TW201400112A - 珊瑚ＢｒＤ１雙萜化合物及其取代物於醫藥上之應用 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種珊瑚BrD1雙萜化合物及其取代物之用途，其係用於製造治療與誘發型一氧化氮合成酶(iNOS)、第二型環氧合酶(COX-2)及/或基質金屬蛋白酶(MMP-9)相關疾病之藥物。本發明亦關於一種該珊瑚BrD1雙萜化合物及其取代物之用途，其係用以製造治療與TNF-α及/或IL-6過度表現相關疾病之藥物

Description

珊瑚BrD1雙萜化合物及其取代物於醫藥上之應用
本發明係關於雙萜化合物之醫療用途，特別是自海洋珊瑚萃取之雙萜化合物BrD1及其取代物之醫療用途。
隨著文明進步，人類除延長壽命外，更重視生活品質之提升。然而至今有許多疾病，例如癌症、慢性疼痛與動脈粥狀硬化，仍無專一且有效治療或預防之藥物。
許多研究報告證實發炎性反應於許多疾病之發生上扮演重要角色。這些發炎性相關疾病之發生和許多例如自由基、污染、飲食及壽命之外在壓力環境所誘發之身體慢性且長期發炎密切相關。
動脈粥狀硬化(atherosclerosis)作用造成血管重塑(remolding)，進而導致血管內徑變小。此病變為引起如心肌梗塞(myocardial infarction)、中風(stroke)及週邊血管病變之急性且致命心血管疾病之重要原因。心血管疾病亦為文明進步國家重大死因之一(Libby，Am J Clin Nutr 83：456S-460S，2006)。研究報告已證實，動脈粥狀硬化為一種慢性發炎性心血管疾病(Ross，N Engl J Med 340：115-126，1999)，因早期血管內皮細胞受到壓力或破壞，誘發單核細胞分化為巨噬細胞並大量聚集在受損組織周圍，經由一連串發炎性反應，導致血管內平滑肌細胞增生及相關發炎性細胞聚集，最後使血管之血流功能受損進而引發心血管疾病(Lucas與Greaves，Exp Rev Mol Med 5：1-18， 2001；Gordon，Bioessays 17：977-986，1995；Majno與Joris，Cells，Tissues and Disease：Principles of General Pathology，Blackwell Science，Cambridge，MA，USA，1996)。於動物實驗之研究結果顯示誘發型一氧化氮合成酶及第二型環氧合酶此兩種發炎性反應關鍵蛋白質在動脈粥狀硬化上扮演重要角色(Cipollone，Lupus 14：756-759，2005；Boyle，Curr Vasc Pharmacol 3：63-68，2005)。此外，從人類粥狀硬化組織中(包含巨噬細胞、增生之平滑肌細胞)亦可發現大量誘發型一氧化氮合成酶及第二型環氧合酶之表現及大量巨噬細胞聚集(Baker等人，Arterioscler Thromb Vasc Biol 19：646-655，1999；Buttery等人，Lab Invest 75：77-85，1996)。目前亦證實給予誘發型一氧化氮合成酶或第二型環氧合酶選擇性抑制劑可顯著預防粥狀硬化之發生(Burleigh等人，Circulation 105：1816-23，2002；Hayashi等人，Atherosclerosis 187：316-324，2006；Pratico等人，Arterioscler Thromb Vasc Biol 19：646-655，2001)。
根據國際疼痛醫學會(International Association for the Study of Pain，IASP)之定義，疼痛是一種伴隨著實質或潛在組織傷害所引起之不愉快情緒或感官經驗。尤其現今人類壽命延長，人們遭受各類型疼痛攻擊的機會及時間一再提高。保守估計全球每年止痛藥消費量約為一千億美元，經由疼痛控制進而提高生活品質為一重要之課題。於各式疼痛中，神經病理性疼痛之起因眾多，如糖尿病所引起之末端循環不良或截肢、外傷所導致之神經受損、病毒感染 及起因不明的疼痛。目前臨床上有關止痛藥物可分為具成癮性止痛藥與非成癮性止痛藥。成癮性止痛藥以鴉片類(opiate)為主，然而鴉片類藥物對神經病理性疼痛之止痛效果並不好。非成癮性止痛藥可分為類固醇型(steroid)及非類固醇型(non-steroid)。類固醇型止痛藥主要經由抗發炎途徑進而達到止痛的效果，其專一性差、副作用大且無法長期服用；而非成癮性之非類固醇型藥物又可分成單純止痛型(如普拿疼)及消炎止痛型(如阿斯匹靈)。目前非類固醇型消炎止痛藥(non-steroid anti-inflammatory drug；NSAID)是目前咸認副作用較低相對安全之藥物。於各式類固醇型消炎止痛劑中選擇性較高者之藥理機制主要係藉由抑制第二型環氧合酶或誘發型一氧化氮合成酶之訊息路徑，進而達到消炎止痛之作用(Turini與DuBois，Annual Rev Med 53：35，2002；Handy等人，Br J Pharmacol 123：1119-1126，1998；Osborne等人，Br J Pharmacol 126：1840-1846，1999)。目前已有研究報告證實在中樞神經系統及週邊組織中由誘發型一氧化氮合成酶或第二型環氧合酶所催化之產物NO或PGE2，對疼痛的產生、維持及敏感化十分重要(Moalem及Tracey，Brain Res Rev 51：240-264，2006)。有別於神經阻斷劑使用於止痛作用會影響運動功能，給予誘發型一氧化氮合成酶或第二型環氧合酶抑制劑並不易產生運動功能下降及神經受損之副作用，故為目前止痛藥物開發上一重要之方向。
皮膚為人體中最大的器官與身體和環境間的主要屏障， 可在第一線扺禦微生物病原和物理及化學性壓力或剌激。皮膚不僅提供物理與化學性保護，亦為能有效引起被動和主動免疫反應的免疫器官，進而保護人體(Kupper TS,Fuhlbrigge RC.Nature reviews Immunology 2004,4：211-222；Nestle FO,Di Meglio P,Qin JZ,Nickoloff BJ.Nature reviews Immunology 2009,9：679-691)。皮膚免疫系統可維持限制過度發炎引起組織損害，並兼顧對病原感染快速反應兩者之間的平衡(Jermy A.Nature Reviews Immunology 2010,10：1)。目前已知的是，不適當或錯誤的免疫反應與許多後天發炎性皮膚不適的病理機轉有關(Kupper TS,Fuhlbrigge RC.Nature reviews Immunology 2004,4：211-222)。因此在皮膚免疫系統中，免疫調節因子運作機轉的系統性研究為皮膚疾病療法發展所必需。
急性發炎為對於有害刺激的首要免疫反應。皮膚中的急性發炎通常會增加皮膚組織的血管滲透性，而引起發炎處有液體聚積(水腫)。媒介分子如一氧化氮和***素的釋放也會促使血管滲透性增加，因而容許白血球(主要為噬中性球)有效地移行至發炎部位。已有文獻指出，基質金屬蛋白酵素(Matrix metalloproteinases，簡稱MMPs)-9可降解表皮和真皮的細胞成份，為白血球移行的重要參與分子(Nagaoka I,Hirota S.Inflamm Res 2000,49：55-62)。再者，由角質細胞或抗原特異細胞所分泌的細胞激素如TNF-α、IL-1α與IL-6等，皆於協調皮膚發炎反應扮演關鍵角色，可作為皮膚發炎情況的指標(Nestle FO,Di Meglio P,Qin JZ,Nickoloff BJ.Nature reviews Immunology 2009,9：679-691；De Vry CG,Valdez M,Lazarov M,Muhr E,Buelow R,Fong T,Iyer S.J Invest Dermatol 2005,125：473-481；Cumberbatch M,Dearman RJ,Kimber I.Immunology 1996,87：513-518)。
對於UVB暴露和發炎性皮膚疾患，目前已有許多新穎方法來監測其造成皮膚癌與組織傷害之風險因子(Stanifortha V,Huang WC,Aravindaram K,Yang NS.The Journal of Nutritional Biochemistry,In Press)。許多來自藥用植物中的植物性化學成分和組織萃取物，已有文獻提及能刺激免疫活性與具有臨床應用的潛力(Nair HB,Sung B,Yadav VR,Kannappan R,Chaturvedi MM,Aggarwal BB.Biochem Pharmacol 2010,80：1833-1843；Wang CY,Staniforth V,Chiao MT,Hou CC,Wu HM,Yeh KC,Chen CH,Hwang PI,Wen TN,Shyur LF,Yang NS.BMC Genomics 2008,9：479)。例如由Lithospermum erythrorhizon萃取之紫草素為小分子植物性化學物能於活體內抑制小鼠皮膚中人類TNF-α促進子的轉錄活性(Staniforth V,Wang SY,Shyur LF,Yang NS.J Biol Chem 2004,279：5877-5885)；咖啡酸能於小鼠皮膚抑制UVB誘導的IL-10表現與MAPK的活性(Staniforth V,Chiu LT,Yang NS.Carcinogenesis 2006,27：1803-1811)；阿魏酸(ferulic acid，一種植物性酚類化學成份)能透過轉譯後修飾機制，有效地抑制小鼠皮膚中UVB誘導基質金屬蛋白酵素表現(Stanifortha V,Huang WC,Aravindaram K, Yang NS.The Journal of Nutritional Biochemistry,In Press)。
於一般認知上，植物與地球上微生物中的天然產物為人類醫藥發展先趨成份的優良來源。但是由於海洋環境的生物歧異度與的海洋化學成份特殊結構和藥物活性的發現，取自海洋生物的成份成為未來醫藥應用的主要來源(Marris E.Nature 2006,443：904-905)。許多新奇的海洋化學成份已被辨識出來，並評估它們的生物活性是否具醫藥應用之潛力(Blunt JW,Copp BR,Munro MH,Northcote PT,Prinsep MR.Nat Prod Rep 2005,22：15-61)。海洋生物為可行之具療效化合物萃取來源。
本發明在於提供一種briarane型雙萜化合物BrD1及其取代物之醫療用途，其係用以製造治療與誘發型一氧化氮合成酶(iNOS)、第二型環氧合酶(COX-2)及/或基質金屬蛋白酶(MMP-9)相關疾病之藥物。
根據本發明，該雙萜化合物BrD1具有式1所示之結構
本發明另提供一種具有式1結構化合物BrD1及其醯氧取代物之用途，其係用以製造治療與TNF-α及/或IL-6過度表現相關疾病之藥物。
本發明自台灣產灌叢柳珊瑚(Briareum excavatum)分離之雙萜化合物BrD1及其取代物具有抑制誘發型一氧化氮合成酶、第二型環氧合酶及/或基質金屬蛋白酶活性，因此可用以製造治療與誘發型一氧化氮合成酶、第二型環氧合酶及/或基質金屬蛋白酶相關疾病之藥物。
根據本發明，該雙萜化合物具有式1所示之結構，
根據本發明之該雙萜化合物BrD1，其具有式1所示之結構，可由其天然來源萃取而得，亦可由化學合成而得；較佳係由其天然來源萃取而得，例如Sheu JH,Sung PJ,Cheng MC,Liu HY,Fang LS,Duh CY,Chiang MY.J Nat Prod 1998,61：602-608及Sheu JH,Sung PJ,Su JH,Wang GH,Duh CY,Shen YC,Chiang MY,Chen IT.J Nat Prod 1999,62：1415-1420所示之萃取方法，該等文獻以參考資料方式併入本文中。
根據本發明之該雙萜化合物BrD1之醯氧取代物中，醯氧基之取代位置可於化學上可接受之位置，於本發明之較佳具體實施例中，該式1結構化合物之醯氧取代物係以醯氧基取代C-12位置之羥基。
根據本發明之醯氧基可經取代或未經取代，較佳係為未經取代。另一方面，該醯氧基之碳數並無限制，較佳係為2至12個；更佳係為4至10個。再一方面，該醯氧基可為直鏈或支鏈，較佳係為直鏈。
於本發明之較佳具體實施例中，該式1結構化合物之醯氧取代物係選自由式2至5結構化合物所組成之群：
該醯氧取代物之製備方法可為化學上合成雙萜化合物醯氧取代物之方法，於本發明之一較佳具體實施例中，其係 於5 mL之吡啶(Pyridine)中將適量之醯氯基團(0.02 mmol)加入式1所示結構之雙萜化合物(10 mg)內，混合物於室溫放置至隔夜。並加入4 mL水至反應溶液中，再以EtOAc(5 ml x 3)萃取，合併EtOAc層，並以無水MgSO4乾燥濃縮。剩餘物質以矽膠層析管柱純化，其係以EtOAc/己烷(1：8)作為洗提液，而可製得如式2至5所示之雙萜化合物醯氧取代物，其濃度介於61.6%和78.3%之間。
由於本發明化合物具有抑制誘發型一氧化氮合成酶及/或、第二型環氧合酶作用之效果，故可用以治療與誘發型一氧化氮合成酶及/或第二型環氧合酶作用相關之疾病。較佳地，根據本發明之化合物同時具有抑制誘發型一氧化氮合成酶及第二型環氧合酶作用之效果，故可用以治療誘發型一氧化氮合成酶及第二型環氧合酶作用相關之疾病。
於本發明之較佳具體實施例中，將C57BL/6JNarl雌鼠腹部分別依下述方式給藥處理：TPA(12-O-tetradecanoyl-13-phorbol-acetate，10 nmol)、局部載劑處理(丙酮)處理6小時、或先以TPA處理10分鐘後再以特定濃度之根據本發明之化合物處理6小時，再以COX-2與iNOS進行免疫組織化學染色。如圖3A和3B，TPA處理可刺激COX-2於表皮層的表現，且相較於控制組TPA處理能明顯刺激iNOS在表皮和真皮層的生成。此外，給予根據本發明之化合物可減少TPA誘導之COX-2於表皮之表現(圖3A)，並顯著減少TPA誘導之iNOS在表皮和真皮的表現(圖3B)。
由於先前文獻已報導許多疾病的發生與一氧化氮合成酶 及/或第二型環氧合酶之作用相關，如關節炎(arthritis)(Cuzzocrea等人，Arthritis Rheum.52：1929-40，2005)、多發性硬化症(multiple sclerosis)(Misko等人，J Neuroimmunol.61：195-204，1995)、發炎性疼痛(inflammatory pain)(Toriyabe等人，Anesthesiology 101,983-990，2004)及脊髓損傷(spinal cord injury)(Lopez-Vales等人，Spine.31：1100-6，2006)，因此較佳地，該疾病係選自由發炎、動脈粥狀硬化、神經病理性疼痛、發炎性血管內膜增生、關節炎、多發性硬化症、發炎性疼痛及脊髓損傷所組成之群。
基質金屬蛋白酵素(MMPs)在生理及病理學上重組細胞外基質組織過程中扮演重要角色(Stamenkovic I.J Pathol 2003,200：448-464)。MMP-9為一種在發炎反應過程中很重要的明膠酶，可於皮膚損傷時被活化(Shakarjian MP,Bhatt P,Gordon MK,Chang YC,Casbohm SL,Rudge TL,Kiser RC,Sabourin CL,Casillas RP,Ohman-Strickland P,Riley DJ,Gerecke DR.J Appl Toxicol 2006,26：239-246)。為評估於TPA誘導發炎皮膚之中，根據本發明之化合物抗發炎效用對於MMP-9活化之影響性，於TPA處理24小時後局部給予根據本發明之化合物。如圖4所示，TPA處理相對於控制組能強烈地刺激MMP-9蛋白質表現。另一方面，根據本發明之化合物顯著依濃度抑制TPA誘導MMP-9蛋白表現，根據本發明之化合物處理(1 mg/部位/小鼠)的抑制效果最高可達89%。根據本發明之化合物處理後抑制TPA誘導 MMP-9表現，也能於mRNA階層觀察到。如圖4B所示，TPA顯著地刺激MMP-9 mRNA表現，TPA處理後根據本發明之化合物局部給藥也顯著依濃度抑制MMP-9 mRNA表現。根據本發明之化合物處理後(1 mg/部位/小鼠)抑制MMP-9表現程度最高可達82%。
於本發明之一較佳具體實施例中，該抑制誘發型一氧化氮合成酶、第二型環氧合酶及/或基質金屬蛋白酶作用係與Akt/NF-B訊號傳遞作用相關，與免疫相關的轉錄因子NF-B為iNOS和MMP-9表現的重要上游媒介蛋白，並參與了多種皮膚免疫反應，因此根據本發明之用途係用以製造治療與Akt/NF-B訊號傳遞作用相關之疾病。
於本發明之一較佳具體實施例中，小鼠皮膚，為了測定Akt和Erk活化的動能變化，以TPA刺激小鼠腹部皮膚0.5至8小時。TPA處理2小時後可觀察到大量Akt和Erk磷酸化(圖5A)。TPA處理顯著地刺激Akt、Erk、NF-B與IBα的磷酸化(圖5B)。根據本發明之化合物似乎僅輕微地抑制TPA誘導之磷酸化。不過根據本發明之化合物處理有效抑止NF-B磷酸化，而且顯著抑制TPA刺激之Akt與IBα之磷酸化。由以上結果可知，根據本發明之化合物能顯著抑制在小鼠皮膚中TPA刺激之NF-B和Akt活化。
於本發明之較佳具體實施例中，該發炎係為急性發炎。急性發炎反應包括血管滲透性、水腫與細胞滲透等變化(Rao TS,Currie JL,Shaffer AF,Isakson PC.Inflammation 1993,17：723-741)。
另一方面，於本發明之較佳具體實施例中，該疾病係為皮膚發炎。
於本發明之一具體實施例中，將C57BL/6JNarl雌鼠腹部分別依下述方式給藥處理：TPA(10 nmol)、局部載劑處理(丙酮)處理6小時、或先以TPA處理10分鐘後再以特定濃度之根據本發明之化合物處理6小時。1% Evans blue dye(100 μL)由小鼠尾靜脈注入20分鐘。TPA可顯著地提升血管滲透性(圖1A、1B和1C)。由TPA處理後局部給予根據本發明之化合物能明顯地抑制TPA誘導之血管滲透性，抑制程度約58%(BrD1之0.5 mg/部位)與77%(BrD1之1mg/部位)(圖1C)。另一方面，如圖2所示，局部處理TPA顯著增加皮膚厚度，特別是對比於未處理或載體控制組的皮下組織層。於TPA處理後給予根據本發明之化合物大致上可減少皮膚厚度，表示根據本發明之化合物能有效地抑制小鼠腹部皮膚中TPA誘導之水腫形成。
本發明另提供一種具有式1結構化合物BrD1及其醯氧取代物之用途，其係用以製造治療與TNF-α及/或IL-6過度表現相關疾病之藥物。於本發明之一較佳具體實施例中，其係用以免疫調節；更佳地，其係用以調節樹突狀細胞。許多研究提及角質細胞和多種免疫分泌細胞特定細胞激素的作用與皮膚發炎有關，包括IL-1β、TNF-α和IL-6(Nestle FO,Di Meglio P,Qin JZ,Nickoloff BJ.Nature reviews Immunology 2009,9：679-691；De Vry CG,Valdez M,Lazarov M,Muhr E,Buelow R,Fong T,Iyer S.J Invest Dermatol 2005,125：473-481；Cumberbatch M,Dearman RJ,Kimber I.Immunology 1996,87：513-518)。
於本發明之一具體實施例中，根據本發明之化合物可有效抑制小鼠骨髓衍生樹突狀細胞中，經脂多醣(LPS)刺激後之促發炎細胞激素TNF-α及IL-6的表現。
於本發明之具體實施例中，LPS刺激後TNF-α和IL-6的高量表現能持續24小時(圖6A)。BrD1處理顯著抑制LPS刺激之樹狀細胞內IL-6的表現，並且抑制TNF-α表現至更少量程度(圖6B)。
本發明之醫藥組合物可以口服、注射或局部方式給予，較佳地，其係為針劑之劑型。
本發明茲以下列實例予以進一步說明，唯不僅侷限於此等實例所揭示之內容。
實例
實驗方法
試劑
基因重組細胞激素mIL-4與mGM-CSF購於PeproTech(Rocky Hill,NJ)，TPA(12-O-tetradecanoyl-13-phorbol-acetate)、Evans blue dye、N,N-二甲基甲醯胺(N,N-dimethylformamide)及脂多醣(LPS，Escherichia coli 055：B5)購於Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)，雙萜化合物如前述文獻中方法由Briareum excavatum中萃取製備之。
實驗小鼠
C57BL/6JNarl雌鼠購於台灣國家實驗動物中心。所有小鼠皆養於無特殊病原動物房的無塵無菌箱中，維持恆溫24±2℃、溼度40-70%、12小時日夜週期等條件。所有實驗設施經中研院動物試驗委員會認證，且動物實驗皆遵循操作守則進行。
製備雙萜化合物BrD1之12-醯氧相似物
將於5 mL之吡啶(Pyridine)中將適量之醯氯基團(0.02 mmol)加入式1所示結構之雙萜化合物(BrD1)(10 mg)內，混合物於室溫放置至隔夜。並加入4 mL水至反應溶液中，再以EtOAc(5 ml x 3)萃取，合併EtOAc層，並以無水MgSO4乾燥濃縮。剩餘物質以矽膠層析管柱純化，其係以EtOAc/己烷(1：8)作為洗提液，而可製得如式2至5(BrD1-5C、BrD1-6C、BrD1-7C與BrD1-10C)所示之雙萜化合物醯氧取代物，其濃度介於61.6%和78.3%之間。
血管滲透性測定
TPA誘導血管滲透性分析依先前文獻所述加以修改後進行(Thurston G,Suri C,Smith K,McClain J,Sato TN,Yancopoulos GD,McDonald DM.Science 1999,286：2511-2514)。將C57BL/6JNarl雌鼠腹部剃毛後，分別以載劑(丙酮，200 μL/部位)、TPA(10 nmol於200 μL丙酮/部位)處理6小時，或以TPA處理10分鐘後接著處理不同濃度的BrD1六小時。未給藥處理的小鼠腹部為控制組。將1% Evans blue dye(100 μL)由小鼠尾靜脈注射進入，20分鐘之後，以拍照方式記錄小鼠腹部在不同處理條件時的解剖變化。每組腹部皮膚的典型表現皆分別取下皮膚後翻轉再拍照記錄。 利用99% N,N-二甲基甲醯胺萃取皮膚樣本中由血管中滲出至皮膚的Evans blue dye，放置於60℃條件至隔日後測量620 nm吸光值。
小鼠骨髓樹狀細胞體外培養
為取得小鼠骨髓樹狀細胞(BMDCs)，由台灣國家實驗動物中心購買5隻6週大的C57BL/6JNarl雌鼠，並飼養於SPF環境下。依先前文獻的方法取出C57BL/6小鼠體內的骨髓細胞後(Yin SY,Wang WH,Wang BX,Aravindaram K,Hwang PI,Wu HM,Yang NS.BMC genomics 2010,11：612)，再培養BMDCs。簡言之，先由股骨、脛骨中分離出骨髓，再以0.45-mm針頭大小的針筒吸取RPMI-1640培養液沖洗，這日為第0日。利用ACK溶解緩衝液(150 mM NH4Cl，1.0 mM KHCO3，0.1 mM EDTA)溶解懸浮紅血球5分鐘。再將骨髓細胞均勻散布於含有10%胎牛血清(FBS)、2 mM左旋穀胺醯胺(L-glutamine)、1%非必需胺基酸(nonessential amino acids)、100 U/mL盤尼西林(penicillin)、100 μg/mL鏈黴素(streptomycin)與20 ng/mL mGM-CSF的RPMI-1640培養液內，置於15-cm培養皿內，細胞濃度為1×107細胞/30 ml，培養於37℃和5% CO2條件之下。實驗第二日，移除三分之二原培養液，再加入30 ml含有mGM-CSF的新鮮培養液。實驗第五日，輕輕搖晃旋轉培養皿，將懸浮與未黏貼好的細胞隨培養液去除，再加入75%量含有20 ng/mL mGM-CSF與20 ng/mL mIL-4的培養液。實驗第七日，取下小鼠BMDCs(95%純度CD11b與MHC Ⅱ)，於含有1 mM丙酮酸鈉(sodium pyruvate)、0.1 mM非必需胺基酸、100 U/mL盤尼西林、100 μg/mL鏈黴素與10%胎牛血清(FBS，Invitrogen，Carlsbad，CA)的RPMI-1640培養液內，分別加入或不添加試驗化學物與脂多醣(LPS，100 ng/mL)，在恆溫37℃條件下培養24小時。
前發炎細胞激素測量
BMDCs分別加入或不添加試驗化學物與脂多醣(LPS，100 ng/ml)，在恆溫37℃條件下培養24小時。每份DC培養的上清液利用商品化ELISA試劑組(R&D Systems，Minneapolis，MN)，依實驗手冊指示進行IL-6和TNF-α測量。
引子設計和RT-PCR
C57BL/6JNarl雌鼠腹部除毛後，分別依下述方式給藥處理：未處理、局部載劑處理(丙酮，200 mL/部位)、TPA(10 nmol於200 mL丙酮/部位)處理6小時、或先以TPA處理10分鐘後再以特定濃度之BrD1處理6小時。利用TRIZol試劑(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)萃取雌鼠腹部皮膚的全RNA，RT-PCR反應則使用AccessQuick RT-PCR system(Promega，Madison，WI)。選用的引子為下述序列：小鼠MMP-9正股引子5'-CTA GTG AGA GAC TCT ACA CGG AG-3'(SEQ ID NO.1)與反股引子5'-GAG CCA CGA CCA TAC AGA TAC TG-3'(SEQ ID NO.2)；小鼠GAPDH正股引子5'-CAT CAC TGC CAC CCA GAA GAC TGT GGA-3'(SEQ ID NO.3)與反股引子5'-TAC TCC TTG GAG GCC ATG TAG GCC ATG-3'(SEQ ID NO.4)。掃描膠圖並利用Gene Tools software(Syngene，Cambridge，UK)分析影像密度。
病理組織分析
小鼠腹部除毛後，分別依下述方式給藥處理：未處理、局部載劑處理(丙酮，200 mL/部位)、TPA(10 nmol於200 mL丙酮/部位)處理6小時、或先以TPA處理10分鐘後再以特定濃度之BrD1處理6小時。小鼠皆以斷頸法犧牲，取下的腹部皮膚以福馬林固定後進行石臘包埋。組織切片(5 mm)後貼於矽烷處理玻片之上，以二甲苯脫臘5分鐘3次，接著浸於不同濃度酒精中脫水。每組切片需進行H&E染色。接者切片要做免疫組織化學染色，脫臘後的切片於10 mM citrate buffer(pH 6.0)中沸煮10分鐘，將抗原回復，接著以含有0.05% Tween-20的PBS潤洗5分鐘。將切片與3%過氧化氫(hydrogen peroxide in methanol)反應15分鐘以減少非特異性結合，再利用阻斷溶液(PBS包含1% BSA)沖洗30分鐘後，PBST沖洗5分鐘。所有切片以含2%山羊血清之阻斷溶液反應30分鐘，接下來加上1：200稀釋的多株iNOS抗體(eBioscience，San Diego，CA)於室溫反應1小時。玻片利用HPR EnVisionTM system(Dako，Glostrup，Denmark)呈色，再染3,3’二胺基聯苯胺四鹽酸(3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride，Dako)以決定過氧化氫酶的決合位。最後，使用Mayer’s蘇木素(hematoxyline)作為複染劑。
西方墨點法分析
C57BL/6JNarl雌鼠腹部除毛後，分別依下述方式給藥處理：局部載劑處理局部載劑處理(丙酮，200 mL/部位)、TPA(10 nmol於200 mL丙酮/部位)、或先以TPA處理10分鐘後再以特定濃度之BrD1處理。取下腹部皮膚樣本後，均質 與溶解以製備全蛋白質。蛋白質樣本接著利用濃度梯度膠體電泳分離，再將分離蛋白轉漬至PVDF Immobilon-P membrane(Millipore，Bedford，CA.)，PVDF膜以含有5%脫脂奶粉的PBST緩衝液(phosphate-buffered saline(PBS)containing 0.1% Tween 20)在室溫下阻斷非專一性無蛋白結合區60分鐘。商品化抗體(1：1000稀釋)與PVDF膜靜置隔夜(4℃)，以小鼠β-肌動蛋白量做為每組注入量的推估標準。PVDF膜以PBST緩衝液沖洗三次各5分鐘，再加入HRP-結合二級抗體(1：100,000稀釋)靜置後，以PBST緩衝液沖洗三次。轉漬後的蛋白質利用enhanced chemiluminescence(ECL)detection kit(Amersham Pharmacia Biotech，Buckinghamshire，UK)產生螢光訊號。最後以Image J軟體計算每個訊號帶的表現量。
統計分析
使用GraphPad Prism第五版進行實驗數據的統計分析。數據資料以單因子變異分析和Tukey多重比較測定法計算標準差，並以平均值±標準差的方式呈現。若P值小於0.05則其平均值被視為具統計意義。
結果
BrD1可有效抑制小鼠皮膚中TPA-誘導之血管滲透性
急性發炎反應包括血管滲透性、水腫與細胞滲透等變化(Rao TS,Currie JL,Shaffer AF,Isakson PC.Inflammation 1993,17：723-741)。為了評估BrD1於TPA誘導皮膚炎的鼠類模式之抗發炎功效，先評估BrD1對於TPA誘導血管滲透性的可能抑制能力。C57BL/6JNarl雌鼠腹部分別依下述方 式給藥處理：TPA(10 nmol)、局部載劑處理(丙酮)處理6小時、或先以TPA處理10分鐘後再以特定濃度之BrD1處理6小時。1% Evans blue dye(100 μl)由小鼠尾靜脈注入20分鐘。TPA可顯著地提升血管滲透性(圖1A、1B和1C)。由TPA處理後局部給予BrD1能明顯地抑制TPA誘導之血管滲透性，抑制程度約58%(BrD1之0.5 mg/部位)與77%(BrD1之1mg/部位)(圖1C)。
BrD1抑制TPA引起的水腫症狀
因為血管滲透性增加為水腫形成因子之一，接著利用皮膚樣本進行縱向切片與H&E染色，探討BrD1是否可抑制TPA誘導之發炎反應並阻止水腫形成。如圖2所示，局部處理TPA顯著增加皮膚厚度，特別是對比於未處理或載體控制組的皮下組織層。於TPA處理後給予BrD1大致上可減少皮膚厚度，表示BrD1能有效地抑制小鼠腹部皮膚中TPA誘導之水腫形成。
BrD1抑制小鼠皮膚中TPA誘導之COX-2與iNOS表現
COX-2和iNOS為多種發炎與免疫活性的媒介因子。COX-2與iNOS的相對高量表現可於皮膚的急性發炎間觀察到(Vane JR,Mitchell JA,Appleton I,Tomlinson A,Bishop-Bailey D,Croxtall J,Willoughby DA.Proc Natl Acad Sci U S A 1994,91：2046-2050)。為了解BrD1是否能抑制COX-2與iNOS的於TPA誘導發炎皮膚的表現，局部給予BrD1於TPA處理後之皮膚6小時，再以COX-2與iNOS進行免疫組織化學染色。如圖3A和3B，TPA處理可刺激COX-2於表皮層的表現，且相較於控制組TPA處理能明顯刺激iNOS在表 皮和真皮層的生成。此外，給予BrD1可減少TPA誘導之COX-2於表皮之表現(圖3A)，並顯著減少TPA誘導之iNOS在表皮和真皮的表現(圖3B)。
BrD1抑制小鼠皮膚中TPA誘導之MMP-9表現
基質金屬蛋白酵素(MMPs)在生理及病理學上重組細胞外基質組織過程中扮演重要角色(Stamenkovic I.J Pathol 2003,200：448-464)。MMP-9為一種在發炎反應過程中很重要的明膠酶，可於皮膚損傷時被活化(Shakarjian MP,Bhatt P,Gordon MK,Chang YC,Casbohm SL,Rudge TL,Kiser RC,Sabourin CL,Casillas RP,Ohman-Strickland P,Riley DJ,Gerecke DR.J Appl Toxicol 2006,26：239-246)。為評估於TPA誘導發炎皮膚之中，BrD1抗發炎效用對於MMP-9活化之影響性，於TPA處理24小時後局部給予BrD1。如圖4所示，TPA處理相對於控制組能強烈地刺激MMP-9蛋白質表現。另一方面，BrD1顯著依濃度抑制TPA誘導MMP-9蛋白表現，BrD1處理(1 mg/部位/小鼠)的抑制效果最高可達89%。BrD1處理後抑制TPA誘導MMP-9表現，也能於mRNA階層觀察到。如圖4B所示，TPA顯著地刺激MMP-9 mRNA表現，TPA處理後BrD1局部給藥也顯著依濃度抑制MMP-9 mRNA表現。BrD1處理後(1 mg/部位/小鼠)抑制MMP-9表現程度最高可達82%。
BrD1抑制小鼠皮膚內TPA刺激之NF-B和Akt活性
小鼠皮膚中，Akt和Erk訊息傳遞於發炎活性之角色已被廣為探討。因此評估了BrD1是否能干擾於發炎皮膚內TPA誘導之Akt和Erk活化。為了測定Akt和Erk活化的動能變化 ，以TPA刺激小鼠腹部皮膚0.5至8小時。TPA處理2小時後可觀察到大量Akt和Erk磷酸化(圖5A)，因此選擇2小時時間點，進一步評估BrD1相關之訊息傳遞活性。與免疫相關的轉錄因子NF-B為iNOS和MMP-9表現的重要上游媒介蛋白，並參與了多種皮膚免疫反應。於皮膚不同處理條件下探討了Akt、Erk、NF-B與IBα的磷酸化程度。TPA處理顯著地刺激Akt、Erk、NF-B與IBα的磷酸化(圖5B)。BrD1似乎僅輕微地抑制TPA誘導之磷酸化。不過BrD1處理有效抑止NF-B磷酸化，而且顯著抑制TPA刺激之Akt與IBα之磷酸化。由以上結果可知，BrD1能顯著抑制在小鼠皮膚中TPA刺激之NF-B和Akt活化。
BrD1抑制源自小鼠骨髓樹狀細胞內LPS誘導之IL-6和TNF-α表現
許多研究提及角質細胞和多種免疫分泌細胞特定細胞激素的作用與皮膚發炎有關，包括IL-1β,TNF-α和IL-6(Nestle FO,Di Meglio P,Qin JZ,Nickoloff BJ.Nature reviews Immunology 2009,9：679-691；De Vry CG,Valdez M,Lazarov M,Muhr E,Buelow R,Fong T,Iyer S.J Invest Dermatol 2005,125：473-481；Cumberbatch M,Dearman RJ,Kimber I.Immunology 1996,87：513-518)。為探究BrD1對於細胞激素抗發炎功效之影響性，選定源自小鼠骨髓樹狀細胞來評估BrD1抑制LPS誘導TNF-α和IL-6表現的程度。在對於TNF-α和IL-6的多時研究中，LPS刺激後TNF-α和IL-6的高量表現能持續24小時(圖6A)。因此選擇24小時這個時間點來評量NF-α和IL-6的表現程度。BrD1處理顯著抑 制LPS刺激之樹狀細胞內IL-6的表現，並且抑制TNF-α表現至更少量程度(圖6B)。
12-醯氧取代基的立體空間阻礙減低了雙萜化合物之抑制性生物活性
結果顯示BrD1內12-醯氧取代基的立體空間阻礙能降低它們的抑制活性。以較長的醯氧基(C5、C6、C7與C10)取代位於C-12之羥基，半合成了多種BrD1相似物。接下來探討LPS刺激成熟DCs內，BrD1和BrD1相似物(BrD1-5C、BrD1-6C、BrD1-7C與BrD1-10C)對於細胞激素分泌的抑制效果。BrD1顯著抑制LPS刺激成熟DCs內細胞激素IL-6的表現(圖7)。然而其抑制效果隨著C-12之羥基被取代為較長醯氧基(C5至C10)時逐漸下降，本發明證實12-醯氧取代基的立體空間阻礙能有效減少BrD1活性，並抑制LPS誘導IL-6表現。
上述實施例僅為說明本發明之原理及其功效，而非限制本發明。習於此技術之人士對上述實施例所做之修改及變化仍不違背本發明之精神。本發明之權利範圍應如後述之申請專利範圍所列。
圖1顯示BrD1抑制小鼠皮膚中TPA誘發之血管滲透性結果圖。C57BL/6JNarl雌鼠腹部除毛後，分別依下述方式給藥處理：未處理、局部載劑處理(丙酮，200 mL/部位)、TPA(10 nmol於200 mL丙酮/部位)處理6小時、或先以TPA處理10分鐘後再以特定濃度之BrD1處理6小時。1% Evans blue dye(100 μL)由小鼠尾靜脈注入20分鐘。(A)小鼠腹部 皮膚經多種藥物處理和血管滲透實驗之照片。(B)經上述藥物試驗後典型腹部皮膚真皮層之照片(C)皮膚內Evans blue滲出量由測量620 nm波長光譜決定之。＊，P<0.05和＊＊，P<0.01(相對於LPS控制組)。實驗結果為兩次獨立實驗之呈現。
圖2(A)及(B)顯示BrD1抑制TPA誘發之水腫結果圖。C57BL/6JNarl雌鼠腹部皮膚依圖1之敘述做局部處理。取下腹部皮膚進行切片與H&E染色。實驗結果為兩次獨立實驗之呈現。
圖3顯示BrD1抑制小鼠皮膚中TPA誘發之iNOS表現結果圖。C57BL/6JNarl雌鼠腹部皮膚依圖1之敘述做局部處理。如材料與方法中所提及，小鼠腹部皮膚的縱向組織切片分別以COX-2(A)和iNOS(B)抗體進行免疫染色，並以蘇木素複染。在真皮與表皮胞可見COX-2和iNOS的棕色陽性染色(如箭頭指示)。實驗結果為兩次獨立實驗之呈現。
圖4顯示BrD1抑制小鼠皮膚中TPA誘發之MMP-9表現結果圖。(A)C57BL/6JNarl雌鼠腹部皮膚分別依下述方式給藥處理：局部載劑處理(丙酮，200 mL/部位)、TPA(10 nmol於200 mL丙酮/部位)處理24小時、或先以TPA處理10分鐘後再以特定濃度之BrD1處理24小時。取下皮膚樣本後以西方墨點法分析MMP-9蛋白表現，小鼠β-肌動蛋白為每個樣本的控制組。(B)C57BL/6JNarl雌鼠腹部皮膚依圖1之敘述做局部處理。利用RT-PCR方法決定MMP-9 mRNA的表現量。結果比值為MMP-9相對於TPA處理控制組的比例 。實驗結果為兩次獨立實驗之呈現。
圖5顯示BrD1抑制小鼠皮膚中TPA誘發之NF-kB與Akt活性結果圖。(A)小鼠皮膚未給藥處理或以TPA於指定時間點給藥處理後，取下實驗皮膚樣本，分析其中Akt和Erk1/2之磷酸化程度。(B)C57BL/6JNarl雌鼠腹部皮膚分別依下述方式給藥處理：局部載劑處理(丙酮)2小時、TPA(10 nmol)處理2小時、或先以TPA處理10分鐘後再以特定濃度之BrD1處理2小時。取下皮膚樣本後以西方墨點法分析Akt、NF-B、IBα及Erk1/2的磷酸化程度。小鼠β-肌動蛋白為每個樣本的控制組。結果比值為每組相對於TPA處理控制組的比例。實驗結果為兩次獨立實驗之呈現。
圖6顯示BrD1抑制小鼠BMDCs內LPS誘發之IL-6與TNF-α表現結果圖。(A)源自C57BL/6小鼠的BMDCs以LPS(100 ng/ml)處理1至24小時。(B)源自C57BL/6小鼠的BMDCs以LPS(100 ng/mL)處理24小時或不同濃度LPS和BrD1共同處理24小時，再利用ELISA分析每組上清液內IL-6和TNF-α之濃度。＊，P<0.05和＊＊＊，P<0.001(相對於LPS控制組)。實驗結果為兩次獨立實驗之呈現。
圖7顯示結構-活性關係促使小鼠BMDCs內LPS誘發之IL-6表現受到抑制。BrD1的化學結構，以及它的相似物包括BrD1-5C、BrD1-6C、BrD1-7C和BrD1-10C。未成熟的DCs以LPS與20 μM BrDs共同處理，再利用ELISA測定上清液中的IL-6含量。＊＊＊，P<0.001(相對於LPS+BrD1處理組)。實驗結果為兩次獨立實驗之呈現。
<110> 國立中山大學
<120> 珊瑚BrD1雙萜化合物及其取代物於醫藥上之應用
<130> 無
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 1
<210> 2
<211> 23
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<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
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<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 3
<210> 4
<211> 27
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<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 4

Claims (12)

  1. 一種具有式1結構化合物BrD1及其醯氧取代物之用途，其係用以製造治療與誘發型一氧化氮合成酶(iNOS)、第二型環氧合酶(COX-2)及/或基質金屬蛋白酶(MMP-9)相關疾病之藥物，
  2. 根據請求項1之用途，其中該式1結構化合物之醯氧取代物係以酯基取代C-12位置之羥基。
  3. 根據請求項1或2之用途，其中該式1結構化合物之醯氧取代物係選自由式2至5結構化合物所組成之群：
  4. 根據請求項1或2之用途，其係用以製造治療與Akt/NF-B訊號傳遞作用相關之疾病。
  5. 根據請求項1或2之用途，其中該疾病係選自由發炎、動脈粥狀硬化、神經病理性疼痛、發炎性血管內膜增生、關節炎、多發性硬化症、發炎性疼痛及脊髓損傷所組成之群。
  6. 根據請求項5之用途，其中該疾病係為急性發炎。
  7. 根據請求項5之用途，其中該疾病係為皮膚發炎。
  8. 一種具有式1結構化合物BrD1及其醯氧取代物之用途，其係用以製造治療與TNF-α及/或IL-6過度表現相關疾病之藥物，
  9. 根據請求項8之用途，其中該式1結構化合物之醯氧取代 物係以酯基取代C-12位置之羥基。
  10. 根據請求項8或9之用途，其中該式1結構化合物之醯氧取代物係選自由式2至5結構化合物所組成之群：
  11. 根據請求項8或9之用途，其係用以免疫調節。
  12. 根據請求項11之用途，其係用以調節樹突狀細胞。
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