TW201335378A

TW201335378A - 自木質纖維素生質之提高糖回收率方法

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Publication number: TW201335378A
Application number: TW102100685A
Authority: TW
Inventors: Paolo Torre; Simone Ferrero; Piero Ottonello; Rensi Liliane Tonet; Francesco Cherchi; Dario Giordano
Original assignee: Beta Renewables Spa
Priority date: 2012-01-09
Filing date: 2013-01-09
Publication date: 2013-09-01
Also published as: BR112014016912A8; US20150136120A1; US9528164B2; BR112014016912A2; WO2013105033A1; AR089690A1; EP2802664A1

Abstract

本發明揭示一種改良將聚葡萄糖水解成為葡萄糖之方法，其中將一部分的葡萄糖從該方法移除而改良葡萄糖之產率。

Description

自木質纖維素生質之提高糖回收率方法

本發明揭示一種基於在水解反應期間移除葡萄糖以改良葡萄糖總產率的原理而改良水解之方法。

在先行技藝中，包含固體流及液體流之經預先處理的木質纖維素生質之水解經常對該二流分別進行。此組態有增加所需的設備，及增加水解方法的總成本之缺點。

依照先行技藝所揭示的其他方法，該二流係在同一容器中藉由混合固體流與全部液體流而水解，因而使該二流在相同的水解時間內同時水解。此種進行水解的方式亦發生在預先處理製造出經預先處理的木質纖維素生質之單一流的情形。

所屬技術領域已知，水解產物(即寡聚與單體糖類)抑制尚未水解的聚合糖類之水解，因而降低水解產率或增加達到特定產率所需的時間。為了避免或限制產物抑制效應，現已提議基於移除水解產物之不同策略。通常添加水以取代被移除的水解產物(液體形式)，因而降低已水解流之糖濃度。

本發明人已發現，在將液體流之木寡糖水解之水解時間歷時比固體流中聚葡萄糖之水解時間短的情形，經預先處理的木質纖維素生質(包含具有聚葡萄糖與聚木糖之固體流，及具有木寡糖之液體流)之水解係針對先行技藝所揭示的方法而改良。所屬技術領域已知，水解聚木糖與木寡糖所需的時間比將聚葡萄糖與葡寡糖水解成為葡萄糖所需的時間短。

本發明揭示一種改良經預先處理的木質纖維素生質之水解之方法，該生質包含固體流及液體流，且該固體流包含聚葡萄糖、聚木糖、及不為聚葡萄糖或聚木糖之化合物，該液體流包含木寡糖、水、及不為木寡糖之化合物。

該方法的步驟包含：a)混合該固體流與第一部分的液體流；b)在第一水解步驟中，在第一水解催化劑存在下，將該固體流中的至少一部分聚葡萄糖水解成為葡萄糖，且將第一部分的液體流中至少一部分木寡糖水解成為木糖，而製造第一水解混合物，其具有第一水解混合物單體糖類濃度及第一水解混合物水解催化劑濃度，其中第一水解混合物具有第一水解混合物催化劑對單體糖類之比，其為第一水解混合物中的水解催化劑重量對第一水解混合物中的單體糖類總重量之比例；及c)從第一水解混合物移除至少一部分單體糖類而製造：i)第一產物流，其包含水、葡萄糖與木糖，其中第一產物流具有第一產物流單體糖類濃度，可為0之第一產物流催化劑濃度，及第一產物流催化劑對單體糖類之比，其為第一產物流催化劑濃度對第一產物流單體糖類濃度之比例；及ii)部分水解流，其為已被移除至少一部分單體糖類之第一水解混合物，其中從第一水解混合物移除至少一部分單體糖類係在將至少一部分聚葡萄糖水解成為葡萄糖仍在進行時發生，及第一水解混合物催化劑對單體糖類之比大於或等於第一產物流催化劑對單體糖類之比。

本發明亦揭示，該方法的步驟可進一步包含：a)混合該部分水解流與第二部分的液體流；b)在第二水解步驟中，在包含至少一部分第一水解催化劑之第二水解催化劑存在下，將該部分水解流中的至少一部分聚葡萄糖水解成為葡萄糖，且將第二部分的液體流中至少一部分木寡糖水解成為木糖，而製造第二水解混合物；及c)從第二水解混合物移除至少一部分單體糖類，而製造包含水、葡萄糖與木糖之第二單體糖類產物流。

本發明進一步揭示，第一水解可在第一容器中發生，及第二水解可在第二容器中發生。

本發明亦揭示，第一水解步驟及第二水解步驟可在同一容器中發生。

本發明進一步揭示，從第一水解混合物及/或第二水解混合物移除單體糖類可在第一容器外部發生。

本發明亦揭示，可從該方法清除至少一部分的部分水解流。

本發明進一步揭示，可從該方法清除至少一部分第一水解混合物及/或第二水解混合物。

本發明亦揭示，可從該方法清除至少一部分聚葡萄糖、聚木糖、及不為聚葡萄糖或聚木糖之化合物。

本發明進一步揭示，該部分水解流可具有部分水解流單體糖類濃度，且該部分水解流單體糖類濃度對第一水解混合物單體糖類濃度之比例可為小於或等於1.0。

本發明亦揭示，該水解可包含酵素水解，且該催化劑包含至少一種可將聚葡萄糖水解成為葡萄糖之酵素。

本發明進一步揭示，從第一水解混合物及/或第二水解混合物移除至少一部分單體糖類可包含選自由離心、過濾、及其組合所組成的群組之方法。

本發明亦揭示，從第一水解混合物及/或第二水解混合物移除至少一部分單體糖類可包含奈米過濾。

本發明進一步揭示，從第一水解混合物及/或第二水解混合物移除至少一部分單體糖類可包含超過濾(ultra-filtration)。

本發明亦揭示，從第一水解混合物及/或第二水解混合物移除至少一部分單體糖類可包含離心。

本發明進一步揭示，從該方法清除的材料質量對被引入第一容器或第二容器中的部分水解流質量之比例可為選自由1：99至99：1、5：95至50：50、50：50至95：5、10：90至90：10、20：80至80：20、30：70至70：30、及40：60至60：40所組成的群組之範圍。

本發明亦揭示，根據乾量基準，被加入該方法之經預先處理的木質纖維素生質之量，對該方法中的第一水解混合物之量加上該方法中的部分水解流之量之比例可為小於選自由2：1、1：1、0.9：1、0.8：1、0.7：1、0.6：1、0.5：1、0.4：1、0.3：1、0.2：1、及0.1：1所組成的群組之比例。

本發明進一步揭示，可將該經預先處理的木質纖維素生質非連續地被引入第一容器中。

本發明亦揭示，可從第一容器非連續地移除第一水解混合物。

本發明進一步揭示，第一產物流單體糖類濃度對部分水解流單體糖類濃度之比例可為大於1.0。

本發明亦揭示，第一水解混合物催化劑對單體糖類之比可大於第一產物流催化劑對單體糖類之比。

本發明進一步揭示，將第一產物流催化劑對單體糖類之比除以第一水解混合物催化劑對單體糖類之比可為小於選自由1.0、0.9、0.8、0.7、0.5、0.4、0.3、0.2、及0.1所組成的群組之數目。

本發明亦揭示，以毫克數表示的酵素量對以克數表示的β-1,4-聚葡萄糖總量之比例可為選自由0.5至25、0.5至20、0.5至15、0.5至10、0.5至9、0.5至8、0.5至7.5、0.5至7、0.5至6.5、0.5至6、0.5至5.5、0.5至5、1至5、1.5至5、2至5、2.5至5、3至5、3.5至5、4至5、4.5至5所組成的群組之範圍。

20‧‧‧第一水解混合物

30‧‧‧第一水解混合物流

40‧‧‧第一產物流

50‧‧‧部分水解流

60‧‧‧清除流

70‧‧‧部分水解流

80‧‧‧第二部分的液體流

100‧‧‧容器

110‧‧‧從第一水解混合物移除單體糖類之移除處

120‧‧‧部分水解流之清除處

200‧‧‧第二容器

210‧‧‧第二單體糖類產物流(240)自第二水解混合物產生處

215‧‧‧至少一部分的部分水解流(70)

220‧‧‧第二水解混合物

230‧‧‧第二水解混合物流

240‧‧‧第二單體糖類產物流

250‧‧‧第二部分水解混合物

260‧‧‧第二部分的液體流

第1圖為本發明之方法之一具體實施例。

第2圖為本發明之方法之另一具體實施例，其顯示不同的清除點。

第3圖為本發明之方法之另一具體實施例，其顯示不同的清除點。

第4圖為本發明之方法之另一具體實施例，其顯示二容器組態。

第5圖以圖表敘述CE1中的葡萄糖及木糖濃度。

第6圖以圖表敘述CE2中的葡萄糖及木糖濃度。

第7圖以圖表敘述WE1中的葡萄糖及木糖濃度。

本發明關於一種改良從木質纖維素生質的水解製造單體糖類流之方法，其係基於在水解期間移除單體糖類會增加單體糖類之製造的發現。此方法因增加單體糖類之產率，尤其是在酵素水解法期間，而可用於第二代生質水解法。

在本發明之揭示中，葡萄糖及木糖為所考量的例示性單體糖類，因為其為由木質纖維素生質之水解所獲得的主要單體糖類。在本發明之揭示中可考慮其他的單體糖類，例如***糖。

進一步而言，本發明之方法可被稱為改良經預先處理的木質纖維素生質之水解之方法。該經預先處理的木質纖維素生質包含經預先處理的木質纖維素生質之固體流及液體流。

該固體流包含聚葡萄糖、聚木糖(以上為水不溶性聚合糖類)、及不為聚葡萄糖或聚木糖之其他化合物。這些化合物可包含其他的水不溶性聚合糖類、木質素、蛋白質、脂肪、鹽類、及與本發明之範圍無關的其他化合物。水溶性寡聚及單體糖類，例如葡寡糖、木寡糖、葡萄糖、與木糖，亦可存在於固體流中，較佳為其量比聚葡萄糖與聚木糖低。

該液體流包含水溶性木寡糖、水、及不為木寡糖之化合物。這些化合物可包含水溶性寡聚及單體糖類，例如葡寡糖、葡萄糖與木糖；水不溶性聚合糖類，例如聚葡萄糖與聚木糖；木質素、脂肪、蛋白質、鹽類、鹽類。根據乾量基準，木寡糖以外的各種化合物較佳為以比聚木糖之用量低的用量存在於液體流中。較佳為液體流之乾燥物質含量小於10%，更佳為小於5%，甚至更佳為小於4%，最佳值為小於3%。在預先處理木質纖維素生質期間，從木質纖維素生質之聚木糖移除或製造木寡糖。

在本發明所揭示的方法中，將由木質纖維素生質之預先處理所製造的固體流、及由同一木質纖維素生質之預先處理所製造的第一部分(非全部)的液體流在第一水解步驟中水解，而製造第一水解混合物。該水解係藉水解催化劑輔助而發生，其可為酸、鹼、至少一種可將聚葡萄糖轉化成為葡萄糖之酵素、或其混合物。所使用的片語「水解催化劑」或「催化劑」係表示將聚葡萄糖轉化成為葡萄糖之催化劑的總存在量。例如水解催化劑經常包含酵素，因為該催化劑為酵素之混合物，亦已知為酵素雞尾酒(enzymatic cocktail)。第一水解混合物包含單體糖類，如葡萄糖與木糖，亦可包含水溶性寡聚糖類，如葡寡糖與木寡糖。單體糖類主要由固體流之聚葡萄糖與聚木糖、及第一部分的液體流之木寡糖之水解所製造；在該水解之前，少部分的葡萄糖與木糖可存在於固體流及/或液體流中。第一水解混合物亦包含存在於液體流及固體流中的其他化合物，如木質素及一部分的聚葡萄糖與聚木糖，或者其會在水解期間形成。然後在固體流中的聚葡萄糖仍在進行水解時，從第一水解混合物移除一部分的單體糖類，因而製造第一產物流及部分水解流。較佳為在液體流之木寡糖的水解速率已降至低於最高水解速率之50%，更佳為低於最高水解速率之40%，甚至更佳為低於最高水解速率之30%，又甚至更佳為低於最高水解速率之20%，且最佳為低於最高水解速率之10%時，從第一水解混合物移除單體糖類。水解速率為在發生水解時，第一水解混合物中的木糖濃度相對時間之曲線的斜率。最高水解速率通常在水解之早期階段發生。

第一產物流包含單體糖類，其具有第一產物流單體糖類濃度；亦可包含一部分的水解催化劑(希望越少越好)，因而第一產物流的特徵亦有可為0之第一產物流催化劑濃度。第一產物流的特徵亦可有第一產物流催化劑對單體糖類比，其為第一產物流催化劑濃度對第一產物流單體糖類濃度之比例。

從第一水解混合物移除單體糖類比從水解催化劑更具選擇性。換言之，第一水解混合物催化劑對單體糖類比大於或等於第一產物流催化劑對單體糖類比。

部分水解流為已被移除至少一部分單體糖類之第一水解混合物。雖然希望從第一水解混合物移除大部分的單體糖類，但特定比例的單體糖類仍可存在於部分水解流中。部分水解流進一步包含尚未被水解的固體流之一部分聚葡萄糖與聚木糖。

在一較佳具體實施例中，在第二水解步驟中，將部分水解流、及在同一木質纖維素生質之預先處理中所製造的第二部分的液體流水解，而製造第二水解混合物。該水解係藉第一水解步驟之至少一部分水解催化劑輔助而發生。視情況可將新的水解催化劑加入第二水解步驟。如果添加新的水解催化劑，則其用量較佳為小於用於第一水解步驟之水解催化劑的用量之50%，更佳為小於40%，甚至更佳為小於30%，又甚至更佳為小於20%，且最佳為小於10%。第二水解混合物包含單體糖類，如葡萄糖與木糖，亦可包含水溶性糖類，如葡寡糖與木寡糖。單體糖類主要由部分水解流之葡萄糖與木糖、及第二部分的液體流之木寡糖之水解所製造；在該水解之前，少部分的葡萄糖與木糖可存在於部分水解流及/或液體流中。第二水解混合物亦包含存在於液體流及部分水解流中的其他化合物，如木質素及一部分的聚葡萄糖與聚木糖，或者其會在水解期間形成。然後從第二水解混合物移除一部分的單體糖類，因而製造包含單體糖類之第二產物流。

在從第二水解混合物移除第二產物流時製造出殘餘流。殘餘流可包含未水解的聚葡萄糖與聚木糖，且可進一步進行後續的水解步驟。

本發明所揭示的方法之優點為在各水解步驟中降低木糖濃度，因而降低產物抑制效應及增加全部方法的水解產率。此外，在第二水解步驟添加液體部分而減少使水解混合物獲得所欲的乾燥物質所必須添加的水量。結果，所獲得的產物流會比先行技藝所揭示的方法更為濃縮，及在下游方法中僅須處理較少的水。通常過量水係藉熱處理移除，或者在廢水設施中處理。兩種解法均增加最終產物的成本。

第一水解步驟及第二水解步驟可在單一容器中，或者在兩個分別的容器中進行。在兩種情形，從第一水解混合物移除單體糖類可在第一容器外部發生。從第二水解混合物移除單體糖類可在第二容器外部發生。

本發明之方法之一具體實施例係敘述於第1圖，其中在容器(100)中將至少一部分聚葡萄糖水解成為葡萄糖且將至少一部分木寡糖水解成為木糖，及在容器外部進行從第一水解混合物移除單體糖類(110)而製造第一產物流(40)，且從水解混合物移除單體糖類而製造部分水解流(50)，其具有部分水解流單體糖類濃度，其中部分水解流為已被移除至少一部分單體糖類之第一水解混合物，及將至少一部分的部分水解流(50至70)引入容器中。將第二部分的液體流(80)引入容器(100)中。在第1圖中，在120將一部分的部分水解流從方法中清除至流60中。因此，流70事實上為部分水解流50之一部分。

雖然較佳為重新引入部分水解流，但並非必要。例如一具體實施例可為容器100具有薄膜而分隔出二或三個室及含有第一水解混合物20的一個室，且該薄膜允許單體糖類移動至至少一個其他室中，其他聚葡萄糖則被保持在第一水解混合物中而持續被水解。在此情況，單體糖類分離不在容器外部完成。

在第1圖之具體實施例中，從第一水解混合物移除單體糖類係在容器(亦稱為水解容器)外部進行。

將原料流引入容器中可藉由連續或不連續方式進入容器(100)中而進行，且仍為連續方法。連續方法係定義為未將容器清空，即未從方法之容器及管線中移除全部的水解混合物，其中該管線包括使用於包含第一水解混合物(20/30)、部分水解流(50/70)，但無第一產物流(40)之方法流的管線。

以下揭述可用於本發明之木質纖維素生質。

除了澱粉之外，植物生質中的三種主要組分為纖維素、半纖維素及木質素(lignin)(其通用術語為木質纖維素，lignocellulose)。通用術語「含有多醣之生質(polysaccharide-containing biomasses)」包括澱粉及木質纖維素生質。因此，一些型式的原料可為植物生質、含有多醣之生質、及木質纖維素生質。

依照本發明，含有多醣之生質包括任何含有聚合糖類(例如澱粉及精製澱粉之形式)、纖維素及半纖維素之材料。

本發明之生質的相關型式可包括衍生自選自由含有澱粉之穀物、精製澱粉；玉米梗、蔗渣、禾稈(例如得自稻米、小麥、黑麥、燕麥、大麥、油菜、高粱)；軟木，例如歐洲赤松(Pinus sylvestris)、輻射松(Pinus radiate)；硬木，如柳屬(Salix spp.)、桉屬(Eucalyptus spp.)；塊莖類，例如甜菜、馬鈴薯；穀物，得自例如稻米、小麥、黑麥、燕麥、大麥、油菜、高粱與玉米所組成的群組之農作物；廢紙、得自生物沼氣處理之纖維部分、堆肥、得自油棕櫚處理之殘渣、都市固體廢棄物等之生質。雖然實驗限於上列幾個實例，但是據信本發明可應用於整體，因為特徵主要為木質素及表面積之獨特特徵。

用於該方法之木質纖維素生質較佳為得自通常稱為草類之科。合適者為已知的開花植物之百合綱(Class Liliopsida，單子葉植物)中的禾本科(Poaceae)或禾本亞目(Gramineae)之科。此科植物通常被稱為草類(grasses)，或者為了將其與其他的類禾本植物(graminoid)區別而稱為真草類(true grass)。亦包括竹子。現有約600屬及約9,000-10,000種或以上的草類(Kew Index of World Grass Species)。

禾本科包括在全世界生長的主食穀物與雜糧作物、草皮與牧草、及竹子。禾本科通常具有中空的莖(稱為稈)，其按間隔(實心)堵塞，該間隔稱為節(node)，為沿稈葉子生長之處。草的葉子通常為交錯對生(distichous)(在一株植物中)，螺旋狀極少見，且葉脈平行。各葉分化成為按一定距離貼近莖之下葉鞘(sheath)，及完全處於邊緣之葉片(blade)。許多種草類之葉片因植物矽石(silica phytolith)而硬化，其有助於阻礙放牧動物。其在某些草類(如劍草)中會使葉片邊緣變尖銳而足以割傷人類皮膚。毛狀或髮狀的膜狀附屬體或(稱為葉舌)位於葉鞘與葉片接合處而防止水或昆蟲進入葉鞘中。

草類葉片係在葉片基部而非從長形莖頂端生長。此低生長點係回應放牧動物而進化，且可使草類被放牧或收割但不嚴重損傷植物。

禾本科之花特徵為以小穗花(spikelet)排列，各小穗花均具有一朵或以上的小花(小穗花進一步分成圓錐花序或穗形花序)。小穗花係由基部的兩個(有時更少)苞(稱為稃(glume))鄰接一朵或以上的小花所組成。小花係由被兩個苞(稱為外穎(lemma)，在外部)及內穎(palea)(在內部)包圍的花所組成。花通常為雌雄同體(雌雄同株之玉蜀黍為例外)，且授粉幾乎始終為經由風媒。花被係縮減成兩個鱗片(稱為鱗被(lodicule))，其擴大及收縮而散布穎與內穎；其通常解釋成變性花萼。

禾本科之果實為穎果，其中種皮被整合至果壁，因此不會脫離(如玉蜀黍粒)。

在草類中出現的生長習性現有三種通用分類：束型(亦稱為叢生性)、走莖性及根莖性。

草類之發跡部分由於其形態及生長過程，且部分由於其生理多樣化。使用固碳作用之C3及C4光合作用路徑可將大部分草類分成兩種生理群組。C4草類之光合作用路徑有關特異化Kranz葉解剖而使其特別適應熱氣候及二氧化碳少的大氣。

C3草類被稱為「寒帶草類」，C4植物則被視為「熱帶草類」。草類可為一年生或多年生。一年生寒帶草類之實例為小麥、黑麥、一年生黍草屬(一年生草地早熟禾、早熟禾(Poa annua)與燕麥)。多年生寒帶草類之實例為果園草(雞腳茅(cocksfoot)、鴨茅(Dactylis glomerata))、牛毛草(羊茅屬(Festuca spp))、肯塔基藍草、及多年生黑麥草(多年生黑麥草屬(Lolium perenne))。一年生熱帶草類之實例為玉米、蘇丹草及珍珠粟。多年生熱帶草類之實例為大藍莖草、印度草、百慕達草、及柳枝稗。

一種分類法將草科分成12個亞科：1)Anomochlooideae，一種包括兩屬(Anomochloa,Streptochaeta)之寬葉草類小族；2)Pharoideae，一種包括三屬(其中包含Pharus與囊稃竹屬(Leptaspis))之小族草類；3)Puelioideae，一種包括非洲屬Puelia之小族；4)早熟禾亞科(Pooideae)，其包括小麥、黑麥、燕麥、雀麥草(Bronnus)、與南方蘆葦(Calamagrostis)；5)竹亞科(Bambusoideae)，其包括竹子；6)稻亞科(Ehrhartoideae)，其包括稻米與野生稻；7)蘆竹亞科(Arundinoideae)，其包括蘆竹與蘆葦；8)假淡竹葉亞科(Centothecoideae)，一種11屬之小亞科，其有時包括於黍亞科之中；9)虎尾草亞科(Chloridoideae)，包括畫眉草類(畫眉草屬(Eragrostis)，約350種，包括衣索比亞畫眉草)、鼠尾粟類(鼠尾粟屬(Sporobolus)，約160種)、龍爪稷類(龍爪稗屬(Eleusine coracana(L.)Gaertn.))、與亂子草類(亂子草屬(Muhlenbergia)，約175種)；10)黍亞科(Panicoideae)，包括小米、玉蜀黍、高粱、蔗糖、大部分粟類、馬唐(fonio)、與藍莖草；11)Micrairoideae；12)扁芒草亞科(Danthoniodieae)，包括銀白葦屬(pampas grass)；以及早熟禾屬(Poa)，其為依照兩半球之溫度區域而原生的約500種草類之屬。

因其食用種子而栽種的農作草類稱為穀物。三種常見穀物為稻米、小麥及玉蜀黍(玉米)。所有的農作物中有70%是草類。

蔗糖為製糖之主要來源。草類被用於營建。由竹子所製造的鷹架可承受會破壞鋼鷹架之強烈颱風。更大的竹子及蘆竹有堅固的稈，其可以類似木料的方式使用，且草根穩定草皮屋之草。蘆竹屬(Arundo)被用以製造木管樂器之舌簧，且竹子被用於許多種工具。

木質纖維素生質原料亦可得自喬木類或木材。喬木類為使用木材作為其結構組織之植物。其一般為多年生植物，其樹幹及較大的根被相鄰維管組織而產生的木材強化。這些植物之主幹、較大的樹枝、及根部通常被一層厚樹皮覆蓋。喬木類通常為樹、灌木或藤木。木材為結構性細胞變異，其可使喬類木年年從地面樹幹生長，某些喬木類因此變成越來越大及越高的植物。

這些植物需要維管系統而將水分及養分從根部輸送至葉子(木質部)及將糖分從葉子輸送至植物的其餘部分(韌皮部)。現有兩種木質部：初生木質部在初期生長期間由原形成層形成，次生木質部在次期生長期間由維管形成層形成。

通常所謂的「木材」為此種植物之次生木質部。

可發現次生木質部之兩種主要群組為：

1)針葉樹類(松柏綱(Coniferae))：現有約六百種針葉樹。所有的種類均有次生木質部，此類的結構均相當均勻。許多種針葉樹會變成大樹，此樹之次生木質部被作為軟木。

2)被子植物類(被子植物綱(Angiospermae))：現有約二十五萬至四十萬種被子植物。此類中的單子葉植物(例如禾本科)尚未發現有次生木質部。許多種非單子葉被子植物會變成樹，且其次生木質部被作為硬木。

術語「軟木」係用以說明得自屬於裸子植物類之樹的木材。裸子植物為具有未以子房封包的裸仔之植物。這些種子「果實」被視為比硬木更原始。軟木樹通常為常綠，帶有毬果，及具有針葉或鱗狀葉。其包括針葉樹種，例如松樹、杉樹、樅樹、及西洋杉。針葉樹種之木材硬度不同。

術語「硬木」係用以說明得自屬於被子植物科之樹的木材。被子植物為具有以子房封包而保護的胚珠之植物。在受粉時，這些胚珠成長成為種子。硬木樹通常為闊葉；在溫帶及寒帶其幾乎落葉，但是在熱帶及亞熱帶則幾乎常綠。這些葉子可為單一(單葉)，或者其可結合附著葉梗之小葉。雖然形狀不同，但所有的硬木葉子均具有清楚的細小葉脈之網路。硬木植物包括例如白楊、樺樹、櫻桃樹、楓木、橡木、及柚木。

因此，較佳的木質纖維素生質可選自由草類及木材所組成的群組。較佳的木質纖維素生質可選自由屬於針葉樹、被子植物、禾木科及/或禾本亞目之植物所組成的群組。另一種較佳的木質纖維素生質亦可為其乾燥物質之至少10重量百分比為纖維素，或更佳為其乾燥物質之至少5重量百分比為纖維素的生質。

木質纖維素生質亦包含選自由基於葡萄糖、木糖及甘露糖單體之碳水化合物所組成的群組之碳水化合物。衍生自木質纖維素生質表示原料流之木質纖維素生質包含聚葡萄糖及聚木糖及木質素。

聚葡萄糖包括木質纖維素生質中的葡萄糖之水不溶性聚合物。與1,4-α-聚葡萄糖則相反，1,4-β-聚葡萄糖特別有利，尤其是纖維素。根據乾量基準，存在於經預先處理的木質纖維素生質中的1,4-β-聚葡萄糖之量應為經預先處理的木質纖維素生質之至少5重量百分比，更佳為經預先處理的木質纖維素生質之至少10重量百分比，且最佳為經預先處理的木質纖維素生質之至少15重量百分比。

聚木糖包括經預先處理的木質纖維素生質中的聚木糖之水不溶性聚合物。

經預先處理的木質纖維素生質可為無澱粉，實質上無澱粉，或者澱粉含量為0。如果有則澱粉可為小於乾燥內容物的75重量百分比。並無較佳的澱粉範圍，因為據信有澱粉不會影響其水解成為葡萄糖。如果有則澱粉量之範圍為乾燥內容物的0至75重量百分比，乾燥內容物的0至50重量百分比，乾燥內容物的0至30重量百分比，及乾燥內容物的0至25重量百分比。

用以預先處理木質纖維素生質之預先處理係用以確保木質纖維素之內容物的結構能使催化劑(如酵素)更易接近，同時有害的抑制性副產物(如乙酸、糠醛與羥甲基糠醛)之濃度低。

現有數種預先處理生質的策略，其中多為仍待發明。在任何情況，經預先處理的木質纖維素生質之木質纖維素內容物比預處理前的木質纖維素內容物更易被使用。

現行的預先處理策略為使木質纖維素材料處於110-250℃之間的溫度歷時1-60分鐘，例如：熱水萃取；多階段稀酸水解，其在形成抑制性物質之前移除溶解材料；激烈度(severity)條件相當低的稀酸水解；鹼性濕氧化；蒸汽爆裂；幾乎任何後續為解毒作用之預先處理。

如果選擇水熱預先處理，則以下的條件較佳：預先處理溫度：110-250℃，較佳為120-240℃，更佳為130-230℃，更佳為140-220℃，更佳為150-210℃，更佳為160-200℃，甚至更佳為170-200℃，或最佳為180-200℃。

預先處理時間：1-60分鐘，較佳為2-55分鐘，更佳為3-50分鐘，更佳為4-45分鐘，更佳為5-40分鐘，更佳為5-35分鐘，更佳為5-30分鐘，更佳為5-25分鐘，更佳為5-20分鐘，及最佳為5-15分鐘。

預先處理後之乾燥物質含量較佳為至少20%(w/w)。經預先處理之木質纖維素原料中的生質量對水之比例的其他較佳上限為1：4至9：1，1.3.9至9：1，1：3.5 至9：1，1：3.25至9：1，1：3至9：1，1：2.9至9：1，1：2至9：1，1.15至9：1，1：1至9：1，及1：0.9至9：1的範圍。

依照本發明，含有多醣之生質包括任何含有聚合糖類(例如澱粉及精製澱粉之形式)、纖維素及半纖維素之材料。然而，如前所討論，澱粉不為主要成分。

較佳的預先處理方法為二段式浸泡/萃取繼而為蒸汽爆裂，如下所述。

木質纖維素生質之較佳預先處理包括浸泡木質纖維素生質原料，及將至少一部分經浸泡的木質纖維素生質原料蒸汽爆裂。

浸泡係在如水(水蒸氣形式、蒸汽或液體形式、或液體與蒸汽一起)之物質中進行而製造產物。該產物為含有第一液體之經浸泡的生質，第一液體通常為液體或水蒸氣形式之水、或某種混合物。

此浸泡可藉任何將物質暴露於水(可為蒸汽或液體、或蒸汽與液體之混合物)，或者更常為在高溫及高壓暴露於水的技術完成。溫度應為以下範圍之一：145至165℃，120至210℃，140至210℃，150至200℃，155至185℃，160至180℃。雖然可為長時間，但小於24小時，或小於16小時，或小於12小時，或小於9小時，或小於6小時；暴露時間較佳為相當短，1分鐘至6小時，1分鐘至4小時，1分鐘至3小時，1分鐘至2.5小時，更佳為5分鐘至1.5小時，5分鐘至1小時，15分鐘至1小時的範圍。

如果使用蒸汽則較佳為飽和，但可為過熱。浸泡步驟可為分批或連續，及有或不攪拌。在高溫浸泡前可使用低溫浸泡。低溫浸泡之溫度為25至90℃的範圍。雖然可為長時間，但小於24小時，或小於16小時，或小於12小時，或小於9小時，或小於6小時；暴露時間較佳為相當短，1分鐘至6小時，1分鐘至4小時，1分鐘至3小時，1分鐘至2.5小時，更佳為5分鐘至1.5小時，5分鐘至1小時，15分鐘至1小時的範圍。

為了在以後的方法中達到高性能，該浸泡步驟亦可包括添加其他的化合物，例如H₂SO₄、NH₃。

然後將包含第一液體之產物送到分離步驟，在此將第一液體從經浸泡的生質分離。該液體不完全分離而是分離至少一部分液體，較佳為在經濟時段內為儘量多的液體。已知得自此分離步驟的液體為包含第一液體之第一液體流。第一液體為用於浸泡之液體，通常為水及原料中的可溶性物種。這些水溶性物種為聚葡萄糖、聚木糖、聚半乳糖、聚***糖、葡寡糖、木寡糖、半乳寡糖、及***寡糖。該固態生質被稱為第一固體流，因為其包含(即使非全部)大部分之固體。

液體分離同樣地可藉已知技術、及某些仍待發明的技術完成。較佳的設備為壓機，因為壓機在高壓下會產生液體。

然後將第一固體流蒸汽爆裂而製造蒸汽爆裂流，其包含固體及第二液體。蒸汽爆裂在生質領域為已知技術，且據信任何現今及未來可用的系統均適合此步驟。蒸汽爆裂之激烈度在文獻中得知為Ro，且為時間與溫度之函數且示為Ro=texp[(T-100)/14.75]其中溫度T係以攝氏表示，及時間t以常用單位(例如分鐘)表示。

該公式亦以Log(Ro)表示，即Log(Ro)=Ln(t)+[(T-100)/14.75]。

Log(Ro)較佳為2.8至5.3，3至5.3，3至5.0，及3至4.3的範圍。

蒸汽爆裂流可視情況至少以水清洗，亦可使用其他的添加劑。預期未來可使用其他的液體，故據信水並非絕對必要。目前水為較佳的液體，且若使用水則將其視為第三液體。來自選用清洗之流出液為第三液體流。此清洗步驟不被認為必要且為選用。

然後處理經清洗的爆裂流而移除經清洗的爆裂材料中的至少一部分液體。此分離步驟亦為選用。術語「移除至少一部分」係提醒雖然希望移除儘可能多的液體(壓迫)，但不太可能為100%移除。在任何情況均不希望為移除100%的水，因為後續的水解反應需要水。此步驟之較佳方法亦為壓機，但是據信其他的已知及尚未被發明之技術均適合。從此方法分離的產物為第二固體流中的固體及第二液體流中的液體。

所揭示的方法之固體流包含蒸汽爆裂流及/或至少一部分經清洗的蒸汽爆裂流。液體流包含第一液體流及/或第二液體流及/或第三液體流。

固體流及第一部分的液體流被引入容器(100) 中。固體流及第一部分的液體流可被混合在一起形成單一流(100)而被引入容器中。在混合之前、期間及/或之後可添加達成所欲的水解條件之其他成分，如達到所欲乾燥物質含量之水。固體流及第一部分的液體流可以二分別之流而被引入容器(100)中，且其他成分可被引入該流之一或兩者、或容器。在將經預先處理的木質纖維素原料之固體流及第一部分的液體流引入容器(100)中之後，將固體流中的至少一部分聚葡萄糖水解成為葡萄糖，將第一部分的液體流中的至少一部分木寡糖水解成為木糖，而在容器(100)內部製造第一水解混合物(20)。此第一水解混合物(20)具有稱為第一水解混合物單體糖類濃度之單體糖類濃度。在分批方法中，第一水解混合物單體糖類濃度隨時間而改變。在真正連續方法中，第一水解混合物單體糖類濃度實質上不隨時間而改變。在任何情況，在說明書指稱兩種濃度或量之比例時，樣品係同時或以相同的時間間隔取得。

將聚葡萄糖水解成為葡萄糖及將木寡糖水解成為木糖可藉任何已知及尚未被發明之方法完成，且包括但不限於酵素水解、酸水解及鹼水解。酵素水解係指使用至少一種酵素而將聚葡萄糖(尤其是1,4-β-聚葡萄糖)轉化成葡萄糖。這些酵素在所屬技術領域為已知的，且多為近年所發展及發現者。

亦由WO 2010/113129號專利(其教示在此全部納入作為參考)得知，根據乾量基準，較佳為被加入容器100之原料流中的經預先處理的木質纖維素生質之量，對容器中所殘留的第一水解混合物(20)之量加上被加入容器的部分水解流(70)之量之比例，小於選自由2：1、1：1、0.9：1、0.8：1、0.7：1、0.6：1、0.5：1、0.4：1、0.3：1、0.2：1、及0.1：1所組成的群組之比例。

例如如果在1小時內將5公斤的乾燥經預先處理的木質纖維素生質加入容器(100)，且每小時加入4公斤的部分水解流(70)，則在比例為1：1，容器中應有1公斤的第一水解混合物(20)。若比例為0.5：1，則容器中應有6公斤的水解混合物。如此可將容器(100)中的經預先處理的木質纖維素生質更快速水解。

將至少一部分第一水解混合物(20)從容器(100)移除而製造第一水解混合物流(30)，視情況在容器(100)中殘留定量之水解混合物。該水解混合物流可以連續或非連續方式被移除。

次一步驟為將至少一部分單體糖類從第一水解混合物(20/30)移除(110)。如此至少製造第一產物流(40)及部分水解流(50)。第一產物流單體糖類濃度(40)對部分水解流單體糖類濃度之比例應大於或等於1.0。

在該比例等於1之情形，移除單體糖類可不必使用過濾或離心而將第一水解混合物分割。雖然該比例可等於1，但較佳為該比例小於1.0，更佳為小於0.90，甚至更佳為小於0.80，甚至更佳為小於0.60，最佳為小於0.5。

從液體或水系組成物移除單體糖類(110)在所屬技術領域為已知的，且可藉任何已知及未來將發現的技術完成。本發明人意欲的至少三種分離方式為離心單獨或結合過濾步驟，其可包含選自由奈米過濾、超過濾、及逆滲透所組成的群組之過濾技術。

另一參數為在從第一水解混合物流移除單體糖類時，大部分催化劑(尤其是實用程度的酵素)不包含於第一產物流而是殘留在部分再循環流中。催化劑可視情況殘留在第一水解混合物中。例如第一水解混合物具有定量之水解催化劑。水解催化劑之量除以第一水解混合物之量(質量比)稱為第一水解混合物水解催化劑濃度。其亦可示為每單位體積的混合物之催化劑克數。在比較濃度時，該單位應一致，如所屬技術領域所已知。

第一水解混合物具有第一水解混合物催化劑對單體糖類之比，其為將第一水解混合物中的催化劑重量除以第一水解混合物中的單體糖類重量之比例。第一水解混合物催化劑對單體糖類之比亦為第一水解混合物催化劑濃度對第一水解混合物單體糖類濃度之比例。

第一產物流具有第一產物流催化劑濃度。如果第一產物流中的催化劑量為0，則第一產物流催化劑濃度為0。0為第一產物流催化劑濃度之較佳值。第一產物流具有第一產物流催化劑對單體糖類之比，其為第一產物流水解催化劑重量對第一產物流中的單體糖類重量之比例。如同第一水解混合物催化劑對單體糖類比，第一產物流催化劑對單體糖類比亦為第一產物流催化劑濃度對第一產物流單體糖類濃度之比例。該值係同時恰在移除單體糖類之前及恰在移除單體糖類之後測定。

由於移除單體糖類之一目的為保留催化劑以進一步使用，故催化劑不應跟隨所移除的單體糖類，而是停留在欲引入容器中之流中。因此，較佳為第一水解混合物催化劑對單體糖類比大於或等於第一產物流催化劑對單體糖類比。在另一具體實施例中，甚至更佳為第一水解混合物催化劑對單體糖類比大於第一產物流催化劑對單體糖類比。

據信移除更多的單體糖類且將催化劑再循環會改良該方法。因此，較佳為將第一產物流催化劑對單體糖類之比除以第一水解混合物催化劑對單體糖類之比為小於選自由1.0、0.9、0.8、0.7、0.5、0.4、0.3、0.2、及0.1所組成的群組之數目。

該方法可如第1-3圖所示，藉由清除或移除該方法之至少一部分材料而進一步強化，其中所清除的材料係選自由第一水解混合物、第一水解混合物流、及葡萄糖再循環流所組成的群組。在第1圖中，將一部分的部分水解流在120轉移至清除流60中，且將剩餘的部分水解流(70)引入容器中。一般而言，該清除僅將一流分成二流，且將清除流從該方法隔離。在第1圖中，將第一水解流(50)之成分分成第一產物流(60)及部分水解流(70)而使該二流之成分的濃度相同。

如此已從該方法清除一些材料。因此，「清除」或「欲清除」係表示從該方法移除材料而在物理上或化學上容納更多原料。該清除可藉閥、彎管、T形管、或任何所屬技術領域已知及尚未被發明的技術而完成。

第1、2及3圖之間的差異為清除流的位置。在第1圖中，清除係對部分水解流進行。在第2圖中，清除係對已離開容器之第一水解混合物進行。在第3圖中，清除係直接從容器轉移一部分的第一水解混合物而完成。

清除亦可關於不為聚葡萄糖或聚木糖之成分，且所清除的材料可揭述為從該方法清除或移除的至少一部分聚葡萄糖、聚木糖、及不為聚葡萄糖或聚木糖之化合物。

清除流之量或質量對部分水解流之量或質量之比例並不重要，但應為選自由1：99至99：1、5：95至50：50、50：50至95：5、10：90至90：10、20：80至80：20、30：70至70：30、及40：60至60：40所組成的群組之範圍。

在第1至3圖之具體實施例中，可視情況將第二部分的液體流(80)加入容器(100)，且混合部分水解流(70)。部分水解流及第二部分的液體流可被混合在一起形成單一流而被引入容器中。在混合之前、期間及/或之後可添加達成所欲的水解條件之其他成分，如達到所欲乾燥物質之水。部分水解流及第二部分的液體流可以二分別之流而被引入容器(100)中，且其他成分可被引入該流之一或兩者、或容器。在將經預先處理的木質纖維素原料之部分水解流及第二部分的液體流引入容器(100)中之後，部分水解流中的至少一部分聚葡萄糖水解成為葡萄糖，第二部分的液體流中的至少一部分木寡糖水解成為木糖，而在容器(100)內部製造第二水解混合物 (20)。再度可從第二水解混合物製造第二單體糖類產物流，其包含第二水解混合物之至少一部分葡萄糖及木糖。亦可藉本說明書先前揭述的分離及清除技術而獲得第二部分水解混合物。第二部分水解混合物可被再度用於進一步水解步驟或從該方法移除。

在第4圖之例示性具體實施例中，在兩個分別的容器中進行兩個水解步驟。將至少一部分(215)的部分水解流(70)及第二部分的液體流引入第二容器(200)中，在此將部分水解流中的至少一部分聚葡萄糖水解成為葡萄糖，將第二部分的液體流中的至少一部分木寡糖水解成為木糖，而在容器(200)內部製造第二水解混合物(220)。流230如同先前方法之流30。在(210)可從第二水解混合物製造第二單體糖類產物流(240)，其包含第二水解混合物之至少一部分葡萄糖及木糖。亦可藉本說明書先前揭述的分離及清除技術而獲得第二部分水解混合物(250)。第4圖之260為與第1-3圖之流80相同之流。

本發明之概念不受上述具體實施例限制，其一般原理應可修改且仍被視為在本發明之申請專利範圍內。

〔實驗〕《分析測量》

分析測量係根據以下的NREL標準而實行。

《NREL分析法》 生質中的結構性碳水化合物及木質素之測定

Laboratory Analytical Procedure(LAP)，發行日期： 4/25/2008

Technical Report NREL/TP-510-42618，2008年4月修訂

生質中的萃取物之測定

Laboratory Analytical Procedure(LAP)，發行日期：7/17/2005

Technical Report NREL/TP-510-42619，2008年1月

組成分析用之樣品之製備

Laboratory Analytical Procedure(LAP)，發行日期：9/28/2005

Technical Report NREL/TP-510-42620，2008年1月

生質中的全部固體及液體方法樣品中的全部溶解固體之測定

Laboratory Analytical Procedure(LAP)，發行日期：3/31/2008

Technical Report NREL/TP-510-42621，2008年3月修訂

生質中的灰分之測定

Laboratory Analytical Procedure(LAP)，發行日期：7/17/2005

Technical Report NREL/TP-510-42622，2008年1月修訂

液態分餾方法樣品中的糖類、副產物、及降解產物之測定

Laboratory Analytical Procedure(LAP)，發行日期： 12/08/2006

Technical Report NREL/TP-510-42623，2008年1月

經預先處理的生質材料中的不溶性固體之測定

Laboratory Analytical Procedure(LAP)，發行日期：03/21/2008

NREL/TP-510-42627，2008年3月

《預先處理步驟》

將小麥稈引入連續反應器中，且在155℃之溫度進行浸泡處理歷時65分鐘。藉壓機將經浸泡的混合物分離成為經浸泡的液體、及含有固態經浸泡的原料之部分。將含有固態經浸泡的原料之部分在190℃之溫度進行蒸汽爆裂歷時4分鐘而製造固體流。

該預先處理製造經浸泡的液體及固體流，經浸泡的液體：固體流之比例為2.8：1。

經浸泡的液體之乾燥物質為3.9%，且根據乾量基準，將該經浸泡的液體之組成物重量比記錄於表1。

固體流之乾燥物質為55.6%，且根據乾量基準，將該固體流之組成物重量比記錄於表2。

對經浸泡的液體進行薄膜過濾步驟而移除一部分乙酸。亦藉薄膜奈米過濾濃縮經浸泡的液體。

首先藉離心及大量過濾(濾器為1微米之過濾袋)，對經浸泡的液體進行初步預先分離步驟而移除固體。離心係藉Alfa Laval CLARA 80離心機以8000 rpm實行。

依照以下步驟，藉Alfa Laval 2.5”設備(薄膜代碼為NF99 2517/48)對經預先分離的液體進行奈米過濾。

在室溫(25℃)及4巴以去礦質水沖洗而檢查滲透流動安定性。測量滲透流速。將192升之量的經浸泡的液體加入進料槽中。為了移除水，在測試前不施壓而將系統沖洗5分鐘。

將系統設定成操作條件(壓力：25-30巴，溫度：30-35℃)。

將阻留流再循環至進料槽且將滲透流廢棄。

進行測試直到將進料槽中的液體體積降到起初經浸泡的液體體積之62.5%，相當於72升之滲透物及 120升之阻留物。

收集經奈米過濾的滲透物及阻留物。

經奈米過濾的阻留物為用於以下水解實驗的液體流。

液體流之乾燥物質為8.7%，相當於經浸泡的液體對液體流之體積比為2.7，且根據乾量基準，將該液體流之組成物記錄於表3。液體流中的乙酸量顯著低於經浸泡的液體中的乙酸量

〔控制實驗1(CE1)〕

以標準分批組態將由該預先處理所產生的比例之固體流及液體流水解。

將0.202公斤之量的固體流及0.202公斤之量的液體流在反應器中混合。為了使乾燥物質達到約6%而加入1.092公斤之量的水。將固體流中的每克聚葡萄糖為100毫克之量的酵素溶液加入，且使用KOH溶液(2 M)將pH設為5。

在50℃水解48小時，且在水解期間的不同時間分析水解混合物之組成物。

第5圖記錄水解期間的葡萄糖及木糖濃度。葡萄糖濃度及木糖濃度在24小時各為22克/升及8克/升，分別相當於78%及75%之水解產率。48小時之最終葡萄糖濃度為24克/升及最終木糖濃度為8克/升，分別相當於81%及80%之水解產率。

水解產率係針對進入酵素水解之液體流與固體流中的聚木糖及聚葡萄糖之量而計算。

由第5圖可知，木糖形成速率顯著比葡萄糖形成速率快，因此，評估改良所考量的最重要因素為葡萄糖釋放及葡萄糖產率。

〔控制實驗2(CE2)〕

對固體流及液體流進行二段式水解，將酵素與部分水解固體流再循環，且在兩個步驟之間分離水解產物。在第一水解步驟引入所有的液體流。

將0.202公斤之量的固體流及0.202公斤之量的液體流以由該預先處理所產生的比例引入反應器中。加入1.092公斤之量的水而使乾燥物質達到約6%。

將固體流中的每克聚葡萄糖為100毫克之量的酵素溶液加入，且使用KOH溶液(2 M)將pH設為5。在50℃水解24小時之第一水解時間，且在不同的時間分析第一水解混合物之組成物。在第一水解時間結束時獲得第一水解流，其葡萄糖濃度為23克/升及木糖濃度為8克/升；所達成的水解產率為聚葡萄糖之79%及木糖之78%。將水解混合物從反應器移除，及在Theroscientific離心機中以9500 rpm離心10分鐘，且分離成包含大部分的溶解糖之第一液體水解部分、及第一固體部分。

為了研究無法用於第二水解步驟之活性酵素量而分析第一液體水解部分中的酵素活性及蛋白質量。表4記錄酵素活性針對對應初值之相對變動。在第一水解步驟結束時，液體部分中的蛋白質濃度為起初蛋白質濃度之13.5%。

將第一固體部分加入反應器而用於第二水解部分。

將0.389公斤之量的水加入反應器而重建約6%之乾燥物質，且在由第一固體部分再循環的酵素存在下，將水解以與第一水解步驟相同的條件持續24小時之第二水解時間。不添加新酵素。在第二水解時間結束時獲得第二水解流，其葡萄糖濃度為1.6克/升及木糖濃度為0.4克/升。

第6圖記錄在兩個酵素水解步驟期間的葡萄糖及木糖濃度。

為了比較CE1而混合得自兩個水解步驟之流。表5根據乾量基準記錄全部流之組成物。整體乾燥物質為4.5%。

全部流之葡萄糖濃度為25克/升及木糖濃度為9克/升，相當於對聚葡萄糖及聚木糖分別為90%及90%之整體水解產率。

CE2證實，移除抑制產物且以酵素再循環可針對CE1之標準分批水解改良方法產率。另一方面，在第二水解步驟中添加重建操作乾燥物質所需的水則產生濃度比CE1低之整體流。

〔作業實驗1(WE1)〕

將固體流及液體流以如CE2之酵素再循環及產物分離接受二段式水解，其差異為在第一水解步驟引入第一部分的液體流，及在第二水解步驟引入第二部分的液體流。

將0.202公斤之量的固體流、0.121公斤之量的液體流、及0.655公斤之量的水引入反應器中，相當於約9%之乾燥物質。

將固體流中的每克聚葡萄糖為100毫克之量的酵素溶液加入，且使用KOH溶液(2 M)將pH設為5。在50℃水解24小時之第一水解時間，且在不同的時間分析第一水解混合物之組成物。在第一水解時間結束時獲得第一水解流，其葡萄糖濃度為34克/升及木糖濃度為10克/升；所達成的水解產率為聚葡萄糖之80%。將水解混合物從反應器移除，及在Theroscientific離心機中以9500 rpm離心10分鐘，且分離成包含大部分的溶解糖之第一液體水解部分、及第一固體部分。將第一固體部分加入反應器而用於第二水解步驟。

將0.081公斤之量的液體流及0.437公斤之量的水加入反應器，相當於約6%之乾燥物質。在由第一固體部分再循環的酵素存在下，將酵素水解以與第一水解步驟相同的條件持續24小時之第二水解時間。不添加新酵素。

在第二水解時間結束時獲得第二水解流，其葡萄糖濃度為1.8克/升及木糖濃度為3.2克/升。

第7圖記錄在WE1之兩個酵素水解步驟期間的葡萄糖及木糖濃度。

為了比較CE1而混合得自兩個水解步驟之流。表6根據乾量基準記錄全部流之組成物。整體乾燥物質為5.7%。

全部流之葡萄糖濃度為36克/升及木糖濃度為14克/升，相當於對聚葡萄糖及聚木糖分別為91%及92%之整體水解產率。

依照本發明之方法而進行的WE1獲得比CE1高的方法產率，及比CE2更濃的全部流。即在全部水解中所添加的水量等於用於CE1者。