TW201619375A - 抗癌劑的篩選方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供包含將黏合性癌細胞在含有轉形增殖因子等增殖因子及可使細胞或組織懸浮、培養之構造體之培養基組成物中懸浮培養之黏合性癌細胞培養方法。又，本發明提供包含將癌細胞在含有可使細胞或組織懸浮、培養之構造體之培養基組成物中懸浮培養，維持該癌腫細胞的類上皮系形質之方法。另，本發明提供包含將具有類上皮系形質之癌腫細胞在上皮間質轉換誘導因子及在含有可使細胞或組織懸浮、培養之構造體之培養基組成物中懸浮培養，誘導該癌腫細胞上皮間質轉換之方法。

Description

抗癌劑的篩選方法

本發明係有關使用可懸浮培養細胞或組織之培養基組成物之癌細胞培養方法及抗癌劑的篩選方法等。

為了研究開發抗癌劑或在癌治療中選擇適當抗癌劑，藉由在含有候選藥劑或抗癌劑之培養液中，將癌細胞在生體外培養，進行評估藥劑對於癌細胞之抗癌活性。惟，於既有之抗癌活性評估方法中，有在生體外顯示抗癌活性之藥劑，在生體內投予時只獲得低效果，不能使用之情況等，導致在生體外之評估結果和實際之臨床效果背離而不合適。最近，盛行開發將對於EGF或TGF-β等增殖因子之受體作為標靶之抗癌劑(分子標靶藥)。尤其在評估藉由增殖因子，癌細胞增殖或血管新生及形質轉換(EMT：上皮間質轉換)時，有於使用藉由既有之單層培養之細胞評估方法不能引出增殖因子效果之報告。此種情況在研究開發將增殖因子受體作為標靶之分子標靶藥時，從多數候選藥劑中以以往之評估方法決定藥劑之有效性亦相同，與實際臨床上之抗癌效果不一致者多，在研究開發上 成為很大的障礙。又，於開發新的抗癌劑時，有不能實施藉由有用之增殖因子之細胞試驗，成為大課題。

為了改善關於如以上之抗癌活性評估方法之問題，開發以儘可能重現體內環境之細胞培養條件進行評估活性之方法。例如開發藉由將癌細胞包埋於軟瓊脂、膠原凝膠、水凝膠等載體，將癌細胞在阻礙黏合於培養容器之環境下培養，進行抗癌劑的評估之方法(專利文獻1、非專利文獻1至6)。又，開發以細胞黏合於培養容器表面之阻礙材料進行塗覆或是藉由在表面實施特殊加工，阻礙細胞黏合，以使癌細胞凝集之狀態進行培養(球體培養(sphere culture)，進行抗癌活性的評估之方法(專利文獻2、3)。惟，該等癌細胞培養法在培養容器之作成過程及細胞培養之操作煩雜，在將細胞從膠原等載體中回收，評估抗癌活性時之操作煩雜，載體為源自動物之成分時，由於為高價，有供給受限之情況，細胞凝集塊(球體)之間會產生匯合，其大小變成過大，有細胞生存率或再現性變低等種種問題。尤其是在實施篩選將增殖因子受體等作為標靶之分子標靶藥時，要求簡便且均一、可處理大量試樣、再現性高之癌細胞培養方法。

本發明人等成功的開發實質上不提高液體培養基中之黏度，而是在維持懸浮狀態下可培養細胞或組織之培養基組成物(專利文獻4)。

[先行技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本特表2014-519813號公報

[專利文獻2]日本特表2013-536689號公報

[專利文獻3]日本特表2012-519281號公報

[專利文獻4]WO 2014/017513 A1

[非專利文獻]

[非專利文獻1]Miyazono K等，Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci 2009、85 : 314-323

[非專利文獻2]Mizushima H等，J Cell Sci 2009、122 : 4277-4286

[非專利文獻3]Del Castillo等，Exp Cell Res 2006、312 : 2860-2871

[非專利文獻4]Wakeling AE等，Breast Cancer Res Treat 1996、38 : 67-73

[非專利文獻5]Heilmann AM等，Cancer Res 2014、74 : 3947-3958

[非專利文獻6]Sonpavde G等，Expert Opin Investing Drugs 2014、23 : 305-315

本發明之目的為提供培養在生體內可確實再現臨床效果之癌細胞之培養技術及抗癌劑的篩選方法。又，本發明之目的為提供可在體外以高感度評估藉由增殖 因子之癌細胞之增殖或上皮間質轉換之方法。

本發明者人等發現藉由實質上不提高液體培養基中之黏度，而是在維持懸浮狀態下可培養細胞或組織之培養基組成物中將黏合性癌細胞懸浮培養，對於以單層培養檢出困難之癌細胞在轉形增殖因子、類胰島素增殖因子及纖維母細胞增殖因子之反應性，於該懸浮培養，可以高感度檢出，發現該懸浮培養技術可用於阻礙該等增殖因子之抗癌劑的篩選。

另，本發明人等發現若將癌腫細胞以單層培養，則有轉換為類間質系形質之傾向時，若以實質上不提高液體培養基中之黏度，而是在維持懸浮狀態下可培養細胞或組織之培養基組成物中懸浮培養，則可良好維持類上皮系形質。另，若在該懸浮培養系添加EGF或TGF-β等上皮間質轉換誘導因子，由於可誘導轉換為間葉系，藉由使用該懸浮培養系，可進行癌細胞上皮間質轉換之評估或阻礙癌細胞之上皮間質轉換之物質的篩選。

以該等見解為基礎更進行檢討，因而完成本發明。

亦即，本發明為以下所述者：

[1]一種黏合性癌細胞的培養方法，該黏合性癌細胞係對選自由轉形增殖因子、類胰素增殖因子及纖維母細胞增殖因子所成群組之任一增殖因子具有反應性，該培養方法包含：將對選自由轉形增殖因子、類胰島素增殖因子及纖維 母細胞增殖因子所成群組之任一種增殖因子中具有反應性之黏合性癌細胞，在含有該增殖因子及可使細胞或組織懸浮、培養之構造體之培養基組成物中進行懸浮培養。

[2]如[1]所述之方法，其中，該增殖因子為轉形增殖因子。

[3]如[2]所述之方法，其中，該轉形增殖因子為TGF-β 1。

[4]如[1]至[3]中任一項所述之方法，其中，上述構造體含有去醯化結蘭膠(gellan gum)。

[5]如[1]至[4]中任一項所述之方法，其中，該培養基組成物於37℃之黏度為8mPa．s以下。

[6]一種試驗黏合性癌細胞對增殖因子之反應性之方法，該增殖因子為選自由由轉形增殖因子、類胰島素增殖因子及纖維母細胞增殖因子所成群組之任一種者，該方法包含(1)將黏合性癌細胞在該增殖因子存在下及不存在下，在含有可使細胞或組織懸浮、培養之構造體之培養基組成物中懸浮培養；(2)測定經培養之癌細胞之增殖；及(3)比較在該增殖因子存在下培養之癌細胞之增殖與該增殖因子不存在下之增殖。

[7]如[6]所述之方法，其中，上述構造體含有去醯化結蘭膠。

[8]如[6]或[7]所述之方法，其中，該培養基組成物於37℃之黏度為8mPa．s以下。

[9]一種針對黏合性癌細胞之抗癌劑之篩選方法，該黏合性癌細胞為對於選自由轉形增殖因子、類胰島素增殖因子及纖維母細胞增殖因子所成群組之任一種增殖因子具有反應 性者，該篩選方法包含：(1)在被檢物質存在下及不存在下，將該癌細胞在含有該增殖因子及可使細胞或組織懸浮、培養之構造體之培養基組成物中懸浮培養；(2)測定經培養之癌細胞之增殖；及(3)比較在被檢物質存在下培養之癌細胞之增殖與被檢物質不存在下之增殖。

[10]如[9]所述之方法，其中，上述構造體含有去醯化結蘭膠。

[11]如[9]或[10]之方法，其中，該培養基組成物於37℃之黏度為8mPa．s以下。

[12]一種癌腫細胞之類上皮系形質之維持方法，包含：將該癌腫細胞在含有可使細胞或組織懸浮、培養之構造體之培養基組成物中懸浮培養。

[13]如[12]所述之方法，其中，上述構造體含有去醯化結蘭膠。

[14]如[12]或[13]所述之方法，其中，該培養基組成物於37℃之黏度為8mPa．s以下。

[15]一種該癌腫細胞之上皮間質轉換之誘導方法，包含：將具有類上皮系形質之癌腫細胞在含有上皮間質轉換誘導因子及可使細胞或組織懸浮、培養之構造體之培養基組成物中懸浮培養。

[16]如[15]所述之方法，其中，上述構造體含有去醯化結蘭膠。

[17]如[15]或[16]所述之方法，其中，該培養基組成物於37℃之黏度為8mPa．s以下。

[18]一種方法，為誘導癌腫細胞之上皮間質轉換之物質之篩選方法，包含：(1)在被檢物質存在下及不存在下，將具有類上皮系形質之癌腫細胞在含有可使細胞或組織懸浮、培養之構造體之培養基組成物中懸浮培養；(2)評估經培養之癌腫細胞之上皮間質轉換；及(3)比較在被檢物質存在下培養之癌腫細胞之上皮間質轉換與被檢物質不存在下之上皮間質轉換。

[19]如[18]所述之方法，其中，上述構造體含有去醯化結蘭膠。

[20]如[18]或[19]所述之方法，其中，該培養基組成物於37℃之黏度為8mPa．s以下。

[21]一種方法，為阻礙癌腫細胞之上皮間質轉換之物質之篩選方法，包含：(1)在被檢物質存在下及不存在下，將具有類上皮系形質之癌腫細胞在含有上皮間質轉換誘導因子及可使細胞或組織懸浮、培養之構造體之培養基組成物中懸浮培養；(2)評估經培養之癌腫細胞之上皮間質轉換；及(3)比較在被檢物質存在下培養之癌腫細胞之上皮間質轉換與被檢物質不存在下之上皮間質轉換。

[22]如[21]所述之方法，其中，上述構造體含有去醯化結蘭膠。

[23]如[21]或[22]所述之方法，其中，該培養基組成物於37℃之黏度為8mPa．s以下。

藉由本發明可以高感度檢出癌細胞對於轉形增殖因子、類胰島素增殖因子及纖維母細胞增殖因子之反應性。因此，本發明之方法可用於阻礙該等增殖因子之抗癌劑的篩選。

若使用本發明之方法，與單層培養比較，癌腫細胞之類上皮系形質可良好地維持。又，若使用本發明之方法，由於癌腫細胞之上皮間質轉換在體外可良好的再現，可用於阻礙上皮間質轉換之抗癌劑的篩選。

(1)本發明中使用之培養基組成物

本發明提供使用在維持懸浮狀態下可培養細胞或組織之培養基組成物之癌細胞培養技術。該培養基組成物在維持懸浮狀態下可培養為評估對象之癌細胞或含有該等癌細胞之組織。該培養基組成物可依照WO 2014/017513 A1之記載調製。以下，將該培養基組成物稱為培養基組成物I。

細胞為構成動物最基本之單位，該要素為在細胞膜之內部具有細胞質及各種細胞胞器。

本發明中使用之癌細胞為哺乳動物之癌細 胞。哺乳動物可列舉例如小鼠、大鼠、倉鼠、土撥鼠等嚙齒類，兔子等兔形目，豬、牛、山羊、馬、綿羊等有蹄目，狗、貓等食肉目，人類、猴子、短尾小猴、食蟹獼猴、小猿、猩猩、黑猩猩等靈長類等。哺乳動物較好為嚙齒類(小鼠等)或靈長類(人類等)。

癌之例不只限於以下之例，可列舉胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、***癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、骨髓癌、腎細胞癌、尿道癌、肝癌、膽管癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、***癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、頭蓋咽頭癌、喉頭癌、舌癌、纖維肉瘤、黏膜肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、***肉瘤、***內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、伊文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、平滑肌肉瘤、横紋肌肉瘤、精原細胞瘤、威爾姆氏腫瘤(Wilms tumor)、神經膠質瘤、星狀細胞瘤、骨髓母細胞瘤、髓膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤、髓母細胞瘤、網膜母細胞瘤、惡性淋巴瘤、源自癌病患之血液等組織。作為癌細胞株之例，不限定為以下者，包含作為人類乳癌細胞株之HBC-4、BSY-1、BSY-2、MCF-7、MCF-7/ADR RES、HS578T、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-N、BT-549、T47D，作為人類子宮頸癌細胞株之HeLa，作為人類肺癌細胞株之A549、EKVX、HOP-62、HOP-92、NCI-H 23、NCI-H 226、NCI-H 322M、NCI-H 460、NCI-H 522、DMS273、DMS114，作為人類大腸癌細胞株之Caco-2、 COLO-205、HCC-2998、HCT-15、HCT-116、HT-29、KM-12、SW-620、WiDr，作為人類***癌細胞株之DU-145、PC-3、LNCaP，作為人類中樞神經系癌細胞株之U251、SF-295、SF-539、SF-268、SNB-75、SNB-78、SNB-19，作為人類卵巢癌細胞株之OVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-5、OVCAR-8、SK-OV-3、IGROV-1，作為人類腎癌細胞株之RXF-631L、ACHN、UO-31、SN-12 C、A498、CAKI-1、RXF-393L、786-0、TK-10，作為人類胃癌細胞株之MKN45、MKN28、St-4、MKN-1、MKN-7、MKN-74，作為皮膚癌細胞株之LOX-IMVI、LOX、MALME-3M、SK-MEL-2、SK-MEL-5、SK-MEL-28、UACC-62、UACC-257、M14，作為白血病細胞株之CCRF-CRM、K562、MOLT-4、H L-60TB、RPMI8226、SR、UT7/TPO、Jurkat，作為人類類上皮癌細胞株之A431，作為人類黑色素細胞株之A375，作為人類骨肉瘤細胞株之MNNG/HOS，作為人類胰臟癌細胞株之MIAPaCa-2等。細胞株之例不限於以下者，包含HEK293(人類胎兒腎細胞)、MDCK、MDBK、BHK、C-33A、AE-1、3D9、Ns0/1、NIH3T3、PC12、S2、Sf9、Sf21、High Five(註冊商標)、Vero等。

本發明中細胞及/或組織之懸浮係指細胞及/或組織對於培養容器為不黏合狀態(非黏合)。另，於本發明中在增殖、分化或維持細胞及/或組織時，對於液體培養基組成物，不伴隨來自外部之壓力、振動或在該組成物中之振動、旋轉操作等，將細胞及/或組織均一分散於該液體培養基組成物中且呈懸浮狀態稱為「懸浮靜置」，在該狀 態培養細胞及/或組織稱為「懸浮靜置培養」。又，於「懸浮靜置」，可懸浮之期間包含5分鐘以上、1小時以上、24小時以上、48小時以上、7日以上等，惟，保持懸浮狀態不只限於該等時間。

本發明中使用之培養基組成物在可維持或培養細胞或組織之溫度範圍(例如0至40℃)之至少1個點，細胞及/或組織可懸浮靜置。本發明中使用之培養基組成物較好在25至37℃溫度範圍之至少1個點，更好在37℃，細胞及/或組織可懸浮靜置。

是否可懸浮靜置可藉由例如將培養對象之細胞以2×10⁴個/mL之濃度均一分散於評估對象之培養基組成物中，在15mL圓錐管中注入10mL，於37℃至少靜置5分鐘以上(例如1小時以上、24小時以上、48小時以上、7日以上)，藉由觀察該細胞是否維持懸浮狀態進行評估。全細胞中之70%以上為懸浮狀態時可結論為維持懸浮狀態。亦可以聚苯乙烯珠(大小500-600μm，Polysciences公司製造)替代細胞進行評估。

本發明中使用之培養基組成物為含有可使細胞或組織懸浮、培養(較好可懸浮靜置培養)之構造體及培養基之組成物。

本發明中使用之培養基組成物較好為在培養時培養基組成物的交換處理及培養完成後，可將細胞或組織從培養基組成物回收之組成物，更好為在將細胞或組織從培養基組成物回收時不需溫度變化、化學處理、酵素處理、剪 切應力之任一者的組成物。

本發明之構造體為從特定化合物形成，顯示將細胞及/或組織均一懸浮效果者。更詳言之，包含將高分子化合物藉由離子集合者或高分子化合物形成三維網狀結構者等。又，多糖類藉由金屬離子形成微凝膠為公知(例如日本特開2004-129596號公報)，本發明之構造體作為一態樣，亦包含該微凝膠。

又，作為高分子化合物藉由離子集合者，其一態樣可列舉薄膜狀之構造體。

本發明中構造體之大小較好為在以過濾器過濾時，通過孔徑為0.2μm至200μm之過濾器者。該孔徑之下限更好為超過1μm者，若考慮到將細胞或組織安定地懸浮，則更好為超過5μm者。該孔徑之上限更好為在100μm以下者，若考慮到細胞或組織之大小，更好為在70μm以下者。

本發明之特定化合物為在將特定化合物與液體培養基混合時形成不定形之構造體，該構造體均一分散於該液體中，具有實質上不提高該液體之黏度，而實質上保持細胞及/或組織，防止其沈降效果者。「實質上不提高液體黏度」係指液體之黏度不超過8mPa．s。此時該液體之黏度(亦即，於本發明中使用之培養基組成物之黏度)於37℃為8mPa．s以下，較好為4mPa．s以下，更好為2mPa．s以下。另，只要能顯示在液體培養基中形成該構造體，實質上不提高該液體之黏度，而使細胞及/或組織均一懸浮(較好使 懸浮靜置)效果者即可，特定化合物之化學構造、分子量、物性等並無特別限制。

含有構造體之液體之黏度可以例如後述實施例中記載之方法測定。具體而言，在37℃條件下使用E型黏度計(東機產業(股)公司製造，TV-22型黏度計、機種：TVE-22L、圓錐轉子：標準轉子1°34’×R24、旋轉數100rpm)而可測定。

本發明中使用之特定化合物之例並無特別限制，可列舉高分子化合物，較好可列舉具有陰離子性官能基之高分子化合物。

陰離子性官能基可列舉羧基、磺基、磷酸基及該等之鹽，較好為羧基或其鹽。

本發明中使用之高分子化合物可使用具有1種或2種以上選自上述陰離子性官能基群者。

本發明中使用之高分子化合物之較佳具體例並無特別限制，可列舉10個以上單糖類(例如丙糖、丁糖、戊糖、己糖、庚糖等)聚合之多糖類，更好可列舉具有陰離子性官能基之酸性多糖類。此處所稱之酸性多糖類只要是在其構造中具有陰離子性官能基即可，並無特別限制，例如具有醣醛酸(例如葡萄醣醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸)之多糖類、構造中之一部分具有硫酸基或磷酸基之多糖類或具有該二者構造之多糖類，不僅為從天然獲得之多糖類，亦包含藉由微生物產生之多糖類、基因工學產生之多糖類或使用酵素，以人工合成之多糖類。更具體而言， 可例示由玻尿酸、結蘭膠、去醯化結蘭膠(以下，亦稱為DAG)、鼠李聚糖膠、大猷坦膠、黃原膠、角叉菜膠、三仙膠、己糖醛酸、褐藻糖膠、果膠、果膠酸、果膠脂酸、硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)、肝素、硫酸類肝素(heparitin sulfate)、硫酸角質、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸鼠李聚糖及該等之鹽所成群組之1種或2種以上所構成者。多糖類較好為玻尿酸、DAG、大猷坦膠、黃原膠、角叉菜膠或該等之鹽，若考慮到以低濃度使用可使細胞或組織懸浮，且細胞或組織回收容易，則更好為DAG。

此處之鹽可列舉例如鋰、鈉、鉀之鹼金屬鹽，鈣、鋇、鎂之鹼土金屬鹽或鋁、鋅、銅、鐵、銨、有機鹼及胺基酸等之鹽。

該等高分子化合物(多糖類等)之重量平均分子量較好為10,000至50,000,000，更好為100,000至20,000,000，最好為1,000,000至10,000,000。例如，該分子量可由凝膠滲透層析儀(GPC)，以普路蘭(pullulan)換算測定。

另，DAG可使用經磷酸化者。該磷酸化可以公知之方法進行。

於本發明，可將上述多糖類複數種(較好2種)組合使用。多糖類組合之種類只要可在液體培養基中形成上述構造體，實質上不提高該液體培養基之黏度，而是使細胞及/或組織均一懸浮(較好使其懸浮靜置)者即可，並無特別限制，該組合較好至少含有DAG或其鹽。亦即，較佳之多糖類組合包含DAG或其鹽及DAG或其鹽以外之多 糖類(例如黃原膠、褐藻酸、角叉菜膠、大猷坦膠、甲基纖維素、槐豆膠或該等之鹽)。具體而言，多糖類之組合可列舉DAG與鼠李聚糖膠、DAG與大猷坦膠、DAG與黃原膠、DAG與角叉菜膠、DAG與三仙膠、DAG與槐豆膠、DAG與κ-角叉菜膠、DAG與褐藻酸鈉、DAG與甲基纖維素等，惟，不只限於該等。

本發明中使用之特定化合物更佳之具體例可列舉玻尿酸、去醯化結蘭膠、大猷坦膠、角叉菜膠及黃原膠及該等之鹽，若考慮到可降低培養基組成物之黏度及細胞或組織回收容易度，則更佳之例可列舉去醯化結蘭膠或其鹽。

本發明中之去醯化結蘭膠為將1-3鍵結之葡萄糖、1-4鍵結之葡萄醣醛酸、1-4鍵結之葡萄糖及1-4鍵結之鼠李糖之4分子糖作為構成單位之直鏈狀高分子多糖類，於以下通式(I)中，R₁、R₂同時為氫原子，n表示2以上之整數之多糖類。亦可包含R₁為甘油基、R₂為乙醯基，惟，乙醯基及甘油基之含量較好在10%以下，更好在1%以下。

本發明中之構造體根據特定化合物成為種種形態，若對於為去醯化結蘭膠之情況加以記載，則去醯化結蘭膠在與液體培養基混合時取回液體培養基中之金屬陽離子(例如鈣離子)，藉由該金屬離子形成不定形構造體，使細胞及/或組織懸浮。從去醯化結蘭膠調製之本發明中使用之培養基組成物之黏度在8mPa．s以下，較好在4mPa．s以下，若 考慮到細胞或組織回收之容易度，則更好在2mPa．s以下。

本發明中之特定化合物亦可以化學合成法獲得，該化合物為天然物時，較好為從含有該化合物之各種植物、各種動物、各種微生物，使用慣用之技術，藉由萃取及分離精製獲得者。於該萃取中，若使用水或超臨界氣體，則可更有效率的萃取該化合物。例如，作為結蘭膠之製造方法，可將生產微生物以發酵培養基培養，將於菌體外生產之黏膜物以通常之精製方法回收、乾燥、粉碎等步驟後作成粉末狀。又，為去醯化結蘭膠之情況，只要在回收黏膜物時施行鹼處理，將結合於1-3鍵結之葡萄糖殘基之甘油基及乙醯基進行脫醯化後回收即可。精製方法可將例如液體-液體萃取、分別沈澱、結晶化、各種離子交換層析、使用交聯葡聚糖凝膠(sephadex)LH-20等凝膠過濾層析、藉由活性碳、矽膠等吸附層析、藉由薄層層析之活性物質的吸附解吸處理或使用逆相管柱之高速液體層析等單獨或以任意順序組合或反覆使用，除去不純物精製。作為結蘭膠生產微生物之例不只限於此，可列舉多沼鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas elodea)及將該微生物之基因改變之微生物。

因此，為去醯化結蘭膠時可使用市售品，例如三晶(股)公司製造之「凱可膠(KELCOGEL)(CP Kelco公司，註冊商標)CG-LA」、三榮源F‧F‧I(股)公司製造「凱可膠(CP Kelco公司，註冊商標)」等。又，原始型(native type)結蘭膠可使用三榮源F．F．I(股)公司製造之「凱可膠(CP Kelco公司，註冊商標)」HT」等。

培養基中特定化合物之濃度依賴特定化合物之種類，可在特定化合物於液體培養基形成上述構造體，實質上不提高該液體培養基之黏度，而使細胞及/或組織均一懸浮(較好使其懸浮靜置)之範圍適當設定，通常只要作成0.0005%至1.0%(重量/容量)，較好為0.001%至0.4%(重量/容量)，更好為0.005%至0.1%(重量/容量)，最好為0.005%至0.05%(重量/容量)即可。例如，為去醯化結蘭膠時，只要在培養基中添加0.001%至1.0%(重量/容量)，較好0.003%至0.5%(重量/容量)，更好0.005%至0.1%(重量/容量)，更好為0.01%至0.05%(重量/容量)，最好為0.01%至0.03%(重量/容量)即可。為黃原膠時，只要在培養基中添加0.001%至5.0%(重量/容量)，較好0.01%至1.0%(重量/容量)，更好0.05%至0.5%(重量/容量)，最好0.1%至0.2%(重量/容量)即可。為κ-角叉菜膠及槐豆膠混合系時，只要在培養基中添加0.001%至5.0%(重量/容量)，較好0.005%至1.0%(重量/容量)，更好0.01%至0.1%(重量/容量)，最好0.03%至0.05%(重量/容量)即可。為原始型結蘭膠時，只要在培養基中添加0.05%至1.0%(重量/容量)，較好0.05%至 0.1%(重量/容量)即可。

將上述多糖類複數種(較好2種)組合使用時，該多糖類之濃度可在該多糖類之組合在液體培養基中形成上述構造體，實質上不提高該液體培養基之黏度，而使細胞及/或組織均一懸浮(較好使其懸浮靜置)之範圍適當設定。例如，使用DAG或其鹽與DAG或其鹽以外之多糖類組合時，DAG或其鹽之濃度可例示0.005至0.02%(重量/容量)，較好0.01至0.02%(重量/容量)，DAG或其鹽以外之多糖類濃度可例示0.005至0.4(重量/容量)，較好0.1至0.4%(重量/容量)。

以下例示具體之濃度範圍組合。

DAG或其鹽：0.005至0.02%(較好0.01至0.02%)(重量/容量)

DAG以外之多糖類

黃原膠：0.1至0.4%(重量/容量)

褐藻酸鈉：0.1至0.4%(重量/容量)

槐豆膠：0.1至0.4%(重量/容量)

甲基纖維素：0.1至0.4%(重量/容量)(較好0.2至0.4%(重量/容量))

角叉菜膠：0.05至0.1%(重量/容量)

大猷坦膠：0.05至0.1%(重量/容量)

又，該濃度可以下述之式算出。

濃度(%)=特定化合物之重量(g)/培養基組成物之容量(mL)×100

上述化合物可根據化學合成法另轉變為其他衍生物，經由此獲得之該衍生物在本發明中亦可有效地使用。具體而言，為去醯化結蘭膠時，將相當於該通式(I)表示之化合物之R₁及/或R₂之羥基置換為C_1-3烷氧基、C_1-3烷基磺醯基、葡萄糖或果糖等單糖殘基，蔗糖、乳糖等寡糖殘基，甘胺酸、精胺酸等胺基酸殘基等之衍生物亦可於本發明中使用。又，可使用1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺(EDC)等交聯劑將該化合物交聯。

本發明中使用之特定化合物或其鹽可根據製造條件作成任意之結晶形存在，亦可作成以任意之水合物存在，該等結晶形或水合物及該等之混合物亦包含於本發明之範圍中。又，亦有作成含有丙酮、乙醇、四氫呋喃等有機溶劑之溶劑化物存在，該等形態都包含於本發明之範圍中。

本發明中使用之特定化合物亦可以藉由環內或環外異構化生成之互變異構體、幾何異構體、互變異構體或幾何異構體之混合物或該等之混合物形態存在。本發明之化合物不論是否藉由異構化產生，於具有不對稱中心之情況，亦可為經分割之光學異構體或將該等以任意比率含有之混合物形態存在。

本發明中使用之培養基組成物可存在有金屬離子，例如2價之金屬離子(鈣離子、鎂離子、鋅離子、鐵離子及銅離子等)，較好含有鈣離子。該金屬離子可如例如鈣離子與鎂離子、鈣離子與鋅離子、鈣離子與鐵離子、 鈣離子與銅離子，將2種以上組合使用。所屬技術領域者可決定適當之組合。於一態樣中，藉由在培養基組成物中含有金屬離子(例如鈣離子)，高分子化合物藉由該金屬離子集合，高分子化合物藉由形成三維網狀結構(例如，多糖類藉由金屬離子(例如鈣離子)形成微凝膠)形成本發明之構造體。金屬離子之濃度可在特定化合物在液體培養基中形成上述構造體，實質上不提高該液體培養基之黏度，而使細胞及/或組織均一懸浮(較好使其懸浮靜置)之範圍適當設定。金屬離子之濃度為0.1mM至300mM，較好為0.5mM至100mM，惟，不只限於此。該金屬離子亦可先與培養基混合或以其他方法調製鹽溶液，添加於培養基中。本發明中使用之培養基組成物亦可含有後述之細胞外基材、黏合分子等。

由本發明使用之特定化合物構成之構造體在使細胞及/或組織於生體外培養時，顯示使該細胞及/或組織懸浮於含有該特定化合物構造體之液體中之效果(較好使懸浮靜置之效果)。藉由該懸浮效果，與單層培養相比，可使每一定體積之細胞及/或組織增加、培養。又，於以往之懸浮培養方法中伴隨旋轉或振動操作時，有由於對於細胞及/或組織產生剪切應力，導致細胞及/或組織之增殖率或回收率降低或細胞之機能受損之情況，而藉由使用含有本發明特定化合物構造體之培養基組成物，可不進行振動等操作即可將細胞及/或組織均一分散，可容易且大量取得細胞機能無損失之目的細胞及/或組織。又，在以往之 含有凝膠基材之培養基中使細胞及/或組織懸浮培養時，有細胞及/或組織之觀察或回收困難、回收時其機能受損之情況，藉由使用含有本發明特定化合物構造體之培養基組成物，可使細胞及/或組織懸浮培養，其機能無受損，可觀察、回收。又，以往之含有凝膠基材之培養基有黏度高、培養基之交換困難之情況，含有本發明特定化合物構造體之培養基組成物由於為低黏度，使用吸管或泵，可容易的交換培養基。

使用本發明之特定化合物培養細胞及/或組織時，可將培養細胞及/或組織時使用之培養基與特定化合物混合，調製培養基組成物。根據該等培養基之組成分類可列舉天然培養基、半合成培養基、合成培養基，或者，根據形狀分類可列舉半固體培養基、液體培養基、粉末培養基(以下，亦稱為粉培養基)等。細胞及/或組織為源自動物時，只要是培養動物細胞使用之培養基均可使用。該等培養基可列舉例如達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium；DMEM)、哈姆F12培養基(Ham’s Nutrient Mixture F12)、DMEM/F12培養基、麥考伊5A培養基(McCoy’s 5A medium)、伊格爾MEM培養基(Eagles’s Minimum Essential Medium；EMEM)、α MEM培養基(alpha Modified Eagles’s Minimum Essential Medium；α MEM)、MEM培養基(Minimum Essential Medium)、RPMI1640培養基、伊斯可夫改良達爾伯克培養基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；IMDM)、MCDB131培養基、威廉培養基E(William's Medium E)、IPL41培養基、費雪(Fischer’s)培養基、StemPro34(Invitrogen公司製造)、X-VIVO 10(Cambrex公司製造)、X-VIVO 15(Cambrex公司製造)、HPGM(Cambrex公司製造)、StemSpan H3000(Stemcell Technologies公司製造)、StemSpanSFEM(Stemcell Technologies公司製造)、StemlineII(Sigma-Aldrich公司製造)、QBSF-60(Quality Biological公司製造)、StemProhESCSFM(Invitrogen公司製造)、Essential 8(註冊商標)培養基(Gibco公司製造)、mTeSR1或2培養基(Stemcell Technologies公司製造)、利普蘿(Repro)FF或利普蘿FF2(利普蘿協(Reprocell)公司製造)、PSGro hESC/iPSC培養基(System Biosciences公司製造)、NutriStem(註冊商標)培養基(Biological Industries公司製造)、CSTI-7培養基(細胞科學研究所公司製造)、MesenPRO RS培養基(Gibco公司製造)、MF-Medium(註冊商標)間葉系幹細胞生長培養基(東洋紡(股)公司製造)、Sf-900II(Invitrogen公司製造)、Opti-Pro(Invitrogen公司製造)等。

培養癌細胞使用之培養基可在上述培養基中含有細胞黏合因子，其例可列舉基底膜膠、膠原凝膠、明膠、聚-L-賴胺酸、聚-D-賴胺酸、層黏蛋白、纖維結合素。亦可將2種以上該等細胞黏合因子組合添加。另，對於培養癌細胞球體使用之培養基，可另將瓜爾膠(guar gum)、羅望子膠(tamarind gum)、褐藻酸丙二醇酯、槐豆膠、***樹膠、刺梧桐膠(tara gum)、羅望子膠(tamarind(seed)gum)、甲基纖維素等增黏劑混合。

所屬技術領域者可根據目的，自由的在上述培養基中添加鈉、鉀、鈣、鎂、磷、氯、各種胺基酸、各種維生素、抗生素、血清、脂肪酸、糖等。源自動物之細胞及/或組織培養時，所屬技術領域者可根據目的，將一種以上之其他化學成分或生體成分組合添加。

添加於源自動物之細胞及/或組織之培養基中之成分可列舉胎牛血清、人類血清、馬血清、胰島素、運鐵蛋白、乳鐵蛋白、膽固醇、乙醇胺、亞硒酸鈉、單硫代甘油、2-巰基乙醇、牛血清白蛋白、丙酮酸鈉、聚乙二醇、各種維生素、各種胺基酸、瓊脂、瓊脂糖、膠原、甲基纖維素、各種細胞激素、各種荷爾蒙、各種增殖因子、各種細胞外基質或各種細胞黏合分子等。

培養基中添加之抗生素之例可列舉磺胺製劑(sulfa drug)、盤尼西林(penicillin)、非奈西林(phenethicillin)、甲氧西林(methicillin)、噁唑西林(oxacillin)、氯噁唑西林(cloxacillin)、雙氯噁唑西林(dicloxacillin)、氟氯噁唑西林(flucloxacillin)、萘夫西林(nafcillin)、安比西林(ampicillin)、盤尼西林、安莫西林(amoxicillin)、胺環己西林(cyclacillin)、卡苯尼西林(carbenicillin)、替卡西林(ticarcillin)、必倍西林(piperacillin)、阿洛西林(azlocillin)、美洛西林(mcczlocillin)、美西林(mecillinam)、安迪諾西林(amdinocillin)、頭孢子菌素及其衍生物、歐索林酸(oxolinic acid)、氨氟沙星(amifloxacin)、替馬氟沙星(temafloxacin)、萘啶酮酸(nalidixic acid)、吡咯米酸(piromidic acid)、環丙沙星 (ciprofloxacin)、西諾沙星(cinoxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、培氟沙星(perfloxacin)、羅索沙星(rosaxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、依諾沙星(enoxacin)、吡哌酸(pipemidic acid)、舒巴克坦(sulbactam)、克拉維酸(clavulanic acid)、β-溴青黴烷酸(β-Bromopenicillanic acid)、β-氯青黴烷酸、6-乙醯基亞甲基-青黴烷酸(acetylmethylene-penicillanic acid)、頭孢噁唑(cefoxazole)、舒他西林(sultampicillin)、腺苷(adenosine)及舒巴克坦之甲醛/食品輕質酯(food light ester)、***巴坦(tazobactam)、安曲南(aztreonam)、磺胺菌素(sulfazecin)、異磺胺菌素(isosulfazecin)、諾卡殺菌素(nocardicin)、m-羧基苯酚、苯乙酰胺磷酸甲酯、氯四環素(chlortetracycline)、羥四環素(oxytetracycline)、四環素、去甲氯四環(demeclocycline)、多西環素(doxycycline)、美他環素(metacycline)及美諾四環素(minocycline)。

在上述培養基中添加本發明之特定化合物時，首先以適當之溶劑將該特定化合物在用時溶解或分散(將此作為培養基添加劑)。之後，作為培養基中特定化合物濃度，如上所述，為可實質上不提高該液體培養基之黏度，而使細胞及/或組織均一懸浮(較好使其懸浮靜置)之濃度，例如將該培養基添加劑添加於培養基中，使成為0.0005%至1.0%(重量/容量)，較好0.001%至0.4%(重量/容量)，更好0.005%至0.1%(重量/容量)，最好0.005%至0.05%(重量/容量)即可。例如，為去醯化結蘭膠時，在培養基中添加0.001%至1.0%(重量/容量)，較好0.003%至0.5%(重量 /容量)，更好0.005%至0.1%(重量/容量)、最好0.01%至0.05%(重量/容量)即可。為黃原膠時，在培養基中添加0.001%至5.0%(重量/容量)，較好0.01%至1.0%(重量/容量)，更好0.05%至0.5%(重量/容量)，最好0.1%至0.2%(重量/容量)即可。為κ-角叉菜膠及槐豆膠混合系時，在培養基中添加0.001%至5.0%(重量/容量)，較好0.005%至1.0%(重量/容量)，更好0.01%至0.1%，最好0.03%至0.05%(重量/容量)即可。為去醯化結蘭膠與大猷坦(Daiyu Tan)膠之混合系時，在培養基中添加0.001%至1.0%(重量/容量)，最好0.005%至0.01%(重量/容量)即可。為去醯化結蘭膠與甲基纖維素之混合系時，在培養基中添加0.001%至1.0%(重量/容量)，最好0.005%至0.2%(重量/容量)即可。為去醯化結蘭膠與槐豆膠之混合系時，在培養基中添加0.001%至1.0%(重量/容量)，最好0.01%至0.1%(重量/容量)即可。為去醯化結蘭膠與褐藻酸鈉之混合系時，在培養基中添加0.001%至1.0%(重量/容量)，最好0.01%至0.1%(重量/容量)即可。為去醯化結蘭膠與黃原膠之混合系時，在培養基中添加0.001%至1.0%(重量/容量)，最好0.01%至0.1%(重量/容量)即可。為去醯化結蘭膠與κ-角叉菜膠之混合系時，在培養基中添加0.001%至1.0%(重量/容量)，最好0.01%至0.1%(重量/容量)即可。又，該濃度可以下述之式算出。

濃度(%)=特定化合物之重量(g)/培養基組成物之容量(mL)×100

此處，培養基添加劑中使用之適當溶劑之 例可列舉水、二甲亞碸(DMSO)、甲醇、乙醇、丁醇、丙醇、丙三醇、丙二醇、丁二醇等各種醇等水性溶劑，惟，不只限於此。此時，特定化合物濃度為0.001%至5.0%(重量/容量)，較好為0.01%至1.0%(重量/容量)，更好為0.1%至0.6%(重量/容量)較理想。此時，可另添加一邊提高該特定化合物之效果一邊降低使用時濃度之添加物。該等添加劑之例可將1種以上之瓜爾膠、羅望膠、褐藻酸丙二醇酯、槐豆膠、***樹膠、刺梧桐膠、羅望膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素、瓊脂糖、羅望子膠、普路蘭(pullulan)等多糖類混合。又，在培養該特定化合物時，可在載體表面上固定或擔載於載體內部使用。該特定化合物在提供時或保存時可為任意形狀。該特定化合物可製劑化為如錠劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑之固體，如以適當之溶劑及以溶解劑溶解之溶液或懸濁液之液體或結合於基板或單體之狀態。製劑化時之添加物可列舉對羥基苯甲酸酯類等防腐劑；乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇等賦形劑；硬脂酸鎂、滑石粉等潤滑劑；聚乙烯醇、羥丙基纖維素、明膠等黏合劑；脂肪酸酯等界面活性劑；丙三醇等可塑劑等。該等添加物不只限於上述者，只要業者可利用者都可自由選擇。又，本發明中之特定化合物必要時可施行滅菌處理。滅菌方法並無特別限制，可列舉例如放射線滅菌、環氧乙烷氣體滅菌、高壓釜滅菌、過濾器滅菌等。進行過濾器滅菌(以下，亦稱為過濾滅菌)時過濾器部分之材質並無特別限制，可列舉例如玻璃纖維、尼龍、PES(聚醚碸)、親水性PVDF(聚偏 二氟乙烯)、纖維素混合酯、纖維素乙酸酯、聚四氟乙烯等。過濾器細孔之大小並無特別限制，較好為0.1μm至10μm，更好為0.1μm至1μm，最好為0.1μm至0.5μm。該等滅菌處理，特定化合物可為固體形態，亦可為溶液狀態。

藉由上述調製，將特定化合物之溶液或分散液添加於液體培養基，在液體培養基中形成上述構造體，可獲得本發明中使用之培養基組成物。培養基通常高分子化合物藉由離子集合或高分子化合物為了形成三維網狀結構，含有充分濃度之金屬離子(例如鈣離子等2價金屬離子)，在液體培養基中只添加本發明特定化合物之溶液或分散液，可獲得本發明中使用之培養基組成物。或亦可在培養基添加劑(特定化合物之溶液或分散液)中添加培養基。另，本發明中使用之培養基組成物可由將特定化合物與培養基成分在水性溶劑(例如含有離子交換水或超純水等之水)中混合而調製。混合之態樣可列舉(1)將液體培養基與培養基添加劑(溶液)混合、(2)將上述高分子化合物(粉末等固體)在液體培養基中混合、(3)將粉末培養基在培養基添加劑(溶液)中混合、(4)將粉末培養基及上述高分子化合物(粉末等固體)與水性溶劑混合等，惟，不只限於此。為了防止特定化合物在本發明使用之培養基組成物中之分布不均一，較好為(1)或是(4)，或(1)或是(3)之態樣。

將特定化合物溶解於溶劑(例如水、液體培養基等水性溶劑)或在將特定化合物及粉末培養基溶解於溶劑時，為了促進溶解，較好將該混合液加熱。加熱之溫度可列舉例如 80℃至130℃，較好為可使加熱滅菌之100℃至125℃(例如121℃)。加熱後將獲得之特定化合物之溶液冷卻至室溫。藉由在該溶液中添加上述之金屬離子(例如鈣離子等2價金屬離子)(例如，將該溶液添加於液體培養基)，形成從該特定化合物構成之上述構造體。或是在將特定化合物溶解於含有上述金屬離子(例如鈣離子等2價金屬離子)之溶劑(例如水、液體培養基等水性溶劑)時，可加熱(例如80℃至130℃，較好100℃至125℃(例如121℃))，將獲得之溶液冷卻至室溫，亦可形成從該特定化合物構成之上述構造體。

雖例示本發明中使用之培養基組成物之調製方法，惟，本發明不只限於該等例。將特定化合物添加於離子交換水或超純水中。如此，在可將該特定化合物溶解之溫度(例如60℃以上、80℃以上，90℃以上)一邊加熱一邊攪拌使溶解至成為透明之狀態。溶解後一邊攪拌一邊放冷，進行滅菌(例如於121℃進行20分鐘之高壓釜滅菌)。回到室溫後，將在靜置培養中使用之任意培養基一邊攪拌(例如均質攪拌機(Homo mixer)等)一邊在該培養基中添加上述滅菌後之水溶液，混合至與該培養基成為均一。本水溶液與培養基之混合方法並無特別限制，可列舉例如以吸取等手動之混合，使用電磁攪拌機或機械攪拌器、均質攪拌機、勻漿器等機器之混合。又，亦可於混合後將本發明中使用之培養基組成物以過濾器過濾。進行過濾處理時使用之過濾器細孔之大小為5μm至100μm，較好為5μm至70μm，更好為10μm至70μm。

或是將粉末培養基及上述高分子化合物(粉末等固體)與水性溶劑混合，於上述溫度加熱，調製本發明中使用之培養基組成物。

例如，調製去醯化結蘭膠時，在離子交換水或超純水中添加去醯化結蘭膠，使成為0.1%至1%(重量/容量)，較好為0.2%至0.5%(重量/容量)，更好為0.3%至0.4%(重量/容量)。又，於另一局面，調製去醯化結蘭膠時，在離子交換水或超純水中添加去醯化結蘭膠，使成為0.1%至1%(重量/容量)，較好為0.2%至0.8%(重量/容量)，更好為0.3%至0.6%(重量/容量)。

如此，只要可將上述去醯化結蘭膠溶解之溫度，在任何溫度均可，可在60℃以上，較好在80℃以上，更好在90℃以上(例如80至130℃)一邊加熱一邊攪拌使溶解至呈透明狀態。溶解後一邊攪拌一邊放冷，於例如121℃進行高壓釜滅菌20分鐘。回到室溫後，以均質攪拌機等將例如DMEM/F12培養基一邊攪拌一邊在該培養基中添加本水溶液，使達到所期待之最終濃度(例如最終濃度為0.015%時，0.3%水溶液：培養基之比率為1：19)，均一混合。本水溶液與培養基之混合方法並無特別限制，可列舉例如以吸取等手動之混合、使用電磁攪拌機、機械攪拌器、均質攪拌機、勻漿器等機器之混合。又，亦可於混合後將本發明中使用之培養基組成物以過濾器過濾。進行過濾處理時使用之過濾器細孔之大小為5μm至100μm，較好為5μm至70μm，更好為10μm至70μm。

本發明中使用之培養基組成物及其製造方法之較佳態樣記載於下。

本發明中使用之培養基組成物較好為可使細胞或組織懸浮、培養之培養基組成物，以上述培養基組成物之黏度在8mPa．s以下(37℃條件下)且含有去醯化結蘭膠或其鹽為特徵之培養基組成物。於一態樣，培養基組成物中之去醯化結蘭膠或其鹽之濃度為0.01至0.05%(重量/容量)。於一態樣，該培養基組成物更含有去醯化結蘭膠或其鹽以外之多糖類。於一態樣，該培養基組成物為了去醯化結蘭膠形成可使細胞或組織懸浮、培養之構造體，含有充分濃度之2價金屬離子(例如鈣離子)。該濃度為例如0.1mM至300mM，較好為0.5mM至100mM。

該培養基組成物可藉由將去醯化結蘭膠或其鹽與培養基混合而製造。於一態樣，該培養基為液體培養基。於一態樣，該液體培養基為了去醯化結蘭膠形成可使細胞或組織懸浮、培養之構造體，含有充分濃度之2價金屬離子(例如鈣離子)。該濃度為例如0.1mM至300mM，較好為0.5mM至100mM。於一態樣，將溶解或分散於溶劑中之去醯化結蘭膠或其鹽與培養基混合。於一態樣，溶解或分散於溶劑中之去醯化結蘭膠或其鹽為經滅菌之狀態。於一態樣中，滅菌藉由高壓釜滅菌進行，於另一態樣，滅菌藉由過濾滅菌進行。於一態樣，過濾滅菌藉由通過0.1至0.5μm之過濾器實施。

(2)在增殖因子存在下培養癌細胞(方法論I) (2-1)癌細胞之培養方法

本發明提供將在任一種選自由轉形增殖因子、類胰島素增殖因子及纖維母細胞增殖因子所成群組之增殖因子中具有反應性之黏合性癌細胞在含有該增殖因子之上述培養基組成物I中進行懸浮培養，培養在任一種選自由轉形增殖因子、類胰島素增殖因子及纖維母細胞增殖因子所成群組之增殖因子中具有反應性之黏合性癌細胞之方法(本發明之方法1)。於單層培養，黏合性癌細胞對於該等增殖因子之反應性低，在評估上困難，相對的，若在上述培養基組成物I中懸浮培養，則對於該等增殖因子之反應性提昇，大大促進增殖。

於方法論I中使用之癌細胞在任一種選自由轉形增殖因子、類胰島素增殖因子及纖維母細胞增殖因子所成群組之增殖因子具有反應性。因此，該癌細胞對於任一種選自由轉形增殖因子、類胰島素增殖因子及纖維母細胞增殖因子所成群組之增殖因子表現機能性受體。

轉形增殖因子(TGF)可列舉TGF-α及TGF-β。較好為TGF-β。於TGF-β有β 1至3亞型，都包含於本發明中。TGF-α之受體為ErbB1/EGFR。TGF-β之受體可列舉1型受體(TGF-β R1)及2型受體(TGF-β R2)，都包含於本發明中。

類胰島素增殖因子(IGF)可列舉IGF-1及IGF-2。較好為IGF-1。IGF-1及IGF-2除了在IGF-1受體強 力結合使活性化之外，與胰島素受體之結合弱。IGF-2受體只與IGF-2結合，未使細胞內信號路徑活性化。IGF受體較好為IGF-1受體。

纖維母細胞增殖因子(FGF)確認為FGF1至FGF23。由於人類FGF19為小鼠FGF15之直向同源基因(orthologue)，人類及小鼠之FGF家族以22成員構成。於本說明書，FGF的稱呼係依照人類FGF之命名法(Nomenclature)命名。FGF較好為FGF2(bFGF)。FGF之受體可列舉FGFR1至4，都包含於本發明中。

方法論I中使用之癌細胞較好在任一種選自由TGF-β、IGF-1及FGF2所成群組之增殖因子具有反應性，更好在TGF-β具有反應性。若在上述培養基組成物I中懸浮培養，特別提昇對於TGF-β之反應性，大大促進增殖。

方法論I中使用之癌細胞為黏合細胞。黏合細胞係指可以支架蛋白黏合進行生存及增殖之支架蛋白依存性細胞。

黏合性之癌細胞可列舉胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、***癌、鱗狀上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、尿道癌、肝癌、膽管癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、***癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、頭蓋咽頭癌、喉頭癌、舌癌、纖維肉瘤、黏膜肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、***肉瘤、 ***內皮肉瘤、滑膜腫、間皮瘤、伊文氏肉瘤、平滑肌肉瘤、横紋肌肉瘤、精原細胞瘤、威爾姆氏腫瘤、神經膠質瘤、星狀細胞瘤、髓膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤、髓母細胞瘤、網膜母細胞瘤等之細胞，惟，不只限於此。黏合性之癌細胞較好為源自上皮細胞之惡性腫瘤，亦即癌腫(carcinoma)細胞。

於本發明之培養方法，將對於上述增殖因子具有反應性之黏合性癌細胞在含有該增殖因子之上述培養基組成物I中懸浮培養。

本發明之培養方法中使用之增殖因子通常為哺乳動物之增殖因子。哺乳動物可列舉上述之動物。由於增殖因子在多數哺乳動物品種之間具有交差反應性，只要可達成本發明之目的，可使用任一種哺乳動物之增殖因子，較好使用與培養之癌細胞為同種之哺乳動物之增殖因子。例如，對TGF-β具有反應性之人類黏合性癌細胞較好在含有人類TGF-β之上述培養基組成物I中懸浮培養。人類TGF-β係指TGF-β具有人類生體內天然表現之TGF-β之胺基酸序列。本說明書中，對於其他之蛋白質等亦同樣解釋。

本發明之方法中使用之增殖因子較好經單離。「單離」係指進行除去目的之成分或細胞以外之因子之操作，脫離天然中存在之狀態。因此，「經單離之增殖因子X」不包含從培養對象之細胞或組織產生之內生性之增殖因子X。「經單離之蛋白質X」之純度(總蛋白質重量 中占有之蛋白質X之重量百分率)通常在70%以上，較好在80%以上，更好在90%以上，更好在99%以上，最好為100%。懸浮培養中使用之培養基中含有之經單離之增殖因子為在培養基組成物I中以外因性添加者。因此，於一態樣，本發明包含提供經單離之任一種選自由轉形增殖因子、類胰島素增殖因子及纖維母細胞增殖因子所成群組之增殖因子之步驟。又，於一態樣，包含在培養基組成物I中以外因性添加任一種選自由經單離之轉形增殖因子、類胰島素增殖因子及纖維母細胞增殖因子所成群組之增殖因子之步驟。

培養基組成物I中，上述增殖因子之濃度為促進培養對象之黏合性癌細胞增殖之濃度。該等濃度只要是所屬技術領域者，即可適當設定。TGF-β之濃度通常在3ng/mL以上。IGF-1之濃度通常在10ng/mL以上。FGF2之濃度通常在10ng/mL以上。添加之增殖因子之上限值只要能促進培養對象之黏合性癌細胞增殖即可，並無特別限制，從確保對於細胞增殖之良好濃度依存性之觀點而言，較好TGF-β之濃度作成在約30ng/mL以下，IGF-1之濃度作成在約100ng/mL以下，FGF2之濃度作成在約100ng/mL以下。

使用本發明之培養方法培養上述之黏合性癌細胞時，可使用通常培養細胞使用之盤、燒瓶、塑膠袋、鐵氟龍(Teflon)(註冊商標)袋、皿、培養皿、組織培養用培養皿、多皿、微量盤、微孔盤、多盤、多孔盤、腔式載玻 片、細胞培養燒瓶、攪拌瓶、管、托盤、培養袋、滾瓶等培養器材進行培養。該等培養容器中，在實施多數抗癌劑、評估醫藥品候補化合物或醫藥品的評估時較好使用微量盤、微孔盤、多盤、多孔盤。該等盤的孔底之形狀並無特別限制，可使用平底、U字型、V字型者，較好使用U字型者。該等培養器材之材質並無特別限制，可列舉例如玻璃、聚氯乙烯、乙基纖維素或乙醯基纖維素等纖維素系聚合物、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚碸、聚胺基甲酸酯、聚酯、聚醯胺、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚丁二烯、聚(乙烯-乙酸乙烯酯)共聚物、聚(丁二烯-苯乙烯)共聚物、聚(丁二烯-丙烯腈)共聚物、聚(乙烯-丙烯酸乙酯)共聚物、聚(乙烯-甲基丙烯酸酯)共聚物、聚氯丁烯、苯乙烯樹脂、氯磺化聚乙烯、乙烯乙酸乙烯酯、丙烯酸系嵌段共聚物等塑膠料等。該等塑膠料不僅氧氣或二氧化碳等氣體透過性優越，在工業上之成形加工性亦優越，亦可忍受各種滅菌處理且為可觀察培養器材內部的情形之透明性材質而較佳。此處，實施滅菌處理之方法並無特別限制，可實施例如放射線滅菌、環氧乙烷氣體滅菌、高壓釜滅菌等。又，對於該等塑膠料可實施種種表面處理(例如等離子體處理、電暈處理等)。

上述黏合性癌細胞之培養可在機械控制下，在封閉環境下自動實行細胞播種、培養基交換、細胞影像取得、培養細胞回收，在一邊控制pH、溫度、氧濃度等一邊藉由可以高密度培養之生物反應器或自動培養裝置 進行。使用該等裝置，在培養途中補給新的培養基，將要求之物質不會多也不會不足地供給細胞及/或組織之方法有批式進料培養、連續培養及灌流培養，任何一種方法都可於本發明之培養方法中使用。又，生物反應器或自動培養裝置中使用之培養容器有容易開閉，與外界接觸面積大之開放系培養容器(例如有蓋子的培養容器)、不容易開閉，與外界接觸面積小之封閉系培養容器(例如匣式型培養容器)，任一種培養容器均可在本發明之培養方法中使用。

於本發明之培養方法，培養之黏合性癌細胞之形態或狀態，所屬技術領域者可任意選擇。較佳之具體例並無特別之限制，可列舉黏合性癌細胞以單一細胞之狀態分散於培養基組成物I中之狀態、黏合性癌細胞黏合於載體表面上之狀態、黏合性癌細胞包埋於載體內部之狀態、複數個黏合性癌細胞集合形成細胞塊(球體)之狀態等。黏合性癌細胞較好為以單一細胞之狀態分散於培養基組成物I中之狀態或複數個細胞集合，形成細胞塊(球體)之狀態在培養基組成物I中懸浮培養(較好為懸浮靜置培養)。亦即，較好不使用將癌細胞黏合或包埋之載體。該等狀態中，形成細胞塊(球體)之狀態為再構築接近生體內環境之細胞-細胞間相互作用及細胞構造體，可在長期維持細胞機能下培養且細胞之回收比較容易，所以較佳。

形成細胞凝集塊(球體)之方法並無特別限制，所屬技術領域者可適當選擇。該等例可列舉使用具有細胞非黏合表面之容器之方法、懸滴法、旋轉培養法、三 維支架法(scaffold method)、離心法、藉由電場或磁場凝集之方法等。例如，對於使用具有細胞非黏合表面之容器之方法，可將目的細胞在施行阻礙細胞黏合之表面處理之培養容器中培養，使形成球體。使用該細胞非黏合性培養容器時，首先在採取目的細胞後調製該細胞懸浮液，播種於該培養容器中，進行培養。若連續培養約一星期，則細胞自發性的形成球體。作為此時使用之細胞非黏合性表面，可使用在通常使用之盤等培養容器表面塗覆阻礙細胞黏合之物質者等。作為該等物質可列舉瓊脂糖、瓊脂、聚-HEMA(聚-(甲基丙烯酸2-羥基-乙基酯)2-甲基丙烯醯基氧基乙基磷酸膽鹼與其他單體(例如甲基丙烯酸丁酯等)之共聚物、聚(丙烯酸2-甲氧基甲基酯)、聚-N-異丙基丙烯醯胺、美比歐凝膠(Mebiol Gel)(登錄商標)等，惟，只要無細胞毒性即可，不只限於此。

又，為了獲得目的之尺寸均一之細胞凝集塊，可在使用之細胞非黏合性培養容器上導入與目的細胞凝集塊相同直徑之複數凹痕。只要該等凹痕可互相連接或是在目的之細胞凝集塊之直徑範圍內，則在播種細胞時，播種之細胞在凹痕與凹痕之間不會形成細胞凝集塊，確實的在凹痕中形成對應其容積大小之細胞凝集塊，可獲得均一尺寸之細胞凝集塊集團。此時之凹痕形狀較好為半球或圓錐形。

可使用培養組成物I形成球體。例如，藉由在培養組成物I中進行離解至成為單一細胞狀態為止， 將目的之黏合性癌細胞均一分散，靜置3日至10日，進行懸浮培養而調製球體。此處調製之球體可藉由離心或過濾處理回收。球體之大小依細胞種類及培養期間而異，並無特別限制，在作成球形狀或橢圓球形狀時具有20μm至1000μm，較好40μm至500μm，更好50μm至300μm，最好80μm至200μm之直径。該等球體即使以原狀繼續靜置培養，在10日以上，較好13日以上，更好30日以上之期間可保持增殖能力，若另在靜置培養中定期進行機械性分割，或另進行單細胞化處理及凝集，實質上可無期限保持增殖能力。

以本發明之方法培養黏合性癌細胞時，對於含有上述增殖因子之培養組成物I亦可添加其他方法調製之黏合性癌細胞，使均一分散之方式混合。此時之混合方法並無特別限制，可列舉例如吸取等手動混合、使用攪拌器、渦旋混合器(vortex mixer)、微量盤混合器、振動機等機器混合。混合後可將獲得之黏合性癌細胞懸濁液靜置培養，必要時可將培養液旋轉、振動或攪拌。其旋轉數及頻率可配合所屬技術領域者之目的適當設定。又，在靜置培養期間培養基組成物必需交換時，可藉由進行離心或過濾處理，將黏合性癌細胞與培養基組成物分離後將新鮮之含有上述增殖因子之培養基組成物I添加於細胞。或可藉由離心或過濾處理，將黏合性癌細胞適當濃縮後將新鮮之含有上述增殖因子之培養基組成物I添加於該濃縮液中。

於一態樣，在懸浮培養黏合性癌細胞時， 例如將該癌細胞從繼代培養回收，將其分散為單一細胞或至接近單一細胞之狀態。癌細胞之分散使用適當之細胞離解液進行。細胞離解液可將例如EDTA；胰蛋白酶、膠原酶IV、金屬蛋白酶等蛋白質分解酵素等單獨或適當組合使用。將經分散之黏合性癌細胞懸濁於含有上述增殖因子之培養基組成物I中，將其懸浮培養(較好為懸浮靜置培養)。培養物中，癌細胞以單一細胞之狀態或以球體之狀態一邊懸浮於培養基組成物I中一邊進行增殖。

培養黏合性癌細胞時之溫度通常為25至39℃，較好為37℃。CO₂濃度通常在培養之大氣中為4至10體積%，較好為5體積%。氧濃度在培養之大氣中為15至50體積%，較好為20體積%，培養期間通常為1至35日，可配合培養之目的自由設定。

(2-2)試驗癌細胞對增殖因子之反應性之方法

本發明提供試驗黏合性癌細胞對選自由轉形增殖因子、類胰島素增殖因子及纖維母細胞增殖因子所成群組之任一種增殖因子之反應性之方法，包含(1)將黏合性癌細胞在該增殖因子存在下及不存在下，在上述培養基組成物I中懸浮培養、(2)測定培養之癌細胞之增殖、及(3)比較在該增殖因子存在下培養之癌細胞之增殖與在該增殖因子不存在下之增殖之方法(本發明之方法2)。

如上所述，於單層培養，黏合性癌細胞對於轉形增殖因子、類胰島素增殖因子及纖維母細胞增殖因子之應答性低，相對的，藉由上述本發明之方法I，由於在上述培養基組成物I中進行懸浮培養，對於該等增殖因子之應答性提昇，大大促進增殖，因此藉由應用該方法，可以高感度評估黏合性癌細胞對於上述增殖因子之反應性。

於本發明之方法2，用語之定義或試驗條件(包含較佳之條件)若無特別說明，則與本發明之方法1相同。

於步驟(1)，將評估對象之黏合性癌細胞在任一種選自由轉形增殖因子(例如TGF-β)、類胰島素增殖因子(例如IGF-1)及纖維母細胞增殖因子(例如FGF2)所成群組之增殖因子存在下及不存在下，在上述培養基組成物I中懸浮培養(較好為懸浮靜置培養)。該增殖因子較好為TGF-β。

培養期間只要可檢出評估對象之黏合性癌細胞藉由該增殖因子之刺激之增殖促進效果即可，並無特別限制，通常為約1至7日。

測定經培養之癌細胞之增殖可藉由本身公知之方法實施。例如，計測培養後癌細胞之細胞數。增殖或出現之細胞數可使用於該領域之標準顯微鏡計數。或，癌細胞之細胞數的計測可使用菌落形成法、結晶紫法、胸苷嵌入法、錐蟲藍染色法、ATP(腺苷3磷酸)測定法、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(3-(4,5-Dimethylthial-2-yl) -2,5-Diphenyltetrazalium Bromide(MTT))染色法、WST-1(註冊商標)染色法、WST-8(註冊商標)染色法、流式細胞儀法、使用細胞數自動測定裝置之方法等實施。

將在該增殖因子存在下培養之癌細胞之增殖，與在該增殖因子不存在下之增殖進行比較。比較癌細胞之增殖較好以在統計學上有無顯著差異為基礎進行。又，未添加被檢增殖因子之對照癌細胞增殖之程度，相對於測定接觸被檢增殖因子之癌細胞之增殖，可為於事前測定者，亦可為同時測定者，從實驗之精密度、重現性之觀點而言，較好為同時測定者。

於比較結果確認因添加該增殖因子促進增殖時，該癌細胞可判定對於該增殖因子具有反應性。

(2-3)抗癌劑的篩選方法

本發明提供篩選對於任一種選自由轉形增殖因子、類胰島素增殖因子及纖維母細胞增殖因子所成群組之增殖因子具有反應性之黏合性癌細胞之抗癌劑之方法，包含(1)在被檢物質存在下及不存在下將該癌細胞在含有該增殖因子之上述培養基組成物I中進行懸浮培養、(2)測定經培養之癌細胞之增殖、及(3)將在被檢物質存在下培養之癌細胞之增殖與在被檢物質不存在下之增殖進行比較之方法(本發明之方法3)。

如上所述，於單層培養，黏合性癌細胞對於轉形增殖 因子、類胰島素增殖因子及纖維母細胞增殖因子之應答性低，相對的，藉由上述本發明之方法I，在上述培養基組成物I中進行懸浮培養，則對於該等增殖因子之應答性提昇，大大促進增殖，因此，藉由應用該方法，可以高感度篩選阻礙黏合性癌細胞之上述增殖因子依存性增殖之物質。

於本發明之方法3，用語之定義或試驗條件(包含較佳之條件)若無特別說明，則與本發明之方法1及2相同。

於步驟(1)，在被檢物質存在下及不存在下，將對於任一種選自由轉形增殖因子(例如TGF-β)、類胰島素增殖因子(例如IGF-1)及纖維母細胞增殖因子(例如FGF2)所成群組之增殖因子具有反應性之黏合性癌細胞，在含有該增殖因子之上述培養基組成物I中懸浮培養(較好為懸浮靜置培養)。該增殖因子較好為TGF-β。

供給本發明方法3之被檢物質，可為任何公知化合物及新穎化合物，可列舉例如核酸、糖質、脂質、蛋白質、肽、有機低分子化合物、使用組合化學(Combinatorial chemistry)技術製作之化合物庫(libray)、隨機肽庫(random peptide library)或源自微生物、動植物、海洋生物等之天然成分等。

培養期間只要可檢出評估對象之黏合性癌細胞之藉由該增殖因子之刺激之增殖效果即可，並無特別限制，通常為約1至7日。

測定經培養之癌細胞之增殖可藉由本身公知 之方法實施。例如，計測培養後癌細胞之細胞數。增殖或出現之細胞數可使用於該領域之標準顯微鏡計數。癌細胞之細胞數的計測可使用菌落形成法、結晶紫法、胸苷嵌入法、錐蟲藍染色法、ATP(腺苷3磷酸)測定法、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)2,5-二苯基溴化四唑(3-(4,5-Dimethylthial-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazalium Bromide(MTT))染色法、WST-1(註冊商標)染色法、WST-8(註冊商標)染色法、流式細胞儀法、使用細胞數自動測定裝置之方法等實施。

將在該被檢物質存在下培養之癌細胞之增殖，與在該被檢物質不存在下之增殖進行比較。比較癌細胞之增殖較好以在統計學上有無顯著差異為基礎進行。又，未添加被檢物質之對照癌細胞增殖之程度，相對於測定接觸被檢物質之癌細胞之增殖，可為於事前測定者，亦可為同時測定者，從實驗之精密度、重現性之觀點而言，較好為同時測定者。

於比較結果，藉由添加該被檢物質，可選擇將藉由該增殖因子阻礙該黏合性癌細胞增殖之物質，作為阻礙黏合性癌細胞對該增殖因子依存性增殖之候補物質或作為對於黏合性癌細胞之抗癌劑之候補物質。

只有上述之比較，不能否定與藉由在上述培養基組成物I中添加之增殖因子之增殖促進效果無關(例如只藉由細胞毒性)、抑制評估對象之癌細胞增殖之可能性。此處，在培養基組成物I中不添加評估對象之增殖因子，進行與上述步驟(1)至(3)相同之操作，亦可進一步評 估被檢物質對於該增殖因子為非依存性之該癌細胞增殖之效果。因此，比較之結果，該被檢物質在該增殖因子不存在，未阻礙該黏合性癌細胞增殖時，可選擇將該被檢物質作為選擇性阻礙該增殖因子依存性黏合性癌細胞增殖之物質。如此，選擇性阻礙特定之增殖因子依存性黏合性癌細胞增殖之物質，由於非特異性的降低傷害正常細胞之風險，作為對於黏合性癌細胞之抗癌劑之候補物質為優越。

另，亦可在生體內確認獲得之候補物質之效果。例如，將該候補物質投予於罹癌之非人類哺乳動物(例如，以體外方法移殖確認阻礙增殖活性之黏合性癌細胞之非人類哺乳動物)，將該非人類哺乳動物中該癌細胞增殖之程度與對照之非人類哺乳動物(除了未投予候補物質以外，飼養條件與投予候補物質之罹癌非人類哺乳動物相同)進行比較，以比較結果為基礎，可選擇在該非人類哺乳動物阻礙癌細胞增殖之候補物質作為經在生體內確認有效性之抗癌劑之候補物質。

(3)評估癌腫細胞之上皮間質轉換(方法論II) (3-1)維持癌腫細胞的類上皮系形質之方法

本發明提供包含將癌腫細胞在上述培養基組成物I中懸浮培養，維持該癌腫細胞的類上皮系形質之方法(本發明之方法4)。若將癌腫細胞進行單層培養，則促進上皮間質轉換，類上皮系形質喪失，類間質系形質占優勢，相對的，若將癌腫細胞在上述培養基組成物I中進行懸浮培 養，則抑制上皮間質轉換，不僅可維持類上皮系形質，亦誘導類間質系形質占優勢之癌腫細胞轉換為類上皮系形質(亦即，間質上皮轉換)，其結果，類上皮系形質占優勢。

上皮間質轉換(EMT)係指上皮細胞喪失其細胞極性或與周圍細胞之細胞黏合機能，可遊走，獲得浸潤能力，變化為類間質系細胞之過程。通常，癌腫細胞藉由引起上皮間質轉換，從上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)表現相對的高，細胞之間以面黏合之類上皮系形質向神經鈣黏蛋白(N-cadherin)表現相對的高，細胞之間以點黏合，細胞之間之黏合性降低之類間質系形質移行，該等認為是引起向周邊組織浸潤或轉移之原因之一。

癌腫(carcinoma)細胞可列舉胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、***癌、鱗狀上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、尿道癌、肝癌、膽管癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、***癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、頭蓋咽頭癌、喉頭癌、舌癌、滑膜瘤、間皮瘤、伊文氏肉瘤、精原細胞瘤、威爾姆氏腫瘤、神經膠質瘤、星狀細胞瘤、髓膜瘤、網膜母細胞瘤等之細胞，惟，不只限於此。

於方法論II中使用之癌腫細胞具有上皮間質轉換能力。上皮間質轉換能力係指藉由上皮間質轉換誘導因子之刺激，引起上皮間質轉換之能力。作為上皮間質轉換誘導因子可列舉TGF-β、FGF(FGF1至FGF23，較好為FGF2)、EGF受體激動劑(EGF、HB-EGF、TGF-α、β- 動物纖維素(cellulin)、雙調蛋白(amphiregulin)、上皮調節蛋白(epiregulin)等)、HGF、Wnt/β-連環蛋白(Catenin)、Notch、I型膠原等。通常，癌腫細胞之上皮間質轉換為可逆，向類間質系形質移行後可回到類上皮系形質。

於本發明之方法4，癌腫細胞在上述培養基組成物I中懸浮培養(較好為懸浮靜置培養)。藉由懸浮培養，抑制癌腫細胞之上皮間質轉換，維持類上皮系形質。若將癌腫細胞以單層培養，則類間質系形質占優勢，將該等類間質系形質占優勢之癌腫細胞在上述培養基組成物I中進行懸浮培養，則誘導間質上皮轉換，喪失類間質系形質，變成類上皮系形質占優勢。於本發明之方法4，「維持癌腫細胞中之類上皮系形質」包含維持癌腫細胞中之類上皮系形質占優勢之狀態及將類間質系形質為優勢之癌腫細胞向類上皮系形質為優勢之狀態移行。

本發明之方法4中，培養癌腫細胞時使用之培養容器或培養裝置，可列舉於上述本發明之方法1中記載之培養容器或培養裝置。

於本發明之方法4中培養之癌腫細胞之形態或狀態並無特別限制，較好為癌腫細胞為以單一細胞之狀態分散於培養基組成物I中之狀態或以複數個癌腫細胞集合，形成細胞塊(球體)之狀態在培養基組成物I中懸浮培養(較好為懸浮靜置培養)。較好不使用為了將癌腫細胞黏合或包埋之載體，進行懸浮培養。藉由黏合於癌腫細胞之載體，有誘導上皮間質轉換之可能性。

形成細胞凝集塊(球體)之方法可列舉上述本發明之方法1中記載之方法。

以本發明之方法4培養癌腫細胞時，對於培養組成物I可添加以其他方法調製之癌腫細胞，混合，使均一分散。此時之混合方法並無特別限制，可列舉例如吸取等手動混合，使用攪拌器、渦旋混合器(vortex mixer)、微量盤混合器、振動機等機器混合。混合後可將獲得之癌腫細胞懸濁液靜置培養，必要時可將培養液旋轉、振動或攪拌。其旋轉數及頻率可配合業者之目的適當設定。又，在靜置培養期間培養基組成物必需交換時，可藉由進行離心或過濾處理，將癌腫細胞與培養基組成物分離後將含有新鮮之培養基組成物I添加於細胞。或可藉由離心或過濾處理，將癌腫細胞適當濃縮後將新鮮之培養基組成物I添加於該濃縮液中。

於一態樣，在懸浮培養癌腫細胞時，例如將該癌腫細胞從繼代培養回收，將其分散為單一細胞或至接近單一細胞之狀態。癌腫細胞之分散使用適當之細胞解離液進行。細胞解離液可將例如EDTA、胰蛋白酶、膠原酶IV、金屬蛋白酶等蛋白質分解酵素等單獨或適當組合使用。將經分散之癌腫細胞懸濁於上述之培養基組成物I中，將其懸浮培養(較好為懸浮靜置培養)。培養物中，癌腫細胞以單一細胞之狀態或以球體之狀態，一邊懸浮於培養基組成物I中，一邊進行增殖。

於較佳之態樣，於本發明之方法4，為了維 持癌腫細胞之類上皮系形質及不阻礙間質上皮轉換，培養基組成物I不含上皮間質轉換誘導濃度之上皮間質轉換誘導因子。上皮間質轉換誘導因子可列舉TGF-β、FGF(FGF1至FGF23，較好為FGF2)、EGF受體激動劑(EGF、HB-EGF、TGF-α、β-動物纖維素、雙調蛋白、上皮調節蛋白等)、HGF、Wnt/β-連環蛋白、Notch、I型膠原等。

培養癌腫細胞時之溫度通常為25至39℃，較好為37℃。CO₂濃度通常在培養之大氣中為4至10體積%，較好為5體積%。

低氧環境由於誘導上皮間質轉換，於本發明之方法4，培養癌腫細胞時之氧濃度，較好在空氣中之氧分壓(20體積%)以上。

培養期間只要能達成維持癌腫細胞之類上皮系形質即可，並無特別限制，可配合培養之目的自由設定。將類間質系形質為優勢之癌腫細胞向類上皮系形質為優勢之狀態移行時(例如，將進行單層培養之癌腫細胞回收，在培養基組成物I中進行懸浮培養時)，較好在培養基組成物I中繼續懸浮培養例如6日以上，較好11日以上，使間質上皮轉換充分進行。

經由此操作，將癌腫細胞藉由在培養基組成物I中進行懸浮培養(較好為懸浮靜置培養)，可獲得維持類上皮系形質之癌腫細胞。本發明之方法4亦為具有類上皮系形質之癌腫細胞之調製方法。

於培養後之癌腫細胞，可進行確認類上皮 系形質被維持(類上皮系形質為優勢)。本發明之方法4可包含該等確認步驟。確認為類上皮系形質被維持之狀態可藉由調查上皮鈣黏蛋白(E-Cadherin)及神經鈣黏蛋白(N-Cadherin)之表現實施。於類上皮系形質為優勢之狀態，上皮鈣黏蛋白之表現相對的高、神經鈣黏蛋白之表現相對的低，於類間質系形質為優勢之狀態，則與此相反，上皮鈣黏蛋白之表現相對的低、神經鈣黏蛋白之表現相對的高。因此，只要上皮鈣黏蛋白之表現相對的高、神經鈣黏蛋白之表現相對的低，即可判斷培養後之癌腫細胞為類上皮系形質被維持(類上皮系形質為優勢)之狀態。又，在將類間質系形質為優勢之癌腫細胞向類上皮系形質為優勢之狀態移行時，於培養後之癌腫細胞，將上皮鈣黏蛋白及神經鈣黏蛋白之表現與培養開始時之癌腫細胞比較，只要確認上皮鈣黏蛋白之表現上昇及神經鈣黏蛋白之表現降低，即可判斷癌腫細胞向類上皮系形質為優勢之狀態移行。上皮鈣黏蛋白及神經鈣黏蛋白之表現可藉由評估mRNA或蛋白質之表現來進行。mRNA表現可藉由使用對於上皮鈣黏蛋白及神經鈣黏蛋白為特異性的引子或探針之RT-PCR、北方墨點法、核酸陣列等進行評估。蛋白質之表現可藉由使用對於上皮鈣黏蛋白及神經鈣黏蛋白為特異性抗體之免疫組織學解析(免疫組織染色、流式細胞技術等)進行評估。

(3-2)上皮間質轉換之誘導方法

本發明提供包含將具有類上皮系形質之癌腫細胞，在 含有上皮間質轉換誘導因子之上述培養基組成物I中進行懸浮培養，誘導該癌腫細胞之上皮間質轉換之方法(本發明之方法5)。於上述本發明之方法4，藉由在培養基組成物I中添加上皮間質轉換誘導之充分量之上皮間質轉換誘導因子，誘導癌腫細胞之上皮間質轉換。

於本發明之方法5，用語之定義或試驗條件(包含較佳之條件)若無特別說明，則與本發明之方法4相同。

於本發明之方法5，首先提供具有類上皮系形質之癌腫細胞。具有類上皮系形質之癌腫細胞可藉由例如上述本發明之方法4調製。因此，可在實施本發明之方法5之前，實施本發明之方法4，調製具有類上皮系形質之癌腫細胞。

接著，將具有類上皮系形質之癌腫細胞在含有上皮間質轉換誘導因子之上述培養基組成物I中進行懸浮培養(較好為懸浮靜置培養)。上皮間質轉換誘導因子可列舉TGF-β、FGF(FGF1至FGF23，較好為FGF2)、EGF受體激動劑(EGF、HB-EGF、TGF-α、β-動物纖維素、雙調蛋白、上皮調節蛋白等)、HGF、Wnt/β-連環蛋白、Notch、I型膠原等。該上皮間質轉換誘導因子較好經單離。懸浮培養中使用之培養基中含有之經單離之上皮間質轉換誘導因子為在培養基組成物I中外因性添加者。因此，於一態樣，本發明包含提供經單離之上皮間質轉換誘導因子之步驟。又，於一態樣，包含在培養基組成物I中將經單離之 上皮間質轉換誘導因子外因性添加之步驟。上述培養基組成物I含有上皮間質轉換誘導濃度之上皮間質轉換誘導因子。各因子之上皮間質轉換誘導濃度，只要是所屬技術領域者即可很容易的設定，例如，TGF-β濃度在0.1ng/mL以上，HB-EGF濃度在30ng/mL以上。

於本發明之方法5，培養之癌腫細胞之形態或狀態並無特別限制，較好癌腫細胞為以單一細胞之狀態分散於培養基組成物I中之狀態，或以複數個癌腫細胞集合，形成細胞塊(球體)之狀態，在培養基組成物I中懸浮培養(較好為懸浮靜置培養)。較好不使用將癌腫細胞黏合或包埋之載體進行懸浮培養。

於一態樣，藉由實施上述本發明之方法4，獲得具有類上皮系形質之癌腫細胞。因此，在培養基組成物I中，添加上皮間質轉換誘導濃度之經單離之上皮間質轉換誘導因子，繼續懸浮培養(較好為懸浮靜置培養)。

培養癌腫細胞時之溫度通常為25至39℃，較好為37℃。CO₂濃度通常在培養之大氣中為4至10體積%，較好為5體積%。

低氧環境由於誘導上皮間質轉換，於本發明之方法5，可在低氧濃度(2至10體積%，較好為3體積%)環境下將癌腫細胞懸浮培養。另一方面，排除因低氧環境之影響，只評估藉由添加之上皮間質轉換誘導因子之效果之觀點而言，較好將本發明之方法5中培養時之氧濃度作成空氣中之氧分壓(20體積%)以上。

培養期間不只限於誘導癌腫細胞之上皮間質轉換，較好在含有上皮間質轉換誘導因子之培養基組成物I中繼續懸浮培養例如6日以上，較好11日以上，使上皮間質轉換充分進行。

由此操作，藉由將具有類上皮系形質之癌腫細胞在含有上皮間質轉換誘導因子之培養基組成物I中進行懸浮培養(較好為懸浮靜置培養)，可誘導上皮間質轉換，獲得具有類間質系形質之癌腫細胞。本發明之方法5亦為調製具有類間質系形質之癌腫細胞之方法。

培養後可進行確認上皮間質轉換被誘導，亦即，癌腫細胞具有類間質系形質(類間質系形質為優勢)。本發明之方法5可包含該等確認步驟。確認上皮間質轉換被誘導可藉由調查上皮鈣黏蛋白及神經鈣黏蛋白之表現來實施。於類上皮系形質為優勢之狀態，上皮鈣黏蛋白之表現相對的高、神經鈣黏蛋白之表現相對的低，於類間質系形質為優勢之狀態與此相反，上皮鈣黏蛋白之表現相對的低、神經鈣黏蛋白之表現相對的高。因此，只要上皮鈣黏蛋白之表現相對的低、神經鈣黏蛋白之表現相對的高，即可判斷培養後之癌腫細胞具有類間質系形質(類間質系形質為優勢)。又，於培養後之癌腫細胞，將上皮鈣黏蛋白及神經鈣黏蛋白之表現與培養開始時之癌腫細胞比較，只要確認上皮鈣黏蛋白之表現降低及神經鈣黏蛋白之表現上昇，即可判斷上皮間質轉換被誘導。上皮鈣黏蛋白及神經鈣黏蛋白之表現可藉由評估mRNA或蛋白質之表現來進 行。mRNA之表現可藉由使用對於上皮鈣黏蛋白及神經鈣黏蛋白為特異性的引子或探針之RT-PCR、北方墨點法、核酸陣列等進行評估。蛋白質之表現可藉由使用對於上皮鈣黏蛋白及神經鈣黏蛋白為特異性抗體之免疫組織學解析(免疫組織染色、流式細胞技術等)進行評估。

(3-3)誘導上皮間質轉換之物質之篩選方法

本發明提供誘導上皮間質轉換之物質之篩選方法，包含(1)在被檢物質存在下及不存在下，將具有類上皮系形質之癌腫細胞在上述培養基組成物I中懸浮培養、(2)評估培養之癌腫細胞之上皮間質轉換及(3)比較在被檢物質存在下培養之癌腫細胞之上皮間質轉換與在被檢物質不存在下之上皮間質轉換之方法(本發明之方法6)。

如上所述，若使用本發明之方法5，則於體外，由於藉由上皮間質轉換誘導因子之刺激，可誘導癌腫細胞之上皮間質轉換，藉由使用被檢物質替代上皮間質轉換誘導因子，可篩選出誘導上皮間質轉換之物質。

於本發明之方法6，用語之定義或試驗條件(包含較佳之條件)若無特別說明，則與本發明之方法4及5相同。

於本發明之方法6，首先提供具有類上皮系形質之癌腫細胞。具有類上皮系形質之癌腫細胞可藉由例 如上述本發明之方法4調製。因此，可在實施本發明之方法6之前，實施本發明之方法4，調製具有類上皮系形質之癌腫細胞。

於步驟(1)，在被檢物質存在下及不存在下，將具有類上皮系形質之癌腫細胞在上述培養基組成物I中懸浮培養(較好為懸浮靜置培養)。

供給本發明方法6之被檢物質可為任何公知化合物及新穎化合物，可列舉例如核酸、糖質、脂質、蛋白質、肽、有機低分子化合物、使用組合化學技術製作之化合物庫、隨機肽庫或源自微生物、動植物、海洋生物等之天然成分等。

於較佳之態樣，於步驟(1)，為了將添加之被檢物質之效果明確化，培養基組成物I不含上皮間質轉換誘導濃度之上皮間質轉換誘導因子。上皮間質轉換誘導因子可列舉TGF-β、FGF(FGF1至FGF23，較好為FGF2)、EGF受體激動劑(EGF、HB-EGF、TGF-α、β-動物纖維素、雙調蛋白、上皮調節蛋白等)、HGF、Wnt/β-連環蛋白、Notch、I型膠原等。

培養期間只要可評估添加之被檢物質上皮間質轉換誘導之效果即可，並無特別限制，較好在培養基組成物I中繼續懸浮培養例如6日以上，較好11日以上，使上皮間質轉換充分進行。

培養之癌腫細胞之上皮間質轉換的評估，可藉由本體公知之方法實施。例如，藉由調查上皮鈣黏蛋 白及神經鈣黏蛋白之表現，可實施該評估。於類上皮系形質為優勢之狀態，上皮鈣黏蛋白之表現相對的高、神經鈣黏蛋白之表現相對的低，於類間質系形質為優勢之狀態與此相反，上皮鈣黏蛋白之表現相對的低、神經鈣黏蛋白之表現相對的高。因此，只要上皮鈣黏蛋白之表現相對的低、神經鈣黏蛋白之表現相對的高，即可判斷培養後之癌腫細胞為具有類間質系形質(類間質系形質為優勢)之狀態。又，於培養後之癌腫細胞，將上皮鈣黏蛋白及神經鈣黏蛋白之表現與培養開始時之癌腫細胞比較，只要確認上皮鈣黏蛋白之表現降低及神經鈣黏蛋白之表現上昇，即可判斷上皮間質轉換被誘導。上皮鈣黏蛋白及神經鈣黏蛋白之表現可藉由評估mRNA或蛋白質之表現來進行。mRNA之表現可藉由使用對於上皮鈣黏蛋白及神經鈣黏蛋白為特異性的引子或探針之RT-PCR、北方墨點法、核酸陣列等進行評估。蛋白質之表現可藉由使用對於上皮鈣黏蛋白及神經鈣黏蛋白為特異性抗體之免疫組織學解析(免疫組織染色、流式細胞技術等)進行評估。

因此，比較在該被檢物質存在下培養之癌腫細胞之上皮間質轉換與在該被檢物質不存在下之上皮間質轉換。上皮間質轉換之比較，較好以在統計學上有無顯著差異為基礎進行。又，未添加被檢物質之對照癌腫細胞之上皮間質轉換之程度，在測定對於接觸被檢物質之癌腫細胞之上皮間質轉換，可為事前測定者，亦可為同時測定者，從實驗之精密度、重現性之觀點而言，較好為同時測 定者。

於比較結果，藉由添加該被檢物質誘導上皮間質轉換時，可選擇將該物質作為誘導癌腫之上皮間質轉換之候補物質。

(3-4)阻礙上皮間質轉換之物質之篩選方法

本發明提供阻礙癌腫細胞上皮間質轉換之物質之篩選方法，包含(1)在被檢物質存在下及不存在下，將具有類上皮系形質之癌腫細胞在含有上皮間質轉換誘導因子之上述培養基組成物I中懸浮培養、(2)評估培養之癌腫細胞之上皮間質轉換及(3)比較在被檢物質存在下培養之癌腫細胞之上皮間質轉換與在被檢物質不存在下之上皮間質轉換之方法(本發明之方法7)。

如上所述，若使用本發明之方法5，則於體外，由於藉由上皮間質轉換誘導因子之刺激，可誘導癌腫細胞之上皮間質轉換，藉由在該培養系中另添加被檢物質，可篩選出阻礙上皮間質轉換之物質。

於本發明之方法7，用語之定義或試驗條件(包含較佳之條件)若無特別說明，則與本發明之方法4及5相同。

於本發明之方法7，首先提供具有類上皮系形質之癌腫細胞。具有類上皮系形質之癌腫細胞可藉由例 如上述本發明之方法4調製。因此，可在實施本發明之方法7之前，實施本發明之方法4，調製具有類上皮系形質之癌腫細胞。

於步驟(1)，在被檢物質存在下及不存在下，將具有類上皮系形質之癌腫細胞，在含有上皮間質轉換誘導因子之上述培養基組成物I中懸浮培養(較好為懸浮靜置培養)。

供給本發明方法7之被檢物質可為任何公知化合物及新穎化合物，可列舉例如核酸、糖質、脂質、蛋白質、肽、有機低分子化合物、使用組合化學技術製作之化合物庫、隨機肽庫或源自微生物、動植物、海洋生物等之天然成分等。

上皮間質轉換誘導因子可列舉TGF-β、FGF(FGF1至FGF23，較好為FGF2)、EGF受體激動劑(EGF、HB-EGF、TGF-α、β-動物纖維素、雙調蛋白、上皮調節蛋白等)、HGF、Wnt/β-連環蛋白、Notch、I型膠原等。該上皮間質轉換誘導因子較好經單離。懸浮培養中使用之培養基中含有之經單離之上皮間質轉換誘導因子為在培養基組成物I中外因性添加者。因此，於一態樣，本發明包含提供經單離之上皮間質轉換誘導因子之步驟。又，於一態樣，包含在培養基組成物I中將經單離之上皮間質轉換誘導因子外因性添加之步驟。上述培養基組成物I含有上皮間質轉換誘導濃度之上皮間質轉換誘導因子。各因子之上皮間質轉換誘導濃度，只要是所屬技術領域者即可很容 易的設定，例如，TGF-β濃度在0.1ng/mL以上，HB-EGF濃度在30ng/mL以上。

於本發明之方法7，培養之癌腫細胞之形態或狀態並無特別限制，較好癌腫細胞為以單一細胞之狀態分散於培養基組成物I中之狀態，或以複數個癌腫細胞集合，形成細胞塊(球體)之狀態，在培養基組成物I中懸浮培養(較好為懸浮靜置培養)。較好不使用將癌腫細胞黏合或包埋之載體進行懸浮培養。

培養癌腫細胞時之溫度通常為25至39℃，較好為37℃。CO₂濃度通常在培養之大氣中為4至10體積%，較好為5體積%。

低氧環境由於誘導上皮間質轉換，於本發明之方法7，可在低氧(2至10%，較好為3%)環境下將癌腫細胞懸浮培養。另一方面，排除因低氧環境之影響，只對於添加之上皮間質轉換誘導因子評估被檢物質之效果之觀點而言，較好將本發明之方法7中培養時之氧濃度作成空氣中之氧分壓(20%)以上。

培養期間只要可評估藉由上皮間質轉換誘導因子，癌腫細胞之上皮間質轉換即可，並無特別限制，較好繼續懸浮培養例如6日以上，較好11日以上，使上皮間質轉換充分進行。

培養之癌腫細胞之上皮間質轉換的評估，可藉由本體公知之方法實施。例如，藉由調查上皮鈣黏蛋白及神經鈣黏蛋白之表現，可實施該評估。於類上皮系形 質為優勢之狀態，上皮鈣黏蛋白之表現相對的高、神經鈣黏蛋白之表現相對的低，於類間質系形質為優勢之狀態與此相反，上皮鈣黏蛋白之表現相對的低、神經鈣黏蛋白之表現相對的高。因此，只要上皮鈣黏蛋白之表現相對的低、神經鈣黏蛋白之表現相對的高，即可判斷培養後之癌腫細胞為具有類間質系形質(類間質系形質為優勢)之狀態。又，於培養後之癌腫細胞，將上皮鈣黏蛋白及神經鈣黏蛋白之表現與培養開始時之癌腫細胞比較，只要確認上皮鈣黏蛋白之表現降低及神經鈣黏蛋白之表現上昇，即可判斷上皮間質轉換被誘導。上皮鈣黏蛋白及神經鈣黏蛋白之表現可藉由評估mRNA或蛋白質之表現來進行。mRNA之表現可藉由使用對於上皮鈣黏蛋白及神經鈣黏蛋白為特異性的引子或探針之RT-PCR、北方墨點法、核酸陣列等進行評估。蛋白質之表現可藉由使用對於上皮鈣黏蛋白及神經鈣黏蛋白為特異性抗體之免疫組織學解析(免疫組織染色、流式細胞技術等)進行評估。

因此，比較在該被檢物質存在下培養之癌腫細胞之上皮間質轉換與在該被檢物質不存在下之上皮間質轉換。上皮間質轉換之比較，較好以在統計學上有無顯著差異為基礎進行。又，未添加被檢物質之對照癌腫細胞之上皮間質轉換之程度，在測定對於接觸被檢物質之癌腫細胞之上皮間質轉換，可為事前測定者，亦可為同時測定者，從實驗之精密度、重現性之觀點而言，較好為同時測定者。

於比較結果，藉由添加該被檢物質阻礙藉由上皮間質轉換誘導因子，癌腫細胞之上皮間質轉換時，可選擇該物質作為阻礙癌腫細胞之上皮間質轉換(較好為藉由上皮間質轉換誘導因子，癌腫細胞之上皮間質轉換)之候補物質。由於上皮間質轉換有助於癌腫之浸潤或轉移，因此，該物質可作為用於阻礙癌腫之浸潤或轉移之醫藥候補物質使用。

此處陳述之包含專利及專利申請說明書之所有刊物中記載之內容於此引用，全都以與明示同程度的編入本說明書中。

[實施例]

以下，將本發明中使用之培養基組成物之分析例、試驗例作為實施例加以具體陳述，將本發明做更詳細之說明，惟，本發明不只限於該等例。

(試驗例1：在以各增殖因子刺激之SKOV3細胞之增殖作用中與單層培養法之比較)

將去醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA、三晶(股)公司製造)懸濁於超純水(Milli-Q水)使成為0.3%(w/v)後於90℃一邊加熱一邊攪拌，溶解之，將本水溶液於121℃進行高壓釜滅菌20分鐘。使用本溶液調製在含有15%(v/v)胎牛血清之MaCoy’s5a培養基(DS PHARMA BIOMEDICAL公司製造)中最終濃度為0.015%(w/v)之添加去醯化結蘭膠之培養基組成物或不含去醯化結蘭膠之未添加培養基組成物。接 著，「去醯化結蘭膠/低黏合培養法係藉由將人類卵巢癌細胞株SKOV3(DS PHARMA BIOMEDICAL公司製造)播種於添加上述去醯化結蘭膠之培養基組成物中，使成為37000細胞/mL後分注於96孔平底超低黏合表面微量盤(Corning公司製造，# 3474)之孔中，使每孔為135μL而實施。「低黏合培養法」為藉由將人類卵巢癌細胞株SKOV3(DS PHARMA BIOMEDICAL公司製造)播種於不含去醯化結蘭膠之培養基組成物中，使成為37000細胞/mL後分注於96孔平底超低黏合表面微量盤(Corning公司製造，# 3474)之孔中，使每孔為135μL而實施。「單層培養法」係藉由將人類卵巢癌細胞株SKOV3播種於不含上述去醯化結蘭膠之培養基組成物中，使成為2200細胞/mL後分注於96孔平底微量盤(Corning公司製造，# 3585)之孔中，使每孔為135μL而實施。將各盤在CO₂保溫箱(37℃、5%CO₂)內以靜置狀態保溫。於培養第1日，各別添加10倍濃度之人類HB-EGF(PEPROTECH公司製造)使最終濃度為30、100ng/mL，10倍濃度之人類TGF-β 1(PEPROTECH公司製造)使最終濃度為3、10ng/mL，10倍濃度之人類PDGF-BB(PEPROTECH公司製造)使最終濃度為3、10ng/mL，10倍濃度之人類IGF-1(PEPROTECH公司製造)使最終濃度為10、100ng/mL及最終濃度0.015%(w/v)之含有去醯化結蘭膠之培養基組成物(去醯化結蘭膠添加群)各15μL。於單層培養群，各別添加只有10倍濃度之各增殖因子之培養基組成物15μL。繼續培養7日。對於第8日之培養液，添加ATP試藥150μL (CellTiter-Glo^TM Luminescent Cell Viability Assay,Promega公司製造)使懸濁，於室溫靜置約10分鐘後以FlexStation 3(Molecular Devices公司製造)測定發光強度(RLU值)，扣除只有培養基之發光值，測定活細胞數。

其結果明瞭藉由使用本發明中使用之培養基組成物之SKOV3細胞增殖試驗法，與單層培養法相比，人類HB-EGF及人類TGF-β 1呈現強的藥效。又，表1表示培養第8日之RLU值(ATP測定、發光強度)%之對照值。

(試驗例2：TGF-β阻礙劑在以TGF-β刺激之SKOV3細胞 的增殖作用中之效果)

將去醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA、三晶(股)公司製造)懸濁於超純水(Milli-Q水)使成為0.3%(w/v)後於90℃一邊加熱一邊攪拌，溶解之，將本水溶液於121℃進行高壓釜滅菌20分鐘。使用本溶液調製在含有15%(v/v)胎牛血清之MaCoy’s5a培養基(DS PHARMA BIOMEDICAL公司製造)中最終濃度為0.015%(w/v)之添加去醯化結蘭膠之培養基組成物或不含去醯化結蘭膠之未添加培養基組成物。接著，「去醯化結蘭膠/低黏合培養法」係藉由將人類卵巢癌細胞株SKOV3(DS PHARMA BIOMEDICAL公司製造)播種於添加上述去醯化結蘭膠之培養基組成物中，使成為37000細胞/mL後分注於96孔平底超低黏合表面微量盤(Corning公司製造，# 3474)之孔中，使每孔為135μL而實施。「單層培養法」係藉由將人類卵巢癌細胞株SKOV3播種於不含上述去醯化結蘭膠之培養基組成物中，使成為2200細胞/mL後分注於96孔平底微量盤(Corning公司製造，# 3585)之孔中，使每孔為135μL而實施。將各盤在CO₂保溫箱(37℃、5%CO₂)內以靜置狀態保溫。於培養第1日，各別添加10倍濃度之人類TGF-β 1(PEPROTECH公司製造)及為TGF-β受體阻礙劑之LY364947(Santa Cruz Biotechnology公司製造)使最終濃度為30ng/mL及最終濃度0.015%(w/v)之含有去醯化結蘭膠之培養基組成物(去醯化結蘭膠添加群)各15μL。於單層培養群，各別添加10倍濃度之只有人類TGF-β 1及LY364947之培養基組成物各15μL。繼續培養4日。 對於第5日之培養液，添加ATP試藥150μL(CellTiter-Glo^TM Luminescent Cell Viability Assay,Promega公司製造)使懸濁，於室溫靜置約10分鐘後以FlexStation 3(Molecular Devices公司製造)測定發光強度(RLU值)，扣除只有培養基之發光值，測定生細胞數。

其結果明瞭藉由使用本發明中使用之培養基組成物之SKOV3細胞增殖試驗法，可明確判斷阻礙劑對於藉由人類TGF-β 1刺激之細胞增殖之效果。另一方面，於單層培養，不能判斷阻礙劑之效果。表2表示單層培養第4日之RLU值(ATP測定、發光強度)，表3表示使用本發明培養基組成物培養第4日之RLU值(ATP測定、發光強度)。

(試驗例3：對於以各增殖因子刺激之A431細胞之增殖作用與單層培養法之比較)

將去醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA、三晶(股)公司製造)懸濁於超純水(Milli-Q水)使成為0.3%(w/v)後於90℃一邊加熱一邊攪拌，溶解之，將本水溶液於121℃進行高壓釜滅菌20分鐘。使用本溶液調製在含有10%(v/v)胎牛血清之EMEM培養基(DS PHARMA BIOMEDICAL公司製造)中最終濃度為0.015%(w/v)之添加去醯化結蘭膠之培養基組成物或不含去醯化結蘭膠之未添加培養基組成物。接著，將人類扁平上皮癌細胞株A431(DS PHARMA BIOMEDICAL公司製造)播種於添加上述去醯化結蘭膠之培養基組成物中，使成為37000細胞/mL後分注於96孔平底超低黏合表面微量盤(Corning公司製造，# 3474)之孔中，使每孔為135μL。單層培養法藉由將人類扁平上皮癌細胞株A431播種於不含上述去醯化結蘭膠之培養基組成物中，使成為2200 細胞/mL後分注於96孔平底微量盤(Corning公司製造，# 3585)之孔中，使每孔為135μL而實施。將各盤在CO₂保溫箱(37℃、5%CO₂)內以靜置狀態保溫。於培養第1日，各別添加10倍濃度之人類HB-EGF(PEPROTECH公司製造)使最終濃度為100ng/mL，10倍濃度之人類EGF(PEPROTECH公司製造)使最終濃度為10、30ng/mL，10倍濃度之人類bFGF(PEPROTECH公司製造)使最終濃度為30、100ng/mL，10倍濃度之人類TGF-β 1(PEPROTECH公司製造)使最終濃度為10、30ng/mL，10倍濃度之人類PDGF-BB(PEPROTECH公司製造)使最終濃度為1、10ng/mL，10倍濃度之人類IGF-1(PEPROTECH公司製造)使最終濃度為10、100ng/mL及最終濃度0.015%(w/v)之含有去醯化結蘭膠之培養基組成物(去醯化結蘭膠添加群)各15μL。於單層培養群，各別添加只有10倍濃度之各增殖因子之培養基組成物15μL。繼續培養7日。對於第8日之培養液，添加ATP試藥150μL(CellTiter-Glo^TM Luminescent Cell Viability Assay,Promega公司製造)使懸濁，於室溫靜置約10分鐘後以FlexStation 3(Molecular Devices公司製造)測定發光強度(RLU值)，扣除只有培養基之發光值，測定活細胞數。

其結果明瞭藉由使用本發明中使用之培養基組成物之A431細胞增殖試驗法，與單層培養法相比，人類HB-EGF、人類EGF、人類bFGF，人類TGF-β 1、人類IGF1呈現強的藥效。又，表4表示靜置培養第8日之RLU值(ATP測定、發光強度)%之對照值。

(試驗例4：在以人類HB-EGF刺激之SKOV3細胞之EMT標記表現與單層培養法之比較)

將去醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA、三晶(股)公司製造)懸濁於超純水(Milli-Q水)使成為0.3%(w/v)後於90℃一邊加熱一邊攪拌，溶解之，將本水溶液於121℃進行高壓釜滅菌20分鐘。使用本溶液調製在含有15%(v/v)胎牛血清 之MaCoy’s5a培養基(DS PHARMA BIOMEDICAL公司製造)中最終濃度為0.015%(w/v)之添加去醯化結蘭膠之培養基組成物或不含去醯化結蘭膠之未添加培養基組成物。接著，去醯化結蘭膠/低黏合培養法係藉由將人類卵巢癌細胞株SKOV3(DS PHARMA BIOMEDICAL公司製造)播種於添加上述去醯化結蘭膠之培養基組成物中，使成為37000細胞/mL後分注於96孔平底超低黏合表面微量盤(Corning公司製造，# 3474)之孔中，使每孔為135μL而實施。單層培養法藉由將人類卵巢癌細胞株SKOV3播種於不含上述去醯化結蘭膠之培養基組成物中，使成為7400細胞/mL後分注於96孔平底微量盤(Corning公司製造，# 3585)之孔中，使每孔為135μL而實施。將各盤在CO₂保溫箱(37℃、5%CO₂)內以靜置狀態保溫。於培養第1日，各別添加10倍濃度之人類HB-EGF(PEPROTECH公司製造)使最終濃度為30、100ng/mL，最終濃度0.015%(w/v)之含有去醯化結蘭膠之培養基組成物(去醯化結蘭膠添加群)及只有10倍濃度之人類HB-EGF之培養基組成物(單層培養群)各15μL，接著，繼續培養11日。於第12日回收含有癌細胞之培養液，以離心分離(400g，3分鐘)將細胞回收。使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司製造)從細胞中萃取總RNA。使用總RNA及PrimeScript^TM RT Master Mix(TAKARA BIO公司製造)，使用GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems公司製造)進行反轉錄反應，合成cDNA。PCR反應中使用之各cDNA試樣使用分注、以滅菌水稀釋為1/10者。又，校正 曲線中使用之試樣使用分注使混合之cDNA，以3倍公比在從1/3稀釋至1/243之定量範圍設定。PCR反應使用各cDNA試樣、檢量試樣、Premix Ex Taq^TM(TAKARA BIO公司製造)及各種Taqman探針(Applied Biosystems公司製造)，使用7500即時聚合酶連鎖反應系統(Real Time PCR System)(Applied Biosystems公司製造)實施。特異性將GAPDH(甘油醛3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase))之mRNA作為內在性對照，E-鈣黏蛋白及N-鈣黏蛋白mRNA之表現以GAPDH之值校正。以下表示使用之各探針(Applied Biosystems公司製造)。

GAPDH：HS99999905

E-鈣黏蛋白：HS01023894

N-鈣黏蛋白：HS00983056

其結果明瞭在使用本發明中使用之培養基組成物之SKOV3細胞，與單層培養法相比，E-鈣黏蛋白之表現量高、N-鈣黏蛋白之表現量低，認為與單層培養相比，為類上皮之形質高者。又，與單層培養相比，明瞭藉由人類HB-EGF，顯示強的降低E-鈣黏蛋白表現之效果及促進N-鈣黏蛋白表現之效果。表5表示於靜置培養第12日之E-鈣黏蛋白mRNA表現值，表6表示N-鈣黏蛋白mRNA表現值。

(試驗例5：TGF-β受體阻礙劑對於以人類TGF-β 1刺激之SKOV3細胞之E-鈣黏蛋白表現之效果)

將去醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA、三晶(股)公司製造)懸濁於超純水(Milli-Q水)使成為0.3%(w/v)後於90℃一邊加熱一邊攪拌，溶解之，將本水溶液於121℃進行高壓釜滅菌20分鐘。使用本溶液調製在含有15%(v/v)胎牛血清之MaCoy’s5a培養基(DS PHARMA BIOMEDICAL公司製造)中最終濃度為0.015%(w/v)之添加去醯化結蘭膠之培養基組成物或不含去醯化結蘭膠之未添加培養基組成物。去醯 化結蘭膠/低黏合培養法係藉由將人類卵巢癌細胞株SKOV3(DS PHARMA BIOMEDICAL公司製造)播種於添加上述去醯化結蘭膠之培養基組成物中，使成為37000細胞/mL後分注於96孔平底超低黏合表面微量盤(Corning公司製造，# 3474)之孔中，使每孔為135μL而實施。將各盤在CO₂使最終濃度為30ng/mL之方式保溫箱(37℃、5%CO₂)內以靜置狀態保溫。於培養第1日，各別添加10倍濃度之人類TGF-β 1(PEPROTECH公司製造)及為TGF-β受體阻礙劑之LY364947(Santa Cruz Biotechnology公司製造)及最終濃度0.015%(w/v)之含有去醯化結蘭膠之培養基組成物(去醯化結蘭膠添加群)各15μL，繼續培養11日。於第12日將含有癌細胞之培養液回收，以離心分離(400g、3分鐘)將細胞回收。使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司製造)從細胞中萃取總RNA。使用總RNA及PrimeScript^TM RT Master Mix(TAKARA BIO公司製造)，使用GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems公司製造)進行反轉錄反應，合成cDNA。PCR反應中使用之各cDNA試樣使用分注、以滅菌水稀釋為1/10者。又，校正曲線中使用之試樣使用分注使混合之cDNA，以3倍公比在從1/3稀釋至1/243之定量範圍設定。PCR反應使用各cDNA試樣、檢量試樣、Premix Ex Taq^TM(TAKARA BIO公司製造)及各種Taqman探針(Applied Biosystems公司製造)，使用7500即時聚合酶連鎖反應系統(Applied Biosystems公司製造)實施。特異性將GAPDH(甘油醛3-磷酸脫氫酶)之mRNA作為內在性對照，E-鈣黏蛋白 mRNA之表現以GAPDH之值校正。以下表示使用之各探針(Applied Biosystems公司製造)

GAPDH：HS99999905

E-鈣黏蛋白：HS01023894

其結果明瞭在使用本發明中使用之培養基組成物之SKOV3細胞，以人類TGF-β 1刺激，E-鈣黏蛋白之表現量降低。另，對於藉由人類TGF-β 1之表現降低，LY364947顯示濃度依存之抑制作用。表7表示靜置培養第12日之E-鈣黏蛋白mRNA表現值。

(試驗例6：選擇性阻礙劑對於以人類HB-EGF刺激之Panc02,03細胞增殖之效果)

將去醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA、三晶(股)公司製造)懸濁於超純水(Milli-Q水)使成為0.3%(w/v)後於90℃一邊加熱一邊攪拌，溶解之，將本水溶液於121℃進行高壓釜滅菌20分鐘。使用本溶液調製在含有10%(v/v)胎牛血清 之DMEM培養基(WAKO公司製造)中最終濃度為0.015%(w/v)之添加去醯化結蘭膠之培養基組成物或不含去醯化結蘭膠之未添加培養基組成物。去醯化結蘭膠/低黏合培養法係藉由將人類胰臟癌細胞株Panc02,03(ATCC公司製造)播種於添加上述去醯化結蘭膠之培養基組成物中，使成為37000細胞/mL後分注於96孔平底超低黏合表面微量盤(Corning公司製造，# 3474)之孔中，使每孔為135μL而實施。將各盤在CO₂保溫箱(37℃、5%CO₂)內以靜置狀態保溫。於培養第1日，使最終濃度為100ng/mL之方式各別添加10倍濃度之人類HB-EGF(PEPROTECH公司製造)、為EGF受體阻礙劑之吉非替尼(Gefitinib)、為TGF-β受體阻礙劑之LY364947、為c-kit/FGF受體-3阻礙劑之馬賽替尼(Masitinib)(均為Santa Cruz Biotechnology公司製造)及最終濃度0.015%(w/v)之含有去醯化結蘭膠之培養基組成物(去醯化結蘭膠添加群)各15μL，繼續培養10日。對於第11日之培養液，添加ATP試藥150μL(CellTiter-Glo^TM Luminescent Cell Viability Assay,Promega公司製造)使懸濁，於室溫靜置約10分鐘後以FlexStation 3(Molecular Devices公司製造)測定發光強度(RLU值)，扣除只有培養基之發光值，測定活細胞數。

其結果確認使用本發明中使用之培養基組成物，藉由為EGF受體之活體配體之人類HB-EGF刺激，Panc02,03細胞之增殖亢進作用明確。又，明瞭該增殖亢進作用被為EGF受體阻礙劑之吉非替尼抑制。表8表示於 靜置培養第11日，在HB-EGF添加條件之RLU值(ATP測定、發光強度)。

(試驗例7：EGF受體阻礙劑對於以人類HB-EGF刺激之SKOV3細胞增殖及E-鈣黏蛋白表現之選擇性確認試驗)

將去醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA、三晶(股)公司製造)懸濁於超純水(Milli-Q水)使成為0.3%(w/v)後於90℃一邊加熱一邊攪拌，溶解之，將本水溶液於121℃進行高壓 釜滅菌20分鐘。使用本溶液調製在含有15%(v/v)胎牛血清之MaCoy’s5a培養基(DS PHARMA BIOMEDICAL公司製造)中最終濃度為0.015%(w/v)之添加去醯化結蘭膠之培養基組成物或不含去醯化結蘭膠之未添加培養基組成物。接著，去醯化結蘭膠/低黏合培養法係藉由將人類卵巢癌細胞株SKOV3(DS PHARMA BIOMEDICAL公司製造)播種於添加上述去醯化結蘭膠之培養基組成物中，使成為37000細胞/mL後分注於96孔平底超低黏合表面微量盤(Corning公司製造，# 3474)之孔中，使每孔為135μL而實施。將各盤在CO₂保溫箱(37℃、5%CO₂)內以靜置狀態保溫。於培養第1日，使最終濃度為100ng/mL之方式各別添加10倍濃度之人類HB-EGF(PEPROTECH公司製造)、為EGF受體阻礙劑之吉非替尼、為TGF-β受體阻礙劑之LY364947、為c-kit/FGF受體-3阻礙劑之馬賽替尼(均為Santa Cruz Biotechnology公司製造)及最終濃度0.015%(w/v)之含有去醯化結蘭膠之培養基組成物(去醯化結蘭膠添加群)各15μL，繼續培養11日。對於第5日之培養液，添加ATP試藥150μL(CellTiter-Glo^TM Luminescent Cell Viability Assay,Promega公司製造)使懸濁，於室溫靜置約10分鐘後以FlexStation 3(Molecular Devices公司製造)測定發光強度(RLU值)，扣除只有培養基之發光值，測定活細胞數。又，於第12日回收含有癌細胞之培養液，以離心分離(400g，3分鐘)將細胞回收。使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司製造)從細胞中萃取總RNA。使用總RNA及PrimeScript^TM RT Master Mix(TAKARA BIO公司製造)，使用GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems公司製造)進行反轉錄反應，合成cDNA。PCR反應中使用之各cDNA試樣使用分注、以滅菌水稀釋為1/10者。又，校正曲線中使用之試樣使用分注使混合之cDNA，以3倍公比在從1/3稀釋至1/243之定量範圍設定。PCR反應使用各cDNA試樣、檢量試樣、Premix Ex Taq^TM(TAKARA BIO公司製造)及各種Taqman探針(Applied Biosystems公司製造)，使用7500即時聚合酶連鎖反應系統(Applied Biosystems公司製造)實施。特異性將GAPDH(甘油醛3-磷酸脫氫酶)之mRNA作為內在性對照，E-鈣黏蛋白mRNA之表現以GAPDH之值校正。以下表示使用之各探針(Applied Biosystems公司製造)。

GAPDH：HS99999905

E-鈣黏蛋白：HS01023894

其結果確認使用本發明中使用之培養基組成物，藉由為EGF受體之生體配體之人類HB-EGF刺激，SKOV3細胞之增殖亢進作用明確。該增殖亢進作用以為EGF受體阻礙劑之吉非替尼選擇性抑制。另，以人類HB-EGF之刺激，E-鈣黏蛋白之表現量降低。對於藉由人類HB-EGF表現降低，為EGF受體阻礙劑之吉非替尼雖顯示抑制效果，惟，對於其他受體之阻礙劑未確認抑制效果。表9表示於靜置培養第5日，以HB-EGF添加條件之RLU值(ATP測定、發光強度)。又，表10表示於靜置培養第12日之E-鈣黏蛋白mRNA表現值。

(試驗例8：TGF-β 1受體阻礙劑對於以人類TGF-β 1刺激之SKOV3細胞E-鈣黏蛋白表現之選擇性確認試驗)

將去醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA、三晶(股)公司製造)懸濁於超純水(Milli-Q水)使成為0.3%(w/v)後於90℃一邊加熱一邊攪拌，溶解之，將本水溶液於121℃進行高壓釜滅菌20分鐘。使用本溶液調製在含有15%(v/v)胎牛血清之MaCoy’s5a培養基(DS PHARMA BIOMEDICAL公司製造) 中最終濃度為0.015%(w/v)之添加去醯化結蘭膠之培養基組成物或不含去醯化結蘭膠之未添加培養基組成物。接著，去醯化結蘭膠/低黏合培養法係藉由將人類卵巢癌細胞株SKOV3(DS PHARMA BIOMEDICAL公司製造)播種於添加上述去醯化結蘭膠之培養基組成物中，使成為37000細胞/mL後分注於96孔平底超低黏合表面微量盤(Corning公司製造，# 3474)之孔中，使每孔為135μL而實施。將各盤在CO₂保溫箱(37℃、5%CO₂)內以靜置狀態保溫。於培養第1日，使最終濃度為100ng/mL之方式各別添加10倍濃度之人類TGF-β 1(PEPROTECH公司製造)、為EGF受體阻礙劑之吉非替尼、為TGF-β受體阻礙劑之LY364947、為c-kit/FGF受體-3阻礙劑之馬賽替尼(均為Santa Cruz Biotechnology公司製造)及最終濃度0.015%(w/v)之含有去醯化結蘭膠之培養基組成物(去醯化結蘭膠添加群)各15μL，繼續培養11日。於第12日回收含有癌細胞之培養液，以離心分離(400g，3分鐘)將細胞回收。使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司製造)從細胞中萃取總RNA。使用總RNA及PrimeScript^TM RT Master Mix(TAKARA BIO公司製造)，使用GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems公司製造)進行反轉錄反應，合成cDNA。PCR反應中使用之各cDNA試樣使用分注、以滅菌水稀釋為1/10者。又，校正曲線中使用之試樣使用分注使混合之cDNA，以3倍公比在從1/3稀釋至1/243之定量範圍設定。PCR反應使用各cDNA試樣、檢量試樣、Premix Ex Taq^TM(TAKARA BIO公司 製造)及各種Taqman探針(Applied Biosystems公司製造)，使用7500即時聚合酶連鎖反應系統(Applied Biosystems公司製造)實施。特異性將GAPDH(甘油醛3-磷酸脫氫酶)之mRNA作為內在性對照，E-鈣黏蛋白mRNA之表現以GAPDH之值補正。以下表示使用之各探針(Applied Biosystems公司製造)。

GAPDH：HS99999905

E-鈣黏蛋白：HS01023894

其結果明瞭使用本發明中使用之培養基組成物，以人類TGF-β 1之刺激，E-鈣黏蛋白之表現量降低。另，為TGF-β 1受體阻礙劑之吉非替尼雖選擇性抑制，惟，對於其他受體，看不到阻礙劑之抑制效果。表11表示於靜置培養第12日之E-鈣黏蛋白mRNA表現值。

(試驗例9：分子標靶藥對於以人類HB-EGF刺激之SKOV3細胞增殖及E-鈣黏蛋白表現之效果)

將去醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA、三晶(股)公司製造)懸濁於超純水(Milli-Q水)使成為0.3%(w/v)後於90℃一邊加熱一邊攪拌，溶解之，將本水溶液於121℃進行高壓釜滅菌20分鐘。使用本溶液調製在含有15%(v/v)胎牛血清之MaCoy’s5a培養基(DS PHARMA BIOMEDICAL公司製造)中最終濃度為0.015%(w/v)之添加去醯化結蘭膠之培養基 組成物或不含去醯化結蘭膠之未添加培養基組成物。接著，去醯化結蘭膠/低黏合培養法係藉由將人類卵巢癌細胞株SKOV3(DS PHARMA BIOMEDICAL公司製造)播種於添加上述去醯化結蘭膠之培養基組成物中，使成為37000細胞/mL後分注於96孔平底超低黏合表面微量盤(Corning公司製造，# 3474)之孔中，使每孔為135μL而實施。將各盤在CO₂保溫箱(37℃、5%CO₂)內以靜置狀態保溫。於培養第1日，使最終濃度為100ng/mL之方式各別添加10倍濃度之人類HB-EGF(PEPROTECH公司製造)、為EGF受體阻礙劑之吉非替尼、為MEK阻礙劑之曲美替尼(Trametinib)、為Akt阻礙劑之MK-2206、為JAK阻礙劑之Cyt387(均為Santa Cruz Biotechnology公司製造)及最終濃度0.015%(w/v)之含有去醯化結蘭膠之培養基組成物(去醯化結蘭膠添加群)各15μL，繼續培養11日。對於第7日之培養液，添加ATP試藥150μL(CellTiter-Glo^TM Luminescent Cell Viability Assay,Promega公司製造)使懸濁，於室溫靜置約10分鐘後以FlexStation 3(Molecular Devices公司製造)測定發光強度(RLU值)，扣除只有培養基之發光值，測定活細胞數。又，於第12日回收含有癌細胞之培養液，以離心分離(400g，3分鐘)將細胞回收。使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司製造)從細胞中萃取總RNA。使用總RNA及PrimeScript^TM RT Master Mix(TAKARA BIO公司製造)，使用GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems公司製造)進行反轉錄反應，合成cDNA。將合成之cDNA分注，以滅菌 水稀釋為1/10，於PCR中使用。將合成之cDNA分注、混合，於校正曲線作成中使用。以3倍公比在從1/3稀釋至1/243之定量範圍設定。使用各cDNA試樣、檢量試樣、Premix Ex Taq^TM(TAKARA BIO公司製造)及各種Taqman探針(Applied Biosystems公司製造)，使用7500即時聚合酶連鎖反應系統(Applied Biosystems公司製造)實施PCR。特異性將GAPDH(甘油醛3-磷酸脫氫酶)之mRNA作為內在性對照，E-鈣黏蛋白mRNA之表現以GAPDH之值校正。以下表示使用之各探針(Applied Biosystems公司製造)。

GAPDH：HS99999905

E-鈣黏蛋白：HS01023894

其結果確認使用本發明之培養基組成物，藉由為EGF受體之活體配體之人類HB-EGF刺激，SKOV3細胞之增殖亢進作用明確。又，明瞭為Akt阻礙劑之MK-2206選擇性抑制該增殖亢進作用。另一方面，曲美替尼顯示弱的抑制作用，Cyt387未看到抑制效果。另，明瞭以人類HB-EGF之刺激，E-鈣黏蛋白之表現量降低。惟，對於藉由人類HB-EGF，E-鈣黏蛋白表現降低，3種阻礙劑未看到抑制效果。表12表示於靜置培養第7日，以HB-EGF添加條件之RLU值(ATP測定、發光強度)。又，表13表示於靜置培養第12日之E-鈣黏蛋白mRNA表現值。

[產業上利用之可能性]

藉由本發明可以高感度檢出癌細胞在轉形增殖因子、類胰島素增殖因子及纖維母細胞增殖因子之反應性。因此，本發明之方法在篩選阻礙該等增殖因子之抗癌劑有用。

若使用本發明之方法，與單層培養比較，癌腫細胞之類上皮系形質可良好維持。又，若使用本發明之方法，由於可將癌腫細胞之上皮間質轉換在體外可良好重現，在阻 礙上皮間質轉換之抗癌劑的篩選為有用。

此處敍述之記載於包含專利、專利申請說明書及科學文獻所有刊物中之內容於此引用，以與所有明示相同程度編入於本說明書中。

本專利申請以於日本提出專利申請之特願2014-195814(申請日：2014年9月2日)為基礎，其內容全包含於本說明書中。

Claims (23)

1. 一種黏合性癌細胞之培養方法，該黏合性癌細胞係對選自由轉形增殖因子、類胰島素增殖因子及纖維母細胞增殖因子所成群組之任一種增殖因子具有反應性者，該培養方法包含：將對選自由轉形增殖因子、類胰島素增殖因子及纖維母細胞增殖因子所成群組之任一種增殖因子具有反應性之黏合性癌細胞，在含有該增殖因子及可使細胞或組織懸浮、培養之構造體之培養基組成物中進行懸浮培養。
2. 如申請專利範圍第1項所述之培養方法，其中，該增殖因子為轉形增殖因子。
3. 如申請專利範圍第2項所述之培養方法，其中，該轉形增殖因子為TGF-β 1者。
4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之培養方法，其中，上述構造體含有去醯化結蘭膠(gellan gum)。
5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述之培養方法，其中，該培養基組成物於37℃之黏度在8mPa．s以下。
6. 一種試驗黏合性癌細胞對增殖因子之反應性之方法，該增殖因子為選自由轉形增殖因子、類胰島素增殖因子及纖維母細胞增殖因子所成群組之任一種者，該方法包含：(1)將黏合性癌細胞在該增殖因子存在下及不存在下，在含有可使細胞或組織懸浮、培養之構造體之培養 基組成物中懸浮培養；(2)測定經培養之癌細胞之增殖；及(3)比較在該增殖因子存在下培養之癌細胞之增殖與該增殖因子不存在下之增殖。
7. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中，上述構造體為含有去醯化結蘭膠。
8. 如申請專利範圍第6項或第7項所述之方法，其中，該培養基組成物於37℃之黏度在8mPa．s以下。
9. 一種針對黏合性癌細胞之抗癌劑篩選方法，該黏合性癌細胞為對選自由轉形增殖因子、類胰島素增殖因子及纖維母細胞增殖因子所成群組之任一種增殖因子具有反應性者，該篩選方法包含(1)在被檢物質存在下及不存在下，將該癌細胞在含有該增殖因子及可使細胞或組織懸浮、培養之構造體之培養基組成物中懸浮培養；(2)測定經培養之癌細胞之增殖；及(3)比較在被檢物質存在下培養之癌細胞之增殖與被檢物質不存在下之增殖。
10. 如申請專利範圍第9項所述之篩選方法，其中，上述構造體含有去醯化結蘭膠。
11. 如申請專利範圍第9項或第10項所述之篩選方法，其中，該培養基組成物於37℃之黏度在8mPa．s以下。
12. 一種癌腫細胞之類上皮系形質之維持方法，包含：將該癌腫細胞在含有可使細胞或組織懸浮、培養之構造體之 培養基組成物中懸浮培養。
13. 如申請專利範圍第12項所述之維持方法，其中，上述構造體含有去醯化結蘭膠。
14. 如申請專利範圍第12項或第13項所述之維持方法，其中，該培養基組成物於37℃之黏度在8mPa．s以下。
15. 一種癌腫細胞之上皮間質轉換之誘導方法，包含：將具有類上皮系形質之癌腫細胞在含有上皮間質轉換誘導因子及可使細胞或組織懸浮、培養之構造體之培養基組成物中懸浮培養。
16. 如申請專利範圍第15項所述之誘導方法，其中，上述構造體含有去醯化結蘭膠。
17. 如申請專利範圍第15項或第16項所述之誘導方法，其中，該培養基組成物於37℃之黏度在8mPa．s以下。
18. 一種篩選方法，為誘導癌腫細胞之上皮間質轉換之物質的篩選方法，包含：(1)在被檢物質存在下及不存在下，將具有類上皮系形質之癌腫細胞在含有可使細胞或組織懸浮、培養之構造體之培養基組成物中懸浮培養；(2)評估經培養之癌腫細胞之上皮間質轉換；及(3)比較在被檢物質存在下培養之癌腫細胞之上皮間質轉換與被檢物質不存在下之上皮間質轉換。
19. 如申請專利範圍第18項所述之篩選方法，其中，上述構造體含有去醯化結蘭膠。
20. 如申請專利範圍第18項或第19項所述之篩選方法，其 中，該培養基組成物於37℃之黏度在8mPa．s以下。
21. 一種篩選方法，為阻礙癌腫細胞之上皮間質轉換之物質的篩選方法，包含：(1)在被檢物質存在下及不存在下，將具有類上皮系形質之癌腫細胞在含有上皮間質轉換誘導因子及可使細胞或組織懸浮、培養之構造體之培養基組成物中懸浮培養；(2)評估經培養之癌腫細胞之上皮間質轉換；及(3)比較在被檢物質存在下培養之癌腫細胞之上皮間質轉換與被檢物質不存在下之上皮間質轉換。
22. 如申請專利範圍第21項所述之篩選方法，其中，上述構造體含有去醯化結蘭膠。
23. 如申請專利範圍第21項或第22項所述之篩選方法，其中，該培養基組成物於37℃之黏度在8mPa．s以下。