TW201605886A - 作爲治療標靶的ｍｉｆ - Google Patents

Abstract

本發明係關於MIF相關疾患中涉及MIF之特異性結構更改之認知，提供一種用於MIF相關疾患之治療及預防的新方法，以及其他特定的醫學應用，例如監測疾病進展、藥物篩選及診斷套組之診斷分析與各別用途。

Description

作為治療標靶的MIF

本發明係關於特異性形式的MIF蛋白質在藥物中之應用。本發明係基於以下認知：MIF之位置81之修飾決定MIF向其疾病相關狀態之轉換。

巨噬細胞遷移抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor；MIF)為最初基於其抑制結核菌素過敏性天竺鼠之腹膜滲出細胞(含有巨噬細胞)之試管內隨機遷移之能力分離的細胞激素(Bloom等人Science 1966,153,80-2；David等人PNAS 1966,56,72-7)。現今，已知MIF為發揮廣譜活性之先天性與後天性免疫反應之關鍵上游調節劑。

人類MIF cDNA選殖於1989年(Weiser等人，PNAS 1989,86,7522-6)，且其基因組定位映射至染色體22。人類MIF基因之產物為具有114個胺基酸(在N端甲硫胺酸裂解之後)及約12.5kDa之表觀分子質量之蛋白質。MIF不具有與任何其他蛋白質的顯著序列同源性。蛋白質以相同次單位之三聚體形式結晶。各單體含有對4股β片進行封裝之兩個反向平行α-螺旋。該單體具有額外兩個與鄰近次單位之β片相互作用之β股以形成單體之間的連接。三個次單位經排列以形成含有沿著分子3倍軸線穿過蛋白質中心之溶劑可進入通道之圓筒(Sun等人PNAS 1996,93,5191-5196)。

據報導，自巨噬細胞分泌MIF係在極低濃度之糖皮質激素 下誘發(Calandra等人Nature 1995,377,68-71)。然而，MIF亦反調節糖皮質激素之效應且刺激諸如腫瘤壞死因子TNF-α及介白素IL-1 β之其他細胞激素之分泌(Baugh等人，Crit Care Med 2002,30,S27-35)。亦展示例如MIF展現促血管生成、促增殖及抗細胞凋亡特性，從而促進腫瘤細胞生長(Mitchell,R.A.,Cellular Signalling,2004.16(1)：第13-19頁；Lue,H.等人，Oncogene 2007.26(35)：第5046-59頁)。其亦例如與淋巴瘤、黑色素瘤及結腸癌之生長直接相關(Nishihira等人J Interferon Cytokine Res.2000,20：751-62)。

MIF為許多病理性病狀(亦即，MIF相關疾患)之介體且因 此與包括尤其發炎性腸道疾病(inflammatory bowel disease；IBD)、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis；RA)、急性呼吸窘迫症候群(acute respiratory distress syndrome；ARDS)、哮喘、絲球體腎炎、IgA腎病、心肌梗塞(myocardial infarction；MI)、敗血症及癌症(但不限於此)之各種疾病相關，且MIF亦介導許多其他MIF相關疾患。

已研發針對重組人類MIF之多株及單株抗MIF抗體(Shimizu 等人，FEBS Lett.1996；381,199-202；Kawaguchi等人，Leukoc.Biol.1986,39,223-232及Weiser等人，Cell.Immunol.1985,90,167778)。

已推薦抗MIF抗體用於治療用途。Calandra等人，(J.Inflamm. (1995)；47,39-51)據報導使用抗MIF抗體保護動物免於實驗上誘發的革蘭氏陰性(gram-negative)及革蘭氏陽性(gram-positive)敗血性休克。推薦抗MIF抗體作為調控敗血性休克及其他發炎性疾病狀態中之細胞激素產生之治療手段。

US 6,645,493揭示來源於融合瘤細胞之單株抗MIF抗體，其 中和MIF之生物活性。在動物模型中可展示，此等來源於小鼠之抗MIF抗體在內毒素誘發的休克之治療方面具有有益效果。

US 200310235584揭示在已純合子地剔除MIF基因之動物中 製備針對MIF之高親和力抗體之方法。

糖基化抑制因子(Glycosylation-inhibiting factor；GIF)為由 Galat等人(Eur.J.Biochem,1994,224,417-21)描述之蛋白質。現認為MIF與GIF為相同的。Watarai等人(PNAS 2000,97,13251-6)描述結合至不同GIF抗原決定基以辨別Ts細胞中的GIF之轉譯後修飾之生物化學性質之多株抗體。Watarai等人(前述)報導GIF在試管內以不同構形同功異構物形式出現。根據Watarai等人，一種同功異構物藉由單一半胱胺酸殘基(亦即半胱胺酸60)之化學修飾而出現，其出現在抑制T(Ts)細胞中且根據Watarai等人，產生GIF之生物活性形式。

歷經過去數十年，已展示，MIF為參與眾多不同相互作用之 分子。WO2013/050453揭示可在(MIF相關)疾患發作之後，例如在體液樣本中或在細胞或細胞表面上偵測到MIF氧化形式(oxidised form of MIF；oxMIF)且彼oxMIF與疾病狀態及/或疾病進展相關。特異性針對疾病相關、氧化形式之MIF之抗體(oxMIF特異性抗體)為已知的。然而，需要更多關於MIF相關疾患中涉及MIF之資訊以便進一步改進MIF相關疾患之治療與預防及相關醫學應用。

本發明藉由揭露MIF自非病原性向疾病相關狀態之轉換， 亦即自redMIF向oxMIF之氧化還原轉換與位置81之修飾的存在相關且受位置81之修飾的存在促進來實現此目標。疾病相關、氧化形式之MIF(oxMIF)藉由oxMIF特異性抗體(亦即相較於與疾病不特別相關之redMIF優先結合至oxMIF之抗體)之結合來定義。本發明人已展示在位置81(半胱胺酸81)處藉由用硫氫基反應劑處理的MIF之修飾誘導此類oxMIF特異性抗體之結合。相比之下，當野生型半胱胺酸81突變為絲胺酸(其與半胱胺酸等排但不受硫氫基反應劑修飾)時，藉由硫氫基反應劑處理確實不誘導oxMIF特異性抗體之結合。本發明人已因此在MIF位置81之修飾與MIF相關疾患中涉及的蛋白質之oxMIF構形之間建立明顯的聯繫。

人類MIF之序列由SEQ ID NO：15表示。

本發明因此提供攜帶81處的修飾之MIF作為MIF相關疾患之治療或預防之標靶之用途。

本發明因此係關於在有需要之個體中治療或預防疾病狀態或疾病進展之治療方法，其藉由向該個體投予有效量之以下化合物來

(a)防止在位置81處的MIF之修飾，或(b)與不含有位置81之修飾之MIF相比，優先結合至攜帶該位置81處的修飾之MIF。

該優先結合化合物可為抗體或包含抗體之抗原結合部分之分子，及/或該優先結合化合物可誘導與在該化合物不存在下該經修飾之MIF相比在更小程度上結合抗體RAM0、RAB0、RAM9或RAB9(或任何其他oxMIF特異性抗體，例如選自本文所揭示之oxMIF特異性抗體)之形式的該經修飾之MIF。

本文中，提及「在位置81處的MIF之修飾」或「在位置81 處修飾之MIF」或「攜帶位置81處的修飾之MIF」及其類似者可藉由提及「經修飾之MIF」簡化。此類修飾在整個本申請案中及在所有具體實例中係指MIF藉以呈其修飾形式或狀態結合至抗體RAM9(及/或RAB9、RAM0、RAB0，及/或任何其他oxMIF特異性抗體，例如選自以下本文所揭示之oxMIF特異性抗體中之任一者)之MIF之修飾。

通常，由於MIF之位置81為半胱胺酸，所以此類對經修飾 之MIF的提及可與例如「攜帶半胱胺酸81處的修飾之MIF」及其類似者或「經半胱胺酸81修飾之MIF」(或等效地經C81修飾之MIF)互換使用。

較佳地，本文中，修飾(特定言之在MIF位置81處)可為 與未經修飾之半胱胺酸殘基相比或與自由半胱胺酸硫氫基相比之修飾。亦即，特定言之，在MIF位置81處的修飾可為MIF半胱胺酸81之修飾且較佳為在半胱胺酸81之硫原子上的修飾。亦即，如本文中所描述，若本文中提及攜帶修飾之MIF位置81，則較佳地MIF半胱胺酸81攜帶與未經修飾之半胱胺酸相比之修飾，或更佳地半胱胺酸81之硫原子攜帶與自由半胱胺酸硫氫基相比之修飾。

修飾不涵蓋僅藉由氧替代半胱胺酸硫原子，亦即僅半胱胺酸 81突變為絲胺酸。本文中，半胱胺酸殘基之硫氫基之修飾係指硫氫基之衍生作用，亦即硫氫基衍生化。亦即，半胱胺酸殘基之硫原子攜帶與半胱胺酸之自由硫氫基相比之修飾，亦即將半胱胺酸之硫原子連接至除H以外的部分(亦即修飾部分)。

本發明亦涵蓋一種監測MIF相關疾患之治療的有效性之方 法，其包含在於該治療之前及之後自個體分離的樣本中測定MIF位置81是否攜帶修飾之步驟，其中若治療後與治療前相比MIF位置81之修飾的程度較小，則該治療鑑定為有效的。

本發明亦提供一種分析一測試化合物是否優先結合至在位 置81處經修飾之形式的MIF之方法，該方法包含以下步驟

(a)在位置81處修飾MIF以獲得經半胱胺酸81修飾之MIF，(b)在測試樣本中及在其中MIF於位置81處未經修飾之對照樣本中組合待測試的化合物與該經修飾之MIF，(c)評估該測試樣本中及該對照樣本中之該化合物與該經修飾之MIF之結合

其中，若該化合物在該測試樣本中與在該對照樣本中相比在更大程度上結合至該經修飾之MIF，則選擇該化合物。

舉例而言，若該化合物在測試樣本中與對照樣本相比優先或以不同方式結合至經修飾之MIF，則可選擇該化合物。舉例而言，若該化合物在測試樣本中與在對照樣本中相比以更大親和力結合至經修飾之MIF，則可選擇該化合物。

在本文所揭示之根據本發明之方法中，測試化合物可(但不限於)較佳為抗體或包含抗體之抗原結合部分之分子。

本發明亦提供一種篩選防止在半胱胺酸81處的MIF之修飾之化合物之方法，該方法包含以下步驟

(a)在測試樣本中組合MIF與待測試的化合物，(b)在含有該化合物之該測試樣本中及在該化合物不存在之對照樣本 中藉由硫氫基反應試劑在該試劑至少在該對照樣本中修飾MIF之半胱胺酸81之硫氫基的條件下處理MIF，(c)評估藉由硫氫基反應試劑之半胱胺酸81之修飾，其中若該硫氫基反應試劑在該測試樣本中與在該對照樣本中相比半胱胺酸81之修飾的程度較小，則選擇該化合物。

本發明亦提供一種分析測試化合物對在位置81處經修飾之MIF的構形影響之方法，該方法包含以下步驟

(a)提供含有在位置81處經修飾之MIF之測試樣本，(b)在該測試樣本中組合測試化合物與該經修飾之MIF，(c)評估與位置81攜帶修飾之MIF的構形(i)(對照組1)及在位置81處含有未經修飾之半胱胺酸殘基之MIF的構形(ii)(對照組2)相比的該測試樣本中之經修飾之MIF的構形，其中若該構形評估指示與構形(i)相比該測試樣本中的經修飾之MIF的構形與構形(ii)具有可偵測的相似性程度，或若該構形評估指示該測試樣本中的經修飾之MIF的構形以其他方式可偵測地自構形(i)偏離，則選擇該化合物。

MIF之構形可藉由免疫分析評估。有利地，免疫分析採用選自RAM0、RAB0、RAM9及RAB9(及/或任何其他oxMIF特異性抗體，例如選自本文所揭示之oxMIF特異性抗體)之抗體，且若測試樣本(亦即在測試化合物存在下)中的經修飾之MIF與在該化合物不存在下的該經修飾之MIF(對照組1)相比在更小程度上結合抗體，則選擇該化合物。

較佳地，在「對照組1」之情況下的MIF位置81之修飾與 測試樣本中相同。

通常，在根據本發明之方法中，MIF之構形可藉由任何對 MIF中的構形變化敏感之方法評估，該變化視位置81處的MIF之修飾的存在、特定言之MIF半胱胺酸81之修飾的存在或不存在、特定言之位置81處的MIF之硫原子而定。舉例而言，MIF之構形可藉由例如使用一或多種如本文中所描述的構形敏感抗MIF抗體之免疫分析評估，亦即該等抗體之結合視MIF位置81之修飾狀態而定。例如，如本文中所描述，位置81之修飾之存在及/或不存在可藉由構形敏感位置-81-修飾-選擇性抗體(及/或構形-選擇性半胱胺酸81硫氫基-特異性抗體)之結合來評估。舉例而言，構形可藉由ELISA或表面電漿子共振來評估。

在其他具體實例中，構形可藉由X射線晶體學分析來評估。 構形可例如亦藉由核磁共振(nuclear magnetic resonance；NMR)分析或藉由圓二色性來評估。

根據上文，本發明亦提供一種分析測試化合物對在位置81 處經修飾之MIF的構形影響之方法，該方法包含以下步驟

(a)提供含有在位置81處經修飾之MIF之測試樣本，(b)在該測試樣本中組合測試化合物與該經修飾之MIF，(c)評估該測試樣本中的經修飾之MIF與選自RAM0、RAB0、RAM9及RAB9及/或任何其他oxMIF特異性、oxMIF構形敏感抗體(例如選自本文所揭示之oxMIF特異性抗體)之結合，使其與(i)在測試化合物不存在下，MIF半胱胺酸81之硫原子攜帶與自由半胱胺酸硫氫基相比之修飾之MIF(對照組1)相比， 其中若該測試樣本(亦即在測試化合物存在下)中的經修飾之MIF與在該化合物不存在下的該經修飾之MIF(對照組1)相比在更小程度上結合抗體，則選擇該化合物。

本發明亦提供一種藉由X射線晶體學分析用於結合至修飾形式的MIF之測試化合物之方法，該方法包含以下步驟

(a)在位置81處修飾MIF以獲得經修飾之MIF，(b)藉由在該測試化合物存在下結晶該經修飾之MIF或藉由結晶該經修飾之MIF且隨後使該測試化合物與該經修飾之MIF的晶體接觸來提供該經修飾之MIF的晶體，及(c)使用該等晶體測定MIF之三維結構。

視情況，相同X射線晶體學方法可涵蓋藉由相同測試化合物但藉由其中位置81未經修飾之MIF另外地進行該結晶與該結構測定步驟。

本發明亦提供含有具有位置81之修飾之MIF之晶體。該晶體可視情況進一步含有另一化合物，例如測試化合物，例如與該經修飾之MIF之結合為待評估的測試化合物。

本文中，一種例如用於結合至在位置81處經修飾之MIF之化合物(例如用於治療或診斷方法之化合物或待分析的測試化合物)為不受特定限制的，但可例如為小分子，有機分子，小於1000Da、小於500Da之分子或任何形式之結合至MIF(尤其至其位置81修飾之形式)的抗體或抗體衍生物(例如Fab片段或包含抗體之抗原結合部分之任何分子)。

本發明亦提供MIF蛋白質之位置81作為診斷標記及/或用於 監測MIF相關疾患之用途。特定言之，本發明提供MIF蛋白質之位置81之修飾狀態作為診斷標記及/或用於監測MIF相關疾患之用途。

本發明提供一種診斷MIF相關疾患之方法，其包含在自個 體分離的樣本中測定MIF位置81是否攜帶修飾之步驟，其中，若MIF位置81被識別為攜帶此類修飾，則診斷該個體患有MIF相關疾患。亦即，MIF位置81攜帶此類修飾之發現指示MIF相關疾患。

本發明提供一種診斷MIF相關疾患之方法，其包含在自個 體分離的樣本中測定MIF半胱胺酸81之硫原子與自由半胱胺酸硫氫基相比是否攜帶修飾之步驟，其中，若MIF半胱胺酸81之硫原子被識別為攜帶該種修飾，則診斷該個體具有MIF相關疾患。亦即，半胱胺酸81之硫原子攜帶該種修飾之發現指示MIF相關疾患。

本發明提供MIF位置81之修飾狀態作為診斷標記之用途， 其中MIF位置81攜帶修飾之發現指示MIF相關疾患。

本發明提供MIF半胱胺酸81之硫氫基之修飾狀態作為診斷 標記之用途，其中MIF半胱胺酸81之硫原子與自由半胱胺酸硫氫基相比攜帶修飾之發現指示MIF相關疾患。

根據本發明之該等方法及用途涵蓋測定給定疾患或病理性 病狀是否涉及經修飾之MIF或與經修飾之MIF相關之方法及用途。

本發明亦提供根據本發明之方法或用途中的診斷套組之用 途，其中該診斷套組包含優先結合至其中半胱胺酸81存在之MIF或結合至攜帶位置81處的修飾之MIF(亦即，特定言之，在半胱胺酸81之硫原子上)之化合物。該種套組可另外包含緩衝劑、對照試劑(例如重組其中半胱胺 酸81存在或不存在之MIF或具有或不具有修飾位置81之MIF，例如半胱胺酸81之硫原子上的修飾、優先結合至任何該等形式的MIF之化合物)、多株抗MIF抗體及/或結合偵測抗體。

本文中，「MIF相關疾患」表述涵蓋例如(MIF相關)疾病、(MIF相關)疾病狀態、(MIF相關)疾病之進展的狀態。

在根據本發明之篩選或分析測試化合物之方法及晶體之某些具體實例中，選擇性地修飾位置81(例如MIF半胱胺酸81之硫氫基)。亦即，MIF實質上未藉由相同修飾部分在其他位置處修飾，或特定言之，MIF實質上未藉由相同修飾部分在MIF序列中的其他半胱胺酸之硫原子處修飾(亦即，實質上不攜帶相同修飾)。例如，MIF在半胱胺酸57之硫原子上實質上不攜帶相同修飾。例如，MIF在半胱胺酸60上實質上不攜帶相同修飾。在某些較佳具體實例中，MIF之半胱胺酸57與半胱胺酸60實質上均不由與半胱胺酸81相同的修飾部分修飾。在某些較佳具體實例中，半胱胺酸57與半胱胺酸60之任一者或兩者可由除半胱胺酸以外的胺基酸取代(亦即突變為，亦即由……替代)，例如由絲胺酸取代。在其他具體實例中，半胱胺酸57可為未經修飾的，亦即可包含自由硫氫基。在其他具體實例中，半胱胺酸60可為未經修飾的，亦即可包含自由硫氫基。在其他具體實例中，半胱胺酸57與半胱胺酸60兩者均為未經修飾的，亦即包含自由硫氫基。

可藉由質譜分析、例如藉由製備肽質量指紋(肽映射及質譜分析)進行位置(半胱胺酸)81(特定言之其硫原子或硫氫基)是否在本發明之含義內經修飾之評估。亦即，本發明之方法(例如診斷方法或篩選化合物之方法)可涵蓋對MIF進行質譜分析。亦即，本發明之方法(例如 診斷方法或篩選化合物之方法)可涵蓋製備包含MIF之樣本用於質譜分析。用以測定胺基酸殘基之修飾之肽質量指紋識別之方法為熟習相關技術領域者所熟知，作為熟習此項技術者的公共常識之一部分。本發明之方法可因此亦涵蓋在待評估的樣本中藉由蛋白質酶(例如胰蛋白質酶)消化MIF。隨後，所得肽(MIF片段)形成該消化，特定言之，可藉由質譜分析來分析含有半胱胺酸81(且較佳不含有其他半胱胺酸殘基)之肽。

亦可藉由免疫分析，亦即使用一或多種抗體進行位置(半胱 胺酸)81是否經修飾之評估。亦即，本發明之方法(例如診斷方法或篩選化合物之方法)可涵蓋使MIF與一或多種抗體接觸。此可導致在MIF(例如經C81修飾之MIF)與抗體之間形成複合物。可因此使用選擇性地結合至其中位置81(例如半胱胺酸81之硫氫基經修飾)之MIF、亦即結合其中位置81(例如半胱胺酸81之硫氫基)與在半胱胺酸81處具有自由硫氫基之MIF相比優先經修飾之形式的MIF之抗體進行位置81是否經修飾之評估。

製備特異性抗體(例如單株抗體)之方法亦為熟習相關技術 者所熟知。抗體之該種結合可視MIF蛋白質之位置81之修飾(例如具有硫氫基)的存在而定用於(或至少用於)在非還原及/或氧化及/或天然條件下使抗體結合至MIF蛋白質。結合抗原決定基可包括或可不包括位置81。抗體可為抗MIF抗體(例如構形敏感抗體，其結合視位置81之修飾狀態而定)，例如半胱胺酸81修飾-特異性抗體，其在MIF半胱胺酸81之硫原子與自由半胱胺酸硫氫基相比、與其結合至在該種修飾不存在下的MIF(亦即在位置81處含有自由半胱胺酸硫氫基之MIF)相比攜帶修飾時特定地、選 擇性地或優先地結合至MIF。例如抗體之結合抗原決定基可為抗原決定基(例如線性或構形抗原決定基，其可或可不包括半胱胺酸81)，其用於抗體結合之可行性在位置81經修飾時與在MIF位置81未經修飾時相比提高。

舉例而言，抗體與MIF之結合可視MIF蛋白質之位置81處 的半胱胺酸之修飾的存在而定，亦即與在半胱胺酸81未經修飾(例如在還原條件下)時或在半胱胺酸81不存在時抗體結合至MIF相比，抗體可在半胱胺酸81經修飾時優先結合MIF(例如在非還原條件下)。舉例而言，抗體可為RAM9或RAB9。抗體亦可為RAM0或RAB0。該結合可視半胱胺酸57及/或半胱胺酸60之存在(如在RAM9或RAB9之情況下)而定或可獨立於半胱胺酸57及/或半胱胺酸60之存在及/或僅僅視MIF半胱胺酸81之硫原子上的修飾之存在而定。

本發明之方法及用途亦可採用抗MIF抗體(例如構形敏感 抗體，其結合視半胱胺酸81之修飾狀態而定)，例如半胱胺酸81硫氫基選擇性抗體，其在MIF半胱胺酸81之硫原子攜帶自由半胱胺酸硫氫基時與其結合至其中半胱胺酸81經修飾之MIF相比優先結合至MIF。可採用該等抗體例如作為對照組。

在本發明之含義內，若測定含有半胱胺酸81(但無其他半 胱胺酸)之MIF肽與含有半胱胺酸81處的自由硫氫基之相應肽相比質量改變，則位置81(例如MIF半胱胺酸81之硫氫基)可被識別為經修飾。

較佳地，MIF蛋白質之何種胺基酸的MIF基因在位置81處 編碼半胱胺酸(例如MIF基因是否在位置81處編碼半胱胺酸)之評估或測定係藉由包括聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction；PCR)之方法進行。

本發明亦關於如本文所揭示之抗體，其特定地認知MIF位 置81處的修飾之存在。本發明亦關於一種特定地結合至其中位置81攜帶修飾(例如在硫原子上，與自由半胱胺酸硫氫基相比)之抗MIF抗體，其中該抗體不可偵測地結合或藉由較低親和力結合至不含有該修飾之MIF。本發明亦關於如本文中所提及之在具有位置81處的修飾之MIF與抗體之間的複合物。

本文中，抗體可具有任何類型，例如較佳具有IgG1類型或 IgG4類型。本文中，抗體稱為具有IgG1類型之「RAM」，且稱為「RAB」之抗體具有IgG4類型。

本文中，除非另外指明，否則提及的結合(例如關於抗體或 測試化合物)為在生理學上相關條件(在例如1℃與45℃之間的任何溫度下)下之結合。在X射線晶體學方法之情況下，提及的結合涵蓋在熟習此項技術者所熟知的結晶條件下之結合。

較佳結合或增強型結合等(例如關於抗體或另一化合物)在 本文中可亦稱為差異性結合。舉例而言，較佳增強型或差異性結合意謂化合物、特定言之如本文中所描述的抗體結合(藉由小於100nM、較佳小於50nM、又更佳小於10nM之KD值)至MIF之第一形式；及在更小程度上(例如藉由較低親和力，例如以例如400nM以上之KD或可偵測結合不存在(亦即該化合物不結合)為特徵)結合至MIF之第二形式。MIF之該第一形式可為例如與MIF相關疾患相關的MIF(例如特定言之經C81修飾之MIF)之形式，及MIF之該第二形式可為非如此相關之形式(例如不含有C81之經修飾之硫原子)，或反之亦然。

舉例而言，差異性結合可指藉由小於100nM(較佳小於50 nM，又更佳小於10nM)之KD值結合至攜帶位置81處(例如在半胱胺酸81之硫原子上)的修飾之MIF，及例如以400nM以上之KD或可偵測結合不存在(亦即，化合物不結合)為特徵較少結合至在半胱胺酸81之硫原子上不含有該修飾之MIF(或反之亦然)。

本文中，諸如「診斷標記」或「(MIF相關)疾病之診斷中 的標記」之術語在本發明之上下文中將涵蓋MIF是否為涉及此(MIF相關)疾病之因子之評價的可能性。在彼方面，作為標記之經修飾之MIF供應關於疾病狀態、其進展之資訊且充當標記以測定給定治療之有效性；此外，樣本(例如體液樣本或細胞樣本)中的經修飾之MIF偵測可充當較佳抗MIF治療之指標。經修飾之MIF之偵測因此用以改進給定疾病或疾患中之已知診斷技術。其對行醫者在其決策如何治療給定疾病或疾患中進行輔助且有助於改進診斷之特異性。經修飾之MIF因此為特異性及適合的二級標記。 其偵測可在罹患MIF相關疾病之患者之管理中充當輔助測試。所討論之疾病在一較佳具體實例中為已知或懷疑為MIF相關之疾病(參見以下詳細提及的疾病)但亦可為迄今為止未被懷疑為MIF相關之疾病。

在一較佳具體實例中，樣本中的經修飾之MIF之存在的偵 測將向行醫者指示個體(已自該個體(或其)採取樣本)可能得益於針對MIF之治療。該種治療可選自抗MIF分子，例如抗經修飾之MIF抗體或針對經修飾之MIF的小分子。

較高MIF含量，亦即通常在各種疾病之發作之後、尤其在 癌症之發作之後偵測的MIF含量。然而，MIF亦在健康個體中循環，其使 得明顯分化困難。相反，本發明連接至經修飾之MIF之oxMIF不存在於健康個體中且因此為MIF相關疾患之更強的診斷標記。根據本發明，可分析諸如血液、血清及尿之患者樣本與健康個體相比之經修飾之MIF的增加含量。

如本文所示，特定言之，藉由連接部分至C81硫原子的C81 硫氫基之衍生作用促進MIF向疾病相關狀態oxMIF之轉換。oxMIF特異性抗體(其特異性結合至oxMIF且不能結合至redMIF)在本發明之上下文中可為有用的。oxMIF特異性抗體之非限制性實例為Baxter抗體RAM9、RAB9、RAM4、RAB4、RAM0及RAB0。

諸如胱胺酸介導之氧化、GSSG(ox.麩胱甘肽)介導之氧化 或藉由Proclin300或蛋白質交聯劑(例如BMOE)之MIF培育之氧化程序均可致使與上文所提及的抗體之結合。

上文所提及之抗體係藉由兩個其序列以及藉由在大腸桿菌 (菌株TG1)中沈積為質體來特性化及支撐，其包含上文所提及之抗體中之每一者之輕鏈或重鏈。質體以其DSM數目為特徵，該數目為如在藉由德國微生物及細胞培養物收集(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures；DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，Braunschweig，Germany，根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)沈積時獲得的官方數目。該等質體分別沈積於大腸桿菌菌株中。

具有DSM 25110數目之質體包含抗MIF抗體RAB4之輕鏈 序列。具有DSM 25112數目之質體包含抗MIF抗體RAB4之重鏈(IgG4)序列。質體DSM 25110與DSM 25112在適合的宿主細胞中之共表現導致較 佳抗MIF抗體RAB4之產生。

具有DSM 25111數目之質體包含抗MIF抗體RAB9之輕鏈 序列。具有DSM 25113數目之質體包含抗MIF抗體RAB9之重鏈(IgG4)序列。質體DSM 25111與DSM 25113在適合的宿主細胞中之共表現導致較佳抗MIF抗體RAB9之產生。

具有DSM 25114數目之質體包含抗MIF抗體RAB0之輕鏈 序列。具有DSM 25115數目之質體包含抗MIF抗體RAB0之重鏈(IgG4)序列。質體DSM 25114與DSM 25115在適合的宿主細胞中之共表現導致較佳抗MIF抗體RAB0之產生。

亦沈積抗體RAM0、RAM9與RAM4；均已藉由根據布達佩斯條約之2012年4月12日的DSZM，Braunschweig，Germany沈積，具有以下名稱：RAM9-重鏈：大腸桿菌GA.662-01.pRAM9hc-DSM 25860。

RAM4-輕鏈：大腸桿菌GA.906-04.pRAM4lc-DSM 25861。

RAM9-輕鏈：大腸桿菌GA.661-01.pRAM9lc-DSM 25859。

RAM4-重鏈：大腸桿菌GA.657-02.pRAM4hc-DSM 25862。

RAM0-輕鏈：大腸桿菌GA.906-01.pRAM0lc-DSM 25863。

RAM0-重鏈：GA.784-01.pRAM0hc-DSM 25864。

在本發明之上下文中的生物樣本較佳為將在其(which/whom)上進行診斷之個體之體液樣本。體液樣本為熟習此項技術者已知之任何體液樣本。該種例示性但非限制性樣本可為血液、血漿、血清、唾液、尿、鼻液、腹水、眼液、羊膜液、水狀液、玻璃狀液、淚液、考珀 液(Cowper's fluid)、***、間質液、淋巴液、母乳、黏液(包括鼻涕與痰)、胸膜液、膿、月經、***潤滑、皮脂、腦脊髓液及滑液。在本申請案之上下文中的另外生物樣本可為(中空)體器官之灌洗(沖刷)(例如支氣管肺泡灌洗、胃灌洗及腸道灌洗)。

在本申請案之上下文中的替代具體實例中之生物樣本為將 在其上進行診斷的個體之細胞樣本，最佳來自循環或患病組織之細胞樣本，更佳如單一細胞懸浮液樣本。

根據本發明，本文所揭示之診斷方法、分析及用途，特定言 之，如本文所揭示之診斷MIF相關疾患之方法涵蓋測定給定疾患或病理性病狀是否涉及經C81修飾之MIF或與經C81修飾之MIF相關之方法。

本發明因此亦關於一種評估疾病之進展之方法；在本發明之 上下文中，術語「疾病之狀態」或「疾病狀態」應理解為與術語「疾病之嚴重度」同義且係指疾病或病狀之嚴重性、程度或狀態(亦即階段)。舉例而言，疾病可特性化為輕度、中度或重度。嚴重度或程度、亦即疾病之狀態之測定或評估為熟習此項技術者熟知的。就此評估而言將進行的實際方法當然視所討論之疾病或病狀而定。舉例而言，疾病之狀態可藉由比較患有疾病之個體的存活之可能性或長度與患有相同疾病之其他個體的存活之可能性或長度來測定。

在其他具體實例中，疾病之狀態可藉由比較患有疾病之個體 的疾病症狀與患有相同疾病之其他個體的症狀來測定。在又一具體實例中，疾病之狀態及其進展藉由同一患者體內歷經時間段之症狀之變化反映。

在另一較佳態樣中，本發明亦可關於一種選擇如符合用抗經 修飾之MIF化合物治療之條件的個體之方法，其中該個體具有(MIF相關)疾患或處於發展(MIF相關)疾患的風險中，該方法包含偵測該個體中的經修飾之MIF之存在及/或含量及/或含量變化。可選擇具有較高含量的經修飾之MIF之個體用於藉由如上文所定義的抗經修飾之MIF化合物之預防性或治療性治療。

術語「預防性」或「治療性」治療為技術認知的且係指向患 者投予藥物。若在非吾人所樂見的病狀(例如宿主(例如人類或動物)之疾病或其他非吾人所樂見的狀態)之臨床表現之前投予其，則該治療為預防性，亦即，其使宿主免於發展非吾人所樂見的病狀，然而若在非吾人所樂見的病狀之表現之後投予，則該治療為治療性(亦即，意欲減少、改善或維持現存非吾人所樂見的病狀或其副作用)。

如本文所用，抗經修飾之MIF化合物係指任何減輕、抑制、 對抗、抵消或降低經修飾之MIF的生物活性之劑。抗經修飾之MIF化合物可為抑制或中和經修飾之MIF活性之劑，例如小分子或抗體。較佳抗體為如本文中所描述之抗體，特定言之，RAM9、RAB9、RAM4、RAB4、RAM0及RAB0；較佳RAB9或RAB0；或RAM9或RAM0。

本文所揭示之診斷方法或分析可用於測定例如患者之體液 樣本或細胞樣本中的經修飾之MIF之存在或含量。oxMIF之存在或不存在適於區分疾病是否為MIF相關的或決定oxMIF治療是否為合理的。OxMIF位準指示疾病進展或治療功效。

在本發明之上下文中進一步揭示了包含抗經修飾之MIF抗 體或其抗原結合部分之套組。套組可包括除抗體之外的另外診斷或治療劑 及其用途。套組亦可包括診斷性或治療性方法中之使用說明書。

定義及一般技術

除非本文中另外定義，否則結合本發明使用之科學與技術術語應具有由一般技術者通常理解之含義。通常，本文中所描述之與細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質與核酸化學結合使用的命名法及其技術為在此項技術中熟知且常用之彼等者。除非另外指明，否則本發明之方法及技術通常根據此項技術中熟知之習知方法且如本說明書通篇所引用及討論之各種一般及更特定文獻中所描述來進行。參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)及Harlow and Lane Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)，其各以引用之方式併入本文中。

「MIF」或「巨噬細胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor)」係指蛋白質，其稱為免疫反應及發炎反應中的關鍵介體且稱為糖皮質激素之反調節劑。MIF包括哺乳動物MIF，具體言之人類MIF(Swiss-Prot主要寄存編號：P14174)，其序列由SEQ ID NO：15表示。單體形式編碼為115胺基酸蛋白質但由於初始甲硫胺酸之裂解生成為114胺基酸蛋白質。「MIF」亦包括「GIF」(糖基化抑制因子)及其他形式的MIF，如熟習此項技術者熟知的諸如(例如)藉由諸如抗生蛋白質鏈菌素結合肽(streptavidin binding peptide；SBP)之親和力標記(其適用於蛋白質之純化)視情況經由連接子(例如(GGGGS)2連接子)之MIF融合蛋白質。根據SEQ ID NO：15，MIF之胺基酸之編號以N端甲硫胺酸(胺基酸1)開始且以C端丙胺酸(胺基酸115)結束。

「氧化MIF(oxidized MIF)」或oxMIF在本文中定義為藉由 用諸如胱胺酸之輕度氧化試劑(硫氫基反應試劑)進行MIF治療產生的MIF同功異構物。該oxMIF包含與在用細菌攻擊動物之後(例如)活體內產生的oxMIF共用結構重組之MIF同功異構物。其特定地受本文所揭示之oxMIF特異性抗體約束。

「還原MIF(reduced MIF)」或redMIF出於本發明的目的定 義為還原MIF且為不結合至RAB0、RAB9及/或RAB4及/或至RAM0、RAM9及/或RAM4之MIF。

抗體與本文所揭示之各種形式的MIF之結合動力學可使用 Biacore 3000系統藉由表面電漿子共振分析來檢查。將該等抗體包覆於CM5(=羧基甲基化聚葡萄糖)晶片上且藉由0.2% Proclin300預培育MIF蛋白質且注射混合物。Proclin300由藉由避免oxMIF向redMIF之轉化使oxMIF結構穩定之氧化異噻唑酮組成。

抗體或其抗原結合部分較佳地藉由小於100nM之KD、較 佳小於50nM之K_D、甚至更佳藉由小於10nM之K_D結合本文所揭示之特異形式的MIF(例如經修飾之MIF)。尤其較佳地，本發明之抗體藉由小於5nM之KD結合至本文所揭示之特異形式的MIF(例如經修飾之MIF)。

抗體之(非)結合可測定為熟習此項技術者通常已知之為以 下方法中之任一者之實例：差異性結合ELISA與重組MIF，或使用本文所揭示之形式中的任一者之重組MIF之表面電漿子共振，類似上文所描述之 熟知的Biacore分析。

用於結合之測定之較佳方法為將抗體表面電漿子共振至本 文所揭示之形式的MIF(例如經修飾之MIF)，其中「結合」係指小於100nM、較佳小於50nM甚至更佳小於10nM之KD，然而，該非結合(例如在經修飾之MIF或oxMIF特異性抗體至redMIF之情況下)以400nM以上之KD為特徵。「結合」及「特異性結合」在本文中可互換使用。本申請案之上下文中的「差異性結合」涵蓋化合物(特定言之如本文中所描述的抗體)或測試化合物，該等測試化合物結合至經修飾之MIF(例如藉由上文所提及的K_D值)而其並不結合至redMIF及/或至不含有C81之經修飾之硫原子的MIF。

本文中，提及「抗體」涵蓋抗原結合抗體衍生物，其構造或 片段為熟習相關技術者所已知，特定言之涵蓋包含抗體之抗原結合部分之抗原結合分子。「抗體(antibody)」係指完整抗體或由與該完整抗體競爭(特異性)結合之抗體的抗原結合部分組成或包含其之分子。通常參見Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.編，第2版Raven Press,N.Y.(1989))(其全文以引用之方式併入本文中)。術語抗體包括人類抗體、哺乳動物抗體、分離抗體及諸如嵌合抗體、駱駝化抗體或人類化抗體之基因工程化形式，但不限於此。

術語抗體之「抗原結合部分(antigen-binding portion)」係指 抗體之一或多個保留特異性結合至抗原(例如經修飾之MIF)之能力之片段。包含抗體之抗原結合部分之分子可藉由重組DNA技術或藉由完整抗體之酶或化學裂解產生。該等分子包括(但不限於)以下：Fab、Fab'、F(ab')2、 Fv及互補決定區(complementarity determining region；CDR)片段、單域抗體及單鏈Fv抗體(single-chain Fv antibody；scFv)、嵌合抗體、雙功能抗體、抗體及含有足以賦予特異性結合至所關注的抗原之抗體之至少一部分之多肽，該抗原例如本文所揭示之形式的MIF，例如至經修飾之MIF、redMIF、oxMIF、在C81中含有自由硫氫基之MIF、不含有C81之經修飾之硫原子之MIF，或本文所揭示之其他形式的MIF。自N端至C端，成熟輕鏈可變域與重鏈可變域兩者包含區域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。 胺基酸至各域之分配係根據Kabat的Sequences of Proteins of Immunological Interest(美國國家衛生研究院(National Institutes of Health)，Bethesda，Md.(1987及1991))、Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)或Chothia等人，Nature 342：878-883(1989)之定義進行。抗體或其抗原結合部分可被衍生化或連接至另一官能分子(例如另一肽或蛋白質)。舉例而言，抗體或其抗原結合部分可在功能上連接至一或多個其他分子實體，諸如另一抗體(例如雙特異性抗體或雙功能抗體)、可偵測劑、細胞毒性劑、藥劑及/或連接分子。

在本發明之上下文內，抗體可例如特性化為人類抗體、人類 化抗體、駱駝化抗體。另外，抗體可為例如嵌合抗體。另外，抗體可為例如分離抗體。

術語「KD」根據熟習此項技術者之公共常識係指兩個相互 作用搭配物(例如特定抗體與其各別抗原)之平衡解離常數。

術語「人類抗體(human antibody)」係指其中可變域及恆定 域為人類序列之任何抗體。該術語涵蓋具有來源於人類基因但已經改變以 例如降低可能的免疫原性、增加親和力、消除可能致使非所要摺疊之半胱胺酸等之序列之抗體。該術語涵蓋在非人類細胞中以重組方式產生的該等抗體，其可能例如賦予非典型的人類細胞之糖基化。

術語「人類化抗體(humanized antibody)」係指包含人類序 列且亦含有非人類序列之抗體。

術語「駱駝化抗體(camelized antibody)」係指其中抗體結構 或序列已改變為更接近於來自駱駝的抗體之抗體，亦指示駱駝抗體。駱駝化抗體之設計及產生方法為熟習此項技術者之常識之一部分。

術語「嵌合抗體(chimeric antibody)」係指包含來自兩種或 兩種以上不同種類之區域之抗體。

術語「分離抗體(isolated antibody)」或「其分離抗原結合部 分(isolated antigen-binding portion thereof)」係指已經識別且選自諸如噬菌體呈現庫或B細胞抗體庫之抗體源之抗體或其抗原結合部分。

本文所揭示之抗體可藉由任何用於產生重組DNA之方法藉 由基因工程、例如經由RNA之反轉錄及/或DNA之擴增且選殖至表現載體中來產生。在一些具體實例中，載體為病毒載體，其中額外DNA片段可接合至病毒基因組。在一些具體實例中，載體能夠在引入其至其中的宿主細胞中自主複製(例如具有複製之細菌來源之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。在其他具體實例中，載體(例如非游離型哺乳動物載體)在引入至宿主細胞中時可整合至宿主細胞之基因組中，且從而與宿主基因組一起複製。 此外，某些載體能夠導引其以操作方式連接的基因之表現。該等載體在本文中稱為「重組表現載體」(或簡言之「表現載體」)。

本文所揭示之抗體可尤其藉助於習知表現載體、諸如細菌載 體(例如pBR322及其衍生物)或真核載體產生。編碼抗體之彼等序列可具有調節來自宿主細胞的複製、表現及/或分泌之調節序列。此等調節序列包含(舉例而言)啟動子(例如CMV或SV40)及信號序列。表現載體亦可包含選擇及擴增標記，諸如二氫葉酸還原酶基因(dihydrofolate reductase gene；DHFR)、潮黴素-B-磷酸轉移酶及胸苷-激酶。所用載體之組分，諸如選擇標記、複製子、增強子，可市售獲得或藉助於習知方法製備。可構建該等載體在各種細胞培養物中、例如在諸如CHO、COS、HEK293、NSO、纖維母細胞、昆蟲細胞、酵母菌或細菌(諸如大腸桿菌)之哺乳動物細胞中的表現。在一些情況下，細胞用於允許表現蛋白質之最佳糖基化。

可將抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因***至分離載體中或將 該等基因***至相同表現載體中。藉由標準方法將抗體基因***至表現載體中，該等方法例如抗體基因片段及載體上的互補限制部位之接合或若無限制部位存在時之鈍端接合。

抗體或其抗原結合片段之產生可包括此項技術中已知的用 於藉由轉染(例如經由電穿孔或顯微注射)將重組DNA引入真核細胞中之任何方法。舉例而言，抗體之重組表現可藉由適當轉染方法在一或多個調節序列(諸如強啟動子)之控制下將含有抗體編碼DNA序列之表現質體引入適合宿主細胞株中、產生細胞使引入的序列穩定地整合至基因組中來實現。脂質體轉染方法為可根據本發明使用的轉染方法之實例。

抗體之產生亦可包括此項技術中已知的用於該等轉型細胞 之培養(例如以連續或分批方式)及抗體之例如組成性或在誘導時的表現 之任何方法。其尤其參考WO 2009/086920作為抗(ox)MIF抗體之產生的進一步參考。

oxMIF特異性抗體之序列亦部分地揭示於WO 2009/086920中。另外oxMIF特異性抗體以以下序列為特徵：RAB9之輕鏈之胺基酸序列SEQ ID NO：1： RAB4之輕鏈之胺基酸序列SEQ ID NO：2： RAB0之輕鏈之胺基酸序列SEQ ID NO：3： RAB2之輕鏈之胺基酸序列SEQ ID NO：4： RAB9之重鏈之胺基酸序列SEQ ID NO：5： RAB4之重鏈之胺基酸序列SEQ ID NO：6： RAB0之重鏈之胺基酸序列SEQ ID NO：7： RAB2之重鏈之胺基酸序列SEQ ID NO：8： RAM0hc之胺基酸序列SEQ ID NO：9： RAM0lc之胺基酸序列SEQ ID NO：10： RAM9hc之胺基酸序列SEQ ID NO：11： RAM9lc之胺基酸序列SEQ ID NO：12： RAM4hc之胺基酸序列SEQ ID NO：13： RAM4lc之胺基酸序列SEQ ID NO：14： 人類MIF之序列SEQ ID NO：15

根據本發明之抗體較佳為分離單株抗體。抗MIF抗體可為 IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。在其他具體實例中，抗MIF抗體為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞綱。在其他具體實例中，抗體為亞綱IgG1或IgG4。在其他具體實例中，抗體為亞綱IgG4。在一些具體實例中，IgG4抗體具有使絲胺酸(絲胺酸228，根據Kabat編號方案)改變為脯胺酸之單一突變。因此，IgG4之Fc區中的CPSC亞序列變為CPPC，其為IgG1中的亞序列(Angal等人Mol Immunol.1993,30,105-108)。

可使用標準蛋白質純化方法、例如經由陰離子交換層析法或親和性層析法自培養基回收抗體。在一個具體實例中，可藉由尺寸排外層析法自細胞培養上清液純化抗(ox)MIF抗體。

術語MIF「中心區域」及「C端區域」係指分別包含胺基酸35-68及胺基酸86-115之人類MIF、較佳分別包含胺基酸50-68及胺基酸86至102之人類MIF之區域。

尤其較佳抗oxMIF抗體結合至人類MIF之區域胺基酸50-68或區域胺基酸86-102。此亦藉由較佳抗體RAB0、RAB4、RAB2及RAB9以及RAM4、RAM9及RAM0之如下結合之結合來反映：

RAB4與RAM4：胺基酸86-102

RAB9與RAM9：胺基酸50-68

RAB0與RAM0：胺基酸86-102

RAB2：胺基酸86-102。

術語「抗原決定基」包括能夠特異性結合至免疫球蛋白質或抗體片段之任何蛋白質決定子。抗原決定基決定子通常由諸如曝露的胺基酸、胺基糖或其他碳水化合物側鏈之分子之化學活性表面分組組成且通常 具有特異性三維結構特徵以及荷質比特徵。

術語「載體(vector)」係指能夠輸送另一核酸至其已連接之 核酸之核酸分子。在一些具體實例中，載體為質體，亦即，額外DNA片段可接合至其中之環狀雙股DNA環。

術語「宿主細胞(host cell)」係指細胞株，其能夠在引入表 現載體之後產生重組蛋白質。術語「重組細胞株(recombinant cell line)」係指其中已引入重組表現載體之細胞株。應理解，「重組細胞株」意謂特定個體細胞株以及該種細胞株之後代。因為某些修飾可能由於突變或環境影響而於後代中發生，所以該後代可能實際上與母細胞不相同，但仍包括於如本文中所用之術語「重組細胞株」之範疇內。

根據本發明之宿主細胞類型為例如COS細胞、CHO細胞或 例如HEK293細胞或熟習此項技術者已知的任何其他宿主細胞，因此亦例如包括細菌細胞，類似例如大腸桿菌細胞。在一個具體實例中，在DHFR缺乏的CHO細胞株(例如DXB11)中且在添加G418作為選擇標記之情況下表現抗體。在將重組表現載體編碼抗體基因引入CHO宿主細胞中時，藉由培養宿主細胞持續足以允許在該等寄主細胞中的抗體之表現或使抗體分泌至其中生長宿主細胞之培養基中之時間段來產生抗體。

本發明上下文中之「MIF相關疾患」包括(但不限於)感染性疾病、炎症、自體免疫、癌症、細胞分化、動脈粥樣化形成及血管生成相關疾病。MIF相關疾患為例如I型及II型糖尿病、急性肺損傷、哮喘、同種異體移植排斥反應、移植物抗宿主病、傷口癒合障礙及發炎性腸道疾病。癌症為另一MIF相關疾患。特定言之，MIF相關癌症包括淋巴瘤、肉瘤、 ***癌及結腸癌、膀胱癌、胰臟癌、卵巢癌、黑色素瘤、肝細胞癌、卵巢癌、乳癌及胰臟癌。

另外，動脈粥樣硬化為MIF相關疾患。

此外，惡性腹水為MIF相關疾患。

另外MIF相關疾患包括類肉瘤病、硬皮病、牛皮癬、(潰瘍性)結腸炎以及異位性皮膚炎，以及敗血性休克、遲發性過敏反應、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、多發性硬化症、胰臟炎及缺血性心臟損傷。

MIF相關的免疫及發炎性疾患包括革蘭氏陰性與革蘭氏陽性敗血症，例如綠膿桿菌感染或敗血症、DTH、絲球體腎炎、關節炎、佐劑關節炎、幼年型關節炎、(自體免疫)腦脊髓炎/腦炎、(自體免疫)心肌炎、過敏性腦炎、胃炎、結腸炎；(免疫)絲球體腎炎；肺炎，毒性休克症候群，病毒感染，肺結核，B型肝炎，登革熱(dengue fever)，寄生蟲與蠕蟲MIF相關感染，特定言之瘧疾、利什曼病(leishmaniasis)、錐蟲病、弓蟲病、阿米巴病(amoebiasis)、血吸蟲病、囊蟲病、旋毛蟲病及絲蟲病；腎臟疾病，如白血球介導的腎損傷、非增殖性腎病、增殖性腎病、腎同種異體移植排斥反應及芬蘭(Finnish)型先天性腎病症候群、腎炎、如尿酸腎病及高血壓腎病之腎病、輸尿管梗阻及糖尿病腎病。

神經痛為另一MIF相關疾患。

根據本發明之待診斷的最佳疾病為：絲球體腎炎、敗血症、淋巴瘤、狼瘡、腎炎、牛皮癬、潰瘍性結腸炎及眼科病狀以及伯基特氏(Burkitt's)淋巴瘤、白血病、惡性腹水、***腺癌、胰臟癌、卵巢癌、結腸直腸癌、頭頸癌、腎細胞癌、肝細胞癌、乳癌及肺癌。k-ras野生型癌症 以及k-ras突變癌症兩者可根據本發明進行治療。

特定言之，本發明亦涵蓋所有上文提及的疾患之第三線治 療。

本發明之一個態樣係關於個體之樣本中的經修飾之MIF之 偵測。該偵測允許熟練的行醫者例如測定MIF是否為折磨個體之疾病或疾患之治療上重要組分。此測定將輔助行醫者對(額外)抗(ox)MIF治療是否可有益於所討論之個體的決策。

經修飾之MIF亦適用作標記來測定通常給定個體之健康或 疾病病狀；較高位準的經修飾之MIF將允許發現個體罹患MIF相關疾病；經修飾之MIF可因此亦用作個體之健康/疾病病狀之(二級)一般標記，例如與當前及廣泛用作該種(二級)標記之C-反應蛋白質(C-reactive protein；CRP)之測定相似。

根據本發明，MIF之半胱胺酸81(C81)之存在對MIF向疾 病相關狀態之轉換、亦即自redMIF向oxMIF之氧化還原轉換為至關重要的，且C81硫氫基之衍生作用促進(或負責)此轉換至oxMIF形式。因此，本發明提供MIF半胱胺酸81之硫氫基之修飾狀態作為診斷標記之用途，用於MIF相關疾患之診斷。

在本說明書之上下文中的「診斷」涵蓋疾病之偵測、疾病狀 態之評價及疾病進展之監測，其亦允許監測治療性治療之功效。

在一較佳具體實例中，根據本發明之該等MIF相關疾患之 診斷可涵蓋結合至經修飾之MIF的化合物之用途或另外用途，用於經修飾之MIF的偵測。此等有差異地結合經修飾之MIF之化合物可為有差異地結 合至經修飾之MIF之抗體或小分子。可用於本發明之診斷分析可為熟習此項技術者熟知的任何診斷分析。特定言之，可以例如ELISA格式、夾層(ELISA)格式，藉由使用FACS、免疫螢光法、免疫組織化學法及各種其他適合方法中之任一者(其所有為此項技術中熟知的)進行診斷分析。

在評估樣本的根據本發明之經修飾之C81之存在時，可能 發生由MIF(諸如經C81修飾之MIF)的氧化形式產生的偽陽性結果。舉例而言，MIF蛋白質(且因此C81)中的半胱胺酸殘基之氧化可由生物樣本(例如溶血性血液樣本)中的氧化還原活性鐵及血紅素誘導，或若將氧化劑添加至樣本，則誘導該氧化。該等偽陽性結果可例如藉由採取如以下本文中所描述之措施、例如藉由去激活氧化還原活性鐵與血紅素及藉由避免例如氧化劑之添加來避免。

對於血液中循環的MIF之分析，較佳採用特殊樣本程序， 其包括以下措施及步驟。檸檬酸鹽血漿為較佳的。以40g離心來自新鮮血液(在+4℃下儲存不超過12h)之檸檬酸鹽血漿5min。將上清液轉移至新的管中且以2000g再次離心3min。再次將不含細胞之上清液轉移至新的管中且以16000g離心3min。在三個離心步驟之後，不含細胞之上清液可在-80℃下儲存或直接用於MIF之分析。若在血清中分析MIF，則較佳藉由經冷凍之存儲之前或運行MIF ELISA之前的相同三個離心步驟移除細胞及不可溶片段。

尿樣本中的沈積物在用於MIF ELISA之前應亦較佳藉由離 心步驟(16000g，5min)移除。通常，生物流體(例如淚液、唾液)中出現的細胞及其他常見粒子必須預先藉由離心步驟移除且接著儲存用於測試 MIF。

此外，由於變性MIF亦可由特異性結合至oxMIF或至經修 飾之MIF之抗體認知，待測試之MIF蛋白質在樣本製備期間(例如在體液之分離及製備期間)應保持其天然構形。因此，避免諸如沸騰、固定(在膜、塑膠(板)或晶片上)及化學治療(例如藉由還原劑、氧化劑及有機溶劑)之變性條件/步驟。

對於細胞表面上的MIF之分析，較佳使用流動式細胞測量 術分析。尤其重要的是，該等樣本在樣本製備期間並不進行溶血。因此，用於本發明流動式細胞測量術分析之所有樣本已經製備而無將導致在樣本內的細胞之溶血之任何步驟。

本發明之較佳具體實例之概述

1. 一種治療或預防有需要之個體中的MIF相關疾患之方法，該方法藉由向該個體投予有效量之以下化合物

(a)防止在位置81處的MIF之修飾，或(b)優先結合至攜帶位置81處的修飾之MIF，其係與不含有半胱胺酸81之該修飾之MIF相比。

2. 具體實例1之方法，其中該優先結合化合物為抗體或為包含抗體之抗原結合部分之分子，及/或該優先結合化合物誘導與在該化合物不存在下該經修飾之MIF相比在更小程度上使抗體RAM0、RAB0、RAM9或RAB9或另一oxMIF特異性抗體結合之形式的該經修飾之MIF。

3. 在位置81處攜帶修飾之MIF之用途，其用作標靶用於MIF相關疾患之治療或預防。

在一較佳具體實例中，在(SEQ ID NO：15之)位置81處攜帶修飾之MIF係用作標靶用於藥物發現分析。藥物發現分析為熟習此項技術者熟知之分析。其為藉以評估給定化合物/用於疾病或疾患之治療或預防(「作為藥物」)的給定化合物之(潛在)有用性之分析。

4. 一種監測MIF相關疾患之治療之有效性的方法，其包含在於該治療之前及之後自個體分離的樣本中測定MIF位置81是否攜帶修飾之步驟，其中若治療後與治療前相比MIF位置81之修飾的程度較小，則該治療被識別為有效的。

「有效性」及「功效」均為熟知術語且在本文中可互換使用。

5. 一種抗MIF抗體或包含抗體之抗原結合部分之分子，該抗體或分子結合在位置81處經修飾之MIF但不結合在位置81處未經修飾之MIF。

6. 一種分析一測試化合物是否優先結合至在位置81處經修飾之形式的MIF之方法，該方法包含以下步驟

(a)在位置81處修飾MIF以獲得經修飾之MIF，(b)在測試樣本中及在其中MIF於位置81處未經修飾之對照樣本中組合待測試的化合物與該經修飾之MIF，(c)評估該測試樣本中及該對照樣本中之該化合物與該經修飾之MIF之結合

其中，若該化合物在該測試樣本中與在該對照樣本中相比在更大程度上結合至該經修飾之MIF，則選擇該化合物。

7. 一種分析測試化合物對在位置81處經修飾之MIF的構形影響之方法，該方法包含以下步驟

(a)提供含有在位置81處經修飾之鉬MIF之測試樣本，(b)在該測試樣本中組合待測試的化合物與該經修飾之MIF，(c)評估該測試樣本中之與其中位置81攜帶修飾之MIF的構形(i)(對照組1)及/或在位置81處含有未經修飾之半胱胺酸殘基之MIF的構形(ii)(對照組2)相比的經修飾之MIF的構形，其中若該構形評估指示該測試樣本中的經修飾之MIF的構形與構形(i)相比具有構形(ii)之可偵測的相似性程度，或若該構形評估指示該測試樣本中的經修飾之MIF的構形以其他方式可偵測地自構形(i)偏離，則選擇該化合物。

8. 具體實例7之方法，其中在步驟(c)中藉由免疫分析、較佳藉由ELISA評估MIF之構形。

9. 具體實例7之方法，其中在步驟(c)中藉由X射線晶體學評估MIF之構形。

10. 一種分析測試化合物對在位置81處經修飾之MIF的構形影響之方法，該方法包含以下步驟

(a)提供含有在位置81處經修飾之MIF之測試樣本，(b)在該測試樣本中組合測試化合物與該經修飾之MIF，(c)評估該測試樣本中的經修飾之MIF與在測試化合物不存在下的(i)該經修飾之MIF(對照組1)相比與選自RAM0、RAB0、RAM9及RAB9及/或任何其他oxMIF特異性、oxMIF構形敏感抗體(例如選自本文所揭示之oxMIF特異性抗體)之結合，其中若該測試樣本(亦即在測試化合物存在下)中的經修飾之MIF與 在該化合物不存在下的該經修飾之MIF(對照組1)相比在更小程度上結合抗體，則選擇該化合物。

11. 一種篩選防止在半胱胺酸81處的MIF之修飾之化合物之方法，該方法包含以下步驟

(a)在測試樣本中組合MIF與待測試的化合物，(b)在含有該化合物之該測試樣本中及在該化合物不存在之對照樣本中藉由硫氫基反應試劑在該試劑至少在該對照樣本中修飾MIF之半胱胺酸81之硫氫基的條件下處理MIF，(c)藉由該硫氫基反應試劑評估半胱胺酸81之修飾，其中若該硫氫基反應試劑在該測試樣本中與在該對照樣本中相比半胱胺酸81之修飾的程度較小，則選擇該化合物。

12. 一種藉由X射線晶體學分析測試化合物結合至修飾形式的MIF之方法，該方法包含以下步驟

(a)在位置81處修飾MIF以獲得經修飾之MIF，(b)藉由在該測試化合物存在下結晶該經修飾之MIF或藉由在該測試化合物不存在下結晶該經修飾之MIF且隨後使所得晶體與該測試化合物接觸來提供該經修飾之MIF的晶體，及(c)使用該等晶體測定MIF之三維結構。

13. 一種含有具有在位置81處的修飾之MIF之晶體。

14. 具體實例13之晶體進一步含有另一化合物。

15. MIF蛋白質之位置81之用途，其用作MIF相關疾患及/或用於監測MIF相關疾患之診斷標記。

16. 一種如具體實例15之用途，其中MIF蛋白質之位置81之修飾狀態係用作MIF相關疾患及/或用於監測MIF相關疾患之診斷標記。

17. MIF位置81之修飾狀態作為診斷標記之用途，其中MIF位置81攜帶修飾之發現指示MIF相關疾患。

18. 一種如具體實例16之用途，其中MIF半胱胺酸81之硫氫基之修飾狀態用作診斷標記，其中MIF半胱胺酸81之硫原子與自由半胱胺酸硫氫基相比攜帶修飾之發現指示MIF相關疾患。

19. 一種診斷MIF相關疾患之方法，其包含在自個體分離的樣本中測定MIF位置81是否攜帶修飾之步驟，其中，MIF位置81被識別為經修飾、個體經診斷患有MIF相關疾患或易感染MIF相關疾患。

20. 一種診斷MIF相關疾患之方法，其包含在自個體分離的樣本中測定MIF半胱胺酸81之硫原子與自由半胱胺酸硫氫基相比是否攜帶修飾之步驟，其中若MIF半胱胺酸81之硫原子被識別為攜帶該種修飾，則診斷該個體患有MIF相關疾患或易感染MIF相關疾患。

21. 一種如具體實例15至具體實例18中之任一項之用途或一種如具體實例19或20之方法，其為一種測定給定疾患或病理性病狀是否涉及在位置81處經修飾之MIF或與在位置81處經修飾之MIF相關之方法。

22. 如具體實例15至具體實例18中任一項之用途中的診斷套組之用途或一種如具體實例19至具體實例21中任一項之方法，其中該診斷套組包含優先結合至其中半胱胺酸81存在之MIF或至在位置81處攜帶修飾之MIF之化合物。

23. 一種如具體實例22之用途，其中該套組另外包含緩衝劑、對照試劑 (例如其中半胱胺酸81存在或不存在之MIF，或在位置81處具有或不具有修飾之MIF，例如與自由半胱胺酸硫氫基相比在半胱胺酸81之硫原子上的修飾，優先結合至任何該等形式的MIF之化合物)、多株抗MIF抗體及/或標記偵測抗體。

24. 一種如具體實例1、2或具體實例6至具體實例12中任一項之方法或如具體實例22或23之用途，其中該化合物為抗體或為包含抗體之抗原結合部分之分子。

25. 一種如具體實例1、2、4、19、20或24中任一項之方法或一種如具體實例3、15至18、21至23中任一項之用途，其中該MIF相關疾患為MIF相關疾病、MIF相關疾病狀態或MIF相關疾病之進展之狀態。

26. 一種如具體實例25之用途或方法，其中該MIF相關疾患為發炎性疾病或贅生性疾病。

27. 一種如具體實例25之用途或方法，其中該MIF相關疾患係選自由以下者組成之群：結腸癌、***癌、膀胱癌、胰臟癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、肝細胞癌、哮喘、ARDS、類風濕性關節炎、敗血症、IgA腎病、絲球體腎炎、狼瘡腎炎(Lupus Nephritis，LN)、肝炎、胰臟炎(+/-急性肺損傷)、克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、胃潰瘍、阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、多發性硬化症、格林-巴利症候群(Guillain-Barre syndrome)、心臟功能障礙、血管成形術、動脈粥樣硬化、心肌炎、第1型糖尿病、糖尿病性視網膜病變、年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration；AMD)、異位性皮膚炎、牛皮癬、子宮內膜異位、神經痛及葡萄膜炎。

28. 一種如項25之用途或方法，其中該MIF相關疾患為惡性腹水，較佳為在第三線治療中者。

29. 一種MIF分子，其在SEQ ID NO：15之位置81上經修飾。

以下實施例及如下文所描述之圖式說明本發明及可在執行或評估本發明中為有用之方法。該等實施例及圖式決不意欲限制本發明。

圖1 展示了如本發明實施例中所採用的MIF與野生型MIF相比之野生型及突變重組融合構造之示意性圖示。

圖2 展示了使用抗體RAM9進行圖1之MIF構造之西方墨點(Western blot)分析。

圖3 展示了使用抗體RAM0進行圖1之MIF構造之西方墨點分析。

圖4 展示了用於在化合物R或MIF上的硫氫基之衍生作用之硫氫基反應試劑之實例、所得反應產物及在衍生作用之後R或MIF之Da中的分子量之預期的增加。

圖5 展示了用於評估MIF及其突變及/或衍生形式之ELISA分析之一般設置。

圖6 展示了在ELISA分析中野生型人類MIF以其還原形式(human MIF in its reduced form；huMIFred)、以半胱胺酸化形式(Cys-MIF)且在使用5,5′-二硫基雙-(2-硝基苯甲酸)/DTNB(DTNB-MIF)衍生時與抗體RAM9之結合。

圖7 展示了藉由ELISA對MIF以其野生型(MIF)、野生型融合 (MIF(wt)SBP)及突變融合(MIF(C57S)SBP等)形式在未經修飾時、在用DNTB衍生且在非還原條件下評估時或在DTT存在下在用DNTB衍生且在還原條件下評估時與抗體RAM9(圖A)及RAM0(圖B)結合之評估。

圖8 (圖A及圖B)展示了藉由MIF以其野生型(MIF)、野生型融合(MIFwt-SBP)及突變融合(MIF(C57S)SBP等)形式獲得的質譜資料，用半胱胺酸或DTNB(+NTB)確認衍生作用。藉由DTNB之半胱胺酸化或衍生作用產生反映相應增加的分子量之峰。

圖9 展示了自半胱胺酸化MIF之肽質量指紋識別獲得的質譜。

圖10 展示了藉由肽質量指紋識別進行半胱胺酸化MIF之分析之結果。

圖11 展示了自由DTNB衍生的MIF之肽質量指紋識別獲得的質譜。

圖12 展示了藉由肽質量指紋識別進行由DTNB衍生的MIF之分析之結果。

以下描述在抗體及/或MIF之評估中為有用之若干分析或方法。

A)抗體篩選之GCO分析：離心THP1懸浮培養物且使細胞再懸浮於新鮮的全培養基中達到每毫升106細胞之細胞密度。將此培養物轉移至96孔微板之孔中(每孔90μl)且添加潛在的抗MIF抗體以得到75μg/ml之最終濃度。各抗體以一式三份進行測試。在37℃下o/n培育之後添加***(dexamethasone)以得到2nM之濃度且在37℃下1小時培育之後添加LPS(3ng/ml最終濃 度)。在37℃下另外6小時培育之後收穫上清液且在市售ELISA中測定IL-6濃度。一式三份之結果取平均值且相比於對照抗體測定IL-6分泌之百分比。導致IL-6分泌小於75%之抗體評估為陽性。

B)IC50值之測定之分析

如關於篩選分析所描述進行實驗程序，除了使用增加量的抗體(典型地為1-125nM)。所得劑量反應曲線表示為相比於陰性對照抗體之%抑制。此曲線用於抗體之最大抑制效果(% Inh max)及展示50%的最大抑制效果之抗體濃度(IC50)之計算。

C)細胞增殖之抑制血清刺激MIF在靜止NIH/3T3中之分泌且MIF轉而刺激細胞增殖。抗體抑制此內源性MIF，因此，減少靜止NIH/3T3細胞之增殖。增殖之減少係藉由3H-胸苷之併入來測定。

在含有10%血清之培養基中歷經週末在37℃下於96孔板中培育每孔1000 NIH/3T3細胞。接著在37℃下藉由在含有0.5%血清之培養基中之培育使細胞饑餓隔夜。移除0.5%培養基且由含有10%血清、75μg/ml抗體及5μCi/ml之3H-胸苷之新鮮培養基替代。在37℃下於CO2培育箱中之16小時培育之後用每孔150μl之冷PBS洗滌細胞兩次。使用多通道移液管添加每孔150μl之5%(w/v)TCA溶液且在4℃下培育30分鐘。用150μl PBS洗滌板。添加每孔75μl之具有0.5% SDS之0.5M NaOH溶液，混合且在室溫下儲存。藉由混合5ml之Ultima Gold(Packard)與75μl樣本溶液以ß-計數器量測樣本。以一式三份進行各測定且藉由t檢驗對該等值與對照抗體之值進行比較。顯著減少增殖(P<0.05)之抗體評估為陽性。

D)結合研究：抗MIF抗體之抗原決定基測定

在偶合緩衝液中稀釋各肽以得到典型地1μg/ml之肽濃度，將其添加至微板(NUNC ImmobilizerTM Amino Plate F96 Clear)且在4℃下培育隔夜(每孔100μl)。使用重組全長MIF及PBS作為對照組。用200μl PBST洗滌該板3次且添加(每孔100μl)抗體(於PBS中之2-4μg/ml)且在室溫下藉由平緩搖動培育2小時。用200μl PBST洗滌該板3次且添加(每孔100μl)偵測抗體(例如Fc特異性抗人類IgG/HRP標記，Sigma)。在室溫下藉由平緩搖動培育1小時之後，用200μl PBST洗滌該板3次。用100μl TMB(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)溶液(T-0440，Sigma)在暗處培育各孔30分鐘。藉由增加每孔100μl之1.8M H2SO4溶液停止染色反應。在450nm處量測樣本。

E)藉由Biacore進行抗MIF抗體之親和力測定

典型地，藉由CM5(=羧基甲基化聚葡萄糖)基質(Biacore)將人類重組MIF之40 RU單元固定於感測器晶片上。在稀釋於HBS-EP中之典型的6-100nM之濃度範圍下注入Fab片段。在各循環之後用50mM NaOH+1M NaCl更新晶片。根據1：1朗格繆爾(Langmuir)模型計算親和力。

F)藉由ELISA進行血清樣本中之經C81修飾之MIF之量測

藉由例如人類抗經C81修飾之MIF單株抗體包覆微量滴定板。以1：25在0.5%魚膠/PBS(pH 7.2)中稀釋人類血清樣本且施加至該板。在洗滌該板之後，例如藉由親和力純化的多株兔抗體抗人類MIF進行由包被抗體捕獲的經C81修飾之MIF之偵測。在例如用HRP標記之山羊抗兔抗體(BioRad,Cat.：171-6516；亦可在本文中使用此項技術中已知的任何其他 山羊抗兔)及TMB(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺；T-0440，Sigma)作為顯色基質(亦可使用如熟習此項技術者已知之任何其他適合基質)之進一步培育之後進行ELISA之讀出。用H2SO4停止TMB之顯色反應且在450nm處量測ELISA板。

ELISA之校準可藉由在半胱胺酸81處新衍生的重組人類 MIF例如使用在含有導致人造oxMIF構形之緩衝液之ProClin中稀釋的DTNB或MIF進行。在包括0.2% ProClin300及4%人類對照血漿(亦即來自50個健康供體之血清樣本池)之0.5%魚膠/PBS中稀釋標準物。校準曲線之範圍可為例如10ng/ml至0.156ng/ml。

G)藉由流動式細胞測量術進行敗血症患者中之細胞表面上的經C81修飾之MIF之量測

藉由Alexa700標記之抗CD3ε(用於T細胞)及PerCP-Cy5.5標記之抗Ly6G(用於粒細胞)或APC標記之抗CD14(用於單核細胞)及PE-Cy7標記之抗CD19(用於B細胞)同時藉由300nM抗經C81修飾之MIF抗體或對照組IgG在細胞染色緩衝液(Biologend)中染色血液(例如來自患有敗血症之患者)。在洗滌之後，使用山羊R-PE標記之抗人類IgG抗體偵測人類抗體。在洗滌之後，用BD FACSTM裂解溶液(Becton Dickinson，Franklin Lakes，USA)裂解紅血球。藉由DIVA^TM軟體(軟體版本6；Becton Dickinson)使用FACS^TM Canto II(Becton Dickinson)進行資料獲取且使用FlowJo^TM軟體(Treestar,Ashland,OR,USA)分析資料。

H)多株及親和力純化的多株兔抗人類MIF抗體之製備

多株兔抗huMIF抗體在新西蘭白兔中之免疫接種程序

對於初次免疫接種，如實施例1中所描述獲得的25μg之重 組人類MIF稀釋於100μl PBS中，與100μl完全弗氏佐劑(Complete Freunds Adjuvant；CFA)混合。將200μl(4×50μl)之混合物皮下施用至各兔之不同身體部分。在初次免疫接種之後的2-3週後，使具有25μg之重組人類MIF(懸浮於100μl PBS中)之第一增強免疫與100μl不完全弗氏佐劑(Incomplete Freunds Adjuvant；IFA)混合。再次，將200μl(4×50μl)之混合物皮下施用至各兔之不同身體部分。在第一增強免疫之後的2-3週進行第二增強免疫，使25μg之重組人類MIF(懸浮於100μl PBS中)與100μl不完全弗氏佐劑(Incomplete Freunds Adjuvant；IFA)混合。再次，將200μl(4×50μl)之混合物皮下施用至各兔之不同身體部分。在第二增強免疫之後的2週終止免疫接種程序。典型地，來自多個兔之血漿經合併且用於抗MIF抗體之分離。

蛋白質A純化及多株兔抗huMIF抗體之huMIF親和力純化程序

兔抗huMIF抗體自免疫血漿之分離典型地藉由兩個親和層析法步驟進行。首先，血漿係藉由蛋白質A親和管柱(MabSelect Sure，GE Healthcare)純化。彼效用在於，用20mM Na2HPO4緩衝液(pH 7.0)以1：3稀釋兔血漿且施加至親和管柱。在洗滌步驟(5個管柱體積用20mM Na2HPO4緩衝液，pH 7.0)之後，藉由100mM甘胺酸(pH 2.8)進行整個兔IgG之洗提。洗提液經合併且使用1M Tris/HCl中和至pH 7.0。對於hu-MIF親和力純化，再次用20mM Na2HPO4緩衝液(pH 7.0)以1：3稀釋整個兔IgG且施加至如由供應商建議與25mg rhuMIF偶合的5ml NHS-親和管柱(GE Healthcare)。在洗滌步驟(5個管柱體積用20mM Na2HPO4緩衝液，pH 7.0) 之後，特異性兔抗huMIF抗體之洗提係藉由100mM甘胺酸(pH 2.8)實現。 洗提液經合併且使用1M Tris/HCl中和至pH 7.0。最後，hu-MIF親和力純化之特異性兔抗人類MIF抗體(以下為「抗人類MIF親和力純化之多株抗體」)針對PBS進行透析且在-20℃下儲存。

實施例

以下實施例尤其說明MIF之半胱胺酸81(C81)之存在對MIF向疾病相關狀態之轉換、亦即自redMIF至oxMIF之氧化還原轉換為至關重要的且C81硫氫基之衍生作用促進(或負責)此轉換。

實施例1 重組野生型及突變形式之MIF之製備

如圖1中所示，藉由抗生蛋白質鏈菌素結合肽(streptavidin binding peptide：SPB)標記經由(GGGGS)2-連接子(參見SEQ ID NO：16)之人類MIF(huMIF)之野生型及半胱胺酸突變重組融合構造係藉由標準方法製備、選殖及表現。簡言之，在pet25b中選殖合成DNA(Invitrogen，GeneArt)且在大腸桿菌Shuffle T7 Express中表現其(NEB)。使用BugBuster®蛋白質萃取主混合(Protein Extraction Master Mix)(Novagen)萃取可溶蛋白質且經由抗生蛋白質鏈菌素管柱及生物素洗提藉由親和層析法純化。使用尺寸排外層析法進行進一步純化。抗生蛋白質鏈菌素結合肽(SPB)標記之序列為：MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP(SEQ ID NO：17)。因此製備具有SBP(SEQ ID NO：18)之野生型人類MIF融合及在MIF之位置57、60與81處具有半胱胺酸向絲胺酸之單一突變之三個半胱胺酸突變SBP融合構造(亦即單一突變分別為C57S、C60S及C81S-SEQ ID NO：19-21)。

重組野生型未標記之huMIF(SEQ ID NO：15)在包括具有 人類MIF序列之表現系統之大腸桿菌細胞中產生。在+37℃下於補充有安比西林(Ampicillin)之Luria Bertani培養基(LB/Amp)中培養新鮮解凍細胞隔夜。在第二天，用相等體積之新鮮LB/Amp培養基稀釋細菌細胞培養物且藉由在30℃下添加4小時IPTG(最終濃度：1.0mM)誘導表現。藉由離心收穫細菌離心塊且在<-15℃下儲存。

對於細胞內人類MIF蛋白質之進一步純化，使冷凍細菌離 心塊再懸浮於20mM Tris/HCl緩衝液(pH 7.8)中且藉由玻璃珠以機械方式破壞細胞。藉由離心移除細胞碎片且使用常見0.2μm過濾器進行過濾。將上清液直接施加至陰離子交換層析管柱(HiTrap 26/16 DEAE FF，GE Healthcare，Waukesha，USA)且藉由被動結合模式純化MIF。在20mM Bis/Tris(pH 6.3)中再緩衝溢流道且藉由陽離子交換層析法(來源30S，GE)進行進一步純化。藉由50mM NaCl之鹽梯度在20mM Bis/Tris緩衝液(pH 6.3)中洗提高度純人類MIF。最後，針對藉由超過濾濃縮的PBS再緩衝純化的人類MIF且以純度及官能度特性化。

實施例2 藉由抗oxMIF抗體進行MIF半胱胺酸突變之西方墨點探測

RAM9為以上本文中以及WO2013/050453中所描述之單株抗體，與還原形式之MIF(redMIF)相比其優先結合至氧化、疾病相關形式之MIF(oxMIF)。RAM0為以上本文中以及WO2013/050453中所描述之單株抗體，與還原形式之MIF(redMIF)相比其優先結合至氧化、疾病相關形式之MIF(oxMIF)。在生理條件下，抗體與MIF之結合僅在MIF向oxMIF之氧化還原依賴(且可逆)轉變之後發生。然而，在非生理或變性條件下，MIF 不可逆地改變其結構，其亦導致抗體結合。因此，例如將MIF固定於塑膠上或用強清潔劑(strong detergent；SDS)處理實現該等抗體之結合。

抗體RAM9及RAM0因此用於根據標準程序進行的西方墨點分析中以便在變性條件下探測實施例1之MIF構造。結果展示於圖2中。在其上進行西方墨點之SDS-PAGE係在還原條件下進行。結果展示C57及C60(但非C81)對RAM9與MIF以線性分子形式之結合具有基本重要性。RAM9在最高MIF濃度處之殘餘結合與其結合至野生型或在C81S突變之情況下相比不顯著。相比之下，RAM0與MIF結合作為線性分子實質上並非受三個半胱胺酸突變中之任一者影響且偵測野生型構造且所有突變實質上相等。

實施例3 不同半胱胺酸殘基之突變效果、硫氫基衍生作用效果及衍生作用缺乏之效果

抗體RAM9及RAM0在ELISA分析中係用作固定捕獲抗體來探測不同半胱胺酸殘基之半胱胺酸至絲胺酸突變、硫氫基衍生作用及衍生作用缺乏對氧化、疾病相關形式之MIF(oxMIF)之形成的影響效果。用於硫氫基在MIF中之衍生作用的硫氫基反應試劑之實施例展示於圖4中。ELISA分析之一般設置展示於圖5中。

在ELISA分析中野生型人類MIF以其還原形式(MIF)、以半胱胺酸化形式(Cys-MIF)或在使用DTNB(DTNB-MIF)衍生時與抗體RAM9之結合展示於圖6中。根據WO2013/050453中之揭示內容，RAM9不結合至還原形式之MIF。然而，RAM9展示了與半胱胺酸化及DTNB衍生的MIF兩者之顯著結合。由於RAM9特異於例如在WO2013/050453中描述為 oxMIF之疾病相關形式，此展示MIF與半胱胺酸(藉由用胱胺酸處理)或2-硝基-5-硫代苯甲酸(2-nitro-5-thiobenzoic acid；NTB)部分(藉由用DTNB處理產生「DTNB衍生的MIF」或MIF+NTB)之衍生作用誘導疾病相關oxMIF形式之蛋白質。藉由RAM0獲得等效結果。

藉由ELISA對MIF以其野生型及突變形式、以還原/未經修 飾之形式(「MIF」、「MIF(wt)SBP」、「MIF(C57S)SBP」等)，在用DNTB衍生且在非還原條件下評估(「DTNB：+」)時或在用DNTB衍生且在還原條件下評估(「DTNB +，DTT +」)時與抗體RAM9及RAM0之結合之評估分別展示於圖7及圖8中。

此等資料再次確認藉由硫氫基反應化合物DTNB之硫氫基 的修飾促進了抗體RAM9及RAM0優先與其結合之疾病相關oxMIF之形成。對於RAM9，此效果在C57或C60由絲胺酸替代時並非觀測到。然而，看來此係因為C60及C57本身由於其為RAM9線性抗原決定基之一部分而對於RAM9之結合為必需的(描述於Kerschbaumer等人J Biol Chem.2012 Mar 2；287(10)：7446-55中)。並非由於在MIF(C57S)SBP-DTNB及MIF(C60S)SBP-DTNB中缺乏oxMIF形成。資料展示在C57或C60由絲胺酸替代時仍形成oxMIF，因為此等突變體藉由DTNB之衍生作用仍強有力地促進RAM0之結合。後一oxMIF特異性抗體在與其結合至已轉化成oxMIF之wtMIF(參見MIF-DTNB及MIF(wt)SBP-DTNB)類似的程度上優先結合MIF(C57S)SBP-DTNB與MIF(C60S)SBP-DTNB。相比之下，資料展示C81及其硫氫基之衍生作用與C57或C60相比在疾病相關oxMIF形式的蛋白質之形成中發揮更基本的作用：當C81由絲胺酸替代時，藉由DTNB處理突變 MIF與非衍生形式相比並不增強兩種oxMIF特異性抗體中之任一者之結合(參見MIF(C81S)SBP及MIF(C81S)SBP-DTNB)。質譜分析資料(參見以下實施例4)展示C57及C60在該種狀況下未經修飾。

資料亦展示由野生型中之DTNB誘導的所有oxMIF物質且C57S或C60S突變體可藉由DTT還原。

實施例4 衍生MIF及半胱胺酸突變體之質譜分析

藉由半胱胺酸或DTNB進行的MIF及其半胱胺酸突變體之衍生作用係藉由質譜分析確認。

藉由MALDI-TOF獲得的全長蛋白質之資料(諸如圖8中所示之彼等者)展示藉由DTNB之半胱胺酸化或衍生作用產生反映相應增加的分子量之峰。

來自半胱胺酸化人類MIF之樣本之最強烈的信號為在m/z 12470處之單質子化分子離子、其次為在m/z 6235處對應於12468Da之質量的2倍質子化離子。此很好地對應於不具有N端甲硫胺酸且具有單一半胱胺酸化(+119Da)之人類MIF序列之理論質量。非半胱胺酸化人類MIF隨著在m/z 12352處的較弱信號而可見。在m/z 12565及m/z 12684處的額外峰係歸因於具有基質之芥子酸之加合物。

來自藉由DTNB衍生的人類MIF之樣本之最強信號為在m/z 12351(未經修飾)及m/z 12549(具有NTB部分，+197Da)處的單質子化分子離子以及在m/z 6177及m/z 6275處分別對應於12352Da(未經修飾)及12549Da(具有NTB部分)之質量的2倍質子化離子。在m/z 12760處的信號歸因於具有芥子酸之加合物，m/z 24693為二聚體且未解釋在m/z 11868 及m/z 18083處的兩個另外信號。

來自融合於藉由DTNB創造的SBP之人類野生型MIF(MIF wt-SBP+NTB)之樣本的最強信號為在m/z 17269(未經修飾)及m/z 17467(具有DTNB，+197Da)處的單質子化分子離子以及在m/z 8636及m/z 8732處分別對應於17270Da(未經修飾)及17462Da(具有DTNB)之質量的2倍質子化離子。在m/z 17675處的信號歸因於具有芥子酸之加合物。

來自藉由DTNB創造的人類MIF(C57S)SBP之樣本之最強信 號為在m/z 17251(未經修飾)、m/z 17453(具有DTNB)及m/z 17651(具有2個DTNB)處的單質子化分子離子。在m/z 8627、m/z 8726及m/z 8824處的2倍質子化離子對應於17252Da、17450Da及17646Da之質量。

來自人類MIF(C60S)SBP-DTNB之樣本之最強信號為在m/z 17246處的單質子化分子離子。此很好地對應於序列之理論質量17247。在m/z 17460處的信號被分配至藉由DTNB及額外氧化修飾之蛋白質。相應2倍質子化離子在m/z 8624(17246Da)及m/z 8731(17460Da)處為可見的。

藉由DTNB創造的人類MIF(C81S)SBP之樣本並未產生指示 蛋白質之衍生作用之任何信號。在m/z 17249處的主峰對應於單質子化未經修飾之分子離子。

經硫氫基修飾之MIF之肽質量指紋識別(MIF之胰蛋白質 酶消化之後的質譜分析)允許衍生作用定位於特定半胱胺酸殘基、特定言之半胱胺酸81。自人類MIF之胰蛋白質酶消化預期的肽展示於以下表1中：

在半胱胺酸化MIF之該胰蛋白質酶消化且使用4800 Proteomics Analyzer(AB Sciex)藉由MALDI-TOF方法進行所得肽之質譜分析之後，由殘基79-87組成之肽(LLCGLLAER)被識別為經半胱胺酸化。 除了預期此肽在MH+ 987.57處呈未經修飾之形式的信號，亦在MH+ 1106.57處觀測到具有+119.00Da之額外質量、亦即對應於半胱胺酸之額外質量之對應於此肽的信號(參見圖9及圖10)。在具有殘基13-67之肽(其含有半胱胺酸57及60)中未觀測到額外質量、亦即無半胱胺酸化。

在已用DTNB處理MIF之該胰蛋白質酶消化且使用4800 Proteomics Analyzer(AB Sciex)藉由MALDI-TOF方法進行所得肽之質譜分析之後，由殘基79-87組成之肽(LLCGLLAER)被識別為經DTNB處理修飾。除了預期此肽在MH+ 987.57處呈未經修飾之形式的信號，亦在MH+ 1184.54處觀測到具有+196.97Da之額外質量、亦即對應於2-硝基-5-硫代苯甲酸部分之額外質量之對應於此肽的信號(參見圖11及圖12)。在具有殘基13-67之肽(其含有半胱胺酸57及60)中未觀測到額外質量，亦即無2- 硝基-5-硫代苯甲酸修飾。

因此，肽質量指紋識別資料在兩種情況下均確認半胱胺酸81之衍生作用。

實施例5 經C81修飾之MIF特異性抗體之產生

抗體在哺乳動物細胞中、優先在CHO細胞中、優先在已基因地剔除MIF(內源性CHO-MIF)之基因編碼之CHO細胞中產生。在基因剔除細胞中可消除具有內源性CHO-MIF之抗體之污染，其由於可提高分析之靈敏度而合乎需要。

典型地，使用高達25L體積之處置生物反應器(波系統)在分批醱酵過程中產生經C81修飾之MIF特異性抗體。將分別含有產生的抗體之重鏈及輕鏈之基因編碼之穩定CHO細胞株接種至PowerCHO培養基(Invitrogen公司)中且在37℃及5% CO2下培育。

在培育期間，各別人類抗體連續地表現至細胞培養基中。在培育(生存率<50%)結束時，藉由常見離心及過濾步驟分離該等細胞。澄清細胞培養上清液(cell culture supernatant；ccs)藉由超過濾濃縮且用於抗體之純化。

藉由蛋白質A親和層析法自濃縮ccs純化人類抗體(MabSelect Sure，GE Healthcare)。在用5個管柱體積(column-volume；cv)之20mM磷酸鈉操作緩衝液(pH 7)進行蛋白質A材料之平衡之後，將同型對照組之濃縮上清液完全施加至親和管柱。用操作緩衝液洗出雜質或非所要蛋白質。使用100mM甘胺酸(pH 3)藉由pH移位洗提抗體且針對250mM甘胺酸緩衝液進行透析。

替代地，在用5 cv之包括150mM氯化鈉緩衝液及0.1%吐溫(Tween)80之20mM Tris/HCl緩衝液(pH 7)平衡之前可將濃縮細胞培養上清液施加至蛋白質A管柱。雜質可藉由兩個洗滌步驟洗出：1.)在平衡緩衝液中添加1M NaCl及2.)包括0.1%吐溫80之100mM磷酸鈉(pH 5)。抗體可藉由包括0.1%吐溫80之100mM甘胺酸緩衝液(pH 3)洗提且接著針對250mM甘胺酸緩衝液(pH 5)進行透析。

本文中所引用之所有參照案均以全文引用之方式併入本文中。

<110> 巴克斯特保健公司

巴克斯特國際公司

<120> 作為治療標靶的MIF

<130> 176986

<160> 28

<170> PatentIn第3.5版

<210> 1

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RAB9之輕鏈

<400> 1

<210> 2

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RAB4之輕鏈

<400> 2

<210> 3

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RAB0之輕鏈

<400> 3

<210> 4

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RAB2之輕鏈

<400> 4

<210> 5

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RAB9之重鏈

<400> 5

<210> 6

<211> 454

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RAB4之重鏈

<400> 6

<210> 7

<211> 454

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RAB0之重鏈

<400> 7

<210> 8

<211> 454

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RAB2之重鏈

<400> 8

<210> 9

<211> 457

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RAM0hc

<400> 9

<210> 10

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RAM0lc

<400> 10

<210> 11

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RAM9hc

<400> 11

<210> 12

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RAM9lc

<400> 12

<210> 13

<211> 457

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RAM4hc

<400> 13

<210> 14

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RAM4lc

<400> 14

<210> 15

<211> 115

<212> PRT

<213> 智人

<400> 15

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> (GGGGS)2-連接子

<400> 16

<210> 17

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗生蛋白質鏈菌素(Streptavidin)結合肽

<400> 17

<210> 18

<211> 163

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白質

<400> 18

<210> 19

<211> 163

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白質

<400> 19

<210> 20

<211> 163

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白質

<400> 20

<210> 21

<211> 163

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白質

<400> 21

<210> 22

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 22

<210> 23

<211> 55

<212> PRT

<213> 智人

<400> 23

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 24

<210> 25

<211> 4

<212> PRT

<213> 智人

<400> 25

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 26

<210> 27

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人

<400> 27

<210> 28

<211> 21

<212> PRT

<213> 智人

<400> 28

Claims (21)

1. 一種化合物之用途，其用於製造用於治療或預防有需要之個體中的MIF相關疾患之醫藥品，其中該化合物(a)防止在位置81處的MIF之修飾，或(b)優先結合至在位置81處攜帶修飾之MIF，其係與不含有該位置81之修飾之MIF相比。
2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該MIF相關疾患為MIF相關疾病、MIF相關疾病狀態、或MIF相關疾病之進展之狀態。
3. 一種在(SEQ ID NO：15之)位置81處攜帶修飾之MIF之用途，其係用作MIF相關疾患之治療或預防之標靶或用作藥物發現分析之標靶。
4. 如申請專利範圍第1項或第3項之用途，其中該化合物為抗體或包含抗體之抗原結合部分之分子。
5. 如申請專利範圍第3項之用途，其中該MIF相關疾患為MIF相關疾病、MIF相關疾病狀態、或MIF相關疾病之進展之狀態。
6. 如申請專利範圍第2項或第5項之用途，其中該MIF相關疾患為發炎性疾病或贅生性疾病。
7. 如申請專利範圍第2項或第5項之用途，其中該MIF相關疾患係選自由以下者組成之群：結腸癌、***癌、膀胱癌、胰臟癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、肝細胞癌、哮喘、ARDS、類風濕性關節炎、敗血症、IgA腎病、絲球體腎炎、狼瘡腎炎(Lupus Nephritis，LN)、肝炎、胰臟炎(+/-急性肺損傷)、克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、胃潰瘍、阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、多發性硬化症、格 林-巴利症候群(Guillain-Barre syndrome)、心臟功能障礙、血管成形術、動脈粥樣硬化、心肌炎、第1型糖尿病、糖尿病性視網膜病變、年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration；AMD)、異位性皮膚炎、牛皮癬、子宮內膜異位、神經痛及葡萄膜炎。
8. 如申請專利範圍第2項或第5項之用途，其中該MIF相關疾患為惡性腹水，較佳為在第三線治療中者。
9. 一種監測MIF相關疾患之治療之功效的方法，其包含在於該治療之前及之後自個體分離的樣本中測定MIF位置81是否攜帶修飾之步驟，其中若治療後與治療前相比MIF位置81之修飾的程度較小，則該治療被識別為有效的。
10. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該MIF相關疾患為MIF相關疾病、MIF相關疾病狀態、或MIF相關疾病之進展之狀態。
11. 一種抗MIF抗體或包含抗體之抗原結合部分之分子，該抗體或分子結合在位置81處經修飾之MIF但不結合在位置81處未經修飾之MIF。
12. 一種分析一化測試合物是否優先結合至在位置81處經修飾之形式的MIF之方法，該方法包含以下步驟(a)在位置81處修飾MIF以獲得經修飾之MIF，(b)在測試樣本中及在其中MIF於位置81處未經修飾之對照樣本中組合待測試的化合物與該經修飾之MIF，(c)評估該測試樣本中及該對照樣本中之該化合物與該經修飾之MIF之結合其中，若該化合物在該測試樣本中與在該對照樣本中相比在更大程度 上結合至該經修飾之MIF，則選擇該化合物。
13. 一種篩選防止在半胱胺酸81處的MIF之修飾之化合物的方法，該方法包含以下步驟(a)在測試樣本中組合MIF與待測試的化合物，(b)在該含有該化合物之測試樣本中及在該化合物不存在之對照樣本中藉由硫氫基反應試劑在該試劑至少在該對照樣本中修飾MIF之半胱胺酸81之硫氫基的條件下處理MIF，(c)藉由該硫氫基反應試劑評估半胱胺酸81之修飾，其中若該硫氫基反應試劑在該測試樣本中與在該對照樣本中相比半胱胺酸81之修飾的程度較小，則選擇該化合物。
14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該化合物為抗體或包含抗體之抗原結合部分之分子。
15. 一種MIF位置81之修飾狀態作為診斷標記之用途，其中MIF位置81攜帶修飾之發現指示MIF相關疾患。
16. 一種診斷MIF相關疾患之方法，其包含在自個體分離的樣本中測定MIF位置81是否攜帶修飾之步驟，其中，MIF位置81被識別為經修飾時，該個體被診斷患有MIF相關疾患或易感染MIF相關疾患。
17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該MIF相關疾患為MIF相關疾病、MIF相關疾病狀態、或MIF相關疾病之進展之狀態。
18. 如申請專利範圍第10項或第17項之方法，其中該MIF相關疾患為發炎性疾病或贅生性疾病。
19. 如申請專利範圍第10項或第17項之方法，其中該MIF相關疾患係選 自由以下者組成之群：結腸癌、***癌、膀胱癌、胰臟癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、肝細胞癌、哮喘、ARDS、類風濕性關節炎、敗血症、IgA腎病、絲球體腎炎、狼瘡腎炎(LN)、肝炎、胰臟炎(+/-急性肺損傷)、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、胃潰瘍、阿茲海默氏症、多發性硬化症、格林-巴利症候群、心臟功能障礙、血管成形術、動脈粥樣硬化、心肌炎、第1型糖尿病、糖尿病性視網膜病變、年齡相關性黃斑變性(AMD)、異位性皮膚炎、牛皮癬、子宮內膜異位、神經痛及葡萄膜炎。
20. 如申請專利範圍第10項或第17項之方法，其中該MIF相關疾患為惡性腹水，較佳為在第三線治療中者。
21. 一種MIF分子，其在SEQ ID NO：15之位置81經修飾。