TW201446258A - 用於促進傷口癒合之短生物活性肽 - Google Patents
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Abstract
本發明揭示具有生物活性之具有4至6個胺基酸殘基之肽。該等肽構成本身為抗微生物蛋白天蠶蛾素(cecropin)B之片段之肽HB-107(MPKEKVFLKIEKMGRNIRN)之短片段,且展現細胞刺激及遷移性質。本發明肽包括位於HB107(MPKEKVFLKIEKMGRNIRN)之位置11與16之間(即EKMGRN)之4至6個連續胺基酸殘基。該等所揭示之肽包括用於醫學治療例如來自糖尿病潰瘍之皮膚創傷之可用試劑。該等肽亦有效地預防並逆轉源自各種環境傷害之皮膚表面損傷。重要的是,該等肽之治療效應在等於或大於肽HB-107之彼等濃度下呈現,且因此代表用於研發有效療法之較廉價、更通用的方式。本發明亦揭示產生及使用該等肽之方法。
Description
本申請案主張於2013年2月14日提出申請之美國臨時申請案第61/764,913號之優先權益,該申請案之全文以引用方式併入本文中。
本發明係關於具有生物、化妝品及治療活性之肽。具體而言,本發明係關於刺激角質細胞細胞增殖及遷移之具有SEQ ID NO:1(EKMGRN)之4至6個連續胺基酸殘基之短肽。本發明進一步係關於使用該等肽來促進傷口修復及治療侵襲皮膚及其他相關體表(例如口腔)之多種損傷之方法。
皮膚係身體之最大器官且係環境與內部生物之間之界面。其係由兩個主要層構成:表皮,其係皮膚之最外層;及真皮,其緊鄰表皮下方。角質細胞係構成95%表皮之主要細胞。上基部角質細胞分化成由蛋白質及脂質(包含神經醯胺、膽固醇及脂肪酸)圍繞之在化學及物理上有抗性之角質層。自然或強制移除此角化上皮之頂層將刺激下伏細胞轉換來替代受損或損失的細胞。此角化層在身體與環境之間提供保護及水障壁功能。角質細胞之主要功能係形成障壁來保護身體免於化學、物理及機械危害、微生物之侵襲、熱、UV輻射及失水(Proksch等人,2008)。角質細胞亦係與表皮連續之黏膜組織之主要成份(Presland及Dale,2000)。
傷口定義為皮膚之上皮完整性之破壞。正常傷口癒合涉及複雜且為動態但良好協調之一系列事件,包含發炎、新組織形成及組織重塑。傷口癒合開始於組織受損之時刻且需要上皮形成與真皮修復之精確配合,其中上皮形成過程最終取決於角質細胞之遷移、增殖及分化能力(Singer及Clark,1999)。在上皮形成期間,位於傷口週邊之角質細胞遷移且增殖以在傷口上方形成單層。角質細胞之進一步增殖及分化建立包括正常複層之表皮層。具有正常真皮纖維母細胞之角質細胞亦使得I型及III型膠原之mRNA上調、纖維母細胞增殖增加及細胞外基質累積並重塑,以藉由恢復組織之結構及功能來完成癒合(Bergers G及Coussens LM,2000)。因此,角質細胞增殖及遷移之能力對於在皮膚表面上實施該等過程至關重要。鑒於已知某些生長因子天然地參與傷口癒合,業內已致力於研發出用於治療傷口之基於生長因子之方法(Mustoe等人,1994;Steed,1995)。然而,大多數採用該策略之嘗試無法達成臨床上顯著的結果,此部分歸因於與使用諸如所涉及之較大尺寸之蛋白質等治療性蛋白質相關聯之困難。使用生長因子之療法亦具有與製備較大蛋白質相關之複雜性及高成本。已表明,宿主防禦肽(HDP)(亦稱為抗微生物肽)係皮膚傷口癒合之調控劑。由於其尺寸較小,故該等短活性肽已吸引治療劑研發之注意(Zhang及Falla,2006)。
HDP在自然界中普遍存在且形成真核生物之固有免疫系統之中心組份。其作為病原體清除以及宿主細胞行為調節之效應子來促進組織再生及修復,故其對於固有宿主防禦至關重要。正常傷口修復涉及發炎、上皮形成、組織-肉芽及重塑之精確協調。已顯示宿主防禦肽影響所有該等行為。抗菌肽PR-39因抑制嗜中性球氧化酶活性而具有抗發炎功能,且誘導傷口修復中重要的多配體蛋白聚糖硫酸肝素蛋白聚糖(Gallo等人,1994;Shi J.,Ross,CR.等人,1996)。亦顯示,抗菌肽
家族宿主防禦肽之另一成員LL-37影響器官培養物中人類皮膚傷口之上皮再形成(Heilborn JD等人,2003)。人類嗜中性球防禦素促進I型膠原之表現,同時抑制間質膠原酶之表現(Oono T.等人,2002)。此外,極其不同的人類抗菌肽LL-37與人類β-防禦素-3促進包含刺激上皮細胞遷移、促進血管生成及阻抑促發炎反應之活性(Steinstraesser等人,2008,2009)。其吸引嗜中性球、單核球、肥大細胞及T淋巴球,且亦在許多細胞類型中誘導產生嗜中性球及單核球趨化因子。最近亦已表明,HDP藉由調節發炎、血管生成以及細胞外組織沈積及重塑作為皮膚傷口修復之調控劑。已顯示,HDP對傷口修復之影響並不取決於抗微生物功能且為HDP提供潛在的新穎臨床應用。先前已報導,在鼠類模型中衍生自天蠶蛾素B之非抗微生物宿主防禦肽HB 107(MPKEKVFLKIEKMGRNIRN)保留幫助傷口修復之能力,且利用HB 107所觀察到之益處無法自經生長因子rhPDGF治療之傷口來辨別(Lee等人,2004)。經HB 107治療之傷口之組織學分析表明,在經HB 107治療之傷口中表皮增生增多,此指示HB 107可影響角質細胞增殖或遷移(Lee PH.等人,2004)。最近已闡述HDP之一種新型合成變體(稱為固有防禦調控劑(IDR)),其提供針對多重抗藥性細菌之全身性感染之廣譜保護(Easton DM.等人,2009)。例如,IDR-1及IDR 1002藉由增強宿主之固有免疫防禦同時阻抑潛在有害的過度發炎反應來賦予針對微生物挑戰之保護(Easton等人,2009;Nijnik A.等人,2010)。
本發明係關於可用於促進哺乳動物之傷口癒合之短生物活性肽。該等傷口較佳係由彼等影響皮膚及相關黏膜表面之分離肽來靶向。儘管不受限於任何具體機制,但本發明肽能夠藉由刺激細胞增殖及遷移來影響傷口癒合。本發明肽可以活體外及活體內方式使用,且能夠在角質細胞中誘導上文所提及之活性。
本發明之一實施例係關於含有位於HB 107(MPKEKVFLKIEKMGRNIRN)之位置11與16之間(即EKMGRN(SEQ ID NO:1))之4至6個連續胺基酸殘基之分離肽。分離肽可含有胺基酸之L-或D-鏡像異構物形式或其組合。根據本發明之又一實施例,分離肽可偶聯至載體蛋白,或經由C端醯胺化或N端乙醯化經脂肪酸修飾(即脂化)。在將肽施加至皮膚及其傷口時,該等添加增強肽之生物活性。
根據本發明之某些較佳實施例,分離肽皆含有甲硫胺酸。分離肽之特定實施例包括SEQ ID NO:1、2、3、4及5,其中之所有皆顯示針對細胞增殖及遷移之刺激活性且影響傷口修復。
本發明之另一實施例係關於製造用於治療組合物或化妝品組合物之藥劑,該等組合物含有醫藥上或化妝品上可接受之載劑及一或多種上文所提及之肽。上文所提及之組合物可用於藥劑或化妝品應用來癒合哺乳動物之皮膚傷口。該等組合物中肽之濃度較佳介於約0.1μg/mL至約500μg/mL或約0.1μg/mL至約20mg/mL範圍內。組合物之較佳形式為氣溶膠、乳液、液體、溶液、洗劑、乳霜、糊劑、軟膏、粉劑、凝膠及泡沫。
此外,本發明之肽及含有該等肽之組合物可提供納入一般皮膚護理及化妝品調配物(例如,各種皮膚化妝品、皮膚乳霜、洗劑、防
曬劑及治療性洗劑或乳霜(例如用於雷射程序後護理之抗痤瘡調配物))中之有用特徵。
本發明亦係關於使用上文所提及之組合物來癒合哺乳動物傷口之方法。通常,治療方法需要向傷口、尤其皮膚(表皮)及相關黏膜組織之彼等投與有效量之含肽組合物且保持有效時間量。該等傷口包含手術傷口、擦傷、起泡、燒傷、裂傷、潰瘍、挫傷、皮疹、瘢痕、妊娠紋以及因老化及環境暴露之內因性及外因性效應造成之皮膚損傷,包含起皺、皮膚下垂及光損傷。
美國專利第5,962,410號、第5,861,478號及第7,696,174號提供可用於理解本發明之揭示內容,且該等專利之全文以引用方式併入本文中。肽HB107(MPKEKVFLKIEKMGRNIRN)(SEQ ID NO:10)本身構成存在於蛾物種中之抗微生物蛋白天蠶蛾素B之片段。儘管HB-107不展示衍生出其之蛋白質之抑菌效應,但其確實展示表皮傷口癒合品質(Lee等人,2004)。此19胺基酸殘基肽係對傷口癒合至關重要之刺激角質細胞增殖、遷移、刮傷閉合及抗發炎活性之多功能免疫調節劑。
基於此基本原理,當前研究集中於HB107之位置11-16之由SEQ ID NO:1(HB2265)EKMGRN表示之6胺基酸段。
包括位於HB 107中之4至6個連續胺基酸殘基之肽之合成說明
進一步產生由SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8及9表示之包括來自SEQ ID NO:1之3至5個連續胺基酸殘基之肽。為評價新衍生之肽是否具有傷口癒合活性,使肽SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8及9經歷角質細胞刮傷測試,該測試係業內公認用來評價活性化合物促進傷口閉合之能力的分析。表1中顯示,肽SEQ ID NO 1、2、3、4及5在介於10μg/ml與20μg/ml之間之濃度下顯著誘導刮傷閉合。與視為100%之經PBS治療之傷口閉合百分比相比,由SEQ ID NO:1、2、3、4及5誘導之傷口閉合百分比介於182%-218%範圍內。然而,由SEQ ID NO:6(HB2268)及SEQ ID NO:7(HB2269)表示之三肽及四肽HB2232皆無法誘導刮傷閉合(表1)。亦顯示,在相同活體外角質細胞刮傷測試中,缺少胺基酸甲硫胺酸殘基之另一肽SEQ ID NO:9(HB1062)(GRNIRN)無法促進刮傷閉合(表1)。因此,所觀察到之傷口癒合活性需要兩個關鍵要素。在所指定序列中,第一,必須為最少四個連續胺基酸殘基;及第二,必須含有甲硫胺酸殘基。HB2232(KIEK)及HB1062(GRNIRN)二者皆無法促進刮傷閉合之事實表明,甲硫胺酸殘基係不可替代之胺基酸,其必須以四個或更多個連續殘基中之一個胺基酸存在以促進傷口癒合活性。因此推斷出,位於HB107之中心區域(即位置11至16(EKMGRN))中之必須含有甲硫胺酸殘基之4至6個連續胺基酸殘基促進傷口修復。為確認該活性並非歸因於肽對角質細胞之毒性,使所有肽經歷MTT細胞毒性測試。所測試之肽在高達500μg/ml之濃度下對活體外正常皮膚角質細胞皆無細胞毒性(表
1)。
對活體外刮傷閉合觀察到之活性與肽之增殖活性密切相關,如活體外角質細胞增殖分析中所顯示(表2)。在較低濃度下增殖活性更顯著。刺激角質細胞增殖活性所需之每一肽之最佳濃度可變化,但通常介於0.625μg/ml至5μg/ml範圍內(表2)。SEQ ID NO 1(HB2265)在2.5μg/ml及5μg/ml下顯示活性,且SEQ ID NO 2(HB2262)在所測試之0.625μg/ml至5μg/ml之所有濃度下刺激角質細胞增殖。SEQ ID 3(HB2263)、SEQ ID 4(HB2234)及SEQ ID 5(HB2235)在相對較低之濃度0.625μg/ml至2.5μg/ml下賦予該活性。三肽HB2268(KMG)及HB2269(GRN)在所測試之所有濃度下似乎並不顯示增殖活性。四肽HB2232亦不誘導角質細胞增殖(表2)。總之,本發明之肽具有針對皮膚角質細胞增殖之調節活性,且該活性對於皮膚傷口修復至關重要。
為更好地理解該機制,將一代表性肽SEQ ID NO:3(HB2235)用於使用EPIDERMTM組織替代物(MatTek,Ashland MA)藉由SUNNY BIODISCOVERYTM基因剖析(Santa Paula,CA)實施之基因剖析研究。將皮膚替代物平衡過夜,然後使用20G針施加全厚度穿刺傷口,隨後用一式兩份肽或水對照治療24hr。亦使用一組兩種正常組織作為對照以觀察受傷組織與正常組織之間之基因剖析變化。在治療結束時,提取RNA且使其經歷PCR陣列分析。首先比較受傷未經治療對未受傷未經治療組織以觀察響應創傷之基因之表現譜,然後比較受傷未經治療對受傷經HB2235治療之組織。表3列示一些在傷口癒合級聯之不同信號傳導途徑中受顯著影響之基因。受影響基因表示編碼基質蛋白(例如膠原及整合素)之彼等、促發炎級聯中之基因(例如細胞介素及趨化因子受體之基因)、參與組織重塑過程之基因(例如基質金屬蛋白酶、纖維蛋白溶酶原活化劑及蛋白酶抑制劑之基因)及其他參與傷口癒合之基因。成功的傷口癒合係涉及許多細胞類型、非細胞組份(例
如纖維蛋白及膠原)以及生物活性化學物質之混合物之良好協調過程。儘管其係重疊過程之連續級聯,但通常將其分成三個時期:發炎;增殖;及重塑。如表3中所顯示,急性受傷或創傷後,與正常未受傷皮膚組織相比,通常與促發炎細胞介素及趨化因子受體相關之基因顯著上調。例如,C-X-C趨化因子配體2及5分別上調4.29倍及2.93倍(表3)。顆粒球巨噬細胞群落刺激因子2及介白素-6信號轉導子亦分別上調1.87倍及1.93倍。在發炎期期間,血小板在創傷位點聚集,然後白血球(例如嗜中性球及巨噬細胞)浸潤至傷口位點中,在此期間形成富含纖維蛋白之凝塊以防止進一步失血,且該凝塊用作早期細胞遷移至傷口中之支架。在創傷後24hr內觀察到之發炎信號(受傷對正常組織)始終一致,且對於在生理學條件下將嗜中性球及巨噬細胞吸引至創傷位點至關重要。富含纖維蛋白之凝塊最終在稍後階段中藉助諸如纖維蛋白溶酶等蛋白質分解。纖維蛋白溶酶之產生受組織纖維蛋白溶酶原活化劑之存在的管控,該活化劑係一種與基質金屬蛋白酶(MMP)之功能密切結合將纖維蛋白溶酶原轉化成纖維蛋白溶酶之蛋白質。此於表3中清晰可見,創傷後24hr時編碼組織及尿激酶纖維蛋白溶酶原活化劑(PLAT及PLAU)二者以及MMP(MMP-1)之基因上調。在正常傷口癒合過程中,重塑階段係在較長時間標度上發生,通常花費數週完成,該階段涉及角質細胞及合成並重塑膠原之纖維母細胞之快速增殖時期。在仔細檢查經HB2235治療之受傷組織時,觀察到在傷口癒合級聯中存在若干受HB2235影響或調節之關鍵步驟。第一,該肽明顯縮短初始發炎期之持續時間,如在經HB2235治療24hr後編碼促發炎細胞介素及趨化因子受體之基因顯著下調所指示(表3)。與發炎信號之下調一致,抗發炎細胞介素IL-10上調(表3)。此具有重大意義,此乃因眾多研究指示縮短發炎過程之長度或持續時間可極大地促進傷口癒合,很明顯,傷口癒合之延遲與貫穿傷口癒合之所有階段之
明顯發炎相關(Leitch等人,2009;Wang等人,2006)。第二,在治療24hr後HB2235顯著下調編碼纖維蛋白溶酶原活化劑及MMP之基因,此指示其可加速組織肉芽過程。第三,藉由調節編碼對細胞遷移及增殖活性至關重要之生長因子(例如TGF-β 1、PDGF、EGF)之基因,該肽明顯參與上皮再形成及組織重塑過程之加速,在此期間新形成之組織開始覆蓋傷口區域以完成組織修復。最顯著地,經HB2235治療之組織顯示玻連蛋白(VTN)5倍以上的上調(表3)。VTN係於細胞外基質中發現之豐富糖蛋白且眾所周知促進角質細胞黏附、增殖及遷移(Upton等人,2008)。第四,與細胞增殖及遷移活性一致,HB2235刺激編碼對上皮再形成及組織重塑至關重要之基質蛋白(例如膠原及整合素)之基因的上調(表3)。基因陣列分析強烈支持該肽藉由促進細胞增殖及遷移以及基質重塑及膠原刺激來加速上皮形成過程。
本發明之肽(包含SEQ ID NO 1、2、3、4及5)展示對角質細胞遷移及增殖之上調至關重要之活性,而角質細胞遷移及增殖對角質細胞所駐留之表皮組織中之傷口癒合過程至關重要。本發明中所揭示之肽比先前所揭示之序列新穎且短。由本發明之肽誘發之生物活性係細胞增殖及遷移,二者在調介傷口癒合功能中皆發揮重大作用。
由於尺寸較小,本發明之例如具有4個胺基酸殘基之肽較容易製造且因此具有顯著成本有效性。而且,與較大肽相比,所揭示肽之化學修飾易於操縱且具有較少溶解度問題。其易處置性使得較大數目之藥物遞送選擇成為可能,例如欲使用之媒劑及其施加方式。本發明肽之較小尺寸及較大溶解度允許經由以下方式來增加其癒合效能:增加傷口位點處之吸收及保留;局部角質細胞及其他細胞於較高濃度之肽下暴露較長時間段。
所有所揭示之肽皆可使用標準Fmoc(9-茀基甲氧基羰基)固相化學法來合成。每一上文所闡述之肽可包括L-或D-胺基酸鏡像異構物。
肽之羧基端可為酸性(-COOH)或經醯胺化(例如,-CONH2、-CONHR或-CONR2)。羧基端之醯胺化可使本發明肽與游離酸形式相比較不易受蛋白酶降解影響且增加其極性,從而提供提高的治療潛能。其論述,N端脂化或乙醯化可在不改變肽之生物活性功能的情況下改良穿過皮膚之肽滲透性(Samah A,2011)。因此,肽亦可經脂化,此可提供增強的皮膚滲透性。可用於提供本發明化合物之C12-18脂質組份之飽和或不飽和脂肪酸之實例包含月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、肉豆蔻烯酸、棕櫚油酸、油酸及亞麻油酸。
肽可偶聯至可溶或不可溶載劑分子以視需要改質其溶解度性質並增加靶組織中肽之局部濃度。可溶載劑分子之實例包含聚乙二醇(PEG)與聚乙烯吡咯啶酮之聚合物;不可溶聚合物之實例包含(但不限於)矽酸鹽、聚苯乙烯及纖維素。肽可使用脂質體技術或經由奈米技術來微囊封以增強其穩定性且控制釋放以增強其在應用期間及之後之穩定性。
本發明係關於在例如調配物中或作為治療劑使用上文所闡述之肽之方法。該等方法可涉及單一肽或多個肽組合之使用。在某些情況下,本發明組合物可佈置在置於皮膚上、皮膚中或皮膚下之裝置內。該等裝置包含藉由被動或主動釋放機制以接觸皮膚或毛囊之該方式釋放物質之經皮貼片、植入物及注射劑。在本文所闡述之方法中用於遞送肽之組合物可呈以下形式:氣溶膠、乳液、液體、洗劑、溶液、凝膠、微囊封劑、乳霜、糊劑、軟膏、粉劑、泡沫或其他醫藥上可接受之調配物。此外,該等肽可使用較少涉及之調配物(例如去離子水/蒸餾水、PBS或標準醫用鹽水溶液)來遞送。
調配物可視情況具有化妝品吸引力及/或含有諸如類視色素、維生素C或其他肽等可用作本發明肽之治療作用之佐劑之其他試劑。亦可將抗生素添加至調配物中以避免感染,由此允許發生最大癒合過
程。
該調配物可含有蛋白酶抑制劑。蛋白酶抑制劑可經選擇以特異性靶向預期將使所選生物活性肽降解之蛋白酶;該選擇將基於生物活性肽之長度及/或序列來確定。然而,蛋白酶抑制劑未必係以任何特定方式來選擇;例如,可在本發明中採用含有兩種或更多種抑制劑之蛋白酶抑制劑混合物。可將以下類型之蛋白酶抑制劑納入本發明中:絲胺酸蛋白酶抑制劑、半胱胺酸蛋白酶抑制劑、天冬胺酸蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、硫醇蛋白酶抑制劑及蘇胺酸蛋白酶抑制劑。本發明中所使用之蛋白酶抑制劑可為肽或蛋白質或化學品。該等抑制劑之非限制性實例為絲胺酸蛋白酶抑制蛋白(serpin),其包含α-1-抗胰蛋白酶、補體1-抑制劑、抗凝血酶、α-1-抗胰凝乳蛋白酶、纖維蛋白溶酶原活化劑抑制劑1及絲胺酸或半胱胺酸蛋白水解酶抑制蛋白(neuroserpin);或化學品,包含(但不限於)熊果酸及傅明酸,該等可用作本發明肽之治療作用之佐劑。
本發明之肽可用於治療皮膚之傷口。皮膚表皮係由主要自角質細胞製造之高度動態的複層上皮組成。諸如纖維母細胞等其他細胞類型亦位於表皮中。新分化的角質細胞自表皮之增殖性基底層連續出現來補充上部層,逐漸分化成外部角化且脫落的死包膜。角質細胞亦係與表皮連續之黏膜組織之主要成份(Presland及Dale,2000)。該組織缺少表皮之不可滲透之角化層,且形成與口、鼻、咽喉、耳、肛門及生殖器相關之內襯表面。與皮膚類似,黏膜表面對於防止感染物進入身體之各個組織至關重要,因此,創傷該等組織類型可損害個體之健康。皮膚及黏膜組織損傷發生在表皮層因例如撕裂、燒傷或起泡而裂口時。創傷亦可涉及在表皮不同時裂傷的情況下涉及組織損傷之壓傷或瘀傷。皮膚感染以及某些慢性疾病(例如癌症及自體免疫疾病)亦對表皮表面造成不利影響。潰瘍(例如侵襲糖尿病人之彼等或與壓瘡相
關之彼等)係皮膚損傷之另一形式;該等傷口通常非常頑固、會發炎、容易感染且需要長期癒合過程。潰瘍或其他類型之慢性傷口之持久性歸因於參與癒合之細胞過程之失效。傷口癒合之失效可能係部分地由於傷口邊界處之角質細胞未遷移以閉合或覆蓋瘡瘍之事實而導致病灶無法形成上皮的結果(Enoch及Price,2004)。皮膚及黏膜傷口之癒合係部分經由基底角質細胞之活化來協調。活化後,位於傷口週邊之角質細胞增殖並遷移以在稱為上皮形成之過程中在傷口上方形成單層。角質細胞之進一步增殖並分化建立包括正常複層之表皮層(Enoch及Price,2004)。因此,本發明亦可用於治療與黏膜組織中之角質細胞相關之損傷。術語「相關黏膜組織」係指以類似於皮膚之方式組織之任何組織且含有上皮細胞/角質細胞。該等組織之實例係口、鼻咽、耳及泌尿生殖表面以及眼睛之眼瞼結膜。可影響該等組織且適於用本發明肽治療之傷口或病灶/損傷之實例係擦傷、起泡、燒傷、裂傷、穿刺、潰瘍、挫傷、皮疹及瘢痕。術後外傷亦可用該等肽來治療。
表皮損傷之另一形式係細微的且持續較長時間段,最終損害皮膚功能,因此稱為皮膚老化。皮膚老化受遺傳程式以及在整個個體壽命中發生之累積環境及內源損傷的影響。存在兩個主要的誘導皮膚老化之過程;太陽保護皮膚中之內因性老化(時間老化)及太陽暴露區域中之外因性老化(光老化)。內因性老化反映遺傳背景且取決於時間。無論如何,皮膚老化共有以下各項中之一或多者:皺紋、細紋、色素沉著過度、失去光澤、光滑度、緊致度、膚色透明度及均勻度以及毛孔外觀之改變。潛在的該等可見體徵係由環境刺激(例如紫外(UV)及污染)之急性或慢性暴露以及遺傳傾向誘導之各種組織學及細胞學變化。諸如起皺、乾燥、變薄、下垂、較易受瘀傷及曬傷影響等化妝品問題係除老化外亦可因於損傷劑(例如紫外線及污染)下之延長暴露而
過早地發生之表皮損傷之常見外部標誌。研究表明,皮膚老化最引人注意的形態改變係皮膚組織之逐漸損失。此皮膚組織損失可歸因於若干因素,例如細胞之損失及細胞增殖減少。在如表皮等自我更新組織中,細胞數受增殖、終端分化與細胞凋亡之間之微妙平衡的嚴格調控(Robert L、Labat-Robert J及Robert AM.2009)。因此,所揭示之肽可用於與由內因性及外因性刺激物引起之皮膚老化相關之問題,以預防或逆轉老化效應。以相關方式,該等肽可適用於已因暴露於各種外部試劑(例如太陽光)而損傷之組織。本發明亦可用作該等方面中之化妝品,以使皮膚具有更年輕外觀及紋理且提供更佳功能。可使本身未經改變或經由化學修飾及/或專門遞送之短肽滲透經過表皮以影響抗衡導致皮膚變薄、皺紋、脆弱及粗糙/硬化之彼等之過程。由於角質細胞係表皮表面之主要組份且在老化及損傷皮膚中減少,故預期藉由肽刺激對其之補充逆轉上文所提及之問題。
皮膚之彈性相對較高,但其拉伸能力有限。妊娠紋或條紋係皮膚上具有變色色調之結瘢之形式。其係由真皮撕裂所引起,其隨時間減少,但不會完全消失。其首次出現為紅色或紫紋,但常常逐漸褪色至較淺範圍。妊娠紋通常係與體重快速生長或快速損失相關之皮膚快速拉伸的結果。妊娠紋可在從未經受顯著或過度拉伸或膨脹之任一身體位點處出現。最常見位置為腹部、***、上臂、腋下、背部、大腿、髖及臀部。妊娠紋通常係由如***及懷孕等一些主要生命階段之激素變化所引起,但皮質類固醇治療、肥胖、美容手術及密集塑身可產生妊娠紋。在皮質類固醇作用下,與正常皮膚相比,角質細胞及纖維母細胞二者之生長可嚴重受損,且因此膠原I及III之合成以及纖連蛋白合成亦顯著減少高達90%以上(Rogalski等人,2002)。真皮/表皮部分中角質細胞之功能修復及恢復可係妊娠紋校正之關鍵。本發明之肽促進角質細胞增殖及遷移,且因此適用於治療妊娠紋。
通常,醫藥上可接受之調配物將包含適用於人類皮膚上之任何載劑。該等醫藥上及化妝品上可接受之載劑包含乙醇、二甲基亞碸、甘油、二氧化矽、氧化鋁、澱粉以及等效載劑及稀釋劑。調配物可視情況具有化妝品吸引力及/或含有諸如類視色素或可用作用於本發明肽之治療作用之佐劑之其他肽之其他試劑。亦可將抗生素添加至調配物中以避免感染,由此允許發生最大癒合過程。組合物中肽之濃度可係約0.1μg/mL至約500μg/mL或約0.1μg/mL至約20mg/mL;然而,所採用之最終濃度可在該等範圍外變化,此端視傷口/組織病況之性質、本發明肽之生物活性及為獲得增強的組合物吸收而使用之任何佐劑或技術而定。
在本發明之較佳實施例中,倘若欲使組合物與人類角質組織接觸,則除本發明肽之外之任何其他組份應適於施加至角質組織;即,該等其他組份在納入組合物中時展示在合理醫學判斷範圍內之過度毒性、不相容性、不穩定性、過敏反應及諸如此類。CTFA Cosmetic Ingredient Handbook,第二版(1992)闡述皮膚護理產業中常用之眾多種非限制性化妝品及醫藥成份,其適用於本發明組合物中。該等成份類別之實例包含:磨料、吸收劑、美容組份(例如芳香劑)、顏料、著色劑/色素、精油、皮膚感受劑(skin sensate)、收斂劑等(例如丁香油、薄荷腦、樟腦、桉樹油、丁香酚、乳酸薄荷酯、金縷梅餾出物)、抗痤瘡劑、抗結塊劑、消泡劑、抗微生物劑(例如丁基胺基甲酸碘丙基酯)、抗氧化劑、黏合劑、生物添加劑、緩衝劑、膨脹劑、螯合劑、化學添加劑、化妝品殺生物劑、變性劑、藥物收斂劑、外用鎮痛藥、成膜劑或材料、失透劑、pH調節劑、推進劑、還原劑、鉗合劑、美白及亮膚劑(例如對苯二酚、麴酸、抗壞血酸、抗壞血酸基磷酸鎂、抗壞血酸基葡糖胺)、皮膚調節劑(例如潤濕劑)、柔膚劑及/或皮膚癒合劑(例如泛醇及其衍生物、吉拉索蘆薈(aloe vera)、泛酸及其
衍生物、尿囊素、甜沒藥醇(bisabolol)及甘草酸二鉀)、皮膚治療劑、增稠劑以及維生素及其衍生物。
可將本發明肽及相關組合物投與人類及動物(包含所有哺乳動物)。亦可與典型及/或實驗材料(例如組織移植物、皮膚替代物、組織培養產品氧及敷料)組合施加。實例包含(但不限於)紗布(織造及非織造、浸漬、非黏附、封裝、清創);壓縮繃帶及系統;傷口填充劑及清潔劑;接觸層;膠原;羊膜;非細胞人類真皮;非細胞基質及組合產品;及各種常用敷料。
通常,組合物可經局部、經口、經皮、全身性或藉由彼等熟習此項技術者已知可用於將本發明肽遞送至靶組織之任何其他方法投與。組合物亦可以活體外或離體方式施加至(例如)在培養物中生長之細胞或患者移植物。
本發明之組合物可含有一或多種發揮皮膚護理活性之其他試劑。除生物活性肽組份外,本發明可含有其他活性試劑,例如透明質酸、菸醯胺、植烷三醇、菌綠烯醇(farnesol)、甜沒藥醇、水楊酸、視黃醇、視黃酸、α羥酸、抗壞血酸及海藻酸。預期,某些其他活性劑將與生物活性肽組份以協同方式起作用,或將增強調配物之存架壽命。
此外,胺基酸之縮寫遵循習用用法:
用於醫藥調配及投與之技術之細節可參見最新版的Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing公司,Easton Pa.)。儘管局部遞送合意,但仍存在其他遞送方式,例如:經口、非經腸、氣溶膠、肌內、皮下、經皮、髓內、鞘內、心室內、靜脈內、腹膜內或鼻內投與。可將本發明調配於多種載劑媒劑中,例如噴霧劑;氣溶膠;水-油型乳液;油-水型乳液;面霜或身體乳霜;防曬洗劑或曬後洗劑;或其他局部投與媒劑。此外,本發明之肽及含有該等肽之組合物可提供納入一般皮膚護理及化妝品調配物(例如各種皮膚化妝品、皮膚乳霜、洗劑、防曬劑及治療性洗劑或乳霜(例如抗痤瘡調配物))中之有用特徵。
本發明包含下列實例以展示本發明之某些較佳實施例。
使人類皮膚角質細胞(ATCC CRL-2404)在補充有5ng/ml人類重組上皮生長因子(EGF)之不含血清之角質細胞生長培養基(Life Technologies公司,Grand Island,N.Y.)中生長。將細胞接種至12孔板上且使其達到100%鋪滿。將細胞單層饑餓24hr,然後使用P200(200
μ1)吸管頭製造刮傷。在0時洗滌刮傷且拍照。添加最終濃度為40μg/ml之肽。將細胞保持在37℃具有>90%濕度之5% CO2培育器中,但在室溫下經短時段捕獲影像時除外。治療7-8hr後進行刮傷閉合,且結果顯示於表1中。
為確保肽對細胞無細胞毒性,將正常人類表皮角質細胞接種至96孔板。在37℃下在5% CO2存在下培育板以使細胞生長至>95%鋪滿。將肽以50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml及500μg/ml之濃度稀釋至儲備溶液中。用含有各種濃度肽之新鮮培養基更換細胞培養基,然後在37℃及5% CO2下培育24hr。在治療結束時,使用購自ATCC(Manassas VA)之MTT分析套組量測細胞活力。結果顯示於表1中。在50μg/ml至500μg/ml之濃度下,肽之如使用MTT分析量測之細胞活力
不發生變化。
使正常人類皮膚角質細胞(ATCC CRL-2404)在補充有5ng/ml人類重組上皮生長因子(EGF)之不含血清之角質細胞生長培養基(Life Technologies公司,Grand Island,N.Y.)中生長。每天用顯微鏡檢查細胞。當培養物變成50%-75%鋪滿時,抽吸板中之培養基且添加0.25%胰蛋白酶/EDTA。當細胞變圓且分離時,藉由添加新鮮培養基來中和胰蛋白酶。然後將細胞離心且將沈澱物重懸於新鮮培養基中。使用血球計對細胞懸浮液進行計數,且藉由將100μl細胞懸浮液添加至每一孔中將總細胞數調節至約500-1000個細胞/孔。通常,使用中心的60個孔,且用新鮮培養基填充外部孔以最小化蒸發。當培育6-8hr後每一孔中之細胞附接時,添加一式三份100μl含有PBS或2×期望濃度肽之新鮮培養基。然後在37℃及5% CO2下將微量板培育48-72hr。
在培育結束時,根據製造商之說明書使細胞經歷CYTOSCANTM SRB細胞毒性分析(GBiosciences公司,St.Louis,MO)。簡言之,在磺基羅丹明B(suforhodamine B,SRB)染色之前固定細胞。大量洗滌後,使用溶解緩衝液溶解顏色。使用微量板讀數器量測565nm下之吸光度。表1中所顯示之結果係一式三份治療之平均值,且將大於120之值視為顯著。
使用由Sunny Biodiscovery公司(Santa Paula,CA)執行之PCR陣列來分析84個編碼傷口癒合、細胞外基質及黏附分子之基因。簡言之,EPIDERMTM皮膚替代物係自MatTek(Ashland,MA)獲得且係根據製造商之說明書來處理。過夜平衡後,更換培養基且使用20G針製造10個全厚度穿刺傷口,並在一式兩份皮膚組織之頂部施加HB2235(330μg/ml)或水對照且治療24小時。亦使用一組兩種正常未受傷組織作為對照以觀察受傷組織與正常組織之間之基因剖析。在治療結束時,收
集組織且保存在RNAlater溶液(Ambion,Austin,TX)中。提取RNA且用Illustra微型RNAspin套組(GE Healthcare,Piscataway,NJ)純化。
使用Agilent HP-8452A二極體陣列分光光度計在260nm及280nm下評價經純化之總RNA。均衡各樣品之RNA濃度,且使用來自Qiagen之使用PCR陣列PAHS-121 A與第一鏈合成(1st strand synthesis)套組、SYBR Green主混合物及PCR運行條件之BioRad iCycler iQ檢測系統藉由實時定量PCR來量測所關注基因之表現。在用RT2剖析儀PCR陣列數據分析3.5版軟體將基因表現正規化至所攜載之5個管家基因後,使用效率△△Ct方法來量化結果。若表現量相當高(檢測小於30個循環)且在每一一式兩份系列中調節為1.5或更高,則將基因視為差異表現。
根據本揭示內容無需過多實驗即可製造並實施本文所揭示且主張之所有組合物或方法。儘管已根據較佳實施例闡述本發明之組合物及方法,但彼等熟習此項技術者將明瞭,可在不背離本發明之概念、精神及範疇下改變該等組合物及/或方法及本文所闡述方法之步驟或步驟之順序。更特定而言,應明瞭,可用某些在化學及生理上皆相關之試劑取代本文所闡述之試劑,同時可達成相同或相似結果。對彼等
熟習此項技術者顯而易見的所有該等類似取代及修改皆視為在本發明之範疇內。本申請案中所鑒定之所有專利及公開案之全文皆以引用方式併入本文中。
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 肽HB107
<400> 10
Claims (14)
- 一種分離肽,其中該肽之序列係由SEQ ID NO:1(EKMGRN)之4至6個連續胺基酸殘基組成。
- 如請求項1之肽,其包括SEQ ID NO:1(EKMGRN)、SEQ ID NO:2(KMGRN)、SEQ ID NO:3(EKMGR)、SEQ ID NO:4(EKMG)或SEQ ID NO:5(MGRN)。
- 如請求項1之肽,其包括L-及D-胺基酸鏡像異構物中之任一者或兩者,或偶聯至載劑分子、經醯胺化或脂化。
- 如請求項1之肽,其係呈游離酸形式。
- 一種組合物,其包括至少一種如請求項1至4中任一項之肽及醫藥上可接受之載劑。
- 如請求項5之組合物,其中該肽係以介於約0.1μg/mL至約500μg/mL、或約0.1μg/mL至約20mg/mL範圍內之濃度存在。
- 如請求項5之組合物,其中該組合物係呈以下形式:氣溶膠、乳液、液體、洗劑、溶液、凝膠、微囊封劑、乳霜、糊劑、軟膏、粉劑或泡沫,或納入適用於施加至皮膚或黏膜組織表面或於該皮膚組織下之裝置中。
- 一種組合物,其在以治療有效量施加且保持有效時間量時用於癒合哺乳動物之傷口,其中該組合物包括醫藥上可接受之載劑及至少一種如請求項1至4中任一項之肽。
- 如請求項8之組合物,其中該傷口影響該哺乳動物之皮膚或相關黏膜組織。
- 如請求項9之組合物,其中該傷口係由於擦傷、起泡、燒傷、撕裂、潰瘍、挫傷、皮疹、瘢痕、妊娠紋或老化或環境暴露之效應。
- 如請求項5至10中任一項之組合物,其用於皮膚護理治療。
- 如請求項5至10中任一項之組合物,其用於化妝產品。
- 一種如請求項1至4中任一項之肽之用途,其用於製造用來治療哺乳動物之皮膚或黏膜組織傷口之藥劑。
- 如請求項13之肽之用途,其中該傷口係由於擦傷、起泡、燒傷、撕裂、潰瘍、挫傷、皮疹、瘢痕、妊娠紋或老化或環境暴露之效應。
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