TW201443004A - 苯氧基乙氧基化合物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供式I化合物：□或其醫藥上可接受之鹽。

Description

苯氧基乙氧基化合物
本發明係關於新穎苯氧基乙氧基化合物、包括該等化合物之醫藥組合物、使用該等化合物來治療生理病症之方法及可用於合成該等化合物之中間體及製程。
本發明屬於治療發炎病況之領域，例如關節炎，包含骨關節炎及類風濕性關節炎，且進一步包含與該等病況相關之疼痛。關節炎僅在美國即侵襲數百萬患者，且係失能之主要原因。治療通常包含可產生不利的心血管及/或胃腸副效應之NSAID(非類固醇抗發炎藥物)或COX-2抑制劑。因此，具有諸如高血壓等較差心血管特徵之患者可能無法使用NSAID或COX-2抑制劑。因此，業內需要骨關節炎及類風濕性關節炎之替代治療，較佳無當前治療之副效應。
四種***素E2(PGE2)受體亞型已鑑別如下：EP1、EP2、EP3及EP4。已揭示，在齧齒類動物類風濕性關節炎及骨關節炎模型中EP4係參與關節發炎疼痛之主要受體(例如，參見J.Pharmacol.Exp.Ther.,325,425(2008))。因此，選擇性EP4拮抗劑可用於治療包含關節炎疼痛在內之關節炎。此外，已表明，由於EP4拮抗並不干擾諸如PGI2及TxA2等類***素之生物合成，故選擇性EP4拮抗劑可能不具有利用NSAID及COX-2抑制劑所見之潛在心血管副效應。(例如，參見Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,21,484(2011))。
US 2005/0250818揭示某些鄰位經取代之芳基及雜芳基醯胺化合物，其係具有鎮痛活性之EP4受體選擇性拮抗劑。此外，WO 2011/102149揭示某些化合物，其係可用於治療IL-23介導之疾病之選擇性EP4拮抗劑。
本發明提供某些相對於EP1、EP2及EP3為EP4選擇性抑制劑之新穎化合物。此外，本發明提供某些與傳統NSAID相比具有減少心血管或胃腸副效應之潛力之新穎化合物。
因此，本發明提供式I化合物：
或其醫藥上可接受之鹽。
本發明亦提供治療患者之關節炎之方法，其包括向需要該治療之患者投與有效量之式I化合物或其醫藥上可接受之鹽。本發明亦提供治療患者之骨關節炎之方法，其包括向需要該治療之患者投與有效量之式I化合物或其醫藥上可接受之鹽。此外，本發明亦提供治療患者之類風濕性關節炎之方法，其包括向需要該治療之患者投與有效量之式I化合物或其醫藥上可接受之鹽。本發明亦提供治療患者之與關節炎相關之疼痛之方法，其包括向需要該治療之患者投與有效量之式I化合物或其醫藥上可接受之鹽。本發明進一步提供治療患者之與骨關節炎或類風濕性關節炎相關之疼痛之方法，其包括向需要該治療之患者投與有效量之式I化合物或其醫藥上可接受之鹽。本發明亦提供治療患者之偏頭痛或與偏頭痛相關之疼痛之方法，其包括向需要該治療之患者投與有效量之式I化合物或其醫藥上可接受之鹽。
此外，本發明提供式I化合物或其醫藥上可接受之鹽用於療法中，尤其用於治療骨關節炎。此外，本發明提供式I化合物或其醫藥上可接受之鹽用於治療類風濕性關節炎。本發明亦提供化合物或其醫藥上可接受之鹽用於治療與骨關節炎或類風濕性關節炎相關之疼痛。 此外，本發明提供式I化合物或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造用來治療骨關節炎之藥劑。本發明提供式I化合物或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造用來治療類風濕性關節炎之藥劑。本發明亦提供式I化合物或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造用來治療與骨關節炎或類風濕性關節炎相關之疼痛之藥劑。
本發明進一步提供醫藥組合物，其包括式I化合物或其醫藥上可接受之鹽與一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之組合。本發明亦涵蓋用於合成式I化合物或其醫藥上可接受之鹽之新穎中間體及製程。
此外，本發明包含治療患者之發炎病況(例如關節炎，包含骨關節炎及類風濕性關節炎)之方法，其包括向需要該治療之患者投與有效量之促發炎***素拮抗劑(例如EP4拮抗劑)與有效量之脂氧素或消退素受體調節劑(例如BLT-1、BLT-2、ALX/FPR1、GPR32、CysLT1、CysLT2或ChemR23之調節劑)的組合。
本發明之又一態樣包含治療患者之發炎疾病(例如關節炎，包含骨關節炎及類風濕性關節炎)之方法，其包括向需要該治療之患者投與有效量之促發炎***素合成酶抑制劑(例如mPGES-1抑制劑)與有效量之脂氧素或消退素受體調節劑(例如BLT-1、BLT-2、ALX/FPR1、GPR32、CysLT1、CysLT2或ChemR23之調節劑)的組合。
本發明化合物尤其可用於本發明之治療方法中。本發明化合物之某些構型較佳。以下段落闡述該等較佳構型。應理解，該等較佳者可適用於本發明之治療方法及化合物二者。
較佳式I化合物係4-[(1S)-1-[[(2R)-3-甲基-2-(2-苯氧基乙氧基)丁醯基]胺基]乙基]苯甲酸： 或其醫藥上可接受之鹽。
又一較佳式I化合物係4-[(1S)-1-[[(2R)-3-甲基-2-(2-苯氧基乙氧基)丁醯基]胺基]乙基]苯甲酸。
如本文所使用，術語「治療」或「以治療」包含遏製、減慢、停止或逆轉現有症狀或病症之進展或逆轉其嚴重程度。
如本文所使用，術語「患者」係指哺乳動物，例如小鼠、豚鼠、大鼠、狗或人類。應理解，較佳患者係人類。
如本文所使用，術語「有效量」係指向患者投與單次或多次劑量後向所診斷或治療之患者提供期望效應之本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽之量或劑量。
有效量可由作為熟習此項技術者之主治診斷醫師藉由使用已知技術並藉由觀察類似情況下所獲得之結果來容易地確定。在確定用於患者之有效量時，主治診斷醫師要考慮眾多因素，包含(但不限於)：哺乳動物之物種；其大小、年齡及總體健康狀況；所涉及之特定疾病或病症；疾病或病症之涉及程度或嚴重程度；個體患者之反應；所投與之具體化合物；投與模式；所投與製劑之生物利用度特徵；所選劑量方案；伴隨藥劑之使用；及其他相關情況。
式I化合物或其醫藥上可接受之鹽之有效劑量範圍通常很廣。例如，每日劑量通常在約0.01mg/kg體重至約50mg/kg體重範圍內。在一些情形下，低於上述範圍下限之劑量值可能超過適量，而在其他情形下可能仍使用更大劑量並具有可接受之副效應，且因此以上劑量範圍並無意以任何方式限制本發明之範疇。
本發明化合物較佳調配成醫藥組合物，藉由可讓生物體利用該 化合物之任何途徑投藥。最佳地，該等組合物用於經口投與。該等醫藥組合物及其製備製程為業內所熟知(例如，參見Remington：The Science and Practice of Pharmacy(D.B.Troy編輯，第21版，Lippincott,Williams & Wilkins,2006)。
如本文所使用，「DMEM」係指達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)；「DMSO」係指二甲基亞碸；「DMF」係指N,N-二甲基甲醯胺；「THF」係指四氫呋喃；「MeOH」係指甲醇；「EtOAc」係指乙酸乙酯；「PGE2」係指***素E2；「FBS」係指胎牛血清；「IBMX」係指(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)；「MES」係指(2-(N-嗎啉基)乙磺酸；「HEPES」係指(2-[4-(2-羥基乙基)六氫吡-1-基]乙磺酸)；「HTRF」係指均相時間解析螢光技術；「HEK」係指人類胚腎；「HBSS」係指漢克氏平衡鹽溶液(Hank’s Balanced Salt Solution)；「EC80」係指藥劑產生該藥劑之80%最大可能功效時之濃度；且「IC50」係指藥劑產生該藥劑之50%最大可能抑制反應時之濃度。
醫藥上可接受之鹽及其常用製備方法為業內所熟知。例如，參見Gould,P.L.,「Salt selection for basic drugs,」International Journal of Pharmaceutics,33：201-217(1986)；Bastin,R.J.等人「Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities,」Organic Process Research and Development,4：427-435(2000)；及Berge,S.M.等人，「Pharmaceutical Salts,」Journal of Pharmaceutical Sciences,66：1-19,(1977)。熟習合成技術者應瞭解，使用熟習此項技術者所熟知之技術及條件，式I化合物容易轉化為醫藥上可接受之鹽且可分離成醫藥上可接受之鹽。
本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽可藉由業內已知之多種程序來製備，其中一些將在下文反應圖、製備及實例中予以闡釋。所述 每一途徑之特定合成步驟可以不同方式組合或結合來自不同反應圖之步驟以製備式I化合物或其醫藥上可接受之鹽。下文反應圖中每一步驟之產物可藉由習用方法回收，該等方法包含萃取、蒸發、沈澱、層析、過濾、研磨及結晶。熟習此項技術者可容易地獲得試劑及起始材料。除非另外指明，否則所有取代基皆如先前所定義。應理解，該等反應圖、製備及實例並不意欲以任何方式限制本發明之範疇。
製備1
(2R)-2-羥基-3-甲基-丁酸之合成.
反應圖1，步驟A. 在0℃下向水(45mL)及硫酸(4mL；75mmol) 之溶液中添加D-纈胺酸(10g；85.4mmol)。經2h向此溶液中緩慢添加亞硝酸鈉(8.8g；128mmol)存於水(45mL)中之溶液，將溫度保持在5℃以下。將混合物緩慢升溫至室溫。2h後，用二***(2×75mL)萃取混合物。用鹽水洗滌合併之醚層，乾燥(MgSO4)，過濾且濃縮，以提供無色油狀標題化合物(6.1g,60%)。此材料未經進一步純化即用於下一步驟中。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ 12.38(寬峰，1H),5.02(寬峰，1H),3.70(d,J=4.4Hz,1H),1.92-1.85(m,1H),0.86(d,J=6.9Hz,3H),0.78(d,J=6.8Hz,3H)。
製備2
4-[(1S)-1-[[(2R)-2-羥基-3-甲基-丁醯基]胺基]乙基]苯甲酸甲酯之合成.
反應圖1，步驟B. 用1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(14.2g；74.1mmol)處理4-[(1S)-1-胺基乙基]-苯甲酸甲酯(5.8g；49.1mmol)、(2R)-2-羥基-3-甲基-丁酸(9.3g；51.9mmol)、1-羥基苯并***(0.82g；6.1mmol)及三乙胺(22mL；158mmol)存於CH2Cl2(120mL)中之混合物。在室溫下將渾濁混合物攪拌過夜。用1N HCl(2×150mL)洗滌反應混合物，然後用鹽水洗滌。經MgSO4乾燥有機層，過濾，濃縮且在真空下乾燥，以提供白色固體狀標題化合物(10.24g,75%)。此材料未經進一步純化即用於下一步驟中。MS(m/z)：280.0(M+1)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ 8.14-8.12(m,1H),7.87-7.84(m,2H),7.45-7.43(m,2H),5.35(d,J=5.7Hz,1H),5.00-4.95(m,1H),3.79 (s,3H),3.64(dd,J=4.0,5.7Hz,1H),1.93-1.89(m,1H),1.36(d,J=7.2Hz,3H),0.81(d,J=6.9Hz,3H),0.65(d,J=6.7Hz,3H)。
製備3
甲磺酸2-苯氧基乙酯之合成.
反應圖1，步驟C. 在0℃下向2-苯氧基乙醇(10.0mL,80.0mmol)及三乙胺(13.5mL,96.9mmol)存於無水CH2Cl2(250mL)中之溶液中添加甲磺醯氯(6.80mL,87.9mmol)。在0℃下將所得渾濁混合物攪拌2h。用水(75mL)稀釋混合物且萃取。用1N HCl(75mL)洗滌有機層，然後用飽和NaHCO3/鹽水(1：1；75mL)洗滌，乾燥(Na2SO4)，過濾且濃縮。在減壓下將殘餘物乾燥至恆定重量，以提供淡黃色油狀標題化合物(17.1g,99%)。此材料未經進一步純化即用於下一步驟中。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.31-7.27(m,2H),7.01-6.96(m,1H),6.91-6.87(m,2H),4.58-4.55(m,2H),4.24-4.22(m,2H),3.08(s,3H)。
製備4
4-[(1S)-1-[[(2R)-3-甲基-2-(2-苯氧基乙氧基)丁醯基]胺基]乙基]苯甲酸甲酯之合成.
反應圖1，步驟D. 向4-[(1S)-1-[[(2R)-2-羥基-3-甲基-丁醯基]胺基]乙基]苯甲酸甲酯(3.0g,10.7mmol)及甲磺酸2-苯氧基乙酯(2.32g,10.7mmol)存於無水THF(25mL)中之溶液添加氫化鈉(440mg,10.7mmol)。在室溫下將混合物攪拌過夜且於1N HCl與EtOAc之間分配。 用EtOAc萃取水層。用鹽水洗滌合併之EtOAc層，經MgSO4乾燥，過濾且濃縮。使用矽膠管柱層析(120g柱；存於庚烷中之30%至100%乙酸乙酯)純化粗材料(4.7g)，以提供白色固體狀標題化合物(1.41g,33%)。MS(m/z)：400.2(M+1)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ 8.21-8.18(m,1H),7.87-7.84(m,2H),7.43-7.41(m,2H),7.26-7.22(m,2H),6.91-6.87(m,3H),5.01-4.97(m,1H),4.10-4.07(m,2H),3.79(s,3H),3.78-3.74(m,1H),3.70-3.65(m,1H),3.52(d,J=5.5Hz,1H),1.95-1.92(m,1H),1.32-1.30(m,3H),0.82-0.79(m,3H),0.75(d,J=6.7Hz,3H)。
實例1
4-[(1S)-1-[[(2R)-3-甲基-2-(2-苯氧基乙氧基)丁醯基]胺基]乙基]苯甲酸之合成.
反應圖1，步驟E. 向4-[(1S)-1-[[(2R)-3-甲基-2-(2-苯氧基乙氧基)丁醯基]胺基]乙基]苯甲酸甲酯(2.0g,5.01mmol)存於MeOH(25mL)及THF(25mL)中之溶液中添加5N NaOH(10mL,50mmol)。在室溫下將混合物攪拌1.5h，用5N HCl(10mL)處理，且濃縮以移除有機溶劑。用乙酸乙酯(3×30mL)萃取水性殘餘物。經MgSO4乾燥合併之乙酸乙酯層，過濾且濃縮。將粗材料(1.36g)溶解於乙酸乙酯中且用1N NaOH(25mL)洗滌。用乙酸乙酯(25mL)萃取水層，用1N HCl(25mL)酸化，且用乙酸乙酯(3×25mL)萃取。經MgSO4乾燥合併之乙酸乙酯層，過濾且濃縮成蠟質固體。將此材料與MeOH(3×)共蒸發，以提供白色固體狀標題化合物(925mg,48%)。MS(m/z)：386.2(M+1)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ 12.82(寬峰)，8.17-8.15(m,1H),7.85-7.82(m,2H),7.39(d,J=8.3Hz,2H),7.26-7.22(m,2H),6.91-6.87(m,3H),5.01-4.98(m,1H),4.09(t,J=4.6Hz,2H),3.80-3.76(m,1H),3.69-3.65(m,1H),3.53(d,J=5.5Hz,1H),1.96-1.93(m,1H),1.31(d,J=7.1Hz,3H),0.80(d,J=6.8Hz,3H),0.76(d,J=6.7Hz,3H)。
製備5
4-[(1S)-1-[[(2R)-3-甲基-2-甲基磺醯基氧基-丁醯基]胺基]乙基]苯甲酸甲酯之合成.
反應圖2，步驟A. 將4-[(1S)-1-[[(2R)-2-羥基-3-甲基-丁醯基]胺基]乙基]苯甲酸甲酯(40g；143mmol)及三乙胺(22.0mL,157mmol)存於CH2Cl2(400mL)中之混合物冷卻至0℃。經45min逐滴添加甲磺醯氯(11.1mL,143mmol)存於CH2Cl2(200mL)中之溶液，且將混合物於室溫下攪拌1h。依序用1N HCl(100mL)及NaHCO3(200mL)水溶液洗滌混合物。經MgSO4乾燥有機層，過濾，且濃縮。經30min將粗材料於甲基第三丁基醚(200mL)及己烷(600mL)中製成漿液，過濾，且在真空下乾燥，以提供白色固體狀標題化合物(50g,98%)。MS (m/z)：358.2(M+1)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ 8.74(d,J=8.0Hz,1H),7.92(d,J=8.0Hz,2H),7.49(d,J=8.5Hz,2H),5.07-4.97(m,1H),4.64(d,J=5.8Hz,1H),3.84(s,3H),3.14(s,3H),2.17-2.06(m,1H),1.40(d,J=7.1Hz,3H),0.92-0.86(m,6H)。
製備6
4-[(1S)-1-[[(2R)-3-甲基-2-(2-苯氧基乙氧基)丁醯基]胺基]乙基]苯甲酸甲酯之合成.
反應圖2，步驟B. 在氮氣氛中，使用冰水浴將存於THF(450mL)中之2-苯氧基乙醇(17.3mL,138mmol)冷卻至5℃，且用第三丁醇鉀存於THF中之1M溶液(138mL,138mmol)逐滴處理5min。將混合物攪拌30min，且一次性添加4-[(1S)-1-[[(2R)-3-甲基-2-甲基磺醯基氧基-丁醯基]胺基]乙基]苯甲酸甲酯(45g,126mmol)。將混合物於室溫下攪拌1h，且添加水(300mL)。分離各層，且用乙酸乙酯(100mL)萃取水層。用鹽水洗滌合併之有機層，經MgSO4乾燥，過濾且濃縮。使用矽膠管柱層析(750g柱；存於庚烷中之20%至60%乙酸乙酯)純化粗材料，以提供白色固體狀標題化合物(30g,60%)。MS(m/z)：400.4(M+1)。
實例1之替代合成
4-[(1S)-1-[[(2R)-3-甲基-2-(2-苯氧基乙氧基)丁醯基]胺基]乙基]苯甲酸之替代合成.
反應圖2，步驟C. 向4-[(1S)-1-[[(2R)-3-甲基-2-(2-苯氧基乙氧基)丁醯基]胺基]乙基]苯甲酸甲酯(30g,75.1mmol)存於THF(300mL)中之溶液中添加2N NaOH(94mL,188mmol)。在55℃下將混合物攪拌過夜，冷卻，及濃縮移除THF。用水(200mL)稀釋水性殘餘物，且用乙酸乙酯(2×200mL)萃取。丟棄有機層。使用濃HCl(25mL)將水層酸化至pH 2且用乙酸乙酯(2×200mL)萃取。用MgSO4乾燥合併之乙酸乙酯層，過濾且濃縮。該材料與庚烷(500mL)在60℃下經2h製成漿液，冷卻至室溫，且過濾。將所得固體與水(500mL)在60℃下經2h製成漿液，冷卻至室溫，過濾，且在40℃下乾燥，以提供白色固體狀標題化合物(20g,69%)。MS(m/z)：386.0(M+1)。
4-[(1S)-1-[[(2R)-3-甲基-2-(2-苯氧基乙氧基)丁醯基]胺基]乙基]苯甲酸之X射線粉末繞射(XRPD).
在於35kV及50mA下操作之配備有CuKa源(λ=1.54060Å)及Vantec檢測器之Bruker D4 Endeavor X射線粉末繞射儀上獲得結晶固體之XRD圖案。在4°與40° 2θ之間掃描樣品，其中步長為0.0087° 2θ且掃描速率為0.5秒/步，且使用0.6mm發散狹縫、5.28mm固定抗散射狹縫及9.5mm檢測器狹縫。將乾燥粉末堆積於石英樣品架上且使用載玻片獲得平滑表面。結晶學領域中已熟知，對於任一指定晶體形式，繞射峰之相對強度可能基於由諸如晶體形態及習性等因素產生之較佳取向而變化。倘若存在較佳取向之效應時，則峰強度會改變，但多晶型之特徵峰位置不變。例如，參見美國藥典(U.S.Pharmacopeia)35-國家處方集(National Formulary)30第<941>章Characterization of crystalline and partially crystalline solids by X-ray powder diffraction (XRPD)官方2012年12月1日-2013年5月1日。此外，在結晶學領域中亦熟知，對於任一指定晶體形式，角峰位置可略有變化。例如，峰位置可因分析樣品時之溫度或濕度之變化、樣品置換或存在或不存在內部標準物而發生移位。在本情形下，±0.2 2θ之峰位置變化將考慮該等潛在變動而不妨礙指定晶體形式之明確鑑別。晶體形式之確認可基於有區別的峰(以° 2θ為單位)、通常為更突出之峰之任一獨特組合來進行。基於NIST 675標準峰在8.85°及26.77° 2θ處調節在環境溫度及相對濕度下收集之晶體形式繞射圖案。
4-[(1S)-1-[[(2R)-3-甲基-2-(2-苯氧基乙氧基)丁醯基]胺基]乙基]苯甲酸之形式1之晶體製備.
將4-[(1S)-1-[[(2R)-3-甲基-2-(2-苯氧基乙氧基)丁醯基]胺基]乙基]苯甲酸(4g)懸浮於庚烷(120mL)中，且在80℃下攪拌1小時。將混合物冷卻至環境溫度，藉由過濾收集固體，且在真空下乾燥固體，以提供3g(75%產率)4-[(1S)-1-[[(2R)-3-甲基-2-(2-苯氧基乙氧基)丁醯基]胺基]乙基]苯甲酸形式1。
與人類EP1、EP2、EP3及EP4之活體外結合
自穩定表現人類EP1(Genbank登錄號為AY275470)或EP4(Genbank登錄號為AY429109)受體之重組HEK293細胞製備hEP1及hEP4膜。自經EP2(Genbank登錄號為AY275471)或EP3(異型體VI：Genbank登錄號為AY429108)受體質體瞬時轉染之HEK293細胞製備hEP2及hEP3膜。使用鐵氟龍(Teflon)/玻璃均質器將冷凍的細胞沈澱物於均質化緩衝液中均質化。將膜蛋白等分且於乾冰上快速冷凍，然後儲存在-80℃下。均質化緩衝液含有10mM Tris-HCl(pH 7.4)、250mM蔗糖、1mM EDTA、0.3mM吲哚美辛(indomethacin)及含有EDTA之plus CompleteTM(自Roche Molecular Biochemicals獲得，目錄編號為1 697 498)。
藉由飽和結合研究或同源競爭來測定[3H]-PGE2與每一受體結合之K d值。以96孔形式使用三倍連續稀釋物測試化合物以產生10點曲線。在25℃下在0.3nM至0.5nM[3H]-PGE2(PerkinElmer,118Ci/mmol至180Ci/mmol)存在下將經稀釋化合物與20μg/孔EP1、10μg/孔EP2、1μg/孔EP3或10μg至20μg/孔EP4膜一起培育90分鐘。使用0.5mL聚苯乙烯96孔深孔板在200μL MES緩衝液(含有KOH之10mM MES (pH 6.0)、10mM MgCl2及1mM EDTA)中實施結合反應。藉由比較在2μM PGE2存在與不存在下之結合來計算非特異性結合。藉由過濾(TomTek收穫器)收穫膜，用冷緩衝液(含有KOH之10mM MES(pH 6.0)、10mM MgCl2)洗滌4次，在60℃爐中乾燥，且使用TopCount檢測器將放射性量化為每分鐘計數(CPM)。特異性結合百分數計算為針對在2μM PGE2存在下之結合所校正在任何抑制劑不存在下之結合百分數。使用如下顯示之4參數非線性邏輯斯諦方程(4-parameter nonlinear logistic equation)(ABase Equation 205)來分析數據：y=(A+((B-A)/(1+((C/x)^D))))，其中y=特異性抑制%，A=曲線底部；B=曲線頂部；C=相對IC50=基於頂部至底部之數據範圍引起50%抑制之濃度；D=希爾斜率(Hill Slope)=曲線斜率。K i自IC50值之轉換(K i=IC50/(1+[L]/K d)，其中[L]為配體濃度)。
遵循基本上如上文闡述之程序，表2中之數據證明實例1化合物以低奈莫耳濃度與hEP4結合。表2中之數據亦證明，實例1化合物與hEP4之結合要強於與hEP1、hEP2及hEP3之結合，從而指示對hEP4受體之選擇性。
活體外人類EP4功能性拮抗劑活性
在穩定表現人類EP4受體之重組HEK293細胞中實施分析。藉由在補充有10%胎牛血清(FBS)、1mM丙酮酸鈉、10mM HEPES、500μg/mL遺傳黴素及2mM L-麩醯胺酸且含有較高葡萄糖及吡哆醇鹽酸鹽之DMEM(Invitrogen)中培養來維持細胞系。在37℃下使鋪滿培養 物在含有5% CO2之氣氛中生長。使用2.5%胰蛋白酶-EDTA收穫細胞，將其以107個細胞/mL懸浮於冷凍培養基(含有6% DMSO之FBS)中，且將等分試樣儲存於液氮中。在即將分析之前，將細胞於DMEM中解凍，離心且重懸浮於cAMP緩衝液中。
使用HTRF(Cisbio目錄編號為62AM4PEB)量測EP4拮抗劑對PGE2刺激之cAMP產生之抑制。在室溫下將相當於4000個細胞之等分試樣與含有預定產生EC80之濃度之PGE2(0.188nM PGE2，來自Sigma，目錄編號為P5640-10mg)之50μL cAMP分析緩衝液及EP4拮抗劑一起培育20分鐘。cAMP分析緩衝液含有500mL HBSS、0.1% BSA、20mM HEPES及200μM IBMX(Sigma I5879)。CJ-042794用作陽性對照(參見WO 2005/021508，實例68，4-{(1S)-1-[({5-氯-2-[(4-氟苯基)氧基]苯基}羰基)胺基]乙基}苯甲酸；亦參見Murase,A.等人，Life Sciences,82：226-232(2008))。為量測cAMP含量，在室溫下將存於溶解緩衝液中之cAMP-d2偶聯物及抗cAMP-穴狀化合物偶聯物與經處理細胞一起培育1小時。使用EnVision®板讀取器(Perkin-Elmer)檢測HTRF信號以計算665nm下之螢光對620nm下之螢光之比率。使用針對每一實驗產生之cAMP標準曲線將原始數據轉換成cAMP量(pmol/孔)。使用如下顯示之4參數非線性邏輯斯諦方程(ABase Equation 205)來分析數據：y=(A+((B-A)/(1+((C/x)^D))))，其中y=特異性抑制%，A=曲線底部，B=曲線頂部，C=相對IC50=基於頂部至底部之數據範圍引起50%抑制之濃度，D=希爾斜率=曲線斜率。
遵循基本上如上文闡述之程序，實例1化合物具有以人類EP4量測之2.2±1.7nM之IC50(n=5)。此證明實例1化合物在活體外係人類EP4之有效拮抗劑。
活體外大鼠EP4功能性拮抗劑活性
將大鼠EP4 cDNA(Genebank登錄號為NM_03276)選殖至pcDNA 3.1載體中，且隨後在用於受體表現之HEK293細胞中轉染。將大鼠EP4穩定純系按比例增加，且然後冷凍為細胞庫以供將來進行化合物篩選。為測試rEP4細胞中之EP4拮抗劑化合物，將經冷凍細胞解凍且然後將細胞重懸浮於cAMP分析緩衝液中。cAMP緩衝液係由補充有20mM HEPES(Hyclone,SH30237)、0.1% BSA(Gibco,15260)及125μM IBMX(Sigma,I5879)且不含酚紅之HBSS(Hyclone,SH30268)來製備。將細胞平鋪於96孔半區平底聚苯乙烯黑色板(Costar 3694)中。使用DMSO連續稀釋化合物以獲得10點濃度反應曲線。然後以DMSO/緩衝液為1/100之比率將經稀釋化合物添加至含有PGE2(Cayman 14010，其濃度預定產生EC80)之cAMP分析緩衝液中。在室溫下在PGE2(EC80濃度)存在下用化合物將細胞處理30分鐘。藉由cAMP HTRF分析套組(Cisbio 62AM4PEC)來量化自細胞產生之cAMP含量。在使用HTRF最佳化方案之EnVision板讀取器(PerkinElmer)上讀取板。使用Graphpad Prism(第4版)非線性回歸、S型劑量反應曲線擬合來計算IC50。
遵循基本上如上文闡述之程序，實例1化合物具有以大鼠EP4量測之2.0nM之IC50(n=1)。此證明實例1化合物在活體外係大鼠EP4之有效拮抗劑。
人類全血中之活體外拮抗劑活性
人們認為，PGE2對LPS誘導之自巨噬細胞/單核球之TNFα產生的抑制效應係由EP4受體介導(參見Murase,A.等人，Life Sciences,82：226-232(2008))。實例1化合物逆轉PGE2對人類全血中LPS誘導之TNFα產生之抑制效應的能力係功能活性之標記。
將血液自正常志願者供體收集至肝素鈉真空採血管(vacutainer tube)中。供體在捐贈之前48小時內未服用NSAID或塞來考昔(celecoxib)或在捐贈之前兩週內未服用糖皮質激素。將所有管/供體彙 集於50mL Falcon尖底離心管中且以98μL/孔分佈至96孔組織培養板(Falcon 3072)中。將化合物於DMSO中稀釋至100X最終濃度，且以1μL/孔一式三份添加至血液中以獲得7點濃度反應曲線。在37℃下在5% CO2加濕氣氛中用化合物將血液預處理30分鐘，此後以1μL/孔添加1mg/mL脂多糖(LPS)(Sigma 0111：B4)存於0.2mg/mL牛血清白蛋白(BSA)/PBS(二者皆具有及不具有1mM PGE2(Cayman 14010))中之溶液，以獲得10μg/mL之最終LPS濃度，二者皆具有及不具有10nM PGE2。在37℃下在5% CO2加濕氣氛中將板培育20-24小時。在22℃下在Eppendorf 5810R離心機中將板以1800×g離心10分鐘。自細胞層移除血漿且將其轉移至v形底聚丙烯板。藉由市售酶免疫分析(R&D Systems DY210)使用Immulon 4 HBX板(Thermo 3855)及3,3',5,5'四甲基聯苯-4,4'-二胺受質(KPL 50-76-03)來量化2μL血漿中之TNFα含量。在板讀取器(Molecular Devices Versamax)上使用SOFTmaxPRO(第4.3.1版)軟體在A450-A650下讀取板。使用Graphpad Prism(第4版)非線性回歸以及S型劑量反應曲線擬合來計算IC50。結果表示為幾何平均值±標準偏差；n=獨立測定次數。
遵循基本上如上文闡述之程序，實例1化合物具有以人類EP4量測之20±24nM之IC50(n=11)。此證明實例1化合物在人類血液TNFα誘導分析中為有效EP4拮抗劑。

Claims (13)

  1. 一種下式化合物， 或其醫藥上可接受之鹽。
  2. 如請求項1之化合物，其係： 或其醫藥上可接受之鹽。
  3. 如請求項2之化合物，其係：
  4. 如請求項1至3中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於療法中。
  5. 如請求項1至3中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療骨關節炎。
  6. 如請求項1至3中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療類風濕性關節炎。
  7. 如請求項1至3中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療與骨關節炎相關之疼痛。
  8. 如請求項1至3中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療與類風濕性關節炎相關之疼痛。
  9. 一種如請求項1至3中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造用來治療患者之骨關節炎之藥劑。
  10. 一種如請求項1至3中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造用來治療患者之類風濕性關節炎之藥劑。
  11. 一種如請求項1至3中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造用來治療患者之與骨關節炎相關之疼痛的藥劑。
  12. 一種如請求項1至3中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造用來治療患者之與類風濕性關節炎相關之疼痛的藥劑。
  13. 一種醫藥組合物，其包括如請求項1至3中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽與一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之組合。
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