TW201350844A - 塑料微型流動分離及檢測平台 - Google Patents

Abstract

本發明提供包含複數個微型流動通道及一檢測窗口之塑料電泳分離晶片，其中該檢測窗口包含薄塑料；且該檢測窗口包含各微型流動通道之檢測區。該等晶片可與支撐體黏結，其限制條件為支撐體中提供一孔隙以允許在薄塑料檢測窗口處檢測電泳晶片中之樣品。此外，本發明描述用於電泳分離及檢測塑料電泳分離晶片上之複數個樣品的方法。

Description

塑料微型流動分離及檢測平台

本發明係屬於在藉由雷射誘發之螢光檢測下藉由電泳進行核酸排序及片段尺寸測定的領域。分析係在塑料電泳晶片上執行。

本申請案根據35 U.S.C.§119(e)主張2007年4月4日申請之美國臨時申請案第60/921,802號及2007年8月13日申請之美國臨時申請案第60/964,502號及2008年2月12日申請之美國臨時申請案第61/028,073號的申請日期之權利，各申請案以全文引用的方式併入本文中。兩個在與本申請案同一日期申請之美國申請案：名為"快速多路擴增靶核酸之方法(METHODS FOR RAPID MULTIPLEXED AMPLIFICATION OF TARGET NUCLEIC ACIDS)"之代理人案號08-318-US及名為"綜合核酸分析(INTEGRATED NUCLEIC ACID ANALYSIS)"之代理人案號07-801-US，以全文引用的方式併入本申請案中。

自20世紀70年代DNA排序技術(Maxam及Gilbert,1977,Proc Natl Acad Sci USA 74：560-564；Sanger等人，1977,Proc Natl Acad Sci USA 74：5463-5467)出現以來，利用此等技術之廣泛應用已發展。同時，已引入愈加複雜之測試設備來實施DNA排序。舉例而言，在1986年，Applied Biosystems上市銷售一種自動DNA排序儀，其係基於由Sanger排序法所產生之DNA片段之分離；將DNA片段用一組四種螢光染料標記且藉由毛細管電泳分離(Smith等人，1986,Nature 321：674- 679)。因此，Sanger排序法已成為過去三十年最廣泛利用之排序技術。

近年來，多種新的排序技術及相關測試設備已發展且繼續發展。稱為"下一代"方法(Metzker,2005,Genome Research 15：1767-1776中綜述)之此等化學方法包括焦磷酸排序法、連接反應排序法及單分子排序法。驅動研究下一代排序技術之主要目標一般為執行高產量基因組排序，且尤其為降低獲得完整基因組序列之成本。雖然下一代技術之每一鹼基對之成本在某些狀況下可比Sanger排序法之成本低，但所有此等方法(包括Sanger)均為高成本的且需要大量時間、人工及實驗室裝備。

目前對自給定基因組獲得極大量之序列資料的強調並不否定快速獲得相對少量之基因組序列的價值。舉例而言，許多常見人類疾病可基於少於1000個鹼基對之DNA序列(比產生完整人類基因組所需之鹼基對少若干個數量級)來診斷。類似地，對藉由短串聯重複分析產生的成組少於20個特定DNA片段之尺寸的精確測定足以鑑別給定之個體。

對將允許聚焦核酸分析(focused nucleic acid analysis)(定義為快速鑑別給定人類、動物或病原體基因組之子集(藉由核酸排序或片段尺寸測定))之儀器及技術的發展存在未滿足之需要。聚焦核酸分析將使最終使用者能夠作出幾乎即時之臨床、法醫學或其他判定。視應用而定，聚焦核酸分析可在多種情形下執行，包括醫院實驗室、醫師診所、床邊或在法醫學或環境應用之情況下在野外執行。

關於核酸(DNA及RNA)排序，臨床應用包括診斷細菌性、真菌性及病毒性疾病(包括測定生物體之抗藥性概況)、癌症(包括測定對化學療法之反應)及遺傳性及其他常見疾病(包括測定對藥物之反應)。聚焦核酸序列亦非常適於藥物基因組分析及某些法醫學應用(包括(例如)線 粒體DNA排序)。

關於核酸片段尺寸測定，聚焦核酸分析可用於法醫學及臨床應用中。舉例而言，一類人類鑑別法係基於短串聯重複(STR)分析(Edwards等人，1991,Am J Hum Genet 49(4)746：756)。在STR分析中，利用一系列引子來擴增含有變化數目之某些短串聯重複的某些基因組區。所得帶之尺寸藉由核酸片段尺寸測定(通常使用毛細管電泳)來測定，且該組STR等位基因之各成員之尺寸獨特地鑑別個體。STR分型已成為用於人類法醫學遺傳鑑別之全球標準，且為允許鑑別個體以及該個體之遺傳親屬之唯一生物測定技術。在臨床應用中，核酸片段尺寸測定可用於診斷給定病症(例如，(如)弗里德賴希共濟失調(Friedreich ataxia)中藉由搜索特徵缺失或***或測定核苷酸重複區之尺寸)(Pandolfo,M.,2006,Methods Mol.Med 126：197-216)。片段尺寸測定亦可用於鑑別傳染劑；DNA指紋法可用於病原體診斷中。

聚焦核酸分析之應用不侷限於以上所討論之彼等應用。聚焦核酸分析可用於藉由排序及片段尺寸測定兩者來鑑別臨床及環境樣品中之生物武器劑(biological weapons agent)。獸醫學及食物測試應用亦反映上述之彼等應用。獸醫學鑑別應用(諸如，賽馬繁育及追蹤、家畜繁育及寵物鑑別)亦在本發明之用途之範疇內。聚焦核酸分析之研究應用為數眾多。簡言之，聚焦核酸分析具有顯著轉變若干行業之潛能。

現有高產量基於毛細管之排序儀及下一代排序儀不能夠以及時及成本有效之方式執行聚焦核酸分析。彼等技術所尋求之規模經濟受降低獲得及分析極大量序列資料之成本所驅動。為使能夠進行聚焦核酸分析之儀器及系統進入常規使用，其應經設計以具有某些"理想"性質及特徵。詳言之，該等儀器及系統應快速地產生結果(理想地，在幾分鐘內)以使可起訴之資料儘快產生。其應易於操作且試劑及消費 品應為廉價的。此外，對於一些應用而言，在一次性物品中執行核酸分離為有用的；此顯著減少樣品污染之可能性。為實現此等性質，基於聚合物之生物晶片比其他材料(諸如，玻璃及矽)適合作為分離基板。

對在塑料晶片上實現DNA片段尺寸測定之嘗試藉由McCormick(Anal Chem 69(14)：26261997)報導，顯示ΦX174 RF DNA之HaeIII限制片段之分離。雖然該等分離係在單個樣品下在單道晶片中執行，但其展示不良解析度分離及不良靈敏度。此外，該系統僅能夠檢測來自單螢光團之發射。雖然Sassi(J Chromatogr A,894(1-2)：203 2000)報導由16個流動分離之分離道組成的丙烯酸晶片用於STR尺寸測定之用途，但此方法亦顯示不良解析能力及低靈敏度。當執行同時16道分離及檢測時，此低系統靈敏度阻止等位基因階梯(法醫學分析中嚴格需要之內尺寸測定標準)之檢測。使用2Hz掃描速率(代表嘗試增加系統信號雜訊比)引起解析能力及精確度兩者之降級。最終，該系統僅能夠檢測來自單螢光團之發射。Shi(Electrophoresis 24(19-20)：3371 2003及Shi,2006,Electrophoresis 27(10)：3703)報導在單個樣品單道塑料分離設備中2及4色分離及檢測。雖然報導4.5cm通道提供單鹼基解析度，但實際上如藉由隔開一個鹼基對之等位基因之外觀所證明，解析度為不良的(THO1 9.3與10個等位基因之峰谷比接近1)。具有較長分離通道(6、10及18cm)之設備用於此研究中以實現與4.5cm設備相比更高之解析度以進行分析。當使用對解析度而言最佳之篩選基質組合物時，10及18cm長之設備因設備分層而受到限制。

實際上，已發現塑料對在經設計以用於核酸排序及片段尺寸測定之生物晶片中之用途呈現若干主要障礙。塑料材料之自身螢光干擾450至800nm之可見範圍中波長之檢測(Puriska,2005,Lab Chip 5(12)：1348；Wabuyele,2001 Electrophoresis 22(18)：3939-48；Hawkins 及Yager 2003 Lab Chip,3(4)：248-52)。

在Sanger排序及STR尺寸測定之商業套組中使用此等波長。此外，現有塑料設備具有對通常所用基板之低黏結強度及在通常所用之篩選基質下不良的效能結果。最終，通道內表面與篩選基質及DNA樣品相互作用，由於電滲流及DNA與壁之相互作用而導致不良解析度(Kan,2004,Electrophoresis 25(21-22)：3564)。

因此，對能夠以高解析度及高信號雜訊比執行聚焦核酸分析之廉價、多道塑料生物晶片存在未滿足之實質性需要。

本發明提供能夠以高解析度及高信號雜訊比執行聚焦核酸分析之廉價、多道塑料生物晶片及使用該等晶片之方法。

在一第一態樣中，本發明提供塑料分離晶片及尤其電泳晶片，其包含一陽極部分、一陰極部分及該陽極部分與該陰極部分之間的一中心部分，其中陰極部分包含至少一個第一通孔；陽極部分包含至少一個第二通孔；且該中心部分包含複數個微型流動通道及一檢測窗口，各微型流動通道具有一分離區及一檢測區；其中各微型流動通道與至少一個第一通孔及至少一個第二通孔處於流體連通中；其中該複數個微型流動通道處於實質上同一平面中；複數個微型流動通道在該中心部分內彼此不相交；該檢測窗口包含薄塑料；且檢測窗口包含各微型流動通道之檢測區域。在檢測區外之晶片部分可具有相同厚度或具有比檢測區厚度大的厚度。

在一第二態樣中，本發明提供包含具有一頂面及一底面之一支撐體之設備，其包含一陽極部分、一陰極部分及在該陽極部分與該陰極部分之間的一中心部分，其中該中心部分在檢測窗口上包含一孔隙，該陽極部分包含至少一個陽極孔，且該陰極部分包含至少一個陰極孔；該裝置進一步包含具有一頂面及一底面之根據第一態樣之一晶 片，其中該晶片之頂面與支撐體之底面接觸，微型流動通道經由通孔與陰極孔及陽極孔處於流體連通中；且晶片固定附著於支撐體。

在一第三態樣中，本發明提供同時電泳分離及檢測複數個樣品之方法，其包含將複數個樣品提供至根據第一態樣之微晶片上之複數個微型流動通道中的每一者中；跨越複數個微型流動通道施加電位以將樣品注射至分離通道中且將包含複數個分析樣品之每一者的可檢測物質分離；且在檢測窗口上檢測包含複數個分離樣品之各可檢測物質。

本發明之特定較佳實施例將自以下某些較佳實施例之更詳細描述及申請專利範圍變得顯而易見。

100‧‧‧晶片

101‧‧‧陽極部分

102‧‧‧陰極部分

103‧‧‧在陽極部分與陰極部分之間的一中心部分

104‧‧‧至少一個第一通孔

105‧‧‧至少一個第二通孔

106‧‧‧複數個微型流動通道

107‧‧‧檢測窗口

108‧‧‧分離區

109‧‧‧檢測區

201‧‧‧具有頂面及底面之支撐體

202‧‧‧陽極部分

203‧‧‧陰極部分

204‧‧‧在陽極部分與陰極部分之間的一中心部分

205‧‧‧檢測窗口

206‧‧‧至少一個陽極孔

207‧‧‧至少一個陰極孔

250‧‧‧晶片

360‧‧‧基板層

361‧‧‧複數個溝槽

370‧‧‧覆蓋層

371‧‧‧通孔

372‧‧‧通孔

400‧‧‧晶片

401‧‧‧陰極部分

403‧‧‧中心部分

405‧‧‧至少一個第二通道

406‧‧‧複數個微型流動通道

408‧‧‧包含樣品孔及廢液孔之注射通道

409‧‧‧樣品孔

410‧‧‧廢液孔

500‧‧‧晶片

501‧‧‧陽極部分

502‧‧‧陰極部分

503‧‧‧中心部分

504‧‧‧第一通孔

505‧‧‧第二通孔

506‧‧‧複數個微型流動通道

507‧‧‧檢測窗口

圖1說明根據本發明之各種實施例之一微型流動分離及檢測晶片。

圖2說明可用於建構根據本發明之各種實施例之一微型流動分離及檢測晶片的分離支撐體及晶片層。

圖3說明可用於建構根據本發明之各種實施例之一微型流動分離及檢測晶片的分離設備層。

圖4說明根據本發明之各種實施例之一微型流動分離及檢測晶片的陰極部分透視圖。

圖5說明根據本發明之各種實施例之具有注射通道的一微型流動分離及檢測晶片。

圖6為根據本發明之各種實施例之一微型流動分離及檢測晶片的示意圖。

圖7說明用於壓印之堆疊。

圖8說明藉由CNC銑削自3/8"厚之丙烯酸板(GE Plastic)製造的晶片支撐體；(頂)俯視圖；底(側視圖)。

圖9為證明與典型玻璃分離晶片相比，塑料晶片具有低自身螢光的螢光光譜；(a)經組裝之塑料晶片(Pchip2)；(b)經組裝之塑料晶片(Pchip1)；(c)僅塑料覆蓋層；(d)玻璃晶片，1.4mm厚；(e)玻璃晶片，0.7mm厚；(f)僅塑料基板。

圖10為來自5色標記套組(ABI AmpFlSTR Identifiler套組)之等位基因階梯的等位基因呼叫概況(allele-called profile)；上至下：藍色、綠色、黃色、紅色、橙色檢測器信號。

圖11為9947A人類基因組DNA之等位基因呼叫STR概況，上至下：藍色、綠色、黃色、紅色、橙色檢測器信號；全部概況在1.0ng DNA模板上實現。

圖12顯示對於達480個bp而言R>0.4之解析度，證明單鹼基解析度達480個bp；上至下：藍色、綠色、黃色、紅色、橙色檢測器信號。

圖13顯示藉由1個核苷酸分離之2個等位基因(THO1 9.3及10)之解析度。

圖14為pGEM片段之DNA排序分析；上至下：藍色、綠色、黃色及紅色檢測器信號。

圖15為顯示pGEM片段之DNA排序分析的複合四個鹼基對圖。

圖16為用於直接電動樣品注射之晶片設計的分離示意圖，其顯示支撐體(上)及晶片(底)層。

本發明提供能夠檢測尺寸相差約1個鹼基對且在至少1.0ng之DNA模板濃度水平下之核酸物質分離的塑料分離晶片。

在多路PCR反應之前待分析用於STR分析之最低含量樣品包含具有少於800副本、少於400副本、少於200副本、少於100副本、少於50副本、少於30副本、少於10副本或1副本核酸模板之核酸模板。待分 析以進行排序之最低濃度樣品包含具有少於0.5 pmole、少於0.1 pmole、少於0.01 pmole之核酸模板作為Sanger排序反應之輸入。

如本文所用之短語"注射通道"意謂一相交通道，其允許樣品被引入與其相交之微型流動通道。交叉通道可處於單一交叉通道、單一T形連接或偏置雙重T形連接組態。

如本文所用之短語"流體連通"係指含有流體之兩個腔室或其他組件或區域連接在一起以便流體可在該兩個腔室、組件或區域之間流動。因此，處於"流體連通"中之兩個腔室可(例如)藉由兩個腔室之間的微型流動通道連接在一起，以便流體可在兩個腔室之間自由流動。該等微型流動通道視情況可包括一或多個閥，該一或多個閥可閉合或關閉，以阻斷及/或另外控制腔室之間的流體連通。

如本文所用之短語"螢光染料"意謂在用光源激發後染料發出具有380-850nm之波長的光。較佳地，染料發出具有在約450-800nm之間的波長之光；更佳地，染料發出具有在約495-775nm之間的波長之光。

如本文所用之術語"自身螢光"意謂由除相關螢光團外之物質在光照射下產生的螢光。

如本文所用之短語"基本上不發螢光"意謂當經受光照射(例如，在約350-500nm、400-500nm或450-500nm之間的一或多個波長下；尤其在488nm下；雷射照射)時來自所述目標(例如，固體或溶液)之背景螢光信號(例如，在約380-850nm、400-800nm、450-800nm、500-800nm或495-775nm之間)具有低於來自由0.7mm厚之borofloat玻璃組成的習知玻璃微型流動設備之螢光信號的背景水準。

如本文所用之術語"基於降冰片烯之聚合物"意謂自至少一種包含 降冰片烯部分之單體製備之聚合物，其中含降冰片烯之單體係根據熟習此項技術者已知之方法根據開環複分解聚合來聚合(參見例如美國專利第4,945,135號、第5,198,511號、第5,312,940號及第5,342,909號)。

如本文所用之術語"聚(甲基丙烯酸甲酯)"或"PMMA"意謂甲基丙烯酸甲酯之合成聚合物，包括(但不限於)以商品名稱Plexiglas^TM、Limacryl^TM、R-Cast^TM、Perspex^TM、Plazcryl^TM、Acrylex^TM、Acrylite^TM、Acrylplast^TM、Altuglas^TM、Polycast^TM及Lucite^TM銷售之彼等聚合物以及美國專利第5,561,208號、第5,462,995號及第5,334,424號(各以引用的方式併入本文中)中所述之彼等聚合物。

如本文所用之術語"聚碳酸酯"意謂碳酸與二醇或二價酚之聚酯。 該等二醇或二價酚之實例為對二甲苯二醇、2,2-雙(4-氧苯基)丙烷、雙(4-氧苯基)甲烷、1,1-雙(4-氧苯基)乙烷、1,1-雙(氧苯基)丁烷、1,1-雙(氧苯基)環己烷、2,2-雙(氧苯基)丁烷及其混合物，包括(但不限於)以商品名稱Calibre^TM、Makrolon^TM、Panlite^TM、Makroclear ^TM、Cyrolon ^TM、Lexan ^TM及Tuffak ^TM銷售之彼等二醇或二價酚。

如本文所用之術語"核酸"意欲包含單鏈及雙鏈DNA及RNA，以及含有修飾鹼基、糖及主鏈之替代性核酸之任何及所有形式。因此，將理解術語"核酸"包括(但不限於)單鏈或雙鏈DNA或RNA(及其可為部分單鏈或部分雙鏈之形式)、cDNA、適體、肽核酸("PNA")、2'-5' DNA(與DNA之A構形匹配的具有縮短主鏈之合成物質，該縮短主鏈含有一個鹼基間隔；2'-5' DNA通常將不與呈B形式之DNA雜交，但其將易於與RNA雜交)及鎖核酸("LNA")。核酸類似物包括具有類似或改良之結合、雜交之鹼基配對性質的天然核苷酸之已知類似物。嘌呤及 嘧啶之"類似"形式在此項技術中熟知，且包括(但不限於)吖丙啶基胞嘧啶、4-乙醯基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基胺基甲基尿嘧啶、肌苷、N⁶-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N⁶-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲氧基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷(beta-D-mannosylqueosine)、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N-6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸及2,6-二胺基嘌呤。本發明所提供之DNA主鏈類似物包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、胺基磷酸酯、烷基磷酸三酯、胺基磺酸鹽、3'-硫縮醛、亞甲基(甲基亞胺基)、3'-N-胺基甲酸酯、N-嗎啉基胺基甲酸酯及肽核酸(PNA)、甲基膦酸酯鍵或交替甲基膦酸酯及磷酸二酯鍵(Strauss-Soukup,1997,Biochemistry 36：8692-8698)及苯甲基膦酸酯鍵，如US 6,664,057中所討論；亦參見OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES,A PRACITICAL APPROACH,F.Eckstein編輯，IRL Press,Oxford University Press(1991)；Antisense Strategies,Annals of the New York Academy of Sciences，第600卷，Baserga及Denhardt編(NYAS 1992)；Milligan,1993,J.Med.Chem.36：1923-1937；Antisense Research and Applications(1993,CRC Press)。本文之核酸可自細胞提取或根據熟習此項技術者已知之任何方式合成製備；舉例而言，在其他來源中，核酸可自cDNA或mRNA化學上合成或轉錄或逆轉錄。

如本文所用之術語"通孔"意謂在固體材料中所形成之透孔以允許材料頂面與底面之間的流體連接。

根據本發明之各種實施例之一例示性電泳晶片顯示於圖1中。晶片(100)包含一陽極部分(101)、一陰極部分(102)及在陽極部分與陰極部分之間的一中心部分(103)。陰極部分包含至少一個第一通孔(104)，且陽極部分包含至少一個第二通孔(105)。中心部分包含複數個微型流動通道(106)及一檢測窗口(107)，各微型流動通道具有一分離區及一檢測區；其中各微型流動通道與至少一個第一通孔及至少一個第二通孔處於流體連通中。複數個微型流動通道實質上處於同一平面中且在中心部分內彼此不相交。各微型流動通道具有一樣品之激發及/或檢測可進行於其中之區域。其中包含複數個微型流動通道之激發及檢測區之該區域稱為檢測窗口，且此窗口包含薄塑料。

如本文所用之短語"薄塑料"意謂所述材料包含厚度(其最小尺寸)小於1mm、小於750μm、小於650μm、小於500μm、小於400μm、小於300μm、小於200μm或小於100μm之塑料；或所述材料包含厚度在25-2000μm、25-1000μm、25-750μm、25-500μm、25-400μm、25-300μm或25-200μm之範圍內的塑料。雖然晶片經設計以在檢測窗口中為薄的，但在檢測區外之晶片部分可具有相同厚度或具有比檢測區厚度大的厚度。

為說明起見，顯示圖1之晶片具有四個微型流動通道，然而該揭示並不意欲限制之，實際上，熟習此項技術者將易於認識到晶片可含有交錯數目之微型流動通道(下文)，包括具有一個通道之晶片及具有兩個或兩個以上通道之晶片。如本文所用之術語"複數個"意謂兩個或兩個以上、四個或四個以上、八個或八個以上、16或16個以上、32個 或32個以上、48個或48個以上、64個或64個以上、96個或96個以上、128個或128個以上、256個或256個以上、384個或384個以上、512個或512個以上或1024個或1024個以上；或2-4、2-8、2-16、2-32、2-48、2-64、2-96、2-128、2-384、2-512、2-1024個微型流動通道。

如圖3中所示，晶片(250)包含一基板層(360)及一覆蓋層(370)。 將複數個溝槽(361)圖案化至基板層中。一系列通孔(亦即，透孔)(371、372)形成於覆蓋層中以使流體進入微型流動通道，且可位於晶片之陽極及陰極部分中微型流動通道之末端。或者，通孔可在基板層中而非覆蓋層中形成以實現相同功能。基板層之頂面與覆蓋層之底面黏結以形成微型流動通道。用於製造基於聚合物之微型流動系統之技術係藉由Becker及Gartner廣泛綜述(Becker,2000,Electrophoresis 21：12-26及Becker,2008,Electrophoresis 390(1)：89)，將其以全文引用方式併入本文中。任何數目之此等方法皆可用於製造本文所述之塑料分離晶片。

詳言之，本發明之塑料分離晶片可藉以具有待製造結構之負型標準模熱壓印薄熱塑薄膜的方式製備。標準模可藉由使用電鑄來複製固體基板中所製備之設備來製備。固體基板可為玻璃板，其係藉由熟習此項技術者已知之標準光刻及化學蝕刻方法來圖案化。藉由施加熱及壓力，使基板與覆蓋層擴散黏結。

晶片之基板及覆蓋層可建構自多種塑料基板，包括(但不限於)聚乙烯、聚(丙烯酸酯)(例如，聚(甲基丙烯酸甲酯))、聚(碳酸酯)及不飽和、部分不飽和或飽和環狀烯烴聚合物(COP)或不飽和、部分不飽和或飽和環狀烯烴共聚物(COC)(例如，ZEONOR^TM、ZEONEX^TM或TOPAS^TM)。詳言之，對於本發明之晶片應用而言，較佳係COP及 COC，因為其在光學上展示在可見光波長範圍中與其他聚合物相比固有之較低自身螢光。

保持本發明之方法中所利用之塑料基板及覆蓋層的厚度為薄的以將來自晶片之自身螢光降至最少。塑料基板及覆蓋層可各自獨立地具有小於2mm、小於1mm、小於750μm、小於650μm、小於500μm、小於400μm、小於300μm、小於200μm或小於100μm之厚度；或塑料基板及覆蓋層可各自獨立地包含厚度在25-2000μm、25-1000μm、25-750μm、25-650μm、25-500μm、25-400μm、25-300μm、25-200μm或25-100μm之範圍內的塑料。

在一實施例中，如圖2中所例示，晶片(250)附著於具有頂面及底面之支撐體(201)，其包含一陽極部分(202)、一陰極部分(203)及在陽極部分與陰極部分之間的中心部分(204)，其中中心部分包含一檢測窗口(205)，陽極部分包含至少一個陽極孔(206)，且陰極部分包含至少一個陰極孔(207)。具有向上通孔之晶片之頂面與支撐體之底面接觸，且晶片係固定附著於支撐體。晶片可根據熟習此項技術者已知之方法(例如，擴散黏結、溶劑黏結或黏著黏結)附著於支撐體。

支撐體層可建構自多種塑料基板，包括(但不限於)聚乙烯、聚(丙烯酸酯)(例如，聚(甲基丙烯酸甲酯))、聚(碳酸酯)及不飽和、部分不飽和或飽和環狀烯烴聚合物(COP)或不飽和、部分不飽和或飽和環狀烯烴共聚物(COC)(例如，ZEONOR^TM、ZEONEX^TM或TOPAS^TM)。本發明之方法中所利用之塑料支撐體層的厚度足夠厚以提供結構剛性且提供足夠量之樣品及緩衝液在儲集層中。塑料支撐體之厚度將在100-15,000μm之範圍內。

或者，可藉由在固體支撐體上圖案化該等溝槽以將晶片基板與 支撐體結構形成在一起來製造晶片。可將覆蓋層與支撐體黏結以完成結構。在此組態中，保持與微型流動通道之檢測部分一致的支撐體及晶片之檢測窗口之厚度為薄的以將自身螢光降至最少。此晶片部分之厚度係少於1000μm、少於750μm、少於500μm或少於250μm；或在25-1000μm、25-750μm或25-500μm之範圍內。

複數個微型流動通道中之每一者可具有至少10μm、50μm、100μm、200μm、500μm或1mm之深度；或具有在1-1000μm、10-100μm、10-50μm或25-50μm之範圍內的深度。複數個微型流動通道可具有至少25μm、50μm、100μm、200μm、500μm或1mm之寬度；或具有在25-1000μm、25-200μm或50-200μm之範圍內的寬度。各通道之微通道橫截面可具有實質上正方形、矩形、圓形、半圓形、橢圓形、三角形或梯形橫截面。熟習此項技術者將認識到微型流動通道之深度、寬度及橫截面可能一致或可能不一致。

複數個微型流動通道(106)中之每一者包含一分離區(108)及一檢測區(109)。分離區通常具有分離長度為約2-50cm、10-50cm、2-25cm、10-25cm之通道。分離長度定義為樣品注射點與樣品檢測點之間的通道部分。分離長度通常小於跨越陰極與陽極儲集層之間的分離通道之總長度。

同時分析複數個樣品可藉由將獨立分離通道中之各樣品注射及堆疊至本文所述之任何分離晶片中來執行。如熟習此項技術者所熟悉，視(例如)通道表面上所存在之電荷而定(下文)，沿分離通道施加電場引起樣品沿通道自分離通道之陰極部分朝陽極部分或自陽極部分朝陰極部分移動。樣品穿過篩選基質之移動基於尺寸來分離物質。

當經分離之樣品通過檢測窗口時，可激發附著於樣品內之各物 質之染料標記且可檢測所得螢光。在各通道之分離區之末端，檢測窗口通常與複數個微通道中之每一者的檢測區重疊。通常，複數個微型流動通道中之每一者的檢測區處於沿該等通道實質上相同之位置，使得檢測窗口可處於支撐體之中心部分中的單一位置處。

較佳地，為晶片提供用於將複數個樣品同時注射至複數個樣品或緩衝液孔中之注射器以能夠同時進行多重樣品分離及檢測。該等注射器將(例如)複數個樣品中之一樣品提供至複數個微型流動通道之一微型流動通道中。注射器可根據熟習此項技術者已知之任何方法(例如)藉由電泳輸送、氣體傳動或液體傳動經由將樣品連接至分離通道之針或管或通道將樣品引入通道中。

在某些實施例中，樣品可經由晶片之陰極儲集層載入晶片中。 可根據熟習此項技術者已知之方法經由陰極孔之一者引入注射量之各樣品。舉例而言，可經由對分離通道及/或分離通道之交叉通道與樣品及廢液孔加偏壓以便將樣品孔中之一部分樣品(亦即，注射量)提供至分離通道中來注射樣品。在樣品注射之後，將額外緩衝溶液引入各陰極孔中；可提供足夠量以稀釋孔中任何剩餘樣品。舉例而言，將約至少5、10、25、50或100倍於樣品注射量之量的緩衝液引入陰極孔中。或者，將在約5-100倍、5-50倍或10-50倍於樣品注射量之範圍內之量的緩衝液引入陰極孔中。

在其他實施例中，複數個微型流動通道中之每一者進一步包含一用於引入樣品之注射通道。舉例而言，參考圖4；其中顯示晶片(400)之透視圖，顯示陰極部分(401)及中心部分(403)之鄰接部分。陰極部分包含至少一個第二通道(405)，且中心部分包含複數個微型流動通道(406)。在晶片之陰極部分內，對於各微型流動通道而言，各 微型流動通道進一步包含一包含樣品孔(409)及廢液孔(410)之注射通道(408)。

注射通道可處於單一交叉通道(如圖4中所說明)、單一T形連接或偏移雙重T形連接組態。在一些實施例中，注射通道為偏移雙重T形連接組態，其將樣品注射量減至最小，藉此改良分離解析度。樣品自注射通道注射至微型流動通道可根據熟習此項技術者已知之方法來達成，該等方法包括經由在樣品、廢液、陽極及陰極孔中施加適當電位之電泳注射。

微型流動分離及檢測晶片之一替代性實施例在圖5中說明。晶片(500)包含一陽極部分(501)、一陰極部分(502)及一中心部分(503)。針對各微型流動通道(506)，陰極部分包含一第一通孔(504)，且針對各微型流動通道(506)，陽極部分包含至少一個第二通孔(505)。中心部分包含複數個微型流動通道(506)及一檢測窗口(507)，各微型流動通道具有一分離區及一檢測區；其中各微型流動通道與一第一通孔及一第二通孔處於流體連通中。複數個微型流動通道基本上處於同一平面，且在中心部分內彼此不相交。檢測窗口包含薄塑料且與各微型流動通道之檢測區重疊。

在此情況下，省略注射通道以利於各微型流動通道之陽極(第二)及陰極(第一)通孔。根據熟習此項技術者已知之方法(上文)經由陰極通孔之一者引入注射量之各樣品。在注射樣品之後，將額外緩衝溶液引入各陰極緩衝液孔中；較佳地，提供足夠量以稀釋孔中任何剩餘樣品，藉此調節自長期樣品注射引入之任何背景信號且改良檢測窗口上所觀測到之信號雜訊比。舉例而言，將約至少5、10、25、50或100倍於樣品注射量之量的緩衝液引入陰極孔中。或者，將在約5-100倍、 5-50倍或10-50倍於樣品注射量之範圍內之量的緩衝液引入陽極緩衝液孔中。

藉由跨越微晶片上之微通道施加電位差來提供微型流動通道內樣品之電泳分離。通常藉由將陰極及陽極分別置放於陰極孔及陽極孔中，沿微型流動通道之分離部分建立電場，且將樣品(例如，核酸)自陰極末端經由分離部分移動至檢測部分且最終至陽極，可跨越微通道之末端施加高壓。有效分離所需之電場通常在50V/cm至600V/cm之範圍內。來自電源之電壓經由電極施加，且陽極及陰極儲集層中使用緩衝液以提供電極與篩選聚合物之間的電接觸。

使用與陰極及陽極孔中之緩衝液接觸之電極將樣品分離所需之高壓施加至分離通道。由於與緩衝液接觸之電極上存在高壓，所以緩衝液水分子進行水解，導致OH^-、H⁺及氫氣之形成。此形成導致緩衝液之pH值隨時間而改變，且緩衝液內形成氣泡。緩衝液之pH值變化可經由在陽極及陰極儲集層中使用足夠緩衝溶液(例如，1X TTE；Amresco)而減弱以提供電極與篩選基質之間的接觸。緩衝液內所形成之氣泡具有移動至篩選基質中之傾向，阻斷通道，導致不良的核酸分離。

可藉由使用以下方法之一者或組合來防止電極上形成之氣泡移動至通道中。首先，可升高儲集層內之電極以移動氣泡產生來源(電極)遠離通道中之入孔。其次，玻璃料、聚合物玻璃料或聚合物膜或聚合物過濾器可***陰極入孔與電極末端之間。詳言之，聚合物玻璃料(例如，聚醚醚酮(PEEK))可***陰極入孔與電極末端之間。

選擇不導電且具有阻止電極上形成之氣泡通過孔之孔徑的玻璃料、膜或過濾器。由於在電極與篩選基質之間***玻璃料、聚合物膜 或過濾器，因此可防止自電解過程形成之氣泡進入通道中。此實施可減少及/或消除因氣泡堵塞通道所造成的故障。

電連接用於由複數個樣品組成之同時分析之分離設備以便共同電源可用於同時加偏壓於複數個通道。此外，晶片及儀器之實體限制通常將不允許所有通道在長度、深度及寬度方面具有相同實體布局。

為實現複數個微型流動通道中之每一者實質上相同之電泳注射及分離條件，個別設備之各通道區段應具有基本上相同之電阻且因此具有基本上相同之電場。實質上相同之電場(亦即，其中跨越複數個微型流動通道中之每一者的電場相差不超過約+/-5%)可藉由同時調整複數個微型流動通道中之每一者的長度、寬度及深度以調整通道之各區段之電阻來建立。各區段之電阻R可藉由以下關係式來描述： 其中ρ為電阻率，l為長度且A為通道之橫截面積。

存在於分離晶片之通道壁上的表面電荷可導致電滲透及樣品與壁之相互作用。可藉由將表面塗層塗覆至微型流動通道之內壁將此等影響降至最低。該等表面塗層及改質可經由熟習此項技術者已知之方法實現(例如Ludwig及Belder,2003 Electrophoresis 24(15)：2481-6)。

可利用大量用於表面改質之候選者，包括羥丙基甲基纖維素(HPMC)、聚(氧化乙烯)(PEO)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚二甲基丙烯醯胺(PDMA)、聚(乙烯基吡咯啶酮)、二甲基丙烯醯胺(DMA)、二乙基丙烯醯胺(DEA)、聚(二乙基丙烯醯胺)(PDEA)及其混合物，諸如PDMA：PDEA。

此外，為用於電泳應用，複數個微型流動通道中之每一者較佳係充滿篩選基質。在非限制性實例中，該等篩選基質可包含線性聚丙烯醯胺(PAA)、聚二甲基丙烯醯胺(PDMA)、聚二乙基丙烯醯胺 (PDEA)、聚乙烯基吡咯啶酮(PVP)及其組合，包括(例如)PVP：PAA、PDMA：PAA、PDEA：PAA、PDEA：PDMA：PAA。在某些實施例中，篩選基質包含0.1-50wt%之聚丙烯醯胺。大量此等篩選基質亦具有動態自塗能力。如使用本發明之電泳分離晶片之此等實施例所實施般，核酸自陽極經由篩選基質電泳移動至陰極末端，且在其中按尺寸分離。如上文所述，通道之內壁可經塗佈以將電滲透及核酸與壁之相互作用的影響降至最低。

解析度(本文特定為電泳解析度)為明確區分兩個及時分離之峰的能力(或藉由鹼基尺寸)。解析度(R)藉由以下方程式定義 其中t為第n個峰之移動時間，hw為第n個峰之全寬及半最大值，且△b為兩個峰之間的鹼基數目之差。單鹼基對解析度定義在R大於0.4之點。視覺上，兩個峰在峰谷比大於0.7時可彼此區分。R及峰：谷要求兩者必須均滿足以具有高解析度，且亦可認為解析度為一系列片段尺寸之特徵。在STR分析中等位基因之片段尺寸的範圍在90至400bp之範圍內，且跨越此範圍之片段尺寸的單鹼基對解析度為STR分析所需。排序分析之片段尺寸範圍高達1200bp。實現每一道長閱讀長度及資料產量之能力部分地藉由晶片能夠產生單鹼基對解析度之範圍來測定。

光學檢測系統之檢測極限由信號雜訊比(SNR)限定。此比率定義為信號功率與破壞信號之雜訊功率(雜訊功率之標準偏差)之比率。高SNR表明信號存在之更高確定性。3之信號雜訊比一般定義為可為確信鑑別信號存在所接受之信號雜訊比(Gilder,2007,J Forensic Sci.52(1)：97)。

當分析及檢測核酸樣品中之複數個核酸物質時，來自晶片檢測 窗口中之塑料的自身螢光對螢光背景有強烈影響。本發明之電泳分離晶片之有利特徵在於使用薄檢測窗口以將來自塑料之背景螢光降至最小。將此背景水準與borofloat^®(其為用於製造微型流動分離晶片之常用基板)相比。藉由使用薄塑料窗口，在PCR方法中可檢測到產生用於分析之螢光標記之片段的最少1000個副本、300個副本、100個副本、30個副本、10個副本、1個副本之模板核酸。亦可檢測到用於排序反應之最少0.5 pmole、0.1 pmole、0.01 pmole或0.001 pmole之核酸模板。

分離及檢測晶片應用

本發明之各種態樣之應用廣泛擴展用於核酸鑑別及排序兩者。用於人類鑑別中之實例包括刑事法醫學及國家安全，例如在軍用檢查點、邊界及港口、機場及大規模災難地點鑑別。獸醫學鑑別應用(包括，賽馬繁育及追蹤、家畜繁育及寵物鑑別)亦在本發明之電泳晶片之用途範疇內。

此外，本發明之儀器可加固且藉此運用於結果可即時使用之領域中。因而，該等儀器可用於軍用檢查點、邊界及港口、機場及大規模傷亡地點。

核酸排序技術之應用可分成四個領域：人類臨床診斷學，包括(例如)細菌性感染及抗體敏感性、病毒性感染(鑑別及抗藥性概況分析)、遺傳性疾病、複雜病症(哮喘、心臟病、糖尿病)及藥物基因組學；獸醫學臨床診斷學；研究排序，包括再排序及完成；生物武器劑鑑別，包括(例如)炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)及艾博拉病毒(Ebola virus)檢測；及食品安全。一些實例如下。

一患有HIV之患者需要抗藥性測試。目前，可花費數週來確立抗性。抗藥菌株可在此時間期間控制。對當患者在醫師診所中等待時可在1-2小時內提供回答之儀器及系統存在未滿足之需要。使用根據本 發明之電泳分離晶片允許頻繁抗藥性監測、臨床上及成本上更有效之使用抗病毒劑及更好之患者結果。

一患有菌血症之患者處於休克中。目前，可花費數天來確定病原體對抗生素是否有抗性及其身份。在此期間，必須用廣譜抗菌素(broad-spectrum antibiotics)來治療患者，廣譜抗菌素可引起對患者之嚴重副作用且促進目前盛行之抗菌藥抗性增加。此外，該等治療可為次佳的。使用根據本發明之電泳分離晶片允許在1-2小時中鑑別病原體之抗生素抗性概況，產生更有效之靶向治療、減少之抗生素毒性及更佳之患者結果。對患者及公眾健康之益處受人稱讚。

一患有癌症之患者正進行手術。目前，當患者在手術台上時取出腫瘤樣品至病理學檢查。基於簡單組織病理學菌株之結果，作出關於外科醫生應如何進取之決定。使用根據本發明之電泳分離晶片可用在不足1小時內癌症之明確核酸診斷代替組織病理學，允許作出基於更好資訊之外科手術決定。

以下實例說明本發明之特定實施例及其各種用途。其闡述僅為達成說明之目的，且不應理解為限制本發明。

實例 實例1 晶片設計及電泳 實例1A：晶片設計

本發明之設備之特定實施例的示意圖在圖6中說明。此微型流動設備由16個微通道組成，各微通道具有雙重T交叉注射器。通道之橫截面尺寸(90μm寬及40μm深)及陽極與交叉注射器之間的通道長度(25cm)對所有通道而言均為相等的。各通道之分離長度(交叉點與激發/檢測窗口之間的距離)在16至20cm長之範圍內。陰極孔與注射器之間的通道橫截面積經調整以便陰極與交叉點之間的所有電阻及因此 電場在偏壓下基本上相等。此確保與載入樣品之分離通道無關，樣品所經受之電場相同。所有通道之交叉點電壓基本上相同。用於注射樣品之樣品入口及樣品廢液支管均為2.5mm長。兩個通道之間的偏距為500μm。

實例1B：晶片及支撐體製造

藉由熱壓印、鑽孔以形成入孔且擴散黏結以密封通道，將晶片圖案化。在玻璃中藉由光刻使用化學濕式蝕刻方法製造母片(master)。接著此玻璃母片用於藉由電鑄來製造鎳鈷壓印工具以產生玻璃母片之負型複製物。Zenor^TM-1420R薄膜板(尺寸為5"×2"及厚度為188μm)用作基板材料。在此等板上，陰極、陽極、樣品及廢液入孔藉由鑽孔來形成。繼此之後，在壓印工具上將晶片設計特徵熱壓印至基板中。如圖7中所說明，藉由將堆疊置放於135℃下及1250psi壓縮壓力下經加熱之水壓機中15分鐘來實現壓印。將堆疊保持在1250psi之壓縮壓力下且在釋放之前使其冷卻至38℃。用含有降冰片烯單體之薄熱塑性聚合物製造此晶片導致在激發及檢測窗口產生低背景螢光。實現高黏結強度擴散黏結允許使用高黏度篩選基質。

藉由將一Zenor^TM-1420R薄膜板(尺寸為5"×2"及厚度為188μm)在基板上對準且使此堆疊經受熱及壓力來實現基板之擴散黏結。在薄膜板之間不塗覆黏著劑；黏結完全藉由熱及壓力來實現。晶片之最終厚度為約376μm。藉由此方法製造之分離晶片經測試且證明在損壞之前能夠經受至少830psi之壓力。

圖8說明藉由CNC銑削自3/8"厚之丙烯酸板(GE Plastic)製造的晶片支撐體。晶片支撐體由三個主要部分組成：陰極板、中心部分及陽極板。陰極板含有陰極孔、樣品及廢液孔及對準孔。陽極板含有陽極孔及對準孔。陰極板及陽極板均為3/8"厚度以提供足夠樣品量進行樣品注射及提供足夠緩衝液量進行電泳。中心部分為0.04"厚度且具有 作為用於微通道中雷射誘發螢光檢測之"檢測窗口"的開口。在此組態下，來自分離晶片之自身螢光藉由約376μm厚之基板來控制。使用雙面壓敏性黏著劑將分離晶片附著於晶片支撐體。選擇對分離緩衝液及篩選基質而言為惰性之黏著劑。使用壓敏性環氧樹脂將支撐體與分離晶片連接。激發及檢測區中塑料之厚度藉由在此區域中載體上製造切口來降至最小。

Zenor^TM-1420R之光學發射光譜具有在570nm下之拉曼(Raman)發射峰，該發射峰限制螢光染料之螢光檢測。圖9證明與典型玻璃分離晶片(玻璃1.4mm及玻璃0.7mm)相比，塑料晶片(Pchip1及PChp2)之低自身螢光。藉由選擇COP聚合物且將檢測區中設備之厚度降至最小且藉由用薄膜製造該設備來實現塑料晶片之低自身螢光。

實例1C：表面改質及篩選基質

藉由最初用去離子水預處理微通道表面，接著用1M NaOH處理微通道表面來實現表面改質。應用吹氮處理(nitrogen flush)自通道移除流體。繼表面處理之後，使0.1%(w/v)羥丙基甲基纖維素(HPMC)溶液流動穿過通道，接著在室溫下培育隔夜。使用高純度氮湧過通道以移除通道內部之流體。

用於此等實驗之篩選基質為7M脲及1X TTE(Amresco)緩衝液中4%線性聚丙烯醯胺(LPA)。

實例1D：電泳STR尺寸測定

核酸分析之電泳分離及分析在Genebench-FX^TM系列100(Network Biosystems,Inc.,Woburn,MA)上執行。此儀器經組態以接受塑料分離晶片及晶片支撐體以考慮到晶片與儀器之間的優良光學、電學及熱耦合。在整個操作中，腔室溫度維持在50℃下。

對於DNA尺寸測定實驗而言，將人類基因組DNA用ABI AmpFISTR套組(Applied Biosystems Inc.,Foster City,CA)擴增。將 PCR產物(2.7μL)與0.3μL尺寸測定標準及10μL甲醯胺混合，且載入樣品孔中進行分析。檢定由以下組成：在156V/cm下執行預電泳6分鐘，接著藉由在陽極孔施加3900V之電位差且將陰極孔接地來引入樣品。藉由歷時18秒施加350V/cm之電場，接著藉由跨越樣品及廢液孔施加350V/cm之電場且同時跨越陰極及陽極孔施加15.6V/cm之電場進行1.2分鐘之雙負載來引入DNA樣品。注射樣品後，藉由跨越陰極及陽極孔施加156V/cm之電場同時將800V之阻擾電壓(pullback voltage)維持40分鐘來執行電泳DNA分離。

對於DNA排序實驗而言，將M13質體用GE Amersham DYEnamic^TM ET染料終止子循環排序套組(GE Healthcare)來循環排序，乙醇沈澱且再懸浮於10μL去離子水中。分離檢定由以下組成：在156V/cm下執行預電泳6分鐘，接著藉由在陽極孔施加3900V之電位差且將陰極孔接地來引入樣品。藉由歷時60秒施加350V/cm之電場來引入DNA樣品。注射樣品後，藉由跨越陰極及陽極孔施加156V/cm之電場同時維持400V之阻擾電壓60分鐘來執行電泳DNA分離。藉由自Peakfit^®提取峰資訊(峰間隔及峰寬)來計算DNA分離解析度。

在塑料晶片中之16道中同時實現成功之分離。圖10顯示來自5色標記套組(ABI AmpFlSTR Identifiler套組)之等位基因階梯的等位基因呼叫概況。此等結果證明本發明之設備能夠在塑料晶片中用5種顏色分離且清楚解析等位基因，包括間隔等於僅單鹼基對之距離的等位基因(THO 1，等位基因9.3及10)。圖11顯示9947A人類基因組DNA之等位基因呼叫STR概況，顯示在1.0ng DNA模板下實現全部概況。圖12顯示對於多達480個bp而言R>0.4之解析度，證明單鹼基解析度至多為480個bp。圖13藉由顯示間隔1個核苷酸之2個等位基因可毫不含糊地清楚解析來說明此解析度。圖14及15顯示證明單鹼基對解析度之DNA排序概況。

實例2 電動注射塑料晶片 實例2A：晶片設計

本發明之電泳分離晶片之另一組態使用單通道進行分離。藉由電動樣品注射將各樣品引入分離通道中。此替代性方法允許使用小樣品量且顯著簡化分離過程。用於電動樣品注射之晶片設計的示意圖顯示於圖16中之分離圖，顯示支撐體及分離晶片部分。該設備由16個分離長度有效為20cm之微通道組成。各通道在各末端具有一入孔。該等通道90μm寬及40μm深。

實例2B：設備製造

圖16之設備係根據以上部分中所述之程序來製造。概括言之，在厚度為188μm之COP薄膜(Zeonor^TM-1420R)中形成入孔(直徑為1mm)。接著藉由熱壓印形成通道圖案(90μm寬及40μm深)。將COP蓋(Zeonor^TM-1420R)擴散黏結至基板以密封通道。

實例2C：電泳

藉由如以上部分中所述將表面改質應用於通道來製備用於分離之設備。繼此之後，用篩選基質填充通道。將樣品載入樣品/陰極儲集層。經由電極將注射場施加至樣品以將帶負電之DNA注射至分離通道中。在將DNA注射至通道後，將緩衝液(1X TTE；Ameresco)以10倍於樣品量之量添加至樣品/陰極儲集層中。跨越陰極及陽極施加電場以將DNA自注射塞沿分離通道向下分離。添加用以稀釋樣品/陰極中之樣品且不必在載入緩衝液之前移除樣品。分離及檢測在Genebench-FX^TM系列100儀器上執行，且使用先前實例中所述之軟體執行資料分析。

實例3 DNA排序

對於DNA排序分析而言，在由以下各物組成之反應混合物中擴增DNA模板：PCR酶SpeedSTAR HS(Takara,Madison,WI)(U/μL)：0.025，Fast緩衝劑1：1x，dNTPs：0.25mM，引子(正向)：250nM及引子(反向)：250nM。將所需含量之模板DNA添加至混合物中。將DI水或TE緩衝液(Tris 10mM或EDTA 0.1mM)添加至反應混合物中，至10μL之總量。根據廠商推薦之方案，PCR反應混合物之熱循環由以下組成：95℃下60秒之熱起始活化、30次變性循環、退火及擴展(98℃下5秒、55℃下10-15秒及72℃下5-10秒/kbp)及最終在72℃下擴展60秒。

根據廠商之方案，整個PCR產物藉由使用30K MWCO UF過濾器(Pall,East Hills,NY)來淨化。由DI水中DNA組成之經淨化之產物經稀釋或整體用作排序反應之模板。

使用DYEnamic^TM ET終止子循環排序套組(GE Amersham Biosciences)在半強度反應下使用以下反應混合物來執行PCR模板之循環排序。排序預混合物：4μL，稀釋緩衝液：4μL，引子(10μM)：5 pmol。將DNA模板添加至排序反應混合物中。將DI水添加至反應混合物中，至20μL之總量。根據廠商推薦之循環方案，所用循環條件由(95℃下20秒、50℃下15秒、60℃下60秒)30次循環組成。

藉由乙醇沈澱來淨化排序反應混合物。將經沈澱之產物再懸浮於13μL DI水中且用作分離及檢測之樣品。

對於STR分析，擴增係在具有由以下各物組成之以下反應混合物之10μL反應中進行：PCR酶SpeedSTAR HS(Takara,Madison,WI)(U/μL)：0.0315，Fast緩衝劑1：1x，引子設置：2μl，Fast緩衝劑1：1X，dNTPs：200μM，引子(正向/反向)：2μL，來自AmpFlSTR Profiler^TM、COFiler^TM或Identifiler^TM(Applied Biosystems,Foster City,CA)。

循環方案根據酶廠商條件，其由以下組成：95℃下60秒之熱起 始活化、接著28次變性循環、退火及擴展(98℃下4 s、59℃下15 s、72℃下5 s)及最終在72℃下擴展60秒。PCR產物用作分離及檢測之樣品。或者，PCR產物亦可經純化且用作分離及檢測之樣品。

應瞭解上文揭示內容強調本發明之某些特定實施例，且其所有修改或替代性等效物在如隨附申請專利範圍中所述之本發明之精神及範疇內。

100‧‧‧晶片

101‧‧‧陽極部分

102‧‧‧陰極部分

103‧‧‧在陽極部分與陰極部分之間的一中心部分

104‧‧‧至少一個第一通孔

105‧‧‧至少一個第二通孔

106‧‧‧複數個微型流動通道

107‧‧‧檢測窗口

Claims (28)

1. 一種用於分離及檢測以至少4種螢光染料標記之核酸片段的系統，其包含(i)一塑料電泳晶片，其包含：一具有頂面及底面之基板層，其進一步包含一陽極部分、一陰極部分及在該陽極部分與該陰極部分之間的中心部分，一具有頂面及底面之覆蓋層，藉此該基板層之頂面與該覆蓋層之底面黏結以形成至少一個微型流動通道，位於該陽極之第一通孔，其與至少一個微型流動通道處於流體連通中，位於該陰極之第二通孔，其與至少一個微型流動通道處於流體連通中，一檢測窗口，其包含塑料，該塑料係選自於由聚乙烯、聚(碳酸酯)、不飽和、部分不飽和或飽和環狀烯烴聚合物(COP)、不飽和、部分不飽和或飽和環狀烯烴共聚物(COC)及降冰片烯熱聚物組成之群組，且具有少於2mm之厚度，及(ii)一電泳儀器，其包含一電力系統及一光學系統，該電力系統具有一陽極及一陰極，該陽極與該基板層之陽極部分接觸，且該陰極與該基板層之陰極部分接觸，藉此當該電力系統由該陰極傳送電壓至該陽極時，可將該經標記之核酸片段由該陰極部分移動至該檢測窗口，其中該以至少4種螢光染料標記之核酸片段係由該光學系統以大於3之信號雜訊比檢測，且該核酸樣品中之複數種核酸物質可在該核酸樣品之 電泳分析後在單鹼基解析度下檢測。
2. 如請求項1之系統，其中該檢測窗口之塑料具有少於約300μm之厚度。
3. 如請求項1之系統，其中該檢測窗口之塑料具有少於約500μm之厚度。
4. 如請求項1之系統，其中該檢測窗口之塑料具有1mm或少於1mm之厚度。
5. 如請求項1之系統，其中各微型流動通道具有2cm至50cm之分離長度。
6. 如請求項1之系統，其中各微型流動通道進一步包含一注射通道。
7. 如請求項1之系統，其中當在約450與500nm之間的波長下激發時，該塑料實質上不發波長在500與800nm之間的螢光。
8. 如請求項7之系統，其中在約488nm之波長下激發該薄塑料。
9. 如請求項1之系統，其中片段尺寸測定應用所產生之核酸樣品中之複數種核酸物質可以用於PCR擴增之核酸模板之單一副本開始檢測。
10. 如請求項1之系統，其中核酸排序應用所產生之核酸樣品中之複數個核酸物質可以用於PCR擴增之核酸模板之單一副本開始檢測。
11. 如請求項1之系統，其中該複數個微型流動通道之各者進一步包含表面塗層。
12. 如請求項11之系統，其中該表面塗層為羥丙基甲基纖維素(HPMA)、聚(氧化乙烯)(PEO)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(二甲 基丙烯醯胺)(PDMA)、聚(乙烯基吡咯啶酮)、二甲基丙烯醯胺(DMA)、二乙基丙烯醯胺(DEA)、聚(二乙基丙烯醯胺)或其混合物。
13. 如請求項11之系統，其中該複數個微型流動通道之各者進一步包含篩選基質。
14. 如請求項13之系統，其中該篩選基質包含直鏈或交聯聚(N,N-二烷基丙烯醯胺)、直鏈聚丙烯醯胺、聚二甲基丙烯醯胺、聚乙烯基吡咯啶酮或其組合。
15. 如請求項14之系統，其中該篩選基質包含1-50wt%之聚丙烯醯胺。
16. 如請求項1之系統，其進一步在各陰極孔與各微型流動通道之間包含多孔層，其中該多孔層能夠實質上阻斷氣泡自該等陰極孔進入各微型流動通道中。
17. 如請求項16之系統，其中該多孔層包含玻璃料、聚合物玻璃料、聚合物膜或聚合物過濾器。
18. 如請求項1之系統，其包含複數個微型流動通道，其中該複數個微型流動通道中之各者進一步包含一用於同時注射複數個要分析之樣品之注射器，每一個樣品係注射至該複數個微型流動通道中之各者。
19. 如請求項1之系統，其中經分離之該核酸片段為人類DNA STR片段。
20. 如請求項1之系統，其中經分離之該核酸片段為Sanger排序反應之產物。
21. 如請求項1之系統，其中該核酸樣品中之複數個核酸種類可以少於1000副本之用於PCR擴增之核酸模板開始檢測。
22. 如請求項1之系統，其中該核酸樣品中之複數個核酸種類可以少於400副本之用於PCR擴增之核酸模板開始檢測。
23. 如請求項1之系統，其中該核酸樣品中之複數個核酸種類可以少於300副本之用於PCR擴增之核酸模板開始檢測。
24. 如請求項1之系統，其中該核酸樣品中之複數個核酸種類可以少於200副本之用於PCR擴增之核酸模板開始檢測。
25. 如請求項1之系統，其中該核酸樣品中之複數個核酸種類可以少於100副本之用於PCR擴增之核酸模板開始檢測。
26. 如請求項1之系統，其中該核酸樣品中之複數個核酸種類可以少於30副本之用於PCR擴增之核酸模板開始檢測。
27. 如請求項1之系統，其中該核酸樣品中之複數個核酸種類可以少於10副本之用於PCR擴增之核酸模板開始檢測。
28. 一種裝置，其包含一支撐體，其包含第二檢測窗口；及如請求項1之系統，其中該電泳晶片係附著於該支撐體，且其中該第二檢測窗口與該晶片之檢測窗口之位置重疊。