TW201518506A - 豬小病毒5b、用法及疫苗 - Google Patents
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Abstract
本發明提供新穎核苷酸序列、蛋白序列、免疫原性組合物、疫苗及關於製備及使用尤其感染馴養豬之新豬小病毒5B(PPV5B)之方法。提供該等組合物及方法用以檢測由該新病毒導致之感染、監測野生及馴養動物及畜群中病毒序列之基因改變、及製備及使用新穎疫苗用以保護動物免於感染該病毒。
Description
本申請案含有符合37 C.F.R.1.821-1.825之序列表。本申請案隨附之序列表特此以全文引用方式併入。該ASCII複本係在2013年3月21日創建,命名為10-0153-PCT-SEQ.txt且大小為34,495個位元組。
本發明屬於動物健康領域且關於新穎豬小病毒菌株(包括用於接種之減毒菌株)、製造方法及使用自該等新穎小病毒菌株獲得之疫苗之治療方法。
小病毒感染眾多種動物物種且一些小病毒導致嚴重臨床疾病,但該等病毒中大多數僅引起輕度或亞臨床感染。其屬於小病毒科(Parvoviridae)且形成兩個亞科:濃核病毒亞科(Densovirinae),其成員感染昆蟲;及小病毒亞科(Parvovirinae),其成員感染脊椎動物。後一亞科目前包括5個屬:依賴病毒屬(Dependovirus)、紅病毒屬(Erythrovirus)、貂阿留申病毒屬(Amdovirus)、博卡病毒屬(Bocavirus)及小病毒屬(Parvovirus)(1)。
小病毒病毒體無套膜且含有約5至6千個鹼基(kb)之單股線性DNA基因組。該基因組由編碼非結構蛋白及衣殼蛋白之兩個主要開放閱讀框(ORF)組成。最近闡述之博卡病毒攜帶位於該兩個主要ORF之間之第三ORF(1)。
小病毒屬之典型豬小病毒(PPV1)菌株廣泛分佈於世界各處且造成豬之生殖障礙,尤其在未正確地實施接種方案或疫苗功效因免疫抑制因子而下降之畜群中。在過去十年期間,已在豬中檢測到多種新小病毒。該等包括豬小病毒2(PPV2)(2)及相關病毒(3)。在香港鑒定出一組新的豬及牛小病毒,即香港病毒(hokovirus)(PhoV、BHoV)(4),且發現該等病毒與人類PARV4及5在遺傳上相似。儘管其最初係以香港命名為香港病毒,但有人提出新將其PhoV分類為PPV3(5)。PPV4顯示與牛小病毒2相似性最高,但編碼容量及基因組組構與博卡病毒之彼等相似,因為PPV4同博卡病毒一樣編碼位於ORF1與ORF2之間之另一ORF3。然而,PPV4編碼之假定ORF3蛋白顯著不同於博卡病毒編碼之假定ORF3蛋白(5)。
業內一直需要監測豬之新病毒之出現且需要針對新病毒研發疫苗、治療及檢測方法。
本發明提供新穎核苷酸序列、蛋白序列、免疫原性組合物、疫苗及關於製備及使用尤其感染馴養豬之新小病毒菌株之方法。該等菌株與在來自臨床上發病之馴養豬之組織樣品中鑒定之新穎豬小病毒相關;基於與已知豬小病毒物種及菌株之序列同源性,將該新穎病毒命名為豬小病毒5B或PPV5B。
本發明之組合物及方法供以檢測由該新病毒導致之感染、監測野生及馴養動物及畜群中病毒序列之基因改變、及製備及使用新穎疫苗用以保護動物免於感染該病毒導致。
本發明之免疫原性組合物及疫苗包含由SEQ ID NO:1之核酸序列編碼之多肽序列或其免疫原性片段,視情況包括佐劑用以誘導更強的免疫原性反應。
本發明之例示性組合物包含對特異性針對PPV5B之抗體具有免疫
反應性之SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ NO:4之多肽序列中之任一者或其片段。本發明之較佳多肽包括SEQ ID NO:4之序列。較佳地,彼等多肽或其片段對特異性針對PPV5B之抗體具有免疫反應性。
在另一態樣中,本發明提供編碼一或多種多肽、抗體構建體或抗體偶聯物之核酸序列。編碼多肽之基因序列包含與SEQ ID NO:1之序列至少95%、90%、85%或甚至80%同源及/或一致之核酸序列,具體而言,編碼對特異性針對PPV5B之抗體具有免疫反應性之多肽之SEQ ID NO:1之第2861位第至5014位核苷酸序列(衣殼蛋白)或SEQ ID NO:1之片段。本發明之例示性核酸序列包括編碼對特異性針對PPV5B之抗體具有免疫反應性之多肽之SEQ ID NO:1之第935位至第2024位核苷酸、SEQ ID NO:1之第2161位至第2860位核苷酸及SEQ ID NO:1之第2861位至第5014位核苷酸之序列中之任一者及其片段。較佳地,該等核酸序列或基因係編碼對特異性針對PPV5B之抗體具有免疫反應性之多肽或肽之彼等。
此外,本文所用本發明之多肽包括(但不限於)包含以下多肽:i)包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之胺基酸序列之多肽;ii)與i)之多肽至少80%同源及/或一致之多肽;iii)i)及/或ii)之多肽之片段;iv)包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之序列中所包括之至少13個、較佳地15個、更佳地17個、甚至更佳地20個鄰接胺基酸之iii)或iv)之片段;v)由包含SEQ ID NO:1之第935位至第2024位核苷酸、SEQ ID NO:1之第2161位至第2860位核苷酸或SEQ ID NO:1之第2861位至第5014位核苷酸之序列之多核苷酸編碼之多肽;vi)由與vi)之多核苷酸至少80%同源或一致之多核苷酸編碼之
多肽;vii)由包含SEQ ID NO:1之第2161位至第2860位核苷酸或SEQ ID NO:1之第2861位至第5014位核苷酸之序列中所包括之至少39個、較佳地45個、更佳地51個、甚至更佳地60個鄰接核苷酸之多核苷酸編碼之蛋白質片段。
包含至少一種或多種如本文所定義PPV5B多肽之本發明免疫原性組合物可進一步包含生理學上可接受之媒劑,例如醫藥上或獸醫學上可接受之載劑、佐劑或其組合。
此處所提供之PPV5B多肽中之任一者或任何包含此處所提供之該等PPV5B多肽中之一或多者之免疫原性組合物皆可用作藥劑,較佳地用作疫苗或免疫原性組合物,最佳地用於預防或治療個體以對抗PPV5B感染。
尤佳PPV5B多肽包括具有誘導對特異性針對PPV5B之免疫反應之免疫原性表位之彼等。較佳PPVB多肽包括具有預計在相關PPV1中為表面抗原之胺基酸序列之彼等(Simpson等人JMB 315,2002)且包括(但不限於)SEQ ID NO:4之第289位、第375位至第381位及第431位至443位殘基。
熟習此項技術者應瞭解,本文所用組合物可納入已知可注射生理學上可接受之無菌溶液。對於製備用於非經腸注射或輸注之即用溶液,水性等滲溶液(例如鹽水或血漿蛋白質溶液)可容易地得到。另外,本發明之免疫原性及疫苗組合物可包括獸醫學上可接受之載劑、稀釋劑、等滲劑、穩定劑或佐劑。
本發明方法包括(但不限於)在個體中激發對抗PPV5B感染之免疫反應之方法,該方法包含向個體投與包含一或多種如本文所定義PPV5B多肽之免疫原性組合物之步驟。較佳地,所激發免疫反應對抗一種以上PPV5B血清型或菌株。本發明組合物可用於治療或另一選擇
為預防PPV5B感染。較佳地,該免疫反應降低與感染一或多種PPV5B血清型相關或因感染一或多種PPV5B血清型而引起之一或多個臨床體徵之發生率或嚴重程度。
在本文中,可投與本發明組合物之適宜個體及有需要的個體包括需要預防或治療相關病毒性、微生物性、寄生性、原蟲性、細菌性或真菌性感染、疾病或病況的動物。利用本發明組合物或方法刺激免疫反應之動物包括家畜,例如豬、牛、家禽(例如雞、鴨、鵝或火雞)、山羊及綿羊;以及馴養動物,例如小鼠、兔、狗、貓及馬。較佳之動物包括豬、鼠科動物、馬科動物、兔類動物及牛科動物。最佳地,刺激豬之免疫反應。
本發明亦提供降低與PPV5B感染相關或由該感染引起之一或多個臨床體徵之發生率或嚴重程度之方法,其包含投與包含一或多種由此提供之PPV5B肽及較佳地載劑分子之本發明之免疫原性組合物之步驟,以使得PPV5B感染之臨床體徵之發生率或嚴重程度相對於未接受由此提供之免疫原性組合物之個體降低至少10%、較佳至少20%、甚至更佳至少30%、甚至更佳至少50%、甚至更佳至少70%、最佳至少100%。該等臨床體徵包括僅因感染PPV5B導致之病毒血症及免疫抑制。該等臨床體徵可包括神經學體徵(情緒低落、共濟失調、嗜睡)、腹瀉、呼吸困難、體況下降、關節腫脹(導致跛行及仰臥)、平均日增重減少、死亡率及與另一有機體(例如,豬鼻黴漿菌(Mycoplasma hyorhinis))共感染導致之多發性漿膜炎。
根據又一態樣,本發明亦關於預防PPV5B感染之方法,其中該PPV5B感染可能由PPV5B引起,該PPV5B與SEQ ID NO:1之核苷酸序列具有100%序列一致性;與SEQ ID NO:1之核苷酸序列具有至少95%序列一致性;與SEQ ID NO:1之核苷酸序列具有至少90%序列一致性;或與SEQ ID NO:1之核苷酸序列具有至少85%序列一致性;該方
法包含投與本發明之免疫原性組合物之步驟,該免疫原性組合物包含一或多種由此提供之PPV5B肽,即,至少一種分別與SEQ ID NO:3及/或SEQ ID NO:4之多肽序列具有100%、至少95%、至少90%及/或至少85%序列一致性之多肽或其包含SEQ ID NO:3及/或SEQ ID NO:4之序列中所包括之至少12個、較佳地15個、更佳地17個、甚至更佳地20個鄰接胺基酸之片段。
本發明亦提供製備任一由此提供之免疫原性組合物之方法,該方法包含將一或多種由此提供之PPV5B肽與載劑分子混合,較佳地使得該一或多種PPV5B肽與載劑分子係彼此共價偶合或偶聯。該等偶聯物可為多價或單價。多價組合物或疫苗包括多種PPV5B肽與載劑分子之免疫偶聯物。在又一態樣中,本發明提供製造一或多種PPV5B肽之方法,該方法包含用編碼任一由此提供之PPV5B肽之核酸分子轉化宿主細胞、較佳地原核細胞(例如大腸桿菌(E.coli))。另一選擇為,宿主細胞可為真核細胞,例如動物細胞、昆蟲細胞、原蟲細胞、植物細胞或真菌細胞。較佳地,真核細胞係哺乳動物細胞,例如CHO、BHK或COS;或真菌細胞,例如啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae);或昆蟲細胞,例如Sf9。本發明核酸之桿狀病毒表現亦較佳。
本發明之另一態樣提供製造一或多種PPV5B肽之方法,該等PPV5B肽誘導對抗至少一種PPV5B遺傳變體且更佳地兩種或更多種PPV5B遺傳變體之免疫反應。此包含培養編碼並表現一或多種本文所揭示PPV5B肽之經轉化表現載體。經表現蛋白質係保留在表現有機體中或分泌至培養基中。表現係在足以產生能夠誘導對PPV5B之免疫反應之PPV5B肽之條件下進行。致使PPV5B肽誘導免疫反應之PPV5B血清型包括(但不限於)具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性之序列。
製備本發明組合物之方法可進一步包含混合一或多種PPV5B肽與
載劑分子之偶聯物與生理學上可接受之媒劑,例如醫藥上或獸醫學上可接受之載劑、佐劑或其組合。熟習此項技術者應認識到,媒劑、佐劑或組合之選擇將尤其由遞送途徑、個人偏好及動物種類來決定。
在另一態樣中,本發明提供診斷個體之PPV5B感染之方法。該方法包含提供一或多種PPV5B肽;使該一或多種PPV5B肽與自該個體獲得之樣品接觸;及若在該樣品中檢測到能夠結合該一或多種PPV5B肽之抗體,則將該個體鑒定為具有PPV5B感染。
在另一態樣中,本發明提供確定先前已暴露於PPV5B感染且能夠表現對PPV5B之免疫反應之個體之方法。該方法包含提供一或多種PPV5B肽;使該一或多種PPV5B肽與自該個體之獲得樣品接觸;及若在該樣品中檢測到能夠結合該一或多種PPV5B肽之抗體,則將該個體鑒定為具有PPV5B感染。
本發明亦提供套組,其包含:包含一或多種PPV5B肽、較佳地連同載劑分子之免疫原性組合物;用於封裝該免疫原性組合物之容器;一套印刷說明書;及能夠向動物投與該免疫原性組合物之分配器。視情況,該一或多種PPV5B肽及該載劑分子可以偶聯物形式或以單獨化合物形式封裝。當單獨供應時,亦供應偶聯該一或多種PPV5B肽與載劑分子之構件以及適當印刷說明書。
本發明亦提供用於接種動物之套組,其包含一套印刷說明書;能夠向動物投與由此提供之包含一或多種PPV5B肽之該免疫原性組合物之分配器;且其中PPV5B肽中之至少一者有效地免疫該動物以對抗至少一種與PPV5B感染相關之疾病。較佳地,該一或多種PPV5B肽係選自由此提供之彼等。本發明套組可進一步包含獸醫學上可接受之載劑、佐劑或其組合。
本發明套組中之分配器能夠將其內含物以微滴形式分配;且該套組中所包括之包含此處所提供之PPV5B肽之該免疫原性組合物在經
鼻內、經口、真皮內或肌內投與動物時能夠降低PPV5B感染之至少一個臨床體徵之嚴重程度。較佳地,使臨床體徵之嚴重程度與未經治療之受感染動物相比降低至少10%、較佳地至少20%、甚至更佳至少30%、甚至更佳至少50%、甚至更佳至少70%、最佳至少100%。
本發明亦揭示治療或預防由PPV5B引起之感染之方法。該方法包含向個體投與有效量之本發明之免疫原性組合物,其中該治療或預防係選自由下列組成之群:減少PPV5B感染之體徵、降低PPV5B感染臨床體徵之嚴重程度或發生率、降低由PPV5B感染引起之個體死亡率及其組合。
本發明組合物進一步包含獸醫學上可接受之載劑、佐劑或其組合。該等組合物可用作疫苗且包含一或多種其他減毒疫苗、滅活疫苗或其組合。該等疫苗引發對抗至少一種與選自由下列組成之群之病毒相關之疾病之保護性免疫反應:豬小病毒1、2、3、4、5A、5B、其他豬小病毒物種、其他豬病原性病毒及細菌及其組合。可與PPV5B疫苗組合共同投與之其他類型疫苗包括(但不限於)、2型豬環狀病毒(例如,Ingelvac® CircoFLEX、Ingelvac® CircoFLEX-MycoFLEX)、豬生殖及呼吸症候群病毒(例如,Ingelvac® PRRS ATP、Ingelvac® PRRSV MLV)、豬小病毒(例如,ReproCyc® PRRSV-PLE)、支原體屬(Mycoplasma)(例如,Ingelvac® MycoFLEX)等。
熟習此項技術者應瞭解,本文所用組合物可納入已知可注射之生理學上可接受之無菌溶液。對於製備用於非經腸注射或輸注之即用溶液,水性等滲溶液(例如鹽水或血漿蛋白質溶液)可容易地得到。另外,本發明之免疫原性及疫苗組合物可包括醫藥上或獸醫學上可接受之載劑、稀釋劑、等滲劑、穩定劑或佐劑。
本發明方法亦可包含將本發明組合物與獸醫學上可接受之載劑、佐劑或其組合混合。熟習此項技術者應認識到,載劑、佐劑或組
合之選擇將尤其由遞送途徑、個人偏好及動物種類來決定。
本發明亦提供降低動物之進行性PPV5B感染之嚴重程度之方法,其藉由向該動物投與組合物來達成該組合物可包括與可接受之獸醫載劑組合之減毒病毒培養物或一或多種PPV5B肽。
較佳之投與途徑包括鼻內、經口(例如,於飲用水中)、真皮內及肌內。肌內投與較佳,最佳地以單一劑量。熟習此項技術者應認識到,本發明組合物亦可以兩次或更多次劑量以及藉由其他投與途徑來投與。例如,該等其他途徑包括皮下、皮內、靜脈內、血管內、動脈內、腹膜腔內、鞘內、氣管內、皮內、心臟內、肺葉內(intralobally)、髓內、肺內或***內。端視治療所期望之持續時間及效力而定,本發明組合物可投與一次或數次,亦可間歇投與,例如以每日計投與數天、數週或數月且以不同劑量。
本發明亦提供用於接種動物之套組,其包含一套印刷說明書;能夠向動物投與疫苗之分配器;及至少一種來自細胞培養物(包括(但不限於)細菌、真菌、昆蟲或哺乳動物細胞培養物)之分離株,該分離株有效地免疫該動物以對抗至少一種與PPV5B、其他小病毒菌株、其他病原體及/或其組合相關之疾病。本發明套組可進一步包含獸醫學上可接受之載劑、佐劑或其組合。
本發明套組中之分配器能夠將其內含物以微滴形式分配;且該套組中所包括之該分離株在鼻內、經口、真皮內或肌內投與動物時能夠降低PPV5B感染之至少一個臨床體徵之嚴重程度。在一些套組中,該分離株亦能夠降低PPV5B感染之至少一個臨床體徵之嚴重程度。較佳地,與未經治療之受感染動物相比,臨床體徵之嚴重程度降低至少10%。
由下列詳細說明可明瞭本發明之其他目標、特徵及優點。然而,應瞭解,當闡述本發明之較佳實施例時,詳細說明及具體實例僅
以說明方式給出,此乃因熟習此項技術者由該詳細說明可明瞭本發明精神及範圍內之各種變化及修改。
下列圖式形成本說明書之一部分且包括其以進一步闡釋本發明之某些態樣。可藉由參照該等圖式中之一或多者以及本文所示具體實施例之詳細說明來更好地理解本發明。本申請案含有至少一個帶顏色之圖式。在要求並支付必要費用之後專利事務局將提供本專利申請公開案帶彩圖之複本。
圖1.顯示PPV5B之核酸序列(SEQ ID NO:1)。
圖2.顯示PPV5B複製酶之蛋白序列(SEQ ID NO:2)。
圖3.顯示PPV5B開放閱讀框(ORF)蛋白之蛋白序列(SEQ ID NO:3)。
圖4.顯示PPV5B衣殼蛋白之蛋白序列(SEQ ID NO:4)。
圖5.顯示PPV5B衣殼蛋白與多種其他病毒序列之蛋白序列之逐對胺基酸一致性比較。關於該等病毒序列之參考文獻列示於表1中:
圖6顯示PPV5B之VP1/CAP區與表1中所列示其他病毒VP1及衣殼蛋白之比較之譜系分析。
圖7顯示PPV5B衣殼蛋白(SEQ ID NO:4之第184位至第851位殘基)與最接近相關蛋白PPV4(GenBank登記號AFM73881(SEQ ID NO:5))之一致性,顯示序列一致性為53%(367/690)。
圖8顯示PPV5B複製酶蛋白(SEQ ID NO:2之第1位至第594位殘基)與最接近相關蛋白PPV4(GenBank登記號ADF59557(SEQ ID NO:11))之一致性,顯示序列一致性為87%(517/597)。
本發明提供與本文所揭示新穎豬小病毒5B及其變體相關之核酸及其片段、多肽及其免疫有效片段、疫苗、免疫有效製劑、抗體、診斷分析及套組、及製備及使用該等組合物及製劑之方法。
除非另外指明,否則本發明之實踐將採用分子生物學、微生物學、重組DNA技術、蛋白質化學及免疫學之習用技術,其均在本領域之技術範圍內。該等技術充分闡釋於文獻中。例如,參見Sambrook,Fritsch & Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第I卷、第II卷及第III卷,第2版(1989);DNA Cloning,第I卷及第II卷(D.N.Glover編輯1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編輯,1984);Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames及S.J.Higgins編輯,1984);Animal Cell Culture(R.K.Freshney編輯,1986);Immobilized Cells and Enzymes(IRL press,1986);Perbal,B.,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984);the series,Methods In Enzymology(S.Colowick及N.Kaplan編輯,Academic Press公司);Protein purification methods-a practical approach(E.L.V.Harris及S.Angal編輯,IRL Press at Oxford University Press);及Handbook of Experimental Immunology,第I卷至第IV卷(D.M.Weir及C.C.Blackwell編輯,1986,Blackwell Scientific Publications)。
在詳細闡述本發明之前,應理解,本發明不限於特定DNA、多肽序列或製程參數,因為該等當然可變化。亦應理解,本文所用術語僅係出於闡述本發明特定實施例之目的,而非意欲為限制性。必須注意,除非內容另外明確指出,否則本說明書及隨附申請專利範圍中所用之單數形式「一(a,an)」及「該(the)」包括複數個指涉對象。因此,例如,所提及之「一種抗原」包括兩個或更多種抗原之混合物,所提及之「一種賦形劑」包括兩種或更多種賦形劑之混合物及諸如此類。
除非另有定義,否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與申請時熟習本發明所屬技術領域者通常所瞭解含義相同之含義。術語之含義及範圍應清楚;然而,讓若存在任何潛在歧義,則本文所提供之定義優先於任一字典或外在之定義。此外,除非上下文另外需要,否則單數術語將包括複數形式且複數術語將包括單數。在本文中,除非另有說明,否則使用「或」意指「及/或」。此外,使用術語「包括(including)」以及其他形式(例如「包括(includes)」及「包括(included)」)不具有限制意義。本文所提及之所有專利及出版物皆以引用方式併入本文中。
「保護免受疾病」、「保護性免疫」、「功能性免疫」及相似片語意指藉由投與一或多種本發明治療組合物或其組合產生對抗疾病或病況之反應,其產生比在已暴露於疾病或感染之未經免疫個體中所預計更小之有害作用。即,在經接種個體中減輕感染有害作用之嚴重程度。在經接種個體中可減少、減慢或可能完全預防感染。在本文中,意指完全預防感染之處將特別指出。若未指出為完全預防,則該術語包括部分預防。
在本文中,「臨床體徵之發生率及/或嚴重程度降低」或「臨床症狀減少」意指(但不限於)與野生型感染相比群組中受感染個體之數量減少、呈現感染臨床體徵之個體之數量減少或消除、或存在於一或多個個體中之任何臨床體徵之嚴重程度降低。例如,其應指病原體載量之任何降低、病原體脫落、病原體傳播之減少或PPV5B感染之任何症狀性臨床體徵之減輕。較佳地,與未接受該組合物且被感染之個體相比,在接受本發明治療組合物之一或多個個體中該等臨床體徵減輕至少10%。更佳地,在接受本發明組合物之個體中臨床體徵減輕至少20%、較佳至少30%、更佳至少40%且甚至更佳至少50%。
術語「增加之保護」在本文中意指(但不限於)與未經接種對照個體群組相比在經接種個體群組中與由感染因子(較佳地PPV5B)導致之感染相關之一或多種臨床症狀顯著減輕。術語「臨床症狀之顯著減輕」意指(但不限於)在使用感染因子攻擊後與未經接種對照群組相比在經接種個體群組中至少一種臨床症狀之發生頻率降低至少10%、較佳20%、更佳30%、甚至更佳50%且甚至更佳70%。
「長期保護」應指「改良之功效」持續至少3週,但更佳至少3個月,仍更佳至少6個月。在家畜之情形下,最佳地,該長期保護應持續到直至動物以肉出售之平均年齡。
「免疫原性或免疫組合物」係指包含至少一種PPV5B蛋白或多肽或其免疫原性部分之物質組合物,其在宿主中引發對該組合物之細胞免疫反應或抗體介導之免疫反應。在本發明之較佳實施例中,免疫原性組合物誘導免疫反應,且更佳地,賦予對抗PPV5B感染之一或多個臨床體徵的保護性免疫。
本文所用「免疫原性」PPV5B多肽或「抗原」係指引發如本文所述免疫反應之多肽或蛋白質。「免疫原性」PPV5B蛋白或多肽包括本文所鑒定編碼序列或其類似物或免疫原性片段中任一者之全長序列。術語「免疫原性片段」或「免疫原性部分」係指PPV5B蛋白之胺基酸序列之片段或經截短及/或經取代形式,其包括一或多個表位且因此引發本文所述免疫反應。一般而言,該等經截短及/或經取代形式或片段將包含或編碼來自全長蛋白(例如,衣殼蛋白)之至少13個鄰接胺基酸。更佳地,該等經截短或經取代形式或片段將具有來自全長蛋白(例如,衣殼蛋白)之至少15個、更佳地至少17個且仍更佳地至少20個、且甚至更佳地30個鄰接胺基酸。
術語「表位」意指物質組合物(例如,蛋白質或多肽)中被免疫系統、尤其被抗體、B細胞或T細胞所識別之區段或片段。在本發明
中,表位通常係病毒蛋白之多肽序列之一或多個片段。
可使用許多業內熟知表位定位技術來鑒定該等片段。例如,參見,Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66卷(Glenn E.Morris,編輯1996)Humana Press,Totowa,New Jersey。例如,線性表位可藉由以下方式測定:在固體支持物上同時合成諸多種肽(該等肽對應於蛋白質分子之部分)及使該等肽與抗體反應,同時使該等肽仍附接至該支持物。該等技術為業內已知且經闡述,例如,參見美國專利第4,708,871號;Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002;Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23:709-715。相似地,構象表位係容易地例如藉由(例如)x射線結晶學及二維核磁共振測定胺基酸之空間構象來鑒定。參見表位定位方案,上述合成抗原亦包括在該定義內,例如,多表位、側翼表位及其他重組或經合成衍生之抗原。例如,參見Bergmann等人(1993)Eur.J.Immunol.23:2777-2781;Bergmann等人(1996),J.Immunol.157:3242-3249;Suhrbier,A.(1997),Immunol.and Cell Biol.75:402-408;及Gardner等人(1998),第12界世界AIDS研討會(12th World AIDS Conference),Geneva,Switzerland,6月28日至7月3日,1998(其教示及內容全部以引用方式併入本文中)。
「免疫反應(immune response或immunological response)」意指(但不限於)出現對目標組合物或疫苗之細胞及/或抗體介導之免疫反應。通常,免疫反應(immune response或immunological response)包括(但不限於)一或多種下述效應:製造或激活特異性地針對目標組合物或疫苗中所包括之一或多種抗原之抗體、B細胞、輔助性T細胞、抑制性T細胞及/或細胞毒性T細胞。較佳地,宿主會呈現治療性或保護性免疫(記憶)反應以增強對新感染之抵抗及/或降低疾病之臨床嚴重程度。該保護可由以下來證實:與病原體感染相關之症狀數量減少、症
狀嚴重程度降低或一或多種症狀消失、病毒血症發作延遲、病毒持續時間縮短、總病毒載量降低及/或病毒分泌減少。
在本文中,「特異性免疫反應性」係指免疫反應性蛋白質或多肽識別PPV5B感染之抗原特性但不與嚴格攻擊對照之抗原特性反應。為測定可能之PPV5B免疫反應性蛋白質或其他多肽之特異性,將使用各種免疫分析(ELISA、IFA、WesternBlot)來測試該蛋白質對抗含有遺傳上相似之病毒之動物血清。亦將在各種免疫分析中測試該蛋白質對抗含有相關與該表現方法相關之蛋白質之物質(桿狀病毒、Sf9細胞等)。
本文所用「醫藥上或獸醫學上可接受之載劑」或「賦形劑」包括任何及全部溶劑、分散介質、包衣劑、佐劑、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌及抗真菌劑、等滲劑、吸收延遲劑及諸如此類。在一些較佳實施例中,且尤其包括凍乾免疫原性組合物之彼等實施例中,用於本發明之穩定劑包括用於凍乾或冷凍乾燥之穩定劑。
在一些實施例中,本發明之免疫原性組合物含有佐劑。本文所用之「佐劑」可包括氫氧化鋁及磷酸鋁;皂苷,例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech公司,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals公司,Birmingham,AL);油包水乳液;水包油乳液;水包油包水乳液。乳液可尤其基於輕質液體石蠟油(歐洲藥典類型(European Pharmacopea type));類異戊二烯油,例如角鯊烷或角鯊烯;由烯烴(尤其異丁烯或癸烯)寡聚製造之油;含有直鏈烷基之酸或醇之酯,更具體而言植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯;具支鏈脂肪酸或醇之酯,尤其異硬脂酸酯。油可與乳化劑組合使用以形成乳液。乳化劑較佳係非離子型表面活性劑,具體而言為山梨醇酐、二縮甘露醇(例如無水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇與油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸之視情況經乙氧基化之酯,以及聚氧丙烯-聚
氧乙烯共聚物嵌段,具體而言普流尼克(Pluronic)產品,尤其L121。參見Hunter等人,The Theory and Practical Application of Adjuvants(Stewart-Tull,D.E.S.編輯),JohnWiley and Sons,NY,第51頁至第94頁(1995)及Todd等人,Vaccine 15:564-570(1997)。實例性佐劑係闡述於M.Powell及M.Newman編輯之「Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach」,Plenum Press,1995之第147頁上之SPT乳液以及闡述於該同一本書第183頁上之乳液MF59。
佐劑之又一實例係選自丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物及馬來酸酐與烯基衍生物之共聚物之化合物。較佳之佐劑化合物係丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物,其尤其與糖類或多元醇之聚烯基醚交聯。此等化合物被稱為術語卡波姆(carbomer)(Pharmeuropa,第8卷,第2冊,1996年6月)。熟習此項技術者亦可參考美國專利第2,909,462號,其闡述與聚羥基化化合物交聯之該等丙烯酸系聚合物,該聚羥基化化合物具有至少3個(較佳不多於8個)羥基,至少3個羥基之氫原子由具有至少2個碳原子之不飽和脂肪族基團替代。較佳基團係彼等含有2個至4個碳原子者,例如乙烯基、烯丙基及其他烯系不飽和基團。不飽和基團自身可含有諸如甲基等其他取代基。以名稱Carbopol(BF Goodrich,Ohio,USA)出售之產品尤其適合。其可與烯丙基蔗糖或與烯丙基異戊四醇交聯。其中可提及者係Carbopol 974P、934P及971P。最佳使用Cabopol 971P。共聚物EMA(Monsanto)屬於馬來酸酐與烯基衍生物之共聚物,其為馬來酸酐與乙烯之共聚物。將該等聚合物溶解於水中會產生酸性溶液,較佳將其中和至生理pH以得到佐劑溶液,將免疫原性、免疫或疫苗組合物本身納入該佐劑溶液中。
其他適宜佐劑尤其包括(但不限於)RIBI佐劑系統(Ribi公司)、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、單磷醯脂質A、阿夫立定(Avridine)脂質-胺佐劑、來自大腸桿菌(重組的或
其他性質的)之不耐熱腸毒素、霍亂毒素、IMS 1314或胞壁醯二肽、或天然存在或重組之細胞因子或其相似物、或者內源細胞因子釋放之刺激物。
預計佐劑可以每劑量約100μg至約10mg之量、較佳地以每劑量約500μg至約5mg之量、更佳地以每劑量約750μg至約2.5mg之量且最佳地以每劑量約1mg之量添加。另一選擇為,以最終產物之體積計,佐劑之濃度可為約0.01至50%,較佳係約2%至30%,更佳為約5%至25%,仍更佳為約7%至22%,且最佳為10%至20%。
「稀釋劑」可包括水、鹽水、右旋糖、乙醇、甘油及諸如此類。等滲劑可尤其包括氯化鈉、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖。穩定劑尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸之鹼金屬鹽。
「經分離」意指「藉由手工」自其天然狀態(即,若其存在於自然界中)改變者已自其原始環境變化或去除或二者。例如,天然存在於活有機體中之多核苷酸或多肽係未「經分離」的,但自其天然狀態之共存物質分離之相同多核苷酸或多肽係「經分離」的,如本文所使用術語。
「安全性」係指在經接種後經接種動物中不存在包括(但不限於)以下在內之不利後果:基於活病毒之疫苗可能恢復毒力、臨床上顯著之副作用,例如持續全身性疾病或在疫苗投與部位不可接受之發炎。
本文所用之術語「經接種(vaccination或vaccinating)」或其變化形式意指(但不限於)包括投與本發明免疫原性組合物之過程,當將該組合物投與至動物時,其在動物中引發或能夠引發(直接或間接)對抗PPV5B之免疫反應。
在本發明之背景下,「死亡率」係指由PPV5B感染及/或由PPV5B感染增強之與其他有機體之共感染導致之死亡,且包括感染十分嚴重而使動物安樂死以免受痛苦並人道終止其生命的情況。
「減毒(attenuation)」意指降低病原體之毒力。在本發明中,「減毒」與無毒力同義。在本發明中,減毒病毒係毒力已降低從而不會引起PPV5B感染之臨床體徵但能夠在目標哺乳動物中誘導免疫反應之病毒,但亦可意味著與感染未減毒PPV5B且未接受減毒病毒之動物「對照群組」相比在感染減毒PPV5B之動物中臨床體徵之發生率或嚴重程度降低。在此背景下,術語降低(reduce/reduced)意指與如上文所定義之對照群組相比降低至少10%、較佳25%、甚至更佳50%、仍更佳60%、甚至更佳70%、仍更佳80%、甚至更佳90%且最佳100%。因此,減毒無毒力PPV5B菌株係適於納入包含經改良活PPV5B病毒之免疫原性組合物中者。
「經殺滅」或「經滅活」意指用使PPV5B病毒死亡及/或以其他方式不能再現之物理或化學試劑處理。PPV5B可藉由習用方式(例如在紫外光存在下由熱、輻射或補骨脂素)殺滅。PPV5B可藉由習用方式(例如,使用一或多種化學滅活劑經由化學滅活)滅活,該等化學滅活劑包括(但不限於)二乙烯亞胺(BEI)、β-丙內酯、福爾馬林、戊二醛及/或十二烷基硫酸鈉中之一或多者。使該等病毒之有毒力株減毒之方法及製備滅活病毒製劑之方法為業內已知且闡述於(例如)U.S.4,567,042及4,567,043中。因此,用於本發明疫苗組合物之PPV5B抗原尤其可呈全病毒形式,全病毒係經改良及/或經減毒之活病毒製劑或經殺滅或經滅活之病毒製劑。
本文所用「抗體」包括抗-PPV5B抗體,例如,單株及多株抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、豬抗體及CDR接枝之抗體,包括包括特異性識別本發明PPV5B多肽之CDR序列之化合物。術語「特異性針對」指示本發明抗體之可變區僅識別並結合PPV5B多肽(即,能夠將單一PPV5B多肽與相關多肽區分,儘管具有多肽家族中發現之序列一致性、同源性或相似性),且容許(視情況)該
等抗體與其他蛋白質(例如,金黃色葡萄球菌(S.aureus)蛋白A或ELISA技術中之其他抗體)藉助與該等抗體之可變區之外且具體而言該抗體分子之恆定區中之序列之相互作用而相互作用。測定本發明抗體之結合特異性之篩選分析眾所周知且為業內常規實踐。關於該等分析之全面論述參見Harlow等人(編輯),Antibodies A Laboratory Manual:Cold Spring Harbor Laboratory;Cold Spring Harbor,NY(1988),第6章。亦涵蓋識別並結合本發明PPV5B多肽之片段之抗體,條件係該等抗體首先係如上文所述特異性針對得到該片段之本發明之PPV5B多肽。為清晰起見,「抗體」係指因與特異性抗原之免疫反應而可與該抗原結合之免疫球蛋白分子。免疫球蛋白係由具有「恆定」區及「可變」區之「輕」及「重」多肽鏈組成之血清蛋白且係基於恆定區之組成進行分類(例如,IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)。抗體可以多種形式(包括(例如)作為Fv、Fab’、F(ab’)2以及以單鏈形式)存在,且包括含有一或多個抗體單鏈多肽序列之全部或一部分之合成多肽。
在本文中,「有效劑量」意指(但不限於)抗原引發或能夠引發免疫反應而使投與抗原之動物臨床症狀減輕的量。
在組合物之背景下,本文所用術語「有效量」意指免疫原性組合物能夠在動物中誘導免疫反應而降低感染或疾病事件之發生率或減輕其嚴重程度的量。尤其,藉由半數組織培養感染劑量(TCID50)(即病原物將使50%經接種且易患病之細胞培養物產生病理學變化之量)來監測減毒活病毒製劑之有效量(以每單位劑量或等效量度之噬斑形成單位(PFU)數量衡量)。對於經殺滅疫苗或抗原性次單位,有效量係指相對抗原含量(RAC),即每單位有效劑量之抗原納入量。另一選擇為,在治療劑之背景下,術語「有效量」係指治療劑足以減少或改善疾病或病症或其一或多個症狀之嚴重程度或持續時間、預防疾病或病
症進展、使疾病或病症復原、預防與疾病或病症相關之一或多個症狀復發、發展、發作或進展或增強或改良另一療法或治療劑之預防或治療的量。
如業內已知,「序列一致性」係指兩個或更多個多肽序列或兩個或更多個多核苷酸序列間之關係,即參考序列與相比於該參考序列之給定序列間之關係。序列一致性係對給定序列及參考序列實施能產生最高程度序列相似性(如藉由該等序列串間之匹配來確定)之最佳比對後藉由比較該等序列來確定,並視需要引入空位。在該比對後,在位置對位置(position-by-position)基礎上確定序列一致性,例如,若在一特定位置處核苷酸或胺基酸殘基係一致的,則序列在該位置係「一致」的。然後用該等位置一致性之總數量除以參考序列中核苷酸或殘基之總數量得到%序列一致性。序列一致性可容易地藉由已知方法計算,該等方法包括但不限於彼等闡述於以下中者:Computational Molecular Biology,Lesk,A.N.編輯,Oxford University Press,New York(1988);Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.編輯,Academic Press,New York(1993);Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.及Griffin,H.G.編輯,Humana Press,New Jersey(1994);Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinge,G.,Academic Press(1987);Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.及Devereux,J.,編輯,M.Stockton Press,New York(1991);及Carillo,H.及Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988),其教示以引用方式併入本文中。確定序列一致性之較佳方法經設計以給出所測試序列間之最大匹配。將確定序列一致性之方法編入可公開獲得之確定給定序列間序列一致性之電腦程式中。該等程式之實例包括(但不限於)GCG程式包(Devereux,J.,等人,Nucleic Acids Research,12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN及BLASTX
(Altschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)。該BLASTX程式可自NCBI及其他來源公開獲得(BLAST Manual,Altschul,S.等人,NCVI NLM NIH Bethesda,MD 20894;Altschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.,215:403-410(1990),其教示以引用方式併入本文中)。該等程式利用缺省空位權重最佳地比對序列以在給定序列與參考序列間產生最高程度之序列一致性。作為說明,就具有與參考核苷酸序列具有至少(例如)85%、較佳地90%、甚至更佳地95%「序列一致性」之核苷酸序列之多核苷酸而言,欲指除該給定多核苷酸序列可包括至多15個、較佳地至多10個、甚至更佳地至多5個點突變/該參考核苷酸序列之每100個核苷酸以外,該給定多核苷酸之核苷酸序列與該參考序列一致。換言之,在具有相對於參考核苷酸序列具有至少85%、較佳地90%、甚至更佳地95%一致性核苷酸序列之多核苷酸中,參考序列中至多15%、較佳地10%、甚至更佳地5%的核苷酸可能缺失或經另一核苷酸取代,或參考序列中總核苷酸之至多15%、較佳地10%、甚至更佳地5%數量之核苷酸可能***參考序列中。參考序列之該等突變可發生在參考核苷酸序列之5’或3’末端位置或在彼等末端位置之間之任何位置,其係個別地散佈在參考序列殘基中之各核苷酸之間或散佈於參考序列內之一或多個鄰接基團中。類似地,就具有與參考胺基酸序列具有至少(例如)85%、較佳地90%、甚至更佳地95%序列一致性之給定胺基酸序列之多肽而言,欲指除該給定多肽序列可包括至多15個、較佳地至多10個、甚至更佳地至多5個胺基酸改變/該參考胺基酸序列之每100個胺基酸以外,該多肽之給定胺基酸序列與該參考序列一致。換言之,為獲得與參考胺基酸序列具有至少85%、較佳地90%、甚至更佳地95%序列一致性之給定多肽序列,該參考序列中至多15%、較佳地至多10%、甚至更佳地至多5%的胺基酸殘基可能缺失或經另一胺基酸取代,或該參考序列中胺基酸殘基總數
之至多15%、較佳地至多10%、甚至更佳地至多5%數量之胺基酸可能***該參考序列中。參考序列之該等改變可發生在參考胺基酸序列之胺基或羧基末端位置或在彼等末端位置之間之任何位置,其係單獨散佈在參考序列殘基中之各殘基之間或散佈於參考序列內之一或多個鄰接基團中。較佳地,不一致之殘基位置係因保守胺基酸取代而不同。然而,當確定序列一致性時,保守取代並不作為匹配包括在內。
本文所用「序列同源性」涉及確定兩個序列之相關性之方法。為確定序列同源性,將兩個或更多個序列進行最佳比對,並視需要引入空位。然而,與「序列一致性」相比,當確定序列同源性時保守胺基酸取代亦作為匹配計數。換言之,為獲得與參考序列具有95%序列同源性之多肽,參考序列中85%、較佳地90%、甚至更佳地95%胺基酸殘基必須匹配或包含經另一胺基酸之保守取代,或參考序列中總胺基酸殘基(不包括保守取代)之至多15%、較佳地至多10%、甚至更佳地至多5%數量之胺基酸可能***參考序列中。較佳地,同源序列包含至少50個、甚至更佳100個、甚至更佳250個、甚至更佳500個編碼同源胺基酸之核苷酸之片段。
「保守取代」係指一胺基酸殘基經另一具有相似特性或性質(包括大小、疏水性等)之胺基酸殘基取代,以使得整體功能性不發生顯著變化。其亦可意指達成保守胺基酸取代之核苷酸取代。
可與本發明之PPV5B蛋白或肽偶聯或共價連接之載劑分子較佳係上文所述之彼等。用於動物用途之較佳載劑係牛血清白蛋白及鑰孔血藍蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin)。較佳地,載劑蛋白自身係免疫原。
可藉由任一業內已知習用方法將本發明之PPV5B蛋白或肽共價偶合至載劑。儘管使用對稱連接體(例如己二酸二醯肼,如Schneerson等
人,J.Experimental Medicine,152,361-376(1980)所述)或異雙官能連接體(例如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯,如Fattom等人,Infection and Immunity,56,2292-2298(1988)所述)係在本發明範圍內,但較佳避免使用任一連接體,取而代之,將本發明之PPV5B肽直接偶合至載劑分子。該偶合可藉助還原胺化來達成,如Landi等人,J.Immunology,127,1011-1019(1981)所述。
免疫原性組合物之大小(如由平均分子量定義)係可變的且取決於所選PPV5B蛋白或肽及PPV5B蛋白或肽與載劑之偶合方法。因此,其可小至1,000道爾頓(103)或大於106道爾頓。在還原胺化偶合方法情況下,PPV5B蛋白或肽之分子量通常係在5,000至500,000範圍內或更大;例如,對於SEQ ID NO:4之衣殼蛋白,預計分子量為約101,000道爾頓,預計其形成由60個單體蛋白質組成之類病毒粒子(VLP)。
特異性結合本發明之PPV5B蛋白或肽之載劑分子(即肽、其衍生物及類似物、及肽模擬物)可藉由業內已知各種方法來製造,包括(但不限於)固相合成或藉由溶液法(Nakanishi等人,1993,Gene 137:51-56;Merrifield,1963,J.Am.Chem.Soc.15:2149-2154;Neurath,H.等人編輯,The Proteins,第II卷,第3版,第105頁至第237頁,Academic Press,New York,N.Y.(1976),其以全文引用方式併入本文中)。
本發明之PPV5B蛋白或肽或本發明之其抗體或結合部分可藉由與醫藥或獸醫載劑溶解或懸浮於稀釋劑中以可注射劑量投與。
該等分子之安全性及功效係如獸醫生物製劑中心(Center for Veterinary Biologics,CVB)所闡述並規定在細胞培養物或實驗動物中藉由標準程序來測定。該等分子之毒性及治療功效可在細胞培養物或實驗動物中藉由標準醫藥程序來測定,例如測定LD50(使群體50%致死之劑量)。
本發明疫苗可為多價或單價。多價疫苗係由多種PPV5B蛋白或肽與載劑分子之免疫偶聯物製成。
在一態樣中,PPV5B蛋白或肽組合物包含有效免疫量之免疫原性偶聯物,較佳地與免疫刺激劑組合;及生理學上可接受之媒劑。在本發明背景下使用之「免疫刺激劑」意欲涵蓋任一能夠增強免疫系統之活性之化合物或組合物,不論其係與特異性抗原組合對免疫反應之一或多個要素之活性產生特異性增強作用,或僅獨立對免疫反應之一或多個要素之活性發揮作用。免疫刺激劑化合物包括(但不限於)礦物凝膠,例如,氫氧化鋁;表面活性物質,例如溶血卵磷脂、普流尼克多元醇;聚陰離子;肽;油乳液;明礬及MDP。使用該等材料之方法為業內已知,且確定給定疫苗刺激物之最佳量完全在技術人員之能力範圍內。在給定調配物中可使用一種以上免疫刺激劑。亦可將免疫原納入脂質體中或偶聯至多糖及/或其他用於疫苗調配物中之聚合物。
該等組合物視需要可存於可含有一或多種含有該活性成份之單位劑型之包裝或分配器裝置中。包裝可包含(例如)金屬或塑膠箔,例如泡罩包裝。包裝或分配器裝置可附帶較佳用於投與哺乳動物、尤其豬之投與說明書。
為進一步增加由此提供且含有一或多種PPV5B蛋白或肽之免疫原性組合物之免疫原性,該組合物亦可包含一或多種佐劑。
佐劑可藉由任一先前所述或業內已知技術純化。較佳純化技術係矽膠層析,具體而言,「急驟」(快速)層析技術,如W.Clark Still等人,J.Organic Chemistry,43,2923-2925(1978)所述。然而,可使用其他層析方法(包括HPLC)來純化佐劑。結晶亦可用於純化佐劑。在一些情形下,因自合成直接獲得分析純產物而無需純化。
本發明疫苗組合物係根據已知用以製造佐劑化組合物之技術在
適當無菌條件下藉由將佐劑與PPV5B蛋白或肽進行物理混合來製備。因偶聯物上存在可被靜電吸引至存於長鏈烷基化合物佐劑上之正電荷之淨負電荷而促進PPV5B蛋白或肽與佐劑複合。
可使用與用於其他醫藥多肽組合物之技術相似之技術調配本發明疫苗組合物。因此,佐劑及PPV5B蛋白或肽(較佳偶聯至載劑分子及/或與佐劑混合)可以凍乾形式儲存且在投與前在生理學上可接受之媒劑中還原以形成懸浮液。另一選擇為,可將佐劑及偶聯物儲存於媒劑中。較佳媒劑係無菌溶液,具體而言,無菌緩衝溶液,例如磷酸鹽緩衝鹽水。任一將佐劑及偶聯物組合於媒劑中以達成免疫原性組合物改良之免疫效力的方法皆係適當的。
本發明疫苗之單一劑量之體積可變化,但通常將在習用疫苗之常用範圍內。在上文所說明偶聯物及佐劑之濃度下,單一劑量之體積較佳介於約0.1ml與約3ml之間,較佳地介於約0.2ml與約1.5ml之間,更佳地約1.0ml。
本發明疫苗組合物可藉由任何習用方式投與。
包含偶合至載劑分子之PPV5B蛋白或肽之免疫原性偶聯物可用作對抗一或多種PPV5B血清型之免疫用疫苗。包含該免疫原性偶聯物於生理學上可接受之媒劑中之疫苗可用於免疫動物、較佳地豬以治療或預防PPV5B之感染之方法中。
利用免疫原性偶聯物經免疫產生之對抗本發明免疫原性偶聯物之抗體可用於被動免疫療法及產生用於治療或預防PPV5B感染之抗獨特型抗體。
投與組合物之個體較佳係動物,包括(但不限於)母牛、馬、綿羊、豬、家禽(例如,雞)、山羊、貓、犬、倉鼠、小鼠及大鼠;最佳
係豬。
本發明調配物包含有效免疫量之一或多種免疫原性組合物或對其之抗體及生理學上可接受之媒劑。疫苗包含有效免疫量之一或多種免疫原性組合物及生理學上可接受之媒劑。該調配物應適合投與模式。
免疫原性組合物視需要亦可含有少量潤濕劑或乳化劑、或pH緩衝劑。免疫原性組合物可為液體溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物或粉末。口服調配物可包括標準載劑,例如醫藥級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。
本文所述化合物可以治療有效劑量投與個體以治療PPV5B相關疾病。劑量將取決於接受疫苗之宿主以及諸如宿主之體型、體重及年齡等因素。
用於調配物中之本發明之免疫原性偶聯物或抗體之精確量將取決於投與途徑及個體性質(例如,物種、年齡、大小、疾病之階段/程度),且應根據醫師之判斷及每一個體之情況根據標準臨床技術決定。有效免疫量即足以治療或預防個體之PPV5B傳染性疾病之量。有效劑量亦可自源自動物模型測試系統之劑量-反應曲線外推且可自0.1mg/kg至20mg/kg、較佳地1mg/kg至10mg/kg變化。
組合物之免疫原性可藉由利用任一業內已知免疫分析監測測試個體在用該組合物免疫後之免疫反應來測定。體液(抗體)反應及/或細胞介導之免疫性之產生可視為免疫反應之指示。測試個體可包括動物,例如豬、小鼠、倉鼠、犬、貓、兔、母牛、馬、綿羊及家禽(例如雞、鴨、鵝及火雞)。
測試個體之免疫反應可藉由諸如以下各種方法來分析:所得免疫血清對該免疫原性偶聯物之反應性,如藉由(例如)酶聯免疫吸附分
析(ELISA)、免疫印跡、免疫沈澱等已知技術來分析;或保護經免疫宿主免於感染該病原體及/或減輕經免疫宿主中由感染該病原體導致之症狀,如藉由任一業內已知用於分析傳染性致病因子之含量之方法(例如,定量PCR、病毒分離或其他業內已知技術)來測定。該傳染性致病因子之含量亦可藉由量測該免疫球蛋白所針對之抗原之量來測定。該傳染性致病因子之量降低或該傳染性疾病之症狀改善指示該組合物有效。
可於在活體內用於動物之前在活體外測試本發明治療劑之預期治療或預防活性。例如,可用於確定指示是否投與具體治療劑之活體外分析包括活體外細胞培養分析,其中將來自細胞系或自患有特定疾病或病症之個體培養之細胞之適當細胞暴露於或經其他方式投與治療劑,並觀察該治療劑對細胞之影響。
另一選擇為,可藉由以下方式來分析該治療劑:使該治療劑接觸易患由該傳染性致病因子導致之感染但感染該傳染性致病因子之細胞(自個體培養或來自經培養細胞系),將該等細胞暴露於該傳染性致病因子,且然後確定與該治療劑接觸之細胞之感染率是否低於未與該治療劑接觸之細胞之感染率。可藉由任一業內已知方法來分析傳染性致病因子對細胞之感染。
另外,可藉由在療法之前、期間或之後以適宜時間間隔在動物模型個體中量測抗體所針對之分子之量來評價該治療劑。可鑒定出該分子之量之任何變化或無變化並與該治療對個體之影響關聯。可藉由任一業內已知方法來測定該分子之量。
在使用本發明之方法及組合物對動物接種PPV5B後,可使用任一業內已知結合分析來評估所得抗體與特定分子間之結合。亦可實施該等分析來選擇對特定抗原展示更高親和性或特異性之抗體。
本發明之抗體或其結合部分(利用天然PPV5B得到)、減毒病毒、蛋白質或肽可用於檢測樣品中PPV5B之存在。此檢測方法包含以下步驟:提供對抗本發明之天然PPV5B、減毒病毒、蛋白質或肽而產生之經分離抗體或其結合部分,向該經分離抗體或其結合部分中添加疑似含有一定量PPV5B病毒之樣品,及檢測包含與PPV5B病毒結合之該經分離抗體或其結合部分之複合物之存在。
本發明之抗體或其結合部分亦可用於檢測樣品中PPV5B蛋白或肽之存在。此檢測方法包含以下步驟:提供對抗天然PPV5B、減毒病毒、蛋白質或肽而產生之經分離抗體或其結合部分,向該經分離抗體或其結合部分中添加疑似含有一定量PPV5B蛋白或肽之樣品,及檢測包含與該PPV5B蛋白或肽結合之該經分離抗體或其結合部分之複合物之存在。
結合為結合對成員之特異性分子之免疫球蛋白、尤其抗體(及其功能性活性片段)可用作診斷學及預測學,如本文所述。在各實施例中,本發明提供結合對成員之量測值,並將該等量測值用於臨床應用中。本發明中之免疫球蛋白可用於(例如)檢測生物樣品中之抗原,藉此可測試個體之與免疫球蛋白結合之分子之偏離量及/或該等分子之異常形式之存在。「偏離量」意指在來自身體某一部分或來自未患該疾病之個體之類似樣品中相對於當前值或代表當前值之標準量增加或減小。本發明抗體亦可作為試劑包括在用於診斷或預後技術之套組中。
在一態樣中,與天然PPV5B或減毒病毒、蛋白質或肽免疫特異性結合之本發明抗體可用於診斷、預測或篩選PPV5B感染。
在另一態樣中,本發明提供診斷或篩選PPV5B感染或對其之免疫性之存在之方法,其包含在個體中量測抗體與來源於該個體之樣品之免疫特異性結合之程度,其中該抗體免疫特異性結合PPV5B蛋白或
肽,其中該免疫特異性結合之程度相對於來自不具有該傳染性致病因子之個體之類似樣品中之該免疫特異性結合之程度增加指示PPV5B之存在。
適於檢測PPV5B肽或其拮抗劑之存在之分析之實例包括(但不限於)ELISA、放射免疫分析、凝膠擴散沈澱反應分析、免疫擴散分析、凝集分析、螢光免疫分析、蛋白A免疫分析或免疫電泳分析。
用於特定分子之免疫分析將通常包含在以可檢測方式標記之抗體存在下培育樣品(例如生物流體、組織提取物、剛剛收穫之細胞或經培養細胞之裂解物)及藉由業內熟知多種技術中之任一者檢測該經結合抗體。
可根據熟知方法來測定給定抗體之結合活性。熟習此項技術者藉由採用常規實驗將能夠確定各測定之有效最佳分析條件。
本發明之另一態樣關於用於檢測或量測PPV5B之診斷套組。提供用於診斷用途之套組,其於一或多個容器中包含抗-PPV5B抗體及視情況該抗體之經標記結合配偶體。另一選擇為,可對抗-PPV5B抗體進行標記(用可檢測之標記物,例如,化學發光、酶性、螢光或放射性部分)。因此,本發明提供包含抗-PPV5B抗體及對照免疫球蛋白之診斷套組。在具體實施例中,該容器中之一種上述化合物可以可檢測方式標記。套組視情況可進一步於容器中包含預定量之由該套組之抗體識別之PPV5B病毒、蛋白質或肽用作標準品或對照。
投與途徑包括(但不限於)鼻內、經口(例如,於飲用水中)、真皮內及肌內。肌內投與尤佳。熟習此項技術者應認識到,本發明組合物亦可以一次、兩次或更多次劑量以及藉由其他投與途徑來投與。例如,該等其他途徑包括皮下、皮內、靜脈內、血管內、動脈內、腹膜腔內、鞘內、氣管內、心臟內、肺葉內(intralobally)、髓內、肺內或
***內。端視治療所期望之持續時間及效力而定,本發明組合物可投與一次或數次,亦可間歇投與,例如以每日計投與數天、數週或數月且以不同劑量。
本發明包括下列實例以展示本發明之較佳實施例。熟習此項技術者應瞭解,下列實例中揭示之技術代表本發明者發現可良好用於實施本發明之技術,且因此可認為該等技術係實施本發明之較佳方式。然而,熟習此項技術者借助於本揭示內容應瞭解,可在不背離本發明之精神及範圍之情況下對所揭示具體實施例作出多種改變且仍獲得相同或相似結果。
本申請案與2012年12月17日提出申請之標題為「Porcine Parvovirus 5A,Methods of Use and Vaccine」之美國第61/738,110號申請案相關,該申請案之全部內容以引用方式併入本文中。
材料來源:自罕見爆發調查接收來自3只豬之組織勻漿。農場之病史係200lb豬患有全身肌肉震顫,該疾病在休息時存在但在運動期間加劇。在獸醫診斷實驗室進行廣泛測試後,將樣品提供本給發明者以幫助測定該等動物中CNS體徵之潛在原因,該廣泛測試表明為病毒劑(基於微細損傷),但僅鑒定為Agent X(非典型豬瘟病毒相關瘟病毒屬)。
DNA及蛋白質分析:使用購自454 Life Sciences(Branford CT)之高通量測序法(「454技術」)來實施受侵襲豬樣品之DNA分析,此係由Operon(Huntsville AL)實施。藉助用核酸酶處理病毒粒子保護之核酸,隨後進行提取、隨機擴增及高通量測序使樣品富含病毒序列;通常如Victoria等人PLoS pathogen 2008年9月26日;4(9):e1000163中所述實施。
所得序列最初藉由BLASTx分析表徵為小病毒科之分枝成員。使用Sequencher軟體來組裝序列且該等DNA分析偶聯靶向序列之結果產生SEQ ID NO:1之DNA序列,其係命名為PPV5B之病毒之假定完整編碼序列。使用Sequencher軟體對該DNA序列之進一步分析鑒定出三個假定編碼區,該等區對應於彼等於其他小病毒物種中發現者,包含病毒複製酶(SEQ ID NO:2)、開放閱讀框「ORF3」(SEQ ID NO:3)及病毒衣殼蛋白(SEQ ID NO:4)。
在2只來自不同州之不相關豬之肺勻漿樣品中藉由454技術(病毒宏基因組學)來鑒定DNA序列。BLASTn及BLASTx分析揭示與豬小病毒4之一致性最接近,其中在複製酶基因(REP)之保守區中核苷酸一致性之最大值為67%,而在該核苷酸量下衣殼(CAP)編碼區未展示可辨別之匹配。在該蛋白質量下,假定複製酶蛋白在衣殼蛋白中展示約60%胺基酸一致性及約50%一致性。將該病毒命名為新物種豬小病毒5B(PPV5B)。基於衣殼編碼序列研發特異性引子且組織及病理學/臨床特性相似之勻漿之基於PCR之篩選揭示在約16%樣品中存在該病毒劑。基於所報告臨床體徵及與所篩選組織相關之病毒學數據,觀察到與若干其他病毒劑及臨床病理學/組織病理學統計學上顯著相關。
多種已知病毒屬之假定複製酶(REP)及衣殼(VP1/CAP)蛋白二者之逐對胺基酸一致性顯示於圖5中。PPV5B與PPV4之序列一致性相對最接近,其中REP及CAP(分別為約90%/65%)支持將PPV5B作為新物種命名。
譜系分析(圖6)揭示該病毒為小病毒科中之新穎物種且基於CAP蛋白之保守區為小病毒屬。使用更保守REP蛋白序列(未顯示)達成相似結果。
使用受PPV5B感染之CDCD豬之腦勻漿來接種剖腹分娩且未食初乳(CDCD)之動物以試圖擴增病毒並確定是否與該等新穎小病毒及PRRSV共感染導致臨床呼吸體徵增加。在此研究中,在用含有該等新穎小病毒之組織勻漿接種之群組中存在意外高死亡率數值(20%至22%)且使用靶向衣殼編碼區之PPV5B特異性PCR在血清中鑒定出高效價PPV5B。然後使用來自此研究中之一只動物之組織來攻擊CDCD豬以再現臨床體徵。在此研究中,在大多數受感染動物中注意到伴有高效價病毒血症之全身性感染。在接受含有PPV5B之接種物之群組中,存在死亡率之高發生率(20%)、跛行、平均每日增重降低、發熱及大體損傷及微細損傷二者。
使用無菌研缽及研杵將PCR陽性組織(例如脾、腦、肺、腸等)之小切片研碎。將經研磨組織再懸浮於5-10ml含有HEPES緩衝液及抗生素之經改良EMEM中並純化以消除較大組織塊。收集上清液並使其連續地通過多個過濾器以消除包括細菌在內之大多數較大粒子。另外,亦藉由連續過濾處理來自PCR陽性動物之糞便樣品懸浮液及血清以分離病毒。
將濾液之稀釋液用胰蛋白酶處理或保持未處理並在特定溫度下吸附至存於6孔板中之已建立細胞培養物及原代細胞培養物(下文所列示)上。抽吸出接種液並用2ml新鮮維持培養基替代。然後在33℃至37℃下在5% CO2氣氛中培育板並每日觀察與模擬(普通培養基)接種之對照相比之細胞病變效應,例如細胞變圓、細胞融合(cell-cell fusion)、脫落、細胞簇聚等。藉由PCR篩選可能之陽性孔用於病毒生長/分離。
所建立可用於病毒分離之細胞系尤其包括:ST(豬睪丸)、SK6
(豬腎)、BHK-21(幼倉鼠腎)、VIDO R1(胎豬視網膜)、PK-15 NADC(豬腎)、PK/WRL(豬腎)、HRT-180(人類結腸直腸腺癌)、Hep2(人類上皮)、Vero(非洲綠猴腎)及RK-13(兔腎)。
可用於該製程之原代細胞培養物尤其包括:胚胎豬肺、腎、睪丸、氣管及腸培養物。
當分離出病毒時,藉由多輪噬斑純化(plaque purification)或限數稀釋法(limiting dilution)將其純化並以更大量擴增並產生用於動物實驗之儲備培養物。
在約35℃至39℃之間且在2mM至15mM BEI存在下、仍更佳在約10mM BEI存在下實施滅活。實施滅活至少24小時、至多24小時至72小時。然後添加等效量之中和溶液中滅活劑之試劑;例如,等效量之硫代硫酸鈉。滅活病毒製劑係根據業內已知方法製備,例如,如Preuss,T.等人,Comparison of Two Different Methods for Inactivation of Viruses in Serum,CLINICAL AND DIAGNOSTIC LABORATORY IMMUNOLOGY,(1997),504-508或Bahnemann,H.G.,Inactivation of viral antigens for vaccine preparation with particular reference to the application of binary ethylenimine,VACCINE,(1990),299-303中所揭示。在製備滅活病毒後,將該物質與載劑製劑組合用於最終疫苗調配物。
減毒病毒製劑係根據業內已知方法製備,例如,如Vaccine Protocols,第2版;Robinson、Husdon、Cranage編輯,Humana Press 2003中所揭示。例如,「...使野生型病毒在組織培養物/動物宿主中廣泛地傳代直至在毒力損失與免疫原性保留之間達到可接受之平衡...」。
藉由多輪噬斑純化或限數稀釋法來純化減毒病毒。使用PCR分
析、深度測序或免疫螢光分析來測定該培養物質之特異性。
藉由將經純化減毒病毒製劑與載劑製劑組合來製備減毒病毒疫苗。
SEQ ID NO:4之衣殼蛋白係藉由使經選殖SEQ ID NO:4或其片段在各種蛋白質表現系統中表現來製備。
桿狀病毒表現:通常根據Kost等人(6),2012中所揭示方法使SEQ ID NO:4之PPV5B衣殼蛋白在桿狀病毒表現系統中表現。在初次純化後在不溶部分中發現少量該蛋白。增加產率及溶解度之方法包括(但不限於)使用替代緩衝條件(例如脲或胍鹽酸鹽)、替代結合及純化條件(例如鈷或鎳親和性管柱、陰離子或陽離子交換管柱)、或替代表現條件(例如溫度、時間、替代細胞系)。
細菌表現:通常根據EMD Chemicals公司,Novagen User Protocol TB184中所揭示方法使SEQ ID NO:4之PPV5B衣殼蛋白在細菌表現系統中表現。此方法包括添加包含於細菌載體中之固有HIS標籤(EMD Chemicals公司,2011(7))以促進所製造蛋白質之純化。通常根據GE Healthcare,2012(8)中所揭示方法來純化用細菌表現之HIS標示之衣殼蛋白且所得產物用來產生PPV5B特異性抗體,如實例8中所述。
藉由將經純化衣殼蛋白製劑與載劑製劑組合來製備減毒次單位疫苗。
藉由用PPV5B病毒之抗原性製劑、或衣殼(SEQ ID NO:4)蛋白或其片段之次單位蛋白製劑免疫兔來製備與PPV5B特異性結合之抗體。針對與PPV5B抗原結合之多株抗體篩選來自經接種兔之血清樣品。將來自確定對該抗原產生抗體之經接種小鼠之脾與骨髓瘤細胞融合以產
生融合瘤。然後針對與PPV5B抗原之結合篩選融合瘤。
多株抗體:在客製化抗體製備服務(Rockland Antibodies and Assays;Gilbertsville,PA)下使用根據實例7製備之HIS標示之用細菌表現之衣殼蛋白來免疫2只新西蘭白兔。在D0、D7、D14及D28用約100μg抗原/兔免疫兔。對於D0及D7接種,動物係真皮內接種;在D14及28給與之接種係皮下投與。在首次接種中使用費氏完全佐劑(Complete Freund’s adjuvant);在後續接種中使用費氏不完全佐劑(incomplete Freud’s adjuvant)。在免疫前及免疫後38天及45天收集來自該兩隻兔之血清樣品。
由Rockland Antibodies and Assays針對抗-PPV5B特異性篩選多株抗體製劑。藉由免疫螢光分析(IFA)、西方墨點法(western blot)及酶聯免疫吸附分析(ELISA)來製備對經純化或經部分地純化之PPV5B蛋白具有結合特異性之抗體。各分析之特異性參數如下:西方墨點法特異性係藉由檢測預計79.0kDa大小之蛋白質來量測,IFA特異性係藉由與未受感染細胞比較來量測,且ELISA特異性係藉由用不相關蛋白質塗覆板來量測。
單株抗體:在客製化抗體製備服務(Rockland Antibodies and Assays;Gilbertsville,PA)下在Balb/c小鼠中使用根據實例7製備之HIS標示之經桿狀病毒表現之衣殼蛋白來製造單株抗體。藉由客製化抗體製造設備根據所設計標準方案用各種PPV5B抗原性製劑免疫小鼠。藉由客製化抗體製造設備來監測接種後免疫反應並選擇抗體候選者用於產生融合瘤。用於產生單株抗體之標準方案為熟習此項技術者所熟知,例如如Gabriele等人(9),第117頁至第135頁中所揭示。
藉由根據標準方案將於融合瘤培養基中培養至增殖階段之B細胞腫瘤細胞與自確定對PPV5B抗原產生抗體之經接種小鼠收穫之脾細胞組合來產生融合瘤,如Gabriele等人(9),第117頁至第135頁所揭示。
在對融合瘤進行融合及培養後,針對與PPV5B抗原之結合篩選融合瘤,並選擇抗-PPV5B產生之融合瘤。根據標準方案使用親和性層析來純化融合瘤產生之單株抗體,如Gabriele等人(9),第209頁至第232頁中所揭示。
使用該領域熟知之免疫技術(例如ELISA、西方墨點分析及表位定位)來鑒定特異性針對PPV5B之高親和性抗體並進一步表徵,包括測定與其結合之表位、該抗體相對於其他相關病毒物種之特異性及選擇對PPV5B病毒抗原具有高特異性之適宜高親和性抗體(Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66卷(Glenn E.Morris編輯,1996)Humana Press,Totowa,New Jersey)。
ELISA分析:使用ELISA程序使用根據實例8製備之抗體來量測生物樣品中之PPV5B。該分析係如下實施:在塗覆緩衝液(0.05M碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液;pH 9.6)中稀釋選自SEQ ID NO:4之衣殼蛋白之包被抗原(Coating antigen)以達成0.25ng/μl之最終濃度。用50μl/孔包被抗原塗覆板(高蛋白質結合96孔ELISA板,Phenix目錄編號MPG-655061)。將板密封並在37℃下培育1小時或在4℃下過夜。去除塗覆溶液並將板用200μl/孔PBST(1X PBS+0.05%Tween-20)洗滌3次。用300μl/孔封阻溶液(存於PBS中之0.5% w/v無脂乾乳)塗覆板,密封並在37℃下培育1小時。去除封阻溶液並將板用200μl/孔PBST洗滌3次。將樣品以1:100稀釋於封阻溶液中;將100μl/孔血清樣品添加至板中。將板密封並在37℃下培育1小時。去除血清樣品並將板用200μl/孔PBST洗滌3次。將二級抗體(HRP-偶聯-山羊抗-豬IgG(H+L);Jackson Immuno-Research 114-035-003)於封阻溶液中稀釋至1:10,000並用於以100μl/孔塗覆板。將板密封並在37℃下培育1小時。去除二級抗體並將板用200μl/孔PBST洗滌3次。用50
μl/孔TMB(3,5,3’,5’-四甲基聯苯胺;KPL目錄編號53-00-01)塗覆板。在室溫下在黑暗中將板培育約10分鐘。用50μl/孔終止溶液(2M H2SO4;KPL目錄編號50-85-04)塗覆板。在450nm下讀取光學密度。
PCR分析:已最佳化PPV5B之基於凝膠之PCR及qPCR分析。該等分析係如下實施:對於qPCR分析,各反應物係藉由添加以下試劑來製備:10μl/反應物之2X SsoFast probe supermix(BioRad,目錄編號172-5233)、5μl/反應物之經DEPC處理之水、1μl/反應物之6μM濃度正向引子(ACC AGA GAA CAG GCG ACA T:SEQ ID NO:6)、1μl/反應物之6μM濃度反向引子(AAA CAC CTG ATG GGA CCA TAA T:SEQ ID NO:7)、1μl/反應物之4μM濃度探針(6-FAM/ACT CAA CAG CCA GGA CCG AGA ACA CAG GAA/BHQ_1:SEQ ID NO:8)及2μl/反應物之經提取DNA。該反應係在T100熱循環儀(Bio-Rad)上實施,在95℃下歷經一個循環,持續2分鐘,隨後在以下兩個溫度下歷經40個循環:95℃持續5秒,隨後60℃持續5秒。使用CFX96光學成像系統(Bio-Rad)讀取數據。對於基於凝膠之分析,各反應物係藉由添加以下試劑來製備:12.5μl/反應物之2X AmpliTaq Gold Mastermix(Applied Biosystems,目錄編號4302758)、8.0μl/反應物之經DEPC處理之水、1.25μl/反應物之10μM濃度正向引子(CCA GAT TTA CAT TTT GAG CAG CTA ACA CAG TAC:SEQ ID NO:9)、1.25μl/反應物之10μM濃度反向引子(GGA TAT AAG CCC AAA TCT GAG ACT CTA G:SEQ ID NO:10)及2μl/反應物之經提取DNA。該反應係在T100熱循環儀(Bio-Rad)上實施,在95℃下歷經一個循環,持續5分鐘,隨後在以下溫度下歷經40個循環:95℃持續30秒、60℃持續30秒及72℃持續45秒,隨後在72℃下最終延長10分鐘。
為評價包含至少一種PPV5B蛋白或多肽之物質組合物(原型
PPV5B疫苗)在豬中之功效,實施隨機化研究,該研究使用隨機分成三個群組之5週齡未食初乳且剖腹分娩(CDCD)之動物(參見表2)。在研究第0天(D0)及D14用組合物或安慰劑(磷酸鹽緩衝鹽水;PBS)接種動物。在D28用已知含有PPV5B之物質攻擊動物。監測臨床觀察、直腸溫度、體重量測及血液採集。在D56,對動物進行屍檢以評價大體損傷。藉由在統計學上比較經接種動物與未接種動物之百分比死亡率、病毒血症(效價及持續時間)、血清轉化現象(效價及持續時間)及臨床體徵來測定PPV5B疫苗之功效。
根據本揭示內容無需過多實驗即可獲得並實施本文所揭示及主張之所有組合物及方法。儘管本發明之組合物及方法已根據較佳實施例予以闡述,但熟習此項技術者應明瞭,可在不背離本發明之概念、精神及範圍之情況下改變該等組合物及方法及本文所述方法之步驟或步驟之順序。更具體而言,應明瞭,某些在化學及生理上皆相關之試劑可代替本文所述試劑並同時可達成相同或相似結果。熟習此項技術者顯而易見之所有該等相似替代物及修改皆被視為涵蓋於隨附申請專利範圍所界定之本發明之精神、範圍及概念內。
下列參考文獻明確地以引用方式併入本文中,從而提供例示性程序或其他補充本文所闡述者之細節。
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<213> 豬小病毒4
<400> 11
Claims (27)
- 一種經分離多核苷酸,其包含如下之多核苷酸:a)具有SEQ ID NO:1之核酸序列;b)具有編碼SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之多肽之核酸序列;c)具有與SEQ ID NO:1至少80%一致之核酸序列,該核酸序列編碼具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之多肽之生物或免疫有效活性之多肽;d)為該SEQ ID NO:1之核酸序列之片段,該片段包含編碼SEQ ID NO:4之至少30個鄰接核苷酸序列,或e)為該SEQ ID NO:1之核酸序列之片段,該片段包含SEQ ID NO:1之至少30個鄰接核苷酸序列,且該等核苷酸序列編碼SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之免疫有效活性之胺基酸序列。
- 一種經分離多肽,其包含如下之多肽:a)具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之胺基酸序列;b)具有與SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4至少80%一致之胺基酸序列且具有由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4編碼之多肽之生物或免疫有效活性;c)為該SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之胺基酸序列之片段,該片段包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之至少13個鄰接胺基酸;d)為該SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之胺基酸序列之片段,該片段包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之至少13個鄰接胺基酸且具有免疫有效活性;或e)由包含SEQ ID NO:1之第2161位至第2860位核苷酸或SEQ ID NO:1之第2861位至第5014位核苷酸之序列中所包括之至少39個核苷酸之多核苷酸編碼之蛋白質片段。
- 一種經分離豬小病毒5B(PPV5B),其包含a)SEQ ID NO:1之核酸序列,或b)與SEQ ID NO:1至少80%一致之核酸序列,該核酸序列編碼具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之多肽之生物或免疫有效活性之多肽。
- 如請求項3之PPV5B,其包含PPV5B之減毒無毒力形式。
- 一種用於治療或預防由有毒力PPV5B導致之感染之疫苗,其包含如請求項3之PPV5B之經殺滅或經減毒形式。
- 一種用於治療或預防由有毒力PPV5B導致之感染之疫苗,其包含如請求項3之PPV5B之經殺滅或經減毒形式之次單位。
- 如請求項6之疫苗,其中該次單位係SEQ ID NO:4之衣殼蛋白。
- 如請求項6之疫苗,其中該次單位係SEQ ID NO:4之多肽之免疫有效片段。
- 一種免疫原性製劑,其包含免疫有效量之如請求項2之多肽及醫藥上或獸醫上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
- 一種免疫有效量之如請求項3之PPV5B在製造藥劑中之用途,該藥劑用於在哺乳動物中產生免疫反應。
- 一種免疫有效量之如請求項2之多肽在製造藥劑中之用途,該藥劑用於在哺乳動物中產生免疫反應。
- 一種免疫有效量之如請求項5之疫苗在製造藥劑中之用途,該藥劑用於在哺乳動物中產生免疫反應。
- 一種免疫有效量之如請求項6之疫苗在製造藥劑中之用途,該藥劑用於在哺乳動物中產生免疫反應。
- 一種免疫有效量之如請求項7之疫苗在製造藥劑中之用途,該藥劑用於在哺乳動物中產生免疫反應。
- 如請求項10之用途,其中該哺乳動物係豬,且該免疫反應提供 對由PPV5B感染引起之疾病之保護性免疫。
- 如請求項11之用途,其中該哺乳動物係豬,且該免疫反應提供對由PPV5B感染引起之疾病之保護性免疫。
- 如請求項12之用途,其中該哺乳動物係豬,且該免疫反應提供對由PPV5B感染引起之疾病之保護性免疫。
- 如請求項13之用途,其中該哺乳動物係豬,且該免疫反應提供對由PPV5B感染引起之疾病之保護性免疫。
- 如請求項14之用途,其中該哺乳動物係豬,且該免疫反應提供對由PPV5B感染引起之疾病之保護性免疫。
- 一種經分離抗體,其與由具有SEQ ID NO:1之序列之豬小病毒5B多核苷酸編碼之PPV5B多肽特異性結合,該多肽具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之胺基酸序列,且其中該抗體不與由不同小病毒編碼之多肽結合。
- 一種鑒定生物樣品中PPV5B之存在之方法,其包含a)使該生物樣品與如請求項20之抗體接觸,b)檢測該抗體與PPV5B多肽間之複合物之形成,其中存在該複合物指示該生物樣品中存在PPV5B。
- 一種載體或質體,其包含如請求項1之多核苷酸。
- 一種宿主細胞,其包含如請求項22之載體。
- 一種融合瘤,其表現如請求項20之抗體。
- 一種用於鑒定生物樣品中PPV5B之存在之診斷套組,其包含a)如請求項20之抗體,及b)用於檢測該抗體與PPV5B多肽間之複合物之形成之試劑。
- 一種免疫原性套組,其包含a)至少一種有效對動物進行免疫以對抗至少一種與PPV5B感染相關之疾病之免疫原性PPV5B肽; b)至少一種載劑或佐劑分子;c)用於包裝該免疫原性組合物之容器;d)一套印刷說明書;及e)能夠將該免疫原性組合物投與動物之分配器。
- 如請求項26之免疫原性套組,其進一步包含至少一種有效對該動物進行免疫以對抗至少另一種引起與感染豬病原性病毒或細菌相關之疾病之該病毒或細菌之免疫原性蛋白質。
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