬物，諸如CBP501)。在一些實施例中，本文所述之方法包含投與鈣調蛋白結合劑。在一些實施例中，本文所述之方法包括向個體投與核酸損傷劑(例如結合於或***DNA中之分子)。
在一些實施例中，本文所述之方法包含單獨或以任何組合形式向個體1次、2次、3次、4次、5次或5次以上投與肽或肽模擬物(例如CBP501)、G2檢查點抑制劑藥劑、鈣調蛋白結合劑或核酸損傷劑。
在某些態樣中，癌症包含肺癌(NSCLC)。
此外，本文揭示癌細胞群，其中該等細胞固定於基板上且該等細胞已結合於偵測NRF2蛋白質或由NRF2靶基因編碼之蛋白質或KEAP 1蛋白質或基因之試劑。在一些實施例中，自個體獲得之癌細胞群固定於基板上且該等細胞已結合於偵測NRF2蛋白質或由NRF2靶基因編碼之蛋白質或KEAP 1蛋白質或基因之試劑。在某些態樣中，偵測NRF2蛋白質或由NRF2靶基因編碼之蛋白質或KEAP 1蛋白質之試劑包含抗體。
本文還進一步揭示癌細胞群，其中該等細胞固定於基板上且該等細胞已結合於選擇性結合NRF2轉錄物或NRF2靶基因轉錄物或KEAP 1轉錄物之試劑。在一些實施例中，自個體獲得之癌細胞群固定於基板上且該等細胞已結合於選擇性結合NRF2轉錄物或NRF2靶基因轉錄物或KEAP 1轉錄物之試劑。在某些態樣中，選擇性結合NRF2轉錄物或NRF2靶基因轉錄物之試劑包含寡核苷酸或引子。
NRF2靶基因包括麩胱甘肽還原酶(GSR)、葡萄糖-6-磷酸去氫酶(G6PD)、ATP結合盒式區亞家族C成員2(ABCC2)、醛基-酮基還原酶家族1C1(AKR1C1)、醛基-酮基還原酶家族1C3(AKR1C3)、NAD(P)H去氫酶醌1(NQO1)、AKR1B10、γ-麩胺醯半胱胺酸合成酶調節劑次單元(γGCSm)或麩胱甘肽過氧化酶1(GPX1)中之任一者。在一些態樣 中，基板包含玻璃或塑膠板、載片或薄片。
本文還進一步揭示包含自癌細胞群分離、純化或提取之核酸的組合物，其中該核酸包含NRF2基因或其轉錄物，其結合於選擇性結合NRF2基因或其轉錄物或結合於KEAP 1基因或其轉錄物之試劑。組合物包括自癌細胞群分離、純化或提取之核酸，其中該核酸包含NRF2靶基因或其轉錄物，其結合於選擇性結合NRF2基因或其轉錄物或結合於KEAP 1基因或其轉錄物之試劑。在一些態樣中，選擇性結合NRF2轉錄物或NRF2靶基因轉錄物之試劑包含寡核苷酸或引子。
本文又進一步揭示包含自癌細胞群分離、純化或提取之蛋白質的組合物，其中該蛋白質包含結合於選擇性地偵測NRF2蛋白質之試劑的NRF2蛋白質或結合於選擇性地偵測KEAP 1蛋白質之試劑的KEAP 1蛋白質。組合物包括自癌細胞群分離、純化或提取之蛋白質，其中該蛋白質包含由NRF2靶基因編碼之蛋白質，其結合於選擇性地偵測由NRF2靶基因編碼之蛋白質的試劑。在一些態樣中，選擇性地偵測NRF2蛋白質或由NRF2靶基因編碼之蛋白質或KEAP 1蛋白質之試劑包含抗體。
NRF2靶基因包括麩胱甘肽還原酶(GSR)、葡萄糖-6-磷酸去氫酶(G6PD)、ATP結合盒式區亞家族C成員2(ABCC2)、醛基-酮基還原酶家族1C1(AKR1C1)、醛基-酮基還原酶家族1C3(AKR1C3)、NAD(P)H去氫酶醌1(NQO1)、AKR1B10、γ-麩胺醯半胱胺酸合成酶調節劑次單元(γGCSm)或麩胱甘肽過氧化酶1(GPX1)中之任一者。在一些態樣中，基板包含玻璃或塑膠板、載片或薄片。
圖1A-1H展示CBP501敏感性，其特徵為H1703及H1437 NSCLC細胞株均用CDDP共處理1小時。(圖1A-D)H1703。(圖1E-H)H1437。(圖A、E)藉由流動細胞測量分析之亞G1群之細胞週期分佈變化(n= 2)。(圖1B、F)G1期(n=2)。(圖1C、G)S期(n=2)。(圖1D、H)G2-M期(n=2)。進行卡方測試(Chi-square tests)以在各CDDP劑量點比較不加及加CBP501(SEQ ID NO：80)之間的細胞週期分佈變化。星號表示統計顯著性(p<0.001)。N.S.=不顯著(p>0.05)。誤差條表示來自一式兩份流動細胞測量分析之標準差。
圖2A-2D展示微陣列基因表現分析，其表示CBP501不敏感細胞株中之Nrf2相關基因表現增加。(圖2A)熱圖顯示由微陣列分析測定之分離基因表現。左圖包含CBP501不敏感細胞株。右圖包含CBP501敏感細胞株。綠色表示低表現量。紅色表示高表現量。黑色表示中等表現量(值為大致5000)。實驗一式三份地進行。(圖2B)NSCLC中Nrf2信號傳導組分之西方墨點分析。(圖2C)NSCLC中Nrf2蛋白質量之定量分析(n=3)。(圖2D)首先藉由微陣列分析鑑別之一系列基因之西方墨點分析。
圖3A-3C展示與高Nrf2表現量相關之高度Nrf2核定位。(圖3A)NSCLC中Nrf2之免疫細胞化學。左圖以綠色展示Nrf2。中圖以紅色展示赫斯特染料(Hoechst dye)。右圖展示合併影像。比例條表示100μm。(圖3B、C)自圖3A之五個不同影像定量Nrf2強度(n=5)。(圖3B)全細胞中之Nrf2強度。(圖3C)核中之Nrf2強度。誤差條表示自五個不同影像測定之Nrf2強度之標準差。
圖4A-D展示Nrf2活化劑蘿蔔硫素(SFN)抵消CBP501之作用；Nrf2之阻斷減弱SFN之作用。(圖4A)NSCLC中一系列Nrf2靶蛋白質之西方墨點分析。(圖4B)確認藉由Nrf2 shRNA慢病毒轉染之阻斷效率。由黑色箭頭表示之上帶為Nrf2蛋白質量。中帶及下帶分別表示IQGAP1及ATM之內部對照。(圖4C、D)藉由使用流動細胞測量分析細胞週期分佈變化(n=4)。在進行1小時CDDP(2.5μg/ml)/CBP501(1μM)治療之前，使SFN經受H1703對照(Ctrl)-sh及Nrf2-sh亞株24小時。(圖4C)全 細胞週期分佈。(圖4D)G2-M期。星號表示統計顯著性(TTEST；p<0.005)。誤差條表示自四份流動細胞測量分析測定之標準差。
圖5A-C展示在CBP501不敏感細胞株H1437中阻斷Nrf2，提高CBP501敏感性。(圖5A)確認藉由Nrf2 shRNA慢病毒感染之阻斷效率。上帶表示Nrf2蛋白質量。中間三個帶分別為Nrf2靶分子AKR1C3、G6PD及GSR。下方兩個帶分別表示IQGAP1及MLC2 α之內部對照。(圖5B)用與或不與CBP501組合之CDDP治療一小時。藉由流動細胞測量偵測細胞週期分佈變化(n=4)。左側圖來自藉由將對照(Ctrl)-shRNA引入H1437中形成之亞株。右側圖來自藉由將Nrf2-shRNA引入H1437中形成之亞株。上圖表示亞G1群。下圖表示G2-M群。星號表示統計顯著性(TTEST；p<0.001)。N.S.=不顯著(p>0.01)。(圖5C)來自圖5B之資料的差異分析圖。藍色條表示加CBP501之對照(Ctrl)-shRNA減去不加CBP501之細胞株。紅色條表示加CBP501之Nrf2-sh減去不加CBP501之細胞株。圖(左)表示亞G1中細胞之百分比。圖(右)表示G2-M中之百分比。星號表示紅色及藍色條之間的統計顯著性(TTEST；p<0.001)。誤差條表示存在於四份流動細胞測量分析之標準差。
圖6A-E展示Nrf2靶基因為標記物之良好候選，其使用其蛋白質或mRNA表現量預測CBP501敏感性。(圖6A)藉由微陣列分析測定之分離基因表現量在總共二十八個NSCLC細胞株中之熱圖顯示。左圖包含CBP501不敏感細胞株。右圖包含CBP501敏感細胞株。綠色表示之值表示低表現量。紅色表示高表現量。黑色表示中等表現量(數值為大致5000)。實驗一式三份地進行。CBP501敏感性與分離基因表現值之間的相關性百分比表示於熱圖之右側。(圖6B)擴展超過原設定之NSCLC細胞株中一系列Nrf2靶蛋白質之西方墨點分析(表2)。(圖6C)來自表1及表2之NSCLC中Nrf2及AKR1C3蛋白質量之定量分析(n= 3)。(圖6D)NSCLC中AKR1C3之免疫細胞化學。上圖以綠色展示AKR1C3。中圖以紅色展示赫斯特染料(Hoechst dye)。下圖展示合併影像。比例條表示100μm。(圖6E)自C定量AKR1C3強度(n=5)。
圖7展示來自圖2之CBP501不敏感細胞株或CBP501敏感細胞株中個別基因表現之比較分析。黑色條表示CBP501不敏感細胞株中之表現平均值。紅色條表示CBP501敏感細胞株中之表現平均值。
圖8A-8B展示(圖8A)NSCLC中AKR1C1之免疫細胞化學。左圖以綠色之偽色展示AKR1C1。中圖以紅色之偽色展示赫斯特。右圖展示合併影像。比例條表示100微米；(圖8B)自圖8A量化AKR1C1強度(n=5)。
圖9A-9B展示(圖9A)NSCLC中AKR1B10之免疫細胞化學。左圖以綠色之偽色展示AKR1B10。中圖以紅色之偽色展示赫斯特。右圖展示合併影像。比例條表示100微米；(圖9B)自圖9A量化AKR1B10強度(n=5)。
在一些實施例中，提供結合本文所揭示之方法採用之肽及肽模擬物。在一個實施例中，肽或肽模擬物序列包括以下結構：P1,P2,P3,P4,P5,P6(SEQ ID NO：1)或P6,P5,P4,P3,P2,P1(SEQ ID NO：2)。P1為Cha，Nal(2)，(Phe-2,3,4,5,6-F)，(Phe-3,4,5F)，(Phe-4CF3)，佔據類似側鏈空間之胺基酸(例如Tyr或Phe)，或側鏈中具有一個或兩個芳族、哌啶、吡嗪、嘧啶、哌嗪、嗎啉或嘧啶基或一個吲哚、并環戊二烯、茚、萘、苯并呋喃、苯并噻吩、喹啉、吲哚啉、色滿、喹喏啉、喹唑啉基之任何胺基酸；P2為Cha，Nal(2)，(Phe-2,3,4,5,6-F)，(Phe-3,4,5F)，(Phe-4CF3)，Bpa，Phe4NO2，佔據類似側鏈空間之胺基酸(例如Tyr或Phe)，或側鏈中具有一個或兩個芳族、哌啶、吡嗪、嘧啶、哌嗪、嗎啉或嘧啶基或一個吲哚、并環戊二烯、 茚、萘、苯并呋喃、苯并噻吩、喹啉、吲哚啉、色滿、喹喏啉或喹唑啉基之任何胺基酸；P3、P4、P5為任何胺基酸(例如，P4為Trp)，或其中P3、P4、P5中之一或多者為簡單碳鏈(例如，11-胺基十一酸、10-胺基癸酸、9-胺基壬酸、8-胺基辛酸、7-胺基庚酸、6-胺基己酸或具有一或多個不飽和碳鍵之類似結構)，使得P2與P6之間的距離與P3、P4、P5中之每一者為胺基酸時之距離大約相同；且P6為Bpa、Phe4NO2、任一種胺基酸與Tyr(例如Ser-Tyr)、任一種胺基酸與Phe(例如Ser-Phe)、任何胺基酸或不存在。
在另一實施例中，肽或肽模擬物序列包括以下結構：P1,P2,P3,P4,P5,P6(SEQ ID NO：3)；P6,P5,P4,P3,P2,P1(SEQ ID NO：4)；P1,P2,P3,P4,P5,P6,P7,P8,P9,P10,P11,P12(SEQ ID NO：5)；P1,P2,P3,P4,P5,P6,P12,P11,P10,P9,P8,P7(SEQ ID NO：6)；P6,P5,P4,P3,P2,P1,P7,P8,P9,P10,P11,P12(SEQ ID NO：7)；P6,P5,P4,P3,P2,P1,P12,P11,P10,P9,P8,P7(SEQ ID NO：8)；P7,P8,P9,P10,P11,P12,P1,P2,P3,P4,P5,P6(SEQ ID NO：9)；P7,P8,P9,P10,P11,P12,P6,P5,P4,P3,P2,P1(SEQ ID NO：10)；P12,P11,P10,P9,P8,P7,P1,P2,P3,P4,P5,P6(SEQ ID NO：11)；P12,P11,P10,P9,P8,P7,P6,P5,P4,P3,P2,P1(SEQ ID NO：12)；P12,P1,P6,P9,P8,P7,P2,P1(SEQ ID NO：13)；P12,P11,P10,P6,P9,P4,P7,P2,P1(SEQ ID NO：14)；P1,P2,P7,P8,P9,P6,P11,P12(SEQ ID NO：15)；或P1,P2,P7,P4,P9,P6,P10,P11,P12(SEQ ID NO：16)。P1為Cha，Nal(2)，(Phe-2,3,4,5,6-F)，(Phe-3,4,5F)，(Phe-4CF3)，Bpa，Phe4NO2，佔據類似側鏈空間之胺基酸(例如，d-Tyr或l-Tyr，d-Phe或l-Phe)，或側鏈中具有一個或兩個芳族、哌啶、吡嗪、嘧啶、哌嗪、嗎啉或嘧啶基或一個吲哚、并環戊二烯、茚、萘、苯并呋喃、苯并噻吩、喹啉、吲哚啉、色滿、喹喏啉、喹唑啉基之任何胺基酸；P2為Cha，Nal(2)， (Phe-2,3,4,5,6-F)，(Phe-3,4,5F)，(Phe-4CF3)，佔據類似側鏈空間之胺基酸(例如Tyr或Phe)，或側鏈中具有一個或兩個芳族、哌啶、吡嗪、嘧啶、哌嗪、嗎啉或嘧啶基或一個吲哚、并環戊二烯、茚、萘、苯并呋喃、苯并噻吩、喹啉、吲哚啉、色滿、喹喏啉、喹唑啉基之任何胺基酸；P3、P4、P5為任何胺基酸(例如，P4為Trp)，或P3、P4、P5中之一或多者為簡單碳鏈(例如，11-胺基十一酸、10-胺基癸酸、9-胺基壬酸、8-胺基辛酸、7-胺基庚酸、6-胺基己酸或具有一或多個不飽和碳鍵之類似結構)，使得P2與P6之間的距離大約與P3、P4、P5中之每一者為胺基酸時之距離相同；P6為Bpa、Phe4NO2、任一種胺基酸與Tyr(例如Ser-Tyr)、任一種胺基酸與Phe(例如Ser-Phe)；且P7、P8、P9、P10、P11、P12中之至少三者為鹼性胺基酸而其餘為任何胺基酸或不存在。
在另一實施例中，肽或肽模擬物序列包括以下結構：P1,P2,P3,P4,P5,P6,P7,P8,P9,P10,P11,P12(SEQ ID NO：17)；P12,P11,P10,P9,P8,P7,P6,P5,P4,P3,P2,P1(SEQ ID NO：18)；P12,P11,P10,P6,P9,P4,P7,P2,P1(SEQ ID NO：19)；或P1,P2,P7,P4,P9,P6,P10,P11,P12(SEQ ID NO：20)。P1為Cha，Nal(2)，(Phe-2,3,4,5,6-F)，(Phe-3,4,5F)，(Phe-4CF3)，Bpa，Phe4NO2，佔據類似側鏈空間之胺基酸，或側鏈中具有一個或兩個芳族、哌啶、吡嗪、嘧啶、哌嗪、嗎啉或嘧啶基或一個吲哚、并環戊二烯、茚、萘、苯并呋喃、苯并噻吩、喹啉、吲哚啉、色滿、喹喏啉或喹唑啉基之任何胺基酸；P2為Cha，Nal(2)，(Phe-2,3,4,5,6-F)，(Phe-3,4,5F)，(Phe-4CF3)，佔據類似側鏈空間之胺基酸(例如Tyr或Phe)，或側鏈中具有一個或兩個芳族、哌啶、吡嗪、嘧啶、哌嗪、嗎啉或嘧啶基或一個吲哚、并環戊二烯、茚、萘、苯并呋喃、苯并噻吩、喹啉、吲哚啉、色滿、喹喏啉、喹唑啉基之任何胺基酸；P3、P4、P5為任何胺基酸(例如，P4為Trp)，或 P3、P4、P5中之一或多者為簡單碳鏈(例如，胺基十一酸或8-胺基辛酸)，使得P2與P6之間的距離與P3、P4、P5中之每一者為胺基酸時之距離大約相同；P6為Bpa、Phe4NO2、任一種胺基酸與Tyr(例如Ser-Tyr)、任一種胺基酸與Phe(例如Ser-Phe)、任何胺基酸或不存在；且P7、P8、P9、P10、P11、P12中之至少三者為鹼性胺基酸而其餘為任何胺基酸或不存在。
在另一實施例中，肽或肽模擬物序列包括以下結構：P1,P2,P3,P4,P5,P6(SEQ ID NO：21)或P6,P5,P4,P3,P2,P1(SEQ ID NO：22)。P1為Cha、Nal(2)、(Phe-2,3,4,5,6-F)、(Phe-3,4,5F)、(Phe-4CF3)、Bpa、Phe4NO2、Tyr或Phe；P2為Cha、Nal(2)、(Phe-2,3,4,5,6-F)、(Phe-3,4,5F)、(Phe-4CF3)、Bpa、Phe4NO2、Tyr或Phe；P3為Ser、Arg、Cys、Pro或Asn；P4為Trp；P5為Ser、Arg或Asn；或P3、P4、P5為單胺基十一酸或單8-胺基辛酸；且P6為Bpa、Phe4NO2、(Ser-Tyr)或(Ser-Phe)。
在另一實施例中，肽或肽模擬物序列包括以下結構：P1,P2,P3,P4,P5,P6,P7,P8,P9,P10,P11,P12(SEQ ID NO：23)；P1,P2,P3,P4,P5,P6,P12,P11,P10,P9,P8,P7(SEQ ID NO：24)；P6,P5,P4,P3,P2,P1,P7,P8,P9,P10,P11,P12(SEQ ID NO：25)；P6,P5,P4,P3,P2,P1,P12,P11,P10,P9,P8,P7(SEQ ID NO：26)；P7,P8,P9,P10,P11,P12,P1,P2,P3,P4,P5,P6(SEQ ID NO：27)；P7,P8,P9,P10,P11,P12,P6,P5,P4,P3,P2,P1(SEQ ID NO：28)；P12,P11,P10,P9,P8,P7,P1,P2,P3,P4,P5,P6(SEQ ID NO：29)；P12,P11,P10,P9,P8,P7,P6,P5,P4,P3,P2,P1(SEQ ID NO：30)；P12,P11,P6,P9,P8,P7,P2,P1(SEQ ID NO：31)；P12,P11,P10,P6,P9,P4,P7,P2,P1(SEQ ID NO：32)；P1,P2,P7,P8,P9,P6,P11,P12(SEQ ID NO：33)；或P1,P2,P7,P4,P9,P6,P10,P11,P12(SEQ ID NO：34)。P1為Cha、Nal(2)、(Phe-2,3,4,5,6- F)、(Phe-3,4,5F)、(Phe-4CF3)、Bpa、Phe4NO2、Tyr或Phe；P2為Cha、Nal(2)、(Phe-2,3,4,5,6-F)、(Phe-3,4,5F)、(Phe-4CF3)、Bpa、Phe4NO2、Tyr或Phe；P3為Ser、Arg、Cys、Pro或Asn；P4為Trp；P5為Ser、Arg或Asn；或P3、P4、P5為單胺基十一酸或單8-胺基辛酸；P6為Bpa、Phe4NO2、(d-Ser-d-Tyr)或(d-Ser-d-Phe)；且P7、P8、P9、P10、P11、P12中之至少三者為Arg或Lys而其餘為任何胺基酸或不存在。
在另一實施例中，肽或肽模擬物序列包括以下結構：P1,P2,P3,P4,P5,P6,P7,P8,P9,P10,P11,P12(SEQ ID NO：35)；P12,P11,P10,P9,P8,P7,P6,P5,P4,P3,P2,P1(SEQ ID NO：36)；P12,P11,P10,P6,P9,P4,P7,P2,P1(SEQ ID NO：37)；或P1,P2,P7,P4,P9,P6,P10,P11,P12(SEQ ID NO：38)。P1為Cha或Nal(2)；P2為(Phe-2,3,4,5,6-F)、(Phe-3,4,5F)、(Phe-4CF3)；P3為Ser；P4為Trp；P5為Ser或Asn；P6為Bpa、Phe4NO2、(Ser-Tyr)或(Ser-Phe)；且P7、P8、P9、P10、P11、P12中之至少三者為Arg而其餘為任何胺基酸或不存在。
在另一實施例中，肽或肽模擬物序列包括以下結構：P1,P2,P3,P4,P5,P6(SEQ ID NO：39)或P6,P5,P4,P3,P2,P1(SEQ ID NO：40)。P1為Cha或Nal(2)；P2為(Phe-2,3,4,5,6-F)、(Phe-3,4,5F)或(Phe-4CF3)；P3為Ser；P4為Trp；P5為Ser；且P6為Bpa或(Ser-Tyr)。
在另一實施例中，肽或肽模擬物序列包含以下結構：P1,P2,P3,P4,P5,P6(SEQ ID NO：41)；P6,P5,P4,P3,P2,P1(SEQ ID NO：42)；P1,P2,P3,P4,P5,P6,P7,P8,P9,P10,P11,P12(SEQ ID NO：43)；P1,P2,P3,P4,P5,P6,P12,P11,P10,P9,P8,P7(SEQ ID NO：44)；P6,P5,P4,P3,P2,P1,P7,P8,P9,P10,P11,P12(SEQ ID NO：45)；P6,P5,P4,P3,P2,P1,P12,P11,P10,P9,P8,P7(SEQ ID NO：46)；P7,P8,P9,P10,P11,P12,P1,P2,P3,P4,P5,P6(SEQ ID NO：47)；P7,P8,P9, P10,P11,P12,P6,P5,P4,P3,P2,P1(SEQ ID NO：48)；P12,P11,P10,P9,P8,P7,P1,P2,P3,P4,P5,P6(SEQ ID NO：49)；P12,P11,P10,P9,P8,P7,P6,P5,P4,P3,P2,P1(SEQ ID NO：50)；P12,P11,P6,P9,P8,P7,P2,P1(SEQ ID NO：51)；P12,P11,P10,P6,P9,P4,P7,P2,P1(SEQ ID NO：52)；P1,P2,P7,P8,P9,P6,P11,P12(SEQ ID NO：53)；或P1,P2,P7,P4,P9,P6,P10,P11,P12(SEQ ID NO：54)。P1為Cha或Nal(2)；P2為(Phe-2,3,4,5,6-F)、(Phe-3,4,5F)或(Phe-4CF3)；P3為任何胺基酸(例如Ser或Pro)；P4為d-Trp或l-Trp；P5為任何胺基酸(例如Ser或Pro)；P6為Bpa或(Ser-Tyr)；P7為Arg；P8為Arg；P9為Arg；P10為Gln或Arg；P11為Arg；且P12為d-Arg或l-Arg。
在另一實施例中，肽或肽模擬物序列包括以下結構：P1,P2,P3,P4,P5,P6,P7,P8,P9,P10,P11,P12(SEQ ID NO：55)；P12,P11,P10,P9,P8,P7,P6,P5,P4,P3,P2,P1(SEQ ID NO：56)；P12,P11,P10,P6,P9,P4,P7,P2,P1(SEQ ID NO：57)；或P1,P2,P7,P4,P9,P6,P10,P11,P12(SEQ ID NO：58)。P1為Cha或Nal(2)；P2為(Phe-2,3,4,5,6-F)；P3為Ser；P4為Trp；P5為Ser；P6為Bpa或(Ser-Tyr)；P7為Arg；P8為Arg；P9為Arg；P10為Gln或Arg；P11為Arg；且P12為Arg。
在特定態樣中，肽或肽模擬物序列包括以下結構：(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(CBP501；SEQ ID NO：80)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO：100)；(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO：59)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO：60)；(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(d- Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO：61)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(SEQ ID NO：62)；(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO：63)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(SEQ ID NO：64)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(SEQ ID NO：65)；(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO：66)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO：67)；(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO：68)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO：69)；(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO：70)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO：71)；(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO：72)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO：73)；(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO：74)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO：75)；或(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO：76)；(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d- Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO：77)。
在一些實施例中，提供CBP501(SEQ ID NO：80)之生理學上可接受之鹽，例如無機鹼之鹽、有機鹼之鹽、無機酸之鹽、有機酸之鹽、鹼性或酸性胺基酸之鹽及其類似鹽。此類鹽可藉由已知方法產生(例如，乙酸鹽可使用含乙酸溶劑藉由液相層析步驟產生)。
無機鹼之鹽之實例包括鹼金屬鹽(諸如鈉鹽、鉀鹽及其類似鹽)、鹼土金屬鹽(諸如鈣鹽、鎂鹽及其類似鹽)及鋁鹽、銨鹽及其類似鹽。
有機鹼之鹽之實例包括三甲胺、三乙胺、吡啶、甲吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、緩血酸胺[參(羥基甲基)胺基甲烷]、第三丁胺、環己胺、苯甲胺、二環己胺、N,N'-二苯甲基乙二胺及其類似者之鹽。
無機酸之鹽之實例包括鹽酸、氫溴酸、硝酸、硫酸、磷酸及其類似者之鹽。
有機酸之鹽之實例包括甲酸、乙酸、三氟乙酸、鄰苯二甲酸、反丁烯二酸、草酸、酒石酸、順丁烯二酸、檸檬酸、丁二酸、蘋果酸、甲磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸及其類似者之鹽。
鹼性胺基酸之鹽之實例包括精胺酸、離胺酸、鳥胺酸及其類似者之鹽。
酸性胺基酸之鹽之實例包括天冬胺酸、麩胺酸及其類似者之鹽。
在一些實施例中，提供有機酸(諸如乙酸及其類似者)之鹽。特定言之，連接至如本文所闡述之肽或肽模擬物(例如CBP501)之乙酸數量可變化，包括例如每個如本文所闡述之肽或肽模擬物(例如CBP501)4或5個乙酸。或者，可使用具有不同數量之連接至其之乙酸的肽或肽模擬物(例如CBP501)乙酸鹽之混合物(例如，4個乙酸及5個乙酸之混合物等)。
在一些實施例中，提供肽化合物CBP501之乙酸鹽：(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO：80)。產生由SEQ ID NO：80顯示之肽化合物乙酸鹽之方法可包含使用含乙酸溶劑進行液相層析之步驟。
在另一態樣中，肽及肽模擬物序列包括一或多種l-型或d-型殘基；經l-殘基取代之d-殘基；或經d-殘基取代之l-殘基。
肽及肽模擬物序列包括以下活性中之一或多者：抑制細胞增殖；廢除細胞之細胞週期G2檢查點；刺激細胞凋亡；刺激細胞災變。
肽及肽模擬物序列包括長度為約6至約12、10至約20、18至約25、25至約100、25至約200或50至約300個殘基之長度的序列
進一步提供包括本文所揭示之肽及肽模擬物序列之組合物。在一個實施例中，組合物包括肽或肽模擬物序列及核酸損傷劑。在另一實施例中，組合物包括肽或肽模擬物序列及抗增殖劑。在另一實施例中，組合物包括醫藥學上可接受之載劑或賦形劑及肽或肽模擬物序列及視情況選用之核酸損傷劑或抗增殖劑。
在一些實施例中，方法包括向個體投與核酸損傷劑、核酸損傷治療、抗增殖劑或抗增殖治療。在特定態樣中，藥劑或治療包含藥物(例如，諸如5-氟尿嘧啶(5-FU)、蝴蝶黴素(rebeccamycin)、阿德力黴素(ADR)、博萊黴素(Bleo)、派萊黴素(pepleomycin)之化學治療藥物，諸如順鉑(CDDP)、卡鉑、吡鉑(picoplatin)、萘達鉑(nedaplatin)、米鉑(miriplatin)、賽特鉑(satraplatin)、特瑞鉑(triplatin)、利普鉑(lipoplatin)、米他鉑(mitaplatin)、奧沙利鉑或喜樹鹼(CPT)之順鉑衍生物)、輻射(例如UV輻射、IR輻射或α-、β-或γ-輻射)、放射性同位素(例如I131、I125、90Y、177Lu、213Bi或211At)、環境衝擊(例如高溫)。
如本文所用，術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」可互換使用且係指由醯胺鍵或非醯胺等效物共價連接之兩個或兩個以上胺基酸。肽可為任何長度。舉例而言，肽可具有約5至100或100個以上殘基，諸如5至12、12至15、15至18、18至25、25至50、50至75、75至100或100個以上之長度。肽可包括l-異構體及d-異構體及l-異構體與d-異構體之組合。肽可包括通常與蛋白質轉譯後加工相關之修飾，例如環化(例如二硫或醯胺鍵)、磷酸化、糖基化、羧化、泛素化、肉豆蔻醯化或脂質化。
本文所揭示之肽進一步包括具有胺基酸結構性及功能性類似物之化合物，例如具有合成或非天然胺基酸或胺基酸類似物之肽模擬物，只要該模擬物具有一或多種功能或活性。因此，本文所揭示之化合物包括「模擬物」及「肽模擬物」形式。
如本文所用，術語「模擬物」及「肽模擬物」係指合成化合物，其具有實質上相同之肽之結構性及/或功能性特徵。模擬物可完全由合成、非天然胺基酸類似物組成或可為包括一或多個天然肽胺基酸及一或多個非天然胺基酸類似物之嵌合分子。模擬物亦可併有任何數目之天然胺基酸保守性取代，只要此類取代不破壞模擬物活性。如同保守性變異體之多肽，可使用常規測試測定模擬物是否具有所需活性，例如其是否具有可偵測細胞週期G2檢查點廢除活性。因此，在向個體投與或與細胞接觸時，可偵測地破壞G2細胞週期檢查點之模擬物將具有G2檢查點廢除活性。
肽模擬物組合物可含有非天然結構性組分之任何組合，其通常來自三種結構性基團：a)天然醯胺鍵(「肽鍵」)鍵聯以外之殘基鍵聯基團；b)代替天然存在之胺基酸殘基之非天然殘基；或c)誘導二級結構性擬態，亦即誘導或穩定例如β轉角、γ轉角、β摺疊、α螺旋構形及其類似者之二級結構的殘基。舉例而言，當殘基中之一或多者藉由化 學方式而非醯胺鍵連接時，多肽可表徵為模擬物。個別肽模擬物殘基可藉由醯胺鍵、非天然及非醯胺化學鍵、其他化學鍵或偶合方式連接，包括例如戊二醛、N-羥基丁二醯亞胺酯、雙功能性順丁烯二醯亞胺、N,N'-二環己基碳化二亞胺(DCC)或N,N'-二異丙基碳化二亞胺(DIC)。替代醯胺鍵之鍵聯基團包括例如酮基亞甲基(例如，替代-C(=O)-NH-之-C(=O)-CH2-)、胺基亞甲基(CH2-NH)、伸乙基、烯烴(CH=CH)、醚(CH2-O)、硫醚(CH2-S)、四唑(CN4-)、噻唑、逆醯胺(retroamide)、硫代醯胺或酯(參見例如Spatola(1983)in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides and Proteins，第7卷，第267-357頁，「Peptide and Backbone Modifications」,Marcel Decker,N.Y.)。
如所論述，肽可表徵為模擬物，其含有一或多個代替天然存在之胺基酸殘基之非天然殘基。非天然殘基為此項技術中已知的。用作天然胺基酸殘基模擬物之非天然殘基之特定非限制性實例為芳族胺基酸模擬物，包括例如D-或L-萘基丙胺酸；D-或L-苯基甘胺酸；D-或L-2噻吩基丙胺酸；D-或L-1、-2,3-或4-芘基丙胺酸；D-或L-3噻吩基丙胺酸；D-或L-(2-吡啶基)-丙胺酸；D-或L-(3-吡啶基)-丙胺酸；D-或L-(2-吡嗪基)-丙胺酸；D-或L-(4-異丙基)-苯基甘胺酸；D-(三氟甲基)-苯基甘胺酸；D-(三氟甲基)-***酸；D-對氟-***酸；D-或L-對聯苯***酸；K-或L-對甲氧基-聯苯***酸；D-或L-2-吲哚(烷基)丙胺酸；及D-或L-烷基丙胺酸，其中烷基可經甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、異丙基、異丁基、第二異丁基、異戊基或非酸性胺基酸取代或未經取代。可代替天然芳環使用之非天然胺基酸之芳環包括例如噻唑基、苯硫基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基及吡啶基芳環。
酸性胺基酸模擬物可藉由用非羧酸胺基酸取代而生成同時維持負電荷；(膦醯基)丙胺酸；及硫酸化蘇胺酸。羧基側基(例如天冬胺醯 基或麩胺醯基)亦可藉由與碳化二亞胺(R'-N-C-N-R')反應而選擇性地修飾，該等碳化二亞胺包括例如1-環己基-3-(2-嗎啉基-(4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳化二亞胺。天冬胺醯基或麩胺醯基亦可藉由與銨離子反應而轉化為天冬醯胺醯基及麩醯胺醯基。
除離胺酸及精胺酸以外，鹼性胺基酸模擬物可藉由例如用胺基酸鳥胺酸、瓜胺酸或(胍基)-乙酸或(胍基)烷基-乙酸取代而生成，其中烷基可經甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、異丙基、異丁基、第二異丁基、異戊基或非酸性胺基酸取代或未經取代。腈衍生物(例如含有代替COOH之CN-部分)可取代天冬醯胺或麩醯胺酸。天冬醯胺醯基及麩醯胺醯基殘基可去胺為相應天冬胺醯基或麩胺醯基殘基。
精胺酸模擬物可藉由使精胺醯基與一或多種試劑反應而生成，該等試劑包括例如苯基乙二醛、2,3-丁二酮、1,2-環己二酮或茚三酮，視情況在鹼性條件下。酪胺酸殘基模擬物可藉由使酪胺醯基與芳族重氮化合物或四硝甲烷反應而生成。N-乙醯基咪唑及四硝甲烷可分別用於形成O-乙醯基酪胺醯基物質及3-硝基衍生物。
離胺酸模擬物可藉由使離胺醯基與丁二酸或其他羧酸酸酐反應而生成(且胺基末端殘基可改變)。離胺酸及其他含α-胺基之殘基模擬物亦可藉由與亞胺基酯(諸如吡啶甲醯亞胺酸甲酯)、吡哆醛磷酸酯、吡哆醛、氯硼氫化物、三硝基苯磺酸、O-甲基異脲、2,4-戊二酮反應及與乙醛酸酯之轉醯胺催化反應而生成。
甲硫胺酸模擬物可藉由與甲硫胺酸亞碸反應而生成。脯胺酸包括模擬物例如哌啶甲酸、噻唑啶羧酸、3-或4-羥基脯胺酸、去氫脯胺酸、3-或4-甲基脯胺酸及3,3-二甲基脯胺酸。組胺酸模擬物可藉由使組胺醯基與焦碳酸二乙酯或對溴苯甲醯甲基溴化物反應而生成。其他 模擬物包括例如由脯胺酸及離胺酸之羥基化；絲胺醯基或羥丁胺醯基殘基之羥基之磷酸化；離胺酸、精胺酸及組胺酸之α-胺基之甲基化；N端胺之乙醯化；主鏈醯胺殘基之甲基化或用N-甲基胺基酸取代；或C端羧基之醯胺化生成之模擬物。
一或多個殘基亦可由具有相反對掌性之胺基酸(或肽模擬物殘基)替換。因此，以L-組態天然存在之任何胺基酸(其亦可稱為R或S，視化學個體之結構而定)可用相同但具有相反對掌性之胺基酸或模擬物替換，其稱為D-胺基酸，但其又可稱為R形式或S形式。
肽及肽模擬物進一步包括本文所闡述之序列之修飾形式，限制條件為修飾形式保留至少一部分未修飾或參考肽或肽模擬物之功能。舉例而言，經修飾肽或肽模擬物將保留至少一部分細胞增殖抑制或G2廢除活性，但可具有相對於參考肽或肽模擬物提高或降低之細胞增殖抑制或G2廢除活性。
經修飾肽及肽模擬物可具有一或多個經另一殘基取代、添加至序列或自序列缺失之胺基酸殘基。在一個實施例中，經修飾肽或肽模擬物具有一或多個胺基酸取代、添加或缺失(例如1-3、3-5、5-10或10個以上)。在一個態樣中，取代用側鏈佔據與參考胺基酸或模擬物(經取代之胺基酸或模擬物)類似之空間的胺基酸或模擬物進行。在另一態樣中，取代用結構上類似於人類殘基之非人類胺基酸進行。在一個特定態樣中，取代為保守性胺基酸取代。
如本文所用，術語「類似空間」意謂佔據大小類似於參考部分之三維空間的化學部分。通常，佔據類似空間之部分大小應類似於參考部分。「佔據類似側鏈空間」之胺基酸或模擬物具有側鏈，其佔據大小類似於參考胺基酸或模擬物之三維空間。d-(Phe-2,3,4,5,6-F)、l-(Phe-2,3,4,5,6-F)、d-(Phe-3,4,5F)、l-(Phe-3,4,5F)、d-(Phe-4CF3)或l-(Phe-4CF3)之特定實施例為(l-或d-Phe-2R1,3R2,4R3,5R4,6R5)，其中 R1、R2、R3、R4、R5可為氯化物、溴化物、氟化物、碘化物、氫、氧化氫或不存在。對於小分子，例如大小為約1埃之氟化物，類似空間可不存在於部分中。
術語「保守性取代」意謂由生物學上、化學上或結構上類似之殘基替代一種胺基酸。生物學上類似意謂取代與生物活性，例如抗細胞增殖或G2廢除活性相容。結構上類似意謂胺基酸之側鏈具有類似長度(諸如丙胺酸、甘胺酸及絲胺酸)或具有類似大小。化學相似性意謂殘基具有相同電荷或均為親水性或疏水性的。特定實例包括一種疏水性殘基(諸如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸或甲硫胺酸)取代另一種，或一種極性殘基取代另一種，諸如精胺酸取代離胺酸、麩胺酸取代天冬胺酸或麩醯胺酸取代天冬醯胺、絲胺酸取代蘇胺酸及其類似取代。
因此，肽及肽模擬物包括序列與表1中所列舉之一連串肽及肽模擬物序列不一致之肽及肽模擬物。在一個實施例中，肽或肽模擬物之序列與表1中所列舉之序列具有50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或95%以上之一致性。在一個態樣中，一致性在序列之界定領域內，例如胺基或羧基末端之3-5個殘基。
肽及肽模擬物可使用此項技術中已知之任何方法產生及分離。肽可使用此項技術中已知之化學方法整體或部分地合成(參見例如Caruthers(1980)Nucleic Acids Res.Symp.Ser.215-223；Horn(1980)Nucleic Acids Res.Symp.Ser.225-232；及Banga,A.K.,Therapeutic Peptides and Proteins,Formulation,Processing and Delivery Systems(1995)Technomic Publishing Co.,Lancaster,Pa.)。肽合成可使用不同固相技術進行(參見例如Roberge(1995)Science 269：202；Merrifield(1997)Methods Enzymol.289：3-13)且自動合成可例如根據製造商之說明書使用ABI 431A肽合成器(Perkin Elmer)達成。
併有模擬物之個別合成殘基及多肽可使用此項技術中已知之多 種程序及方法合成(參見例如Organic Syntheses Collective Volumes,Gilman等人(編)John Wiley & Sons,Inc.,NY)。肽及肽模擬物亦可使用組合方法合成。生成肽及肽模擬物庫之技術為吾人所熟知，且包括例如多針、茶袋及***-偶合-混合技術(參見例如al-Obeidi(1998)Mol.Biotechnol.9：205-223；Hruby(1997)Curr.Opin.Chem.Biol.1：114-119；Ostergaard(1997)Mol.Divers.3：17-27；及Ostresh(1996)Methods Enzymol.267：220-234)。經修飾肽又可藉由化學改良方法產生(參見例如Belousov(1997)Nucleic Acids Res.25：3440-3444；Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19：373-380；及Blommers(1994)Biochemistry 33：7886-7896)。
肽亦可用連接至其之一或多個額外域合成且表現為融合蛋白來產生免疫性較強之肽，以較容易地分離以重組方式合成之肽，或鑑別且分離抗體或表現抗體之B細胞。促進偵測及純化之域包括例如金屬螯合肽，諸如允許在固定金屬上純化之聚組胺酸段及組胺酸-色胺酸模組；允許在固定免疫球蛋白上純化之蛋白質A域；及FLAGSTM擴展/親和純化系統(Immunex Corp,Seattle,Wash.)中利用之域。純化域與肽之間包括可裂解連接子序列(諸如因子Xa或腸激酶(Invitrogen,San Diego Calif.))可用於促進肽純化。舉例而言，表現載體可包括連接至六個組胺酸殘基後接硫氧還原蛋白及腸激酶裂解位點之肽編碼核酸序列(參見例如Williams(1995)Biochemistry 34：1787-1797；Dobeli(1998)Protein Expr.Purif.12：404-14)。組胺酸殘基促進融合蛋白質之偵測及純化，而腸激酶裂解位點提供自融合蛋白質之其餘部分純化肽之構件。關於編碼融合蛋白質之載體及塗覆融合蛋白質之技術為此項技術中已知的(參見例如Kroll(1993)DNA Cell.Biol.,12：441-53)。
在一些實施例中，提供本文所揭示之編碼肽之核酸。在特定實施例中，本文編碼肽序列之核酸之長度為約8至12、12至15、15至 18、15至20、18至25、20至25、25至35、25至50或50至100個胺基酸或100個胺基酸以上之長度。
術語「核酸」及「聚核苷酸」可互換使用指所有核酸形式，包括去氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)。核酸可為雙鏈、單鏈或三鏈，線性或環狀。核酸包括染色體組DNA、cDNA及反義。RNA核酸可為剪接或未剪接mRNA、rRNA、tRNA或反義(例如RNAi)。核酸包括天然存在的、合成的以及核苷酸類似物及衍生物。此類經改變或修飾聚核苷酸包括提供例如核酸酶抗性之類似物。核酸長度亦可短於例示性肽序列。舉例而言，該等肽序列中任一者之子序列可編碼具有抗增殖或G2廢除活性之肽。
核酸可使用多種熟知之標準選殖及化學合成方法中之任一者產生且可藉由定點突變誘發或其他熟習此項技術者已知之重組技術有意地改變。聚核苷酸之純度可經由定序、凝膠電泳及其類似方法測定。
核酸可***核酸構築體中，其中核酸之表現由「表現控制元件」影響或調節，其組合稱為「表現盒式區」。術語「表現控制元件」意謂調節或影響其以操作方式連接之核酸序列之表現的一或多個序列元件。表現控制元件以操作方式連接至核酸序列控制核酸序列之轉錄及(按需要)轉譯。
術語「以操作方式連接」係指功能性併接，其中如此描述之組件處於允許其以其預期方式起作用之關係中。通常，表現控制元素在基因之5'或3'端部處併接，但亦可為內含子。啟動子一般位於編碼序列之5'處。「啟動子」意謂足以引導轉錄之最少序列元件。
表現控制元件包括啟動子、強化子、轉錄終止子、基因靜止子、蛋白質編碼基因前面之開始密碼子(例如ATG)。表現控制元件激活構成性轉錄、誘導性轉錄(亦即，需要用於激活之外部信號)或去抑制轉錄(亦即，信號關閉轉錄；移除信號激活轉錄)。表現盒式區亦可 包括足以使基因表現對於特異性細胞類型或組織可控之控制元件(亦即組織特異性控制元件)。
核酸可***用於傳播至宿主細胞中及後續基因操作之質體中。質體為可穩定傳播至宿主細胞中之核酸；質體視情況含有表現控制元件以驅動宿主細胞中編碼肽之核酸之表現。本文所用之術語「載體」與質體同義且亦可包括用於在宿主細胞中表現之表現控制元件。質體及載體一般含有至少一個用於在細胞中傳播之複寫起點及一個啟動子。因此，質體及載體可用於肽編碼核酸之基因操作以用於產生肽，及用於例如在宿主細胞或整個有機體中表現肽。
因此，肽可在細菌系統中使用構成性啟動子(諸如T7)或誘導性啟動子(諸如噬菌體π pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac混合啟動子))；在酵母系統中使用構成性啟動子(諸如ADH或LEU2)或誘導性啟動子(諸如GAL)(參見例如Ausubel等人，In：Current Protocols in Molecular Biology，第2卷，第13章，Greene Publish編.Assoc.& Wiley Interscience,1988；Grant等人.Methods in Enzymology,153：516(1987),Wu & Grossman編；Bitter Methods in Enzymology,152：673(1987),Berger & Kimmel編，Acad.Press,N.Y.；及Strathern等人，The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces(1982)Cold Spring Harbor Press編，第I卷及第II卷；R.Rothstein In：DNA Cloning,A Practical Approach，第11卷，第3章，D.M.Glover編，IRL Press,Wash.,D.C.,1986)；在昆蟲細胞系統中使用構成性或誘導性啟動子(諸如蛻皮激素)；且在哺乳動物細胞系統中使用構成性啟動子(諸如SV40、RSV)或來源於哺乳動物細胞基因組之誘導性啟動子(諸如金屬硫蛋白IIA啟動子、熱休克啟動子)或來源於哺乳動物病毒之誘導性啟動子(諸如腺病毒後啟動子或誘導性小鼠***腫瘤病毒長末端重複序列)來表現。肽表現系統另外包括設計用於活體內用途之載體，包括腺病毒載 體(美國專利第5,700,470號及第5,731,172號)、腺結合載體(美國專利第5,604,090號)、單純疱疹病毒載體(美國專利第5,501,979號)及反轉錄病毒載體(美國專利第5,624,820號、第5,693,508號及第5,674,703號及WIPO公開案WO92/05266及WO92/14829)。牛乳頭狀瘤病毒(BPV)亦已用於基因治療中(美國專利第5,719,054號)。此類基因治療載體亦包括基於CMV之載體(美國專利第5,561,063號)。
實例
CBP501(SEQ ID NO：80)為抗癌候選藥物，其在兩個隨機化II期臨床試驗中研究用於患有非鱗狀非小細胞肺癌(NSCLC)及惡性胸膜間皮瘤(MPM)之患者。已顯示CBP501具有兩種作用機制，即鈣調蛋白調節及G2檢查點廢除。本文揭示預測對CBP501之敏感性之生物標記物。經由短期(1小時)共暴露於CDDP及CBP501或單獨任一者之治療藉由定量分析CBP501之順-二胺二氯-鉑(II)(CDDP)增強活性將二十八個NSCLC細胞株分類為CBP501敏感及不敏感之兩個子組。對此等細胞株進行微陣列分析以鑑別與CBP501敏感性相關之基因表現模式。已發現多種核因子紅血球-2相關因子2(Nrf2)靶基因在CBP501不敏感細胞株中呈現高表現。NSCLC細胞株中Nrf2之西方墨點法及免疫細胞化學分析亦表明CBP501不敏感細胞株中之較高蛋白質量。此外，CBP501敏感性由抑制或蘿蔔硫素(SEN)誘導之Nrf2過度表現調節。此等結果表明Nrf2轉錄因子為抗CBP501之生物標記物之潛在候選。此實例鑑別將很好地對NSCLC之CBP501及CDDP組合療法作出反應的彼等患者亞群。
確立預測對特定藥物之敏感性的可定量標記物為個性化藥物之目標。已基於已知致癌突變發展若干抗癌藥物且已發現突變存在本身為此等藥物之有用生物標記物。實例包括一些靶向NSCLC中之表皮生長因子受體(EGFR)的酪胺酸激酶抑制劑，包括吉非替尼(gefitinib) 及埃羅替尼(erlotinib)，其功效視特定EGFR突變之存在而定(1，2)；克卓替尼(Crizotinib)，其在NSCLC細胞具有EML4-ALK融合基因時極有效(3)；及BRAF抑制劑維羅非尼(Vemurafenib)，其在黑素瘤細胞攜有BRAF之V600E突變時極有效(4)。
已表明CDDP加CBP501之組合在患有抗鉑卵巢癌及MPM之患者中展示臨床活性證據(5)。療效之主要終點已對MPM達成(6)。G2檢查點廢除已基於以下觀測提出為作用機制(MOA)：CBP501(i)抑制多種使CDC25C在Ser216處磷酸化之激酶，(ii)直接結合於14-3-3蛋白質，其與磷酸基-CDC25C形成抑制錯合物，(iii)減弱CDC25C在Ser216處之磷酸化及(iv)在與CDDP或博萊黴素(BLM)超長組合暴露後，減少癌細胞在G2/M期積聚(7，8)。
說明CBP501之其他MOA。此需要CBP501與鈣調蛋白之直接相互作用，與廢除G2檢查點之所需條件相比，其在暴露於CBP501更短時間下及更低CBP501劑量下即可提高癌細胞吸收CDDP(9)。已知CDDP之吸收視多種轉運子及通道而定(10)。鈣調蛋白-CBP501相互作用可能影響多種轉運子，以提高癌細胞吸收CDDP。
Nrf2為轉錄因子，其調節諸多抗氧化基因(包括彼等與麩胱甘肽合成相關之抗氧化基因)之表現(11)。在腫瘤形成中，Kras、BRAF及Myc之特定致癌對偶基因之表現藉由誘導Nrf2表現來提高胞內抗氧化劑之量(12)。Nrf2亦調節與藥物去毒及轉運相關之基因之表現(13)。
此實例藉由僅短期暴露於CBP501及CDDP後偵測細胞，來關注CBP501對促進CDDP吸收而非廢除G2檢查點之影響。藉由分析二十八個NSCLC細胞株在經過CDDP及CBP501短期(1h)共同暴露後相較於經過任一單獨藥物暴露後之反應，依定量方式界定其為對CBP501敏感或不敏感。對此等細胞株進行全面基因表現分析(微陣列)以鑑別此CBP501 MOA之敏感性標記物。由Nrf2轉錄因子調節之多種基因經鑑 別為在CBP501不敏感細胞株中具有高度表現。另外，可藉由使用Nrf2 sh-RNA減弱Nrf2時，表示Nrf2表現係抵抗CBP501所必需。
材料及方法
細胞培養物及試劑。於37℃、5% CO2/空氣下，在多種培養基中培養人類NSCLC細胞株，各補充有10%胎牛血清(Invitrogen,San Diego,CA)。將培養基RPMI1640(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)用於NCI-H1755、NCI-H2030、NCI-H1437、NCI-H2122、NCI-H2172、NCI-H2228、NCI-H1563、NCI-H1944、NCI-H1993、NCI-H1734、NCI-H1568、NCI-H2444、NCI-H2291、NCI-H2347、NCI-H1838、NCI-H1299、HCC827、NCI-H1975、NCI-H1155、NCI-H522及NCI-H1703；補充有2mM L-麩醯胺酸(Invitrogen)之RPMI1640用於NCI-H727；補充有4.5g/L D-葡萄糖(Sigma-Aldrich)、10mM HEPES(Sigma-Aldrich)及1mM丙酮酸鈉(Sigma-Aldrich)之RPMI1640用於NCI-H358、NCI-H520、NCI-H23、NCI-H647及NCI-H838；Ham氏F12K(Sigma-Aldrich)用於A549。CDDP購自Sigma-Aldrich。蘿蔔硫素(Sulforaphane)(SFN)購自Sigma-Aldrich。所有NSCLC細胞株購自ATCC且已由ATCC進行STR分析，以鑑認各細胞株之標識。所有細胞株在解凍後三個月內使用。
細胞週期分析。將細胞塗覆於24孔培養板中且培育24小時。使用或不使用添加加或不添加CBP501之CDDP，在指定濃度下處理細胞指定次數。收集細胞且用Krishan溶液(0.1%檸檬酸鈉、50μg/ml碘化丙錠、20μg/ml RNase A、0.5% NP-40)染色。使用CELLQuest軟體(Becton Dickinson)，藉由FACSCalibur(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)分析染色細胞。
抗體。抗體購自指定來源：抗NR0B1、抗Grx、抗Prx、抗γGCSc、抗γGCSm及抗Gpx1(SantaCruz,Dallas,TX)；抗MLC、抗 G6PD、抗ABCC2、抗KEAP1、抗BACH1、抗Trx1、抗SOD1、抗HO1、抗NQO1、抗IQGAP1及抗ATM(Cell Signaling Technology,Beverly,MA)；抗GSR、抗AKR1C1、抗AKR1C3、抗AKR1B10及抗Nrf2(Epitomics,San Francisco,CA)。
微陣列及基因表現分析。在RNA分離之前，在單層中生長NSCLC細胞株。使用RNeasy微套組(Qiagen,Tokyo,Japan)分離總RNA。在TAKARABIO Inc.(Shiga,Japan)進行分離之總RNA樣品之按捷倫表現陣列(Agilent Expression Array)分析。一式三份地進行細胞株總RNA之各分析。由TAKARABIO Inc.進行基因表現資料之基本統計處理(單因子變異數分析及本亞明-霍赫貝格方法(Benjamini-Hochberg method)：錯誤發現率0.05)。
慢病毒感染。Nrf2 shRNA慢病毒粒子及對照shRNA慢病毒粒子購自SantaCruz。根據製造商之說明書進行慢病毒感染。在病毒感染之前用5μg/ml凝聚胺(SantaCruz)治療細胞(50%匯合)。添加病毒之後一天，將細胞轉移至新製培養基且藉由用嘌呤黴素(SantaCruz)治療選擇細胞。
免疫螢光。蓋玻片上生長之細胞與4%多聚甲醛結合(15min)，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌(五分鐘，三次)，接著在1×PBS中用1%阻斷Ace(DS pharma,Osaka,Japan)進行阻斷。接著其使用標準方案用抗體培育。初級抗體包括抗Nrf2(1：100)、抗AKR1C1(1：100)、抗AKR1C3(1：100)及抗AKR1B10(1：100)。用Alexa-488(Invitrogen)標記二級抗體且使用Hoechst 33342(DOJINDO,Kumamoto,Japan)將DNA染色。使用FV10i共焦顯微鏡(OLYMPUS,Tokyo,Japan)進行共焦顯微。
西方墨點分析。用或不用SFN在指定濃度下治療細胞(50%匯合)指定次數。收集細胞且在裂解緩衝液[50mM Tris-HCl(pH 8.0)、5 mM EDTA(pH 8.0)、100mM NaCl、0.5% NP-40、2mM DTT、50mM NaF、1mM Na3VO4、1μM微囊藻素與蛋白酶抑制劑混合物(Roche,Mannheim,Germany)]中裂解(於冰上30min)。藉由離心(20600g，4℃)澄清裂解液，且根據製造商之說明書使用清潔劑可相容之蛋白質分析套組(Bio-Rad,Hercules,CA)對清液層分析蛋白質含量。在10-12% SDS-PAGE上操作全細胞裂解液(60μg)。將來自各凝膠之蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad)上。於室溫下在含有1%阻斷Ace(DS pharma)之TBST(10mM Tris-HCl[pH 8.0]、150mM NaCl及0.05% Tween-20)中將膜阻斷1h且在4℃下用初級抗體培育隔夜。在洗滌後於室溫下進一步用抗過氧化酶結合二級抗體(Cell Signaling)將膜培育一小時，且使用增強化學發光偵測系統(ECL高級西方墨點偵測套組，GE Healthcare)偵測信號。使用Lumino-mater LAS-4000儀器(Fujifilm,Tokyo,Japan)量化偵測帶。
NSCLC細胞株之突變搜尋。在NSCLC細胞株中搜索Keap1突變使用在線資料庫，即癌症體細胞突變目錄(Catalogue of somatic mutations in cancer，COSMIC)(http：//cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/)進行。
結果 NSCLC細胞株及對CBP501之敏感性
如多種方法所示，CBP501使腫瘤細胞對CDDP敏感，該等方法包括群落形成分析、活體外存活力分析及流動細胞測量分析(其量測細胞週期分佈中之全身變化)。不同方法之間的結果很好地相關(8，9)且不同細胞株對CBP501之差異性敏感性不斷變化(9)。
本文中，如流動細胞測量所指示，使用細胞週期分佈中之變化來估算NSCLC細胞株對CDDP經CBP501增強細胞毒性之敏感性。在CBP501存在或不存在之情況下，在用CDDP治療之細胞中監測此類變 化。將此分析用於評估抗癌治療之有效性係基於G1/S檢查點調節功能在諸多類型癌細胞之細胞週期中不存在(14)。功能性G1/S檢查點之缺乏導致癌細胞在其暴露於DNA損傷抗癌劑後在G2/M期中積聚(14，15)。
為評定CBP501之CDDP增強活性，一者可偵測兩個劑量-反應曲線中之任一者，其中X軸表示CDDP劑量且Y軸表示亞G1或G2/M中之細胞數量。對於CBP501敏感細胞，在CBP501存在下，任一劑量-反應曲線中之轉變及峰會轉移至左側，表明CDDP改變細胞週期分佈之能力增強。藉由此類NCI-H1703細胞分析，CBP501之存在使得CDDP改變細胞週期分佈之有效性提高約八倍(圖1A-D)。另一方面，NCI-H1437細胞株未在CDDP劑量-反應曲線中展現由CBP501所產生之任何可偵測轉移(圖1E-H)。基於CBP501轉移CDDP誘導之亞G1或G2/M劑量-反應曲線之能力使用此規則，將十二個NSCLC細胞株分類為CBP501敏感或CBP501不敏感。將轉移曲線兩倍或兩倍以上之細胞株分類為CBP501敏感細胞且將轉移曲線小於兩倍之細胞株分類為CBP501不敏感(表1)。NSCLC細胞株中CBP501敏感性之分類。
全面基因表現分析表明一些Nrf2靶基因在CBP501不敏感細胞株中可能具有上調表現。
對表1中所列十二個NSCLC細胞株進行全面基因表現(微陣列)分析。將表現量之臨限信號值設定為5000後，四十個基因展示70%以上與CBP501敏感性之相關性(圖2A)。將此等經鑑別基因再分成兩個類別：在敏感細胞株中高度表現之基因或在不敏感細胞株中高度表現之基因。對分別分類為敏感或不敏感之基因分組之平均表現量值的偵測表明，當比較CBP501敏感及不敏感細胞株時，一些不敏感基因分組不斷展現可辯別之表現量差異(圖7)。亦對表1中所列十二個NSCLC細胞株進行超過四十個蛋白質之西方墨點分析，該等蛋白質在包括壓力反應、抗藥性、代謝、分化及抗氧化反應之多種生物過程中起作用(資料未顯示)。發現Nrf2蛋白質之表現量在同一組NSCLC細胞株中很好地與CBP501敏感性相關(圖2B、C)。基於此等分析，將焦點置於來自圖2A之麩胱甘肽還原酶(GSR)、葡萄糖-6-磷酸鹽去氫酶(G6PD)、ATP結合盒式區亞家族C成員2(ABCC2)、醛基-酮基還原酶家族1C1(AKR1C1)及AKR1C3之mRNA表現水準上，因為已知此等基因之表現由共同轉錄因子Nrf2調節(16-20)。藉由西方墨點分析已確認蛋白質表現量與mRNA表現相關(圖2D)。
使用免疫細胞化學偵測若干NSCLC細胞株中Nrf2之胞內定位。此等測試揭示相較於CBP501敏感細胞株，CBP501不敏感細胞株中Nrf2之高度核定位以及Nrf2之顯著較高之全細胞表現量(圖3)。此等結果表明CBP501不敏感細胞株中Nrf2蛋白質之高表現量產生高靶基因表現量。
CBP501敏感性受Nrf2可用性影響
進行西方墨點分析來偵測Nrf2之其他已知基因標靶之表現量(16-20)。NAD(P)H去氫酶醌1(NQO1)、AKR1B10、γ-麩胺醯半胱胺酸合 成酶調節劑次單元(γGCSm)及麩胱甘肽過氧化酶1(GPX1)各自在CBP501不敏感細胞株中展示較高表現量(圖4A)。此等結果支持在正常培養條件下Nrf2靶基因之表現在CBP501不敏感細胞株中增強。
為說明CBP501敏感性與Nrf2表現之間的直接因果關係，產生對CBP501敏感之H1703之穩定Nrf2阻斷細胞株(圖4B)。將此細胞株一式三份地暴露於CBP501、CDDP及SFN，研究已知Nrf2活化子(17)。如圖4B中所示，SFN導致Nrf2蛋白質量在用對照shRNA轉染之細胞中以劑量相關方式提高。SFN未導致Nrf2蛋白質量在用Nrf2 shRNA轉染之細胞中有類似提高。添加SFN減弱CBP501在用對照shRNA轉染之細胞中之作用(圖4C、D)。然而，SFN之作用在Nrf2阻斷株系中消除(圖4B-D)。
研究CBP501不敏感細胞株H1437中之Nrf2阻斷作用。發現Nrf2阻斷導致AKR1C3、G6PD及GSR之表現量降低(圖5A)。對於此阻斷細胞株，發現CBP501提高CDDP對亞G1及G2-M之細胞週期分佈變化之作用，逆轉初始CBP501不敏感性。另一方面，用對照shRNA轉染之細胞株展示在有或無CBP501之情況下CDDP活性無差異(圖5B、C)。此等結果表明高Nrf2表現量可能誘導CBP501抗性。
Nrf2蛋白質之高表現為預測CBP501抗性之候選標記物；Nrf2標靶(在蛋白質或mRNA量下)為其他候選標記物。
儘管Nrf2或其若干下游轉錄標靶之表現可能可預測CBP501抗性，但CBP501敏感性之此等預測標記物之總體可靠性仍待確定。分析CBP501與CDDP在十六個其他NSCLC細胞株中之組合作用，該等細胞株各自藉由先前標準分類為CBP501敏感或不敏感(表2)。其他NSCLC細胞株中CBP501敏感性之分類。
表2
接著對此等細胞株進行與初始十二個細胞株相同之微陣列分析。再次分析二十八個細胞株之擴增組之基因表現熱圖來鑑別具有70%以上精確性之CBP501敏感性預測標記物候選。鑑別七個此類基因，包括三個Nrf2靶基因GSR(85.7%預測率)、AKR1C3(75%)及G6PD(85.7%)(圖6A)。亦藉由西方墨點法確認此等細胞株中相應蛋白質之表現量(圖6B)。值得注意地，AKR1C3及GSR之高表現量同等地保持與CBP501抗性及Nrf2表現相關(圖6B、C)。為研究此觀測之實際效用，偵測若干NSCLC細胞株以確定藉由免疫細胞化學方法偵測AKR1C3之蛋白質表現是否可充當可能之CBP501敏感性預測標記物。此類方法有希望大體上適用於標記物偵測，因為其在通常可購自NSCLC腫瘤活檢體之小組織樣品中足夠敏感以偵測經表現蛋白質量(21)。根據此等測試，推斷與Nrf2之結果類似，相較於CBP501敏感細胞株(圖6D、E)，實際上可在CBP501不敏感細胞株中偵測AKRIC3之較高量(圖3及6B)。此等結果表明Nrf2及一系列Nrf2基因靶分子之免疫組織化學偵測可為預測至少活體外CBP501抗性之高度可靠標記 物。
已表明CBP501作為抗癌候選藥物具有至少兩種作用機制(8，9)。此等中之一者，即G2檢查點廢除於較長治療持續時間及較高劑量下發生(8)。CBP501之第二抗癌活性，即經由與鈣調蛋白結合促進CDDP吸收於較短治療持續時間及較低劑量下發生(9)。在此實例中，將焦點置於後一作用上且藉由用較低劑量CBP501治療細胞持續較短時間來表徵諸多不同NSCLC細胞株之CBP501敏感性。此CBP501二級抗癌活性之詳細分子機制仍待闡明，因為CBP501-鈣調蛋白相互作用似乎影響CDDP吸收中涉及之眾多通道及轉運子中之若干者(10)。此等關於CDDP吸收之不明確性使最獨特地受CBP501影響之單一CDDP轉運路徑之鑑別複雜化。如藉由微陣列分析所測定，藉由鑑別CBP501敏感與不敏感細胞株之間的基因表現概況之主要差異來預測CBP501敏感性。此基因表現之全面分析首先產生若干CBP501敏感性之預測標記物候選。將來自由Nrf2調節之共同轉錄路徑的基因之提高表現鑑別為CBP501不敏感性之可能指示物。已知Nrf2為與細胞保護功能相關之基因關鍵轉錄因子(22-26)。在體內恆定機制條件下，藉由蛋白酶體降解系統經由其與結合Kelch類表氯醇之蛋白質1(Keap1)及Cul3 E3接合酶之結合來使Nrf2保持於極低胞內濃度下(27-30)。已發現Nrf2蛋白質表現量在CBP501不敏感細胞株中比在CBP501敏感細胞株中高。然而，Keap1表現量並未亦與CBP501敏感性相關(圖2B)。此結果可表明Nrf2蛋白質在體內恆定機制條件下降解之能力在不同細胞株之間變化。若干報導表明NSCLC細胞株及腫瘤中Keap1突變與不良預後或化學抗性之間的關係(31-33)。Keap1突變存在於此實例中所使用之一系列NSCLC細胞株中(下表3)。Keap1突變具有存在於CBP501不敏感細胞株中之傾向。此表明Keap1突變情況為CBP501抗性之有用指示物。各突變類型之作用將進一步檢驗。
將若干Nrf2靶基因於RNA或蛋白質量方面之差異性表現鑑別為鑑別預測CBP501不敏感性之標記物候選之方式。在此等初始候選中，G6PD、GSR及AKR1C3在CBP501敏感與不敏感細胞株之間的mRNA及蛋白質表現量中均顯示顯著差異。公認調節此等經鑑別基因之表現在稱為抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)之Nrf2結合元件之共同控制下進行(23)。若干已知轉錄因子可藉由爭奪ARE處之相互作用來拮抗Nrf2。此等轉錄因子包括小MAF蛋白質、BACH1、c-FOS及FRA1(23,34,35)。此等轉錄調控子可參與控制不同Nrf2靶基因之差異性表現。實際上，BACH1蛋白質為其在NSCLC細胞株中之表現似乎在CBP501敏感細胞株中提高之蛋白質(圖2B)。
Nrf2藉由誘導眾多基因之表現而參與廣泛範圍之不同生物現象，包括代謝、異生物質反應及抗氧化反應(22-26)。舉例而言，誘導 G6PD及GSR之表現提高麩胱甘肽量且此引起抗氧化反應(36，37)。AKR1C3可介導引起睾固酮合成及***素形成之路徑(38，39)。儘管Nrf2阻斷實驗表明Nrf2可調節CBP501敏感性，但關於何種Nrf2靶基因或現象直接影響CBP501敏感性仍無決定性解答。一種或若干Nrf2靶基因可參與測定細胞對CBP501對CDDP吸收之作用之敏感性。此類直接作用可能難以藉由習知微陣列分析偵測，該分析有時可能受技術限制阻礙，諸如個別探針偵測中變化之敏感性。儘管已表明在至少七個細胞株中CBP501/CDDP對短期暴露之組合作用很好地與CDDP吸收相關(9)，但並未說明NSCLC細胞株中之鉑積累。因此CBP501可能不僅影響CDDP吸收之增強且亦影響相對於CDDP之Nrf2相關細胞保護作用之抑制。舉例而言，可由Nrf2上調的降低之麩胱甘肽(GSH)結合於CDDP且可降低毒性(40)。然而，所量測之NSCLC細胞株中胞內降低之GSH量不與CBP501敏感性相關(資料未顯示)。顯而易見，需要進一步調查以確定具體機制，Nrf2藉由該機制調節CBP501不敏感性。
然而，對於實際選擇可由CBP501敏感性受益之患者，免疫組織化學(IHC)可為所選首要方法，因為可能自經由生檢可利用之小腫瘤樣品獲得敏感性之明確指示。可藉由IHC而非西方墨點法分析較小樣品(21)。對Nrf2、AKR1C1、AKR1B10及AKR1C3之免疫細胞化學量測之研究表明其可靠地再現西方墨點實驗中獲得之結果(圖3、6C、D、圖8及9)。驗證使用IHC偵測腫瘤生檢樣品中之此等蛋白質及進一步驗證與CBP501敏感性之相關性可提供有用工具來預測患者對組合CDDP+CBP501治療之提高之反應性。
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Claims (73)

  1. 一種CBP501之用途，其用於製造用以治療個體中之癌症之藥物，其中該治療包含：a.)量測患有癌症之候選個體或來自該候選個體之癌症樣品中核因子紅血球-2相關因子2(NRF2)或NRF2靶基因之表現，及測定該樣品中或該患有癌症之個體中NRF2之量；b.)將該所測定NRF2或所測定NRF2靶基因之量與NRF2或NRF2靶基因之基線或參考量進行比較，藉此確定該樣品中或該患有癌症之個體中該NRF2或NRF2靶基因之量是否低於該NRF2或NRF2靶基因之基線或參考量；及c.)若該樣品中或該患有癌症之個體中該NRF2或該NRF2靶基因之表現低於該NRF2或NRF2靶基因之基線或參考量，則用CBP501治療該患有癌症之個體。
  2. 一種CBP501之用途，其用於製造用以治療個體中之癌症之藥物，其中該治療包含：a.)篩檢患有癌症之候選個體或來自該候選個體之癌症樣品中的正常或功能性KEAP 1、或降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變，及測定正常或功能性KEAP 1、或降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變是否存在；及b.)若該個體表現正常或功能性KEAP 1，或該個體不具有降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變，則用CBP501治療該患有癌症之個體。
  3. 一種CBP501之用途，其用於製造用以治療個體中之癌症之藥物，其中該治療包含：a.)鑑別及/或選擇患有癌症之個體：(i)其中該個體或來自該個體之癌症樣品中之NRF2表現或NRF2靶基因 表現低於NRF2或NRF2靶基因之基線或參考量，或(ii)該個體或來自該個體之癌症樣品中具有正常或功能性KEAP 1、或具有降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變；及b.)用CBP501治療該個體中之癌症：(i)若該樣品中或該個體中之該NRF2或該NRF2靶基因之表現低於該NRF2或NRF2靶基因之基線或參考量，或(ii)若該個體具有正常或功能性KEAP 1，或該個體不具有降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變。
  4. 如請求項1或3之用途，其中NRF2靶基因為麩胱甘肽還原酶(GSR)、葡萄糖-6-磷酸去氫酶(G6PD)、ATP結合盒式區亞家族C成員2(ABCC2)、醛基-酮基還原酶家族1C1(AKR1C1)、醛基-酮基還原酶家族1C3(AKR1C3)、NAD(P)H去氫酶醌1(NQO1)、AKR1B10、γ-麩胺醯半胱胺酸合成酶調節劑次單元(γGCSm)或麩胱甘肽過氧化酶1(GPX1)中之任一者。
  5. 如請求項1或3之用途，其中該基線或參考量或預定值係藉由對CBP501治療起反應之癌細胞中之表現與對CBP501治療反應較弱之癌細胞進行比較而測定。
  6. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該樣品包含生物樣品。
  7. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該樣品包含細胞、組織或器官生檢或血液或血清樣品。
  8. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該樣品包含肺生檢。
  9. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該個體為哺乳動物。
  10. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該個體為人類。
  11. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該表現係藉由定量分析法量測。
  12. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該表現係藉由與偵測該NRF2蛋白質或由該NRF2靶基因編碼之該蛋白質之分析物接觸來 量測或偵測，或偵測該降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變。
  13. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該表現係藉由與偵測該NRF2轉錄物或該NRF2靶基因轉錄物之分析物接觸，或藉由定序包含該降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變的核酸來量測或偵測。
  14. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該表現係藉由免疫分析法量測或偵測。
  15. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該表現係藉由抗體免疫分析法量測或偵測。
  16. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該表現係藉由西方墨點法(Western blot)、ELISA、北方墨點法(Northern blot)、免疫組織化學或免疫細胞化學法量測或偵測。
  17. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該表現係藉由測定NRF2之cDNA或NRF2靶基因之cDNA來量測或偵測。
  18. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該表現係藉由NRF2 RNA或NRF2靶基因RNA之反轉錄及NRF2 cDNA或NRF2靶基因cDNA之聚合酶鏈反應(RT-PCR)，或KEAP 1 RNA或KEAP 1基因之反轉錄及KEAP 1 cDNA之聚合酶鏈反應(RT-PCR)來量測或偵測。
  19. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該CBP501包含其前藥之鹽。
  20. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該CBP501鹽包含鈉鹽、鈣鹽、鎂鹽、硝酸鹽、鉀鹽、磷酸鹽、磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、檸檬酸鹽、碳酸鹽、抗壞血酸鹽、丁二酸鹽、三氟乙酸鹽或乙酸鹽。
  21. 如請求項1至3中任一項之用途，其進一步包含投與G2檢查點抑 制劑。
  22. 如請求項1至3中任一項之用途，其進一步包含投與鈣調蛋白結合劑。
  23. 如請求項1至3中任一項之用途，其進一步包含向該個體投與核酸損傷劑。
  24. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該核酸損傷劑包含結合於或***DNA中之分子。
  25. 如請求項1至3中任一項之用途，其包含單獨或以任何組合形式向該個體投與CBP501、G2檢查點抑制劑、鈣調蛋白結合劑或核酸損傷劑1次、2次、3次、4次、5次或5次以上。
  26. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該癌症包含肺癌(NSCLC)。
  27. 一種選擇用CBP501進行癌症治療之個體的活體外方法，其包含：a.)量測來自該候選個體之癌症樣品中核因子紅血球-2相關因子2(NRF2)或NRF2靶基因之表現，及測定該癌症樣品中該NRF2或NRF2靶基因之量；b.)將該所測定NRF2或所測定NRF2靶基因之量與NRF2或NRF2靶基因之基線或參考量進行比較，藉此確定該NRF2或NRF2靶基因之量是否低於該NRF2或NRF2靶基因之基線或參考量；及c.)若該樣品中之該NRF2或NRF2靶基因低於該NRF2或NRF2靶基因之基線或參考量，則選擇該個體用CBP501進行癌症治療。
  28. 一種選擇用CBP501進行癌症治療之個體的活體外方法，其包含：a.)量測篩檢來自該患有癌症之候選個體之癌症樣品中的正常或功能性KEAP 1或降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變；及 b.)若該樣品具有正常或功能性KEAP 1，或該樣品不具有降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變，則選擇該個體用CBP501進行癌症治療。
  29. 一種鑑別用CBP501進行癌症治療之候選個體的活體外方法，其包含：a.)量測來自該候選個體之癌症樣品中核因子紅血球-2相關因子2(NRF2)或NRF2靶基因之表現，及測定該癌症樣品中該NRF2或NRF2靶基因之量；b.)將該所測定NRF2或所測定NRF2靶基因之量與NRF2之基線或參考量進行比較，以確定該NRF2或NRF2靶基因之量是否低於該NRF2或NRF2靶基因之基線或參考量；及c.)若該樣品中之該NRF2或NRF2靶基因低於該NRF2或NRF2靶基因之基線或參考量，則將該個體鑑別為用CBP501進行癌症治療之候選者。
  30. 一種鑑別用CBP501進行癌症治療之候選個體的活體外方法，其包含：a.)篩檢來自該候選個體之癌症樣品中的降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變；及b.)若該樣品具有正常或功能性KEAP 1，或若該樣品沒有降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變，則將該個體鑑別為用CBP501進行癌症治療之候選者。
  31. 一種判別癌症對用CBP501進行之治療為反應較強或反應較弱的活體外方法，其包含：a.)量測來自患有癌症之候選個體之癌症樣品中核因子紅血球-2相關因子2(NRF2)或NRF2靶基因之表現，及測定該所表現NRF2或NRF2靶基因之量； b.)將該所測定NRF2或所測定NRF2靶基因之量與NRF2或NRF2靶基因之預定值進行比較，以測定該NRF2或NRF2靶基因之量是否低於或高於該NRF2或NRF2靶基因之預定值；及c.)若該NRF2或NRF2靶基因表現低於或高於該NRF2或NRF2靶基因之預定值，則判別該癌症對用CBP501進行之治療為反應較強或反應較弱。
  32. 一種判別癌症對用CBP501進行之治療為反應較強的活體外方法，其包含：a.)篩檢來自患有癌症之候選個體之癌症樣品中的正常或功能性KEAP 1或降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變；b.)若存在正常或功能性KEAP 1，或缺少或不存在降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變，則判別該癌症對用CBP501進行之治療為反應較強。
  33. 如請求項27、29及31中任一項之方法，其中該NRF2靶基因為麩胱甘肽還原酶(GSR)、葡萄糖-6-磷酸去氫酶(G6PD)、ATP結合盒式區亞家族C成員2(ABCC2)、醛基-酮基還原酶家族1C1(AKR1C1)、醛基-酮基還原酶家族1C3(AKR1C3)、NAD(P)H去氫酶醌1(NQO1)、AKR1B10、γ-麩胺醯半胱胺酸合成酶調節劑次單元(γGCSm)或麩胱甘肽過氧化酶1(GPX1)中之任一者。
  34. 如請求項27、29及31中任一項之方法，其中該基線或參考量或預定值係藉由對CBP501治療起反應之癌細胞中之表現與對CBP501治療反應較弱之癌細胞進行比較而測定。
  35. 如請求項27至32中任一項之方法，其中該樣品包含生物樣品。
  36. 如請求項27至32中任一項之方法，其中該樣品包含細胞、組織或器官生檢、或血液或血清樣品。
  37. 如請求項27至32中任一項之方法，其中該樣品包含肺生檢。
  38. 如請求項27至32中任一項之方法，其中該個體為哺乳動物。
  39. 如請求項27至32中任一項之方法，其中該個體為人類。
  40. 如請求項27至32中任一項之方法，其中該表現係藉由定量分析法量測。
  41. 如請求項27至32中任一項之方法，其中該表現係藉由與偵測該NRF2蛋白質或由該NRF2靶基因編碼之蛋白質之分析物接觸來量測或偵測，或偵測該降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變。
  42. 如請求項27至32中任一項之方法，其中該表現係藉由與偵測該NRF2轉錄物或該NRF2靶基因轉錄物之分析物接觸，或藉由定序包含該降低或減少KEAP 1之活性、功能或表現之突變的核酸來量測或偵測。
  43. 如請求項27至32中任一項之方法，其中該表現係藉由免疫分析法量測或偵測。
  44. 如請求項27至32中任一項之方法，其中該表現係藉由抗體免疫分析法量測或偵測。
  45. 如請求項27至32中任一項之方法，其中該表現係藉由西方墨點法、ELISA、北方墨點法、免疫組織化學或免疫細胞化學法量測或偵測。
  46. 如請求項27至32中任一項之方法，其中該表現係藉由測定NRF2之cDNA或NRF2靶基因之cDNA來量測或偵測。
  47. 如請求項27至32中任一項之方法，其中該表現係藉由NRF2 RNA或NRF2靶基因RNA之反轉錄及NRF2 cDNA或NRF2靶基因cDNA之聚合酶鏈反應(RT-PCR)，或KEAP 1 RNA或KEAP 1基因之反轉錄及KEAP 1 cDNA之聚合酶鏈反應(RT-PCR)來量測或偵測。
  48. 如請求項27至32中任一項之方法，其中該CBP501包含其前藥之 鹽。
  49. 如請求項27至32中任一項之方法，其中該CBP501鹽包含鈉鹽、鈣鹽、鎂鹽、硝酸鹽、鉀鹽、磷酸鹽、磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、檸檬酸鹽、碳酸鹽、抗壞血酸鹽、丁二酸鹽、三氟乙酸鹽或乙酸鹽。
  50. 如請求項27至32中任一項之方法，其進一步包含投與G2檢查點抑制劑。
  51. 如請求項27至32中任一項之方法，其進一步包含投與鈣調蛋白結合劑。
  52. 如請求項27至32中任一項之方法，其進一步包含向該個體投與核酸損傷劑。
  53. 如請求項27至32中任一項之方法，其中該核酸損傷劑包含結合於或***DNA中之分子。
  54. 如請求項27至32中任一項之方法，其包含單獨或以任何組合形式向該個體投與CBP501、G2檢查點抑制劑、鈣調蛋白結合劑或核酸損傷劑1次、2次、3次、4次、5次或5次以上。
  55. 如請求項27至32中任一項之方法，其中該癌症包含肺癌(NSCLC)。
  56. 一種癌細胞群，其中該等細胞固定或固著於基板上且其中該等細胞已結合於偵測NRF2蛋白質或由NRF2靶基因編碼之蛋白質或KEAP 1蛋白質之試劑。
  57. 一種自個體獲得之癌細胞群，其中該等細胞固定或固著於基板上且其中該等細胞已結合於偵測NRF2蛋白質或由NRF2靶基因編碼之蛋白質或KEAP 1蛋白質之試劑。
  58. 如請求項56或57之細胞群，其中該偵測NRF2蛋白質或由NRF2靶基因編碼之蛋白質或KEAP 1蛋白質之試劑包含抗體。
  59. 一種癌細胞群，其中該等細胞固定或固著於基板上且其中該等細胞已結合於選擇性結合NRF2轉錄物或NRF2靶基因轉錄物或KEAP 1轉錄物之試劑。
  60. 一種自個體獲得之癌細胞群，其中該等細胞固定或固著於基板上且其中該等細胞已結合於選擇性結合NRF2轉錄物或NRF2靶基因轉錄物或KEAP 1轉錄物之試劑。
  61. 如請求項59或60之細胞群，其中該選擇性結合NRF2轉錄物或NRF2靶基因轉錄物之試劑包含寡核苷酸或引子。
  62. 如請求項56、57、59及60中任一項之細胞群，其中該NRF2靶基因為麩胱甘肽還原酶(GSR)、葡萄糖-6-磷酸去氫酶(G6PD)、ATP結合盒式區亞家族C成員2(ABCC2)、醛基-酮基還原酶家族1C1(AKR1C1)、醛基-酮基還原酶家族1C3(AKR1C3)、NAD(P)H去氫酶醌1(NQO1)、AKR1B10、γ-麩胺醯半胱胺酸合成酶調節劑次單元(γGCSm)或麩胱甘肽過氧化酶1(GPX1)中之任一者。
  63. 如請求項56、57、59及60中任一項之細胞群，其中該基板包含玻璃或塑膠板、載片或薄片。
  64. 如請求項56、57、59及60中任一項之細胞群，其中癌細胞包含肺癌(NSCLC)。
  65. 一種包含自癌細胞群分離、純化或提取之核酸的組合物，其中該核酸包含NRF2基因或其轉錄物，其結合於選擇性結合NRF2基因或其轉錄物或結合於KEAP 1基因或其轉錄物之試劑。
  66. 一種包含自癌細胞群分離、純化或提取之核酸的組合物，其中該核酸包含NRF2靶基因或其轉錄物，其結合於選擇性結合NRF2基因或其轉錄物或結合於KEAP 1基因或其轉錄物之試劑。
  67. 如請求項65或66之組合物，其中該選擇性結合NRF2轉錄物或NRF2靶基因轉錄物之試劑包含寡核苷酸或引子。
  68. 一種包含自癌細胞群分離、純化或提取之蛋白質的組合物，其中該蛋白質包含結合於選擇性地偵測NRF2蛋白質之試劑的NRF2蛋白質，或結合於選擇性地偵測KEAP 1蛋白質之試劑的KEAP 1蛋白質。
  69. 一種包含自癌細胞群分離、純化或提取之蛋白質的組合物，其中該蛋白質包含由NRF2靶基因編碼之蛋白質，其結合於選擇性地偵測該由NRF2靶基因編碼之蛋白質的試劑。
  70. 如請求項68或69之組合物，其中該選擇性地偵測NRF2蛋白質或由NRF2靶基因編碼之蛋白質或KEAP 1蛋白質之試劑包含抗體。
  71. 如請求項65、66、68及69中任一項之組合物，其中該NRF2靶基因為麩胱甘肽還原酶(GSR)、葡萄糖-6-磷酸去氫酶(G6PD)、ATP結合盒式區亞家族C成員2(ABCC2)、醛基-酮基還原酶家族1C1(AKR1C1)、醛基-酮基還原酶家族1C3(AKR1C3)、NAD(P)H去氫酶醌1(NQO1)、AKR1B10、γ-麩胺醯半胱胺酸合成酶調節劑次單元(γGCSm)或麩胱甘肽過氧化酶1(GPX1)中之任一者。
  72. 如請求項65、66、68及69中任一項之組合物，其中該組合物包含溶液。
  73. 如請求項65、66、68及69中任一項之組合物，其中該癌細胞包含肺癌(NSCLC)。
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